JPS6340857A - Ｓｈ化合物の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 未発明は主として臨床検査の分野での利用を目的とした
ＳＨ化合物の定量方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、Ｓｉ（基を有するＳＨ化合物の５ＨＡＸの定量方
法に：よ種々のものがあるが、中でも放射化学的方法や
メルカプチド生成反応による方法は操作が繁雑な事や、
前者は放射性物質、後者は水銀化合物を用いるため安全
面や公害の点などから問題があり、現在ではＳ　Ｈ−Ｓ
　Ｓ交換反応が最もよく用いられている。

Ｓ　Ｈ−Ｓ　Ｓ交換反応によるＳ１１基の定量方法は、
ＳＩＩ化合物がＳＳ化合物と反応し、ＳＨ５の存在によ
りＳＳ化合物はそのＳＨＩの量に相当する■のＳＳ結合
が切断されてチオールを生成することから、その千オー
ルの量を分光光学的に吸収を測定することによって、Ｓ
　Ｈ基を定量するものである。このようなＳＳ化合物と
しては一般には、５゜５“　−ジチオビス（２−ニトロ
安息香Ｍ）（以下、ＤＴＮＢと略）、２．２°　−ジチ
オジピリジン、４．４°−ジチオジピリジン、６．６゛
　−ジチオジピリジンなどが知られている。

これらは分子吸光係数が大きく感度が高いため微量のＳ
　Ｈ基の定■が可能で、なかでもＤ　ＴＮ　Ｂはエール
マン試薬とも呼ばれ、これ自体は３２５ｎＩ１１に吸収
極大を持つが、５Ｈｊ５との反応により生成されるチオ
ールの吸収極大はそれとは重なるない４１２ｎｍにある
という利点からよく利用されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、Ｓ　Ｈ−Ｓ　Ｓ交換反応によるＳ　ＩＩ基の定
量方法をり一床検査に用いた場合は次のような問題があ
る。すなわち、臨床検査で検体とする血液、特に血清に
はタンパク質を始め種々のＳ　Ｈ基を有する化合物、い
わゆる内因性Ｓ　Ｈ化合物が混在しており、これが非特
異反応を与え、当該定量における特異性を低下さセる原
因となることである。

そのため、まず内因性ＳＨ化合物とＳＳ化合物とを反応
させて、非特異反応を除去してから、木来定壇を目的と
するＳ　Ｈ化合物による特異反応を生起させてＳ　ＨＪ
Ｊの定量を行う必要がある。ところが、一般に内因性Ｓ
　Ｈ化合物は、ＳＳ化合物との反応性に欠けることが多
く、反応に長時間を要するのが実情である。従って、従
来は定量全体の反応時間としてはこのような内因性Ｓ　
Ｉ−＋化合物の影響を避けるだけでも約３０分間を要す
ることになる。もし、この内因性Ｓ　Ｈ化合物による非
特異反応を除去する時間を省略して直ちに目的とするＳ
Ｈ基の測定すれば、このような内因性ＳＨ化合物をも加
えて定量したことになり、特異性が低下する。従って短
時間に測定する場合に（よ、このような内因性Ｓ　Ｈ化
合物の影響を避けることが不可能となり問題がある。

本発明の目的は、従来の５Ｈ−５Ｓ交換反応によるＳＨ
基の定量方法を改良し、検体中の内因性Ｓ　Ｈ化合物の
影響を受けることなく短時間で測定できるようにするこ
とにある。

ｃ問題点を解決するための手段〕 本発明者らは１．このような問題を解決し上述の目的を
達成するため鋭意研究を進めた結果、Ｓ　Ｈ−ＳＳ交換
反応によるＳＨ基の定量の際に、界面活性剤の存在下で
は、内因性Ｓｌｌ化合物とＳＳ化合物との反応が著しく
促進されて、−ｆｆａ的には１分程度で当該反応が終了
することを見い出し、さ、らに研究を重ねた結果、本発
明を完成した。

すなわち、本発明は５Ｈ−３Ｓ交換反応によりＳＨｉを
定量するＳＨ化合物の定量方法において、界面活性剤の
存在下に、検体中に存在する非特異反応を生起する物質
とＳＳ化合物とを反応させて非特異反応を除去する工程
を含むことを特徴とするＳ　Ｈ化合物の定量方法に関す
るものである。

本発明に用いる界面活性剤としては本発明の目的を満足
するものはすべて用いることができるが、中でも非イオ
ン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性イオン界面活
性剤の群から選択することができる。そのような界面活
性剤の種類の例としては、ポリオキシエチレンアルキル
エーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエー
テル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、
ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレ
ン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪
酸エステル、第２級直鎮アルコールエトキシレート、ノ
ニルフェノールエトキシレート等の非イオン界面活性剤
や、ポリオキシアルキル硫酸エステル塩、アルキルベン
ゼンスルホンａｍ、フルキルリン酸エステル塩、アルキ
ルナフタレンスルホン酸塩、ジアルキルスルホコハク酸
エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、脂肪酸塩等のア
ニオン界面活性剤があり、両性イオン界面活性剤の！、
１！ｌとしてはアルキルヘタイン等があげられるが、こ
れらの例に限定されるものではない。なお本発明で用い
る界面活性剤は通常１種類で良いが、２種類以上を併用
して用いることもできる。また、本発明で用いる界面活
性剤の濃度は反応条件により一概に限定されないが、通
常は０．００１〜４０ｗ　／　ｖ％、好ましくは０．０
０２〜２０　ｗ／　ｖ％を用いることができる。

本発明の方法はＳ　Ｈ−Ｓ　Ｓ交換反応によるＳＨ基の
定量において、内因性Ｓ　Ｈ化合物による非特異反応を
防止するために、まずＳＳ化合物と内因性ＳＨ化合物と
を反応させて非特異反応を除去するに際して、当該反応
を界面活性剤の存在下に行うものである。かくして、当
該反応は検体や添加した界面活性剤によりやや異なるが
、反応の短い場合ではほとんど瞬時にその反応を終了さ
せろことができる。

上記の反応で非特異反応を除去した後、本来のＳＨ基の
定量が行われる。たとえば、生体内酵素による基質の分
解によって生成したＳＨ化合物を定量して生体内酵素を
定量する場合を例にとる。

まず、上述の反応で非特異反応を除去された検体中に７
３質をいれると、基質は当該酵素によって分解されてＳ
Ｈ化合物を生成するが、このＳＨ化合物はＳＳ化合物と
５Ｈ−５Ｓ交換反応を起こしてＳＳ化合物のＳＳ結合が
切断される。かくして生したチオール化合物を定量すれ
ば、基質の分解によって生じたＳＨ化合物ひいては生体
内の酵素を定量することが出来る。かくして、内因性Ｓ
Ｉ＋化合物による非特異反応を伴わない、正確なＳＨ基
の迅速な定量が可能となる。

本発明において、その定量の目的とされるＳｔ（基を有
するＳＨ化合物には、特に限定はないが、好ましくは臨
床検査において、生体内における酵素などの作用で基質
から遊離した３１（化合物が例示され、具体的には、ア
セチルチオコリンハライド、ブチリルチオコリンハライ
ド、２，３−ジメトキシベンゾイルチオコリンハライド
、イソブチリルチオコリンハライド、シクロヘキサンカ
ルボニルチオコリンハライド、プロピオニルチオコリン
ハライド、サクシエルチオコリンハライド、２゜３−ジ
メルカプトプロパン−１−オール、トリブチロエイトな
どが例示される。ここに生体内における酵素としては、
たとえばコリンエステラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ
などが例示される。従って、本発明における検体として
は、体液、ながでも血液、特に血ｌ＃や血漿、及び尿な
どが代表的なものとして例示される。

また、本発明で使用されるＳＳ化合物としては、たとえ
ば上述したＳ　Ｈ化合物とＳ　Ｉ（−Ｓ　Ｓ交換反応を
起こすもの、たとえばＤＴＮＢ、２．２’−ジチオジピ
リジン、４．４′−ジチオジピリジン、６．６′−ジチ
オジピリジンなどが例示される。

〔発明の作用・効果〕

本発明により、内因性ＳＨ化合物とＳＳ化合物との反応
をごく短時間に終了させることができるので、定量を目
的とするＳ　Ｈ化合物との反応を短時間で開始させるこ
とができる。たとえば、検体中の酵素コリンエステラー
ゼの作用で基質から遊離したＳ　Ｈ化合物を定量し、該
酵素の活性を測定する場合、従来は先に述べたように検
体中の内因性Ｓ　Ｈ化合物との反応に長時間を要するた
め、自動分析装置には応用できないか、あるいは無理に
応用した場合は特異性が低くなる問題があった。

それが本発明では内因性Ｓ　Ｈ化合物との反応をごく短
時間に終了させることができることから、自動分析装置
でコリンエステラーゼをその特異性を低くすることなく
測定することが可能となった。

特に近年臨床検査は高速の自動分析装置が背反し、より
迅速な方法が要求されているため、本発明は臨床検査に
広く汎用できる方法として有用なものである。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例
に限定されるものではない。

実施例１ ＤＴＮＢを１５■／ｄ！含む１００ｄ）リス緩衝？＆（
ｐＨ８，０）にそれぞれ界面活性剤としてポリオキシエ
チレンアルキルフェノールエーテル系の商品名：Ｈ５−
２４０（日本油脂（Ｉ鳶製品〕、ポリオキシエチレンア
ルキルフェニルエーテル系の商品名：　　Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１００（片山化学９ｍ製品〕、第２級直鎮アルコ
ールエトキシレート系の商品名ニアデカトールＳｏ−＋
６０（旭電化工業■製品〕、アルキル硫酸エステル塩系
のラウリル硫酸ナトリウム、アルキルベタイン系の商品
名：アンヒトール２４Ｂ〔花王アトラス０荀製品〕をＩ
ｇ／ｄ！添加する。これをそれぞれ２．５ｍｌとり、更
に検体として血清を３例準θｍし、各０．１ｍｌをそれ
ぞれ添加して反応させ、反応温度３７℃で波長４１２ｎ
ｍにおける喚光度をチエツクして反応の開始から終了ま
での反応所要時間を調べた。その結果は表１のようにな
り、いずれも１分間以内で反応が終了することがわかっ
た。なお、界面活性剤を添加しない場合は２０分間程度
反応が持続した。

（以下余白） 表１ 数値は反応所要時間（分）を示す。

＊はほとんど瞬時に反応が終了する。

実施例２ 実施例１で用いた界面活性剤ＨＳ　−２４０についてそ
の添加濃度を変化させ、実施例１と同様に操作して反応
所要時間を調べた。その結果は表２のようになり、添加
濃度０．０５Ｗ／Ｖ％から反応所要時間の短縮が認めら
れ、特に１．Ｑｗ／ｖ％を越えると非常に短い時間で反
応が終了することがわかった。

表２ 表１と同様数値は反応所要時間（分）を示す。

＊はほとんど瞬時に反応が終了する。

実施例３ ＤＴＮＢを１２■／ｄＩ含む１００１１Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ８，０）に界面活性剤ＭＳ−２４０をＩｇ／ａ添
加する。（なお対照として界面活性剤を添加しないもの
を準備し以下同様に操作する。）これを２．４ｍｌとり
、これに検体として血清１０例を０゜１１それぞれ添加
し、３７℃で５分間加温する。

更に２．３−ジメトキシベンゾイルチオコリンヨーダイ
ドを０．２５ｇ／ａ含む水溶液を０．５ｍ１７ＪＩＩｔ
て波長４１２ｎｍにおける吸光度の上昇を測定した後、
それぞれについてあらかじめ得られた検量線からコリン
エステラーゼの活性値に換算した。その結果は表３のよ
うになり、界面活性剤を無添加の場合のほうがすべて高
値を示し、検体中の内因性ＳＨ化合物の影響を受けてい
ることが示唆された。

（以下余白） 表３ 数値はコリンエステラーゼ活性値（１０／　１　）を示
す。

実施例４ 実施例３で用いた血清のうち３例（覧１〜３）について
それぞれ検体中の内因性ＳＨ化合物の歴をｆｆ１１１定
し、それをコリンエステラーゼの活性値に換算した（検
体ブランク）。ずなわち、ＤＴＮＢを１２ｔｔｗ／ｄｌ
含むｌｏＯｍＭトリスＫｉ　１１７ｅｊ、　（ｐＨ８，
Ｏ）を２．４ｍｌとり、検体として血清（覧１〜３）を
０．１ｍｌそれぞれ添加し、３７゛Ｃで３０分間加温す
る。

更に精製水を０．５１加えて波長４１２ｎｍにおける吸
光度の上昇を測定した後、それぞれについてあらかじめ
得られた検量線からコリンエステラーゼの活性値に換算
した。その結果は表４のようになり、実施例３で界面活
性剤を無添加の場合の値からこの検体ブランク値を差し
引くと、界面活性剤を添加した場合の値とほとんど一致
することがわかった。このことから、本発明の方法はコ
リンエステラーゼの活性値の測定に際して、検体中の内
因性Ｓ　Ｈ化合物の影響を受けないことが認められ表１ 数値はコリンエステラーゼ活性値（１０／　ｌ　）に相
当量を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＳＨ−ＳＳ交換反応によりＳＨ基を定量するＳＨ化合物
   の定量方法において、界面活性剤の存在下に、検体中に
   存在する非特異反応を生起する物質とＳＳ化合物とを反
   応させて非特異反応を除去する工程を含むことを特徴と
   するＳＨ化合物の定量方法。