JPH0767394B2 - 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット - Google Patents
化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキットInfo
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- JPH0767394B2 JPH0767394B2 JP3081922A JP8192291A JPH0767394B2 JP H0767394 B2 JPH0767394 B2 JP H0767394B2 JP 3081922 A JP3081922 A JP 3081922A JP 8192291 A JP8192291 A JP 8192291A JP H0767394 B2 JPH0767394 B2 JP H0767394B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物のペルオキシダーゼお
よび酸化剤による化学発光の増強剤、この増強された化
学発光を利用した検出または定量法ならびに測定用キッ
トに関する。
１，４−フタラジンジオン化合物のペルオキシダーゼお
よび酸化剤による化学発光の増強剤、この増強された化
学発光を利用した検出または定量法ならびに測定用キッ
トに関する。
【０００２】
【従来の技術】２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン
ジオン化合物のペルオキシダーゼおよび酸化剤による化
学発光においては、発光反応のブランク値が低く、かつ
化学発光量が多いことが要求されている。従来この化学
発光の増強剤としては、パラヨードフェノールなどのハ
ロゲン化フェノールが提案されている［ゲイリー エイ
チ ジー スオープ等、メソッズ イン エンザイモロ
ジー、第１３３巻、３３１ページ、（１９８６年）］。
ジオン化合物のペルオキシダーゼおよび酸化剤による化
学発光においては、発光反応のブランク値が低く、かつ
化学発光量が多いことが要求されている。従来この化学
発光の増強剤としては、パラヨードフェノールなどのハ
ロゲン化フェノールが提案されている［ゲイリー エイ
チ ジー スオープ等、メソッズ イン エンザイモロ
ジー、第１３３巻、３３１ページ、（１９８６年）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記化学発光において
増強剤を使用する場合は、発光反応のブランク値が低い
ことと共に、増強剤の使用量がより少ない条件で発光量
が多い程価値がある。本発明は従来よりこれらの点で更
にレベルアップしたものを得るとともに、この増強され
た化学発光を用いた、更に高感度の検出・定量法と測定
用キットを見いだすことを課題とする。
増強剤を使用する場合は、発光反応のブランク値が低い
ことと共に、増強剤の使用量がより少ない条件で発光量
が多い程価値がある。本発明は従来よりこれらの点で更
にレベルアップしたものを得るとともに、この増強され
た化学発光を用いた、更に高感度の検出・定量法と測定
用キットを見いだすことを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果本発明に到達した。すな
わち、本発明は下記一般式化２で示されるフェノール系
化合物（ａ）からなることを特徴とする２，３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）のペルオキ
シダーゼ（ｃ）および酸化剤（ｄ）による化学発光の増
強剤；２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化
合物（ｂ）の酸化剤（ｄ）存在下での酸化発光によりペ
ルオキシダーゼ（ｃ）の検出または定量を行う方法にお
いて上記増強剤を共存させることを特徴とするペルオキ
シダーゼの検出または定量法；ペルオキシダーゼ（ｃ）
と酸化剤（ｄ）の存在下での酸化反応により２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）を発光
させて検出・定量を行う方法において、上記増強剤を共
存させることを特徴とする２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラジンジオン化合物（ｂ）の検出または定量法；試
料中の測定対象物質の検出・定量を２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）のペルオキシダ
ーゼ（ｃ）および酸化剤（ｄ）による化学発光を利用し
て行う免疫測定法において、（ｂ）もしくは（ｃ）のい
ずれかが配位子と結合しており、さらに上記増強剤を共
存させて化学発光を行うことを特徴とする免疫測定法；
ならびに２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
化合物（ｂ）、ペルオキシダーゼ（ｃ）および酸化剤
（ｄ）を組合わせた化学発光を利用した免疫測定用キッ
トにおいて、（ｂ）もしくは（ｃ）のいずれかが配位子
と結合しており、さらに上記増強剤を組合わせたことを
特徴とする免疫測定用キットである。
解決するため鋭意検討した結果本発明に到達した。すな
わち、本発明は下記一般式化２で示されるフェノール系
化合物（ａ）からなることを特徴とする２，３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）のペルオキ
シダーゼ（ｃ）および酸化剤（ｄ）による化学発光の増
強剤；２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化
合物（ｂ）の酸化剤（ｄ）存在下での酸化発光によりペ
ルオキシダーゼ（ｃ）の検出または定量を行う方法にお
いて上記増強剤を共存させることを特徴とするペルオキ
シダーゼの検出または定量法；ペルオキシダーゼ（ｃ）
と酸化剤（ｄ）の存在下での酸化反応により２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）を発光
させて検出・定量を行う方法において、上記増強剤を共
存させることを特徴とする２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラジンジオン化合物（ｂ）の検出または定量法；試
料中の測定対象物質の検出・定量を２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）のペルオキシダ
ーゼ（ｃ）および酸化剤（ｄ）による化学発光を利用し
て行う免疫測定法において、（ｂ）もしくは（ｃ）のい
ずれかが配位子と結合しており、さらに上記増強剤を共
存させて化学発光を行うことを特徴とする免疫測定法；
ならびに２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
化合物（ｂ）、ペルオキシダーゼ（ｃ）および酸化剤
（ｄ）を組合わせた化学発光を利用した免疫測定用キッ
トにおいて、（ｂ）もしくは（ｃ）のいずれかが配位子
と結合しており、さらに上記増強剤を組合わせたことを
特徴とする免疫測定用キットである。
【０００５】
【化２】
【０００６】［式中ｎは１から５の整数、Ｒはハロゲン
原子で置換されていてもよいフェニル基、水素原子、シ
アノ基、モルホリノ基、アミノ基、カルボキシル基（ア
ルカリ金属塩、Ｃ1 〜Ｃ6 のアルキルエステルあるいは
アミドとなっていてもよい）、アルデヒド基またはアリ
ル基を、Ａは水素原子またはハロゲン原子を、Ｘは水素
原子またはアルカリ金属を表す。また、−Ａおよび−Ｓ
（ＣＨ2 ）n −Ｒで表される置換基は−ＯＸ基に対して
置換基−Ａがパラ位に置換されている場合、置換基−Ｓ
（ＣＨ2 ）n −Ｒはオルト位に、また置換基−Ａがオル
ト位に置換されている場合、−Ｓ（ＣＨ2 ）n −Ｒはパ
ラ位に置換される。］
原子で置換されていてもよいフェニル基、水素原子、シ
アノ基、モルホリノ基、アミノ基、カルボキシル基（ア
ルカリ金属塩、Ｃ1 〜Ｃ6 のアルキルエステルあるいは
アミドとなっていてもよい）、アルデヒド基またはアリ
ル基を、Ａは水素原子またはハロゲン原子を、Ｘは水素
原子またはアルカリ金属を表す。また、−Ａおよび−Ｓ
（ＣＨ2 ）n −Ｒで表される置換基は−ＯＸ基に対して
置換基−Ａがパラ位に置換されている場合、置換基−Ｓ
（ＣＨ2 ）n −Ｒはオルト位に、また置換基−Ａがオル
ト位に置換されている場合、−Ｓ（ＣＨ2 ）n −Ｒはパ
ラ位に置換される。］
【０００７】一般式（１）で示されるフェノール系化合
物（ａ）の具体例としては、４−（ベンジルチオ）フェ
ノール、４−（フルオロベンジルチオ）フェノール、４
−（ブロモベンジルチオ）フェノール、４−（クロロベ
ンジルチオ）フェノール、４−（ヨードベンジルチオ）
フェノール、４−（メチルチオ）フェノール、４−（シ
アノメチルチオ）フェノール、４−（シアノエチルチ
オ）フェノール、４−（シアノプロピルチオ）フェノー
ル、４−（シアノブチルチオ）フェノール、４−（シア
ノペンチルチオ）フェノール、４−（モルホリノメチル
チオ）フェノール、４−（アミノメチルチオ）フェノー
ル、４−（ニトロメチルチオ）フェノール、４−（ヒド
ロキシフェニルチオ）酢酸、４−（ヒドロキシフェニル
チオ）アセトアルデヒド、４−（ヒドロキシフェニルチ
オ）アセトアミド、４−（アリルチオ）フェノール、４
−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シ
アノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメ
チルチオ−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチ
オ−２−ヨードフェノールおよびこれらのナトリウムあ
るいはカリウム塩が挙げられる。これらのうち好ましい
ものは、４−（ベンジルチオ）フェノール、４−（メチ
ルチオ）フェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノ
ール、４−（モルホリノメチルチオ）フェノール、４−
シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ
−２−ヨードフェノールであり、特に好ましいものは４
−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチル
チオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチルチオ
−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ−２−
ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ−２−ヨード
フェノールおよびこれらのナトリウムあるいはカリウム
塩である。
物（ａ）の具体例としては、４−（ベンジルチオ）フェ
ノール、４−（フルオロベンジルチオ）フェノール、４
−（ブロモベンジルチオ）フェノール、４−（クロロベ
ンジルチオ）フェノール、４−（ヨードベンジルチオ）
フェノール、４−（メチルチオ）フェノール、４−（シ
アノメチルチオ）フェノール、４−（シアノエチルチ
オ）フェノール、４−（シアノプロピルチオ）フェノー
ル、４−（シアノブチルチオ）フェノール、４−（シア
ノペンチルチオ）フェノール、４−（モルホリノメチル
チオ）フェノール、４−（アミノメチルチオ）フェノー
ル、４−（ニトロメチルチオ）フェノール、４−（ヒド
ロキシフェニルチオ）酢酸、４−（ヒドロキシフェニル
チオ）アセトアルデヒド、４−（ヒドロキシフェニルチ
オ）アセトアミド、４−（アリルチオ）フェノール、４
−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シ
アノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメ
チルチオ−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチ
オ−２−ヨードフェノールおよびこれらのナトリウムあ
るいはカリウム塩が挙げられる。これらのうち好ましい
ものは、４−（ベンジルチオ）フェノール、４−（メチ
ルチオ）フェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノ
ール、４−（モルホリノメチルチオ）フェノール、４−
シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ
−２−ヨードフェノールであり、特に好ましいものは４
−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチル
チオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチルチオ
−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ−２−
ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ−２−ヨード
フェノールおよびこれらのナトリウムあるいはカリウム
塩である。
【０００８】本発明において、２，３−ジヒドロ−１，
４−フタラジンジオン化合物（ｂ）としては、ルミノー
ル、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチル
イソルミノール（ＡＨＥＩ）およびＮ−アミノブチル−
Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）が挙げられる。
これらのうち好ましいものはルミノールである。
４−フタラジンジオン化合物（ｂ）としては、ルミノー
ル、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチル
イソルミノール（ＡＨＥＩ）およびＮ−アミノブチル−
Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）が挙げられる。
これらのうち好ましいものはルミノールである。
【０００９】本発明において、ペルオキシダーゼ（ｃ）
としては、西洋ワサビ、牛乳、白血球等から抽出したペ
ルオキシダーゼが挙げられる。これらのうち好ましいも
のは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。酸化剤
（ｄ）としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過
ホウ酸カリウム等が挙げられる。これらのうち好ましい
ものは過酸化水素である。
としては、西洋ワサビ、牛乳、白血球等から抽出したペ
ルオキシダーゼが挙げられる。これらのうち好ましいも
のは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。酸化剤
（ｄ）としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過
ホウ酸カリウム等が挙げられる。これらのうち好ましい
ものは過酸化水素である。
【００１０】本発明のペルオキシダーゼ（ｃ）の検出ま
たは定量方法において、（ｃ）は遊離の状態であって
も、また免疫測定において用いられるような免疫活性物
質（例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビ
ジン、ビオチンなど）である配位子と結合した複合体の
状態であってもよい。
たは定量方法において、（ｃ）は遊離の状態であって
も、また免疫測定において用いられるような免疫活性物
質（例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビ
ジン、ビオチンなど）である配位子と結合した複合体の
状態であってもよい。
【００１１】酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により試料中の
測定対象物質の検出・定量を行う場合に、この方法が利
用できる。すなわちペルオキシダーゼ（ｃ）が遊離の状
態の場合、検体中の測定対象物質の量は一定量の
（ｃ）、（ｄ）と反応する、配位子と結合した（ｂ）の
発光量と対照することによって求めることができるし、
複合体の状態の場合は、一定量の（ｂ）、（ｄ）と反応
する（ｃ）の量に対応して発生する発光量と対照させる
ことによって求めることができる。
測定対象物質の検出・定量を行う場合に、この方法が利
用できる。すなわちペルオキシダーゼ（ｃ）が遊離の状
態の場合、検体中の測定対象物質の量は一定量の
（ｃ）、（ｄ）と反応する、配位子と結合した（ｂ）の
発光量と対照することによって求めることができるし、
複合体の状態の場合は、一定量の（ｂ）、（ｄ）と反応
する（ｃ）の量に対応して発生する発光量と対照させる
ことによって求めることができる。
【００１２】一方、本発明の２，３−ジヒドロ−１，４
−フタラジンジオン化合物（ｂ）の検出または定量方法
において、（ｂ）は遊離の状態であっても上記に例示し
たような免疫活性物質などの配位子と結合した複合体の
状態であってもよい。
−フタラジンジオン化合物（ｂ）の検出または定量方法
において、（ｂ）は遊離の状態であっても上記に例示し
たような免疫活性物質などの配位子と結合した複合体の
状態であってもよい。
【００１３】この方法も、ＥＩＡによる試料中の測定対
象物質の検出・定量に利用できる。すなわち２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）が遊離
の状態の場合、試料中の測定対象物質の量は一定量の
（ｂ）、（ｄ）と反応する、配位子と結合した（ｃ）の
量に対応して発生する発光量と対照させることによって
求めることができるし、複合体の状態の場合は測定対象
物質の量を一定量の（ｃ）、（ｄ）と反応する（ｂ）の
量に対応して発生する発光量と対照させることによって
求めることができる。
象物質の検出・定量に利用できる。すなわち２，３−ジ
ヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）が遊離
の状態の場合、試料中の測定対象物質の量は一定量の
（ｂ）、（ｄ）と反応する、配位子と結合した（ｃ）の
量に対応して発生する発光量と対照させることによって
求めることができるし、複合体の状態の場合は測定対象
物質の量を一定量の（ｃ）、（ｄ）と反応する（ｂ）の
量に対応して発生する発光量と対照させることによって
求めることができる。
【００１４】しかしながら、（ｂ）がルミノールやイソ
ルミノールの場合、免疫活性物質と結合させるとその発
光量子収率が大幅に低下するため、複合体とする場合は
（ｂ）としてＡＨＥＩ、ＡＢＥＩを用いた複合体とする
必要がある。
ルミノールの場合、免疫活性物質と結合させるとその発
光量子収率が大幅に低下するため、複合体とする場合は
（ｂ）としてＡＨＥＩ、ＡＢＥＩを用いた複合体とする
必要がある。
【００１５】本発明のペルオキシダーゼ、２，３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジンジオン化合物の各検出または
定量方法は、アルカリ性サイドで行われることが好まし
いのは勿論であるが、特に好ましくは7.0 〜11.0のpHで
ある。発光反応の場として用いられる緩衝液は前記のpH
を満足させるものであればどのような種類の緩衝液を用
いることも可能であるが、リン酸緩衝液、グリシン／Na
OH緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、
炭酸緩衝液、バルビタール緩衝液、ホウ酸緩衝液などが
好ましいものとして挙げられる。
ドロ−１，４−フタラジンジオン化合物の各検出または
定量方法は、アルカリ性サイドで行われることが好まし
いのは勿論であるが、特に好ましくは7.0 〜11.0のpHで
ある。発光反応の場として用いられる緩衝液は前記のpH
を満足させるものであればどのような種類の緩衝液を用
いることも可能であるが、リン酸緩衝液、グリシン／Na
OH緩衝液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、
炭酸緩衝液、バルビタール緩衝液、ホウ酸緩衝液などが
好ましいものとして挙げられる。
【００１６】この際、好ましい緩衝液濃度は１〜１００
０（ミリモル／リットル）である。また、増強剤の濃度
としては用いる増強剤により、各々最適な濃度を設定す
ることが必要であるが、本発明において特に好ましい増
強剤である４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−
シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−ブロモフェノールおよび４−シアノメチル
チオ−２−ヨードフェノールについては10-4〜1.0(w/v
%) の範囲で使用することが好ましい。
０（ミリモル／リットル）である。また、増強剤の濃度
としては用いる増強剤により、各々最適な濃度を設定す
ることが必要であるが、本発明において特に好ましい増
強剤である４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−
シアノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−ブロモフェノールおよび４−シアノメチル
チオ−２−ヨードフェノールについては10-4〜1.0(w/v
%) の範囲で使用することが好ましい。
【００１７】本発明の増強剤（ａ）は、（ｂ）、
（ｃ）、（ｄ）とは別な溶液として発光反応系に添加す
ることも、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれかと予め混
和した状態で発光反応系に添加することも可能である。
（ｃ）、（ｄ）とは別な溶液として発光反応系に添加す
ることも、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）のいずれかと予め混
和した状態で発光反応系に添加することも可能である。
【００１８】また、必要に応じて適当な界面活性剤ある
いは牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白
成分を発光反応系に添加することも可能である。
いは牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白
成分を発光反応系に添加することも可能である。
【００１９】発光反応を進めるための（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）の各濃度は測定方法、条件によって最適濃度が設
定されなくてはならないが、本発明の（ｂ）、（ｃ）の
各検出または定量方法においては、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）（100nmol 〜1m
ol／リットル）、ペルオキシダーゼ（ｃ）（1ng 〜5000
mg／リットル）、酸化剤（ｄ）（100nmol 〜1mol／リッ
トル）の範囲とし、各物質を適当な濃度で組合わせて使
用するのが好ましい。
（ｄ）の各濃度は測定方法、条件によって最適濃度が設
定されなくてはならないが、本発明の（ｂ）、（ｃ）の
各検出または定量方法においては、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）（100nmol 〜1m
ol／リットル）、ペルオキシダーゼ（ｃ）（1ng 〜5000
mg／リットル）、酸化剤（ｄ）（100nmol 〜1mol／リッ
トル）の範囲とし、各物質を適当な濃度で組合わせて使
用するのが好ましい。
【００２０】本発明の各方法において、発光反応を行う
際の温度はペルオキシダーゼ（ｃ）の酵素反応に最も適
した温度（５〜５０℃）で実施することが好ましい。
際の温度はペルオキシダーゼ（ｃ）の酵素反応に最も適
した温度（５〜５０℃）で実施することが好ましい。
【００２１】本発明のもう１つの目的は、増強された化
学発光を利用した測定用キット、特に増強された化学発
光を利用した免疫測定（イムノアッセイ）法に用いる免
疫測定用キットに関するものである。
学発光を利用した測定用キット、特に増強された化学発
光を利用した免疫測定（イムノアッセイ）法に用いる免
疫測定用キットに関するものである。
【００２２】ペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）については広く知られている。この場合、試
料中の測定対象物質の量はペルオキシダーゼ標識された
免疫活性物質（例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチンなど）の量に対応させてその
ペルオキシダーゼ活性を酸化剤とオルトフェニレンジア
ミンのような発色基質を用いて比色法で測定するもので
ある。
（ＥＩＡ）については広く知られている。この場合、試
料中の測定対象物質の量はペルオキシダーゼ標識された
免疫活性物質（例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチンなど）の量に対応させてその
ペルオキシダーゼ活性を酸化剤とオルトフェニレンジア
ミンのような発色基質を用いて比色法で測定するもので
ある。
【００２３】本発明の増強された化学発光を利用した測
定用キットにおいては、（ｃ）としてペルオキシダーゼ
標識された免疫活性物質を用いた場合、試料中の測定対
象物質の量をペルオキシダーゼ標識された免疫活性物質
の量に対応させ、そのペルオキシダーゼ活性を２，３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）と酸
化剤（ｄ）および４−（シアノメチルチオ）フェノール
に代表される本発明における増強剤から成る試薬を用い
て発光強度として測定することができる。
定用キットにおいては、（ｃ）としてペルオキシダーゼ
標識された免疫活性物質を用いた場合、試料中の測定対
象物質の量をペルオキシダーゼ標識された免疫活性物質
の量に対応させ、そのペルオキシダーゼ活性を２，３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物（ｂ）と酸
化剤（ｄ）および４−（シアノメチルチオ）フェノール
に代表される本発明における増強剤から成る試薬を用い
て発光強度として測定することができる。
【００２４】ペルオキシダーゼに代表される酵素を用い
る免疫測定法は均一（ホモジニアス）系と不均一（ヘテ
ロジニアス）系に大別されるが、そのいずれにも本発明
の測定用キットを用いることができる。
る免疫測定法は均一（ホモジニアス）系と不均一（ヘテ
ロジニアス）系に大別されるが、そのいずれにも本発明
の測定用キットを用いることができる。
【００２５】均一系においては、例えば本発明の測定用
キットを構成する（ｂ）または（ｃ）としてリポソーム
中にルミノールあるいはペルオキシダーゼを封入し、且
つこのリポソーム表面に免疫活性物質を固定化したもの
を用いるとよい。試料中の免疫活性物質とリポソーム表
面に固定化された免疫活性物質との間で行われた抗原抗
体反応の量に応じてリポソーム外に出たルミノールある
いはペルオキシダーゼの量を増強剤及び過酸化水素など
の酸化剤（ｄ）を用いて増強されたルミノールの化学発
光量を測定することにより、試料中の免疫活性物質の検
出または定量をすることができる。
キットを構成する（ｂ）または（ｃ）としてリポソーム
中にルミノールあるいはペルオキシダーゼを封入し、且
つこのリポソーム表面に免疫活性物質を固定化したもの
を用いるとよい。試料中の免疫活性物質とリポソーム表
面に固定化された免疫活性物質との間で行われた抗原抗
体反応の量に応じてリポソーム外に出たルミノールある
いはペルオキシダーゼの量を増強剤及び過酸化水素など
の酸化剤（ｄ）を用いて増強されたルミノールの化学発
光量を測定することにより、試料中の免疫活性物質の検
出または定量をすることができる。
【００２６】一方、不均一系のイムノアッセイは現在ほ
とんどの検査室でルーチン分析に用いられている方法で
あるが、この測定法はさらに(1) サンドイッチ法、(2)
競合法に大別することができる。そして、本発明法はこ
れら両方の測定法に応用することができる。
とんどの検査室でルーチン分析に用いられている方法で
あるが、この測定法はさらに(1) サンドイッチ法、(2)
競合法に大別することができる。そして、本発明法はこ
れら両方の測定法に応用することができる。
【００２７】サンドイッチ法は、試験管、ガラスビー
ズ、プラスティックビーズ、マイクロパーティクルなど
の固相担体に免疫活性物質を結合させ、これに試料を加
え抗原抗体反応を行う。未反応物を除去し、次に酵素標
識された免疫活性物質を加え、最初の反応で固定化され
た免疫活性物質と反応、結合した試料中の測定対象物質
と抗原抗体反応を行う。抗原抗体反応をして固相に結合
した酵素の量は試料中の測定対象物質の量に比例するの
で、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料中の
測定対象物質量を求めることを原理とする方法である。
ズ、プラスティックビーズ、マイクロパーティクルなど
の固相担体に免疫活性物質を結合させ、これに試料を加
え抗原抗体反応を行う。未反応物を除去し、次に酵素標
識された免疫活性物質を加え、最初の反応で固定化され
た免疫活性物質と反応、結合した試料中の測定対象物質
と抗原抗体反応を行う。抗原抗体反応をして固相に結合
した酵素の量は試料中の測定対象物質の量に比例するの
で、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料中の
測定対象物質量を求めることを原理とする方法である。
【００２８】このサンドイッチ法を利用したイムノアッ
セイに関して［エム シー リベナント、クリニカル
ケミストリー、第２９巻、６８１ページ、（１９８３
年）］にポリプロピレン製試験管に抗フェリチン抗体を
結合させた固相担体とペルオキシダーゼ標識抗フェリチ
ン抗体を用いたＥＩＡに関する記載がある。これによる
と酵素活性は発色基質である２、２’−アジノ−ジ（３
−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルフォネイト）
（ＡＢＴＳ）を用いて比色法により測定され、この発色
度から試料中のフェリチン濃度を求めている。
セイに関して［エム シー リベナント、クリニカル
ケミストリー、第２９巻、６８１ページ、（１９８３
年）］にポリプロピレン製試験管に抗フェリチン抗体を
結合させた固相担体とペルオキシダーゼ標識抗フェリチ
ン抗体を用いたＥＩＡに関する記載がある。これによる
と酵素活性は発色基質である２、２’−アジノ−ジ（３
−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルフォネイト）
（ＡＢＴＳ）を用いて比色法により測定され、この発色
度から試料中のフェリチン濃度を求めている。
【００２９】本発明は上記方法において、酵素（ペルオ
キシダーゼ）活性を求める段階で発色基質の代わりに発
光物質（ｂ）、酸化剤（ｄ）および増強剤（ａ）を用い
ることにより酵素活性を増強された化学発光量として測
定し、その発光量から試料中のフェリチン濃度を求める
ことを可能にさせるものである。
キシダーゼ）活性を求める段階で発色基質の代わりに発
光物質（ｂ）、酸化剤（ｄ）および増強剤（ａ）を用い
ることにより酵素活性を増強された化学発光量として測
定し、その発光量から試料中のフェリチン濃度を求める
ことを可能にさせるものである。
【００３０】一方、競合法はサンドイッチ法と同様に試
験管、ガラスビーズ、プラスティックビーズ、マイクロ
パーティクルなどの固相担体に抗体を結合させ、これに
試料中の測定対象物質と酵素標識された測定対象物質抗
原を固相化抗体に対し競合反応させる。固相化抗体と結
合した酵素の量は試料中の測定対象物質の量に逆比例す
るので、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料
中の物質量を求めることを原理とする方法である。
験管、ガラスビーズ、プラスティックビーズ、マイクロ
パーティクルなどの固相担体に抗体を結合させ、これに
試料中の測定対象物質と酵素標識された測定対象物質抗
原を固相化抗体に対し競合反応させる。固相化抗体と結
合した酵素の量は試料中の測定対象物質の量に逆比例す
るので、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料
中の物質量を求めることを原理とする方法である。
【００３１】競合法を利用したイムノアッセイについて
は［荒川等、アナリティカル バイオケミストリー、第
９７巻、２４８ページ、（１９７９年）］にペルオキシ
ダーゼ標識コーチゾールとセファロース４Ｂに抗コーチ
ゾール抗体を固定化した固相担体を用い、固相に結合し
たペルオキシダーゼの量をルミノールと過酸化水素を用
いた化学発光により測定し、試料中のコーチゾールの量
を求める方法に関する記載がある。
は［荒川等、アナリティカル バイオケミストリー、第
９７巻、２４８ページ、（１９７９年）］にペルオキシ
ダーゼ標識コーチゾールとセファロース４Ｂに抗コーチ
ゾール抗体を固定化した固相担体を用い、固相に結合し
たペルオキシダーゼの量をルミノールと過酸化水素を用
いた化学発光により測定し、試料中のコーチゾールの量
を求める方法に関する記載がある。
【００３２】本発明は上記方法における、発光反応系に
さらに増強剤（ａ）を加えることにより発光量を増や
し、感度よく測定することを可能にさせるものである。
さらに増強剤（ａ）を加えることにより発光量を増や
し、感度よく測定することを可能にさせるものである。
【００３３】本発明の化学発光反応を利用する測定用キ
ットは、ＡＦＰ、ＣＥＡ、フェリチンなどの腫瘍マーカ
ー、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、インスリンなどのホルモ
ン、コーチゾール、Ｔ３、Ｔ４などのハプテンホルモ
ン、ジゴキシン、テオフィリンなどの薬物、肝炎抗原な
どの感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥなどの抗体の測定に
利用することができるが、必ずしもこれらの項目に限定
されるものではない。
ットは、ＡＦＰ、ＣＥＡ、フェリチンなどの腫瘍マーカ
ー、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、インスリンなどのホルモ
ン、コーチゾール、Ｔ３、Ｔ４などのハプテンホルモ
ン、ジゴキシン、テオフィリンなどの薬物、肝炎抗原な
どの感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥなどの抗体の測定に
利用することができるが、必ずしもこれらの項目に限定
されるものではない。
【００３４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。
が本発明はこれに限定されるものではない。
【００３５】実施例１ この実施例は、本発明における化学発光増強剤が、ルミ
ノールと西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と過酸化水
素との化学発光反応を促進させ、増強剤が存在しない発
光反応に比べて大きく発光量を増大させることが可能と
なったことを例示するものである。
ノールと西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と過酸化水
素との化学発光反応を促進させ、増強剤が存在しない発
光反応に比べて大きく発光量を増大させることが可能と
なったことを例示するものである。
【００３６】西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社
製、グレードＩ−Ｃ）を０．０２モル／リットル（以下
Ｍと略す）、pH 7.2のリン酸緩衝液に溶解し、溶液中の
ペルオキシダーゼ濃度を４０３ｎｍの吸光度より求めた
ところ０．１２ｍｇ／ｍｌであった。これをさらに前記
リン酸緩衝液を用いて1/10000 に希釈した。
製、グレードＩ−Ｃ）を０．０２モル／リットル（以下
Ｍと略す）、pH 7.2のリン酸緩衝液に溶解し、溶液中の
ペルオキシダーゼ濃度を４０３ｎｍの吸光度より求めた
ところ０．１２ｍｇ／ｍｌであった。これをさらに前記
リン酸緩衝液を用いて1/10000 に希釈した。
【００３７】ルミノール（東京化成製）０．１８ｇおよ
び４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（ベンジ
ルチオ）フェノール、４−（メチルチオ）フェノール、
４−（モルホリノメチルチオ）フェノール、４−シアノ
メチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ
−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ−２−
ヨードフェノールおよび対照としてパラヨードフェノー
ルそれぞれ０．１ｇを０．１Ｍ（モル／ｌ）、ｐＨ８．
５のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解し、ストック
溶液とした。
び４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（ベンジ
ルチオ）フェノール、４−（メチルチオ）フェノール、
４−（モルホリノメチルチオ）フェノール、４−シアノ
メチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ
−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ−２−
ヨードフェノールおよび対照としてパラヨードフェノー
ルそれぞれ０．１ｇを０．１Ｍ（モル／ｌ）、ｐＨ８．
５のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解し、ストック
溶液とした。
【００３８】酸化剤としては過酸化水素を用いた。これ
についても２００μｌの３５％過酸化水素水を０．１
Ｍ、ｐＨ８．５のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解
し、ストック溶液とした。
についても２００μｌの３５％過酸化水素水を０．１
Ｍ、ｐＨ８．５のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解
し、ストック溶液とした。
【００３９】発光強度の測定には、アロカ社製ルミネッ
センスリーダーＢＬＲ−２０１型を使用した。先に希釈
調製したペルオキシダーゼ溶液１００μｌ（ペルオキシ
ダーゼ量として１．２ｎｇ）を１２×７５mmのガラス製
試験管に分注し、ルミネッセンスリーダーのサンプルホ
ルダーにセットした。次に増強剤を含むルミノール溶液
２５０μｌを分注し、最後に過酸化水素溶液２５０μｌ
を分注して反応を開始させた。（反応温度３０℃）
センスリーダーＢＬＲ−２０１型を使用した。先に希釈
調製したペルオキシダーゼ溶液１００μｌ（ペルオキシ
ダーゼ量として１．２ｎｇ）を１２×７５mmのガラス製
試験管に分注し、ルミネッセンスリーダーのサンプルホ
ルダーにセットした。次に増強剤を含むルミノール溶液
２５０μｌを分注し、最後に過酸化水素溶液２５０μｌ
を分注して反応を開始させた。（反応温度３０℃）
【００４０】同様にブランク試験、増強剤を添加しない
場合の試験および比較対照としてパラヨードフェノール
を増強剤とした場合の試験も行った。結果は表１に示し
た。ここで記載されている数値は過酸化水素分注時点か
ら１分間積分した値（キロカウント）である。また、増
強剤として４−（シアノメチルチオ）フェノールを添加
した場合の３秒毎に測定した発光パターンは図１に示し
た通りで、過酸化水素投入後約１５秒で一定となった。
場合の試験および比較対照としてパラヨードフェノール
を増強剤とした場合の試験も行った。結果は表１に示し
た。ここで記載されている数値は過酸化水素分注時点か
ら１分間積分した値（キロカウント）である。また、増
強剤として４−（シアノメチルチオ）フェノールを添加
した場合の３秒毎に測定した発光パターンは図１に示し
た通りで、過酸化水素投入後約１５秒で一定となった。
【００４１】
【表１】
【００４２】実施例２ この実施例は、本発明において見いだされた増強剤であ
る４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメ
チルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチル
チオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ−
２−ブロモフェノールおよび４−シアノメチルチオ−２
−ヨードフェノールと既知の増強剤であるパラヨードフ
ェノールの化学発光を増強させるうえでの最適濃度につ
いて比較検討したものである。
る４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメ
チルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノメチル
チオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチルチオ−
２−ブロモフェノールおよび４−シアノメチルチオ−２
−ヨードフェノールと既知の増強剤であるパラヨードフ
ェノールの化学発光を増強させるうえでの最適濃度につ
いて比較検討したものである。
【００４３】ルミノール（東京化成製）０．１８ｇを
０．１Ｍ、ｐＨ８．５のトリス／塩酸緩衝液１リットル
に溶解し、さらにこれに４−（シアノメチルチオ）フェ
ノール、４−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノー
ル、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４
−シアノメチルチオ−２−ブロモフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−ヨードフェノールおよびパラヨード
フェノールをそれぞれ０．１、０．０５、０．０１、
０．００５、０．００１％となるよう溶解してこれらを
ストック溶液とした。
０．１Ｍ、ｐＨ８．５のトリス／塩酸緩衝液１リットル
に溶解し、さらにこれに４−（シアノメチルチオ）フェ
ノール、４−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノー
ル、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４
−シアノメチルチオ−２−ブロモフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−ヨードフェノールおよびパラヨード
フェノールをそれぞれ０．１、０．０５、０．０１、
０．００５、０．００１％となるよう溶解してこれらを
ストック溶液とした。
【００４４】発光強度の測定には、実施例１と同様アロ
カ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型を使用
した。先に調製したペルオキシダーゼ溶液１００μｌ
（ペルオキシダーゼ量として１．２ｎｇ）を１２×７５
mmのガラス製試験管に分注し、ルミネッセンスリーダー
のサンプルホルダーにセットした。次に各濃度の増強剤
を含むルミノール溶液２５０μｌを分注し、最後に過酸
化水素溶液２５０μｌを分注して反応を開始させた。
（反応温度３０℃）
カ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型を使用
した。先に調製したペルオキシダーゼ溶液１００μｌ
（ペルオキシダーゼ量として１．２ｎｇ）を１２×７５
mmのガラス製試験管に分注し、ルミネッセンスリーダー
のサンプルホルダーにセットした。次に各濃度の増強剤
を含むルミノール溶液２５０μｌを分注し、最後に過酸
化水素溶液２５０μｌを分注して反応を開始させた。
（反応温度３０℃）
【００４５】結果を表２に示した。ここで記載されてい
る数値も実施例１同様過酸化水素分注時点から１分間積
分した値（キロカウント）である。また、各増強剤濃度
における発光強度のブランク値との比を図２に示した。
本結果から、本発明において見いだされた増強剤４−
（シアノメチルチオ）フェノールは既知の増強剤である
パラヨードフェノールに比べ約１／１０の濃度において
もパラヨードフェノールを上回る性能（発光量および発
光量の対ブランク値比）を発揮することが確認された。
また、４−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノー
ル、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４
−シアノメチルチオ−２−ブロモフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−ヨードフェノールについてもパラヨ
ードフェノールと同じ濃度でパラヨードフェノールを上
回る性能を示した。
る数値も実施例１同様過酸化水素分注時点から１分間積
分した値（キロカウント）である。また、各増強剤濃度
における発光強度のブランク値との比を図２に示した。
本結果から、本発明において見いだされた増強剤４−
（シアノメチルチオ）フェノールは既知の増強剤である
パラヨードフェノールに比べ約１／１０の濃度において
もパラヨードフェノールを上回る性能（発光量および発
光量の対ブランク値比）を発揮することが確認された。
また、４−シアノメチルチオ−２−フルオロフェノー
ル、４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４
−シアノメチルチオ−２−ブロモフェノール、４−シア
ノメチルチオ−２−ヨードフェノールについてもパラヨ
ードフェノールと同じ濃度でパラヨードフェノールを上
回る性能を示した。
【００４６】
【表２】
【００４７】実施例３ この実施例は、４−（シアノメチルチオ）フェノールを
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗体、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
たサンドイッチ法化学発光免疫測定法によるα−フェト
プロテイン（以下ＡＦＰと略す）の測定に関する。
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗体、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
たサンドイッチ法化学発光免疫測定法によるα−フェト
プロテイン（以下ＡＦＰと略す）の測定に関する。
【００４８】(1) 試験管への抗ＡＦＰ抗体の固定化 炭酸緩衝液（０．０２Ｍ）ｐＨ９．５に抗ＡＦＰ抗体
（ウサギ由来、ダコ社製）を１００μｇ／ｍｌになるよ
う溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験管（１２×７
５mm）にこのＡＦＰ抗体含有炭酸緩衝液を各５００μｌ
ずつ分注し、４℃で４８時間反応させ抗体を試験管内壁
に固定化した。反応終了後、アスピレーターを用いて試
験管内の液を除去した。生理食塩水１ｍｌで試験管内を
３回洗浄し、さらに１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ
と略す）を含むリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．
２）１ｍｌを加え、使用時まで４℃で保存した。
（ウサギ由来、ダコ社製）を１００μｇ／ｍｌになるよ
う溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験管（１２×７
５mm）にこのＡＦＰ抗体含有炭酸緩衝液を各５００μｌ
ずつ分注し、４℃で４８時間反応させ抗体を試験管内壁
に固定化した。反応終了後、アスピレーターを用いて試
験管内の液を除去した。生理食塩水１ｍｌで試験管内を
３回洗浄し、さらに１％牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ
と略す）を含むリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．
２）１ｍｌを加え、使用時まで４℃で保存した。
【００４９】(2) 酵素標識抗ＡＦＰ抗体の調製 ペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体の調製は、東洋紡社
製西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｉ−Ｃ）およびダコ社
製抗ＡＦＰ抗体（ウサギ）を過ヨウ素酸酸化法［ナカネ
等、ジェー ヒストケム サイトケム、第２２巻、１０
８４ページ、（１９７４年）］により実施した。
製西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｉ−Ｃ）およびダコ社
製抗ＡＦＰ抗体（ウサギ）を過ヨウ素酸酸化法［ナカネ
等、ジェー ヒストケム サイトケム、第２２巻、１０
８４ページ、（１９７４年）］により実施した。
【００５０】(3) 血中ＡＦＰの測定 酵素標識抗体液 (2) で得たペルオキシダーゼ標識抗ＡＦＰ抗体を１％Ｂ
ＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）で希
釈し、測定に必要な濃度に希釈した。
ＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）で希
釈し、測定に必要な濃度に希釈した。
【００５１】標準液 精製ヒトＡＦＰを１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０
２Ｍ、ｐＨ７．２）で２０、８０、３２０、６４０ｎｇ
／ｍｌとなるよう希釈調製した。
２Ｍ、ｐＨ７．２）で２０、８０、３２０、６４０ｎｇ
／ｍｌとなるよう希釈調製した。
【００５２】測定操作法 (1) で調製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピレー
ターを用いて除去する。生理食塩水１ｍｌを用いて試験
管内を１回洗浄する。洗浄した試験管に標準液または試
料（血清または血漿）３０μｌをサンプリングし、１％
ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）５
００μｌを加え、よく撹拌し、３７℃で３０分間インキ
ュベートした。反応終了後、反応液をアスピレーターを
用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操
作した。この操作を３回繰り返し試料中の様々な血清成
分を除去した。
ターを用いて除去する。生理食塩水１ｍｌを用いて試験
管内を１回洗浄する。洗浄した試験管に標準液または試
料（血清または血漿）３０μｌをサンプリングし、１％
ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）５
００μｌを加え、よく撹拌し、３７℃で３０分間インキ
ュベートした。反応終了後、反応液をアスピレーターを
用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再び同様に操
作した。この操作を３回繰り返し試料中の様々な血清成
分を除去した。
【００５３】先の試験管にで調製した酵素標識抗ＡＦ
Ｐ抗体液５００μｌを加え、よく撹拌し、３７℃で３０
分間インキュベートした。反応終了後、反応液をアスピ
レーターを用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再
び同様に除去した。この操作を３回繰り返し未反応の酵
素標識抗ＡＦＰ抗体を除去した。
Ｐ抗体液５００μｌを加え、よく撹拌し、３７℃で３０
分間インキュベートした。反応終了後、反応液をアスピ
レーターを用いて除去し、生理食塩水１ｍｌを加えて再
び同様に除去した。この操作を３回繰り返し未反応の酵
素標識抗ＡＦＰ抗体を除去した。
【００５４】洗浄の終了した先の試験管をルミネッセン
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例１で
調製した４−（シアノメチルチオ）フェノール含有のル
ミノール溶液２５０μｌ及び過酸化水素液２５０μｌを
加え、化学発光反応を行った。測定値は１分間の積分値
として得た。
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例１で
調製した４−（シアノメチルチオ）フェノール含有のル
ミノール溶液２５０μｌ及び過酸化水素液２５０μｌを
加え、化学発光反応を行った。測定値は１分間の積分値
として得た。
【００５５】標準液を検体として用いた場合の各標準液
濃度における発光量を表３に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線（図３参照）から試料中のＡＦＰ濃度を読み取っ
た。
濃度における発光量を表３に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線（図３参照）から試料中のＡＦＰ濃度を読み取っ
た。
【００５６】
【表３】
【００５７】本実験に用いた試料をペルオキシダーゼ標
識抗ＡＦＰ抗体を用いた比色法ＥＩＡで測定した結果と
の相関を図４に示した。
識抗ＡＦＰ抗体を用いた比色法ＥＩＡで測定した結果と
の相関を図４に示した。
【００５８】実施例４ この実施例は、４−（シアノメチルチオ）フェノールを
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗原、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
た化学発光免疫測定法によるサイロキシン（Ｔ４）の定
量に関する。
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗原、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
た化学発光免疫測定法によるサイロキシン（Ｔ４）の定
量に関する。
【００５９】(1) 試験管への抗Ｔ４抗体の固定化 実施例３で記載したのと同様な方法で試験管内壁にカル
スタッド社製抗Ｔ４抗体（ウサギ）を結合させた。
スタッド社製抗Ｔ４抗体（ウサギ）を結合させた。
【００６０】(2) 酵素標識抗原（Ｔ４）の調製 ペルオキシダーゼ標識Ｔ４の調製は、東洋紡社製西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（Ｉ−Ｃ）およびカルバイオケミ
ストリー社製Ｔ４をグルタルアルデヒド法［アブラメス
等、イムノケミストリー、第６巻、４３ページ、（１９
６９年）］により実施した。
サビペルオキシダーゼ（Ｉ−Ｃ）およびカルバイオケミ
ストリー社製Ｔ４をグルタルアルデヒド法［アブラメス
等、イムノケミストリー、第６巻、４３ページ、（１９
６９年）］により実施した。
【００６１】酵素標識抗原液 (2) で得たペルオキシダーゼ標識抗原（Ｔ４）を、０．
１％ＢＳＡ、０．０４％８−アニリノ−１−ナフタレン
スルホン酸アンモニウム含有バルビタール緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ８．６）で希釈し、測定に必要な濃度に希釈
した。
１％ＢＳＡ、０．０４％８−アニリノ−１−ナフタレン
スルホン酸アンモニウム含有バルビタール緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ８．６）で希釈し、測定に必要な濃度に希釈
した。
【００６２】標準液 標準液は宮井等の方法に従い［宮井等、エンドクリノー
ル ジャパン、第２７巻、３７５ページ、（１９８０
年）］ヒト血清を活性炭処理することにより得られたＴ
３、Ｔ４フリー血清にカルバイオケミストリー社製Ｔ４
を添加し、２．０、６．０、１２．０、２４．０μｇ／
ｄｌとなるよう調製した。
ル ジャパン、第２７巻、３７５ページ、（１９８０
年）］ヒト血清を活性炭処理することにより得られたＴ
３、Ｔ４フリー血清にカルバイオケミストリー社製Ｔ４
を添加し、２．０、６．０、１２．０、２４．０μｇ／
ｄｌとなるよう調製した。
【００６３】測定操作法 実施例３と同様に試験管内を洗浄する。その試験管に標
準液または試料（血清または血漿）２０μｌをサンプリ
ングし、さらに酵素標識抗原液５００μｌを加え、よく
撹拌し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応終
了後、反応液をアスピレーターを用いて除去し、生理食
塩水１ｍｌを加えて再び同様に除去した。この操作を３
回繰り返し試料中の様々な血清成分および未反応の酵素
標識抗原（Ｔ４）を除去した。
準液または試料（血清または血漿）２０μｌをサンプリ
ングし、さらに酵素標識抗原液５００μｌを加え、よく
撹拌し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応終
了後、反応液をアスピレーターを用いて除去し、生理食
塩水１ｍｌを加えて再び同様に除去した。この操作を３
回繰り返し試料中の様々な血清成分および未反応の酵素
標識抗原（Ｔ４）を除去した。
【００６４】洗浄の終了した先の試験管をルミネッセン
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例３と
同様な方法で化学発光反応を行った。測定値は１分間の
積分値として得た。
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例３と
同様な方法で化学発光反応を行った。測定値は１分間の
積分値として得た。
【００６５】標準液を検体として用いた場合の各標準液
濃度における発光量を表４に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線（図５参照）から試料（血清または血漿）中のＴ４
濃度を読み取った。
濃度における発光量を表４に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線（図５参照）から試料（血清または血漿）中のＴ４
濃度を読み取った。
【００６６】
【表４】
【００６７】本実験に用いた試料をペルオキシダーゼ標
識抗原（Ｔ４）を用いた比色法によるＥＩＡで測定した
結果との相関を図６に示した。
識抗原（Ｔ４）を用いた比色法によるＥＩＡで測定した
結果との相関を図６に示した。
【００６８】
【発明の効果】本発明の増強剤を用いることにより化学
発光量が増強剤を使用しない場合と比較して10000 倍以
上に増強され、かつ安定な発光が得られる。また従来の
増強剤と比べ1/10の使用量でも従来より化学発光量およ
び化学発光量の対ブランク値比が高い点で大幅にレベル
アップしたものである。本発明の増強剤、この増強剤を
用いた従来より高感度な本発明の各検出・定量方法およ
び従来より高感度な測定ができる本発明の測定用キット
を用いることにより、例えば、化学発光を利用した免疫
測定法の感度を著しく上昇させることができる。
発光量が増強剤を使用しない場合と比較して10000 倍以
上に増強され、かつ安定な発光が得られる。また従来の
増強剤と比べ1/10の使用量でも従来より化学発光量およ
び化学発光量の対ブランク値比が高い点で大幅にレベル
アップしたものである。本発明の増強剤、この増強剤を
用いた従来より高感度な本発明の各検出・定量方法およ
び従来より高感度な測定ができる本発明の測定用キット
を用いることにより、例えば、化学発光を利用した免疫
測定法の感度を著しく上昇させることができる。
【図１】発光増強剤を使用した場合のルミノールの発光
パターンである。
パターンである。
【図２】４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シ
アノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノ
メチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチル
チオ−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ−
２−ヨードフェノールおよびパラヨードフェノールの最
適使用濃度を示したグラフである。
アノメチルチオ−２−フルオロフェノール、４−シアノ
メチルチオ−２−クロロフェノール、４−シアノメチル
チオ−２−ブロモフェノール、４−シアノメチルチオ−
２−ヨードフェノールおよびパラヨードフェノールの最
適使用濃度を示したグラフである。
【図３】ＡＦＰの化学発光免疫測定法による検量線であ
る。
る。
【図４】化学発光免疫測定法と比色法免疫測定法による
ＡＦＰ測定結果の相関図である。
ＡＦＰ測定結果の相関図である。
【図５】Ｔ４の化学発光免疫測定法による検量線であ
る。
る。
【図６】化学発光免疫測定法と比色法免疫測定法による
Ｔ４測定結果の相関図である。
Ｔ４測定結果の相関図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高下 勝滋 山口県熊毛郡平生町大字平生村777番地の ３ (72)発明者 小泉 達也 山口県熊毛郡平生町大字平生村742番地− １
Claims (8)
- 【請求項１】 下記一般式化１ 【化１】 ［この式を一般式（１）と略称する。式中ｎは１から５
の整数、Ｒはハロゲン原子で置換されていてもよいフェ
ニル基、水素原子、シアノ基、モルホリノ基、アミノ
基、カルボキシル基（アルカリ金属塩、Ｃ1 〜Ｃ6 のア
ルキルエステルあるいはアミドとなっていてもよい）、
アルデヒド基またはアリル基を、Ａは水素原子またはハ
ロゲン原子を、Ｘは水素原子またはアルカリ金属を表
す。また、−Ａおよび−Ｓ（ＣＨ2 ）n −Ｒで表される
置換基は−ＯＸ基に対して置換基−Ａがパラ位に置換さ
れている場合、置換基−Ｓ（ＣＨ2 ）n −Ｒはオルト位
に、また置換基−Ａがオルト位に置換されている場合、
置換基−Ｓ（ＣＨ2 ）n −Ｒはパラ位に置換される。］
で示されるフェノール系化合物（ａ）からなることを特
徴とする２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン
化合物（ｂ）のペルオキシダーゼ（ｃ）および酸化剤
（ｄ）による化学発光の増強剤。 - 【請求項２】 ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン
ジオン化合物（ｂ）の酸化剤（ｄ）存在下での酸化発光
によりペルオキシダーゼ（ｃ）の検出または定量を行う
方法において、請求項１記載の増強剤を共存させること
を特徴とするペルオキシダーゼの検出または定量法。 - 【請求項３】 ペルオキシダーゼ（ｃ）が配位子と結合
している請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ペルオキシダーゼ（ｃ）と酸化剤（ｄ）
の存在下での酸化反応により２，３−ジヒドロ−１，４
−フタラジンジオン化合物（ｂ）を化学発光させ、この
化合物の検出、定量を行う方法において、請求項１記載
の増強剤を共存させることを特徴とする２，３−ジヒド
ロ−１，４−フタラジンジオン化合物の検出または定量
法。 - 【請求項５】 ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン
ジオン化合物（ｂ）が配位子と結合している請求項４記
載の方法。 - 【請求項６】 試料中の測定対象物質の検出・定量を
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物
（ｂ）のペルオキシダーゼ（ｃ）および酸化剤（ｄ）に
よる化学発光を利用して行う免疫測定法において、
（ｂ）もしくは（ｃ）のいずれかが配位子と結合してお
り、さらに請求項１記載の増強剤を共存させて化学発光
を行うことを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項７】 ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン
ジオン化合物（ｂ）、ペルオキシダーゼ（ｃ）および酸
化剤（ｄ）を組合わせた化学発光を利用した測定用キッ
トにおいて、さらに請求項１記載の増強剤を組合わせる
ことを特徴とする測定用キット。 - 【請求項８】 ２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジン
ジオン化合物（ｂ）またはペルオキシダーゼ（ｃ）が配
位子と結合している請求項７記載の免疫測定用キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3081922A JPH0767394B2 (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット |
| EP92302414A EP0505198B1 (en) | 1991-03-20 | 1992-03-20 | A method of enhancing a luminescent reaction, luminometric assay and kits for use in the same |
| DE69216265T DE69216265T2 (de) | 1991-03-20 | 1992-03-20 | Verfahren zum Steigern einer Lumineszenzreaktion, Luminometrischer Test und Testsätze zur Verwendung in demselben |
| US08/102,542 US5424194A (en) | 1991-03-20 | 1993-08-05 | 4-(cyanomethylthio)phenol enhanced peroxidase assays |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3081922A JPH0767394B2 (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04293498A JPH04293498A (ja) | 1992-10-19 |
| JPH0767394B2 true JPH0767394B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=13759953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3081922A Expired - Fee Related JPH0767394B2 (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0505198B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0767394B2 (ja) |
| DE (1) | DE69216265T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5372931A (en) * | 1992-12-22 | 1994-12-13 | Eastman Kodak Company | Use of 4'-hydroxy- and 4'-alkoxy-substituted electron transfer agents in compositions, elements, test kits and analytical methods |
| GB9306888D0 (en) * | 1993-04-01 | 1993-05-26 | Kricka Larry J | Chemiluminescent enhancers |
| US5491072A (en) * | 1993-05-17 | 1996-02-13 | Lumigen, Inc. | N-alkylacridan carboxyl derivatives useful for chemiluminescent detection |
| US5811253A (en) * | 1995-09-01 | 1998-09-22 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Use of vanadium bromoperoxidase as a signal-generating enzyme for chemiluminescent systems: test kits and analytical methods |
| US5679803A (en) * | 1995-10-25 | 1997-10-21 | Tropix, Inc. | 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance |
| FR2740219B1 (fr) * | 1995-10-20 | 1998-01-16 | Covalab | Systeme d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de preference biologiques, par chimiluminescence, amplifiee, procede et necessaire d'analyse en faisant application |
| US6121050A (en) * | 1997-08-29 | 2000-09-19 | Han; Chi-Neng Arthur | Analyte detection systems |
| US6902918B1 (en) * | 1998-05-21 | 2005-06-07 | California Institute Of Technology | Oxygenase enzymes and screening method |
| AU2002307340A1 (en) | 2001-04-16 | 2002-10-28 | California Institute Of Technology | Peroxide-driven cytochrome p450 oxygenase variants |
| US7226768B2 (en) | 2001-07-20 | 2007-06-05 | The California Institute Of Technology | Cytochrome P450 oxygenases |
| WO2005017105A2 (en) | 2003-06-17 | 2005-02-24 | California University Of Technology | Regio- and enantioselective alkane hydroxylation with modified cytochrome p450 |
| WO2005017116A2 (en) | 2003-08-11 | 2005-02-24 | California Institute Of Technology | Thermostable peroxide-driven cytochrome p450 oxygenase variants and methods of use |
| WO2006076034A2 (en) * | 2004-05-21 | 2006-07-20 | Bhanu, Kalra | Stabilized two component system for chemilumiescent assay in immunodiagnostics |
| CN1318538C (zh) * | 2004-08-30 | 2007-05-30 | 北京源德生物医学工程有限公司 | 含辅助增强剂和增强剂的增敏化学发光液 |
| US11214817B2 (en) | 2005-03-28 | 2022-01-04 | California Institute Of Technology | Alkane oxidation by modified hydroxylases |
| US8715988B2 (en) | 2005-03-28 | 2014-05-06 | California Institute Of Technology | Alkane oxidation by modified hydroxylases |
| US8252559B2 (en) | 2006-08-04 | 2012-08-28 | The California Institute Of Technology | Methods and systems for selective fluorination of organic molecules |
| US8026085B2 (en) | 2006-08-04 | 2011-09-27 | California Institute Of Technology | Methods and systems for selective fluorination of organic molecules |
| ES2324509B1 (es) * | 2008-02-06 | 2010-06-17 | Matilde Esther Lleonart Pajarin | Composicion de revelado en ensayos de inmunodeteccion. |
| CN106501535B (zh) * | 2016-11-30 | 2018-11-09 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种ans盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒 |
| CN110041913B (zh) * | 2019-04-10 | 2022-01-11 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种增强型化学发光底物及其应用 |
| CN112255406B (zh) * | 2020-09-29 | 2023-04-14 | 北京利德曼生化股份有限公司 | 测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒 |
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| US4804682A (en) * | 1986-11-14 | 1989-02-14 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | 2-chloro-4-((cyanomethyl)thio)phenyl N-methyl carbamate for treating carcinomas |
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- 1991-03-20 JP JP3081922A patent/JPH0767394B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-03-20 DE DE69216265T patent/DE69216265T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-20 EP EP92302414A patent/EP0505198B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-08-05 US US08/102,542 patent/US5424194A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
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| US5424194A (en) | 1995-06-13 |
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