DE69114499T2

DE69114499T2 - Verfahren zur verstärkung des emissionssignals einer lumineszierenden verbindung.

Info

Publication number: DE69114499T2
Application number: DE69114499T
Authority: DE
Inventors: Daniel Aspe; Christophe Dumont; Muriel Foyentin; Etienne Jolu; Gerard Mathis; Dominique Nuti
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2011-07-13
Also published as: DE69114499D1; JP3117459B2; FR2664699B1; ATE130096T1; ES2082217T3; AU8198091A; US5512493A; DK0539477T3; JPH06500852A; EP0539477B1; GR3018429T3; WO1992001225A1; FR2664699A1; EP0539477A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Verstärkung des Emissionssignals einer lumineszierenden Verbindung.
Sie betrifft auch ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Lumineszenzmmessung in einem Medium, in dem sie enthalten ist, wobei das Verfahren zur Verstärkung des Emissionssignals einer lumineszierenden Verbindung eingesetzt wird.
Die Anwendung immunologischer Bestimmungen zur qualitativen und quantitativen Analyse von Verbindungen in biologischen Flüssigkeiten ist derzeit weit verbreitet.
Von den vorliegenden Verfahren gewannen die fluorimetrischen Bestimmungen wachsende Bedeutung.
Der Grund hierfür ist, daß diese Bestimmungsverfahren einige Vorteile aufweisen, zu denen die Empfindlichkeit, die Schnelligkeit der Messung, die Stabilität und Unschädlichkeit der mit fluoreszierenden Verbindungen markierten Reaktanten sowie die relativ niedrigen Kosten gehören.
Es ist bekannt, daß die fluorimetrischen Bestimmungsverfahren per se hohe Empfindlichkeit aufweisen und die Erzielung von Nachweisgrenzen erlauben, die unter den Nachweisgrenzen liegen, wie sie mit immunologischen Bestimmungen unter Verwendung radioaktiv markierter Reaktanten erzielt werden, insbesondere durch Verwendung von modulierbaren Laserlichtquellen (I. Wieder, Immunofluorescence and related staining techniques, 1978, Elsevier).
Die Empfindlichkeit der Technik hängt jedoch von zahlreichen Parametern ab.
Das als Tracer ausgewählte fluoreszierende Molekül sollte nach dem Stand der Technik folgende Eigenschaften aufweisen:
- Es sollte eine chemische Gruppe enthalten, die eine Kupplung mit einem biologischen Molekül erlaubt, ohne es zu denaturieren oder seine immunologischen Eigenschaften zu modifizieren;
- der molare Absorptionskoeffizient des fluoreszierenden Moleküls sollte so hoch wie möglich sein;
- die Quantenausbeute der Fluoreszenz sollte so hoch wie möglich sein;
- die Stokes-Verschiebung sollte so groß wie möglich sein;
- die Emissionswellenlänge sollte möglichst größer als 500 nm sein;
- es sollte in Wasser oder in Pufferlösungen löslich sein.
Diese Bedingungen sind beispielsweise in der Veröffentlichung von E. Soini et al., Clin. Chem. 25 (1979) 353, oder bei I. Hemmilla, Clin. Chem. 31/3 (1985) 359 genauer beschrieben.
Eine der für die quantitative Bestimmung mit hoher Empfindlichkeit notwendigen Voraussetzungen auf dem Gebiet der Immunfluoreszenzbestimmungen und insbesondere auf dem Gebiet der homogenen immunologischen Bestimmungen ist die Verwendung eines fluoreszierenden Tracers, der eine hohe Quantenausbeute aufweist und im für die Messung verwendeten Medium bei geringer Verdünnung stabil ist.
Unter homogener immunologischer Bestimmung versteht man eine Bestimmung, bei der das Signal des Tracermoleküls durch die Bindung zwischen dem Liganden und dem Rezeptor oder zwischen zwei Liganden und dem Rezeptor (wobei einer von beiden das zu bestimmende Molekül ist) modifiziert wird, wodurch eine Trennung der markierten Moleküle, die im dem für die Messung verwendeten Medium ungebunden vorliegen, von den gebundenen Molekülen vor der Durchführung der Messung nicht nötig ist.
Im Fall der homogenen immunologischen Bestimmungen über Fluoreszenz, in denen die Energieübertragung ausgenutzt wird, ist die Bedingung der hohen Quantenausbeute des Donors umso wichtiger, da sie auch die Effizienz der Energieübertragung und dadurch die Ausbeute des vom Akzeptor emittierten Lichts bestimmt, die gemessen wird (Ullman et al., Clinical Lab. Techniques for the 1980's, 1980, S. 13-43, A.R. Liss Ed.).
Die Auswahlkriterien für den lumineszierenden Tracer gelten auch für die Bestimmungen mit phosphoreszierenden Molekülen.
Die Empfindlichkeit der Messung ist auch stark abhängig vom "Untergrundrauschen", das durch Emission anderer in der zu untersuchenden Probe vorhandener Moleküle entsteht, die gleichzeitig mit dem lumineszierenden Tracer angeregt werden können und in der Lage sind, bei der Wellenlänge der Messung zu emittieren.
Dieses Problem stellt sich insbesondere im Falle von Bestimmungen in Serummedien, die zahlreiche Moleküle (Proteine etc.) enthalten, die Störungen bei der Messung hervorrufen können.
Fluorimetrische Meßmethoden mit Zeitauflösung erlauben es im Falle der Immunfluoreszenzbestimmungen, diesen Nachteil teilweise zu umgehen. Das Prinzip dieser Verfahren beruht auf der Messung der von einem Tracermolekül emittierten Fluoreszenz, wobei das Tracermolekül eine relativ lange Lebensdauer aufweist und die Messung über die Emissionslebensdauer der anderen vorliegenden Moleküle hinaus verzogert wird.
In diesem Fall müssen fluoreszierende Tracermoleküle mit einer relativ langen Lebensdauer, wie beispielsweise Seltenerdmetallchelate, eingesetzt werden.
Diese Technik kann insbesondere bei homogenen immunologischen Bestimmungen über Fluoreszenz, bei denen die Energieübertragung ausgenutzt wird, angewendet werden.
In der Patentschrift US 4 822 733 wird ein homogenes Nachweisverfahren einer zu analysierenden Substanz in einer Probe beschrieben, das einen Rezeptor und eine zu analysierende Substanz verwendet, die mit fluoreszierenden Molekülen mit unterschiedlicher Lebensdauer markiert sind. Die Messung der aus dem Energieübertrag resultierenden Fluoreszenz wird nach einer Zeitspanne durchgeführt, die größer ist als die Emissionslebensdauer des Moleküls, das die kürzeste Lebensdauer aufweist.
Nur durch die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung kann dennoch eines der wesentlichen bei den homogenen Immunfluoreszenzbestimmungen mit Energieübertragung auftretenden Probleme nicht gelöst werden, nämlich das Auftreten eines Restsignals, das von dem das fluoreszierende Donormolekül tragenden Tracer herrührt, wenn bei der Fluoreszenzwellenlänge des Akzeptors gemessen wird (Morrison, Anal. Biochem. 174 (1988) 119). Dieses Phänomen ist umso wichtiger, wenn wie im Falle der Sandwichtechnik mit einem hohen Überschuß an Tracer oder wenn mit einem kompetitiven Verfahren gearbeitet wird und das markierte Antigen nicht rein ist.
Dieses wesentliche Problem, das die Empfindlichkeit begrenzt, wurde von Ullman et al., (Clinical Lab. Techniques for the 1980's, 1980, S. 13-43, A.R. Liss Ed.) erläutert, der die Verwendung eines Anti-Tracer-Antikörpers vorschlägt, um den ungebunden in Lösung vorliegenden Tracer zu hemmen.
Dieses Phänomen wird noch verschlimmert, wenn die Lebensdauer des Donors im Vergleich zur Lebensdauer des Akzeptors lang ist.
Die Anmeldung WO 87/07955 beschreibt verschiedene immunologische Bestimmungsmethoden über Fluoreszenzmessung in einem stark verdünnten Medium, wobei der fluoreszierende Marker ein wasserlösliches, in einem stark verdünnten wäßrigen Medium stabiles Seltenerdmetallchelat mit langer Lebensdauer ist. Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die verwendeten Chelate eine hohe Quantenausbeute aufweisen müssen ("intense quantum yield", S. 9, Z. 26).
Die Anmeldung GB 2 223 096 betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer zu analysierenden Substanz durch Energieübertragung, wobei die Wechselwirkung des Donors oder des Akzeptors mit der zu analysierenden Substanz die Effektivität der Übertragung vom Donor zum Akzeptor vermindert, wodurch die Signalemission des Donors erhöht und die des Akzeptors vermindert wird (S. 2, Z. 12-26).
Die Patentschrift US 4 542 104 beschreibt fluoreszierende Donor-Akzeptor-Konjugate, wobei diese u.a. durch die Quantenausbeute des Donors eine hohe Quantenausbeute der Fluoreszenz aufweisen (Spalte 3, Z. 49-53).
Es wurde nun unerwarteterweise festgestellt, daß durch Verwendung von Molekülen als lumineszierende Donorverbindung, die eine geringe Gesamt-Quantenausbeute aufweisen und daher nach dem Stand der Technik nicht für quantitative Bestimmungen, vor allem bei quantitativen immunologischen Bestimmungen durch Lumineszenzmessung, eingesetzt werden konnten, insbesondere das Problem des Restsignals des fluoreszierenden Tracers gelöst werden konnte, ohne daß die Effizienz der Übertragung vermindert wurde, wodurch die Empfindlichkeit der Bestimmung erhöht werden konnte.
Es wurde beobachtet, daß bei der Verwendung von Akzeptorverbindungen in Konzentrationen, die mit den in der Literatur angegebenen Konzentrationen bei der Verwendung von Donorverbindungen mit hoher Quantenausbeute vergleichbar sind, mit einer Donorverbindung mit geringer Gesamt-Quantenausbeute eine hohe Effizienz der Übertragung erreicht werden konnte, und daß die Intensität des am Akzeptor gemessenen Signals größer war als die Intensität des an der Donorverbindung alleine gemessenen Signals. Aufgrund dieser Feststellung kann eine präzise und empfindliche Messung mit einer Donorverbindung mit geringer Gesamt-Quantenausbeute durchgeführt werden, wobei dies in Anbetracht einer Analyse des Standes der Technik überraschend ist.
Es handelt sich daher um ein Verfahren zur Verstärkung des Emissionssignals einer lumineszierenden Donorverbindung. Vorteilhafterweise ist diese Verstärkung umso signifikanter, je geringer die Gesamt-Quantenausbeute der lumineszierenden Donorverbindung ist.
Eine der Hypothesen, die den Mechanismus dieses Phänomens zu erklären erlaubt, ist die Verknüpfung der bei der Verwendung einer lumineszierenden Donorverbindung mit geringer Gesamt-Quantenausbeute beobachteten hohen Effizienz der Übertragung mit der Quantenausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau der Donorverbindung, im Gegensatz zur Verknüpfung mit der Gesamt-Quantenausbeute nach dem Stand der Technik.
Im Fall der als fluoreszierende Tracer verwendeten Seltenerdmetallkryptate und -chelate kann der photophysikalische Mechanismus zwischen Lichtabsorption und -emission bei den Seltenerdmetallen, wie beispielsweise bei N. Sabbatini et al. in Supramolecular Biochemistry, 1987, S. 187-206, Reidel Dordrecht, Ed. V. Balzani, gezeigt, auffolgende Weise dargestellt werden: Donorverbindung Seltenerdmetall Emissionsniveau Grundzustand
Durch die Anregungsenergie wird das Niveau S1 besetzt, das durch Intersystem-Crossing das Triplett besetzt. Das Triplett überträgt seine Energie auf das Emissionsniveau des Seltenerdmetalls, das durch Strahlung oder strahlungslos desaktiviert wird. Die Gesamtausbeute der Fluoreszenz ist das Produkt aus den Ausbeuten der verschiedenen Schritte:
ΦT = Φ1 x Φ2 x Φ3.
Der letzte Schritt ist die Desaktivierung vom Emissionsniveau des Seltenerdmetalls. Die Desaktivierung kann auf unterschiedliche Weise mit verschiedenen Geschwindigkeiten stattfinden. Emissionsniveau Grundzustand
Die Ausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau des Seltenerdmetalls wird durch die Formel
ausgedrückt, worin bedeuten:
kR die Geschwindigkeit der Strahlungsdesaktivierung und
kNR die Summe der Geschwindigkeiten der strahlungslosen Desaktivierung.
Die Summe der beiden Geschwindigkeiten der Desaktivierung wird durch kD ausgedrückt.
Die Effizienz der Übertragung ist im Falle einer Energieübertragung zwischen Donor und Akzeptor:
Im Stand der Technik wird üblicherweise angenommen, daß die Übertragungsgeschwindigkeit kT von der Gesamt-Quantenausbeute ΦT abhängt. kT ist, wie beispielsweise bei D. Thomas et al., PNAS 75 (1978) 5746 - 5750, gezeigt, durch die Beziehung
gegeben, worin bedeuten:
- r den Abstand zwischen Donor und Akzeptor und
- Ro den Abstand zwischen Donor und Akzeptor, bei dem die Effizienz der Übertragung 50 % ist,
und wobei Ro eine Funktion der Gesamt-Quantenausbeute Qo ist.
Im Falle der phosphoreszierenden Tracermoleküle sind die Desaktivierungsmechanismen analog, wobei die Strahlungsdesaktivierung aber vom Triplett-Niveau aus erfolgt.
Lumineszierende Akzeptorverbindungen, die zur Verstärkung des Emissionssignals der lumineszierenden Donorverbindungen verwendet werden können, werden in Abhängigkeit von letzteren, bzw. genauer im Hinblick auf ihre Ausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau ausgewählt.
Es wurde nämlich festgestellt, daß eine Verstärkung des Emissionssignals der Donorverbindung stattfindet, wenn die Beziehung gilt:
E ΦA > Φ&sub3;,
worin bedeuten:
- E die Effizienz der Übertragung,
- ΦA die Quantenausbeute der Akzeptorverbindung und
-Φ&sub3; die Ausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau.
Diese Größen können durch folgende Formeln ausgedrückt werden:
worin bedeuten:
- E, kT, kR und kD dasselbe wie oben,
- das J Integral über die Spektren
- R den Abstand zwischen Donor und Akzeptor in der untersuchten Probe
und wobei K = n&supmin;&sup4; 5,87 10²³ ist, wobei n der Brechungsindex des Mediums ist und R in Å und J in cm³M&supmin;¹ ausgedrückt sind.
E kann daher durch folgende Beziehung ausgedrückt werden:
E ΦA > Φ&sub3; kann ausgedrückt werden durch
oder
Die Beziehung
bestimmt daher die Wahl der Akzeptorverbindung in Abhängigkeit von der Donorverbindung, da die Werte ΦA, Φ&sub3; und J für das Donor-Akzeptor-Paar charakteristisch sind.
Das Integral J über die Spektren wird wie bei Conrad et. al., Biochemistry 7 (1968) 777-787, angegeben berechnet.
Die Berechnung der Ausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau Φ&sub3; ist aus der Literatur bekannt und ist beispielsweise bei N. Sabbatini et al. in Supramolecular Biochemistry, 1987, S. 187-206, Reidel Dordrecht, Ed. V. Balzani, beschrieben.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Verstärkung des Emissionssignals einer lumineszierenden Verbindung, die als Donorverbindung bei der quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Lumineszenzmessung verwendet wird, bei dem ferner eine lumineszierende Akzeptorverbindung eingesetzt wird und das emittierte Signal der Akzeptorverbindung nach Anregung der Donorverbindung bei ihrer Anregungswellenlänge gemessen wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Donorverbindung eine geringe Gesamt-Quantenausbeute aufweist und die Quantenausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau der Donorverbindung kleiner ist als die Quantenausbeute der Akzeptorverbindung.
Vorteilhafterweise werden Verbindungen mit langer Lebensdauer, wie Seltenerdmetallchelate oder -kryptate, oder auch phosphoreszierende Moleküle als lumineszierende Donorverbindungen bei der Bestimmung durch Lumineszenzmessung verwendet.
Ein bevorzugter Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Verstärkung des Emissionssignals eines Seltenerdmetallkryptats oder -chelats, das als Donorverbindung bei der quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Lumineszenzmessung verwendet wird, bei dem ferner eine lumineszierende Akzeptorverbindung eingesetzt wird und das emittierte Signal der Akzeptorverbindung nach Anregung des Seltenerdmetallkryptats oder -chelats bei seiner Anregungswellenlänge gemessen wird und das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Seltenerdmetallkryptat oder Seltenerdmetallchelat eine geringe Gesamt-Quantenausbeute aufweist und die Quantenausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsmiveau des Seltenerdmetalls kleiner ist als die Quantenausbeute der Akzeptorverbindung.
Die Erfindung betrifft andererseits ein homogenes Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, durch Lumineszenzmessung unter Einsatz des Produkts der Reaktion zwischen der zu analysierenden Substanz und mindestens einem entsprechenden Rezeptor, das folgende Schritte umfaßt:
1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, zum Medium,
2) Zugabe eines zweiten, unter der zu analysierenden Substanz und mindestens einem ihrer Rezeptoren ausgewählten Reaktanten, wobei einer der beiden Reaktanten an eine lumineszierende Donorverbindung, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder -chelat besteht, und der andere Reaktant an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt sind,
wobei die Reihenfolge der Zugabe der Reaktanten umgekehrt werden kann,
und, nach Anregung des Gemisches mit einer Lichtquelle bei der Anregungswellenlänge der lumineszierenden Donorverbindung,
3) Messung des Emissionssignals der lumineszierenden Akzeptorverbindung,
wobei das als Donorverbindung eingesetzte Seltenerdmetallkryptat oder -chelat eine geringe Gesamt-Quantenausbeute aufweist und die Quantenausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau des Seltenerdmetalls kleiner ist als die Quantenausbeute der Akzeptorverbindung.
In der vorliegenden Beschreibung gelten folgende Definitionen:
- unter einer zu analysierenden Substanz werden beliebige Substanzen oder Gruppen analoger Substanzen verstanden, die zu erfassen und/oder zu bestimmen sind;
- unter Rezeptoren werden beliebige Substanzen verstanden, die zu einer spezifischen Bindung an einer Stelle der zu analysierenden Substanz befähigt sind;
- unter lumineszierenden Verbindungen werden beliebige Substanzen verstanden, die befähigt sind, nach Anregung bei einer gegebenen Wellenlänge Licht zu ermittieren.
Nach einer bevorzugten Ausführungsart ist das homogene Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, erfindungsgemäß ein Überschußverfahren mit folgenden Schritten:
1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, der an eine lumineszierende Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder -chelat besteht, zu dem Medium, das die zu analysierende Substanz enthält,
2) Zugabe eines zweiten aus einem oder mehreren anderen Rezeptoren der zu analysierenden Substanz bestehenden Reaktanten, wobei der zweite Reaktant an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt ist,
3) Inkubation des Mediums nach jeder Zugabe von Reaktanten oder nach Zugabe beider Reaktanten,
4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der lumineszierenden Donorverbindung,
5) Messung des von der lumineszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird in der obengenannten Überschußmethode ein einziger Rezeptor der zu analysierenden Substanz verwendet, der entweder an die lumineszierende Donorverbindung oder an die lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt ist.
Nach einer anderer Ausführungsart ist das Verfahren ein kompetitives Verfahren, das aus folgenden Schritten besteht:
1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, der an eine Iumineszierende Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder -chelat besteht, zu dem Medium, das die zu analysierende Substanz enthält,
2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus der an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelten zu analysierenden Substanz besteht,
3) Inkubation des Mediums nach jeder Zugabe von Reaktanten oder nach der Zugabe beider Reaktanten,
4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der lumineszierenden Donorverbindung,
5) Messung des von der lumineszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.
Das homogene Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz kann erfindungsgemäß ebenfalls in einem kompetitiven Verfahren angewendet werden, das aus folgenden Schritten besteht:
1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, der an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt ist, zu dem Medium, das die zu analysierende Substanz enthält,
2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus der zu analysierenden Substanz besteht, die an eine lumineszierende Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder -chelat besteht,
3) Inkubation des Mediums nach Zugabe jedes Reaktanten oder nach Zugabe beider Reaktanten,
4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregunswellenlänge der lumineszierenden Donorverbindung,
5) Messung des von der lumineszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform werden der erste und der zweite Reaktant, die in den oben beschriebenen Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz verwendet werden, dem die zu analysierende Substanz enthaltenden Medium gleichzeitig zugegeben.
Vorteilhafterweise werden als lumineszierende Donorverbindungen Chelate oder Kryptate von Terbium, Europium, Dysprosium, Samarium oder Neodym verwendet. Vorzugsweise verwendet man Chelate oder Kryptate von Terbium oder Europium. Die Seltenerdmetallkryptate, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhafterweise verwendet werden können, sind in der Patentanmeldung EP 180 492 beschrieben. Diese Verbindungen bestehen aus mindestens einem Seltenerdmetallsalz, das mit einer makropolycyclischen Verbindung der allgemeinen Formel komplexiert ist,
in der bedeuten:
Z ein drei- oder vierwertiges Atom, wie Stickstoff, Kohlenstoff oder Phosphor,
R keine Substituenten oder Wasserstoff, Hydroxy, Amino oder eine Kohlenwasserstoffgruppe , , und unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffketten, die ggf. ein oder mehrere Heteroatome enthalten und ggf. durch einen Heteromakrocyclus unterbrochen sind, wobei mindestens eine der Gruppen , und mindestens eine Molekülgruppe trägt oder im wesentlichen aus ihr besteht, die eine Triplett-Energie besitzt, die größer ist als die Energie des Emissionsniveaus des komplexgebundenen Seltenerdmetallions.
Erfindungsgemäß bevorzugte Molekülgruppen sind insbesondere Phenanthrolin, Anthracen, Benzol, Naphthalin, Biphenyl und Terphenyl, Bipyridine, Bichinoline, insbesondere Biisochinoline, z.B. 2,2'-Bipyridin, Azobenzol, Azopyridin, Pyridin oder 2,2'-Biisochinolin.
Beispiele für die Gruppen , und , die eine Gruppe als Energiedonor enthalten, sind folgende Ketten:
wobei X&sub1; und X&sub2;, die gleich oder voneinander verschieden sind, Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel bezeichnen,
wobei X Sauerstoff oder Wasserstoff bedeutet.
In der Anmeldung EP 0 180 492 beschriebene und beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendete Verbindungen sind das Terbiumkryptat Tb-Tris(bipyridin) und das Europiumkryptat Eu-Tris(bipyridin).
Andere Seltenerdmetallkryptate, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind in der Anmeldung EP 321 353 beschrieben. Sie bestehen aus mindestens einem Seltenerdmetallsalz, das mit einer makropolycyclischen Verbindung der nachstehenden Formeln I oder II komplexiert ist:
worin bedeuten:
- das Ringsystem der Formel
eine der folgenden cyclischen Gruppen: n = 0 oder 1 Makrocyclus [N&sub2;O&sub4;] bzw. Cyclus (22) Makrocyclus [N&sub2;O&sub3;] bzw. Cyclus (21) makrocyclisches Bis(bipyridin)
- Y eine Gruppe oder eine Spacergruppe, die aus einer zweiwertigen organischen Gruppe besteht, die ausgewählt ist unter geradkettigen und verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;- Alkylgruppen, die ggfs. eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen und/oder ggfs. durch ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor, unterbrochen sind, C&sub5;&submin;&sub8;-Cycloalkylengruppen und C&sub6;&submin;&sub1;&sub4;-Arylengruppen, wobei die Alkylengruppen, Cycloalkylengruppen und Arylengruppen ggfs. mit Alkylgruppen, Arylgruppen oder Sulfonatgruppen substituiert sind,
- Z eine funktionelle Gruppe, die befähigt ist, eine kovalente Bindung mit einer biologischen Substanz einzugehen,
- R Methyl oder die Gruppierung -Y-Z und
- R' Wasserstoff oder eine Gruppe -COOR", in der R" eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl und vorzugsweise Methyl, Ethyl oder t-Butyl darstellt, oder die Gruppe -CO-NH-Y-Z.
Beispiele für geeignete funktionelle Gruppen sind insbesondere Amino, Thio, Cyano, Isocyanato, Isothiocyanato, Thiocyanato, Carboxy, Hydroxy, Maleinimido, Succinimido, Mercapto, Phenol, Imidazol, Aldehyd, Epoxy, Halogenid, Thionyl, Sulfonyl, Nitrobenzoyl, Carbonyl, Triazo, Anhydrid, Halogenacetat, Hydrazino, Acridin, usw.
Besonders bevorzugt werden Amino-, Thio- und Carboxygruppen, die vor der kovalenten Kupplung mit der biologischen Substanz aktiviert sein können, sowie Maleinimido-, Succinimido- und Isothiocyanatgruppen, die direkt an die biologische Substanz gebunden werden können.
Das Europiumkryptat Eu-Tris(bipyridin)diamin und das Terbiumkryptat Tb-Tris(bipyridin)diamin werden in den erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhafterweise verwendet und sind in der Anmeldung EP 321 353 beschrieben.
Die obengenannten Seltenerdmetallkryptate haben den großen Vorteil, eine lange Lebensdauer in der Größenordnung von mehreren Zehn us aufzuweisen, wodurch sie einerseits bei der Technik der zeitaufgelösten Messung verwendet werden können und dadurch die Emissionen störender Verbindungen umgangen werden können, und andererseits bei der Messung herkömmlicher Materialien verwendet werden können.
Als lumineszierende Donorverbindungen können auch phosphoreszierende Verbindungen, wie Eosin oder Erythrosin, verwendet werden.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten lumineszierenden Akzeptorverbindungen werden, wie oben angegeben, in Abhängigkeit von den Donorverbindungen ausgewählt.
Wenn die lumineszierende Donorverbindung ein fluoreszierendes Europiumkryptat ist, verwendet man vorteilhafterweise eine fluoreszierende Akzeptorverbindung, die unter Allophycocyanin, Allophycocyanin B, C-Phycocyanin und R-Phycocyanin ausgewählt wird.
Wenn als Donorverbindung ein Terbiumkryptat verwendet wird, verwendet man vorteilhafterweise eine fluoreszierende Akzeptorverbindung, die unter Rhodaminen, Thionin, R-Phycocyanin, Phycoerythrocyanin, C-Phycoerythrin, B-Phycoerythrin und R-Phycoerythrin ausgewählt wird.
Als lumineszierende Donorverbindung kann ferner eine phosphoreszierende Verbindung wie Eosin oder Erythrosin verwendet werden. In diesem Fall wird die fluoreszierende Akzeptorverbindung vorteilhafterweise unter Chlorophyll, (in den Anmeldungen EP 73 991 und EP 314 402 beschrieben) oder den Porphyrinen (in der Anmeldung EP 71 991 beschrieben) oder auch den Phtalocyaninen (wie in der Anmeldung PCT/WO 88 04777) ausgewählt.
Im Falle einer Bestimmung unter Verwendung von phosphoreszierenden Donorverbindungen in flüssigem Medium erfolgt die Messung entweder auf einem festen Trägermaterial oder unter Zusatz von Molekülen zum Meßmedium, die Sauerstoff abfangen, wobei diese Verfahren dem Fachmann geläufig sind.
Chlorophylle und Phtalocyanine können ebenfalls als fluoreszierende Akzeptorverbindungen verwendet werden, wobei als Donorverbindung ein Europiumkryptat oder Europiumchelat verwendet wird.
Als Lichtquelle für die Anregung der lumineszierenden Donorverbindung wird vorteilhafterweise eine modulierbare Lichtquelle verwendet, wie sie bei Lakowicz, Principles of fluorescent spectroscopy, Plenum Press, New York, 1983, S. 96-100, beschrieben wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verstärkung wird insbesondere bei den immunologischen Bestimmungen durch Fluoreszenzmessung angewendet, aber auch bei den genannten Bestimmungsmethoden mit Überschuß oder bei kompetitiven Verfahren in homogener oder heterogener Phase, die im Stand der Technik beschrieben wurden (Landon, Ann. Clin. Biochem 18 (1981) 253 und E. Soini et al., Clin. Chem. 25 (1979) 353).
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Verstärkung kann insbesondere vorteilhafterweise bei den immunologischen Bestimmungen im Serummedium verwendet werden, wo eine hohe Empfindlichkeit gefordert wird, die üblicherweise durch hohes Untergrundrauschen beeinträchtigt wird.
Der Grund hierfür ist, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Verstärkung Tracer mit geringer Gesamt-Quantenausbeute verwendet werden können und daher das Restsignal noch schwächer ist.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, die nicht einschränkend sind.

Beispiel 1:

Zwei Versuchsserien zur dynamischen Verstärkung wurden unter Verwendung des Europiumkryptats Eu-Tris(bipyridin) (Eu TBP), dessen Herstellung in der Anmeldung EP 180 492 (Beispiel 5) beschrieben wurde, als Donorverbindung und des Allophycocyanins (Interchim, Frankreich) als Akzeptorverbindung sowie des Terbiumkryptats Tb-Tris(bipyridin) (Tb TBP), das analog zum Eu-Tris(bipyridin) hergestellt wurde, als Donorverbindung und von Rhodamin B (Fluka, Schweiz) oder B- Phycoerythrin (Sigma, USA) als Akzeptorverbindung durchgeführt.
Die Donorverbindung wurde mit einer Konzentration von 10&supmin;&sup8; mol/l in verschiedenen Pufferlösungen verwendet:
- Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4
- Tris-Puffer 0,1 M, pH 8
- Tris/HCl-Puffer 0,1 M, pH 7,1,
wobei die Pufferlösungen gleichzeitig 1 g/l Humanserumalbumin enthalten und die Akzeptorverbindung in unterschiedlichen Konzentrationen vorliegt. Die Fluoreszenz kann mit einem Fluorimeter vom Typ Arcus (LKB, Schweden) unter Verwendung eines an die Emission der Akzeptorverbindung angepaßten Interferenzfilters zeitaufgelöst gemessen werden.
In diesem Versuch wurde die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung mit einem Laser-Fluorimeter (Prototyp) durchgeführt, der nachfolgend beschrieben wird:
Ein gepulster Stickstofflaser (Laser Science Inc., Modell LS1-337ND) wird als Anregungslichtquelle verwendet (Wellenlänge 337,1 nm). Die Impulsdauer ist mit 3 ns spezifiziert, wobei die Wiederholfrequenz 10 Hz beträgt. Das Strahlenbündel tritt durch ein Filter (Corning) hindurch, um jede störende Lichtstrahlung mit einer von 337 nm abweichenden Anregungswellenlänge zu eliminieren.
Nach Wiedereintritt in die Meßkammer wird das Strahlenbündel von einem unter 45º schräg angeordneten dichroitischen Filter reflektiert, das die Eigenschaft besitzt, UV-Strahlung zu reflektieren und sichtbares Licht durchzulassen.
Das vom dichroitischen Filter reflektierte Strahlenbündel wird durch eine Quarzglaslinse auf die zu messende Vertiefung einer Mikrotiterplatte fokussiert. Die emittierte Fluoreszenzstrahlung wird unter einem festen Winkel von 20º erfaßt und von der gleichen Linse kollimiert und tritt direkt durch das dichroitische Filter hindurch (Fluoreszenz im sichtbaren Bereich).
Ein Interferenzfilter, dessen Charakteristik je nach der Wellenlänge der zu erfassenden Fluoreszenzstrahlung definiert ist, erlaubt die Abtrennung von Lichtanteilen, die das Signal stören könnten, dessen Intensität anschließend mit einem Photomultiplier (Hamamatsu R2949) gemessen wird.
Der verwendete Photonenzähler ist vom Typ SR-400 (Stanford Research Systems), dessen Betrieb und Synchronisation mit dem Laser über einen Rechner vom Typ IBM PC-AT über eine RS 232-Schnittstelle gesteuert werden. Die vom Photomultiplier stammenden Pulse werden während eines Zeitfensters (tg) und nach einer Verzögerung (td), die so festgelegt sind, daß sie über einem vom Photonenzähler ausgewählten Schwellenwert liegen, umso das Signal/Rausch-Verhältnis des Photomultipliers zu optimieren, registriert.
Ein vom IBM PC-AT angesteuerter X-Y-Tisch erlaubt die verschiedenen Positionierungen der vermessenen Mikrotiterplatten über Schrittmotoren, einschließlich der Füllmanöver, der Positionierung unter dem anregenden Lichtstrahl, der automatischen sequentiellen Messung der 96 Vertiefungen und des Ausgangs.
200 ul einer 2 10&supmin;&sup8; M Lösung aus Eu TBP oder Tb TBP in der Arbeitspufferlösung werden 200 ul des Arbeitspuffers oder 200 ul der folgenden Lösungen zugesetzt:
1,24 10&supmin;&sup5; M Allophycocyanin im Arbeitspuffer
2 10&supmin;&sup5; M, 1,6 10&supmin;&sup5; M, 1,2 10&supmin;&sup5; M Rhodamin B in 0,1 M Tris/HCl-Puffer bei pH 7,1
1,54 10&supmin;&sup6; M und 9,6 10&supmin;&sup7; M B-Phycoerythrin in 0,1 M Tris/HCl-Puffer bei pH 7,1.
Zur Bestimmung der Verstärkung wurde die Fluoreszenz zuerst für die Donorverbindung alleine durch Messung der Fläche des Peaks bei 620 nm mit einem Interferenzfilter mit 80 % Transmission und einer Halbwertsbreite von 20 nm im Falle von Eu TBP und bei 545 nm mit einem Filter mit 80 % Transmission und einer Halbwertsbreite von 20 nm im Falle von Tb TBP bestimmt.
Danach wurde die Fluoreszenz des Gemisches nach Anregung bei 307 nm auf die gleiche Weise, aber bei 670 nm im Falle der Donorverbindung in Gegenwart der Akzeptorverbindung (Allophycocyanin) und bei 580 nm (Rhodamin, B-Phycoerythrin) bestimmt.
Die Messung wird nach einer Verzögerung von 0,1 und 0,05 ms durchgeführt. Die Lebensdauer der emittierten Signale wird ebenfalls gemessen.
Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgelistet: 1) Eu-Tris(bipyridin) in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 Allophycocyanin Signal 2) Eu-Tris(bipyridin) in 0,1 M Tris-Puffer pH 8 Allophycocyanin Signal 3) Tb-Tris(bipyridin) in 0,1 M Tris/HCl-Puffer pH 7,1 Allophycocyanin Signal 4) Tb-Tris(bipyridin) in 0,1 M Tris/HCl-Puffer pH 7,1 B-Phycoerythrin Signal T = Lebensdauer des emittierten Signals td = Verzögerung bei der Messung A = Verstärkung
Die Ergebnisse zeigen, daß man in allen Fällen eine Verstärkung des durch die Akzeptorverbindung einittierten Signals im Vergleich zu dem vor der Donorverbindung allein emittierten Signal erhält. Diese Verstärkung variiert von 1,8 bis 5,9.

Beispiel 2:

Die dynamische Verstärkung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung des Europiumkryptats Eu-Tris(bipyridin) (hergestellt nach Beispiel 5 der Anmeldung EP 180 492) untersucht, wobei die Donorverbindung in einer Konzentration von 10&supmin;&sup8; M/l vorlag, und von Allophycocyanin (Cyanotech, USA), wobei die Akzeptorverbindung in einer Konzentration von 6,2 10&supmin;&sup6; M vorlag, in Wasser oder 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,4 durchgeführt.
Zuerst wurde die Ausbeute der Desaktivierung des Seltenerdmetalls (Φ3 Eu) in den zwei verwendeten Pufferlösungen nach der Formel:
Φ&sub3; Eu = τ/τ&sub7;&sub7;
bestimmt, worin bedeuten:
- τ die unter Arbeitsbedingungen gemessene Lebensdauer des Europiumkryptats Eu-Tris (bipyridin),
- τ&sub7;&sub7; die Lebensdauer des Kryptats in schwerem Wasser bei 77º K (flüssiger Stickstoff).
Die Gesamt-Quantenausbeute (Φ total) wurde nach einem herkömmlichen Verfahren, wie es beispielsweise bei Lakowicz, Principles offluorescent spectroscopy, Plenum Press, New York, 1983, beschrieben wurde, bestimmt.
Die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung wurde mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Laser-Fluorimeter (Prototyp) durchgeführt, wobei das Kryptat Eu-Tris(bipyridin) und Allophycocyanin wie in Beispiel 1 verwendet wurden. Die Effizienz der Übertragung wurde nach D. Thomas et al., P.N.A.S. 75 (1978) 5746-5750, nach der Formel
E = 1 - τ/τo
berechnet, worin bedeuten:
τ die Lebensdauer des Donors in Gegenwart des Akzeptors und
τo die Lebensdauer des Donors alleine.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I aufgeführt: Tabelle I Medium Φ total Effizienz des Übertragung mit 6,2 10&supmin;&sup6; M Allophycocyanin Tris-Puffer 0,1 M, pH 8 Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7
Die Ergebnisse zeigen, daß auch bei Verwendung einer Donorverbindung mit geringer Gesamt-Quantenausbeute eine hohe Effizienz der Übertragung erhalten werden kann, wodurch eine Verstärkung des Signals der Donorverbindung erreicht wird.

Beispiel 3:

Die Untersuchung der dynamischen Verstärkung wurde unter den Bedingungen wie in Beispiel 1 unter Verwendung des Terbiumkryptats Tb-Tris(bipyridin) als Donorverbindung, das wie in der Anmeldung EP 180 492 beschrieben hergestellt wurde, und von B-Phycoerythrin (Sigma, USA) oder Rhodamin B (Fluka, Schweiz) als Akzeptorverbindungen zur Bestimmung der Akzeptorkonzentration durchgeführt, wobei eine Effizienz der Übertragung von 50 % erhalten werden konnte.
Das Terbiumchelat Tb (DPA)&sub3;, das eine Quantenausbeute von 100 % aufweist und bei D. Thomas et al., P.N.A.S. 75 (1978) 5746-5750, beschrieben wurde, wurde als Referenz verwendet.
Die Ergebnisse zeigen, daß bei der Verwendung des Terbiumkryptats Tb-Tris(pyridin) als Donorverbindung, dessen Quantenausbeute ungefähr 2 % beträgt, die Akzeptorkonzentrationen (B-Phycoerythrin oder Rhodamin B), wobei eine Effizienz der Übertragung von 50 % erhalten werden kann, in der gleichen Größenordnung (6 10&supmin;&sup7; M) liegen wie die Konzentrationen, die bei der Verwendung des Terbiumchelats (DPA)&sub3; gemessen wurden, dessen Quantenausbeute ungefähr bei 100 % liegt.
Dies führt zu einer Verstärkung des Signals des Donors Tb- Tris(bipyridin).

Beispiel 4:

Quantitative Bestimmung von Prolactin:

Ein homogener Immunoassay, der das Verstärkungsprinzip bei der quantitativen Bestimmung von Prolactin zeigt, wurde unter Verwendung des nach der Patentanmeldung EP 321 353 (Beispiel 3 und 4) hergestellten Europiumkryptats Eu-Tris (bipyridin)diamin als Donorverbindung und von Allophycocyanin (Cyanotech, USA) als Akzeptorverbindung durchgeführt, die an monoklonale Anti-Prolactin E&sub1;- bzw. -3D3-Antikörper (CIS bio international, Frankreich) gekuppelt waren, die zwei unterschiedliche Epitope des Prolactins erkennen.
Im folgenden werden die nachstehenden Abkürzungen verwendet:
APC = Allophycocyanin
DTT = Dithiothreit
EuTBP = Europiumkryptat Eu-Tris(bipyridin)diamin
HSA = Humanserumalbumin
IgG = Immunglobulin G
SPDP = N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat
Sulfo-SMCC = Sulfosuccinimidyl-(4-N-maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat

(1) Herstellung des ING 3D3-APC

a) Aktivierung von APC mit Sulfo-SMCC

Im Handel in Form eines Präcipitats in einer 60%igen Ammoniumsulfatlösung erhältliches APC (3 mg) wird zentrifugiert. Nach Abtrennung des Überstands wird der Bodensatz in 250 ul 100 mM Phosphatpuffer von pH 7,0 aufgenommen und dann durch ein 0,8-um-Filter filtriert, um ggf. suspendierte Partikel abzutrennen.
Das Filtrat wird dann durch Ausschlußchromatographie an einer G25-Superfine-Säule (Pharmacia, Schweden) im gleichen Puffer gereinigt. Die in das Ausschlußvolumen eluierte APC- Konzentration wird bei 650 nm mit einem Extinktionskoeffizienten &epsi;650nm von 731000 M&supmin;¹cm&supmin;¹ bestimmt.
Die Aktivierung des APC erfolgt durch Zusatz einer unmittelbar zuvor hergestellten Lösung von Sulfo-SMCC einer Konzentration von 6,9 mM in einem 100 mM Phosphatpuffer von pH 7,0, wobei die Reaktion während 1 h bei Raumtemperatur unter mäßigem Rühren stattfinden kann (Molverhältnis 15 bis 75 Sulfo-SMCC pro APC). Das APC-Maleinimid wird anschließend an einer G25-Superfine-Säule in einem 100 mM Phosphatpuffer mit 5 mM EDTA und pH 6,5 gereinigt und vor der Kupplung an IgG 3D3 bei 4 ºC aufbewahrt.

b) Aktivierung des IgG 3D3 mit SPDP

Gleichzeitig werden 5mg IGG 3D3 in einer Konzentration von 10 mg/ml in einem 100 mM Phosphatpuffer von pH 7,0 durch Zusatz einer Lösung von SPDP (Pierce, USA) einer Konzentration von 6,4 mM in Dioxan in einem Molverhältnis von 7,5 SPDP pro IgG 3D3 aktiviert.
Nach 35 min Aktivierung bei Raumtemperatur wird das IgG Pyridin-2-thion an einer G25-Superfine-Säule in einem 100 mM Phosphatpuffer mit 5 mM EDTA und pH 6,5 gereinigt.
Die Proteine werden aufkonzentriert und die 2-Pyridyl-sulfid-Gruppen mit einer Lösung von DTT (Sigma, USA) mit einer Endkonzentration von 19 mM während 15 min bei Raumtemperatur reduziert. Das DTT und das Pyridin-2-thion werden durch Reinigung an einer G25-Superfine-Säule in einem 100 mM Phosphatpuffer mit 5 mM EDTA und pH 6,5 abgetrennt. Die Konzentration an IgG-SH wird bei 280 nm mit einem Extinktionskoeffizienten &epsi;280nm von 210000 M&supmin;¹cm&supmin;¹ bestimmt.

c) Konjugation des IgG 3D3-SH mit APC-Maleinimid

Die Bindung der Thiolgruppen an den Maleinimid-Gruppen erfolgt durch Zusatz von 2,51 mg aktiviertem APC pro mg IgG 3D3-SH. Nach 18 h Inkubation bei 4 ºC und im Dunkeln unter mäßigem Rühren werden die freigebliebenen Thiolfunktionen durch Zusatz einer 100 mm Lösung von N-methyl-maleinimid (Sigma, USA) einer Endkonzentration von 20 mM während 1 h bei Raumtemperatur blockiert.
Das Reaktionsmedium wird durch Gelfiltration an einer halbpräparativen Säule TSK G3000SW (Beckmann, USA) in 100 mM Phosphatpuffer von pH 7,0 gereinigt.
Die Konzentrationen an APC und IgG 3D3 des gereinigten im ersten Peak eluierten Konjugats werden durch Absorption bei 280 und 650 nm nach folgender Gleichung bestimmt:
[APC]mol/l = A650 nm/710000
[IgG]mol/l = (A280 nm -A'280 nm)/210000
wobei A'280 nm der oben bestimmte (Abschnitt 1-a) Beitrag des APC-Maleinimids bei dieser Wellenlänge ist.
Zu dem Konjugat wird Humanserumalbumin (HSA) in einer Konzentration von 1 g/l zugegeben, das Anschließend in aliquote Mengen aufgeteilt und danach bei -20 ºC eingefroren wird.

2) Herstellung von IgG E1-Eu-TBP-Konjugaten

Die Herstellung des IgG E1-SH erfolgt nach dem oben für IgG 3D3 beschriebenen Protokoll, wobei jedoch das Molverhältnis von 6 bis 16 SPDP pro IgG E1 variiert wird.
Einer Lösung von 25 mM Sulfo-SMCC in einem 20 mM Phosphatpuffer mit 10 % (V/V) Dimethylformamid und pH 7,0 wird 5 mg (5 10&supmin;&sup6; mol) Eu TBP in einem Verhältnis von 2,5 mol Aktivator pro Mol Eu TBP zugesetzt.
Nach 45 min Aktivierung bei Raumtemperatur wird das Reaktionsmedium durch ein 0,8 um-Filter filtriert, um ggfs. gebildete Präcipitate abzutrennen. Unerwünschte Reaktionsprodukte (Sulfo-SMCC, N-Hydroxysuccinimid, N-Maleinimidomethylcarbonsäure) werden durch Ionenaustauschchromatographie an einer Mono Q-Säule (Pharmacia, Schweden) in einem 20 mM Phosphatpuffer mit 10 % (V/V) Dimethylformamid und pH 7,0 unter NaCI-Schock abgetrennt. Die Konzentration an Eu-TBP- Maleinimid wird bei 307 nm mit einem Extinktionskoeffizienten &epsi;307 nm von 25000 M&supmin;¹cm&supmin;¹ bestimmt, ferner das Verhältnis A307 nm/A280 nm.
Die Reaktion der Maleinimidgruppen mit den an den Antikörper gekuppelten Thiolgruppen erfolgt ähnlich wie oben beschrieben, wobei das Molverhältnis zwischen 1 bis 30 Eu- TBP-Maleinimid pro IgG E1-SH variiert.
Nach 18 h Inkubation bei 4 ºC und Blockierung der Diolfunktionen (die ggfs. freigeblieben sind) durch N-Methylmaleinimid wird das ungekuppelte Eu-TBP durch Dialyse in 100 mM Phosphatpuffer von pH 7,0 bei 4 ºC vollständig abgetrennt (keine Fluoreszenz mehr im Dialysebad).
Die Eigenschaften des Konjugats werden durch seine Absorption bei 307 und 280 nm bestimmt, wobei die folgenden Werte unter Berücksichtigung der Eigenabsorption des Kryptats, die über das Verhältnis A307 nm / A280 nm bestimmt wurde, verwendet wurden:

Eu TBP-Maleinimid:

&epsi;307 nm = 25000 M&supmin;¹cm&supmin;¹ A307 nm / A280 nm: Experimentell bestimmt

IgG E1-SH:

&epsi;280 nm = 210000 M&supmin;¹cm&supmin;¹
&epsi;307 nm = 0 M&supmin;¹cm&supmin;¹

3) Anwendung zur quantitativen Bestimmung von Prolactin

In Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen (Dynatech, USA) von 350 ul werden nacheinander zugegeben:
- 100 ul Prolactin Standardlösung von bekannter Konzentration
- 100 ul IgG E1-Eu-TBP-Konjugat (Donor) bei einer Konzentration von 0,5 ug/ml
- 100 ul des Konjugats IgG 3D3-APC (Akzeptor) bei einer Konzentration von 3 ug/ml
Die beiden Konjugate werden in 50 mM Phosphatpuffer mit 1 g/l HSA und pH 7,4 verdünnt.
Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Messung mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Laserfluorimeter (Prototyp), das mit einem 650 nm-Filter einer Halbwertsbreite von 20 nm ausgerüstet ist, nach einer Verzögerung von 50 us während 100 us vorgenommen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II aufgeführt (Zählimpulse pro Sekunde (cps)): Tabelle II mit HSA-Puffer Prolactin
Die Ergebnisse zeigen, daß das von der Donor-Akzeptor-Übertragung stammende Meßsignal proportional zur Prolactinkonzentration im Medium variiert.
Die erfindungsgemäßen Donorverbindungen von geringer Gesamt-Quantenausbeute sind daher für diesen Typ der immunologischen Bestimmung besonders geeignet.

Beispiel 5:

Quantitative Bestimmung von Prolactin

Ein weiteres Immunoassay wurde analog zum oben beschriebenen Beispiel 4 Abschnitt 3) durchgeführt, wobei eine andere Akzeptorverbindung, das C-Phycocyanin (Cyanotech, USA), verwendet wurde.
In Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen (Dynatech, USA) von 350 ul werden nacheinander zugegeben:
- 100 ul Prolactin Standardlösung von bekannter Konzentration
- 100 ul des Konjugats IgG E1-Eu-TBP (Donor) mit einer Konzentration von 0,1 oder 0,5 ug/l
- 100 ul des Konjugats IgG 3D3-Phycocyanin mit einer Konzentration von 3 ug/ml.
Die beiden Konjugate werden in 50 mM Phosphatpuffer mit 1 g/l HSA und pH 7,4 verdünnt.
Die Messung wird nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Laserfluorimeter durchgeführt, das mit einem 647 nm-Filter einer Halbwertsbreite von 20 nm ausgestattet ist.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III aufgeführt und wurden in Zählimpulse pro s (cps) ausgedrückt: Tabelle III mit HSA-Puffer - IgG E1-Eu-TBP 0,1 g/ml Prolactin - IgG E1-Eu-TBP 0,5 g/ml Prolactin
Die Resultate zeigen wieder die proportionale Abhängigkeit des Meßsignals der Donor-Akzeptor-Übertragung von der im Medium vorhandenen Prolactinmenge.

Beispiel 6:

Quantitative Bestimmung des Antigens-19.9:

Das Antigen-19.9 ist ein Kohlenhydrat, das einen Indikator für Dickdarmkarzinome darstellt.
Da die Bindungsstelle des Anti-19.9-Antikörpers ein repetitives Epitop ist, wird der gleiche Antikörper entweder mit dem Donor oder mit dem Akzeptor markiert.
Für dieses im homogenen System durchgeführte Immunoassay werden Antikörper-Eu-TBP-Konjugate und Antikörper-APC-Konjugate verwendet, die in analoger Weise wie im Beispiel 4 beschrieben hergestellt wurden.
Das Antigen-19.9 und der Anti-19.9-Antikörper sind durch Centochor, USA, im Handel.
Die beiden Konjugate werden in 100 mM Phosphatpuffer, NaF 150 mm, HSA 1 g/l, pH 6, verdünnt.
Durch Verdünnen einer konzentrierten Lösung des Antigens in Kälberfetalserum wird ein Bereich von Eichlösungen des Antigens-19.9 hergestellt.
In Mikrotiterplatten aus Polystyrol mit 96 Vertiefungen (Dynatech, USA) werden nacheinander folgende Lösungen zugegeben:
- 50 ul Antigen-19.9-Eichlösung
- 50 ul Verdünnungspuffer
- 100 ul Antikörper-Eu-TBP-Konjugat in einer Konzentration von 0,5 ug/ml
- 100 ul Antikörper-APC-Konjugat in einer Konzentration von 5 ug/ml
Nach 3,5 h Inkubation bei Raumtemperatur wird die Messung mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Laserfluorimeter das mit einem 650 nm-Filter mit einer Halbwertsbreite von 20 nm ausgerüstet ist, bei einer Verzögerung von 50 us während 400 us durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV aufgeführt und in willkürlichen Einheiten (AU) ausgedrückt. Tabelle IV Antigen-19.9 (u/ml) Signal (AU)
Die Ergebnisse zeigen, daß sich das Meßsignal proportional zur Menge an Antigen-19.9 im Medium ändert.

Beispiel 7:

Quantitative Bestimmung des karzinoembryonalen Antigens (CEA)

In diesem in homogenem System durchgeführten Immunoassay werden zwei monoklonale Antikörper, G12 und G15 (CIS Bio International, Frankreich), verwendet, die mit dem Europiumkryptat Eu-TBP bzw. Allophycocyanin gekuppelt sind.
Die beiden Konjugate G12-Eu-TBP und G15-APC werden in Phosphatpuffer 100 mm, HSA 1 g/1, NaF 150 mM verdünnt. In Mikrotiterplatten aus Polystyrol (Dynatech, USA) werden nacheinander folgende Lösungen gegeben:
- 100 ul Eichlösung
- 100 ul G12-Kryptat-Konjugat in einer Konzentration von 0,5 ug/ml
- 100 ul G15-APC-Konjugat in einer Konzentration von 5 ug/ml.
Nach 3 h Inkubation bei 37 ºC wird die Messung mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Laserfluorimeter, das mit einem 650 nm-Filter einer Halbwertsbreite von 20 nm ausgerüstet ist, mit einer Verzögerung von 50 us während 400 us durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V aufgeführt und in willkürlichen Einheiten (AU) ausgedrückt: Tabelle V CEA (ng/ml) Signal (AU)
Die Ergebnisse zeigen eine zur Konzentration an CEA proportionale Anderung des emittierten Signals. Darüber hinaus erlaubt die Verstärkung des Signals die Erfassung von CEA mit einer Empfindlichkeit in der Größenordnung von ng/ml.

Beispiel 8:

Quantitative Bestimmung von Digoxin

Digoxin ist ein kardiotonisch wirksames Glykosid, das als Wirkstoff in Arzneimitteln zur Behandlung von Merzinsuffizienz verwendet wird.

A Herstellung eines Allophycocyanin-Digoxin-Tracers durch Kupplung mit Periodat

a) Aktivierung des Dioxins mit Periodat

268 ul einer unmittelbar zuvor hergestellten Lösung von NaIO&sub4; (Fluka, Schweiz) werden zu einer Suspension von Digoxin (Fluka, Schweiz, Referenz-Nr. 37100) in einer Menge von 5,35 mg in 268 ul absolutem Ethanol zugegeben.
Das Gemisch wird 20 min bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert, worauf die Reaktion durch Zusatz von 100 ul 0,1 M Glycerinlösung blockiert wird.
Die Endkonzentration an aktiviertem Digoxin, berechnet auf die Anfangsmasse und das Endvolumen, beträgt 1,2 10&supmin;² M.

b) Kupplung des aktivierten Digoxins mit Allophycocyanin (APC)

2 ml einer Lösung von gereinigtem APC (Cyanotech, USA) in Boratpuffer von pH 9,0 werden mit 95 ul der Lösung des mit Periodat aktivierten Digoxins versetzt.
Das Gemisch wird 1,5 h bei Raumtemperatur unter mäßigem Röhren inkubiert. Die Reaktion wird dann durch Zusatz von 100 ul einer unmittelbar zuvor hergestellten Lösung von Natriumborhydrid in einer Menge von 5 mg NaBH&sub4; in 1,32 ml Boratpuffer von pH 9,0 blockiert.

c) Reinigung des APC-Dioxin-Tracers

2 ml des Reaktionsgemischs werden auf eine mit 100 mM Phosphatpuffer ph 7 äquilibrierte Säule HR 10/10 G25 (Pharmacia, Schweden) aufgegeben und im Ausschlußvolumen eluiert. Die überschüssigen Reaktanten werden mit 8 ml Puffer eluiert.
Es werden etwa 4 ml Lösung des gekuppelten Produkts APC-Digoxin mit einem APC-Gehalt von 1,22 mg/ml (gemessen über die Absorption bei 650 nm) gewonnen.
Die Konzentration an Digoxin wird durch quantitative RIA- oder DELFIA-Bestimmung (Pharmacia, Schweden) ermittelt.
Das resultierende berechnete Molverhältnis Digoxin zu Allophycocyanin beträgt ungefähr 0,8.

B) Quantitative Bestimmung von Digoxin in Humanserum nach einem kompetitiven Verfahren in homogenem System

In analoger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wird ein Konjugat aus Antikörper und Europiumkryptat Eu-TBP-Diamin hergestellt, wobei ein monoklonaler Anti-Digoxin-Antikörper der Maus (Interchim, Frankreich, Referenz-Nr. G 31604 M) verwendet wird. Dieses Antikörper-Kryptat-Konjugat wird in einer Konzentration von 0,5 ug/ml in 100 mM Phosphatpuffer, NaF 150 mm, HSA 1 g/l, pH 7, eingesetzt.
Der APC-Digoxin-Tracer wird bei einer Konzentration von 0,2 ug/ml im gleichen Puffer verwendet.
Es wird ein Bereich von Digoxin-Eichlösungen durch Verdünnen einer Lösung von Digoxin (Fluka, Schweiz) von 1 ug/ml in einem Ethanol-Wasser-Gemisch 50/50 in Humanserum hergestellt.
Die Eichkurve wird mit Proben von 250 ul aufgestellt, die enthalten:
- 50 ul Phosphatpuffer
- 50 ul Eichlösung
- 100 ul APC-Digoxin-Tracer
- 100 ul Antikörper-Kryptat-Konjugat.
Die zu bestimmenden Proben haben die gleiche Zusammensetzung, wobei die 50 ul Eichlösung durch 50 ul des jeweiligen zu bestimmenden Serums ersetzt wird.
Die quantitative Bestimmung erfolgt in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Dynatech, USA).
Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die Messung mit einem Laserfluorimeter wie in Beispiel 1 beschrieben, das mit einem 665 nm-Filter mit einer Halbwertsbreite von 20 nm ausgerüstet ist, in einem Zeitfenster von 100 us nach einer Verzögerung von 50 us durchgeführt.
Die Ergebnisse sind als Prozentsatz des Verhältnisses B/B&sub0; angegeben, wobei B den für jede Eichlösung erhaltenen Wert und B&sub0; den Wert des Standards 0 darstellen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VI aufgeführt: Tabelle VI Digoxin-Eichlösung B/B&sub0; (ng/ml)
Diese Ergebnisse zeigen, daß sich die erhaltenen Werte proportional zur Konzentration an Digoxin ändern.

Beispiel 9:

Quantitative Bestimmung von Thyroxin

A) Herstellung eines Allophycocyanin-Thyroxin-Tracers (APC-T&sub4;)

a) Aktivierung von Thyroxin mit S-AMSA

500 ul einer Lösung von T&sub4; (Calbiochem, Frankreich) in einer Konzentration von 20 mg/ml in Methanol werden mit einer Lösung von S-AMSA (Sigma, USA) einer Konzentration von 8,6 mg/ml (50 mM) in Methanol versetzt und das Gemisch wird anschließend 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei danach 500 ul einer Lösung von Hydroxylamin einer Konzentration von 6,95 mg/ml (100 mM) in Methanol zugegeben werden. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur werden 975 ul des Reaktionsgemischs entnommen und mit 525 ul bidestilliertem Wasser versetzt, das über ein Millipore-Filter HA 0,45 um filtriert wurde. Diese Lösung wird in Anteilen von 250 ul durch eine HPLC-Säule vom Typ Pep. RPC HR 5/5 (Pharmacia, Schweden) geleitet und mit einem Methanol-Wasser-Gemisch 65/35 eluiert. Die drei ersten eluierten Peaks werden gewonnen, die nachfolgenden Fraktionen werden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer im Vakuum eingedampft. Man gewinnt etwa 3 mg aktiviertes T&sub4; (T&sub4;-SH).

b) Aktivierung von Allophycocyanin mit SMCC

10 mg APC werden gereinigt und dann mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung vom Typ Amicon Centricon 30 bis auf eine Konzentration von 10,6 mg/ml in 700 um aufkonzentriert.
Diese Lösung wird mit 160 ul einer Lösung von Sulfo-SMCC (Pierce, USA) einer Konzentration von 10 mg/ml in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7, versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 1 h bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert, worauf das aktivierte APC durch Ausschlußchromatographie an einer Säule G25 HR 10/10 (Pharmacia, Schweden) in Phosphatpuffer pH 7 gereinigt wird.

c) Kupplung des aktivierten Thyroxins mit aktiviertem Allophycocyanin

Der Inhalt des Kolbens mit dem T&sub4;-SH wird mit 200 ul Methanol aufgenommen; 50 ul dieser Lösung werden zu 2 ml der Lösung von aktiviertem APC in 100 mM Phosphatpuffer, pM 7, zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 18 h bei 4 ºC unter Rühren inkubiert, worauf die überschüssigen Maleinimidstellen mit 5 ul einer Lösung von Mercaptoethanol (Sigma, USA) in Verdünnung 1/10 in Phosphatpuffer blockiert werden.

d) Reinigung des APC-T&sub4;-Tracers

Das Reaktionsgemisch wird mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung Amicon Centricon 30 bis auf ein Volumen von 1 ml aufkonzentriert, worauf 50 ul einer Lösung von N-AANS in einer Konzentration von 1 mg/ml in dem Phosphatpuffer zugegeben werden (Endkonzentration an N-AANS etwa 50 g/ml). Der Tracer wird schließlich an einer Säule G25 HR 10/10 (Pharmacia) durch Ausschlußchromatographie gereinigt (Phosphatpuffer 100 mm, pH 7). Man erhält etwa 2,5 ml Tracer in einer Konzentration von 0,8 mg/ml (berechnet nach der optischen Dichte OD bei 650 nm mit &epsi; = 731000).
Die Ermittlung der Anzahl der pro APC-Molekül gekuppelten T&sub4;-Moleküle geschieht durch quantitative RIA-Bestimmung des Tracers und Vergleich mit einer T&sub4;-Eichkurve (Set T&sub4;-KPR, Oris Industrie, Frankreich). Aus der Berechnung ergibt sich für den gereinigten Tracer ein Verhältnis von 1,4 T&sub4;/APC.
Die Reinigung des Tracers APC-T&sub4; geschieht in Gegenwart von N-AANS, das aus N-ANS (Kodak, USA) nach einer Modifizierung des von Hinds et al., (Clin. Chem. 32 (1986) 16-21) beschriebenen Protokolls synthetisiert wurde.

B) Quantitative Bestimmung von Thyroxin in Humanserum in homogenem System nach einem kompetitiven Verfahren

In analoger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wird ein Konjugat aus Antikörper und Europiumkryptat Eu-TBP-Diamin hergestellt, wobei ein monoklonaler Antikörper der Maus anti-T&sub4; R41 (CIS Bio International, Frankreich) verwendet wird. Dieses Konjugat wird in einer Konzentration von 2 ug/ml in Phosphatpuffer 100 mM, NaF 120 mM, HSA 0,2 %, pH 7, eingesetzt.
Durch Verdünnung einer durch Ionenaustausch behandelten und von T&sub4; befreiten Standardlösung von Humanserum wird eine Reihe von T&sub4;-Eichlösungen hergestellt. Die Eichkurve wird mit Proben von 250 ul aufgestellt, die enthalten:
- 50 ul N-AANS-Lösung
- 50 ul von T&sub4; befreites Humanserum oder 50 ul einer der T&sub4;-Eichlösungen
- 100 APC-T&sub4;-Tracer
- 100 ul Antikörper-Kryptat-Konjugat.
Die zu bestimmenden Proben weisen die gleiche Zusammensetzung auf, wobei die 50 ul Eichlösung durch 50 ul des jeweils quantitativ zu bestimmenden Serums ersetzt werden.
Die quantitative Bestimmung erfolgt in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefunden (Dynatech, USA).
Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die Messung mit einem wie in Beispiels 1 beschriebenen Laserfluorimeter, das mit einem 665 nm-Filter mit einer Halbwertsbreite von 20 nm ausgerüstet ist, unter Verwendung einer 1000-Hz- Blitzlampe als Anregungslichtquelle während 1 s in einem Zeitfenster von 100 45 nach einer Verzögerung von 50 us durchgeführt.
Die für jeden Standard (B) erhaltenen Werte werden durch den Wert des Standards 0 (B&sub0;) dividiert und als Prozentsatz (B/B&sub0; %) ausgedrückt. Die Konzentration der zu bestimmenden Proben wird durch Vergleich mit der Eichkurve berechnet.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII aufgeführt: Tabelle VII Thyroxin (ng/ml)
Die Ergebnisse zeigen, daß sich die erhaltenen Werte proportional zur Konzentration an T&sub4; ändern.

Claims

1. Verfahren zur Verstärkung des Emissionssignals einer lumineszierenden Verbindung, die als Donorverbindung bei der quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Lumineszenzmessung verwendet wird,

bei dem ferner eine lumineszierende Akzeptorverbindung eingesetzt wird und das emittierte Signal der Akzeptorverbindung nach Anregung der Donorverbindung bei ihrer Anregungswellenlänge gemessen wird,

dadurch gekennzeichnet, daß

die Donorverbindung eine geringe Gesamt-Quantenausbeute aufweist und die Quantenausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau der Donorverbindung kleiner ist als die Quantenausbeute der Akzeptorverbindung.

2. Verfahren zur Verstärkung des Emissionssignals eines Seltenerdmetallkryptats oder Seltenerdmetallchelats, das als Donorverbindung bei der quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz durch Lumineszenzmessung verwendet wird,

bei dem ferner eine lumineszierende Akzeptorverbindung eingesetzt wird und das emittierte Signal der Akzeptor- Verbindung nach Anregung des Seltenerdmetallkryptats oder Seltenerdmetallchelats bei seiner Anregungswellenlänge gemessen wird,

dadurch gekennzeichnet, daß

das Seltenerdmetallkryptat oder Seltenerdmetallchelat eine geringe Gesamt-Quantenausbeute aufweist und die Quantenausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveau des Seltenerdmetalls kleiner ist als die Quantenausbeute der Akzeptorverbindung.

3. Homogenes Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer zu analysierenden Substanz in einem Medium, in dem sie enthalten sein kann, durch Lumineszenzmessung unter Einsatz des Produkts der Reaktion zwischen der zu analysierenden Substanz und mindestens einem entsprechenden Rezeptor, das folgende Schritte umfaßt:

1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, zum Medium,

2) Zugabe eines zweiten, unter der zu analysierenden Substanz und mindestens einem ihrer Rezeptoren ausgewählten Reaktanten, wobei einer der beiden Reaktanten an eine lumineszierende Donorverbindung, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder Seltenerdmetallchelat besteht, und der andere Reaktant an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt sind,

wobei die Reihenfolge der Zugabe der Reaktanten umgekehrt werden kann,

und, nach Anregung des Gemisches mit einer Lichtquelle bei der Anregungswellenlänge der lumineszierenden Donorverbindung,

3) Messung des von der lumineszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals,

dadurch gekennzeichnet, daß das als Donorverbindung eingesetzte Seltenerdmetallkryptat oder Seltenerdmetallchelat eine geringe Gesamt-Quantenausbeute aufweist und die Quantenausbeute der Strahlungsdesaktivierung vom Emissionsniveua des Seltenerdmetalls kleiner ist als die Quantenausbeute der Akzeptorverbindung.

4, Verfahren nach Anspruch 3, das ein Überschußverfahren darstellt,

gekennzeichnet durch folgende Schritte:

1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus mindestens einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, der an eine lumineszierende Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder Seltenerdmetallchelat besteht, zu dem Medium, das die zu analysierende Substanz enthält,

2) Zugabe eines zweiten, aus einem oder mehreren anderen Rezeptoren der zu analysierenden Substanz bestehenden Reaktanten, wobei der zweite Reaktant an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt ist,

3) Inkubation des Mediums nach jeder Zugabe von Reaktanten oder nach Zugabe beider Reaktanten,

4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der lumineszierenden Donorverbindung

und

5) Messung des von der lumineszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.

5. Verfahren nach Anspruch 3, das ein kompetitives Verfahren darstellt,

gekennzeichnet durch folgende Schritte:

1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, der an eine lumineszierende Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder Seltenerdmetallchelat besteht, zu dem Medium, das die zu analysierende Substanz enthält,

2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus der an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelten zu analysierenden Substanz besteht,

4) Anregung des resultierenden Mediums bei der Anregungswellenlänge der luminesz ierenden Donorverbindung

und

5) Messung des von der lumineszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.

6. Verfahren nach Anspruch 3, das ein kompetitives Verfahren darstellt,

gekennzeichnet durch folgende Schritte:

1) Zugabe eines ersten Reaktanten, der aus einem Rezeptor der zu analysierenden Substanz besteht, der an eine lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt ist, zu dem Medium, das die zu analysierende Substanz enthält, die bestimmt werden soll,

2) Zugabe eines zweiten Reaktanten, der aus der zu analysierenden Substanz besteht, die an eine lumineszierende Donorverbindung gekuppelt ist, die aus einem Seltenerdmetallkryptat oder Seltenerdmetallchelat besteht,

3) Inkubation des Mediums nach Zugabe jedes Reaktanten oder nach Zugabe beider Reaktanten,

und

5) Messung des von der lumineszierenden Akzeptorverbindung emittierten Signals.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Reaktant dem die zu analysierende Substanz enthaltenden Medium gleichzeitig zugegeben werden.

8. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein einziger Rezeptor der zu analysierenden Substanz verwendet wird, der entweder an die lumineszierende Donorverbindung oder an die lumineszierende Akzeptorverbindung gekuppelt ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die luminesz ierende Donorverbindung ein Chelat oder ein Kryptat von Terbium oder Europium ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Donorverbindung ein Seltenerdmetallkryptat ist, das aus mindestens einem Seltenerdmetallsalz besteht, das mit einer makropolycyclischen Verbindung der allgemeinen Formel komplexiert ist,

in der bedeuten:

Z ein drei- oder vierwertiges Atom, wie Stickstoff, Kohlenstoff oder Phosphor,

R keinen Substituenten oder Wasserstoff, Hydroxy, Amino oder eine Kohlenwasserstoffgruppe

und

A, B und C unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffketten, die ggfs. ein oder mehrere Heteroatome enthalten und ggfs. durch einen Heteromakrocyclus unterbrochen sind, wobei mindestens eine der Gruppen A, B und C ferner mindestens eine Molekülgruppe trägt oder im wesentlichen aus ihr besteht, die eine Triplett- Energie besitzt, die größer ist als die Energie des Emissionsniveaus des komplexgebundenen Seltenerdmetallions.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdmetallkryptat mit einer makropolycyclischen Verbindung der allgemeinen Formel komplexiert ist,

in der bedeuten:

A, B und C:

wobei X&sub1; und X&sub2;, die gleich oder voneinander verschieden sind, Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel bezeichnen,

oder

worin X Sauerstoff oder Wasserstoff bedeutet.

12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Donorverbindung das Terbiumkryptat Tb- Tris(bipyridin) oder das Europiumkryptat Eu-Tris(bipyridin) ist.

13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die lumineszierende Donorverbindung ein Seltenerdmetallkryptat ist, das aus mindestens einem Seltenerdmetallsalz besteht, das mit einer makropolycyclischen Verbindung der Formel I oder II komplexiert ist,

worin bedeuten:

- das Ringsystem der Formel

eine der folgenden cyclischen Gruppen: n = 0 oder 1 Makrocyclus [N&sub2;O&sub4;) bzw. Cyclus (22) Makrocyclus (N&sub2;O&sub3;) bzw. Cyclus (21) makrocyclisches Bis(bipyridin)

- Y eine Gruppe oder eine Spacergruppe, die aus einer zweiwertigen organischen Gruppe besteht, die ausgewählt ist unter geradkettigen und verzweigten C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylgruppen, die ggfs. eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen und/oder ggfs. durch ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, unterbrochen sind, C&sub5;&submin;&sub8;-Cycloalkylengruppen und C&sub6;&submin;&sub1;&sub4;-Arylengruppen, wobei die Alkylengruppen, Cycloalkylengruppen und Arylengruppen ggfs. mit Alkylgruppen, Arylgruppen oder Sulfonatgruppen substituiert sind,

- Z eine funktionelle Gruppe, die befähigt ist, eine kovalente Bindung mit einer biologischen Substanz einzugehen,

- R Methyl oder die Gruppierung -Y-Z

und

- R' Wasserstoff oder eine Gruppe -COOR", in der R" C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl und vorzugsweise Methyl, Ethyl oder t-Butyl darstellt,

oder die Gruppe -CO-NH-Y-Z.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Donorverbindung ein Europiumkryptat ist und die fluoreszierende Akzeptorverbindung unter Allophycocyanin, Allophycocyanin B, C-Phycocyanin und R-Phycocyanin ausgewählt ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Donorverbindung ein Terbiumkryptat ist und die fluoreszierende Akzeptorverbindung unter den Rhodaminen, Thionin, R-Phycocyanin, Phycoerythrocyanin, C-Phycoerythrin, B-Phycoerythrin und R-Phycoerythrin ausgewählt ist.