JP2000184899A - ペルオキシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents
ペルオキシダーゼ活性の測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ
活性の高感度測定が可能な化学発光系を用いてペルオキ
シダーゼ活性を測定する新規な方法を提供する。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又は
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物及び特定アミノアルコール化合物を主成分とする化学
発光試薬を用いる化学発光系により、水素受容体の存在
下にペルオキシダーゼ活性を高感度に測定する方法。
活性の高感度測定が可能な化学発光系を用いてペルオキ
シダーゼ活性を測定する新規な方法を提供する。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又は
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物及び特定アミノアルコール化合物を主成分とする化学
発光試薬を用いる化学発光系により、水素受容体の存在
下にペルオキシダーゼ活性を高感度に測定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光法を利用
するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであ
り、更に詳しくは、特定の新規化学発光試薬を用いる化
学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感
度なペルオキシダーゼの測定方法に関するものである。
するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関するものであ
り、更に詳しくは、特定の新規化学発光試薬を用いる化
学発光法を利用する、水素受容体の存在下における高感
度なペルオキシダーゼの測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼは、水素受容体の存在
下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。この
ような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵
素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総
称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感
度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検
出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用
試薬として幅広い分野で利用されている。
下で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。この
ような触媒活性は、例えば、ヘモグロビンのような非酵
素物質においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総
称される。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感
度に検出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検
出のみならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用
試薬として幅広い分野で利用されている。
【０００３】このようにペルオキシダーゼを標識物質と
して用いる分析方法としては、抗原抗体反応を利用する
免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチ
ン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異
的な親和性を利用する分析系が挙げられる。
して用いる分析方法としては、抗原抗体反応を利用する
免疫学的測定法、核酸の相補性を利用する核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイ法、その他にアビジン−ビオチ
ン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−レクチン等の特異
的な親和性を利用する分析系が挙げられる。
【０００４】また、このようなペルオキシダーゼ活性の
測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を
酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で
測定する比色法又は蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍
光分光光度計で測定する蛍光法等が行われている。しか
しながら、ペルオキシダーゼ活性測定に比色法を用いる
場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に
欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光
法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未
だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化
学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発さ
れている。化学発光法はペルオキシダーゼ酵素の触媒活
性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態とな
り、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量
を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量
する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素
受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にｐ−ヨード
フェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペル
オキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっ
ている。しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測
定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度
領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多
く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が
望まれていた。
測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を
酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で
測定する比色法又は蛍光物質を生成させてその蛍光を蛍
光分光光度計で測定する蛍光法等が行われている。しか
しながら、ペルオキシダーゼ活性測定に比色法を用いる
場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域での定量性に
欠けると云う問題点があり、これを解決する目的で蛍光
法が開発されたが、低濃度領域での定量性に関しては未
だ充分とは言えない。この問題点を解決する目的で、化
学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定法が開発さ
れている。化学発光法はペルオキシダーゼ酵素の触媒活
性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態とな
り、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量
を測定することによりペルオキシダーゼ酵素活性を定量
する方法であり、化学発光性物質にルミノールを、水素
受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤にｐ−ヨード
フェノールを用いる化学発光系が開発されており、ペル
オキシダーゼ活性を高感度に定量することが可能になっ
ている。しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素活性の測
定を酵素免疫測定法に応用する場合には、酵素の低濃度
領域での定量性を更に高める必要性が生じるケースが多
く、ペルオキシダーゼ酵素活性測定の更なる高感度化が
望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、上
記事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測
定可能な化学発光法による新規な測定方法を提供するこ
とを課題とする。
記事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測
定可能な化学発光法による新規な測定方法を提供するこ
とを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定
アミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を
用い、水素受容体として過酸化水素を用い、そして、更
に、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用い
る発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる発光
系に比較して、更に、高感度でペルオキシダーゼ活性を
定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に
基づいて本発明に到達したものである。
上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定
アミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を
用い、水素受容体として過酸化水素を用い、そして、更
に、発光増強剤として特定のフェノール系化合物を用い
る発光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる発光
系に比較して、更に、高感度でペルオキシダーゼ活性を
定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に
基づいて本発明に到達したものである。
【０００７】従って、本発明の第一は、Ｎ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体
及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分と
する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において
ペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする
化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関
するものである。
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体
及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分と
する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下において
ペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴とする
化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方法に関
するものである。
【０００８】また、本発明の第二は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアル
コール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素
受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測
定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダ
ーゼ活性の測定方法に関するものである。
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアル
コール化合物を主成分とする化学発光試薬を用い、水素
受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性を測
定することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダ
ーゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００９】更に、本発明の第三は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及
びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物又はＮ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移
動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びア
ミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用
い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素
活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化
合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオ
キシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及
びＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物又はＮ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移
動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びア
ミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用
い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素
活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノール性化
合物を用いることを特徴とする化学発光法によるペルオ
キシダーゼ活性の測定方法に関するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、
化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移
動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びア
ミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用
い、水素受容体の存在下において、更に好ましく、発光
増強剤を加えてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するも
のであり、その測定操作は任意であるが、一般に、化学
発光試薬、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有
する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水
素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発
光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれてい
る。
明する。本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、
化学発光試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物を主成分とするか又はＮ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移
動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びア
ミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用
い、水素受容体の存在下において、更に好ましく、発光
増強剤を加えてペルオキシダーゼ酵素活性を測定するも
のであり、その測定操作は任意であるが、一般に、化学
発光試薬、発光増強剤及びペルオキシダーゼ酵素を含有
する測定試料を混合し、特定塩基性ｐＨ領域において水
素受容体溶液を添加して化学発光反応させ、この化学発
光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれてい
る。
【００１１】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法
に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分として含有
してなる混合物又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主
成分として含有してなる混合物である。Ｎ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体
は、下記一般式（１）
に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分として含有
してなる混合物又はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主
成分として含有してなる混合物である。Ｎ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体
は、下記一般式（１）
【００１２】
【化４】 で表わすことができる。
【００１３】一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、
それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリー
ル基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異な
るものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン
化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、
好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例
えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペ
ンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニ
ル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分
岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール
基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニ
ル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、
さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール
基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化
アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化
トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることがで
き、特に、クロロフェニル基が好ましい。
それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリー
ル基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異な
るものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン
化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、
好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例
えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペ
ンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニ
ル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分
岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール
基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニ
ル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、
さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール
基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化
アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化
トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることがで
き、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１４】一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5
及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基はアルキル基が置換されたものでもよい。また、
一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウ
ム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジ
カルを示す。
及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基はアルキル基が置換されたものでもよい。また、
一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジニウ
ム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジ
カルを示す。
【００１５】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルに
おける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸
収帯を分光光度計を用いて測定することができる。上記
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
エチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−
ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，
Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスア
クリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙
げられるが、これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ル
シゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
ジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルに
おける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸
収帯を分光光度計を用いて測定することができる。上記
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
エチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−
ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，
Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスア
クリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙
げられるが、これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ル
シゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１６】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオン
としては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸
イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカ
ルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。上記化学発
光試薬の成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物は、下記一般式（２）
ジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオン
としては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸
イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカ
ルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。上記化学発
光試薬の成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物は、下記一般式（２）
【００１７】
【化５】 で表わすことができる。
【００１８】一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、
炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケ
ニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より
選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸
基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよ
い。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択さ
れる。Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜
１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基か
らなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニ
トロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換さ
れていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合し
て、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及
びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケ
ニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より
選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸
基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよ
い。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択さ
れる。Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜
１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基か
らなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニ
トロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換さ
れていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合し
て、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及
びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１９】上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン等が非限定的に挙げられる。さらに、上記化学発光試
薬の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、下記
一般式（３）
物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン等が非限定的に挙げられる。さらに、上記化学発光試
薬の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、下記
一般式（３）
【００２０】
【化６】 で表わされる化合物である。
【００２１】一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５
の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を
表わす。上記アミノアルコール化合物の具体的な例とし
ては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、ト
リエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジ
イソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン
等を非限定的に挙げることができる。
の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を
表わす。上記アミノアルコール化合物の具体的な例とし
ては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、ト
リエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジ
イソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン
等を非限定的に挙げることができる。
【００２２】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定に用
いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定の
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とす
るものであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類はもう一つの成
分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在
により自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現
象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸
アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安
定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸から
なるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として
作用している。また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置
換カルボン酸アミド化合物に対し、特定のアミノアルコ
ール化合物を添加することにより得られる化学発光試薬
において、このアミノアルコール化合物の添加は、発光
反応のブランク値を低下させると共に、より広いペルオ
キシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実
現することが可能になる。このアミノアルコール化合物
の添加効果については必ずしもはっきりはしていない
が、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与して
その反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有
するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存
酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除
することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定
を可能にしているものと考えられる。
いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定の
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とす
るものであるが、その成分の一つであるＮ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類はもう一つの成
分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在
により自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現
象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸
アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安
定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸から
なるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として
作用している。また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置
換カルボン酸アミド化合物に対し、特定のアミノアルコ
ール化合物を添加することにより得られる化学発光試薬
において、このアミノアルコール化合物の添加は、発光
反応のブランク値を低下させると共に、より広いペルオ
キシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実
現することが可能になる。このアミノアルコール化合物
の添加効果については必ずしもはっきりはしていない
が、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与して
その反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有
するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存
酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因を排除
することにより、ブランク値の低い安定した高感度測定
を可能にしているものと考えられる。
【００２３】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法
に用いられる化学発光試薬の製造方法は任意であり、第
一の発明に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上の
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然
光の下に放置することにより調製されるが、電荷移動錯
体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反応を
行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源として
は、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視
部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視
光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低
圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に
用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられ
る。
に用いられる化学発光試薬の製造方法は任意であり、第
一の発明に用いられる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置
換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上の
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然
光の下に放置することにより調製されるが、電荷移動錯
体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反応を
行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源として
は、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視
部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可視
光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低
圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に
用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられ
る。
【００２４】また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物との混合比としては、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を
１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で用
いることができる。
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物との混合比としては、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を
１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で用
いることができる。
【００２５】第二の発明に用いられる化学発光試薬は、
第一の発明に用いられる化学発光試薬にさらに特定のア
ミノアルコール化合物を添加すことにより得られるが、
その添加はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に行なう
ことができるが、電荷移動反応後に添加するのが好まし
い。尚、ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反
応時の添加も含む。アミノアルコール化合物の添加量
は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モル、好ましく
は１〜２千倍モルの量でよい。
第一の発明に用いられる化学発光試薬にさらに特定のア
ミノアルコール化合物を添加すことにより得られるが、
その添加はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に行なう
ことができるが、電荷移動反応後に添加するのが好まし
い。尚、ここで、電荷移動反応時の添加には電荷移動反
応時の添加も含む。アミノアルコール化合物の添加量
は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モル、好ましく
は１〜２千倍モルの量でよい。
【００２６】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法
に用いられる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基
性条件下において、過剰の水素受容体の存在下、ペルオ
キシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光
は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強す
ることが認められる。このようなフェノール性化合物と
しては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノー
ル、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４
−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェ
ニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモ
フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロ
フェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチア
ゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限
定的に挙げられる。また、水素受容体としては、ペルオ
キシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定
されるものではなく、無機過酸化物、有機過酸化物等が
任意に用いられるが、特に過酸化水素が好ましい。
に用いられる化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基
性条件下において、過剰の水素受容体の存在下、ペルオ
キシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光
は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強す
ることが認められる。このようなフェノール性化合物と
しては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノー
ル、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４
−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェ
ニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモ
フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロ
フェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチア
ゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限
定的に挙げられる。また、水素受容体としては、ペルオ
キシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定
されるものではなく、無機過酸化物、有機過酸化物等が
任意に用いられるが、特に過酸化水素が好ましい。
【００２７】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法
において、化学発光試薬は、１０-8〜１Ｍ好ましくは１
０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量と
しては１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌ
の範囲が望ましい。また、発光促進剤の使用量は、化学
発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１
〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は、１０-6〜１
Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲である。また、
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法の化学発光反
応に用いられる水素受容体の量は、化学発光試薬に対し
て充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用
量としては化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ま
しくは１０〜１０００倍モルの範囲が望ましい。
において、化学発光試薬は、１０-8〜１Ｍ好ましくは１
０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量と
しては１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌ
の範囲が望ましい。また、発光促進剤の使用量は、化学
発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１
〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は、１０-6〜１
Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲である。また、
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法の化学発光反
応に用いられる水素受容体の量は、化学発光試薬に対し
て充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用
量としては化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ま
しくは１０〜１０００倍モルの範囲が望ましい。
【００２８】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法
によれば、ペルオキシダーゼを標識物質として用いるこ
とにより、抗原、抗体又は核酸等の種々の物質の定量を
行なうことが可能である。このようにペルオキシダーゼ
を標識物質として用いる場合には、特に限定されるもの
ではないが、ペルオキシダーゼとして西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
によれば、ペルオキシダーゼを標識物質として用いるこ
とにより、抗原、抗体又は核酸等の種々の物質の定量を
行なうことが可能である。このようにペルオキシダーゼ
を標識物質として用いる場合には、特に限定されるもの
ではないが、ペルオキシダーゼとして西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２９】上記化学発光反応に用いられる緩衝液とし
ては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭
酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げ
ることができる。これらの緩衝液の濃度としては、１ｍ
Ｍ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に
界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いること
ができる。
ては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭
酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を挙げ
ることができる。これらの緩衝液の濃度としては、１ｍ
Ｍ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に
界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いること
ができる。
【００３０】
【実施例】以下、実施例等を示し、本発明を具体的に説
明する。もっとも本発明は下記実施例等により限定され
るものではない。
明する。もっとも本発明は下記実施例等により限定され
るものではない。
【００３１】［参考例１］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の
電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含有
する化学発光試薬を得た。尚、電荷移動錯体の生成は、
紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に極大をも
つ幅広い吸収帯の出現を分光光度計を用いる方法により
測定して確認した。
沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の
電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを含有
する化学発光試薬を得た。尚、電荷移動錯体の生成は、
紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に極大をも
つ幅広い吸収帯の出現を分光光度計を用いる方法により
測定して確認した。
【００３２】［実施例１］化学発光測定用マイクロプレ
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表１に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
【００３３】
【表１】
【００３４】［参考例２］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミドを含有する化学発光試薬を得た。
【００３５】［実施例２］化学発光測定用マイクロプレ
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表２に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表２に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
【００３６】
【表２】
【００３７】［参考例３］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセト
アミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の
調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、９５℃の
湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更
に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して
未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得
た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これ
にＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解さ
せた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーラン
プを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５
ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯
体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノール
アミンを含有する化学発光試薬を得た。
沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセト
アミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の
調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、９５℃の
湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してから、更
に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾燥して
未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の収率で得
た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採り、これ
にＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解さ
せた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーラン
プを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５
ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の電荷移動錯
体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びトリエタノール
アミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００３８】［実施例３］化学発光測定用マイクロプレ
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表３に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表３に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
【００３９】
【表３】
【００４０】［参考例４］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含
む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾
固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して
副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生
成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮
光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻
してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾
別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−
９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収
率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミ
ン０．５ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル
−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯
体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びトリエタノール
アミンを含有する化学発光試薬を得た。
塩酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含
む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾
固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して
副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生
成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮
光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻
してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾
別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−
９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収
率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミ
ン０．５ｍｌを添加することによりＮ，Ｎ’−ジメチル
−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移動錯
体、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びトリエタノール
アミンを含有する化学発光試薬を得た。
【００４１】［実施例４］化学発光測定用マイクロプレ
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表４に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素水溶液５０μｌを
加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣ
Ｔ−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、
表４に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
【００４２】
【表４】
【００４３】［参考例５］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加
し混合することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−
ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む
化学発光試薬を得た。
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加
し混合することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−
ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド及びトリエタノールアミンを含む
化学発光試薬を得た。
【００４４】［実施例５］化学発光測定用マイクロプレ
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素溶液５０μｌを加
え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表
５に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
ートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
H7.8) 溶液１００μｌ、及び１０ｍＭｐ−ヨードフェノ
ール溶液８００μｌと上記化学発光試薬２０μｌとを１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液９．１８ｍｌに添
加して調製した発光試薬溶液１００μｌを加えた後、こ
れに０．００３４重量％の過酸化水素溶液５０μｌを加
え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ
−９０００Ｄ）で１〜５秒間発光量を積算した結果、表
５に示すような発光強度が得られ、ＨＲＰを１×１０
-19 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定することが可能であっ
た。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【発明の効果】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方
法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使
用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で
測定することが可能になり、従って、ペルオキシダーゼ
を標識物質に使用する酵素免疫測定法により抗原、抗体
類を、またハイブリダイゼーションアッセイ法により核
酸類をそれぞれより高感度に検出又は定量することがで
きる。
法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を従来から広く使
用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度で
測定することが可能になり、従って、ペルオキシダーゼ
を標識物質に使用する酵素免疫測定法により抗原、抗体
類を、またハイブリダイゼーションアッセイ法により核
酸類をそれぞれより高感度に検出又は定量することがで
きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 荒谷 弦一郎 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 細越 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 2G054 AB10 CA28 CE01 CE10 EA01 4B063 QA01 QQ22 QR41 QR50 QR57 QR66 QS02 QS22 QS24 QX02
Claims (11)
- 【請求項１】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬を用
い、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素
活性を測定することを特徴とする化学発光法によるペル
オキシダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項２】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成
分とする化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下にお
いてペルオキシダーゼ酵素活性を測定することを特徴と
する化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定方
法。 - 【請求項３】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又は
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光
試薬を用い、水素受容体の存在下においてペルオキシダ
ーゼ酵素活性を測定する際に、発光増強剤としてフェノ
ール性化合物を用いることを特徴とする化学発光法によ
るペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項４】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類の電荷移動錯体が下記一般式
（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞ
れアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素
原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
ロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互
いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビ
スアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残
基である酸ラジカルを示す。）で表わされる化合物であ
る請求項１〜３のいずれかの請求項に記載のペルオキシ
ダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項５】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物が下記一般式（２） 【化２】 （上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよく、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが
結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒
素原子と共に環を形成していてもよい。）で表わされる
化合物である請求項１〜４のいずれかの請求項に記載の
ペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項６】 前記アミノアルコール化合物が下記一
般式（３） 【化３】 （上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価
の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わ
す。）で表わされる化合物である請求項２〜５のいずれ
かの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項７】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類の電荷移動錯体がＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート
（ルシゲニン）の電荷移動錯体である請求項１〜６のい
ずれかの請求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方
法。 - 【請求項８】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ，Ｎ−ジ
メチルアセトアミドである請求項１〜７のいずれかの請
求項に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項９】 前記アミノアルコール化合物がモノエ
タノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノー
ルアミンからなる群より選択される少なくとも一種の化
合物である請求項２〜８のいずれかの請求項に記載のペ
ルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項１０】 前記水素受容体が過酸化水素又は過酸
化水素源である請求項１〜９のいずれかの請求項に記載
のペルオキシダーゼ活性の測定方法。 - 【請求項１１】 前記発光増強剤がｐ−ヨードフェノー
ル、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾチ
アゾールから選ばれる少なくとも１種のフェノール性化
合物である請求項３〜１０のいずれかの請求項に記載の
ペルオキシダーゼ活性の測定方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36157098A JP5048889B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 |
| PCT/JP1999/004401 WO2000009626A1 (fr) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Reactifs chimioluminescents et procedes d'analyse par chimioluminescence dans lesquels on utilise lesdits reactifs |
| EP99937071A EP1038939B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
| DE69933850T DE69933850T2 (de) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemilumineszenzmittel und chemilumineszenzanalyseverfahren mit deren verwendung |
| CA002306752A CA2306752C (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagent and chemiluminescent analysis using the same |
| US09/529,546 US6395503B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36157098A JP5048889B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000184899A true JP2000184899A (ja) | 2000-07-04 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36157098A Expired - Fee Related JP5048889B2 (ja) | 1998-08-14 | 1998-12-18 | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP5048889B2 (ja) |
-
1998
- 1998-12-18 JP JP36157098A patent/JP5048889B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|
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