JPS62174637A - 化学発光反応成分検出感度増大法 - Google Patents
化学発光反応成分検出感度増大法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔本発明の技術分野〕
本発明は化学発光反応の光出力を増大する方法及び化学
発光反応の成分を検出方法に関する０本発明はこれら分
析試験の幾つかを行うための分析試験キットにも関する
。
発光反応の成分を検出方法に関する０本発明はこれら分
析試験の幾つかを行うための分析試験キットにも関する
。
〔本発明の背景〕
幾つかの化合物は化学発光挙動を示し、それらはこの性
質のため一般に重要視されている。ルミノール（５−２
，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）は酸化さ
れた時、光を発する能力があるためよく知られている。
質のため一般に重要視されている。ルミノール（５−２
，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）は酸化さ
れた時、光を発する能力があるためよく知られている。
それは例えばｖ＆を金属イオン、銅、鉄、過酸化物及び
シアン化物を分析するだめの多くの分析方法で用いられ
ている。
シアン化物を分析するだめの多くの分析方法で用いられ
ている。
ルミノールの光発光は典型的にはペルオキシダーゼの如
き酸化反応のための触媒を存在させて過酸化水素の如き
酸化剤とそれを一緒にすることにより、惹き起こされて
いる。この反応はここでは［ルミノールＪ反応と呼ばれ
ている。ホタル ルシフェリンをルミノール反応に添加
すると光出力が増大することはホワイトヘッド（Ｗｈｉ
ｔｅｈｅａｄ）その他によりＮ ａｔｕｒｅ、３０５，
１５８−１５９（１９８３）に報告されている。
き酸化反応のための触媒を存在させて過酸化水素の如き
酸化剤とそれを一緒にすることにより、惹き起こされて
いる。この反応はここでは［ルミノールＪ反応と呼ばれ
ている。ホタル ルシフェリンをルミノール反応に添加
すると光出力が増大することはホワイトヘッド（Ｗｈｉ
ｔｅｈｅａｄ）その他によりＮ ａｔｕｒｅ、３０５，
１５８−１５９（１９８３）に報告されている。
化学的に引き起こされる蛍光を用いた分析試験は当分野
で知られている１例えば米国特許第４．２２０，４５０
号を参照されたい。
で知られている１例えば米国特許第４．２２０，４５０
号を参照されたい。
米国特許第４，４３３，０６０号には過酸化物とクロラ
ミンによって活性化されたトリフェニルメタン染料を用
いた化学発光免疫試験（ｉＩｌｍｕｎｏａｓｓａｙ）が
記載されている。 トリフェニルメタン染料は標識（ｌ
ａｂｅｌｌｉｎｇ）物質として用いられている。
ミンによって活性化されたトリフェニルメタン染料を用
いた化学発光免疫試験（ｉＩｌｍｕｎｏａｓｓａｙ）が
記載されている。 トリフェニルメタン染料は標識（ｌ
ａｂｅｌｌｉｎｇ）物質として用いられている。
ユｏ −（Ｙ ｕｒｏｗ）その他によるＡ ｎａｌｙｔ
ｉｃａ Ｃｈｉｎｉｃａ Ａ ｅｔａ、 、６８．
ｐｐ、 ２０３−２０４−（１９７４）には、ルミノー
ルを含んだ化学発光反応を用いたあるケトンのための分
析試験が記載されている。
ｉｃａ Ｃｈｉｎｉｃａ Ａ ｅｔａ、 、６８．
ｐｐ、 ２０３−２０４−（１９７４）には、ルミノー
ルを含んだ化学発光反応を用いたあるケトンのための分
析試験が記載されている。
化学発光反応からの光出力ご増大するための方法は既に
米国特許５ｅｒｉａｌ Ｎｏ、 ５９７，４８３に発
明者によって記載されている。その特許出願の方法は共
反応物としてβ−ラクタム抗生物質を用いている。
米国特許５ｅｒｉａｌ Ｎｏ、 ５９７，４８３に発
明者によって記載されている。その特許出願の方法は共
反応物としてβ−ラクタム抗生物質を用いている。
Ｇ 、Ｈ、Ｇ 、ソープ（Ｔｈｏｒｐｅ）その他による
Ｊ。
Ｊ。
Ｉｍｓｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、７９
．５７−６３（１９８５）及び欧州特許出願筒８４３０
０７２５．３にはルミノール反応の如き化学発光反応か
らの光出力を増大するための別の方法が記載されている
。この方法は触媒として芳香族ａ（フェノール）を使用
することを要求している。
．５７−６３（１９８５）及び欧州特許出願筒８４３０
０７２５．３にはルミノール反応の如き化学発光反応か
らの光出力を増大するための別の方法が記載されている
。この方法は触媒として芳香族ａ（フェノール）を使用
することを要求している。
ｔＪ、ｓ、ｓ、Ｒ，特許７６Ｓ Ｕ−３６０４４２につ
いてのダーウエント（Ｄｅｒｗｅｎｔ） アブストラ
クトには、植物病理学的微生物によっておかされたジャ
ガイモ塊茎の化学発光分析が記載されており、この場合
水で薄めたジャガイモジュースをルミノール、過酸化水
素及びベンジジンで処理し、化学発光試験に必要な分析
時間は３４分に減少されている。
いてのダーウエント（Ｄｅｒｗｅｎｔ） アブストラ
クトには、植物病理学的微生物によっておかされたジャ
ガイモ塊茎の化学発光分析が記載されており、この場合
水で薄めたジャガイモジュースをルミノール、過酸化水
素及びベンジジンで処理し、化学発光試験に必要な分析
時間は３４分に減少されている。
発光は少なくとも三つの主な発光系即ち発光測定免疫試
験系で用いられている： （ａ）有機発光又は有機発光測定免疫試験で、この瑞合
発光反応に直接関与する（即ち励起状態へ変化され、次
に光子を放出して非励起状態へ戻る）化学発光或は生物
発光化合物がプロティン、ホルモン、へ７°テン、ステ
ロイド、核酸、代謝産物、抗原及び（又は）抗体の如き
配位子に標識を付けるのに用いられている。安定な化合
物の例には、ルミノール及びイソルミノールが含まれる
；（ｂ）発光触媒又は共同因子免疫試験で、この場合発
光反応の触媒又は共同因子が標識として用いられている
。適当な触媒の例には酵素ペルオキシダーゼがある； （ｅ）酵素結合免疫試験で、この場合発光反応は適当な
基質につけた酵素標識の作用によって形成された生成物
を決定するのに用いられている。この種の免疫試験の例
は、酵素／抗体試薬とグルコースと反応させて過酸化水
素を形成させ、次に発光反応を開始させるため調節され
た条件でルミノールを添加することにより生成した過酸
化水素の量を測定することによる抗体に結合したグルコ
ース オキシダーゼの決定である。
験系で用いられている： （ａ）有機発光又は有機発光測定免疫試験で、この瑞合
発光反応に直接関与する（即ち励起状態へ変化され、次
に光子を放出して非励起状態へ戻る）化学発光或は生物
発光化合物がプロティン、ホルモン、へ７°テン、ステ
ロイド、核酸、代謝産物、抗原及び（又は）抗体の如き
配位子に標識を付けるのに用いられている。安定な化合
物の例には、ルミノール及びイソルミノールが含まれる
；（ｂ）発光触媒又は共同因子免疫試験で、この場合発
光反応の触媒又は共同因子が標識として用いられている
。適当な触媒の例には酵素ペルオキシダーゼがある； （ｅ）酵素結合免疫試験で、この場合発光反応は適当な
基質につけた酵素標識の作用によって形成された生成物
を決定するのに用いられている。この種の免疫試験の例
は、酵素／抗体試薬とグルコースと反応させて過酸化水
素を形成させ、次に発光反応を開始させるため調節され
た条件でルミノールを添加することにより生成した過酸
化水素の量を測定することによる抗体に結合したグルコ
ース オキシダーゼの決定である。
上記免疫試験の感度は一つには標識或は標識生成物を検
出するための下限によって決定される。
出するための下限によって決定される。
発光或は発光測定免疫試験の場合には、その系の５５度
は標識がつけられた物質の１単位当たり発光反応で放出
した光に一部依存するであろう。
は標識がつけられた物質の１単位当たり発光反応で放出
した光に一部依存するであろう。
免疫試験ではないが、発光反応が入っている分析試験の
例には次のようなものがある：（ａ）不溶性ベルオキシ
ダーゼーエラシチン製造からのペルオキシダーゼの遊離
に基づくエラシターゼ分析試験、 （ｂ）−緒に不動化したグルコース オキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼに基づくグルコース分析試験、及び （ｃ）ペルオキシダーゼ酵素、アミン置換環化ジアシル
ヒドラジド、又は過酸化水素の如き酸化剤の、これらの
物質が標識でもなく標識生成物でもない時の分析試験。
例には次のようなものがある：（ａ）不溶性ベルオキシ
ダーゼーエラシチン製造からのペルオキシダーゼの遊離
に基づくエラシターゼ分析試験、 （ｂ）−緒に不動化したグルコース オキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼに基づくグルコース分析試験、及び （ｃ）ペルオキシダーゼ酵素、アミン置換環化ジアシル
ヒドラジド、又は過酸化水素の如き酸化剤の、これらの
物質が標識でもなく標識生成物でもない時の分析試験。
本発明はルミノール反応の如き反応の化学発光を増大す
るために、あるアミンを使用することに関する。特にル
ミノール及び他の化学発光化合物と一緒になったそのよ
うなアミンの化学発光挙動はそのアミン化合物を用いる
ことにより、反応の感度を増大する結果として化学発光
反応の特定の成分を発光検出するのに有用である。！＆
後に本発明は化学発光分析試験を行うための分析試験キ
ットにも関する。
るために、あるアミンを使用することに関する。特にル
ミノール及び他の化学発光化合物と一緒になったそのよ
うなアミンの化学発光挙動はそのアミン化合物を用いる
ことにより、反応の感度を増大する結果として化学発光
反応の特定の成分を発光検出するのに有用である。！＆
後に本発明は化学発光分析試験を行うための分析試験キ
ットにも関する。
特に本発明の一つの方法は化学発光化合物、無機過酸化
物源、及び酸化触媒を含む化学発光反応の成分を検出す
るための分析試験反応の感度を増大するためのものであ
る０分析試験される成分は前記成分のいずれかでよい、
この方法は分析試験反応にその感度を増大するためアミ
ンを含ませることからなる。用いられるアミンは次の群
即ち、（ａ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、各Ｙは独
立に電子供与基であり、ｎは０．１．２又は３である） の単環アニリン化合物； （ｂ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｗは炭素
−炭素結合、酸素、メチレン、又は−ＣＨ２０−であり
、Ｚ及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、アミン、低級ア
ルキル又は低級アルコキシである） のビフェニル化合物： （ｃ）式： く式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｚ及びＺ
′は独立に水素、ハロゲン、アミン、低級アルキル又は
低級アルコキシである〉 のナフタレン化合物；及び （ｄ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｚ及びＺ
′は独立に水素、ハロゲン、アミノ、低級アルキル又は
低級アルコキシである） のアントラセン化合物； からなる群から選択された。
物源、及び酸化触媒を含む化学発光反応の成分を検出す
るための分析試験反応の感度を増大するためのものであ
る０分析試験される成分は前記成分のいずれかでよい、
この方法は分析試験反応にその感度を増大するためアミ
ンを含ませることからなる。用いられるアミンは次の群
即ち、（ａ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、各Ｙは独
立に電子供与基であり、ｎは０．１．２又は３である） の単環アニリン化合物； （ｂ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｗは炭素
−炭素結合、酸素、メチレン、又は−ＣＨ２０−であり
、Ｚ及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、アミン、低級ア
ルキル又は低級アルコキシである） のビフェニル化合物： （ｃ）式： く式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｚ及びＺ
′は独立に水素、ハロゲン、アミン、低級アルキル又は
低級アルコキシである〉 のナフタレン化合物；及び （ｄ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｚ及びＺ
′は独立に水素、ハロゲン、アミノ、低級アルキル又は
低級アルコキシである） のアントラセン化合物； からなる群から選択された。
分析試験は発光測定器で測定した時、光出力のピークが
得られた後１分の光出力信号が、その光出力ピークの強
度の少なくとも約５０％である（換言すれば光出力のピ
ークが得られた後、光出力のｔ１／２は少なくとも１分
である）ことを特徴とする。
得られた後１分の光出力信号が、その光出力ピークの強
度の少なくとも約５０％である（換言すれば光出力のピ
ークが得られた後、光出力のｔ１／２は少なくとも１分
である）ことを特徴とする。
本発明の好ましい方法として、光出力のピークは反応開
始後約１５分以内で得られ、もっと好ましくは約５分以
内で得られるであろう。
始後約１５分以内で得られ、もっと好ましくは約５分以
内で得られるであろう。
本発明によって与えられる分析試験キットは、反応物と
して化学発光化合物、無機過酸化物源及び酸化触媒を含
む化学発光反応の成分を検出するためのもので、その成
分は、化学発光化合物、無機過酸化物源及び酸化触媒の
うちの一つである。
して化学発光化合物、無機過酸化物源及び酸化触媒を含
む化学発光反応の成分を検出するためのもので、その成
分は、化学発光化合物、無機過酸化物源及び酸化触媒の
うちの一つである。
分析試験キットは、
（ａ）分析すべき成分以外の反応物；及び（ｂ）上で述
べた種類のアミン； からなる、そのアミンは更に、化学発光反応が、ｉ ）
０．ＯＩＢ／ ｗｂｌの濃度でのルミノール及びＤＨを
９．５に維持するための０．０５Ｍ硼酸ナトリウム１０
、ＯＩＭ ＥＤＴＡ＆！１ｉ剤を含む水溶液１００μ
ｅ。
べた種類のアミン； からなる、そのアミンは更に、化学発光反応が、ｉ ）
０．ＯＩＢ／ ｗｂｌの濃度でのルミノール及びＤＨを
９．５に維持するための０．０５Ｍ硼酸ナトリウム１０
、ＯＩＭ ＥＤＴＡ＆！１ｉ剤を含む水溶液１００μ
ｅ。
ｉｉ）ワサビダイコン へルオキシダーゼの０．０４鋼
ｇ／ｌ１１１水溶液１０μｌ； ｉｉｉ ）０．００１Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ中退酸化水
素０．０３５Ｍ溶液１００μｌ； ｉｖ ）水ｔｏｏ、ｕｚ；及び Ｖ）アミンのＯ，１ｍｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｉ’水溶
液の一方及び（又は）他方１０μｌ； を−緒にすることにより得られた反応混合物中で行なわ
れた時、光出力のピークが得られた後、１分でその光出
力のピークの強度の少なくとも約５０％である化学発光
光出力信号を与えることを特徴とする。
ｇ／ｌ１１１水溶液１０μｌ； ｉｉｉ ）０．００１Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ中退酸化水
素０．０３５Ｍ溶液１００μｌ； ｉｖ ）水ｔｏｏ、ｕｚ；及び Ｖ）アミンのＯ，１ｍｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｉ’水溶
液の一方及び（又は）他方１０μｌ； を−緒にすることにより得られた反応混合物中で行なわ
れた時、光出力のピークが得られた後、１分でその光出
力のピークの強度の少なくとも約５０％である化学発光
光出力信号を与えることを特徴とする。
本発明の新規な分析試験は、極めて感度が高くヘプテン
、ステロイド、抗原、抗体、プロティン及びプロティン
含有分子の如き配位子に対する迅速な分析を与える０本
発明の促進された反応は、ＤＮＡ及び小さな分子或は低
分子量のホルモンを検出するのに用いることもできる０
反応がルミノールを存在させて行われる場合、それらは
過酸化物を検出するのに用いることができる。化学発光
反応の光出力を増大するのみでなく、増大した光出力を
持続することができるアミンの優れた用途分発見したこ
とは驚くべきことであり又非常に有用なことであった０
本発明の方法によって与えられる持続した大きな光出力
の結果として、本方法は非常に有用で便利な分析手段を
与える。
、ステロイド、抗原、抗体、プロティン及びプロティン
含有分子の如き配位子に対する迅速な分析を与える０本
発明の促進された反応は、ＤＮＡ及び小さな分子或は低
分子量のホルモンを検出するのに用いることもできる０
反応がルミノールを存在させて行われる場合、それらは
過酸化物を検出するのに用いることができる。化学発光
反応の光出力を増大するのみでなく、増大した光出力を
持続することができるアミンの優れた用途分発見したこ
とは驚くべきことであり又非常に有用なことであった０
本発明の方法によって与えられる持続した大きな光出力
の結果として、本方法は非常に有用で便利な分析手段を
与える。
本発明は化学発光挙動を示す新規な反応及びその新規な
反応と組成物を分析試験手段として利用することに関す
る。
反応と組成物を分析試験手段として利用することに関す
る。
ルミノール反応の如き化学発光反応は一般に化学発光化
合物（例えばルミノール反応のルミノール）、過酸化物
の如き酸化剤及びペルオキシダーゼの如き酸化触媒の存
在を必要とする。
合物（例えばルミノール反応のルミノール）、過酸化物
の如き酸化剤及びペルオキシダーゼの如き酸化触媒の存
在を必要とする。
本明細書及び特許請求の範囲で用いられている用語「化
学発光化合物」とはエネルギーをもち、過酸化物の存在
下で（即ち化学発光化合物と過酸化物との反応の結果と
して）蛍光の形でそれを発する化合物のことを指す０本
発明を実施する際に用いてもよい化学発光化合物には、
ルミノール及びイソルミノール；及び７−シメチルアミ
ノナフタレンー１．２−ジカルボン酸ヒドラジドの如き
ルミノール及びイソルミノール類似物が含まれ、それら
は米国特許第４，３５５，１６５号及び第４，２２６，
９９３号に記載されている（両方の特許は参考のためこ
こに入れである）。
学発光化合物」とはエネルギーをもち、過酸化物の存在
下で（即ち化学発光化合物と過酸化物との反応の結果と
して）蛍光の形でそれを発する化合物のことを指す０本
発明を実施する際に用いてもよい化学発光化合物には、
ルミノール及びイソルミノール；及び７−シメチルアミ
ノナフタレンー１．２−ジカルボン酸ヒドラジドの如き
ルミノール及びイソルミノール類似物が含まれ、それら
は米国特許第４，３５５，１６５号及び第４，２２６，
９９３号に記載されている（両方の特許は参考のためこ
こに入れである）。
無機過酸化物源に関して、適当な無機過酸化物は過酸化
水素及び過硼酸ナトリウムである。
水素及び過硼酸ナトリウムである。
本発明で用いるのに適した酸化触帽こζよ、ワサビダイ
コン ペルオキシダーゼの如きべｌレオキシダーゼが含
まれる。
コン ペルオキシダーゼの如きべｌレオキシダーゼが含
まれる。
本発明の実施で用いてよいアミンは次の群ｆｌＤち、（
ａ）式： （式中χは水素、メチル、又はエチルであり、各Ｙは独
立に電子供与基であり、ｎは０．１．２又は３である） の単環アニリン化合物； （ｂ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｗは炭素
−炭素結合、酸素、メチレン、又は−ＣＨ，Ｏ・であり
、Ｚ及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、アミノ、低級ア
ルキル又は低級アルコキシである） のビフェニル化合物； （ｃ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｚ及び２
′は独立に水素、）＼ロゲン。
ａ）式： （式中χは水素、メチル、又はエチルであり、各Ｙは独
立に電子供与基であり、ｎは０．１．２又は３である） の単環アニリン化合物； （ｂ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｗは炭素
−炭素結合、酸素、メチレン、又は−ＣＨ，Ｏ・であり
、Ｚ及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、アミノ、低級ア
ルキル又は低級アルコキシである） のビフェニル化合物； （ｃ）式： （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであり、Ｚ及び２
′は独立に水素、）＼ロゲン。
アミノ、低級アルキル又は低級アルコキシである）
のナフタレン化合物；及び
（ｄ）式：
す、２及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、アミノ、低級
アルキル又は低級アルコキシである） アントラセン化合物； からなる群から選択される。
アルキル又は低級アルコキシである） アントラセン化合物； からなる群から選択される。
（ａ）の部類に入る単環アニリン化合物のＹ置換基に関
連して、「電子供与基」とは誘導及び（又は）共鳴効果
により芳香族環に電子を放出する置換基な意味する。
連して、「電子供与基」とは誘導及び（又は）共鳴効果
により芳香族環に電子を放出する置換基な意味する。
Ｘは（ａ）〜（ｄ）の部類の中のアミンの式で好ましく
は水素又はメチルであり、最も好ましくは水素である。
は水素又はメチルであり、最も好ましくは水素である。
「低級アルキル」及び「低級アルコキシ」とは炭化水素
銀が１〜４個の炭素原子と含むことを意味する。好まし
い低級アルキル及び低級アルコキシ基はそれぞれメチル
及びｔ−ブチル、メトキシ及びエトキシである。
銀が１〜４個の炭素原子と含むことを意味する。好まし
い低級アルキル及び低級アルコキシ基はそれぞれメチル
及びｔ−ブチル、メトキシ及びエトキシである。
本発明の促進された反応はアミンのない通常ルミノール
反応よりも明るい光を生じ、その反応速度は持続した一
層大きな光出力の形で一層長い時間にわたって光を発す
るような反応速度であるのみならず、背景の発光即ちペ
ルオキシダーゼが存在しない所で生ずる光はここに記載
するアミンにより実質的に減少することが発見されてい
る。
反応よりも明るい光を生じ、その反応速度は持続した一
層大きな光出力の形で一層長い時間にわたって光を発す
るような反応速度であるのみならず、背景の発光即ちペ
ルオキシダーゼが存在しない所で生ずる光はここに記載
するアミンにより実質的に減少することが発見されてい
る。
分析は発光測定器で測定した時、光出力のピークが得ら
れた後１分の光出力信号がその光出力ピークの強度の少
なくとも約５０％である（換言すれば光出力のピークが
得られた後光出力のｔ１／２は少なくとも１分である）
ことを特徴とする０本発明の好ましい方法として、光出
力のピークは反応開始後約１５分以内で得られ、もっと
好ましくは約５分以内で得られるであろう。
れた後１分の光出力信号がその光出力ピークの強度の少
なくとも約５０％である（換言すれば光出力のピークが
得られた後光出力のｔ１／２は少なくとも１分である）
ことを特徴とする０本発明の好ましい方法として、光出
力のピークは反応開始後約１５分以内で得られ、もっと
好ましくは約５分以内で得られるであろう。
別のやり方として分析試験はアミンに伴われる「増大係
数」が１より大きい、即ちアミン〔０，１及び（又は＞
１．０ｗＭ ）を用いた分析試験の光出力対アミンを用
いない分析試験の光出力の比が１より大きいことを特徴
とする。
数」が１より大きい、即ちアミン〔０，１及び（又は＞
１．０ｗＭ ）を用いた分析試験の光出力対アミンを用
いない分析試験の光出力の比が１より大きいことを特徴
とする。
好ましいアミンは１より大きな増大係数と同様に、少な
くとも１分の光出力（光出力ピークが得られたｆ＆）の
ｔ１／２をも示す。
くとも１分の光出力（光出力ピークが得られたｆ＆）の
ｔ１／２をも示す。
本発明の方法の高強度グロー反応特性は免疫試験の化学
発光検出を一層簡単で速いものにするであろう、用語「
グロー反応」とは、反応が高強度光放出即ち肉眼でしば
しば観察することができる充分な高い強度の光３発する
のみならず、わずか５秒より短い時間ではなく、時には
分単位でさえある測定可能な期間にわたってこの大きな
強度で光を発することを意味する。グロー反応の光出力
は通常数分間にわたって安定であるので、活性化剤は、
発する光の水準を決定するための従来の発光測定器より
もらっと簡単な道具を用いて光測定が行なわれる前にベ
ンチの一番上に添加することができる。この検出法は従
来の化学発光、比色或は蛍光分析試験よりも速く、後者
の二つの方法よりも一層感度が高い、これらの信号の動
的範囲はルミノール反応自体よりも一般に２桁〜３桁大
きく、それは従来の化学発光免疫試験よりもこれらの系
の感度を増大することがある。
発光検出を一層簡単で速いものにするであろう、用語「
グロー反応」とは、反応が高強度光放出即ち肉眼でしば
しば観察することができる充分な高い強度の光３発する
のみならず、わずか５秒より短い時間ではなく、時には
分単位でさえある測定可能な期間にわたってこの大きな
強度で光を発することを意味する。グロー反応の光出力
は通常数分間にわたって安定であるので、活性化剤は、
発する光の水準を決定するための従来の発光測定器より
もらっと簡単な道具を用いて光測定が行なわれる前にベ
ンチの一番上に添加することができる。この検出法は従
来の化学発光、比色或は蛍光分析試験よりも速く、後者
の二つの方法よりも一層感度が高い、これらの信号の動
的範囲はルミノール反応自体よりも一般に２桁〜３桁大
きく、それは従来の化学発光免疫試験よりもこれらの系
の感度を増大することがある。
更に、アミンを用いることにより、写真フィルムによる
化学発光反応の検出を可能にしている。
化学発光反応の検出を可能にしている。
こ らの促進した反応により、数分間にわたって発生す
る光に迷惑フィルム又はＸｔｉフィルムを露出すること
は、目で観察した時、定性的乃至は定置的結果にとって
充分な像密度を生ずるのに充分である。定量的な結果は
コストの低い密度計を用いることにより、これらの像か
ら得ることもできる。
る光に迷惑フィルム又はＸｔｉフィルムを露出すること
は、目で観察した時、定性的乃至は定置的結果にとって
充分な像密度を生ずるのに充分である。定量的な結果は
コストの低い密度計を用いることにより、これらの像か
ら得ることもできる。
勿論、本発明の方法自体は光出力信号を決定するための
どんな適当な手段を用いてもよく、光出力信号はピーク
の高さの測定、全信号の下の面積又はその一部を積分す
るなどのような適当な方法により分析することができる
ことは理解されるであろう。
どんな適当な手段を用いてもよく、光出力信号はピーク
の高さの測定、全信号の下の面積又はその一部を積分す
るなどのような適当な方法により分析することができる
ことは理解されるであろう。
本発明の化学発光反応の光放出はある程度までｐＨ５反
応物濃度、温度、光測定法等の如き補助因子により影響
されるであろう、最適結果を得るために、これらの因子
は可能な程度まで制御され、調節されるべきである。
応物濃度、温度、光測定法等の如き補助因子により影響
されるであろう、最適結果を得るために、これらの因子
は可能な程度まで制御され、調節されるべきである。
現在のところ、本発明の化学発光は他の同様な分析試験
反応程９Ｈの変動には左右されないと考えられている。
反応程９Ｈの変動には左右されないと考えられている。
一般に約７．０〜１３゜０のｐＨが適切であることが判
明している。現在ｐＨは約８〜１０．５であるのが好ま
しく 、８．５〜９．０の９８が最も好ましい６選択さ
れたｐＨを維持するのに用いるのに適しなＭ衝剤は硼酸
塩、炭酸塩、燐酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン等である。
明している。現在ｐＨは約８〜１０．５であるのが好ま
しく 、８．５〜９．０の９８が最も好ましい６選択さ
れたｐＨを維持するのに用いるのに適しなＭ衝剤は硼酸
塩、炭酸塩、燐酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン等である。
−ｍ的にいって分析試験反応で用いられる試薬濃度の範
囲は次の通りである： 酸化触ＯＸ ０．０１μｇ〜５０００ｍｇ／
１過酸化物源 １０ ）ｔ Ｍ 〜３００＋＋
Ｍ ／ １化学Ｑ光化合物０．５μＭ〜２０（ＬａＭ
／１アミンＩＯμＭ 〜３００＋＋ ／ １グロ一反応
の光出力の強度及び継続時間はある程度まで選択された
化学発光反応の特定の成分及び用いられたそれぞれの量
に依存するであろう。
囲は次の通りである： 酸化触ＯＸ ０．０１μｇ〜５０００ｍｇ／
１過酸化物源 １０ ）ｔ Ｍ 〜３００＋＋
Ｍ ／ １化学Ｑ光化合物０．５μＭ〜２０（ＬａＭ
／１アミンＩＯμＭ 〜３００＋＋ ／ １グロ一反応
の光出力の強度及び継続時間はある程度まで選択された
化学発光反応の特定の成分及び用いられたそれぞれの量
に依存するであろう。
特に、光出力の性質は用いられたアミンの旦によって大
きく影響されるようにみえる。
きく影響されるようにみえる。
最適結果を得るように分析試験が行なわれる温度は中程
度であるのがよく、例えば約０〜５０’Ｃ１好ましくは
約２０℃である。
度であるのがよく、例えば約０〜５０’Ｃ１好ましくは
約２０℃である。
ここに記載された促進された化学発光反応は化学発光化
合物、過酸化物源或は酸化触媒の如き反応の成分に対す
る分析試験でも非常に有用である。
合物、過酸化物源或は酸化触媒の如き反応の成分に対す
る分析試験でも非常に有用である。
ここに記載した促進した化学発光反応は、標識が化学発
光化合物（例えばルミノール）又は化学発光反応のため
の触媒である場合の免疫試験にも有用である。これらの
反応は一層感度を高くすることができる。即ち、分析試
験にかけられる成分はアミンの存在によって得られる一
層大きな光出力により、一層容易に検出され、定量され
る。
光化合物（例えばルミノール）又は化学発光反応のため
の触媒である場合の免疫試験にも有用である。これらの
反応は一層感度を高くすることができる。即ち、分析試
験にかけられる成分はアミンの存在によって得られる一
層大きな光出力により、一層容易に検出され、定量され
る。
既知のルミノールに基づく免疫試験の例は、プロゲステ
ロン、ビオチン及びアビジンの如きステロイド、シロキ
シン、及び肝炎８表面抗原のための分析試験である。こ
れらの分析試験はＭ、セリオ（Ｓｅｒｉｏ）及びＭ、ボ
ザグリ（Ｐ ｏｚｚａｇｌ ｉ）によって編集された本
”ＬｕｒａｉｎｅｓａｅｎＬ Ａｓ５ａｙｓ：Ｐｅｒ
ｓｐｅｃＬｉｖｅｓ ｉｎ Ｅ ｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ ＣＩｎ１ｃａｌＣｂｅｎｉｓＬ
ｒｙ”（ラベンブレス、ニューヨーク、１９８２）に記
載されている。
ロン、ビオチン及びアビジンの如きステロイド、シロキ
シン、及び肝炎８表面抗原のための分析試験である。こ
れらの分析試験はＭ、セリオ（Ｓｅｒｉｏ）及びＭ、ボ
ザグリ（Ｐ ｏｚｚａｇｌ ｉ）によって編集された本
”ＬｕｒａｉｎｅｓａｅｎＬ Ａｓ５ａｙｓ：Ｐｅｒ
ｓｐｅｃＬｉｖｅｓ ｉｎ Ｅ ｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ ＣＩｎ１ｃａｌＣｂｅｎｉｓＬ
ｒｙ”（ラベンブレス、ニューヨーク、１９８２）に記
載されている。
標識のつけられた物質がワサビダイコン ペルオキシダ
ーゼであるルミノール反応を基にした分析試験の例には
、プロティン結合分析試験が含まれ、オルソン（Ｏｌ５
ｓｏｎ）その他によるＪ 、 Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５，１２７−１３５（１
９７９）に記載されている。
ーゼであるルミノール反応を基にした分析試験の例には
、プロティン結合分析試験が含まれ、オルソン（Ｏｌ５
ｓｏｎ）その他によるＪ 、 Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５，１２７−１３５（１
９７９）に記載されている。
分析試験を改良するための方法として化学発光反応を促
進することの有用性は、次のようにもっと完全に説明す
ることができる。化学発光反応は幾つかの基質を必要と
するか或は利用する。それら基質の一つ以上（一般に全
て〉は臨界的又は速度律速性をもつであろう。それらの
基質は結合されていても或はされていなくてもよい、即
ち或は場合にはそれら基質は他の基質例えば、薬品、抗
体、プロティン、抗原、ＤＮＡ等に結合され、そのよう
な他の基質が検出される標識を与えるようにしてもよい
。
進することの有用性は、次のようにもっと完全に説明す
ることができる。化学発光反応は幾つかの基質を必要と
するか或は利用する。それら基質の一つ以上（一般に全
て〉は臨界的又は速度律速性をもつであろう。それらの
基質は結合されていても或はされていなくてもよい、即
ち或は場合にはそれら基質は他の基質例えば、薬品、抗
体、プロティン、抗原、ＤＮＡ等に結合され、そのよう
な他の基質が検出される標識を与えるようにしてもよい
。
ルミノール反応の例として、遊離のルミノール又はある
他の基質に結合されたルミノールが検出されてもよい、
この反応は本発明の方法により促進されるであろう。
他の基質に結合されたルミノールが検出されてもよい、
この反応は本発明の方法により促進されるであろう。
過酸化物源は化学発光反応で必要な成分であるので、過
酸化物源の存在は化学発光反応が起きることによって示
すことができる。従って本発明の方法は、′例えば、過
酸化水素又は過酸化水素を発生する基質の検出を促進す
るであろう。
酸化物源の存在は化学発光反応が起きることによって示
すことができる。従って本発明の方法は、′例えば、過
酸化水素又は過酸化水素を発生する基質の検出を促進す
るであろう。
更に化学発光反応を含む米国特許第４，２２０，４５０
号の反応は全て本発明を使用する機会を与えるであろう
、即ち米国特許第４，２２０，４５０号に記載された配
位子或は抗配位子（ａｎｔｉｉｉｇａｎｄ）は化学発光
反応の成分によって標識をつけることができ、アミンを
用いた化学発光反応の促進の結果として配位子或は抗配
位子は一層容易に検出されるであろう。
号の反応は全て本発明を使用する機会を与えるであろう
、即ち米国特許第４，２２０，４５０号に記載された配
位子或は抗配位子（ａｎｔｉｉｉｇａｎｄ）は化学発光
反応の成分によって標識をつけることができ、アミンを
用いた化学発光反応の促進の結果として配位子或は抗配
位子は一層容易に検出されるであろう。
化学発光反応の成分を検出するための本発明の分析試験
キットは、ｉ）分析試験される成分とは別の化学発光反
応の反応物；及びｉｉ）アミンからなる。そのような反
応物及びアミンは通常複数の分析試験を行なうのに充分
な量で存在し、実質的に安定な形で包装されている（即
ちキットは室温で少なくとも約３０日間の保存寿命を示
す）。
キットは、ｉ）分析試験される成分とは別の化学発光反
応の反応物；及びｉｉ）アミンからなる。そのような反
応物及びアミンは通常複数の分析試験を行なうのに充分
な量で存在し、実質的に安定な形で包装されている（即
ちキットは室温で少なくとも約３０日間の保存寿命を示
す）。
分析試験キットは一般に分析反応混合物のｐ）ｌを調節
するために用いられる一種類以上の好ましい）１１１溶
液も含んでいるであろう、キットは任意に、分析すべき
基質の既知の量の一種類以上の標準溶液を含んでいても
よく、或は標準的な条件で行なわれた分析試験を示す標
準的曲線を含んでいてもよい。 キットは光出力を測定
するのに用いられる装置中で分析試験反応を行なうのに
適した容器を含んでいてもよい。
するために用いられる一種類以上の好ましい）１１１溶
液も含んでいるであろう、キットは任意に、分析すべき
基質の既知の量の一種類以上の標準溶液を含んでいても
よく、或は標準的な条件で行なわれた分析試験を示す標
準的曲線を含んでいてもよい。 キットは光出力を測定
するのに用いられる装置中で分析試験反応を行なうのに
適した容器を含んでいてもよい。
得られた分析試験は医師の事務所及び臨床実験室の両方
で有用であろう。従来の化学発光反応の、例えばルミノ
ール、オキサレ−１〜、或はアクリジニウム誘導体を用
いたものは、直ぐに減衰して消える強い閃光を生ずるか
或は低いレベルで長く発光するような反応速度を有する
。両方の型の反応速度は特別な器機の使用を必要とする
。即ち活性化剤は測定室中の各試料に注入し、次に光強
度のピークを積分する或は見出だすための観察時間を設
ける必要がある。これはどこでも試料一つに付き５〜２
０秒かかり、その方法を速くするための多数の試料を収
り扱える器具は市販されていない。
で有用であろう。従来の化学発光反応の、例えばルミノ
ール、オキサレ−１〜、或はアクリジニウム誘導体を用
いたものは、直ぐに減衰して消える強い閃光を生ずるか
或は低いレベルで長く発光するような反応速度を有する
。両方の型の反応速度は特別な器機の使用を必要とする
。即ち活性化剤は測定室中の各試料に注入し、次に光強
度のピークを積分する或は見出だすための観察時間を設
ける必要がある。これはどこでも試料一つに付き５〜２
０秒かかり、その方法を速くするための多数の試料を収
り扱える器具は市販されていない。
アミンを用いた分析試験は発生するグロー反応により、
ベンチの一番上で活性化し、次にルマツクバイオカウン
ター（１−ｕｍａｃ Ｂ １ｏｃｏｕｎＬｅｒ）２０
１０又はルマック バイオカウンターＭ３０００（ミネ
ソタ州セントボールの３Ｍから入手される発光測定器の
如き簡単な器具の中に入れ、試料の光水準を数秒間読む
ようにすることができる。その方法の速度は臨床実験室
用に増大することができ、この場合微量滴定板（測定点
９６）を微量滴定板読み取り機により、精密に読み取る
ことができる。
ベンチの一番上で活性化し、次にルマツクバイオカウン
ター（１−ｕｍａｃ Ｂ １ｏｃｏｕｎＬｅｒ）２０
１０又はルマック バイオカウンターＭ３０００（ミネ
ソタ州セントボールの３Ｍから入手される発光測定器の
如き簡単な器具の中に入れ、試料の光水準を数秒間読む
ようにすることができる。その方法の速度は臨床実験室
用に増大することができ、この場合微量滴定板（測定点
９６）を微量滴定板読み取り機により、精密に読み取る
ことができる。
実施例中の発光測定器による測定は全てルマンク バイ
オカウンターＭ ３０００で行なわれた。
オカウンターＭ ３０００で行なわれた。
次の実施例は例示のために与えられているのであって、
限定するために与えられているのではない。
限定するために与えられているのではない。
実施例１
１００μｌのルミノール（ｐＨ９，５の０．ＯＩＭエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と−緒にした０、０５
Ｍ印酸塩桜川剤用に入れた０、０１ｍｇ／Ｊ）、１０μ
ｌのアミン（水中０．１又は１．０１１１？／社）、
１００ノ１１の水及び１０μｌの水又はワサビダイコン
ベルオキシダーゼ（ＨＲＰ ）（０，０４ｍｇ／ ｍ
ｌ）の混合物を発光測定器間中に入れ１００μｌの過酸
化水素（０，ＯＯＩＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ中０．０２Ｍ
）を発光測定器の検出室中へ添加した。
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と−緒にした０、０５
Ｍ印酸塩桜川剤用に入れた０、０１ｍｇ／Ｊ）、１０μ
ｌのアミン（水中０．１又は１．０１１１？／社）、
１００ノ１１の水及び１０μｌの水又はワサビダイコン
ベルオキシダーゼ（ＨＲＰ ）（０，０４ｍｇ／ ｍ
ｌ）の混合物を発光測定器間中に入れ１００μｌの過酸
化水素（０，ＯＯＩＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ中０．０２Ｍ
）を発光測定器の検出室中へ添加した。
ｐ−アニシジンを用いたその反応の光出力は３分間検査
され、第１図中時間に対してプロットしである６点線は
ｐ−アニシジンを入れた場合に観察された光出力を表し
、実線はそれを含まない場合を表している。背景に対す
る信号比（Ｓ ／ Ｂ ）はＨＲＰを用いた場合と用い
ない場合に生じた光を比較することによって決定された
６表１に示したこれらのデーターは、記載のアミンを添
加するとルミノール反応の光発生を劇的に変化し、一層
高い強度の発光をはるかに長い時間にわたって生じた（
光出力のピークが得られた後のＬ１／２によって証明さ
れているように）ことを示している。更に第２図はｐ−
アニシジンが実際に背景の光出力を低下させることを示
している。それは点線がｐ−アニシジンを用いたルミノ
ール反応の背景の光が著しく減少したことを示し、実線
がｐ−アニシジンを用いないルミノール反応の背景の光
を示しているところから判る６両方の反応共ワサビダイ
コン ペルオキシダーゼは存在していなかった。光出力
単位はルマック バイオカウンターで測定されたものと
して相体的な光羊位による。表１に値えがないのは特別
な測定が行なわれながったことを示している。
され、第１図中時間に対してプロットしである６点線は
ｐ−アニシジンを入れた場合に観察された光出力を表し
、実線はそれを含まない場合を表している。背景に対す
る信号比（Ｓ ／ Ｂ ）はＨＲＰを用いた場合と用い
ない場合に生じた光を比較することによって決定された
６表１に示したこれらのデーターは、記載のアミンを添
加するとルミノール反応の光発生を劇的に変化し、一層
高い強度の発光をはるかに長い時間にわたって生じた（
光出力のピークが得られた後のＬ１／２によって証明さ
れているように）ことを示している。更に第２図はｐ−
アニシジンが実際に背景の光出力を低下させることを示
している。それは点線がｐ−アニシジンを用いたルミノ
ール反応の背景の光が著しく減少したことを示し、実線
がｐ−アニシジンを用いないルミノール反応の背景の光
を示しているところから判る６両方の反応共ワサビダイ
コン ペルオキシダーゼは存在していなかった。光出力
単位はルマック バイオカウンターで測定されたものと
して相体的な光羊位による。表１に値えがないのは特別
な測定が行なわれながったことを示している。
実施例２
実施例１の手順を０．１ｍｇ／ｍｌ’の濃度で次の表２
に示したアミンを用いて縁り返した０表２から解るよう
に、これらのアミンは全て６０秒より短いし１／２を与
えた（光出力のピークが得られた後）表２中のデーター
としては含まれていないが、表中に示されたアミンの濃
度を１ｍｇ／ｍ１へ増大してもＬ１／２を著しく変える
ことはながった（即ち本発明で要求されているように少
なくとも６０秒のＬ１／２は得られなかった）。
に示したアミンを用いて縁り返した０表２から解るよう
に、これらのアミンは全て６０秒より短いし１／２を与
えた（光出力のピークが得られた後）表２中のデーター
としては含まれていないが、表中に示されたアミンの濃
度を１ｍｇ／ｍ１へ増大してもＬ１／２を著しく変える
ことはながった（即ち本発明で要求されているように少
なくとも６０秒のＬ１／２は得られなかった）。
実施例３
促進したルミノール反応を７．０〜１０．５のｐ＋範囲
にわたって０．０１ｍｇ／＋ｏｉ！のルミノールと０．
ＯＩＭのエチレンジアミン四酢酸を含む０．１Ｍのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンｔｒｔｖｔ剤中で
行なわれた。反応混合物は１０μｌのワサビダイコン
ペルオキシダーゼ（０，０４ｍｇ／ ｍｌ）、１０μｌ
のｐ−アニシジン（０，１μｍｇ／ ｍｌ）、１０μｍ
の水及び１００μｆのルミノール溶液を含んでいた６発
光測定器中、１００μｌの過酸化水素、Ｏ，ＯＯＩＭエ
チレンジアミン四酢酸中０゜０３５Ｍ、を試料中に注入
し、その反応によって生じた光を３分間検査した。ρ−
アニシジンを添加しないルミノール反応は同じ溶液を用
いて同様なやり方で行なわれた。但し、１０μｌの水を
アニシジンの変わりに用いた。次にこれらの反応の積分
光出力３第３図中反応ｐＨに対してプロットしであるが
、ｐ−アニシジンを用いるとｐＨｓ、ｏより上で一層有
用な光出力が観察されたく点線）のに対し、促進されて
いないルミノール反応はｐＨ７〜９．５で最小の光を生
じた（実線）ことを示している。同様な結果は０．１Ｍ
重炭酸ナトリウムＥ１ｍ剤中でも示された。光発生ピー
クはこれらのｐ−アニシジンにより促進された反応につ
いては約８．５〜９．０のｕ Ｉ−１で起きた。
にわたって０．０１ｍｇ／＋ｏｉ！のルミノールと０．
ＯＩＭのエチレンジアミン四酢酸を含む０．１Ｍのトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンｔｒｔｖｔ剤中で
行なわれた。反応混合物は１０μｌのワサビダイコン
ペルオキシダーゼ（０，０４ｍｇ／ ｍｌ）、１０μｌ
のｐ−アニシジン（０，１μｍｇ／ ｍｌ）、１０μｍ
の水及び１００μｆのルミノール溶液を含んでいた６発
光測定器中、１００μｌの過酸化水素、Ｏ，ＯＯＩＭエ
チレンジアミン四酢酸中０゜０３５Ｍ、を試料中に注入
し、その反応によって生じた光を３分間検査した。ρ−
アニシジンを添加しないルミノール反応は同じ溶液を用
いて同様なやり方で行なわれた。但し、１０μｌの水を
アニシジンの変わりに用いた。次にこれらの反応の積分
光出力３第３図中反応ｐＨに対してプロットしであるが
、ｐ−アニシジンを用いるとｐＨｓ、ｏより上で一層有
用な光出力が観察されたく点線）のに対し、促進されて
いないルミノール反応はｐＨ７〜９．５で最小の光を生
じた（実線）ことを示している。同様な結果は０．１Ｍ
重炭酸ナトリウムＥ１ｍ剤中でも示された。光発生ピー
クはこれらのｐ−アニシジンにより促進された反応につ
いては約８．５〜９．０のｕ Ｉ−１で起きた。
実施例４
ｐＨ９，０の０．１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン及び０．ＯＩＭエチレンジアミン四酢酸酢酸
中０１＋ｎｇ／ ＋１１のルミノール１００μｍ、 ワ
サビダイコン ペルオキシダーゼ１０μｍ、水中０．０
２μｍｍｆ、水１００μｒ及びｐ・アニシジン１０μｌ
からなるルミノール反応へ添加した時、ｐ−アニシジン
の濃度を０．５から０．０１翔ｇ／ｍ１（４，１０〜０
．０８１ｍＭ ）へ変えた。
ミノメタン及び０．ＯＩＭエチレンジアミン四酢酸酢酸
中０１＋ｎｇ／ ＋１１のルミノール１００μｍ、 ワ
サビダイコン ペルオキシダーゼ１０μｍ、水中０．０
２μｍｍｆ、水１００μｒ及びｐ・アニシジン１０μｌ
からなるルミノール反応へ添加した時、ｐ−アニシジン
の濃度を０．５から０．０１翔ｇ／ｍ１（４，１０〜０
．０８１ｍＭ ）へ変えた。
反応は１００μｌの過酸化水素、０．ＯＩＭエチレンジ
アミン四酢酸酢酸中０３５Ｍを注入することによって開
始させ、その反応によって生じた光を３分間検査した。
アミン四酢酸酢酸中０３５Ｍを注入することによって開
始させ、その反応によって生じた光を３分間検査した。
第４図はこれらの反応による積分光出力をその反応混合
物へ添加したｐ−アニシジンの濃度に対してプロットし
たものを示している。それは増大した光出力効果がｐ−
アニシジン約０．０００４１Ｍ即ち０．０５ｍｇ／ｉ１
で最大になることを示している。゛実施例５ ｐＨ８，５の、０．ＩＭｆｆｉ炭酸ナトリウム及び０．
０１Ｍエチレンジアミン四酢酸酢酸中０ｈａｇ／…！の
ルミノール５００μｌと、水中０．０００４１Ｍのｐ−
アニシジン１０μｌとの混合物へ、水中ワサビダイコン
ペルオキシダーゼを７．０Ｍｇ〜１．７μビ含有する
７ｆＪＭを２０μｌ分ずつ添加することによりワサビダ
イコン へルオキシダーゼの滴定な行なった０反応は過
酸化水素１００μβ、０．ＯＩＭエチレンジアミン四酢
酸酢酸中０３５Ｍを発光測定器中に注入することにより
、開始させ、３分間検査した。試料は３組にして行ない
、光出力曲線を平均し、真の光水準〔（試料の光水準）
−（ペルオキシダーゼを添加しない時の光水準）〕を計
算した。第 ５図は過酸化水素を注入した陵、３０秒〈
実線）及び９０秒（点線）での平均の真の光水準に対す
るワサビダイコン ペルオキシダーゼ濃度をプロットし
たものを示している。このプロワｉ・及び注入後６０．
１２０．１５０及び１８０秒での光水準についてプロッ
トしたものは、殆んど同じ傾斜及び切片をもつ非常に似
たものであり１．ペルオキシダーゼの濃度が反応中の殆
んどどの時点でも本発明の化学発光反応によって生じた
光に関係していることを示している。これらの結果はｐ
−アニシジンを ルミノール反応へ添加すると増大した化学発光を生じ、
それは分析上有用であり、多くの時点で測定して分析結
果を与えることができることを示している。
物へ添加したｐ−アニシジンの濃度に対してプロットし
たものを示している。それは増大した光出力効果がｐ−
アニシジン約０．０００４１Ｍ即ち０．０５ｍｇ／ｉ１
で最大になることを示している。゛実施例５ ｐＨ８，５の、０．ＩＭｆｆｉ炭酸ナトリウム及び０．
０１Ｍエチレンジアミン四酢酸酢酸中０ｈａｇ／…！の
ルミノール５００μｌと、水中０．０００４１Ｍのｐ−
アニシジン１０μｌとの混合物へ、水中ワサビダイコン
ペルオキシダーゼを７．０Ｍｇ〜１．７μビ含有する
７ｆＪＭを２０μｌ分ずつ添加することによりワサビダ
イコン へルオキシダーゼの滴定な行なった０反応は過
酸化水素１００μβ、０．ＯＩＭエチレンジアミン四酢
酸酢酸中０３５Ｍを発光測定器中に注入することにより
、開始させ、３分間検査した。試料は３組にして行ない
、光出力曲線を平均し、真の光水準〔（試料の光水準）
−（ペルオキシダーゼを添加しない時の光水準）〕を計
算した。第 ５図は過酸化水素を注入した陵、３０秒〈
実線）及び９０秒（点線）での平均の真の光水準に対す
るワサビダイコン ペルオキシダーゼ濃度をプロットし
たものを示している。このプロワｉ・及び注入後６０．
１２０．１５０及び１８０秒での光水準についてプロッ
トしたものは、殆んど同じ傾斜及び切片をもつ非常に似
たものであり１．ペルオキシダーゼの濃度が反応中の殆
んどどの時点でも本発明の化学発光反応によって生じた
光に関係していることを示している。これらの結果はｐ
−アニシジンを ルミノール反応へ添加すると増大した化学発光を生じ、
それは分析上有用であり、多くの時点で測定して分析結
果を与えることができることを示している。
第１図は本発明による化学発光反応の光放出反応速度を
プロットした図である。 第２図はアミンを存在させて得られた背景の光出力を１
０ツｌ−した図である。 第３図は７．０〜１０．５のｐＨ範囲にわたって本発明
の化学発光反応の積分光出力をプロットした図である。 第４図は添加したアミン旦を変化させて、本発明の（ヒ
学発光反応の積分光出力をプロツトシた図である。 第５図は本発明の化学発光反応を用いて、酸化触媒の濃
度に対する光出力をプロットした図である。 代 理 人 浅 村 皓図面の降口（内
容に変更なし） Ｆｒｃ、Ｉ Ｆｒｃ、２ Ｆｒｃ−４ Ｆｚｃ、！５ 手続補正書（方式） 昭和ｌ工年シ月ｔ３日
プロットした図である。 第２図はアミンを存在させて得られた背景の光出力を１
０ツｌ−した図である。 第３図は７．０〜１０．５のｐＨ範囲にわたって本発明
の化学発光反応の積分光出力をプロットした図である。 第４図は添加したアミン旦を変化させて、本発明の（ヒ
学発光反応の積分光出力をプロツトシた図である。 第５図は本発明の化学発光反応を用いて、酸化触媒の濃
度に対する光出力をプロットした図である。 代 理 人 浅 村 皓図面の降口（内
容に変更なし） Ｆｒｃ、Ｉ Ｆｒｃ、２ Ｆｒｃ−４ Ｆｚｃ、！５ 手続補正書（方式） 昭和ｌ工年シ月ｔ３日
Claims (4)
- （１）化学発光化合物、無機過酸化物源及び酸化触媒を
含む化学発光反応の成分で、前記化学発光化合物、前記
過酸化物源及び前記酸化触媒の一つである成分を検出す
るための分析試験反応の感度を増大するための方法にお
いて、前記分析試験反応の中に、次の群即ち、 （ａ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであ り、各Ｙは独立に電子供与基であり、ｎは ０、１、２又は３である） の単環アニリン化合物である； （ｂ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであ り、Ｗは炭素−炭素結合、酸素、メチレン、又は−ＣＨ
＿２Ｏ−であり、Ｚ及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、
アミノ、低級アルキル 又は低級アルコキシである） のビフエニル化合物； （ｃ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであ り、Ｚ及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、 アミノ、低級アルキル又は低級アルコキシ である） のナフタレン化合物；及び （ｄ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘは水素、メチル、又はエチルであ り、Ｚ及びＺ′は独立に水素、ハロゲン、 アミノ、低級アルキル又は低級アルコキシ である） のアントラセン化合物； からなる群から選択されたアミンで、光出力のピークが
得られた後１分で、その光出力ピークの強度の少なくと
も約５０％である光出力信号を与えることを更に特徴と
するアミンを含有させることからなる感度増大法。 - （２）酸化触媒又は化学発光化合物が配位子に結合して
いる前記第１項に記載の方法。 - （３）分析試験が免疫試験である前記第２項に記載の方
法。 - （４）配位子が抗体である前記第２項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78752585A | 1985-10-15 | 1985-10-15 | |
| US787525 | 1985-10-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62174637A true JPS62174637A (ja) | 1987-07-31 |
Family
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