JP5048889B2 - ペルオキシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、更に詳しくは、特定の新規化学発光試薬を用いる化学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感度なペルオキシダーゼの測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは、水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。
【０００３】
このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法としては、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系が挙げられる。
【０００４】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法又は蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行われている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性測定に比色法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法はペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっている。
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、上記事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測定可能な化学発光法による新規な測定方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体として過酸化水素を用い、そして、更に、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる発光系に比較して、更に、高感度でペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発明に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】
更に、本発明の第三は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において、更に好ましく、発光増強剤を加えてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものであり、その測定操作は任意であるが、一般に、化学発光試薬、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれている。
【００１１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分として含有してなる混合物又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分として含有してなる混合物である。
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、下記一般式（１）
【００１２】
【化４】
で表わすことができる。
【００１３】
一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基はアルキル基が置換されたものでもよい。
また、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。
【００１５】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸収帯を分光光度計を用いて測定することができる。
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙げられるが、これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１６】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。
上記化学発光試薬の成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、
下記一般式（２）
【００１７】
【化５】
で表わすことができる。
【００１８】
一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択される。Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１９】
上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。
さらに、上記化学発光試薬の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、下記一般式（３）
【００２０】
【化６】
で表わされる化合物である。
【００２１】
一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わす。
上記アミノアルコール化合物の具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２２】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類はもう一つの成分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在により自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用している。また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物に対し、特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる化学発光試薬において、このアミノアルコール化合物の添加は、発光反応のブランク値を低下させると共に、より広いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実現することが可能になる。このアミノアルコール化合物の添加効果については必ずしもはっきりはしていないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定を可能にしているものと考えられる。
【００２３】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の製造方法は任意であり、第一の発明に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然光の下に放置することにより調製されるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。
【００２４】
また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合比としては、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で用いることができる。
【００２５】
第二の発明に用いられる化学発光試薬は、第一の発明に用いられる化学発光試薬にさらに特定のアミノアルコール化合物を添加すことにより得られるが、その添加はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に行なうことができるが、電荷移動反応後に添加するのが好ましい。尚、ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反応時の添加も含む。アミノアルコール化合物の添加量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モル、好ましくは１〜２千倍モルの量でよい。
【００２６】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
また、水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではなく、無機過酸化物、有機過酸化物等が任意に用いられるが、特に過酸化水素が好ましい。
【００２７】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法において、化学発光試薬は、１０-8〜１Ｍ好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量としては１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が望ましい。また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲である。
また、本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法の化学発光反応に用いられる水素受容体の量は、化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量としては化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が望ましい。
【００２８】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法によれば、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、抗原、抗体又は核酸等の種々の物質の定量を行なうことが可能である。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２９】
上記化学発光反応に用いられる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。これらの緩衝液の濃度としては、１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例等を示し、本発明を具体的に説明する。もっとも本発明は下記実施例等により限定されるものではない。
【００３１】
［参考例１］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計を用いる方法により測定して確認した。
【００３２】
［実施例１］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３３】
【表１】
【００３４】
［参考例２］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。
【００３５】
［実施例２］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
［参考例３］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００３８】
［実施例３］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
［参考例４］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００４１】
［実施例４］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００４２】
【表４】
【００４３】
［参考例５］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬を得た。
【００４４】
［実施例５］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表５に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、従って、ペルオキシダーゼを標識物質に使用する酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、またハイブリダイゼーションアッセイ法により核酸類をそれぞれより高感度に検出又は定量することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光法を利用するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであり、更に詳しくは、特定の新規化学発光試薬を用いる化学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感度なペルオキシダーゼの測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは、水素受容体の存在下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬として幅広い分野で利用されている。
【０００３】
このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる分析方法としては、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系が挙げられる。
【０００４】
また、このようなペルオキシダーゼ活性の測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で測定する比色法又は蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行われている。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性測定に比色法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発されている。化学発光法はペルオキシダーゼ酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっている。
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、上記事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測定可能な化学発光法による新規な測定方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体として過酸化水素を用い、そして、更に、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる発光系に比較して、更に、高感度でペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発明に到達したものである。
【０００７】
従って、本発明の第一は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００８】
また、本発明の第二は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】
更に、本発明の第三は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において、更に好ましく、発光増強剤を加えてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するものであり、その測定操作は任意であるが、一般に、化学発光試薬、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれている。
【００１１】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分として含有してなる混合物又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分として含有してなる混合物である。
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、下記一般式（１）
【００１２】
【化４】
で表わすことができる。
【００１３】
一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１４】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基はアルキル基が置換されたものでもよい。
また、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。
【００１５】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸収帯を分光光度計を用いて測定することができる。
上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙げられるが、これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１６】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。
上記化学発光試薬の成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、
下記一般式（２）
【００１７】
【化５】
で表わすことができる。
【００１８】
一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択される。Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１９】
上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。
さらに、上記化学発光試薬の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、下記一般式（３）
【００２０】
【化６】
で表わされる化合物である。
【００２１】
一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わす。
上記アミノアルコール化合物の具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２２】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類はもう一つの成分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在により自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用している。また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物に対し、特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる化学発光試薬において、このアミノアルコール化合物の添加は、発光反応のブランク値を低下させると共に、より広いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実現することが可能になる。このアミノアルコール化合物の添加効果については必ずしもはっきりはしていないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定を可能にしているものと考えられる。
【００２３】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬の製造方法は任意であり、第一の発明に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然光の下に放置することにより調製されるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。
【００２４】
また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合比としては、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で用いることができる。
【００２５】
第二の発明に用いられる化学発光試薬は、第一の発明に用いられる化学発光試薬にさらに特定のアミノアルコール化合物を添加すことにより得られるが、その添加はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に行なうことができるが、電荷移動反応後に添加するのが好ましい。尚、ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反応時の添加も含む。アミノアルコール化合物の添加量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モル、好ましくは１〜２千倍モルの量でよい。
【００２６】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
また、水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではなく、無機過酸化物、有機過酸化物等が任意に用いられるが、特に過酸化水素が好ましい。
【００２７】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法において、化学発光試薬は、１０-8〜１Ｍ好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量としては１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が望ましい。また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲である。
また、本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法の化学発光反応に用いられる水素受容体の量は、化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量としては化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が望ましい。
【００２８】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法によれば、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、抗原、抗体又は核酸等の種々の物質の定量を行なうことが可能である。このようにペルオキシダーゼを標識物質として用いる場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２９】
上記化学発光反応に用いられる緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げることができる。これらの緩衝液の濃度としては、１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例等を示し、本発明を具体的に説明する。もっとも本発明は下記実施例等により限定されるものではない。
【００３１】
［参考例１］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計を用いる方法により測定して確認した。
【００３２】
［実施例１］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３３】
【表１】
【００３４】
［参考例２］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。
【００３５】
［実施例２］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３６】
【表２】
【００３７】
［参考例３］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００３８】
［実施例３］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
［参考例４］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モルの固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌することにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びトリエタノールアミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００４１】
［実施例４］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表４に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００４２】
【表４】
【００４３】
［参考例５］
Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬を得た。
【００４４】
［実施例５］
化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、これに０．００３４重量％の過酸化水素溶液５０μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表５に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【発明の効果】
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で測定することが可能になり、従って、ペルオキシダーゼを標識物質に使用する酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、またハイブリダイゼーションアッセイ法により核酸類をそれぞれより高感度に検出又は定量することができる。
Claims (4)
- 下記一般式（１）
下記一般式（２）
及び
下記一般式（３）
- 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである請求項１に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記アミノアルコール化合物が、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記水素受容体が、過酸化水素又は過酸化水素源である請求項１に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
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