DE3039157A1

DE3039157A1 - Markiertes konjugat fuer immunologische bestimmungen

Info

Publication number: DE3039157A1
Application number: DE19803039157
Authority: DE
Inventors: Peter Salvatore 06905 Stamford Forgione; William Arthur 06903 Stamford Henderson jun.
Original assignee: Fisher Scientific Co 15219 Pittsburgh Pa; Fisher Scientific Co LLC
Current assignee: Allied Corp
Priority date: 1979-10-17
Filing date: 1980-10-16
Publication date: 1981-08-27
Also published as: FR2468125B1; JPS5696249A; GB2063469A; GB2063469B; CA1135620A; FR2468125A1

Description

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Beschreibung

Markiertes Kon.jugat für immunologische Bestimmungen

Die Erfindung betrifft ein Konjugat zum Nachweis und zur Bestimmung von Antikörpern und Antigenen in Körperflüssigkeiten durch immunologische Bestimmungsverfahren (Immunoassays) und immunologische Bestimmungsverfahren mit Hilfe von Chemilumineszenz unter Verwendung des Konjugats. Das Konjugat ist im Stande mit einem Antigen oder einem Antikörper oder beiden zu reagieren und umfaßt eine Markierung (tag) die im Stande ist_/eine Chemiluminszenz-Reaktion zu katalysieren. Das Konjugat kann ein Antikörper oder ein Antigen SeIn₁ an das bzw. den ein Metallporphyrin als Markierung gebunden ist _f und umfaßt vorzugsweise Immunoglobulin,an das Hämoglobulin gebunden ist.

Die Erfindung bezieht sich auf immunologische Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antikörpern und Antigenen (einschließlich Haptenen) und anderen Substanzen, die in geringen Mengen in Körperflüssigkeiten vorhanden sind. Insbesondere betrifft es Chem !Lumineszenz-immunologische-Bestimmungsverfahren sowie ein neues Konjugat, das bei diesen Verfahren angewandt werden kann.

Es sind verschiedene Testsysteme zum Nachweis und zur Bestimmung von Antikörpern, Antigenen und anderen Substanzen^ die in geringen Mengen in Körperflüssigkeiten vorhanden sind, bekannt. Die empfindlichsten Verfahren sind die immunologischen Bestimmungen oder Immunoassays, die die Tatsache ausnutzen, daß ein Antikörper spezifische Bindungen mit dem Antigen eingeht und diese Reaktion folgt dem Massenwirkungsgesetz, Ab + Ag AbAg.

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Zur Zeit werden verschiedene Immunoassay-Verfahren angewandt, die nach ihren Bindungscharakteristika eingeteilt werden. Die bekanntesten sind die Konkurrenz-bzw. Kompetitiv-Verfahren und die Sandwich-Verfahren. Unabhängig von dem angewandten Verfahren muß in jedem Falle ein markiertes Konjugat zum Nachweis angewandt werden. Die am häufigsten angewandten Markierungen sind Radioisotopen und dieses Verfiiren wird als Radioimmunoassay (RIA) bezeichnet. Andere Verfahren, bei denen unterschiedliche Markierungen angewandt werden sind Enzym-Immunoassays (EIA) und Fluoreszenz-Immunoassays (FIA).

Radioimmunoassays unter Verwendung der radioaktiven Isotopen ¹²⁵J, ¹⁴C oder ³H sind zur Zeit hauptsächlich auf dem Markt

aufgrund ihrer außerordentlich hohen Empfindlichkeit, d.h. der

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Möglichkeit 10 mol oder darunter Antigen oder Antikörper nachzuweisen. Trotz ihrer hohen Empfindlichkeit besitzen RIA die folgenden Nachteile: 1. Die Zähl vorrichtungen für 13-und ^-Strahlung zur Auswertung der Systeme sind teuer und erfordern eine aufwendige Überwachung durch hoch ausgebildetes Bedienungspersonal; 2. Das Aufsichtspersonal muß gut ausgebildet bzw. erfahren sein und eine spezielle Zulassung für die Arbeit mit Radioisotopen besitzen; 3. Aufgrund der dabei auftretenden Radioaktivität sind RIAs in verschiedenen Ländern verboten;

4. Die hohe Radioaktivität, die erforderlich ist, um angemessene Signale zu erhalten, erfordert die Anwendung von Isotopen mit kurzer Halbwertszeit (short-lived isotopes) wodurch die markierten Verbindungen häufig neu hergestellt werden müssen und

5. Die kurzen Halbwertszeiten bedeuten, daß sich das Verhältnis des ausgesandten Signals zu der Konzentration an Markierungssubstanz kontinuierlich und verhältnismäßig schnell ändert und damit für jede Bestimmung eine neue Eichkurve erforderlich wird.

Enzym-Immunoassays erfordern die Anwendung von komplexen biologischen Substanzen, die ihre ursprüngliche Aktivität beibehalten. Die Verfahren selbst sind zeitraubend aufgrund des langsamen Ablaufs der Nachweisreaktion und führen nicht immer zu den erforderlichen hohen Empfindlichkeiten.

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Fluoreszenzsysteme besitzen eine etwas geringere Empfindlichkeit als Radioimmunoassay-Systeme und erfordern längere Inkubationszeiten. Außerdem treten häufig hohe und verschiedene Werte für Blindproben auf. Chemilumineszenz bezeichnet Licht, das direkt aufgrund einer chemischen Änderung bzw. chemischen Reaktion gebildet wird. Sie umfaßt die Umwandlung von freier Energie einer chemischen Reaktion in Lichtenergie. Die chemische Reaktion muß ausreichend Energie freisetzen, um einen angeregten Zustand (des Atoms bzw. Moleküls) zu erreichen. Die Reaktionsfolge muß die Bildung eines Produktes im angeregten Zustand begünstigen und dieses Produkt muß im Stande sein selbst ein Photon zu emittieren, um seine Energie auf ein anderes Molekül zu übertragen, das emittieren (Licht aussenden) kann.

Eine bekannte sehr wirksame Chemilumineszenz-Reaktion ist die Oxidation von Luminol (5-Amino-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion) in basischer Lösung. Das am häufigsten angewandte Oxidationsmittel ist Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines Katalysators wie Fe(CN)g~^, Cu(Il), und Co(Il). Andere Oxidantien sind unter anderem Perborat, Hypochlorit, Jod, Permanganat und Sauerstoff.

Chemiluminszenz wurde bereits für Immunoassays angewandt. In der US-PS 4 104 029 ist ein Verfahren zur Bestimmung von pharmakologisch, immunologisch und biochemisch wirksamen Verbindungen in biologischen Flüssigkeiten angegeben, bei dem ein Ligand mit einer chemiluminszierenden Substanz wie Luminol markiert wird. Außerdem ist bekannt, daß Eisen und speziell Eisenprotoprophyrin-Verbindungen mit Luminol in Gegenwart von Wasserstoffperoxid oder Natriumperborat und einer Base unter Bildung einer angeregten Verbindung reagieren, die stark Licht aussendet (Ewetz und Thöre's Facotrs Affecting the Specificity of the Luminol Reaction with Hematin Compounds, Analytical Biochemistry, 71, 564-570 (1976)).

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles^ empfindliches und genaues immunologisches Bestimmungsverfahren für Anti·

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"gene und" Antikörper' zu entwickeln, bei dem die mit Radioisotopen verbundenen Gefahren nicht auftreten und kein besonders geschultes Personal und keine speziellen Einrichtungen zum Arbeiten mit Radioisotopen erforderlich sind. Es soll mit Hilfe einfacher Vorrichtungen und Instrumente durchgeführt werden können und schnell mit hoher Empfindlichkeit (bis zu 10 mol) die gewünschten Ergebnisse liefern. Das markierte Immunoreagenz soll eine lange Lebensdauer besitzen_tnicht teuer und leicht zugänglich sein. Außerdem soll das Verfahren auf zahlreiche unterschiedliche Bestimmungen angewandt werden können.

Die Erfindung betrifft ein Konjugat, das bei einem Immunoassay-Verfahren angewandt wird und das durch Chemiluminszenz nachweisbar ist. Dieses Konjugat umfaßt eine immunologisch aktive Verbindung· an die ein Metallporphyr in als Markierung gebunden ist. Irgendein Antikörper oder Bindungspartner für einen Antikörper wie Antigen oder Hapten kann als immunologisch wirksame Verbindung angewandt werden. Besonders günstig sind Antikörper, die in Tierarten wie Ziegen oder Kaninchen gebildet worden sind. Antigene wie Hormone und Blutplasmaproteine sowie Haptene können angewandt werden. Besonders günstig ist Immunoglobulin und besonders IgG aufgrund seiner guten Verfügbarkeit und da es sowohl als Antigen als auch als Antikörper wirken kann. Antigene, die von Natur aus Eisenporphyrin enthalten, wie Hämoglobin, Myoglobin und Cytochrom C können insgesamt als Konjugat angewandt werden,ι Da die Markierungssubstanz mehr als Katalysator als als Reaktionpartner wirkt, führt jedes Molekül Markierungssubstanz zur Bildung einer Vielzahl von Photonen während Luminol als Markierungs substanz nur zur Bildung eines einzigen Photons führt. Hierdurch treten zwei Vorteile auf, d.hu die Empfindlichkeit wird größer dund die Emission wird verlängert.

Die Metallporphyrin-Markierung kann

ein Molekül sein, das ein Metallporphyrin enthält und besonders ein Protein, das Eisenporphyrin enthält. Sie kann auch

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Eisenporphyrin selbst" seih, ·-Wie"-Hämin. Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrom C und Katalase sind besonders geeignet.

Die" Metallporphyr inniärkierung wird an das Antigen oder den Antikörper mit Hilfe bekannter zweiwertiger Bindungssubstanzen wie Cyanursäurechlorid, Acrylylchlrid und/oder GIutaraldehyd gebunden.

Das Konjugat kann für verschiedene Immunoassay-Verfahren angewandt werden, um die Konzentration einer Substanz in einer Probe zu bestimmen. Typischer Weise werden bei derartigen Verfahren ein Reagenz, die zu analysierende Probe und ein Konjugat angewandt. Bei einer Bestimmung aufgrund einer Konkurrenzreaktion muß das Reagenz, das im allgemeinen an eine feste Phase wie Nylon oder Polystyrol gebunden ist, ein Bindungspartner für das Konjugat sein. Die zu analysierende Probe bzw. die zu bestimmende Substanz kann ein Bindungspartner für das Konjugat oder für das Reagenz sein, Jedoch nicht für beides. Bei einer Bestimmung mit Hilfe des Sandwich-Verfahrens können das Konjugat und das Reagenz keine Bindungspartner für einander sein. Beide sind Bindungspartner für die zu bestimmende Substanz. Die Bindungsreaktionen können graphisch folgendermaßen dargestellt werden.

Reagenz

A. Konkurrenz-Verfahren

zu bestimmende Konjugat Substanz

(feste Phase)

ι /

/

. 1

Ab,

Ag-Tag

(2)

- Ab

(3) Λ

- Ab

Ag₅ + Ag-Tag

B. Sandwich -Verfahren Ag₅ ■' + Ab'-Tag

- Ab-f Ag-Tag

Ab_s +Ag-Tag -Ab-Ag-Tag

- Ab - Ag

-Ab-Ag₈-AU-Te

Ab = Antikörper» " Ag = Antigen₅ Tag = Markierung /6

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COPY

So kann bei einem Konkuirenzverfahren ura so'weniger Konjugat_ mit dem Reagenz reagieren, 3e größer die Menge an zu bestimmender Substanz (Ab oder Ag ) in der Probe ist. Bei einem Sandwich-Verfahren ist das Gegenteil der Fall. Mit zunehmender Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe nimmt auch die Menge an Konjugat zu, die mit dem Reagenz reagiert.

Um die Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe zu bestimmen,wird das Reagenz von den sonstigen Reaktionsteinehmern abgetrennt. Um diese Abtrennung zu erleichtern wird das Reagenz im allgemeinen an einen Feststoff gebunden.Nach der Abtrennung einschließlich gründlichem Waschen, um sicherzustellen, daß kein nicht umgesetztes Konjugat in dem Rückstand verbleibt _/ wird das Reagenz mit dem Chemiluminesζenz-Reagenz vermischt. Aufgrund seiner Wirksamkeit ist hierfür Luminol bevorzugt. Andere chemilumineszierende Substanzen, die angewandt werden können sind unter anderem Tetrabis- (dimethylamino)äthylen, Luciferin, Lucigenin (Dimethyl-diacridinum-nitrat) und Oxalylchlorid. Als Oxidationsmittel ist Natriumperborat bevorzugt. Es können jedoch auch andere bekannte Katalysatoren (Oxidationsmittel) angewandt werden. Die metallische Komponente bzw. das Metallatom der Markierung in dem Konjugat katalysiert die Chemilumineszenz-Reaktion. Die auf übliche Weise gemessene bzw. aufgezeichnete Lichtemission gibt ein quantitatives Maß für die Menge an Konjugat, das an&as Reagenz gebunden ist und damit für die Menge der zu bestimmenden Substanz in der Probe.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Konkurrenzverfahren zur'Bestimmung von Humanimmunoglobulin G

a) Herstellung des Reagenz (feste Phase)

*) Menge der

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ν- ν ,COPY

Ein Nylongevirk wurde teilweise hydrolysiert durch Behandeln mit 2 η HCl bei 37⁰C über Nacht. Das Nylon wurde mit 0,01 m Na_pC0-2, pH 10 Säure frei gewaschen und anschließend mit Wasser. Es wurde-in eine Lösung von 400 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid in Wasser, von pH 3,7 gegeben. Der pH-Wert wurde zwischen 3,5 und -3,8 gehalten. Die Aktivierungsreaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt bis der Säureverbrauch aufhörte. Das Nylongewirk wurde dann schnell zwei mal mit verdünnter HCl (pH 3,4 bis 3,8) gewaschen.

Humanimmunoglobulin in 0,05 m NaCl, pH 3,4,in einer Menge von 10 mg Protein pro ml wurde zu dem aktivierten gewaschenen Nylongewirk gegeben und der pH-Wert nach und nach innerhalb von 60 min auf 7 erhöht. Die Bindungsreaktion konnte 60 min bei pH 7 a&aufen. Der pH-Wert wurde auf 7,2 bis 7,4 eingestellt und das Gemisch 4 h inkubiert.

Das Nylongewirk wurde folgendermaßen gewaschen: 2 mal mit 2 m NaCl, mit Wasser, 2 mal mit 0,01 m Phosphatpuffer pH 7,35, enthaltend 0,3 m NaCl, 0„2 % Rinderserumalbumin und 0,1 % oberflächenaktives Mittel (Tween 80), 2 mal mit Phosphat gepufferter Salzlösung und wieder mit Wasser. Das gewaschene Nylon-Immunoglobulin-Reagenz wurde an der Luft getrocknet und

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in Form von 1 cm großen Stücken als feste Phase für die Immunoassays verwendet.

B. Herstellung des Konjugats

Ein Eisenporphyrin-Antikörper-Konjugat wurde folgendermaßen hergestellt: Ziegenantihumanserum wurde teilweise gereinigt durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und Dialysieren gegen Salzlösung. Zu 2 ml dieser Lösung (100 mg Protein) wurden 30 mg Natriumbicarbonat und 2 ml Wasser gegeben. Eine Lösung von 4 mg Cyanursäure pro ml Dioxan wurde unter schnellem Rühren zu der Globullnlösung gegeben. Nach 2 min wurde eine Lösung von 100 mg Hämoglobin in 4 ml Wasser zugegeben und die Bindungsreaktion konnte 18 h bei 25⁰C ablaufen.

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'" 'COPY

/O

Nach Ablauf der Reaktion wurde das Gemisch auf eine 1,5 mal 100 cm Säule eines Polyacrylamidgels (Biogel P-200, Korngröße 0,15 bis 0,075 mm (100 bis 200 mesh)) aufgegeben und mit 0,002 η Phosphatpuffer, pH 7,O₁ enthaltend 0,05 m Natriumchlorid und 0,02 % Natriumacidjeluiert. Auf diese Weise konnte etwaiges nicht umgesetztes Hämoglobin von dem Konjugat entfernt werden. Die Fraktionen, die sowohl Hämoglobin als auch Antikörperaktivität enthielten, wurden zusammengegeben und als Konjugat verwendet.

C. Herstellung des Chemilumineszenz-Reagenz

Die Chemilumineszenzmessungen wurden mit Hilfe eines Aminc.o-Chem-Glo-Photometers durchgeführt.

Es wurden folgende Lösungen für die CL-Analysei angewandt:

Luminolvorratslösung: Zu 2,0 mg Luminol und 32 mg Glukose wurden 4 ml 0,1 η Natriumhydroxidlösung gegeben. Nach vollständiger Lösung des Luminols wurde die Lösung mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Die Lösung wurde bei 4°C aufbewahrt.

Luminolarbeitslösung: An jedem Arbeitstag wurde 1,0 ml der obigen Vorratslösung und 10 ml 0,1 η Natriumhydroxidlösung mit Wasser auf 100 ml ergänzt.

Perboratlösung: An jedem Arbeitstag wurden 77 mg Natriumperborat in 100 ml Wasser gelöst.

Die Chemilumineszenzanalysen wurden folgendermaßen durchgeführt:

In eine Glasschale wurden 0,5 ml der Testlösung, die in der wie oben beschriebenen Luminol-Lösung zubereitet war gegeben. Diese Schale wurde in die Probenkammer des Chem-Glo-Meters gegeben. Dann wurden 0,1 ml der Perboratlösung zugegeben. Die Lichtabgabe wurde als maximaler Ausschlag des Schreibers der Aufzeichenvorrichtung genommen. In den meisten Fällen

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wurde das Mifeel der Ergebnisse von 3 Proben genommen.

D. Bestimmungsverfahren

Das Immunoassay wurde mit Humanimmunoglobulin-Nylon und dem Elsen-porphyrin-Antikörper-Konjugat durchgeführt.

Nylönstücke (Fläche 1 cm ) wurden mit 0,4" ml Konjugat bei verschiedenen Verdünnungen und O₉I ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung oder 0,4 ml Kon-Jugat bei verschiedenen Verdünnungen und 0,1 ml einer Lösung von Humanimmunoglobulin inkubiert«, Alle Verdünnungen des Konjugats und Humanimamno= globulins wurden mit Phosphat gepufferter Salzlösung hergestellt. Nach 16 min langer Inkubation bei Räumtenperatur wurden die Lösungen abgezogen und die Nylonstücke nacheinander mit 0,4 ml, 0,5 % BSA, 0,05 % oberflächenaktivem Mittel (Tween 20), 2 m NaCl₁PH 9,0, BSA-Tween-20 und 2 mal mit 0,01 m Phosphatpuffer, pH 6,1 gewaschen.

Nach dem Waschen wurden einzelne Stücke mit einer Luminolar=- beitslösung gespült. Zu diesem Zweck wurden 3,0 ml der Luminol· arbeitslösung in oedes Glas gegeben und das Glas mit Inhalt wurde 5 min beschallt. Ein Anteil von 500 /ul der Probe wurde in ein Glasgefäß gegeben und in eine geeignete Vorrichtung wie das Aminco-Chem-Glo-Photometer gestellt und mit einer Lösung von Natriumperborat umgesetzt und das austretende Licht gemessen bzw. aufgezeichnet.

E. Ergebnisse

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Eine Hemmung der Konjugataufnahme durch das unlösliche (an Nylon gebundene) Humanimmunoglobulin war über einen weiten Bereich von Konzentrationen an Konjugat und konkurrierenden Immun©= globulinkonzentrationen zu beobachten»

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Tabelle I

Nylon stück	Konjugat Ko nz. (mg/ml)	Lösliches Immunoglobulin zugesetzt (/Ug)	Relative Li chtintens ität
A	0,1	0	4 300
B	0,1	0,1	2 885
C	0,04	0	1 995
D	0,04	0,1	1 245
E	0,04	100,0	202
F	' 0,02	0	1 490
G	0,02	0,1	364
H	0,01	0	1 125
I	0,01	0,1	182
J	0,000	0	52
B e i s	ρ i e 1 2

Herstellung von Hämoglobin-Antikörper-Konjugaten

Es wurde eine Reihe von Hämoglobin-Antikörper-Konjugaten hergestellt wie aus Tabelle H hervorgeht.

Tabelle II

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Ab

"Tabelle II

	Aktivierungs-Stufe	4	Zeit (s)	Tempera tur (⁰O	Bin- dungs - Stufe	Produkt- zusammen- setzung
ver such	Volumen Cyanur- (ml) säurechlorid (mg)	8	120	25·	Hämo globin (mg)	Hämoglobin/ Immunoglo bin
A	4	4	120	25	400	0,83
B	4	4	120	25	400	0,65
C	4	8 2	600	25	100	0,63
D	4 '	1	120 120	25 25	100	0,74
E F	4 · 4	4	120	25	100 100	unlösliche Produkte 0,49
G	4	4	10	0	100	0,19
H	10	Z	1	0	100	1,34
I	10	4	10	0	100	1,07
J	10	4	10	0	100	0,90
K	20		10	0	100	1,05
L	4		100	1,73

*) Molverhältnis bestimmt aus der Menge an freiem Hämoglobin und der Menge an Hämoglobin in der Oligomerfraktion, bestimmt durch Säulen-Gel-Filtration wie in Beispiel 1.

Die !Conjugate wurden untersucht und hattensowohl eine die Chemolumineszenz-Reaktion (CL) katalysierende Wirkung als auch immunologische Eigenschaften. Man erhielt ähnliche Ergebnisse wie in Beispiel 1 bei dem Immunoassay mit den Konjugaten C und L und an Nylon gebundene!Antikörpern aus Beispiel 1.

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COPY

IS/

Beispiel 3

Konkurrenzverfahren zur Bestimmung von Immunoglobulinen in Human-Serum.

An Nylon gebundenes Human-Immunoglobulin_/das entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war und Hämoglobin konjugiert mit Antiimmunoglobulin, entsprechend Beispiel 2 C wurden in Gegenwart und in Abwesenheit von menschlichem Serum inkubiet. In Gegenwart von menschlichem; Serum wurde eine Verringerung des erzeugten Lichts beobachtet.

Beispiel 4

Direkte Bestimmung von Human-Hämöglobin

Antikörper gegen Human-Hämoglobin wurden durch Ammoniumsulfat-Ausfällung teilweise gereinigt, auf 12 ,ug Protein pro ml 0,05 m Natriumcarbonatlösung bei pH 9,6 gelöst. Der Antikörper wurde an Polystyrol-Röhrchen (Falcon Nummer 2054) -1 h bei37⁰C adsorbiert. Die Röhrchen, die den Antikörper in fester Phase enthielten wurden 30-min bei 37⁰C mit 0,5 % Rinderserumalbumin behandelt und 2 mal mit 0,2 % Rinderserumalbumin^enthaltend 0,5 % Tween in gepufferter Salzlösung gewaschen. Die Antikörper-Röhrchen wurden in Abwesenheit und in Gegenwart von Humanhämoglobin 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit der mit Tween gepufferten Alb,uminsalzlösung 3 mal gewaschen und die Chemilumineszenz wie in Beispiel 1 gemessen. Die Lichtemisdon war höher, wenn Hämoglobin zu den Röhrchen gegeben wurde und proprotional der vorhandenen Menge an Hämoglobin.

Beispiel 5

Immunoassay von Myoglobin

Antikörper zu Myoglobin wurden wie in Beispiel 4 an Polystyrol adsorbiert und die Immunoassays entsprechend Beispiel 4 durchgeführt, wobei man ähnliche Ergebnisse erhielt.

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ORIGINAL INSPECTED

Ab

Beispiel

Sandwich-Verfahren zur Bestimmung von Chorion-Gonadotropin

A. Herstellung des Reagenz

Ziegenantikörper gegen Humanchoriongonadotropin (HCG) wurden an Nylonperlen gebunden: Teilweise Hydrolyse des Nylons wurde mit 1 η HCl 2 h durchgeführt. Die Perlen wurden gewaschen und zusätzliche Carboxylgruppen eingeführt, indem man die Perlen 1 h mit einem Überschuß an Maleinsäureanhydrid bei einem konstanten pH-Wert zwischen 8 und 9 behandeile. Die Perlen wurden gewaschen und die Carboxylgruppen mit 2 g wasserlöslichem Carbodiimidbei einem kostanten pH-Wert von 4,5 bis 5,2, 30 mir; aktiviert. Überschüssiges Carbodiimid wurde entfernt und das Ziegen-Anti-HCG wurde 3 h bei Raumtemperatur und anschließend 18 h bei 4⁰C an die Perlen gebunden. Die Antikörper haltigen Perlen wurden mit 0,2 % Rinderserumalbumin in gepufferter SaIs= lösung behandelt, gewaschen und in Rinderserumalbumin in gepufferter Salzlösung bei 4°C vor der Verwendung aufbewahrt.

B. Herstellung des' Konjugats

Ein Eisenporphyrin enthaltendes Peptid, das abgeleitet war von Cytochrom C wurde hergestellt durch Pepsinabbau von Cytochrom C und anschließende Säureauefällung und Dialyse. Dieses Peptid ergab eine höhere Chemilumineszenzausbeute pro Porphyrinmolekül als das Cytochrom C selbst. Ziegenantikörper zu HCG wurcen teilweise durch Ammoniumsulfatausfällung gereinigt und mit Pepsin behandelt, um (Fab¹)p-Fragmente zu erhalten, die durch Gelfiltration über eine Sephadex G-75-Säule gereinigt wurden. An den Antikörperfragmenten wurden mit Hilfe von N-Acetylhomocysteinthiolacton Thiolgruppen eingeführt und die thiolierten Antikörperfragmente von dem überschüssigen Thiolierungsmittel durch Gelfiltration über eine Sephadex G-25-Säule abgetrennt. Das Eisenporphyrinpeptid wurde zur Konjugation mit dem thJoLierten Antikörperfragment aktiviert durch Einführung von Maleinsäureimidgruppen mit Hilfe von m-Malein-

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imidobenzoyl- N-hydroxysuccinimidester und anschließende Filtration über Sephadex G-25. Das Konjugat wurde hergestellt durch Vermischen der thüierten Antikörperfragmente mit dem Maleinimido-Eisenporphyrin-Peptid innerhalb 1 h bei Raumtemperatur und anschließende Gelfiltration über eine Sephadex G-75-Säule.

Es wurden Immunoassays durchgeführt unter Verwendung von Antikörpern zu HCG, die an Nylonperlen gebunden waren, und Eisenporphyrin, das mit Antikörperfragmenten konjugiert war, die abgeleitet waren von Antikörpern zu HCG.

C. Bestimmungsverfahren

/mit

Nylonperlen, die'Antihuman IgG konjugiert waren wurden in Glasröhrchen gegeben und 30 min bei 37°C mit 2,5 IE HCG in einer Lösung von 0,2 % Rinderserumalbumin in Phosphat gepufferter Salzlösung oder nur in Phosphat gepufferter Salzlösung inkubiert. Die Lösungen wurden dann abgezogen und die Perlen mit 0,05 m HEPES^, 15 m NaCl-Lösung^pH 7,2_% gewaschen und

dann 30 min bei 37°C mit verschiedenen Verdünnungen des Konju-

/Puffer gats in 0,05 m HEPES, 0,15 m NaCl-Lösung pH 7,2'inkubiert. Nach

30 min langer Inkubation bei 37⁰C wurden die Perlen erneut gewaschen und mit 0,5 ml 0,1 % Natriumdodecylsulfat 5 min behandelt (eluiert). Es wurde Luminol zugegeben und die Lichtemission wie in Beispiel 1" gemessen. In der folgenden Tabelle VI sind Ergebnisse angegeben, wie sie für disses Doppelantikörper-Sandwich-Verfahren zur Bestimmung von Antigen typisch sind.

Tabelle VI

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Tabelle VI

Röhrchen	zugesetztes HCG	^:	-	Verdünnung des Konjugats	relative Licht empfindlichkeit (-ausbeute)
1	+	-	1:5	61,1
2	+	-	1:10	39,0
3	+		1:25	16,1
4	+	1:50	3,25
5	+	1:100	2,40
6	+	-	1,21
7	-	1:5	19,5
8	1:10	4,81
9	1:25	3,56
10	1:50	2,34
11	1:100	2,21
12		1,63

Diese Daten zeigen eine erhöhte Chemilumineszenzreaktion, die eine verstärkte Aufnahme des Konjugats in Gegenwart von HCG über einen weiten Bereich von Konjugatverdünnungen anzeigt.

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Claims

WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS-GOETZ ΖΣ^

DIPL.-CHEM. DR. Ϊ. FREIHERR VON PBCHMi PROFESSIONAL XBPRBSBNTATIVES BEFORB THB BUROPBAN PATBNT OPFICB DR.-ING. DIETBR BBHRBNS

MANDATAIRBS AGREB* FKBI L'OFFICB XUROPBBN DBS »RBVSTS DIPU-INC; DIPU-WIIITSCh₁-INCKUPBRT C

Fisher Scientific Company D-8000 MÜNCHEN 90

1A-54 163 SCHWEIGERSTRASSE 2

telbfon: (089) 66 20 ji tblbgkamm: protectpatent tblbx: $24070

Patentansprüche

Iy Markiertes Konjugat für immunologische Bestimmungen aus einer immunologisch wirksamen Verbindung und einer Markierungssubstanz, die durch Chemilumineszenz nachgewiesen werden kann, dadurch gekennzeichnet , daß die Markierungssubstanz im Stande ist eine Chemilumineszenz-Reaktion zu katalysieren.
2. Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungssubstanz ein Metallporphyrin ist.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die immunologisch wirksame Komponente ein Antikörper oder ein Bindungspartner für einen Antikörper ist.
4. Konjugat nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Protein, an das ein Metallporphyrin gebunden ist, besteht.
5. Konjugat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Immunoglobulin ist.
6. Konjugat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Hormon ist.

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7. Konjugat nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Metallporphyrin ein Eisenporphyrin ist.
8. Konjugat nach Anspruch 7_f dadurch gekennzeichnet, daß das Eisenporphyrin abgeleitet ist von Hämoglobin oder Myoglobin oder von Cytochrom C.
9. Konjugat nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß das KonQugat im Stande ist, mit einem
Antigen oder einem Antikörper oder beiden zu reagieren.
10. Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 bis 9 2ur Durchführung immunologischer Bestimmungsverfahren, -wobei die Markierungssubstanz nachgewiesen bzw. bestimmt wird durch Zugabe eines Chemiluninenszenz-Reagenz und Messung des emittierten Lichts.

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