DE69216265T2

DE69216265T2 - Verfahren zum Steigern einer Lumineszenzreaktion, Luminometrischer Test und Testsätze zur Verwendung in demselben

Info

Publication number: DE69216265T2
Application number: DE69216265T
Authority: DE
Inventors: Tatsuya Koizumi; Katsushige Kouge; Ken Otagiri; Masakazu Sugiura
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 1991-03-20
Filing date: 1992-03-20
Publication date: 1997-05-28
Anticipated expiration: 2012-03-21
Also published as: JPH04293498A; US5424194A; EP0505198B1; EP0505198A1; JPH0767394B2; DE69216265D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung einer Lumineszenzreaktion und einen luminometrischen Assay, die auf der Reaktion zwischen 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder einem Derivat davon, einem Peroxidase- Enzym und einem Oxidans in Gegenwart eines Verstärkers beruhen. Weiters betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnoseset zur Verwendung im luminometrischen Assay, umfassend 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder ein Derivat davon, eine Peroxidase, ein Oxidans und den Verstärker. Insbesondere eignet sich das Set zur Durchführung eines Immunassays.
Gary H.G. Thorpe et al. offenbaren eine Chemolumineszenzreaktion von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder einem Derivat davon, einem Peroxidase-Enzym und einem Oxidans, die in Gegenwart eines halogenierten Phenols wie z.B. p-Iodphenol abläuft, wodurch die Chemolumineszenzreaktion verstärkt wird (Clinical Chemistry (1985), Bd. 31, Nr. 8, S. 1335). Kricka et al. offenbaren Verfahren zur Durchführung eines Assays oder Immunassays, worin die obige Lumineszenzreaktion unter Verwendung einer bestimmten Art von Phenolverbindung als Verstärker durchgeführt wird (US-A-4.598.044). Außerdem gibt es unter den Assays auf Substanzen in biologischen Flüssigkeiten den allgemein bekannten Enzymimmunassay (EIA), bei dem die Substanzen oder Antigene für die Substanzen mit einer Peroxidase markiert werden und die Aktivität der Peroxidase mittels eines kolorimetrischen Assays mit einem Oxidans und (o-)Phenylendiamin, einem Chromogen, überprüft wird.
Wenn für die obige Chemolumineszenzreaktion ein Verstärker gefunden werden könnte, der stärkere Lumineszenz und weniger Hintergrund bietet, in geringeren Mengen eingesetzt werden kann und sich für einen luminometrischen Assay eignet, würde dieser günstigerweise den Anwendungsbereich erweitern.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die Chemolumineszenzreaktion zwischen 2,3-Phthalazindiol oder einem Derivat davon, einem Peroxidase-Enzym und einem Oxidans zu steigern. Dadurch kann ein Assay, insbesondere ein Immunassay, zu einem verbesserten Verfahren zum Nachweisen und Messen von 2,3-Dihydro-1,4phthalazindion oder seines Derivats oder eines Peroxidase-Enzyms unter Durchführung der obigen Chemolumineszenzreaktion führen. Außerdem kann ein Assayset unter Nutzung der obigen verstärkten Chemolumineszenzreaktion besonders vorteilhaft sein. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Steigerung einer Lumineszenzreaktion mit 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder einem Derivat davon, einem Peroxidase-Enzym und einem Oxidans bereitgestellt, welches Verfahren die Durchführung der Lumineszenzreaktion in Gegenwart eines Verstärkers umfaßt, der ein Phenolderivat der nachstehenden allgemeinen Formel (1) ist:
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; R Wasserstoff, Cyano, Morpholino, Carboxyl, eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, Metallcarboxylat, Amido, Aldehyd oder Allyl oder eine gegebenenfalls mit einem Halogenatom substituierte Phenylgruppe ist; A ein Wasserstoff- oder ein Halogenatom ist; und X Wasserstoff oder ein Alkalimetall ist. Vorzugsweise liegen OX und S(CH&sub2;)n-R in Abhängigkeit von den jeweiligen Assaybedingungen in ortho- oder para-Stellung zueinander.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung einen Assay mit Peroxidase-Enzym, 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder einem Derivat davon, der die obige Chemolumineszenzreaktion umfaßt, insbesondere einen Immunassay in Verbindung mit diesem Assay. Der Nachweis durch den Assay kann wahlweise qualitativ oder quantitativ sein.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Assayset, umfassend ein Phenolderivat der allgemeinen Formel (1), ein Oxidans und zumindest ein 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder ein Derivat davon und eine Peroxidase.
In der Chemolumineszenzreaktion der Erfindung, die durch Verwendung des Phenolderivats der allgemeinen Formel (1) gesteigert wird, wird die Lichtemission im Vergleich zur Nicht-Verwendung eines Phenolderivats deutlich erhöht.
Es folgt eine Beschreibung spezifischer, in der Erfindung verwendeter Komponenten.
Als erstes werden Substanzen mit (a) einem Phenolderivat, (b) einem 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion oder einem Derivat davon, (c) einem Peroxidase-Enzym und (d) einem Oxidans, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, ausführlich beschrieben.
Beispiele für das Phenolderivat (a) der allgemeinen Formel (1), das als Verstärker der Lumineszenzreaktion eingesetzt wird, sind: (4-Benzylthio)phenol, (4-Fluorbenzylthio)phenol, (4-Iodbenzylthio)phenol, (4-Chlorbenzylthio)phenol, (4-Brombenzylthio)phenol, (4-Methylthio)phenol, (4-Cyanomethylthio)phenol, (4-Cyanoethylthio)phenol, (4-Cyanopropylthio)phenol, (4-Cyanobutylthio)phenol, (4-Cyanopentylthio)phenol, (4- Morpholinomethylthio)phenol, (4-Aminomethylthio)phenol, (4-Nitromethylthio)phenol, (4-Hydroxyphenylthio)essigsäure, (4-Hydroxyphenylthio)acetaldehyd, (4-Hydroxyphenylthio)acetamid, (4-Allylthio)phenol, 4-Cyanomethylthio-2-fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-chlorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-bromphenol, 4-Cyanomethylthio-2-iodphenol sowie die Natrium- und Kaliumsalze aller dieser Substanzen. Davon werden (4-Benzylthio)phenol, (4-Methylthio)phenol, (4-Cyanomethylthio)phenol, (4- Morpholinomethylthio)phenol, 4-Cyanomethylthio-2-fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2- chlorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-bromphenol und 4-Cyanomethylthio-2-iodphenol sowie die Natrium- und Kaliumsalze aller dieser Substanzen bevorzugt. Am meisten werden (4-Cyanomethylthio)phenol, 4-Cyanomethylthio-2-fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-chlorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-bromphenol sowie die Natrium- und Kaliumsalze aller dieser Substanzen bevorzugt.
Das in der Erfindung verwendete 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder dessen Derivat (b) kann die folgende allgemeine Formel (2) aufweisen:
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; jeweils ein Wasserstoffatom, eine gegebenenfalls unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppe, eine gegebenenfalls unsubstituierte oder substituierte C&sub1;-C&sub6;-Alkenylgruppe, eine Hydroxyl-, C&sub1;-C&sub6;-Alkoxy-, Carboxyl-, Aminooder eine substituierte Aminogruppe sind. Vorzugsweise ist zumindest eines von R&sub1; oder R&sub2; in Abhängigkeit von den jeweiligen Assaybedingungen eine Amino- oder substituierte Aminogruppe (einschließlich von Amido).
Von den obigen Verbindungen werden Luminol, Isoluminol, N-Aminohexyl-N- ethylisoluminol (nachstehend mit AHEI abgekürzt) und N-Aminobutyl-N-ethylisoluminol (nachstehend mit ABEI abgekürzt). Am meisten wird Luminol bevorzugt.
Das 2,3-Dihydro-1,4-Phthalazindion oder dessen Derivat (b), das im Assay der Erfindung verwendet wird, kann je nach Art des Assays in einer an einen Liganden, wie z.B. ein Antigen, einen Antikörper, ein Hapten, Protein A, Avidin und Biotin, gebundenen Form oder in freier Form eingesetzt werden. Im ersteren Fall sind Antigene und Antikörper bevorzugte Liganden. Der Ligand kann direkt oder über ein Kupplungsmittel an das 2,3- Dihydro-1,4-phthalazindion oder dessen Derivat (b) gebunden sein. Als Kupplungsmittel kann beispielsweise herkömmliches N-(m-Maleimidobenzoyloxy)succinimid (MBS) verwendet werden. (T. Kitagawa et al., J. Biol. Chem. Bd. 79, S. 233-236 (1976)). Da die Photonen-Quantenausbeute von an einen Liganden gebundenem Luminol oder Isoluminol verringert ist, wird vorzugsweise AHEI oder ABEI verwendet.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Peroxidase-Enzym (c) umfaßt aus z.B. Meerrettich, Milch oder Leukozyten extrahierte Peroxidase. Ein aus Meerrettich extrahiertes Peroxidase-Enzym wird bevorzugt.
Ein geeignetes Peroxidase-Enzym (c), das beim luminometrischen Assay der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommt, kann je nach Art des Assays entweder an einen Liganden, wie z.B. ein Antigen, einen Antikörper, ein Hapten, Protein A, Abizin und Biotin, gebunden sein oder frei vorliegen. Im ersten Fall ist ein Antigen ein bevorzugter Ligand. Der Ligand kann direkt oder über ein Kupplungsmittel an das Peroxidase-Enzym gebunden sein. Ein bevorzugtes Kupplungsmittel ist das allgemein bekannte N-(m-Maleimidobenzoyloxy)succinimid (MBS).
Ein geeignetes, in der vorliegenden Erfindung verwendetes Oxidans (d) ist z.B. Wasserstoffperoxid, Natriumperborat und Kaliumperborat, wovon Wasserstoffperoxid bevorzugt wird.
Dem Assay der Erfindung können im Bedarfsfall ein Tensid, Rinderserum-Albumin, Casein, Gelatine und dergleichen hinzugefiigt werden.
Es folgt eine ausführliche Beschreibung der Durchführungsbedingungen der Erfindung.
Die erfindungsgemäße Lumineszenzreaktion erfolgt vorzugsweise unter mäßigen Bedingungen, d.h. bei Temperaturen von 5-50ºC und einem pH-Wert von mehr als 6, insbesondere bei 10-50ºC und einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 11. Geeignete Pufferlösungen, die für das Verfahren der Erfindung in Frage kommen, sind alle Puffer, die im obigen Bereich liegen. Davon werden Phosphatpuffer, Glycin/NaOH-Puffer, Tris/HCl-Puffer, Tris/Essigsäure-Puffer, Carbonatpuffer, Barbitalpuffer und Boratpuffer bevorzugt. Die Konzentration des obigen Puffers reicht vorzugsweise von 1 bis 1000 mMol/l.
Die Konzentrationen von Reaktanden, die in einer Lumineszenzreaktion oder einem luminometrischen Assay verwendet werden können, ausschließlich der zu prüfenden Substanzen, werden im allgemeinen konstant gehalten. Die Konzentration des jeweiligen Reaktanden hängt von der Lumineszenzreaktion, dem Ziel des Assays, dem Verfahren und den Bedingungen ab. Im allgemeinen sind geeignete Konzentrationen für die Lumineszenzreaktion oder den luminometrischen Assay wie folgt: für das Phenolderivat (a) der allgemeinen Formel (1) vorzugsweise 10&supmin;&sup4; bis 1 (g/dl); für das 2,3- Dihydro-1,4-Phthalazindion oder dessen Derivat (b) vorzugsweise 100 nMol/l bis 1 Mol/l; für die Peroxidase (c) vorzugsweise 1 ng/l bis 5.000 mg/l; und für das Oxidans (d) vorzugsweise 100 nMol/l bis 1 Mol/l.
Es folgt eine ausführliche Beschreibung luminometrischer Assays, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist. Das emittierte Licht kann mittels eines herkömmlichen Luminometers quantifiziert werden (z.B. eines Luminescence Readers von Alka Co.).
Da es zwei Arten von Immunassays gibt, nämlich homogene und heterogene, ist der luminometrische Assay der Erfindung auf beide anwendbar. Es folgt eine Beschreibung des homogenen und des heterogenen Immunassays, auf die der luminometrische Assay der Erfindung anwendbar ist.
Beispielsweise wird in einem homogenen Immunassay entweder 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion oder dessen Derivat (b) oder ein Peroxidase-Enzym (c), die beide vorzugsweise in einem Assayset der vorliegenden. Erfindung enthalten sind, in ein Liposom eingeschlossen und ein Ligand, wie z.B. ein Antigen, Antikörper, Hapten, Protein A, Avidin und Biotin, auf der Oberfläche dieses Liposoms immobilisiert. Eine Antigen-Antikörper-Reaktion kann dann zwischen dem Liganden in der Probe und der Immunsubstanz erfolgen, die auf die Oberfläche des Liposoms immobilisiert wird; in der Folge wird die Menge der Peroxidase oder des Luminols aus dem Liposom unter Durchführung eines luminometrischen Assays quantifiziert, der ein Phenolderivat (a) der allgemeinen Formel (1) und ein Oxidans (d) umfaßt; auf diese Weise kann der Ligand in der Probe untersucht werden.
Die andere Art von Immunassay, der heterogene Immunassay, ist ein Verfahren, das allgemein für Routineanalysen in Versuchslaboratorien angewandt und grob gesprochen in zwei Kategorien aufgeteilt wird: (1) den heterogenen Zweistellen-Immunassay; (2) den kompetitiven heterogenen Immunassay. Der luminometrische Assay der vorliegenden Erfindung ist auf beide heterogenen Immunassays anwendbar.
Beim heterogenen Zweistellen-Immunassay wird ein Ligand, wie z.B. ein Antigen, Antikörper, Hapten, Protein A, Avidin und Biotin, auf einem Träger, wie z.B. einem Reagenzglas, Glasperlen, Kunststoffperlen, Mikropartikel und dergleichen, immobilisiert, die Probe wird zugegeben, und dann erfolgt darin eine Antigen- Antikörper-Reaktion. Nach dem Entfernen von nicht-umgesetzten Substanzen und der Zugabe von enzymmarkiertem Liganden erfolgt darin eine Antigen-Antikörper-Reaktion mit den zu untersuchenden Substanzen in der Probe, die mit dem Liganden, der im esten Schritt der Reaktion immobilisiert wordem war, umgesetzt und/oder daran gebunden wurde.
Ein heterogener Immunassay unter Anwendung eines heterogenen Zweistellen- Immunassays kann einen herkömmlichen Immunassay vorsehen, umfassend einen Festphasen-Antikörper, wobei ein Antiferritin-Antikörper auf einem aus Polypropylen bestehenden Eprouvetten immobilisiert ist, und einen Antiferritin-Antikörper, der mit Peroxidase markiert ist. Die Enzymaktivität wird durch einen kolorimetrischen Assay mit einem Chromogen, 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat) (ABTS), untersucht und die Konzentration an Ferritin in der Probe durch den Grad dieser Verfärbung gemessen (M.C. Revanet, Clin. Chem., Bd. 29, S. 681 (1983)). Aus der Verwendung eines Phenolderivats der allgemeinen Formel (1) anstelle des Chromogens, von 2,3- Dihydro-1,4-phthalazindion oder dessen Derivats (b) und eines Oxidans (d) resultiert eine verstärkte Lumineszenzreaktion mit stärkerer Lumineszenz. Die Konzentration von Ferritin in der Probe kann durch Quantifizieren des emittierten Lichts präzise und zuverlässig gemessen werden.
Im kompetitiven heterogenen Immunassay hingegen, in dem Antikörper an den Festphasenträger, wie z.B. ein Eprouvetten, Glasperlen, Kunststoffperlen, Mikropartikel und dergleichen, immobilisiert wird, wird eine kompetitive Reaktion der zu untersuchenden Substanz in einer Probe und des enzymmarkierten Antigens für die zu untersuchende Substanz darin ablaufen gelassen. Da die Menge des an den am Festphasenträger immobilisierten Antikörper gebundenen Enzyms umgekehrt proportional zur Menge der Substanz in der zu untersuchenden Probe ist, kann die Menge der zu untersuchenden Substanz in der Probe anhand einer Eichkurve bestimmt werden, die zuvor unter Verwendung einer Standardsubstanz erstellt wird. Im kompetitiven heterogenen Immunassay, der von T. Arakawa et al. (Anal. Biochem. Bd. 97, S. 248 (1974)) detailliert beschrieben wird, wird unter Verwendung von Festphasen- Antigen, wobei Anticortisol-Antigen auf Sepharose 48 immobilisiert ist, und mit einer Peroxidase (c) markiertem Cortisol die Menge der an der festen Phase gebundenen Peroxidase durch eine Lumineszenzreaktion unter Verwendung von Luminol und Wasserstoffperoxid untersucht und somit das Cortisol in der Probe quantifiziert. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Phenolderivat (a) der allgemeinen Formel (1) zu dieser Lumineszenzreaktion zugesetzt, um diese zu verstärken und die Empfindlichkeit der Messung durch Maximieren der Lichtemission zu maximieren, damit das Cortisol in der Probe derartig empfindlich quantifiziert werden kann.
Demzufolge liefert die vorliegende Erfindung ein Assayset zur Verwendung im verstärkten Lumineszenz- oder luminometrischen Assay der vorliegenden Erfindung.
Das Assayset umfaßt vorzugsweise:
(1) ein Phenolderivat (a) der allgemeinen Formel (1)
(2) ein 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder ein Derivat davon (b)
(3) ein Peroxidase-Enzym (c)
(4) ein Oxidans (d).
Das Assayset kann auch andere Additive enthalten, solange diese die beabsichtigte Verwendung nicht beeinträchtigen.
Bevorzugte Kombinationen des Assaysets sind alle der zur Verwendung im Assay bevorzugten obigen Substanzen. In der besonders bevorzugten Ausführungsform des Assaysets ist zumindest eines von Peroxidase-Enzym (c) oder 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion oder dessen Derivat (b) an einen Antikörper gegen die zu untersuchende Substanz gebunden. Das Assayset der Efindung kann jede der obigen Komponenten (1) bis (4) unabhängig voneinander enthalten, oder (1) wird zuvor entweder mit (2), (3) oder (4) vermischt. Gegebenenfalls kann das Assayset auch eine oder mehrere Standardlösungen, die jeweils eine bekannte Menge der zu untersuchenden Substanz umfassen, und/oder eine oder mehrere der bevorzugten Pufferlösungen enthalten. Günstigerweise kann das Assayset ein Reaktionsgefäß umfassen, das sich zur gemeinsamen Verwendung mit der Vorrichtung zur Bestimmung der Lichtemission im Laufe der Durchführung des Assays eignet. Weiters kann günstigerweise eine Mischvorrichtung im Assayset vorgesehen sein, um die Reaktanden zu vermischen.
Es folgt eine Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Abbildungen und Beispiele.
In den Abbildungen ist Fig. 1 ist eine grafische Darstellung eines Lumineszenzmusters von Luminol in Gegenwart von (4-Cyanomethylthio)phenol und somit eine Veranschaulichung der in Beispiel 1 beschriebenen Lumineszenzreaktion als Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung eines Vergleichs der verstärkenden Wirkungen auf die Chemolumineszenz von (4-Cyanomethylthio)phenol, 4-Cyanomethylthio-2- chlorphenol und p-Iodphenol, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung einer Eichkurve für einen Chemolumineszenz-Immunassay und zeigt die AFP-Konzentration.
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung der Korrelation der Ergebnisse des AFP-Assays mittels Chemolumineszenz-Immunassay und chromometrischem Immunassay, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Fig. 5 ist eine grafische Darstellung einer Eichkurve für den Chemolumineszenz- Immunassay und zeigt die T4-Konzentration.
Fig. 6 ist eine grafische Darstellung der Korrelation der Ergebnisse des EIA-Assays mittels Chemolumineszenz-Immunassay der vorliegenden Erfindung und chromometrischem Immunassay, wie in Beispiel 4 beschrieben.

Beispiel 1

Das vorliegende Beispiel zeigt, daß ein Chemolumineszenzverstärker der vorliegenden Erfindung eine Chemolumineszenzreaktion zwischen Luminol, einer gebundenen Form von Meerrettich-Peroxidase und Wasserstoffperoxid fördert und die Lichtemission im Vergleich zur Lumineszenzreaktion in Abwesenheit des Verstärkers und sogar in Gegenwart eines bekannten Verstärkers deutlich erhöht.
Als erstes wurden 0,02 Mol/l (nachstehend mit M bezeichnet) Meerrettich-Peroxidase (Qualität I-C, hergestellt von Toyobo Co., Ltd., Japan) in Phosphatpuffer (pH 7,2) gelöst. Die Konzentration der Peroxidase in der Lösung wurde anhand des Absorptionsvermögens bei 403 nm gemessen und betrug 0,12 mg/ml. Die so erhaltene Lösung wurde mit dem Phosphatpuffer auf 1/10.000 weiter verdünnt.
Danach wurden 0,18 g Luminol (ein Produkt von Tokyo Kasei Co., Ltd., Japan) und jeweils 0,1 g 4-(Cyanomethylthio)phenol, 4-(Cyanoethylthio)phenol, 4-(Benzylthio)phenol, 4-(Methylthio)phenol, 4-(Morpholinomethylthio)phenol, 4-Cyanomethylthio-2- fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-chlorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-bromphenol, 4- Cyanomethylthio-2-iodphenol sowie p-Iodphenol als Vergleich in 1 Liter Tris/Hydrochlorid-Puffer (0,1 M, pH 8,5) gelöst, um eine Stammlösung zu erhalten.
Als Oxidans wurde Wasserstoffperoxid verwendet. 200 µl 35%-iges Wasserstoffperoxid wurden in 11 Tris/Hydrochlorid-Puffer (0,1 M, pH 8,5) gelöst, um eine Stammlösung zu erhalten.
Ein Lumineszenszablesegerät (BLR-201, hergestellt von Aloca Co., Ltd.) diente zur Messung der Lichtintensität. Die wie oben beschrieben hergestellte Peroxidase-Lösung (die 1,2 ng Peroxidase enthielt) wurde zu jeweils 100 µl in Eprouvetten aus Glas mit den Abmessungen 12 x 75 mm gefüllt. Die Eprouvetten wurden in Probenhalter des Lumineszenzablesegeräts gestellt. Dann wurden 250 µl Luminol-Lösung, die den jeweiligen Verstärker enthielt, in die jeweiligen Eprouvetten eingefüllt. Schließlich wurden jeweils 250 µl Wasserstoffperoxid-Lösung in die Eprouvetten gefüllt, wodurch die Reaktion ausgelöst wurde (Reaktionstemperatur 30ºC).
In gleicher Weise wurde ein Blindversuch, ein Versuch in Abwesenheit des Verstärkers und ein Vergleichsversuch mit p-Iodphenol als Verstärker durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 veranschaulicht. Tabelle 1
Anmerkungen: POD = Meerrettich-Peroxidase; Dimension: 10³ Counts
Die in Tabelle 1 angeführten Werte (x 10³ Counts) wurden durch Integrieren der Lichtemission für eine Minute ab dem Zusatz von Wasserstoffperoxid erhalten. Ein Lumineszenzmuster, das durch Messungen alle drei Sekunden nach Zugabe von 4- (Cyanomethylthio)phenol als Verstärker erhalten wurde, ist in Fig. 1 dargestellt. Dieses Muster wurde etwa 15 Sekunden nach dem Zusatz von Wasserstoffperoxid konstant.

Beispiel2

In diesem Beispiel wurden Vergleiche der optimalen Konzentrationen zwischen den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verstärkern, wie z.B. zwischen 4- (Cyanomethylthio)phenol, 4-Cyanomethylthio-2-fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2- chlorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-bromphenol und 4-Cyanomethylthio-2-iodphenol, sowie einem herkömmlichen Verstärker wie etwa p-Iodphenol angestellt.
Als erstes wurden 0,18 g Luminol (Tokyo Kasei Co.) in 1l Tris/Hydrochlorid-Puffer (0,1 M, pH 8,5) gelöst. Dann wurden jeweils 4-(Cyanomethylthio)phenol, 4- Cyanomethylthio-2-fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-chlorphenol, 4-Cyanomethylthio- 2-bromphenol und 4-Cyanomethylthio-2-iodphenol sowie p-Iodphenol in der so erhaltenen Lösung derartig gelöst, daß die Konzentation jeweils 0,1 g/dl, 0,05 g/dl, 0,01 g/dl, 0,005 g/dl und 0,001 g/dl betrug, um Stammlösungen zu erhalten.
Das Lumineszenzablesegerät (Alkca Co.; BLR-201) diente zur Messung der Lichtintensität. jeweils 100 µl der wie oben beschrieben hergestellten Peroxidase- Lösung (die 1,2 ng Peroxidase enthielt) wurden in Eprouvetten aus Glas mit den Dimensionen 12 x 75 mm eingefüllt. Die Eprouvetten wurden in Probenhalter des Lumineszenzablesegeräts gestellt. Dann wurden 250 µl Luminol-Lösung mit dem Verstärker in jeder Konzentration in die jeweiligen Eprouvetten gefüllt. Schließlich wurden jeweils 250 µl Wasserstoffperoxid-Lösung in die Eprouvetten eingefüllt, was die Reaktion auslöste (Reaktionstemperatur: 30ºC).
Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 ersichtlich.
Die in Tabelle 2 aufgelisteten Werte (x 10³ Counts) wurden durch Integration der Lichtemission über einer Minute ab dem Einfüllen des Wasserstoffperoxids erhalten. Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen den jeweiligen Konzentrationen der Verstärker und der Blindwerte für die Lichtintensität. Diese Ergebnisse zeigen, daß das gemäß vorliegender Erfindung verwendete 4-(Cyanomethylthio)phenol eine noch bessere Leistung (Lichtemission sowie Verhältnis von Lichtemission zum Blindwert) aufwies als das p- Iodphenol nach dem Stand der Technik, selbst wenn die Konzentration des 4(Cyanomethylthio)phenols nur 1/10 jener von p-Iodphenol betrug. Außerdem zeigten 4- Cyanomethylthio-2-fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-chlorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-bromphenol und 4-Cyanomethylthio-2-iodphenol im Vergleich zu p-Iodphenol eine ausgezeichnete Leistung, selbst wenn die Konzentrationen der obigen in der vorliegenden Erfindung verwendeten Phenole die gleichen waren wie jene von p- Iodphenol. Tabelle 2
Anmerkungen: Dimension; 10³ Counts
1; Lichtmesser POD 1,2 ng
2; Lichtmesser POD 0 ng (blank)
1/2; Verhältnis zwischen Lichtemission und Blindwert

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Messung von α-Phetoprotein (nachstehend als AFP bezeichnet) mittels eines Zweistellen-Chemolumineszenzassays, worin 4-(Cyanomethylthio)phenol als Lumineszenzverstärker verwendet wird und ein Festphasen-Antikörper, ein mit Peroxidase markierter Antikörper, Luminol und Wasserstoffperoxid kombiniert werden.

(1) Immobilisierung von Anti-AFP-Antikörper auf Eprouvetten:

Ein Anti-AFP-Antikörper (eines Hasen; hergestellt von Dako Co., Ltd.) wurde mit 100 µg/ml in Carbonatpuffer (0,02 M, pH 9,5) gelöst. Der den Anti-AFP-Antikörper enthaltende Carbonatpuffer wurde zu jeweils 500 µl in Eprouvetten aus Poylstyrol mit den Dimensionen 12 x 75 mm (ein Produkt von Nunk Co., Ltd.) gefüllt und 48 Stunden lang bei 4ºC reagieren gelassen, um dadurch die Antikörper an den Innenwänden der Eprouvetten zu immobilisieren. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Flüssigkeit in den Eprouvetten mittels eines Aspirators entfernt. Die Eprouvetten wurden dreimal mit 1 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Dann wurde 1 ml Phosphatpuffer (0,02 M, pH 7,2) mit 1% Rinderserumalbumin (nachstehend als BSA bezeichnet) zu jeder Eprouvette zugegeben und bis zum Gebrauch bei 4ºC gehalten.

(2) Herstellung von enzymmarkiertem Anti-AFP-Antikörper

Mit Anti-AFP-Antikörper markierte Peroxidase wurde aus Meerrettich-Peroxidase (Toyobo Co.; I-C) und Anti-AFP-Antikörper (von Hasen, hergestellt von Dako Co., Ltd.) mittels des Periodat-Oxidationsverfahrens gebildet (Nakane et al; J. Histochem. Cytochem., Bd. 22, S. 1084 (1974)).

(3) Messung von AFP im Blut

(i) Enzymmarkierte Antikörperlösung

Der unter (2) erhaltene, mit Peroxidase markierte Anti-AFP-Antikörper wurde mit Phosphatpuffer (0,02 M, pH 7.2), der 1% BSA enthielt, verdünnt, um in einer für die Messung erforderlichen Konzentration vorzuliegen.

(ii) Standardlösung

Gereinigtes menschliches AFP wurde mit Phosphatpuffer (0,02 M, pH 7,2), der 1 % BSA enthielt, so verdünnt, daß die Konzentration einen Wert von jeweils 20 ng/ml, 80 ng/ml, 320 ng/ml und 640 ng/ml erreichte.

(iii) Meßverfahren

Die in die unter (1) hergestellten Eprouvetten mit immobilisierten Antikörpern an den Innenwänden eingefüllte Lösung wurde mittels eines Aspirators entfernt. Die Eprouvetten wurden mit 1 ml physiologischer Salzlösung einmal gewaschen. Dann wurden 30 µl Standardlösung oder Probe (Serum oder Plasma) in die gewaschenen Eprouvetten eingebracht. 500 µl Phosphatpuffer (0,02 M, pH 7,2) mit 1 % BSA wurde zur Standardlösung oder Probe in den Eprouvetten zugegeben und sorgfältig gerührt, gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei 37ºC.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslöung mittels eines Aspirators entfernt. Danach wurden die Eprouvetten erneut mit 1 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Dieselbe Vorgangsweise wurde deimal wiederholt, um verschiedene Serumkomponenten in der Probe zu entfernen.
Als nächstes wurden 500 µl der unter (i) gebildeten enzymmarkierten Anti-AFP- Antikörper-Lösung in die Eprouvetten gefüllt und sorgfältig gerührt, gefolgt von 30minütiger Inkubation bei 37ºC. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung mittels eines Aspirators entfernt. Die Eprouvetten wurden erneut mit 1 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Diese Vorgangsweise wurde dreimal wiederholt, um nichtumgesetzten enzymmarkierten Anti-AFP-Antikörper zu entfernen.
Die wie oben beschrieben gewaschenen Eprouvetten wurden in die Probenhalter des Lumineszenzablesegeräts eingesetzt. Anschließend wurden 250 µl Luminol-Lösung mit 4-(Cyanomethylthio)phenol und 250 µl des in Beispiel 1 hergestellten Wasserstoffperoxids in die jeweiligen Eprouvetten gefüllt, woraufhin die Chemolumineszenzreaktion erfolgte. Die Meßwerte wurden durch Integration der Lichtemission über eine Minute erhalten.
Die Lichtemission bei jeder Konzentration der Standardlösung bei deren Einsatz als Probe ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Die AFP-Konzentration wurde aus einer Eichkurve (Fig. 3) abgelesen, die durch Auftragen der Lichtemission bei jeder Konzentration der Standardlösung erstellt wurde.
Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen der AFP-Konzentration, die durch Messen der Probe nach dem Verfahren dieses Beispiels erhalten wurde, und der AFP-Konzentration, die durch Messen der Probe gemäß dem chromometrischen EIA (Enzym-Immunassay) unter Verwendung des mit Peroxidase markierten Anti-AFP-Antikörpers erhalten wurde.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt die Quantifizierung von Thyroxin (T4) mittels eines Chemolumineszenzassays, wobei 4-(Cyanomethylthio)phenol als Lumineszenzverstärker verwendet wird und ein Festphasen-Antikörper, ein mit Peroxidase markiertes Antigen, Luminol und Wasserstoffperoxid kombiniert werden.

(1) Immobilisierung von Anti-T4-Antikörper auf Eprouvetten:

Anti-T4-Antikörper (aus Hasen, hergestellt von Kallestad Co., Ltd.) wurde an den Innenwänden der Eprouvetten in gleicher Weise wie in Beispiel 3 immobilisiert.

(2) Herstellung von enzymmarkiertem Antigen (T4):

Mit Peroxidase markiertes T4 wurde aus Meerrettich-Peroxidase (Toyobo Co.; I-C) und T4 (Calbiochemistry Co., Ltd.) nach dem Glutaraldehyd-Verfahren (Abrameas; Immunochemistry, Bd. 6, S. 43 (1969)) gebildet.

(i) Enzymmarkierte Antigenlösung

Das unter (2) erhaltene, mit Peroxidase markierte Antigen (T4) wurde mit Barbitalpuffer (0,1 M, pH 8,6), der 1% BSA und 0,04% 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäureammoniumsalz enthielt, verdünnt, um in einer für die Messung erforderlichen Konzentration vorzuliegen.

(ii) Standardlösung

T4 (Calbiochemistry Co.) wurde zu T3- und T4-freiem Serum, das durch Behandlung von menschlichem Serum mit Aktivkohle erhalten wurde, so zugegeben, daß die Konzentration gemäß dem Verfahren von Miyai et al. (Miyai et al; Endocrinol. Japan, Bd. 27, S. 375 (1980)) Werte von 2,0 µg/dl, 6,0 µg/dl, 12,0 µg/dl und 24,0 µg/dl erreichte.

(iii) Meßverfahren

Die Eprouvetten wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 3 gewaschen. Danach wurden 20 µl Standardlösung oder Probe (Serum oder Plasma) in die gewaschenen Eprouvetten eingebracht. 500 µl enzymmarkierte Antigenlösung wurden zur Standardlösung oder Probe in den Eprouvetten zugegeben und sorgfältig gerührt, gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei 37ºC.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung mittels eines Aspirators entfernt. Als nächstes wurden die Eprouvetten erneut mit 1 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Dieselbe Vorgangsweise wurde dreimal wiederholt, um verschiedene Serumkomponenten in der Probe und nichtumgesetztes enzymmarkiertes Antigen (T4) zu entfernen.
Die wie oben beschrieben gewaschenen Eprouvetten wurden in die Probenhalter des Lumineszenzablesegeräts eingesetzt. Die Chemolumineszenz-Reaktion erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 3. Die Meßwerte wurden durch Integration der Lichtemission über eine Minute erhalten.
Die Lichtemission bei jeder Konzentration der Standardlösung bei deren Verwendung als Probe ist aus Tabelle 4 ersichtlich. Tabelle 4
Die T4-Konzentration in der Probe (Serum oder Plasma) wurde anhand einer Eichkurve (Fig. 5) abgelesen, die durch Auftragen der Lichtemission bei jeder Konzentration der Standardlösung erstellt wurde.
Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen der T4-Konzentration, die durch Messen der Probe gemäß dem Verfahren dieses Beispiels erhalten wurde, und der T4-Konzentration, die durch Messen der Probe gemäß dem chomometrischen EIA unter Verwendung des mit Peroxidase markierten Antigens (T4) erhalten wurde.

Claims

1. Verfahren zum Verstärken einer Lumineszenzreaktion, an der 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion oder sein Derivat, ein Peroxidase-Enzym und ein Oxidans beteiligt sind, welches Verfahren die Durchführung der Reaktion in Gegenwart eines Verstärkers umfaßt, der ein Phenolderivat ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenolderivat die allgemeine Formel (1)

besitzt, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 5 darstellt; R ein Wasserstoffatom oder eine Cyano-, Morpholino-, Carbonsäure-, C&sub2;&submin;&sub7;-Alkoxycarbonyl-, Metallcarboxylat-, Amido-, Aldehyd- oder Allylgruppe ist; oder eine Phenylgruppe ist, die gegebenenfalls durch ein Halogenatom substituiert ist; A ein Wasserstoff- oder Halogenatom ist; X Wasserstoff oder Alkalimetall ist; und OX und S(CH&sub2;)n-R sich gegebenenfalls relativ zueinander in ortho- oder para-Position befinden.

2. Luminometrischer Assay, an dem eine durch ein Verfahren nach Anspruch 1 verstärkte Lumineszenzreaktion beteiligt ist.

3. Luminometrischer Assay nach Anspruch 2, worin zumindest eines von Peroxidase und 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder seinem Derivat als Assayreagens verwendet wird bzw. werden.

4. Luminometrischer Assay nach Anspruch 2, umfassend das Nachweisen der Gegenwart einer Peroxidase.

5. Luminometrischer Assay nach Anspruch 2, umfassend das Nachweisen der Gegenwart eines 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindions oder seines Derivats.

6. Luminometrischer Assay nach einem der Ansprüche 2 bis 5, worin eines von 2,3- Dihydro-1,4-phthalazindion oder seinem Derivat und Peroxidase in einer an Liganden gekuppelten Form vorliegt.

7. Luminometrischer Assay nach Anspruch 6, worin der Ligand ein Antigen, Antikörper, Hapten, Protein A, Avidin oder Biotin ist.

8. Luminometrischer Assay nach einem der Ansprüche 2 bis 7, worin das 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder sein Derivat Luminol, N-Aminohexyl-N-ethylisoluminol oder N-Aminobutyl-N-ethylisoluminol ist.

9. Luminometrischer Assay nach einem der Ansprüche 2 bis 8, worin das Phenolderivat (4-Benzylthio)phenol, (4-Methylthio)phenol, (4-Cyanomethylthio)phenol, (4-Morpholinomethylthio)phenol, 4-Cyanomethylthio-2-fluorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-chlorphenol, 4-Cyanomethylthio-2-bromphenol oder 4-Cyanomethylthio-2-iodphenol ist.

10. Luminometrischer Assay nach Anspruch 9, worin das Phenolderivat (4- Cyanomethylthio)phenol ist.

11. Luminometrischer Assay nach einem der Ansprüche 2 bis 10, worin das Peroxidase- Enzym eine Meerrettich-Peroxidase ist.

12. Luminometrischer Assay nach einem der Ansprüche 2 bis 11, worin das Oxidans Wasserstoffperoxid oder Perborat ist.

13. Set zur Verwendung bei einem Lumineszenz- oder luminometrischen Assay, umfassend ein Phenolderivat der in Anspruch 1 definierten allgemeinen Formel (1), ein Oxidans und zumindest eines von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder seinem Derivat und einem Peroxidase-Enzym.

14. Set nach Anspruch 13, umfassend das Phenolderivat, das Oxidans, das 2,3-Dihydro- 1,4-phthalazindion oder sein Derivat und das Peroxidase-Enzym.

15. Set nach Anspruch 13 oder 14, worin eines von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder seinem Derivat oder Peroxidase mit einem Liganden gekuppelt ist.

16. Set nach Anspruch 14, worin der Ligand ein Antigen, Antikörper, Hapten, Protein A, Avidin oder Biotin ist.

17. Set nach einem der Ansprüche 13 bis 16, worin das 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder sein Derivat Luminol, N-Aminohexyl-N-ethylisoluminol oder N-Aminobutyl-N- ethylisoluminol ist.

18. Set nach einem der Ansprüche 13 bis 14, worin das Phenolderivat (4- Cyanomethylthio)phenol ist.

19. Set nach einem der Ansprüche 13 bis 18, worin das Peroxidase-Enzym Meerrettich- Peroxidase ist.

20. Set nach einem der Ansprüche 13 bis 19, worin das Oxidans Wasserstoffperoxid oder Perborat ist.

21. Verwendung eines Phenolderivats zur Verstärkung einer Lumineszenzreaktion, an der 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion oder sein Derivat, ein Peroxidase-Enzym und ein Oxidans beteiligt sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Phenolderivat die allgemeine Formel (1)

aufweist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; R ein Wasserstoffatom oder eine Cyano-, Morpholino-, Carbonsäure-, C&sub2;&submin;&sub7;-Alkoxycarbonyl-, Metallcarboxylat-, Amido-, Aldehyd- oder Allylgruppe ist; oder eine Phenylgruppe ist, die gegebenenfalls durch ein Halogenatom substituiert ist; A ein Wasserstoffatom oder ein Halogenatom ist; X ein Wasserstoff oder Alkalimetall ist; und OX und S(CH&sub2;)n-R sich gegebenenfalls relativ zueinander in ortho- oder para-Position befinden.