SE461117B - Foerfarande foer bestaemning av koncentrationen av en luminiscerande lantanid foerening - Google Patents

Description

461 117 10 15 20 25 30 2 helt och hållet genom användning av lämpliga luminiscens- föreningar med långvarig luminiscens samt genom mätning av ljusemissionen med en viss tidsfördröjning efter det att excitationspulsen upphört.

Elektrogenererad kemiluminiscens är känd sedan länge.

Dess användning vid immunanalys har föreslagits av Bard et al. (D. Ege, W. Becker and A. Bard, Anal.Cnem. 56 (1984) 2413). Bard et al. föreslår ruteniumbipyridinkomplex som markör vid immunanalys. Platina eller glaskarbon användes som material för arhetselektroden, och ljusemissionen från elektroden mätes under själva spänningspulsen.

Den elektrogenererade kemiluminiscensen hos ruteniumbi- pyridin är en anodisk process och således begränsad till an- vändandet av icke-oxiderbara elektrodmaterial såsom ädel- metaller och glaskarbon. Lösningarna som skall analyseras kan dessutom innehålla föroreningar som även alstrar elektro- genererad kemiluminiscens. Ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande som tillåter billiga elektroder, företrädesvis av engångs- typ, samt utnyttjar föreningar som uppvisar långvarig luminiscens och som är förhållandevis interferensfria. En dylik metod skulle finna användning vid exempelvis homogen eller heterogen immunanalys och kräva en tämligen enkel och billig instrumentering.

Uppfinningen avser en metod där luminiscens induceras på elektrodens yta eller i dess omedelbara närhet medelst en elektrisk puls, varefter den resulterande ljusemissionen mäts med en viss tidsfördröjning efter det att den elektriska pulsen upphört. Fenomenet som mätes kommer i det följande att kallas fördröjd elektroluminiscens.

Mätsystemet utgöres av en pulsgenerator, en potentiostat, en provcell med tvâ eller tre elektroder, eventuellt ett ljusfilter eller en monokromator, samt en ljusdetektor och 10 15 20 25 30 3 461 117 en grindstyrd integrator eller fotonräknare.

Pulsgeneratorn kan vara en godtycklig generator som kan alstra fritt programmerbara pulstàg med inställbar amplitud.

Potentiostaten kan vara en konventionell potentiostat med tre elektroder eller om endast tvâ elektroder användes en enkel hjälpförstärkare_söm kan avge en ström av nâgra tio- tals milliampere.

Provcellen och ljusdetektorn är inneslutna i samma ljus- täta kammare. Cellen har två eller tre elektroder nedsänkta i elektrolytlösningen. I fallet med tre elektroder är den ena elektroden en referenselektrod, medan den andra elektroden är en njälpelektrod och den tredje elektroden är en arbets- elektrod. Dessa är anslutna till potentiostaten på konven- tionellt sätt. Ljusemission mätes från arbetselektroden som består av ett ledande material. Ett föredraget material är en oxidbelagd metall, exempelvis aluminium eller tantal.

Referenselektroden kan utgöras av en godtycklig, konventionell referenselektrod, exempelvis en kalomelelektrod eller en Ag-AgCl-elektrod. Hjälpelektroden kan vara tillverkad av ett godtyckligt, ledande material, oftast platina. Om endast tvâ elektroder användes kan båda vara tillverkade av samma material, exempelvis aluminium, i vilket fall ljus kan fås att emitteras från båda elektroderna, eller den andra elektroden vara tillverkad av ett annat material.

Ljusintensiteten från arbetselektroden mäts medelst en fotomultiplikator eller en fotodiod, eventuellt med mellan- liggande filter eller monokromator, och den elektriska signalen matas till en grindstyrd integrator eller en grind- styrd fotonräknare. Grindstyrningen synkroniseras med pulserna från pulsgeneratorn.

Provet som skall mätas med avseende på dess fördröjda elektro- luminiscens är en förening som är löst i lösning eller ad- sorberad på arbetselektrodens yta. Föreningen skall ha en långsamt avklingande elektroluminiscens. Föredragna föreningar 461 117 10 l5 20 25 30 4 är komplex avluminiscentalantanádföreningar, företrädes- vis kelat såsom Tb3+ eller Bu3+, vilka har en avklingning inom millisekundområdet. Föreningen kan mätas som sådan eller densamma kan vara bunden såsom en markör vid materialet som skall analyseras. Utöver föreningen som skall mätas inne- håller elektrolytlösningen i provcellen viss elektrolyt, företrädesvis sulfat eller acetat, för att öka konduktivi- teten. En oxiderande förening såsom exempelvis peroxidisulfat, väteperoxid eller löst syre kan förekomma i lösningen.

Syftet med oxidationsmedlét är att alstra kraftigt reaktiva radikaler genom en direkt eller indirekt elektrolytiskt reduktion, exempelvis szoez' + e' -> 5042' + so4°" Dessa radikaler reagerar med den luminiscenta föreningen som alstrar ljusemissionen. Elektroluminiscensen observeras följaktligen efter en katodisk puls över arbetselektroden.

För vissa typer av lantanidföreningar kan anodiska pulser användas.

Ett tâg av pulser av lämplig varaktighet och pulskvot i beroende av den luminiscenta föreningen påtryckes över arbetselektroden. Den resulterande ljusemissionen mätes efter det att de katodiska pulserna upphört under användande av en lämplig grindbredd och fördröjning. För de föredragna terbiumkomplexen kan den katodiska pulsens varaktighet variera från 0,2 ms till 5 ms, medan fördröjningen efter pulsen uppgår till mellan 0,1 och 0,5 ms och grindbredden till ca 2 ms. För europiumkomplexen är dessa tider ca 4 ggr kortare. Den under den tid som grinden är öppen integrerade signalen medelvärdesberäknas under så många perioder som erfordras för uppnâende av önskat signal/brusförhâllande.

Exempel Provlösningen i exemplet är 0,1 M natriumsulfat, 0,001 M kaliumperoxidisulfat och 10-4 M 2,6-bis EN,N-bis(karboxi- u 10 15 461 117 5 metyl)aminometyl] -4-bensoilfenol (EP-A-68,875). Ökande mängder terbiumklorid tillsättes och den fördröjda elektro- luminiscensen mätes under användande av katodiska pulser med en varaktighet av 2 ms, en amplitud av 4 V och en puls- kvot av 25%. Integratorns grind öppnades 0,4 ms efter det att den katodiska pulsen upphört och hölls öppen under 2 ms.

Integratorns tidskonstant var 1 s.

Hittills har flera olika lantanidföreningar provats och _befunnits användbara vid förfarandet enligt uppfinningen, även om vissa föreningar befunnits vara overksamma. Varje förening måste således provas. Detta kan göras exempelvis genom användande av ett förfarande enligt ovanstående exempel. De variabler som måste kontrolleras är huruvida pulsen skall vara positiv eller negativ samt typen och mängden av oxidationsmedlet.

Claims (1)

1. 4 6 1 1 'MYATENTKRAV Förfarande för bestämning av koncentraticnen av en luminiscerande lantanidförening, företrädesvis ett luminiscerande lantanidkelat, exempelvis ett Tb3+- eller Eu3+-kelat, genom pâtrycxning av en elektrisk puls över en i lösning nedsänkt elektrod och mätning av ljusemissionen en viss tid efter det att pulsen upphört, varvid föreningen är bunden till elektroden och/eller förekommer i lösningen och det emitterade lfiuset utgör ett mått på mängden av föreningen intill elektroden.