JPH0665271A - 発光性金属キレート標識及び検出手段 - Google Patents
発光性金属キレート標識及び検出手段Info
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- JPH0665271A JPH0665271A JP4351891A JP35189192A JPH0665271A JP H0665271 A JPH0665271 A JP H0665271A JP 4351891 A JP4351891 A JP 4351891A JP 35189192 A JP35189192 A JP 35189192A JP H0665271 A JPH0665271 A JP H0665271A
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- integer
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
- C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System compounds of the platinum group
- C07F15/0046—Ruthenium compounds
- C07F15/0053—Ruthenium compounds without a metal-carbon linkage
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
- C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System compounds of the platinum group
- C07F15/002—Osmium compounds
- C07F15/0026—Osmium compounds without a metal-carbon linkage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/806—Electrical property or magnetic property
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】下記式：
（ここでｎは１，２または３の整数である）の構造を有
する化合物およびその塩類。 【効果】これらのＲｕ−含有有機金属化合物及びＯｓ−
含有有基金属化合物は電気化学ルミネセンスラベルとし
て有用であり、このようなラベルを用いることにより感
度が高く、安全で安価な分析が可能となる。
する化合物およびその塩類。 【効果】これらのＲｕ−含有有機金属化合物及びＯｓ−
含有有基金属化合物は電気化学ルミネセンスラベルとし
て有用であり、このようなラベルを用いることにより感
度が高く、安全で安価な分析が可能となる。
Description
【０００１】
【発明の背景】本出願は１９８４年１０月３１日出願の
米国シリアルＮｏ．６６６，９８７の部分的継続出願で
あり、前記Ｎｏ．６６６，９８７は本出願に参考として
包含される。化学的、生化学的及び生物学的物質を短時
間で極めて特異的に検出し且つ計量せしめる方法の必要
性は益々高くなってきている。特に重要なのは少量の薬
物、代謝物質、微生物及び他の診断上重要な物質を測定
する方法である。この種の物質としては、例えば麻酔薬
及び毒薬、治療用として投与された薬剤、ホルモン、病
原となる微生物及びウイルス、抗体、代謝物質、酵素並
びに核酸が挙げられる。
米国シリアルＮｏ．６６６，９８７の部分的継続出願で
あり、前記Ｎｏ．６６６，９８７は本出願に参考として
包含される。化学的、生化学的及び生物学的物質を短時
間で極めて特異的に検出し且つ計量せしめる方法の必要
性は益々高くなってきている。特に重要なのは少量の薬
物、代謝物質、微生物及び他の診断上重要な物質を測定
する方法である。この種の物質としては、例えば麻酔薬
及び毒薬、治療用として投与された薬剤、ホルモン、病
原となる微生物及びウイルス、抗体、代謝物質、酵素並
びに核酸が挙げられる。
【０００２】これらの物質の存在はしばしば、多くの生
化学的系及び生物学的系の特徴をなす高度の特異性を利
用する結合法によって測定できる。頻繁に使用される方
法は例えば抗原−抗体システム、核酸ハイブリダイゼー
ション技術、及びタンパク質−リガンドシステムに基づ
くものである。これらの方法では診断上重要な複合体の
存在が通常、複合体構成物質の１つ又は複数に結合され
た観察可能ラベル（標識）の存在又は不在によって示さ
れる。選択された特定ラベリング（標識）法はしばしば
問題の物質の特定検出システムの有効性及び多目的性を
支配する。好ましい標識は安価、安全であり、且つ広範
囲にわたる化学的、生化学的及び生物学的物質にこれら
物質の重要な結合特性を変化させることなく効果的に結
合され得るという条件を満たさなければならない。この
好ましいラベルは極めて特徴的なシグナルを与えるもの
でなければならず、且つ自然界に余り見られない、又は
好ましくは全く存在しないものであることが望まれる。
このラベルはまた、安定性を有し且つ数箇月にわたって
水性システム内で検出できるようなものでなければなら
ない。ラベルの検出は高価な専用設備又は人員を必要と
せず短時間で、高感度及び再現性をもって実施されるこ
とが望まれる。ラベルの計量は温度及びアッセイされる
混合物の組成のごとき変数に余り左右されないことが重
要である。最も有利なものは、均質系即ち複合体状のラ
ベルされた物質及び非複合体状のラベルされた物質を分
離する必要のない系で使用できるラベルである。これは
ラベルされた物質が特定複合体内に合体された時にラベ
ルの検出性が変化しても可能である。
化学的系及び生物学的系の特徴をなす高度の特異性を利
用する結合法によって測定できる。頻繁に使用される方
法は例えば抗原−抗体システム、核酸ハイブリダイゼー
ション技術、及びタンパク質−リガンドシステムに基づ
くものである。これらの方法では診断上重要な複合体の
存在が通常、複合体構成物質の１つ又は複数に結合され
た観察可能ラベル（標識）の存在又は不在によって示さ
れる。選択された特定ラベリング（標識）法はしばしば
問題の物質の特定検出システムの有効性及び多目的性を
支配する。好ましい標識は安価、安全であり、且つ広範
囲にわたる化学的、生化学的及び生物学的物質にこれら
物質の重要な結合特性を変化させることなく効果的に結
合され得るという条件を満たさなければならない。この
好ましいラベルは極めて特徴的なシグナルを与えるもの
でなければならず、且つ自然界に余り見られない、又は
好ましくは全く存在しないものであることが望まれる。
このラベルはまた、安定性を有し且つ数箇月にわたって
水性システム内で検出できるようなものでなければなら
ない。ラベルの検出は高価な専用設備又は人員を必要と
せず短時間で、高感度及び再現性をもって実施されるこ
とが望まれる。ラベルの計量は温度及びアッセイされる
混合物の組成のごとき変数に余り左右されないことが重
要である。最も有利なものは、均質系即ち複合体状のラ
ベルされた物質及び非複合体状のラベルされた物質を分
離する必要のない系で使用できるラベルである。これは
ラベルされた物質が特定複合体内に合体された時にラベ
ルの検出性が変化しても可能である。
【０００３】これまでにも様々なラベルが開発されてき
たが、これらのラベルはいずれも特定の利点及び欠点を
有する。例えば、放射性ラベルは使用範囲がかなり広
く、且つ極めて低い濃度で検出できる。しかしながらこ
の種のラベルは高価で危険性もあり、その使用には精巧
な設備と熟練した人員とが必要とされる。更に放射性ラ
ベルの感度は、検出し得る事象がその本質的性質上ラベ
ルされた物質の放射性原子１つ当たり１度の割合でしか
生起し得ないため限定される。加えて、放射性ラベルは
均質法では使用し得ない。
たが、これらのラベルはいずれも特定の利点及び欠点を
有する。例えば、放射性ラベルは使用範囲がかなり広
く、且つ極めて低い濃度で検出できる。しかしながらこ
の種のラベルは高価で危険性もあり、その使用には精巧
な設備と熟練した人員とが必要とされる。更に放射性ラ
ベルの感度は、検出し得る事象がその本質的性質上ラベ
ルされた物質の放射性原子１つ当たり１度の割合でしか
生起し得ないため限定される。加えて、放射性ラベルは
均質法では使用し得ない。
【０００４】そこで非放射性ラベルが注目される。この
種のラベルは分光測光法、スピン共鳴法及びルミネセン
ス法により観察し得る分子、並びにこれらの分子を産生
する酵素を含む。有用な非放射性ラベリング物質の１つ
に有機金属化合物がある。生物系ではある種の金属は希
であるため、有機金属化合物の金属成分を特異的にアッ
セイする方法が有効に使用される。例えば、Ｃａｉｓの
米国特許第４，２０５，９５２号には、特定抗原の定量
に使用するための特定有機金属化合物でラベルされた免
疫化学的活性物質の使用が開示されている。これらのラ
ベルには、発光スペクトル、吸光スペクトル及び蛍光ス
ペクトルの測定、原子吸光並びに中性子活性化を含め
て、通常の選択金属検出法のいずれも使用できる。これ
ら通常の方法はしばしば感度に欠け、均質系にはほとん
ど使用し得ず、且つ原子吸光の場合のごとく、時として
試料の破壊を生起する。
種のラベルは分光測光法、スピン共鳴法及びルミネセン
ス法により観察し得る分子、並びにこれらの分子を産生
する酵素を含む。有用な非放射性ラベリング物質の１つ
に有機金属化合物がある。生物系ではある種の金属は希
であるため、有機金属化合物の金属成分を特異的にアッ
セイする方法が有効に使用される。例えば、Ｃａｉｓの
米国特許第４，２０５，９５２号には、特定抗原の定量
に使用するための特定有機金属化合物でラベルされた免
疫化学的活性物質の使用が開示されている。これらのラ
ベルには、発光スペクトル、吸光スペクトル及び蛍光ス
ペクトルの測定、原子吸光並びに中性子活性化を含め
て、通常の選択金属検出法のいずれも使用できる。これ
ら通常の方法はしばしば感度に欠け、均質系にはほとん
ど使用し得ず、且つ原子吸光の場合のごとく、時として
試料の破壊を生起する。
【０００５】特に有利なラベルは、光化学的手段、化学
的手段及び電気化学的手段によって発光させ得るラベル
である。“ホトルミネセンス”は物質が電磁放射線（電
磁波）を吸収した時に発光するように誘導されるプロセ
スである。蛍光及びリン光はホトルミネセンスの一種で
ある。化学ルミネセンスはエネルギーの化学的移行によ
って発光種を発生させるプロセスである。電気化学ルミ
ネセンスは電気化学的に発光種を発生させる。
的手段及び電気化学的手段によって発光させ得るラベル
である。“ホトルミネセンス”は物質が電磁放射線（電
磁波）を吸収した時に発光するように誘導されるプロセ
スである。蛍光及びリン光はホトルミネセンスの一種で
ある。化学ルミネセンスはエネルギーの化学的移行によ
って発光種を発生させるプロセスである。電気化学ルミ
ネセンスは電気化学的に発光種を発生させる。
【０００６】これら発光システムの重要性は益々高まっ
てきている。例えばＭａｎｄｌｅの米国特許第４，３７
２，７４５号には免疫化学的用途における化学発光性ラ
ベルの使用が開示されている。このシステムではラベル
が化学的手段、例えばラベルとＨ２Ｏ２及びシュウ酸
（オキサレート）との反応によって発光状態に励起され
る。これらのシステムではＨ２Ｏ２がシュウ酸を高エネ
ルギー誘導体に酸化的に変換し、この誘導体がラベルを
励起する。このシステムは原則として、このアッセイの
酸化性条件下で安定性を示し且つ高エネルギーシュウ酸
誘導体により励起され得る発光物質のいずれに対しても
有効である。ところが残念なことに、この広範囲な利用
性自体がこの方法を大きく限定する。即ち、問題のアナ
ライト（対象分析物、ａｎａｌｙｔｅ）を含む通常の生
物学的流体は潜在的発光物質も多く含み、これらの物質
が大きなバックグラウンドレベルのルミネセンス（発
光）を誘起し得るのである。
てきている。例えばＭａｎｄｌｅの米国特許第４，３７
２，７４５号には免疫化学的用途における化学発光性ラ
ベルの使用が開示されている。このシステムではラベル
が化学的手段、例えばラベルとＨ２Ｏ２及びシュウ酸
（オキサレート）との反応によって発光状態に励起され
る。これらのシステムではＨ２Ｏ２がシュウ酸を高エネ
ルギー誘導体に酸化的に変換し、この誘導体がラベルを
励起する。このシステムは原則として、このアッセイの
酸化性条件下で安定性を示し且つ高エネルギーシュウ酸
誘導体により励起され得る発光物質のいずれに対しても
有効である。ところが残念なことに、この広範囲な利用
性自体がこの方法を大きく限定する。即ち、問題のアナ
ライト（対象分析物、ａｎａｌｙｔｅ）を含む通常の生
物学的流体は潜在的発光物質も多く含み、これらの物質
が大きなバックグラウンドレベルのルミネセンス（発
光）を誘起し得るのである。
【０００７】同様の欠点を有する化学ルミネセンスの免
疫化学的使用の別の例がＯｂｅｒｈａｒｄｔ他の米国特
許第４，２８０，８１５号に開示されている。この場合
は化学発光種でラベルされた免疫反応物の極めて近くに
その場で酸化体（例えばＨ２Ｏ２）を電気化学的に形成
せしめる。電気的に発生した酸化体は化学発光種内に向
かって拡散してこれを化学的に酸化し、その結果１つ以
上の電子がこの電気的発生酸化体に移行する。前記化学
発光種は酸化されると光子を放出する。これに対しこの
発明では、電子を電気化学的エネルギー源から光子を繰
り返し放出し得る化学発光種に直接移行しなければなら
ない。
疫化学的使用の別の例がＯｂｅｒｈａｒｄｔ他の米国特
許第４，２８０，８１５号に開示されている。この場合
は化学発光種でラベルされた免疫反応物の極めて近くに
その場で酸化体（例えばＨ２Ｏ２）を電気化学的に形成
せしめる。電気的に発生した酸化体は化学発光種内に向
かって拡散してこれを化学的に酸化し、その結果１つ以
上の電子がこの電気的発生酸化体に移行する。前記化学
発光種は酸化されると光子を放出する。これに対しこの
発明では、電子を電気化学的エネルギー源から光子を繰
り返し放出し得る化学発光種に直接移行しなければなら
ない。
【０００８】本発明は電気化学ルミネセンスラベルに係
わる。適切なラベルは有機化合物及び有機金属化合物を
含む電気化学発光性化合物からなる。ラベルされた物質
の存在を決定する電気化学ルミネセンス法は多くの理由
から他の方法より好ましい。即ちこの種の方法は特定ラ
ベルの存在を極めて良く診断し得、感度が高く安全、安
価であると共に使用範囲が広い。電気化学的ラベルに適
した有機化合物としては例えばルブレン及び９，１０−
ジフェニルアントラセンが挙げられる。多くの有機金属
化合物が適切な電気化学的ラベルを構成するが、特に有
用なものはＲｕ−含有化合物及びＯｓ−含有化合物であ
る。本発明は種々の方法によって検出し得るＲｕ−含有
及びＯｓ−含有ラベルの使用に係わる。これらのラベル
は後述の種々の理由から有利である。
わる。適切なラベルは有機化合物及び有機金属化合物を
含む電気化学発光性化合物からなる。ラベルされた物質
の存在を決定する電気化学ルミネセンス法は多くの理由
から他の方法より好ましい。即ちこの種の方法は特定ラ
ベルの存在を極めて良く診断し得、感度が高く安全、安
価であると共に使用範囲が広い。電気化学的ラベルに適
した有機化合物としては例えばルブレン及び９，１０−
ジフェニルアントラセンが挙げられる。多くの有機金属
化合物が適切な電気化学的ラベルを構成するが、特に有
用なものはＲｕ−含有化合物及びＯｓ−含有化合物であ
る。本発明は種々の方法によって検出し得るＲｕ−含有
及びＯｓ−含有ラベルの使用に係わる。これらのラベル
は後述の種々の理由から有利である。
【０００９】Ｒｕ−含有有機金属化合物及びＯｓ−含有
有機金属化合物についてはこれまでにも文献で議論され
てきた。Ｃａｉｓの開示によれば、第ＶＩＩＩ属の責金
属、例えばＲｕを含む任意の金属元素又は複数の金属元
素の組み合わせは原子吸光法によって検出し得る有機金
属ラベルの適切な成分となる（Ｃａｉｓ、１１欄、２０
行目）。しかしながらルテニウムはＣａｉｓにおいては
好ましい金属ではなく、オスミウムについては特に記述
がなく、開示されているいずれの方法でもＲｕ及びＯｓ
の使用の効果についてのデータが全く示されていない。
また、好ましいとされている検出法、即ち原子吸光法は
試料を破壊する。
有機金属化合物についてはこれまでにも文献で議論され
てきた。Ｃａｉｓの開示によれば、第ＶＩＩＩ属の責金
属、例えばＲｕを含む任意の金属元素又は複数の金属元
素の組み合わせは原子吸光法によって検出し得る有機金
属ラベルの適切な成分となる（Ｃａｉｓ、１１欄、２０
行目）。しかしながらルテニウムはＣａｉｓにおいては
好ましい金属ではなく、オスミウムについては特に記述
がなく、開示されているいずれの方法でもＲｕ及びＯｓ
の使用の効果についてのデータが全く示されていない。
また、好ましいとされている検出法、即ち原子吸光法は
試料を破壊する。
【００１０】Ｗｅｂｅｒの米国特許第４，２９３，３１
０号はイムノアッセイにおけるアナライト用の電気化学
的ラベルとしてのＲｕ−含有複合体及びＯｓ−含有複合
体の使用を開示している。開示されている複合体はチオ
尿素結合を介してアナライトのアミノ基に結合される。
Ｗｅｂｅｒはまた、ラベルと別のアナライトのヒドロキ
シ基との間でのカルボン酸エステル形成の可能性につい
て示唆している。Ｗｅｂｅｒによれば、ラベルされた物
質の存在は消光剤と光手段付き電気化学的フローセル
（電池）とからなる装置及び方法によって決定し得る。
光電気化学的活性ラベルは光励起すると電子を消光剤分
子に移行させる。酸化された分子は次いで、適切な電位
（ポテンシャル）に保持されたフローセルの電極からの
電子によって還元される。この電子は光電流として決定
される。このシステムのラベルされた遊離アナライトの
量は光電流信号によって測定される。この方法は発光物
質の電気化学発光検出法の逆の方法であることに留意さ
れたい。
０号はイムノアッセイにおけるアナライト用の電気化学
的ラベルとしてのＲｕ−含有複合体及びＯｓ−含有複合
体の使用を開示している。開示されている複合体はチオ
尿素結合を介してアナライトのアミノ基に結合される。
Ｗｅｂｅｒはまた、ラベルと別のアナライトのヒドロキ
シ基との間でのカルボン酸エステル形成の可能性につい
て示唆している。Ｗｅｂｅｒによれば、ラベルされた物
質の存在は消光剤と光手段付き電気化学的フローセル
（電池）とからなる装置及び方法によって決定し得る。
光電気化学的活性ラベルは光励起すると電子を消光剤分
子に移行させる。酸化された分子は次いで、適切な電位
（ポテンシャル）に保持されたフローセルの電極からの
電子によって還元される。この電子は光電流として決定
される。このシステムのラベルされた遊離アナライトの
量は光電流信号によって測定される。この方法は発光物
質の電気化学発光検出法の逆の方法であることに留意さ
れたい。
【００１１】Ｗｅｂｅｒ他によるその後の報告（１９８
３年）Ｃ１ｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９，
ｐｐ．１６６５−１６７２、Ｐｈｏｔｏｅ１ｅｃｔｒｏ
ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｏｓｓ
ｉｂ１ｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｓｅｒ
ｕｍ ａｎｄ Ｓｅ１ｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｔｒｉｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎ
ｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅ
ｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔｓでは、Ｒ
ｕ−含有ラベルの検出にこの方法を使用することに伴う
問題が議論された。Ｗｅｂｅｒ等の表２によれば、トリ
ス（ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）の補外検出限度は
最適条件下で１．１×１０−１０モル／Ｌである。これ
らのラベルの実際的使用により複合体混合物の存在が測
定されることを期待して、Ｎｅｂｅｒ等は彼等のシステ
ムにおける潜在的干渉物質（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔ）
をテストした。Ｗｅｂｅｒ等の表３には、ジメチルアル
キルアミン、ＥＤＴＡ、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，
Ｎ’−ジメチルピペラジン、水酸化物、シュウ酸
（塩）、アスコルビン酸（塩）、尿酸、及び血清が、実
際の検出限度を１．１×１０−１０モル／Ｌよりかなり
上昇させ得る干渉物質として列挙されている。
３年）Ｃ１ｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９，
ｐｐ．１６６５−１６７２、Ｐｈｏｔｏｅ１ｅｃｔｒｏ
ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｏｓｓ
ｉｂ１ｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｓｅｒ
ｕｍ ａｎｄ Ｓｅ１ｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｔｒｉｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎ
ｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅ
ｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔｓでは、Ｒ
ｕ−含有ラベルの検出にこの方法を使用することに伴う
問題が議論された。Ｗｅｂｅｒ等の表２によれば、トリ
ス（ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）の補外検出限度は
最適条件下で１．１×１０−１０モル／Ｌである。これ
らのラベルの実際的使用により複合体混合物の存在が測
定されることを期待して、Ｎｅｂｅｒ等は彼等のシステ
ムにおける潜在的干渉物質（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔ）
をテストした。Ｗｅｂｅｒ等の表３には、ジメチルアル
キルアミン、ＥＤＴＡ、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，
Ｎ’−ジメチルピペラジン、水酸化物、シュウ酸
（塩）、アスコルビン酸（塩）、尿酸、及び血清が、実
際の検出限度を１．１×１０−１０モル／Ｌよりかなり
上昇させ得る干渉物質として列挙されている。
【００１２】これらの研究は簡単なＲｕ−含有化合物を
用いて行なわれた。Ｒｕ−含有ラベルでラベルした複雑
な物質の検出限度について、又はラベルされた物質とラ
ベルとの間のチオ尿素結合がこのアッセイの条件下で安
定しているか否かについては、Ｗｅｂｅｒ又はＷｅｂｅ
ｒ等による研究では全く報告されていない。
用いて行なわれた。Ｒｕ−含有ラベルでラベルした複雑
な物質の検出限度について、又はラベルされた物質とラ
ベルとの間のチオ尿素結合がこのアッセイの条件下で安
定しているか否かについては、Ｗｅｂｅｒ又はＷｅｂｅ
ｒ等による研究では全く報告されていない。
【００１３】本発明が係わる特定のラベルは電気化学発
光ラベルである。これらのラベルはしばしば、化合物を
電磁放射線又は化学的エネルギー源、例えば典型的シュ
ウ酸−Ｈ２Ｏ２システムによって形成されるものに曝す
ことによって、酸化又は還元されることなく、発光状態
に励起され得る。加えて、これら化合物のルミネセンス
はこれら化合物の酸化又は還元を伴う電気化学的方法に
よって誘起され得る。
光ラベルである。これらのラベルはしばしば、化合物を
電磁放射線又は化学的エネルギー源、例えば典型的シュ
ウ酸−Ｈ２Ｏ２システムによって形成されるものに曝す
ことによって、酸化又は還元されることなく、発光状態
に励起され得る。加えて、これら化合物のルミネセンス
はこれら化合物の酸化又は還元を伴う電気化学的方法に
よって誘起され得る。
【００１４】光ルミネセンス、化学ルミネセンス及び電
気化学ルミネセンス手段を用いるＲｕ（２，２’−ビピ
リジン）３ ２＋検出法に関する研究も報告されている：
Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ及びＢａｒｄの“Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ
ｃｅ．３７．Ａｑｕｅｏｕｓ Ｅｃｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ
ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｒｕ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉ
ｎｅ）３ ２＋ ａｎｄＯＸａ１ａｔｅ ｏｒ Ｏｒｇａ
ｎｉｃ Ａｃｉｄｓ”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．、１０３、ｐｐ．５１２−５１６（１９８１年）、
並びにＷｈｉｔｅ及びＢａｒｄの“Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅ
ｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ．４１．Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅ
ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｕ（２，
２’−ｂｐｙ）３ ２＋−Ｓ２Ｏ８ ２−Ｓｙｓｔｅｍ ｉ
ｎ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ−Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎｓ”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０
４、ｐ．６８９１（１９８２年）。この研究は明るいオ
レンジ色の化学ルミネセンスが化学的又は電気的に発生
したＲｕ（ｂｐｙ）３ ３＋（式中、“ｂｐｙ”はビピリ
ジルリガンドを表す）と、シュウ酸イオン又は他の有機
酸の酸化の中間生成物として形成される強い還元剤との
水性反応に基づき得ることを示している。ルミネセンス
は電気的又は化学的に発生したＲｕ（ｂｐｙ）３ １＋と
ペルオキシジスルフェートの還元の間に発生する強い酸
化剤との反応によって有機溶媒−Ｈ２Ｏ溶液中でも得ら
れる。Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋からの電気化学ルミネセン
ス発生の第３のメカニズムはＲｕ（ｂｐｙ）３ １＋を発
生させるに十分な負の電位とＲｕ（ｂｐｙ）３ ３＋を発
生させるに十分な正の電位との間の電極電位振動を利用
する。これら３つの方法は夫々“酸化的還元”、“還元
的酸化”、及び“Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ３＋／＋再生システ
ム”と称する。
気化学ルミネセンス手段を用いるＲｕ（２，２’−ビピ
リジン）３ ２＋検出法に関する研究も報告されている：
Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ及びＢａｒｄの“Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎ
ｃｅ．３７．Ａｑｕｅｏｕｓ Ｅｃｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ
ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｒｕ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉ
ｎｅ）３ ２＋ ａｎｄＯＸａ１ａｔｅ ｏｒ Ｏｒｇａ
ｎｉｃ Ａｃｉｄｓ”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．、１０３、ｐｐ．５１２−５１６（１９８１年）、
並びにＷｈｉｔｅ及びＢａｒｄの“Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅ
ｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ．４１．Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅ
ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｕ（２，
２’−ｂｐｙ）３ ２＋−Ｓ２Ｏ８ ２−Ｓｙｓｔｅｍ ｉ
ｎ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ−Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎｓ”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０
４、ｐ．６８９１（１９８２年）。この研究は明るいオ
レンジ色の化学ルミネセンスが化学的又は電気的に発生
したＲｕ（ｂｐｙ）３ ３＋（式中、“ｂｐｙ”はビピリ
ジルリガンドを表す）と、シュウ酸イオン又は他の有機
酸の酸化の中間生成物として形成される強い還元剤との
水性反応に基づき得ることを示している。ルミネセンス
は電気的又は化学的に発生したＲｕ（ｂｐｙ）３ １＋と
ペルオキシジスルフェートの還元の間に発生する強い酸
化剤との反応によって有機溶媒−Ｈ２Ｏ溶液中でも得ら
れる。Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋からの電気化学ルミネセン
ス発生の第３のメカニズムはＲｕ（ｂｐｙ）３ １＋を発
生させるに十分な負の電位とＲｕ（ｂｐｙ）３ ３＋を発
生させるに十分な正の電位との間の電極電位振動を利用
する。これら３つの方法は夫々“酸化的還元”、“還元
的酸化”、及び“Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ３＋／＋再生システ
ム”と称する。
【００１５】酸化的還元法は水中で実施し得、酸素又は
不純物の存在に比較的感応し難い強くて効果的で安定し
たルミネセンスを生起する。Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋から
のこのルミネセンスはシュウ酸又は他の有機酸、例えば
ピルビン酸（ピルベート）、乳酸（ラクテート）、マロ
ン酸（マロネート）、酒石酸（タートレート）、クエン
酸（シトレート）の存在とＲｕ（ｂｐｙ）３ ３＋種を酸
化的に産生する手段とに依存する。この酸化はＰｂＯ２
又はＣｅ（ＩＶ）塩のような強い酸化剤によって化学的
に実施し得、また連続的又は断続的に加えられる十分に
正の電位により電気化学的に実施し得る。Ｒｕ（ｂｐ
ｙ）３ ２＋の電気化学的酸化に適した電極は例えばＰ
ｔ、熱分解グラファイト、及びガラス質炭素である。シ
ュウ酸又は他の有機酸は化学ルミネセンスの間に消耗さ
れるが、消耗物質の過剰の存在又は反応室内への消耗物
質の連続的供給により、何時間にもわたる強くて一定し
た化学ルミネセンスが生起し得る。
不純物の存在に比較的感応し難い強くて効果的で安定し
たルミネセンスを生起する。Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋から
のこのルミネセンスはシュウ酸又は他の有機酸、例えば
ピルビン酸（ピルベート）、乳酸（ラクテート）、マロ
ン酸（マロネート）、酒石酸（タートレート）、クエン
酸（シトレート）の存在とＲｕ（ｂｐｙ）３ ３＋種を酸
化的に産生する手段とに依存する。この酸化はＰｂＯ２
又はＣｅ（ＩＶ）塩のような強い酸化剤によって化学的
に実施し得、また連続的又は断続的に加えられる十分に
正の電位により電気化学的に実施し得る。Ｒｕ（ｂｐ
ｙ）３ ２＋の電気化学的酸化に適した電極は例えばＰ
ｔ、熱分解グラファイト、及びガラス質炭素である。シ
ュウ酸又は他の有機酸は化学ルミネセンスの間に消耗さ
れるが、消耗物質の過剰の存在又は反応室内への消耗物
質の連続的供給により、何時間にもわたる強くて一定し
た化学ルミネセンスが生起し得る。
【００１６】還元的酸化法は例えばアセトニトリルのご
とき有機共存溶媒を含む部分的水性溶液中で実施し得
る。このルミネセンスはペルオキシジスルフェートの存
在とＲｕ（ｂｐｙ）３ １＋種を還元的に産生する手段と
に依存する。この還元は例えばマグネシウム又は他の金
属のごとき強い還元剤によって化学的に実施し得、また
連続的又は断続的に加えられる十分な負の電位により電
気化学的に実施し得る。Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋の電気化
学的還元に適した電極としては例えば磨いたガラス質炭
素電極が挙げられる。酸化的還元法の場合と同様に、過
剰試薬の存在又は反応混合物への消耗試薬の連続的添加
により強い連続的発光が何時間にもわたって得られる。
とき有機共存溶媒を含む部分的水性溶液中で実施し得
る。このルミネセンスはペルオキシジスルフェートの存
在とＲｕ（ｂｐｙ）３ １＋種を還元的に産生する手段と
に依存する。この還元は例えばマグネシウム又は他の金
属のごとき強い還元剤によって化学的に実施し得、また
連続的又は断続的に加えられる十分な負の電位により電
気化学的に実施し得る。Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋の電気化
学的還元に適した電極としては例えば磨いたガラス質炭
素電極が挙げられる。酸化的還元法の場合と同様に、過
剰試薬の存在又は反応混合物への消耗試薬の連続的添加
により強い連続的発光が何時間にもわたって得られる。
【００１７】Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ３＋／＋再生システムは
アセトニトリルのごとき有機溶媒又は部分的水性システ
ム中で、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋を還元するに十分な負の
電位とＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋を酸化するに十分な正の電
位との間で電極電位をパルスにすることで実施し得る。
このような再生システムに適した電極としては例えばＰ
ｔ電極がある。このシステムは化学的試薬を消耗せず、
原則として永久に作動し得る。
アセトニトリルのごとき有機溶媒又は部分的水性システ
ム中で、Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋を還元するに十分な負の
電位とＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋を酸化するに十分な正の電
位との間で電極電位をパルスにすることで実施し得る。
このような再生システムに適した電極としては例えばＰ
ｔ電極がある。このシステムは化学的試薬を消耗せず、
原則として永久に作動し得る。
【００１８】これら３種のＲｕ−含有発光化合物産生法
はいずれもＲｕ−含有化合物の酸化−還元又は還元−酸
化を繰り返し行なう。従ってこれらの化合物を含む溶液
のルミネセンスは、加えられるエネルギー源の電位に大
きく依存し、そのためＲｕ−含有化合物の存在を極めて
良く検出（診断）する。
はいずれもＲｕ−含有化合物の酸化−還元又は還元−酸
化を繰り返し行なう。従ってこれらの化合物を含む溶液
のルミネセンスは、加えられるエネルギー源の電位に大
きく依存し、そのためＲｕ−含有化合物の存在を極めて
良く検出（診断）する。
【００１９】ＭａｎｄｌｅはＣｕｒｔｉｓ他の“Ｃｈｅ
ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；ＡＮｅｗ Ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔＣｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｂｙ
Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １３４，ｐ
ｐ．３４３−３５０（１９７７年）をＲｕ−トリス（ビ
ピリジル）（ＩＩ）を化学ルミネセンス用途において使
用し得るラベルとして確認するものとして引用してい
る。Ｃｕｒｔｉｓ他はＲｕ複合体がシュウ酸／Ｈ２Ｏ２
システムにより化学的に励起されると光を発するように
なり得るという非公開意見を報告しているに過ぎない
（Ｃｕｒｔｉｓ他ｐ．３５０）。ＭａｎｄｌｅもＣｕｒ
ｔｉｓも化学ルミネセンス用途におけるルテニウム及び
オスミウム複合体の例外的有用性、又は電気化学ルミネ
センスシステムの有用性は認めなかった。Ｓｐｒｉｎｔ
ｓｃｈｎｉｋ，Ｇ．他の“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉ
ｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｒｕｔｈｅｎｉｕ
ｍ（ＩＩ）Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ Ｍｏｎｏ１ａｙ
ｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ａｎｄ ａｔ Ｗａｔｅ
ｒ−Ｓｐｌｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ”，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９９，ｐｐ，４９４７−４９５４
（１９７７年）にはオクタデカノール又はデヒドロコレ
ステロールでエステル化したトリス（２，２’−ビピリ
ジン）ルテニウム（ＩＩ）が記載されており、これら界
面活性複合体の単層フィルムの形成法が開示されてい
る。これら複合体はホトルミネセンス性であった。しか
しながら、このフィルムを水に曝し次いで光に曝すとＲ
ｕ−複合体はホトルミネセンスを発生しなかった。その
原因は光の存在下におけるエステル基の光加水分解にあ
った。
ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；ＡＮｅｗ Ｍｅｔｈｏ
ｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔＣｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｂｙ
Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ”，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １３４，ｐ
ｐ．３４３−３５０（１９７７年）をＲｕ−トリス（ビ
ピリジル）（ＩＩ）を化学ルミネセンス用途において使
用し得るラベルとして確認するものとして引用してい
る。Ｃｕｒｔｉｓ他はＲｕ複合体がシュウ酸／Ｈ２Ｏ２
システムにより化学的に励起されると光を発するように
なり得るという非公開意見を報告しているに過ぎない
（Ｃｕｒｔｉｓ他ｐ．３５０）。ＭａｎｄｌｅもＣｕｒ
ｔｉｓも化学ルミネセンス用途におけるルテニウム及び
オスミウム複合体の例外的有用性、又は電気化学ルミネ
センスシステムの有用性は認めなかった。Ｓｐｒｉｎｔ
ｓｃｈｎｉｋ，Ｇ．他の“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉ
ｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｒｕｔｈｅｎｉｕ
ｍ（ＩＩ）Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ Ｍｏｎｏ１ａｙ
ｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ａｎｄ ａｔ Ｗａｔｅ
ｒ−Ｓｐｌｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ”，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９９，ｐｐ，４９４７−４９５４
（１９７７年）にはオクタデカノール又はデヒドロコレ
ステロールでエステル化したトリス（２，２’−ビピリ
ジン）ルテニウム（ＩＩ）が記載されており、これら界
面活性複合体の単層フィルムの形成法が開示されてい
る。これら複合体はホトルミネセンス性であった。しか
しながら、このフィルムを水に曝し次いで光に曝すとＲ
ｕ−複合体はホトルミネセンスを発生しなかった。その
原因は光の存在下におけるエステル基の光加水分解にあ
った。
【００２０】本出願人は広範囲のアナライトと当該アナ
ライトに結合する化学種（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）とがＲｕ
−含有又はＯｓ−含有ラベルにアミド結合又はアミン結
合を介して適切に結合されることを発見した。本明細書
はこれを開示する。これらのラベルされた物質は広範囲
にわたる任意の手段によって検出（決定）し得るが、現
在のところ最も有効で信頼できる高感度手段はホトルミ
ネセンス、化学ルミネセンス及び電気化学ルミネセンス
手段である。本明細書では、Ｒｕ−含有及びＯｓ−含有
ラベルとルブレン及び９，１０−ジフェニルアントラセ
ンのごとき有機分子とを含む電気化学ルミネセンスラベ
ルが特に多目的に使用し得、有利であることも開示す
る。以下にこれら新規のラベルされた物質の使用と、こ
れら物質の検出法との大きな利点を説明する。
ライトに結合する化学種（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）とがＲｕ
−含有又はＯｓ−含有ラベルにアミド結合又はアミン結
合を介して適切に結合されることを発見した。本明細書
はこれを開示する。これらのラベルされた物質は広範囲
にわたる任意の手段によって検出（決定）し得るが、現
在のところ最も有効で信頼できる高感度手段はホトルミ
ネセンス、化学ルミネセンス及び電気化学ルミネセンス
手段である。本明細書では、Ｒｕ−含有及びＯｓ−含有
ラベルとルブレン及び９，１０−ジフェニルアントラセ
ンのごとき有機分子とを含む電気化学ルミネセンスラベ
ルが特に多目的に使用し得、有利であることも開示す
る。以下にこれら新規のラベルされた物質の使用と、こ
れら物質の検出法との大きな利点を説明する。
【００２１】
【発明の要約】本発明によれば、式
【化１０】〔Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム；ＰはＭの多座
配位（Ｐｏｌｙｄｅｎｔａｔｅ）リガンド；Ｌ１、Ｌ
２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６はＭのリガンドであり、
各々が別のリガンドと互いに同じでもよく異なるもので
もよい；Ｂは１つ以上のアミド又はアミン結合によって
Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、又はＬ６の１つ以
上に共有結合した物質；ｍは１以上の整数；ｎ、ｏ、
ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数；ｔは１以上の整
数；ｕは１以上の整数；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、
Ｌ５、Ｌ６及びＢは化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｉ
ｅｔｙ）が電磁放射線（電磁波）を放出すべく誘導され
るような組成と数とを有しており、Ｍのリガンドによっ
てＭに与えられる結合の総数がＭの配位数に等しい〕で
示される化学種が提供される。本発明は特に、発光ルテ
ニウム−又はオスミウム−含有ラベルを化学物質、生化
学物質及び生物物質のアミノ基に結合するための中間体
（介在物）として適当な化合物を提供する。従ってこれ
ら中間体は本発明の化学種の生成に特に適している。中
間体は、ルテニウム−又はオスミウム−ビス（２，２’
−ビピリジン）（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジ
カルボン酸）のモノ−及びジ−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル及びその塩、並びにルテニウム−又はオ
スミウム−ビス（２，２’−ビピリジン）（４，４’−
ジ（クロロメチル）−２，２’−ビピリジン）である。
これら化合物は当業者に公知の手段で合成され得る。
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム；ＰはＭの多座
配位（Ｐｏｌｙｄｅｎｔａｔｅ）リガンド；Ｌ１、Ｌ
２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６はＭのリガンドであり、
各々が別のリガンドと互いに同じでもよく異なるもので
もよい；Ｂは１つ以上のアミド又はアミン結合によって
Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、又はＬ６の１つ以
上に共有結合した物質；ｍは１以上の整数；ｎ、ｏ、
ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数；ｔは１以上の整
数；ｕは１以上の整数；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、
Ｌ５、Ｌ６及びＢは化学種（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｉ
ｅｔｙ）が電磁放射線（電磁波）を放出すべく誘導され
るような組成と数とを有しており、Ｍのリガンドによっ
てＭに与えられる結合の総数がＭの配位数に等しい〕で
示される化学種が提供される。本発明は特に、発光ルテ
ニウム−又はオスミウム−含有ラベルを化学物質、生化
学物質及び生物物質のアミノ基に結合するための中間体
（介在物）として適当な化合物を提供する。従ってこれ
ら中間体は本発明の化学種の生成に特に適している。中
間体は、ルテニウム−又はオスミウム−ビス（２，２’
−ビピリジン）（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジ
カルボン酸）のモノ−及びジ−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル及びその塩、並びにルテニウム−又はオ
スミウム−ビス（２，２’−ビピリジン）（４，４’−
ジ（クロロメチル）−２，２’−ビピリジン）である。
これら化合物は当業者に公知の手段で合成され得る。
【００２２】本発明は、新規な化学種の存在の判定方法
を提供する。本発明はまた、式
を提供する。本発明はまた、式
【化１１】〔Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム；ＰはＭの多座
配位リガンド；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６
はＭのリガンドであり、各々が別のリガンドと互いに同
じでもよく異なるものでもよい；ＢはＭのリンガド物質
であるか又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、又は
Ｌ６の１つ以上に結合した物質；ｍは１以上の整数；
ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数；ｔは１
以上の整数；ｕは１以上の整数；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ
３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは化学種が電磁放射線を放
出すべく誘導されるような組成と数とを有しており、Ｍ
のリガンドによってＭに与えられる結合の総数がＭの配
位数に等しい〕で示される化学種の存在の判定方法を提
供する。
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム；ＰはＭの多座
配位リガンド；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６
はＭのリガンドであり、各々が別のリガンドと互いに同
じでもよく異なるものでもよい；ＢはＭのリンガド物質
であるか又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、又は
Ｌ６の１つ以上に結合した物質；ｍは１以上の整数；
ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数；ｔは１
以上の整数；ｕは１以上の整数；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ
３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは化学種が電磁放射線を放
出すべく誘導されるような組成と数とを有しており、Ｍ
のリガンドによってＭに与えられる結合の総数がＭの配
位数に等しい〕で示される化学種の存在の判定方法を提
供する。
【００２３】本発明方法は、 ａ）適当な条件下で化学種を含有する反応混合物（ｒｅ
ａｇｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）を形成させ、 ｂ）反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種からの電磁放射線の放出を誘導し、 ｃ）放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定する ステップを含む。
ａｇｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ）を形成させ、 ｂ）反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種からの電磁放射線の放出を誘導し、 ｃ）放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定する ステップを含む。
【００２４】本発明は更に、対象物質の存在を判定する
結合方法においてルテニウム含有又はオスミウム含有ラ
ベルの使用を提案する。これらの方法は、ラベルされた
対象化学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用
して対象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析
物の類似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を
判定するため、等に使用され得る。これら結合方法は均
一又は不均一結合方法のいずれでもよい。
結合方法においてルテニウム含有又はオスミウム含有ラ
ベルの使用を提案する。これらの方法は、ラベルされた
対象化学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用
して対象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析
物の類似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を
判定するため、等に使用され得る。これら結合方法は均
一又は不均一結合方法のいずれでもよい。
【００２５】更に本発明は、本発明のルテニウム含有又
はオスミウム含有化学種の存在を判定するためのシステ
ムを提供する。本発明のシステムは化学種からの電磁放
射線の放出を誘導する手段と放出された電磁放射線を検
出する手段とを含む。本発明は更に、対象分析物判定用
の結合方法にルテニウム含有又はオスミウム含有化学種
を使用するためのシステムを提供する。本発明によれ
ば、式
はオスミウム含有化学種の存在を判定するためのシステ
ムを提供する。本発明のシステムは化学種からの電磁放
射線の放出を誘導する手段と放出された電磁放射線を検
出する手段とを含む。本発明は更に、対象分析物判定用
の結合方法にルテニウム含有又はオスミウム含有化学種
を使用するためのシステムを提供する。本発明によれ
ば、式
【化１２】（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ａは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電磁
放射線を反復的に放出すべく誘導され得る化合物；Ｂは
Ａに結合した物質；ｋは１以上の整数；ｕは１以上の整
数〕で示される化学種の存在を判定するために、 ａ）適当な条件下で化学種を含有する反応混合物を形成
し、 ｂ）化学種を電気化学エネルギに直接曝露して化学種か
らの電磁放射線の反復的放出を誘導し、 ｃ）放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定する ステップを含む方法を提供する。
放射線を反復的に放出すべく誘導され得る化合物；Ｂは
Ａに結合した物質；ｋは１以上の整数；ｕは１以上の整
数〕で示される化学種の存在を判定するために、 ａ）適当な条件下で化学種を含有する反応混合物を形成
し、 ｂ）化学種を電気化学エネルギに直接曝露して化学種か
らの電磁放射線の反復的放出を誘導し、 ｃ）放出された電磁放射線を検出しこれにより化学種の
存在を判定する ステップを含む方法を提供する。
【００２６】本発明は更に、対象物質の存在を判定する
ための結合方法における電気化学ルミネセンス性ラベル
の使用を提案する。これらの方法はラベルされた対象化
学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用して対
象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析物の類
似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を判定す
るため、等に使用され得る。これら結合方法は均一又は
不均一結合方法のいずれでもよい。
ための結合方法における電気化学ルミネセンス性ラベル
の使用を提案する。これらの方法はラベルされた対象化
学種を判定するため、ラベルされた化学種を使用して対
象分析物を判定するため、ラベルされた対象分析物の類
似体を使用して競合結合アッセイで対象分析物を判定す
るため、等に使用され得る。これら結合方法は均一又は
不均一結合方法のいずれでもよい。
【００２７】本発明の特定具体例では、異なる２種以上
の化学種を含有する組成物が提供される。化学種の各々
は異なる波長の電磁放射線を放出すべく誘導され得る化
学物質種（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）でもよ
い。本発明の別の具体例では、化学種は、各々が異なる
値のエネルギ又は異なるエネルギ源からのエネルギに曝
露されて電磁放射線を放出すべく誘導されるような複数
の化学物質種から成ってもよい。この場合、別の対象物
質又は分析物が異なる化学種の各々に特異的に結合し得
る。これらの組成物及び方法の使用によって、被験サン
プル中に存在する異なる２種以上の対象物質又は分析物
を判定することが可能である。
の化学種を含有する組成物が提供される。化学種の各々
は異なる波長の電磁放射線を放出すべく誘導され得る化
学物質種（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）でもよ
い。本発明の別の具体例では、化学種は、各々が異なる
値のエネルギ又は異なるエネルギ源からのエネルギに曝
露されて電磁放射線を放出すべく誘導されるような複数
の化学物質種から成ってもよい。この場合、別の対象物
質又は分析物が異なる化学種の各々に特異的に結合し得
る。これらの組成物及び方法の使用によって、被験サン
プル中に存在する異なる２種以上の対象物質又は分析物
を判定することが可能である。
【００２８】
【本発明の詳細な説明】本発明によれば、式、
【化１３】〔Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム；ＰはＭの多座
配位リガンド；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６
はＭのリガンドであり各々が別のリガンドと互いに同じ
でもよく異なるものでもよい；Ｂは１つ以上のアミド又
はアミン結合によってＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ
５、又はＬ６の１つ以上に共有結合した物質；ｍは１以
上の整数；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整
数；ｔは１以上の整数；ｕは１以上の整数；Ｐ、Ｌ１、
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは化学種が電磁放
射線を放出すべく誘導され得るような組成と数とを有し
ており、ＭのリガンドによってＭに与えられる結合の総
数がＭの配位数に等しい〕で示される化学種が提供され
る。
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウム又はオスミウム；ＰはＭの多座
配位リガンド；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６
はＭのリガンドであり各々が別のリガンドと互いに同じ
でもよく異なるものでもよい；Ｂは１つ以上のアミド又
はアミン結合によってＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ
５、又はＬ６の１つ以上に共有結合した物質；ｍは１以
上の整数；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整
数；ｔは１以上の整数；ｕは１以上の整数；Ｐ、Ｌ１、
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは化学種が電磁放
射線を放出すべく誘導され得るような組成と数とを有し
ており、ＭのリガンドによってＭに与えられる結合の総
数がＭの配位数に等しい〕で示される化学種が提供され
る。
【００２９】この化学種は、１種類以上のＭの多座配位
リガンドを有していなければならない。この化学種が２
つ以上の多座配位リガンドを有するとき複数の多座配位
リガンドは互いに同じでもよく異なっていてもよい。多
座配位リガンドは芳香族及び脂肪族リガンドを含む。適
当な芳香族多座配位リガンドは芳香族複素環リガンドを
含む。好ましい芳香族複素環リガンドは窒素含有リガン
ド例えば、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル及び
フェナントロリルである。
リガンドを有していなければならない。この化学種が２
つ以上の多座配位リガンドを有するとき複数の多座配位
リガンドは互いに同じでもよく異なっていてもよい。多
座配位リガンドは芳香族及び脂肪族リガンドを含む。適
当な芳香族多座配位リガンドは芳香族複素環リガンドを
含む。好ましい芳香族複素環リガンドは窒素含有リガン
ド例えば、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル及び
フェナントロリルである。
【００３０】適当な多座配位リガンドは未置換でもよ
く、又は当業者に公知の多数の置換基のいずれかによっ
て置換されていてもよい。適当な置換基の例は、アルキ
ル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキ
ル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシア
ルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロ
キシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニ
ル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、硫黄含有
基、燐含有基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカル
ボン酸エステルである。
く、又は当業者に公知の多数の置換基のいずれかによっ
て置換されていてもよい。適当な置換基の例は、アルキ
ル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキ
ル、置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシア
ルデヒド、カルボキシアミド、シアノ、アミノ、ヒドロ
キシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニ
ル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、硫黄含有
基、燐含有基及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカル
ボン酸エステルである。
【００３１】この化学種は１種類以上の単座配位（ｍｏ
ｎｏｄｅｎｔａｔｅ）リガンドを有していてもよい。多
数の単座配位リガンドが当業者に公知である。適当な単
座配位リガンドは例えば、一酸化炭素、シアニド（シア
ン化物）、イソシアニド、ハロゲン化物、並びに、脂肪
族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチビン、
アルシンである。
ｎｏｄｅｎｔａｔｅ）リガンドを有していてもよい。多
数の単座配位リガンドが当業者に公知である。適当な単
座配位リガンドは例えば、一酸化炭素、シアニド（シア
ン化物）、イソシアニド、ハロゲン化物、並びに、脂肪
族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチビン、
アルシンである。
【００３２】本発明の化学種のとくに好ましい具体例
は、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（Ｉ
Ｉ）である。
は、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
及びトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（Ｉ
Ｉ）である。
【００３３】付加的化学ラベル例えば放射性同位体、蛍
光成分又は付加的発光ルテニウム−もしくはオスミウム
−含有中心に結合されるべき１種類以上のＭのリガンド
は本発明の範囲内に包含される。更に、２つ以上又は多
数の電気化学ルミネセンス性中心によってラベルされる
べきラベル物質（Ｂ）も本発明の範囲内に包含される。
光成分又は付加的発光ルテニウム−もしくはオスミウム
−含有中心に結合されるべき１種類以上のＭのリガンド
は本発明の範囲内に包含される。更に、２つ以上又は多
数の電気化学ルミネセンス性中心によってラベルされる
べきラベル物質（Ｂ）も本発明の範囲内に包含される。
【００３４】適当な物質（Ｂ）としては多くの生物物
質、例えば全細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク
質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、核
酸、多糖類、リポ多糖類、細胞代謝物、ホルモン、薬理
物質、トランキライザー、バルビツール酸エステル、ア
ルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及び糖類
がある。全細胞は動物又は植物又は細菌のいずれでもよ
く、生細胞でも死細胞でもよい。例えば植物病原体例え
ば菌類又は線虫類がある。「細胞下粒子」なる用語は、
例えば、細胞下小器官、破壊細胞の膜粒子、細胞壁の断
片、リボソーム、多酵素複合体及びその他の生体由来の
粒子を包含する。核酸は例えば、様々な由来の染色体Ｄ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、及び組換体
ＤＮＡを含む。核酸はまた、ＲＮＡ例えば、メッセンジ
ャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡを含む。ポ
リペプチドは例えば、酵素、輸送タンパク質、受容体タ
ンパク質、及び構造タンパク質例えばウイルスコートタ
ンパク質を含む。好ましいポリペプチドは酵素及び抗体
である。特に好ましいポリペプチドはモノクローナル抗
体である。ホルモンは例えばインシュリン及びＴ４甲状
腺ホルモンを含む。薬理物質（薬理剤）は例えば、強心
配糖体を含む。生物物質に化学的に類似した合成物質例
えば合成ポリペプチド、合成核酸、合成膜、小胞及びリ
ポソームも勿論本発明の範囲内に包含される。これらは
全て本発明での使用に適した生物物質の判り易い例とし
て示しただけであり、本発明の範囲はこれらの物質に限
定はされない。
質、例えば全細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク
質、リポタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、核
酸、多糖類、リポ多糖類、細胞代謝物、ホルモン、薬理
物質、トランキライザー、バルビツール酸エステル、ア
ルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及び糖類
がある。全細胞は動物又は植物又は細菌のいずれでもよ
く、生細胞でも死細胞でもよい。例えば植物病原体例え
ば菌類又は線虫類がある。「細胞下粒子」なる用語は、
例えば、細胞下小器官、破壊細胞の膜粒子、細胞壁の断
片、リボソーム、多酵素複合体及びその他の生体由来の
粒子を包含する。核酸は例えば、様々な由来の染色体Ｄ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、及び組換体
ＤＮＡを含む。核酸はまた、ＲＮＡ例えば、メッセンジ
ャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡを含む。ポ
リペプチドは例えば、酵素、輸送タンパク質、受容体タ
ンパク質、及び構造タンパク質例えばウイルスコートタ
ンパク質を含む。好ましいポリペプチドは酵素及び抗体
である。特に好ましいポリペプチドはモノクローナル抗
体である。ホルモンは例えばインシュリン及びＴ４甲状
腺ホルモンを含む。薬理物質（薬理剤）は例えば、強心
配糖体を含む。生物物質に化学的に類似した合成物質例
えば合成ポリペプチド、合成核酸、合成膜、小胞及びリ
ポソームも勿論本発明の範囲内に包含される。これらは
全て本発明での使用に適した生物物質の判り易い例とし
て示しただけであり、本発明の範囲はこれらの物質に限
定はされない。
【００３５】ラベルされた重合物質の如き非生物物質も
本発明の範囲内に含まれる。これらの物質は可溶重合分
子の形態でもよく、又は、公知の種々の巨視形態のいず
れか例えばビーズ等でもよく、又は、試験管、壜もしく
はアッセイウェル等の如き容器でもよい。生物物質及び
非生物物質（Ｂ）はアミド又はアミン結合を介してＭの
リガンドに共有結合する。アミド結合の場合、結合は、
物質（Ｂ）がアミド結合のカルボニル又は窒素に直接結
合するように配向される。これらの化学種はイオン化さ
れていてもよい。その場合、異なる多くの対イオンが化
学種調整物の電荷を中和し得ることは当業者に明らかで
あろう。適当なカチオンは例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、グ
アニジニウム、Ａｇ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ
２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｄ２＋である。適当なアニオンは例
えば、ハロゲン化物、ＯＨ−、炭酸塩、ＳＯ４ ２−、ヘ
キサフルオロホスフェート及びテトラフルオロボレート
である。
本発明の範囲内に含まれる。これらの物質は可溶重合分
子の形態でもよく、又は、公知の種々の巨視形態のいず
れか例えばビーズ等でもよく、又は、試験管、壜もしく
はアッセイウェル等の如き容器でもよい。生物物質及び
非生物物質（Ｂ）はアミド又はアミン結合を介してＭの
リガンドに共有結合する。アミド結合の場合、結合は、
物質（Ｂ）がアミド結合のカルボニル又は窒素に直接結
合するように配向される。これらの化学種はイオン化さ
れていてもよい。その場合、異なる多くの対イオンが化
学種調整物の電荷を中和し得ることは当業者に明らかで
あろう。適当なカチオンは例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、グ
アニジニウム、Ａｇ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ
２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｄ２＋である。適当なアニオンは例
えば、ハロゲン化物、ＯＨ−、炭酸塩、ＳＯ４ ２−、ヘ
キサフルオロホスフェート及びテトラフルオロボレート
である。
【００３６】本発明は更に、ルテニウム含有又はオスミ
ウム含有の発光ラベルを化学物質、生化学物質及び生物
物質のアミノ基に結合させる中間体（介在物）として特
に適した化合物を提供する。従ってこれら中間体は本発
明の化学種の合成に特に適している。本発明の中間体は
ルテニウム又はオスミウムのビス（２，２’−ビピリジ
ン）（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン
酸）のモノ−及びジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル及びその塩並びにルテニウム又はオスミウムビス
（２，２’−ビピリジン）（４，４’−ジ（クロロメチ
ル）−２，２’−ビピリジン）である。
ウム含有の発光ラベルを化学物質、生化学物質及び生物
物質のアミノ基に結合させる中間体（介在物）として特
に適した化合物を提供する。従ってこれら中間体は本発
明の化学種の合成に特に適している。本発明の中間体は
ルテニウム又はオスミウムのビス（２，２’−ビピリジ
ン）（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン
酸）のモノ−及びジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル及びその塩並びにルテニウム又はオスミウムビス
（２，２’−ビピリジン）（４，４’−ジ（クロロメチ
ル）−２，２’−ビピリジン）である。
【００３７】これら中間体は以下の化学構造を有する。
ルテニウム又はオスミウムのビス（２，２’−ビピリジ
ン）（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン
酸）のモノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
は、
ルテニウム又はオスミウムのビス（２，２’−ビピリジ
ン）（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン
酸）のモノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
は、
【化１４】 〔式中、ＭはＲｕ又はＯｓ、ｎは整数１、２又は３〕又
はその塩及びその立体異性体を含む。
はその塩及びその立体異性体を含む。
【００３８】ルテニウム又はオスミウムービス（２，
２’−ビピリジン）（２，２’−ビピリジン−４，４’
−ジカルボン酸）のジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルは、
２’−ビピリジン）（２，２’−ビピリジン−４，４’
−ジカルボン酸）のジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルは、
【化１５】 〔式中、ＭはＲｕ又はＯｓ、ｎは整数１、２又は３〕又
はその塩及びその立体異性体を含む。
はその塩及びその立体異性体を含む。
【００３９】ルテニウム又はオスミウム−ビス（２，
２’−ビピリジン）４，４’−ジ（クロロメチル）−
２，２’−ビピリジン）は、
２’−ビピリジン）４，４’−ジ（クロロメチル）−
２，２’−ビピリジン）は、
【化１６】 〔式中、ＭはＲｕ又はＯｓ、ｎは整数１、２又は３〕及
びその塩及びその立体異性体を含む。これら化合物は当
業者に公知の手段で合成され得る。
びその塩及びその立体異性体を含む。これら化合物は当
業者に公知の手段で合成され得る。
【００４０】ルテニウム含有Ｎ−ヒドロキシスクシンミ
ンドエステルの好ましい合成方法によれば、先ず炭酸水
素ナトリウムの高温メタノール水溶液中でルテニウムジ
クロロビス２，２’−ビピリジンを２，２’−ビピリジ
ン−４，４’−ジカルボン酸と反応させる。酸性化した
後にカルボキシル化したルテニウム化合物の溶液にＮａ
ＰＦ６の水溶液を添加する。単離したルテニウム錯体の
ヘキサフルオロホスフェート塩を次に、ジメチルホルム
アミド中のジシクロヘキシルカルボジイミドの存在中で
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させてエステル化
する。本発明の中間体の効果を実質的に悪化させずにＮ
−ヒドロキシスクシンイミド成分の構造について多くの
変形が可能である。これら中間体はイオン化されてもよ
い。その場合、異なる多くの対イオンが中間体調整物の
電荷を中和し得ることは当業者に明らかであろう。適当
なカチオンは例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、グアニジニウ
ム、Ａｇ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ
２＋、Ｃｄ２＋である。適当なアニオンは例えばハロゲ
ン化物、炭酸塩、ＳＯ４ ２−、ヘキサフルオロホスフェ
ート及びテトラフルオロボレートである。
ンドエステルの好ましい合成方法によれば、先ず炭酸水
素ナトリウムの高温メタノール水溶液中でルテニウムジ
クロロビス２，２’−ビピリジンを２，２’−ビピリジ
ン−４，４’−ジカルボン酸と反応させる。酸性化した
後にカルボキシル化したルテニウム化合物の溶液にＮａ
ＰＦ６の水溶液を添加する。単離したルテニウム錯体の
ヘキサフルオロホスフェート塩を次に、ジメチルホルム
アミド中のジシクロヘキシルカルボジイミドの存在中で
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させてエステル化
する。本発明の中間体の効果を実質的に悪化させずにＮ
−ヒドロキシスクシンイミド成分の構造について多くの
変形が可能である。これら中間体はイオン化されてもよ
い。その場合、異なる多くの対イオンが中間体調整物の
電荷を中和し得ることは当業者に明らかであろう。適当
なカチオンは例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、グアニジニウ
ム、Ａｇ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ
２＋、Ｃｄ２＋である。適当なアニオンは例えばハロゲ
ン化物、炭酸塩、ＳＯ４ ２−、ヘキサフルオロホスフェ
ート及びテトラフルオロボレートである。
【００４１】これら中間体は、カルボン酸エステルを攻
撃してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを置換し得るか又
はクロロメチル基を攻撃して塩化物を置換し得る遊離ア
ミノ基を含有する物質をラベルするために有効である。
対象分析物をラベルするためには従来技術のイソチオシ
アネート（例えばＷｅｂｅｒ、米国特許第４，２９３，
３１０号）よりも本発明の中間体のほうが好ましい。イ
ソチオシアネートは一般に、二硫化炭素又はチオホスゲ
ンと第一級アミンとの反応によって調製されるが、二硫
化炭素及びチオホスゲンはいずれも揮発性であり極めて
有毒である。二硫化炭素はまた、引火爆発の危険があ
る。また必要な前駆物質たる芳香族第一級アミンは本発
明で使用される前駆物質たる芳香族カルボン酸よりも入
手が難しい。また、本発明の中間体はイソチオシアネー
ト誘導体よりも反応しにくく従って保存及び取り扱いが
容易である。
撃してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを置換し得るか又
はクロロメチル基を攻撃して塩化物を置換し得る遊離ア
ミノ基を含有する物質をラベルするために有効である。
対象分析物をラベルするためには従来技術のイソチオシ
アネート（例えばＷｅｂｅｒ、米国特許第４，２９３，
３１０号）よりも本発明の中間体のほうが好ましい。イ
ソチオシアネートは一般に、二硫化炭素又はチオホスゲ
ンと第一級アミンとの反応によって調製されるが、二硫
化炭素及びチオホスゲンはいずれも揮発性であり極めて
有毒である。二硫化炭素はまた、引火爆発の危険があ
る。また必要な前駆物質たる芳香族第一級アミンは本発
明で使用される前駆物質たる芳香族カルボン酸よりも入
手が難しい。また、本発明の中間体はイソチオシアネー
ト誘導体よりも反応しにくく従って保存及び取り扱いが
容易である。
【００４２】本発明は更に、本発明の化学種の存在を判
定する方法を提供する。金属含有組成物は、当業者に公
知の種々の手段例えば放出（エミッション）、吸収、蛍
光スペクトル測定、原子吸収、陽極ストリッピング電圧
測定、中性子活性化及び電気化学的方法の如き手段によ
って検出され得る。ホトルミネセンス、ケミルミネセン
ス及び電気化学ルミネセンスの方法が特に重要である。
ルミネセンスの技術を使用するとＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋
が極めて低濃度でも測定できる。酸化的還元法を用いる
と（Ｅｇｅ等（１９８４）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、印刷中）、５×１０−８Ｍの濃度の
Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋の検出が可能であった。これらの
実験では、燐酸バッファｐＨ５．０中に１ｍＭのシュウ
酸ナトリウムを用い、飽和塩化ナトリウム参照電極に対
して電位を＋１．０Ｖ〜＋１．４Ｖで５〜１０秒間隔の
パルスにした。還元的酸化法ではより高い感度が得られ
ることも知見された。ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１容量
／容量）中の１８ｍＭのＮａ２Ｓ２Ｏ８と０．１Ｍのテ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウムテトラフルオロボレート
とを使用すると１０−１３Ｍという低い濃度のＲｕ（ｂ
ｐｙ）３ ２＋が検出できた。方法を更に精密にすれば更
に高い感度が期待できる。これらの方法はまた、ラベル
された物質の敏感で正確な測定値を与える。これに関し
ては後出の実施例で十分に説明する。
定する方法を提供する。金属含有組成物は、当業者に公
知の種々の手段例えば放出（エミッション）、吸収、蛍
光スペクトル測定、原子吸収、陽極ストリッピング電圧
測定、中性子活性化及び電気化学的方法の如き手段によ
って検出され得る。ホトルミネセンス、ケミルミネセン
ス及び電気化学ルミネセンスの方法が特に重要である。
ルミネセンスの技術を使用するとＲｕ（ｂｐｙ）３ ２＋
が極めて低濃度でも測定できる。酸化的還元法を用いる
と（Ｅｇｅ等（１９８４）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、印刷中）、５×１０−８Ｍの濃度の
Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋の検出が可能であった。これらの
実験では、燐酸バッファｐＨ５．０中に１ｍＭのシュウ
酸ナトリウムを用い、飽和塩化ナトリウム参照電極に対
して電位を＋１．０Ｖ〜＋１．４Ｖで５〜１０秒間隔の
パルスにした。還元的酸化法ではより高い感度が得られ
ることも知見された。ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１容量
／容量）中の１８ｍＭのＮａ２Ｓ２Ｏ８と０．１Ｍのテ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウムテトラフルオロボレート
とを使用すると１０−１３Ｍという低い濃度のＲｕ（ｂ
ｐｙ）３ ２＋が検出できた。方法を更に精密にすれば更
に高い感度が期待できる。これらの方法はまた、ラベル
された物質の敏感で正確な測定値を与える。これに関し
ては後出の実施例で十分に説明する。
【００４３】Ｒｕ（ｂｐｙ）３ ２＋でラベルした物質に
関する本出願人等の実験によって、ルテニウム含有及び
オスミウム含有化合物の化学ラベルとしての利点が証明
された。これらの化合物は長期安定性であり、種々の化
学物質、生化学物質及び生物物質に有効に結合し得る。
ラベルは安全で比較的安価である。
関する本出願人等の実験によって、ルテニウム含有及び
オスミウム含有化合物の化学ラベルとしての利点が証明
された。これらの化合物は長期安定性であり、種々の化
学物質、生化学物質及び生物物質に有効に結合し得る。
ラベルは安全で比較的安価である。
【００４４】それらは極めて特徴的なシグナルを与え、
自然には生起しないものである。標識の発光に基づく測
定は高感度、迅速且つ再現性があり、簡単な装置を利用
するものである。これらの標識の発光に基づく検出はリ
ン酸緩衝溶液、トウィーンＴＭ（界面活性剤）、肝臓組
織抽出物又は血清のような成分のよっては殆んど干渉さ
れることはない。これら標識の発光に基づく測定は試料
又は標識物質を破壊することなく繰返し行うことができ
る。各標識分子によりシグナルが繰返し発せられ、それ
によって、これら標識を検出し得るだけに感度が増強さ
れる。特定用途の必要に応じて、標識物質の存在は定量
的又は定性的に測定することができる。 注意事項：「測定」という用語は本明細書に於いて標識
物質の定量的又は定性的測定の意味に用いる。
自然には生起しないものである。標識の発光に基づく測
定は高感度、迅速且つ再現性があり、簡単な装置を利用
するものである。これらの標識の発光に基づく検出はリ
ン酸緩衝溶液、トウィーンＴＭ（界面活性剤）、肝臓組
織抽出物又は血清のような成分のよっては殆んど干渉さ
れることはない。これら標識の発光に基づく測定は試料
又は標識物質を破壊することなく繰返し行うことができ
る。各標識分子によりシグナルが繰返し発せられ、それ
によって、これら標識を検出し得るだけに感度が増強さ
れる。特定用途の必要に応じて、標識物質の存在は定量
的又は定性的に測定することができる。 注意事項：「測定」という用語は本明細書に於いて標識
物質の定量的又は定性的測定の意味に用いる。
【００４５】従って、本発明は次式を有する化学種：
【化１７】〔Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり、Ｐは
Ｍの多座配位リガンドであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、
Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はＭのリガンドであって各々同一
でもまたは互いに他のリガンドと異なっていてもよく、
ＢはＭのリガンドである物質であるかまたはＰ、Ｌ１、
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５もしくはＬ６の１個以上に結合
している物質であり、ｍは１以上の整数であり、ｎ、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数であ
り、ｔは１以上の整数であり、ｕは１以上の整数であ
り、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＢ
は電磁放射線を放出させるべくこの化学種を誘導できる
ような組成と数になっており、ＭのリガンドとＭとの結
合の総数はＭの配置数に等しい〕の存在を測定するため
の方法であって、
ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり、Ｐは
Ｍの多座配位リガンドであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、
Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はＭのリガンドであって各々同一
でもまたは互いに他のリガンドと異なっていてもよく、
ＢはＭのリガンドである物質であるかまたはＰ、Ｌ１、
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５もしくはＬ６の１個以上に結合
している物質であり、ｍは１以上の整数であり、ｎ、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数であ
り、ｔは１以上の整数であり、ｕは１以上の整数であ
り、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＢ
は電磁放射線を放出させるべくこの化学種を誘導できる
ような組成と数になっており、ＭのリガンドとＭとの結
合の総数はＭの配置数に等しい〕の存在を測定するため
の方法であって、
【００４６】ａ）適切な条件下で前記化学種を含有する
試薬混合物を形成し、 ｂ）この試薬混合物を化学エネルギーまたは電気化学エ
ネルギーに曝露することによって化学種を誘導して電磁
放射線を放出させ、 ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより対象分
析物の存在を測定することからなる方法 を提供するものである。
試薬混合物を形成し、 ｂ）この試薬混合物を化学エネルギーまたは電気化学エ
ネルギーに曝露することによって化学種を誘導して電磁
放射線を放出させ、 ｃ）放出された電磁放射線を検出することにより対象分
析物の存在を測定することからなる方法 を提供するものである。
【００４７】本発明方法で使用し得る化学種中に、生物
由来の又はそうでない物質（Ｂ）はＭへの直接の配位に
よって、又はＭのリガンドに結合することで該種に取り
込まれ得るものである。結合は共有結合、静電気結合又
は水素結合によってなされ得るものである。物質（Ｂ）
をＭのリガンドに共有結合させ得る手段は多様である。
例えば、上記結合はアミドあるいはアミン結合、エステ
ルあるいはチオエステル結合、エーテルあるいはチオエ
ーテル結合又は当業者に公知の多数の他の手段のうちの
いかなるものでも良い。結合の型はリガンドの置換基及
び標識されることになっている物質上にあるリガンドと
の結合に用い得る適当な化学基によって決定されること
になる。適当な物質（Ｂ）には、例えば、細胞全体、細
胞レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパ
ク、リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝
物質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤（トランキライザ
ー）、精神安定剤（バルビツエート）、アルカロイド、
ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由来でな
いポリマーがある。本発明の好適具体例では、結合はア
ミド又はアミン結合である。アミド又はアミン結合はリ
ガンド上の置換基及び標識されることになっている物質
上のアミノ基との間で形成される。
由来の又はそうでない物質（Ｂ）はＭへの直接の配位に
よって、又はＭのリガンドに結合することで該種に取り
込まれ得るものである。結合は共有結合、静電気結合又
は水素結合によってなされ得るものである。物質（Ｂ）
をＭのリガンドに共有結合させ得る手段は多様である。
例えば、上記結合はアミドあるいはアミン結合、エステ
ルあるいはチオエステル結合、エーテルあるいはチオエ
ーテル結合又は当業者に公知の多数の他の手段のうちの
いかなるものでも良い。結合の型はリガンドの置換基及
び標識されることになっている物質上にあるリガンドと
の結合に用い得る適当な化学基によって決定されること
になる。適当な物質（Ｂ）には、例えば、細胞全体、細
胞レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパ
ク、リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝
物質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤（トランキライザ
ー）、精神安定剤（バルビツエート）、アルカロイド、
ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由来でな
いポリマーがある。本発明の好適具体例では、結合はア
ミド又はアミン結合である。アミド又はアミン結合はリ
ガンド上の置換基及び標識されることになっている物質
上のアミノ基との間で形成される。
【００４８】本発明方法は相補的物質と特異的複合体
（コンプレックス）を形成することによって化学種を測
定する方法を含むものである。特に興味があるのは、抗
原−抗体の一対の物質についてである。この結合方法
は、例えば、血液、尿又は合成反応混合物のような複合
体混合物中のジゴキシン又はジギトキシンのような標識
抗原の存在を、まず初めに対象抗原に特異的な固定化抗
体に該混合物を接触させ、その後該固定化抗体に結合し
た標識物質の量を測ることによって測定する為に使用す
ることができる。
（コンプレックス）を形成することによって化学種を測
定する方法を含むものである。特に興味があるのは、抗
原−抗体の一対の物質についてである。この結合方法
は、例えば、血液、尿又は合成反応混合物のような複合
体混合物中のジゴキシン又はジギトキシンのような標識
抗原の存在を、まず初めに対象抗原に特異的な固定化抗
体に該混合物を接触させ、その後該固定化抗体に結合し
た標識物質の量を測ることによって測定する為に使用す
ることができる。
【００４９】「誘導して電磁放射線を放出させる」とい
う語句は該化学種の励起状態を作り出すことを意味し、
これは室温にて２００ｎｍ〜９００ｎｍの波長の発光を
行なうものである。本発明はオスミウム含有種及びルテ
ニウム含有種に関するものであり、リガンドの化学構造
を変化させることによって得られる広範囲に恒る様々な
発光種を含有するものである。これらの金属及びリガン
ドが変化することにより、それら発光種が励起状態にな
る為に必要とされるエネルギー入力の正確な値が変り得
る。これと同様に、電磁放射線の放出波長はルテニウム
又はオスミウム含有物質の性質及び環境によって変化し
得るものである。一般に、ホトルミネセンスに於ける励
起及び発光は約２００ｎｍ〜約９００ｎｍの波長の電磁
放射線を伴って生起するものである。化学発光及び電気
化学発光に於ける放出は一般に約２００ｎｍ〜約９００
ｎｍの波長の電磁放射線の放出を伴って生起するもので
ある。化学種の酸化・還元が起るポテンシャルは使用す
る電極の性質及び溶液のｐＨのような因子と同様にまさ
にその化学構造に左右されるものである。一般に、ホト
ルミネセンスシステムに於ける励起及び放出の最適波長
及び化学発光又は電気化学発光システムの最適ポテンシ
ャル及び最適放出波長の測定方法は当業者には周知のこ
とである。
う語句は該化学種の励起状態を作り出すことを意味し、
これは室温にて２００ｎｍ〜９００ｎｍの波長の発光を
行なうものである。本発明はオスミウム含有種及びルテ
ニウム含有種に関するものであり、リガンドの化学構造
を変化させることによって得られる広範囲に恒る様々な
発光種を含有するものである。これらの金属及びリガン
ドが変化することにより、それら発光種が励起状態にな
る為に必要とされるエネルギー入力の正確な値が変り得
る。これと同様に、電磁放射線の放出波長はルテニウム
又はオスミウム含有物質の性質及び環境によって変化し
得るものである。一般に、ホトルミネセンスに於ける励
起及び発光は約２００ｎｍ〜約９００ｎｍの波長の電磁
放射線を伴って生起するものである。化学発光及び電気
化学発光に於ける放出は一般に約２００ｎｍ〜約９００
ｎｍの波長の電磁放射線の放出を伴って生起するもので
ある。化学種の酸化・還元が起るポテンシャルは使用す
る電極の性質及び溶液のｐＨのような因子と同様にまさ
にその化学構造に左右されるものである。一般に、ホト
ルミネセンスシステムに於ける励起及び放出の最適波長
及び化学発光又は電気化学発光システムの最適ポテンシ
ャル及び最適放出波長の測定方法は当業者には周知のこ
とである。
【００５０】存在する発光種を定量する方法は多数ある
ということは明らかである。システムへのエネルギー入
力の速度によって発光種を測定することができる。適当
な測定としては、例えば、発光種が電気化学的に生成さ
れる際の電流測定、化学的に発光種を生成する際の還元
剤あるいは酸化剤の使用速度又はホトルミネセンス法に
於ける電磁エネルギーの吸収速度の測定が挙げられる。
更に当然のことながら、放出される電磁放射線を測定す
ることによっても、発光種を検出することができる。こ
れら測定は全て、速度に基づく連続的な測定、又は長時
間に恒りシグナルを累積する累積法のいずれかの方法と
して実施し得る。速度に基づく測定の例としては、入射
光強度に比例した量の電流を生じる、光電子増倍管チュ
ーブ、光ダイオード又は光トランジスターを用いるもの
がある。累積法の例としては、速度に基づいて得られた
データの積分、及び直接に累積データを与える写真フィ
ルムを用いるものがある。
ということは明らかである。システムへのエネルギー入
力の速度によって発光種を測定することができる。適当
な測定としては、例えば、発光種が電気化学的に生成さ
れる際の電流測定、化学的に発光種を生成する際の還元
剤あるいは酸化剤の使用速度又はホトルミネセンス法に
於ける電磁エネルギーの吸収速度の測定が挙げられる。
更に当然のことながら、放出される電磁放射線を測定す
ることによっても、発光種を検出することができる。こ
れら測定は全て、速度に基づく連続的な測定、又は長時
間に恒りシグナルを累積する累積法のいずれかの方法と
して実施し得る。速度に基づく測定の例としては、入射
光強度に比例した量の電流を生じる、光電子増倍管チュ
ーブ、光ダイオード又は光トランジスターを用いるもの
がある。累積法の例としては、速度に基づいて得られた
データの積分、及び直接に累積データを与える写真フィ
ルムを用いるものがある。
【００５１】これら全ての発光に基づく方法には、ルテ
ニウム含有化合物による発光の繰返しが必然的に伴って
いる。検出し得る事象が繰返し起るというこれらの標識
の持つ性質は、放射性同位体又はルミノールのような結
合化学発光分子とは明確に異なるものである。後者の標
識はその分子（又は原子）１個につきただの１回しか検
出し得る事象を生起せず、その為にこれら標識の検出可
能性は制限される。
ニウム含有化合物による発光の繰返しが必然的に伴って
いる。検出し得る事象が繰返し起るというこれらの標識
の持つ性質は、放射性同位体又はルミノールのような結
合化学発光分子とは明確に異なるものである。後者の標
識はその分子（又は原子）１個につきただの１回しか検
出し得る事象を生起せず、その為にこれら標識の検出可
能性は制限される。
【００５２】本発明は更に、ルテニウム及びオスミウム
含有標識を対象分析物の存在を測定する為の結合方法に
使用することを提供するものである。このような結合方
法は当業者には数多く知られている。これらの方法はし
ばしば、生化学的及び生物的成分が互いに結合する際の
高度な特異性を利用するものである。その例としては、
核酸ハイブリダイゼーション法に基づく方法、抗原−抗
体に基づく方法及び酵素−リガンドに基づく方法があ
る。これらの方法では、対象分析物を測定する為に標識
種を用いるか又は競合結合アッセイに於いては対象分析
物を測定する為に対象分析物の標識類似体を使用する為
に標識種を用いることができる。対象分析物及び化学種
は特異的な様式でお互いに結合し得る物質の対であれば
どのようなものでもかまわない。このような物質として
は、例えば、細胞全体、細胞レベル下の粒子、核酸、多
糖、タンパク、糖タンパク、リポタンパク、リポ多糖、
ポリペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理剤、鎮静
剤、精神安定剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸、糖及び生物由来でないポリマーがある。
含有標識を対象分析物の存在を測定する為の結合方法に
使用することを提供するものである。このような結合方
法は当業者には数多く知られている。これらの方法はし
ばしば、生化学的及び生物的成分が互いに結合する際の
高度な特異性を利用するものである。その例としては、
核酸ハイブリダイゼーション法に基づく方法、抗原−抗
体に基づく方法及び酵素−リガンドに基づく方法があ
る。これらの方法では、対象分析物を測定する為に標識
種を用いるか又は競合結合アッセイに於いては対象分析
物を測定する為に対象分析物の標識類似体を使用する為
に標識種を用いることができる。対象分析物及び化学種
は特異的な様式でお互いに結合し得る物質の対であれば
どのようなものでもかまわない。このような物質として
は、例えば、細胞全体、細胞レベル下の粒子、核酸、多
糖、タンパク、糖タンパク、リポタンパク、リポ多糖、
ポリペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理剤、鎮静
剤、精神安定剤、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸、糖及び生物由来でないポリマーがある。
【００５３】特に興味があるのは、抗原−抗体対であ
る。例えばこの方法には細胞表面抗原の存在を測定する
為に標識抗体を使用すること、又は細胞選別法による検
出の為に或る特定の細胞を標識することが含まれる。例
えば固定化された非標識抗体に結合することによって固
定化された抗原は一般に「サンドイッチ法」として公知
の方法に於いて標識抗体によって検出することができ
る。
る。例えばこの方法には細胞表面抗原の存在を測定する
為に標識抗体を使用すること、又は細胞選別法による検
出の為に或る特定の細胞を標識することが含まれる。例
えば固定化された非標識抗体に結合することによって固
定化された抗原は一般に「サンドイッチ法」として公知
の方法に於いて標識抗体によって検出することができ
る。
【００５４】競合結合アッセイに於いては、対象分析物
及び該分析物の標識類似体は、例えば、細胞全体、細胞
レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパク、
リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝物
質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤、精神安定剤、アルカロ
イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由
来でないポリマーのような相補的物質との特異的複合体
の形成に関与することのできる物質であればどのような
物質でもかまわない。特に興味があるのは抗原−抗体に
基づく方法である。この方法は、対象分析物がその分析
物の標識類似体を抗体から追い出したときにその分析物
を検出する、ラジオイムノアッセイと呼ばれる周知のも
のに類似している。当業者に公知のラジオイムノアッセ
イの様々な変法は、放射活性標識された化合物の代りに
本発明の標識化学種を用いることによって原理的には有
利に使用することができる。
及び該分析物の標識類似体は、例えば、細胞全体、細胞
レベル下の粒子、核酸、多糖、タンパク、糖タンパク、
リポタンパク、リポ多糖、ポリペプチド、細胞代謝物
質、ホルモン、薬理剤、鎮静剤、精神安定剤、アルカロ
イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖及び生物由
来でないポリマーのような相補的物質との特異的複合体
の形成に関与することのできる物質であればどのような
物質でもかまわない。特に興味があるのは抗原−抗体に
基づく方法である。この方法は、対象分析物がその分析
物の標識類似体を抗体から追い出したときにその分析物
を検出する、ラジオイムノアッセイと呼ばれる周知のも
のに類似している。当業者に公知のラジオイムノアッセ
イの様々な変法は、放射活性標識された化合物の代りに
本発明の標識化学種を用いることによって原理的には有
利に使用することができる。
【００５５】本発明は更にホモジーナス又はへテロジー
ナスな結合方法に於いて標識化学種を使用することを提
供するものである。へテロジーナス結合方法に於いて
は、標識の存在を測定する前に未結合標識物質から結合
標識物質を物理的に分離しなければならない。これは抗
原−抗体システムに於いてしばしば、例えば抗体という
一成分を、フィルターのような不溶マトリックスか又は
テストチューブのような反応容器或いはビーズの表面に
結合させて固定化することにより達成される。抗原含有
溶液をフィルターを通すか又は反応容器に注ぎ、その後
それをフィルター又は反応容器側部から洗滌除去する。
抗体に特異的に結合した抗原のみが残留し測定されるこ
とになる。
ナスな結合方法に於いて標識化学種を使用することを提
供するものである。へテロジーナス結合方法に於いて
は、標識の存在を測定する前に未結合標識物質から結合
標識物質を物理的に分離しなければならない。これは抗
原−抗体システムに於いてしばしば、例えば抗体という
一成分を、フィルターのような不溶マトリックスか又は
テストチューブのような反応容器或いはビーズの表面に
結合させて固定化することにより達成される。抗原含有
溶液をフィルターを通すか又は反応容器に注ぎ、その後
それをフィルター又は反応容器側部から洗滌除去する。
抗体に特異的に結合した抗原のみが残留し測定されるこ
とになる。
【００５６】これと対照的にホモジーナス方法に於いて
は、標識の存在を測定するときに結合及び未結合の標識
物質が同一反応混合物中に存在する。これは標識からの
検知可能なシグナルの特性が結合によって修飾されると
きに可能となる。発光標識をホモジーナスシステムで使
用することのできるような多数の方法がある。例えば、
もし発光消光剤が抗体上に適切に配置されているなら
ば、標識抗原が結合することによって該抗体上の発光消
光剤が標識の発光を抑制する。発光標識を用いる多数の
ホモジーナス方法が当業者に公知であり、そのうちの幾
つかはＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ及びＬｉ（１９８２）著の
「ホモジーナスイムノアッセイ」、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ７，４０１−４１４頁中で検討されている。
は、標識の存在を測定するときに結合及び未結合の標識
物質が同一反応混合物中に存在する。これは標識からの
検知可能なシグナルの特性が結合によって修飾されると
きに可能となる。発光標識をホモジーナスシステムで使
用することのできるような多数の方法がある。例えば、
もし発光消光剤が抗体上に適切に配置されているなら
ば、標識抗原が結合することによって該抗体上の発光消
光剤が標識の発光を抑制する。発光標識を用いる多数の
ホモジーナス方法が当業者に公知であり、そのうちの幾
つかはＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ及びＬｉ（１９８２）著の
「ホモジーナスイムノアッセイ」、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ７，４０１−４１４頁中で検討されている。
【００５７】本発明によって独特で有効なタイプの均質
結合アッセイが提供される。本文中の記載によれば、こ
れらのラベルは、ラベルされた対象物質の溶液を電極に
接触させることによって電気化学的に測定され得る。溶
液中に存在するが電極の表面に接近できないラベル物質
は検出されないであろう。検出されない場合として例え
ば、ラベル物質が電極を収容した反応容器の表面に直接
又は間接に結合しているとき、又は、ラベルが特異的複
合体例えば抗原抗体複合体の内部深くに包埋されている
とき、又は、電極自体がラベル物質を通過させるが錯体
を形成したラベル物質を通過させない層で被覆されてい
るときがある。更に、電極の表面が抗体で被覆されるこ
ともあり、この場合、固定化抗体に結合したラベル抗原
だけが電極に接近でき従って測定され得る。所望の電極
電位が短いパルスで与えられるときはこの特別な均質法
が最も有効であろう。
結合アッセイが提供される。本文中の記載によれば、こ
れらのラベルは、ラベルされた対象物質の溶液を電極に
接触させることによって電気化学的に測定され得る。溶
液中に存在するが電極の表面に接近できないラベル物質
は検出されないであろう。検出されない場合として例え
ば、ラベル物質が電極を収容した反応容器の表面に直接
又は間接に結合しているとき、又は、ラベルが特異的複
合体例えば抗原抗体複合体の内部深くに包埋されている
とき、又は、電極自体がラベル物質を通過させるが錯体
を形成したラベル物質を通過させない層で被覆されてい
るときがある。更に、電極の表面が抗体で被覆されるこ
ともあり、この場合、固定化抗体に結合したラベル抗原
だけが電極に接近でき従って測定され得る。所望の電極
電位が短いパルスで与えられるときはこの特別な均質法
が最も有効であろう。
【００５８】ラベル化合物の存在を測定する手段の組み
合わせ使用も本発明の範囲内に包含される。例えば、ホ
トルミネセンス又はケミルミネセンスの如き結合ラベル
物質と未結合ラベル物質とを識別しない手段によってラ
ベル物質の総量を測定し、例えば電気化学ルミネセンス
の如き結合ラベル物質と未結合ラベル物質とを識別する
手段によって結合ラベル物質の量を測定するのが好まし
い。かかる組み合わせ方法は同じサンプルに実施するこ
とができ、従って方法が個々に使用される場合よりもサ
ンプルに関して多くの情報が得られる。更に、本発明の
範囲内で同じ反応混合物中の異なる２種以上のラベル化
合物の存在を測定することも可能である。このような方
法は、異なるラベルが異なる波長の電磁放射線を放出す
るとき、又は、ラベルが異なる値又は異なるエネルギ源
のエネルギに曝露されることによって電磁放射線を放出
すべく誘導され得るときに可能である。本発明は更に、
ルテニウム含有又はオスミウム含有化学種の存在を測定
（判定、決定）するシステムを提供する。該システム
は、化学種を含有する反応混合物（試薬混合物）と電磁
放射線を放出せしむべく化学種を誘導する手段と、放出
された電磁放射線を検出する手段とを含む。
合わせ使用も本発明の範囲内に包含される。例えば、ホ
トルミネセンス又はケミルミネセンスの如き結合ラベル
物質と未結合ラベル物質とを識別しない手段によってラ
ベル物質の総量を測定し、例えば電気化学ルミネセンス
の如き結合ラベル物質と未結合ラベル物質とを識別する
手段によって結合ラベル物質の量を測定するのが好まし
い。かかる組み合わせ方法は同じサンプルに実施するこ
とができ、従って方法が個々に使用される場合よりもサ
ンプルに関して多くの情報が得られる。更に、本発明の
範囲内で同じ反応混合物中の異なる２種以上のラベル化
合物の存在を測定することも可能である。このような方
法は、異なるラベルが異なる波長の電磁放射線を放出す
るとき、又は、ラベルが異なる値又は異なるエネルギ源
のエネルギに曝露されることによって電磁放射線を放出
すべく誘導され得るときに可能である。本発明は更に、
ルテニウム含有又はオスミウム含有化学種の存在を測定
（判定、決定）するシステムを提供する。該システム
は、化学種を含有する反応混合物（試薬混合物）と電磁
放射線を放出せしむべく化学種を誘導する手段と、放出
された電磁放射線を検出する手段とを含む。
【００５９】本発明は更に、対象分析物を測定するため
にルテニウム含有又はオスミウム含有のラベル化学種を
使用するシステムを提供する。本発明のシステムは、本
明細書に開示され且つ教示された種々の方法の迅速、有
効且つ柔軟な実行に有用である。本発明は更に、式
（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕで示される化学種の存在の測定方法を
提供する。Ａは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電
磁放射線を反復的に放出するように誘導され得る化合物
である。これら化合物は、無機、有機金属又は有機化合
物のいずれでもよく、例えばルブレン、９，１０−ジフ
ェニルアントラセン、又はルテニウム含有もしくはオス
ミウム含有ラベルである。ＢはＡに結合した物質であ
り、ｋは１以上の整数であり、ｎは１以上の整数であ
る。
にルテニウム含有又はオスミウム含有のラベル化学種を
使用するシステムを提供する。本発明のシステムは、本
明細書に開示され且つ教示された種々の方法の迅速、有
効且つ柔軟な実行に有用である。本発明は更に、式
（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕで示される化学種の存在の測定方法を
提供する。Ａは電気化学エネルギ源に直接曝露されて電
磁放射線を反復的に放出するように誘導され得る化合物
である。これら化合物は、無機、有機金属又は有機化合
物のいずれでもよく、例えばルブレン、９，１０−ジフ
ェニルアントラセン、又はルテニウム含有もしくはオス
ミウム含有ラベルである。ＢはＡに結合した物質であ
り、ｋは１以上の整数であり、ｎは１以上の整数であ
る。
【００６０】該方法によれば、適当な条件下で化学種を
含有する反応（試薬）混合物を形成し、化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線を反
復的に放出せしむべく誘導する。放出された電磁放射線
は適当な方法によって検出されこれによって化学種の存
在を測定し得る。生物又は非生物物質（Ｂ）はＡに対す
る任意の結合形態によって化学種に組み込まれることが
可能である。結合は、Ａ中に存在する金属原子又はＡの
リガンドに対する配位によって行なわれる。結合は、共
有結合、静電結合又は水素結合でもよい。結合のタイプ
は、ＡとＢとの双方の結合に使用し得る適当な化学基に
よって決定されるであろう。
含有する反応（試薬）混合物を形成し、化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線を反
復的に放出せしむべく誘導する。放出された電磁放射線
は適当な方法によって検出されこれによって化学種の存
在を測定し得る。生物又は非生物物質（Ｂ）はＡに対す
る任意の結合形態によって化学種に組み込まれることが
可能である。結合は、Ａ中に存在する金属原子又はＡの
リガンドに対する配位によって行なわれる。結合は、共
有結合、静電結合又は水素結合でもよい。結合のタイプ
は、ＡとＢとの双方の結合に使用し得る適当な化学基に
よって決定されるであろう。
【００６１】適当な物質（Ｂ）は例えば、全細胞、細胞
下粒子、核酸、多糖類、タンパク質、糖タンパク質、リ
ポタンパク質、リポ多糖類、ポリペプチド、細胞代謝
物、ホルモン、薬理物質、トランキライザー、バルビツ
ール酸エステル、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸及び糖である。物質は生物物質に限定され
ない。ポリマー、有機又は無機の化合物の如き任意の適
当な非生物物質でもよい。
下粒子、核酸、多糖類、タンパク質、糖タンパク質、リ
ポタンパク質、リポ多糖類、ポリペプチド、細胞代謝
物、ホルモン、薬理物質、トランキライザー、バルビツ
ール酸エステル、アルカロイド、ステロイド、ビタミ
ン、アミノ酸及び糖である。物質は生物物質に限定され
ない。ポリマー、有機又は無機の化合物の如き任意の適
当な非生物物質でもよい。
【００６２】化学種は、室温で約２００ナノメータ〜約
９００ナノメータの波長で発光する化学種の励起状態を
生起することによって電磁放射線を放出すべく誘導され
る。本発明のこの具体例において、化学種は反応（試
薬）混合物を電気化学エネルギに曝露することによって
励起される。本発明の化学種の還元又は酸化が生じる電
位は、該化学種の正確な化学構造と溶液のｐＨ及び使用
電極の種類の如き要因とに依存する。電気化学ルミネセ
ンスシステムの最適な電位と放出波長との決定方法は当
業者に公知である。電気化学発光性の化学種を測定する
には、電流又は放出電磁放射線の測定の如き任意の適当
な方法を用いる。また、本発明の化学種の存在の測定方
法を化学種が別の化学物質と結合できる場合に利用する
ことも可能である。化学物質は化学種に特異的に結合し
得る任意の物質でよい。かかる方法の例として核酸ハイ
ブリダイゼーション方法、抗体−抗原に基づく方法及び
酵素−リガンド方法がある。
９００ナノメータの波長で発光する化学種の励起状態を
生起することによって電磁放射線を放出すべく誘導され
る。本発明のこの具体例において、化学種は反応（試
薬）混合物を電気化学エネルギに曝露することによって
励起される。本発明の化学種の還元又は酸化が生じる電
位は、該化学種の正確な化学構造と溶液のｐＨ及び使用
電極の種類の如き要因とに依存する。電気化学ルミネセ
ンスシステムの最適な電位と放出波長との決定方法は当
業者に公知である。電気化学発光性の化学種を測定する
には、電流又は放出電磁放射線の測定の如き任意の適当
な方法を用いる。また、本発明の化学種の存在の測定方
法を化学種が別の化学物質と結合できる場合に利用する
ことも可能である。化学物質は化学種に特異的に結合し
得る任意の物質でよい。かかる方法の例として核酸ハイ
ブリダイゼーション方法、抗体−抗原に基づく方法及び
酵素−リガンド方法がある。
【００６３】本発明の別の具体例によれば、電気化学発
光性の化学種（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕが、該化学種に結合する
対象分析物の存在を測定するために使用され得る。対象
分析物は、電気化学発光性の化学種に結合し得るいかな
る物質でもよい。例えば電気化学発光性の化学種でラベ
ルされた抗体に結合し得る抗原でもよい。方法は、反応
（試薬）混合物を形成させるに適した条件下で分析物を
化学種と接触させるステップを含む。次に化学種を電気
化学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の
反復的放出を誘導する。分析物に結合した化学種によっ
て放出された電磁放射線を検出することによって分析物
の存在を測定（判定）する。
光性の化学種（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕが、該化学種に結合する
対象分析物の存在を測定するために使用され得る。対象
分析物は、電気化学発光性の化学種に結合し得るいかな
る物質でもよい。例えば電気化学発光性の化学種でラベ
ルされた抗体に結合し得る抗原でもよい。方法は、反応
（試薬）混合物を形成させるに適した条件下で分析物を
化学種と接触させるステップを含む。次に化学種を電気
化学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の
反復的放出を誘導する。分析物に結合した化学種によっ
て放出された電磁放射線を検出することによって分析物
の存在を測定（判定）する。
【００６４】また、対象分析物の存在を測定するために
競合結合方法を使用することも可能である。分析物と化
学種（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕとは化学物質に競合的に結合す
る。反応混合物を形成させるに適した条件下で化学物質
を化学種と分析物とに接触させる。次に化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の反
復的放出を誘導する。電磁放射線の放出量を検出するこ
とによって対象分析物の存在を測定（判定）する。
競合結合方法を使用することも可能である。分析物と化
学種（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕとは化学物質に競合的に結合す
る。反応混合物を形成させるに適した条件下で化学物質
を化学種と分析物とに接触させる。次に化学種を電気化
学エネルギに直接曝露することによって電磁放射線の反
復的放出を誘導する。電磁放射線の放出量を検出するこ
とによって対象分析物の存在を測定（判定）する。
【００６５】本発明は更に、本発明のルテニウム含有又
はオスミウム含有化学種と異なる波長の電磁放射線を放
出すべく誘導され得る１種類以上の別の化学種とを含む
組成物に係る。これら組成物は同じ物質と別の物質との
混合物に含有される異なる２種以上の対象物質又は分析
物を検出する方法及びシステムにおいて有効である。別
の１種以上の化学種は、電磁放射線を放出すべく誘導さ
れ得る無機、有機及び有機金属化合物の如き任意の適当
な化学種、例えばルブレン又は９，１０−ジフェニルア
ントラセンである。これらの化学種は、ルテニウム含有
又はオスミウム含有化学種から電磁放射線を誘導するた
めに使用されるエネルギとは異なる値を持つか又は異な
るエネルギ源からでるエネルギに曝露されるときに電磁
放射線を放出すべく誘導されるような化学種である。本
発明の特定具体例において、別の化学種の各々は、ルテ
ニウム含有又はオスミウム含有化学種の電磁放射線の放
出を誘導するエネルギと同じ値及び同じエネルギ源のエ
ネルギによって電磁放射線の放出を誘導されると別の異
なる波長の電磁放射線を放出する。
はオスミウム含有化学種と異なる波長の電磁放射線を放
出すべく誘導され得る１種類以上の別の化学種とを含む
組成物に係る。これら組成物は同じ物質と別の物質との
混合物に含有される異なる２種以上の対象物質又は分析
物を検出する方法及びシステムにおいて有効である。別
の１種以上の化学種は、電磁放射線を放出すべく誘導さ
れ得る無機、有機及び有機金属化合物の如き任意の適当
な化学種、例えばルブレン又は９，１０−ジフェニルア
ントラセンである。これらの化学種は、ルテニウム含有
又はオスミウム含有化学種から電磁放射線を誘導するた
めに使用されるエネルギとは異なる値を持つか又は異な
るエネルギ源からでるエネルギに曝露されるときに電磁
放射線を放出すべく誘導されるような化学種である。本
発明の特定具体例において、別の化学種の各々は、ルテ
ニウム含有又はオスミウム含有化学種の電磁放射線の放
出を誘導するエネルギと同じ値及び同じエネルギ源のエ
ネルギによって電磁放射線の放出を誘導されると別の異
なる波長の電磁放射線を放出する。
【００６６】これら化学種の測定方法では、適当な条件
下で化学種を含有する反応（試薬）混合物を形成させ、
次に反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種の電磁放射線放出を誘導する。化学種の
各々によって放出される別々の波長の電磁放射線を検出
することによって各化学種の存在が決定される。本発明
は更に、同一混合物中に存在する異なる化学種に選択的
に結合する１種類以上の対象分析物の存在を測定する方
法に係る。方法は、反応（試薬）混合物を形成させる適
当な条件下で分析物と化学種とを接触させる。反応混合
物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに曝露すること
によって化学種を電磁放射線を放出すべく誘導し、放出
された異なる波長の電磁放射線を検出して対象分析物の
各々の存在を決定する。
下で化学種を含有する反応（試薬）混合物を形成させ、
次に反応混合物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに
曝露して化学種の電磁放射線放出を誘導する。化学種の
各々によって放出される別々の波長の電磁放射線を検出
することによって各化学種の存在が決定される。本発明
は更に、同一混合物中に存在する異なる化学種に選択的
に結合する１種類以上の対象分析物の存在を測定する方
法に係る。方法は、反応（試薬）混合物を形成させる適
当な条件下で分析物と化学種とを接触させる。反応混合
物を化学エネルギ又は電気化学エネルギに曝露すること
によって化学種を電磁放射線を放出すべく誘導し、放出
された異なる波長の電磁放射線を検出して対象分析物の
各々の存在を決定する。
【００６７】混合物中の２種以上の化学種の存在を測定
するこれらの方法は、ルテニウム含有及びオスミウム含
有の発光ラベルを測定するための前記の全てのケースに
適用できる。しかし乍ら、かかる具体例では同一サンプ
ル中に同時に存在する２種以上の異なる物質を測定し得
る。本発明の別の具体例によれば、別々の化学種は、別
々の値又は別々のエネルギ源のエネルギに曝露されて電
磁放射線を放出すべく誘導される。これらの別々の化学
種の測定方法は誘導ステップ以外は、異なる波長の電磁
放射線を放出する化学種の測定方法と本質的に同じであ
る。これら化学種は、異なる値又はエネルギ源のエネル
ギによって電磁放射線を放出すべく誘導される。化学種
含有サンプルが異なる時間に別々の値又はエネルギ源の
エネルギの各々に曝露され、特定の化学種によって放出
された電磁放射線が検出され、これにより化学種の存在
が決定される。方法はまた、サンプル中に存在する別々
の化学種に選択的に結合する対象分析物の存在を決定す
るためにも有効である。
するこれらの方法は、ルテニウム含有及びオスミウム含
有の発光ラベルを測定するための前記の全てのケースに
適用できる。しかし乍ら、かかる具体例では同一サンプ
ル中に同時に存在する２種以上の異なる物質を測定し得
る。本発明の別の具体例によれば、別々の化学種は、別
々の値又は別々のエネルギ源のエネルギに曝露されて電
磁放射線を放出すべく誘導される。これらの別々の化学
種の測定方法は誘導ステップ以外は、異なる波長の電磁
放射線を放出する化学種の測定方法と本質的に同じであ
る。これら化学種は、異なる値又はエネルギ源のエネル
ギによって電磁放射線を放出すべく誘導される。化学種
含有サンプルが異なる時間に別々の値又はエネルギ源の
エネルギの各々に曝露され、特定の化学種によって放出
された電磁放射線が検出され、これにより化学種の存在
が決定される。方法はまた、サンプル中に存在する別々
の化学種に選択的に結合する対象分析物の存在を決定す
るためにも有効である。
【００６８】本発明の別の具体例では、同一サンプル中
に存在する１種類以上の式（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕをもつ電気
化学発光性の化学種を測定する方法及びシステムを含
む。これら化学種は、電気化学エネルギ源に曝露される
と異なる波長の電磁放射線を放出する化合物又は各々が
別々の電気化学エネルギ源に曝露されて電磁放射線を放
出すべく誘導され得る複数の異なる化合物を含有する。
これら複数の異なる電気化学発光性の化学種は別々の対
象物質又は分析物に特異的に結合し得る。異なる化学種
の測定は前記と同じ手順で行なわれる。本発明を実施例
に基づいて以下に説明する。これらの実施例は本発明を
理解し易くするための非限定例であり、本発明の範囲は
請求の範囲のみによって限定される。
に存在する１種類以上の式（Ａ）ｋ（Ｂ）ｕをもつ電気
化学発光性の化学種を測定する方法及びシステムを含
む。これら化学種は、電気化学エネルギ源に曝露される
と異なる波長の電磁放射線を放出する化合物又は各々が
別々の電気化学エネルギ源に曝露されて電磁放射線を放
出すべく誘導され得る複数の異なる化合物を含有する。
これら複数の異なる電気化学発光性の化学種は別々の対
象物質又は分析物に特異的に結合し得る。異なる化学種
の測定は前記と同じ手順で行なわれる。本発明を実施例
に基づいて以下に説明する。これらの実施例は本発明を
理解し易くするための非限定例であり、本発明の範囲は
請求の範囲のみによって限定される。
【００６９】実施例Ｉ ルテニウムビス（２，２’−ビピリジン）（２，２’−
ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸）ビス（へキサフ
ルオロホスフェート）の調製 重炭酸ナトリウム（０．４０ｇ）、ルテニウムジクロロ
ビス（２，２’−ビピリジン）（０．４０ｇ）及び２，
２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸（０．３０
ｇ）を、環流メタノール（２０ｍｌ）−水（５ｍｌ）中
で９時間撹拌した。得られた溶液を氷浴中で冷却し、５
滴の濃Ｈ２ＳＯ４で処理し、１．５時間氷温に維持し
た。形成した沈殿を濾別しＭｅＯＨ（８ｍｌ）で洗浄し
た。炉液と洗浄液を合わせたものを水（２５ｍｌ）中の
ナトリウムヘキサフルオロホスフェート（５．０ｇ）の
溶液で処理した。得られた溶液を氷浴で３時間冷却し、
赤紫色結晶の得られた沈殿を濾過により回収した（０．
４０ｇ）。
ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸）ビス（へキサフ
ルオロホスフェート）の調製 重炭酸ナトリウム（０．４０ｇ）、ルテニウムジクロロ
ビス（２，２’−ビピリジン）（０．４０ｇ）及び２，
２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸（０．３０
ｇ）を、環流メタノール（２０ｍｌ）−水（５ｍｌ）中
で９時間撹拌した。得られた溶液を氷浴中で冷却し、５
滴の濃Ｈ２ＳＯ４で処理し、１．５時間氷温に維持し
た。形成した沈殿を濾別しＭｅＯＨ（８ｍｌ）で洗浄し
た。炉液と洗浄液を合わせたものを水（２５ｍｌ）中の
ナトリウムヘキサフルオロホスフェート（５．０ｇ）の
溶液で処理した。得られた溶液を氷浴で３時間冷却し、
赤紫色結晶の得られた沈殿を濾過により回収した（０．
４０ｇ）。
【００７０】実施例ＩＩ ルテニウムビス（２，２’−ビピリジン）（２，２’−
ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸）の活性エステル
の調製 ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０．０４６
ｇ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０３４
ｇ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中に撹拌して溶解し、氷溶中で
冷却した。ルテニウムビス（２，２’−ビピリジン）
（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸）
（０．１０１ｇ、実施例１のように調製した）をＤＭＦ
（１ｍｌ）中に溶解した溶液を加え、混合物を氷浴温度
で５時間撹拌した。形成した沈殿を遠心分離した。活性
化ルテニウム複合体を含む上清を、基質を標識するため
に保存した。
ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸）の活性エステル
の調製 ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０．０４６
ｇ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０３４
ｇ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中に撹拌して溶解し、氷溶中で
冷却した。ルテニウムビス（２，２’−ビピリジン）
（２，２’−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸）
（０．１０１ｇ、実施例１のように調製した）をＤＭＦ
（１ｍｌ）中に溶解した溶液を加え、混合物を氷浴温度
で５時間撹拌した。形成した沈殿を遠心分離した。活性
化ルテニウム複合体を含む上清を、基質を標識するため
に保存した。
【００７１】実施例ＩＩＩ 子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の活性化ルテニウム複合
体による標識化 実施例ＩＩで調製した活性化ルテニウム複合体のＤＭＦ
溶液（１ｍｌ）を、撹拌下の水性生理緩衝塩溶液（ＰＢ
Ｓ、５ｍｌ）中のＢＳＡ溶液（２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）
に加えた。混合物を１夜撹拌し、沈殿を遠心分離で除去
した。ルテニウム標識ＢＳＡを含む上清を２つの方法で
分析した。
体による標識化 実施例ＩＩで調製した活性化ルテニウム複合体のＤＭＦ
溶液（１ｍｌ）を、撹拌下の水性生理緩衝塩溶液（ＰＢ
Ｓ、５ｍｌ）中のＢＳＡ溶液（２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）
に加えた。混合物を１夜撹拌し、沈殿を遠心分離で除去
した。ルテニウム標識ＢＳＡを含む上清を２つの方法で
分析した。
【００７２】方法１：透析 ルテニウム標識ＢＳＡ溶液をＰＢＳ溶液で透析した。コ
ントロールとして実施例ＩＩで調製した非結合の活性化
ルテニウム複合体もＰＢＳ溶液で透析した。８時間後、
コントロールでは透析チューブ中には蛍光を有するもの
は見られなかった。それに対し、ルテニウム標識ＢＳＡ
溶液は強い蛍光を示し、ルテニウム複合体が高分子量Ｂ
ＳＡに結合したことを示した。
ントロールとして実施例ＩＩで調製した非結合の活性化
ルテニウム複合体もＰＢＳ溶液で透析した。８時間後、
コントロールでは透析チューブ中には蛍光を有するもの
は見られなかった。それに対し、ルテニウム標識ＢＳＡ
溶液は強い蛍光を示し、ルテニウム複合体が高分子量Ｂ
ＳＡに結合したことを示した。
【００７３】方法２：マイクロフィルトレーション ルテニウム標識ＢＳＡ溶液をアミコンマイクロコンセン
トレーター中に入れ、８０００ｒｐｍで遠心した。赤橙
色溶液の小画分がフィルター上に残り、この着色画分を
洗浄ＰＢＳ溶液で希釈し遠心した。この手順は数回繰り
返した。４回の洗浄後、フィルターを通しては無色の溶
液が得られ、フィルター上には強く赤橙色に着色した物
質が残った。この結果は、ルテニウム複合体が高分子量
ＢＳＡに結合したことを示している。
トレーター中に入れ、８０００ｒｐｍで遠心した。赤橙
色溶液の小画分がフィルター上に残り、この着色画分を
洗浄ＰＢＳ溶液で希釈し遠心した。この手順は数回繰り
返した。４回の洗浄後、フィルターを通しては無色の溶
液が得られ、フィルター上には強く赤橙色に着色した物
質が残った。この結果は、ルテニウム複合体が高分子量
ＢＳＡに結合したことを示している。
【００７４】実施例ＩＶ ヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）の活性化ルテニウム
複合体による標識化 実施例ＩＩで調製した活性化ルテニウム複合体のＤＭＦ
溶液を撹拌下に水性バッファー中のアフィニティー精製
ヒトＩｇＧ溶液に加えた。ルテニウム標識化ＩｇＧ溶液
は、充分に透析した後に強い蛍光を示し、ルテニウム複
合体が高分子量のアフィニティー精製ヒトＩｇＧに結合
したことが示された。
複合体による標識化 実施例ＩＩで調製した活性化ルテニウム複合体のＤＭＦ
溶液を撹拌下に水性バッファー中のアフィニティー精製
ヒトＩｇＧ溶液に加えた。ルテニウム標識化ＩｇＧ溶液
は、充分に透析した後に強い蛍光を示し、ルテニウム複
合体が高分子量のアフィニティー精製ヒトＩｇＧに結合
したことが示された。
【００７５】実施例Ｖ ウサギ抗サルモネラ抗体の標識化 実施例ＩＩで調製した活性化ルテニウム複合体のＤＭＦ
溶液（０．１ｍｌ）を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血
清（１ｍｌ）と共に室温で１時間撹拌し、その後ジエタ
ノールアミン（０．１ｍｌ）を加えて停止した。ルテニ
ウム標識抗サルモネラ抗体を含む得られた溶液でサルモ
ネラ細胞を処理した。細胞の遠心分離及び新鮮バッファ
ーへの再懸濁を５回繰り返し、全ての非結合抗体（ルテ
ニウム標識非結合抗体を含む）及び全ての遊離ルテニウ
ム複合体から細胞を分離した。ルテニウム標識抗サルモ
ネラ抗体で処理したサルモネラ細胞は、蛍光光学顕微鏡
で観察すると明るい赤橙色光を発しており、抗サルモネ
ラ抗体がルテニウム複合体で標識され、ルテニウム標識
抗体はルテニウム複合体が蛍光を発する条件下でサルモ
ネラ細胞に結合する能力を保有することが示された。
溶液（０．１ｍｌ）を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血
清（１ｍｌ）と共に室温で１時間撹拌し、その後ジエタ
ノールアミン（０．１ｍｌ）を加えて停止した。ルテニ
ウム標識抗サルモネラ抗体を含む得られた溶液でサルモ
ネラ細胞を処理した。細胞の遠心分離及び新鮮バッファ
ーへの再懸濁を５回繰り返し、全ての非結合抗体（ルテ
ニウム標識非結合抗体を含む）及び全ての遊離ルテニウ
ム複合体から細胞を分離した。ルテニウム標識抗サルモ
ネラ抗体で処理したサルモネラ細胞は、蛍光光学顕微鏡
で観察すると明るい赤橙色光を発しており、抗サルモネ
ラ抗体がルテニウム複合体で標識され、ルテニウム標識
抗体はルテニウム複合体が蛍光を発する条件下でサルモ
ネラ細胞に結合する能力を保有することが示された。
【００７６】実施例ＶＩ 正常マウス血清（即ち、抗サルモネラ抗体を持たない）
を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清の代りに使用して
実施例Ｖの手順を繰り返した。処理後、サルモネラ細胞
は蛍光光学顕微鏡で観察しても赤橙色を発しておらず、
ルテニウム標識正常マウス血清成分のサルモネラ細胞に
対する非特異的結合は起こらないことが示された。
を抗サルモネラ抗体を含むウサギ血清の代りに使用して
実施例Ｖの手順を繰り返した。処理後、サルモネラ細胞
は蛍光光学顕微鏡で観察しても赤橙色を発しておらず、
ルテニウム標識正常マウス血清成分のサルモネラ細胞に
対する非特異的結合は起こらないことが示された。
【００７７】実施例ＶＩＩ ヤギ抗ウサギイムノグロブリン（ＩｇＧ）の標識化及び
ローダミンとの比較 実施例ＩＩで調製した活性化ルテニウム複合体のＤＭＦ
溶液を撹拌下にアフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ
溶液に加えた。反応後、混合物をバッファーに対して透
析した。透析チューブ内に残った物質はＵＶライト下で
蛍光を発した。ルテニウム標識ＩｇＧのウサギ抗サルモ
ネラ抗体被覆サルモネラに対する反応性をテストした。
ガラス顕微鏡スライドに固定したサルモネラ・ワーシン
トン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏ
ｎ）とウサギ抗サルモネラ抗体を反応させ、非反応抗体
をバッファーで洗い流した。次にルテニウム標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧを抗体処理サルモネラ・ワーシントンと反
応させ、非反応物質をバッファーで洗い流した。このス
ライドを５０Ｗ水銀ランプを備えた光学顕微鏡で観察す
ると、非常に明るい橙赤色螢光がバクテリア上及び周囲
に見られた。ルテニウム標識抗体の非特異的結合につい
てコントロールの実験を行なった。ガラス顕微鏡スライ
ドに固定したサルモネラ・ワーシントンを正常マウス血
清と反応させ、その後ルテニウム標識ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ抗血清と反応させた。その後同じ洗浄工程を行なっ
た。橙赤色蛍光は観察されなかった。比較の目的で、ロ
ーダミンイソチオシアナート結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗
血清を（ルテニウム結合抗体と等価のタンパク質濃度
で）、ウサギ抗サルモネラ抗体で被膜したサルモネラ・
ワーシントンと反応させた。赤色の蛍光がわずかに検出
されたが、蛍光の強度はルテニウム結合体に比較して有
意に小さいものであった。
ローダミンとの比較 実施例ＩＩで調製した活性化ルテニウム複合体のＤＭＦ
溶液を撹拌下にアフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ
溶液に加えた。反応後、混合物をバッファーに対して透
析した。透析チューブ内に残った物質はＵＶライト下で
蛍光を発した。ルテニウム標識ＩｇＧのウサギ抗サルモ
ネラ抗体被覆サルモネラに対する反応性をテストした。
ガラス顕微鏡スライドに固定したサルモネラ・ワーシン
トン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏ
ｎ）とウサギ抗サルモネラ抗体を反応させ、非反応抗体
をバッファーで洗い流した。次にルテニウム標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧを抗体処理サルモネラ・ワーシントンと反
応させ、非反応物質をバッファーで洗い流した。このス
ライドを５０Ｗ水銀ランプを備えた光学顕微鏡で観察す
ると、非常に明るい橙赤色螢光がバクテリア上及び周囲
に見られた。ルテニウム標識抗体の非特異的結合につい
てコントロールの実験を行なった。ガラス顕微鏡スライ
ドに固定したサルモネラ・ワーシントンを正常マウス血
清と反応させ、その後ルテニウム標識ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ抗血清と反応させた。その後同じ洗浄工程を行なっ
た。橙赤色蛍光は観察されなかった。比較の目的で、ロ
ーダミンイソチオシアナート結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗
血清を（ルテニウム結合抗体と等価のタンパク質濃度
で）、ウサギ抗サルモネラ抗体で被膜したサルモネラ・
ワーシントンと反応させた。赤色の蛍光がわずかに検出
されたが、蛍光の強度はルテニウム結合体に比較して有
意に小さいものであった。
【００７８】実施例ＶＩＩＩ ルテニウム標識・子ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の電
気化学発光（ＥＣＬ）検知 光学的に平坦な底部を有する１区角タイプのセル（３０
ｍｌ）中でＥＣＬ測定を行なった。測定電極はガラス状
炭素で、対する電極はプラチナネットとし、疑似対照電
極は銀ワイヤで行なった。光強度の測定は、−２．０Ｖ
（Ａｇワイヤに対して）の電位をかけ、光増強管（Ｈａ
ｍａｍａｔｓｕ ９２８）で発光を検知し、２つに対し
て得られる信号をＢａｓｃｏｍ−Ｔｕｒｎｅｒ Ｒｅｃ
ｏｒｄｅｒで統合した。アセトニトリル−水（９ｍｌ、
５０：５０ｖ／ｖ）、テトラブチルアンモニウムテトラ
フルオロボレート（３２９ｍｇ）及びジアンモニウムパ
ーオキシジスルフェート（４２ｍｇ）をＥＣＬセル中で
混合し、バックグラウンド光強度を記録した。ルテニウ
ム標ＢＳＡ溶液（実施例ＩＩＩで調製したもの）を、ア
セトニトリル−水（５０：５０ｖ／ｖ）中に希釈し、該
希釈ＢＳＡ溶液（１ｍｌ）をＥＣＬセル中に加えた。得
られた溶液は溶媒飽和窒素気泡で脱気した。表Ｉはルテ
ニウム標識ＢＳＡの異なる濃度に対して得られた結果を
示している。
気化学発光（ＥＣＬ）検知 光学的に平坦な底部を有する１区角タイプのセル（３０
ｍｌ）中でＥＣＬ測定を行なった。測定電極はガラス状
炭素で、対する電極はプラチナネットとし、疑似対照電
極は銀ワイヤで行なった。光強度の測定は、−２．０Ｖ
（Ａｇワイヤに対して）の電位をかけ、光増強管（Ｈａ
ｍａｍａｔｓｕ ９２８）で発光を検知し、２つに対し
て得られる信号をＢａｓｃｏｍ−Ｔｕｒｎｅｒ Ｒｅｃ
ｏｒｄｅｒで統合した。アセトニトリル−水（９ｍｌ、
５０：５０ｖ／ｖ）、テトラブチルアンモニウムテトラ
フルオロボレート（３２９ｍｇ）及びジアンモニウムパ
ーオキシジスルフェート（４２ｍｇ）をＥＣＬセル中で
混合し、バックグラウンド光強度を記録した。ルテニウ
ム標ＢＳＡ溶液（実施例ＩＩＩで調製したもの）を、ア
セトニトリル−水（５０：５０ｖ／ｖ）中に希釈し、該
希釈ＢＳＡ溶液（１ｍｌ）をＥＣＬセル中に加えた。得
られた溶液は溶媒飽和窒素気泡で脱気した。表Ｉはルテ
ニウム標識ＢＳＡの異なる濃度に対して得られた結果を
示している。
【表１】
【００７９】実施例ＩＸ ４，４’−ジ（クロロメチル）−２，２’−ビピリジン
−ビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）
２＋の調製 Ｓｐｒｉｎｔｓｃｈｉｎｋ等（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．９９，４９４７（１９７７））の方法によ
り、２，２−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸から
４，４’−ジエトキシカルボニル−２，２’−ビピリジ
ンを調製した。該ジエチルエステル（１００ｍｇ）を無
水ジエチルエーテル（３５ｍｌ）中に溶解した。リチウ
ムアルミニウムヒドリド（１００ｍｇ）を加え、３０分
インキュベートした後ジエチルエーテル（３５ｍｌ）及
び氷冷脱イオン水（１００ｍｌ）を加えた。溶液をよく
混合し、エーテル層を回収した。水成層はエーテル（７
０ｍｌ）で２回以上抽出した。エーテル抽出物を合わ
せ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し濾過した。ロータリー
エバポレーターで溶媒を除去し、所望生成物（４３ｍ
ｇ）を得た。この４３ｍｇの４，４−ジ（ヒドロキシメ
チル）−２，２’−ビピリジン及び１２０ｍｇのｃｉｓ
−ジクロロビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム
（ＩＩ）ジヒドレートをエタノール（２５ｍｌ）に加
え、溶液を１４時間環流させた。溶液を冷却した後、ア
ンモニウムヘキサフルオロホスフェートの溶液（水１ｍ
ｌ中１ｍｇ）の５０μｌを加え、得られた結晶状固体を
回収し、少量のエタノールで洗浄して乾燥し、１３８ｍ
ｇの４，４−ジヒドロキシメチル複合体のヘキサフルオ
ロホスフェート塩を得た。この複合体（６ｍｇ）を塩化
チオニル（５ｍｌ）に加え、溶液を６時間環流させた。
蒸留により塩化チオニルを除去し、固体残渣をジオキサ
ン−水（１：１）混合物（５００μｌ）に溶解した。
４，４’−ジ（クロロメチル）−２，２’−ビピリジン
−ビス−（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）
２＋を含むこの溶液を抗体の標識に使用した。
−ビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）
２＋の調製 Ｓｐｒｉｎｔｓｃｈｉｎｋ等（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．９９，４９４７（１９７７））の方法によ
り、２，２−ビピリジン−４，４’−ジカルボン酸から
４，４’−ジエトキシカルボニル−２，２’−ビピリジ
ンを調製した。該ジエチルエステル（１００ｍｇ）を無
水ジエチルエーテル（３５ｍｌ）中に溶解した。リチウ
ムアルミニウムヒドリド（１００ｍｇ）を加え、３０分
インキュベートした後ジエチルエーテル（３５ｍｌ）及
び氷冷脱イオン水（１００ｍｌ）を加えた。溶液をよく
混合し、エーテル層を回収した。水成層はエーテル（７
０ｍｌ）で２回以上抽出した。エーテル抽出物を合わ
せ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し濾過した。ロータリー
エバポレーターで溶媒を除去し、所望生成物（４３ｍ
ｇ）を得た。この４３ｍｇの４，４−ジ（ヒドロキシメ
チル）−２，２’−ビピリジン及び１２０ｍｇのｃｉｓ
−ジクロロビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム
（ＩＩ）ジヒドレートをエタノール（２５ｍｌ）に加
え、溶液を１４時間環流させた。溶液を冷却した後、ア
ンモニウムヘキサフルオロホスフェートの溶液（水１ｍ
ｌ中１ｍｇ）の５０μｌを加え、得られた結晶状固体を
回収し、少量のエタノールで洗浄して乾燥し、１３８ｍ
ｇの４，４−ジヒドロキシメチル複合体のヘキサフルオ
ロホスフェート塩を得た。この複合体（６ｍｇ）を塩化
チオニル（５ｍｌ）に加え、溶液を６時間環流させた。
蒸留により塩化チオニルを除去し、固体残渣をジオキサ
ン−水（１：１）混合物（５００μｌ）に溶解した。
４，４’−ジ（クロロメチル）−２，２’−ビピリジン
−ビス−（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）
２＋を含むこの溶液を抗体の標識に使用した。
【００８０】実施例Ｘ ４，４’−ジ（クロロメチル）−２，２’−ビピリジン
−ビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）
２＋によるウサギ及びヒツジ抗マウスＩｇＧの標識化 ウサギ及びヒツジ抗体をＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌの溶液
とした。これ等の溶液を重炭酸ナトリウム（５００ｍ
ｌ、５０ｍＭ、ｐＨ９）に対して一晩透析した。その後
抗体（２ｍｇ）を重炭酸ナトリウム溶液で希釈し２ｍｌ
の最終容量とした。この溶液（１ｍｌ）を炭酸ナトリウ
ム溶液（１ｍｌ、５０ｍＭ）に加えｐＨを１０に調整し
た。ジオキサン−水中の活性化複合体溶液（１００μ
ｌ）を抗体溶液に加え４℃で１６時間反応させた。この
後、反応物にＢＳＡ（５ｍｇ）を加え、溶液を直ちに炭
酸バッファー（５００ｍｌ、２５ｍＭ、ｐＨ９）に対し
て透析した。透析バッファーは２４時間間隔で３回交換
した。
−ビス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）
２＋によるウサギ及びヒツジ抗マウスＩｇＧの標識化 ウサギ及びヒツジ抗体をＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌの溶液
とした。これ等の溶液を重炭酸ナトリウム（５００ｍ
ｌ、５０ｍＭ、ｐＨ９）に対して一晩透析した。その後
抗体（２ｍｇ）を重炭酸ナトリウム溶液で希釈し２ｍｌ
の最終容量とした。この溶液（１ｍｌ）を炭酸ナトリウ
ム溶液（１ｍｌ、５０ｍＭ）に加えｐＨを１０に調整し
た。ジオキサン−水中の活性化複合体溶液（１００μ
ｌ）を抗体溶液に加え４℃で１６時間反応させた。この
後、反応物にＢＳＡ（５ｍｇ）を加え、溶液を直ちに炭
酸バッファー（５００ｍｌ、２５ｍＭ、ｐＨ９）に対し
て透析した。透析バッファーは２４時間間隔で３回交換
した。
【００８１】実施例ＸＩ 蛍光光度測定分析による標識ウサギ及びヒツジ抗マウス
イムノグロブリンの免疫学的反応性のデモンストレーシ
ョン レジオネラ・ニューモフィラ１（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈ
ｉａ １単離体）のホルマリン化懸濁液をＰＢＳバッフ
ァーで希釈して光学密度１．００（４２５ｎｍ）に調整
した。この懸濁液の１．３希釈物（１ｍｌ）を一連の円
垂形マイクロ遠心分離管に入れた。細胞を遠心分離（１
０分、１００００ＲＰＭ）、上清を傾瀉して細胞をマウ
スモノクローナル１ｇＧ抗体を含むＰＢＳ（“１０Ｃ
８”０．８５ｍｇ／ｍ１）（１ｍｌ）あるいは陰性対照
としてのＰＢＳ中に１：１００希釈物として再懸濁し
た。室温で１時間インキュベートした後、細胞を先と同
じように遠心分離し、上清を傾瀉して細胞をＰＢＳバッ
ファー中に再懸濁し、再度遠心分離した。上清を傾瀉し
た後、細胞を貯蔵ルテニウム標識ウサギ及びヒツジ抗マ
ウスＩｇＧ抗体の１：５希釈物（ＰＢＳ中）（１ｍｌ、
１０ｍｇルテニウム複合体／ｍｌ）、あるいは陽性対照
としてフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の
１：５０希釈物（ＰＢＳ中）（１ｍｌ、０．５ｍｇＩｇ
Ｇ／ｍｌ）、あるいは陰性対照としてＰＢＳ中に再懸濁
した。室温で１時間インキュベートした後、前と同じよ
うに細胞を遠心分離して上清を傾瀉し、細胞をＰＢＳ中
に再懸濁して前のように遠心分離で２回洗浄した。最後
の洗浄の後細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁し、ポリ
スチレンキュベット中に移して蛍光光度測定分析に供し
た。
イムノグロブリンの免疫学的反応性のデモンストレーシ
ョン レジオネラ・ニューモフィラ１（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈ
ｉａ １単離体）のホルマリン化懸濁液をＰＢＳバッフ
ァーで希釈して光学密度１．００（４２５ｎｍ）に調整
した。この懸濁液の１．３希釈物（１ｍｌ）を一連の円
垂形マイクロ遠心分離管に入れた。細胞を遠心分離（１
０分、１００００ＲＰＭ）、上清を傾瀉して細胞をマウ
スモノクローナル１ｇＧ抗体を含むＰＢＳ（“１０Ｃ
８”０．８５ｍｇ／ｍ１）（１ｍｌ）あるいは陰性対照
としてのＰＢＳ中に１：１００希釈物として再懸濁し
た。室温で１時間インキュベートした後、細胞を先と同
じように遠心分離し、上清を傾瀉して細胞をＰＢＳバッ
ファー中に再懸濁し、再度遠心分離した。上清を傾瀉し
た後、細胞を貯蔵ルテニウム標識ウサギ及びヒツジ抗マ
ウスＩｇＧ抗体の１：５希釈物（ＰＢＳ中）（１ｍｌ、
１０ｍｇルテニウム複合体／ｍｌ）、あるいは陽性対照
としてフルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の
１：５０希釈物（ＰＢＳ中）（１ｍｌ、０．５ｍｇＩｇ
Ｇ／ｍｌ）、あるいは陰性対照としてＰＢＳ中に再懸濁
した。室温で１時間インキュベートした後、前と同じよ
うに細胞を遠心分離して上清を傾瀉し、細胞をＰＢＳ中
に再懸濁して前のように遠心分離で２回洗浄した。最後
の洗浄の後細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中に再懸濁し、ポリ
スチレンキュベット中に移して蛍光光度測定分析に供し
た。
【００８２】フルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗
体溶液の励起及び放射を精査したところ、４９１ｎｍに
励起ピーク、５１９ｎｍに放射ピークが観察された。こ
れ等の波長をフルオレセイン標識細胞の蛍光測定に使用
した。ルテニウム標識ウサギ／ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗
体溶液の励起及び放射を精査したところ、４５５ｎｍに
励起ピーク、６２３ｎｍに放射ピークが認められた。こ
れ等の波長をルテニウム標識細胞の蛍光測定に使用し
た。“１０Ｃ８”第１抗体及び蛍光性結合体の代りにＰ
ＢＳとインキュベートした細胞懸濁液を陰性コントロー
ルとし、蛍光光度計のブランクに使用した。“１０Ｃ
８”第１抗体と蛍光性結合体の両方と共にインキュベー
トした細胞懸濁液の蛍光を１００とし、その他の全ての
蛍光測定はこれ等の内部標準に対する相対的な蛍光単位
で行なった。表ＩＩに示した結果は、ルテニウム標識抗
マウスＩｇＧ結合体は蛍光を発し、“１０Ｃ８”第１抗
体の存在下で特異的な免疫学的反応性を示すことを表わ
している。
体溶液の励起及び放射を精査したところ、４９１ｎｍに
励起ピーク、５１９ｎｍに放射ピークが観察された。こ
れ等の波長をフルオレセイン標識細胞の蛍光測定に使用
した。ルテニウム標識ウサギ／ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗
体溶液の励起及び放射を精査したところ、４５５ｎｍに
励起ピーク、６２３ｎｍに放射ピークが認められた。こ
れ等の波長をルテニウム標識細胞の蛍光測定に使用し
た。“１０Ｃ８”第１抗体及び蛍光性結合体の代りにＰ
ＢＳとインキュベートした細胞懸濁液を陰性コントロー
ルとし、蛍光光度計のブランクに使用した。“１０Ｃ
８”第１抗体と蛍光性結合体の両方と共にインキュベー
トした細胞懸濁液の蛍光を１００とし、その他の全ての
蛍光測定はこれ等の内部標準に対する相対的な蛍光単位
で行なった。表ＩＩに示した結果は、ルテニウム標識抗
マウスＩｇＧ結合体は蛍光を発し、“１０Ｃ８”第１抗
体の存在下で特異的な免疫学的反応性を示すことを表わ
している。
【表２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/58 7055−2Ｊ
Claims (17)
- 【請求項１】 下記式 【化１】 （ここでｎは１、２または３の整数である）の構造を有
する化合物およびその塩類。 - 【請求項２】 下記式 【化２】 （ここでｎは１、２または３の整数である）の構造を有
する化合物およびその塩類。 - 【請求項３】 下記式 【化３】 （ここでｎは１、２または３の整数である）の構造を有
する化合物およびその塩類。 - 【請求項４】 下記式 【化４】 （ここでｎは１、２または３の整数である）の構造を有
する化合物およびその塩類。 - 【請求項５】 下記式 【化５】 （ここでｎは１、２または３の整数である）の構造を有
する化合物およびその塩類。 - 【請求項６】 下記式 【化６】 （ここでｎは１、２または３の整数である）の構造を有
する化合物およびその塩類。 - 【請求項７】 対イオンがＮＨ４ ＋、グアニジニウム、
Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋
もしくはＣｄ２＋カチオン、またはＯＨ−、Ｓ
Ｏ４ ２−、ハライド、カーボネート、へキサフルオロホ
スフェートもしくはテトラフルオロボレートアニオンで
ある請求項１、２、３、４、５または６の塩。 - 【請求項８】 次式を有する化学種 【化７】〔Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ
（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり、Ｐは
Ｍの多座配位リガンドであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、
Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はＭのリガンドであって各々同一
でもまたは互いに他のリガンドと異なっていてもよく、
Ｂは１個以上のアミド結合またはアミン結合を介して
Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５またはＬ６の１個以
上と共有結合している物質であり、ｍは１以上の整数で
あり、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは
整数であり、ｔは１以上の整数であり、ｕは１以上の整
数であり、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６お
よびＢは電磁放射線を放出させるべくこの化学種を誘導
できるような組成と数になっており、ＭのリガンドとＭ
との結合の総数はＭの配位数に等しい〕の存在を測定す
るためのシステムであって、 ａ）化学種を含む試薬混合物、 ｂ）化学種を誘導して電磁放射線を放出させるための手
段、および ｃ）放出された電磁放射線を検出するための手段 からなるシステム。 - 【請求項９】 化学種に結合する対象分析物の存在を測
定するためのシステムであって、前記種が構造式 【化８】〔Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ
（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり、Ｐは
Ｍの多座配位リガンドであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、
Ｌ４、Ｌ５およびＬ６はＭのリガンドであって各々同一
でもまたは互いに他のリガンドと異なってもよく、Ｂは
１個以上のアミド結合またはアミン結合を介してＰ、Ｌ
１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５またはＬ６の１個以上と共
有結合している物質であり、ｍは１以上の整数であり、
ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数で
あり、ｔは１以上の整数であり、ｕは１以上の整数であ
り、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＢ
は電磁放射線を放出させるべくこの化学種を誘導できる
ような組成と数になっており、ＭのリガンドとＭとの結
合の総数はＭの配位数に等しい〕を有しており、 ａ）化学種 ｂ）化学種を当該分析物に接触せしめて試薬混合物を形
成するための手段、 ｃ）化学種を誘導して電磁放射線を放出させるための手
段、および ｄ）放出された電磁放射線を検出するための手段 からなるシステム。 - 【請求項１０】 次式を有する化学種 【化９】〔Ｍ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ
（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、Ｍはルテニウムまたはオスミウムであり、Ｐは
Ｍの多座配位であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５お
よびＬ６はＭのリガンドであって各々同一でもまたは互
いに他のリガンドと異なっていてもよく、Ｂは１個以上
のアミド結合またはアミン結合を介してＰ、Ｌ１、
Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５またはＬ６の１個以上と共有結
合している物質であり、ｍは１以上の整数であり、ｎ、
ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの各々はゼロまたは整数であ
り、ｔは１以上の整数であり、ｕは１以上の整数であ
り、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＢ
は電磁放射線を放出させるべくこの化学種を誘導できる
ような組成と数になっており、ＭのリガンドとＭとの結
合の総数はＭの配位数に等しい〕と、各々異なる波長の
電磁放射線を放出させるべく誘導することができるいろ
いろな化学種の１種以上とからなる組成物。 - 【請求項１１】 前記化学種が各々異なる対象分析物に
結合している請求項１０の組成物。 - 【請求項１２】 試薬混合物が各々異なる波長の電磁放
射線を放出させるベく誘導することができるいろいろな
化学種も１種以上含む請求項８のシステム。 - 【請求項１３】 試薬混合物が、各々異なる波長の電磁
放射線を放出させるべく誘導することができるいろいろ
な化学種を１種以上含み、各々の種が異なる対象分析物
に結合している請求項９のシステム。 - 【請求項１４】 いろいろな化学種を異なる値のエネル
ギーまたは異なるエネルギー源からのエネルギーに曝露
することによって誘導して電磁放射線を放出させる請求
項１０の組成物。 - 【請求項１５】 化学種が各々異なる物質に結合してい
る請求項１４の組成物。 - 【請求項１６】 試薬混合物が、各々異なる値のエネル
ギーまたは異なるエネルギー源からのエネルギーに曝露
することによって誘導して電磁放射線を放出させること
ができるいろいろな化学種も１種以上含む請求項８のシ
ステム。 - 【請求項１７】 試薬混合物が、各々異なる値のエネル
ギーまたは異なるエネルギー源からのエネルギーに曝露
することによって誘導して電磁放射線を放出させること
ができるいろいろな化学種を１種以上含み、各々の種が
異なる対象分析物に結合している請求項９のシステム。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66698784A | 1984-10-31 | 1984-10-31 | |
| US789113 | 1985-10-24 | ||
| US06/789,113 US5238808A (en) | 1984-10-31 | 1985-10-24 | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
| US666987 | 1985-10-24 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60505060A Division JPH0826054B2 (ja) | 1984-10-31 | 1985-10-30 | 発光性金属キレ−ト標識及び検出手段 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6235511A Division JP2702075B2 (ja) | 1984-10-31 | 1994-09-29 | 発光性金属キレート標識及び検出手段 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0665271A true JPH0665271A (ja) | 1994-03-08 |
| JP2710534B2 JP2710534B2 (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=27099589
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60505060A Expired - Lifetime JPH0826054B2 (ja) | 1984-10-31 | 1985-10-30 | 発光性金属キレ−ト標識及び検出手段 |
| JP4351891A Expired - Lifetime JP2710534B2 (ja) | 1984-10-31 | 1992-11-19 | 発光性金属キレート標識及び検出手段 |
| JP6235511A Expired - Lifetime JP2702075B2 (ja) | 1984-10-31 | 1994-09-29 | 発光性金属キレート標識及び検出手段 |
| JP8194842A Expired - Lifetime JP2706650B2 (ja) | 1984-10-31 | 1996-07-24 | 発光性金属キレート標識及び検出手段 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60505060A Expired - Lifetime JPH0826054B2 (ja) | 1984-10-31 | 1985-10-30 | 発光性金属キレ−ト標識及び検出手段 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6235511A Expired - Lifetime JP2702075B2 (ja) | 1984-10-31 | 1994-09-29 | 発光性金属キレート標識及び検出手段 |
| JP8194842A Expired - Lifetime JP2706650B2 (ja) | 1984-10-31 | 1996-07-24 | 発光性金属キレート標識及び検出手段 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5238808A (ja) |
| EP (2) | EP0580979B1 (ja) |
| JP (4) | JPH0826054B2 (ja) |
| AT (2) | ATE230114T1 (ja) |
| AU (1) | AU5020085A (ja) |
| CA (1) | CA1339835C (ja) |
| DE (2) | DE3588243T2 (ja) |
| HK (2) | HK1007349A1 (ja) |
| IL (1) | IL76872A (ja) |
| WO (1) | WO1986002734A1 (ja) |
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| US5310687A (en) * | 1984-10-31 | 1994-05-10 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
| US5238808A (en) * | 1984-10-31 | 1993-08-24 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
| US5585279A (en) * | 1986-01-23 | 1996-12-17 | Davidson; Robert S. | Time-resolved luminescence binding assays using a fluorescent transition metal label other than ruthenium |
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| US6271041B1 (en) * | 1986-04-30 | 2001-08-07 | Igen International, Inc. | Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant |
| US5770459A (en) * | 1986-04-30 | 1998-06-23 | Igen International, Inc. | Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection |
| US6165729A (en) * | 1986-04-30 | 2000-12-26 | Hyperion Catalysis International, Inc. | Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant |
| US6451225B1 (en) * | 1986-04-30 | 2002-09-17 | Igen International, Inc. | Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant |
| US6316607B1 (en) | 1986-04-30 | 2001-11-13 | Igen International, Inc. | Electrochemiluminescent assays |
| US5591581A (en) * | 1986-04-30 | 1997-01-07 | Igen, Inc. | Electrochemiluminescent rhenium moieties and methods for their use |
| US6881536B1 (en) * | 1986-04-30 | 2005-04-19 | Bioveris Corporation | Particle based electrochemiluminescent assays |
| EP0265519B1 (en) * | 1986-04-30 | 1995-09-13 | IGEN, INC. (a California corporation) | Electrochemiluminescent assays |
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| US4855930A (en) * | 1987-03-27 | 1989-08-08 | Chimerix Corporation | Method and appartatus for improved time-resolved fluorescence spectroscopy |
| WO1988007670A2 (en) * | 1987-03-27 | 1988-10-06 | Chimerix Corporation | Time-resolved fluorescence apparatus and immunoassay |
| US6881589B1 (en) * | 1987-04-30 | 2005-04-19 | Bioveris Corporation | Electrochemiluminescent localizable complexes for assay compositions |
| US5935779A (en) * | 1988-11-03 | 1999-08-10 | Igen International Inc. | Methods for improved particle electrochemiluminescence assay |
| HU204856B (en) * | 1987-08-12 | 1992-02-28 | Orszagos Mueszaki Fejlesztesi | Process for releasing cell mixtures and tissues from undesired populations and for producing monoclonal antibody - hematoporphyrin conjugates |
| AU2827389A (en) * | 1987-11-04 | 1989-06-01 | Igen, Inc. | Electrochemiluminescent rhenium moieties and methods |
| SE8800613D0 (sv) * | 1988-02-23 | 1988-02-23 | Wallac Oy | A novel spectrofluorometric method and compounds that are of value for the method |
| US5308754A (en) * | 1988-03-21 | 1994-05-03 | Kankare Jouko J | Electrogenerated luminescence in solution |
| SE461117B (sv) * | 1988-03-21 | 1990-01-08 | Jouko J Kankare | Foerfarande foer bestaemning av koncentrationen av en luminiscerande lantanid foerening |
| US5093268A (en) * | 1988-04-28 | 1992-03-03 | Igen, Inc. | Apparatus for conducting a plurality of simultaneous measurements of electrochemiluminescent phenomena |
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