-
Diese
Erfindung betrifft den Bereich der analytischen und diagnostischen
Chemie für
den Nachweis verschiedener Analyte in biologischen Flüssigkeiten.
Insbesondere betrifft sie eine signalerzeugende Zusammensetzung,
die in chemilumineszenten Testverfahren nützlich ist, Testkits, die dieselbe
enthalten und analytische Verfahren, in denen die Zusammensetzung
und die Testkits verwendet werden können.
-
Luminiszente
und luminometrische Testverfahren sind die, die eine Lichtemission
als Ergebnis der Gegenwart eines interessierenden Analyts erzeugen.
Die Lichtemission ist im allgemeinen von ausreichender Dauer, damit
sie gemessen und nachgewiesen werden kann, wodurch die Bestimmung
des Analyten erlaubt wird.
-
Es
gibt mehrere Haupttypen der Testverfahren, bei dem ein Chemilumineszenzsignal
vorteilhaft verwendet werden kann, um einen Analyten zu bestimmen:
-
- 1. Testverfahren, bei denen eine chemilumineszente
Verbindung verwendet wird, um spezifische Bindungensliganden wie
Proteine, Oligonukleotide, Antigene, Haptene, Hormone, Nukleinsäuren und
andere Verbindungen vom biologischen Interesse direkt zu markieren.
Die Chemilumineszenz kann durch das Hinzufügen einer Peroxidase oder eines
Oxidants zu den markierten Liganden nachgewiesen werden.
- 2. Testverfahren, bei denen Katalysatoren oder Kofaktoren der
Lumineszenzreaktion als Markierungen für spezifisch bindende Liganden
verwendet werden. Beispielsweise kann Peroxidas an Liganden konjugiert werden
und verwendet werden um ein chemilumineszentes Signal bereitzustellen.
- 3. Testverfahren, bei denen chemilumineszente Reaktionen verwendet
werden, um die Produkte zu bestimmen, die durch die Wirkung einer
Enzymmarkierung, die nicht Peroxidase ist, auf geeignete Substrate
gebildet werden. Ein Beispiel dieser Sorte eines Testverfahrens
ist die Bestimmung eines Glukoseoxidase-markierten spezifisch bindenden
Ligandens durch die Erzeugung von Wasserstoffperoxidase in der Gegenwart
von Peroxidase.
- 4. Nicht Immunessays und ein Katalysator wie Peroxidase oder
ein Oxidanz wie
- Wasserstoffperoxid, das als Ergebnis eines nicht-immunreaktiven
Analyts erzeugt wird, zu bestimmen.
-
Weitere
Details solcher Testverfahren werden in der umfassenden Literatur
wie in U.S.-Pat. Nr. 4,729,950 (Kricka et al.) und darin erwähnten Publikationen
zur Verfügung
gestellt.
-
Im
allgemeinen ist die Quelle des Wasserstoffperoxids, das an der Lumineszenzreaktion
beteiligt ist, ein Perborat und das Substrat für die peroxidative Wirkung
ist ein 2,3-Dihydro-1,4-phtalazindion wie Luminol. Eine niedrige
Menge spontaner Lichtemission wird beobachtet, wenn Luminol mit
einem Perboratsalz in wäßriger Lösung gemischt
wird. Solche "Hintergrund"-Lichtemission ist
in chemischen Systemen nicht wünschenswert
(wie einen chemilumineszenten Immun-Testverfahren) bei dem Licht
aus der kontrollierten Oxidation des Luminols gemessen wird, um
den Reaktionsendpunkt zu bestimmen. Es ist daher wichtig, wenn solche
Enzymimmun-Testverfahren entworfen werden, daß "Hintergrund"-Lichtemission soweit wie möglich reduziert
wird.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung stellen wir ein chemilumineszentes analytisches Verfahren
zur Verfügung,
das einen geeigneten Katalysator wie ein Peroxidaseenzym in einer
Reaktion mit Luminol oder einem substituierten Luminol und ein Perborat
in einem wäßrigen Lösungsmittel
und den Nachweis und das Messen der durch die Reaktion erzeugten
Lumineszenz umfaßt,
dadurch charakterisiert, daß das
wäßrige Lösungsmittel
ein nicht-luminizierendes chelatisierendes Mittel für die Chelatisierung
eines Elektronen-Defizienten-Boratoms
in dem Perborat umfaßt.
-
Des
weiteren stellen wir gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Reagenz zur Verfügung,
das in einem chemilumineszenten analytischen Verfahren nützlich ist,
das Perborationen in einem wäßrigen Lösungsmittel umfaßt, dadurch
charakterisiert, daß das
wäßrige Lösungsmitel
auch ein nicht-lumineszierendes chelatisierendes Mittel für die Chelatisierung
eines Elektronen-Defizienten-Boratoms in den Perborat-Ionen umfaßt.
-
Des
weiteren stellen wir gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Kit zur Verfügung,
das in einem chemilumineszenten analytischen Verfahren nützlich ist,
das ein erstes Reagenz, das Luminol oder ein substituiertes Luminol
in einer wäßrigen Lösung umfaßt und ein
zweites Reagenz, das Perborationen in einer wäßrigen Lösung umfaßt, dadurch charakterisiert,
daß auch
das zweite Reagenz ein nicht-luminizierendes chelatisierendes Mittel
für die
Chelatisierung von Elektronen-Defizienten-Boratomen in den Perborat-Ionen umfaßt.
-
Das
erste und das zweite Reagenz des Kits der vorliegenden Erfindung
kann zusammen oder getrennt zur Verfügung gestellt werden, im letzeren
Fall werden sie vor der Verwendung gemischt, oder gleichzeitig oder nacheinander
zu den anderen Komponenten der Lumineszenz-Reaktion hinzugefügt. Wir
haben durch Analyse einer Luminol-Perborat-Lösung durch Fluoresenzspektroskopie
gezeigt, daß ein
Teil der beteiligten Moleküle
in Lösung
als Komplex koexistiert. Ein wahrscheinlicher Mechanismus für die Komplexbildung
ist die Chelatisierung des Elektronen-Defizienten-Perborat-Boratoms
durch Luminol. Wir vermuten, daß der
gebildete Komplex instabil ist und das er zu der Hintergrund-Luminesenz
durch Zerfall unter Aussendung von Licht beiträgt.
-
Wir
haben nun gefunden, daß die
Hintergrundlumineszenz von Luminol-Perborat-Lösungen
durch das Hinzufügen
eines nicht-lumineszierenden chelatisierenden Mittels einer geeigneten
molekularen Geometrie, d.h. eines nicht-lumineszierenden chelatisierenden
Mittels für
die Chelatisierung eines Elektronen-Defizienten-Boratoms in einem
Perboration, verringert werden. Wir vermuten, daß das hinzugefügte chelatisierende Mittel
mit Luminol um die Bindung an Perborat kompetiert, wodurch die Bildung
des instabilen Luminol-Perborat-Komplexes minimiert wird.
-
Der
Mechanismus, durch den die Erfindung vermutlich die Hintergrundlumineszenz
unter Verwendung zweier bevorzugter Chelatisierungsmittel verhindert,
wird unten in den vorgeschlagenen Interaktionsschemata 1 und 2 gezeigt.
In Schema 1 ist das Chelatisierungsmittel Glycin während in
Schema 2 das Chelatisierungsmittel Sulfosalicylsäure (SSA) ist. In beiden Interaktionsschemata
bildet Luminol durch die lockere Bindung über Sauerstoff- und Stickstoffatome über das
elektronen-defiziente Boratom des Perborations hinweg einen instabilen
Komplex mit Perborat. In der Gegenwart des Chelatisierungsmittels
(Glycin in Schema 1 oder SSA in Schema 2) bildet sich ein alternativer
Komplex, da die Chelatisierungsmittel eine geeignete molekulare
Geometrie aufweisen, um Luminol in den Komplex zu ersetzen. Wir
glauben, daß dadurch
die Hintergrundlumineszenz wesentlich verringert werden kann.
-
1.
Vorgeschlagene Interaktion zwischen Perborat, Luminol und Glycin
-
2.
Vorgeschlagene Interaktionen zwischen Perborat, Luminol und Sulfosalicylsäure (SSA)
-
Die
vorliegende Erfindung kann auf jedes chemilumineszente analytisches
Verfahren angewendet werden, ohne besondere Einschränkungen
solange ein geeigneter Katalysator wie ein Peroxidaseenzym verwendet
wird und mit Luminol oder einem substituierten Luminol und Perborat
in einem wäßrigen Lösungsmittel reagiert
wird und die Lumineszenz dann nachgewiesen und gemessen wird. Vorzugsweise
ist der Katalysator ein Peroxidaseenzym, das als Markierungssubstanz
gut bekannt ist und das umfassend in Testverfahren, die auf immunologischen
Reaktionen und Nukleinsäurehybridisierungstechniken
basieren, verwendet worden ist. Beispielsweise kann die Peroxidase
unter Verwendung eines zielspezifischen Bindungsreagenz an ein Ziel
gebunden werden. Das Peroxidase-gebundende Ziel wird isoliert und
mit Luminol und Perborat in einem wäßrigen Lösungsmittel zur Reaktion gebracht.
Das Luminol oder das substituierte Luminol und das Perborat in einem
wäßrigen Lösungsmittel
werden als Signalreagenz bezeichnet.
-
Der
Begriff "zielspezifische
Bindungsreagenz" wie
hierin verwendet bezeichnet eine Substanz, die spezifisch an ein
zu analysierendes Ziel binden kann. Das Ziel kann ein physiologisch
aktives Peptid, ein Hormon, eine Nukleinsäure und ähnliche Substanzen umfassen.
Wenn das zu analysierende Ziel in der Lage ist als Antigen zu wirken,
kann ein Antikörper
(umfassenden polyklonale und monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und ähnliche)
ein zielspezifisches Bindungsreagenz werden. Wenn das zu analysierende
Ziel eine Nukleinsäure
ist, kann ihre komplentäre
(Einzelstrang) Nukleinsäure
oder ein Nukleinsäurefragment
ein zielspezifisches Bindungsreagenz sein.
-
Als
chelatisierendes Mittel kann in der Erfindung jedes nicht-lumineszierende
chelatisierende Mittel, das eine geeignete molekulare Geometrie
aufweist, d.h. jedes nicht-lumineszierende chelatisierende Mittel
für die
Chelatisierung eines Elektronen-Defizienten
Boratoms in einem Perboration verwendet werden.
-
Geeignete
chelatisierende Mittel sind Verbindungen, die eine Zähnigkeit
von mindestens zwei aufweisen. Bevorzugte Bindungsanordnungen sind
zweizähnig,
wobei eine Chelatringgröße von 5-
oder 6-Ringen besonders bevorzugt ist. Es ist bevorzugt, daß für die Bindung
innerhalb dieser Systeme mindestens eine Ligandengruppe eine elektronegative
Ladung trägt.
Mehrzähnige
oder makrozyklische Liganden verringern die Wahrscheinlichkeit,
daß das
Perborat sich löst
und führen
zu bevorzugten Systemen. Bevorzugte chelatisierende Mittel sind
Glycin und Sulfosalicylsäure
(SSA) aber andere können
auch verwendet werden. Die Konzentration des chelatisierenden Mittels,
das geeigneter Weise in einer typischen Signalreagenz vorhanden
ist, ist innerhalb des Bereiches von 4 bis 15 mmol/l aber diese
Konzentration hängt
im gewissen Maße
von den anderen Komponenten des Signalreagenzes ab. Geeigneter Weise
ist das chelatisierende Mittel sowohl hinsichtlich des Perborats
und des Luminols in einem stöchometrischen Übschuß in dem
Signalreagenz vorhanden. In einem typischen Signalreagenz wird das
chelatisierende Mittel in einer molaren Menge zwischen dem zwei-
und dem zehnfachen der molaren Mengen des darin vorhandenen Luminols
und Perborats vorhanden sein.
-
Das
in den analytischen Verfahren der Erfindung verwendete wäßrige Lösungsmittel
und das in dem Signalreagenz vorhanden ist, ist im allgemeinen Wasser
oder ein Puffer. Geeignete Puffer umfassen die Puffer, die im allgemeinen
in biochemischen Reaktionen verwendet werden, insbesondere umfassend
Phosphatpuffer und Boratpuffer. Es kann bemerkt werden, daß in Gegenwart
eines Boratpuffers und von Wasserstoffperoxid die Komplexe, die
in den Reaktionsschemata 1 und 2 erwähnt sind, gebildet werden können (J.
Flanagan et al., J. Chem. Soc., Dorten Tarans, 1651, 1989: BN Chernyshov,
Russian J. Inorg. Chem, 35 (neu) 1333, 1990). Geeigneterweise hat
der Puffer einen pH im Bereich 5 bis 12 und vorzugsweise im Bereich
von 7 bis 11. pH-Werte unter 5 sind außerhalb des für die Enzyme
optimalen pH-Bereichs für
Peroxidaseenzyme, so daß die
emitierte Lumineszenz niedriger wird. pH-Werte über 12 sind auch außerhalb
des optimalen Bereichs führen
in diesem Fall jedoch zu stärkerer
Lumineszenz, die nicht auf der Aktivität der Peroxidase beruht, d.h.
sie führen
zu nichtspezifischer Lumineszenz.
-
Der
bevorzugte Katalysator ist ein Peroxidaseenzym aber andere anerkannte
Katalysatoren können auch
verwendet werden, umfassend Porphyrine wie NPll (Mikroperoxidase).
Das Peroxidaseenzym, das als Markierungsubstanz verwendet wird,
ist geeigne terweise ein basisches Isoenzym des Meerrettichs (Meerrettichperoxidase
oder HRP). Geeignete Isoenzyme der Meerrettichperoxidase umfassen
Typ VI und Typ IX erhältlich
von Sigma Chemical, Poole, Dorset, wobei Typ VI für die Verwendung
in der Erfindung bevorzugt ist.
-
Die
Bindung zwischen dem zielspezifisch bindenden Bindungsreagenz und
dem Peroxidaseenzym (d.h. die Markierung des Bindungsreagenz mit
dem Enzym) kann mit jedem geeigneten Mittel erreicht werden. Das
Bindungsreagenz und die Peroxidasemarkierung kann durch Verfahren,
die in M. Brinklake, Bioconj. Can., 3 Seite 2 (1991) beschrieben
werden oder durch ähnliche
Verfahren, direkt aneinander gebunden werden. Alternativ kann das
zielspezifische Bindungsreagenz mit einer ersten chemischen Gruppe
wie einer Biotinylgruppe ausgestattet werden, gefolgt von einer
Reaktion mit einer Peroxidase, die eine zweite chemische Gruppe enthält, die
mit der ersten Gruppe reaktiv ist, wie die ein Avidin- oder Streptavidinrest,
so daß das
Bindungsreagenz indirekt markiert wird.
-
Das
Luminol für
die Verwendung in der Erfindung ist geeigneterweise Natriumluminol.
Das verwendete Perborat ist vorzugsweise Natriumperborat. Es ist
als eine Quelle für
das Wasserstoffperoxid, ein Substrat des Peroxidaseenzyms, vorhanden.
-
Vorzugsweise
enthält
das Signalreagenz eine Verbindung, die die Chemiluminesenzreaktion
verstärken
kann, wie die, die in U.S.P. 4,842,997 und U.S.P. 5,279,940 beschrieben
sind. In der vorliegenden Erfindung kann jeder Verstärker verwendet
werden, der einen Elektronentransfer vom Wasserstoffperoxid (abgeleitet
aus dem Perborat) über
die Peroxidase zum Luminol ermöglicht
und eine verstärkende
Wirkung zeigen kann. Geeignete Verstärker umfassen 4-Iodphenol,
4-Bromphenol, 4-Chlorphenol, 4-Phenylphenol, 2-Chlor-4-phenylphenol,
6-Hydroxybenzotiazol, 4-[41-(21-Metyl)thiazolyl]phenol,
4-[21-(41-Metyl)thiazolyl]phenol,
4-(21-Benzothiazolyl)phenol, 3-(10-Phenothiazyl)-n-propylsulfonat
und 3-Chlor,4-Hydroxyacetanilid. Wenn die Reaktion zwischen dem
Luminol und dem Wasserstoffperoxid durch die Peroxidase in Ge genwart
eines geeigneten Verstärkers
zustande kommt, verstärkt
der Verstärker
die Oxidationsrate des Enzyms. Zusätzlich zu den nicht-lumineszierenden
chelatisierenden Mittel, das in dem Signalreagenz umfaßten, um
mit Luminol zu kompetieren, können
andere chelatisierende Mittel enthalten sein, um unerwünschte Metallionen
zu entfernen oder für
andere Zwecke.
-
Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlicht, deren
Ergebnisse graphisch in den 1 und 2 der begleitenden Zeichnung
wiedergegeben sind, wobei die Zeichnungen sind:
-
1: eine Kurve der Prozente
der Kontrolluminesenz, Hintergrundluminesenz und des Signal-Rauschverhältnisses,
die die Wirkung des Hinzufügens
von Glycin zu der Peroxidase/Luminol/Perborat verstärkten Chemilumineszenzreaktion
des Beispiels 1 zeigt; und
-
2: eine Kurve der Lichtemission
in willkürlichen
Lichteinheiten aufgetragen gegen die Konzentration des Thyroid-stimulierenden
Hormons (TSH), die die Wirkung hinzugefigten Glycins auf die Dosis-Antwortkuve
eines chemilumineszenten TSH-Immun-Testverfahrens
des Beispiels 2 zeigt.
-
Beispiel 1
-
Glycin
wurde zu Natriumluminolperborat bei einem pH 8,5 in einem Boratpuffer,
der Citrat und 3-Chlor,4-Hydroxyacetanilid (ein Chemilumineszenzverstärker) enthielt,
hinzugefügt: Reagenzzusammensetzung:
| Chemikalie | Konzentration |
| | (mmol
pro Liter in Wasser) |
| Borsäure | 57,5 |
| Natriumtetraborat | 17,5 |
| Natriumperborat | 2,00 |
| Tri-Natriumcitrat | 4,65 |
| Zitronensäure | 2,15 |
| Kaliumchlorid | 100,0 |
| 3-Chlor,4-hydroxyacetanilid | 0,15 |
| Natriumluminol | 1,00 |
| Glycin | 0
bis 15,00 |
-
Wenn
die Glycinkonzentration erhöht
wurde, wurde eine Verringerung der Hintergrunchemilumineszenz beobachtet.
Bei Glycinkonzentrationen über
4 mmol/l stabilisierte sich das Hintergrundlicht bei etwa 40% seiner
Anfangsstärke.
Die Lumineszenz, die durch das Hinzufügen von etwa 100 attomol (1016 mol) Meerrettichperoxidase zu 250 Mikrolitern
von war die Chemilumineszenzbildung durch die Gegenwart von Glycin
nicht beeinflußt,
wobei Letzteres nützlich
erhöhte
Signalverhältnisse
erzeugte (siehe 1).
-
Die
Lumineszenz wurde in weißen
Mikrotitervertiefungen unter Verwendung eines "Amerlite" Registriertes Warenzeichen Analysator,
Johnson & Johnson
Clinical Diagnostics Limited (J&JCDL),
Amersham, UK durchgeführt.
-
Beispiel 2
-
Die
Chemilumineszenzzusammensetzung des Beispiels 1, die entweder 0
oder 5 mmol pro Liter Glycin enthielt, wurde durch das kommerzielle
Chemilumineszenzreagenz des "Amerlite" TSH-30 Ultrasensitive Immunoassay
Kit (TSH bedeutet menschliches Thyroid-stimulierendes Hormon), das
von J&JCDL, Amersham,
UK erhältlich
ist, ersetzt. Die folgenden Ergebnisse wurden unter Verwendung des
publizierten Protokolls für
das Testverfahren erhalten:
-
Mit
Glycin wurde aufgrund der Reduktion lichtspezifischer Hintergrundchemilumineszenz
ein verringertes Nullstandardsignal beobachtet. Es gab dementsprechend
ein höheres
Signalverhältnis
zwischen dem ersten und dem zweiten Standards des Testverfahrens
("B"/"A"-Verhältnis).
Unter Annahme einer linearen Dosis-Antwort-Charakteristik zwischen den zwei Standards
zeigt die statistische Analyse, daß sich die niedrigere Nachweisgrenze
für TSH
(Sensitivität
des Testverfahrens) in Gegenwart von Glycin von 0,0023 auf 0,0014
milli-Internationaleeinheiten pro Liter verbesserte. Dies beinhaltet
eine größere Kapazität des Testverfahrens niedriger
Mengen des TSHs aufzulösen – ein deutlicher
Vorteil dieses Testtyps. Andere Leistungsparameter des Testverfahrens
wurden durch das Hinzufügen
von Glycin nicht betroffen (siehe 2).
