JP3996283B2 - 新規化学発光試薬の製造方法 - Google Patents
新規化学発光試薬の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3996283B2 JP3996283B2 JP32956698A JP32956698A JP3996283B2 JP 3996283 B2 JP3996283 B2 JP 3996283B2 JP 32956698 A JP32956698 A JP 32956698A JP 32956698 A JP32956698 A JP 32956698A JP 3996283 B2 JP3996283 B2 JP 3996283B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- chemiluminescent reagent
- producing
- disubstituted
- bisacridinium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Other In-Based Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能な化学発光試薬として、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬及びその製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
化学発光試薬として、従来から用いられているルシゲニン(N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレート)は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリの存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素のグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とする化学発光分析法は、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑であることから、ペルオキシダーゼを標識酵素に用いる化学発光分析法用の安価な化学発光試薬の開発が望まれていた。
【0004】
本発明は、上記事情に鑑み、過酸化水素を基質とするペルオキシダーゼを用いることができる新規な化学発光試薬及びその製造方法を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行なった結果、ルシゲニン等のN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類をN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において有機溶媒中で還元剤と接触させることにより調製した化学発光試薬が、特定アルカリ性pH条件下において過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下においてペルオキシダーゼの量に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達したものである。
【0006】
従って、本発明は、下記一般式(1)
【0008】
【化4】
(上記一般式(1)において、R1 及びR2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、R3 、R4 、R5 及びR6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Xはn価の陰イオンであり、nは1又は2である。)
で表わされるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類をN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において有機溶媒中で還元剤と接触処理することを特徴とする化学発光試薬の製造方法に関するものである。
【0009】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の化学発光試薬は、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類をN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において還元処理することにより得られる反応生成物を含有するものである。
【0010】
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類は、
次の一般式(1):
【0011】
【化5】
で表され、式中、R1 及びR2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、各々、互いに同一でも異なるものでもよい。
【0012】
アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数1〜20を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数1〜10のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数6〜20のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【0013】
一般式(I)において、R3 、R4 、R5 及びR6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、各々、互いに同一でもまたは異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数が、例えば、1〜20、特に、1〜10のものが好ましい。
【0014】
また、一般式(1)において、Xはn価の陰イオンであり、nは1又は2である。陰イオンとしては、具体的には、硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【0015】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の例としては、N,N−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジエチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N−ジ−m−クロロフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩などが挙げられる。特に、N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレート(ルシゲニン)が好適に用いることができるが、勿論これらに限定されるものではない。
【0016】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられるN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N,N−ジメチルアクリルアミド、N,N−ジメチルプロピオンアミド、N,N−ジメチルベンズアミド、N−メチル−2−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。このN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、本発明の化学発光試薬の製造には必須であり、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類と複合体を形成した後、アクリジニウム塩構造の還元反応に伴い、より発光収率の高い化合物へと変化するものと考えられ、本発明の化学発光試薬の製造反応に反応成分として関与し、反応生成物の水溶性の付与等に寄与しているものと考えられる。
【0017】
本発明の化学発光試薬の製造に用いられる蟻酸は、反応を促進し、化学発光試薬の反応収率を著しく高める作用を有し、その使用量はN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類に対して0.1〜5000当量、好ましくは0.5〜1000当量、特に好ましくは1〜500当量の割合で用いられる。
【0018】
本発明の化学発光試薬の製造における還元処理は、還元剤を用いて行なうものであり、還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウムボロン、水素化ナトリウムボロン等が挙げられるが、水素化リチウムアルミニウムが特に好ましく用いられる。
【0019】
還元反応を行なう際に使用される反応溶媒としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、特に限定されるものではないが、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エーテル類、及びN−メチル−2−ピロリドン等が好ましく用いられる。
【0020】
反応温度は用いられる還元剤及び反応溶媒の種類によって異なるが、一般的に、−10〜+150℃、好ましくは0〜120℃、特に好ましくは20〜90℃の範囲に設定することができる。また、反応時間は1分〜一昼夜、好ましくは10分〜12時間、特に好ましくは30分〜5時間の範囲で採用することができる。
【0021】
本発明の化学発光試薬は、塩基性条件下に過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で反応して発光するが、この反応は過酸化水素の検出及びペルオキシダーアゼの定量等に利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、更に、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【0022】
具体的に述べるならば、本発明の化学発光試薬は、pH7.5〜13の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、p−ヒドロキシ桂皮酸、p−フェニルフェノール、p−(4−クロロフェニル)フェノール、p−(4−ブロモフェニル)フェノール、p−(4−ヨードフェニル)フェノール、p−ヨードフェノール、p−ブロモフェノール、p−クロロフェノール、6−ヒドロキシベンゾチアゾール、2−ナフトール、ホタルルシフェニリン等が非限定的に挙げられる。
【0023】
本発明の化学発光試薬を用いて化学発光分析を行なう場合には、化学発光試薬は10-6〜1M、好ましくは10-4〜10-2Mの範囲の濃度とし、その使用量としては10〜500μl、好ましくは50〜300μlの範囲で用いるのが望ましい。また、発光増強剤の使用量としては、化学発光試薬の0.01〜100倍モル、好ましくは0.1〜10倍モルの範囲で用い、その濃度は10-6〜1M、好ましくは10-4〜10-2Mの範囲が望ましい。また、化学発光反応に用いる過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量としては化学発光試薬に対して3〜1万倍モル、好ましくは10〜1000倍モルの範囲で用いるのが望ましい。なお、過酸化水素のほか、他の無機過酸化物及び有機過酸化物等の水素受容体を使用することもできる。
【0024】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)が好ましく用いられる。化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は1mM〜1Mの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【0025】
【実施例】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等により限定されるものではない。
【0026】
[実施例1]
ルシゲニン1mg試験管に採り、これにN,N−ジメチルアセトアミド150μlを加えて溶解させた後、攪拌下に1、4−ジオキサン1ml中へ加えてルシゲニンを1、4−ジオキサン中に微分散させる。次に、これに蟻酸20μlを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末200μgを添加して、60℃で3時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水1ml中へ少量ずづ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させる。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のpHを1N塩酸で7.0に調整することにより新規化学発光試薬を得る。
[ペルオキシダーゼ活性の測定]
この化学発光試薬を直ちに20μlずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の種々の濃度水準の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液200μl及びp−ヨードフェノール10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液20μlを加えた後、これに0.0034重量%過酸化水素水溶液50μlを加え、ルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間発光量を積算した結果、表1に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定できることが認められた。
【0027】
【表1】
【0028】
[実施例2]
ルシゲニン1mgを試験管に採り、これにN,N−ジメチルホルムアミド150μlを加えて溶解させた後、攪拌下に1、4−ジオキサン1ml中へ加えてルシゲニンを1、4−ジオキサン中に微分散させる。次に、これに蟻酸20μlを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末200μgを添加して、60℃で3時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水1ml中へ少量ずづ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させる。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のpHを1N塩酸で7.0に調整することにより新規化学発光試薬を得る。
[ペルオキシダーゼ活性の測定]
この化学発光試薬を直ちに20μlずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の種々の濃度水準の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液200μl及びp−ヨードフェノール10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液20μlを加えた後、これに0.0034重量%過酸化水素水溶液50μlを加え、ルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間発光量を積算した結果、表2に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定出来ることが認められた。
【0029】
【表2】
【0030】
[実施例3]
ルシゲニン1mgを試験管に採り、これにN,N−ジメチルホルムアミド150μlを加えて溶解させた後、攪拌下にN−メチル−2−ピロリドン1ml中へ加えてルシゲニンをN−メチル−2−ピロリドン中に微分散させる。次に、これに蟻酸20μlを加えてよく攪拌してから、水素化リチウムアルミニウム粉末200μgを添加して、60℃で3時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に脱イオン水1ml中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させる。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のpHを1N塩酸で7.0に調整することにより新規化学発光試薬を得る。
[ペルオキシダーゼ活性の測定]
この化学発光試薬を直ちに20μlずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次いで、このウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の種々の濃度水準の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液200μl及びp−ヨードフェノール10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液20μlを加えた後、これに0.0034重量%過酸化水素水溶液50μlを加え、ルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間発光量を積算した結果、表3に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を濃度依存性良く測定出来ることが認められた。
【0031】
【表3】
【0032】
[比較例1]
ルシゲニン1mgを純水2mlに溶解し、これを20μlずつ複数の化学発光測定用ウェルに加え、次に、このウェルに、各々、西洋ワサビペルオキシダーゼの種々の濃度水準の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液200μl及びp−ヨードフェノール10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液20μlを加え、更に、これに0.0034重量%過酸化水素水溶液50μlを加え、ルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間発光量を積算した結果、表4に示すような発光強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を正確には測定出来ないことが確認された。
【0033】
【表4】
【0034】
【発明の効果】
本発明により提供される新規化学発光試薬は、安価な製造原料を用いて短時間で容易に製造することができ、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下においてペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有することを利用したものであり、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。更に、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原等をウェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロット法によりDNA及びRNAを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸を各々特異的に、且つ高感度で測定することができる。
Claims (5)
- 前記N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類がN,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項1に記載の化学発光試薬の製造方法。
- 前記N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物がN,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド及びN−メチル−2−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種である請求項1に記載の化学発光試薬の製造方法。
- 前記有機溶媒がテトラヒドロフラン及び/又はジオキサン類の環状エーテル化合物である請求項1〜2のいずれかの項に記載の化学発光試薬の製造方法。
- 前記還元剤が水素化リチウムアルミニウムである請求項1〜3のいずれかの項に記載の化学発光試薬の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32956698A JP3996283B2 (ja) | 1997-11-19 | 1998-11-19 | 新規化学発光試薬の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33490497 | 1997-11-19 | ||
JP9-334904 | 1997-11-19 | ||
JP32956698A JP3996283B2 (ja) | 1997-11-19 | 1998-11-19 | 新規化学発光試薬の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11246854A JPH11246854A (ja) | 1999-09-14 |
JP3996283B2 true JP3996283B2 (ja) | 2007-10-24 |
Family
ID=26573253
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP32956698A Expired - Fee Related JP3996283B2 (ja) | 1997-11-19 | 1998-11-19 | 新規化学発光試薬の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3996283B2 (ja) |
-
1998
- 1998-11-19 JP JP32956698A patent/JP3996283B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH11246854A (ja) | 1999-09-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5319714B2 (ja) | 過酸化水素検出方法に用いるシグナリング化合物 | |
WO2016206654A2 (zh) | 一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物 | |
EP1038939B1 (en) | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same | |
JP3996283B2 (ja) | 新規化学発光試薬の製造方法 | |
JP3720977B2 (ja) | 化学発光試薬及びその製造方法 | |
JP4286356B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP3958452B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
JP3792885B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP4028647B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
JP3792897B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
JP3745113B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP3720988B2 (ja) | 新規化学発光試薬及びその製造方法 | |
JP3792898B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP4028644B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP3792908B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP3779849B2 (ja) | 化学発光試薬の製造方法 | |
JP4028648B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP3692265B2 (ja) | 化学発光試薬の製造方法 | |
JP4212698B2 (ja) | 新規化学発光試薬 | |
JP3776229B2 (ja) | 化学発光試薬及びその製造方法 | |
JP3792959B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP5048889B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 | |
JP4286357B2 (ja) | 化学発光酵素免疫測定方法 | |
JPH05103696A (ja) | 化学発光増感方法 | |
JPH0649057A (ja) | トリオキサン誘導体、その製造方法および化学発光方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041228 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20070328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132 Effective date: 20070410 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070611 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070703 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070802 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100810 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100810 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |