DE3587793T2 - Lumineszierende metallchelatmarker und mittel zu deren nachweis. - Google Patents

Lumineszierende metallchelatmarker und mittel zu deren nachweis.

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Description

  • Es existiert ein beständiger und steigender Bedarf an schnellen, hochspezifischen Verfahren zum Detektieren und Quantifizieren von chemischen, biochemischen und biologischen Substanzen. Von besonderem Wert sind Verfahren zum Messen kleiner Mengen von Arzneimitteln, Metaboliten, Mikroorganismen und anderen Substanzen mit diagnostischem Wert. Beispiele für solche Materialien umfassen Narkotika und Gifte, Arzneimittel bzw. Drogen, die für therapeutische Zwecke verabreicht werden, Hormone, pathogene Mikroorganismen und Viren, Antikörper, Metaboliten, Enzyme und Nukleinsäuren.
  • Das Vorhandensein dieser Substanzen kann häufig durch Bindungsverfahren bestimmt werden, die den hohen Grad an Spezifität nutzen, der viele biochemische und biologische Systeme auszeichnet. Häufig verwendete Verfahren beruhen beispielsweise auf Antigen-Antikörpersystemen, Nukleinsäurehybridisierungstechniken und Protein-Liganden-Systemen. In diesen Verfahren wird die Existenz des Komplexes mit diagnostischem Wert typischerweise durch das Vorhandensein oder Fehlen eines beobachtbaren "Markers" erkennbar gemacht, der an eine oder mehrere der komplexierenden Substanzen gebunden wurde.
  • Das gewählte spezifische Markierungsverfahren bestimmt häufig den Wert und die Vielseitigkeit eines bestimmten Systems zum Auffinden eines interessierenden Materials. Ein bevorzugter Marker sollte preiswert, sicher und in der Lage sein, wirksam an eine Vielzahl von chemischen, biochemischen und biologischen Substanzen gebunden werden zu können, ohne daß dies die wichtigen Bindungseigenschaften dieser Materialien ändert. Der Marker sollte ein hochcharakteristisches Signal liefern und kaum oder vorzugsweise gar nicht in der Natur zu finden sein. Der Marker sollte in wäßrigen Systemen über Zeiträume im Bereich bis zu mehreren Monaten stabil und auffindbar sein. Die Detektion des Markers sollte schnell, empfindlich und reproduzierbar sein, ohne daß teure, spezielle Einrichtungen oder solches Personal benötigt würden. Die Quantifizierung des Markers sollte relativ unabhängig von Variablen wie Temperatur und Zusammensetzung der zu untersuchenden Mischung sein. Besonders vorteilhaft sind Marker, die man in homogenen Systemen verwenden kann, d. h. in Systemen, in denen die Trennung der komplexierten und der nicht komplexierten markierten Substanz nicht notwendig ist. Dies ist dann möglich, wenn die Detektierbarkeit des Markers verändert ("moduliert") wird, wenn die markierte Substanz in einen spezifischen Komplex eingebaut wird.
  • Es wurde eine Vielzahl von Markern entwickelt, die jeweils bestimmte Vorteile und Nachteile aufweisen. Beispielsweise sind radioaktive Marker sehr vielseitig und können bei sehr geringen Konzentrationen detektiert werden. Sie sind jedoch teuer, gefährlich, und ihre Verwendung erfordert hochentwickeltes Gerät und ausgebildetes Personal. Darüberhinaus ist die Empfindlichkeit von radioaktiven Markern durch die Tatsache beschränkt, daß das detektierbare Ereignis in seiner ihm eigenen Natur nur einmal pro radioaktivem Atom im markierten Material auftreten kann. Darüberhinaus können radioaktive Marker in homogenen Verfahren nicht verwendet werden.
  • Es besteht deshalb ein großes Interesse an nicht radioaktiven Markern. Diese umfassen Moleküle, die durch Spektophotometrie, Spinresonanz und Lumineszenztechniken beobachtbar sind, wie auch Enzyme, die solche Moleküle erzeugen. Unter den brauchbaren nicht radioaktiven markierenden Substanzen sind organometallische Verbindungen. Wegen der Seltenheit einiger Metalle in biologischen Systemen können Verfahren, die spezifisch den Metallbestandteil der organometallischen Verbindungen bestimmen, erfolgreich eingesetzt werden. Beispielsweise offenbart Cais, US-Patent Nr. 4.205.952 die Verwendung immunchemisch aktiver Substanzen, die mit bestimmten organometallischen Verbindungen markiert sind, für die Verwendung bei der Quantifizierung spezifischer Antigene. Jedes beliebige Verfahren zum Auffinden der gewählten Metalle kann bei diesen Markern verwendet werden, einschließlich Emissions-, Absorptions- und Fluoreszenz-Spektrometrie, Atomabsorption und Neutronenaktivierung. Diesen Verfahren mangelt es häufig an Empfindlichkeit, sie können nur selten an ein homogenes System adaptiert werden, und sie verursachen, beispielsweise bei der Atomabsorption, die Zerstörung der Probe.
  • Von besonderem Interesse sind Marker, die man auf photochemischem, chemischem und elektrochemischem Wege zu Lumineszenz anregen kann. "Photolumineszenz" ist das Verfahren, wodurch ein Material zu Lumineszenz angeregt wird, wenn es elektromagnetische Strahlung absorbiert. Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind Typen der Photolumineszenz. "Chemilumineszenz"-Verfahren erfordern die Erzeugung der lumineszierenden Spezies mit Hilfe einer chemischen Energieübertragung. "Elektrochemilumineszenz" umfaßt die Erzeugung der lumineszierenden Spezies auf elektrochemischem Wege.
  • Diese lumineszierenden Systeme sind von wachsender Bedeutung. Beispielsweise offenbart Mandle, US-Patent Nr. 4.372.745 die Verwendung von chemilumineszierenden Markern für immunchemische Anwendungen. In den offenbarten Systemen werden die Marker mit chemischen Mitteln, beispielsweise durch Umsetzung des Markers mit H&sub2;O&sub2; und einem Oxalat, zu einem lumineszierenden Zustand angeregt. In diesen Systemen wandelt H&sub2;O&sub2; das Oxalat oxidativ in ein hochenergetisches Derivat um, das dann den Marker anregt. Dieses System funktioniert im Prinzip mit jedem beliebigen lumineszierenden Material, das unter den oxidierenden Bedingungen des Tests stabil ist und durch das hochenergetische Oxalat-Derivat angeregt werden kann. Unglücklicherweise ist diese enorme Vielfältigkeit Quelle für eine starke Einschränkung der Technik: typische biologische, den interessierenden Analyten enthaltende Fluide enthalten auch eine große Anzahl von potentiell lumineszierenden Substanzen, die hohe Hintergrundwerte an Lumineszenz verursachen können.
  • Ein anderes Beispiel für die immunchemische Verwendung von Lumineszenz, die die gleichen Nachteile aufweist, ist Oberhardt et al, US-Patent Nr. 4.280.815, der die in situ erfolgende elektrochemische Erzeugung eines Oxidationsmittels (z. B. H&sub2;O&sub2;) in direkter Nähe zu einem Immunreagens offenbart, das mit einer chemilumineszierenden Spezies markiert ist. Das elektroerzeugte Oxidationsmittel diffundiert zu der chemilumineszierenden Spezies und oxidiert sie auf chemischem Weg, was zu einer Netto- Übertragung von einem oder mehreren Elektronen auf das elektroerzeugte Oxidationsmittel führt. Nach der Oxidation emittiert die chemilumineszierende Spezies ein Photon. Im Gegensatz dazu erfordert die vorliegende Erfindung die direkte Übertragung von Elektronen von einer Quelle elektrochemischer Energie auf eine chemilumineszierende Spezies, die wiederholt Photonen emittieren kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft elektrochemilumineszierende Marker. Geeignete Marker umfassen elektrochemilumineszierende Verbindungen, einschließlich organischer Verbindungen und organometallischer Verbindungen. Elektrochemilumineszenzverfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins markiert er Substanzen sind aus vielen Gründen gegenüber anderen Verfahren bevorzugt. Sie sind von hohem diagnostischem Wert in Bezug auf das Vorhandensein eines bestimmten Markers, empfindlich, nicht gefährlich zu handhaben, preiswert, und sie können bei einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden. Organische Verbindungen, die geeignete elektrochemische Marker sind, umfassen beispielsweise Rubren und 9,10-Diphenylanthracen. Viele organometallische Verbindungen sind geeignete elektrochemische Marker, jedoch sind Ru enthaltende und Os enthaltende Verbindungen von besonderer Brauchbarkeit.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Ru enthaltenden und Os enthaltenden Markern, die mittels einer Vielzahl von Verfahren aufgefunden werden können. Diese Marker sind aus vielerlei hier nachfolgend diskutierten Gründen vorteilhaft.
  • Ru enthaltende und Os enthaltende organometallische Verbindungen sind in der Literatur diskutiert worden. Cais offenbart, daß ein beliebiges Metallelement oder eine beliebige Kombination von Metallelementen einschließlich der Edelmetalle der Gruppe VIII wie z. B. Ru geeignete Bestandteile von durch Atomabsorptionsverfahren auffindbaren organometallischen Markern sind (Cais, Spalte 11, Zeile 20). Ruthenium ist bei Cais jedoch kein bevorzugtes Metall, Osmium ist nicht im einzelnen erwähnt, es werden keine Daten bezüglich der Wirksamkeit der Verwendung von Ru oder Os in einem der offenbarten Verfahren angegeben, und das bevorzugte Verfahren der Detektion, Atomabsorption, bewirkt die Zerstörung der Probe.
  • Weber, US-Patent Nr. 4.293.310, offenbart die Verwendung von Ru enthaltenden und Os enthaltenden Komplexen als elektrochemische Marker für Analyte in Immunoassays. Die offenbarten Komplexe sind durch eine Thioharnstoffbindung an Aminogruppen des Analyten gebunden. Weber schlägt auch die Möglichkeit der Bildung von Carboxylatestern zwischen den Markern und Hydroxygruppen an anderen Analyten vor.
  • Gemäß Weber kann das Vorhandensein der markierten Substanzen mit einer Vorrichtung und einem Verfahren bestimmt werden, welches einen Löscher (Quencher) und eine elektrochemische Durchflußzelle mit Lichtauslaß umfaßt. Der photoelektrochemisch aktive Marker überträgt nach der Photoanregung ein Elektron auf ein Löscher-Molekül; im Anschluß daran wird das oxidierte Molekül mit einem Elektron aus einer Elektrode der Durchflußzelle, die auf einem geeigneten Potential gehalten wird, reduziert. Dieses Elektron wird als Photostrom gemessen. Die Menge an freiem markiertem Analyten im System wird durch das Photostromsignal festgestellt. Es ist anzumerken, daß dieses Verfahren die Umkehrung einer Elektrochemilumineszenz-Detektion von lumineszierenden Substanzen ist.
  • In späteren Berichten haben Weber et al. (1983), Clinical Chemistry 29, Seiten 1665-1672, "Photoelectroanalytical Chemistry: Possible Interferences in Serum and Selective Detection of Tris(2,2'-blpyridine)ruthenium(II) in the Presence of Interferents", die mit der Verwendung dieses Verfahrens zum Auffinden von Ru enthaltenden Markern verbundenen Probleme diskutiert. In Tabelle 2 von Weber et al. beträgt die extrapolierte Detektionsgrenze für Tris(bipyridyl)ruthenium(II) 1,1 · 10&supmin;¹&sup0; mol/l unter optimalen Bedingungen. Da sie vermuteten, daß die tatsächliche Verwendung dieser Marker Messungen in Gegenwart komplexer Mischungen umfassen würde, untersuchten Weber et al. ihr System auf mögliche interferierende Einflüsse. Tabelle 3 von Weber et al. führt Dimethylalkylamine, EDTA, N-Methylmorpholin, N,N'-Dimethylpiperazin, Hydroxid, Oxalat, Ascorbat, Harnsäure und Serum als interferierende Substanzen auf, die vermutlich die praktische Detektionsgrenze auf wesentlich mehr als 1,1 · 10&supmin;¹&sup0; mol/l anheben wurden.
  • Diese Studien wurden mit einer einfachen Ru enthaltenden Verbindung durchgeführt. In Weber oder Weber et al. wurde weder über Untersuchungen in Bezug auf die Detektionsgrenzen von mit Ru-haltigen Markern markierten komplexen Substanzen noch darüber berichtet, ob die Thioharnstoffbindung zwischen der markierten Substanz und dem Marker unter den Untersuchungsbedingungen stabil ist.
  • Die spezifischen Marker, mit denen sich die vorliegende Erfindung beschäftigt, sind elektrochemilumineszierend. Sie können häufig zu einem lumineszierenden Zustand angeregt werden, ohne daß sie oxidiert oder reduziert würden, indem man die Verbindungen elektromagnetischer Strahlung oder einer chemischen Energiequelle wie derjenigen, die durch typische Oxalat-H&sub2;O&sub2;-Systeme erzeugt wird, aussetzt. Darüberhinaus kann Lumineszenz dieser Verbindungen durch elektrochemische Verfahren induziert werden, die ihre Oxidation und Reduktion mit umfassen.
  • Über ausführliche Arbeiten in Bezug auf Verfahren zum Auffinden von Ru(2,2'-bipyridin)&sub3;²&spplus; unter Verwendung von photolumineszierenden, chemilumineszierenden und elektrochemilumineszierenden Mitteln wurde berichtet: Rubinstein und Bard (1981), "Electrogenerated Chemiluminescence. 37. Aqueous Ecl Systems based on Ru(2,2'-bypyridine)&sub3;²&spplus; and Oxalate or Organic Acids", J. Am. Chem. Soc., 103, Seiten 512-516; und White und Bard (1982), "Electrogenerated Chemiluminescence. 41. Electrogenerated Chemiluminescence and Chemiluminescence of the Ru(2,2'-bpy)&sub3;²&spplus; - S&sub2;O&sub8;²&supmin; System in Acetonitrile-Water Solutions" J. Am. Chem. Soc., 104, Seite 6891. Diese Arbeit zeigt, daß hellorangefarbene Chemilumineszenz auf der in wäßrigem Milieu erfolgenden Umsetzung von chemisch erzeugtem oder elektrogeneriertem Ru(bpy)&sub3;³&spplus; (worin "bpy" einen Bipyridyl-Liganden darstellt) mit als Zwischenprodukte bei der Oxidation von Oxalat-Ionen oder anderen organischen Säuren erzeugten starken Reduktionsmitteln beruhen kann. Luminszenz kann auch durch Umsetzung von elektrogeneriertem oder chemisch erzeugtem Ru(bpy)&sub3;¹&spplus; mit starken, während der Reduktion von Peroxydisulfat erzeugten Oxidationsmitteln in Lösungen aus organischem Solvens- H&sub2;O erreicht werden. Ein dritter Mechanismus für die Erzeugung von Elektrochemilumineszenz aus Ru(bpy)&sub3;²&spplus; umfaßt die Oszillation eines Elektrodenpotentials zwischen einem Potential, das ausreichend negativ ist, um Ru(bpy)&sub3;¹&spplus; zu erzeugen, und ausreichend positiv ist, um Ru(bpy)&sub3;³&spplus; zu erzeugen. Diese drei Verfahren werden als "Oxidativ-Reduktion", "Reduktiv-Oxidation" bzw. "Das regenerative Ru(bpy)&sub3;³&spplus;/&spplus; System" bezeichnet.
  • Das Oxidativ-Reduktionsverfahren kann in Wasser durchgeführt werden und erzeugt eine intensive, wirkungsvolle, stabile Lumineszenz, die gegenüber dem Vorhandensein von. Sauerstoff oder Verunreinigungen relativ unempfindlich ist. Diese Lumineszenz von Ru(bpy)&sub3;²&spplus; hängt von dem Vorhandensein von Oxalat oder anderen organischen Säuren wie beispielsweise Pyruvat, Lactat, Malonat, Tartrat und Citrat und Mitteln zum oxidativen Erzeugen der Ru(bpy)&sub3;³&spplus;-Spezies ab. Diese Oxidation kann chemisch mit Hilfe solch starker Oxidationsmittel wie PbO&sub2; oder einem Ce(IV)-Salz durchgeführt werden. Sie kann elektrochemisch mit Hilfe eines ausreichend positiven Potentials, das entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich angelegt wird, durchgeführt werden. Geeignete Elektroden für die elektrochemische Oxidation von Ru(bpy)&sub3;²&spplus; sind beispielsweise Pt, pyrolytischer Graphit und glasartiger Kohlenstoff. Obwohl das Oxalat oder andere organische Säure während der Chemilumineszenz verbraucht wird, kann bei Vorhandensein eines Überschusses an der Substanz, die verbraucht wird, oder dadurch, daß das zu verbrauchende Material kontinuierlich der Reaktionskammer zugeführt wird, über Stunden hinweg eine starke, konstante Chemilumineszenz erreicht werden.
  • Das Reduktiv-Oxidations-Verfahren kann in zu einem- Teil Wasser enthaltenden Lösungen mit einem organischen Co-Solvens wie beispielsweise Acetonitril durchgeführt werden. Diese Lumineszenz hängt vom Vorhandensein von Peroxydisulfat und einem Mittel zum reduktiven Erzeugen der Ru(bpy)&sub3;¹&spplus;-Spezies ab. Die Reduktion kann chemisch mit Hilfe starker Reduktionsmittel wie beispielsweise Magnesium oder anderen Metallen durchgeführt werden. Sie kann elektrochemisch mit Hilfe eines ausreichend negativen Potentials, das entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich angelegt wird, durchgeführt werden. Eine geeignete Elektrode für die elektrochemische Reduktion von Ru(bpy)&sub3;²&spplus; ist beispielsweise eine polierte Elektrode aus glasartigem Kohlenstoff. Wie beim Oxidativ-Reduktions-Verfahren kann durch die Einbeziehung von überschüssigen Reagenzien oder durch die kontinuierliche Zugabe der zu verbrauchenden Reagenzien zur Reaktionsmischung über viele Stunden hinweg eine intensive Lumineszenz erreicht werden.
  • Das regenerative Ru(bpy)&sub3;³&spplus;/&spplus;-System kann in organischen Solventien, wie beispielsweise Acetonitril, oder in zum Teil Wasser enthaltenden Systemen durch In-Schwingung-Versetzen ("Pulsen") eines Elektroden-Potentials zwischen einem Potential, das ausreichend negativ ist, um Ru(bpy)&sub3;²&spplus; zu reduzieren, und einem Potential, das ausreichend positiv ist, um Ru(bpy)&sub3;²&spplus; zu oxidieren, ausgeführt werden. Eine geeignete Elektrode für ein solches regeneratives System ist beispielsweise eine Pt-Elektrode. Dieses System konsumiert keine chemischen Reagenzien und kann im Prinzip für eine unbegrenzte Dauer arbeiten.
  • Diese drei Verfahren zum Erzeugen von lumineszierenden, Ru enthaltenden Verbindungen haben die wiederholte Oxidations-Reduktion oder Reduktions-Oxidation der Ru enthaltenden Verbindung gemeinsam. Die Lumineszenz von Lösungen, die diese Verbindungen enthalten, ist deshalb in hohem Maße vom elektrischen Potential der angewendeten Energiequelle abhängig und besitzt deshalb in hohem Maße diagnostischen Wert bezüglich des Vorhandenseins einer Ru enthaltenden Verbindung.
  • Mandle zitiert Curtis et al. (1977), "Chemiluminescence; A New Method for Detecting Fluorescent Compounds Separated By Thin Layer Chromatography", J. Chromatography 134, Seiten 343-350, damit, daß dieser Ru-tris(biyridyl) (II) als möglichen Marker für Chemilumineszenz-Anwendungen angibt. Curtis et al. berichtet nur über unveröffentlichte Beobachtungen, daß Ru-Komplexe zu Lichtemission angeregt werden können, wenn sie durch ein Oxalat/H&sub2;O&sub2;-System chemisch angeregt werden (Curtis et al., Seite 350).
  • Weder Mandle noch Curtis erkannten die außerordentliche Brauchbarkeit von Ruthenium- und Osmium-Komplexen für Chemilumineszenz-Anwendungen oder die Einsetzbarkeit elektrochemilumineszierender Systeme. Sprintschnik, G. et al. (1977), "Preparation and Photochemical Reactivity of Surfactant Ruthenium (II) Complexes in Monolayer Assemblies and at Water-Solid Interfaces", J. Am. Chem. Soc. 99, Seiten 4947-4954, haben Komplexe von Tris(2,2'- bipyridin)ruthenium(II) beschrieben, die mit Octadecanol oder Dehydrocholesterin verestert waren, und sie haben Monolayer- Schichten dieser oberflächenaktiven Komplexe erzeugt. Die Komplexe waren photolumineszierend. Wenn die Schichten jedoch Wasser und dann Licht ausgesetzt wurden, zeigten die Ru-Komplexe keine Photolumineszenz mehr. Dies war auf die Photohydrolyse von Estergruppen in Gegenwart von Licht zurückzuführen.
  • Es wurde nun gefunden und wird hier vorliegend offenbart, daß eine Vielzahl von interessierenden Analyten und chemischen Verbindungen/Gruppen, die an interessierende Analyte binden, durch Amid- oder Amin-Bindungen bequem an Ru enthaltende oder Os enthaltende Marker gebunden werden können. Die markierten Substanzen können dann mit Hilfe elektrochemilumineszenzerzeugender Mittel bestimmt werden. Es wird ferner vorliegend offenbart, daß elektrochemilumineszierende Marker einschließlich von Ru enthaltenden und Os enthaltenden Markern und organischen Molekülen, wie beispielsweise Rubren und 9,10-Diphenylanthracen besonders vielseitig und vorteilhaft sind. Die großen Vorteile der Verwendung dieser neuen markierten Substanzen und der Verfahren zu ihrer Detektion werden nachfolgend eingehender diskutiert.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß wird eine chemische Verbindung/Gruppe mit der Formel
  • [M(P)m(L¹)m(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
  • bereitgestellt, worin M Ruthenium oder Osmium ist, P ein mehrzähniger aromatischer, heterocyclischer, stickstoffhaltiger Ligand von M ist; L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; aromatische, heterocyclische, stickstoffhaltige Liganden von M sind, von denen jeder mit jedem anderen Liganden identisch oder auch nicht identisch sein kann; B eine kovalent über eine oder mehrere Amid- oder Amin-Bindungen an einen oder mehrere der Liganden P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; oder L&sup6; gebundene Substanz ist; m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist; n, o, p, q, r und s jeweils Null oder eine ganze Zahl sind; t eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist; u eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist; wobei P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5;, L&sup6; und B von einer derartigen Zusammensetzung und Zahl sind, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden kann und wobei die Gesamtzahl der von den Liganden von M für M zur Verfügung gestellten Bindungen der Koordinationszahl von M entspricht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen bereit, die sich besonders als Zwischenverbindungen zum Binden eines lumineszierenden, Ruthenium oder Osmium enthaltenden Markers an Aminogruppen chemischer, biochemischer und biologischer Substanzen eignen. Diese Zwischenverbindungen eignen sich daher besonders zum Erzeugen erfindungsgemäßer chemischer Verbindungen/Gruppen. Die Zwischenverbindungen sind die Mono- und Di-N-hydroxysuccinimidester von Ruthenium- oder Osmium-bis(2,2'-bipyridin) (2,2'-bipyridin-4,4'-dicarbonsäure) und deren Salze; und Ruthenium- oder Osmium-bis(2,2'-bipyridin) (4,4'-di(chlormethyl)- 2,2'-bipyridin). Diese Verbindungen können mit im Stand der Technik bekannten Mitteln synthetisiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Feststellen bzw. Bestimmen des Vorhandenseins der neuen chemischen Verbindungen/Gruppen bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Feststellen bzw. Bestimmen des Vorhandenseins einer chemischen Verbindung/Gruppe mit der wie oben definierten Formel zur Verfügung.
  • Das Verfahren umfaßt:
  • a) Das Bilden eines Reagenzgemisches mit der chemischen Verbindung/Gruppe unter geeigneten Bedingungen;
  • b) Das Anregen der Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz, indem die Reaktionsmischung elektrochemischer Energie ausgesetzt wird; und
  • c) das Nachweisen emittierter Lumineszenz und dadurch das Bestimmen des Vorhandenseins der chemischen Verbindung/Gruppe.
  • Diese Erfindung stellt weiterhin die Verwendung Ruthenium enthaltender und Osmium enthaltender Marker in Bindungsverfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins von interessierenden Substanzen bereit. Diese Verfahren können verwendet werden, um markierte interessierende Verbindungen/Gruppen zu bestimmen, um markierte Verbindungen/Gruppen zur Bestimmung interessierender Analyte einzusetzen, oder um markierte Analoge von interessierenden Analyten einzusetzen, um damit interessierende Analyte in kompetitierende Bindung nutzenden Tests zu bestimmen. Diese Bindungsverfahren können homogene oder heterogene Bindungsverfahren sein.
  • Darüberhinaus stellt die vorliegende Erfindung Systeme zum Feststellen/Bestimmen des Vorhandenseins der Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden chemischen Verbindungen/Gruppen dieser Erfindung zur Verfügung. Diese Systeme umfassen ein Mittel zum Anregen von Elektrochemilumineszenz in der chemischen Gruppe/Verbindung und ein Mittel zum Detektieren emittierter Lumineszenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Systeme zum Verwenden der Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden chemischen Verbindungen/Gruppen in Bindungsverfahren für die Bestimmung von interessierenden Analyten bereit.
  • Ferner stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung elektrochemilumineszierender Marker in Bindungsverfahren zum Feststellen/Bestimmen des Vorhandenseins von interessierenden Substanzen bereit. Diese Verfahren können verwendet werden, um markierte interessierende Verbindungen/Gruppen zu bestimmen, um markierte Verbindungen/Gruppen für die Bestimmung interessierender Analyte einzusetzen, oder um markierte Analoge von interessierenden Analyten zu verwenden, um damit interessierende Analyte in kompetitive Bindung nutzenden Tests zu bestimmen. Diese Bindungsverfahren können homogene oder heterogene Bindungsverfahren sein.
  • Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die zwei oder mehr verschiedene chemische Verbindungen/Gruppen enthalten. Jede der Verbindungen/Gruppen kann eine chemische Spezies sein, die zur Emission von Elektrochemilumineszenz einer anderen bzw. unterschiedlichen Wellenlänge angeregt werden kann. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die chemischen Verbindungen/Gruppen chemische Spezies sein, die jeweils dadurch zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden können, daß sie verschiedenen Energiebeträgen oder Energie aus verschiedenen Quellen ausgesetzt werden. Verschiedene interessierende Substanzen oder solche Analyte können dann spezifisch an jeweils verschiedene chemische Verbindungen/Gruppen gebunden werden. Beim Verwenden dieser Zusammensetzungen und Verfahren ist es möglich, zwei oder mehrere verschiedene interessierende Substanzen oder Analyte zu bestimmen, die in der zu untersuchenden Probe vorhanden sein können.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß wird eine chemische Verbindung/Gruppe mit der Formel
  • [M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
  • bereitgestellt, worin die verschiedenen Parameter wie oben definiert sind.
  • Diese chemische Verbindung/Gruppe muß mindestens einen mehrzähnigen Liganden von M enthalten. Wenn die Verbindung/Gruppe mehr als einen mehrzähnigen Liganden enthält, können die mehrzähnigen Liganden identisch oder nicht alle identisch sein. Mehrzähnige Liganden umfassen aromatische und aliphatische Liganden. Geeignete aromatische mehrzähnige Liganden umfassen aromatische heterocyclische Liganden. Bevorzugte aromatische heterocyclische Liganden sind stickstoffhaltig, wie beispielsweise Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl und Phenathrolyl.
  • Geeignete mehrzähnige Liganden können unsubstituiert oder durch beliebige aus einer großen Anzahl im Stand der Technik bekannter Substituenten substituiert sein. Geeignete Substituenten umfassen beispielsweise Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxy, Imino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidinium, Ureid, schwefelhaltige Gruppen, phosphorhaltige Gruppen und die Carboxylatester von N-Hydroxysuccinimid.
  • Diese chemische Verbindung/Gruppe kann einen oder mehrere einzähnige Liganden enthalten, die in einer großen Zahl im Stand der Technik bekannt sind. Geeignete einzähnige Liganden umfassen beispielsweise Kohlenmonoxid, Cyanide, Isocyanide, Halogenide und aliphatische, aromatische und heterocyclische Phosphine, Amine, Stibine und Arsine.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen dieser chemischen Verbindung/Gruppe umfassen Bis(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) und Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II).
  • Innerhalb des Rahmens dieser Erfindung kann einer oder können mehrere der Liganden von M an weitere chemische Marker gebunden sein, beispielsweise an radioaktive Isotope, fluoreszierende Verbindungen oder weitere lumineszierende Ruthenium oder Osmium enthaltende Zentren.
  • Ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegt die Ausführungsform, in welcher die markierte Substanz (B) mit mehr als einem oder vielen elektrochemilumineszierenden Zentren markiert ist.
  • Geeignete Substanzen (B) umfassen viele biologische Substanzen, beispielsweise ganze Zellen, Viren, subzelluläre Teilchen, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine, Polypeptide, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, zelluläre Metaboliten, Hormone, pharmakologische Substanzen, Beruhigungsmittel, Barbiturate, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren und Zucker. Ganze Zellen können Tier-, Pflanzen- oder Bakterienzellen sein, und sie können lebensfähig oder tot sein. Beispiele umfassen Pflanzenpathogene, wie beispielsweise Pilze und Nematoden. Der Ausdruck "subzelluläre Teilchen" soll so, wie er verwendet wird, beispielsweise subzelluläre Organellen, Membranteilchen, wie solche aus zerstörten Zellen, Fragmente von Zellwänden, Ribosomen, Multienzym-Komplexe und andere Teilchen umfassen, die von lebenden Organismen stammen können. Nukleinsäuren umfassen beispielsweise chromosomale DNA, plasmidische DNA, virale DNA und rekombinante DNA, alle aus einer Vielzahl von Quellen. Nukleinsäuren umfassen auch RNA's, beispielsweise Messenger-RNA's, ribosomale RNA's und Transfer-RNA's. Polypeptide umfassen beispielsweise Enzyme, Transportproteine, Rezeptorproteine und strukturelle Proteine, so z. B. virale Hüllproteine. Bevorzugte Polypeptide sind Enzyme und Antikörper. Besonders bevorzugte Polypeptide sind monoklonale Antikörper. Hormone umfassen beispielsweise Insulin und T4-Schilddrüsenhormon. Pharmakologische Mittel umfassen beispielsweise Herzglycoside. Selbstverständlich werden vom Rahmen der vorliegenden Erfindung synthetische Substanzen umfaßt, die biologischen Materialien chemisch ähnlich sind, beispielsweise synthetische Polypeptide, synthetische Nukleinsäuren und synthetische Membranen, Vesikel und Liposomen. Das Voranstehende soll keine abschließende Liste der biologischen Substanzen darstellen, die sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, sondern soll einzig den weiten Rahmen der Erfindung erläutern.
  • Unter die vorliegende Erfindung fallen markierte nicht-biologische Substanzen einschließlich polymerer Materialien. Diese Substanzen können in Form von löslichen polymeren Molekülen oder in einer beliebigen der großen Vielzahl von bekannten makroskopischen Formen, wie beispielsweise Perlen oder Behältern, wie Teströhrchen, Flaschen, muldenartige Vorrichtungen zu Tests ("assay wells") und dergleichen vorliegen.
  • Biologische und nicht-biologische Substanzen (B) sind kovalent durch eine Amid- oder Amin-Bindung an einen Liganden von M gebunden. Wenn es sich um eine Amid-Bindung handelt, kann die Bindung so angeordnet sein, daß das Material (B) direkt entweder an das Carbonyl oder an den Stickstoff der Amidbindung gebunden ist. Diese chemischen Verbindungen/Gruppen können in ionischer Form vorliegen. Wenn das der Fall ist, so ist den Fachleuten klar, daß viele verschiedene Gegenionen dazu dienen können, die Ladung von Präparationen der chemischen Verbindung/Gruppe zu neutralisieren. Geeignete Kationen umfassen beispielsweise H&spplus;, NH&sub4;&spplus;, Guanidinium, Ag&spplus;, Li&spplus;, Na&spplus;, K&spplus;, Mg²&spplus;, Mn²&spplus; und Cd²&spplus;. Geeignete Anionen umfassen beispielsweise Halogenide, OH&supmin;, Carbonate, SO&sub4;²&spplus;, Hexafluorphosphat und Tetrafluorborat.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verbindungen bereit, die sich besonders als Zwischenverbindungen zum Anbinden eines lumineszierenden, Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden Markers an Aminogruppen von chemischen, biochemischen und biologischen Substanzen eignen. Diese Zwischenverbindungen sind demzufolge besonders für das Synthetisieren von chemischen Verbindungen/Gruppen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Die erfinderischen Zwischenprodukte sind die Mono- und Di-N-hydroxysuccinimidester von Ruthenium- oder Osmium-bis(2,2'-bipyridin) (2,2'-bipyridin-4,4'-dicarbonsäure) und deren Salze; und Ruthenium- oder Osmium-bis(2,2'-bipyridin) (4,4'-di(chlormethyl)- 2,2'-bipyridin).
  • Die chemischen Strukturen dieser Zwischenverbindungen sind die folgenden. Der Mono-N-hydroxysuccinimidester von Ruthenium- oder Osmium-bis(2,2'-bipyridin) (2,2'-bipyridin-4,4'-bicarbonsäure) umfaßt
  • worin M Ru oder Os ist, n die ganze Zahl 1, 2 oder 3 ist, sowie dessen Salze und Stereoisomere. Die Di-N-hydroxysuccinimidester von Ruthenium- oder Osmium-bis(2,2'-bipyridin) (2,2'-bipyridin- 4,4'-dicarbonsäure) umfaßt
  • worin M Ru oder Os ist, n die ganze Zahl 1, 2 oder 3 ist, sowie dessen Salze und Stereoisomere. Ruthenium- oder Osmium-bis(2,2'- bipyridin) (4,4'-di(chlormethyl)-2,2'-bipyridin) umfaßt
  • worin M Ru oder Os ist, n die ganze Zahl 1, 2 oder 3 ist, sowie dessen Salze und Stereoisomere. Diese Verbindungen können durch in der Technik bekannte Maßnahmen synthetisiert werden.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Synthetisieren der Ruthenium enthaltenden N-Hydroxysuccinimidester ist es, zuerst Ruthenium(dichlorbis-2,2'-bipyridin) mit 2,2'-Bipyridin-4,4'- dicarbonsäure in einer heißen, wäßrigen Methanol-Lösung von Natriumhydrogencarbonat umzusetzen. Nach Ansäuern wird eine wäßrige Lösung von NaPF&sub6; zu der Lösung der carboxylierten Rutheniumverbindung zugesetzt. Das isolierte Hexafluorphosphatsalz des Rutheniumkomplexes wird dann durch Umsetzung mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid verestert. Selbstverständlich sind viele Variationen bezüglich der Struktur des N-Hydroxysuccinimid-Bestandteils möglich, ohne die Verwendbarkeit der erfinderischen Zwischenprodukte wesentlich zu ändern. Diese Zwischenprodukte können ionisch sein. Wenn das der Fall ist, so ist es allgemeines technisches Verständnis, daß viele verschiedene Gegenionen zur Neutralisierung der Ladung von Präparationen des Zwischenproduktes dienen können. Geeignete Kationen umfassen beispielsweise H&spplus;, NH&sub4;&spplus;, Guanidinium, Ag&spplus;, Li&spplus;, Na&spplus;, K&spplus;, Mg²&spplus;, Mn²&spplus; und Cd²&spplus;. Geeignete Anionen umfassen beispielsweise Halogenide, Carbonate, SO&sub4;²&supmin;, Hexafluorphosphat und Tetrafluorborat.
  • Diese Zwischenverbindungen eignen sich zum Markieren von Substanzen mit einer freien Aminogruppe, die den Carboxylatester unter Verdrängung von N-Hydroxysuccinimid oder die Chlormethylgruppe unter Verdrängung von Chlorid angreifen kann. Die Verwendung dieser Zwischenverbindungen zur Markierung von interessierenden Analyten ist im Vergleich mit den Isothiocyanaten des Standes der Technik (z. B. Weber, US-Patent 4.293.310) bevorzugt. Isothiocyanate werden im allgemeinen durch Umsetzung eines primären Amins mit Schwefelkohlenstoff oder Thiophosgen hergestellt, die beide flüchtig und in hohem Maße toxisch sind. Schwefelkohlenstoff ist außerdem ein akut feuer- und explosionsgefährdeter Gefahrenstoff. Die als Vorstufe erforderlichen primären aromatischen Amine sind schwieriger zu erhalten als die aromatischen Vorstufen-Carbonsäuren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Auch sind die Zwischenverbindungen der vorliegenden Erfindung weniger reaktiv und leichter lager- und handhabbar als die Isothiocyanat-Derivate.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Feststellen bzw. Bestimmen des Vorhandenseins von erfindungsgemäßen chemischen Verbindungen/Gruppen zur Verfügung. Die metallhaltigen Verbindungen werden mit Hilfe von Elektrochemilumineszenz-Verfahren detektiert.
  • Ru(bpy)&sub3;²&spplus; kann unter Verwendung von Lumineszenz-Techniken in sehr geringen Konzentrationen bestimmt werden. Unter Verwendung des Oxidativ-Reduktions-Verfahrens waren Ege et al. (November 1984) (Analytical Chemistry, Band 5, Nr. 13, auf Seiten 2413-17) in der Lage, Ru(bpy)&sub3;²&spplus; in Konzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup8; M aufzufinden. In diesen Experimenten lag das Natriumoxalat 1 mM in Phosphatpuffer mit pH 5,0 vor, und das Potential wurde mit +1,0 bis +1,4 Volt gegen eine Referenzelektrode mit gesättigtem Natriumchlorid mit Intervallen von 5 bis 10 Sekunden gepulst. Diese Wissenschaftler fanden, daß das Reduktiv-Oxidations- Verfahren noch empfindlicher ist. Unter Verwendung von 18 mM Na&sub2;S&sub2;O&sub8; und 0,1 M Tetra-n-butylammoniumtetrafluorborat in CH&sub3;CN:H&sub2;O (1 : 1 Vol/Vol) wurden Ru(bpy)&sub3;²&spplus;-Konzentrationen bis hinunter zu 10-13 M detektiert. Weitere Verfeinerungen der Techniken lassen eine noch größere Empfindlichkeit erwarten. Diese Techniken ermöglichen empfindliche und genaue Messungen auch von markierten Substanzen, was ausführlicher in den hier nachfolgenden Beispielen gezeigt wird.
  • Unsere Erfahrung mit Ru(bpy)&sub3;²&spplus;-markierten Substanzen zeigt die Vorteile der Verwendung von Ruthenium enthaltenden und Osmium enthaltenden Verbindungen als chemische Marker. Sie sind über lange Zeiträume stabil und können wirksam an eine Vielzahl von chemischen, biochemischen und biologischen Substanzen gebunden werden. Die Marker sind sicher und relativ preiswert. Sie liefern ein hochcharakteristisches Signal und kommen in der Natur nicht vor. Auf Lumineszenz der Marker basierende Messungen sind empfindlich, schnell, reproduzierbar und mit einfachen Apparaturen handhabbar. Es gibt nur sehr wenig Interferenz bei der Detektion, die auf der Lumineszenz dieser Marker beruht, mit Bestandteilen wie phosphatgepufferter Salzlösung, TweenR (einem oberflächenaktiven Mittel), Lebergewebe-Extrakt oder Serum. Auf Lumineszenz basierende Messung dieser Marker zerstört weder die Probe noch markierte Materialien und kann wiederholt durchgeführt werden. Das Signal wird von jedem Molekül des Markers wiederholt erzeugt, wodurch die Empfindlichkeit, mit der diese Marker nachgewiesen werden können, gesteigert wird. Das Vorhandensein von markierten Materialien kann qualitativ oder quantitativ bestimmt werden, in Abhängigkeit von den Anforderungen der jeweiligen Anwendung. Anzumerken ist: das Wort "bestimmt" oder "festgestellt", wie es in dieser Patentanmeldung verwendet wird, bezieht sich sowohl auf qualitative als auf quantitative Bestimmungen des markierten Materials.
  • Demzufolge stellt diese Erfindung ein Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins einer chemischen Verbindung/Gruppe mit der Formel
  • [M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
  • bereit, worin die verschiedenen Parameter wie oben definiert sind.
  • Das Verfahren umfaßt:
  • a) das Bilden eines Reagenzgemisches mit der chemischen Verbindung/Gruppe unter geeigneten Bedingungen;
  • b) das Anregen der Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz, indem das Reagenzgemisch elektrochemischer Energie ausgesetzt wird; und
  • c) das Nachweisen/Auffinden der emittierten Lumineszenz und das dadurch erfolgende Feststellen des Vorhandenseins des interessierenden Analyten.
  • In die chemischen Verbindungen/Gruppen, die sich für diese Verfahren eignen, können biologische und nicht-biologische Substanzen (B) durch direkte Koordination an M oder durch Bindung an einen Liganden von M in die Verbindungen/Gruppen eingeführt werden. Bindung kann durch kovalente Bindung oder durch elektrostatische oder Wasserstoffbindung erfolgen. Viele verschiedene Mittel zum Bewirken kovalenter Bindung von Substanzen (B) an Liganden von M sind verfügbar. Die bindende Verknüpfung kann beispielsweise eine Amid- oder Aminbindung, eine Ester- oder Thioesterbindung, eine Ether- oder Thioetherbindung oder eine beliebige andere Maßnahme sein, die im Stand der Technik bekannt ist. Die Art der Verknüpfung wird durch die Substituenten des Liganden und die geeigneten chemischen Gruppen auf der zu markierenden Substanz, die für die Bindung mit dem Liganden zur Verfügung stehen, festgelegt. Geeignete Substanzen (B) umfassen beispielsweise ganze Zellen, subzelluläre Teilchen, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Proteine, Glycoprotein, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Polypeptide, zelluläre Metaboliten, Hormone, pharmakologische Mittel, Sedativa, Barbiturate, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren, Zucker und nicht-biologische Polymere. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die verknüpfende Bindung eine Amid- oder Aminbindung. Die Amid- oder Aminbindung wird zwischen dem Substituenten am Liganden und einer freien Aminogruppe der zu markierenden Substanz gebildet.
  • Diese Verfahren umfassen ein Verfahren zum Bestimmen der chemischen Verbindung/Gruppe durch Bildung eines spezifischen Komplexes mit einem komplementären Material. Von besonderem Interesse sind Antikörper-Antigen-Paare von Substanzen. Dieses Bindungsverfahren kann verwendet werden, um das Vorhandensein von markierten Antigenen, beispielsweise Digoxin oder Digitoxin, in komplexen Mischungen wie beispielsweise Blut, Urin oder synthetischen Reaktionsmischungen festzustellen, indem die Mischung zuerst immobilisierten Antikörpern ausgesetzt wird, die für das interessierende Antigen spezifisch sind, und dann die Menge an markiertem Material gemessen wird, das an die immobilisierten Antikörper gebunden ist.
  • Der Ausdruck "Anregen zu Elektrochemilumineszenz" bezieht sich auf das Erzeugen eines angeregten Zustands der entsprechenden Verbindung/Gruppe, der bei Wellenlängen zwischen 200 Nanometern und 900 Nanometern bei Umgebungstemperatur luminesziert. Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl Osmium enthaltende Verbindungen/Gruppen als auch Ruthenium enthaltende Verbindungen/Gruppen und umfaßt die große Vielzahl lumineszierender Verbindungen/Gruppen, die durch Variieren der chemischen Struktur der Liganden erzeugt werden kann. Jede dieser Abwandlungen bezüglich des Metalls und der Liganden kann den genauen Betrag der einzusetzenden Energie verändern, die zum Erzeugen des lumineszierenden, angeregten Zustands erforderlich ist. In ähnlicher Weise ist die Wellenlänge der emittierten Lumineszenz von der Natur und der Umgebung des Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden Materials abhängig. Im allgemeinen wird Elektrochemilumineszenz-Emission mit der emittierten Lumineszenz zwischen etwa 200 Nanometern und etwa 900 Nanometern Wellenlänge auftreten. Das Potential, bei dem die Reduktion oder Oxidation der chemischen Verbindung/Gruppe auftritt, wird von deren genauer chemischer Struktur wie auch von Faktoren wie dem pH-Wert der Lösung und der Natur der eingesetzten Elektrode abhängen. Im allgemeinen ist es auf diesem Gebiet der Technik gut bekannt, wie das optimale Potential und die entsprechende Emissions-Wellenlänge eines Elektrochemilumineszenz-Systems zu bestimmen ist.
  • Es sollte klar sein, daß es viele Verfahren zum Quantifizieren der Menge an vorhandener lumineszierender Spezies gibt. Der Betrag der in das System eingebrachten Energie kann als Maß für die lumineszierende Spezies dienen. Geeignete Messungen umfassen beispielsweise Messungen des elektrischen Stroms, wenn die lumineszierende Spezies elektrochemisch erzeugt wird. Zusätzlich kann natürlich die lumineszierende Spezies durch Messen der emittierten Lumineszenz nachgewiesen werden. All diese Messungen können entweder als kontinuierliche, mengenbasierende (ratebased) Messungen oder als kumulative Methoden, die das Signal über einen langen Zeitraum akkumulieren, durchgeführt werden. Ein Beispiel für mengenbasierende Messungen ist die Verwendung von Photomultiplier-Röhren, Photodioden oder Phototransistoren zur Erzeugung von elektrischen Strömen, deren Größe proportional zur Intensität des einfallenden Lichtes ist. Beispiele für kumulative Verfahren sind die Integration von betragsbasierenden Daten und die Verwendung von photographischem Film, um kumulative Daten direkt verfügbar zu machen.
  • All diese auf Lumineszenz beruhenden Verfahren führen zur Lumineszenz durch die Ruthenium enthaltende Verbindung. Die Natur des nachweisbaren Ereignisses, nämlich dessen wiederholtes Auftreten, unterscheidet diese Marker von radioaktiven Isotopen oder gebundenen chemilumineszierenden Molekülen wie Luminol. Die letztgenannten Marker erzeugen ein nachweisbares Ereignis nur einmal pro Molekül (oder Atom) des Markers, wodurch ihre Nachweisbarkeit begrenzt ist.
  • Diese Erfindung stellt weiterhin die Verwendung von Ruthenium enthaltenden und Osmium enthaltenden Markern in Bindungsverfahren zum Feststellen des Vorhandenseins von interessierenden Analyten bereit. Viele derartige Bindungsverfahren sind im Stand der Technik bekannt. Diese Verfahren nutzen häufig die große Spezifität, mit der biochemische und biologische Substanzen aneinander binden. Beispiele sind auf Techniken der Nukleinsäurehybridisierung basierende Verfahren, Techniken auf Antikörper-Antigen-Basis und Techniken auf Enzym-Ligand-Basis. Diese Verfahren können markierte Verbindungen/Gruppen nutzen, um interessierende Analyten zu bestimmen oder um markierte Analoga von interessierenden Analyten zur Bestimmung von interessierenden Analyten in kompetitive Bindung nutzenden Tests zu verwenden.
  • Der interessierende Analyt und die chemische Verbindung/Gruppe kann ein beliebiges Paar von Substanzen sein, die auf spezifische Weise aneinander binden können. Solche Substanzen umfassen beispielsweise ganze Zellen, subzelluläre Teilchen, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Proteine, Glycoproteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Polypeptide, zelluläre Metaboliten, Hormone, pharmakologische Mittel, Sedativa, Barbiturate, Alkaloide, Steroide, Vitamine, Aminosäuren, Zucker und nicht-biologische Polymere. Von besonderem Interesse sind Antikörper-Antigen-Paare. Beispielsweise umfaßt dieses Verfahren die Verwendung von markierten Antikörpern zur Bestimmung des Vorliegens von Oberflächenantigenen von Zellen oder zur Markierung von bestimmten Zellen für den Nachweis durch zellsortierende Verfahren. Antigene, die durch Bindung an beispielsweise immobilisierte, unmarkierte Antikörper immobilisiert sind, können durch markierte Antikörper in einem Verfahren nachgewiesen werden, das gängigerweise als "Sandwich"-Verfahren bekannt ist.
  • In Tests, die kompetitive Bindung nutzen, können der interessierende Analyt und das markierte Analogon des Analyten beliebige Substanzen sein, die sich an der Bildung eines spezifischen Komplexes mit einem komplementären Material, beispielsweise ganzen Zellen, subzellulären Teilchen, Nukleinsäuren, Polysacchariden, Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Lipopolysacchariden, Polypeptiden, zellulären Metaboliten, Hormonen, pharmakologischen Mitteln, Sedativa, Barbituraten, Alkaloiden, Steroiden, Vitaminen, Aminosäuren, Zuckern und nicht-biologischen Polymeren beteiligen können. Von besonderem Interesse sind Verfahren auf Antikörper-Antigen-Basis. Diese Verfahren sind analog zu den gut bekannten Radioimmuntests, in denen ein interessierender Analyt nachgewiesen wird, wenn er ein radioaktives Analogon des Analyten von einem Antikörper verdrängt. Die vielen Abwandlungen des Radioimmuntests, die in der Technik bekannt sind, können im Prinzip in vorteilhafter Weise verwendet werden, indem erfindungsgemäß markierte Verbindungen/Gruppen anstelle von radioaktiv markierten Verbindungen eingesetzt werden.
  • Von der vorliegenden Erfindung wird weiterhin die Verwendung markierter chemischer Verbindungen/Gruppen in entweder heterogenen oder homogenen Bindungsverfahren zur Verfügung gestellt. In heterogenen Bindungsverfahren muß die gebundene markierte Substanz vor der Messung des Vorliegens von Marker von der ungebundenen markierten Substanz räumlich getrennt werden. Dies wird in Antikörper-Antigen-Systemen häufig durch Immobilisieren von einem Bestandteil, beispielsweise dem Antikörper, durch Anbinden an eine unlösliche Matrix, beispielsweise ein Filter oder die Oberfläche von Kügelchen oder von Reaktionsgefäßen, wie zum Beispiel Teströhrchen, erreicht. Die das Antigen enthaltende Lösung wird durch das Filter oder in das Reaktionsgefäß gegossen und dann aus dem Filter oder den Seiten des Reaktionsgefäßes ausgewaschen. Dabei bleibt nur Antigen für die Bestimmung zurück, das spezifisch an Antikörper gebunden ist.
  • Im Gegensatz hierzu liegen bei homogenen Verfahren das gebundene und das ungebundene markierte Material in der gleichen Reaktionsmischung vor, wenn das Vorhandensein von Marker gemessen wird. Dies ist möglich, wenn die Bindung die Eigenschaften des vom Marker detektierbaren Signals verändert. Es gibt viele Möglichkeiten, wie lumineszierende Marker in homogenen Systemen verwendet werden können. Wenn beispielsweise ein Lumineszenz- Löscher in geeigneter Weise auf einem Antikörper angebracht wäre, könnte die Bindung eines markierten Antigens durch den Lumineszenz-Löscher auf dem Antikörper zur Unterdrückung der Lumineszenz des Markers führen. Viele homogene Verfahren für lumineszierende Marker sind in der Technik bekannt, und über einige von diesen wird im Übersichtsartikel von Boguslaski und Li (1982), "Homogeneous Immunoassays", Applied Biochemistry and Biotechnology, 7, Seiten 401-414, berichtet.
  • Eine besonders einzigartige und wertvolle Klasse homogener Bindungstests wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Wie hier voranstehend beschrieben, können diese Marker elektrochemisch dadurch gemessen werden, daß eine Lösung der markierten interessierenden Substanz einer Elektrode ausgesetzt wird. Eventuell vorhandene markierte Substanz, die in der Lösung vorhanden ist, jedoch keinen Zugang zur Oberfläche der Elektrode erhält, wird nicht nachgewiesen werden. Dies kann beispielsweise dann auftreten, wenn die markierte Substanz direkt oder indirekt an die Oberfläche des Reaktionsgefäßes gebunden ist, in welches die Elektrode plaziert worden ist, oder wenn der Marker tief in das Innere des spezifischen Komplexes eingebettet ist, beispielsweise innerhalb eines Antigen-Antikörper-Komplexes, oder wenn die Elektrode selbst mit einer Schicht umhüllt wäre, durch welche markiertes Material hindurchtreten könnte, komplexiertes markiertes Material jedoch nicht hindurchtreten könnte. Darüberhinaus sollte es möglich sein, die Oberfläche einer Elektrode mit Antikörpern zu beschichten, so daß nur an die immobilisierten Antikörper gebundenes markiertes Antigen Zugang zur Elektrode erhalten kann und dadurch bestimmt wird. Dieses besondere homogene Verfahren kann am wirksamsten sein, wenn das erforderliche Elektrodenpotential in kurzen Pulsen angelegt wird.
  • Es liegt innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung, eine Kombination von Mitteln zum Feststellen des Vorhandenseins von markierten Verbindungen zu verwenden. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, die Gesamtmenge an markierter Substanz durch ein Mittel zu messen, das nicht zwischen gebundener und ungebundener markierter Substanz unterscheidet, und die Menge an gebundener markierter Substanz durch ein Mittel zu bestimmen, welches zwischen gebundener und ungebundener markierter Substanz unterscheidet, beispielsweise Elektrochemilumineszenz. Eine solche Kombination von Verfahren könnte mit derselben Probe durchgeführt werden und damit eine reichhaltigere Informationsquelle über die Probe sein als es ein beliebiges Verfahren könnte, wenn man es einzeln einsetzen würde. Es liegt auch innerhalb des Rahmens dieser Erfindung, das Vorhandensein von zwei oder mehreren verschieden markierten Verbindungen innerhalb derselben Reaktionsmischung festzustellen. Dies ist entweder dann möglich, wenn die Marker Lumineszenz unterschiedlicher Wellenlängen emittieren, oder dann, wenn die Marker durch Einwirkenlassen von Energie mit unterschiedlichen Beträgen oder aus verschiedenen Quellen zur Emission von Lumineszenz angeregt werden können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Systeme zum Feststellen/Bestimmen des Vorhandenseins der Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden chemischen Verbindungen/Gruppen zur Verfügung. Die Systeme umfassen Reagenzgemische mit der chemischen Verbindung/Gruppe, ein Mittel zum Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe, damit sie Lumineszenz emittiert, und ein Mittel zum Nachweisen von emittierter Lumineszenz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Systeme zum Verwenden von Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden markierten chemischen Verbindungen/Gruppen für die Bestimmung von interessierenden Analyten bereit.
  • Die Systeme der vorliegenden Erfindung sind für die Verwendung bei der schnellen, wirksamen und vielseitigen Durchführung der verschiedenen Verfahren, die durch die vorliegende Erfindungsoffenbarung offenbart und vorgeschlagen werden, vorgesehen.
  • Der interessierende Analyt kann eine beliebige Substanz sein, die an die elektrochemilumineszierende Verbindung/Gruppe binden kann, wie es bei der Bindung eines Antigens an einen mit einer elektrochemilumineszierenden Verbindung/Gruppe markierten Antikörper der Fall ist. Das Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen des Analyten mit der chemischen Verbindung/Gruppe unter geeigneten Bedingungen, so daß ein Reaktionsgemisch gebildet wird. Die chemische Verbindung/Gruppe wird dann zur wiederholten Emission von Lumineszenz angeregt, indem die Verbindung/Gruppe direkt elektrochemischer Energie ausgesetzt wird. Das Vorhandensein des Analyten wird durch Nachweisen der Lumineszenz bestimmt, die von der an den Analyten gebundenen chemischen Verbindung/Gruppe emittiert wird.
  • Diese Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden chemischen Verbindungen/Gruppen und eine oder mehrere davon verschiedene chemische Verbindungen/Gruppen enthalten, von denen jede zur Emission von Lumineszenz einer von der/den anderen verschiedenen Wellenlänge angeregt werden kann. Diese Zusammensetzungen sind in Verfahren und Systemen zum Nachweisen von zwei oder mehr verschiedenen interessierenden Substanzen oder Analyten geeignet, die in einer Mischung dieser und anderer Substanzen enthalten sind.
  • Die andere(n) davon verschiedene(n) chemische(n) Verbindung oder Verbindungen bzw. Gruppe oder Gruppen kann/können eine beliebige geeignete chemische Verbindung/Gruppe sein, z. B. anorganische, organische und organometallische Verbindungen, die zur Emission von Lumineszenz angeregt werden können, beispielsweise Rubren oder 9, 10 -Diphenylanthracen. Diese Verbindungen/Gruppen können solche Verbindungen/Gruppen sein, die dann zur Emission von Lumineszenz angeregt werden, wenn sie anderen Energiebeträgen oder Energie aus anderen Quellen ausgesetzt werden als der Energie, die für die Anregung zu Lumineszenz aus den Ruthenium enthaltenden oder Osmium enthaltenden chemischen Verbindungen/Gruppen verwendet wird. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung emittiert jede andere chemische Verbindung/Gruppe Lumineszenz einer jeweils von der/den anderen verschiedenen Wellenlänge, wenn sie durch Energie der gleichen Quelle und dem gleichen Betrag, der die Ruthenium enthaltende oder Osmium enthaltende chemische Verbindung/Gruppe zur Emission von Lumineszenz anregt, zur Emission von Lumineszenz angeregt wird.
  • Verfahren zum Bestimmen dieser chemischen Verbindungen/Gruppen umfassen das Bilden eines Reaktionsgemisches, welches die chemischen Verbindungen/Gruppen enthält, unter geeigneten Bedingungen, und dann das Induzieren der chemischen Verbindungen/Gruppen zur Emission von Lumineszenz, indem das Reagenzgemisch chemischer Energie oder elektrochemischer Energie ausgesetzt wird. Das Vorhandensein von jeder der Verbindungen/Gruppen wird durch das Nachweisen der Lumineszenz verschiedener Wellenlängen, die von den jeweiligen Verbindungen/Gruppen emittiert wird, festgestellt.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins von einem oder mehreren interessierenden Analyten, die selektiv an die verschiedenen, in derselben Mischung vorhandenen Verbindungen/Gruppen binden. Das Verfahren umfaßt das In-Kontakt-Bringen der Analyten mit den chemischen Verbindungen/Gruppen unter geeigneten Bedingungen, wobei ein Reagenzgemisch gebildet wird. Die Verbindungen/Gruppen werden zur Emission von Lumineszenz angeregt, indem das Reagenzgemisch chemischer Energie oder elektrochemischer Energie ausgesetzt wird, und die emittierte Lumineszenz mit verschiedenen Wellenlängen wird detektiert, um das Vorhandensein eines jeden der interessierenden Analyten festzustellen bzw. zu bestimmen.
  • Diese Verfahren, in denen das Vorhandensein von zwei oder mehr chemischen Verbindungen/Gruppen in einer Mischung bestimmt wird, ist auf alle voranstehend für die Bestimmung der Ruthenium enthaltenden und Osmium enthaltenden Lumineszenzmarker beschriebenen Fälle anwendbar. Diese Ausführungsform erlaubt jedoch die Feststellung/Bestimmung von zwei oder mehr verschiedenen Substanzen, die gleichzeitig in derselben Probe vorliegen.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die verschiedenen chemischen Verbindungen/Gruppen zur Emission von Lumineszenz angeregt, indem sie unterschiedlichen Energiebeträgen oder Energie aus verschiedenen Quellen ausgesetzt werden. Die Verfahren zum Bestimmen dieser verschiedenen chemischen Verbindungen/Gruppen sind im wesentlichen die gleichen wie diejenigen für die Bestimmung der chemischen Verbindungen/Gruppen, die verschiedene Wellenlängen der Lumineszenz emittieren, mit Ausnahme des Anregungsschrittes. Diese chemischen Verbindungen/Gruppen werden durch unterschiedliche Energiebeträge oder durch Energie aus verschiedenen Quellen zur Emission von Lumineszenz angeregt. Die die Verbindungen/Gruppen enthaltende Probe wird jeweils zu unterschiedlichen Zeiten den verschiedenen Energiebeträgen (energy values) oder -quellen ausgesetzt, und die von der spezifischen Verbindung/Gruppe emittierte Lumineszenz wird nachgewiesen, wodurch das Vorhandensein der Verbindung/Gruppe festgestellt wird. Dieses Verfahren ist auch für das Feststellen des Vorhandenseins von interessierenden Analyten verwendbar, die selektiv an die verschiedenen in der Probe vorhandenen chemischen Verbindungen/Gruppen binden.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung umfaßt Verfahren und Systeme zum Bestimmen von einer oder mehreren verschiedenen elektrochemilumineszierenden Verbindungen/Gruppen (A)k(B)u, die in derselben Probe vorhanden sind. Diese chemischen Verbindungen/Gruppen enthalten verschiedene Verbindungen, die Lumineszenz mit verschiedenen Wellenlängen emittieren, wenn sie einer elektrochemischen Energiequelle ausgesetzt werden, oder sie können jeweils zur Emission von Lumineszenz angeregt werden, indem sie verschiedenen elektrochemischen Energiequellen ausgesetzt werden. Diese verschiedenen elektrochemilumineszierenden Verbindungen/Gruppen können spezifisch an verschiedene interessierende Substanzen oder Analyte gebunden sein. Bei der Bestimmung dieser verschiedenen Verbindungen/Gruppen wurden die gleichen Verfahren wie voranstehend diskutiert genutzt.
  • Diese Erfindung wird in den nun folgenden Beispielen näher erläutert. Die Beispiele sind als Verständnishilfe für die Erfindung angegeben.
    • BEISPIEL I Herstellung von Rutheniumbis(2,2'-bipyridin) (2,2'-bipyridin- 4,4'-dicarbonsäure)bis(hexafluorphosphat).
  • Natriumhydrogencarbonat (0,40 g), Rutheniumdichlorbis(2,2- bipyridin) (0,40 g) und 2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarbonsäure (0,30 g) wurden in zum Rückfluß erhitztem Methanol (20 ml) - Wasser (5 ml) 9 Stunden lang gerührt. Die gebildete Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, mit 5 Tropfen konzentrierter H&sub2;SO&sub4; versetzt und bei Eistemperatur 1,5 Stunden lang stehengelassen. Es bildete sich ein Niederschlag, der durch Filtration abgetrennt und mit MeOH (8 ml) gewaschen wurde.
  • Das Filtrat und die Waschlösung, die zusammengegeben worden waren, wurden mit einer Lösung aus Natriumhexafluorphosphat (5,0 g) in Wasser (25 ml) versetzt. Die gebildete Lösung wurde in einem Eisbad 3 Stunden lang gekühlt, und der gebildete Niederschlag aus purpurroten Kristallen wurde durch Filtration gesammelt (0,40 g).
    • BEISPIEL II Herstellung von aktivem Ester von Rutheniumbis(2,2'- bipyridin) (2,2'-bipyridin-4,4'-dicarbonsäure)
  • Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 0,046 g) und N-Hydroxysuccinimid (0,034 g) wurden unter Rühren in DMF (2 ml) gelöst und in einem Eisbad gekühlt. Eine Lösung aus Rutheniumbis(2,2'- bipyridin) (2,2'-bipyridin-4,4'-dicarbonsäure) (0,101 g, hergestellt wie in Beispiel I), gelöst in DMF (1 ml), wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 5 Stunden lang bei Eisbad-Temperatur gerührt. Es bildete sich ein Niederschlag, der durch Zentrifugation abgetrennt wurde. Der den aktivierten Ruthenium-Komplex enthaltende Überstand wurde zum Markieren von Substraten aufbewahrt.
    • BEISPIEL III Markieren von Rinderserumalbumin (BSA) mit aktiviertem Rutheniumkomplex
  • Die DMF-Lösung des im Beispiel II hergestellten Rutheniumkomplexes (1 ml) wurde zu einer gerührten Lösung von BSA in wäßriger physiologischer, gepufferter Salzlösung (PBS, 5 ml; 25 mg/ml BSA) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht gerührt, und der Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand, der das mit Ruthenium markierte BSA enthielt, wurde durch zwei Verfahren analysiert.
    • VERFAHREN 1: Dialyse
  • Eine Lösung von mit Ruthenium markiertem BSA wurde mit PBS-Lösung dialysiert. Als Kontrolle wurde der in Beispiel II hergestellte nicht gebundene, aktivierte Ruthenium-Komplex ebenfalls gegen PBS-Lösung dialysiert. Nach 8 Stunden zeigte die Kontrolle keine fluoreszierende Spezies innerhalb des Dialyseröhrchens. Die Lösung von mit Ruthenium markiertem BSA zeigte dagegen eine starke Fluoreszenz, was zeigt, daß der Ruthenium-Komplex an das BSA mit hohem Molekulargewicht gebunden worden war.
    • VERFAHREN 2: Mikrofiltration
  • Eine Lösung von mit Ruthenium markiertem BSA wurde in einen Amicon-Mikrokonzentrator gegeben und mit 8000 Upm zentrifugiert. Eine geringe Fraktion rot-orangefarbener Lösung verblieb oberhalb des Filters, und diese gefärbte Fraktion wurde mit PBS-Waschlösung verdünnt und zentrifugiert. Dieser Verfahrensschritt wurde mehrmals wiederholt. Nach dem vierten Waschschritt trat farblose Lösung durch das Filter durch, während stark rot-orange gefärbtes Material oben auf dem Filter verblieb. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Ruthenium-Komplex an das BSA mit hohem Molekulargewicht gebunden war.
    • BEISPIEL IV Markieren von Human-Immunglobulin G (IgG) mit aktiviertem Rutheniumkomplex
  • Die DMF-Lösung von in Beispiel II hergestelltem aktiviertem Ruthenium-Komplex wurde zu einer gerührten Lösung von affinitätsgereinigtem Human-IgG in wäßrigem Puffer hinzugegeben. Die mit Ruthenium markierte IgG-Lösung fluoreszierte nach ausgedehnter Dialyse hell, was zeigt, daß der Ruthenium-Komplex an das affinitätsgereinigte Human-IgG mit hohem Molekulargewicht gebunden vorlag.
    • BEISPIEL V Markieren von Kaninchen-Antikörper gegen Salmonellen
  • Die im Beispiel II hergestellte DMF-Lösung von aktiviertem Rutheniumkomplex (0,1 ml) wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit Kaninchen-Serum (1 ml) gerührt, das Antikörper gegen Salmonella enthielt, und dann wurde die Reaktion durch Zugabe von Diethanolamin (0,1 ml) abgebrochen. Salmonella-Zellen wurden mit der gebildeten Lösung, die mit Ruthenium markierten Antikörper gegen Salmonella enthielt, versetzt. Die Zellen wurden fünfmal durch Zentrifugation abgetrennt und in frischem Puffer resuspendiert, um die Zellen von eventuell vorhandenem nicht gebundenem Antikörper (einschließlich von mit Ruthenium markiertem nicht gebundenem Antikörper) und von eventuell vorhandenem freiem Rutheniumkomplex zu trennen. Die Salmonella-Zellen, die mit mit Ruthenium markiertem Antikörper gegen Salmonella versetzt waren, emittierten hellrot-orangefarbenes Licht, wenn sie durch ein Fluoreszenz-Lichtmikroskop betrachtet wurden, was zeigt, daß der Antikörper gegen Salmonella mit Rutheniumkomplex markiert war und daß der mit Ruthenium markierte Antikörper seine Fähigkeit zur Bindung an Salmonella-Zellen unter Bedingungen, unter denen der Rutheniumkomplex fluoresziert, behalten hatte.
    • BEISPIEL VI
  • Das Verfahren des Beispiels V wurde unter Verwendung von normalem Mäuseserum (d. h. solchem, dem Antikörper gegen Salmonella fehlte) anstelle des Antikörper gegen Salmonella enthaltenden Kaninchenserums wiederholt. Die Salmonella-Zellen emittierten nach der Behandlung kein rot-orangefarbenes Licht, wenn sie durch ein Fluoreszenz-Lichtmikroskop beobachtet wurden, was zeigt, daß keine unspezifische Bindung von mit Ruthenium markierten Bestandteilen des normalen Mäuseserums an Salmonella- Zellen auftrat.
    • BEISPIEL VII Markieren von gegen Kaninchen gerichtetem Ziegen-Immunglobulin (IgG) und Vergleich mit Rhodamin
  • Die im Beispiel II hergestellte DMF-Lösung von aktiviertem Rutheniumkomplex wurde zu einer gerührten Lösung von affinitätsgereinigtem Ziegen-IgG gegen Kaninchen gegeben. Nach der Umsetzung wurde die Mischung gegen Puffer dialysiert. Material, das im Dialysenröhrchen verblieben war, fluoreszierte unter UV-Licht.
  • Das mit Ruthenium markierte IgG wurde auf seine Reaktivität gegenüber Salmonella getestet, die mit gegen Salmonella gerichteten Kaninchen-Antikörpern überzogen war. Kaninchen-Antikörper gegen Salmonella wurden mit Salmonella worthington umgesetzt, die auf einem gläsernen Objektträger fixiert worden war, und unumgesetzter Antikörper wurde mit Puffer weggewaschen. Das mit Ruthenium markierte Ziegen-IgG gegen Kaninchen wurde dann mit der mit Antikörper versetzten S. worthington zur Reaktion gebracht, und unumgesetztes Material wurde mit Puffer weggewaschen. Der Objektträger wurde unter einem mit einer 50 W Quecksilberlampe ausgerüsteten Lichtmikroskop untersucht, und auf dem und rund um das Bakterium wurde sehr helle-orange-rote Fluoreszenz beobachtet.
  • Ein Kontrollexperiment untersuchte die unspezifische Bindung von mit Ruthenium markiertem Antikörper. S. worthington, das auf einem gläsernen Objektträger fixiert war, wurde mit normalem Mäuseserum und dann mit mit Ruthenium markiertem Ziegen-Antiserum gegen Kaninchen-IgG umgesetzt. Die gleichen Waschstufen schlossen sich an. Es wurde keine orange-rote Fluoreszenz beobachtet.
  • Zu Vergleichszwecken wurde ein Rhodamin-Isothiocyanat, das an Ziegen-Antiserum gegen Kaninchen-IgG konjugiert war (in einer Proteinkonzentration, die der des Ruthenium-konjugierten Antikörpers entsprach) mit S. worthington, das mit gegen Salmonella gerichteten Kaninchen-Antikörpern überzogen war, umgesetzt. Eine rote Fluoreszenz war kaum detektierbar, und die Intensität der Fluoreszenz war signifikant niedriger als die des Ruthenium-Konjugates.
    • BEISPIEL VIII Elektrochemilumineszenz-Detektion (ECL-Detektion) von mit Ruthenium markiertem Rinderserumalbumin (BSA)
  • ECL-Messungen wurden in einer Zelle mit einem Kompartiment (30 ml) mit einem optisch flachen Boden durchgeführt. Die Arbeitselektrode war aus glasartigem Kohlenstoff, die Gegenelektrode bestand aus einem Platin-Drahtnetz, und die Pseudo- Referenzelektrode war ein Silberdraht. Lichtintensitätsmessungen wurden durchgeführt, indem ein Potential von -2,0 V (gegen den Ag Draht) angelegt, das emittierte Licht mit einer Photoelektronenvervielfacher-(photomultiplier)-Röhre (Hamamatsu 928) detektiert und das gebildete Signal 2 s lang mit einem Bascom-Turner- Aufzeichnungsgerät integriert wurde.
  • Acetonitril-Wasser (9 ml, 50 : 50 Vol/Vol), Tetrabutylammoniumtetrafluorborat (329 mg) und Diammoniumperoxydisulfat (42 mg) wurden in der ECL-Zelle vermischt, und die Intensität des Hintergrundlichts wurde aufgezeichnet. Eine Lösung von mit Ruthenium markiertem BSA (hergestellt im Beispiel III) wurde in Acetonitril-Wasser (50 : 50 Vol/Vol) verdünnt, und die verdünnte BSA-Lösung (1 ml) wurde zu der ECL-Zelle gegeben. Die gebildete Lösung wurde durch Begasen mit Solvens-gesättigtem Stickstoff entlüftet. Die Tabelle I faßt die Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen an mit Ruthenium markiertem BSA zusammen. TABELLE I Lichtintensität Arbeitseinheiten (Ruthenium)
    • BEISPIEL IX Herstellung von 4,4'-Di(chlormethyl)-2,2'-bipyridin-bis(2,2'- bipyridin)ruthenium(II)²&spplus;
  • 4,4'-Diethoxycarbonyl-2,2'-bipyridin wurde nach dem Verfahren von Sprintschink et al. (J. Amer. Chem. Soc. 99, 4947 (1977)) aus 2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarbonsäure hergestellt. Der Diethylester (100 mg) wurde in wasserfreiem Diethylether (35 ml) gelöst. Lithiumaluminiumhydrid (100 mg) wurde zugesetzt, und nach einer Inkubationsdauer von 30 Minuten wurden Diethylether (35 ml) und eiskaltes, entionisiertes Wasser (100 ml) hinzugegeben. Die Lösung wurde gründlich vermischt und die Etherschicht wurde gesammelt. Die wäßrige Phase wurde zwei weitere Male mit Ether (70 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde auf einem Rotationsverdampfer entfernt, wobei man das gewünschte Produkt (43 mg) erhielt. Diese 43 mg 4,4'-Di(hydroxymethyl)-2,2'-bipyridin und 120 mg cis-Dichloro- bis (2,2'-bipyridin)ruthenium(II)dihydrat wurden zu Ethanol (25 ml) gegeben, und die Lösung wurde 14 Stunden lang zum Rückfluß erhitzt. Nachdem die Lösung abgekühlt war, wurden 50 ul einer Lösung von Ammoniumhexafluorphosphat (1 g in 1 ml Wasser) zugefügt, und der gebildete kristalline Feststoff wurde gesammelt, mit einem geringen Volumen Ethanol gewaschen und getrocknet, wobei man 138 mg des Hexafluorphosphat-Salzes des 4,4'-Dihydroxymethyl-Komplexes erhielt. Dieser Komplex (6 mg) wurde zu Thionylchlorid (5 ml) gegeben, und die Lösung wurde 6 Stunden lang zum Rückfluß erhitzt. Das Thionylchlorid wurde abdestilliert, und der feste Rückstand wurde in einer Dioxan-Wasser- Mischung (1 : 1) (500 ul) gelöst. Diese 4,4'-Di(chlormethyl)-2,2'- bipyridin-bis(2,2'-bipyridin)ruthenium(II)²&spplus; enthaltende Lösung wurde zum Markieren von Antikörper verwendet.
    • BEISPIEL X Markierung von gegen Mäuse gerichtetem Kaninchen- und Schaf-IgG mit 4,4'-Di(chlormethyl)-2,2'-bipyridin-bis-(2,2'- bipyridin)ruthenium(II)²&spplus;
  • Man erhielt die Kaninchen- und Schaf-Antikörper als Lösungen mit 2 mg/ml in PBS. Diese Lösungen wurden über Nacht gegen Natriumhydrogencarbonat (500 ml, 50 mM, pH 9) dialysiert. Der Antikörper (2 mg) wurde dann mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung auf ein Endvolumen von 2 ml verdünnt. Diese Lösung (1 ml) wurde zu Natriumcarbonat-Lösung (1 ml, 50 mM) zugesetzt, um den pH auf 10 einzustellen. Die Lösung von aktiviertem Komplex in Dioxan-Wasser (100 ul) wurde zu der Lösung des Antikörpers hinzugefügt und bei 4ºC 16 Stunden lang der Reaktion überlassen. Hierauf wurde BSA (5 mg) zur Reaktionsmischung zugesetzt, und die Lösung wurde sofort gegen Carbonatpuffer (500 ml, 25 mM, ph 9) dialysiert. Der Dialysepuffer wurde mit 24-stündigen Intervallen dreimal gewechselt.
    • BEISPIEL XI Demonstration der immunologischen Reaktivität von markiertem Kaninchen- und Schaf-Immunglobulin gegen Mäuse durch fluorimetrische Analyse
  • Eine formalinisierte Suspension von Legionella pneumophila 1 (Philadelphia 1-Isolat) wurde durch Verdünnung mit PBS-Puffer auf eine optische Dichte (bei 425 nm) von 1,00 eingestellt. Eine 1,3 Verdünnung (1 ml) dieser Suspension wurde zu einer Reihe von konischen Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Die Zellen wurden zentrifugiert (10 Minuten, 10.000 Upm), der Überstand wurde dekantiert, und die Zellen wurden in einer 1 : 100-Verdünnung (1 ml) eines monoklonalen Mäuse-IgG-Antikörpers ("10C8", 0,85 mg/ml) in PBS oder in PBS als Negativkontrolle resuspendiert. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen wie zuvor zentrifugiert, der Überstand wurde abdekantiert, und die Zellen wurden in PBS-Puffer resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstands wurden die Zellen in einer 1 : 5-Verdünnung (in PBS) des gepoolten, mit Ruthenium markierten Kaninchen- und Schaf-anti-Mäuse-IgG-Antikörpers (1 ml, 10 mg Rutheniumkomplex/ml) oder in einer 1 : 50-Verdünnung (in PBS) von mit Fluorescein markiertem Ziegenanti-Mäuse-IgG-Antikörper (1 ml, 0,5 mg IgG/ml) als Positiv-Kontrolle, oder in PBS als Negativkontrolle resuspendiert. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen wie zuvor zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen, und die Zellen wurden in PBS resuspendiert und zweimal, jeweils mit Zentrifugation, gewaschen, wie zuvor. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in PBS (1 ml) resuspendiert und für die fluorimetrische Analyse in eine Polystyrol-Küvette überführt.
  • Anregungs- und Emissionsrasterung der Lösung des mit Fluorescein markierten Ziegen-Antikörpers gegen das Mäuse-IgG zeigten einen Anregungspeak bei 491 nm und einen Emissionspeak bei 519 nm. Diese Wellenlängen wurden für die Fluoreszenz-Messungen der mit Fluorescein markierten Zellen verwendet. Die Anregungs- und Emissionsrasterung der Lösung des mit Ruthenium markierten Kaninchen-/Schaf-Antikörpers gegen das Mäuse-IgG lieferte einen Anregungspeak bei 455 nm und einen Emissionspeak bei 623 nm. Diese Wellenlängen wurden für die Fluoreszenz-Messungen der mit Ruthenium markierten Zellen verwendet. Zellsuspensionen, die mit PBS anstelle von primären "10C8"-Antikörpern inkubiert worden waren, und Fluoreszenz-Konjugate dienten als Negativ-Kontrollen und wurden verwendet, um den Leerwert des Fluorimeters zu bestimmen. Die Fluoreszenz von Zellsuspensionen, die sowohl mit dem primären "10C8"-Antikörper als auch dem Fluoreszenz-Konjugat inkubiert worden waren, wurde mit 100 definiert, und alle anderen Fluoreszenz-Messungen wurden in Fluoreszenzeinheiten in Relation zu diesen internen Standards angegeben. Die Tabelle I listet die Ergebnisse auf, welche zeigen, daß das mit Ruthenium markierte Konjugat gegen Mäuse-IgG fluoresziert und spezifische immunologische Reaktivität in der Gegenwart von primären "10C8"-Antikörper zeigt. TABELLE I RELATIVE FLUORESZENZEINHEITEN Fluorescein (bei 519 nm) Ruthenium (bei 623 nm) 1 : 3 Zell-Verdünnung Fluoreszenz von Konjugat mit primärem Antikörper Fluoreszenz von Konjugat ohne primärem Antikörper Hintergrund-Fluoreszenz (mit primärem Antikörper, ohne Konjugat)

Claims (84)

1. Chemische Verbindung/Gruppe der Formel:
[M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
worin
M Ruthenium oder Osmium ist;
P ein mehrzähniger aromatischer, heterocyclischer, stickstoffhaltiger Ligand von M ist;
L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; aromatische, heterocyclische, stickstoffhaltige Liganden von M sind, von denen jeder mit jedem anderen Liganden identisch oder auch nicht identisch sein kann;
B eine Substanz ist, die an einen oder mehrere Liganden p, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; über eine oder mehrere Amid- oder Aminbindung(en) kovalent gebunden ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
n, o, p, q, r und s jeweils 0 oder eine ganze Zahl sind;
t eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist und
u eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
wobei P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5;, L&sup6; und B von solcher Zusammensetzung und Zahl sind, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden kann und wobei die Gesamtzahl der von den Liganden von M für M zur Verfügung gestellten Bindungen der Koordinationszahl von M entspricht.
2. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1, worin M für Ruthenium steht.
3. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1, worin M für Osmium steht.
4. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1, worin P Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthrolyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl, substituiertes Terpyridyl oder substituiertes Phenanthrolyl ist.
5. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 4, worin P durch ein Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxycarbonyl, Hydroxyamino, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidinium, Ureid, eine schwefelhaltige Gruppe, eine phosphorhaltige Gruppe oder den Carboxylatester von N-Hydroxysuccinimid als Substituenten substituiert ist.
6. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1, worin mindestens einer der Liganden L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; ein mehrzähniger Ligand ist.
7. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 6, worin mindestens einer der Liganden L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; für Bipyridyl, Bipyrazyl, Terpyridyl, Phenanthrolyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl, substituiertes Terpyridyl oder substituiertes Phenanthrolyl steht.
8. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 7, worin mindestens einer der Liganden L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; durch ein Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl, substituiertes Aralkyl, Carboxylat, Carboxaldehyd, Carboxamid, Cyano, Amino, Hydroxycarbonyl, Hydroxyamino, Aminocarbonyl, Amidin, Guanidinium, Ureid, eine schwefelhaltige Gruppe, eine phosphorhaltige Gruppe oder den Carboxylatester eines N-Hydroxysuccinimid als Substituenten substituiert ist.
9. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1 mit zwei zweizähnigen Liganden, worin jeder zweizähnige Ligand Bipyridyl, Bipyrazyl, Phenanthrolyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl oder substituiertes Phenanthrolyl ist.
10. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1 mit drei zweizähnigen Liganden, worin jeder zweizähnige Ligand Bipyridyl, Bipyrazyl, Phenanthrolyl, substituiertes Bipyridyl, substituiertes Bipyrazyl oder substituiertes Phenanthrolyl ist.
11. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 10, worin M für Ruthenium steht.
12. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 11 mit zwei zweizähnigen Bipyridyl-Liganden und einem substituierten zweizähnigen Bipyridyl-Liganden.
13. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1, worin B eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, ein Polypeptid, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Glycoprotein, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, ein Polypeptid, ein Zellmetaboliten, ein Hormon, ein pharmakologisches Mittel, ein Sedativum, ein Barbiturat, ein Akaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure oder ein nicht-biologisches Polymeres ist.
14. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 13, worin B ein Pflanzenpathogen ist.
15. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 13, worin B ein aus Serum stammender Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper ist.
16. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 13, worin B T4 Thyroidhormon ist.
17. Chemische Verbindung/Gruppe nach Anspruch 1, worin die Amidbindung so ausgerichtet ist, daß die Carbonylgruppe der Amidbindung direkt an den substituierten Bipyridyl-Liganden gebunden ist.
18. Verbindung mit der Struktur:
worin n für die ganze Zahl 1, 2 oder 3 steht, sowie deren Salze.
19. Verbindung der Struktur:
worin n für die ganze Zahl 1, 2 oder 3 steht, sowie deren Salze.
20. Verbindung der Struktur:
worin n für die ganze Zahl 1, 2 oder 3 steht, sowie deren Salze.
21. Verbindung der Struktur:
worin n für die ganze Zahl 1, 2 oder 3 steht, sowie deren Salze.
22. Verbindung der Struktur
worin n für die ganze Zahl 1, 2 oder 3 steht, sowie deren Salze.
23. Verbindung der Struktur:
worin n für die ganze Zahl 1, 2 oder 3 steht, sowie deren Salze.
24. Salz nach einem der Ansprüche 18 bis 23, worin das Gegenion das Kation NH&sub4;&spplus;, Guanidinium, Li&spplus;, Na&spplus;, K&spplus;, Ca²&spplus;, Mg²&spplus;, Mn²&spplus; oder Cd&sub2;&spplus; oder das Anion OH-, SO&sub4;²-, Halogenid, Carbonat, Hexafluorophosphat oder Tetrafluoroborat ist.
25. Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins einer chemischen Verbindung/Gruppe gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt:
a) das Bilden eines Reagenzgemisches mit der chemischen Verbindung/Gruppe und
b) das Nachweisen des Vorhandenseins der Verbindung/Gruppe mit Hilfe von Elektrochemilumineszenz.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Feststellen des Vorhandenseins der Verbindung/Gruppe ein Elektrochemilumineszenzverfahren umfaßt.
27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Feststellen des Vorhandenseins der Verbindung/Gruppe einschließt, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt und die emittierte Lumineszenz nachgewiesen wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe zu Lumineszenz einschließt, daß das Reagenzgemisch elektrochemischer Energie ausgesetzt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 25, umfassend
a) die Bildung eines Reagenzgemisches mit der chemischen Verbindung/Gruppe;
b) das Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz durch Einwirkenlassen von elektrochemischen Energie auf das Reagenzgemisch und
c) das Nachweisen der emittierten Lumineszenz und das dadurch erfolgende Feststellen des Vorhandenseins der chemischen Verbindung/Gruppe.
30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Verbindung/Gruppe die Fähigkeit zur Bindung an ein chemisches Mittel besitzt.
31. Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins eines interessierenden Analyten, der mit einer chemischen Verbindung/Gruppe eine Bindung eingeht, wobei die chemische Verbindung/Gruppe die Formel:
[M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
besitzt, worin
M Ruthenium oder Osmium ist;
P ein mehrzähniger aromatischer, heterocyclischer, stickstoffhaltiger Ligand von M ist;
L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; aromatische, heterocyclische, stickstoffhaltige Liganden von M sind, von denen jeder mit jedem anderen Liganden identisch oder auch nicht identisch sein kann;
B eine Substanz ist, die an einen oder mehrere Liganden P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; gebunden ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
n, o, p, q, r und s jeweils 0 oder eine ganze Zahl sind;
t eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist und
u eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
wobei P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5;, L&sup6; und B von solcher Zusammensetzung und Zahl sind, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden kann und wobei die Gesamtzahl der von den Liganden von M für M zur Verfügung gestellten Bindungen der Koordinationszahl von M entspricht,
wobei das Verfahren umfaßt:
a) das Kontaktieren des Analyten mit der chemischen Verbindung/Gruppe unter Bedingungen, die sich zur Bildung eines Reagenzgemisches eignen;
b) das Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz durch Einwirkenlassen elektrochemischer Energie auf das Reagenzgemisch und
c) das Nachweisen emittierter Lumineszenz und dadurch das Feststellen des Vorhandenseins des interessierenden Analyten.
32. Kompetitive Bindung nutzendes Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins eines interessierenden Analyten, wobei der Analyt und eine chemische Verbindung/Gruppe um die Bindung mit einem komplementären Material konkurrieren und die chemische Verbindung/Gruppe die Formel:
[M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
besitzt, worin
M Ruthenium oder Osmium ist;
P ein mehrzähniger aromatischer, heterocyclischer, stickstoffhaltiger Ligand von M ist;
L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; aromatische, heterocyclische, stickstoffhaltige Liganden von M sind, von denen jeder mit jedem anderen Liganden identisch oder auch nicht identisch sein kann;
B eine Substanz ist, die an einen oder mehrere Liganden P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; gebunden ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
n, o, p, q, r und s jeweils 0 oder eine ganze Zahl sind;
t eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist und
u eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
wobei P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5;, L&sup6; und B von solcher Zusammensetzung und Zahl sind, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden kann und wobei die Gesamtzahl der von den Liganden von M für M zur Verfügung gestellten Bindungen der Koordinationszahl von M entspricht,
wobei das Verfahren umfaßt:
a) das Kontaktieren des Materials, der chemischen Verbindung/Gruppe und des Analyten unter Bedingungen, die sich zur Bildung eines Reagenzgemisches eignen;
b) das Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz durch Einwirkenlassen elektrochemischer Energie auf das Reagenzgemisch und
c) das Nachweisen emittierter Lumineszenz und dadurch das Feststellen des Vorhandenseins des interessierenden Analyten.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 und 32, wobei B eine Substanz ist, die an einen oder mehrere Liganden P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; oder L&sup6; durch eine oder mehrere Amid- oder Aminbindung(en) kovalent gebunden ist.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 33, wobei B eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, ein Glycoprotein, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit, ein Hormon, ein pharmakologisches Mittel, ein Sedativum, ein Barbiturat, ein Akaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker oder ein nichtbiologisches Polymeres ist.
35. Verfahren nach Anspruch 34, worin B ein Nukleotid oder Polynukleotid ist.
36. Verfahren nach Anspruch 34, worin B ein aus Serum stammender Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper ist.
37. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das chemische Mittel eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, ein Glycoprotein, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit, ein Hormon, ein pharmakologisches Mittel, ein Sedativum, ein Barbiturat, ein Akaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker oder ein nichtbiologisches Polymeres ist.
38. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das chemische Mittel auf der Oberfläche eines Testgefäßes immobilisiert ist.
39. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das chemische Mittel ein aus Serum stammender Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper ist.
40. Verfahren nach Anspruch 32, wobei B die gleiche Substanz ist wie der Analyt.
41. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, wobei der Analyt eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, ein Glycoprotein, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit, ein Hormon, ein pharmakologisches Mittel, ein Sedativum, ein Barbiturat, ein Akaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker oder ein nichtbiologisches Polymeres ist.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Analyt Insulin, Digoxin, Digitoxin oder T4 Thyroidhormon ist.
43. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Analyt ein Pilz oder ein Fadenwurm (Nematode) ist.
44. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Analyt ein Antikörper ist.
45. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Material eine ganze Zelle, ein subzelluläres Teilchen, eine Nukleinsäure, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, ein Glycoprotein, ein Polypeptid, ein Zellmetabolit, ein Hormon, ein pharmpkologisches Mittel, ein Sedativum, ein Barbiturat, ein Alkaloid, ein Steroid, ein Vitamin, eine Aminosäure, ein Zucker oder ein nicht-biologisches Polymeres ist.
46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei das komplementäre Mittel ein aus Serum stammender Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper ist.
47. Verfahren nach Anspruch 45, wobei das komplementäre Mittel ein DNA- oder RNA-Fragment ist.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, worin das Verfahren ein homogenes Verfahren ist und die geeigneten Bedingungen derart sind, daß gebundene chemische Verbindung/Gruppe und nichtgebundene chemische Verbindung/Gruppe nicht voneinander getrennt werden, bevor das Reagenzgemisch der Energiequelle ausgesetzt wird.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, worin das Verfahren ein heterogenes Verfahren ist und die geeigneten Bedingungen eine Trennung von gebundener chemischer Verbindung/Gruppe und ungebundener chemischer Verbindung/Gruppe umfassen, bevor das Reagenzgemisch der Energiequelle ausgesetzt wird.
50. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, wobei der Analyt an eine unlösliche Matrix fixiert ist.
51. Verfahren nach Anspruch 50, bei dem es sich um ein Sandwich-Verfahren handelt.
52. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das chemische Mittel an eine unlösliche Matrix fixiert ist und die chemische Verbindung/Gruppe ein Bestandteil einer biologischen Flüssigkeit oder einer synthetischen Reaktionsmischung ist.
53. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Verfahren ein kompetitive Bindung nutzendes Verfahren ist, wobei das Material an eine unlösliche Matrix fixiert ist.
54. Heterogenes Verfahren nach Anspruch 53, wobei das Material ein monoklonaler Antikörper ist und die unlösliche Matrix die Oberfläche eines Testgefäßes ist.
55. Homogenes Verfahren nach Anspruch 53, wobei das Material ein monoklonaler Antikörper ist und die unlösliche Matrix die Oberfläche eines Testgefäßes ist.
56. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei das Reagenzgemisch einer Kombination aus elektromagnetischer Strahlung, chemischer Energie und elektrochemischer Energie ausgesetzt wird.
57. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei die chemische Verbindung/Gruppe dadurch oxidiert wird, daß sie der Energiequelle ausgesetzt wird.
58. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei die chemische Verbindung/Gruppe dadurch reduziert wird, daß sie der Energiequelle ausgesetzt wird.
59. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei jede chemische Verbindung/Gruppe mehr als einmal zu Elektrochemilumineszenz angeregt wird.
60. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei das Reagenzgemisch Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Citrat, Tartrat oder Peroxydisulfat enthält.
61. Verfahren nach Anspruch 57, wobei das Reaktionsgemisch Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Citrat oder Tartrat enthält.
62. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei das Reaktionsgemisch kontinuierlich einer Elektrode ausgesetzt wird, deren Potential zwischen einem zum Bewirken der Reduktion der chemischen Verbindung/Gruppe ausreichenden Potential und einem zum Bewirken der Oxidation der chemischen Verbindung/Gruppe ausreichenden Potential oszilliert.
63. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Energiequelle eine Elektrode ist, deren Potential zwischen einem höheren und einem niedrigeren als dem zur Oxidation der chemischen Verbindung/Gruppe ausreichenden Potential oszilliert und das Reagenzgemisch Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Tartrat oder Citrat enthält.
64. Verfahren nach Anspruch 57, wobei die Energiequelle eine Elektrode ist, deren Potential konstant und ausreichend ist, um die chemische Verbindung/Gruppe zu oxidieren, und die Reaktionsmischung Oxalat, Pyruvat, Lactat, Malonat, Tartrat oder Citrat enthält.
65. Verfahren nach Anspruch 58, wobei die Energiequelle eine Elektrode ist, deren Potential zwischen einem höheren und einem niedrigeren als dem zur Reduktion der chemischen Verbindung/Gruppe ausreichenden Potential oszilliert und das Reaktionsgemisch Peroxydisulfat enthält.
66. Verfahren nach Anspruch 58, wobei die Energiequelle eine Elektrode ist, deren Potential konstant und ausreichend ist, um die chemische Verbindung/Gruppe zu reduzieren, und das Reagenzgemisch Peroxidisulfat enthält.
67. Verfahren nach Anspruch 65, wobei die Reaktionsmischung ein Acetonitril enthält.
68. Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Reaktionsmischung Acetonitril enthält.
69. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, umfassend das kontinuierliche Nachweisen der emittierten Lumineszenz.
70. Verfahren nach Anspruch 69, wobei das Nachweisen der emittierten Lumineszenz visuell erfolgt.
71. Verfahren nach Anspruch 69, wobei der kontinuierliche Lumineszenznachweis die Verwendung einer Photodiode umfaßt.
72. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 32, umfassend den kumulativen Nachweis (Gesamtdetektion) der emittierten Lumineszenz.
73. Verfahren nach Anspruch 69, wobei das Nachweisen der emittierten Lumineszenz die Verwendung eines photographischen Films umfaßt.
74. System zum Feststellen des Vorhandenseins einer chemischen Verbindung/Gruppe der Formel:
[M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
worin:
M Ruthenium oder Osmium ist;
P ein mehrzähniger aromatischer, heterocyclischer, stickstoffhaltiger Ligand von M ist;
L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; aromatische, heterocyclische, stickstoffhaltige Liganden von M sind, von denen jeder mit jedem anderen Liganden identisch oder auch nicht identisch sein kann;
B eine Substanz ist, die an einen oder mehrere Liganden P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; über eine oder mehrere Amid- oder Aminbindung(en) kovalent gebunden ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
n, o, p, q, r und s jeweils 0 oder eine ganze Zahl sind;
t eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist und
u eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist; wobei P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5;, L&sup6; und B von solcher Zusammensetzung und Zahl sind, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden kann und wobei die Gesamtzahl der von den Liganden von M für M zur Verfügung gestellten Bindungen der Koordinationszahl von M entspricht,
wobei das System umfaßt:
a) ein Reagenzgemisch mit der chemischen Verbindung/Gruppe;
b) Mittel zum Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe zur Elektrochemilumineszenz und
c) Mittel zum Nachweis von emittierter Lumineszenz.
75. System zum Feststellen des Vorhandenseins eines interessierenden Analyten, der mit einer chemischen Verbindung/Gruppe eine Bindung eingeht, wobei die chemische Verbindung/Gruppe die Strukturformel:
[M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
besitzt, worin:
M Ruthenium oder Osmium ist;
P ein mehrzähniger aromatischer, heterocyclischer, stickstoffhaltiger Ligand von M ist;
L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; aromatische, stickstoffhaltige Liganden von M sind, von denen jeder mit jedem anderen Liganden identisch oder auch nicht identisch sein kann;
B eine Substanz ist, die an einen oder mehrere Liganden P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; über eine oder mehrere Amid- oder Aminbindung(en) kovalent gebunden ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
n, o, p, q, r und s jeweils 0 oder eine ganze Zahl sind;
t eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist und
u eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
wobei P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5;, L&sup6; und B von solcher Zusammensetzung und Zahl sind, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden kann, und wobei die Gesamtzahl der von den Liganden von M für M zur Verfügung gestellten Bindungen der Koordinationszahl von M entspricht,
wobei das System umfaßt:
a) die chemische Verbindung/Gruppe;
b) Mittel zum Kontaktieren der chemischen Verbindung/Gruppe mit dem interessierenden Analyten zur Bildung eines Reagenzgemisches;
c) Mittel zum Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz und
d) Mittel zum Nachweisen von emittierter Lumineszenz.
76. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Reagenzgemisch eine oder mehrere verschiedene chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede zum Lumineszieren bei unterschiedlicher Wellenlänge angeregt werden kann.
77. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Reaktionsgemisch eine oder mehrere verschiedene chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede zum Lumineszieren bei unterschiedlicher Wellenlänge angeregt werden kann, wobei jede Verbindung/Gruppe an einen anderen interessierenden Analyten gebunden ist.
78. System nach Anspruch 74, wobei das Reagenzgemisch ferner eine oder mehrere unterschiedliche chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede zum Lumineszieren bei unterschiedlicher Wellenlänge angeregt werden kann.
79. System nach Anspruch 75, wobei das Reaktionsgemisch eine oder mehrere verschiedene chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede zum Lumineszieren bei unterschiedlicher Wellenlänge angeregt werden kann, wobei jede Verbindung/Gruppe an einen anderen interessierenden Analyten gebunden ist.
80. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Reagenzgemisch eine oder mehrere verschiedene chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede durch Einwirkenlassen von Energie unterschiedlicher Größe oder aus einer unterschiedlichen Quelle zum Lumineszieren angeregt werden kann.
81. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Reagenzgemisch eine oder mehrere verschiedene chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede durch Einwirkenlassen einer Energie unterschiedlicher Größe oder aus einer unterschiedlichen Quelle zum Lumineszieren angeregt werden kann, wobei jede Verbindung/Gruppe an einen anderen interessierenden Analyten gebunden ist.
82. System nach Anspruch 74, wobei das Reagenzgemisch ferner eine oder mehrere verschiedene chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede durch Einwirkenlassen von Energie unterschiedlicher Größe oder aus einer unterschiedlichen Quelle zum Lumineszieren angeregt werden kann.
83. System nach Anspruch 75, wobei das Reagenzgemisch eine oder mehrere verschiedene chemische Verbindung(en)/Gruppe(en) enthält, von denen jede durch Einwirkenlassen einer Energie unterschiedlicher Größe oder aus einer unterschiedlichen Quelle zum Lumineszieren angeregt werden kann, wobei jede Verbindung/Gruppe an einen anderen interessierenden Analyten gebunden ist.
84. Kompetitive Bindung nutzendes System zur Bestimmung des Vorhandenseins eines interessierenden Analyten, wobei der Analyt und eine chemische Verbindung/Gruppe um die Bindung mit einem komplementären Material konkurrieren, wobei die chemische Verbindung/Gruppe die Strukturformel:
[M(P)m(L¹)n(L²)o(L³)p(L&sup4;)q(L&sup5;)r(L&sup6;)s]t(B)u
aufweist, worin:
M Ruthenium oder Osmium ist;
P ein mehrzähniger aromatischer, heterocyclischer, stickstoffhaltiger Ligand von M ist;
L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; aromatische, stickstoffhaltige Liganden von M sind, von denen jeder mit jedem anderen Liganden identisch oder auch nicht identisch sein kann;
B eine Substanz ist, die an einen oder mehrere Liganden P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5; und L&sup6; gebunden ist;
m eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
n, o, p, q, r und s jeweils 0 oder eine ganze Zahl sind;
t eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist und
u eine ganze Zahl gleich oder größer 1 ist;
wobei P, L¹, L², L³, L&sup4;, L&sup5;, L&sup6; und B von solcher Zusammensetzung und Zahl sind, daß die chemische Verbindung/Gruppe zu Elektrochemilumineszenz angeregt werden kann, und wobei die Gesamtzahl der von den Liganden von M für M zur Verfügung gestellten Bindungen der Koordinationszahl von M entspricht,
wobei das System umfaßt:
a) die chemische Verbindung/Gruppe;
b) das komplementäre Material;
c) Mittel zum Kontaktieren der chemischen Verbindung/Gruppe, des komplementären Materials und des interessierenden Analyten miteinander unter Bildung eines Reagenzgemisches;
d) Mittel zum Anregen der chemischen Verbindung/Gruppe zur Elektrochemilumineszenz und
e) Mittel zum Nachweisen der emittierten Lumineszenz.
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