DE3486052T2 - Verfahren zur unabaenderlichen bindung von proteinen auf polystyren-oberflaechen mit aufrechterhaltung ihrer biologischen wirksamkeit, derart erhaltene polystyren-oberflaechen und ihre verwendung. - Google Patents

Verfahren zur unabaenderlichen bindung von proteinen auf polystyren-oberflaechen mit aufrechterhaltung ihrer biologischen wirksamkeit, derart erhaltene polystyren-oberflaechen und ihre verwendung.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur irreversiblen Bindung von Proteinen an Polystyroloberflächen, Polystyrol sowie durch dieses Verfahren erhaltene Gegenstände und ihre Verwendung.
  • Die Immobilisierung von biologisch aktiven Proteinen wie Enzymen, Antikörpern, Antigenen findet weitgehende Verwendung für verschiedene Zwecke wie z. B. in Enzymreaktoren, bei der Affinitätschromatographie, bei der Immunadsorption, sowie bei Ligandentests mit Festphasentrennung.
  • Eine spezielle Anwendung ist die von immobilisierten Antigenen und Antikörpern auf dem Gebiet der Immuntests (z. B. RIA, ELISA, etc.) zur Phasentrennung bei heterogenen Systemen. Die heterogenen Immuntestsysteme umfassen einen oder mehrere Schritte, durch die eine Trennung zwischen gebundenen und ungebundenen Anteilen eines Analyten oder Reagenz erzielt wird. Bei dieser Bindung handelt es sich um Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen.
  • Die erforderliche Trennung kann in eleganter Weise dadurch erfolgen, daß man den entsprechenden Bindungspartner (den spezifischen Antikörper oder das spezifische Antigen) in reaktiver Form auf einer glatten makroskopischen Oberfläche irreversibel immobilisiert. Die Immobilisierung kann zum Beispiel auf der Innenwand des Reaktionsgefäßes oder auf einem mit der Reaktionsflüssigkeit bedeckten Kügelchen erfolgen.
  • Zur Vermeidung mechanischer Trennung z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren, was bei mikroskopisch verteilten Oberflächen (z. B. Latexen) nötig ist, und zur Verringerung der (im Falle von porösen Substanzen wie z. B. Gelen großen) Menge an noch anhaftender Reaktionsflüssigkeit wird einer glatten makroskopischen Oberfläche der Vorzug gegeben.
  • Mit einer adsorptiven Proteinschicht versehene Polystyroloberflächen haben bei der Festphasentrennung von Immuntestsystemen weitgehende Verwendung gefunden. Polystyrol bietet folgende Vorteile: - geringer Preis - klar, durchsichtig - verschiedenartige Reaktionsgefäße und Kügelchen im Handel erhältlich.
  • Der Hauptvorteil der Adsorptionsbeschichtung liegt in ihrer Einfachheit: eine Proteinlösung geeigneter Konzentration wird mit der Kunststoffoberfläche unter Proteinadsorptionsbedingungen eine gewisse Zeit, z. B. 3-16 Stunden, in Berührung gebracht, wonach die Proteinlösung entfernt und die Oberfläche gewaschen wird. Die Ausbeute beträgt bis zu 60% immobilisierten Proteins, wobei die Dichte in der Größenordnung von 1 ug Protein pro cm² liegt. Dem Vorteil eines einfachen Beschichtungsverfahrens stehen Nachteile bei der Anwendung gegenüber: bei Proteinen mit geringerem Bindungsvermögen wird eine ausreichende Beschichtungsdichte nur bei einem deutlichen Überschuß an Protein erzielt; unter den Testbedingungen (d. h. in Gegenwart anderer Proteine oder von Tween 20 zur Verhinderung unerwünschter, sich anschließender Adsorption) ist die Immobilisierung reversibel, oder man beobachtet einen Verlust an immobilisiertem Protein ("Ausbluten"), was bei dem Test störend wirken könnte.
  • Es wurden bereits Versuche zur Überwindung dieser Nachteile der adsorptiven Immobilisierung durch Einführung einer kovalenten Bindung mit der Kunststoffoberfläche unternommen. So wurden verschiedene Verfahren beschrieben, bei denen Glutardialdehyd als Kupplungsreagenz eingesetzt wird. Um welchen Mechanismus es sich hierbei handelt, ist noch unklar, und zwar insbesondere, ob die beobachteten Verbesserungen eine Folge der Beteiligung des Glutardialdehyd an der Bindung zu dem Kunststoffmaterial sind, oder ob sie durch Stabilisierung der biologisch aktiven Proteinkonfirmation mittels intramolekularer Brückenbildung verursacht werden.
  • Die veröffentlichte deutsche Patentanmeldung P 19 15 970 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes auf der Basis von aktiven Proteinverbindungen. Wie aus den Beispielen, insbesondere Beispiele 5, 7, 8 und 9 ersichtlich ist, werden die Proteinmoleküle polymerisiert oder gehärtet. Fixierung auf einem Trägermaterial findet nicht statt. Bei der Fixierung von Proteinpolymeren auf einen Träger handelt es sich um einen mechanischen Vorgang, bei dem zwischen dem Trägermaterial und den Proteinpolymeren keine chemische Reaktion stattfindet. Gemäß dem bekannten Verfahren müssen die brückenbildenden Verbindungen und das Protein gleichzeitig umgesetzt werden.
  • Gemäß der US-PS 41 18 349 werden eine wäßrige Suspension kolloider Polystyrolteilchen, ein Protein sowie eine aromatische Diazoniumverbindung miteinander umgesetzt. Zur Stabilisierung der entstehenden Suspension aus Protein-Polystyrol-Latexverbindungen muß Albumin als Stabilisator zugesetzt werden. Eine homogene Immobilisierung einer ausreichenden Menge an Proteinen auf glatten makroskopischen Polystyroloberflächen ist mit diesem Verfahren nicht möglich.
  • In der europäischen Patentanmeldung 00 08 682 werden ein Latexträgermaterial, an das eine Proteinsubstanz gebunden ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz beschrieben. Gemäß dem bekannten Verfahren wird Bisdiazobenzidin-2,2'-Disulfonsäure mit dem Latexmaterial und dann mit dem Protein umgesetzt. Das aus der zitierten Anmeldung bekannte Verfahren läßt sich nicht zur irreversiblen Bindung von Proteinen an eine Polystyroloberfläche verwenden, da die zu behandelnde Oberfläche gemäß dem bekannten Verfahren aktive Gruppen aufweisen muß.
  • Die nicht vorveröffentlichte deutsche Patentanmeldung P 32 10 080, die jedoch in Bezug auf Neuheit für den benannten Vertragsstaat Deutschland als Stand der Technik anzusehen ist, betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antistreptolysin-O-Latexreagenz. Gemäß diesem bekannten Verfahren wird das Protein auf dem Latex lediglich adsorbiert, wobei keine chemische Bindung zwischen dem Protein und dem Latex erzielt wird.
  • Außerdem wird zur Verbesserung der adsorptiven Bindung von Proteinen γ-Bestrahlung (Kobaltsterilisierung) von Polystyrolgegenständen verwendet, doch werden hierdurch die Preise im Handel erhältlicher Gegenstände beträchtlich erhöht.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein einfaches und preiswertes Verfahren zur irreversiblen Bindung von Proteinen an Polystyroloberflächen bei Aufrechterhaltung ihrer biologischen Aktivität zugänglich zu machen.
  • Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 erfüllt. Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden in Ansprüchen 2 bis 13 beansprucht.
  • Alkyl- oder Alkoxygruppen sind solche mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Methyl und Methoxy. Halogenatome sind Brom, Chlor und Fluor, vorzugsweise Chlor. Bevorzugte Bisdiazoniumverbindungen sind solche der allgemeinen Formel Ia
  • worin
  • R1a für ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Methoxygruppe und worin
  • R2a für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und worin
  • X für ein Halogenion oder Tetrafluorboration stehen.
  • Eine bevorzugte Verbindung der Formel Ia ist jene, bei der R1a für eine Methoxygruppe, R2a für ein Wasserstoffatom und X für Cl&supmin; oder BF&sub4;&supmin; stehen.
  • Wahlweise lassen sich die Bisdiazoniumverbindungen I oder Ia in anderen im Handel erhältlichen Formen, z. B. als Komplexe, einsetzen.
  • Die Polystyroloberflächen können in jeder beliebigen Form vorliegen; z. B. als Reaktionsgefäße, als Reagenzröhrchen, Bechergläser, Küvetten, Kolonnen, Mikrotiter- oder Mikrotestplatten, oder als Teile, z. B. Kügelchen, Stäbe, Scheiben oder Platten. Solche Polystyroloberflächen sind dem Fachmann wohl bekannt und leicht zugänglich.
  • Die Vorbehandlung (Aktivierung) wird unter Vorbehandlungsbedingungen durchgeführt, z. B. bei Temperaturen von etwa -5 bis etwa +30ºC, vorzugsweise 4-10ºC mit einer Aktivierungszeit von etwa 5 bis 60 Min. Die Konzentration der Bisdiazoniumverbindung beträgt im allgemeinen zwischen etwa 10&supmin;&sup5; und 10&supmin;¹ Mol pro Liter, vorzugsweise in einem Puffer mit einem pH von 6-8. Geeignete Salze wie NaCl, KJ oder NaJO&sub4; lassen sich zur Stabilisierung in stabilisierenden Mengen zugeben.
  • Vor der sich anschließenden Adsorption des Proteins werden die Polystyroloberflächen durch Waschen mit Puffer und/oder Wasser von nicht umgesetzter Bisdiazoniumverbindung gereinigt. Die Adsorption kann sofort anschließend an die Aktivierung oder mit einer Zeitverzögerung erfolgen.
  • Die sich anschließende Adsorption des Proteins wird unter Proteinadsorptionsbedingungen durch Inkubierung des Proteins, das z. B. durch Auflösen in einem Puffer mit einem pH von 6-8 auf eine Konzentration von etwa 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;³ g/ml, vorzugsweise 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup4; g/ml gebracht wird, während etwa 1 bis etwa 72 Stunden durchgeführt. Jedes beliebige Protein kann zum Einsatz kommen, z. B. Antikörper, Antigene, Hapten-Protein-Konjugate, antikörperbindende Proteine, zum Beispiel Staphylokokkenprotein-A oder Komplementärkomponente C1q, Enzyme und Lektine.
  • Die Polystyroloberfläche mit dem adsorbierten (immobilisierten) Protein läßt sich unmittelbar nach der Adsorption oder nach einer Lagerung für den gewünschten Zweck verwenden.
  • Durch die Aktivierung der Polystyroloberflächen erfolgt praktisch irreversible Bindung der Proteine, wodurch eine Erhöhung der Empfindlichkeit und eine Erniedrigung des Materialverbrauchs z. B. in Immuntests (kein Ausbluten) ermöglicht werden. Die Aktivierung führt besonders bei Durchführung eines anschließenden Trockenschrittes zu einer Stabilisierung der adsorbierten Proteine.
  • Die Polystyrolgegenstände lassen sich nach der Aktivierung oder nach der Proteinadsorption oder in Form eines Bestecks im Handel vertreiben. Bei Vertreibung in Form eines Bestecks enthält dieses neben dem Polystyrolgegenstand ein Reagenzglas oder eine Mikrotestplatte, andere übliche Komponenten, z. B. einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen sowie ein Nachweisreagenz für das Markierungsmittel, z. B. ein chromogenes Substrat.
  • Die Bisdiazoniumverbindungen I sind wohlbekannt, und ihre Herstellung erfolgt aus den entsprechenden Benzidinen nach bekannten Verfahren. (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Band 10/3, Seiten 1-212, insb. 46; Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, 4. Auflage Verlag Chemie Weinheim, Band 8, S. 356 ff).
  • Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken. Die Temperaturangaben erfolgen in ºC.
    • A. Allgemeine Arbeitsvorschrift
  • 1. Die Polystyroloberflächen werden bei 4º 30 Minuten lang vollständig mit einer Lösung von 0,001 Mol pro Liter FBS(BF&sub4;)&sub2; (FBS - Fast Blue 3 Salt (Echtblausalz) = Bis-diazotiertes o-Dianisidin) in 0,01 Mol pro Liter Natriumphosphatpuffer pH 6,8 unter Schutz gegen direktes Licht bedeckt. Nach Entfernung der FBS-Lösung wurden die Polystyrolgegenstände dreimal mit 0,01 Mol pro Liter Natriumphosphatpuffer gewaschen.
    • 2. Proteinadsorption
  • Die gemäß 1. vorbehandelten Polystyrolgegenstände werden zusammen mit einer Lösung oder Suspension des gewünschten Proteins (höchstens 2 ug Protein pro cm² der zu beschichtenden Oberfläche), 16 Stunden lang bei 40 in 0,01 Mol pro Liter Natriumphosphatpuffer pH 6,8 inkubiert. Nach Entfernung der Proteinlösung wird schwach gebundenes Protein durch einstündiges Inkubieren mit Natriumphosphatpuffer, der 0,1% Tween®20 (Polysorbat-20 = Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat) enthält, entfernt.
    • B. Spezifische Beispiele
  • 1. Unbehandelte Polystyrolröhrchen (11·65, Greiner, Deutschland) sowie die gleichen, gemäß A.1. vorbehandelten Röhrchen wurden mit 125 J-markiertem γ-Globulin (von der Ziege, 140 000 Teilchen pro Minute/kg Protein) gemäß A.2. beschichtet. Das Volumen der FBS- und γ-Globulinlösungen betrug jeweils 1 ml, wobei die γ-Globulinlösung über einen Bereich abgestufter Konzentrationen (1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 und 0,03125 ug/ml) eingesetzt wurde.
  • In der Tabelle 1 sind die erzielten Ergebnisse aufgeführt: Tabelle 1 Beschichtungsausbeute ¹²&sup5;J-Y-Globulin-Einsatzmenge (in %) ohne FBS-Vorbehandlung mit I: Vor der Behandlung mit Tween II: Nach
  • Die Beschichtungsausbeute ohne FBS-Vorbehandlung betrug etwa 65% und die mit FBS-Vorbehandlung etwa 60%. Bei einstündiger Inkubierung beider Arten beschichteter Röhrchen mit einer 0,1%-igen Lösung von Tween 20 in physiologischer Kochsalzlösung fiel die Beschichtungsausbeute der Röhrchen ohne FBS-Vorbehandlung auf etwa 20% ab, während sie im Falle der vorbehandelten Röhrchen praktisch unverändert blieb.
  • 2. Gemäß B.1. wurden unbehandelte und FBS-vorbehandelte Polystyrolröhrchen mit Theophyllin-Antiserum (vom Kaninchen, 1 ml pro Röhrchen, Verdünnung 1:36 000) beschichtet. Die Röhrchen wurden anschließend 1 Stunde mit einer 1%-igen Lösung aus Polyvinylalkohol (des niedermolekularen Typs) in 0,01 Mol pro Liter Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen. Die beschichteten Röhrchen wurden 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit jeweils 1 ml einer Lösung aus Theophyllin-Peroxidase-Konjugat (10&supmin;&sup7; g/ml, etwa 2 Moleküle Theophyllin pro Molekül Meerrettichperoxidase) in 0,01 Mol pro Liter Kaliumphosphatpuffer pH 7,4, der 0,1% Gelatine, 0,9% NaCl und 0,03% Magnesium-1-anilinonaphthalen-8-sulfonat enthielt, inkubiert. Anschliessend wurden die Röhrchen mit kaltem Leitungswasser gewaschen (3 mal). Die Bestimmung der Antikörper-gebundenen Enzymaktivität erfolgte durch 20-minütige Inkubierung der Röhrchen bei Zimmertemperatur mit 1 ml einer Lösung, die 0,33 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,05 mg/ml H&sub2;O&sub2; in 0,1 Mol pro Liter Trisacetatpuffer pH 5,6 enthielt. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 1 ml einer 1 Mol pro Liter Schwefelsäure abgebrochen. Die Bestimmung der optischen Dichte bei 492 nm erfolgte auf photometrischem Wege. Es ergab sich ein Wert von 0,129 für unbehandelte und 0,944 für FBS-vorbehandelte Röhrchen.
  • 3(a) Gemäß 3.1. wurden unbehandelte und FBS- vorbehandelte Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 0,1 ml/Näpfchen einer unterschiedlich verdünnten Streptolysin-o-Zubereitung (0,131 mg/ml Protein; etwa 4000 IE/mg Protein) beschichtet.
  • Unter Verwendung von 0,1 Mol pro Liter Tris-HCl- Puffer pH 7,8 mit 0,1% Tween 20 als Verdünnungsmittel wurden 1:2 Verdünnungsreihen (Volumen 0,1 ml/Vertiefung) aus Anti-Streptolysin-Standardserum (Behring-Werke, Marburg; 10 IE/ml) in den unterschiedlich beschichteten Mikrotiterplatten hergestellt. Die Platten wurden 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, die Serumlösungen wurden entfernt und die Platten einmal mit kaltem Leitungswasser gewaschen. Jedes Näpfchen wurde mit 0,1 ml einer Lösung versetzt, die 2 ug/ml eines Anti-Hu-IgG-Peroxidasekonjugats (Kaninchen-IgG gegen Human-IgG gekoppelt mit Meerrettichperoxidase) und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach Entfernung der Konjugatlösung wurden die Platten dreimal mit kaltem Leitungswasser gewaschen. Zum Nachweis der durch Immunadsorption immobilisierten Peroxidaseaktivität wurde pro Näpfchen 0,1 ml einer Substratmischung (0,15 mg/ml o-Toluidin, 0,05 mg/ml H&sub2;O&sub2; in 0,1 Mol pro Liter Triszitratpuffer pH 5) zugegeben und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Zur Auswertung wurde die höchste sich noch blaufärbende Serumverdünnung bestimmt.
  • Die Ergebnisse finden sich in der Tabelle 2. Tabelle 2 Zur Beschichtung verwendete Streptolysinverdünnung Höchste positive Verdünnung von Standardserum ohne FBS mit
  • 3(b) Schließt sich an das Beschichtungsverfahren ein Trockenschritt (3 Stunden bei Zimmertemperatur unter einem Vakuum von 0,1 mbar) an, was für längere Lagerung von Vorteil ist, so sind die Unterschiede noch ausgeprägter.
  • In der Tabelle 3 sind die gemäß 3(a) (Streptolysinverdünnung 1:80; Angabe der höchsten positiven Verdünnungen für Standardserum und Patientenseren) erzielten Ergebnisse aufgeführt. Hieraus ist die größere Leistungsfähigkeit der aktivierten Platten ersichtlich. Tabelle 3 Höchste positive Verdünnung der Serumprobe ohne FBS mit Standardserum negativ Patient I
  • 4. Gemäß 3.1. wurden unbehandelte oder FBS-behandelte Mikrotiterplatten aus Polystyrol pro Näpfchen mit 0,1 ml einer Lösung beschichtet, die 0,01 mg/ml einer Glycoproteinfraktion von Candida albicans, (hergestellt von Dr. H. Mauch, Universität des Saarlandes, Homburg- Saar, Deutschland) enthielt.
  • 1:4600-fache Verdünnungen der unten angegebenen Serumproben in 0,1 Mol pro Liter 0,1% Tween®20 enthaltendem Tris-HCl-Puffer pH 7,8 wurden hergestellt und 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit 0,1 ml pro Näpfchen in den beschichteten Platten inkubiert.
  • Serum A: Gesunde Versuchsperson mit geringer Antikörperkonzentration gegen Candida albicans.
  • Serum B: Gepoolte Seren von gesunden Spendern.
  • Serum C: Patientenserum I mit erhöhter Antikörperkonzentration gegen Candida albicans.
  • Serum D: Patientenserum II mit erhöhter Antikörperkonzentration gegen Candida albicans.
  • Nach Entfernung der Serumproben wurden die Platten einmal mit kaltem Leitungswasser gewaschen. Jedes Näpfchen wurde mit 0,1 ml einer Lösung versetzt, die 0,1 ug/ml eines Anti-Hu-IgG-Peroxidasekonjugats (Kaninchen- IgG gegen Human-IgG gekoppelt mit Meerrettichperoxidase) enthielt, und eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach Entfernung der Konjugatlösung wurden die Platten dreimal mit kaltem Leitungswasser gewaschen. Zum Nachweis der durch Immunadsorption immobilisierten Peroxidasenaktivität wurde pro Näpfchen 0,1 ml einer Substratmischung (0,1 mg/ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 0,06 mg/ml H&sub2;O&sub2; in 0,1 Mol pro Liter Triszitratpuffer pH 5) zugegeben und 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 0,1 ml pro Vertiefung einer 1 Mol pro Liter Schwefelsäure wurde die Umsetzung abgebrochen, und die Bestimmungen der Adsorption bei 455 nm erfolgte auf photometrischem Wege in einem Kontron-SLT-210-Mikrotiterplattenablesegerät.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Serumprobe Absorption bei 455 nm ohne FBS mit
  • 5. Besteck zur Bestimmung von Antikörpern gegen Streptolysin-o in Humanserum.
  • Das Besteck besteht aus:
  • a) Einer gemäß der beschriebenen Erfindung mit Streptolysin-o beschichteten Mikrotiterplatte, die als Antigenbeschichtetes Reaktionsgefäß dient
  • b) einer Lösung aus Kaninchen-IgG-Meerrettichperoxidasenkonjugat, das gegen Human-IgG (gegebenenfalls lyophilisiert) gerichtet ist
  • c) 0,1 Mol pro Liter Triszitratpuffer pH 5 zur Reaktion mit Peroxidase
  • d) einer Stammlösung aus 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in Dimethylsulfoxid (0,1 mg/ml), die als Chromogen für die Reaktion mit der Peroxidase dient
  • e) einer Wasserstoffperoxidlösung (3%) zur Reaktion mit der Peroxidase
  • f) einer 0,1 Mol pro Liter Tris-HCl-Pufferlösung pH 7,8, die 0,1% Tween®20 enthält und als Verdünnungsmittel für die Serumproben und das Antikörper-Peroxidase- Konjugat dient.

Claims (13)

1. Verfahren zum irreversiblen Binden von Proteinen auf eine Polystyroloberfläche umfassend zunächst
a) Behandlung einer Polystyroloberfläche unter bei der Behandlung mit Bisdiazonium-Verbindungen üblichen Bedingungen mit einer Bisdiazonium-Verbindung der allgemeinen Formel I
in der
R1 für ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe, eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxygruppe oder eine Nitrogruppe steht
und in der
R2 für ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe steht
und wobei
X für ein Anion steht
und Entfernen von nicht umgesetzter Bisdiazonium-Verbindung,
b) danach Absorption eines Proteins unter bei der Absorption von Proteinen üblichen Bedingungen auf der Oberfläche ohne weitere Zugabe von Stabilisatoren, wie Albumin, und weitere Stabilisatoren, wie Glycerin.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel Ia
in der
R1a für ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Methoxygruppe steht
und in der
R2a für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe steht
und in der
X für ein Halogen oder für das Tetrafluoroborat- Ion steht.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
wobei
R1a für eine Methoxygruppe steht,
R2a für ein Wasserstoffatom steht,
und
X für Cl&supmin; oder BF&sub4;&supmin; steht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bisdiazonium-Verbindung als Komplex vorliegt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein ein Antikörper, ein Antigen, ein Hapten-Protein-Konjugat, ein Antikörper bindendes Protein, ein Enzym oder ein Lectin ist.
6. Polystyrolartikel, hergestellt nach Schritt (a) in Anspruch 1.
7. Polystyrolartikel, hergestellt nach Anspruch 1.
8. Polystyrolartikel nach Anspruch 7, wobei das Protein ein Antikörper, Antigen, Hapten-Protein-Konjugat, Antikörper bindendes Protein, Enzym oder Lectin ist.
9. Immunochemische oder enzymatische Methode zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer bestimmten Menge einer wäßrigen Probe, bei der die besagte wäßrige Lösung (1) mit einem unlöslichen Träger in Kontakt gebracht wird, an den eine biologisch aktive Substanz fixiert ist, die in der Lage ist, mit besagtem Analyten zu reagieren und (2) mit einer bestimmten Menge eines mit einem Tracer markierten Partners in Kontakt gebracht wird, um nach weitgehender Einstellung des Gleichgewichts ein Zweiphasensystem zu bilden, das eine feste Phase mit einem Teil des markierten Partners und des unmarkierten Partners gebunden an besagte biologisch aktive Verbindung enthält, und eine flüssige Phase mit dem Rest des ungebundenen markierten Partners und des ungebundenen, nicht markierten Partners enthält, die beiden Phasen getrennt werden und die Konzentration bestimmt wird, wobei die Verbesserung die Verwendung der Artikel nach Anspruch 7 als unlöslichen Träger umfaßt.
10. Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay, Fluoreszenzimmunoassay oder Lumineszenzimmunoassay nach Anspruch 9.
11. Verwendung von Polystyrolartikeln nach Anspruch 6 oder 7 für Ligandenassays mit Festphasentrennung.
12. Verwendung von Polystyrolartikeln nach Anspruch 6 oder 7 für Immunoassays, z. B. Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Fluoreszenz- oder Lumineszenzimmunoassays.
13. Reagensbesteck enthaltend
1. einen Polystyrolartikel nach einem der Ansprüche 6 oder 7,
2. gewünschtenfalls ein zur Absorption bestimmtes Protein,
3. einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen und
4. ein Nachweisreagens.
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