JPH04293498A - 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット - Google Patents
化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキットInfo
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、2,3−ジヒドロ−1
,4−フタラジンジオン化合物のペルオキシダーゼおよ
び酸化剤による化学発光の増強剤、この増強された化学
発光を利用した検出または定量法ならびに測定用キット
に関する。
,4−フタラジンジオン化合物のペルオキシダーゼおよ
び酸化剤による化学発光の増強剤、この増強された化学
発光を利用した検出または定量法ならびに測定用キット
に関する。
【0002】
【従来の技術】2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジン
ジオン化合物のペルオキシダーゼおよび酸化剤による化
学発光においては、発光反応のブランク値が低く、かつ
化学発光量が多いことが要求されている。従来この化学
発光の増強剤としては、パラヨードフェノールなどのハ
ロゲン化フェノールが提案されている[ゲイリー エ
イチ ジー スオープ等、メソッズ イン エ
ンザイモロジー、第133巻、331ページ、(198
6年)]。
ジオン化合物のペルオキシダーゼおよび酸化剤による化
学発光においては、発光反応のブランク値が低く、かつ
化学発光量が多いことが要求されている。従来この化学
発光の増強剤としては、パラヨードフェノールなどのハ
ロゲン化フェノールが提案されている[ゲイリー エ
イチ ジー スオープ等、メソッズ イン エ
ンザイモロジー、第133巻、331ページ、(198
6年)]。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】上記化学発光において
増強剤を使用する場合は、発光反応のブランク値が低い
ことと共に、増強剤の使用量がより少ない条件で発光量
が多い程価値がある。本発明は従来よりこれらの点で更
にレベルアップしたものを得るとともに、この増強され
た化学発光を用いた、更に高感度の検出・定量法と測定
用キットを見いだすことを課題とする。
増強剤を使用する場合は、発光反応のブランク値が低い
ことと共に、増強剤の使用量がより少ない条件で発光量
が多い程価値がある。本発明は従来よりこれらの点で更
にレベルアップしたものを得るとともに、この増強され
た化学発光を用いた、更に高感度の検出・定量法と測定
用キットを見いだすことを課題とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果本発明に到達した。すな
わち、本発明は下記一般式化2で示されるフェノール系
化合物(a)からなることを特徴とする2,3−ジヒド
ロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)のペルオキ
シダーゼ(c)および酸化剤(d)による化学発光の増
強剤;2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン化
合物(b)の酸化剤(d)存在下での酸化発光によりペ
ルオキシダーゼ(c)の検出または定量を行う方法にお
いて上記増強剤を共存させることを特徴とするペルオキ
シダーゼの検出または定量法;ペルオキシダーゼ(c)
と酸化剤(d)の存在下での酸化反応により2,3−ジ
ヒドロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)を発光
させて検出・定量を行う方法において、上記増強剤を共
存させることを特徴とする2,3−ジヒドロ−1,4−
フタラジンジオン化合物(b)の検出または定量法;試
料中の測定対象物質の検出・定量を2,3−ジヒドロ−
1,4−フタラジンジオン化合物(b)のペルオキシダ
ーゼ(c)および酸化剤(d)による化学発光を利用し
て行う免疫測定法において、(b)もしくは(c)のい
ずれかが配位子と結合しており、さらに上記増強剤を共
存させて化学発光を行うことを特徴とする免疫測定法;
ならびに2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン
化合物(b)、ペルオキシダーゼ(c)および酸化剤(
d)を組合わせた化学発光を利用した免疫測定用キット
において、(b)もしくは(c)のいずれかが配位子と
結合しており、さらに上記増強剤を組合わせたことを特
徴とする免疫測定用キットである。
解決するため鋭意検討した結果本発明に到達した。すな
わち、本発明は下記一般式化2で示されるフェノール系
化合物(a)からなることを特徴とする2,3−ジヒド
ロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)のペルオキ
シダーゼ(c)および酸化剤(d)による化学発光の増
強剤;2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン化
合物(b)の酸化剤(d)存在下での酸化発光によりペ
ルオキシダーゼ(c)の検出または定量を行う方法にお
いて上記増強剤を共存させることを特徴とするペルオキ
シダーゼの検出または定量法;ペルオキシダーゼ(c)
と酸化剤(d)の存在下での酸化反応により2,3−ジ
ヒドロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)を発光
させて検出・定量を行う方法において、上記増強剤を共
存させることを特徴とする2,3−ジヒドロ−1,4−
フタラジンジオン化合物(b)の検出または定量法;試
料中の測定対象物質の検出・定量を2,3−ジヒドロ−
1,4−フタラジンジオン化合物(b)のペルオキシダ
ーゼ(c)および酸化剤(d)による化学発光を利用し
て行う免疫測定法において、(b)もしくは(c)のい
ずれかが配位子と結合しており、さらに上記増強剤を共
存させて化学発光を行うことを特徴とする免疫測定法;
ならびに2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン
化合物(b)、ペルオキシダーゼ(c)および酸化剤(
d)を組合わせた化学発光を利用した免疫測定用キット
において、(b)もしくは(c)のいずれかが配位子と
結合しており、さらに上記増強剤を組合わせたことを特
徴とする免疫測定用キットである。
【0005】
【化2】
【0006】[式中nは1から5の整数、Rはハロゲン
原子で置換されていてもよいフェニル基、水素原子、シ
アノ基、モルホリノ基、アミノ基、カルボキシル基(ア
ルカリ金属塩、C1 〜C6 のアルキルエステルある
いはアミドとなっていてもよい)、アルデヒド基または
アリル基を、Aは水素原子またはハロゲン原子を、Xは
水素原子またはアルカリ金属を表す。また、−Aおよび
−S(CH2 )n −Rで表される置換基は−OX基
に対して置換基−Aがパラ位に置換されている場合、置
換基−S(CH2 )n −Rはオルト位に、また置換
基−Aがオルト位に置換されている場合、−S(CH2
)n −Rはパラ位に置換される。]
原子で置換されていてもよいフェニル基、水素原子、シ
アノ基、モルホリノ基、アミノ基、カルボキシル基(ア
ルカリ金属塩、C1 〜C6 のアルキルエステルある
いはアミドとなっていてもよい)、アルデヒド基または
アリル基を、Aは水素原子またはハロゲン原子を、Xは
水素原子またはアルカリ金属を表す。また、−Aおよび
−S(CH2 )n −Rで表される置換基は−OX基
に対して置換基−Aがパラ位に置換されている場合、置
換基−S(CH2 )n −Rはオルト位に、また置換
基−Aがオルト位に置換されている場合、−S(CH2
)n −Rはパラ位に置換される。]
【0007】一般式(1)で示されるフェノール系化合
物(a)の具体例としては、4−(ベンジルチオ)フェ
ノール、4−(フルオロベンジルチオ)フェノール、4
−(ブロモベンジルチオ)フェノール、4−(クロロベ
ンジルチオ)フェノール、4−(ヨードベンジルチオ)
フェノール、4−(メチルチオ)フェノール、4−(シ
アノメチルチオ)フェノール、4−(シアノエチルチオ
)フェノール、4−(シアノプロピルチオ)フェノール
、4−(シアノブチルチオ)フェノール、4−(シアノ
ペンチルチオ)フェノール、4−(モルホリノメチルチ
オ)フェノール、4−(アミノメチルチオ)フェノール
、4−(ニトロメチルチオ)フェノール、4−(ヒドロ
キシフェニルチオ)酢酸、4−(ヒドロキシフェニルチ
オ)アセトアルデヒド、4−(ヒドロキシフェニルチオ
)アセトアミド、4−(アリルチオ)フェノール、4−
シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シア
ノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチ
ルチオ−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ
−2−ヨードフェノールおよびこれらのナトリウムある
いはカリウム塩が挙げられる。これらのうち好ましいも
のは、4−(ベンジルチオ)フェノール、4−(メチル
チオ)フェノール、4−(シアノメチルチオ)フェノー
ル、4−(モルホリノメチルチオ)フェノール、4−シ
アノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチル
チオ−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−ヨードフェノールであり、特に好ましいものは4−
(シアノメチルチオ)フェノール、4−シアノメチルチ
オ−2−フルオロフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−クロロフェノール、4−シアノメチルチオ−2−ブ
ロモフェノール、4−シアノメチルチオ−2−ヨードフ
ェノールおよびこれらのナトリウムあるいはカリウム塩
である。
物(a)の具体例としては、4−(ベンジルチオ)フェ
ノール、4−(フルオロベンジルチオ)フェノール、4
−(ブロモベンジルチオ)フェノール、4−(クロロベ
ンジルチオ)フェノール、4−(ヨードベンジルチオ)
フェノール、4−(メチルチオ)フェノール、4−(シ
アノメチルチオ)フェノール、4−(シアノエチルチオ
)フェノール、4−(シアノプロピルチオ)フェノール
、4−(シアノブチルチオ)フェノール、4−(シアノ
ペンチルチオ)フェノール、4−(モルホリノメチルチ
オ)フェノール、4−(アミノメチルチオ)フェノール
、4−(ニトロメチルチオ)フェノール、4−(ヒドロ
キシフェニルチオ)酢酸、4−(ヒドロキシフェニルチ
オ)アセトアルデヒド、4−(ヒドロキシフェニルチオ
)アセトアミド、4−(アリルチオ)フェノール、4−
シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シア
ノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチ
ルチオ−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ
−2−ヨードフェノールおよびこれらのナトリウムある
いはカリウム塩が挙げられる。これらのうち好ましいも
のは、4−(ベンジルチオ)フェノール、4−(メチル
チオ)フェノール、4−(シアノメチルチオ)フェノー
ル、4−(モルホリノメチルチオ)フェノール、4−シ
アノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチル
チオ−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−ヨードフェノールであり、特に好ましいものは4−
(シアノメチルチオ)フェノール、4−シアノメチルチ
オ−2−フルオロフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−クロロフェノール、4−シアノメチルチオ−2−ブ
ロモフェノール、4−シアノメチルチオ−2−ヨードフ
ェノールおよびこれらのナトリウムあるいはカリウム塩
である。
【0008】本発明において、2,3−ジヒドロ−1,
4−フタラジンジオン化合物(b)としては、ルミノー
ル、イソルミノール、N−アミノヘキシル−N−エチル
イソルミノール(AHEI)およびN−アミノブチル−
N−エチルイソルミノール(ABEI)が挙げられる。 これらのうち好ましいものはルミノールである。
4−フタラジンジオン化合物(b)としては、ルミノー
ル、イソルミノール、N−アミノヘキシル−N−エチル
イソルミノール(AHEI)およびN−アミノブチル−
N−エチルイソルミノール(ABEI)が挙げられる。 これらのうち好ましいものはルミノールである。
【0009】本発明において、ペルオキシダーゼ(c)
としては、西洋ワサビ、牛乳、白血球等から抽出したペ
ルオキシダーゼが挙げられる。これらのうち好ましいも
のは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。酸化剤(d
)としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ
酸カリウム等が挙げられる。これらのうち好ましいもの
は過酸化水素である。
としては、西洋ワサビ、牛乳、白血球等から抽出したペ
ルオキシダーゼが挙げられる。これらのうち好ましいも
のは西洋ワサビのペルオキシダーゼである。酸化剤(d
)としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ
酸カリウム等が挙げられる。これらのうち好ましいもの
は過酸化水素である。
【0010】本発明のペルオキシダーゼ(c)の検出ま
たは定量方法において、(c)は遊離の状態であっても
、また免疫測定において用いられるような免疫活性物質
(例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテインA、アビジ
ン、ビオチンなど)である配位子と結合した複合体の状
態であってもよい。
たは定量方法において、(c)は遊離の状態であっても
、また免疫測定において用いられるような免疫活性物質
(例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテインA、アビジ
ン、ビオチンなど)である配位子と結合した複合体の状
態であってもよい。
【0011】酵素免疫測定法(EIA)により試料中の
測定対象物質の検出・定量を行う場合に、この方法が利
用できる。すなわちペルオキシダーゼ(c)が遊離の状
態の場合、検体中の測定対象物質の量は一定量の(c)
、(d)と反応する、配位子と結合した(b)の発光量
と対照することによって求めることができるし、複合体
の状態の場合は、一定量の(b)、(d)と反応する(
c)の量に対応して発生する発光量と対照させることに
よって求めることができる。
測定対象物質の検出・定量を行う場合に、この方法が利
用できる。すなわちペルオキシダーゼ(c)が遊離の状
態の場合、検体中の測定対象物質の量は一定量の(c)
、(d)と反応する、配位子と結合した(b)の発光量
と対照することによって求めることができるし、複合体
の状態の場合は、一定量の(b)、(d)と反応する(
c)の量に対応して発生する発光量と対照させることに
よって求めることができる。
【0012】一方、本発明の2,3−ジヒドロ−1,4
−フタラジンジオン化合物(b)の検出または定量方法
において、(b)は遊離の状態であっても上記に例示し
たような免疫活性物質などの配位子と結合した複合体の
状態であってもよい。
−フタラジンジオン化合物(b)の検出または定量方法
において、(b)は遊離の状態であっても上記に例示し
たような免疫活性物質などの配位子と結合した複合体の
状態であってもよい。
【0013】この方法も、EIAによる試料中の測定対
象物質の検出・定量に利用できる。すなわち2,3−ジ
ヒドロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)が遊離
の状態の場合、試料中の測定対象物質の量は一定量の(
b)、(d)と反応する、配位子と結合した(c)の量
に対応して発生する発光量と対照させることによって求
めることができるし、複合体の状態の場合は測定対象物
質の量を一定量の(c)、(d)と反応する(b)の量
に対応して発生する発光量と対照させることによって求
めることができる。
象物質の検出・定量に利用できる。すなわち2,3−ジ
ヒドロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)が遊離
の状態の場合、試料中の測定対象物質の量は一定量の(
b)、(d)と反応する、配位子と結合した(c)の量
に対応して発生する発光量と対照させることによって求
めることができるし、複合体の状態の場合は測定対象物
質の量を一定量の(c)、(d)と反応する(b)の量
に対応して発生する発光量と対照させることによって求
めることができる。
【0014】しかしながら、(b)がルミノールやイソ
ルミノールの場合、免疫活性物質と結合させるとその発
光量子収率が大幅に低下するため、複合体とする場合は
(b)としてAHEI、ABEIを用いた複合体とする
必要がある。
ルミノールの場合、免疫活性物質と結合させるとその発
光量子収率が大幅に低下するため、複合体とする場合は
(b)としてAHEI、ABEIを用いた複合体とする
必要がある。
【0015】本発明のペルオキシダーゼ、2,3−ジヒ
ドロ−1,4−フタラジンジオン化合物の各検出または
定量方法は、アルカリ性サイドで行われることが好まし
いのは勿論であるが、特に好ましくは7.0 〜11.
0のpHである。発光反応の場として用いられる緩衝液
は前記のpHを満足させるものであればどのような種類
の緩衝液を用いることも可能であるが、リン酸緩衝液、
グリシン/NaOH緩衝液、トリス/塩酸緩衝液、トリ
ス/酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、バルビタール緩衝液、ホ
ウ酸緩衝液などが好ましいものとして挙げられる。
ドロ−1,4−フタラジンジオン化合物の各検出または
定量方法は、アルカリ性サイドで行われることが好まし
いのは勿論であるが、特に好ましくは7.0 〜11.
0のpHである。発光反応の場として用いられる緩衝液
は前記のpHを満足させるものであればどのような種類
の緩衝液を用いることも可能であるが、リン酸緩衝液、
グリシン/NaOH緩衝液、トリス/塩酸緩衝液、トリ
ス/酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、バルビタール緩衝液、ホ
ウ酸緩衝液などが好ましいものとして挙げられる。
【0016】この際、好ましい緩衝液濃度は1〜100
0(ミリモル/リットル)である。また、増強剤の濃度
としては用いる増強剤により、各々最適な濃度を設定す
ることが必要であるが、本発明において特に好ましい増
強剤である4−(シアノメチルチオ)フェノール、4−
シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シア
ノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチ
ルチオ−2−ブロモフェノールおよび4−シアノメチル
チオ−2−ヨードフェノールについては10−4〜1.
0(w/v%) の範囲で使用することが好ましい。
0(ミリモル/リットル)である。また、増強剤の濃度
としては用いる増強剤により、各々最適な濃度を設定す
ることが必要であるが、本発明において特に好ましい増
強剤である4−(シアノメチルチオ)フェノール、4−
シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シア
ノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチ
ルチオ−2−ブロモフェノールおよび4−シアノメチル
チオ−2−ヨードフェノールについては10−4〜1.
0(w/v%) の範囲で使用することが好ましい。
【0017】本発明の増強剤(a)は、(b)、(c)
、(d)とは別な溶液として発光反応系に添加すること
も、(b)、(c)、(d)のいずれかと予め混和した
状態で発光反応系に添加することも可能である。
、(d)とは別な溶液として発光反応系に添加すること
も、(b)、(c)、(d)のいずれかと予め混和した
状態で発光反応系に添加することも可能である。
【0018】また、必要に応じて適当な界面活性剤ある
いは牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白
成分を発光反応系に添加することも可能である。
いは牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白
成分を発光反応系に添加することも可能である。
【0019】発光反応を進めるための(b)、(c)、
(d)の各濃度は測定方法、条件によって最適濃度が設
定されなくてはならないが、本発明の(b)、(c)の
各検出または定量方法においては、2,3−ジヒドロ−
1,4−フタラジンジオン化合物(b)(100nmo
l 〜1mol/リットル)、ペルオキシダーゼ(c)
(1ng 〜5000mg/リットル)、酸化剤(d)
(100nmol 〜1mol/リットル)の範囲とし
、各物質を適当な濃度で組合わせて使用するのが好まし
い。
(d)の各濃度は測定方法、条件によって最適濃度が設
定されなくてはならないが、本発明の(b)、(c)の
各検出または定量方法においては、2,3−ジヒドロ−
1,4−フタラジンジオン化合物(b)(100nmo
l 〜1mol/リットル)、ペルオキシダーゼ(c)
(1ng 〜5000mg/リットル)、酸化剤(d)
(100nmol 〜1mol/リットル)の範囲とし
、各物質を適当な濃度で組合わせて使用するのが好まし
い。
【0020】本発明の各方法において、発光反応を行う
際の温度はペルオキシダーゼ(c)の酵素反応に最も適
した温度(5〜50℃)で実施することが好ましい。
際の温度はペルオキシダーゼ(c)の酵素反応に最も適
した温度(5〜50℃)で実施することが好ましい。
【0021】本発明のもう1つの目的は、増強された化
学発光を利用した測定用キット、特に増強された化学発
光を利用した免疫測定(イムノアッセイ)法に用いる免
疫測定用キットに関するものである。
学発光を利用した測定用キット、特に増強された化学発
光を利用した免疫測定(イムノアッセイ)法に用いる免
疫測定用キットに関するものである。
【0022】ペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法
(EIA)については広く知られている。この場合、試
料中の測定対象物質の量はペルオキシダーゼ標識された
免疫活性物質(例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテイ
ンA、アビジン、ビオチンなど)の量に対応させてその
ペルオキシダーゼ活性を酸化剤とオルトフェニレンジア
ミンのような発色基質を用いて比色法で測定するもので
ある。
(EIA)については広く知られている。この場合、試
料中の測定対象物質の量はペルオキシダーゼ標識された
免疫活性物質(例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテイ
ンA、アビジン、ビオチンなど)の量に対応させてその
ペルオキシダーゼ活性を酸化剤とオルトフェニレンジア
ミンのような発色基質を用いて比色法で測定するもので
ある。
【0023】本発明の増強された化学発光を利用した測
定用キットにおいては、(c)としてペルオキシダーゼ
標識された免疫活性物質を用いた場合、試料中の測定対
象物質の量をペルオキシダーゼ標識された免疫活性物質
の量に対応させ、そのペルオキシダーゼ活性を2,3−
ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)と酸
化剤(d)および4−(シアノメチルチオ)フェノール
に代表される本発明における増強剤から成る試薬を用い
て発光強度として測定することができる。
定用キットにおいては、(c)としてペルオキシダーゼ
標識された免疫活性物質を用いた場合、試料中の測定対
象物質の量をペルオキシダーゼ標識された免疫活性物質
の量に対応させ、そのペルオキシダーゼ活性を2,3−
ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン化合物(b)と酸
化剤(d)および4−(シアノメチルチオ)フェノール
に代表される本発明における増強剤から成る試薬を用い
て発光強度として測定することができる。
【0024】ペルオキシダーゼに代表される酵素を用い
る免疫測定法は均一(ホモジニアス)系と不均一(ヘテ
ロジニアス)系に大別されるが、そのいずれにも本発明
の測定用キットを用いることができる。
る免疫測定法は均一(ホモジニアス)系と不均一(ヘテ
ロジニアス)系に大別されるが、そのいずれにも本発明
の測定用キットを用いることができる。
【0025】均一系においては、例えば本発明の測定用
キットを構成する(b)または(c)としてリポソーム
中にルミノールあるいはペルオキシダーゼを封入し、且
つこのリポソーム表面に免疫活性物質を固定化したもの
を用いるとよい。試料中の免疫活性物質とリポソーム表
面に固定化された免疫活性物質との間で行われた抗原抗
体反応の量に応じてリポソーム外に出たルミノールある
いはペルオキシダーゼの量を増強剤及び過酸化水素など
の酸化剤(d)を用いて増強されたルミノールの化学発
光量を測定することにより、試料中の免疫活性物質の検
出または定量をすることができる。
キットを構成する(b)または(c)としてリポソーム
中にルミノールあるいはペルオキシダーゼを封入し、且
つこのリポソーム表面に免疫活性物質を固定化したもの
を用いるとよい。試料中の免疫活性物質とリポソーム表
面に固定化された免疫活性物質との間で行われた抗原抗
体反応の量に応じてリポソーム外に出たルミノールある
いはペルオキシダーゼの量を増強剤及び過酸化水素など
の酸化剤(d)を用いて増強されたルミノールの化学発
光量を測定することにより、試料中の免疫活性物質の検
出または定量をすることができる。
【0026】一方、不均一系のイムノアッセイは現在ほ
とんどの検査室でルーチン分析に用いられている方法で
あるが、この測定法はさらに(1) サンドイッチ法、
(2) 競合法に大別することができる。そして、本発
明法はこれら両方の測定法に応用することができる。
とんどの検査室でルーチン分析に用いられている方法で
あるが、この測定法はさらに(1) サンドイッチ法、
(2) 競合法に大別することができる。そして、本発
明法はこれら両方の測定法に応用することができる。
【0027】サンドイッチ法は、試験管、ガラスビーズ
、プラスティックビーズ、マイクロパーティクルなどの
固相担体に免疫活性物質を結合させ、これに試料を加え
抗原抗体反応を行う。未反応物を除去し、次に酵素標識
された免疫活性物質を加え、最初の反応で固定化された
免疫活性物質と反応、結合した試料中の測定対象物質と
抗原抗体反応を行う。抗原抗体反応をして固相に結合し
た酵素の量は試料中の測定対象物質の量に比例するので
、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料中の測
定対象物質量を求めることを原理とする方法である。
、プラスティックビーズ、マイクロパーティクルなどの
固相担体に免疫活性物質を結合させ、これに試料を加え
抗原抗体反応を行う。未反応物を除去し、次に酵素標識
された免疫活性物質を加え、最初の反応で固定化された
免疫活性物質と反応、結合した試料中の測定対象物質と
抗原抗体反応を行う。抗原抗体反応をして固相に結合し
た酵素の量は試料中の測定対象物質の量に比例するので
、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料中の測
定対象物質量を求めることを原理とする方法である。
【0028】このサンドイッチ法を利用したイムノアッ
セイに関して[エム シー リベナント、クリニカ
ル ケミストリー、第29巻、681ページ、(19
83年)]にポリプロピレン製試験管に抗フェリチン抗
体を結合させた固相担体とペルオキシダーゼ標識抗フェ
リチン抗体を用いたEIAに関する記載がある。これに
よると酵素活性は発色基質である2、2’−アジノ−ジ
(3−エチル−ベンズチアゾリン−6−スルフォネイト
)(ABTS)を用いて比色法により測定され、この発
色度から試料中のフェリチン濃度を求めている。
セイに関して[エム シー リベナント、クリニカ
ル ケミストリー、第29巻、681ページ、(19
83年)]にポリプロピレン製試験管に抗フェリチン抗
体を結合させた固相担体とペルオキシダーゼ標識抗フェ
リチン抗体を用いたEIAに関する記載がある。これに
よると酵素活性は発色基質である2、2’−アジノ−ジ
(3−エチル−ベンズチアゾリン−6−スルフォネイト
)(ABTS)を用いて比色法により測定され、この発
色度から試料中のフェリチン濃度を求めている。
【0029】本発明は上記方法において、酵素(ペルオ
キシダーゼ)活性を求める段階で発色基質の代わりに発
光物質(b)、酸化剤(d)および増強剤(a)を用い
ることにより酵素活性を増強された化学発光量として測
定し、その発光量から試料中のフェリチン濃度を求める
ことを可能にさせるものである。
キシダーゼ)活性を求める段階で発色基質の代わりに発
光物質(b)、酸化剤(d)および増強剤(a)を用い
ることにより酵素活性を増強された化学発光量として測
定し、その発光量から試料中のフェリチン濃度を求める
ことを可能にさせるものである。
【0030】一方、競合法はサンドイッチ法と同様に試
験管、ガラスビーズ、プラスティックビーズ、マイクロ
パーティクルなどの固相担体に抗体を結合させ、これに
試料中の測定対象物質と酵素標識された測定対象物質抗
原を固相化抗体に対し競合反応させる。固相化抗体と結
合した酵素の量は試料中の測定対象物質の量に逆比例す
るので、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料
中の物質量を求めることを原理とする方法である。
験管、ガラスビーズ、プラスティックビーズ、マイクロ
パーティクルなどの固相担体に抗体を結合させ、これに
試料中の測定対象物質と酵素標識された測定対象物質抗
原を固相化抗体に対し競合反応させる。固相化抗体と結
合した酵素の量は試料中の測定対象物質の量に逆比例す
るので、予め標準物質を用いて作成した検量線から試料
中の物質量を求めることを原理とする方法である。
【0031】競合法を利用したイムノアッセイについて
は[荒川等、アナリティカル バイオケミストリー、
第97巻、248ページ、(1979年)]にペルオキ
シダーゼ標識コーチゾールとセファロース4Bに抗コー
チゾール抗体を固定化した固相担体を用い、固相に結合
したペルオキシダーゼの量をルミノールと過酸化水素を
用いた化学発光により測定し、試料中のコーチゾールの
量を求める方法に関する記載がある。
は[荒川等、アナリティカル バイオケミストリー、
第97巻、248ページ、(1979年)]にペルオキ
シダーゼ標識コーチゾールとセファロース4Bに抗コー
チゾール抗体を固定化した固相担体を用い、固相に結合
したペルオキシダーゼの量をルミノールと過酸化水素を
用いた化学発光により測定し、試料中のコーチゾールの
量を求める方法に関する記載がある。
【0032】本発明は上記方法における、発光反応系に
さらに増強剤(a)を加えることにより発光量を増やし
、感度よく測定することを可能にさせるものである。
さらに増強剤(a)を加えることにより発光量を増やし
、感度よく測定することを可能にさせるものである。
【0033】本発明の化学発光反応を利用する測定用キ
ットは、AFP、CEA、フェリチンなどの腫瘍マーカ
ー、TSH、LH、FSH、インスリンなどのホルモン
、コーチゾール、T3、T4などのハプテンホルモン、
ジゴキシン、テオフィリンなどの薬物、肝炎抗原などの
感染性物質、肝炎抗体、IgEなどの抗体の測定に利用
することができるが、必ずしもこれらの項目に限定され
るものではない。
ットは、AFP、CEA、フェリチンなどの腫瘍マーカ
ー、TSH、LH、FSH、インスリンなどのホルモン
、コーチゾール、T3、T4などのハプテンホルモン、
ジゴキシン、テオフィリンなどの薬物、肝炎抗原などの
感染性物質、肝炎抗体、IgEなどの抗体の測定に利用
することができるが、必ずしもこれらの項目に限定され
るものではない。
【0034】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。
が本発明はこれに限定されるものではない。
【0035】実施例1
この実施例は、本発明における化学発光増強剤が、ルミ
ノールと西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と過酸化水
素との化学発光反応を促進させ、増強剤が存在しない発
光反応に比べて大きく発光量を増大させることが可能と
なったことを例示するものである。
ノールと西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と過酸化水
素との化学発光反応を促進させ、増強剤が存在しない発
光反応に比べて大きく発光量を増大させることが可能と
なったことを例示するものである。
【0036】西洋ワサビペルオキシダーゼ(東洋紡社製
、グレードI−C)を0.02モル/リットル(以下M
と略す)、pH 7.2のリン酸緩衝液に溶解し、溶液
中のペルオキシダーゼ濃度を403nmの吸光度より求
めたところ0.12mg/mlであった。これをさらに
前記リン酸緩衝液を用いて1/10000 に希釈した
。
、グレードI−C)を0.02モル/リットル(以下M
と略す)、pH 7.2のリン酸緩衝液に溶解し、溶液
中のペルオキシダーゼ濃度を403nmの吸光度より求
めたところ0.12mg/mlであった。これをさらに
前記リン酸緩衝液を用いて1/10000 に希釈した
。
【0037】ルミノール(東京化成製)0.18gおよ
び4−(シアノメチルチオ)フェノール、4−(ベンジ
ルチオ)フェノール、4−(メチルチオ)フェノール、
4−(モルホリノメチルチオ)フェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノメチ
ルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチルチオ
−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ−2−
ヨードフェノールおよび対照としてパラヨードフェノー
ルそれぞれ0.1gを0.1M(モル/l)、pH8.
5のトリス/塩酸緩衝液1リットルに溶解し、ストック
溶液とした。
び4−(シアノメチルチオ)フェノール、4−(ベンジ
ルチオ)フェノール、4−(メチルチオ)フェノール、
4−(モルホリノメチルチオ)フェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノメチ
ルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチルチオ
−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ−2−
ヨードフェノールおよび対照としてパラヨードフェノー
ルそれぞれ0.1gを0.1M(モル/l)、pH8.
5のトリス/塩酸緩衝液1リットルに溶解し、ストック
溶液とした。
【0038】酸化剤としては過酸化水素を用いた。これ
についても200μlの35%過酸化水素水を0.1M
、pH8.5のトリス/塩酸緩衝液1リットルに溶解し
、ストック溶液とした。
についても200μlの35%過酸化水素水を0.1M
、pH8.5のトリス/塩酸緩衝液1リットルに溶解し
、ストック溶液とした。
【0039】発光強度の測定には、アロカ社製ルミネッ
センスリーダーBLR−201型を使用した。先に希釈
調製したペルオキシダーゼ溶液100μl(ペルオキシ
ダーゼ量として1.2ng)を12×75mmのガラス
製試験管に分注し、ルミネッセンスリーダーのサンプル
ホルダーにセットした。次に増強剤を含むルミノール溶
液250μlを分注し、最後に過酸化水素溶液250μ
lを分注して反応を開始させた。(反応温度30℃)
センスリーダーBLR−201型を使用した。先に希釈
調製したペルオキシダーゼ溶液100μl(ペルオキシ
ダーゼ量として1.2ng)を12×75mmのガラス
製試験管に分注し、ルミネッセンスリーダーのサンプル
ホルダーにセットした。次に増強剤を含むルミノール溶
液250μlを分注し、最後に過酸化水素溶液250μ
lを分注して反応を開始させた。(反応温度30℃)
【
0040】同様にブランク試験、増強剤を添加しない場
合の試験および比較対照としてパラヨードフェノールを
増強剤とした場合の試験も行った。結果は表1に示した
。ここで記載されている数値は過酸化水素分注時点から
1分間積分した値(キロカウント)である。また、増強
剤として4−(シアノメチルチオ)フェノールを添加し
た場合の3秒毎に測定した発光パターンは図1に示した
通りで、過酸化水素投入後約15秒で一定となった。
0040】同様にブランク試験、増強剤を添加しない場
合の試験および比較対照としてパラヨードフェノールを
増強剤とした場合の試験も行った。結果は表1に示した
。ここで記載されている数値は過酸化水素分注時点から
1分間積分した値(キロカウント)である。また、増強
剤として4−(シアノメチルチオ)フェノールを添加し
た場合の3秒毎に測定した発光パターンは図1に示した
通りで、過酸化水素投入後約15秒で一定となった。
【0041】
【表1】
【0042】実施例2
この実施例は、本発明において見いだされた増強剤であ
る4−(シアノメチルチオ)フェノール、4−シアノメ
チルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノメチル
チオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−ブロモフェノールおよび4−シアノメチルチオ−2
−ヨードフェノールと既知の増強剤であるパラヨードフ
ェノールの化学発光を増強させるうえでの最適濃度につ
いて比較検討したものである。
る4−(シアノメチルチオ)フェノール、4−シアノメ
チルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノメチル
チオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−ブロモフェノールおよび4−シアノメチルチオ−2
−ヨードフェノールと既知の増強剤であるパラヨードフ
ェノールの化学発光を増強させるうえでの最適濃度につ
いて比較検討したものである。
【0043】ルミノール(東京化成製)0.18gを0
.1M、pH8.5のトリス/塩酸緩衝液1リットルに
溶解し、さらにこれに4−(シアノメチルチオ)フェノ
ール、4−シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール
、4−シアノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−
シアノメチルチオ−2−ブロモフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−ヨードフェノールおよびパラヨードフ
ェノールをそれぞれ0.1、0.05、0.01、0.
005、0.001%となるよう溶解してこれらをスト
ック溶液とした。
.1M、pH8.5のトリス/塩酸緩衝液1リットルに
溶解し、さらにこれに4−(シアノメチルチオ)フェノ
ール、4−シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール
、4−シアノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−
シアノメチルチオ−2−ブロモフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−ヨードフェノールおよびパラヨードフ
ェノールをそれぞれ0.1、0.05、0.01、0.
005、0.001%となるよう溶解してこれらをスト
ック溶液とした。
【0044】発光強度の測定には、実施例1と同様アロ
カ社製ルミネッセンスリーダーBLR−201型を使用
した。先に調製したペルオキシダーゼ溶液100μl(
ペルオキシダーゼ量として1.2ng)を12×75m
mのガラス製試験管に分注し、ルミネッセンスリーダー
のサンプルホルダーにセットした。次に各濃度の増強剤
を含むルミノール溶液250μlを分注し、最後に過酸
化水素溶液250μlを分注して反応を開始させた。 (反応温度30℃)
カ社製ルミネッセンスリーダーBLR−201型を使用
した。先に調製したペルオキシダーゼ溶液100μl(
ペルオキシダーゼ量として1.2ng)を12×75m
mのガラス製試験管に分注し、ルミネッセンスリーダー
のサンプルホルダーにセットした。次に各濃度の増強剤
を含むルミノール溶液250μlを分注し、最後に過酸
化水素溶液250μlを分注して反応を開始させた。 (反応温度30℃)
【0045】結果を表2に示した。ここで記載されてい
る数値も実施例1同様過酸化水素分注時点から1分間積
分した値(キロカウント)である。また、各増強剤濃度
における発光強度のブランク値との比を図2に示した。 本結果から、本発明において見いだされた増強剤4−(
シアノメチルチオ)フェノールは既知の増強剤であるパ
ラヨードフェノールに比べ約1/10の濃度においても
パラヨードフェノールを上回る性能(発光量および発光
量の対ブランク値比)を発揮することが確認された。 また、4−シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール
、4−シアノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−
シアノメチルチオ−2−ブロモフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−ヨードフェノールについてもパラヨー
ドフェノールと同じ濃度でパラヨードフェノールを上回
る性能を示した。
る数値も実施例1同様過酸化水素分注時点から1分間積
分した値(キロカウント)である。また、各増強剤濃度
における発光強度のブランク値との比を図2に示した。 本結果から、本発明において見いだされた増強剤4−(
シアノメチルチオ)フェノールは既知の増強剤であるパ
ラヨードフェノールに比べ約1/10の濃度においても
パラヨードフェノールを上回る性能(発光量および発光
量の対ブランク値比)を発揮することが確認された。 また、4−シアノメチルチオ−2−フルオロフェノール
、4−シアノメチルチオ−2−クロロフェノール、4−
シアノメチルチオ−2−ブロモフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−ヨードフェノールについてもパラヨー
ドフェノールと同じ濃度でパラヨードフェノールを上回
る性能を示した。
【0046】
【表2】
【0047】実施例3
この実施例は、4−(シアノメチルチオ)フェノールを
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗体、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
たサンドイッチ法化学発光免疫測定法によるα−フェト
プロテイン(以下AFPと略す)の測定に関する。
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗体、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
たサンドイッチ法化学発光免疫測定法によるα−フェト
プロテイン(以下AFPと略す)の測定に関する。
【0048】(1) 試験管への抗AFP抗体の固定化
炭酸緩衝液(0.02M)pH9.5に抗AFP抗体(
ウサギ由来、ダコ社製)を100μg/mlになるよう
溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験管(12×75
mm)にこのAFP抗体含有炭酸緩衝液を各500μl
ずつ分注し、4℃で48時間反応させ抗体を試験管内壁
に固定化した。反応終了後、アスピレーターを用いて試
験管内の液を除去した。生理食塩水1mlで試験管内を
3回洗浄し、さらに1%牛血清アルブミン(以下BSA
と略す)を含むリン酸緩衝液(0.02M、pH7.2
)1mlを加え、使用時まで4℃で保存した。
炭酸緩衝液(0.02M)pH9.5に抗AFP抗体(
ウサギ由来、ダコ社製)を100μg/mlになるよう
溶解した。ヌンク社製ポリスチレン試験管(12×75
mm)にこのAFP抗体含有炭酸緩衝液を各500μl
ずつ分注し、4℃で48時間反応させ抗体を試験管内壁
に固定化した。反応終了後、アスピレーターを用いて試
験管内の液を除去した。生理食塩水1mlで試験管内を
3回洗浄し、さらに1%牛血清アルブミン(以下BSA
と略す)を含むリン酸緩衝液(0.02M、pH7.2
)1mlを加え、使用時まで4℃で保存した。
【0049】(2) 酵素標識抗AFP抗体の調製ペル
オキシダーゼ標識抗AFP抗体の調製は、東洋紡社製西
洋ワサビペルオキシダーゼ(I−C)およびダコ社製抗
AFP抗体(ウサギ)を過ヨウ素酸酸化法[ナカネ等、
ジェー ヒストケム サイトケム、第22巻、10
84ページ、(1974年)]により実施した。
オキシダーゼ標識抗AFP抗体の調製は、東洋紡社製西
洋ワサビペルオキシダーゼ(I−C)およびダコ社製抗
AFP抗体(ウサギ)を過ヨウ素酸酸化法[ナカネ等、
ジェー ヒストケム サイトケム、第22巻、10
84ページ、(1974年)]により実施した。
【0050】(3) 血中AFPの測定■酵素標識抗体
液 (2) で得たペルオキシダーゼ標識抗AFP抗体を1
%BSA含有リン酸緩衝液(0.02M、pH7.2)
で希釈し、測定に必要な濃度に希釈した。
液 (2) で得たペルオキシダーゼ標識抗AFP抗体を1
%BSA含有リン酸緩衝液(0.02M、pH7.2)
で希釈し、測定に必要な濃度に希釈した。
【0051】■標準液
精製ヒトAFPを1%BSA含有リン酸緩衝液(0.0
2M、pH7.2)で20、80、320、640ng
/mlとなるよう希釈調製した。
2M、pH7.2)で20、80、320、640ng
/mlとなるよう希釈調製した。
【0052】■測定操作法
(1) で調製した抗体結合試験管中の浸漬液をアスピ
レーターを用いて除去する。生理食塩水1mlを用いて
試験管内を1回洗浄する。洗浄した試験管に標準液また
は試料(血清または血漿)30μlをサンプリングし、
1%BSA含有リン酸緩衝液(0.02M、pH7.2
)500μlを加え、よく撹拌し、37℃で30分間イ
ンキュベートした。反応終了後、反応液をアスピレータ
ーを用いて除去し、生理食塩水1mlを加えて再び同様
に操作した。この操作を3回繰り返し試料中の様々な血
清成分を除去した。
レーターを用いて除去する。生理食塩水1mlを用いて
試験管内を1回洗浄する。洗浄した試験管に標準液また
は試料(血清または血漿)30μlをサンプリングし、
1%BSA含有リン酸緩衝液(0.02M、pH7.2
)500μlを加え、よく撹拌し、37℃で30分間イ
ンキュベートした。反応終了後、反応液をアスピレータ
ーを用いて除去し、生理食塩水1mlを加えて再び同様
に操作した。この操作を3回繰り返し試料中の様々な血
清成分を除去した。
【0053】先の試験管に■で調製した酵素標識抗AF
P抗体液500μlを加え、よく撹拌し、37℃で30
分間インキュベートした。反応終了後、反応液をアスピ
レーターを用いて除去し、生理食塩水1mlを加えて再
び同様に除去した。この操作を3回繰り返し未反応の酵
素標識抗AFP抗体を除去した。
P抗体液500μlを加え、よく撹拌し、37℃で30
分間インキュベートした。反応終了後、反応液をアスピ
レーターを用いて除去し、生理食塩水1mlを加えて再
び同様に除去した。この操作を3回繰り返し未反応の酵
素標識抗AFP抗体を除去した。
【0054】洗浄の終了した先の試験管をルミネッセン
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例1で
調製した4−(シアノメチルチオ)フェノール含有のル
ミノール溶液250μl及び過酸化水素液250μlを
加え、化学発光反応を行った。測定値は1分間の積分値
として得た。
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例1で
調製した4−(シアノメチルチオ)フェノール含有のル
ミノール溶液250μl及び過酸化水素液250μlを
加え、化学発光反応を行った。測定値は1分間の積分値
として得た。
【0055】標準液を検体として用いた場合の各標準液
濃度における発光量を表3に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線(図3参照)から試料中のAFP濃度を読み取った
。
濃度における発光量を表3に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線(図3参照)から試料中のAFP濃度を読み取った
。
【0056】
【表3】
【0057】本実験に用いた試料をペルオキシダーゼ標
識抗AFP抗体を用いた比色法EIAで測定した結果と
の相関を図4に示した。
識抗AFP抗体を用いた比色法EIAで測定した結果と
の相関を図4に示した。
【0058】実施例4
この実施例は、4−(シアノメチルチオ)フェノールを
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗原、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
た化学発光免疫測定法によるサイロキシン(T4)の定
量に関する。
発光増強剤として用い、固相化抗体、ペルオキシダーゼ
標識抗原、ルミノール、過酸化水素の組合わせで実施し
た化学発光免疫測定法によるサイロキシン(T4)の定
量に関する。
【0059】(1) 試験管への抗T4抗体の固定化実
施例3で記載したのと同様な方法で試験管内壁にカルス
タッド社製抗T4抗体(ウサギ)を結合させた。
施例3で記載したのと同様な方法で試験管内壁にカルス
タッド社製抗T4抗体(ウサギ)を結合させた。
【0060】(2) 酵素標識抗原(T4)の調製ペル
オキシダーゼ標識T4の調製は、東洋紡社製西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ(I−C)およびカルバイオケミスト
リー社製T4をグルタルアルデヒド法[アブラメス等、
イムノケミストリー、第6巻、43ページ、(1969
年)]により実施した。
オキシダーゼ標識T4の調製は、東洋紡社製西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ(I−C)およびカルバイオケミスト
リー社製T4をグルタルアルデヒド法[アブラメス等、
イムノケミストリー、第6巻、43ページ、(1969
年)]により実施した。
【0061】■酵素標識抗原液
(2) で得たペルオキシダーゼ標識抗原(T4)を、
0.1%BSA、0.04%8−アニリノ−1−ナフタ
レンスルホン酸アンモニウム含有バルビタール緩衝液(
0.1M、pH8.6)で希釈し、測定に必要な濃度に
希釈した。
0.1%BSA、0.04%8−アニリノ−1−ナフタ
レンスルホン酸アンモニウム含有バルビタール緩衝液(
0.1M、pH8.6)で希釈し、測定に必要な濃度に
希釈した。
【0062】■標準液
標準液は宮井等の方法に従い[宮井等、エンドクリノー
ル ジャパン、第27巻、375ページ、(1980
年)]ヒト血清を活性炭処理することにより得られたT
3、T4フリー血清にカルバイオケミストリー社製T4
を添加し、2.0、6.0、12.0、24.0μg/
dlとなるよう調製した。
ル ジャパン、第27巻、375ページ、(1980
年)]ヒト血清を活性炭処理することにより得られたT
3、T4フリー血清にカルバイオケミストリー社製T4
を添加し、2.0、6.0、12.0、24.0μg/
dlとなるよう調製した。
【0063】■測定操作法
実施例3と同様に試験管内を洗浄する。その試験管に標
準液または試料(血清または血漿)20μlをサンプリ
ングし、さらに酵素標識抗原液500μlを加え、よく
撹拌し、37℃で30分間インキュベートした。反応終
了後、反応液をアスピレーターを用いて除去し、生理食
塩水1mlを加えて再び同様に除去した。この操作を3
回繰り返し試料中の様々な血清成分および未反応の酵素
標識抗原(T4)を除去した。
準液または試料(血清または血漿)20μlをサンプリ
ングし、さらに酵素標識抗原液500μlを加え、よく
撹拌し、37℃で30分間インキュベートした。反応終
了後、反応液をアスピレーターを用いて除去し、生理食
塩水1mlを加えて再び同様に除去した。この操作を3
回繰り返し試料中の様々な血清成分および未反応の酵素
標識抗原(T4)を除去した。
【0064】洗浄の終了した先の試験管をルミネッセン
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例3と
同様な方法で化学発光反応を行った。測定値は1分間の
積分値として得た。
スリーダーのサンプルホルダーにセットし、実施例3と
同様な方法で化学発光反応を行った。測定値は1分間の
積分値として得た。
【0065】標準液を検体として用いた場合の各標準液
濃度における発光量を表4に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線(図5参照)から試料(血清または血漿)中のT4
濃度を読み取った。
濃度における発光量を表4に示した。また各標準液濃度
における発光量をグラフ用紙にプロットして得られた検
量線(図5参照)から試料(血清または血漿)中のT4
濃度を読み取った。
【0066】
【表4】
【0067】本実験に用いた試料をペルオキシダーゼ標
識抗原(T4)を用いた比色法によるEIAで測定した
結果との相関を図6に示した。
識抗原(T4)を用いた比色法によるEIAで測定した
結果との相関を図6に示した。
【0068】
【発明の効果】本発明の増強剤を用いることにより化学
発光量が増強剤を使用しない場合と比較して10000
倍以上に増強され、かつ安定な発光が得られる。また
従来の増強剤と比べ1/10の使用量でも従来より化学
発光量および化学発光量の対ブランク値比が高い点で大
幅にレベルアップしたものである。本発明の増強剤、こ
の増強剤を用いた従来より高感度な本発明の各検出・定
量方法および従来より高感度な測定ができる本発明の測
定用キットを用いることにより、例えば、化学発光を利
用した免疫測定法の感度を著しく上昇させることができ
る。
発光量が増強剤を使用しない場合と比較して10000
倍以上に増強され、かつ安定な発光が得られる。また
従来の増強剤と比べ1/10の使用量でも従来より化学
発光量および化学発光量の対ブランク値比が高い点で大
幅にレベルアップしたものである。本発明の増強剤、こ
の増強剤を用いた従来より高感度な本発明の各検出・定
量方法および従来より高感度な測定ができる本発明の測
定用キットを用いることにより、例えば、化学発光を利
用した免疫測定法の感度を著しく上昇させることができ
る。
【図1】発光増強剤を使用した場合のルミノールの発光
パターンである。
パターンである。
【図2】4−(シアノメチルチオ)フェノール、4−シ
アノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチル
チオ−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−ヨードフェノールおよびパラヨードフェノールの最
適使用濃度を示したグラフである。
アノメチルチオ−2−フルオロフェノール、4−シアノ
メチルチオ−2−クロロフェノール、4−シアノメチル
チオ−2−ブロモフェノール、4−シアノメチルチオ−
2−ヨードフェノールおよびパラヨードフェノールの最
適使用濃度を示したグラフである。
【図3】AFPの化学発光免疫測定法による検量線であ
る。
る。
【図4】化学発光免疫測定法と比色法免疫測定法による
AFP測定結果の相関図である。
AFP測定結果の相関図である。
【図5】T4の化学発光免疫測定法による検量線である
。
。
【図6】化学発光免疫測定法と比色法免疫測定法による
T4測定結果の相関図である。
T4測定結果の相関図である。
Claims (8)
- 【請求項1】 下記一般式化1 【化1】 [この式を一般式(1)と略称する。式中nは1から5
の整数、Rはハロゲン原子で置換されていてもよいフェ
ニル基、水素原子、シアノ基、モルホリノ基、アミノ基
、カルボキシル基(アルカリ金属塩、C1 〜C6 の
アルキルエステルあるいはアミドとなっていてもよい)
、アルデヒド基またはアリル基を、Aは水素原子または
ハロゲン原子を、Xは水素原子またはアルカリ金属を表
す。また、−Aおよび−S(CH2 )n −Rで表さ
れる置換基は−OX基に対して置換基−Aがパラ位に置
換されている場合、置換基−S(CH2 )n −Rは
オルト位に、また置換基−Aがオルト位に置換されてい
る場合、置換基−S(CH2 )n −Rはパラ位に置
換される。]で示されるフェノール系化合物(a)から
なることを特徴とする2,3−ジヒドロ−1,4−フタ
ラジンジオン化合物(b)のペルオキシダーゼ(c)お
よび酸化剤(d)による化学発光の増強剤。 - 【請求項2】 2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジ
ンジオン化合物(b)の酸化剤(d)存在下での酸化発
光によりペルオキシダーゼ(c)の検出または定量を行
う方法において、請求項1記載の増強剤を共存させるこ
とを特徴とするペルオキシダーゼの検出または定量法。 - 【請求項3】 ペルオキシダーゼ(c)が配位子と結
合している請求項2記載の方法。 - 【請求項4】 ペルオキシダーゼ(c)と酸化剤(d
)の存在下での酸化反応により2,3−ジヒドロ−1,
4−フタラジンジオン化合物(b)を化学発光させ、こ
の化合物の検出、定量を行う方法において、請求項1記
載の増強剤を共存させることを特徴とする2,3−ジヒ
ドロ−1,4−フタラジンジオン化合物の検出または定
量法。 - 【請求項5】 2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジ
ンジオン化合物(b)が配位子と結合している請求項4
記載の方法。 - 【請求項6】 試料中の測定対象物質の検出・定量を
2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン化合物(
b)のペルオキシダーゼ(c)および酸化剤(d)によ
る化学発光を利用して行う免疫測定法において、(b)
もしくは(c)のいずれかが配位子と結合しており、さ
らに請求項1記載の増強剤を共存させて化学発光を行う
ことを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項7】 2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジ
ンジオン化合物(b)、ペルオキシダーゼ(c)および
酸化剤(d)を組合わせた化学発光を利用した測定用キ
ットにおいて、さらに請求項1記載の増強剤を組合わせ
ることを特徴とする測定用キット。 - 【請求項8】 2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジ
ンジオン化合物(b)またはペルオキシダーゼ(c)が
配位子と結合している請求項7記載の免疫測定用キット
。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3081922A JPH0767394B2 (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット |
EP92302414A EP0505198B1 (en) | 1991-03-20 | 1992-03-20 | A method of enhancing a luminescent reaction, luminometric assay and kits for use in the same |
DE69216265T DE69216265T2 (de) | 1991-03-20 | 1992-03-20 | Verfahren zum Steigern einer Lumineszenzreaktion, Luminometrischer Test und Testsätze zur Verwendung in demselben |
US08/102,542 US5424194A (en) | 1991-03-20 | 1993-08-05 | 4-(cyanomethylthio)phenol enhanced peroxidase assays |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3081922A JPH0767394B2 (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04293498A true JPH04293498A (ja) | 1992-10-19 |
JPH0767394B2 JPH0767394B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=13759953
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3081922A Expired - Fee Related JPH0767394B2 (ja) | 1991-03-20 | 1991-03-20 | 化学発光増強剤、化学発光利用検出・定量法及びキット |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5424194A (ja) |
EP (1) | EP0505198B1 (ja) |
JP (1) | JPH0767394B2 (ja) |
DE (1) | DE69216265T2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110041913A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-07-23 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种增强型化学发光底物及其应用 |
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GB9306888D0 (en) * | 1993-04-01 | 1993-05-26 | Kricka Larry J | Chemiluminescent enhancers |
US5491072A (en) * | 1993-05-17 | 1996-02-13 | Lumigen, Inc. | N-alkylacridan carboxyl derivatives useful for chemiluminescent detection |
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US5679803A (en) * | 1995-10-25 | 1997-10-21 | Tropix, Inc. | 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance |
FR2740219B1 (fr) * | 1995-10-20 | 1998-01-16 | Covalab | Systeme d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de preference biologiques, par chimiluminescence, amplifiee, procede et necessaire d'analyse en faisant application |
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AU2002307340A1 (en) | 2001-04-16 | 2002-10-28 | California Institute Of Technology | Peroxide-driven cytochrome p450 oxygenase variants |
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WO2005017105A2 (en) | 2003-06-17 | 2005-02-24 | California University Of Technology | Regio- and enantioselective alkane hydroxylation with modified cytochrome p450 |
WO2005017116A2 (en) | 2003-08-11 | 2005-02-24 | California Institute Of Technology | Thermostable peroxide-driven cytochrome p450 oxygenase variants and methods of use |
WO2006076034A2 (en) * | 2004-05-21 | 2006-07-20 | Bhanu, Kalra | Stabilized two component system for chemilumiescent assay in immunodiagnostics |
CN1318538C (zh) * | 2004-08-30 | 2007-05-30 | 北京源德生物医学工程有限公司 | 含辅助增强剂和增强剂的增敏化学发光液 |
US11214817B2 (en) | 2005-03-28 | 2022-01-04 | California Institute Of Technology | Alkane oxidation by modified hydroxylases |
US8715988B2 (en) | 2005-03-28 | 2014-05-06 | California Institute Of Technology | Alkane oxidation by modified hydroxylases |
US8252559B2 (en) | 2006-08-04 | 2012-08-28 | The California Institute Of Technology | Methods and systems for selective fluorination of organic molecules |
US8026085B2 (en) | 2006-08-04 | 2011-09-27 | California Institute Of Technology | Methods and systems for selective fluorination of organic molecules |
ES2324509B1 (es) * | 2008-02-06 | 2010-06-17 | Matilde Esther Lleonart Pajarin | Composicion de revelado en ensayos de inmunodeteccion. |
CN106501535B (zh) * | 2016-11-30 | 2018-11-09 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种ans盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒 |
CN112255406B (zh) * | 2020-09-29 | 2023-04-14 | 北京利德曼生化股份有限公司 | 测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒 |
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-
1991
- 1991-03-20 JP JP3081922A patent/JPH0767394B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-03-20 DE DE69216265T patent/DE69216265T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-20 EP EP92302414A patent/EP0505198B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-08-05 US US08/102,542 patent/US5424194A/en not_active Expired - Lifetime
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---|---|---|---|---|
CN110041913A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-07-23 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种增强型化学发光底物及其应用 |
CN110041913B (zh) * | 2019-04-10 | 2022-01-11 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种增强型化学发光底物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69216265D1 (de) | 1997-02-13 |
US5424194A (en) | 1995-06-13 |
JPH0767394B2 (ja) | 1995-07-26 |
DE69216265T2 (de) | 1997-05-28 |
EP0505198A1 (en) | 1992-09-23 |
EP0505198B1 (en) | 1997-01-02 |
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