JP3745113B2 - ペルオキシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法(ケミルミネッセンス)を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、さらに詳しくは、特定のアクリジニウム塩類の還元生成物を化学発光性物質として用いるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法としては、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他アビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析方法が挙げられる。
【0003】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として用い水素供与体を酸化し色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法、または蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行なわれている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性の測定に比色法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、従来、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にp−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性をさらに高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定のさらなる高感度化が望まれていた。従って、本発明は、上記のような開発事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をさらに高感度で測定可能な化学発光法による新規な測定系を提供することを課題とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光性物質として、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物を用い、水素受容体として過酸化水素を、そして、さらに好ましくは発光増強剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる化学発光系に比較してさらに高感度でペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し本発明の完成に到達したものである。
【0006】
すなわち、本発明の第一は、
下記一般式(1)
【0007】
【化4】
(上記一般式(1)において、R1 およびR2 は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、R3 、R4 、R5 およびR6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Xn-はn価の陰イオンであり、nは1または2である。)
で表わされるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を化学発光性物質として用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とするペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【0008】
また、本発明の第二は、
下記一般式(1)
【0009】
【化5】
(上記一般式(1)において、R1 およびR2 は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、R3 、R4 、R5 およびR6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Xn-はn価の陰イオンであり、nは1または2である。)
で表わされるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を化学発光性物質として用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に発光増強剤を用いることを特徴とするペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【0010】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
【0011】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光性物質としてN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用い、水素受容体の存在下において化学発光反応によりペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものであり、さらに好ましくは、ペルオキシダーゼ酵素活性を、上記化学発光性物質を用い水素受容体および発光増強剤の存在下において化学発光反応により測定する方法に関するものである。その測定手法は任意であり、一般に、化学発光性物質、発光増強剤およびペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性pH領域において水素受容体を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法等を採用することができる。
【0012】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光性物質の出発物質は、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類であり、一般式(1)
【0013】
【化6】
で表わされる化合物である。一般式(1)において、R1 およびR2 は、各々、アルキル基、アリール基またはハロゲン化アリール基であり、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、炭素数6〜20のものであり、各々、炭素数1〜14のアルキル基で置換されたものでもよいが、特にフェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、式中、R3 、R4 、R5 およびR6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基またはハロゲン原子であり、互いに同一でも異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のものでもよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数6〜20のものであり、置換基としてアルキル基を有するものでもよい。
【0014】
前記一般式(1)において、Xn-はn価の陰イオンであり、nは1または2である。陰イオンとしては、特に限定されるものではないが、硝酸イオン(NO3 -)、ハロゲン化物イオン(例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン等)等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかでは特に硝酸イオンが好ましい。
【0015】
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の具体例を例示すると、N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジエチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジプロピル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジブチル−9,9’−ビスアクジニウム塩、N,N’−ジペンチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジ−m−クロロフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩等を挙げることができ、特に、N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
【0016】
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物は、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスジヒドロアクリジン誘導体を含有してもよく、該誘導体は、下記一般式(2)
【0017】
【化7】
で表することができる。
【0018】
一般式(2)において、R11、およびR22は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、炭素数6〜20のものであり、各々、アルキル基で置換されたものでよいが、特に、フェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、R33、R44、R55およびR66は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のものでよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数6〜20のものであり、アルキル基で置換されたものでもよい。
【0019】
これらの化学発光性物質は、pH7.5〜13の塩基性条件下において、過剰の水素受容体、例えば、過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。
【0020】
この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められている。このようなフェノール性化合物としては、p−ヨードフェノール、p−フェニルフェノール、6−ヒドロキシベンゾチアゾールが特に好ましいが、その他にもp−ヒドロキシ桂皮酸、p−(4−クロロフェニル)フェノール、p−(4−ブロモフェニル)フェノール、p−(4−ヨードフェニル)フェノール、p−ブロモフェノール、p−クロロフェノール、2−ナフトール、ホタルルシフェリン等を例示することができる。
【0021】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法において用いられる化学発光性物質の濃度は、還元処理の出発原料であるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の濃度に換算して、10-6〜1M、好ましくは10-4〜10-2Mの範囲であり、その使用量としては、10〜500μl、好ましくは50〜300μlの範囲でよい。また、発光増強剤の使用量は化学発光性物質の0.01〜100倍モル、好ましくは、0.1〜10倍モルの範囲であり、濃度は10-6〜1M、特に、10-4〜10-2Mの範囲が好ましい。
【0022】
また、化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではなく、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、特に、過酸化水素が好ましい。この水素受容体の使用量は化学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光性物質に対して3〜1万倍モル、特に、10〜1000倍モルの範囲で用いることが好ましい。
【0023】
化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としてはトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度としては1mM〜1Mが好ましい。また、反応時には界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【0024】
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩の還元処理により得られる反応生成物は、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解反応で生成する発生期の酸素により酸化されてN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム化合物となり、さらに過剰に存在する過酸化水素と反応して励起状態のジオキセタン構造を形成した後、アルカリで分解されてアクリドンを生成して基底状態に戻るときに発光するものと推定される。
【0025】
本発明の化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測定されるが、その測定の開始点および積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時間を選択することが好ましい。例えば、測定開始点は試薬混合後0〜1時間、好ましくは0〜30分、特に好ましくは0〜15分であり、測定の積算時間は1秒〜1分、好ましくは1〜30秒、特に好ましくは1〜10秒である。
【0026】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物の製造方法は任意であるが、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類を還元剤を用いて還元処理することにより容易に製造することができる。用いられる還元剤としては、リチウムアルミニウムハイドライド、リチウムボロンハイドライド、ナトリウムボロンハイドライド等が挙げられるが、リチウムアルミニウムハイドライドが特に好ましい。また、還元処理の際に、N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物、例えば、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N,N−ジメチルアクリルアミド、N,N−ジメチルベンズアミド等を添加することもできる。
【0027】
還元反応は反応溶媒中で行なうことが好ましい。反応溶媒としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、限定されるものではなく、特に、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エーテル類等が好ましく用いられる。反応温度は用いられる還元剤および反応溶媒の種類によって異なるが、一般的に、−10〜+150℃、好ましくは0〜120℃、特に好ましくは20〜90℃の範囲の温度である。反応時間は1分〜一昼夜、好ましくは10分〜12時間、特に好ましくは30分〜5時間の範囲である。
【0028】
また、本発明によれば、ペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスジヒドロアクリジン塩類の還元反応生成物からなる化学発光測定試薬を提供することができ、N,N’−ジ置換−9,9’−ヒスアクリジウム塩還元反応生成物、水素受容体の過酸化水素、発光増強剤のフェノール性化合物等との組合せからなるペルオキシダーゼ活性測定用試薬キットを提供することができる。この化学発光測定用試薬キットは効率的な化学発光測定に極めて有用である。
【0029】
【実施例】
以下、参考例および比較例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。なお、実施例中の%は重量%を意味する。
【0030】
[参考例1]
化学発光試薬の調製
ルシゲニン(N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレート)1mgを試験管に採り、撹拌しながら1,4−ジオキサン1ml中へ加えてルシゲニンを1,4−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに水素化リチウムアルミニウム粉末150mgを添加して、80℃で2時間撹拌して還元処理した後、反応生成物を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のpHを1N塩酸で7.0に調整することによりルシゲニンの還元反応生成物を含有する化学発光試薬を得た。
【0031】
[実施例1]
ペルオキシダーゼ活性の測定
参考例1で調製した化学発光試薬ルシゲニンの還元反応生成物を0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)で10倍に希釈した溶液10μlおよびp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)100μlに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)水溶液50μlを混合し、これに0.0034重量%過酸化水素水溶液50μlを加え、ルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間発光量を積算した結果、表1に示す如くHRPを5×10-19 mol/assayまで測定することが可能であった。
【0032】
【0033】
[実施例2]
ペルオキシダーゼ活性の測定
参考例1で調製した化学発光試薬ルシゲニンの還元反応生成物および6−ヒドロキシベンゾチアゾールを10-3Mの濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)100μlに、種々の濃度水準のHRP水溶液50μlを混合し、これに0.0034重量%過酸化水素水溶液50μlを加えルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間発光量を積算した結果、表2に示すようにHRPを10-18 mol/assayまで測定することが可能であった。
【0034】
【0035】
[比較例1]
ルミノールを5.6×10-5Mおよびp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)100μlに、種々の濃度水準のHRP水溶液50μlを混合した後、これに0.0034重量%過酸化水素水溶液50μlを加え、ルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間発光量を積算した結果、表3に示すようにHRPを10-17 mol/assayまでは測定できることが認められた。
【0036】
【0037】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を、従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、ペルオキシダーゼを標識物質に用いる酵素免疫測定法により抗原抗体類を、ハイブリダイゼーションアッセイ法により核酸類を各々より高感度に検出することができ、また定量することもできる。
Claims (8)
- 下記一般式(1)
で表わされるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を化学発光性物質として用い、水素受容体の存在下において、ペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に発光増強剤を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 前記N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類が、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジエチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジプロピル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジブチル−9,9'−ビスアクジニウム塩、N,N'−ジペンチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、またはN,N'−ジ−m−クロロフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩である請求項1または2に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類がN,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項1または2に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記水素受容体が過酸化水素である請求項1〜4のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記発光増強剤がフェノール性化合物である請求項2〜5のいずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記フェノール性化合物がp−ヨードフェノール、p−フェニルフェノールおよび6−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なくとも1種の化合物である請求項6に記載のペルオキジダーゼ活性の測定方法。
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