KR19990044308A - 화학발광 시스템의 신호-발생 효소로서의 바나듐 브로모퍼옥시다제의 용도 ; 테스트 키트 및 분석 방법 - Google Patents

화학발광 시스템의 신호-발생 효소로서의 바나듐 브로모퍼옥시다제의 용도 ; 테스트 키트 및 분석 방법 Download PDF

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KR19990044308A
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알랜 에릭 프리드만
사라 핑거 그룩스
알리슨 버틀러
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스타크 마이클
오르토- 클리니컬 다이아그노스틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 분석물의 존재하에 화학발광 신호를 발생시킴으로써 과산화수소 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제를 검출하는데 사용할 수 있는 수성 조성물, 테스트 키트 및 방법에 관한다. 신호 발생 및 반응 카이네틱스는 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체 ; 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드-발생 시약 조성물을 포함하는 조성물을 사용함으로써 개선된다.

Description

화학발광 시스템의 신호-발생 효소로서의 바나듐 브로모퍼옥시다제의 용도 ; 테스트 키트 및 분석 방법
액체내 분석물의 농도에 비례하여 검출가능한 결과를 나타낼 수 있는 시약 조합물과 액체를 접촉시켜 수성 액체의 정성분석 또는 정량분석을 하는 것은 널리 공지되어 있다. 한 형태의 유용한 분석은 분석물이 적절한 반응물과 접촉하여 적당한 효소의 존재하에 산소와 반응함으로써 과산화수소를 생성시키는 효소 반응을 이용한다. 이후 검출가능한 생성물을 글루코스, 트리글리세리드, 우르산, 콜레스테롤 및 크레틴 키나제와 같은 분석물을 이렇게 검출할 수 있다. 일반적으로 이들 분석들에서 퍼옥시다제를 사용한다.
다른 분석에서는, 특정 분석물의 양을 측정하기 위하여 시스템에 가해진 과산화수소의 존재하에 퍼옥시다제를 반응시킨다. 예를들어, 이러한 분석은 표지로서 퍼옥시다제를 사용하는 특이 결합 분석에서 리간드를 특이 결합시키는 것으로 대표된다. 이러한 측정은 진단 테스트 장치 또는 용액내, 표면상에서 수행할 수 있다. 이러한 분석에서 생성되는 신호는 널리 공지된 신호-발생 시약을 사용하는 비색, 화학 발광 및 형광 신호일 수 있다.
해당 분석물의 존재 결과로서 빛을 방출하는 몇가지 주요 형태의 퍼옥시다제-의존 발광 또는 루미노미터 분석이 있다. 이들 분석은 화학발광 분석으로서 또한 공지되어 있으며 예를들어, Kricka 등의 미국 제 4,729,950 호 및 여기에 인용된 문헌에 기술되어 있다. 이러한 분석에서 빛의 생성을 증대시키기 위하여 여러 가지 방향족 아민 및 4-아이오도페놀과 같은 페놀이 유용하다(Kricka 등의 미국 제 4,598,044 호를 참조하시오). Friedman 등의 미국 특허 제 5,372,931 호는 신호 발생을 증대시키기 위하여 혹종의 4′- 하이드록시 - 및 알콕시-치환된 페놀 또는 나프틸 전자 전이제를 이용하는 수성 조성물을 제공한다.
선행기술의 증대된 퍼옥사다제-의존성 발광 시스템은 면역측정을 위한 적절한 빛 신호를 생성하나 선행기술 시약 조제물은 혹종의 공지된 단점을 가진다. 예를들어, 상기 정의한 바와 같은 화학발광 증대제를 포함하는 시약 조성물은 더 복잡하고 저장하기 불안정한 경향이 있다. 선행 기술 조제물내 여러 가지 시약의 활성을 엄격하게 조절할 필요는 상당한 제조 문제를 나타낸다.
게다가, 선행 기술 신호 카이네틱스는 비-선형 구경측정을 유도할 수 있는 퍼옥시다제 농도와 밀접한 함수이다.
최근, 버틀러 및 워커는 과산화수소 및 브로마이드 음이온의 존재하에 잠재적인 산화제인 활성화된 브롬 종을 촉매적으로 생성시키는 몇몇 지상의 지의류 및 균류 및 바다 조류로부터 추출된 일군의 바나듐 브로모퍼옥시다제를 기술하였다(버틀러 등의 Chem. Revs.,93, pp.1937-1944, 1993 및 이의 참고문헌 및 웨버 등의 Biochem. Phys. Acta, 830, pp.181-186, 1985 및 이의 참고문언을 참조하시오). 전술한 참고문헌 둘다는 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
대부분의 할로퍼옥시다제로 인한 문제들 중 하나는 이들의 최적 pH 가 일반적으로 낮은 pH 범위, 즉 3-5 이라는 것이다. 이것은 퍼옥시 음이온에 의존하는 퍼옥시다제-베이스 화학발광 시스템으로 인한 문제인데 ; 하이드로퍼옥시다제는 일반적으로 약 11.5 의 pKa 를 가진다. 바나듐 브로모퍼옥시다제는 약 6 - 10 의 pH 범위에서 효과적으로 작동한다.
선행 기술에 기술된 수성 신호-제공 조성물은 다수의 분석 시스템에서 놀라운 행동을 보이나 여전히 이 분야에 추가적인 개선이 필요하다. 예를들어, 여전히 더 간단한 신호-제공 조성물, 즉 미국 특허 제 5,372,931 호에 기술된 전자 전달제를 사용하지 않는 것을 제공할 필요가 있다. 또한, 공지된 선행 기술 시스템과 비교하여 개선된 효소 안정성, 더 큰 감도 및 개선된 신호 결과를 갖는 수성 조성물을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
분석 조성물 및 방법을 더욱 개선시킬 필요로 인하여 본 발명은 약 6.5 - 10 의 pH 를 갖는 화학발광 신호를 제공하게 되었다. 구체적으로 상기 특성을 갖는 본 발명 화학발광 신호-제공 조성물은 (a) 바나듐 브로모퍼옥시다제의 촉매 활성에 대한 응답으로 신호를 제공하는, 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체인 화학발광 신호-발생 시약 ; (b) 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 (c) 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드-발생 시약 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 바나듐 브로모퍼옥시다제의 촉매 활성 결과로서 분석물 측정용 진단 테스트 키트를 제공한다. 본 발명의 이러한 구체예에 따르면 본 진단 테스트 키트는
(i) 상기 기술한 신호-제공 조성물 ; 및 (ii) 바나듐 브로모퍼옥시다제 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 특이 결합 분자를 포함한다.
본 발명의 제 2 의 양상은 바나듐 브로모퍼옥시다제에 대한 응답으로 검출가능한 신호를 생성시키는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 (A) 전술한 신호-제공 조성물의 존재하에 바나듐 브로모퍼옥시다제를 반응시키는 단계 ; 및 (B) 바나듐 브로모퍼옥시다제를 측정하여 이렇게 얻어진 화학발광 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 (A) 특이 결합 리간드를 이 리간드에 대하여 특정한 수용체로 착물화하여 특이 결합 착물을 형성시키는 단계 ; (B) 상기 수용체 또는 특이 결합 리간드와 반응하는 특이 결합 분자로 컨주게이팅되거나 상기 수용체로 컨주게이팅되는 바나듐 브로모퍼옥시다제로 특이 결합 착물을 표지하는 단계 ; (C) 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 착물로부터 탁물화되지 않은 물질을 분리한후, 착물을 상기 기술한 신호-제공 조성물과 접촉시키는 단계 ; 및 (D) 특이 결합 리간드를 측정하여 얻어지는 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 여러 가지의 화학발광 분석의 사용과 관련된 모든 공지된 선행 기술의 이점을 제공하나 반응 도식에서 여러 가지 바나듐 브로모퍼옥시다제 화합물을 이용한다. 모든 공지된 선행 기술의 이점을 제공하는 외에, 본 발명 신호-제공 조성물을 이용함으로써 분석의 감도가 커짐을 이해하여야 한다.
또한, 본 발명 조성물은 방출된 빛 신호가 장시간 일정 강도로 남아있는 안정한 카이네틱스를 입증한다. 게다가, 본 발명의 더 간단한 조성물은 유기 증대제 화합물에 대한 요구를 일소한다.
본 발명은 화학발광 조성물, 테스트 키트 및 신호-발생 효소로서 바다듐 브로모퍼옥시다제를 사용하여 여러 가지 분석물을 검출하는 방법에 관한다.
도 1 은 미국 특허 제 5,372,931 호의 실시예 1 에 기술된 바와 같이 본 발명 조성물 및 대조구 조성물을 사용하여 얻어진 화학발광 신호를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2 는 미국 특허 제 5,372,931 호의 실시예 1 에 기술된 바와 같이 본 발명 조성물 및 대조구 조성물을 사용하여 얻어진 화학발광 신호-대-소음 응답을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3 은 본 발명의 신호-제공 조성물을 사용하여 바나듐 브로모퍼옥시다제 반응의 카이네틱스를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4 는 미국 특허 제 5,372,931 호의 실시예 1 에 기술된 바와 같이 HRP 대조구 조성물의 50,000 아토몰에서의 신호 결과를 동일 농도의 바나듐 브로모퍼옥시다제와 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 바나듐 브로모퍼옥시다제의 존재에 대한 응답으로 화학발광 신호를 발생시키도록 디자인된 혹종의 분석 방법에 이익이 될 수 있도록 실시될 수 있다. 이러한 분석법은 유기 또는 무기 퍼옥사이드(예를들어, 과산화수소) 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제의 검출 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제 또는 과산화수소를 제외한 비-면역학적인 분석물의 검출을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명은 화학발광 신호를 발생시키는 특정한 결합 분석법의 실시에 유용하다.
본 분석법은 정성분석 또는 정량분석 또는 둘다일 수 있으며 인간 또는 동물의 생물학적 유체, 폐유체, 음식, 환경적인 유출물, 화학 공정 액체 및 당업자가 용이하게 알 수 있는 기타의 표본을 포함하는 수성 액체내의 생물학적 또는 화학적 물질을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
과산화수소(또는 또다른 퍼옥사이드)는 본 발명으로 측정될 수 있다. 또한, 본 발명은 과산화수소를 생성시킬 수 있는 분석물을 측정하는데 사용할 수 있는데 즉, 분석물은 적당한 신호-발생 시약 및 바나듐 브로모퍼옥시다제의 존재하에 과산화수소를 생성시키는 하나 이상의 반응에 참여하게 된다. 본원에서는 이러한 분석물을 "바나듐 브로모퍼옥시다제에 촉매적으로 관련된 분석물"로서 간주한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 신호-제공 조성물은 특정한 결합 리간드 또는 해당 수용체(즉, 리간드와 특이 결합하는 물질)의 검출에 유동하다. 이러한 리간드는 항체, 항체 조각 및 기타 단백질(리포단백질, 혈액단백질, 효소 및 글리코단백질 포함), 헵텐, 약물, 호르몬, 스테로이드, 독소, 바이러스, 박테리아, 비타민, 당류(다당류 포함), 지질, 핵산, 단백질을 함유하지 않는 혈액성분 또는 당업자가 용이하게 이해하는 혹종의 혈액 성분을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은
(a) 바나듐 브로모퍼옥시다제의 촉매 활성에 때한 응답으로 신호를 제공하는 화학발광 신호-발생 시약(2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체임) ;
(b) 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및
(c) 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드-발생 시약 조성물
을 포함하며, pH 가 약 6.5 - 10 인 화학발광 신호를 제공하기 위한 분석 조성물에 관한다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명 신호-제공 조성물은 성분 중 하나로서 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체(본원에서는 "DPD"라 함)를 함유한다. 화학발광 반응에서 들뜬상태로 전환된 다음 빛의 방출과 함께 들뜨지 않은 상태로 돌아갈 수 있는 혹종의 유리 또는 컨주게이팅된 DPD 는 본 발명의 실시에 유용하다. 이러한 화합물은 상당수 업계(Kricka 의 미국 특허 제 4,598,044 호 및 Grundermann 등의 유기화학에서의 화학발광, Springer-Verlag, 베를린, 1987, 페이지 204-207에 기술된 것들 포함)에 공지되어 있다.
이러한 화합물은 일반적으로 "루미놀-형 하이드라지드" 로서 공지되어 있으며 프탈 하이드라지드, 나프탈렌-1,2-디카복실산 하이드라지드, 안트라센-2,3-디카복실산 하이드라지드, 페난트렌-1,2-디카복실산 하이드라지드, 플루오렌-1,2-디카복실산 하이드라지드, 벤조[g,h,i]-페릴렌-1,2-디카복실산 하이드라지드, 코로넨-1,2-디카복실산 하이드라지드 및 당업자가 용이하게 알 수 있는 기타의 것들을 포함한다.
특히, 본 발명에서 사용할 수 있는 DPD 는 에 다음 구조식으로 정의된다.
[식중, Z1, Z2, Z3및 Z4는 독립적으로 수소 ; 메틸, 에틸, 이소프로필,t-부틸,sec-펜틸 및 헥실과 같이 약 1 - 6 의 탄소원자를 함유하는 알킬 ; 에테닐, 1-프로페닐, 이소부테닐, 2-(N,N-디이소프로필아미노)비닐, 2-(N,N-디이소부틸아미노)비닐, 2-(N,N-디이소펜틸아미노)비닐 및 2-헥세닐과 같이 약 2 - 6 의 탄소원자를 함유하는 알케닐 ; 하이드록시 ; 메톡시, 에톡시, 이소프로폭시,t-부톡시 및 헥속시와 같이 약 1 - 6 의 탄소원자를 함유하는 알콕시 ; 카복시, 메틸아미노, 에틸아미노, 아미도(예를들어, 아세트아미도 및 헥산아미도), 디메틸아미노, 디에틸아미노 및 디이소부틸아미노와 같이 알킬 또는 알카노일로 치환된 아미노를 포함하는 아미노 ; 컨주게이팅된 아미노알케닐(예를들어, 하기 기술한 바와 같음) ; 또는 p-(N,N-디메틸아미노)페닐, p-(N,N-디에틸아미노)페닐 및 5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온-8-일(또한 루미닐로서 공지됨)과 같은 치환된 아미노아릴을 포함하는 아미노아릴임.
Z1및 Z2중 하나 이상은 아미노(상기 정의한 바와 같이 치환된 아미노 포함), 컨주게이팅된 아미노알케닐(상기 기술한 바와 같이 치환된 아미노알케닐 포함) 또는 p-(N,N-디메틸아미노)페닐, p-(N,N-디에틸아미노)페닐 및 5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온-8-일과 같은 아미노아릴이다. 본원에서 사용될 때, "컨주게이팅된 아미노알케닐" 이란 아미노 그룹으로부터 알케닐 그룹을 통하여 치환된 프탈아진디온의 방향족 고리에 이르는 전자 공명을 할 수 있는 1 가의 그룹을 말하며 예를들어, 2-(N,N-디이소프로필아미노)비닐, 2-(N,N-디이소부틸아미노)비닐 및 2-(N,N-디이소펜틸아미노)비닐과 같은 디알킬아미노비닐 그룹 ; 및 4-(N,N-디에틸아미노)-1,3-부타디엔-1-일과 같은 디알킬아미노부타디엔 그룹을 포함한다.
이와는 다르게, Z1, Z2, Z3및 Z4중 혹종의 인접한 2개, 3 개 또는 모두가 함께 하나 이상의 방향족 그룹을 함유하는 융합된 고리 시스템을 형성할 수 있다(즉, 2 또는 3 의 인접한 그룹들의 조합 또는 4 그룹 모두의 조합). 이러한 융합된 고리는 하나 이상의 하이드록시, 아미노(상기 기술한 바와 같이 치환되거나 치환되지 않음) 또는 메톡시, 에톡시 및 이소프로폭시와 같이 약 C1-4를 함유하는 알콕시로 치환될 수 있다. 이러한 융합된 고리는 바람직하게는 상기 기술한 바와 같이 하나 이상의 1 차, 2 차 또는 3 차 아민, 하이드록시 또는 알콕시로 치환된다.
대표적인 유용한 DPD 화합물은 루미놀, 이소루미놀, N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀 헤미숙신이미드, N-(6-아미노헥실)-N-에틸이소루미놀. N-에틸이소루미놀 및 7-디메틸아미노나프탈렌-1,2-디카복실산 하이드라지드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 루미놀 (5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온) 및 이소루미놀 (6-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온)이 바람직하고 루미놀이 가장 바람직하다.
다른 유용한 부류의 DPD 화합물은 Gundermann 등의 상기 인용된 공개에 기술되어 있으며 하기 구조에 의하여 예시되는 것들과 같은 치환되거나 치환되지 않은 프탈산 하이드라지드, 안트라센-2,3-디카복실산 하이드라지드, 페난트렌 디카복실산 하이드라지드, 플루오렌-1,2-디카복실산 하이드라지드, 벤조[g,h,i]페릴렌-1,2-디카복실산 하이드라지드 및 코로넨-1,2-디카복실산 하이드라지드를 포함한다 :
본 발명에 유용한 것으로 당업자가 인정하는 기타의 프탈아진디온 유사체는 Masuya 등의 유럽 특허 출원 제 91310875.9 호 및 Yamaguchi 등의 미국 특허 제 5,324,835 호(이 내용은 본원에 참고문헌으로 포함되어 있음)에 기술된 것들이다.
상기 밝힌 화합물들은 구입하거나 당업자에 널리 공지된 종래의 출발물질 및 전구체를 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명 신호-제공 조성물의 제 2 의 성분은 할로겐, 슈도 할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원이다. 본원에서 사용될 때, "할로겐 또는 할로겐-제공 공급원"이란 본 발명 조성물에 가할 경우 할로겐 음이온, 즉 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오도 음이온을 제공하는 혹종의 물질을 나타낸다. 이것은 염소, 브롬 및 요오드와 같은 할로겐을 포함한다. 할로겐-제공 공급원은 암모늄, 알킬 암모늄, 치환된 알킬 암모늄, 아릴 암모늄, 치환된 아릴 암모늄, 하이드라지늄, 옥소늄, 트로필륨, 설포늄 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 금속 또는 비금속 염을 포함할 수 있을 것이다. 일반적으로, 할로겐-제공 공급원은 IA 족 금속염으로서 조성물에 가해지나 IA 족 금속염에 한정되지 않는다. 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서, 할로겐-제공 공급원은 NaBr 또는 암모늄 브로마이드이다.
"유사할로겐 또는 유사할로겐-제공 공급원" 은 본 발명 조성물에 가해질 경우 할로겐에 필적할만한 높은 전자 친화도를 갖는 음이온을 제공하는 혹종의 물질을 나타낸다. 유사할로겐-제공 공급원은 일반적으로 IA 족 금속 화합물이나 이에 한정되지 않음을 이해하여야 한다. 본 분석용 신호-제공 조성물내에 존재할 수 있는 적당한 유사할로겐은 CN-, SCN-, OCN-, 아지드, 이소니트릴 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 유사할로겐 중에서 SCN-이 특히 바람직하다.
본 발명 분석 조성물의 제 3 의 성분은 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드-제공 시약 조성물이다. '퍼옥사이드' 란 선행 기술에서 일반적으로 사용되는 무기 또는 유기 퍼옥사이드 화합물을 포함한다. 퍼옥사이드 - 제공 시약 조성물은 본 발명 조성물에 가해질 경우 퍼옥사이드를 생성시킬 수 있는 혹종의 시약 조성물을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 퍼옥사이드 - 제공 시약 조성물은 당업자에 널리 공지되어 있으며 퍼보레이트, 퍼아세테이트, 우레아 퍼옥사이드 및 하이드록시퍼옥사이드 뿐만 아니라 과산, 퍼옥시벤조산 및 옥손과 같은 유기 퍼옥사이드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 분석 조성물은 일반적으로 pKa 가 약 6.0 - 8.0 인 하나 이상의 적당한 생물학적 완충액을 사용하여 pH 약 6.5 - 10, 더 바람직하게는 약 6.8 - 8.0 으로 완충된다. 이들 완충액은 업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 완충액의 예시적인 예에는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-HCl(트리스-HCl) ; 2-[N-모폴리노]에탄설폰산(MES) ; 피페라진-N,N′-비스[2-에탄설폰산](PIPES) ; 3-[N-모폴리노]-2-하이드록시프로판설폰산(MOPSO), 포스페이트 완충액 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 언급된 생물학적 완충액 중에서 트리스-HCl 이 특히 바람직하다.
분석 조성물은 또한 테트라하이드로퓨란, 아세토니트릴, 헥산, 헥산 이성질체, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 부탄올등과 같은 유기 용매를 포함할 수 있을 것이나 이에 한정되지 않는다. 본 발명 분석 조성물은 수-유기 용매 혼합물 또는 유기 용매 혼합물을 포함할 수 있을 것이다.
본 발명 신호-제공 조성물에서, 각 성분의 양은 의도하는 용도, 시약의 특정한 민감성 및 당업자가 잘 이해하고 있는 기타의 요소에 따라 변할 수 있을 것이다. 따라서, 다음의 범위는 당업자를 위하여 가이드를 제공하고자 하는 의도이며 본 발명의 실시를 한정하려는 뜻은 아니다.
구체적으로, 본 발명에 사용되는 완충액의 양은 의도하는 pH 를 유지하기 위하여 필요한 혹종의 완충액의 양을 측정하는 방법이 널리 공지되어 있으므로 당업자가 용이하게 알 수 있다. 신호-발생 화합물(DPD)의 양은 일반적으로 약 0.01 mMolar 이상이며 약 0.1 - 10 mMolar 범위의 양이 바람직하다.
제 2 성분, 즉 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원에 대하여, 이것은 통상적으로 약 0.1 mMolar 이상의 양으로 존재한다. 더 바람직하게, 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원은 본 발명의 신호-제공 조성물내에 약 50 - 100 mMolar 의 양으로 존재한다,
제 3 성분, 즉 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드-발생 시약 조성물에 대하여, 이것은 신호-제공 조성물내에 약 0.02 mMolar 이상의 양으로 존재한다. 더 바람직하게, 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드-발생 시약 조성물은 약 0.5 - 1.0 mMolar 의 양으로 존재한다.
본 발명은 또한 바나듐 브로모퍼옥시다제(VBrPO)를 유리 형태로 또는 특정한 결합 분자(예를들어, 항체, 아비딘 또는 비오틴)로 표지된 컨주게이트로서 함유하는 바나듐 브로모퍼옥시다제-함유 수성 조성물 및 상기 기술한 신호-제공 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 또한 본 발명 신호-제공 조성물에 대하여 상기 기술한 바와 같이 완충될 수 있다. 바나듐 브로모퍼옥시다제 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 특정 결합 분자 및 신호-제공 조성물의 양은 당업자가 용이하게 알 수 있다.
상기 기술한 조성물 외에, 본 발명은 또한 여러 가지 분석 방법(아래 기술함)을 수행하는데 유용한 키트, 장치 및 지시사항을 제공한다. 키트 성분들을 개별적으로 또는 미리 함께 혼합시켜 포장하는 것은 업계에 널리 공지되어 있다.
한 구체예에서, 키트는 상기 기술한 신호-제공 조성물 및 바나듐 브로모퍼옥시다제 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제-라벨된 특정 결합 분자를 포함한다. "특정 결합 분자"란 수용체와 특이결합하게 될 혹종의 생물학적 또는 화학적 화합물을 의미한다. 특히 유용한 표지된 특이 결합 종은 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 단백질 또는 올리고누클레오티드이다. 이러한 단백질은 항체 및 아비딘을 포함한다. 주어진 특이 결합 종에 대한 적당한 수용체는 당업계에 널리 공지되어 있으므로 여기서는 기술하지 않는다. 분석에 유용한 기타의 성분들(예를들어, 계면활성제)은 본 발명의 테스트 키트에 포함될 수 있다.
본 발명의 또다른 키트는 본 발명의 신호-제공 조성물만을 포함한다.
본원에서 사용될 때, "바나듐 브로모퍼옥시다제" 란 루미놀과 같은 물질의 산화를 촉매하여 적절한 신호를 생성시키는 혹종의 바나듐 할로과산화제 물질(효소 또는 다른 것)을 의미한다. 본 발명에 사용할 수 있는 단백질을 함유하는 바나듐 브로모퍼옥시다제 화합물의 구체적인 예는 Butler 의 Chem. Revs.,93, pp. 1937-1944(1993) 에서 찾을 수 있으며 아스코필룸 노도숨, 세라미룸 루브룸, 라미나리아 사카리나, 푸쿠스 디스티쿠스, 코랄리나 필루리페라, 코랄리나 오피시날리스, 마크로시스티스 피리페라등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 바나듐 브로모퍼옥시다제 화합물 중에서, 상기 Butler 등의 상기 문헌, de Boer, FEBS, 235 pp.93-97(1988) 및 Rehder 등의 Inorganica Chom. Acta, 136, L7-L10, 1987(모두 본원에 참고문헌으로 포함되어 있음)에 기술된 것들을 본 발명에 사용할 수 있을 것이다. 이것은 VO(Salen)[Salen = 옥소-N,N′-비스(살리실리덴)에틸렌디아민] 및 VO(MeOX)2[MeOX = 옥소비스(2-메틸퀴놀린-8-올라토], VO(HSP)(OEt)(HOEt)[hsp=n-(2-하이드록시페닐 살리실리덴디엔아민)]을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들중에서, 단백질을 함유하지 않는 바나듐 브로모퍼옥시다제 화합물, VO(HSP)(OEt)(HOEt)가 바람직하다.
본 발명에 사용되는 바나듐 브로모퍼옥시다제의 양은 반응에 사용되는 다른 성분들의 양에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 융용한 양은 당업자가 용이하게 알 수 있을 것이나 최소량은 일반적으로 펨토분자 범위가 될 것이다.
테스트 키트의 또다른 구체예는 신호-제공 조성물의 개별적인 성분들 및 당업자가 용이하게 이해할 혹종의 추가적인 임의 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 몇가지 방법에서, 바나듐 브로모퍼옥시다제는 임상적인 분석을 위하여 "유리 형태"(컨주게이팅되지 않음)로 사용된다. 그러나, 특이 결합 방법에서 바나듐 브로모퍼옥시다제는 특이 결합 리간드 또는 이의 수용체와의 컨주게이트로서 또는 상기 리간드 또는 수용체와 반응하는 특이 결합 분자와의 컨주게이트로서 사용된다. 리간드 및 수용체는 이러한 분석에서 착물화되므로 착물 또는 착물화되지 않는 물질의 실제적인 검출을 위하여 바나듐 브로모퍼옥시다제로 표지된다. 이러한 컨주게이트는 여러 가지 공지된 기법(예를들어, Yoshitake 등의 Eur. J. Biochem.,101, 395, 1979 및 Kondo 등의 미국 특허 제 5,106,732 호를 참조하시오)을 사용하여 제조할 수 있다.
여러 가지 특이 결합 분석 체제는 본 발명의 실시에 유용하며 핵산 잡종형성 분석, 면역화학적인 분석(예를들어, 효소 면역분석 및 샌드위치 분석) 및 당업계에 널리 공지된 다른 분석들을 포함한다. 이러한 분석은 일반적으로 예를들어 미국 특허 제 4,598,044 호, Holian 등의 미국 특허 제 4,745,077 호, Shih 등의 미국 특허 제 5,077,198 호, Mauck 등의 미국 특허 제 5,085,986 호, Matthews 등의 Anal. Biochem.,169, 페이지 1-25(1988), 제 WO 88/01302 호(1988 년 2 월 25 일 공개됨), Warren 등의 미국 특허 제 5,082,780 호 및 Wu 의 미국 특허 제 5,387,510 호에 기술되어 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한 (i) (a)2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체를 포함하는 화학발광 신호-발생 시약 ; (b)할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 (c)퍼옥시다제 또는 퍼옥시다제-생성 시약의 존재하에 바나듐 브로모퍼옥시다제를 반응시켜 검출가능한 화학발광 신호를 생성시키는 단계 ; 및 (ii) 이렇게 얻어진 화학발광 신호를 바나듐 브로모퍼옥시다제를 측정하여 측정하는 단계를 포함하는, 바나듐 브로모퍼옥시다제에 대한 응답으로 검출가능한 신호를 생성시키는 방법을 제공한다.
본 발명 방법은 이후 본 발명의 신호-제공 조성물을 사용하여 검출될 수 있는 표적 핵산의 양을 증가시키기 위하여 예를들어 Mullis 등의 미국 특허 제 4,965,188 호에 기술된 바와 같은 중합화제 사슬 반응(통상적으로 PCR 로서 공지됨) 및 일반적으로 Weiss, Science, 251, 페이지 1292-3, 1991 에 의하여 기술된 리가제 사슬 반응과 같은 증폭 방법에 의하여 진행시킬 수 있다.
따라서, 본 발명 방법은 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질(효소, 아비딘, 항체 및 항원 단백질 포함), 카보하이드레이트(모노사카라이드, 폴리사카라이드 및 리포폴리사카라이드 포함), 호르몬(예를들어, 인간 융모막성 생식선 자극 호르몬, 티로이드 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 티록신, 난포 자극 호르몬, 파라티로이드 호르몬 및 성장 호르몬), 대사물(예를들어, 글루코스, 락테이트 및 피루베이트), 올리고누클레오티드, 핵산, 비타민(예를들어, B12및 비오틴), 여러 가지 유기물(미생물 포함)로부터 얻어지는 본래의 세포 및 약물(마취제, 치료제 및 남용되는 것들)과 같은 혹종의 광범위한 화학적 및 생물학적 물질을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
특히 유용한 본 발명의 특이 결합 방법은 대상 리간드를 최소한 제 1 및 제 2 수용체로 동시에 또는 바람직한 순서로 착물화하는 샌드위치 분석과 같이 당업계에 공지된 것들이다. 수용체 중 하나는 흡수, 공유 또는 기타 공지된 결합 절차에 의하여 적당한 지지체 상에서 불용화되거나 추가적인 착물화 도는 반응을 통하여 불용화될 수 있다. 예를들어, 수용체는 지지체 상에서 불용화된 해당 수용체 부분(예를들어, 아비딘)과 반응하는 특이 결합 부분(예를들어, 비오틴)으로 표지될 수 있다,
샌드위치 분석에서, 해당 리간드에 대한 제 2 의 수용체는 바나듐 브로모퍼옥시다제로 표지될 수 있거나 추가의 특이 결합 반응(예를들어, 아비딘-비오틴 착물을 통한 리간드 표지)을 통하여 표지될 수 있다. 표지의 검출은 상기 기술된 신호-제공 조성물을 사용하여 검출한다. 더 바람직한 구체예에서, 해당 리간드는 항체와 반응하는 항원 물질이거나 상보적인 핵산(예를들어, 올리고누클레오티드)을 잡종형성시킬 수 있는 핵산이다.
다음 실시예는 본 발명의 영역을 예시하기 위하여 주어진 것이다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 주어진 것이므로 여기서 구체화된 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 지시가 되어 있는 경우를 제외하고는 모든 시약 및 장치는 이스트만 코닥 컴퍼니 또는 다른 상업적인 공급원의 제품이다.
실시예 1
수성 화학발광 조성물의 제조
화학발광 신호를 제공하는 수성 조성물을 다음과 같이 제조하였다 :
0.05 M 의 트리스-HCl 완충액내 0.01 M 의 NaBr 및 10μM 의 디에틸렌트리아민펜타아세트산을 함유하는 완충용액(pH 8.0)을 제조하였다.
2-부분 혼합물로부터 신호-제공 조성물을 제조하였다. 제 1 부분은 1.0 mM 의 Na 루미놀을 함유하였고 제 2 부분은 1.0 mM 의 H2O2를 함유하였다(둘다 상기 완충액내에서 제조함). 이들 두 부분을 사용 직전에 조합하였다. 이후 약 5 - 50,000 아토몰 범위의 공지된 농도의 바나듐 브로모퍼옥시다제를 가하였다.
0.05 M 의 트리스-HCl(pH 8.0), 0.01 % 의 소 혈청 알부민(BSA)내에서 바나듐 브로모퍼옥시다제(원료용액 ; 4℃ 에서 저장됨)를 연속적으로 희석하였다. 이들 효소 용액을 상기 기술한 신호-제공 조성물을 함유하는 불투명한 미소적장 플레이트내로 피펫팅하였다.
이후 37 ℃ 에서 DYNATECH [상표명] ML3000 루미노미터를 사용하여 본 조성물의 화학발광 신호를 측정하였다.
도 1 은 미국 특허 제 5,372,931 호 실시예 1 의 수성 화학발광 조성물을 사용하는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 대한 신호 결과 및 하기 조건하에서의 바나듐 브로모퍼옥시다제에 대한 화학발광 결과(t=5분에서 1.0초 인테그랄)를 보여준다. 이 도면은 본 발명 신호-제공 조성물이 '931 특허에 요구된 증대제 또는 전자 전달제를 필요로 하지 않고도 미국 특허 제 5,372,931 호에 시루된 조성물에 필적할만한 신호를 생성시킴을 보여준다.
도 2 는 '931 특허에 기술된 조성물에 필적할만한 본 발명 신호-제공 조성물을 사용하여 부가되는 훨씬 감소된 백그라운드 이점 및 신호-대-소음 응답을 보여준다. 표 1 의 테이타(pH 7.5 및 pH 8.0 에서 상기 기술한 완충액내)는 본 발명의 조성물을 사용여 생성된 상대적인 화학발광 신호 및 신호-대-소음 비의 비교를 도시한다. 4-아이오도페놀(AMERLITE(상표명) 시스템) 또는 3′클로로-4′-하이드록시아세트아닐라이드를 사용하여 바나듐 브로모퍼옥시다제를 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 증대된 시스템과 비교하였다. 표 1 에 요약된 결과는 본 발명 바나듐 브로모퍼옥시다제 시스템이 선행 기술에 기술된 HRP 증대된 시스템보다 10 배 더 낮은 농도의 효소 농도를 검출할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2
수성 화학발광 조성물의 제조
화학발광 신호를 제공하는 수성 조성물을 다음과 같이 제조하였다 :
0.05 M 의 MES 완충액내 0.05 M 의 NaBr 및 10μM 의 디에틸렌트리아민펜타아세트산을 함유하는 완충용액"(pH 7.0)을 제조하였다.
2-부분 혼합물로부터 신호-제공 조성물을 제조하였다. 제 1 부분은 1.0 mM 의 Na 루미놀 및 300 μM 의 3′Cl-4′-하이드록시아세트아닐리드 또는 4-아이오도페놀 증대제를 함유하였다. 제 2 부분은 1.0 mM 의 H2O2를 함유하였다(둘다 상기 완충액내에서 제조함). 이들 두 부분을 사용 직전에 조합하였다. 이후 약 5 - 50,000 아토몰 범위의 공지된 농도의 바나듐 브로모퍼옥시다제를 가하였다.
0.05 M 의 트리스-HCl(pH 8.0), 0.01 % 의 소 혈청 알부민(BSA)내에서 바나듐 브로모퍼옥시다제(원료용액 ; 4℃ 에서 저장됨)를 연속적으로 희석하였다. 이들 효소 용액을 상기 기술한 신호-제공 조성물을 함유하는 불투명한 미소적장 플레이트내로 피펫팅하였다. 대조구의 경우, 제 1 부분은 증대제를 함유하지 않았다.
이후 t=5분 에서 1.0초 인테그랄을 사용하여 37 ℃ 에서 DYNATECH [상표명] ML3000 루미노미터를 사용하여 본 조성물의 화학발광 신호를 측정하였다.
표 2 는 본 발명의 바나듐 브로모퍼옥시다제가 HRP 시스템에 사용된 증대제에 의하여 긍적적인 영향을 받지 못함을 보여준다.
HRP 시스템에 대한 본 발명의 또다른 이점은 도 3 및 4 에 보여지는 바와 같이 '931 특허에 기술되어 있는데 상이한 농도의 바나듐 브로모퍼옥시다제에서 시스템의 카이네틱스가 본질적으로 장기간에 걸쳐 일정하게 유지된다는 것이다. 이것은 도 4 에 명백히 예시되어 있는데 여기에는 선행 기술의 시스템을 사용하는 신호는 극적이고 즉각적으로 감소하는 반면 본 발명 조성물을 사용하여 발생된 신호는 매우 일정하게 남아있음을 보여준다.
상기 구체예 및 실시예는 본 발명의 취지 및 범위를 예시하기 위하여 주어진 것이다. 이들 구체예 및 실시예는 당업자에 명백할 것이다. 이들 다른 구체예 및 실시예는 본 발명의 의도내에 포함되므로 본 발명은 동봉된 청구의 범위에 의하여만 한정되어야 한다.

Claims (40)

  1. (a) 바나듐 브로모퍼옥시다제의 촉매 활성에 대한 응답으로 신호를 제공하며 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체를 포함하는 화학발광 신호-발생 시약 ; (b) 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 (c) 퍼옥시다제 또는 퍼옥시다제-생성 시약 조성물
    을 포함하고 pH 가 약 6.5 - 10 인 화학발광 신호를 제공하기 위한 분석 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 할로겐-제공 공급원이 금속 또는 비금속염인 분석 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 할로겐-제공 공급원이 혹종의 비금속염인 분석 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 할로겐-제공 공급원이 암모늄 브로마이드인 분석 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 할로겐-제공 공급원이 NaBr 인 분석 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 유사할로겐-제공 공급원이 리간드 중 하나로서 CN-, SCN-, OCN-, 아지드 또는 이소니트릴을 함유하는 금속 화합물인 분석 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 퍼옥사이드-발생 시약 조성물이 퍼보레이트, 퍼아세테이트, 우레아 퍼옥사이드, 과산, 옥손, 하이드로퍼옥사이드 또는 퍼옥시벤조산인 분석 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 수성 혼합물을 추가로 포함하는 분석 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 유기용매를 추가로 포함하는 분석 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 유기용매가 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 테트라하이드로퓨란, 아세토니트릴, 헥산, 헥산 이성질체 또는 이들의 혼합물인 분석 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 수성 유기용매 혼합물을 추가로 포함하는 분석 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체가 루미놀, 이소루미놀, N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀 헤미숙신이미드, N-(6-아미노-헥실)-N-에틸이소루미놀, N-에틸이소루미놀 또는 7-디메틸아미노나프탈렌-1,2-디카복실산 하이드라지드인 분석 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체가 루미놀인 분석 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 바나듐 브로모퍼옥시다제 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 특이 반응 분자를 추가로 포함하는 분석 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 바나듐 브로모퍼옥시다제가 단백질을 함유하거나 함유하지 않는 분석 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 아스코필룸 노도숨, 세라미룸 루브룸, 라미나리아 사카리나, 푸쿠스 디스티쿠스, 코랄리나 필루리페라, 코랄리나 오피시날리스 또는 마크로시스티스 피페라로부터 얻어지는 분석 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 아스코필룸 노도숨에서 얻어지는 분석 조성물.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하지 않는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 VO(Salen), VO(MeOX)2또는 VO(HSP)(OEt)(HOEt)인 분석 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하지 않는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 VO(HSP)(OEt)(HOEt)인 분석 조성물.
  20. (i)(a) 바나듐 브로모퍼옥시다제의 촉매 활성에 대한 응답으로 신호를 제공하며 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체를 포함하는 화학발광 신호-발생 시약 ; (b) 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 (c) 퍼옥시다제 또는 퍼옥시다제-생성 시약 조성물
    을 포함하고 pH 가 약 6.5 - 10 인 화학발광 신호를 제공하기 위한 분석 조성물을 포함하는, 바나듐 브로모퍼옥시다제의 촉매 활성 결과로서 분석물을 검출하기 위한 진단 테스트 키트.
  21. 제 20 항에 있어서, (ii) 바나듐 브로모퍼옥시다제 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 특이 반응 종을 추가로 포함하는 진단 테스트 키트.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 바나듐 브로모퍼옥시다제가 단백질을 함유하거나 함유하지 않는 진단 테스트 키트.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 아스코필룸 노도숨, 세라미룸 루브룸, 라미나리아 사카리나, 푸쿠스 디스티쿠스, 코랄리나 필루리페라, 코랄리나 오피시날리스 또는 마크로시스티스 피페라로부터 얻어지는 진단 테스트 키트.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 아스코필룸 노도숨에서 얻어지는 진단 테스트 키트.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하지 않는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 VO(Salen), VO(MeOX)2또는 VO(HSP)(OEt)(HOEt)인 진단 테스트 키트.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 단백질을 함유하지 않는 바나듐 브로모퍼옥시다제가 VO(HSP)(OEt)(HOEt)인 진단 테스트 키트.
  27. (i) (a)2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체를 포함하는 화학발광 신호-발생 시약 ; (b)할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 (c)퍼옥시다제 또는 퍼옥시다제-생성 시약의 존재하에 바나듐 브로모퍼옥시다제를 반응시켜 검출가능한 화학발광 신호를 생성시키는 단계 ; 및 (ii) 이렇게 얻어진 화학발광 신호를 바나듐 브로모퍼옥시다제를 측정하여 측정하는 단계를 포함하는, 바나듐 브로모퍼옥시다제에 대한 응답으로 검출가능한 신호를 생성시키는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 바나듐 브로모퍼옥시다제가 바나듐 브로모퍼옥시다제를 제외한 비면역학적 분석물의 검출을 위하여 유리 형태로 존재하거나 분석물로서 존재하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 바나듐 브로모퍼옥시다제가 특이 결합 종 및 바나듐 브로모퍼옥시다제의 컨주게이트의 일부로서 검출되는 방법.
  30. 특이 결합 리간드를 특이 결합 짝과 반응시켜 특이 결합 착물을 형성하고 특이 결합 착물을 검출하기 위한 표지로 퍼옥사이드를 사용하여 상기 착물을 검출하는 것을 포함하는, 특이 결합 리간드의 검출을 위한 특이 결합 분석으로서, 상기 표지로서 바나듐 브로모퍼옥시다제를 사용하고 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 특이 결합 착물을 (a)2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체를 포함하는 화학발광 신호-발생 시약 ; (b)할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 (c)퍼옥시다제 또는 퍼옥시다제-생성 시약과 접촉시켜 검출가능한 화학발광 신호를 생성시키는 것을 개선점으로 하는 분석.
  31. 상기 특이 결합 리간드 또는 상기 특이 결합 짝이 불용화되거나 불용화가능한 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 특이 결합 리간드에 대하여 특이적으로 결합하는 제 2 의 특이 결합 짝을 추가로 사용하여 특이 결합 리간드의 샌드위치를 생성시키고 상기 특이 결합 짝 또는 상기 제 2 의 특이 결합 짝이 불용화도거나 불용화될 수 있는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 특이 결합 짝 및 상기 제 2 의 특이 결합 짝이 상기 항원에 대한 특정 항체인, 상기 특이 반응 리간드로서 항체를 검출하는 방법.
  34. 제 30 항에 있어서, 상기 특이 결합 종이 상기 핵산과 반응할 수 있는, 핵산의 검출 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, 상기 특이 결합 짝 및 상기 제 2 의 특이 결합 짝이 상이한 서열의 핵산에 상보적인 올리고누클레오티드인, 핵산의 검출 방법.
  36. 제 30 항에 있어서, 반응 단계 전에 상기 핵산을 증폭시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제 32 항에 있어서, 상기 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체가 루미놀, 이소루미놀, N-(4-아미노부틸)-N-에틸이소루미놀 헤미숙신이미드, N-(6-아미노-헥실)-N-에틸이소루미놀, N-에틸이소루미놀 또는 7-디메틸아미노나프탈렌-1,2-디카복실산 하이드라지드인 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체가 루미놀인 방법.
  39. 제 30 항에 있어서, 상기 화학발광 신호-제공 화합물이 약 0.01 - 10 mM 의 양으로 존재하고, 상기 할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 또는 유사할로겐-제공 공급원이 약 0.1 - 100 mM 의 양으로 존재하며, 상기 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드-발생 시약 조성물이 약 0.5 - 10 mM 의 양으로 존재하는 방법.
  40. (a) 바나듐 브로모퍼옥시다제 또는 바나듐 브로모퍼옥시다제-표지된 특이 결합 분자 ; (b) 2,3-디하이드로-1,4-프탈아진디온 유도체를 포함하는 화학발광 신호-발생 시약 ; (c)할로겐, 유사할로겐, 할로겐-제공 공급원 또는 유사할로겐-제공 공급원 ; 및 (d)퍼옥시다제 또는 퍼옥시다제-생성 시약
    을 포함하고 약 pH 6.5 - 10 으로 완충시킨 수성 조성물.
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