JPH03164198A - 成分の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、還元性物質を含有する試料中の特定の戊分か
ら化学量論的に過酸化水素を生成させ、パー才キシダー
ゼの存在下該過酸化水素と色源体とを反応させて生成す
る色素を定量する方法に関し、試料中の還元性物質を予
かしめ分解することにより、より正確に目的成分を定量
するところに特徴を有する。

従来技術 生体試料成分中の目的成分にその酸化酵素を作用させて
、生成した過酸化水素をパーオヰシダーゼ及び色源体の
共存下で色素に導ひきこれを定量することによって目的
成分を定量する方法は公知である。この方法は感度及び
再現性に優れ、自動分析装置にも広く応用されている。

しかし、その反応は酸化縮合反応のため、生体試料中に
共存する還元性物質例えばピリルビン、システイン、グ
ルタチオン等、或いは投与薬剤などにより干渉を受けや
すい。その中でも特にビリルビン〈色合型及び遊離型）
をはじめとする還元性物質の干渉は大きく、目的成分の
真値を求めることは困難である。

この還元性物質の影響を小さくするために、還元性物質
を分解する酵素例えばビリルビンオキシダーゼ等を用い
る方法も検討されているが、分解に多くの時間を要する
等の問題がある。

一方、還元性物質を分解するのに過酸化水素が有効であ
ることは知られている（京都府臨床衛生検査技師会会誌
　１０巻　ｋ２．　１９８３　　３１〜３６頁），しか
し直接試料に過酸化水素を加えると、その酸化力の強さ
のため目的成分の分解の恐れがあり、又定量組底物をキ
ットとして商品化する際に都合が悪い。

発明が解決しようとする課題 試料中の還元性物質の干渉を回避し、且つキットとして
商品化できる手段が見出されていない。

課題を解決するための手段 本発明によれば、試料中の定量すべき成分をレドックス
反応（２）を利用して定量する際の反応に係る戊分以外
の成分（Ｙ）を用い、レドックス反応（１）を利用して
試料中の還元性物質の分解に充分な量の過酸化水素を生
成させ、試料中の還元性物質と該生成過酸化水素とをパ
ーオキシダーゼの存在下に反応させ、要すればレドック
ス反応（１冫で用いた酵素を不活化させた後、パー才キ
シダーゼの存在下過酸化水素と反応してラジカルに変換
される化合物（Ｘ）と試料中に残存する過酸化水素とを
パーオキシダーゼの存在下に反応させ、ついで定量すべ
き戒分を用いレドックス反応（２）を行わせて過酸化水
素を生成させ、これをそれ自体公知の方法で定量するこ
とによって試料中の成分を正確に求めることができる。

本発明の原理は、試料中の基質もしくは酵素活性をこれ
らの成分に由来して化学量論的に生筬する過酸化水素を
定量することにより定量する方法に準拠し、より正確に
目的を達成するために試料中の成分を利用して除々に過
酸化水素を生成させ、その作用によって試料中の還元性
物質を分解させることにより還元性物質の干渉を回避す
ることに特徴を有する。

本発明方法によれば、直接過酸化水素を試料に供給する
ことによる目的成分の分解の恐れもなく、簡単で正確に
目的を達成できる。

以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明を用いて定量できる成分としては、レドックス反
応（２）を利用して過酸化水素を化学量論的に生成させ
ることができる戊分であればいずれも対象にできる。

具体的には目的戊分のオキシダーゼを利用してレドック
ス反応（２）を行い、過酸化水素を生成させることがで
きる戊分、例えばコレステロール、尿酸、グルコース、
乳酸、コリン、グリセロール、ビルビン酸、ザルコシン
などがあげられる。

目的成分（基質）のオキシダーゼがない場合には、目的
戒分を適当な酵素で分解してオキシダーゼが存在するよ
うな基質例えば前記基質に変換し、次いでその基質にオ
キシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させればよい
。かかる成分としてコレステロールエステル、トリグリ
セライド、リン脂質、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン
酸、スターチ、マルトース、シアル酸、クレアチン、タ
レアチニン等が例示される。

目的戒分が酵素の場合は、その酵素の基質に目的成分で
ある酵素を作用させ、さらに要すれば生成成分を才キシ
ダーゼの存在する基質に変換した後、レドックス反応０
｝を行えばよい。該酵素の例として，コリンエステラー
ゼがあげられる。

本発明で用いられる成分（Ｙ）は、目的成分の分析に係
る成分以外の成分であって、オキシダーゼによって過酸
化水素を生戒できる成分や、適当な酵素によってあるい
は基質を試料に加えてオキシダーゼの存在する基質に変
換できるような基質や酵素などがあげられる。

具体的成分（Ｙ）としては、前記目的成分の例がいずれ
も利用できる。

成分（Ｙ）は１つに制限されることなく、２つ以上利用
することができ、試料中に適当な戊分がないときは、試
料に戊分（Ｙ）として基質及びそのオキシダーゼを加え
ることができる。

化合物（Ｘ）としては、パーオキシダーゼの存在下に過
酸化水素と反応して非発色性のラジカルに変換される化
合物であればいずれも用いつる。

かかる化合物として、下記一般式（Ｉ）ρ． 〔式中、ＺはＯＨ又はＮＲ．ＲＳ（Ｒ．，　Ｒｓは同一
又は異なってよく、水素、アルキル、置換アルキル、ア
シルを示す）を示し、Ｒ，，Ｒ２，Ｒ，は同一又は異な
ってよく、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ア
ミノ、ニトロ、カルボキシル、スルホニルを示す〕で表
わされる化合物があげられる。

これらは特公昭６２−２１５１７号公報、特公昭６１−
２３９９８号公報等に記載されているが、具体的には以
下に例示される。

フェノール、２．４−ジクロルフェノール、ｐ一クロル
フェノール、２．４−ジブロムフェノール、Ｐ−ブロム
フェノール、２．３−ジクロルフェノール、２−ニトロ
フェノール、３−ニトロフェノール、２一アミノフェノ
ール、３−アミノフェノール、アニリン、２−ブロムア
ニリン、３−プロムアニリン、２−クロムアニリン、３
−クロルアニリン、オノレトトルイジン、メタトルイジ
ン、ジメチルアニリン、ジェチルアニリン、０−７ェニ
レンジアミン、Ｎ．Ｎ−ｐ−７ェニレンジアミン、０−
アニンジン、メタアニシジン、０−クレゾール、ｍ−ク
レゾール、２−メチル−２，６−ジニトロフェノール、
２−メトキシ−５′−ニトロアニリン、２−メチル−５
−ニトロアニリン、３．５−ジヒドロキシトルエン、３
−メトキシフェノール、２−アミノー５−メチルフェノ
ール、２−ヒドロキシ−３−メチルベンゾイックアシッ
ド、２−ヒドロキシフエニル酢酸、２．３−ジメチルフ
ェノール、２．５−ジメチルフェノール、２−エチルフ
ェノール、３−エチルフェノール、２−メトキシメチル
フェノール、２，３−ジメチルアニリン、２．５−ジメ
チルアニリン、３．５−ジェチルアニリン、３−（ジメ
チルアミノ）フェノール、３−メトキシーＮ．Ｎ−ジメ
チルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジェチル−１．３−フ二二レン
ジアミン、３．５−ジメチル−１．２−７エニレンジア
ミン、４−アミノアンチピリン。

本発明方法を実施するに際しては、一般に適当な緩衝液
に試料を加え、ついで反応を順次行わせるに必要な材料
を順次加えて反応させ、レドックス反応（２）の終了後
、生成した色素の極大吸収波長において、着色した反応
液の吸収の変化を測定することにより目的の成分を定量
できる。

より好ましい方法として、次のステップ八とステップＢ
の組合せを利用することにより簡便に実施できる。

ステップＡ（還元性物質の分解） Ｉａ分（Ｙ）のオキシダーゼが利用できる場合成分（Ｙ
）の才キシダーゼ、パーオキシダーゼ、化合物（Ｘ）及
び試料を１１ｆＩｉ液中に存在させて反応を行わせる。

このステップでレドックス反応（１）によって過酸化水
素が生成し、ついで還元性物質が酸化される。この酸化
反応の反応速度は、化合物（Ｘ）の存在によって増幅さ
れる。

残存する過酸化水素は、化合物（Ｘ）と反応してラジカ
ルとなる。還元性物質の酸化反応は、ラジカル生成反応
より早いので、還元性物質は完全に酸化される。

■　戊分（Ｙ）が直接酸化できない基質である場Ａ 成分（Ｙ）が直接酸化できる基質（Ｂ）に変換するのに
必要な酵素及び基質、基％（Ｂ）のオキシダーゼ、パー
才キシダーゼ、化合物（Ｘ）及び試料を適当な緩衝液に
存在させて反応を行わせる。

このステップで先ず、成分（Ｙ）の基質（Ｂ）への変換
反応が進み、次いで前記ステップ八一■の反応が進む。

■　成分（Ｙ）が酵素の場合 成分（Ｙ）の基質（Ａ）、基質（Ａ）の変換によって得
られる基質（Ｂ）のオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、
化合物（Ｘ）及び試料を適当なｃ１衡液中に存在させて
反応を行わせる。還元性物質の分解反応終了後、成分（
Ｙ）の失活剤を加えてｇ素反応を停止させる。この失活
剤は次のステップＢで加えることもできる。

ステップＢ（目的成分の定量） 過酸化水素の定量が、過酸化水素と色源体とをパーオキ
シダーゼの存在下に反応〔レドックス反応（２）〕させ
て、生成する色素によって着色した反応液を比色定量す
る方法の場合について述べる。

■　目的成分のオキシダーゼを利用する場合目的成分の
オキシダーゼ、色源体をステップ八の反応液に加え、反
応後色素の極大吸収波長における反応液の吸収の変化を
測定する。

■　目的成分のオキシダーゼが利用できない（存在しな
い）場合 目的成分をオキシダーゼを有する基質（Ｂ）に変換する
のに必要な酵素及び基質、基質（Ｂ）のオキシダーゼ、
色源体がステップＡの反応液に加えられる。

試料中に基質（Ｂ）が存在する場合には、基質（Ｂ）の
オキシダーゼはステップＡでＮ衡液に加えられる。

二のステップで先ず目的成分の基質（Ｂ）への変換反応
が進み、次いで上記Ｉの反応が進む。

■　目的成分が酵素の場合 その酵素の基質、さらに要すれば他の基質及び酵素、色
源体がステップＡの反応液に加えられる。反応は上記■
の反応が進む。

本発明で用いられる色源体としては，ノ＜−オキシダー
ゼの存在下に過酸化水素と反応して定量的に色素を生成
するような色源体であればいずれも使用できる。

化合物（Ｘ）は、色源体の一部として利用できる。かか
る場合用いられるカップラーとしては４一アミノアンチ
ピリン（４−ＡΔ）、３−メチル−２−チアゾリノンヒ
ドラゾン（ＭＢＴＩＩ），　４　．　　４’．４″−メ
チジントリス等の他、下記式で表わされる化合物が用い
つる。これらの化合物は、化合物（Ｘ）としても利用で
きる。

カップラーを用いる場合には、化合物（Ｘ）＄よびカッ
プラーの一方をステップ八で他方をステップＢで加えね
ばならない。

式中Ｍｌ％　１２は同一もしくは異なってよく、水素原
子、アルキル、アルケニル、アリール、ヒドロキシアル
キル、シクロアルキル、アシル、アリールアルキル、ア
シルアルキル、カルボキシル、アルコヰシ、スルホ、ス
ルホアルキルを示し、モルホリンｙｉ　（ｍｕ−）を形
成しても良い。Ｍ，、Ｍ，、℃−ノ 旙，、Ｍ６、Ｍ，、ｈは同一もしくは異なってよく、水
素原子、アルキル、アルケニル、アシルアリール、ハロ
ゲン原子、ニトロ、スルホ、カルボキシル、ヒドロキシ
ル、アルコキシを示す。

１つの化合物で色源体として用いられる化合物として、
特開昭５６−１４５３５２号、特開昭６０−２１８０６
９号等に記載の色源体が例示される。

目的成分のオキシダーゼが存在しない場合、先ず目的戊
分は直接酸化できる（オキシダーゼを有する〉基質（Ｂ
）に変換されるが、試料が基質（Ｂ）を含んでいる場合
には目的成分を基質（Ｂ）に変換する前に試料中に元々
存在していた基質（Ｂ）を分解しておかねばならない。

この場合、ステップ八で基質（Ｂ）のオキシダーゼを存
在させれば基質（Ｂ）は酸化されて過酸化水素を生威し
、これはステップＡの段階で分解されるので操作は簡単
である。

例えば遊離のコレステロールを含有する試料中のエステ
ル型のコレステロールを定量する場合がこれに該当する
。

反応はいずれも適当な緩衝液中、ｐＨ２〜ｌ２、好まし
くは用いられる酵素の至適ｐＨ付近で、１０〜４０℃で
行われる。

！ｌ衝剤としてはトリスＨＣＩ，硫酸塩、コハク酸塩、
リン酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩等がｏ．　ｏ　ｏ　
ｔ〜２Ｍで用いられる。

反応液中、酸化酵素０．１〜５Ｕ／ｄ、化合物（Ｘ）及
び色源体０．　５　〜１　０　ｍＭ，　ハ−ｔ＋　シ’
／　−ゼ０．　１　／１０００／ｒｎｉ、目的成分分解
酵素（基質）０．　１　〜１００［１／ｄ　（０．　１
〜１　０　０　ｍＭ）の濃度で用いいられる。

本発明方法を実施するに便利な定量キットとして、組或
物ＡおよびＢからなるキットが提供される。

組戒物Ａ （１）成分（Ｙ）のオキシダーゼ又は戒分（Ｙ）を用い
て過酸化水素を生成させるに要する基質及び／又は酵素 （２）パーオキシダーゼ （３）化合物（Ｘ） （４）下記基質（Ｂ）のオキシダーゼ 組成物Ｂ （１）目的戒分のオキシダーゼ又は目的成分を用いて直
接酸化できる基質（Ｂ）への変換に必要な基質及び／又
は酵素 （２）色源体 以下本発明の態様を実施例によって説明する。

以下の実施例で用いられる血清は実質的に還元性物質を
含有しない血清を用いた。

実施例ｌ． クレアチンの定量 ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩衝液２．２５ｍｌ中に
フェノール２０μｍｏｌｅ，パーオキシダーゼＩＯ単位
、ザルコシンオキシダーゼ３０単位を含有する溶液にＬ
−ラクテートオキシダーゼ（ＬＯＤ）４単位を添加した
溶液及び添加しない溶液を作製し、この各溶液に５■／
ｄｌクレアチン溶液と精製水の等量混合液、血清と精製
水の等量混合液、血清とビリルビンを第ｌ表に示す濃度
の溶液の等量混合液又は精製水を試料として０．０６ｍ
ｌ添加し、３７℃恒温槽内で３分間ほど予備加温（ビリ
ルビン分解反応〉する。

次にそれぞれにｐＨ．０の５０ｍＭＮ．Ｎ−ビス（２−
とドロキシエチル）グリシン緩衝液０．７５ｍｌ中に４
．４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル（２，７−ジ
ヒドロオキシ−１−ナフチル）メタンｌμｍｏｌｅ，タ
レアチンアミジノハイドロラーゼｌ００単位を含有する
試薬液を加え、３７℃恒温槽内で１０分間反応を行った
後、分光光度計（日立製作所＝２２８型）にて波長６３
３ｎｍで精製水を対照として吸光度を測定した。得られ
た結果を第１表に示す。

第 １ 表 実施例２． 実施例ｌにおいて、ビリルビンの代わりにグルタチオン
を用いる他は、実施例１と同様に実施した。結果を第２
表に示す。

第２表 実施例３． 尿酸の定量 ｐＨ６．５の２５ｍＭフタル酸水素カリ緩衝液１．５ｍ
ｌ中にＮ一エチルーＮ−（３−メチルフエニル）一Ｎ′
一サクシニルエチレンジアミン２．７μｍｏｌｅ，パー
オキシダーゼＩＯ単位を含有する溶液に、コレステロー
ルオキシダーゼ（ＣＨＯＤ）　１０単位及びコレステロ
ールエステラーゼ（Ｃ｝ＩＢＲ）　　５単位を添加した
溶液又は添加しない溶液を作製する。

この溶液に５　ｍｇ　／　ｄｌｌ尿酸溶液と精製氷の等
量混合液、血清と精製水の等量混合液、血清とビリルビ
ン各濃度溶液の等量混合液又は精製水を試料として０．
０８ｍｌずつ添加し、３７℃恒温槽内で５分間予備加温
（ビリルビン分解反応）する。

次にそれぞれにＰＨ６．５の０．　１　Ｍ　！Ｊン酸塩
緩衝液１．５ｍｌ中に４一アミノアンチピリンｌμｍｏ
ｌｅ，ウリカーゼ２単位を含有する試薬液を加え、３７
℃恒温槽内で５分間ほど反応を行った後、分光光度計（
日立製作所：２２８型）にて波長５５５ｎｍで精製水を
対照として吸光度を測定した。得られた結果を第３表に
示す。

第 ３ 表 実施例４． ビリルビンの代わりにグルタチオンを用いる他は、実施
例３と同様に実施した。結果を第４表に示す。

第 ４ 表 実施例５． 乳酸の定量 ＰＨ７．５の６０ｍＭ　｝リス緩衝液２．５ｍｌ中に４
−アミノアンチビリン３．６μｍｏｌｅ，パーオキシダ
ーゼ３８単位、コリンオキシダーゼ７単位を含有する溶
液に、オルソトルオイルコリン（ＯＴＣＣ　：コリンエ
ステラーゼの基質）■．５μｍｏｌｅを添加した溶液及
び添加しない溶液を作製する。これに、４０■／ｄ１の
し一乳酸溶液と精製水の等量混合液、血清と精製水の等
量混合液、血清とビリルビン各濃度溶液の等量混合液又
は精製水を試料として０．０４＋＋＋１添加し、３７℃
恒温槽内で５分間予備加温（ビリルビン分解反応）する
。

次にそれぞれの中にｐＨ７．５の６０ｍＭ　｝リスｌｌ
Ｉｒ液０．５ｍｌ中にフェノールｌ，　５　，ｕｍｏｌ
ｅ，ネオスチグミン（コリンエステラーゼ阻害剤）　Ｏ
．　ｌｍａＩｏｌｅ　，　Ｌ−ラクテート才キシダーゼ
４単位を含有する試薬液を加え、３７℃恒温槽内で５分
間ほど反応を行なう。しかる後分光光度計（日立製作所
：２２８型）にて彼長５００ｎｍで精製水を対照として
吸光度を測定した。

得られた結果を第５表に示す。

第 ５ 表 実施例６． ビリルビンの代わりにグルタチオンを用いる他は、実施
例５と同様に実施した。結果を第６表に示す。

第 ６ 表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中の定量すべき成分をレドックス反応（２）
   を利用して定量する際の反応に係る成分以外の成分（Ｙ
   ）を用い、レドックス反応（１）を利用して試料中の還
   元性物質の分解に充分な量の過酸化水素を生成させ、試
   料中の還元性物質と該生成過酸化水素とをパーオキシダ
   ーゼの存在下に反応させ、要すればレドックス反応（１
   ）で用いた酵素を不活化させた後、パーオキシダーゼの
   存在下過酸化水素と反応してラジカルに変換される化合
   物（Ｘ）と試料中に残存する過酸化水素とをパーオキシ
   ダーゼの存在下に反応させ、ついで定量すべき成分を用
   いレドックス反応（２）を行わせて過酸化水素を生成さ
   せ、これをそれ自体公知の方法で定量することを特徴と
   する試料中の成分の分析法。