DE69629880T2 - Verfahren zur Chemilumineszenzanalyse - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft den Bereich der analytischen und diagnostischen Chemie für den Nachweis verschiedener Analyte in biologischen Flüssigkeiten. Insbesondere betrifft sie eine signalerzeugende Zusammensetzung, die in chemilumineszenten Testverfahren nützlich ist, Testkits, die dieselbe enthalten und analytische Verfahren, in denen die Zusammensetzung und die Testkits verwendet werden können.
  • Luminiszente und luminometrische Testverfahren sind die, die eine Lichtemission als Ergebnis der Gegenwart eines interessierenden Analyts erzeugen. Die Lichtemission ist im allgemeinen von ausreichender Dauer, damit sie gemessen und nachgewiesen werden kann, wodurch die Bestimmung des Analyten erlaubt wird.
  • Es gibt mehrere Haupttypen der Testverfahren, bei dem ein Chemilumineszenzsignal vorteilhaft verwendet werden kann, um einen Analyten zu bestimmen:
    • 1. Testverfahren, bei denen eine chemilumineszente Verbindung verwendet wird, um spezifische Bindungensliganden wie Proteine, Oligonukleotide, Antigene, Haptene, Hormone, Nukleinsäuren und andere Verbindungen vom biologischen Interesse direkt zu markieren. Die Chemilumineszenz kann durch das Hinzufügen einer Peroxidase oder eines Oxidants zu den markierten Liganden nachgewiesen werden.
    • 2. Testverfahren, bei denen Katalysatoren oder Kofaktoren der Lumineszenzreaktion als Markierungen für spezifisch bindende Liganden verwendet werden. Beispielsweise kann Peroxidas an Liganden konjugiert werden und verwendet werden um ein chemilumineszentes Signal bereitzustellen.
    • 3. Testverfahren, bei denen chemilumineszente Reaktionen verwendet werden, um die Produkte zu bestimmen, die durch die Wirkung einer Enzymmarkierung, die nicht Peroxidase ist, auf geeignete Substrate gebildet werden. Ein Beispiel dieser Sorte eines Testverfahrens ist die Bestimmung eines Glukoseoxidase-markierten spezifisch bindenden Ligandens durch die Erzeugung von Wasserstoffperoxidase in der Gegenwart von Peroxidase.
    • 4. Nicht Immunessays und ein Katalysator wie Peroxidase oder ein Oxidanz wie
    • Wasserstoffperoxid, das als Ergebnis eines nicht-immunreaktiven Analyts erzeugt wird, zu bestimmen.
  • Weitere Details solcher Testverfahren werden in der umfassenden Literatur wie in U.S.-Pat. Nr. 4,729,950 (Kricka et al.) und darin erwähnten Publikationen zur Verfügung gestellt.
  • Im allgemeinen ist die Quelle des Wasserstoffperoxids, das an der Lumineszenzreaktion beteiligt ist, ein Perborat und das Substrat für die peroxidative Wirkung ist ein 2,3-Dihydro-1,4-phtalazindion wie Luminol. Eine niedrige Menge spontaner Lichtemission wird beobachtet, wenn Luminol mit einem Perboratsalz in wäßriger Lösung gemischt wird. Solche "Hintergrund"-Lichtemission ist in chemischen Systemen nicht wünschenswert (wie einen chemilumineszenten Immun-Testverfahren) bei dem Licht aus der kontrollierten Oxidation des Luminols gemessen wird, um den Reaktionsendpunkt zu bestimmen. Es ist daher wichtig, wenn solche Enzymimmun-Testverfahren entworfen werden, daß "Hintergrund"-Lichtemission soweit wie möglich reduziert wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung stellen wir ein chemilumineszentes analytisches Verfahren zur Verfügung, das einen geeigneten Katalysator wie ein Peroxidaseenzym in einer Reaktion mit Luminol oder einem substituierten Luminol und ein Perborat in einem wäßrigen Lösungsmittel und den Nachweis und das Messen der durch die Reaktion erzeugten Lumineszenz umfaßt, dadurch charakterisiert, daß das wäßrige Lösungsmittel ein nicht-luminizierendes chelatisierendes Mittel für die Chelatisierung eines Elektronen-Defizienten-Boratoms in dem Perborat umfaßt.
  • Des weiteren stellen wir gemäß der vorliegenden Erfindung ein Reagenz zur Verfügung, das in einem chemilumineszenten analytischen Verfahren nützlich ist, das Perborationen in einem wäßrigen Lösungsmittel umfaßt, dadurch charakterisiert, daß das wäßrige Lösungsmitel auch ein nicht-lumineszierendes chelatisierendes Mittel für die Chelatisierung eines Elektronen-Defizienten-Boratoms in den Perborat-Ionen umfaßt.
  • Des weiteren stellen wir gemäß der vorliegenden Erfindung ein Kit zur Verfügung, das in einem chemilumineszenten analytischen Verfahren nützlich ist, das ein erstes Reagenz, das Luminol oder ein substituiertes Luminol in einer wäßrigen Lösung umfaßt und ein zweites Reagenz, das Perborationen in einer wäßrigen Lösung umfaßt, dadurch charakterisiert, daß auch das zweite Reagenz ein nicht-luminizierendes chelatisierendes Mittel für die Chelatisierung von Elektronen-Defizienten-Boratomen in den Perborat-Ionen umfaßt.
  • Das erste und das zweite Reagenz des Kits der vorliegenden Erfindung kann zusammen oder getrennt zur Verfügung gestellt werden, im letzeren Fall werden sie vor der Verwendung gemischt, oder gleichzeitig oder nacheinander zu den anderen Komponenten der Lumineszenz-Reaktion hinzugefügt. Wir haben durch Analyse einer Luminol-Perborat-Lösung durch Fluoresenzspektroskopie gezeigt, daß ein Teil der beteiligten Moleküle in Lösung als Komplex koexistiert. Ein wahrscheinlicher Mechanismus für die Komplexbildung ist die Chelatisierung des Elektronen-Defizienten-Perborat-Boratoms durch Luminol. Wir vermuten, daß der gebildete Komplex instabil ist und das er zu der Hintergrund-Luminesenz durch Zerfall unter Aussendung von Licht beiträgt.
  • Wir haben nun gefunden, daß die Hintergrundlumineszenz von Luminol-Perborat-Lösungen durch das Hinzufügen eines nicht-lumineszierenden chelatisierenden Mittels einer geeigneten molekularen Geometrie, d.h. eines nicht-lumineszierenden chelatisierenden Mittels für die Chelatisierung eines Elektronen-Defizienten-Boratoms in einem Perboration, verringert werden. Wir vermuten, daß das hinzugefügte chelatisierende Mittel mit Luminol um die Bindung an Perborat kompetiert, wodurch die Bildung des instabilen Luminol-Perborat-Komplexes minimiert wird.
  • Der Mechanismus, durch den die Erfindung vermutlich die Hintergrundlumineszenz unter Verwendung zweier bevorzugter Chelatisierungsmittel verhindert, wird unten in den vorgeschlagenen Interaktionsschemata 1 und 2 gezeigt. In Schema 1 ist das Chelatisierungsmittel Glycin während in Schema 2 das Chelatisierungsmittel Sulfosalicylsäure (SSA) ist. In beiden Interaktionsschemata bildet Luminol durch die lockere Bindung über Sauerstoff- und Stickstoffatome über das elektronen-defiziente Boratom des Perborations hinweg einen instabilen Komplex mit Perborat. In der Gegenwart des Chelatisierungsmittels (Glycin in Schema 1 oder SSA in Schema 2) bildet sich ein alternativer Komplex, da die Chelatisierungsmittel eine geeignete molekulare Geometrie aufweisen, um Luminol in den Komplex zu ersetzen. Wir glauben, daß dadurch die Hintergrundlumineszenz wesentlich verringert werden kann.
  • 1. Vorgeschlagene Interaktion zwischen Perborat, Luminol und Glycin
    Figure 00050001
  • 2. Vorgeschlagene Interaktionen zwischen Perborat, Luminol und Sulfosalicylsäure (SSA)
    Figure 00060001
  • Die vorliegende Erfindung kann auf jedes chemilumineszente analytisches Verfahren angewendet werden, ohne besondere Einschränkungen solange ein geeigneter Katalysator wie ein Peroxidaseenzym verwendet wird und mit Luminol oder einem substituierten Luminol und Perborat in einem wäßrigen Lösungsmittel reagiert wird und die Lumineszenz dann nachgewiesen und gemessen wird. Vorzugsweise ist der Katalysator ein Peroxidaseenzym, das als Markierungssubstanz gut bekannt ist und das umfassend in Testverfahren, die auf immunologischen Reaktionen und Nukleinsäurehybridisierungstechniken basieren, verwendet worden ist. Beispielsweise kann die Peroxidase unter Verwendung eines zielspezifischen Bindungsreagenz an ein Ziel gebunden werden. Das Peroxidase-gebundende Ziel wird isoliert und mit Luminol und Perborat in einem wäßrigen Lösungsmittel zur Reaktion gebracht. Das Luminol oder das substituierte Luminol und das Perborat in einem wäßrigen Lösungsmittel werden als Signalreagenz bezeichnet.
  • Der Begriff "zielspezifische Bindungsreagenz" wie hierin verwendet bezeichnet eine Substanz, die spezifisch an ein zu analysierendes Ziel binden kann. Das Ziel kann ein physiologisch aktives Peptid, ein Hormon, eine Nukleinsäure und ähnliche Substanzen umfassen. Wenn das zu analysierende Ziel in der Lage ist als Antigen zu wirken, kann ein Antikörper (umfassenden polyklonale und monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und ähnliche) ein zielspezifisches Bindungsreagenz werden. Wenn das zu analysierende Ziel eine Nukleinsäure ist, kann ihre komplentäre (Einzelstrang) Nukleinsäure oder ein Nukleinsäurefragment ein zielspezifisches Bindungsreagenz sein.
  • Als chelatisierendes Mittel kann in der Erfindung jedes nicht-lumineszierende chelatisierende Mittel, das eine geeignete molekulare Geometrie aufweist, d.h. jedes nicht-lumineszierende chelatisierende Mittel für die Chelatisierung eines Elektronen-Defizienten Boratoms in einem Perboration verwendet werden.
  • Geeignete chelatisierende Mittel sind Verbindungen, die eine Zähnigkeit von mindestens zwei aufweisen. Bevorzugte Bindungsanordnungen sind zweizähnig, wobei eine Chelatringgröße von 5- oder 6-Ringen besonders bevorzugt ist. Es ist bevorzugt, daß für die Bindung innerhalb dieser Systeme mindestens eine Ligandengruppe eine elektronegative Ladung trägt. Mehrzähnige oder makrozyklische Liganden verringern die Wahrscheinlichkeit, daß das Perborat sich löst und führen zu bevorzugten Systemen. Bevorzugte chelatisierende Mittel sind Glycin und Sulfosalicylsäure (SSA) aber andere können auch verwendet werden. Die Konzentration des chelatisierenden Mittels, das geeigneter Weise in einer typischen Signalreagenz vorhanden ist, ist innerhalb des Bereiches von 4 bis 15 mmol/l aber diese Konzentration hängt im gewissen Maße von den anderen Komponenten des Signalreagenzes ab. Geeigneter Weise ist das chelatisierende Mittel sowohl hinsichtlich des Perborats und des Luminols in einem stöchometrischen Übschuß in dem Signalreagenz vorhanden. In einem typischen Signalreagenz wird das chelatisierende Mittel in einer molaren Menge zwischen dem zwei- und dem zehnfachen der molaren Mengen des darin vorhandenen Luminols und Perborats vorhanden sein.
  • Das in den analytischen Verfahren der Erfindung verwendete wäßrige Lösungsmittel und das in dem Signalreagenz vorhanden ist, ist im allgemeinen Wasser oder ein Puffer. Geeignete Puffer umfassen die Puffer, die im allgemeinen in biochemischen Reaktionen verwendet werden, insbesondere umfassend Phosphatpuffer und Boratpuffer. Es kann bemerkt werden, daß in Gegenwart eines Boratpuffers und von Wasserstoffperoxid die Komplexe, die in den Reaktionsschemata 1 und 2 erwähnt sind, gebildet werden können (J. Flanagan et al., J. Chem. Soc., Dorten Tarans, 1651, 1989: BN Chernyshov, Russian J. Inorg. Chem, 35 (neu) 1333, 1990). Geeigneterweise hat der Puffer einen pH im Bereich 5 bis 12 und vorzugsweise im Bereich von 7 bis 11. pH-Werte unter 5 sind außerhalb des für die Enzyme optimalen pH-Bereichs für Peroxidaseenzyme, so daß die emitierte Lumineszenz niedriger wird. pH-Werte über 12 sind auch außerhalb des optimalen Bereichs führen in diesem Fall jedoch zu stärkerer Lumineszenz, die nicht auf der Aktivität der Peroxidase beruht, d.h. sie führen zu nichtspezifischer Lumineszenz.
  • Der bevorzugte Katalysator ist ein Peroxidaseenzym aber andere anerkannte Katalysatoren können auch verwendet werden, umfassend Porphyrine wie NPll (Mikroperoxidase). Das Peroxidaseenzym, das als Markierungsubstanz verwendet wird, ist geeigne terweise ein basisches Isoenzym des Meerrettichs (Meerrettichperoxidase oder HRP). Geeignete Isoenzyme der Meerrettichperoxidase umfassen Typ VI und Typ IX erhältlich von Sigma Chemical, Poole, Dorset, wobei Typ VI für die Verwendung in der Erfindung bevorzugt ist.
  • Die Bindung zwischen dem zielspezifisch bindenden Bindungsreagenz und dem Peroxidaseenzym (d.h. die Markierung des Bindungsreagenz mit dem Enzym) kann mit jedem geeigneten Mittel erreicht werden. Das Bindungsreagenz und die Peroxidasemarkierung kann durch Verfahren, die in M. Brinklake, Bioconj. Can., 3 Seite 2 (1991) beschrieben werden oder durch ähnliche Verfahren, direkt aneinander gebunden werden. Alternativ kann das zielspezifische Bindungsreagenz mit einer ersten chemischen Gruppe wie einer Biotinylgruppe ausgestattet werden, gefolgt von einer Reaktion mit einer Peroxidase, die eine zweite chemische Gruppe enthält, die mit der ersten Gruppe reaktiv ist, wie die ein Avidin- oder Streptavidinrest, so daß das Bindungsreagenz indirekt markiert wird.
  • Das Luminol für die Verwendung in der Erfindung ist geeigneterweise Natriumluminol. Das verwendete Perborat ist vorzugsweise Natriumperborat. Es ist als eine Quelle für das Wasserstoffperoxid, ein Substrat des Peroxidaseenzyms, vorhanden.
  • Vorzugsweise enthält das Signalreagenz eine Verbindung, die die Chemiluminesenzreaktion verstärken kann, wie die, die in U.S.P. 4,842,997 und U.S.P. 5,279,940 beschrieben sind. In der vorliegenden Erfindung kann jeder Verstärker verwendet werden, der einen Elektronentransfer vom Wasserstoffperoxid (abgeleitet aus dem Perborat) über die Peroxidase zum Luminol ermöglicht und eine verstärkende Wirkung zeigen kann. Geeignete Verstärker umfassen 4-Iodphenol, 4-Bromphenol, 4-Chlorphenol, 4-Phenylphenol, 2-Chlor-4-phenylphenol, 6-Hydroxybenzotiazol, 4-[41-(21-Metyl)thiazolyl]phenol, 4-[21-(41-Metyl)thiazolyl]phenol, 4-(21-Benzothiazolyl)phenol, 3-(10-Phenothiazyl)-n-propylsulfonat und 3-Chlor,4-Hydroxyacetanilid. Wenn die Reaktion zwischen dem Luminol und dem Wasserstoffperoxid durch die Peroxidase in Ge genwart eines geeigneten Verstärkers zustande kommt, verstärkt der Verstärker die Oxidationsrate des Enzyms. Zusätzlich zu den nicht-lumineszierenden chelatisierenden Mittel, das in dem Signalreagenz umfaßten, um mit Luminol zu kompetieren, können andere chelatisierende Mittel enthalten sein, um unerwünschte Metallionen zu entfernen oder für andere Zwecke.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlicht, deren Ergebnisse graphisch in den 1 und 2 der begleitenden Zeichnung wiedergegeben sind, wobei die Zeichnungen sind:
  • 1: eine Kurve der Prozente der Kontrolluminesenz, Hintergrundluminesenz und des Signal-Rauschverhältnisses, die die Wirkung des Hinzufügens von Glycin zu der Peroxidase/Luminol/Perborat verstärkten Chemilumineszenzreaktion des Beispiels 1 zeigt; und
  • 2: eine Kurve der Lichtemission in willkürlichen Lichteinheiten aufgetragen gegen die Konzentration des Thyroid-stimulierenden Hormons (TSH), die die Wirkung hinzugefigten Glycins auf die Dosis-Antwortkuve eines chemilumineszenten TSH-Immun-Testverfahrens des Beispiels 2 zeigt.
  • Beispiel 1
  • Glycin wurde zu Natriumluminolperborat bei einem pH 8,5 in einem Boratpuffer, der Citrat und 3-Chlor,4-Hydroxyacetanilid (ein Chemilumineszenzverstärker) enthielt, hinzugefügt: Reagenzzusammensetzung:
    Chemikalie Konzentration
    (mmol pro Liter in Wasser)
    Borsäure 57,5
    Natriumtetraborat 17,5
    Natriumperborat 2,00
    Tri-Natriumcitrat 4,65
    Zitronensäure 2,15
    Kaliumchlorid 100,0
    3-Chlor,4-hydroxyacetanilid 0,15
    Natriumluminol 1,00
    Glycin 0 bis 15,00
  • Wenn die Glycinkonzentration erhöht wurde, wurde eine Verringerung der Hintergrunchemilumineszenz beobachtet. Bei Glycinkonzentrationen über 4 mmol/l stabilisierte sich das Hintergrundlicht bei etwa 40% seiner Anfangsstärke. Die Lumineszenz, die durch das Hinzufügen von etwa 100 attomol (1016 mol) Meerrettichperoxidase zu 250 Mikrolitern von war die Chemilumineszenzbildung durch die Gegenwart von Glycin nicht beeinflußt, wobei Letzteres nützlich erhöhte Signalverhältnisse erzeugte (siehe 1).
  • Die Lumineszenz wurde in weißen Mikrotitervertiefungen unter Verwendung eines "Amerlite" Registriertes Warenzeichen Analysator, Johnson & Johnson Clinical Diagnostics Limited (J&JCDL), Amersham, UK durchgeführt.
  • Beispiel 2
  • Die Chemilumineszenzzusammensetzung des Beispiels 1, die entweder 0 oder 5 mmol pro Liter Glycin enthielt, wurde durch das kommerzielle Chemilumineszenzreagenz des "Amerlite" TSH-30 Ultrasensitive Immunoassay Kit (TSH bedeutet menschliches Thyroid-stimulierendes Hormon), das von J&JCDL, Amersham, UK erhältlich ist, ersetzt. Die folgenden Ergebnisse wurden unter Verwendung des publizierten Protokolls für das Testverfahren erhalten:
    Figure 00120001
  • Mit Glycin wurde aufgrund der Reduktion lichtspezifischer Hintergrundchemilumineszenz ein verringertes Nullstandardsignal beobachtet. Es gab dementsprechend ein höheres Signalverhältnis zwischen dem ersten und dem zweiten Standards des Testverfahrens ("B"/"A"-Verhältnis). Unter Annahme einer linearen Dosis-Antwort-Charakteristik zwischen den zwei Standards zeigt die statistische Analyse, daß sich die niedrigere Nachweisgrenze für TSH (Sensitivität des Testverfahrens) in Gegenwart von Glycin von 0,0023 auf 0,0014 milli-Internationaleeinheiten pro Liter verbesserte. Dies beinhaltet eine größere Kapazität des Testverfahrens niedriger Mengen des TSHs aufzulösen – ein deutlicher Vorteil dieses Testtyps. Andere Leistungsparameter des Testverfahrens wurden durch das Hinzufügen von Glycin nicht betroffen (siehe 2).

Claims (8)

  1. Chemilumineszentes analytisches Verfahren, das die Verwendung eines geeigneten Katalysators in einer Reaktion mit Luminol oder einem substituierten Luminol und einem Perborat in einem wäßrigen Lösungsmittel und das Nachweisen und das Messen der durch die Reaktion erzeugten Lumineszenz umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Lösungsmittel ein nicht-lumineszierendes chelatisierendes Mittel, das in einer Molmenge zwischen dem zwei- und dem zehnfachen der Molmenge des Luminols oder eines substituierten Luminols und zwischen dem zwei- und dem zehnfachen der Molmenge des Perborats vorhanden ist, für die Chelatisierung eines Elektronen-defizienten Boratoms in dem Perborat, umfaßt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Katalysator ein Peroxidaseenzym ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht lumineszierende chelatisierende Mittel eine Verbindung ist, die eine Zähnigkeit von mindestens zwei aufweist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Chelatringgröße ein Fünf- oder Sechsring ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtlumineszierende chelatisierende Mittel Glycin oder Sulphosalicylsäure ist.
  6. Reganz, die Perborationen in einem wäßrigen Lösungsmittel umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Lösungsmittel auch ein nicht-lumineszierendes chelatisierendes Mittel, das in einer Molmenge zwischen dem zwei- und dem zehnfachen der Molmenge des Luminols oder eines substituierten Luminols und zwischen dem zwei- und dem zehnfachen der Molmenge des Perborats vorhanden ist, für die Chelatisierung von Elektronen-defizienten Boratomen in den Perborationen, umfaßt.
  7. Reagenz gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtlumineszierende chelatisierende Mittel Glycin oder Sulphosalicylsäure ist.
  8. Kit nützlich in einem chemilumineszenten analytischen Verfahren, das in einem oder mehreren Teilen eine erste Reagenz umfassend Luminol oder ein substituiertes Luminol in wäßriger Lösung und ein zweites Reagenz umfassend Perforationen in wäßriger Lösung umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Reagenz auch ein nicht-lumineszierendes chelatisierendes Mittel, das in einer Molmenge zwischen dem zwei- und dem zehnfachen der Molmenge des Luminols oder eines substituierten Luminols und zwischen dem zwei- und dem zehnfachen der Molmenge des Perborats vorhanden ist, für die Chelatisierung Elektronen-defizienter Boratome in dem Perborationen umfaßt.
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