JP3745112B2 - 化学発光酵素免疫測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学発光方法を利用する酵素免疫測定方法に関するものであり、さらに詳しくは、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特定のアクリジニウム塩類の還元反応生成物を化学発光性物質として用いる抗原または抗体の免疫学的測定方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
酵素免疫測定方法は、標識物質に放射性同位元素を使用しないので良好な測定環境を保持することが可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されている。この酵素免疫測定方法において、ぺルオキシダーゼ、アルカリホスファダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ等の種々の酵素が使用されている。これらの酵素を用いた酵素標識抗体または抗原の酵素活性を検出する方法としては、過酸化水素/o−フェニレンジアミン、4−ニトロフェニル−ホスフェ−ト、2−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発色量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体または抗原の量を定量する比色法が一般的である。しかしながら、臨床化学分析においてはその測定対象が生体試料(主として血清、尿等)であり、その測定値は病態の診断または経過観察等に用いられることが多く、そのために、さらに高感度および高精度の測定が求められているが、比色法によりこの要求を完全に満足させるのは困難である。そこで、この要求を満たすことを目的として蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた酵素の触媒活性により、4−ヒドロキシフェニル酢酸、4−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド、4−メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体または抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法では、励起光の散乱が存在するため上記の要求を満たすには充分とは云い難い。また、比色法および蛍光法では、キセノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因となり、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうので、比色法および蛍光法による測定の高感度化は原理的に困難である。近年、比色法および蛍光法を上回る高感度の酵素免疫測定方法として、化学発光酵素免疫測定方法(CLEIA)が開発され、注目されている。
【0003】
化学発光酵素免疫測定方法は、酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体または抗原の量を定量する方法であり、化学反応により化学発光性物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度化が可能である。化学発光酵素免疫測定方法に用いられる酵素としては、ぺルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、取り扱い易さ、入手し易さ等の点でぺルオキシダーゼが好適に用いられ、化学発光性物質にルミノールを用い、発光増強剤にp−ヨードフェノールを用いる化学発光方法が開発され、種々の物質が化学発光方法により免疫学的に高感度に定量することが可能になっている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とする化学発光酵素免疫測定方法(CLEIA)においては、測定対象物質の低濃度領域での定量性をさらに高める必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とする化学発光酵素免疫測定方法のさらなる高感度化が望まれていた。本発明は、上記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な化学発光方法を利用する新規な酵素免疫測定方法を提供することを課題とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光性物質として、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用い、水素受容体の存在下において、特に好ましくは発光増強剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光系が、化学発光性物質としてルミノールを用いる化学発光系より高感度に測定対象物質を免疫学的に定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達したものである。
【0006】
従って、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体もしくは抗原を試料中の測定すべき抗原もしくは抗体またはそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を生成させ、さらに、好ましくは、該免疫複合体を不溶性担体に固定化した抗体もしくは抗原と反応させて該不溶性担体上に捕捉した後、化学発光性物質として
下記一般式(1)
【0007】
【化3】
(上記一般式(1)において、R1 およびR2 は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、R3 、R4 、R5 およびR6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよく、Xn-はn価の陰イオンであり、nは1または2である。)
で表わされるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その化学発光量を測定することにより試料中の抗原もしくは抗体を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測定方法に関するものである。
【0008】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につきさらに詳しく説明する。
【0009】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗原抗体反応により測定すべき抗原または抗体をペルオキシダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識酵素を用いる化学発光方法により測定する化学発光反応段階とからなる。
【0010】
免疫反応段階を構成する免疫反応の方法は任意であり、化学発光反応段階において酵素活性の検出・定量に化学発光性物質N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジンニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用いることができるものであれば、いずれの方法も採用することができる。
【0011】
例えば、
▲1▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原を捕捉させると同時または捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応させるサンドイッチ法、
▲2▼サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンドイッチ錯体に対して、さらに、この抗体に対する標識した第二抗体を反応させる二抗体法、
▲3▼不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる競合法、
▲4▼測定すべき抗原または抗体を含有する試料にこれらと特異的に反応する標識した抗体または抗原を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分離して分離された免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈殿法
または
▲5▼不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗体を作用させる抗体検出法等の方法、
さらに、ビオチン標識抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジン等を利用する方法等を非限定的に用いることができる。
【0012】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法の免疫反応段階において用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、紙、ガラス、金属、磁性粒子およびこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。さらに、これら不溶性担体への抗原、抗体類の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【0013】
なお、本発明の化学発光酵素免疫測定方法において用いられる抗体類はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも可能であり、形態は全抗体でもF(ab’)2 、Fab等の断片を用いることもできる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。
【0014】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法の後段の化学発光反応段階を構成する化学発光反応は、化学発光性物質としてN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を用いることに特異性がある。さらに、反応系に発光増強剤を存在させることが好ましく、発光増強剤の存在下において水素受容体を作用させて、標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を測定することができる。その測定手法は任意であるが、一般に、化学発光性物質および発光増強剤を含有する測定試薬をペルオキシダーゼ酵素標識抗体または抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、特定塩基性pH領域において水素受容体を添加して化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なうことができる。
【0015】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用いられる化学発光性物質であるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物は、前記一般式(1)で表わされる化合物を溶媒中において還元剤を用いて還元処理を行なうことにより得られる反応生成物であり、単一化合物または混合物である。一般式(1)において、R1 およびR2 は、各々、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては、炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、各々、炭素数6〜20のものであり、炭素数1〜14のアルキル基で置換されたものでもよいが、特にフェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、式中、R3 、R4 、R5 およびR6 は、各々、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のものでもよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数6〜20のものであり、アルキル基で置換されたものでもよい。
【0016】
前記一般式(1)において、Xn-はn価の陰イオンであり、nは1または2である。陰イオンとしては、特に限定されるものではないが、硝酸イオン(NO3 -)、ハロゲン化物イオン(例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン等)、リン酸イオン(PO3 -)等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで特に硝酸イオンが好ましい。
【0017】
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の具体例を例示すると、N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩が好適に用いられるが、その他に、N,N’−ジエチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジプロピル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジブチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジペンチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジ−m−クロロフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩等を非限定的に挙げることができる。これらのなかで、特に、N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレートが好適である。
【0018】
前記還元反応生成物は、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスジヒドロアクリジン誘導体を含有するものでよく、該誘導体は、例えば、下記一般式(2)で表すことができる。
【0019】
【化4】
一般式(2)において、R11、およびR22は、アルキル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基としては炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のいずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、炭素数6〜20のものであり、各々、炭素数1〜14のアルキル基で置換されたものでよいが、特に、フェニル基およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、R33、R44、R55およびR66は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数1〜20、好ましくは、1〜14の直鎖状または分岐状のものでよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数6〜20のものであり、アルキル基で置換されたものでもよい。
【0020】
これらの化学発光性物質は、pH7.5〜13の塩基性条件下において、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は特にフェノール性化合物等の発光増強剤によって増強することが認められている。このようなフェノール性化合物としては、p−ヨードフェノール、p−フェニルフェノール、6−ヒドロキシベンゾチアゾールが特に好ましいが、その他にもp−ヒドロキシ桂皮酸、p−(4−クロロフェニル)フェノール、p−(4−ブロモフェニル)フェノール、p−(4−ヨードフェニル)フェノール、p−ブロモフェノール、p−クロロフェノール、2−ナフトール、ホタルルシフェリン等がその例として非限定的に挙げられる。
【0021】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法において用いられる化学発光性物質であるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物の濃度は、出発物質のN,N’置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類に換算して10-8〜1M、好ましくは10-5〜10-2Mの範囲であり、その使用量としては10〜500μl、特に、50〜300μlの範囲が好ましい。また、発光増強剤の使用量は還元反応生成物からなる化学発光性物質の0.01〜100倍モル、好ましくは0.1〜10倍モルの範囲であり、濃度は10-6〜1M、好ましくは10-4〜10-2Mの範囲である。
【0022】
また、化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではないが、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素が好ましく用いられる。この水素受容体の使用量は化学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光性物質に対して3〜1万倍モル、好ましくは10〜1000倍モルの範囲で用いることができる。
【0023】
化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は1mM〜1Mの範囲で用いるのが好ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【0024】
本発明の化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測定することができ、その測定の開始点および積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時間を選択するのが望ましい。例えば、測定開始点は試薬混合後0〜1時間、好ましくは0〜30分、特に好ましくは0〜15分であり、測定の積算時間は1秒〜1分、好ましくは1〜30秒、特に好ましくは1〜10秒である。
【0025】
本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用いられるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物の製造方法は任意であるが、前記一般式(1)で表される化合物を還元剤を用いて還元処理することにより容易に製造することができる。用いられる還元剤としては、リチウムアルミニウムハイドライド、リチウムボロンハイドライド、ナトリウムボロンハイドライド等が挙げられるが、リチウムアルミニウムハイドライドが特に好ましく用いられる。還元反応は反応溶媒中で行なうことが好ましいが、反応溶媒としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に対する溶解性を有するものであれば、特に限定されるものではなく、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エーテル類等が好ましく用いられる。反応温度は用いられる還元剤および反応溶媒の種類によって異なるが、一般的に、−10〜+150℃、好ましくは0〜120℃、特に好ましくは20〜90℃の範囲の温度である。反応時間は1分〜一昼夜、好ましくは10分〜12時間、特に好ましくは30分〜5時間の範囲である。
【0026】
また、本発明によれば、N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物からなる化学発光測定用試薬を提供することができ、ペルオキシダーゼ酵素標識物質、化学発光測定用試薬、水素受容体溶液の過酸化水素および発光増強剤のフェノール性化合物等を用いた酵素免疫測定用試薬キットを提供することができる。この測定用試薬またはこれらの測定用試薬キットは効率的な化学発光酵素免疫測定を行なう上で極めて有用である。
【0027】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例等を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。なお、参考例および実施例等中の%は重量%を意味する。
【0028】
[参考例1]
化学発光試薬の製造
ルシゲニン(N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレート)1mgを試験管に採り、撹拌下に1,4−ジオキサン1ml中へ加えてルシゲニンを1,4−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに水素化リチウムアルミニウム粉末150mgを添加して、80℃で2時間撹拌して還元処理した後、反応生成物を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のpHを1N塩酸で7.0に調整することによりルシゲニンの還元反応生成物を含有する化学発光試薬を得た。
【0029】
[参考例2]
不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリクローナル抗体を10mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)(PBS)に10mg/mlの濃度で溶解した溶液を、白色マイクロプレート(ラボシステム社)の各ウェルに0.1mlずつ加え、37℃の温度で1時間放置した後、PBSで洗浄してから、1%ウシ血清アルブミン(BSA)水溶液を0.3mlずつ加えて37℃の温度で1時間放置してポストコーティング処理を実施してポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
【0030】
[参考例3]
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造
抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクローナル抗体を10mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)に1.0mg/mlの濃度で溶解した溶液1mlに、N−(m−マレイミド安息香酸)−N−サクシンイミドエステル(MBS)の10mg/mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液0.1mlを添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスG−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応MBSとを分離した。
【0031】
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)の1.0mg/mlのPBS溶液に、N−サクシンイミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)の10mg/mlの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させた。
【0032】
次いで、この反応混合液をセファデックスG−25を充填したカラムを用い、10mM酢酸緩衝液(pH4.5)でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化HRPを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約10倍に濃縮した。次に、これに0.1Mジチオスレイトールを含有する0.1M酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5)1mlを添加して、25℃の温度で30分間撹拌してHRP分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスG−25を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化HRPを含有する画分を得た。
【0033】
次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、4℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルAcA44(SEPRACOR社)を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。
【0034】
[実施例1]
同時サンドイッチ法CLEIAによるα−フェトプロテイン(AFP)の測定
兎抗ヒトAFPポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトAFP(標準物質)を0〜800ng/mlの範囲で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)50μlとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトAFPモノクローナル抗体を約3μg/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)100μlとを加え、37℃の温度で1時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに参考例1で調製した化学発光試薬を0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)で10倍に希釈した溶液10μlおよびp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)240μlを加え、これに0.0034%過酸化水素の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)50μlを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図1に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトAFPを0.05ng/mlの濃度まで測定することが可能であった。
【0035】
[実施例2]
同時サンドイッチ法CLEIAによるプロラクチン(PRL)の測定
兎抗ヒトPRLポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトPRL(標準物質)を0〜200ng/mlの範囲で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)50μlとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトPRLモノクローナル抗体を約2μg/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)100μlとを加え、37℃の温度で1時間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに参考例2で調製したN,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩の還元反応生成物を0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)で10倍に希釈した溶液10μlおよびp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)240μlを加え、これに0.0034%過酸化水素の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)50μlを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図2に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを0.1ng/mlの濃度まで測定することが可能であった。
【0036】
[実施例3]
同時サンドイッチ法CLEIAによるヒト絨毛性ゴナドトロピンβ鎖(βhCG)の測定
兎抗ヒトhCGポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したβhCG(標準物質)を0〜200mIU/mlの範囲で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)50μlとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗βhCGモノクローナル抗体を約2μg/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)100μlとを加え、37℃の温度で1時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに化学発光試薬を0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)で10倍に希釈した溶液10μl、およびp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)240μlを加え、これに0.0034%過酸化水素の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)50μlを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図3に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβhCGを0.1mIU/mlの濃度まで測定することが可能であった。
【0037】
[比較例1]
ルミノールを用いる同時サンドイッチ法CLEIAによるα−フェトプロティン(AFP)の測定
兎抗ヒトAFPポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したヒトAFP(標準物質)を0〜800ng/mの範囲で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)50μlとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗ヒトAFPモノクローナル抗体を約3μg/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液(pH7.4)100μlとを加え、37℃の温度で1時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにルミノールを5.6×10-5M、p−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)100μlを加え、これに0.0034%過酸化水素の0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4)50μlを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図4に示される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトAFPを2.0ng/mlの濃度まで測定することが可能であった。
【0038】
【発明の効果】
本発明の酵素免疫測定方法は、入手が容易であり、取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、化学発光性物質としてN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物を用いる化学発光方法により測定対象物質である種々の抗原または抗体類を免疫学的に高感度に測定することができる。
【0039】
さらに、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定方法により抗体、抗原等を、ウェスタンブロット法により蛋白質を、そしてサザーン及びノーザンブロット法により酵素標識核酸プローブを用いてDNAおよびRNA等の核酸を夫々特異的に、且つ高感度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトαAFP(標準物質)の濃度の関数としてプロットして作成したヒトαAFP測定用の検量線である。
【図2】 実施例2記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトプロラクチン(標準物質)の濃度の関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定用の検量線である。
【図3】 実施例3記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をβhCG(標準物質)の濃度の関数としてプロットして作成したβhCG測定用の検量線である。
【図4】 比較例1記載の従来方法による反応系を用いて化学発光させた化学発光量をヒトαAFP(標準物質)の濃度の関数としてプロットして作成したヒトαAFP測定用の検量線である。
Claims (9)
- ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体もしくは抗原を試料中の測定すべき抗原もしくは抗体またはそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を生成させ、該免疫複合体に化学発光性物質として下記一般式(1)
で表わされるN,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その化学発光量を測定することにより試料中の抗原もしくは抗体の含有量を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測定方法。 - 前記免疫複合体が不溶性担体に固定化した抗体または抗原と反応し該不溶性担体上に捕捉されてなる請求項1に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
- 前記N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類が、N,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジエチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジプロピル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジブチル−9,9’−ビスアクジニウム塩、N,N’−ジペンチル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、またはN,N’−ジ−m−クロロフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩である請求項1に記載のペルオキシダーゼ活性の測定方法。
- 前記N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類がN,N’−ジメチル−9,9’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項1に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
- 前記水素受容体が過酸化水素である請求項1〜4のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
- 発光増強剤をさらに含有させてなる請求項1〜5のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
- 前記発光増強剤がフェノール性化合物である請求項6に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
- 前記フェノール性化合物がp−ヨードフェノール、p−フェニルフェノール、6−ヒドロキシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なくとも1種のフェノール性化合物である請求項7に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
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