JP3792959B2 - ペルオキシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、更に詳しくは、特定の新規化学発光系を用いる化学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感度なペルオキシダーゼの測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えばヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法には、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系に用いられる。
【０００３】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法又は蛍光物質を生成させてそのを蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行われている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性測定に比色法を用いる場合にはペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けるという問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっている。
【０００４】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測定可能な化学発光法による新規な測定方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化学発光試薬としてN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体として過酸化水素等を用い、そして、更に、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる発光系が、化学発光物質にルミノールを用いる発光系に比較して、より高感度にペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】
更に、本発明の第三は、
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光試薬としてN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下において、更に好ましくは、発光増強剤を加えてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものである。その測定方法は任意であるが、一般に、化学発光試薬、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれている。
【００１１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする混合物又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする混合物である。
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、下記一般式（１）
【００１２】
【化４】
で表わすことができる。
【００１３】
上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、それぞれ炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特にフェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特にクロロフェニル基が好ましい。
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
また、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体のN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩の対イオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。
【００１５】
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸収帯を分光光度計を用いて測定することができる。
【００１６】
前記N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体例としては、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジエチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジ−ｍ−クロロフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙げられるが、特に、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１７】
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の対イオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の成分の一つである N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、下記一般式（２）
【００１８】
【化５】
で表わされる。
【００１９】
上記一般式（２）において、Ｒ1 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよい。また、Ｒ2 は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される。アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合してそれぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００２０】
前記 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、 N,N−ジメチルホルムアミド、 N,N−ジメチルアセトアミド、 N,N−ジメチルアクリルアミド、 N,N−ジメチルプロピオンアミド、 N,N−ジメチルベンズアミド、 N−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の他の成分であるアミノアルコール化合物は、下記一般式（３）
【００２１】
【化６】
で表わされる。
【００２２】
上記一般式（３）において、Ｒは、炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは、１〜３の整数を表わす。その具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２３】
上記の第一の発明に用いられる化学発光試薬は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定の N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つであるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類は、もう一つの成分である N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在により自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、この N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用している。また、上記の第一の発明に係る化学発光試薬へ特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる第二の発明に係る化学発光試薬において、このアミノアルコール化合物の添加により、発光反応のブランク値を低下させると共に、より廣いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実現することが可能になる。このアミノアルコール化合物の添加効果については必ずしもはっきりはしていないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定を可能にしているものと考えられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光系の一成分であるローダミンＢは、下記一般式（４）
【００２４】
【化７】
で表わされる構造式を有する化合物であり、希薄水溶液は強い蛍光を発する性質を有する。この蛍光物質の化学発光系への添加により、化学発光反応による発光を一次光として二次光である蛍光を発すると同時に、溶存酸素との反応を抑えて発光反応時のブランク値を低下させる作用を有しているものと考えられる。ローダミンＢの発光系への添加量は任意であるが、0.05〜5mM の範囲、好ましくは 0.1〜2mM の範囲である。
【００２５】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の製造方法は任意であるが、第一の発明に用いられる化学発光試薬の調製は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上の N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然光の下に放置することにより得られるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されているので、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源としては、波長領域が約 290〜800nm の範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約 400〜800nm の範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。
【００２６】
また、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体と N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合比は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を 1〜 1万倍モル、好ましくは 1〜 5千倍モルの割合で用いることができる。
【００２７】
第二の発明に用いられる化学発光試薬の調製は、第一の発明に係る化学発光試薬に特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られるが、アミノアルコール化合物はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に添加することができるが、電荷移動反応後に添加するのが好ましい。アミノアルコール化合物の添加量はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対してアミノアルコール化合物を 1〜 1万倍モル、好ましくは 1〜 2千倍モルの量で用いることができる。
【００２８】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、pH7.5 〜13の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって促進することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフト−ル、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の使用濃度は、10-8〜1M、好ましくは10-6〜10-2M の範囲の濃度であり、その使用量としては10〜500 μｌ、好ましくは50〜300 μｌの範囲が望ましい。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の0.01〜100 倍モル、好ましくは 0.1〜10倍モルの範囲でよく、その濃度は10-6〜1M、好ましくは10-4〜10-2M の範囲で用いられる。また、化学発光反応において、過酸化水素は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して 3〜1 万倍モル、好ましくは10〜1000倍モルの範囲が望ましい。
【００２９】
化学発光反応に用いる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は1mM 〜1Mの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、抗原、抗体又は核酸等の種々の物質の定量を行なうことが可能である。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとしては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。もちろん本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３１】
〔参考例１〕
N,N' −ジメチル− 9,9' −ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及び N,N −ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン1.5mg を試験管に採り、これに N,N−ジメチルアセトアミド１mlを加えて溶解させた後、30℃の温度の水浴中で250Wのコピーランプを 7時間照射することによりN,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及び N,N−ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。
【００３２】
〔実施例１〕
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液 100μｌ、及び10mMｐ−ヨードフェノール溶液 800μｌと上記化学発光試薬20μｌとを75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液9.18mlに添加して調製した発光試薬溶液 100μｌを加え、更に、0.2mM ローダミンＢ水溶液20μｌを加えた後、これに0.0017重量％の過酸化水素水溶液50μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス CT-9000 D）で 1〜5 秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを 5×10-2O mol/assay まで測定することが可能であった。
【００３３】
【表１】
【００３４】
〔参考例２〕
N,N' −ジメチル− 9,9' −ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、 N,N −ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの 1×10-2モル／ｌの水溶液に、 2倍モルの固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間撹拌することにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に60℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に95℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、 4℃に冷却放置し、生成する沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してN,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約75％の収率で得た。次に、この化合物1.5 mgを試験管に採り、これに N,N−ジメチルホルムアミド１mlを加えて溶解させた後、30℃の温度の水浴中で250Wのコピーランプを 7時間照射してから、トリエタノールアミン0.5ml を添加することによりN,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、 N,N−ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００３５】
〔実施例２〕
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液 100μｌ、及び10mMｐ−ヨードフェノール溶液 800μｌと上記化学発光試薬20μｌとを75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液9.18mlに添加して調製した発光試薬溶液 100μｌを加え、更に、0.2mM ローダミンＢ水溶液20μｌを加えた後、これに0.0017重量％の過酸化水素水溶液50μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス CT-9000 D）で 1〜5 秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを 5×10-2O mol/assay まで測定することが可能であった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
〔比較例１〕
ルミノール 5.6×10-5M 及びｐ−ヨードフェノールを10-3M の濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)100μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液 100μｌを混合した後、これに0.0034重量％過酸化水素水溶液50μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス CT-9000 D）で 0〜5 秒間発光量を積算した結果、表４に示すようにＨＲＰを10-17 mol/assay まで測定できることが認められた。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、従って、ペルオキシダーゼを標識物質に使用する酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、またハイブリダイゼーションアッセイ法等により核酸類を夫々より高感度に検出又は定量をすることができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、更に詳しくは、特定の新規化学発光系を用いる化学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感度なペルオキシダーゼの測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えばヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法には、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系に用いられる。
【０００３】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法又は蛍光物質を生成させてそのを蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行われている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性測定に比色法を用いる場合にはペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けるという問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっている。
【０００４】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測定可能な化学発光法による新規な測定方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化学発光試薬としてN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体として過酸化水素等を用い、そして、更に、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる発光系が、化学発光物質にルミノールを用いる発光系に比較して、より高感度にペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】
更に、本発明の第三は、
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光試薬としてN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下において、更に好ましくは、発光増強剤を加えてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものである。その測定方法は任意であるが、一般に、化学発光試薬、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれている。
【００１１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする混合物又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする混合物である。
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、下記一般式（１）
【００１２】
【化４】
【００１３】
上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、それぞれ炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特にフェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特にクロロフェニル基が好ましい。
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
また、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体のN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩の対イオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。
【００１５】
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸収帯を分光光度計を用いて測定することができる。
【００１６】
前記N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体例としては、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジエチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジ−ｍ−クロロフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙げられるが、特に、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１７】
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の対イオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の成分の一つである N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、下記一般式（２）
【００１８】
【化５】
【００１９】
上記一般式（２）において、Ｒ1 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよい。また、Ｒ2 は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される。アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合してそれぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００２０】
前記 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、 N,N−ジメチルホルムアミド、 N,N−ジメチルアセトアミド、 N,N−ジメチルアクリルアミド、 N,N−ジメチルプロピオンアミド、 N,N−ジメチルベンズアミド、 N−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の他の成分であるアミノアルコール化合物は、下記一般式（３）
【００２１】
【化６】
【００２２】
上記一般式（３）において、Ｒは、炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは、１〜３の整数を表わす。その具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２３】
上記の第一の発明に用いられる化学発光試薬は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定の N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つであるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類は、もう一つの成分である N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在により自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、この N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用している。また、上記の第一の発明に係る化学発光試薬へ特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる第二の発明に係る化学発光試薬において、このアミノアルコール化合物の添加により、発光反応のブランク値を低下させると共に、より廣いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実現することが可能になる。このアミノアルコール化合物の添加効果については必ずしもはっきりはしていないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定を可能にしているものと考えられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光系の一成分であるローダミンＢは、下記一般式（４）
【００２４】
【化７】
【００２５】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の製造方法は任意であるが、第一の発明に用いられる化学発光試薬の調製は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上の N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然光の下に放置することにより得られるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されているので、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源としては、波長領域が約 290〜800nm の範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約 400〜800nm の範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。
【００２６】
また、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体と N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合比は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を 1〜 1万倍モル、好ましくは 1〜 5千倍モルの割合で用いることができる。
【００２７】
第二の発明に用いられる化学発光試薬の調製は、第一の発明に係る化学発光試薬に特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られるが、アミノアルコール化合物はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に添加することができるが、電荷移動反応後に添加するのが好ましい。アミノアルコール化合物の添加量はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対してアミノアルコール化合物を 1〜 1万倍モル、好ましくは 1〜 2千倍モルの量で用いることができる。
【００２８】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、pH7.5 〜13の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増強剤によって促進することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフト−ル、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の使用濃度は、10-8〜1M、好ましくは10-6〜10-2M の範囲の濃度であり、その使用量としては10〜500 μｌ、好ましくは50〜300 μｌの範囲が望ましい。また、発光増強剤の使用量は、化学発光試薬の0.01〜100 倍モル、好ましくは 0.1〜10倍モルの範囲でよく、その濃度は10-6〜1M、好ましくは10-4〜10-2M の範囲で用いられる。また、化学発光反応において、過酸化水素は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して 3〜1 万倍モル、好ましくは10〜1000倍モルの範囲が望ましい。
【００２９】
化学発光反応に用いる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は1mM 〜1Mの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、抗原、抗体又は核酸等の種々の物質の定量を行なうことが可能である。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとしては西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。もちろん本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３１】
〔参考例１〕
N,N' −ジメチル− 9,9' −ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及び N,N −ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン1.5mg を試験管に採り、これに N,N−ジメチルアセトアミド１mlを加えて溶解させた後、30℃の温度の水浴中で250Wのコピーランプを 7時間照射することによりN,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及び N,N−ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。
【００３２】
〔実施例１〕
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液 100μｌ、及び10mMｐ−ヨードフェノール溶液 800μｌと上記化学発光試薬20μｌとを75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液9.18mlに添加して調製した発光試薬溶液 100μｌを加え、更に、0.2mM ローダミンＢ水溶液20μｌを加えた後、これに0.0017重量％の過酸化水素水溶液50μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス CT-9000 D）で 1〜5 秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを 5×10-2O mol/assay まで測定することが可能であった。
【００３３】
【表１】
〔参考例２〕
N,N' −ジメチル− 9,9' −ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、 N,N −ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの 1×10-2モル／ｌの水溶液に、 2倍モルの固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間撹拌することにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に60℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に95℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、 4℃に冷却放置し、生成する沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してN,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約75％の収率で得た。次に、この化合物1.5 mgを試験管に採り、これに N,N−ジメチルホルムアミド１mlを加えて溶解させた後、30℃の温度の水浴中で250Wのコピーランプを 7時間照射してから、トリエタノールアミン0.5ml を添加することによりN,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、 N,N−ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００３５】
〔実施例２〕
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液 100μｌ、及び10mMｐ−ヨードフェノール溶液 800μｌと上記化学発光試薬20μｌとを75mMトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液9.18mlに添加して調製した発光試薬溶液 100μｌを加え、更に、0.2mM ローダミンＢ水溶液20μｌを加えた後、これに0.0017重量％の過酸化水素水溶液50μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス CT-9000 D）で 1〜5 秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを 5×10-2O mol/assay まで測定することが可能であった。
【００３６】
【表２】
〔比較例１〕
ルミノール 5.6×10-5M 及びｐ−ヨードフェノールを10-3M の濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)100μｌに、種々の濃度水準のＨＲＰ水溶液 100μｌを混合した後、これに0.0034重量％過酸化水素水溶液50μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナス CT-9000 D）で 0〜5 秒間発光量を積算した結果、表４に示すようにＨＲＰを10-17 mol/assay まで測定できることが認められた。
【００３８】
【表３】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、従って、ペルオキシダーゼを標識物質に使用する酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、またハイブリダイゼーションアッセイ法等により核酸類を夫々より高感度に検出又は定量をすることができる。
Claims (8)
- 下記一般式（１）
で表わされるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び下記一般式（２）
で表わされる N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 請求項１に記載の化学発光試薬に、下記一般式（３）
で表わされるアミノアルコール化合物を添加してなる化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 前記N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬にローダミンＢを添加してなる化学発光系を用いて、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記N,N'-ジ置換−9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体が、N，N'−ジメチル−9，9'−ビスアクリジニウム塩又はN，N'−ジエチル−9，9'−ビスアクリジニウム塩である請求項１ないし３のいずれかの請求項に記載の化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類が、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ硝酸塩又は、N，N'−ジメチル−9，9'−ビスアクリジニウムジ塩酸塩である請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記N,N-ジ置換カルボン酸アミド化合物が、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジメチルプロピオンアミド、N-メチル-2-ピロリドン及びN-エチル-2-ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種である請求項１ないし５のいずれかの請求項に記載の化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、 N,N−ジメチルホルムアミド、 N,N−ジメチルアセトアミド及び N−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記発光増強剤がｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾールから選ばれる少なくとも１種のフェノール性化合物である請求項３に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
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