JP4212698B2 - 新規化学発光試薬 - Google Patents
新規化学発光試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4212698B2 JP4212698B2 JP36157198A JP36157198A JP4212698B2 JP 4212698 B2 JP4212698 B2 JP 4212698B2 JP 36157198 A JP36157198 A JP 36157198A JP 36157198 A JP36157198 A JP 36157198A JP 4212698 B2 JP4212698 B2 JP 4212698B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- bisacridinium
- carbon atoms
- chemiluminescent reagent
- disubstituted
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Other In-Based Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能な化学発光試薬であり、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光試薬として、古くから用いられているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法（以下、必要に応じ「ＣＬＥＩＡ」と略称する。）等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【０００３】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑である。また、安定性にも優れ、取り扱いが比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必ずしも充分とは云えない。
従って、化学発光試薬の調製及び発光系の操作が容易であり、かつ高感度測定が可能な、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、過酸化水素等の過酸化物を基質とするペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、特定のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボンアミド化合物を含む混合物またはこれに特定のアミノアルコール化合物を添加した混合物が、特定ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基づいて本発明に到達したものである。
従って、本発明の第一は、下記一般式（１）
【０００６】
【化４】
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、
及び下記一般式（２）
【０００７】
【化５】
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする、ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光することを特徴とする化学発光試薬に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
第一の発明の化学発光試薬にアミノアルコール化合物を添加することによりペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光することを特徴とする化学発光試薬に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
第一の発明の化学発光試薬の主成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、
次の一般式（１）
【００１０】
【化６】
で表わされる化合物である。
【００１１】
上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、それぞれ炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特にフェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特にクロロフェニル基が好ましい。
【００１２】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
また、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。
【００１３】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸収帯を分光光度計を用いて測定することができる。
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙げられるが、これらのなかで、特にＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１４】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。
第一の発明の化学発光試薬の主成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、次の一般式（２）
【００１５】
【化７】
で表わされる化合物である。
【００１６】
上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される。該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１７】
上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を非限定的に挙げることができる。
第二の発明に関する化学発光試薬の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、次の一般式（３）
【００１８】
【化８】
で表わされる化合物である。
【００１９】
上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わす。
上記アミノアルコール化合物の具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２０】
第一の発明になる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、もう一つの成分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用している。また、第一の発明になる化学発光試薬に対し特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる第二の発明になる化学発光試薬において、このアミノアルコール化合物を添加することにより、発光反応のブランク値を低下させると共に、より廣いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実現することが可能になる。このアミノアルコール化合物の添加効果については必ずしもはっきりはしていないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定を可能にしているものと考えられる。
【００２１】
本発明の化学発光試薬の製造方法は任意であるが、第一の発明の化学発光試薬の調製は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然光の下に放置することにより得られるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。
【００２２】
また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合比は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で採用することができる。
【００２３】
第二の発明になる化学発光試薬は、第一の発明の化学発光試薬に特定のアミノアルコール化合物を添加すことにより得られるが、その添加はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後でよいが、電荷移動反応後に添加するのが好ましい。尚、ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反応前の添加も含む。アミノアルコール化合物の添加量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モル、好ましくは１〜２千倍モルでよい。
【００２４】
本発明の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光するという特性を有する。
【００２５】
この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤を添加することによって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げることができる。
【００２６】
上記新規化学発光試薬を用いて化学発光分析を行なう場合には、化学発光試薬は１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲で採用される。また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度としては、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲でよい。
【００２７】
また、化学発光反応に用いる過酸化物は、無機過酸化物及び有機過酸化物を任意に選択できるが、特に過酸化水素が好ましい。過酸化物は、化学発光試薬に対して充分に過剰な量が必要であり、その使用量としては、化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が採用される。
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２８】
化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に挙げることができる。これらの緩衝液の濃度としては、１ｍＭ〜１Ｍの範囲が好ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例等を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等により限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計を用いる方法により測定して確認した。
【００３１】
［実施例１−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例１で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
［実施例２］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。
【００３４】
［実施例２−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例２で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３５】
【表２】
【００３６】
［実施例３］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及 びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。
【００３７】
［実施例３−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例３で調製した上記化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３８】
【表３】
【００３９】
［実施例４］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００４０】
［実施例４−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例４で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表４に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００４１】
【表４】
【００４２】
［実施例５］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、 Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発光試薬を得た。
【００４３】
［実施例５−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例５で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表５に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００４４】
【表５】
【００４５】
【発明の効果】
本発明により提供される新規化学発光試薬は、安価な製造原料を用いて比較的短時間で容易に製造でき、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有するのでこれを利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。更に、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗原、抗体等を、ウェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸をそれぞれ特異的に且つ高感度で測定することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能な化学発光試薬であり、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光試薬として、古くから用いられているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法（以下、必要に応じ「ＣＬＥＩＡ」と略称する。）等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【０００３】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑である。また、安定性にも優れ、取り扱いが比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必ずしも充分とは云えない。
従って、化学発光試薬の調製及び発光系の操作が容易であり、かつ高感度測定が可能な、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、過酸化水素等の過酸化物を基質とするペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、特定のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボンアミド化合物を含む混合物またはこれに特定のアミノアルコール化合物を添加した混合物が、特定ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基づいて本発明に到達したものである。
従って、本発明の第一は、下記一般式（１）
【０００６】
【化４】
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。）
で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、
及び下記一般式（２）
【０００７】
【化５】
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする、ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光することを特徴とする化学発光試薬に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
第一の発明の化学発光試薬にアミノアルコール化合物を添加することによりペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光することを特徴とする化学発光試薬に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
第一の発明の化学発光試薬の主成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、
次の一般式（１）
【００１０】
【化６】
で表わされる化合物である。
【００１１】
上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、それぞれ炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特にフェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特にクロロフェニル基が好ましい。
【００１２】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
また、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。
【００１３】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸収帯を分光光度計を用いて測定することができる。
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙げられるが、これらのなかで、特にＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１４】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。
第一の発明の化学発光試薬の主成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、次の一般式（２）
【００１５】
【化７】
で表わされる化合物である。
【００１６】
上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される。該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１７】
上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を非限定的に挙げることができる。
第二の発明に関する化学発光試薬の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、次の一般式（３）
【００１８】
【化８】
で表わされる化合物である。
【００１９】
上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わす。
上記アミノアルコール化合物の具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２０】
第一の発明になる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、もう一つの成分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用している。また、第一の発明になる化学発光試薬に対し特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる第二の発明になる化学発光試薬において、このアミノアルコール化合物を添加することにより、発光反応のブランク値を低下させると共に、より廣いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実現することが可能になる。このアミノアルコール化合物の添加効果については必ずしもはっきりはしていないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定を可能にしているものと考えられる。
【００２１】
本発明の化学発光試薬の製造方法は任意であるが、第一の発明の化学発光試薬の調製は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然光の下に放置することにより得られるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。
【００２２】
また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合比は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で採用することができる。
【００２３】
第二の発明になる化学発光試薬は、第一の発明の化学発光試薬に特定のアミノアルコール化合物を添加すことにより得られるが、その添加はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後でよいが、電荷移動反応後に添加するのが好ましい。尚、ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反応前の添加も含む。アミノアルコール化合物の添加量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モル、好ましくは１〜２千倍モルでよい。
【００２４】
本発明の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光するという特性を有する。
【００２５】
この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤を添加することによって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げることができる。
【００２６】
上記新規化学発光試薬を用いて化学発光分析を行なう場合には、化学発光試薬は１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲で採用される。また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度としては、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲でよい。
【００２７】
また、化学発光反応に用いる過酸化物は、無機過酸化物及び有機過酸化物を任意に選択できるが、特に過酸化水素が好ましい。過酸化物は、化学発光試薬に対して充分に過剰な量が必要であり、その使用量としては、化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が採用される。
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２８】
化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に挙げることができる。これらの緩衝液の濃度としては、１ｍＭ〜１Ｍの範囲が好ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例等を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等により限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計を用いる方法により測定して確認した。
【００３１】
［実施例１−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例１で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
［実施例２］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。
【００３４】
［実施例２−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例２で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３５】
【表２】
【００３６】
［実施例３］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及 びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。
【００３７】
［実施例３−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例３で調製した上記化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３８】
【表３】
【００３９】
［実施例４］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００４０】
［実施例４−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例４で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表４に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００４１】
【表４】
【００４２】
［実施例５］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、 Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発光試薬を得た。
【００４３】
［実施例５−１］
ペルオキシダーゼ活性の測定方法
実施例５で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表５に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００４４】
【表５】
【００４５】
【発明の効果】
本発明により提供される新規化学発光試薬は、安価な製造原料を用いて比較的短時間で容易に製造でき、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有するのでこれを利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。更に、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗原、抗体等を、ウェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸をそれぞれ特異的に且つ高感度で測定することができる。
Claims (5)
- 下記一般式（１）
で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体であって、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍに極大を持つ吸収帯を有するもの、及び下記一般式（２）
で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする、ペルオキシターゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光することを特徴とする化学発光試薬。 - 請求項１に記載の化学発光試薬に、
下記一般式（３）
で表されるアミノアルコール化合物を添加することによりペルオキシターゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光することを特徴とする化学発光試薬。 - 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体が、Ｎ，Ｎ‘−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム沃化水素酸塩又はＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩酸塩の電荷移動錯体である請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
- 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１又は２のいずれかの請求項に記載の化学発光試薬。
- 前記Ｎ，Ｎ‘−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム沃化水素酸塩又は塩酸塩が、Ｎ，Ｎ‘−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム硝酸塩と沃化アルカリまたは塩化アルカリとの反応生成物である請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36157198A JP4212698B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | 新規化学発光試薬 |
| DE69933850T DE69933850T2 (de) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemilumineszenzmittel und chemilumineszenzanalyseverfahren mit deren verwendung |
| EP99937071A EP1038939B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
| US09/529,546 US6395503B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
| CA002306752A CA2306752C (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagent and chemiluminescent analysis using the same |
| PCT/JP1999/004401 WO2000009626A1 (fr) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Reactifs chimioluminescents et procedes d'analyse par chimioluminescence dans lesquels on utilise lesdits reactifs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36157198A JP4212698B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | 新規化学発光試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000178550A JP2000178550A (ja) | 2000-06-27 |
| JP4212698B2 true JP4212698B2 (ja) | 2009-01-21 |
Family
ID=18474117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36157198A Expired - Fee Related JP4212698B2 (ja) | 1998-08-14 | 1998-12-18 | 新規化学発光試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4212698B2 (ja) |
-
1998
- 1998-12-18 JP JP36157198A patent/JP4212698B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000178550A (ja) | 2000-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPWO2007055364A1 (ja) | パーオキシナイトライト蛍光プローブ | |
| JPH11514006A (ja) | ジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル類及びそれらの化学ルミネセント分析法への利用 | |
| EP1038939B1 (en) | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same | |
| WO2008059910A1 (fr) | Sonde fluorescente sensible au ph | |
| JP4212698B2 (ja) | 新規化学発光試薬 | |
| JP5048889B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3792959B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3779849B2 (ja) | 化学発光試薬の製造方法 | |
| JP3827465B2 (ja) | 改良された化学発光試薬 | |
| JP3792897B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
| JP3692265B2 (ja) | 化学発光試薬の製造方法 | |
| JP3720977B2 (ja) | 化学発光試薬及びその製造方法 | |
| JP4028647B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
| JP3792908B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3792898B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP4028648B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3720988B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
| JP3792885B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3958452B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
| JP4177498B2 (ja) | 酵素免疫測定法 | |
| JP4028644B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3996283B2 (ja) | 新規化学発光試薬の製造方法 | |
| JP4286356B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3745113B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
| JP3815905B2 (ja) | 酵素免疫測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041228 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132 Effective date: 20080304 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080507 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080528 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080624 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080825 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080930 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081029 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111107 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111107 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121107 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121107 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131107 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |