JPS6264955A - 発色の安定化法 - Google Patents
発色の安定化法Info
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- JPS6264955A JPS6264955A JP60205685A JP20568585A JPS6264955A JP S6264955 A JPS6264955 A JP S6264955A JP 60205685 A JP60205685 A JP 60205685A JP 20568585 A JP20568585 A JP 20568585A JP S6264955 A JPS6264955 A JP S6264955A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は発色の安定化法、更に詳細には、ペルオキシダ
ーゼ活性を利用した２、７−ジアミノフルオレンの発色
反応において、当該発色反応を特定の発色安定化物質の
存在下で行うことＫよる発色の安定化法に関する。
ーゼ活性を利用した２、７−ジアミノフルオレンの発色
反応において、当該発色反応を特定の発色安定化物質の
存在下で行うことＫよる発色の安定化法に関する。
〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕ペル
オキシダーゼ活性を利用した発色系は、生化学的測定系
や、細胞の持つ内因性ペルオキシダーゼを利用した細胞
染色及び組織染色、さらに、ペルオキシダーゼ活性を持
つ酵素と抗体等のある椙の物質と親和性を有する物質と
の結合物を利用しての細胞染色や組織染色並びに酵素免
疫測定法等きわめて広範囲に用いられている。従って、
ペルオキシダーゼ活性の測定系も多くの方法が知られて
いる。ところが、細胞染色、組織染色において主に用い
られてきたベンチジンが発癌性を有することが明らかに
なり、厳しい使用規制を受けることとなったことから、
ペルオキシダーゼ染色に利用可能な新たな反応基質が求
められてきた。
オキシダーゼ活性を利用した発色系は、生化学的測定系
や、細胞の持つ内因性ペルオキシダーゼを利用した細胞
染色及び組織染色、さらに、ペルオキシダーゼ活性を持
つ酵素と抗体等のある椙の物質と親和性を有する物質と
の結合物を利用しての細胞染色や組織染色並びに酵素免
疫測定法等きわめて広範囲に用いられている。従って、
ペルオキシダーゼ活性の測定系も多くの方法が知られて
いる。ところが、細胞染色、組織染色において主に用い
られてきたベンチジンが発癌性を有することが明らかに
なり、厳しい使用規制を受けることとなったことから、
ペルオキシダーゼ染色に利用可能な新たな反応基質が求
められてきた。
このような経違の中から見い出された２、７−ジアミノ
フルオレンは、発癌性を有さないとされるペルオキシダ
ーゼ染色基質である。しかし、この２．７−ジアミノフ
ルオレンは、ペルオキシダーゼ活性によって次式に従っ
て反応が進行し、反応のごく初期にほんのわずかの間鮮
やかな青色を呈するが、その後、重合が進むに従って茶
褐色に変色するものである。
フルオレンは、発癌性を有さないとされるペルオキシダ
ーゼ染色基質である。しかし、この２．７−ジアミノフ
ルオレンは、ペルオキシダーゼ活性によって次式に従っ
て反応が進行し、反応のごく初期にほんのわずかの間鮮
やかな青色を呈するが、その後、重合が進むに従って茶
褐色に変色するものである。
従って、２，７−ジアミノフルオレンを利用する種々の
測定系においては、この液絡反応生成物であるフルオレ
ンブラウンの茶褐色で測定しなければならないが、この
茶褐色の色調は、吸光度測定時渚血によるヘモグロビン
やビリルビンの影響を受けることを避けられず、検体に
よっては測定値に定量性を求めることが困難な場合があ
った。
測定系においては、この液絡反応生成物であるフルオレ
ンブラウンの茶褐色で測定しなければならないが、この
茶褐色の色調は、吸光度測定時渚血によるヘモグロビン
やビリルビンの影響を受けることを避けられず、検体に
よっては測定値に定量性を求めることが困難な場合があ
った。
そこで、上記反応のごく初期の青色発色に注目し、もし
この発色を青色の１までとどめることができれば、茶褐
色よりもはるかに見易く、且つ前記ヘモグロビンやビリ
ルビンの影響も防止することができる。この考えに基づ
いて、上記反応液中に硫酸アルミニウムを加えることに
よって、発色、を青色にとどめる試みがなされている。
この発色を青色の１までとどめることができれば、茶褐
色よりもはるかに見易く、且つ前記ヘモグロビンやビリ
ルビンの影響も防止することができる。この考えに基づ
いて、上記反応液中に硫酸アルミニウムを加えることに
よって、発色、を青色にとどめる試みがなされている。
しかし、硫酸アルミニウムを利用する方法は、硫酸アル
ミニウムの添加により反応液が白濁するために、生化学
的測定系や酵素免疫測定系のような溶液系での測定系に
おいて吸光度測定が不可能であることから利用できず、
わずかに細胞染色の分野において利用できるにすぎない
ものであった。
ミニウムの添加により反応液が白濁するために、生化学
的測定系や酵素免疫測定系のような溶液系での測定系に
おいて吸光度測定が不可能であることから利用できず、
わずかに細胞染色の分野において利用できるにすぎない
ものであった。
従って、細胞染色の分野のみならず、生化学的測定系や
酵素免疫測定系のような溶液系においても利用可能なペ
ルオキシダーゼ活性を利用した２゜７−ジアミノフルオ
レンの発色反応における発色の安定化方法の開発が望ま
れていた。
酵素免疫測定系のような溶液系においても利用可能なペ
ルオキシダーゼ活性を利用した２゜７−ジアミノフルオ
レンの発色反応における発色の安定化方法の開発が望ま
れていた。
かかる実状において本発明者らは、鋭意検討を重ねたと
ころ、ペルオキシダーゼ活性を利用した２、７−ジアミ
ノフルオレンの発色反応において、当該反応を特定の発
色安定化物質の存在下で行えば、きわめて容易かつ効果
的にこの発色を青色のままとどめることができ、反応液
の白濁も生じないことを見い出し、本発明を完成した。
ころ、ペルオキシダーゼ活性を利用した２、７−ジアミ
ノフルオレンの発色反応において、当該反応を特定の発
色安定化物質の存在下で行えば、きわめて容易かつ効果
的にこの発色を青色のままとどめることができ、反応液
の白濁も生じないことを見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明はベルオキシタ゛−ゼ活性を利用した
２、７−ジアミノフルオレンの発色反応において、該反
応を次の一般式（１） ％式％（１） （式中、Ｒは有機基を、Ａは酸素原子を、Ｍは水素原子
、アルカリ金属、ＮＨ，又はトリエタノールアミンを、
ｎＦｉｏ又は１の数を示す）で表わされる発色安定化物
質の存在下で行うことを特徴とする、発色の安定化法に
関する。
２、７−ジアミノフルオレンの発色反応において、該反
応を次の一般式（１） ％式％（１） （式中、Ｒは有機基を、Ａは酸素原子を、Ｍは水素原子
、アルカリ金属、ＮＨ，又はトリエタノールアミンを、
ｎＦｉｏ又は１の数を示す）で表わされる発色安定化物
質の存在下で行うことを特徴とする、発色の安定化法に
関する。
本発明で用いる一般式（Ｉ）の発色安定化物質としては
、Ｒが広い範囲の有機基のものが使用されるが、その好
ましい具体例としては次の■〜（８） Ｋ示す化合物が
挙げられる。これらは、単独あるいは二種以上混合して
用いることができる。
、Ｒが広い範囲の有機基のものが使用されるが、その好
ましい具体例としては次の■〜（８） Ｋ示す化合物が
挙げられる。これらは、単独あるいは二種以上混合して
用いることができる。
Ｕ）式（ＩＩ）で表わされるアルキル（又はアルケニル
）スルホン酸又はその塩 （式中、Ｒ１％ Ｒ２及びＲ３は水素原子、または炭素
数が１−２５のアルキル若しくはアルケニル基であるが
、少なくとも一つは炭素数５−２５である。Ｍは水素原
子、アルカリ金属、ＮＨ４、トリエタノールアミンであ
る。）■ 式（Ｉｌｌ）で表わされるアルキル（又はア
ルケニル）ベンゼンスルホン酸又ｔｆ−’ｔの塩ｐ。
）スルホン酸又はその塩 （式中、Ｒ１％ Ｒ２及びＲ３は水素原子、または炭素
数が１−２５のアルキル若しくはアルケニル基であるが
、少なくとも一つは炭素数５−２５である。Ｍは水素原
子、アルカリ金属、ＮＨ４、トリエタノールアミンであ
る。）■ 式（Ｉｌｌ）で表わされるアルキル（又はア
ルケニル）ベンゼンスルホン酸又ｔｆ−’ｔの塩ｐ。
（式中、Ｒ１，８１％Ｒ３及び、Ｍは前記と同じ。）（
３） 式（ＩＶ）で表わされるアルキル（又はアルケ
ニル）硫酸又はその塩 Ｒｓ Ｃ−０−ＳＯ３Ｍ・・・・・・（■）１式中、
８１％Ｒ３、Ｒ３及び、Ｍは前記と同じ。）（４）式（
Ｖ）で表わされるアルキル（又はアルケニル）芳香族ス
ルホン酸又はその塩 （式中、Ｒ１、Ｒ１％ Ｒ１及び、Ｍは前記と同じ。）
（５）式（Ｍ）で表わされるジアルキル（又はアルケニ
ル）スルホコハク酸エステル又はその塩Ｒａ０ＣＯＣＨ
ｚ ＲｓＯＣＯＣＨ８ＯｓＭ −−（Ｍ） （式中、Ｒ４及びＲ，は水素原子または炭素数１−２５
のアルキル若しくはアルケニル基であるが少なくとも一
つは炭素数５−２５である。
３） 式（ＩＶ）で表わされるアルキル（又はアルケ
ニル）硫酸又はその塩 Ｒｓ Ｃ−０−ＳＯ３Ｍ・・・・・・（■）１式中、
８１％Ｒ３、Ｒ３及び、Ｍは前記と同じ。）（４）式（
Ｖ）で表わされるアルキル（又はアルケニル）芳香族ス
ルホン酸又はその塩 （式中、Ｒ１、Ｒ１％ Ｒ１及び、Ｍは前記と同じ。）
（５）式（Ｍ）で表わされるジアルキル（又はアルケニ
ル）スルホコハク酸エステル又はその塩Ｒａ０ＣＯＣＨ
ｚ ＲｓＯＣＯＣＨ８ＯｓＭ −−（Ｍ） （式中、Ｒ４及びＲ，は水素原子または炭素数１−２５
のアルキル若しくはアルケニル基であるが少なくとも一
つは炭素数５−２５である。
Ｍは前記と同じ。）
（６）式（■）で表わされるポリオキシエチレンアルキ
ル（又はアルケニル）エーテル硫酸又はその塩 ＲｓＯ（ＣＨｚＣＨｘＯ）ｍＳＯｓＭ ・・・・・・
（■）（式中、ａＳは水素原子、または炭素数が５−２
５のアルキル若しくはアルケニル基であり、ｍは、１−
２０の正の整数である。Ｍは前記と同じ。） （７）式（■）で表わされるポリオキシエチレンアルキ
ル（又ハアルケニル）フェニルエーテル硫酸またはその
塩 （式中、−及びｍは前記と同じ。） （０式（Ｘ）で表わされるナフタリンホルマリン縮合物
のスルホン酸又はその塩 （式中、Ｍ及びｍＦｉ前記と同じ。） 本発明に用いられるペルオキシダーゼとしては、２．７
−ジアミノフルオレンと過酸化水素の反応を触媒する能
力を有していればよく、その起源は制限されず、動物及
び植物組織由来の各種のものが挙げられる。また、ペル
オキシダーゼは、その活性を発現しうる状態のものであ
ればよく、例えば抗原、抗体、抗原抗体複合体等圧結合
している形態でも、更にそれが種々の担体に担持された
形態でも使用可能である。
ル（又はアルケニル）エーテル硫酸又はその塩 ＲｓＯ（ＣＨｚＣＨｘＯ）ｍＳＯｓＭ ・・・・・・
（■）（式中、ａＳは水素原子、または炭素数が５−２
５のアルキル若しくはアルケニル基であり、ｍは、１−
２０の正の整数である。Ｍは前記と同じ。） （７）式（■）で表わされるポリオキシエチレンアルキ
ル（又ハアルケニル）フェニルエーテル硫酸またはその
塩 （式中、−及びｍは前記と同じ。） （０式（Ｘ）で表わされるナフタリンホルマリン縮合物
のスルホン酸又はその塩 （式中、Ｍ及びｍＦｉ前記と同じ。） 本発明に用いられるペルオキシダーゼとしては、２．７
−ジアミノフルオレンと過酸化水素の反応を触媒する能
力を有していればよく、その起源は制限されず、動物及
び植物組織由来の各種のものが挙げられる。また、ペル
オキシダーゼは、その活性を発現しうる状態のものであ
ればよく、例えば抗原、抗体、抗原抗体複合体等圧結合
している形態でも、更にそれが種々の担体に担持された
形態でも使用可能である。
本発明を実施するＫは、２．７−ジアミノフルオレンと
過酸化水素との反応をペルオキシダーゼを用いて反応さ
せる際に、発色安定化物質（＋）を添加せしめることに
より行なわれる。
過酸化水素との反応をペルオキシダーゼを用いて反応さ
せる際に、発色安定化物質（＋）を添加せしめることに
より行なわれる。
反応条件、すなわち、緩衝液の種類、濃度及びそのｐＨ
等には、特に制限はなく、自体公知の通常の条件を用い
ることができる。発色安定化物質（１）の添加は、反応
の開始と同時かあるいはそれより前が好ましいが、反応
液が青色を呈している間ならば多少遅れても効果が発揮
される。添加量は、使用する発色安定化物質（１）の種
類によって異なるが、通常反応系終濃度としてｏ、 ｏ
ｏ ｓ〜０．５ｗ／ｖチが好ましい。添加方法は、発
色反応の形態によって適宜選択することができ、生化学
的測定系や酵素免疫測定系のような溶液系の場合には、
精製水、緩衝液等に溶解したものを反応系に添加するの
が好ましいが、固体又は原液のまま添加しても効果が得
られる。細胞染色や組織染色のための反応系の場合には
、２，７−ジアミノフルオレン基質液中に溶解して用い
るのが好適でおる。また、試験紙による簡易検査又は後
記実施例２及び３のようにドライ試薬を毛細管中につめ
て実施する検査等のドライケミストリーの分野で用いる
場合には、発色安定化物質（１）として常温で固体のも
のを選択して直接用いるか、又は支持体にそのまま若し
くＦｉ溶液として接触させてから乾燥することにより保
持させて用いるのが好ましい。更には、発色後の検出反
応に用いる希釈液、反応液、基質液等に加えて用いるこ
ともできる。
等には、特に制限はなく、自体公知の通常の条件を用い
ることができる。発色安定化物質（１）の添加は、反応
の開始と同時かあるいはそれより前が好ましいが、反応
液が青色を呈している間ならば多少遅れても効果が発揮
される。添加量は、使用する発色安定化物質（１）の種
類によって異なるが、通常反応系終濃度としてｏ、 ｏ
ｏ ｓ〜０．５ｗ／ｖチが好ましい。添加方法は、発
色反応の形態によって適宜選択することができ、生化学
的測定系や酵素免疫測定系のような溶液系の場合には、
精製水、緩衝液等に溶解したものを反応系に添加するの
が好ましいが、固体又は原液のまま添加しても効果が得
られる。細胞染色や組織染色のための反応系の場合には
、２，７−ジアミノフルオレン基質液中に溶解して用い
るのが好適でおる。また、試験紙による簡易検査又は後
記実施例２及び３のようにドライ試薬を毛細管中につめ
て実施する検査等のドライケミストリーの分野で用いる
場合には、発色安定化物質（１）として常温で固体のも
のを選択して直接用いるか、又は支持体にそのまま若し
くＦｉ溶液として接触させてから乾燥することにより保
持させて用いるのが好ましい。更には、発色後の検出反
応に用いる希釈液、反応液、基質液等に加えて用いるこ
ともできる。
本発明によって２．７−ジアミノフルオレンによる発色
は通常青色に安定化されるが、添加物質の稽類によって
は多少緑色又は紫色を帯びる場合がある。このため吸収
スペクトルにおいて極大を示す波長が多少前後にシフト
することはあるが６２０１ｍ付近の明瞭な極大吸収が消
失することはない。また肉眼的に発色の強さが低下する
場合であっても極大吸収が明瞭に存在する。従って、こ
の場合にも、何ら本発明の効果に影響はなく、６２０ｎ
ｍ付近の吸光度を測定することにより、ペルオキシダー
ゼ活性を利用した種々の測定法が実施できる。
は通常青色に安定化されるが、添加物質の稽類によって
は多少緑色又は紫色を帯びる場合がある。このため吸収
スペクトルにおいて極大を示す波長が多少前後にシフト
することはあるが６２０１ｍ付近の明瞭な極大吸収が消
失することはない。また肉眼的に発色の強さが低下する
場合であっても極大吸収が明瞭に存在する。従って、こ
の場合にも、何ら本発明の効果に影響はなく、６２０ｎ
ｍ付近の吸光度を測定することにより、ペルオキシダー
ゼ活性を利用した種々の測定法が実施できる。
本発明によって、ペルオキシダーゼ活性を利用した発色
系による生化学的測定系、細胞染色、組織染色、酵素免
疫測定法等の分野において、従来その発色が茶褐色であ
ったために測定値に重大な影響を与えていたヘモグロビ
ンやビリルビンの影響を全く受けずに、容易かつ正確に
これらの測定・染色をすることが可能となった。特に本
発明は定量性が要求される生化学的測定系、酵素免疫測
定法の分野において有用であり、現在すでに商品化され
ている２、７−ジアミノフルオレンを使用したペルオキ
シダーゼ活性を持つ酵素を利用した乾式チップなどによ
る生化学的測定系や、現在開発が進んでいる免疫反応を
利用した乾式チップでの測定系においてもその有効性が
大いに発揮される。
系による生化学的測定系、細胞染色、組織染色、酵素免
疫測定法等の分野において、従来その発色が茶褐色であ
ったために測定値に重大な影響を与えていたヘモグロビ
ンやビリルビンの影響を全く受けずに、容易かつ正確に
これらの測定・染色をすることが可能となった。特に本
発明は定量性が要求される生化学的測定系、酵素免疫測
定法の分野において有用であり、現在すでに商品化され
ている２、７−ジアミノフルオレンを使用したペルオキ
シダーゼ活性を持つ酵素を利用した乾式チップなどによ
る生化学的測定系や、現在開発が進んでいる免疫反応を
利用した乾式チップでの測定系においてもその有効性が
大いに発揮される。
次に本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
実施例１
（基質液）
０．２Ｍ リン酸緩衝液 （ｐＨ６，５’） ５０
ｍ１２．７−ジアミ／ フルオレン（ｌ ＱＩ９／
ｍｌ ） ０．３ｍ１３％ 過酸化水素
５０ μｔ（試験方法） 市販のマイクロプレート穴に、基質液２５０μｔを分注
し、それぞれに１表１に記載した各発色安定化物質３０
ｐｔを終濃度で０．０１ ｗ、Ａ ％ 。
ｍ１２．７−ジアミ／ フルオレン（ｌ ＱＩ９／
ｍｌ ） ０．３ｍ１３％ 過酸化水素
５０ μｔ（試験方法） 市販のマイクロプレート穴に、基質液２５０μｔを分注
し、それぞれに１表１に記載した各発色安定化物質３０
ｐｔを終濃度で０．０１ ｗ、Ａ ％ 。
０、１ Ｗ／Ｖ％、 １． Ｑ ｗ／ｖ％（以下、単に
チと略記する）となるように加え、続いて精製水を１０
μを加えて試験液とした。
チと略記する）となるように加え、続いて精製水を１０
μを加えて試験液とした。
次に、それぞれに、ペルオキシダーゼ量トして５ｎｆの
ペルオキシダーゼ標繊抗人絨毛性ゴナドトロピンｃ以下
、ｈＣＧと略記する）抗体またはペルオキシダーゼを加
え、発色を惹起し、現れた青色発色の茶褐色への変色を
観察し、下記判定基準に従い判定した。
ペルオキシダーゼ標繊抗人絨毛性ゴナドトロピンｃ以下
、ｈＣＧと略記する）抗体またはペルオキシダーゼを加
え、発色を惹起し、現れた青色発色の茶褐色への変色を
観察し、下記判定基準に従い判定した。
（結果）
その結果を表１の判定の欄に示したが、これは、０．０
１％、０．１％、 １％（Ｄ、３点で検討したうち、最
も効果の大きかった１点についてのみ、記載した。
１％、０．１％、 １％（Ｄ、３点で検討したうち、最
も効果の大きかった１点についてのみ、記載した。
なお、ペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体とペルオキシ
ダーゼとでは、全く同じ結果を示した。
ダーゼとでは、全く同じ結果を示した。
この結果より、本発明における発色安定化物質が溶液系
において、２，７−ジアミノフルオレンの青色発色から
茶褐色への変色防止に有効なことは明らかである。
において、２，７−ジアミノフルオレンの青色発色から
茶褐色への変色防止に有効なことは明らかである。
判定基準
一：青色から茶褐色への変色が、２０分以内に完了した
もの。
もの。
士：青色から茶褐色への変色が、２時間以内に完了した
もの。
もの。
＋：青色から茶褐色への変色が、２時間以上、２４時間
以以内光了したもの。
以以内光了したもの。
丑＝２４時間後においても青色を呈していたもの。
＋ｌ＋：２４時間後において、最初と全く変わらない鮮
やかな青色を保持していたもの。
やかな青色を保持していたもの。
表１
※；終濃度で０．１９６
＊秦； Ｉ Ｏ，０１％
′実施例２
（測定用毛細管の作製）
内径１謔、長さ１０譚の毛細管の末端から■４１ｊまで
ポリエステル繊維を詰め、順次、■２，７−ジアミノフ
ルオレン混合ガラスピーズ４ｍ、■牛血清アルブミン（
以下、ＢＳＡと略記する）混合ガラスピーズ８ｉｍ、■
ペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体混合ガｙ スヒーＸ
８ ｘｘ ＊ ｏＢ、Ｓ 入処理カラスビーズ８謔、
■抗ｈＣＧ抗体固定化ガラスピーズ４關、そして、■残
りに未処理ガラスピーズを詰め、最後の４ｍＶＣ再び■
ポリエステル繊維を詰めて、図１の測定用ガラス毛細管
を作製する。
ポリエステル繊維を詰め、順次、■２，７−ジアミノフ
ルオレン混合ガラスピーズ４ｍ、■牛血清アルブミン（
以下、ＢＳＡと略記する）混合ガラスピーズ８ｉｍ、■
ペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体混合ガｙ スヒーＸ
８ ｘｘ ＊ ｏＢ、Ｓ 入処理カラスビーズ８謔、
■抗ｈＣＧ抗体固定化ガラスピーズ４關、そして、■残
りに未処理ガラスピーズを詰め、最後の４ｍＶＣ再び■
ポリエステル繊維を詰めて、図１の測定用ガラス毛細管
を作製する。
（押上液のｖ４！り
過酸化水系をＯ，ＯＯ３％含んだ、０．２ Ｍ ’Ｊン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）に、表１に記載した、各発色安
定化物質を終濃度で、０．１％となるように加えて、押
上液とする。
酸緩衝液（ｐＨ６，５）に、表１に記載した、各発色安
定化物質を終濃度で、０．１％となるように加えて、押
上液とする。
（検体の調［）
健康非妊婦尿に、ｈＣＧを２０ ＩＵＡＩとなるように
溶解し、検体を調製する。
溶解し、検体を調製する。
（試験方法）
検体７μｔを、測定用毛細管に毛細管現象によ）吸入し
、直ち罠、各発色安定化物質を含んだ押上液を用いて押
し上げ、約１０分後Ｋ、抗ｈＣＧ抗体固定化ガラスピー
ズの部分への青色の着色を観察した。
、直ち罠、各発色安定化物質を含んだ押上液を用いて押
し上げ、約１０分後Ｋ、抗ｈＣＧ抗体固定化ガラスピー
ズの部分への青色の着色を観察した。
（結果）
その結果を、表１の判定の欄に示した。この結果よシ、
本発明における発色安定化物質が、固相に固定化された
状態の酵素による２、７−ジアミノフルオレンの青色発
色の茶褐色への変色を防止することが明らかである。
本発明における発色安定化物質が、固相に固定化された
状態の酵素による２、７−ジアミノフルオレンの青色発
色の茶褐色への変色を防止することが明らかである。
実施例３
（測定用毛細管の作製）
内径１ ｗｇ 、長さ１０譚の毛細管の末端から■４Ｕ
までポリエステル繊維を詰め、順次■ラウリル硫酸す）
ＩＪウム（以下、ＳＤＳと、略記する）混合ガラスピ
ーズ４ｍ、■２，７−ジアミノフルオレン混合ガラスピ
ーズ４ ｗｔ 、■ＢＳＡ混合ガラスピーズ４關、■ペ
ルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体混合ガ２スビーズ８ｍ
ｔ■ＢＳＡ処理ガラスピーズ８ ｍ 、■抗ｈＣＧ抗体
固定化ガラスピーズ４鵡、そして、残ｆｉＫ■未処理ガ
ラスピーズを詰め、最後の４ｍに再び■ポリエステル繊
維を詰めて、匣２の測定用ガラス毛細管を作製する。寿
お対照としては、ＳＤＳ混合ガラスピーズの代わシに、
■ＢＳＡ処理したガラスピーズを充填する（図３）。
までポリエステル繊維を詰め、順次■ラウリル硫酸す）
ＩＪウム（以下、ＳＤＳと、略記する）混合ガラスピ
ーズ４ｍ、■２，７−ジアミノフルオレン混合ガラスピ
ーズ４ ｗｔ 、■ＢＳＡ混合ガラスピーズ４關、■ペ
ルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体混合ガ２スビーズ８ｍ
ｔ■ＢＳＡ処理ガラスピーズ８ ｍ 、■抗ｈＣＧ抗体
固定化ガラスピーズ４鵡、そして、残ｆｉＫ■未処理ガ
ラスピーズを詰め、最後の４ｍに再び■ポリエステル繊
維を詰めて、匣２の測定用ガラス毛細管を作製する。寿
お対照としては、ＳＤＳ混合ガラスピーズの代わシに、
■ＢＳＡ処理したガラスピーズを充填する（図３）。
（押上液の調製）
過酸化水素を０．００３％含んだ、０．２ Ｍ リン酸
緩衝液（ｐＨ６，５）を調製する。
緩衝液（ｐＨ６，５）を調製する。
（検体の調製）
健康非妊婦尿に、ｈＣＧを１．０ ＩＵ／ｆｎｌ 、
５．０ＩＵＡＩ 、 １０ ＩＵ／ｆｎｌ 、 ２０
ＩＵＡＩとなるように溶解し、検体を調製する。なお、
０ ’ＩＵ／Ｆｎｌとしては、健康非妊婦尿を用いた。
５．０ＩＵＡＩ 、 １０ ＩＵ／ｆｎｌ 、 ２０
ＩＵＡＩとなるように溶解し、検体を調製する。なお、
０ ’ＩＵ／Ｆｎｌとしては、健康非妊婦尿を用いた。
（試験方法）
検体７μｔを、測定用毛細管に毛細管現象により吸入し
、直ちに、押上液を用いて押し上げ、抗ｈＣＧ抗体固定
化ガラスピーズの部分への青色の着色を観察することに
より、検体中のｈＣＧの有無を下記基準によシ判定した
。
、直ちに、押上液を用いて押し上げ、抗ｈＣＧ抗体固定
化ガラスピーズの部分への青色の着色を観察することに
より、検体中のｈＣＧの有無を下記基準によシ判定した
。
判定基準
−陰性
± 擬陽性
＋ｌ！＃ｌ性
丑 強陽性
（結果）
その結果を、表２の判定の項に示した。
この結果より、ＳＤＳによって２，７−ジアミノフルオ
レンの青色発色の茶褐色への変色が防止されると同時に
検体中のｈＣＧの検出限界も約性が示された。
レンの青色発色の茶褐色への変色が防止されると同時に
検体中のｈＣＧの検出限界も約性が示された。
表２
実施例４
（試薬）
実施例１の基質液を用いた。
（酵素溶液の調製）
ペルオキシダーゼ（シグマ： ３３０ ＵＡ）１．５５
■を、０．０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，２）３
１ ｔｎｌ Ｋ溶解したものを、ＢＳＡを１％含む０、
ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）で、１００倍に
希釈し５００ ｎ２７ｍｌ酵素溶液とする。
■を、０．０１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，２）３
１ ｔｎｌ Ｋ溶解したものを、ＢＳＡを１％含む０、
ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）で、１００倍に
希釈し５００ ｎ２７ｍｌ酵素溶液とする。
（各種発色安定化物質の水？Ｉ液）
ペレックスＮＢ−Ｌ（花王石ケン）、ラウリル硫酸ナト
リウム、ペレックスＯＴＰ （花王石ケン）。
リウム、ペレックスＯＴＰ （花王石ケン）。
ドデシルベンゼン、スルホン酸ナトリウムの１０％。
１％、０．１％、０．０１チ水溶液を調製する。
（実験り
基質液２．５ ｍｌに精製水１００μを及び各濃度の発
色安定化物質３００μｔを加え、日立２２０Ａ型ダブル
ビ一ム分光光度計（条件：３７℃、攪拌）にセットし、
酵素溶液１００μｔを加え、その後の６２０ｎｍでの吸
光度の変化を記録する。対照としては発色安定化物質の
代わりに精製水を３００μを加えた。
色安定化物質３００μｔを加え、日立２２０Ａ型ダブル
ビ一ム分光光度計（条件：３７℃、攪拌）にセットし、
酵素溶液１００μｔを加え、その後の６２０ｎｍでの吸
光度の変化を記録する。対照としては発色安定化物質の
代わりに精製水を３００μを加えた。
（実験■）
実験■と同様の方法でセットする。
酵素溶液１００μｔを加えてから、３０秒後（対照につ
いてのみ）、５分後、１時間後、２時間後の７ＱＱｎｍ
から３５０ｎｍまでの吸収スペクトルを記録した。
いてのみ）、５分後、１時間後、２時間後の７ＱＱｎｍ
から３５０ｎｍまでの吸収スペクトルを記録した。
（結果）
各濃度で検討した中で、最も良い結果を、図４〜８に示
した。
した。
これらの結果から、発色安定化物質を利用することによ
シ、６２０ｒｌｒｎ付近に現れた極大吸収を長時間保持
できた。
シ、６２０ｒｌｒｎ付近に現れた極大吸収を長時間保持
できた。
図１、図２１図３は実施例２、実施例３、実施例３の対
照で使用した毛細管をそれぞれ示す図面でおる。 図４は、実施例４において発色安定化物質としてペレッ
クスＮ Ｂ −Ｌ （０，１％）を添加した場合の反応
液の吸収スペクトルを示す図面である。 図５は、実施例４において発色安定化物質としてラウリ
ル硫酸ナトリウム（０，０１％）を添加した場合の反応
液の吸収スペクトルを示す図面である。 図６は、実施例４において発色安定化物質としてペレッ
クスｏＴｐ（ｏ、ｏｔ％）を添加した場合の反応液の吸
収スペクトルを示す図面である。 図７は、実施例４において発色安定化物質としてドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム（０，０１チ）を添加
した場合の反応液の吸収スペクトルを示す図面である。 図８は、実施例４において発色安定化物質の代わりに精
製水を添加した場合の反応液の吸収スペクトルを示す図
面である。 ■ポリエステル繊維 ■２．７−ジアミノフルオレン混合ガラスピーズ ■ＢＳＡ混合ガラスピーズ ■ペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体混合ガラスピーズ ■ＢＳＡ処理ガラスピーズ ■抗ｈＣＧ抗体固定化ガラスビーズ ■未処理がラスビーズ ■ＳＤＳ混合ガラスピーズ 以上
照で使用した毛細管をそれぞれ示す図面でおる。 図４は、実施例４において発色安定化物質としてペレッ
クスＮ Ｂ −Ｌ （０，１％）を添加した場合の反応
液の吸収スペクトルを示す図面である。 図５は、実施例４において発色安定化物質としてラウリ
ル硫酸ナトリウム（０，０１％）を添加した場合の反応
液の吸収スペクトルを示す図面である。 図６は、実施例４において発色安定化物質としてペレッ
クスｏＴｐ（ｏ、ｏｔ％）を添加した場合の反応液の吸
収スペクトルを示す図面である。 図７は、実施例４において発色安定化物質としてドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウム（０，０１チ）を添加
した場合の反応液の吸収スペクトルを示す図面である。 図８は、実施例４において発色安定化物質の代わりに精
製水を添加した場合の反応液の吸収スペクトルを示す図
面である。 ■ポリエステル繊維 ■２．７−ジアミノフルオレン混合ガラスピーズ ■ＢＳＡ混合ガラスピーズ ■ペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＧ抗体混合ガラスピーズ ■ＢＳＡ処理ガラスピーズ ■抗ｈＣＧ抗体固定化ガラスビーズ ■未処理がラスビーズ ■ＳＤＳ混合ガラスピーズ 以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ペルオキシダーゼ活性を利用した２，７−ジアミノ
フルオレンの発色反応において、該反応を次の一般式（
I ） Ｒ−（Ａ）−＿ｎＳＯ＿３Ｍ（ I ） （式中、Ｒは有機基を、Ａは酸素原子を、Ｍは水素原子
、アルカリ金属、ＮＨ＿４又はトリエタノールアミンを
、ｎは０又は１の数を示す） で表わされる発色安定化物質の存在下で行うことを特徴
とする発色の安定化法。 ２、発色安定化物質が次の（１）〜（８）に示す化合物
より選ばれるものである特許請求の範囲第１項記載の発
色の安定化法。 （１）式（II）で表わされるアルキル（又はアルケニル
）スルホン酸又はその塩 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（II） （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２及びＲ＿３は水素原子、または
炭素数が１−２５のアルキル若しくはアルケニル基であ
るが、少なくとも一つは炭素数５−２５である。Ｍは水
素原子、アルカリ金属、ＮＨ＿４、トリエタノールアミ
ンである。） （２）式（III）で表わされるアルキル（又はアルケニ
ル）ベンゼンスルホン酸又はその塩 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（III
） （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３及び、Ｍは前記と同じ
。） （３）式（IV）で表わされるアルキル（又はアルケニル
）硫酸又はその塩 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（IV） （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３及び、Ｍは前記と同じ
。） （４）式（Ｖ）で表わされるアルキル（又はアルケニル
）芳香族スルホン酸又はその塩 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（Ｖ） （式中、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３及び、Ｍは前記と同じ
。） （５）式（VI）で表わされるジアルキル（又はアルケニ
ル）スルホコハク酸エステル又はその塩▲数式、化学式
、表等があります▼・・・・・・（VI） （式中、Ｒ＿４及びＲ＿５は水素原子または炭素数１−
２５のアルキル若しくはアルケニル基であるが少なくと
も１つは炭素数５−２５である。 Ｍは前記と同じ。） （６）式（VII）で表わされるポリオキシエチレンアル
キル（又はアルケニル）エーテル硫酸又はその塩 Ｒ＿６Ｏ（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｍＳＯ＿３Ｍ・・・
・・・（VII） （式中、Ｒ＿６は水素原子、または炭素数が５−２５の
アルキル若しくはアルケニル基であり、ｍは、１−２０
の正の整数である。Ｍは前記と同じ。） （７）式（VIII）で表わされるポリオキシエチレンアル
キル（又はアルケニル）フェニルエーテル硫酸またはそ
の塩 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（VII
I） （式中、Ｒ＿６及びｍは前記と同じ。） （８）式（IX）で表わされるナフタリンホルマリン縮合
物のスルホン酸又はその塩 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（IX） （式中、Ｍ及びｍは前記と同じ。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205685A JPS6264955A (ja) | 1985-09-18 | 1985-09-18 | 発色の安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205685A JPS6264955A (ja) | 1985-09-18 | 1985-09-18 | 発色の安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6264955A true JPS6264955A (ja) | 1987-03-24 |
| JPH0566120B2 JPH0566120B2 (ja) | 1993-09-21 |
Family
ID=16511003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205685A Granted JPS6264955A (ja) | 1985-09-18 | 1985-09-18 | 発色の安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6264955A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015519038A (ja) * | 2012-03-23 | 2015-07-09 | サーモディクス，インコーポレイティド | スルホン酸を含むインビトロの診断テスト用組成物および方法 |
-
1985
- 1985-09-18 JP JP60205685A patent/JPS6264955A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015519038A (ja) * | 2012-03-23 | 2015-07-09 | サーモディクス，インコーポレイティド | スルホン酸を含むインビトロの診断テスト用組成物および方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0566120B2 (ja) | 1993-09-21 |
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