JP3792897B2 - 新規化学発光試薬及びその製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能な化学発光試薬に関し、特に化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光試薬として、古くから用いられているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在下で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【０００３】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑である。又、安定性にも優れ、取り扱いが比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必ずしも充分とは云えない。
【０００４】
従って、試薬の調製及び発光系の操作が容易で、かつ高感度測定が可能な、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、過酸化水素を基質とするペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬及びその製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、ルシゲニン等のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射することにより得られる化学発光試薬が、特定アルカリ性ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基づいて本発明に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより得られる化学発光性物質を含有することを特徴とする化学発光試薬に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることを特徴とする化学発光試薬の製造方法に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、次の一般式（１）
【００１０】
【化５】

で表すことができる。
【００１１】
一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、各々、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよい。アルキル、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜１４を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜２０のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１２】
一般式（１）において、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
【００１３】
また、一般式（１）において、Ｘ^n-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではなく、硝酸イオン（ＮＯ₃ ^-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン等）、（メタ）リン酸イオン（ＰＯ₃ ^-）等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１４】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）等を挙げることができる。特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好適である。
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、次の一般式（２）
【００１５】
【化６】

で表すことができる。
【００１６】
上記一般式（２）において、Ｒ₁ は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ₂ は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ₃ は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。又、Ｒ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１７】
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げることができる。
【００１８】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられる光照射用の光線としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、特に白熱電灯が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示すことと、この反応を光遮蔽下に実施した場合にはペルオキシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られないことから、化学発光性化合物の生成には光照射が重要な役割を担っていることが認められる。Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの対アニオンからの電化移動が促進され、イオン性の高い塩類からラジカル性を有する電化移動錯体に変化し、この錯体がＮ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位もしくは溶媒和によって安定化され、この安定化されたラジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解により生成する活性酸素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経て発光するので、ペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強度が得られるものと考えられる。
【００１９】
本発明の化学発光試薬の製造において、上記光照射を行なう際に必要なＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対するＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物のモル比としては、過剰量が望ましいが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モルの割合で用いることができ、更に、この場合において、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を反応溶媒として用いることもできる。
【００２０】
反応温度は用いられる溶媒の有無及び種類によって異なるが、一般的に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３０分〜１０時間の範囲の時間で行なうことができる。
【００２１】
本発明の化学発光試薬は、塩基性条件下において過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在で反応して発光するが、この反応は過酸化水素の検出及びペルオキシダーゼの定量等に利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、更に、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【００２２】
本発明の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェニリン等が非限定的に挙げられる。
【００２３】
本発明の新規化学発光試薬を用いて化学発光分析を行なう場合には、１０^-8〜１Ｍ、好ましくは１０^-6〜１０^-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、特に５０〜３００μｌの範囲で用いるのが好ましい。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲で用い、その濃度は１０^-6〜１Ｍ、特に１０^-4〜１０^-2Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、化学発光反応に用いる過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、特に１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが好ましい。
【００２４】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２５】
化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例等に限定されるものではない。
【００２７】
［実施例１］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、光照射せずに反応を行なった比較例１に較べて感度及び発光強度において大幅な改善が認められた。
【００２８】
【表１】

【００２９】
［比較例１］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で３時間静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬溶液を直ちに２０μｌ採り、複数の化学発光測定用ウェルに加え、次に、このウェルに各々西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の異なる複数の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示すような発光強度が得られた。
【００３０】
【表２】

【００３１】
［実施例２］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを５時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、光照射せずに反応を行なった比較例２に較べて発光強度において改善が認められた。
【００３２】
【表３】

【００３３】
［比較例２］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬を直ちに２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示すような発光強度が得られた。
【００３４】
【表４】

【００３５】
［実施例３］
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチル−２−ピロリドン１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴注で２５０Ｗのコピーランプを３時間照射することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製する。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表５に示すような発光強度が得られ、光照射せずに反応を行なった比較例３に較べて発光強度において改善が認められた。
【００３６】
【表５】

【００３７】
［比較例３］
ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ−メチル−２−ピロリドン２ｍｌを加えて溶解させた後、室温において９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混合することにより化学発光性物質を含有する化学発光試薬を得る。
［ペルオキシダーゼ活性の測定］
この化学発光試薬溶液を直ちに２０μｌずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２００μｌ及びｐ−ヨードフェノール１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液２０μｌを加えた後、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表６に示すような発光強度が得られた。
【００３８】
【表６】

【００３９】
【発明の効果】
本発明により提供される新規化学発光試薬は、安価な製造原料を用いて比較的に短時間で容易に製造することができ、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。更に、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原等をウェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン法及びノーザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸を各々特異的に、且つ高感度で測定することができる。

Claims (7)

1. 下記一般式（１）
   

   

   （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基であり、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子であり、Ｘは硝酸イオン又はハロゲン化物イオンであり、ｎは１である。）
   で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、
   下記一般式（２）
   

   

   （一般式（２）において、Ｒ₁ は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アクリル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、Ｒ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合しているアミド基の炭素原子及び窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
   で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることにより得られる化学発光性物質を含有することを特徴とする化学発光試薬。
2. 前記Ｎ，Ｎ'−ジ置換−９，９'−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ'−ジメチル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジエチル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジプロピル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジブチル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジイソブチル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９'−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ'−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９'−ビスアクリジニウムジナイトレートからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１に記載の化学発光試薬。
3. 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に記載の化学発光試薬。
4. 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１に記載の化学発光試薬。
5. 前記光照射に用いる光源が可視光を発する光源である請求項１のいずれかの項に記載の化学発光試薬。
6. 下記一般式（１）
   

   

   （上記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基であり、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子であり、Ｘは硝酸イオン又はハロゲン化物イオンであり、ｎは１である。）
   で表されるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を
   下記一般式（２）
   

   

   （一般式（２）において、Ｒ₁ は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アクリル基又はフェニル基であり、Ｒ₂ は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、Ｒ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合しているアミド基の炭素原子及び窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
   で表されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射下で反応させることを特徴とする化学発光試薬の製造方法。
7. 前記光照射に用いる光源が可視光を発する光源である請求項６に記載の化学発光試薬の製造方法。