DE69933850T2 - Chemilumineszenzmittel und chemilumineszenzanalyseverfahren mit deren verwendung - Google Patents

Chemilumineszenzmittel und chemilumineszenzanalyseverfahren mit deren verwendung Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Chemilumineszenzmittel bzw. -reagenz, das eine gesteuerte Chemilumineszenz bereitstellen kann und z.B. für den Nachweis oder die quantitative Analyse verschiedener Materialien durch eine Chemilumineszenzanalyse geeignet ist. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Messung der Peroxidaseaktivität in der Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors durch die Chemilumineszenzanalyse unter Verwendung des vorstehend genannten Chemilumineszenzmittels, und einen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay, bei dem Peroxidase als Marker verwendet wird.
  • Bezüglich Lucigenin (N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitrat), das für eine lange Zeit für verschiedene Mikroanalyseverfahren als Chemilumineszenzmittel verbreitet verwendet wurde, ist bekannt, dass es in einer wässrigen alkalischen Lösung geringfügig Licht erzeugt und in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid intensiv Licht erzeugt. Es kann zur quantitativen Analyse von Wasserstoffperoxid verwendet werden, da es in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einem Alkali quantitativ Licht emittiert, jedoch ist es nur schwer auf einen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay (nachstehend gegebenenfalls als CLEIA bezeichnet) anwendbar, bei dem die Enzymaktivität durch das Ausmaß der Lumineszenz gemessen wird, die es durch dessen Reaktion erzeugt, während die Lumineszenz gesteuert wird. Eines der Verfahren, das zur Lösung dieser Probleme vorgeschlagen wurde, nutzt Glukoseoxidase als Markerenzym zur Erzeugung einer Chemilumineszenz, deren Ausmaß von der Konzentration des zu analysierenden Materials abhängt, und zwar durch Einwirken von Wasserstoffperoxid als Produkt der Glukoseoxidation auf Lucigenin in der Gegenwart von Alkali.
  • Das CLEIA-Verfahren mit Glukoseoxidase als Marker weist jedoch die Probleme einer zeitaufwändigen Reagenzherstellung und Handhabung des Lumineszenzsystems auf. Luminol wird als Chemilumineszenzmittel verwendet, das für das CLEIA-Verfahren mit Peroxidase als Marker, die relativ einfach gehandhabt werden kann, anwendbar ist. Es kann jedoch selbst in der Gegenwart eines Lumineszenzpromotors, wie z.B. p-Iodphenol, nicht immer eine ausreichende Empfindlichkeit aufweisen.
  • Daher gibt es einen zunehmenden Bedarf für Chemilumineszenzmittel, die einfach hergestellt werden können, das Lumineszenzanalyseverfahren vereinfachen, auf das CLEIA-Verfahren mit Peroxidase als Marker anwendbar sind und eine Analyse mit hoher Empfindlichkeit realisieren.
  • Es ist auch erforderlich, die Empfindlichkeit des CLEIA-Verfahrens mit Peroxidase als Marker weiter zu verbessern, da es erforderlich ist, immer niedrigere Konzentrationen der zu analysierenden Materialien quantitativ zu erfassen.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Chemilumineszenzmittel für eine Chemilumineszenz bereitzustellen, die von der molaren Konzentration von Peroxidase abhängt, wobei das Substrat eines Peroxids, wie z.B. Wasserstoffperoxid, als Wasserstoffakzeptor dient.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Chemilumineszenzmittel bereitzustellen, das ein hohes Maß an Chemilumineszenz erzeugt und sehr stabil ist.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Analyse auf der Basis einer Chemilumineszenz bereitzustellen, die das vorstehend genannte Chemilumineszenzmittel zur Messung der Peroxidaseaktivität mit einer höheren Empfindlichkeit nutzt.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay durch das neue Immunoassaysystem bereitzustellen, das auf der Basis der Chemilumineszenz entwickelt worden ist, welches das vorstehend genannte Chemilumineszenzmittel und ein Peroxidaseenzym als Marker zur Messung eines zu analysierenden Materials mit einer höheren Empfindlichkeit nutzt.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nach umfangreichen Untersuchungen zur Lösung der vorstehend genannten Aufgaben gefunden, dass
    ein Chemilumineszenzmittel, das einen Charge-Transfer-Komplex aus einem N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalz und einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung enthält,
    ein Chemilumineszenzmittel, das durch Einbringen einer Aminoalkoholverbindung in das vorstehend genannte Chemilumineszenzmittel erhalten wird,
    ein Chemilumineszenzmittel, das durch Umsetzen eines N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes mit einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung unter Bestrahlung mit Licht hergestellt wird, oder
    ein Chemilumineszenzmittel, das durch Umsetzen eines N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes mit einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung unter Bestrahlung mit Licht, wobei dem Reaktionssystem während und/oder nach der Charge-Transfer-Reaktion eine Aminoalkoholverbindung zugesetzt wird, hergestellt wird,
    nicht mit Wasserstoffperoxid bei einem spezifischen pH-Niveau reagiert, jedoch eine Chemilumineszenz bei der gleichzeitigen Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Peroxidase in einem Ausmaß erzeugt, das durch die molare Konzentration der Peroxidase bestimmt wird, wodurch die vorliegende Erfindung gemacht wurde.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft erstens ein Chemilumineszenzmittel (nachstehend gegebenenfalls als Chemilumineszenzmittel I bezeichnet), gekennzeichnet durch die in der Gegenwart eines Peroxids erzeugte Chemilumineszenz, deren Ausmaß in Abhängigkeit von der Konzentration an Peroxidaseenzym variiert, und als die Hauptinhaltsstoffe einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz, dargestellt durch die allgemeine Formel (1):
    Figure 00030001
    (wobei R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen und Halogen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, und X· ein Säureradikal als der durch den Elektronentransfer von dem Gegenanion des Bisacridiniumsalzes als dem Vorläufer bzw. dem Precursor verbliebene Rest ist), und
    eine N,N-disubstituierte Carbonsäureamidverbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (2), umfassend:
    Figure 00030002
    (wobei R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10 und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe mit einer Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppe, Halogen oder dergleichen substituiert sein kann, R2 aus der Gruppe, bestehend aus Methyl- und Ethylgruppen, ausgewählt ist, und R3 aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10, und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe mit Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppen, Halogen oder dergleichen substituiert sein kann, und R1 und R3 aneinander gebunden sein können, um zusammen mit dem Kohlenstoffatom und Stickstoffatom, welche in den Carbonyl- bzw. Amidgruppen sind, an welche R1 und R3 jeweils gebunden sind, einen Ring zu bilden).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zweitens ein Chemilumineszenzmittel (nachstehend gegebenenfalls als Chemilumineszenzmittel II bezeichnet), gekennzeichnet durch die in der Gegenwart eines Peroxids erzeugte Chemilumineszenz, deren Ausmaß in Abhängigkeit von der Konzentration an Peroxidaseenzym variiert, und als die Hauptinhaltsstoffe einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz, dargestellt durch die allgemeine Formel (1), eine N,N-disubstiuierte Carbonsäureamidverbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (2), und eine Aminoalkoholverbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (3), umfassend: (HOR)mNH3-m (3)(wobei R eine zweiwertige, aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 5 ist und (m) eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft drittens ein Chemilumineszenzmittel (nachstehend gegebenenfalls als Chemilumineszenzmittel III bezeichnet), das durch Umsetzen, in der Gegenwart von eingestrahltem Licht, eines durch die allgemeine Formel (1A) dargestellten N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes:
    Figure 00050001
    (wobei R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen und Halogen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, und Xn– ein n-wertiges Anion ist, und (n) 1 oder 2 ist),
    mit der durch die allgemeine Formel (2) dargestellten N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung,
    Figure 00050002
    (wobei R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10 und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe mit einer Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppe oder Halogen substituiert sein kann, R2 aus der Gruppe, bestehend aus Methyl- und Ethylgruppen, ausgewählt ist, und R3 aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10, und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe mit Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppen oder Halogen substituiert sein kann, und R1 und R3 aneinander gebunden sein können, um zusammen mit dem Kohlenstoffatom und Stickstoffatom, welche in den Carbonyl- bzw. Amidgruppen sind, an welche R1 und R3 jeweils gebunden sind, einen Ring zu bilden), hergestellt ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft viertens ein Chemilumineszenzmittel (nachstehend gegebenenfalls als Chemilumineszenzmittel IV bezeichnet), das durch Umsetzen, in der Gegenwart von eingestrahltem Licht, eines durch die allgemeine Formel (1A) dargestellten N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes mit einer durch die allgemeine Formel (2) darge stellten N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung, wobei eine durch die allgemeine Formel (3) dargestellte Aminoalkoholverbindung: (HOR)mNH3-m (3)(wobei R eine zweiwertige, aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 5 ist und (m) eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist) dem Reaktionssystem während und/oder nach der Charge-Transfer-Reaktion zugesetzt wird, hergestellt wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft fünftens ein Verfahren zur Messung der Peroxidaseaktivität in der Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors durch eine Chemilumineszenzanalyse unter Verwendung eines der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Chemilumineszenzmittel.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft sechstens einen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay, welcher das Mischen eines mit Peroxidaseenzym markierten Antikörpers oder Antigens mit einem Antigen, Antikörper oder Agglomerat davon in einer zu analysierenden Probe, um den Immunkomplex aus dem Marker/Antigen-Antikörper-Komplex durch die Antigen-Antikörper-Reaktion zu bilden, das Abtrennen des Immunkomplexes, das Erzeugen von dessen Chemilumineszenz in der Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors durch die Hilfe des vorstehend beschriebenen Chemilumineszenzmittels, und das Messen der Lumineszenzintensität, um das Antigen oder den Antikörper in der Probe quantitativ zu analysieren, umfasst.
  • 1 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung von menschlichem α-Fetoprotein (menschlichem αAFT) als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Beispiel 1-2 gegen die Konzentration von menschlichem αAFT aufgetragen ist.
  • 2 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung der β-Kette von menschlichem Choriongonadotropin (βhCG) als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Beispiel 3-2 gegen die Konzentration von βhCG aufgetragen ist.
  • 3 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung von menschlichem Prolactin (PRL) als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Beispiel 4-2 gegen die Konzentration von menschlichem PRL aufgetragen ist.
  • 4 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung von menschlichem αAFT als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Beispiel 5-2 gegen die Konzentration von menschlichem αAFT aufgetragen ist.
  • 5 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung von menschlichem αAFT als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Vergleichsbeispiel 4-1 gegen die Konzentration von menschlichem αAFT aufgetragen ist.
  • 6 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung von menschlichem αAFT als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Vergleichsbeispiel 1-2 gegen die Konzentration von menschlichem αAFT aufgetragen ist.
  • 7 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung von menschlichem Prolactin (PRL) als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Vergleichsbeispiel 2-2 gegen die Konzentration von menschlichem PRL aufgetragen ist.
  • 8 ist eine Kalibrierungskurve zur Messung der β-Kette von menschlichem Choriongonadotropin (βhCG) als Standard, wobei die Chemilumineszenzintensität des Reaktionssystems von Vergleichsbeispiel 1-3 gegen die Konzentration von βhCG aufgetragen ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird konkreter beschrieben.
  • Chemilumineszenzmittel
  • Das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel I umfasst als Hauptinhaltsstoffe einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz und einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung, wobei mit „Hauptinhaltsstoff" gemeint ist, dass der Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz und einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung 50 Gew.-% oder mehr, vorzugsweise 70 Gew.-% oder mehr des Gesamtgewichts des Chemilumineszenzmittels ausmacht. Das Mittel kann andere Substanzen enthalten, wie z.B. ein Nebenprodukt, das mit dem Herstellungsverfahren einhergeht.
  • Der Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz als einer der Hauptinhaltsstoffe ist durch die allgemeine Formel (1) dargestellt:
    Figure 00080001
  • In der allgemeinen Formel (1) sind R1 und R2 jeweils aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen ausgewählt und können gleich oder verschieden sein. Jede der Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen weist eine Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20, vorzugsweise von 1 bis 10 im Fall der Alkylgruppe, auf. Die bevorzugten Alkylgruppen umfassen geradkettige und verzweigte Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- und Decylgruppen. Die bevorzugten Arylgruppen sind diejenigen mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, einschließlich Phenyl-, Tolyl- und Xylylgruppen. Diese können mit einer Alkylgruppe substituiert sein. Eine Phenylgruppe ist mehr bevorzugt. Die bevorzugten halogenierten Arylgruppen umfassen halogenierte Phenyl-, Tolyl- und Xylylgruppen, von denen eine Chlorphenylgruppe mehr bevorzugt ist.
  • In der allgemeinen Formel (1) sind R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen und Halogen ausgewählt und können gleich oder verschieden sein. Diese Kohlenwasserstoffgruppen weisen eine Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20, vorzugsweise von 1 bis 10 auf. Insbesondere umfassen diese Gruppen geradkettige oder verzweigte Alkyl- und Alkoxygruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20 und eine Aryl- und Aryloxygruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, wobei die Aryl- und Aryl-oxygruppe mit einer Alkylgruppe substituiert sein kann.
  • Die bevorzugten Ausführungsformen weisen eine Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10 oder Aryl- oder halogenierte Arylgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20 für jeden von R1 und R2 und ein Wasserstoffatom für jeden von R3, R4, R5 und R6 auf.
  • In der Allgemeinen Formel (1) ist X· ein Säureradikal als der durch den Elektronentransfer von dem Gegenanion des Bisacridiniumsalzes als dem Precursor verbliebene Rest.
  • Der Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz wird durch eine breite Absorptionsbande mit einem Maximum bei etwa 550 nm in der Ultraviolettabsorptionsspektroskopie dargestellt, die mit einem Spektrophotometer gemessen werden kann.
  • Insbesondere umfasst der Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzen jeden Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diethyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Dipropyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diisopropyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Dibutyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diisobutyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diphenyl-9,9'-bisacridinium- und N,N'-Di-m-chlorphenyl-9,9'-bisacridiniumsalzen.
  • Die Gegenionen in dem N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalz als Precursor für die Charge-Transfer-Komplexe von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz umfassen unter anderem Chlor-, Brom-, Iod-, Nitrat-, Sulfat-, Phosphat- und Carbonationen. Daher umfassen die bevorzugten Precursor für den Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydrochlorid, N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodid und N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitrat, von denen N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitrat (Lucigenin) bevorzugt ist.
  • Die N,N-disubstituierte Carbonsäureamidverbindung als anderer Hauptinhaltsstoff für das Chemilumineszenzmittel I ist durch die allgemeine Formel (2) gezeigt:
    Figure 00090001
  • In der allgemeinen Formel (2) ist R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10 und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt, wobei die Arylgruppe mit einer Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppe oder Halogen substituiert sein kann, R2 aus der Gruppe, bestehend aus Methyl- und Ethylgruppen, ausgewählt, und R3 aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10, und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt, wobei die Arylgruppe mit Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppen oder Halogen substituiert sein kann, und R1 und R3 aneinander gebunden sein können, um zusammen mit dem Kohlenstoffatom und Stickstoffatom, welche in den Carbonyl- bzw. Amidgruppen sind, an welche R1 und R3 jeweils gebunden sind, einen Ring zu bilden.
  • Insbesondere umfassen die N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindungen unter anderem N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetoamid, N,N-Dimethylacrylamid, N,N-Dimethylpropionamid, N,N-Dimethylbenzamid und N,N-Dimethyl-2-pyrrolidon.
  • Das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel 1 enthält, wie es vorstehend beschrieben worden ist, einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz und einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung als essentielle Bestandteile. Es wurde gefunden, dass sich ein N,N'-disubstituiertes 9,9'-Bisacridiniumsalz als Precursor für den Charge-Transfer-Komplex als einer der essentiellen Bestandteile für das Mittel in der Gegenwart einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung als der andere essentielle Bestandteil selbst von dem stark ionischen Salz in den stark radikalischen Charge-Transfer-Komplex umwandelt, wenn mit Licht bestrahlt wird. Dieses Phänomen wird durch den beschleunigten Ladungstransfer zu dem N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumkation von dem Gegenion erklärt. Es wird auch davon ausgegangen, dass die N,N-disubstituierte Carbonsäureamidverbindung bei der Stabilisierung der Radikale des gebildeten Charge-Transfer-Komplexes unterstützt und als essentieller Bestandteil zur Bildung und Stabilisierung des Charge-Transfer-Komplexes von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz wirkt, der aus der Säure mit schwacher Nukleophilie zusammengesetzt ist.
  • Das Molverhältnis der N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung zu dem Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz für das Chemilumineszenzmittel I beträgt 1 bis 10000, vorzugsweise 1 bis 5000.
  • Das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel II enthält als Hauptinhaltsstoffe einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz, einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung und einer Aminoalkoholverbindung, wobei diese Hauptinhaltsstoffe 50 Gew.-% oder mehr, vorzugsweise 70 Gew.-% oder mehr des Gesamtgewichts des Chemilumineszenzmittels ausmachen. Das Mittel kann andere Substanzen enthalten, wie z.B. ein Nebenprodukt, das mit dem Herstellungsverfahren einhergeht, wie dies bei dem Chemilumineszenzmittel I der Fall ist. Das N,N'-disubstituierte 9,9'-Bisacridiniumsalz und die N,N-disubstituierte Carbonsäureamidverbindung als essentielle Bestandteile des Chemilumineszenzmittels II sind mit denjenigen für das Chemilumineszenzmittel I identisch. Andererseits ist die Aminoalkoholverbindung durch die allgemeine Formel (3) dargestellt: (HOR)mNH3-m (3)
  • In der allgemeinen Formel (3) ist R eine zweiwertige, aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 5 und m ist eine ganze Zahl von 1 bis 3.
  • Insbesondere umfassen die Aminoalkoholverbindungen unter anderem Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Monoisopropanolamin, Diisopropanolamin und Triisopropanolamin.
  • Das Chemilumineszenzmittel II, das durch weiteres Einbringen der Aminoalkoholverbindung in das Chemilumineszenzmittel I erhalten wird, weist ein geringeres Grundniveau für die Lumineszenzreaktion auf und realisiert die Chemilumineszenzreaktion stabil über einen breiteren Peroxidasekonzentrationsbereich.
  • Die Funktion der Aminoalkoholverbindung ist nicht vollständig klar. Es wird jedoch angenommen, dass die Verbindung bei dem Ladungstransfer von dem Gegenion des Bisacridiniumsalzes zu dem Acridinring beteiligt ist, wodurch die Reaktion des Bisacridiniumsalzes beschleunigt wird, und dass sie gleichzeitig die Radikale des gebildeten Charge-Transfer-Komplexes weiter stabilisiert, um die Reaktion mit gelöstem Sauerstoff während der Lumineszenzreaktion zu verhindern und die Ursachen für die Erhöhung des Grundniveaus zu beseitigen, wodurch eine stabile hochempfindliche Messung eines niedrigen Grundniveaus realisiert wird.
  • Die Molverhältnisse der N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung und der Aminoalkoholverbindung zu dem Charge-Transfer-Komplex des N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalzes für das Chemilumineszenzmittel II sind 1 bis 10000, vorzugsweise 1 bis 5000 bzw. 1 bis 10000, vorzugsweise 1 bis 2000.
  • Als nächstes wird das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Chemilumineszenzmittels beschrieben, das den Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz enthält.
  • Das Chemilumineszenzmittel I kann durch Bestrahlen eines N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes mit Licht in der Gegenwart einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung in einem Molverhältnis von 1 bis 10000 zu dem vorstehend genannten Salz hergestellt werden. Andererseits kann das Chemilumineszenzmittel II durch Bestrahlen eines Gemischs von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz und einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung mit Licht, wobei eine Aminoalkoholverbindung dem Reaktions system während und/oder nach der Charge-Transfer-Reaktion zugesetzt wird, hergestellt werden.
  • Das N,N'-disubstituierte 9,9'-Bisacridiniumsalz, das zur Herstellung des erfindungsgemäßen Chemilumineszenzmittels verwendet wird, wird durch die allgemeine Formel (1A) dargestellt:
    Figure 00120001
  • In der allgemeinen Formel (1A) sind R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen, ausgewählt und können gleich oder verschieden sein. Jede der Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen weist eine Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20, vorzugsweise von 1 bis 10 im Fall der Alkylgruppe, auf. Die bevorzugten Alkylgruppen umfassen geradkettige und verzweigte Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- und Decylgruppen. Die bevorzugten Arylgruppen sind diejenigen mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, einschließlich Phenyl-, Tolyl- und Xylylgruppen. Diese können mit einer Alkylgruppe substituiert sein. Eine Phenylgruppe ist mehr bevorzugt. Die bevorzugten halogenierten Arylgruppen umfassen halogenierte Phenyl-, Tolyl- und Xylylgruppen, von denen eine Chlorphenylgruppe mehr bevorzugt ist.
  • In der allgemeinen Formel (1A) sind R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen und Halogen ausgewählt und können gleich oder verschieden sein. Diese Kohlenwasserstoffgruppen weisen eine Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20, vorzugsweise von 1 bis 10 auf. Insbesondere umfassen diese Gruppen geradkettige oder verzweigte Alkyl- und Alkoxygruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20 und eine Aryl- und Aryloxygruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, wobei die Aryl- und Aryl-oxygruppe mit einer Alkylgruppe substituiert sein kann.
  • Die bevorzugten Ausführungsformen weisen eine Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10 oder Aryl- oder halogenierte Arylgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20 für jeden von R1 und R2 und ein Wasserstoffatom für jeden von R3, R4, R5 und R6 auf.
  • In der allgemeinen Formel (1A) ist Xn– ein n-wertiges Anion und n ist 1 oder 2. Die Anionen umfassen unter anderem Chlor-, Brom-, Iod-, Nitrat-, Sulfat-, Phosphat- und Carbonationen, wobei ein Nitration bevorzugt ist.
  • Insbesondere umfassen die N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalze N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diethyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Dipropyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diisopropyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Dibutyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diisobutyl-9,9'-bisacridinium-, N,N'-Diphenyl-9,9'-bisacridinium- und N,N'-Di-m-chlorphenyl-9,9'-bisacridiniumsalze, von denen N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitrat (Lucigenin) bevorzugt ist.
  • Die N,N-disubstituierte Carbonsäureamidverbindung, die mit derjenigen identisch sein kann, die vorstehend beschrieben worden ist, ist durch die allgemeine Formel (2) gezeigt:
    Figure 00130001
  • In der allgemeinen Formel (2) ist R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10 und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt, wobei die Arylgruppe mit einer Gruppe substituiert sein kann, die aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppen oder Halogen ausgewählt ist, R2 aus der Gruppe, bestehend aus Methyl- und Ethylgruppen, ausgewählt, und R3 aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10, und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt, wobei die Arylgruppe mit einer Gruppe substituiert sein kann, die aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppen oder Halogen ausgewählt ist. Die Alkylgruppen für R1 und R3 umfassen geradkettige und verzweigte Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- und Decylgruppen. R1 und R3 können aneinander gebunden sein, um zusammen mit dem Kohlenstoffatom und Stickstoffatom, welche in den Carbonyl- bzw. Amidgruppen sind, an welche R1 und R3 jeweils gebunden sind, einen Ring zu bilden.
  • Insbesondere umfassen die N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindungen unter anderem N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetoamid, N,N-Dimethylacrylamid, N,N-Dimethylpropionamid, N,N-Dimethylbenzamid und N,N-Dimethyl-2-pyrrolidon.
  • Die vorstehend beschriebene Aminoalkoholverbindung wird durch die allgemeine Formel (3) dargestellt: (HOR)mNH3-m (3)
  • In der allgemeinen Formel (3) ist R eine zweiwertige, aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 5 und m ist eine ganze Zahl von 1 bis 3.
  • Insbesondere umfassen die Aminoalkoholverbindungen unter anderem Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Monoisopropanolamin, Diisopropanolamin und Triisopropanolamin.
  • Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Chemilumineszenzmittels wird ein N,N'-disubstituiertes 9,9'-Bisacridiniumsalz in der Gegenwart einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung mit Licht bestrahlt, wobei das Licht eine Wellenlänge von etwa 290 nm bis 800 nm (ultravioletter bis sichtbarer Bereich), vorzugsweise von etwa 400 nm bis 800 nm (sichtbarer Bereich) aufweist. Die Lichtquellen umfassen unter anderem Hochspannungsquecksilberlampen, Niederspannungsquecksilberlampen, bakterizide Lampen, Fluoreszenzlampen und Glühlampen, von denen eine Glühlampe bevorzugt ist.
  • Die Aminoalkoholverbindung kann dem Gemisch von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz und einer N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung zugesetzt werden, bevor es mit Licht bestrahlt wird. Es wird jedoch empfohlen, die Verbindung während und/oder nach der Charge-Transfer-Reaktion des N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes, die in der Gegenwart von Licht beschleunigt wird, zuzusetzen. Es ist im Hinblick auf eine stabile Beibehaltung der Lumineszenzleistung mehr bevorzugt, die Aminoalkoholverbindung nach dem Stoppen der Bestrahlung mit Licht zuzusetzen (d.h. nach der Charge-Transfer-Reaktion).
  • Die Zugabe der Aminoalkoholverbindung zu dem erfindungsgemäßen Chemilumineszenzmittel bringt die vorteilhaften Effekte mit sich, dass dessen Grundniveau während des Lumineszenzreaktionsvorgangs vermindert wird, dessen Lumineszenzintensität in einem Bereich mit hoher Peroxidasekonzentration erhöht wird und dessen Aufbewahrungsstabilität erhöht wird, so dass eine Verschlechterung von dessen Lumineszenzkapazität während der Lagerung verhindert wird, wodurch die Aminoalkoholverbindung stark zur Verbesserung der Leistung des Chemilumineszenzmittels, z.B. der Empfindlichkeit und der Stabilität, beiträgt.
  • Das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel, das die vorstehend beschriebene Zusammensetzung aufweist, ist durch die Chemilumineszenz gekennzeichnet, die sie unter basischen Bedingungen (pH 7,5 bis 13) in der Gegenwart einer Überschussmenge an Wasserstoffperoxid erzeugt, wobei deren Ausmaß von der Peroxidasekonzentration abhängt.
  • Das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel, das die vorstehend beschriebenen Lumineszenzeigenschaften aufweist, kann zur Messung der Peroxidaseaktivität verwendet werden. Diese Eigenschaften machen das Mittel auch für einen Enzymimmunoassay geeignet. Diese werden nachstehend beschrieben.
  • Verfahren zur Messung der Peroxidaseaktivität
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Messung der Peroxidaseaktivität auf der Basis der Chemilumineszenzanalyse bezüglich der Enzymaktivität von Peroxidase unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Chemilumineszenzmittels in der Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Messung der Peroxidaseaktivität auf der Basis der Chemilumineszenzanalyse bezüglich der Enzymaktivität von Peroxidase unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Chemilumineszenzmittels in der Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors, wobei eine phenolische Verbindung als Lumineszenzpromotor verwendet wird, bereit.
  • Das Verfahren zur Messung der Peroxidaseaktivität ist nicht beschränkt. Im Allgemeinen wird dabei ein Gemisch aus einer Chemilumineszenzmittellösung, eines Lumineszenzpromotors und eines Peroxidaseenzyms als Probe hergestellt und dem vorstehend genannten Gemisch wird eine Wasserstoffakzeptorlösung in einem spezifischen pH-Bereich für die Chemilumineszenz zugesetzt, deren Ausmaß von einem Analysegerät bestimmt wird.
  • Bei der Messung der Peroxidaseaktivität wird das Chemilumineszenzmittel bei einer Konzentration von 10–8 bis 1 M, vorzugsweise 10–6 bis 10–2 M verwendet und dessen Menge beträgt 10 bis 500 μl, vorzugsweise 50 bis 300 μl.
  • Das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel erzeugt eine Lumineszenz bei einer spezifischen basischen Bedingung, wobei bekannt ist, dass deren Ausmaß in der Gegenwart eines Lumineszenzpromotors, wie z.B. einer phenolischen Verbindung, intensiviert wird. Die phenolischen Verbindungen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem p-Hydroxyzimtsäure, p-Phenylphenol, p-(4-Chlorphenyl)phenol, p-(4-Bromphenyl)phenol, p-(4-Iodphenyl)phenol, p-Iodphenol, p-Bromphenol, p-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, p-Cumarinsäure, 6-Hydroxybenzothiazol, 2-Naphthol und Leuchtkäfer-Luciferin. Von diesen Verbindungen sind p-Iodphenol, p-Phenylphenol und 6-Hydroxybenzothiazol bevorzugt. Die Menge des Lumineszenzpromotors beträgt das 0,01 bis 100-fache, vorzugsweise das 0,1 bis 10-fache, bezogen auf die Molzahl des Chemilumineszenzmittels, und dessen Konzentration beträgt 10–6 bis 1 M, vorzugsweise 10–4 bis 10–2 M.
  • Der Wasserstoffakzeptor für die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt, so lange er das Substrat für das Peroxidaseenzym werden kann. Obwohl es sich um ein anorganisches oder organisches Peroxid handeln kann, ist Wasserstoffperoxid besonders bevorzugt. Es ist erforderlich, den Wasserstoffakzeptor in einem ausreichenden Überschuss bezogen auf das Chemilumineszenzmittel zu verwenden, und zwar in der 3- bis 10000-fachen Menge, vorzugsweise in der 10- bis 1000-fachen Menge, bezogen auf die Molzahl.
  • Bei der Messung der Peroxidaseaktivität durch die vorliegende Erfindung ermöglicht die Verwendung von Peroxidase als Marker die quantitative Analyse verschiedener Substanzen, wie z.B. eines Antigens, eines Antikörpers und einer Nukleinsäure. Die Peroxidase als Marker ist nicht beschränkt und eine der bevorzugten Peroxidasen ist Meerrettichperoxidase (HRP).
  • Die basische Pufferlösung, die für die Chemilumineszenz geeignet ist, ist nicht beschränkt. Die geeigneten Pufferlösungen umfassen eine Tris-Pufferlösung, eine Phosphatpufferlösung, eine Boratpufferlösung, eine Carbonatpufferlösung und Glycin/Natriumhydroxid-Pufferlösungen. Die Pufferlösung wird vorzugsweise bei einer Konzentration von 1 mM bis 1 M verwendet.
  • Darüber hinaus kann für die Reaktion gegebenenfalls ein grenzflächenaktives Mittel oder ein Chelatisierungsmittel verwendet werden.
  • Die Chemilumineszenz kann z.B. mit einem Luminometer, verschiedenen Photozählern, einem Röntgenfilm und anderen lichtempfindlichen Filmen analysiert werden.
  • Verfahren für einen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für einen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay für ein Antigen oder einen Antikörper mit einem Peroxidaseenzym als Marker als eine der Anwendungen des neuen erfindungsgemäßen Chemilumineszenzmittels bereit.
  • Das Verfahren des Chemilumineszenz-Enzymimmunoassays, bei dem das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel verwendet wird, umfasst zwei Schritte: (1) Einen Immunreaktionsschritt, bei dem ein Antikörper oder ein Antigen, der bzw. das mit einem Peroxidaseenzym markiert ist, mit einem Antigen, einem Antikörper oder einem Agglomerat davon in der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion zu analysierenden Probe gemischt und davon eingefangen wird, um den mit dem Peroxidaseenzym markierten Immunkomplex zu bilden, und (2) einen Chemilumineszenzreaktionsschritt, bei dem der Immunkomplex durch das Chemilumineszenzverfahren analysiert wird, das dem in dessen Molekül vorhandenen Markerenzym folgt.
  • Das Verfahren für die Antigen-Antikörper-Reaktion für den vorstehend genannten Schritt (1) ist nicht beschränkt, so lange es das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel nutzen kann. Einige der geeigneten Verfahren sind nachstehend beschrieben.
    • (1) Ein Sandwichverfahren, bei dem ein in der Probe zu analysierendes Antigen durch einen Antikörper eingefangen wird, der an einen unlöslichen Träger gebunden ist, und dann mit einem mit einer Peroxidase markierten Antikörper umgesetzt wird,
    • (2) ein Zwei-Antikörper-Verfahren, bei dem es sich um das Sandwichverfahren handelt, bei dem ein Antikörper einer Tierart, die von derjenigen für den Antikörper, der an einen unlöslichen Träger gebunden ist, verschieden ist, nach dem Markieren mit dem Sandwichkomplex umgesetzt wird,
    • (3) ein Konkurrenzverfahren, bei dem ein Antikörper, der an einen unlöslichen Träger gebunden ist, mit einem in der Probe zu analysierenden Antigen in der Gegenwart eines mit einer Peroxidase markierten Antigens umgesetzt wird,
    • (4) eine koagulierende Sedimentation, bei der ein markierter Antikörper oder ein markiertes Antigen, der bzw. das eine bestimmte Reaktion mit einem anderen zu analysierenden Antigen oder Antikörper zeigt, auf die Probe einwirken gelassen wird, um eine koagulierende Sedimentation zu verursachen, und das Sediment mittels Zentrifugation behandelt wird, um den Marker in dem abgetrennten Immunkomplex zu messen,
    • (5) ein Antikörpernachweis, bei dem ein in der Probe zu analysierender Antikörper (Anti-Mensch-gamma-Globulinantikörper, der mit einem Peroxidaseenzym markiert ist) auf ein Antigen einwirken gelassen wird, das an einen unlöslichen Träger gebunden ist, und
    • (6) ein Biotin-Avidin-Verfahren, bei dem ein mit Biotin markierter Antikörper mit Avidin umgesetzt wird, das mit einem Peroxidaseenzym markiert ist.
  • Die unlöslichen Träger, die für den erfindungsgemäßen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay geeignet sind, umfassen diejenigen von Polymerverbindungen, wie z.B. Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyester, Polyacrylnitril, Fluorharz, vernetztes Dextran und Polysaccharid, und diejenigen von anderen Materialien, wie z.B. Glas, Metalle, magnetische Teilchen und eine Kombination davon. Der unlösliche Träger kann in verschiedenen Formen vorliegen, wie z.B. Schalen-, Kugel-, Faser-, Stab-, Scheiben-, Behälter-, Zellen-, Mikroplatten- und Reagenzglasformen. Das Verfahren zur Immobilisierung des Antigens oder Antikörpers auf dem unlöslichen Träger ist nicht beschränkt. Beispielsweise kann es bzw. er durch eine physikalische Adsorption, ein kovalentes Binden und ein ionisches Binden immobilisiert werden.
  • Der Antikörper, der für den erfindungsgemäßen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay geeignet ist, kann monoklonal oder polyklonal sein. Er kann in Form eines ganzen Körpers oder eines Fragments, wie z.B. F(ab')2 oder Fab, vorliegen. Der Ursprüng des Antikörpers ist nicht beschränkt. Die bevorzugten Antikörper umfassen diejenigen von Maus, Ratte, Hase, Schaf, Ziege und Huhn.
  • Die Chemilumineszenzreaktion als zweiter Schritt für den erfindungsgemäßen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay analysiert die Aktivität von Peroxidase als Marker, der von einem unlöslichen Träger eingefangen ist, durch die Wirkung eines Wasserstoffakzeptors unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Chemilumineszenzmittels in der Gegenwart eines Lumineszenzpromotors. Dieses Verfahren ist nicht beschränkt. Bei einem der gebräuchlichen Verfahren wird ein Wasserstoffakzeptor (z.B. eine wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid) bei einem spezifischen basischen pH-Niveau dem Probenreagenz zugesetzt, das ein chemilumineszierendes Material oder einen Lumineszenzpromotor enthält, das bzw. der immunologisch durch einen unlöslichen Träger eingefangen worden ist, um eine Chemi lumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß durch ein zweckmäßiges Analysegerät bestimmt wird.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay erzeugt das Chemilumineszenzmittel eine Lumineszenz bei pH 7,5 bis 13, von der bekannt ist, dass deren Ausmaß in der Gegenwart eines Lumineszenzpromotors, wie z.B. einer phenolischen Verbindung, intensiviert wird. Das Chemilumineszenzmittel wird bei einer Konzentration von 10–8 bis 1 M, vorzugsweise von 10–6 bis 10–2 M verwendet und dessen Menge beträgt 10 bis 500 μl, vorzugsweise 50 bis 300 μl. Die Menge des Lumineszenzpromotors beträgt das 0,01 bis 100-fache, vorzugsweise das 0,1 bis 10-fache bezogen auf die Molzahl des Chemilumineszenzmittels. Der gleiche Wasserstoffakzeptor, die gleiche Peroxidase und die gleiche basische Pufferlösung, wie sie für die Messung der Peroxidaseaktivität verwendet werden, können unter den gleichen Bedingungen verwendet werden.
  • Effekte der Erfindung
  • Das neue erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel kann aus billigen Ausgangsmaterialien in einer relativ kurzen Zeit einfach hergestellt werden. Es erzeugt eine Chemilumineszenz in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase, deren Ausmaß von der Peroxidasekonzentration abhängt, wobei es sich um eine Eigenschaft handelt, die zum Nachweis eines Peroxidaseenzyms mit einer hohen Empfindlichkeit verwendet werden kann. Die Verwendung eines bzw. einer mit einer Peroxidase markierten Antigens, Antikörpers oder Nukleinsäure ermöglicht insbesondere die Messung eines Antigens oder Antikörpers durch den Enzymimmunoassay, eines Proteins durch das Western-Blotting-Verfahren, von DNA und RNA durch das Southern- oder Northern-Blotting-Verfahren und einer Nukleinsäure durch das Verfahren, bei dem eine Enzym-markierte Nukleinsäuresonde genutzt wird, mit einer hohen Empfindlichkeit.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird konkreter durch Beispiele und Vergleichsbeispiele beschrieben, welche die vorliegende Erfindung keinesfalls beschränken.
  • Das zur Bestimmung der Lumineszenz in den Beispielen und Vergleichsbeispielen verwendete Luminometer ist LUMINOUS CT-9000D, das von DIAIATRON CO., LTD. hergestellt wird.
  • Beispiel 1
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodidsalz und N,N'-Dimethylacetoamid enthält
  • Ein Gemisch einer wässrigen 1 × 10–2 mol/Liter-Lösung von Lucigenin und festem Kaliumiodid (Molverhältnis: 1:2) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein roter Niederschlag erzeugt wurde. Die Niederschlag-enthaltende Reaktionslösung wurde in einen auberginenförmigen Kolben eingebracht und mit einem Rotationsverdampfer bei 60°C unter vermindertem Druck erhitzt, um Wasser abzudestillieren, das als Lösungsmittel dient. Der Rückstand des verfestigten roten Niederschlags wurde zur Entfernung von Nebenprodukten mit Benzol gewaschen und die in Benzol unlöslichen Bestandteile wurden durch Filtration abgetrennt und getrocknet, wobei das Rohprodukt erzeugt wurde. Das Rohprodukt wurde durch Erhitzen unter Lichtausschluss bei 95°C in einem Wasserbad in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Die Lösung wurde wieder auf Raumtemperatur abgekühlt und dann bei 4°C gehalten. Der resultierende Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und getrocknet, und nicht umgesetzte Substanzen wurden entfernt, so dass das N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodidsalz in einer Ausbeute von etwa 70% erhalten wurde. 1,5 mg dieser Verbindung, die in ein Reagenzglas eingebracht worden sind, wurden in 1 ml N,N-Dimethylacetoamid gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 7 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodidsalz enthielt. Die Bildung des Charge-Transfer-Komplexes wurde durch ein Spektrophotometer bestätigt, wie es sich durch das Auftreten einer breiten Absorptionsbande mit einem Maximum bei etwa 550 nm im Ultraviolettabsorptionsspektralmuster zeigte.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Die Leistung des in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellten Chemilumineszenzmittels wurde durch dessen Peroxidaseaktivität bewertet.
  • Ein Gemisch aus 50 μl des Chemilumineszenzmittels und 2,95 ml einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8) wurde hergestellt. Diese Lösung wurde dann mit 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die 10 mM p-Iodphenol enthielt, versetzt, um die Chemilumineszenzmittellösung herzustellen. Jeder einer Mehrzahl von Wells, die von einer Mikroplatte für eine Chemilumineszenzmessung gehalten wurden, wurde mit einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die ver schiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, beschickt. Die Chemilumineszenzlösung und 100 μl einer 0,0017%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid wurden nacheinander den Wells zugesetzt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde. Die Tabelle 1 zeigt einen Bereich der Lumineszenzintensität, die der HRP-Konzentration entspricht. Es wird somit bestätigt, dass die Peroxidaseaktivität bei einer HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–3 mol/Liter bestimmt werden kann.
  • Daher wird gefunden, dass das Ausmaß der Lumineszenz durch die Peroxidasekonzentration auf ein sehr niedriges Niveau der Konzentration eingestellt werden kann.
  • Beispiel 1-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • Jeder einer Mehrzahl von Wells, die von einer Mikroplatte für eine Chemilumineszenzmessung gehalten wurden, wurde mit 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, 800 μl einer 10 mM p-Iodphenollösung und 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung (20 μl des Chemilumineszenzmittels, das im Beispiel 1 hergestellt worden ist, gelöst in 9,18 ml einer 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8)), der 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen, die in der Tabelle A gezeigt ist. Es wird somit bestätigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–9 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle A
    Figure 00210001
  • Beispiel 1-2
  • Messung von α-Fetoprotein (AFP) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des im Beispiel 1 hergestellten Chemilumineszenzmittels
  • 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 800 ng/ml gereinigtes menschliches AFP (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 3 μg/ml von im Referenzbeispiel 2 hergestellten monoklonalen Maus-anti-Mensch-AFT-Antikörper, der mit einem Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-AFP-Antikörper immobilisiert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 100 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung, die im Beispiel 1 hergestellt worden ist, und 50 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die eine 0,0017%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, in dieser Reihenfolge beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde, um die Chemilumineszenzintensität zu bestimmen. Die Chemilumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (1) zu erstellen. Wie es gezeigt ist, korreliert die Intensität gut mit der Konzentration. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von menschlichem AFP, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 0,01 ng/ml verwendet werden.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydrochloridsalz und N,N'-Dimethylacetoamid enthält
  • Ein Gemisch einer wässrigen 1 × 10–2 mol/Liter-Lösung von Lucigenin und festem Kaliumchlorid (Molverhältnis: 1:2) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein bräunlichroter Niederschlag erzeugt wurde. Die Niederschlag-enthaltende Reaktionslösung wurde in einen auberginenförmigen Kolben eingebracht und mit einem Rotationsverdampfer bei 60°C unter vermindertem Druck erhitzt, um Wasser abzudestillieren, das als Lösungsmittel dient. Der Rückstand des verfestigten bräunlich-roten Niederschlags wurde zur Entfernung von Nebenprodukten mit Benzol gewaschen und die in Benzol unlöslichen Bestandteile wurden durch Filtration abgetrennt und getrocknet, wobei das Rohprodukt erzeugt wurde. Das Rohprodukt wurde durch Erhitzen unter Lichtausschluss bei 95°C in einem Wasserbad in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Die Lösung wurde wieder auf Raumtemperatur abgekühlt und dann bei 4°C gehalten. Der resultierende Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und getrocknet, und nicht umgesetzte Substanzen wurden entfernt, so dass das N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydrochloridsalz in einer Ausbeute von etwa 70% erhalten wurde. 1,5 mg dieser Verbindung, die in ein Reagenzglas eingebracht worden sind, wurden in 1 ml N,N-Dimethylacetoamid gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 7 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydrochloridsalz enthielt.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 2 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Es wird somit bestätigt, dass die Peroxidaseaktivität bei einer Konzentration bis zu 1 × 10–3 mol/Liter bestimmt werden kann und dass die Lumineszenz durch die Peroxidasekonzentration eingestellt werden kann.
  • Beispiel 3
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitratsalz und N,N'-Dimethylacetoamid enthält
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 1 ml N,N-Dimethylacetoamid gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 7 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitratsalz enthielt.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 3 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Es wird somit bestätigt, dass die Peroxidaseaktivität bei einer Konzentration bis zu 1 × 10–3 mol/Liter bestimmt werden kann und dass die Lumineszenz durch die Peroxidasekonzentration eingestellt werden kann.
  • Beispiel 3-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • Jeder einer Mehrzahl von Wells, die von einer Mikroplatte für eine Chemilumineszenzmessung gehalten wurden, wurde mit 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, 800 μl einer 10 mM p-Iodphenollösung und 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung (20 μl des Chemilumineszenzmittels, das im Beispiel 3 hergestellt worden ist, gelöst in 9,18 ml einer 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8)), der 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen, die in der Tabelle B gezeigt ist. Es wird somit bestätigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–9 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle B
    Figure 00240001
  • Beispiel 3-2
  • Messung der β-Kette von menschlichem Choriongonadotropin (βhCG) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des im Beispiel 3 hergestellten Chemilumineszenzmittels
  • 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 100 mlU/ml gereinigtes βhCG (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 2 μg/ml von im Referenzbeispiel 2 hergestellten monoklonalen Maus-anti-βhCG-Antikörper, der mit einem Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-βhCG-Antikörper immobilisiert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 100 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung, die im Beispiel 3 hergestellt worden ist, und 50 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die eine 0,0017%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, in dieser Reihenfolge beschickt, um die Lumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde, um die Chemilumineszenzintensität zu bestimmen. Die Chemilumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (2) zu erstellen. Wie es gezeigt ist, korreliert die Intensität gut mit der Konzentration. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von βhCG, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 0,01 mlU/ml verwendet werden.
  • Beispiel 4
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodidsalz und N,N'-Dimethylacetoamid und Triethanolamin enthält
  • Ein Gemisch einer wässrigen 1 × 10–2 mol/Liter-Lösung von Lucigenin und festem Kaliumiodid (Molverhältnis: 1:2) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein roter Niederschlag erzeugt wurde. Die Niederschlag-enthaltende Reaktionslösung wurde in einen auberginenförmigen Kolben eingebracht und mit einem Rotationsverdampfer bei 60°C unter vermindertem Druck erhitzt, um Wasser abzudestillieren, das als Lösungsmittel dient. Der Rückstand des verfestigten roten Niederschlags wurde zur Entfernung von Nebenprodukten mit Benzol gewaschen und die in Benzol unlöslichen Bestandteile wurden durch Filtration abgetrennt und getrocknet, wobei das Rohprodukt erzeugt wurde. Das Rohprodukt wurde durch Erhitzen unter Lichtausschluss bei 95°C in einem Wasserbad in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Die Lösung wurde wieder auf Raumtemperatur abgekühlt und dann bei 4°C gehalten. Der resultierende Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und getrocknet, und nicht umgesetzte Substanzen wurden entfernt, so dass das N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodidsalz in einer Ausbeute von etwa 70% erhalten wurde. 1,5 mg dieser Verbindung, die in ein Reagenzglas eingebracht worden sind, wurden in 1 ml N,N-Dimethylacetoamid gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 7 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, und dann wurden 0,5 ml Triethanolamin zugesetzt, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodidsalz enthielt.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 4 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Es wird somit bestätigt, dass die Peroxidaseaktivität bei einer Konzentration bis zu 1 × 10–3 mol/Liter bestimmt werden kann und dass die Lumineszenz durch die Peroxidasekonzentration eingestellt werden kann.
  • Beispiel 4-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • Jeder einer Mehrzahl von Wells, die von einer Mikroplatte für eine Chemilumineszenzmessung gehalten wurden, wurde mit 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, 800 μl einer 10 mM p-Iodphenollösung und 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung (20 μl des Chemilumineszenzmittels, das im Beispiel 4 hergestellt worden ist, gelöst in 9,18 ml einer 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8)), der 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen, die in der Tabelle C gezeigt ist. Es wird somit bestätigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–9 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle C
    Figure 00260001
  • Beispiel 4-2
  • Messung von menschlichem Prolactin (PRL) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des im Beispiel 4 hergestellten Chemilumineszenzmittels
  • 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 100 ng/ml gereinigtes menschliches PRL (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 3 μg/ml monoklonalen Maus-anti-Mensch-PRL-Antikörper, der mit dem im Referenzbeispiel 2 hergestellten Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-PRL-Antikörper immobilisiert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 100 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung, die im Beispiel 4 hergestellt worden ist, und 50 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die eine 0,0017%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, in dieser Reihenfolge beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde, um die Chemilumineszenzintensität zu bestimmen. Die Chemilumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (3) zu erstellen. Wie es gezeigt ist, korreliert die Intensität gut mit der Konzentration. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von PRL, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 0,01 ng/ml verwendet werden.
  • Beispiel 5
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitratsalz und N,N'-Dimethylacetoamid und Triethanolamin enthält
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 1 ml N,N-Dimethylacetoamid gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 7 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, und dann wurden 0,5 ml Triethanolamin zugesetzt, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 5 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Es wird somit bestätigt, dass die Peroxidaseaktivität bei einer Konzentration bis zu 1 × 10–3 mol/Liter bestimmt werden kann und dass die Lumineszenz durch die Peroxidasekonzentration eingestellt werden kann.
  • Beispiel 5-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • Jeder einer Mehrzahl von Wells, die von einer Mikroplatte für eine Chemilumineszenzmessung gehalten wurden, wurde mit 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, 800 μl einer 10 mM p-Iodphenollösung und 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung (20 μl des Chemilumineszenzmittels, das im Beispiel 5 hergestellt worden ist, gelöst in 9,18 ml einer 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8)), der 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen, die in der Tabelle D gezeigt ist. Es wird somit bestätigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–9 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle D
    Figure 00280001
  • Beispiel 5-2
  • Messung von α-Fetoprotein (AFP) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des im Beispiel 5 hergestellten Chemilumineszenzmittels
  • 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 800 ng/ml gereinigtes menschliches AFP (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 3 μg/ml von im Referenzbeispiel 2 hergestellten monoklonalen Maus-anti-Mensch-AFT-Antikörper, der mit einem Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-AFP-Antikörper immobili siert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 100 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), 100 μl der Chemilumineszenzmittellösung, die im Beispiel 5 hergestellt worden ist, und 50 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 7,8), die eine 0,0017%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, in dieser Reihenfolge beschickt, um die Lumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 1 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde, um die Chemilumineszenzintensität zu bestimmen. Die Chemilumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (4) zu erstellen. Wie es gezeigt ist, korreliert die Intensität gut mit der Konzentration. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von menschlichem AFP, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 0,01 ng/ml verwendet werden.
  • Beispiel 6
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 1 ml N,N-Dimethylformamid gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 5 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde, das die chemilumineszierende Substanz enthielt.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 6 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Die in der Tabelle 1 gezeigte Lumineszenzintensität ist höher als diejenige, die durch das Mittel bereitgestellt wird, welches durch das Vergleichsbeispiel 2 bei fehlender Bestrahlung mit Licht hergestellt worden ist, was zeigt, dass die Bestrahlung mit Licht die Lumineszenzintensität verbessert.
  • Beispiel 6-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • Das im Beispiel 6 hergestellte Chemilumineszenzmittel wurde mit einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,0), die 8 × 10–4 M p-Iodphenol enthielt, 500-fach verdünnt. Jeder einer Mehrzahl von Wells, die von einer Mikroplatte für eine Chemilumineszenzmessung gehalten wurden, wurde mit 100 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,0), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, und dann mit 100 μl der vorstehend beschriebenen Chemilumineszenzmittellösung und 50 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,0), die eine 0,0017 %ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, durch Lösungsinjektionseinheiten in dieser Reihenfolge beschickt. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen, die in der Tabelle E gezeigt ist. Es wird somit bestätigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 5 × 10–9 mol/Assay gemessen werden kann, und dass sowohl die Empfindlichkeit als auch die Leuchtintensität bezüglich der Empfindlichkeit und der Leuchtintensität verbessert sind, die durch das Mittel bereitgestellt werden, das im Vergleichsbeispiel 2 bei fehlender Bestrahlung mit Licht hergestellt worden ist. Tabelle E
    Figure 00300001
  • Beispiel 7
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 1 ml N-Methyl-2-pyrrolidon gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 3 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde, das die chemilumineszierende Substanz enthielt.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 7 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Die in der Tabelle 1 gezeigte Lumineszenzintensität ist höher als diejenige, die durch das Mittel bereitgestellt wird, wel ches durch das Vergleichsbeispiel 3 bei fehlender Bestrahlung mit Licht hergestellt worden ist, was zeigt, dass die Bestrahlung mit Licht die Lumineszenzintensität verbessert.
  • Beispiel 7-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • Das im Beispiel 7 hergestellte Chemilumineszenzmittel wurde mit einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,0), die 8 × 10–4 M p-Iodphenol enthielt, 500-fach verdünnt. Jeder einer Mehrzahl von Wells, die von einer Mikroplatte für eine Chemilumineszenzmessung gehalten wurden, wurde mit 100 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,0), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, und dann mit 100 μl der vorstehend beschriebenen Chemilumineszenzmittellösung und 50 μl einer 75 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,0), die eine 0,0017 %ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, durch Lösungsinjektionseinheiten in dieser Reihenfolge beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen, die in der Tabelle F gezeigt ist. Es wird somit bestätigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 5 × 10–9 mol/Assay gemessen werden kann, und dass sowohl die Empfindlichkeit als auch die Leuchtintensität bezüglich der Empfindlichkeit und der Leuchtintensität verbessert sind, die durch das Mittel bereitgestellt werden, das im Vergleichsbeispiel 3 bei fehlender Bestrahlung mit Licht hergestellt worden ist. Tabelle F
    Figure 00310001
  • Beispiel 8
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 1 ml N,N-Dimethylacetoamid gelöst und die Lösung wurde mit Licht von einer 250 W-Kopierlampe 7 Stunden belichtet, während das Reagenzglas in einem 30°C-Wasserbad gehalten wurde, und 0,1 ml Monoethanolamin wur den zugesetzt, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde, das die chemilumineszierende Substanz enthielt.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 8 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen und dessen Leistung zu bewerten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.
  • Beispiel 8-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • Das gleiche Verfahren, das für das Beispiel 7-1 verwendet worden ist, mit der Ausnahme, dass das Chemilumineszenzmittel durch das im Beispiel 8 hergestellte Chemilumineszenzmittel ersetzt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um dessen Peroxidaseaktivität zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle G gezeigt. Es wird somit bestätigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–9 mol/Assay bestimmt werden kann und dass sowohl die Empfindlichkeit als auch die Leuchtintensität bezüglich der Empfindlichkeit und der Leuchtintensität verbessert sind, die in den Vergleichsbeispielen 6-1 und 7-1, bei denen kein Monoethanolamin verwendet worden ist, festgestellt worden sind. Tabelle G
    Figure 00320001
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 2 ml N,N-Dimethylacetoamid gelöst und die Lösung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und mit 2 ml reinem Wasser versetzt, wobei das Chemilumineszenzmittel hergestellt wurde.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Jeder einer Mehrzahl von Wells für eine Chemilumineszenzmessung wurde mit 20 μl des vorstehend beschriebenen Chemilumineszenzmittels unmittelbar nach dessen Herstellung und dann mit 200 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, und 20 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die 10 mM p-Iodphenol enthielt, der 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, beschickt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Lumineszenzintensität ist unzureichend, wie es in der Tabelle 1 gezeigt ist.
  • Vergleichsbeispiel 1-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die 4 × 10–5 M des im Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Chemilumineszenzmittels und 10–3 M p-Iodphenol enthielt, wurden mit 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die verschiedene Konzentrationen an Meerrettichperoxidase (HRP) enthielt, der 50 μl einer 0,0034 %igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, gemischt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle a gezeigt. Es ist gezeigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–18 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle a
    Figure 00330001
  • Vergleichsbeispiel 1-2
  • Messung von α-Fetoprotein (AFP) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des im Vergleichsbeispiel 1 hergestellten Chemilumineszenzmittels
  • 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 800 ng/ml gereinigtes menschliches AFP (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 3 μg/ml monoklonalen Maus-anti-Mensch-AFT-Antikörper, der mit dem im Referenzbeispiel 2 hergestellten Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-AFP-Antikörper immobilisiert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 250 μl einer 0,1 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4) beschickt, die 4,0 × 10–5 M des Chemilumineszenzmittels, das im Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden ist, und 10–3 M p-Iodphenol enthielt, der 50 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die eine 0,0034%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, zugesetzt worden sind, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Lumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (6) zu erstellen. Wie es gezeigt ist, korreliert die Intensität gut mit der Konzentration. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von menschlichem AFP, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 0,5 ng/ml verwendet werden.
  • Vergleichsbeispiel 1-3
  • Messung der β-Kette von menschlichem Choriongonadotropin (βhCG) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des im Vergleichsbeispiel 3 hergestellten Chemilumineszenzmittels
  • 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 200 mlU/ml gereinigtes βhCG (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 2 μg/ml von im Referenzbeispiel 2 hergestellten monoklonalen Maus-anti-βhCG-Antikörper, der mit einem Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-βhCG-Antikörper immobilisiert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 250 μl einer 0,1 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4) beschickt, die 4 × 10–5 M des Chemilumineszenzmittels, das im Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden ist, und 10–3 M p-Iodphenol enthielt, der 50 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die eine 0,0034%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, zugesetzt worden sind, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Lumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (8) zu erstellen. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von βhCG, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 1,0 mlU/ml verwendet werden.
  • Vergleichsbeispiel 2
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 2 ml N,N-Dimethylformamid gelöst und die Lösung wurde 90 min bei Raumtemperatur stehengelassen und mit 2 ml reinem Wasser versetzt, um das Chemilumineszenzmittel herzustellen.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, wie es im Vergleichsbeispiel 1 verwendet worden ist, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um die Chemilumineszenz zu messen und dadurch die Leistung des Chemilumineszenzmittels zu bewerten. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.
  • Vergleichsbeispiel 2-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die 4,0 × 10–5 M des im Vergleichsbeispiel 2 hergestellten Chemilumineszenzmittels und 10–3 M p-Iodphenol enthielt, wurden mit 100 μl einer Meerrettichperoxidaselösung (HRP-Lösung), der 50 μl einer 0,0034 %igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, gemischt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle b gezeigt. Es ist gezeigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–18 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle b
    Figure 00360001
  • Vergleichsbeispiel 2-2
  • Messung von Prolactin (PRL) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des im Vergleichsbeispiel 2 hergestellten Chemilumineszenzmittels 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 200 ng/ml gereinigtes menschliches PRL (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 2 μg/ml monoklonalen Maus-anti-Mensch-PRL-Antikörper, der mit dem im Referenzbeispiel 2 hergestellten Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-PRL-Antikörper immobilisiert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 250 μl einer 0,1 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4) beschickt, die 4,0 × 10–5 M des Lucigenin-N,N-Dimethylacetoamid-Komplexes und 10–3 M p-Iodphenol enthielt, der 50 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die eine 0,0034%ige wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid enthielt, zugesetzt worden sind, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Lumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (7) zu erstellen. Wie es gezeigt ist, korreliert die Intensität gut mit der Konzentration. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von menschlichem PRL, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 1,0 ng/ml verwendet werden.
  • Vergleichsbeispiel 3
  • Herstellung eines Chemilumineszenzmittels
  • 1,5 mg Lucigenin wurden in einem Reagenzglas in 2 ml N-Methyl-2-pyrrolidon gelöst und die Lösung wurde 90 min bei Raumtemperatur stehengelassen und mit 2 ml reinem Wasser versetzt, um das Chemilumineszenzmittel herzustellen.
  • Bewertung der Leistung des Chemilumineszenzmittels
  • Das gleiche Verfahren, wie es im Vergleichsbeispiel 1 verwendet worden ist, wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um die Chemilumineszenz zu messen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.
  • Vergleichsbeispiel 3-1
  • Messung der Peroxidaseaktivität
  • 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die 4,0 × 10–5 M des im Vergleichsbeispiel 3 hergestellten Chemilumineszenzmittels und 10–3 M p-Iodphenol enthielt, wurden mit 100 μl einer Meerrettichperoxidaselösung mit unterschiedlicher Konzentration (HRP-Lösung), der 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt worden sind, gemischt, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen. Das Ausmaß der Chemilumineszenz wurde für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle c gezeigt. Es ist gezeigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–18 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle c
    Figure 00370001
  • Vergleichsbeispiel 4
  • Messung der Peroxidaseaktivität unter Verwendung von Luminol
  • Jeder einer Mehrzahl von Wells für eine Chemilumineszenzmessung wurde mit 200 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die verschiedene Konzentrationen an Merrettichperoxidase (HRP) enthielt, und 20 μl einer Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4) beschickt, die 10 mM p-Iodphenol enthielt, der 50 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die 5,6 × 10–5 M Luminol enthielt, und 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid in dieser Reihenfolge zugesetzt worden sind, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle d gezeigt. Es ist gezeigt, dass die HRP-Konzentration bis zu 1 × 10–17 mol/Assay gemessen werden kann. Tabelle d
    Figure 00380001
  • Vergleichsbeispiel 4-1
  • Messung von α-Fetoprotein (AFP) durch das simultane Sandwich-CLEIA-Verfahren unter Verwendung des Luminols
  • 50 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die 0 bis 800 ng/ml gereinigtes menschliches AFP (Standardmaterial) enthielt, und 100 μl einer 2% BSA-enthaltenden PBS-Lösung (pH: 7,4), die etwa 3 μg/ml monoklonalen Maus-anti-Mensch-AFT-Antikörper, der mit dem im Referenzbeispiel 2 hergestellten Peroxidaseenzym markiert war, enthielt, wurden in Wells eingebracht, die von einer weißen Mikroplatte gehalten wurden, in denen der im Referenzbeispiel 1 hergestellte polyklonale Hase-anti-Mensch-AFP-Antikörper immobilisiert war, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck von jedem Well entfernt und das Innere des Wells wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurde jeder Well mit 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die 10–3 M p-Iodphenol enthielt, beschickt, der 100 μl einer 0,1 M Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH: 8,4), die 5,6 × 10–5 M Luminol enthielt, und 50 μl einer 0,0034%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid zugesetzt wurden, um eine Chemilumineszenz zu erzeugen, deren Ausmaß für 0 bis 5 s durch ein Luminometer aufaddiert wurde, um die Lumineszenzintensität zu bestimmen. Die Lumineszenzintensität wurde gegen die Konzentration des Standardmaterials aufgetragen, um die Kalibrierungskurve (5) zu erstellen. Wie es gezeigt ist, korreliert die Intensität gut mit der Konzentration. Diese Kalibrierungskurve kann zur Bestimmung der Konzentration von menschlichem AFP, das in der Probe von menschlichem Serum vorliegt, bis 2,0 ng/ml verwendet werden.
  • Referenzbeispiel 1
  • Herstellung eines polyklonalen Antikörpers, der auf einem unlöslichen Träger immobilisiert ist
  • Ein von einem Tier (z.B. einem Hasen) stammender polyklonaler Antikörper, der eine bestimmte Reaktion mit einem Antigen zeigt, wurde in einer 10 mM Phosphat-gepufferten normalen Kochsalzlösung (PBS, pH: 7,4) in einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst. 0,1 ml dieser Lösung wurden in jeden Well überführt, der von einer weißen Mikroplatte (Lab System Corp.) gehalten wurde. Die Wells wurden 1 Stunde bei 37°C stehengelassen und mit PBS gewaschen, der 0,3 ml einer 1%igen wässrigen Rinderserumalbuminlösung (BSA-Lösung) zugesetzt worden sind. Die Wells wurden dann erneut 1 Stunde bei 37°C stehengelassen und durch Nachbeschichten behandelt, um eine weiße Mikroplatte herzustellen, die den polyklonalen Antikörper immobilisiert.
  • Referenzbeispiel 2
  • Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der mit Peroxidase markiert ist Ein von einer Maus stammender monoklonaler Antikörper, der eine bestimmte Reaktion mit einem Antigen zeigt, wurde in einer 10 mM Phosphat-gepufferten normalen Kochsalzlösung (PBS, pH: 7,4) in einer Konzentration von 1,0 mg/ml gelöst. 1 ml dieser Lösung wurde mit 0,1 ml einer Dimethylformamidlösung, die 10 mg/ml N-(m-Maleimidbenzosäure)-N-succinimidester (MBS) enthielt, 30 min bei 25°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Säule, die mit Sephadex G-25 gefüllt war, für eine Gelfiltration mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH: 6,0) geleitet, um das monoklonale MBS-Reaktionsprodukt von dem nicht umgesetzten MBS zu trennen.
  • Eine PBS-Lösung, die 1,0 mg/ml Merrettichperoxidase (HRP) als Peroxidaseenzym enthielt, wurde mit einer Ethanollösung, die 10 mg/ml N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) enthielt, 30 min bei 25°C umgesetzt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Säule, die mit Sephadex G-25 gefüllt war, zur Reinigung mittels Gelfiltration mit einer 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH: 4,5) geleitet. Die Fraktion, die das SPDP-HRP-Reaktionsprodukt enthielt, wurde gesammelt und etwa 10-fach angereichert, während sie mit Eis in einem Kollodiumbeutel gekühlt wurde. Die Fraktion wurde dann mit 1 ml einer 0,1 M Acetat-gepufferten normalen Kochsalzlösung (pH: 4,5), die eine 0,1 M Dithiothreitollösung enthielt, 30 min bei 25°C gemischt, um die in das HRP-Molekül eingeführte Pyridyldisulfidgruppe zu reduzieren. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Säule, die mit Sephadex G-25 gefüllt war, für eine Gelfiltration geleitet, um die Fraktion zu erhalten, die das Thiol-HRP-Reaktionsprodukt enthielt.
  • Das Gemisch aus dem monoklonalen MBS-Reaktionsprodukt und dem Thiol-HRP-Reaktionsprodukt wurde auf 4 mg/ml als Protein angereichert, während es mit Eis in einem Kollodiumbeutel gekühlt wurde. Es wurde dann 24 Stunden bei 4°C stehengelassen und durch eine Säule geleitet, die mit Ultragel AcA44 (SEPRACOR) gefüllt war, um den mit dem Peroxidaseenzym markierten monoklonalen Antikörper zu erhalten.
  • Figure 00410001
  • Es ist beschrieben worden, dass das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel, das durch jedwedes der Beispiele 1 bis 8 hergestellt worden ist, mit Peroxidase bei einem spezifischen pH-Niveau empfindlich reagiert, so dass eine Lumineszenz erzeugt wird, deren Ausmaß von der Peroxidasekonzentration abhängt, was die Messung von Peroxidase mit einer sehr niedrigen Konzentration ermöglicht. Andererseits erzeugen die Chemilumineszenzmittel, die in den Vergleichsbeispielen 1 bis 4 hergestellt worden sind, eine Lumineszenz mit einer niedrigeren Intensität und weisen höhere Obergrenzen der messbaren Konzentrationen auf. Bei einem Vergleich der Ergebnisse der Beispiele 1-1 bis 8-1 mit den Ergebnissen der Vergleichsbeispiele 1-1 bis 4 zeigt sich, dass das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel eine höhere Peroxidaseempfindlichkeit aufweist als die herkömmlichen Chemilumineszenzmittel, und dass es Peroxidase mit einer niedrigeren Konzentration nachweisen kann.
  • Bei einem Vergleich der Ergebnisse der Beispiele 1-2 bis 5-2 mit den Ergebnissen der Vergleichsbeispiele 1-2 bis 4-1 zeigt sich auch, dass das erfindungsgemäße Chemilumineszenzmittel Spurenkomponenten, wie z.B. AFP, PRL und βhCG, mit einer höheren Empfindlichkeit nachweisen kann.
  • Industrielle Nutzung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Chemilumineszenzmittel, das einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz enthält, und ein hochempfindliches Chemilumineszenzanalyseverfahren bereit, bei dem dieses eingesetzt wird, das insbesondere zur Messung der Peroxidaseaktivität und in einem Enzymimmunoassay geeignet ist, was in hohem Maß zur Kommerzialisierung der hochempfindlichen Chemilumineszenzanalysetechnologie für verschiedene Bereiche, wie z.B. klinische Tests, Nahrungsmitteltests und Tier/Pflanzen-Tests, beitragen kann.

Claims (15)

  1. Chemilumineszenzmittel, gekennzeichnet durch die in der Gegenwart eines Peroxids hergestellte Chemilumineszenz, deren Ausmaß in Abhängigkeit von der Konzentration an Peroxidaseenzym variiert, und als die Hauptinhaltsstoffe einen Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz, dargestellt durch die allgemeine Formel (1):
    Figure 00430001
    (wobei R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen und Halogen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, und X· ein Säureradikal als der durch den Elektronentransfer von dem Gegenanion des Bisacridiniumsalzes als dem Precursor verbliebene Rest ist), und eine N,N-disubstituierte Carbonsäureamidverbindung, dargestellt durch die allgemeine Formel (2), umfassend:
    Figure 00430002
    (wobei R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10 und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe mit einer Alkyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppe oder Halogen substituiert sein kann, R2 aus der Gruppe, bestehend aus Methyl- und Ethyigruppen, ausgewählt ist, und R3 aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, einer Alkenylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 10, und einer Arylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt ist, wobei die Arylgruppe mit A1kyl-, Nitro-, Hydroxyl- oder Amingruppen oder Halogen substituiert sein kann, und R1 und R3 aneinander gebunden sein können, um zusammen mit dem Kohlenstoffatom und Stickstoffatom, welche in den Carbonyl- bzw. Amidgruppen sind, an welche R1 und R3 jeweils gebunden sind, einen Ring zu bilden), wobei der Charge-Transfer-Komplex von N,N'-disubstituiertem 9,9'-Bisacridiniumsalz durch Umsetzen, in der Gegenwart von eingestrahltem Licht, eines durch die allgemeine Formel (1A) dargestellten N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes:
    Figure 00440001
    (wobei R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Al kyl-, Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen und Halogen, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, und Xn– ein n-wertiges Anion ist, und (n) 1 oder 2 ist), mit der durch die allgemeine Formel (2) dargestellten N,N-disubstituierten Carbonsäureamidverbindung hergestellt ist.
  2. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 1, ferner umfassend eine durch die allgemeine Formel (3) dargestellte Aminoalkoholverbindung: (HCR)mNH3-m (3)(wobei R eine zweiwertige, aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 5 ist, und (m) eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist).
  3. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl-, Aryl- und halogenierten Arylgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20, ausgewählt sind, und R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Halogenatomen, und Alkyl-, Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 20, für die allgemeine Formel (1) ausgewählt sind.
  4. Chemilumineszenzmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, und Aryl- und halogenierten Arylgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt sind, und R3, R4, R5 und R6 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Halogenatomen, und einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, und Aryl-, Alkoxy- und Aryloxygruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt sind.
  5. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 4, wobei das R1 und R2 jeweils aus der Gruppe, bestehend aus einer Alkylgruppe mit einer Kohlenstoffanzahl von 1 bis 10, und Aryl- und halogenierten Arylgruppen mit einer Kohlenstoffanzahl von 6 bis 20, ausgewählt sind, und R3, R4, R5 und R6 jeweils Wasserstoffatom sind.
  6. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das N,N'-disubstituierte 9,9'-Bisacridiniumsalz für den Charge-Transfer-Komplex aus der Gruppe, bestehend aus N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdinitrat, N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydrochlorid und N,N'-Dimethyl-9,9'-bisacridiniumdihydroiodid, ausgewählt ist.
  7. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die N,N'-disubstituierte Carbonsäureamidverbindung aus der Gruppe, bestehend aus N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und N,N-Dimethyl-2-pyrrolidon, ausgewählt ist.
  8. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aminoalkoholverbindung aus der Gruppe, bestehend aus Monoalkanolamin, Dialkanolamin und Trialkanolaminen, ausgewählt ist.
  9. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 2, wobei die durch die allgemeine Formel (3) dargestellte Aminoalkoholverbindung während und/oder nach der Reaktion zu dem Reaktionssystem gegeben wird.
  10. Chemilumineszenzmittel nach Anspruch 1 oder 9, wobei die Lichtquelle für die Lichteinstrahlung sichtbares Licht emittiert.
  11. Chemilumineszenz-Analyseverfahren zum Messen von Peroxidaseaktivität in der Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors, gekennzeichnet durch das Verwenden des Chemilumineszenzmittels nach einem der Ansprüche 1, 2 und 9 zum Messen der Peroxidaseenzymaktivität.
  12. Chemilumineszenz-Analyseverfahren zum Messen von Peroxidaseaktivität nach Anspruch 11, wobei ferner ein Lumineszenzpromoter, welcher aus minde stens einer Art einer phenolischen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus p-Iodphenol, p-Phenylphenol und 6-Hydroxybenzothiazol, aufgebaut ist, zur Messung der Peroxidaseenzymaktivität in Gegenwart des Wasserstoffakzeptors verwendet wird.
  13. Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay, welcher das Mischen eines mit Peroxidaseenzym markierten Antikörpers oder Antigens mit einem Antigen, Antikörper oder Agglomerat davon in einer zu analysierenden Probe, um den Immunkomplex aus dem Marker/Antigen-Antikörper-Komplex durch die Antigen-Antikörper-Reaktion zu bilden, das Abtrennen des Immunkomplexes, das Herstellen von dessen Chemilumineszenz in der Gegenwart eines Wasserstoffakzeptors durch die Hilfe des Chemilumineszenzmittels nach einem der Ansprüche 1, 2 und 9, und das Messen der Lumineszenzintensität, um das Antigen oder den Antikörper in der Probe quantitativ zu analysieren, umfasst.
  14. Chemilumineszenz-Enzymimmunoassay nach Anspruch 13, wobei die Antigen-Antikörper-Reaktion in der Gegenwart des auf einem unlöslichen Träger immobilisierten Antigens bewirkt wird und der mit dem Peroxidaseenzym markierte Immunkomplex auf dem Träger gebildet wird.
  15. Charge-Transfer-Komplex des durch die allgemeine Formel (1) dargestellten N,N'-disubstituierten 9,9'-Bisacridiniumsalzes, welcher für ein Chemilumineszenzmittel verwendet wird.
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