KR20150097688A

KR20150097688A - 디술피드-연결 다가 ｍｈｃ 클래스 ｉ 포함 다관능 단백질

Info

Publication number: KR20150097688A
Application number: KR1020157019208A
Authority: KR
Inventors: 기 조르쥬; 자비네 임호프-융; 헨드릭 크뇌트겐; 마르티나 슈미트네겔
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2015-08-26
Also published as: SG11201504414UA; HK1214276A1; CA2889788A1; AU2013360775B2; JP6475167B2; WO2014096015A1; PL2935328T3; IL238499B; US20150344586A1; US10501521B2; RU2015129640A; MX361076B; EP2935328A1; AR094149A1; IL238499A0; MX2015007239A; ES2700984T3; JP2016501900A; EP2935328B1; AU2013360775A1

Abstract

본원에서는, 둘 이상의 항원 제시 도메인, 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 보고되며, 이때 상기 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 (i) β2-마이크로글로불린, 및 (ii) 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 또는 (i) T-세포 반응 유도 펩티드, (ii) β2-마이크로글로불린, 및 (iii) 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 을 포함하고, 상기 항원 결합 부위는 암 세포 표면 항원 또는 바이러스-감염 세포 표면 항원에 결합하고, 상기 항원 제시 도메인은 사슬내/도메인간 디술피드 결합을 형성하는 2 개 이상의 비-자연 발생 시스테인 잔기를 갖는다.

Description

디술피드-연결 다가 ＭＨＣ 클래스 Ｉ 포함 다관능 단백질 {DISULFIDE-LINKED MULTIVALENT MHC CLASS I COMPRISING MULTI-FUNCTION PROTEINS}

본원은 항체 단편 및 하나, 둘 또는 그 이상의 디술피드-연결 MHC 클래스 I 성분을 포함하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 및 순환하는 바이러스-특이적 세포독성 T-세포의 표적화된 유도에 의해 암 세포 또는 바이러스 감염 세포를 제거하기 위한 이의 용도를 보고한다.

MHC 클래스 I 단백질은 α-사슬 (α-1 내지 3 및 막관통 도메인) 및 β-마이크로글로불린으로 이루어진다. 이는 6 개의 상이한 MHC 클래스 I 단백질 α-사슬 (인간에서 2 개 HLA-A, 2 개 HLA-B, 2 개 HLA-C) 이 생기게 하는 다유전자성이다 (반수체 게놈에서의 MHC-클래스 I 단백질에 대한 3 개 유전자의 유전자좌). MHC 는 또한 다형성이다. 인간 HLA-A 대립형질 A*0201 은 백인 인구집단의 약 30% 내지 50% 에서 흔하다 (예를 들어, Player, et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19 (1996) 357-363 참조).

인간 거대세포 바이러스 huCMV (= 인간 헤르페스바이러스 5, HHV-5) 는 가장 큰 인간 바이러스 중 하나이다. 이의 게놈은 대략 230,000 bp 선형 이중가닥 DNA 를 포함하며 160 개 초과의 단백질을 인코딩한다 (예를 들어, Davison, A.J., et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 17-28 참조).

CMV 는 인간 게놈의 거대 기생충이 되도록 진화해왔으며 면역계의 모든 완부 (arm) 로부터 강력한 면역 반응을 촉발시킨다. 상기 바이러스는 인간 면역계에 알려져 있는 것들 중에 가장 면역우성의 항원인 것으로 나타나며 전례 없는 규모의 CD8⁺-T-세포 반응을 자극한다.

CMV "잠복기" 는 바이러스 전사 패턴에서의 변화보다는 CMV 바이러스의 장기 면역 억제에 따라 좌우된다 (예를 들어, Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464 참조).

CD8⁺-T-세포 면역 반응은 모든 CMV 단백질에 고르게 유도되는 것이 아니라 집중된다. CMV 단백질 pp65 및 IE-1 은 우세한 표적이다 (예를 들어, McLaughlin-Taylor, E., et al., J. Med. Virol. 43 (1994) 103-110; Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464 참조).

CMV-특이적 T-세포의 빈도는 개별적 펩티드에 대해 CD8⁺-T-세포 레퍼토리의 대략 1 내지 2% 이하의 매우 높은 빈도를 갖는다 (예를 들어, Moss & Khan, Human Immunology supra; Wills, M.R., et al., J. Virol. 70 (1996) 7569-7579 참조).

CMV-특이적 CD8⁺-T-세포 반응은 연령 및 총 CD8⁺-T-세포 풀 (pool) 의 10% 초과로 빈번히 발생하는 개별적 HLA-펩티드 사량체로 인해 현저히 증가한다 (예를 들어, Khan, N., et al., J. Immunol. 169 (2002) 1984-1992 참조).

건강한 노인 공여자에서의 총 CD8⁺-T-세포 반응은 CD8⁺-T-세포 레퍼토리의 대략 50% 를 구성할 수 있다.

막대한 CD8⁺-T-세포 확장은 종종 클론에 의해 제한되며, 이것이 노화에 따라 말초 혈액에서 나타나는 클론 CD8⁺-T-세포 팽창의 30% 이상의 원인이라는 것이 예측된다. 총 CD8⁺-T-세포 계수는 CMV-혈청반응 음성 코호트와 비교하여 60 세 이상의 CMV-혈청반응양성 공여자에서 2 배 더 높다 (예를 들어, Looney, R.J., et al., Clin. Immunol. 90 (1999) 213-219 참조).

가용성 HLA 및 β-2-마이크로글로불린의 융합이 Mottez et al. (Eur. J. Immunol. 21 (1991) 467-471); Godeau et al. (J. Biol. Chem. 267 (1992) 24223-24229) 및 Mage et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992) 10658-10662) 에 으해 보고되어 있다. 바이러스-유래 펩티드와 가용성 HLA 및 β-2-마이크로글로불린의 융합이 Mottez et al. (J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502) 에 의해 보고되어 있다. 면역글로불린 중쇄와 가용성 HLA 및 동시발현 β-2-마이크로글로불린의 융합이 Dal Porto et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6671-6675) 에 의해 보고되어 있다. Fab 에 화학적으로 커플링된 스트렙타비딘을 갖는 비오틴화 펩티드-가용성 HLA 및 β-2-마이크로글로불린의 사량체성 다관능 단백질이 Robert et al. (Eur. J. Immun. 30 (2000) 3165-3170) 에 의해 기재되어 있다. 바이러스-유래 펩티드와 가용성 HLA 및 β-2-마이크로글로불린의 융합물과 화학적으로 커플링된 Fab 가 Robert et al. (Cancer Immunity 1 (2001) 2) 에 의해 보고되어 있다. 쥐과 단일클론 항체 중쇄에 대한 가용성 HLA 및 β-2-마이크로글로불린과 바이러스-유래 펩티드의 융합이 Greten et al. (J. Immunol. Methods 271 (2002) 125-135) 에 의해 보고되어 있다. 펩티드, 시험관내 리폴딩 및 펩티드 로딩이 없는 scFv 웅합물의 대장균 발현이 Lev et al. (J. Immunol. 169 (2002) 2988-2996; Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (2004) 9051-9056), 및 Novak et al. (Int. J. Cancer 120 (2006) 329-336) 에 의해 보고되어 있다. 스트렙타비딘 융합 Fab 또는 scFv 항체에 커플링되고 펩티드로 로딩된 비오틴화 가용성 MHC 의 용도가 Mous et al. (Leukemia 20 (2006) 1096-1102) 에 의해 보고되어 있다.

WO 2005/099361 에서는 개질된 베타-2-마이크로글로불린과의 MHC 클래스 I - 펩티드-항체 접합체가 보고되어 있다. WO 2005/099361 에 보고된 바와 같은 예시적 접합체는 MHC-다관능 단백질의 알파 사슬 (HLA) 의 시험관내 접합 또는 동일 세포에서의 별개 유전자로부터의 동시 발현에 의해 수득된다.

US 2004/0091488 에서는 특이적 운반체 분자를 갖는 주조직적합성 다관능 단백질 클래스 I 항원의 항원성 구축물이 보고되어 있다. 이러한 보고된 융합 폴리펩티드는 힌지 부위를 갖지 않는다.

WO 99/13095 에서는 항원-특이적 T 세포-의존적 면역 반응을 검출하고, 활성화시키거나 억제하기 위한 다가 키메라 펩티드-로딩된 MHC/IG 분자의 용도가 보고되어 있다. 암 치료에 특히 유용한, 면역 소모를 위한 방법 및 약학 조성물이 WO 02/102299 에 보고되어 있다. Oelke, M., et al. (Nat. Med. 9 (2003) 619-624) 은 HLA-Ig 코팅된 인공 항원 제시 세포에 의한 항원-특이적 세포독성 T 세포의 생체외 유도 및 확장을 보고하고 있다. 복합체를 포함하는 MHC 클래스 I 을 사용하여 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 순환시켜 표적 세포를 제거하는 것이 WO 2012/175508 에 보고되어 있다. Robert, B., et al. (Eur. J. Immunol. 30 (2000) 3165-3170) 은 항체-접합된 MHC 클래스 I 사량체가 T 림프구에 의한 특이적 용해에 대해 종양 세포를 표적화할 수 있다는 것을 보고하고 있다.

본원에서는, 한 구현예에서는 하나, 둘 또는 그 이상의, 또 다른 구현예에서는 둘 또는 넷의 항원 제시 도메인을 제 1 부분으로서, 하나의 항체 Fc-부위를 제 2 부분으로서, 및 항체로부터 유래되며 표적 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 제 3 부분으로서 포함하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 보고하고 있다.

본원에 보고된 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질로, 개인의 현존 바이러스-특이적 순환 세포독성 T-세포 (T-메모리-세포 및/또는 T-효가기-세포) 는 표적 항원을 발현하는 세포에 유도될 수 있으며, 이에 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 항체 유래 부분이 특이적으로 결합한다. 그 후 이러한 세포를 MHC 클래스 I 복합체로 균포화함으로써, MHC 클래스 I 단백질 다관능 단백질에 연결된 바이러스-유래 펩티드에 의한 급성 바이러스 감염이 모방되고 세포독성 세포가 유도되어, 표적화된 세포가 제거된다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이고:

- 하나, 둘 또는 둘 초과의 항원 제시 도메인,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 서로 독립적으로 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하고:

(i) β2-마이크로글로불린, 및

(ii) 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

(iii) 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

또는

(i) 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및

(ii) β2-마이크로글로불린,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및

(iii) β2-마이크로글로불린,

이때, 상기 항원 결합 부위(들) 는 암 세포 표면 항원 또는 바이러스-감염 세포 표면 항원에 결합하고,

상기 항원 제시 도메인은 사슬내/도메인간 디술피드 결합을 형성하는 둘 이상의 비-자연 발생 시스테인 잔기를 갖는다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인 내 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 T-세포 반응 유도 펩티드 사이의 링커 내에 있으며 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 중 하나 내에 있다. 한 구현예에서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에 시스테인 잔기를 가지며 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다 (위치 11 은 링커의 위치 2 에 상응하고; 위치 227 은 SEQ ID NO: 72 또는 SEQ ID NO: 140 의 위치 84 에 상응함).

한 구현예에서 항원 제시 도메인 내의 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 T-세포 반응 유도 펩티드 사이의 링커 내에 있으며 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 중 하나 내에 있다. 한 구현예에서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에 시스테인 잔기를 가지며 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다 (위치 11 은 링커의 위치 2 에 상응하고; 위치 108 은 SEQ ID NO: 71 의 위치 84 에 상응함).

한 구현예에서 항원 제시 도메인 내의 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 T-세포 반응 유도 펩티드 사이의 링커 내에 있으며 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 β2-마이크로글로불린 내에 있다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인 내의 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 T-세포 반응 유도 펩티드 사이의 링커 내에 있으며 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기는 β2-마이크로글로불린 사이의 링커 및 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1 내에 있다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 제 1 및 제 2 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하며, 이로써 항원 결합 부위 또는 항원 결합 부위들 중 하나는 제 1 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하고, 존재하는 경우, 제 2 항원 결합 부위는 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 항원 결합 부위는 하기를 포함한다: i) 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 (동족) 쌍 (이로써 개별 사슬이 야생형 사슬 또는 개질된 사슬 (치환, 돌연변이화 또는 도메인 교환된) 일 수 있음), 또는 ii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFv 항체 단편 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFv 융합 폴리펩티드, 또는 iii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFab 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFab 융합 폴리펩티드.

한 구현예에서 항원 결합 부위는 서로 독립적으로 하기를 포함한다: i) 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 (동족) 쌍 (이로써 개별 사슬이 야생형 사슬 또는 개질된 사슬 (치환, 돌연변이화 또는 도메인 교환된) 일 수 있음), 또는 ii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFv 항체 단편 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFv 융합 폴리펩티드, 또는 iii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFab 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFab 융합 폴리펩티드.

한 구현예에서 i) 항원 제시 도메인은 항원 결합 부위의 중쇄의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 연결되거나 (하나의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), ii) 하나의 항원 제시 도메인은 각 항원 결합 부위의 중쇄의 각 N-말단 또는 경쇄의 각 N-말단에 연결되거나 (2 개의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), iii) 항원 제시 도메인은 항원 결합 부위의 중쇄의 C-말단 또는 경쇄의 C-말단에 연결되거나 (하나의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), vi) 하나의 항원 제시 도메인은 각 항원 결합 부위의 중쇄의 각 C-말단 또는 경쇄의 각 C-말단에 연결되거나 (2 개의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), v) 항원 제시 도메인은 scFv 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나 (하나의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), vi) 하나의 항원 제시 도메인은 각 scFv 융합 폴리펩티드의 각 N- 또는 C-말단에 연결되거나 (2 개의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), vii) 항원 제시 도메인은 scFab 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나 (하나의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), viii) 하나의 항원 제시 도메인은 각 scFab 융합 폴리펩티드의 각 N- 또는 C-말단에 연결되거나 (2 개의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), ix) 항원 제시 도메인은 제 2 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나 (하나의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우), x) 하나의 항원 제시 도메인은 제 1 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되고 하나의 항원 제시 도메인은 제 2 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결된다 (2 개의 항원 제시 도메인이 존재하는 경우).

한 구현예에서 세포 표면 항원은 암 세포 표면 항원이다. 한 구현예에서 암 세포 표면 항원은 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 이다.

한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 공유 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다.

한 구현예에서 T-세포 반응 유도 펩티드는 바이러스-유래 펩티드이다. 한 구현예에서 T-세포 반응 유도 펩티드는 CD8⁺-T-세포 반응 유도 펩티드이다.

한 구현예에서 바이러스는 인간 거대세포 바이러스, 아데노바이러스, 인간 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 2, 인간 헤르페스바이러스 4 (엡스테인-바 바이러스), 간염-B-바이러스, 간염-C-바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종 바이러스 유형 16, 인간 유두종 바이러스 유형 18, 인간 유두종 바이러스 유형 31, 인간 유두종 바이러스 유형 33, 인간 유두종 바이러스 유형 35, 인간 유두종 바이러스 유형 39, 인간 유두종 바이러스 유형 45, 인간 유두종 바이러스 유형 51, 인간 유두종 바이러스 유형 52, 인간 유두종 바이러스 유형 56, 인간 유두종 바이러스 유형 58, 인간 유두종 바이러스 유형 59, 인간 유두종 바이러스 유형 68, 인간 유두종 바이러스 유형 73, 인간 유두종 바이러스 유형 82, 인간 T-세포 림프친화 바이러스 유형 I, 인간 인플루엔자 A 바이러스, 인간 인플루엔자 B 바이러스, 백시니아 바이러스, 뎅기열 바이러스에서 선택된다.

한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 펩티드 NLVPMVATV (SEQ ID NO: 01), VTEHDTLLY (SEQ ID NO: 02), NTDFRVLEL (SEQ ID NO: 03), CVETMCNEY (SEQ ID NO: 04), VLEETSVML (SEQ ID NO: 05), NLVPMVATV (SEQ ID NO: 06), RIFAELEGV (SEQ ID NO: 07), IIYTRNHEV (SEQ ID NO: 08), VLAELVKQI (SEQ ID NO: 09), AVGGAVASV (SEQ ID NO: 10), TVRSHCVSK (SEQ ID NO: 11), IMREFNSYK (SEQ ID NO: 12), GPISHGHVLK (SEQ ID NO: 13), ATVQGQNLK (SEQ ID NO: 14), VYALPLKML (SEQ ID NO: 15), AYAQKIFKIL (SEQ ID NO: 16), QYDPVAALF (SEQ ID NO: 17), YVKVYLESF (SEQ ID NO: 18), DIYRIFAEL (SEQ ID NO: 19), VFETSGGLVV (SEQ ID NO: 20), KARDHLAVL (SEQ ID NO: 21), QARLTVSGL (SEQ ID NO: 22), KARAKKDEL (SEQ ID NO: 23), QIKVRVDMV (SEQ ID NO: 24), RRRHRQDAL (SEQ ID NO: 25), ARVYEIKCR (SEQ ID NO: 26), KMQVIGDQY (SEQ ID NO: 27), NVRRSWEEL (SEQ ID NO: 28), CPSQEPMSIYVY (SEQ ID NO: 29), KPGKISHIMLDVA (SEQ ID NO: 30), ELRRKMMYM (SEQ ID NO: 31), IPSINVHHY (SEQ ID NO: 32), FEQPTETPP (SEQ ID NO: 33), YAYIYTTYL (SEQ ID NO: 34), QEFFWDANDIY (SEQ ID NO: 35), YEQHKITSY (SEQ ID NO: 36), QEPMSIYVY (SEQ ID NO: 37), SEHPTFTSQY (SEQ ID NO: 38), QAIRETVEL (SEQ ID NO: 39), TRATKMQVI (SEQ ID NO: 40), DALPGPCI (SEQ ID NO: 41), CEDVPSGKL (SEQ ID NO: 42), HERNGFTVL (SEQ ID NO: 43), PTFTSQYRIQGKL (SEQ ID NO: 44), QMWQARLTV (SEQ ID NO: 45), HELLVLVKKAQL (SEQ ID NO: 46), or DDYSNTHSTRYV (SEQ ID NO: 47), SLYNTVATL (SEQ ID NO: 48), GLCTLVAML (SEQ ID NO: 49), GILGFVFTL (SEQ ID NO: 50), STNRQSGRQ (SEQ ID NO: 51), LLFGYPVYV (SEQ ID NO: 52), FAEGFVRAL (SEQ ID NO: 53), LIVIGILIL (SEQ ID NO: 54), or ILHTPGCV (SEQ ID NO: 55), WYAQIQPHW (SEQ ID NO: 56), AFSGVSWTM (SEQ ID NO: 57), ILIGVVITW (SEQ ID NO: 58), MMIPTVVAF (SEQ ID NO: 59), PFPQSNAPI (SEQ ID NO: 60), LLLTLLATV (SEQ ID NO: 61), IVLEHGSCV (SEQ ID NO: 62), LLFKTENGV (SEQ ID NO: 63), PLNEAIMAV (SEQ ID NO: 64), NLVRLQSGV (SEQ ID NO: 65), LVISGLFPV (SEQ ID NO: 66), LLLVAHYAI (SEQ ID NO: 67), LALLAAFKV (SEQ ID NO: 68), VILAGPMPV (SEQ ID NO: 69), HVLGRLITV (SEQ ID NO: 70), 또는 1 내지 3 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체에서 선택된다.

한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 인간 거대세포 바이러스-유래 펩티드이다. 한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 SEQ ID NO: 01 ~ SEQ ID NO: 70 의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 SEQ ID NO: 01 ~ SEQ ID NO: 47 의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 갖는다.

한 구현예에서 상대 빈도 1% 이상의 클래스 I MHC 분자는 상대 빈도 10% 이상을 갖는다.

한 구현예에서 상대 빈도 1% 이상의 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*0201, 또는 HLA-A*1101, 또는 HLA-A*2402, 또는 HLA-A*340101, 또는 HLA-C*0304, 또는 HLA-C*0401, 또는 HLA-C*0702 이다.

한 구현예에서 상대 빈도 1% 이상의 클래스 I MHC 분자는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 투여되는 개인의 지역에 따라 하기와 같이 선택된다:

- 유럽인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*4402, HLA-C*0401, HLA-C*0501, HLA-C*0701, 및 HLA-C*0702 를 포함하는 군에서 선택되고,

- 호주인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-B*1301, HLA-B*1521, HLA-B*5601, HLA-B*5602, HLA-C*0102, HLA-C*0401, HLA-C*0403, 및 HLA-C*1502 를 포함하는 군에서 선택되고,

- 북아메리카인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*0201, HLA-A*2402, HLA-C*0202, HLA-C*0304, HLA-C*0401, 및 HLA-C*0702 를 포함하는 군에서 선택되고,

- 동남아시아인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-B*1504, HLA-C*0102, HLA-C*0304, HLA-C*0702, 및 HLA-C*0801 을 포함하는 군에서 선택된다.

- 유럽인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*0201 이고,

- 호주인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*2402, HLA-B*1301, HLA-C*0102, 및 HLA-C*0401 를 포함하는 군에서 선택되고,

- 북아메리카인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*2402, 및 HLA-C*0304 를 포함하는 군에서 선택되고,

- 동남아시아 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*2402 이다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 T-세포 반응 유도 펩티드, β2-마이크로글로불린 및 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 을 포함하며, 여기서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 T-세포 반응 유도 펩티드, 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 및 β2-마이크로글로불린을 포함하며, 여기서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 T-세포 반응 유도 펩티드, β2-마이크로글로불린 및 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 를 포함하며, 여기서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 T-세포 반응 유도 펩티드, 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 및 β2-마이크로글로불린을 포함하며, 여기서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다.

한 구현예에서 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자는 HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA-B*6701, 및 HLA-B*7802 를 포함하는 군에서 선택된다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 하기를 포함한다:

(i) 바이러스-유래 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린,

(iii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201, 및

(iv) 적어도 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 하기를 포함한다:

(i) 바이러스-유래 펩티드,

(ii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201, 및

(iii) β2-마이크로글로불린,

(iv) 적어도 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

한 구현예에서 β2-마이크로글로불린은 인간 β2-마이크로글로불린이다.

한 구현예에서 β2-마이크로글로불린은 야생형 인간 β2-마이크로글로불린이다.

한 구현예에서 β2-마이크로글로불린은 SEQ ID NO: 71 의 아미노산 서열 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체로 이루어진다.

한 구현예에서 β2-마이크로글로불린은 인간 β2-마이크로글로불린이고 상대 빈도 10% 이상인 클래스 I MHC 분자는 인간 HLA-A*0201 이다.

한 구현예에서 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 은 SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체로 이루어진다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 발생 상대 빈도 1% 미만인 β2-마이크로글로불린 및 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 을 포함하고, 여기서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 발생 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 및 β2-마이크로글로불린을 포함하고, 여기서 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다.

한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 제 1 링커 펩티드를 통해 β2-마이크로글로불린에 융합된다.

한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 β2-마이크로글로불린의 N-말단에 융합된다.

한 구현예에서 β2-마이크로글로불린은 제 2 링커 펩티드를 통해 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1 에 융합된다.

한 구현예에서 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α3 은 제 3 링커 펩티드를 통해 디술피드-연결 폴리펩티드 사슬 중 하나에 융합된다.

한 구현예에서 제 1, 제 2 및 제 3 링커 펩티드는 동일하거나 상이하다.

한 구현예에서 제 1 링커 펩티드, 제 2 링커 펩티드, 및 제 3 링커 펩티드는 서로 독립적으로 아미노산 서열 GS (SEQ ID NO: 73), GGS (SEQ ID NO: 74), GSG (SEQ ID NO: 136), GGGS (SEQ ID NO: 75), GGGSGGGS (SEQ ID NO: 76), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 77), GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 78), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 79), GGGGS (SEQ ID NO: 80), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 81), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 82), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 83), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 84), 및 GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 139) 에서 선택된다.

모든 측면의 한 구현예에서 제 1 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 139 의 아미노산 서열을 포함한다.

모든 측면의 한 구현예에서 제 2 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 83 의 아미노산 서열을 포함한다.

모든 측면의 한 구현예에서 제 3 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 136 의 아미노산 서열을 포함한다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함한다:

(i) SEQ ID NO: 01 ~ SEQ ID NO: 70 을 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84, 및 139 를 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 1 링커 펩티드,

(iii) SEQ ID NO: 71 의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린,

(iv) SEQ ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 및 84 를 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 2 링커 펩티드,

(v) SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열을 갖는 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

(vi) SEQ ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84, 및 136 을 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 3 링커 펩티드, 및

(vii) 적어도 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합.

(iii) SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열을 갖는 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

(iv) SEQ ID NO: 71 의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린,

(v) SEQ ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 및 84 를 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 2 링커 펩티드,

(vii) 적어도 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합.

한 구현예에서

- 제 1 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 139 의 서열을 갖고/갖거나,

- 제 2 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 83 의 아미노산 서열을 갖고/갖거나,

- 제 3 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 136 의 아미노산 서열을 갖는다.

한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 항원 제시 도메인이 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(iii) SEQ ID NO: 71 의 아미노산 서열 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체를 갖는 β2-마이크로글로불린,

(v) SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체를 갖는 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

(iii) SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체를 갖는 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

(iv) SEQ ID NO: 71 의 아미노산 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체를 갖는 β2-마이크로글로불린,

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 클래스 IgG 또는 클래스 IgE 의 인간 항체의 항체 Fc-부위에서 선택된다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 서브클래스 IgG1, 또는 IgG2, 또는 IgG3, 또는 IgG4 의 인간 항체의 항체 Fc-부위에서 선택된다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 서브클래스 IgG1 또는 IgG2 의 인간 항체의 것이며 E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330, 및/또는 P331 에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다 (번호화는 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 서브클래스 IgG1 또는 인간 서브클래스 IgG2 의 인간 항체의 것이며 이는 돌연변이 L234A 및 L235A, 및/또는 돌연변이 D265A 및 N297A 를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 함유하고/함유하거나 돌연변이 P329G 를 함유한다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 돌연변이 L234A 및 L235A 및/또는 P329G 를 갖는 서브클래스 IgG1 의 인간 항체의 것이다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 돌연변이 S228P 및/또는 L235E 를 갖는 서브클래스 IgG4 의 인간 항체의 것이다.

한 구현예에서 제 1 및 제 2 항체 Fc-부위 폴리펩티드는 서로 독립적으로 SEQ ID NO: 87 ~ 101 을 포함하는 군에서 선택된다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 SEQ ID NO: 94 의 아미노산 서열을 갖는 2 개의 Fc-부위 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 SEQ ID NO: 100 의 아미노산 서열을 갖는 2 개의 Fc-부위 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 SEQ ID NO: 101 의 아미노산 서열을 갖는 2 개의 Fc-부위 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 SEQ ID NO: 89 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 Fc-부위 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 90 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 SEQ ID NO: 97 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 Fc-부위 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 98 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 SEQ ID NO: 102 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 Fc-부위 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 103 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다:

- 서로 독립적으로 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 1 또는 2 개의 항원 제시 도메인:

(i) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(ii) β2-마이크로글로불린,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) β2-마이크로글로불린,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 또는 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고, 위치 11 및 위치 108 또는 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

본원에 보고한 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다:

- N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 1 또는 2 개의 항원 제시 도메인:

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및

(ii) β2-마이크로글로불린,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

(iii) SEQ ID NO: 72 의 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 72 의 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및

(iii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 2 개의 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하며, 이에 대해 제 1 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 97 의 아미노산 서열을 갖고 제 2 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 98 의 아미노산 서열을 갖는, 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 72 의 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

(iii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 2 개의 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하며, 그에 대해 제 1 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 97 의 아미노산 서열을 갖고 제 2 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 98 의 아미노산 서열을 갖는, 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 2 개의 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하며, 이에 대해 제 1 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 102 의 아미노산 서열을 갖고 제 2 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 103 의 아미노산 서열을 갖는, 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- SEQ ID NO: 104 ~ 106 에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인, 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 하나 이상의 항원 결합 부위 (이는 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합함).

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 104 ~ 106 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하는, 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, 각각 SEQ ID NO: 105 ~ 107 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 110 ~ 112 를 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하는, 2 개의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 105 ~ 107 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 110 ~ 112 를 포함 하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위가 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드 중 하나인, 하나 이상의 항원 결합 부위.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 104 ~ 106 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위가 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드 중 하나인, 하나 이상의 항원 결합 부위,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 가변 도메인 중 하나의 N-말단에 연결된다.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, 각각 SEQ ID NO: 104 ~ 106 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위가 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드인, 2 개의 항원 결합 부위,

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, 각각 SEQ ID NO: 105 ~ 107 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 110 ~ 112 를 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위가 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드인, 2 개의 항원 결합 부위,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 중쇄 가변 도메인 중 하나의 N-말단에 연결된다.

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, 각각 SEQ ID NO: 105 ~ 107 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 110 ~ 112 를 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 항체 중쇄의 Fc-부위가 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드인, 2 개의 항원 결합 부위,

- SEQ ID NO: 117 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 118 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

- SEQ ID NO: 137 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 118 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 117 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 118 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

- SEQ ID NO: 137 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 118 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 117 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 137 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 117 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 137 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- 각 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는, SEQ ID NO: 108 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 및 SEQ ID NO: 109 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 SEQ ID NO: 110 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는, SEQ ID NO: 104 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는, SEQ ID NO: 108 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; SEQ ID NO: 109 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; SEQ ID NO: 110 이 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 104 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는, SEQ ID NO: 111 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, SEQ ID NO: 112 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 SEQ ID NO: 110 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는, SEQ ID NO: 107 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는, SEQ ID NO: 111 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; SEQ ID NO: 112 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; SEQ ID NO: 110 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 107 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는, SEQ ID NO: 114 의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 113 의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는 SEQ ID NO: 114 의 항체 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 113 의 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는 SEQ ID NO: 114 및 SEQ ID NO: 113 을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는 SEQ ID NO: 116 의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 115 의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는 SEQ ID NO: 116 의 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 115 의 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.

한 구현예에서 MCSP 결합 부위는 SEQ ID NO: 116 및 SEQ ID NO: 115 를 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 MCSP 에 결합하는 단리된 항체의 결합 특이부를 포함하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질, 즉 HVR 또는 가변 도메인을 제공한다. 특히, 본원에 제공된 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에 포함되는 항-MCSP 항체 결합 특이부, 즉 HVR 또는 가변 도메인은 인간 MCSP 의 멤브레인 근부 에피토프에 결합한다. [Staub, E., et al. (FEBS Lett. 527 (2002) 114-118)] 에서 토의된 바와 같이, MCSP 의 막 근부 부위는 다수의 신규 반복 도메인 (CSPG 반복 도메인으로도 지칭) 으로 이루어진다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 인코딩하는 핵산이다.

한 구현예에서 핵산은 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 구조 유전자를 포함하는 2 내지 4 개 발현 카세트를 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 본원에 보고한 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 생성되도록 본원에서 보고한 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 생성 방법이다.

한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 세포 또는 배양 배지로부터 회수되고 이로써 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 생성된다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.

한 구현예에서 약학 제형은 추가적인 치료제를 추가로 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 약제로서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 암 치료에서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적에 유도하는데 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 암 세포의 배제 (제거) 에 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 바이러스-감염 세포의 배제 (제거) 에 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 약제의 제조에서의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 용도이다.

한 구현예에서 약제는 암 치료를 위한 것이다.

한 구현예에서 약제는 바이러스 감염 치료를 위한 것이다.

한 구현예에서 약제는 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적에 유도하기 위한 것이다.

한 구현예에서 약제는 암 세포의 배제 (제거) 를 위한 것이다.

한 구현예에서 약제는 바이러스 감염 세포의 배제 (제거) 를 위한 것이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 개인에게 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸린 개인의 치료 방법이다.

한 구현예에서 상기 방법은 개인에게 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 개인에게 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 바이러스 감염된 개인의 치료 방법이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 개인에게 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 투여하여 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적에 유도하는 것을 포함하는, 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 개인에서의 표적에 유도하는 방법이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 개인에게 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 투여하여 암 세포를 제거/분해하는 것을 포함하는, 개인에서의 암 세포 제거 방법이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 개인에게 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 투여하여 바이러스-감염 세포를 제거/분해하는 것을 포함하는, 개인에서의 바이러스-감염 세포 제거 방법이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 i) β2-마이크로글로불린 및 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 의 융합 폴리펩티드, ii) 각각 항체 힌지 부위를 포함하는 디술피드-연결 폴리펩티드 사슬의 한 쌍, 및 iii) 진핵 세포에서 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인의 하나 이상의 쌍을 포함하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 재조합체 생성 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하고: i) 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계, 및 ii) 세포 또는 배양 배지로부터 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 회수하는 단계, 이때 상기 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 및 β2-마이크로글로불린의 하나, 둘 또는 그 이상의 디술피드-연결 융합 폴리펩티드를 포함하고, 상기 디술피드 결합은 잔기 11 과 227 사이에 존재한다.

한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 하나의 MHC-유래 폴리펩티드 또는 MHC-유래 분자를 포함하는 하나의 융합 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 2 개의 MHC-유래 폴리펩티드 또는 MHC-유래 분자를 포함하는 2 개의 융합 폴리펩티드를 포함한다.

한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 배양 배지에서 1 mg/L 이상의 농도로 수득된다. 한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 배양 배지에서 4 mg/L 이상의 농도로 수득된다.

한 구현예에서 진핵 세포는 포유류 세포이다. 한 구현예에서 포유류 세포는 인간 배아 신장 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포, 또는 햄스터 새끼 신장 세포, 또는 마우스 골수종 세포이다.

하기 구현예는 본원에 보고한 바와 같은 임의 하나의 측면과 조합될 수 있다. 또한 본원에 보고한 바와 같은 임의의 구현예는 본원에 보고한 바와 같은 임의의 기타 구현예 또는 구현예의 조합물과 조합될 수 있다.

도 1: 본원에서 보고한 바와 같은 예시적 디술피드-연결 2 가 디술피드-연결 다가 다관능 단백질; HLA-Fc-부위 융합 폴리펩티드 N- 에서 C-말단 서열: 1-2-3-4-5-6-(3-6 디술피드 결합)-7-8-9-12-13-14 (II 를 가짐); HLA-중쇄 융합 폴리펩티드 N- 에서 C-말단 서열: 1-2-3-4-5-6-(3-6 디술피드 결합)-7-8-9-10-11-12-13-14 (I 을 가짐); 경쇄: a-b 의 주석을 단 모식도이다.
도 2: 본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질에 포함된 예시적 폴리펩티드: 융합 폴리펩티드는 폴리펩티드를 포함하는 항체 중쇄 힌지 부위 또는 항체 경쇄에 N-말단 융합되었다.
도 3: 상응하는 발현 플라스미드로 트랜스펙션된 HEK 293 세포의 세포 배양 상청액의 SDS 폴리아크릴아미드 겔의 웨스턴 블롯. 염색을 퍼옥시다아제 접합된 다클론 토끼 항-인간 κ-경쇄 항체 및 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 접합된 다클론 토끼 항-인간 IgG 항체로 수행하였다.
레인: 1: 2-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc; 2: 1-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + IgG-Fc; 3: 1-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄 + IgG-Fc; 4: 1-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-중쇄 + IgG-경쇄; 5: 2-완형 β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-경쇄 + IgG-중쇄; 6: 2-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-경쇄 + IgG-중쇄; 7: 2-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-중쇄 + IgG-경쇄; 8: 2-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc-scFv; 9: 1-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + 1-완형 IgG (중쇄 및 경쇄); 10: 분자량 마커; 11: 표준 참조 IgG1 항체.
도 4: 특정 펩티드로의 시험관내 자극 전 및 후 상이한 공여자로부터의 CMV-특이적 세포용해 T-세포의 수를 측정하기 위한 유세포 분석: 4 명의 인간 공여자로부터 유래한 말초 혈액 림프구 (PBL) 의 분석; 항-CD8 항체를 FITC 표지 염색 (BD, 카탈로그 번호 345772) 에 접합, Pro5 오량체 APC (ProImmune, 카탈로그 번호 F008-4A-E) 와 조합, TCR 인지 MHC-클래스 I (HLA-A*0201) 염색, CMV-유래 펩티드 (NLVPMVATV, SEQ ID NO: 01) 로 로딩; 원형: CMV-특이적 CD8⁺-T-세포; A: 공여자 1; B: 공여자 3.
도 5: A: 쿠마시 염색한 SDS-PAGE 겔: 레인 1: 분자량 표준, 레인 2: 1-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + 1-완형 IgG (중쇄 및 경쇄), 비-환원 조건; 레인 3: 1-완형 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-IgG-Fc + 1-완형 IgG 다관능 단백질 (중쇄 및 경쇄), 환원 조건.
B: 크기 배제 크로마토그래피 크로마토그램; 1: 고분자량 형태 (0.7 면적%); 2: 단량체성 다관능 단백질 (99.3 면적%).
C: 모식적 분자.
도 6: A: a) 단백질 A HPLC 및 SEC 후 쿠마시 블루 염색한 SDS-PAGE 겔; 비-환원 조건; 레인 1: 분자량 표준, 레인 2: 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc, 레인 3: 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + 1-완형 IgG (중쇄 및 경쇄).
b): 단백질 A HPLC 및 SEC 후 쿠마시 블루 염색한 SDS-PAGE 겔; 환원 조건; 레인 1: 분자량 표준, 레인 2: 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc, 레인 3: 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + 1-완형 IgG (중쇄 및 경쇄).
B: a) 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc 의 크기 배제 크로마토그래피 크로마토그램; 1: 고분자량 형태 (1.9 면적%); 2: 단량체성 다관능 단백질 (98.1 면적%).
b) 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + 1-완형 IgG (중쇄 및 경쇄) 의 크기 배제 크로마토그래피 크로마토그램; 1: 고분자량 형태 (2.1 면적%); 2: 단량체성 다관능 단백질 (97.9 면적%)
C: 모식적 분자 2: 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + IgG-Fc, 3: 펩티드-β2-마이크로글로불린-HLA-A0201-HC + LC + 1-완형 IgG.
도 7: MCSP+ 표적 세포 (Colo38) 에 대한 상이한 MHC-I-다기능 단백질의 결합: Colo38 세포를 Accutase (PAA, 카탈로그 번호 L11-007) 와 함께 5 분 동안 인큐베이션하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 바이알 당 2x10⁵ 세포를 100 ㎕ PBS/2%FCS 중 1 ㎍/ml MHC-I-다기능 단백질과 함께 45 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 세포를 1 ml 냉각 PBS/2%FCS 로 세척하고 7 분 동안 910 rpm 으로 원심분리하였다. 세포를 2 차 항체 (염소 항-인간 IgG1 항체 PE 접합체, Jackson, 카탈로그 번호 109-116-088) (2 ㎍/ml) 와 함께 100 ㎕ PBS/2%FCS 중 재현탁하고, 추가 45 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하였다. 세포를 1 ml PBS%2%FCS 로 2 회 세척하고 BD Canto II 유세포분석기로 측정하였다.
도 8: 세포독성 검정: 본원에 보고한 바와 같은 항원 결합 다관능 단백질은 인간 CMV-특이적 T-세포를 통해 H460M2 종양 세포의 용해를 촉발시킨다. a) (6h) 표적 세포:CMV-특이적 효과기 T-세포 1:1.5; b) (6h) 표적 세포:CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.75; c) (6h) 표적 세포:CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.5; 좌측 막대: 본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질; 우측 막대 MAB IGF-1R-비-푸코실화 (afucosylated).
도 9: 세포독성 검정: 본원에 보고한 바와 같은 항원 결합 다관능 단백질은 인간 CMV-특이적 T-세포를 통해 I24 3T3 종양 세포의 용해를 촉발시킨다; a) (9h) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:1.5; b) (9h) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.75; c) 9h) 표적 세포 : CMV-특이적 효과기 T-세포 1:0.5; 좌측 막대: 본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질; 중간 막대: MAB IGF-1R-afu; 우측 막대: 항-디곡시게닌 항체.
도 10: 항-IGF-1R 항체 및 본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질의 폐 선암종 세포주 H460M2 에 대한 결합의 FACS 분석; a) 2 차 항체만 포함 (염소 항-인간 IgG(H+L) (Jackson Laboratories, 카탈로그 번호 109-116-088)); b) 본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질 (융합 폴리펩티드는 가변 도메인의 오직 한 쌍을 포함하는 항-IGF-1R 항체의 중쇄의 N-말단에 융합됨); c) 항-IGF-1R 항체.
도 11: 본원에 보고한 바와 같은 상이한 다관능 단백질의 시험관내 효능 및 특이성 (세포독성 검정); a) 1 가 항-IGF1R 항체 및 CMV-유래 펩티드를 포함하는 다관능 단백질; b) 1 가 항-IGF1R 항체 및 EBV-유래 펩티드를 포함하는 다관능 단백질 (대조군); c) 2 가 항-IGF1R 항체 및 CMV-유래 펩티드를 포함하는 다관능 단백질; d) 항-IGF-1R 항체 (대조군); e) 항-디곡시게닌 항체 (대조군).
도 12: 상이한 표적 (T) 대 효과기 (E) 세포 비율로 측정된, 본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질의 시험관내 효능 및 특이성 (EC50 값) (융합 폴리펩티드는 전체 항-IGF-1R 항체의 중쇄의 N-말단에 융합됨).
도 13: 하기의 것과 함께 6 시간 인큐베이션한 후 표적 세포의 용해: a) 1 가 항-IGF1R 항체 및 융합 폴리펩티드 (CMV-유래 펩티드 포함) 를 포함하는 다관능 단백질 및 b) 표적 대 효과기 세포 비율 1:1.5 에서의 항-IGF-1R 항체.
도 14: MHC-I-항-MCSP 다관능 단백질과 함께 인큐베이션한 Colo38 세포에 대한 정규화된 세포 지수의 추세; 1 ㎍/ml 다관능 단백질 농도 (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), MHCI-0030 (3), MHCI-0031(4)), 효과기 대 표적 세포 비율 10:1; 공여자 3 으로부터의 PBMC (200.000 세포, 공여자 3 은 CMV-양성이지만 EBV 음성임) 및 흑색종 종양 세포주 Colo38 (20.000 세포) 및 96 웰 당 데이터를 삼반복함.
도 15: A: MHC-I-항-MCSP 다관능 단백질과 함께 인큐베이션한 Colo38 세포에 대한 정규화된 세포 지수의 추세; 1 ㎍/ml 다관능 단백질 농도 (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), PBMC 단독 (3)), 효과기 대 표적 세포 비율 10:1; 공여자 3 으로부터의 PBMC (200.000 세포, 공여자 3 은 CMV-양성이지만 EBV 음성임) 및 흑색종 종양 세포주 Colo38 (20.000 세포) 및 96 웰 당 데이터를 삼반복함.
B: MHC-I-항-MCSP 다관능 단백질과 함께 인큐베이션한 WM266 세포에 대한 정규화된 세포 지수의 추세; 1 ㎍/ml 다관능 단백질 농도 (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), MHCI-0030 (3), MHCI-0031 (4), 표적 세포 단독 (5), 표적 세포 + T-세포 (6)), 효과기 대 표적 세포 비율 10:1; 공여자 3 으로부터의 PBMC (200.000 세포, 공여자 3 은 CMV-양성이지만 EBV 음성임) 및 흑색종 종양 세포주 MW266 (20.000 세포) 및 96 웰 당 데이터를 삼반복함.
도 16: 다관능 단백질 MHCI-0008 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 1), MHCI-0010 (1 가, EBV 펩티드 로딩 대조군, 2), MHC-0026 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 미-결합 대조군, 3), MHCI-0030 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 4) 및 MHCI-0031 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 5) 에 의한 미-자극 PBMC 의 존재 하 다관능 단백질과 함께 42 시간 인큐베이션한 후 표적 세포의 용해.
도 17: 다관능 단백질 MHCI-0008 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 1), MHCI-0010 (1 가, EBV 펩티드 로딩 대조군, 2), MHC-0026 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 미-결합 대조군, 3), MHCI-0030 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 4) 및 MHCI-0031 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 5) 에 의한 미-자극 PBMC 의 존재 하 다관능 단백질과 함께 48 시간 인큐베이션한 후 LDH 배출.
도 18: A: 1 ㎍/ml 의 농도에서, 다관능 단백질 MHCI-0008 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 1), MHCI-0010 (1 가, EBV 펩티드 로딩 대조군, 2), MHC-0026 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 미-결합 대조군, 3), MHCI-0030 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 4) 및 MHCI-0031 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 5) 에 의한 자극 PBMC 의 존재 하 다관능 단백질과 함께 10 시간 인큐베이션한 후 Colo38 세포의 용해.
B: 1 ㎍/ml 의 농도에서, 다관능 단백질 MHCI-0008 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 1), MHCI-0010 (1 가, EBV 펩티드 로딩 대조군, 2), MHC-0026 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 미-결합 대조군, 3), MHCI-0030 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 4) 및 MHCI-0031 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 5) 에 의한 자극 PBMC 의 존재 하 다관능 단백질과 함께 10 시간 인큐베이션한 후 WM266 세포의 용해.
도 19: 비-디술피드 안정화 다관능 단백질 (A) 및 디술피드 안정화 다관능 단백질 (B) 의, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 후, 분취용 크기 배제 크로마토그래피 이전의 분석적 크기 배제 크로마토그램.
도 20: 1 ㎍/ml 의 농도에서, 다관능 단백질 MHCI-0031 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, 비-디술피드-연결, 1) 및 MHCI-0054 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 활성, MHCI-0031 의 디술피드-연결 형태, 2) 에 의한 자극 PBMC 의 존재 하 Colo38 세포의 용해.
도 21 : 야생형 전체 길이 IgG (삼각형), 본원에서 보고한 바와 같은 예시적 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 (다이아몬드형), 디술피드 결합 안정화를 갖지 않는 다가 다관능 단백질 (X 표시) 의 열 안정성.

서열의 간단한 설명

SEQ ID NO: 01 ~ 47 인간 거대세포 바이러스-유래 펩티드.

SEQ ID NO: 48 인간 면역결핍 바이러스-유래 펩티드.

SEQ ID NO: 49 인간 헤르페스바이러스 4 유래 펩티드.

SEQ ID NO: 50 인플루엔자 바이러스-유래 펩티드.

SEQ ID NO: 51 간염-B-바이러스-유래 펩티드.

SEQ ID NO: 52 인간 T-세포 림프친화 바이러스 유형 1 유래 펩티드.

SEQ ID NO: 53 V-jun 육종 바이러스 17 발암유전자 동족체 (JUN) 유래 펩티드.

SEQ ID NO: 54 인간 아데노바이러스 유형 3-유래 펩티드.

SEQ ID NO: 55 간염-C-바이러스-유래 펩티드.

SEQ ID NO: 56 ~ 70 뎅기열 바이러스-유래 펩티드.

SEQ ID NO: 71 인간 β2-마이크로글로불린 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 72 인간 HLA-A*0201 α1-α3 사슬 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 73-84 링커 펩티드 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 85 인간 IgG1 CH2 도메인 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 86 인간 IgG1 CH2 도메인 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 87 인간 IgG1 Fc-부위 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 88 인간 IgG1 Fc-부위 L234A, L235A 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 89 인간 IgG1 Fc-부위 T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 90 인간 IgG1 Fc-부위 T366W 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 91 인간 IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 92 인간 IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, T366W 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 93 인간 IgG1 Fc-부위 P329G 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 94 인간 IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 95 인간 IgG1 Fc-부위 P329G, T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 96 인간 IgG1 Fc-부위 P329G, T366W 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 97 인간 IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 98 인간 IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G, T366W 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 99 인간 IgG4 Fc-부위 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 100 인간 IgG4 Fc-부위 S228P, L235E 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 101 인간 IgG4 Fc-부위 S228P, L235E, P329G 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 102 인간 IgG4 Fc-부위 S228P, L235E, P329G, T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 103 인간 IgG4 Fc-부위 S228P, L235E, P329G, T366W 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 104 HVR-L1

SEQ ID NO: 105 HVR-L2

SEQ ID NO: 106 HVR-L3

SEQ ID NO: 107 HVR-L1

SEQ ID NO: 108 HVR-H1

SEQ ID NO: 109 HVR-H2

SEQ ID NO: 110 HVR-H3

SEQ ID NO: 111 HVR-H1

SEQ ID NO: 112 HVR-H2

SEQ ID NO: 113 VL

SEQ ID NO: 114 VH

SEQ ID NO: 115 VL

SEQ ID NO: 116 VH

SEQ ID NO: 117 MHC-I-VH (MCSP)-IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 118 VH(MCSP)-IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G, T366W 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 119 VL(MCSP)-CL 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 120 인간화 항-IGF-1R 단일클론 경쇄 항체 아미노산 서열 (카파).

SEQ ID NO: 121 인간화 항-IGF-1R 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체).

SEQ ID NO: 122 인간화 항-IGF-1R 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 놉 (knob) 변이체).

SEQ ID NO: 123 인간화 항-IGF-1R 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 홀 (hole) 변이체).

SEQ ID NO: 124 인간 IgG1 Fc-부위 돌연변이체 힌지 부위 및 L234A, L235A 돌연변이체 및 놉 변이체.

SEQ ID NO: 125 인간화 항-IGF-1R 단일클론 항체의 디술피드-안정화 단일 사슬 Fv.

SEQ ID NO: 126 쥐과 항-MCSP 단일클론 경쇄 항체 아미노산 서열 (카파).

SEQ ID NO: 127 인간화 항-MCSP 단일클론 경쇄 항체 아미노산 서열 (카파).

SEQ ID NO: 128 쥐과 항-MCSP 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체).

SEQ ID NO: 129 인간화 항-MCSP 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체).

SEQ ID NO: 130 쥐과 항-MCSP 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 놉 변이체).

SEQ ID NO: 131 인간화 항-MCSP 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 놉 변이체).

SEQ ID NO: 132 쥐과 항-MCSP 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 홀 변이체).

SEQ ID NO: 133 인간화 항-MCSP 단일클론 중쇄 항체 아미노산 서열 (IgG1 L234A, L235A 돌연변이체 및 홀 변이체).

SEQ ID NO: 134 쥐과 항-MCSP 단일클론 항체의 디술피드-안정화 단일 사슬 Fv.

SEQ ID NO: 135 인간화 항-MCSP 단일클론 항체의 디술피드-안정화 단일 사슬 Fv.

SEQ ID NO: 136 링커 펩티드 13.

SEQ ID NO: 137 디술피드-안정화 MHC-I-VH (MCSP)-IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 138 인간 MCSP 의 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 139 디술피드-연결 다관능 단백질에 대한 링커.

SEQ ID NO: 140 디술피드-연결 다관능 단백질에 대한 개질된 인간 HLA-A*0201 α1-α3 사슬 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 141 VH (MCSP)-IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G, T366S, L368A, Y407V 돌연변이체 아미노산 서열.

SEQ ID NO: 142 VH (MCSP)-IgG1 Fc-부위 L234A, L235A, P329G, T366W 돌연변이체 아미노산 서열.

I. 정의

"친화성" 은 분자 (예를 들어 항체) 의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 강도 총합을 의미한다. 다르게 나타내지 않는 한, 본원에서 사용한 바와 같은, "결합 친화성" 은 결합 쌍 멤버 (예를 들어 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화성을 의미한다. 분자 X 의 그의 파트너 Y 에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd) 로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재한 것들을 포함하는 당업계에 공지되어 있는 통상적 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 설명적이고 예시적인 구현예를 하기에서 기재한다.

용어 "아미노산" 은 직접적으로 또는 전구체의 형태로 핵산에 의해 인코딩될 수 있는, 카르복시 α-아미노산의 군을 나타낸다. 개별적인 자연 발생적 아미노산은 3 개 뉴클레오티드, 소위 코돈 또는 삼중 염기 (base-triplet) 로 이루어지는 핵산에 의해 인코딩된다. 각각의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 인코딩된다. 이는 "유전 코드의 퇴보" 로 알려져 있다. 본 명세서 내에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산" 은 알라닌 (3 문자 코드: ala, 1 문자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y) 및 발린 (val, V) 을 포함하는 자연 발생적 카르복시 α-아미노산을 나타낸다.

용어 "항-표적 항체" 및 "표적에 결합하는 항체" 는 항체가 표적을 치료하는데 있어서 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성을 가지고 표적에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 특정 구현예에서, 표적에 결합하는 항체는 해리 상수 (Kd) 가 ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M) 이다.

본원에서 용어 "항체" 는 광범위한 의미로 사용되며 다양한 항체 구조, 예컨대 비제한적으로 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한) 을 포함한다.

"항체 단편" 은 미손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 미손상 항체의 일부를 포함하는 미손상 항체 외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

용어 "항원 결합 부위" 는 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 부분을 나타낸다. 예시적인 항원 결합 부위는 펩티드, 항체 단편, 도메인 항체, 또는 단일 사슬 항체 (예를 들어 낙타 또는 상어 항체) 의 가변 도메인이다. 항원 결합 부위는 자연 발생적 항원 결합 부위 또는 조작된 항원 결합 부위일 수 있다. 예시적인 조작된 항원 결합 부위는 DARPIN, 도메인 교환된 항체 또는 도메인 교환된 항체 단편, 및 이중 가변 도메인 항체이다.

항체의 "클래스" 는 그의 중쇄에 의해 포함되는 불변 도메인 또는 불변부의 유형을 의미한다. 5 개 주요 클래스의 항체가 존재하며: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 일부는 서브클래스 (동기준 (isotype)), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가 분화될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 지칭된다.

용어 "상대 빈도가 ~ 인 클래스 I MHC 분자" 는 각각의 클래스 I MHC 분자가 주어진 상대 빈도의 모든 인간 내에서 또는 특정 인간 집단에서 발생 빈도를 갖는다는 것을 나타낸다. 즉 상대 빈도가 10% 이상인 클래스 I MHC 분자는 특정 집단의 모든 인간에서 10% 이상으로, 예컨대 유럽인 기원의 모든 인간에서 27.2% 로 발견될 수 있다.

다관능 단백질의 그의 접합 파트너에 대한 "접합" 은 상이한 방법, 예컨대 화학적 결합, 또는 특정 결합 쌍을 통한, 또는 유전적 융합을 통한 결합에 의해 수행될 수 있다. 용어 "접합 파트너" 는 예를 들어 폴리펩티드, 검출가능 표지, 특정 결합 쌍의 멤버를 나타낸다. 한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 그의 접합 파트너에 대한 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노기 (리신 (lysine)), 상이한 리신 (lysin) 의 ε-아미노기, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 일부의 아미노산 서열의 카르복시-, 술프히드릴-, 히드록실-, 및/또는 페놀 관능기 및/또는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 탄수화물 구조의 당 알코올 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 한 구현예에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 특정 결합 쌍을 통해 그의 접합 파트너에 접합된다.

본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "세포독성제" 는 세포 기능을 저해하거나 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 일으키는 물질을 의미한다. 세포 독성제는 비제한적으로, 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu 의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제); 성장 저해제; 효소 및 이의 단편 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 각종 항종양 또는 항암제를 포함한다.

색원체 (형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성 기 또는 금속 입자, 합텐, 예를 들어 디곡시게닌은 "검출가능 표지" 의 예이다. 상기 검출가능 표지은 또한 광활성가능 가교기, 예를 들어 아지도 또는 아지린기일 수 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 적합한 신호-방출기이며, 특히 루테늄 킬레이트, 예를 들어 루테늄 (비스피리딜)₃ ²⁺ 킬레이트가 관심 대상의 것이다. 적합한 루테늄 표지기는 예를 들어 EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 및 WO 92/14138 에 기재되어 있다. 직접 검출을 위해, 표지기는 임의의 공지된 검출가능 마커기, 예컨대 염료, 발광 표지기 예컨대 화학발광기, 예를 들어 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄, 또는 형광 염료, 예를 들어 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레조루핀, 시아닌 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다. 표지기의 기타 예는 발광 금속 착물, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 착물, 효소 (예를 들어 ELISA 또는 CEDIA (복제된 효소 공여자 면역검정 (Cloned Enzyme Donor Immunoassay), 예를 들어 EP-A-0 061 888) 에 사용되는 바와 같음), 및 방사성동위원소이다.

용어 "효과기 기능" 은 항체 클래스에 따라 가변적인 항체의 Fc-부위에 기인하는 생물학적 활성을 나타낸다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체) 의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.

작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량" 은, 요구되는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 및 투약량에서 효과적인 양을 나타낸다.

본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "발현" 은 세포 내에서 발생하는 전사 및/또는 번역 및 분비 과정을 의미한다. 세포에서의 관심 핵산 서열의 전사 수준은 세포 내 존재하는 상응하는 mRNA 의 양을 기반으로 하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 관심 서열로부터 전사된 mRNA 는 RT-PCR 또는 노던 하이브리드화에 의해 정량화될 수 있다 (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 참조). 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 각종 방법, 예를 들어 ELISA, 폴리펩티드의 생물학적 활성의 검정, 또는 이러한 활성에 대해 독립적인 검정 이용, 예컨대 웨스턴 블롯팅 또는 방사면역측정법 이용 (폴리펩티드를 인지하고 결합하는 면역글로불린 사용) (Sambrook, et al., (1989), 상기 참조) 에 의해 정량화될 수 있다.

"발현 카세트" 는 세포 내 적어도 함유된 핵산의 발현을 위한 필요 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 구축물을 나타낸다.

용어 "발현 기구 (expression machinery)" 는 핵산 또는 유전자 (즉, 또한 "유전자 발현 기구" 로 지칭) 의 전사 단계로 시작하여 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 전사후 개질 단계에 포함되는 세포의 효소, 보조인자 등의 총계를 나타낸다. 발현 기구는 예를 들어 DNA 의 예비-mRNA 로의 전사, 성숙 mRNA 로의 예비-mRNA 스플라이싱, mRNA 의 폴리펩티드로의 번역, 및 폴리펩티드의 번역후 개질의 단계를 포함한다.

"발현 플라스미드" 는 숙주 세포 내 포함된 구조 유전자(들) 의 발현을 위한 모든 필요 요소를 제공하는 핵산이다. 통상, 발현 플라스미드는 복제 기원, 및 선택가능 마커, 진핵생물 선택 마커, 및 각각 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 터미네이터를 포함하는 관심 구조 유전자(들) 의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 예를 들어 대장균에 대한 원핵생물 플라스미드 증식 단위를 포함한다. 유전자 발현은 통상 프로모터의 제어 하에 위치하며, 상기 구조 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결" 되는 것으로 일컬어진다. 유사하게, 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조절하는 경우, 조절 요소 및 코어 프로모터는 작동가능하게 연결된다.

용어 "Fc-부위" 는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 나타낸다. Fc-부위는 2 개의 디술피드-연결 항체 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 이량체성 분자이다. Fc-부위는 미손상 (전체 길이) 항체의 파파인 소화, 또는 IdeS 소화, 또는 트립신 소화에 의해 생성될 수 있거나, 재조합적으로 생성될 수 있다.

전체 길이 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득할 수 있는 Fc-부위는 전체 길이 중쇄의 C-말단에 대해 적어도 잔기 226 (Cys) 을 포함하며, 따라서 힌지 부위 일부 및 2 또는 3 개의 불변 도메인, 즉 CH2 도메인, CH3 도메인, 및 추가/가외 CH4 도메인 (IgE 및 IgM 클래스 항체의 경우) 을 포함한다. 그러나, Fc-부위의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명기하지 않는 한, Fc-부위 또는 불변부에서의 아미노산 잔기 번호화는 EU 번호화 시스템 (또한 EU 인덱스로 지칭) 에 따른다 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재된 바와 같음).

2 개의 동일하거나 동일하지 않은 항체 중쇄 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 이량체성 Fc-부위의 형성은 포함된 CH3 도메인의 비-공유 이량체화에 의해 조정된다 (관련된 아미노산 잔기에 대해서는 예를 들어 [Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273] 참조). Fc-부위는 힌지 부위에서의 디술피드 결합의 형성에 의해 공유적으로 안정화된다 (예를 들어 [Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79] 참조).

Fc-부위에서의 규정된 아미노산 잔기의 개질이 표현형적인 결과를 초래한다는 것이 US 5,648,260 및 US 5,624,821 로부터 공지되어 있다.

본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 한 구현예에서 항체 중쇄 힌지 부위 폴리펩티드로서 인간 Fc-부위 또는 인간 기원에서 유래한 Fc-부위를 포함할 수 있다. 추가 구현예에서 Fc-부위는 서브클래스 IgG4 의 인간 항체의 Fc-부위 또는 서브클래스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 의 인간 항체의 Fc-부위이다 (Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRIIIa) 결합 및/또는 C1q 결합이 검출될 수 없도록 개질됨). 한 구현예에서 Fc-부위는 인간 Fc-부위이고 특히 인간 IgG4 서브클래스로부터의 것이거나 인간 IgG1 서브클래스로부터의 돌연변이화된 Fc-부위이다. 한 구현예에서 Fc-부위는 돌연변이 L234A 및 L235A 및 P329G 를 갖는 인간 IgG1 서브클래스로부터의 것이다. IgG4 가 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 나타내지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강력한 결합을 나타낸다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물 손실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 및/또는 His435 는, 변형되는 경우 또한 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 한 구현예에서 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 IgG4 서브클래스 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 Fcγ 수용체 결합에 관련하여, L234, L235, P329 및/또는 D265 에 돌연변이를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 포함한다. 한 구현예에서 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E, PVA236 (PVA236 은, IgG1 의 아미노산 위치 233 ~ 236 로부터의 아미노산 서열 ELLG (하나의 아미노산 코드로 제공됨) 또는 IgG4 의 EFLG 가 PVA 에 의해 대체된다는 것을 나타냄) 및/또는 P329G 이다. 한 구현예에서 돌연변이는 IgG4 의 S228P 및 P329G, 및 IgG1 의 L234A, L235A 및 P329G 이다. 항체의 Fc-부위는 ADCC (항체-의존적 세포-매개 세포독성) 및 CDC (보체-의존적 세포독성) 에 직접적으로 관련된다. Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 을 이끌어내지 않는다.

IgG1 동기준의 야생형 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

L234A, L235A 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

L234A, L235A 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

L234A, L235A 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

P239G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

L234A, L235A, P329G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

L234A, L235A, P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

IgG4 동기준의 야생형 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

S228P 및 L235E 돌연변이를 갖는 IgG4 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

S228P, L235E 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG4 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

S228P, L235E, P329G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG4 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

S228P, L235E, P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG4 동기준의 변이체 인간 Fc-부위의 폴리펩티드 사슬은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호교환가능하게 사용되며 외인성 핵산이 도입된 세포 (그러한 세포의 자손을 포함함) 를 의미한다. 숙주 세포는, 일차 형질전환된 세포 및 계대수에 상관없이 그로부터 유래한 자손을 포함하는, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함한다. 자손은 모체 세포와 핵산 내용이 완전히 일치하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.

용어 "세포" 는 플리스미드의 증식에 사용되는 원핵 세포, 및 핵산의 발현에 사용되는 진핵 세포 둘 모두를 포함한다. 한 구현예에서 진핵 세포는 포유류 세포이다. 한 구현예에서 포유류 세포는 CHO 세포 (예를 들어 CHO K1, CHO DG44), BHK 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, HEK 293 세포, HEK 293 EBNA 세포, PER.C6® 세포 및 COS 세포를 포함하는 포유류 세포의 군에서 선택된다.

"인간 항체" 는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 근원에서 유래하는 또는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.

"면역접합체" 는 하나 이상의 이종 분자(들) (비제한적으로 세포독성제 포함) 에 접합된 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 나타낸다.

"개인" 또는 "대상" 은 포유류이다. 포유류는 비제한적으로, 가축 (예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어 마우스 및 랫트) 를 포함한다. 특정 구현예에서, 개인 또는 대상은 인간이다.

"단리된" 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 이의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다.

"단리된" 핵산은 이의 자연적 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 보통 핵산 분자를 함유하는 세포 내 함유된 핵산 분자를 포함하나, 상기 핵산 분자는 염색체외 또는 자연적 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에서 존재한다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "MCSP" 는 다르게 나타내지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트) 를 포함하는 임의의 척추동물 근원으로부터의 임의의 선천적 MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸) 를 의미한다. 상기 용어는 "전체-길이", 비가공된 MCSP 뿐 아니라 세포에서의 가공으로 인한 MCSP 의 임의의 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 MCSP 의 자연 발생적 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. MCSP 는 또한 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 NG2, 고분자량-흑색종 연관 항원 (HMW-MAA), 및 흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸으로 공지된다. 예시적 인간 MCSP 의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 1 에 나타낸다. 또한, [Pluschke, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 9710-9715], [Staub, E., et al., FEBS Lett. 527 (2002) 114-118], 및 GenBank 제어 번호: NP_001888 을 참조한다.

용어 "하나의 항원 제시 도메인" 은 정확히 하나, 즉 단일한, 정의한 바와 같은 항원 제시 도메인을 나타내며 추가적인, 즉 제 2 의 정의한 항원 제시 도메인을 배제한다. 용어 "하나" 는 "정확히 하나" 또는 "단일" 을 나타낸다.

용어 "2 개의 항원 제시 도메인" 은 정확히 2 개의, 정의한 바와 같은 항원 제시 도메인의 존재를 나타내며 오직 단일한, 즉 하나의, 항원 제시 도메인을 배제한다.

"작동가능하게 연결" 은 둘 이상의 성분의 병렬 배치를 의미하며, 이때 상기 기재된 성분은 의도된 방식으로 이들이 기능할 수 있게 하는 관계에 있다. 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서는, 연결 서열의 전사를 제어하거나 조절하기 위해 시스 (cis) 로 작용하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로, "작동가능하게 연결된" DNA 서열은 인접하며, 분비성 리더 및 폴리펩티드와 같은 2 개 단백질 인코딩 부위와 연결될 필요가 있는 경우, 인접하며 (판독) 프레임 내에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터가 일반적으로 코딩 서열의 업스트림에 위치함에도 불구하고, 반드시 이와 인접한 것은 아니다. 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 인핸서가 코딩 서열의 전사를 증가시키는 경우, 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 업스트림, 코딩 서열 내 또는 코딩 서열의 다운스트림, 및 프로모터로부터 상당한 거리에 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는, 코딩 서열의 다운스트림 말단부에 위치하여 전사가 코딩 서열을 통해 폴리아데닐화 서열로 진행되는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 중지 코돈은, 코딩 서열의 다운스트림 말단 (3' 말단) 에 위치하여 전사가 코딩 서열을 통해 중지 코돈으로 진행하여 그 곳에서 종료되는 경우, 엑손 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 연결은 예를 들어, PCR 방법 사용 및/또는 편리한 제한 위치에서의 라이게이션에 의해 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해 이루어진다. 편리한 제한 위치가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 종래 실행에 따라 사용된다.

용어 "패키지 삽입물" 은 치료 제품의 사용과 관련되는 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 치료요법, 상충 및/또는 경고 사항에 대한 정보를 포함하는, 상기 치료 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함된 지시사항을 의미하는 것으로 사용된다.

용어 "펩티드 링커" 는 자연적 및/또는 합성적 기원의 아미노산 서열을 나타낸다. 이들은 선형 아미노산 사슬로 이루어지는데, 이때 20 개의 자연 발생적 아미노산은 단량체성 빌딩 블록이다. 펩티드 링커는 그 길이가 1 내지 50 개 아미노산이고, 한 구현예에서는 1 내지 28 개 아미노산이고, 추가 구현예에서는 2 내지 25 개 아미노산이다. 펩티드 링커는 자연 발생적 폴리펩티드의 서열 또는 반복적 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 링커는 폴리펩티드가 올바르게 폴딩되고 적절하게 제시되게 함으로써, 서로 접합된 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 수행할 수 있다는 것을 보장하는 기능을 갖는다. 한 구현예에서 펩티드 링커에는 글리신, 글루타민 및/또는 세린 잔기가 풍부하다. 이러한 잔기는 예를 들어 5 개 이하의 아미노산의 작은 반복적 단위로 배열된다 (예컨대 GS (SEQ ID NO: 73), GGS (SEQ ID NO: 74), GGGS (SEQ ID NO: 75), 및 GGGGS (SEQ ID NO: 80)). 이러한 작은 반복적 단위는 1 내지 5 회 반복될 수 있다. 다량체성 단위의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 끝에서, 6 개 이하의 추가 임의적, 자연 발생적 아미노산이 첨가될 수 있다. 기타 합성 펩티드 링커는 단일 아미노산으로 구성되는데, 이는 10 내지 20 회 반복되며 아미노- 및/또는 카르복시-말단 끝에서 6 개 이하의 추가 임의적, 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 모든 펩티드 링커는 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있으며, 따라서 재조합적으로 발현될 수 있다. 링커가 그 자체로 펩티드이므로, 링커에 의해 연결된 폴리펩티드는 2 개 아미노산 사이에 형성된 펩티드 결합을 통해 링커에 연결된다.

용어 "약학 제형" 은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있게 하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 수용될 수 없을 정도로 독성인 추가적 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.

"약학적으로 허용가능한 담체" 는, 대상에게 비독성인, 활성 성분 외의 약학 제형 내의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 비제한적으로 포함한다.

"폴리펩티드" 는 자연적 또는 합성적으로 생성되는, 펩티드 결합에 의해 연결되는 아미노산으로 이루어지는 중합체이다. 약 25 개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드" 로 지칭될 수 있는 한편, 100 개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드를 포함하거나 둘 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 분자는 "단백질" 로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예컨대 탄소화물 기, 금속 이온 또는 카르복실산 에스테르를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 가변적일 수 있다. 폴리펩티드는 그의 아미노산 백본 구조 또는 이를 인코딩하는 핵산에 있어서 본원에서 정의된다. 탄수화물 기와 같은 부가물은 일반적으로 명기되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.

"구조 유전자" 는 신호 서열이 없는 유전자 부위, 즉 코딩 부위를 나타낸다.

용어 "T-세포 반응 유도 펩티드" 는 클래스 I MHC 다관능 단백질의 펩티드-결합 그루브 (groove) 에 존재하며 순환 메모리 또는 효과기 T-세포에 의해 인지되는 펩티드를 나타낸다. 펩티드의 인지는 면역 반응을 초래하여, 이러한 펩티드-클래스 I MHC 다관능 단백질을 제시하는 세포를 제거한다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "치료" (및 그의 문법적 변이형 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는") 는 치료되는 개인의 자연적 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추는데 사용된다.

용어 "가변부" 또는 "가변 도메인" 은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 선천적 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격부 (FR) 및 3 개의 과가변부 (HVR) 를 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91 페이지 참고). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리되어, 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리가 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, [Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; [Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628)] 를 참조한다.

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "벡터" 는 그것이 연결되어 있는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로 지칭된다.

II . 조성물 및 방법

A. 예시적인 디술피드 -연결 다가 다관능 단백질

본원에서는, 제 1 부분으로서 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체 유래 부분, 및 제 2 부분으로서 MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래 펩티드를 포함하는 항원 결합 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 보고하고 있다.

본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질로, 개인의 현존 바이러스-특이적 순환 세포독성 T-세포 (T-메모리-세포및/또는 T-효과기-세포) 는 표적 항원을 발현하는 세포에 유도될 수 있으며, 급성 바이러스 감염을 모방하는 MHC 클래스 I 다관능 복합체로 이러한 세포를 균포화함으로써, 이에 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 항체 유래 부분이 특이적으로 결합한다.

한 측면에서, 본 발명은 제 1 부분으로서 MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래 펩티드 및 제 2 부분으로서 항체 유래 디술피드-연결 분자를 포함하는 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이, 개인의 현존 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 급성 바이러스 감염을 모방하는 표적 항원 발현 세포에 유도하는데 사용될 수 있고 이로써 표적 항원을 발현하는 세포의 배제 (제거) 가 개시될 수 있다는 발견을 일부 근거로 한다.

다관능 단백질을 포함하는 비-디술피드-연결 MHC 클래스 I (여기서 최대한으로, 항체 힌지 부위와 조합된 단일 MHC 클래스 I 단위가 존재하여 재조합체가 생성되게 할 수 있음) 와 반대로, 다관능 단백질을 포함하는 디술피드-연결 MHC 클래스 I 에서는 하나, 둘 또는 그 이상의 디술피드-연결 MHC 클래스 I 단위가 항체 힌지 부위와 조합된 재조합체 생성을 제한하지 않고 다가 다관능 단백질에서 존재할 수 있다는 것이 발견되었다.

하나, 즉 단일한 항원 제시 도메인을 포함하는 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 사용함으로써, 둘 이상의 항원 제시 도메인을 포함하는 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 일부 작용 방식이 더 이상 가능하지 않다 (예컨대 T-세포 수용체의 가교). 추가적으로, 하나의 항원 제시 도메인을 포함하는 본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 향상된 수율로 생성될 수 있으며 향상된 열 안정성을 가질 수 있다. 이러한 이론에 의해 더 속박됨이 없이, 하나의 항원 제시 도메인을 포함하는 본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 T-세포 활성화에 대해 보다 특이적이다 (실시예 15 참조).

특정 구현예에서 각각 (i) 바이러스-유래 펩티드, (ii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201 및 (iii) 베타-2-마이크로글로불린을 포함하는 하나, 둘 또는 그 이상의 항원 제시 도메인을 포함하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 (이때 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함) 이 제공된다.

특정 구현예에서 각각 (i) 바이러스-유래 펩티드, (ii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201 및 (iii) 베타-2-마이크로글로불린을 포함하는 하나, 둘 또는 그 이상의 항원 제시 도메인을 포함하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 (이때 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함) 이 제공된다.

본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 예를 들어, 암 또는 바이러스 감염과 같은 각종 질환의 진단 또는 치료에 유용하다.

한 측면에서, 본 발명은 (i) 세포 표면 항원 및 (ii) 세포독성 T-세포에 결합하는 다관능 단백질을 제공한다.

본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 표적 세포, 예를 들어 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포를 배제/제거/분해하기 위한 자연 발생적인, 매우 효과적 항-바이러스 면역 반응을 활용한다. 세포 배제는, 활성화를 위해 어떠한 동시 자극도 필요로 하지 않는 매우 강력한 개인 고유의 순환 T-세포를 사용함으로써 이루어진다. 추가적으로, 이러한 작용 메커니즘을 위해 세포 표면 상에 소수의 치료 분자가 필요하다 (예를 들어 Mottez et al., J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502 참조).

치료 동안 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 면역화와 유사한 개인의 항-바이러스 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. 이로써 다수의 치료/적용이 치료의 효능을 증강시킬 수 있다. 따라서, 예비치료로서 면역화를 사용하여 효능을 증강시킬 수 있다.

또한, 인구집단 내 그의 빈도가 매우 낮은 (한 구현예에서 1% 미만) 동종이인자형을 사용할 수 있다. 이러한 동종이인자형을 사용하여, 동종이인자형이 개인의 면역계에 의해 외래의 것으로서 인지되고 면역 반응이 개시되는 바와 같은 면역화 단계가 쓸모없게 될 수 있다.

항원 결합 부위 표적화는 독성 및 부작용이 제한되도록 매우 세포 또는 항원 특이적일 필요가 있다.

따라서 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 사용함으로써:

(i) 매우 특이적인 T-세포 집단만이 활성화되고 (디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 MHC-I 단백질 복합체에서 디스플레이된 단일 바이러스-유래 펩티드에 대해 특이적인 CD8 양성 효과기/메모리 세포), 모든 다른 CD3⁺-세포는 영향받지 않는다 (CD4⁺-T-세포: TH1, TH2, TH17, 조절 T-세포);

(ii) 개인의 면역계의 자연적 반응이 모방된다 (바이러스-감염 세포의 정상적인 제거); 및

(iii) 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의/단백질로의 적용/치료에 대한 반응은 시작시에는 낮을 것이나 치료 동안에 신장될 수 있으며 (특이적 T-세포가 활성화되고 그 수가 확장됨), 그로 인해 초기에는 투입 반응 및 초기 사이토카인 배출이 감소될 수 있다.

한 구현예에서 방법은 선택된 바이러스-유래 펩티드, 예를 들어 인간 거대세포 바이러스 (huCMV) 유래 펩티드를 적용하여 CD8-양성 세포독성 T-세포를 자극하는 단계를 포함한다. 한 바람직한 구현예에서 펩티드는 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 갖는다.

활성화된 CMV-펩티드 특이적 T-세포가 효과적인 시험관내 종양 세포 제거 (시험관내 CMV-유래 펩티드로 로딩된 종양 세포) 를 매개한다는 것이 나타난다.

바이러스-감염 세포는 그의 세포 표면 상에 바이러스-유래 펩티드와 MHC 클래스 I 단백질의 복합체를 제시한다. 이들은 바이러스-유래 펩티드 제시 세포를 제거/고갈시키는 특이적 CD8⁺ T-세포에 의해 인지된다. 세포용해 (세포독성) CD8⁺-T-세포 (CTL) 는 그의 특이적인 T-세포-수용체에 의해 MHC 클래스 I 단백질에서의 펩티드를 인지한다. CTL 은 동시 자극 신호 필요 없이 바이러스 감염 세포의 제거를 촉발시킨다.

효과기 세포, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 FACS-분류 CD8⁺-T-세포 (본원에 보고한 바와 같은 융합 폴리펩티드에 포함된 바와 같은 CMV-유래 펩티드로 예비자극될 수 있음) 가 사용될 수 있다.

치료할 개인의 HLA-동종이인자형이 인지되어야 한다.

NCBI 에 따라, 빈도 10% 이상인 HLA-동종이인자형이 하기 표에서 나타낸 바와 같이 분포되어 있다.

표.

따라서, 본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이며:

- 하나, 둘 또는 그 이상의 항원 제시 도메인,

- 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위,

(i) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(ii) β2-마이크로글로불린,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) β2-마이크로글로불린,

이때, 상기 항원 결합 부위는 암 세포 표면 항원에 결합하고,

상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다.

한 구현예에서 N- 에서 C-말단 방향으로 β2-마이크로글로불린 및 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 을 포함하는 항원 제시 도메인은 이의 N-말단에서 MHC-펩티드 결합 그루브에 결합하는 펩티드를 추가로 포함하고, 이때 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성한다. 한 구현예에서 펩티드는 T-세포-반응 유도 펩티드이다.

한 구현예에서 T-세포-반응 유도 펩티드는 바이러스-유래 펩티드이다. 한 구현예에서 바이러스는 아데노바이러스, 인간 헤르페스바이러스 1, 인간 헤르페스바이러스 2, 인간 헤르페스바이러스 4 (엡스테인 바 바이러스), 간염-B-바이러스, 간염-C-바이러스, 인간 거대세포 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인간 유두종 바이러스 유형 16, 인간 유두종 바이러스 유형 18, 인간 유두종 바이러스 유형 31, 인간 유두종 바이러스 유형 33, 인간 유두종 바이러스 유형 35, 인간 유두종 바이러스 유형 39, 인간 유두종 바이러스 유형 45, 인간 유두종 바이러스 유형 51, 인간 유두종 바이러스 유형 52, 인간 유두종 바이러스 유형 56, 인간 유두종 바이러스 유형 58, 인간 유두종 바이러스 유형 59, 인간 유두종 바이러스 유형 68, 인간 유두종 바이러스 유형 73, 인간 유두종 바이러스 유형 82, 인간 T-세포 림프친화 바이러스 유형 I, 인간 인플루엔자 A 바이러스, 인간 인플루엔자 B 바이러스 또는 백시니아 바이러스에서 선택된다.

한 구현예에서 바이러스-유래 펩티드는 NLVPMVATV (SEQ ID NO: 01), SLYNTVATL (SEQ ID NO: 48), GLCTLVAML (SEQ ID NO: 49), GILGFVFTL (SEQ ID NO: 50), STNRQSGRQ (SEQ ID NO: 51), LLFGYPVYV (SEQ ID NO: 52), FAEGFVRAL (SEQ ID NO: 53), LIVIGILIL (SEQ ID NO: 54), 또는 ILHTPGCV (SEQ ID NO: 55) 에서 선택된다.

한 구현예에서 β2-마이크로글로불린은 인간 β2-마이크로글로불린이다. 한 구현예에서 β2-마이크로글로불린은 SEQ ID NO: 71 의 아미노산 서열로 이루어진다.

한 구현예에서 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자는 인간 HLA-A*0201 이다. 한 구현예에서 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 은 SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열로 이루어진다.

한 구현예에서 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α3 은 제 3 링커 펩티드를 통해 폴리펩티드 (디술피드-연결되거나 디술피드-연결되지 않은) 에 융합된다.

한 구현예에서 제 1 링커 펩티드, 제 2 링커 펩티드 및 제 3 링커 펩티드는 서로 독립적으로 아미노산 서열 GS (SEQ ID NO: 73), GGS (SEQ ID NO: 74), GGGS (SEQ ID NO: 75), GGGSGGGS (SEQ ID NO: 76), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 77), GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 78), GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 79), GGGGS (SEQ ID NO: 80), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 81), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 82), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 83), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 84), 및 GCGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 139) 에서 선택된다.

한 구현예에서 제 1 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 82 의 아미노산 서열을 포함한다.

한 구현예에서 제 2 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 83 의 아미노산 서열을 포함한다.

한 구현예에서 제 3 링커 펩티드는 SEQ ID NO: 73 의 아미노산 서열을 포함한다.

한 구현예에서 항체 Fc-부위는 클래스 IgG 또는 클래스 IgE 의 인간 항체의 항체 Fc-부위로부터 선택된다.

한 구현예에서 제 1 디술피드-연결 폴리펩티드 및 제 2 디술피드-연결 폴리펩티드는 인간 기원의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 한 구현예에서 인간 기원의 CH2 도메인 및 CH3 도메인은 클래스 IgG 또는 IgE 의 인간 항체의 것이다. 한 구현예에서 CH2 도메인 및 CH3 도메인은 서브클래스 IgG1, 또는 IgG2, 또는 IgG3, 또는 IgG4 의 인간 항체의 것이다. 한 구현예에서 CH2 도메인은 SEQ ID NO: 85 의 아미노산 서열을 포함한다. 한 구현예에서 CH2 도메인은 서브클래스 IgG1 또는 IgG2 의 인간 항체의 것이며 E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330, 및/또는 P331 (번호화는 Kabat 의 EU 인덱스에 따름) 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 구현예에서 CH2 도메인은 서브클래스 IgG1 의 인간 항체 또는 돌연변이 L234A 및 L235A, 및/또는 돌연변이 D265A 및 N297A 를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 포함하고/하거나 돌연변이 P329G 를 포함하는 인간 서브클래스 IgG2 의 것이다. 한 구현예에서 CH2 도메인은 돌연변이 L234A 및 L235A, 및/또는 P329G 를 갖는 서브클래스 IgG1 의 인간 항체의 것이다. 한 구현예에서 CH2 도메인은 돌연변이 S228P 및/또는 L235E 를 갖는 서브클래스 IgG4 의 인간 항체의 것이다.

한 구현예에서 제 1 디술피드-연결 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 89 의 아미노산 서열을 포함하고 제 2 디술피드-연결 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 90 의 아미노산 서열을 포함한다.

한 구현예에서 제 1 및 제 2 디술피드-연결 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 101 의 아미노산 서열을 포함한다.

한 구현예에서 제 1 디술피드-연결 폴리펩티드 또는 제 2 디술피드-연결 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 97 또는 SEQ ID NO: 98 의 아미노산 서열로 이루어진다.

한 구현예에서 제 1 디술피드-연결 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 102 의 아미노산 서열을 포함하고 제 2 디술피드-연결 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 103 의 아미노산 서열을 포함한다.

한 구현예에서 디술피드-연결 폴리펩티드는 2 또는 3 또는 4 개의 디술피드 결합에 의해 연결된다.

한 구현예에서 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(i) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 139 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 링커 펩티드.

(iv) SEQ ID NO: 83 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 링커 펩티드,

(vi) SEQ ID NO: 136 의 아미노산 서열을 갖는 제 3 링커 펩티드, 및

(vii) 적어도 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

(ii) SEQ ID NO: 139 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 링커 펩티드,

(iv) SEQ ID NO: 83 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 링커 펩티드,

(vii) 적어도 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

도 10 으로부터, 다관능 단백질이, 이와 조합되는 항원 결합 부위의 결합 특성을 유지한다는 것을 볼 수 있다 (도 10 b) 및 c)).

도 11 및 13 에서 다관능 단백질의 시험관내 효능 및 특이성을 나타낸다.

세포독성 검정을 CMV-특이적 CD8⁺ T-세포의 존재 하에 수행하였다. CMV-유래 바이러스 펩티드를 포함하는 다관능 단백질이 표적 세포의 용해/제거/분해/배제를 유도한다는 것을 볼 수 있다 (1 차 항체에 대해서는 도 11 a), 2 차 항체에 대해서는 도 11 b) 참조). EBV-유래 바이러스 펩티드 (도 11 b)) 및 제어 항체 (도 11 d) 및 e)) 를 포함하는 다관능 단백질과의 인큐베이션이 대규모 세포 용해 (자연적 용해는 약 3.5% 임) 를 초래하지 않으므로 표적 세포의 용해가 매우 특이적이라는 것을 추가로 볼 수 있다.

도 13 에서 IGF-1R 양성 폐 선암종 세포주 H460M2 의 용해를 나타낸다.

CMV-유래 펩티드 및 2 가 항체를 포함하는 다관능 단백질에 대한 EC₅₀ 값은 약 10 ng/ml 이다 (약 50 pM 에 상응). 측정한 EC₅₀ 값은 표적 세포 대 효과기 세포 비율과 독립적이다 (도 12 참조; 표적 세포 대 효과기 세포 비율이 1:3 내지 1:1, 효과적 비율 1:0.44 내지 1:0.14 에 상응함 (76% 의 효과기 세포가 CD8 양성이고 19% 가 CMV 특이적임)).

1. 친화성

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 항체, 예를 들어 항체 가변 도메인 또는 단일 도메인 항체의 쌍에서 유래한 항원 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서 항원 결합 부위는 이의 항원에 대해 해리 상수 (Kd) ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M) 이다.

한 구현예에서, Kd 는 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 측정된다.

예를 들어 이는 ~10 반응 단위 (RU) 에서 고정화 항체 CM5 칩을 사용하여 25℃ 에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 기기 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 를 사용하여 수행될 수 있다. 간단히, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc.) 을 공급처의 지시사항에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8 을 사용하여 5　㎍/ml (~0.2 μM) 로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여 대략 10 반응 단위 (RU) 의 커플링된 단백질을 수득한다. 항원 주입 후, 1　M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 블로킹한다. 반응속도 측정을 위해, Fab 의 2 배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM) 을 대략 25 ㎕/분의 유속에서 25℃ 에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20^TM) 계면활성제 (PBST) 와 함께 PBS 중 주입한다. 결합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off) 를 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅하여, 간단한 1 대 1 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델 (BIACORE® Evaluation Software version 3.2) 을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd) 를 비율 k_off/k_on로서 계산한다. 예를 들어, [Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881] 을 참고한다.

2. 발현

HEK 293 및 CHO 세포에서의 상이한 비-디술피드-연결 2 가 다관능 단백질 (상이한 링커, HLA 및 β2-마이크로글로불린의 상이한 조합) 의 발현은, 적어도 검출가능하다면, 소포체 내에서, 비-디술피드-연결 2 가 다관능 단백질의 축적을 초래하였으며, 즉, 적어도 검출가능하다면, 비-디술피드-연결 2 가 다관능 단백질의 단리 및 분비가 강력하게 악화되었다.

비-디술피드-연결 다관능 단백질이 배양 배지로 분비되지 않는 것은, 다관능 단백질이 하기 표에서 개략적으로 나타낸 바와 같은 폴리펩티드 중 하나를 포함하는 것으로 의도된 경우, 검출될 수 있다.

표.

표.

MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래 펩티드로 형성된 2 개의 비-디술피드-연결 항원 제시 도메인, 및 항체의 하나 이상의 가변 도메인 및 하나의 불변 도메인을 포함하는 다관능 단백질의 발현, 및 특히 분비가 진핵 세포에서는 가능하지 않다는 것이 발견되었다.

또한, MHC 클래스 I 단백질 다관능 단백질에 연결된 바이러스-유래 펩티드로 형성된 2 개의 비-디술피드-연결 항원 제시 도메인, 하나 이상의 가변 도메인, 및 항체 힌지 부위를 포함하는 다관능 단백질의 발현, 및 특히 분비가 진핵 세포에서는 가능하지 않다는 것이 발견되었다.

그러나, MHC 클래스 I 단백질 복합체에 연결된 바이러스-유래 펩티드로 형성된 1 또는 2 개의 디술피드-연결 항원 제시 도메인, 및 항체의 하나 이상의 가변 도메인 및 하나의 불변 도메인을 포함하는 다관능 단백질의 발현, 및 특히 분비가 진핵 세포에서 가능하다는 것이 발견되었다. 추가로, 발현 수율은 비-디술피드-연결 복합체와 비교하여 증가한다.

따라서, 본원에서 보고한 바와 같은 다관능 단백질에서 MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래 펩티드를 포함하는 하나, 둘 또는 그 이상의 디술피드-연결 항원 제시 도메인 및 하나 이상의 항체 가변 도메인 및 하나의 항체 불변 도메인이 존재하여, 진핵 세포를 사용하여 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 재조합 생성 및 분비가 가능해질 수 있다.

따라서, MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래 펩티드의 하나, 둘 또는 그 이상의 디술피드-연결 항원 제시 도메인, 항체 중쇄 힌지 부위, 및 하나 이상의 항체 가변 도메인 및 하나의 항체 불변 도메인을 포함하는 다관능 단백질은 진핵 세포에서 재조합적으로 생성되고 진핵 세포로부터 분비될 수 있다.

따라서, 항체 중쇄 힌지 부위, 하나 이상의 쌍의 항체 가변 도메인, 임의로는 항체 불변 도메인, 및 MHC 클래스 I 단백질에 연결된 바이러스-유래 펩티드의 하나, 둘 또는 그 이상의 디술피드-연결 항원 제시 도메인을 포함하는 다관능 단백질은 진핵 세포에서 재조합적으로 생성되고 진핵 세포로부터 분비될 수 있다.

다양한 조합을 시험하였다. 다관능 단백질의 분비된 발현은 예를 들어 면역글로불린-유래 신호 펩티드의 N-말단 융합에 의해 수행될 수 있으며 이때 바이러스-유래 펩티드는 클래스 I MHC 분자에 N-말단 융합된다. 클래스 I MHC 분자 중쇄 (α1-α2-α3 결여 막관통 및 세포질 도메인) 및 경쇄 (β-마이크로글로불린) 는 유효하게 변화할 수 있다. 상이한 항원 제시 도메인은 폴리펩티드를 포함하는 항체 경쇄 또는 항체 중쇄 힌지 부위에 N-말단 융합되었다. 예시적 조합을 도 2 에 나타낸다.

하기 표에서 볼 수 있듯이, MHC-I 단백질 복합체를 포함하는 하나, 둘 또는 그 이상의 항원 제시 도메인을 포함하는 다관능 단백질은, 항원 제시 도메인이 디술피드-연결되는 경우, 가변 항체 도메인 및 항체 힌지 부위 유래 폴리펩티드의 존재 하에 발현될 수 있다. 또한 수득가능한 수율은 증가한다.

표.

일부 구현예에서 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 상이한 쌍의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 적절한 쌍이 가능해지게 하기 위해서, 놉-인투-홀 기술 또는 교차-mAb 기술을 사용하여 올바르게 연관되지 않은 다관능 단백질의 양을 감소시킬 수 있다.

놉 개질은 항체의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366W 를 나타낸다 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호화).

홀-개질은 항체의 CH3 도메인에서의 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 나타낸다 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호화).

놉 및 홀 개질에 추가로, 하나의 CH3 도메인에서의 돌연변이 S354C 및 다른 CH3 도메인에서의 돌연변이 Y349C 가 존재할 수 있다.

교차-mAb 기술은 예를 들어 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080254, WO 2009/080253, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2010/145793 에 보고되어 있다.

3. 변이체

특정 구현예에서, 본원에서 제공된 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 아미노산 서열 변이체는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 개질을 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 개질은 예를 들어, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 상기 잔기 내로의 삽입 및/또는 상기 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 생성되어 최종 구성물에 도달할 수 있다 (단, 최종 구성물이 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합을 갖는 경우).

a) 치환, 삽입 및 결실 변이체

특정 구현예에서, 하나 이상의 폴리펩티드 사슬에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 변이체가 제공된다. 하기 표에서 "예시적 치환" 의 제목으로, 아미노산 측쇄 클래스를 참조로 하여 하기 추가 기재된 바와 같이, 예시적인 변화가 제공된다. 보존적 치환을 하기 표에서 "바람직한 치환" 의 제목으로 나타낸다. 아미노산 치환은 관심 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에 도입될 수 있으며 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 ADCC 또는 CDC 에 대해 스크리닝된다.

표.

아미노산은 통상의 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 또 다른 클래스에 대한 이들 클래스 중 한 멤버의 교환을 수반할 것이다.

아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입 뿐 아니라 1 개 잔기 내지 100 개 이상 잔기 포함 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입물의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소에 대한 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 폴리펩티드 사슬의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.

b) 글리코실화 변이체

특정 구현예에서, 본원에 제공된 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 하나 이상의 폴리펩티드는 폴리펩티드(들) 가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 감소되도록 변형될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변형시켜 편리하게 이루어질 수 있어, 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거된다.

디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 항체 Fc-부위를 포함하며 이에 부착된 탄수화물은 변형될 수 있다. 포유류에 세포에 의해 생성된 선천적 Fc-부위는 통상, 일반적으로 N-결합에 의해 Fc-부위의 CH2 도메인의 Asn297 에 부착되는 분지형, 2 안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들어, [Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32] 를 참고한다. 올리고당은 예를 들어, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산 뿐 아니라 2 안테나 올리고당 구조의 "줄기" 에서 GlcNAc 에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에서의 올리고당의 개질은 특정한 향상된 특성을 갖는 항체를 생성시키기 위해 이루어질 수 있다.

한 구현예에서, (직접 또는 간접적으로) Fc-부위에 부착된 푸코오스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 포함 폴리펩티드 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 Fc-부위 중 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40% 일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들어 WO　2008/077546 에서 기재된 바와 같은 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같이, Asn 297 에 부착된 모든 당구조의 합 (예를 들어, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질, 하이브리드 및 고-만노오스 구조) 에 대하여 Asn297 에서의 당 사슬 내 평균량의 푸코오스를 계산함으로써 측정된다. Asn297 은 Fc-부위의 대략 위치 297 (Fc-부위 잔기의 EU 번호화) 에서 위치한 아스파라긴 잔기를 의미하나; Asn297 은 또한, 항체에서의 소수 서열 변이로 인해 위치 297 의 대략 ±3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다 (즉 위치 294 내지 300). 이러한 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 을 참고한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코오스-결핍" 항체 변이체에 관한 발행물의 예는: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622 를 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 부족한 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자, FUT8 , 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 및 WO 2003/085107 참고) 를 포함한다.

예를 들어, Fc-부위에 부착된 2 안테나 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되는 이등분 올리고당과 함께 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 포함 Fc-부위 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재되어 있다. Fc-부위에 부착된 올리고당 중 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 갖는 Fc-부위 변이체가 또한 제공된다. 이러한 Fc-부위 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상응하는 항체 변이체는 예를 들어 WO 97/30087; WO 98/58964; 및 WO 99/22764 에 기재되어 있다.

c) Fc -부위 변이체

특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 개질이 본원에 제공된 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 Fc-부위에 도입될 수 있으며, 이로써 Fc-부위 변이체가 생성된다. Fc-부위 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 개질 (예를 들어 치환) 을 포함하는 인간 Fc-부위 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-부위) 을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 일부이나 전부는 아닌 효과기 기능을 갖는 Fc-부위 변이체를 고려하며, 이는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 생체내 반감기가 중요한 적용물에 대한 바람직한 후보물이 되게 하나, 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC) 은 불필요하거나 유해하다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 FcγR 결합이 결핍되나 (따라서 ADCC 활성이 손실될 가능성이 있음) FcRn 결합 능력은 유지하는 것을 확실히 할 수 있다. ADCC 를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 한편, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상 FcR 발현은 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492] 의 464 페이지의 표 3 에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어 Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참조); 미국 특허 번호 5,821,337 (Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 참조) 에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI^TM 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI) 참조). 이러한 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어 [Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656] 에서 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 검정을 또한 실행하여, 항체가 C1q 에 결합할 수 없으며 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402 에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S. and Glennie M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정을 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769 참조).

감소된 효과기 기능을 갖는 Fc-부위는 Fc-부위 잔기 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (예를 들어 US 6,737,056 참조). 이러한 Fc-부위 돌연변이체는 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc-부위 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에서 치환을 갖는 Fc-부위 돌연변이체를 포함한다 (US 7,332,581).

FcR 에 대한 향상되거나 약화된 결합을 갖는 특정 Fc-부위 변이체가 기재되어 있다 (예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참조).

특정 구현예에서, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 변이체는 ADCC 를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc-부위의 위치 298, 333 및/또는 334 에서의 치환 (잔기의 EU 번호화) 을 갖는 Fc-부위를 포함한다.

일부 구현예에서, 예를 들어, US 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 에서 기재된 바와 같은 변형된 (즉, 향상되거나 약화된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 을 초래하는 변형이 Fc-부위에서 생긴다.

증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 향상된 결합을 갖는 향체 (모 IgGs 의 태아로의 이동에 책임을 가짐) (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 및 Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 가 US 2005/0014934 에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn 에 대한 Fc-부위 결합을 향상시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc-부위를 포함한다. 이러한 Fc-부위 변이체는 Fc-부위 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환을 갖는 것들, 예를 들어 Fc-부위 잔기 434 의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 7,371,826).

Fc-부위 변이체의 기타 예에 관해서는 또한 Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참조한다.

B. 재조합 방법 및 조성물

본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 예를 들어 US 4,816,567 에서 기재한 바와 같은 재조합 ㅂq법 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 한 구현예에서, 본원에 기재한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 형질전환됨) (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 한 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포) 이다. 한 구현예에서, 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 생성 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 폴리펩티드의 발현 및 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 형성에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로는 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 회수하는 것을 포함한다.

디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 재조합체 생성을 위해, 예를 들어 상기 기재한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내에 삽입한다. 이러한 핵산은 용이하게 단리될 수 있으며 종래의 절차를 사용하여 서열분석될 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용).

클로닝 또는 발현 벡터에 대해 적합한 숙주 세포는 본원에 기재한 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 박테리아이서 생성될 수 있다 (특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우). 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523 을 참조한다 (또한, 대장균에서의 항체 단편 발현을 기재하고 있는 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 참조). 발현 후, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 가용성 분획물 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가 정제될 수 있다.

원핵생물에 추가로, 사상균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물이 폴리펩티드-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다 (예컨대 그의 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 부분 또는 전체 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체가 생성되게 하는 진균 및 효모 균주). Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 를 참조한다.

글리코실화된 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 발현을 위한 적합한 숙주세포는 또한 다세포 유기체 (무척추 동물 및 척추동물) 로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 도둑나방 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인된 바 있다.

식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생성시키기 위한 PLANTIBODIES^TM 기술을 기재하고 있음) 를 참조한다.

척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장할 수 있게끔 맞추어진 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포의 기타 예는 SV40 으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장주 (예를 들어 [Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74] 에서 기재된 바와 같은 HEK 293 또는 293 세포); 햄스터 새끼 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 [Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252] 에서 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방암 (MMT 060562); 예를 들어 [Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68] 에서 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예컨대 DHFR^- CHO 세포 (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생성에 유용한 특정 포유류 숙주 세포 검토를 위해서는, 예를 들어 [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268] 를 참조한다.

C. 약학 제형

본원에 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 약학 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 이용한 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 비제한적으로: 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 산화방지제 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함한다. 본원의 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 사이질 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX® Baxter International, Inc.) 을 추가로 포함한다. 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법 (rhuPH20 포함) 은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP 는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나아제 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.

예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 US 6,171,586 및 WO　2006/044908 에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.

본원의 제형은 또한 치료하는 특정 징후에 필요한 바에 따라 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

활성 성분은, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 에서 또는 마크로에멀젼 중에서, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해, 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)] 에 개시되어 있다.

서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다 (매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태임).

생체내 투여에 사용하는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균성은 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

D. 치료 방법 및 조성물

본원에 보고한 바와 같은 임의의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 치료 방법에서 사용될 수 있다.

한 측면에서, 약제로서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 제공된다.

추가 측면에서, 암 치료에서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 제공된다.

특정 구현예에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 제공된다.

특정 구현예에서, 본 발명은 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 바이러스 감염을 갖는 개인의 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 제공한다. 이러한 한 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 하기에 기재한 바와 같은 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.

추가 구현예에서, 본 발명은 암 세포 또는 바이러스 감염 세포를 제거하는데 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 암 세포를 제거하기 위해 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에서의 암 세포 또는 바이러스-감염 세포의 제거 방법에서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 제공한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 약제 생산 또는 제조에 있어서의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 용도를 제공한다. 한 구현예에서, 약제는 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 약제는 유효량의 약제를 암 또는 바이러스 감염을 갖는 개인에게 투여하는 것을 포함하는 암 또는 바이러스 감염 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 이러한 한 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 약제는 암 세포 또는 바이러스 감염 세포의 제거를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 암 세포 또는 바이러스 감염 세포를 제거하기 위해 유효량의 약제를 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에서의 암 세포 또는 바이러스 감염 세포 제거 방법에서 사용하기 위한 것이다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 방법은 이러한 암 또는 바이러스 감염을 갖는 개인에게 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 개인에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예에 따른 "개인" 은 인간일 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 개인에서의 암 세포 또는 바이러스 감염 세포를 제거하기 위한 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 방법은 암 세포 또는 바이러스 감염 세포를 제거하기 위해 유효량의 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 개인에게 투여하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, "개인" 은 인간이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 예를 들어 상기 임의의 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에 보고한 바와 같은 임의의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고한 바와 같은 임의의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학 제형은 본원에 보고한 바와 같은 임의의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 및 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.

본 발명의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 치료요법에 있어서 다른 작용제와 조합으로 또는 단독으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 하나 이상의 추가적인 치료제와 동시-투여될 수 있다.

상기 나타낸 이러한 조합 치료요법은 조합 투여 (둘 이상의 치료제가 동일 또는 개별 제형 중에 포함됨) 및 개별 투여 (이 경우, 본 발명의 다관능 단백질 투여는 추가적인 치료제 및/또는 아쥬반트의 투여 전에, 이와 동시에, 및/또는 그 후에 발생할 수 있다) 를 포함한다. 본 발명의 다관능 단백질은 또한 방사선 치료요법과 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 (및 임의의 추가적인 치료제) 은 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국부 치료에 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로, 부분적으로는 투여가 간략한 것인지 또는 만성적인 것인지에 따라 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의한 것일 수 있다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다수 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 비제한적으로 포함하는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.

본 발명의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 표준 의료 행위 기준 (good medical practice) 과 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고 투여될 수 있다. 이러한 맥락에 있어서의 고려를 위한 인자는 치료하는 특정 장애, 치료하는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의사에게 공지된 기타 인자를 포함한다. 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 의문의 장애를 예방하거나 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화될 필요는 없으나 임의로는 제형화된다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 중에 존재하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 토의한 기타 인자에 따라 좌우된다. 이들은 일반적으로 동일 투약량으로, 본원에 기재된 바와 같은 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투약량의 약 1 내지 99% 로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정되는 임의의 경로에 의해 사용된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 적절한 투약량 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 추가 치료제와 조합으로 사용되는 경우) 은 치료할 질환의 유형, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 예방용으로 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 이력 및 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에 대한 반응, 및 참여 의사의 재량에 따라 좌우될 것이다. 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 적합하게는 일련의 치료에 걸쳐 또는 한번에 환자에게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1　㎍/kg 내지 15　mg/kg (예를 들어 0.5 mg/kg　-　10　mg/kg) 의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 예를 들어 하나 이상의 개별 투여에 의한, 또는 연속 투입에 의한 환자에 대한 투여용의 초기 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 1 일 투약량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여를 위해서, 상태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 수 있다. 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 하나의 예시적 투약량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10　mg/kg 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3 주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6 회 용량의 항체를 받도록) 투여될 수 있다. 초기의 높은 로딩 용량, 이후 하나 이상의 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 계획이 유용할 수 있다. 이러한 치료요법의 진행은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.

임의의 상기 제형 또는 치료 방법이 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 대신 또는 이에 추가로 본 발명의 면역접합체를 사용하여 실행될 수 있다는 것이 이해된다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 환자에서의 암 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이며, 이때 상기 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에 포함된 바이러스-유래 펩티드로 환자를 면역화시키기 전에, 동시에 또는 그 후에 투여된다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 측면은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에 포함된 바이러스-유래 펩티드에 대한 면역화와 조합으로 암 또는 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 용도이다.

제 1 단계에서 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에 포함된 바와 같은 바이러스-유래 펩티드가 치료할 개인에게 먼저 투여된다. 특정 기간 후에, 즉 4 일 내지 28 일, 본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질이 개인에게 투여된다.

본원에서 보고한 바와 같은 디술피드-연결 다가 다관능 단백질에서 제 1 단계 단독으로 또는 제 2 단계에서, 이러한 바이러스-유래 펩티드의 연속적이고 분리된 적용에 의해, 바이러스-유래 펩티드 특이적 T-세포의 수를 증가시키고, 그에 따라 치료 효능을 증가시킬 수 있다.

III . 제조 물품

본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 이와 연관된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 상기 용기는 자체적으로 조성물을 보유하거나 병상을 치료, 예방 및/또는 진단하기에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사침에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 다관능 단백질이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택한 병상의 치료에 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 조성물을 함유하는 제 1 용기 (여기서 상기 조성물은 본 발명의 다관능 단백질을 포함함); 및 (b) 조성물을 함유하는 제 2 용기 (여기서 상기 조성물은 추가의 세포독성 또는 다르게는 치료제를 포함함) 를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예의 제조 물품은 상기 조성물이 특정 병상을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 세균발육저지 주사용수 (BWFI), 인산완충식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예컨대 기타 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

임의의 상기 제조 물품이 본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질 대신 또는 이에 추가로 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있다는 것이 이해된다.

IV . 특정 구현예

1. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- 둘 이상의 항원 제시 도메인,

- 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위,

이때, 각각의 항원 제시 도메인은 서로 독립적으로 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함함:

(i) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(ii) β2-마이크로글로불린,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) β2-마이크로글로불린,

하나 이상의 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성하거나, 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인을 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

2. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- 하나의 항원 제시 도메인,

- 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함함:

(i) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(ii) β2-마이크로글로불린,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) β2-마이크로글로불린,

항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성하거나, 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

3. 항목 1 또는 2 에 있어서, 항체 Fc-부위가 제 1 및 제 2 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하고, 이로써 항원 결합 부위 또는 항원 결합 부위들 중 하나가 제 1 Fc-부위 폴리펩티드 및 제 2 항원 결합 부위를 포함하고, 존재하는 경우, 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 항원 결합 부위가 서로 독립적으로 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질: i) 항체 중쇄 및 항체 경쇄 한 쌍, 또는 ii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFv 항체 단편 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFv 융합 폴리펩티드, 또는 iii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFab 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFab 융합 폴리펩티드.

5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, i) 항원 제시 도메인이 항원 결합 부위의 중쇄의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 연결되거나, ii) 하나의 항원 제시 도메인이 각 항원 결합 부위의 중쇄의 각 N-말단 또는 경쇄의 각 N-말단에 연결되거나, iii) 항원 제시 도메인이 항원 결합 부위의 중쇄의 C-말단 또는 경쇄의 C-말단에 연결되거나, vi) 하나의 항원 제시 도메인이 각 항원 결합 부위의 중쇄의 각 C-말단 또는 경쇄의 각 C-말단에 연결되거나, v) 항원 제시 도메인이 scFv 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나, vi) 하나의 항원 제시 도메인이 각 scFv 융합 폴리펩티드의 각 N- 또는 C-말단에 연결되거나, vii) 항원 제시 도메인이 scFab 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나, viii) 하나의 항원 제시 도메인이 각 scFab 융합 폴리펩티드의 각 N- 또는 C-말단에 연결되거나, ix) 항원 제시 도메인이 제 2 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나, x) 하나의 항원 제시 도메인이 제 1 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되고 하나의 항원 제시 도메인이 제 2 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 암 세포 표면 항원이 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, T-세포 반응 유도 펩티드가 바이러스-유래 펩티드인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, T-세포 반응 유도 펩티드가 CD8⁺-T-세포 반응 유도 펩티드인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

9. 항목 7 또는 8 에 있어서, 바이러스-유래 펩티드가 인간 거대세포 바이러스-유래 펩티드인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 바이러스-유래 펩티드가 SEQ ID NO: 01 ~ SEQ ID NO: 70 의 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 바이러스-유래 펩티드가 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자가 HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-C*0304, HLA-C*0401, 및 HLA-C*0702 를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

13. 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자가 다관능 단백질이 투여되는 개인의 지역에 따라 하기와 같이 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질:

- 동남아시아 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-B*1504, HLA-C*0102, HLA-C*0304, HLA-C*0702, 및 HLA-C*0801 을 포함하는 군에서 선택됨.

14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자가 다관능 단백질이 투여되는 개인의 지역에 따라 하기와 같이 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질:

- 호주인 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*2402, HLA-B*1301, HLA-C*0102, 및 HLA-C*0401 을 포함하는 군에서 선택되고,

- 동남아시아 기원의 개인에 대해 클래스 I MHC 분자는 HLA-A*2402 임.

15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자가 HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA-B*6701, 및 HLA-B*7802 를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

16. 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, β2-마이크로글로불린이 인간 β2-마이크로글로불린이고 상대 빈도 10% 이상인 클래스 I MHC 분자가 인간 HLA-A*0201 인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

17. 항목 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 항원 제시 도메인이 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질:

(i) 바이러스-유래 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린,

(iii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201, 및

(iv) 적어도 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함, 또는 적어도 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함,

또는

(i) 바이러스-유래 펩티드,

(ii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201,

(iii) β2-마이크로글로불린, 및

(iv) 적어도 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함, 또는 적어도 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

18. 항목 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, β2-마이크로글로불린이 SEQ ID NO: 71 의 아미노산 서열 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

19. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 이 SEQ ID NO: 72 또는 SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열 또는 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

20. 항목 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 항원 제시 도메인이 N - 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질:

(vii) 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

21. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 항원 제시 도메인이 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질:

(v) SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열을 가지며 1 내지 10 개 아미노산 교환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 이의 변이체인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,

(vi) SEQ ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84, 136 을 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 3 링커 펩티드, 및

(vii) 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성.

22. 항목 21 에 있어서, 하기를 특징으로 하는 다관능 단백질:

- 제 1 링커 펩티드가 SEQ ID NO: 139 의 아미노산 서열을 가짐, 및/또는

- 제 2 링커 펩티드가 SEQ ID NO: 83 의 아미노산 서열을 가짐, 및/또는

- 제 3 링커 펩티드가 SEQ ID NO: 136 의 아미노산 서열을 가짐.

23. 항목 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 클래스 IgG 또는 클래스 IgE 의 인간 항체의 항체 Fc-부위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

24. 항목 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 서브클래스 IgG1, 또는 IgG2, 또는 IgG3, 또는 IgG4 의 인간 항체의 항체 Fc-부위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

25. 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 서브클래스 IgG1 또는 IgG2 의 인간 항체의 것이며 E233, L234, L235, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, P329, A330, 및/또는 P331 에 있어서의 하나 이상의 돌연변이 (번호화는 Kabat 의 EU 인덱스에 따름) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 돌연변이 L234A 및 L235A, 및/또는 돌연변이 D265A 및 N297A 를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 함유하고/함유하거나 돌연변이 P329G 를 함유하는 서브클래스 IgG1 또는 인간 서브클래스 IgG2 의 인간 항체의 것인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

27. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 돌연변이 L234A 및 L235A 및/또는 P329G 를 갖는 서브클래스 IgG1 의 인간 항체의 것인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

28. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 돌연변이 S228P 및/또는 L235E 를 갖는 서브클래스 IgG4 의 인간 항체의 것인 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

29. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 제 1 및 제 2 항체 Fc-부위 폴리펩티드가 서로 독립적으로 SEQ ID NO: 87 ~ 103 을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

30. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 SEQ ID NO: 94 의 아미노산 서열을 갖는 2 개의 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

31. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 SEQ ID NO: 100 의 아미노산 서열을 갖는 2 개의 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

32. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 SEQ ID NO: 101 의 아미노산 서열을 갖는 2 개의 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

33. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 SEQ ID NO: 89 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 Fc-부위 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 90 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

34. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 SEQ ID NO: 97 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 Fc-부위 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 98 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

35. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc-부위가 SEQ ID NO: 102 의 아미노산 서열을 갖는 제 1 Fc-부위 폴리펩티드 및 SEQ ID NO: 103 의 아미노산 서열을 갖는 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

36. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 2 개의 항원 제시 도메인:

(i) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(ii) β2-마이크로글로불린,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) β2-마이크로글로불린,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성하거나, 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

37. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

38. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 2 개 항원 제시 도메인:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성하거나 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

39. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

40. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

41. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- SEQ ID NO: 104 ~ 106 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하는, 하나 이상의 항원 결합 부위.

42. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

43. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포 함하는 2 개의 항원 제시 도메인:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, 각각 SEQ ID NO: 105 ~ 107 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 110 ~ 112 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하는, 2 개의 항원 결합 부위.

44. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 105 ~ 107 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 110 ~ 112 를 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위는 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드 중 하나인, 하나 이상의 항원 결합 부위.

45. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 104 ~ 106 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위는 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드 중 하나인, 하나 이상의 항원 결합 부위,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 가변 도메인 중 하나의 N-말단에 연결됨.

46. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- N- 에서 C-말단 방향으로 포함하는 2 개의 항원 제시 도메인:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, 각각 SEQ ID NO: 104 ~ 106 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위는 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드인, 2 개의 항원 결합 부위,

47. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, 각각 SEQ ID NO: 105 ~ 107 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 110 ~ 112 를 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하여, 이로써 항체 중쇄의 Fc-부위는 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드인, 2 개의 항원 결합 부위,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 중쇄 가변 도메인 중 하나의 N-말단에 연결됨.

48. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

49. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- SEQ ID NO: 117 또는 137 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- SEQ ID NO: 118 의 1 개 폴리펩티드 사슬,

- 각각의 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

이때, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성하거나 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

50. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- SEQ ID NO: 117 또는 137 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

- 각각의 SEQ ID NO: 119 의 2 개 폴리펩티드 사슬,

51. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

- N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 하나의 항원 제시 도메인:

(i) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(ii) β2-마이크로글로불린,

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

또는

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(iii) β2-마이크로글로불린,

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

52. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) β2-마이크로글로불린, 및

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

53. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 정확히 하나의 항체 Fc-부위, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

54. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

55. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 하나 이상의 항원 결합 부위.

56. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

57. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

- 흑색종-연관 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 (MCSP) 에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO: 104 ~ 106 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 경쇄 및 SEQ ID NO: 108 ~ 110 을 포함하는 가변 도메인을 갖는 항체 중쇄를 포함하는 하나 이상의 항원 결합 부위.

58. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

59. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

60. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

61. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

62. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

63. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:

(i) SEQ ID NO: 01 의 T-세포 반응 유도 펩티드,

(ii) SEQ ID NO: 71 의 β2-마이크로글로불린, 및

64. 항목 1 내지 63 중 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 108 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, SEQ ID NO: 109 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 SEQ ID NO: 110 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

65. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 104 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

66. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 108 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; SEQ ID NO: 109 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; SEQ ID NO: 110 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 104 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

67. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 111 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, SEQ ID NO: 112 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 SEQ ID NO: 110 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

68. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 107 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

69. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 111 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; SEQ ID NO: 112 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; SEQ ID NO: 110 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 107 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; SEQ ID NO: 105 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 SEQ ID NO: 106 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

70. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 114 의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 113 의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

71. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 114 의 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 113 의 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

72. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 114 및 SEQ ID NO: 113 을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

73. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 116 의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 115 의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

74. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 116 의 항체 중쇄 가변 도메인; 및 SEQ ID NO: 115 의 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

75. 항목 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, MCSP 결합 부위가 SEQ ID NO: 116 및 SEQ ID NO: 115 를 포함하는 것을 특징으로 하는 다관능 단백질.

76. 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 따른 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 인코딩하는 핵산.

77. 항목 76 의 핵산을 포함하는 숙주 세포.

78. 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 따른 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.

79. 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 다관능 단백질.

80. 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 암 또는 바이러스 감염 치료에 사용하기 위한 다관능 단백질.

81. 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적에게 유도하는데 사용하기 위한 다관능 단백질.

82. 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 암 세포 또는 바이러스 감염 세포 제거에 사용하기 위한 다관능 단백질.

83. 하기 단계를 포함하는, 항목 1 에 따른 디술피드-연결 다가 다관능 단백질의 재조합 생성 방법:

- 항목 76 에 따른 핵산을 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계, 및

- 세포 또는 배양 배지로부터 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 회수하는 단계,

이때, 상기 디술피드-연결 다가 다관능 단백질은 β2-마이크로글로불린 및 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 을 포함하는 정확히 둘 이상의 항원 제시 도메인을 포함하고, 상기 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성하거나 항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.

84. 약제 제조에 있어서의, 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 따른 다관능 단백질의 용도.

85. 항목 84 에 있어서, 약제가 암 또는 바이러스 감염 치료를 위한 것인 용도.

86. 항목 84 에 있어서, 약제가 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적에 유도하기 위한 것인 용도.

87. 항목 84 에 있어서, 약제가 암 세포 또는 바이러스-감염 세포 제거를 위한 것인 용도.

88. 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적에게 유도하기 위한, 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 따른 유효량의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개인에서의 표적에 대해 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 유도하는 방법.

89. 암 세포 또는 바이러스-감염 세포를 제거하기 위한, 항목 1 내지 75 중 어느 하나에 따른 유효량의 디술피드-연결 다가 다관능 단백질을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에서의 암 세포 또는 바이러스-감염 세포를 제거하는 방법.

전술한 발명이 이해의 목적으로 설명 및 예시로서 일부 상세히 기재되었으나, 상세한 설명 및 실시예가 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본원에 인용한 모든 특허 및 과학 문헌의 개시물은 그 전체가 참조로 명백히 포함된다.

V. 실시예

하기의 것은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 주어진 일반적 설명을 고려하여, 각종 기타 구현예가 실행될 수 있다는 것이 이해된다.

실시예 1

인간 공여자로부터의 CMV-특이적 CD8 양성 T-세포의 단리 및 자극에 대한 절차

PBL 의 단리

PBL 을 인간 공여자 혈액으로부터 Ficoll 구배 원심분리에 의해 단리하였다 (Greiner bio-one, 카탈로그 번호 227290). PBL 을 5% 인간 혈청 (Sigma 카탈로그 번호 H2520), 2 mM L-글루타민 (PAN Biotech, 카탈로그 번호 P04-80100), 100 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 14001100) 이 보충된 RPMI 에서 배양하였다.

PBL 의 자극

세포 (2 x 10⁷ 세포/ml) 를 50 ㎍/ml CMV pp65-유래 펩티드 (SEQ ID NO: 01) 가 보충된 세포 배양 배지에서 세포 배양 조건 (37℃, 5% CO₂, 80% 습도) 하에 2 시간 동안 배양하였다. 그 후 세포 현탁액을 배양 배지로 20-배 희석하고 96 웰 당 2 x 10⁵ 세포의 시딩 밀도로 평평 바닥 96-웰 플레이트에서 추가 배양하였다. 4 내지 5 일 후, 20 U/ml IL-2 (Roche, 카탈로그 번호 11011456001), 25 ng/ml IL-7 (Peprotech, 카탈로그 번호 200-01) 및 25 ng/ml IL-15 (Peprotech, 카탈로그 번호 200-15) 를 첨가하고, 세포를 추가 7 내지 8 일 동안 배양하였다. T-세포의 자극은 세포 무리로서 현미경 하에 가시적이었다.

PBL 의 재자극

동일 공여자의 펩티드-펄스 자가조직 1 차 PBL (새로 제조된 것이거나 동결 저장물로부터 유래한 것) 인 자극기 세포와 T-세포를 동시 배양하였다. 자극기 세포를 상기 기재한 바와 같은 펩티드로 펄스화하였다. 펩티드 인큐베이션 2 시간 후, PBL 을 방사선조사하고 (4000 rad; STS GmbH OB29 Nr.9510-5), 펩티드가 없는 배양 배지로 2 회 세척하였다. 재자극을 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 실행하였다. 8 x 10⁴ 내지 1 x 10⁵ 자극기 세포를 96 웰 당 사용하였다. 1 차 배양물로부터의 세포를 배양 배지로 2 회 세척하고, 200 ㎕ 배양 배지 중 재현탁하고, 80 ㎕ 을 자극기 세포의 각 웰에 옮겼다. 3 일 후 20 U/ml IL-2, 25 ng/ml IL-7 및 25 ng/ml IL-15 를 첨가하였다. 세포는 증식하였으며 새로운 배지를 갖는 새 웰에서 2 내지 3 일 마다 확장되었다.

T-세포의 분석

세포를 CD8 발현 (BD, 카탈로그 번호 345772) 및 CMV-특이적 T-세포 수용체 (ProImmune, 카탈로그 번호 F008-4A-E) 에 대해 염색하고 FACS 에서 분석하였다.

세포 배양 배지

RPMI1640 (PAN Biotech, 카탈로그 번호 P04-17500), 5% 인간 혈청 (HS; Sigma 카탈로그 번호 H2520), 2 mM L-글루타민 (PAN Biotech, 카탈로그 번호 P04-80100), 100 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 카탈로그 번호 14001100).

결과

4 개의 인간 공여자 유래 말초 혈액 림프구 (PBL) 의 FACS 분석을 수행하였다. 상기 세포를 APC-접합 Pro5 오량체 (ProImmune, 카탈로그 번호 F008-4A-E) 와 조합된 FITC-접합 항-CD8 항체 (BD, 카탈로그 번호 345772) 로 표지하여, CMV-유래 펩티드 (NLVPMVATV (SEQ ID NO: 01)) 로 로딩된 MHC-클래스 I (HLA-A*0201) 을 인지하는 T-세포 수용체 (TCR) 를 운반하는 T-세포를 염색하였다. 결과에 대해서는 도 4 를 참조한다. 제 0 일에 공여자 1 및 4 는 적은 수의 CMV-특이적 CD8 T-세포 (각각 0.08% 및 0.1%) 를 가졌다. 공여자 2 및 3 은 말초 혈액에서 높은 수의 CMV-특이적 CD8 T 세포 (각각 0.25% 및 3.12%) 를 가졌다. CMV-유래 펩티드 펄스화 자가조직 세포로 자극한 후 14 일 후에, 오직 공여자 2 및 3 만이 CMV-특이적 CD8 T 세포에 있어서 유의한 증가를 나타낸 한편 (각각 6.2% 및 71.2%), 공여자 1 및 4 는 증가된 수의 CMV-특이적 CD8 T 세포를 나타내지 않았다 (각각 0.01% 및 0.05%). CMV-유래 펩티드 펄스화 자가조직 세포로의 제 2 자극 후 추가 14 일 후에, 공여자 2 및 3 은 CMV-특이적 CD8 T 세포에 있어서 추가적 증가를 나타내었다 (각각 15.1% 및 96.6%).

실시예 2

세포독성 검정

급성 림프구성 백혈병 세포 MN60 은 A*0201 HLA-A 대립형질을 갖는다. MN60 세포 (1 x 10⁶ 세포/ml) 를 50 ㎍/ml CMV pp65 펩티드 (SEQ ID NO: 01) 와 함께 세포 배양 조건 (37℃, 5% CO₂, 80% 습도) 하에 45 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션으로 인해, HLA-A*0201 펩티드 결합 그루브에서의 펩티드 교환이 초래된다. 펩티드 교환된 MN60 세포를 원심분리하고 PBS (PanBiotech, 카탈로그 번호 P04-36500) 로 1 x 10⁶ 세포/ml 의 밀도로 희석하고, 1 μM 의 세포 추적제 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, Invitrogen, 카탈로그 번호 34554) 로 15 분 동안 실온 (RT) 에서 염색하였다. 그후 세포를 PBS 로 1 회 세척하고, AIM-V 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 0870112DK) 로 1 x 10⁵ 세포/ml 로 희석하였다. 검정을 위해 MN60 세포 (표적 세포) 를 CMV-특이적 인간 공여자 3 유래 CD8⁺ T-세포 (효과기 세포, 실시예 1 참조) 와 함께 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 세포 배양 조건 하에 4 시간 동안 동시 배양하였다. 효과기 대 표적 세포 비율은 4:1 이었다. 사멸 세포를 1 ㎕/100 ㎕ 프로피듐 요오드화물 (PI, Sigma, 카탈로그 번호 P-4864) 로 염색하고 FACS 분석하였다.

결과

유세포 분석을 수행하여, CMV 펩티드로 로딩된 MN60 종양 세포의 용해를 통해 자극 CTL 의 세포용해 능력을 분석하였다:

CMV-유래 펩티드로 로딩되지 않은 MN60 세포의 동시 배양을 수행하였다. MN60 세포는 FITC-양성이었다. 효과기 세포는 FITC-음성이었다. 사멸 세포는 PI 양성이었고, 생존 세포는 PI-음성이었다. CMV-유래 펩티드로 로딩되지 않은 경우, 85% 초과의 MN60 세포가 생존하였다 (Q2 및 Q4).

CMV-유래 펩티드로 로딩된 MN60 세포의 동시 배양을 수행하였다. 80% 초과의 MN60 세포가 사멸한 한편 (Q2 및 Q4), 생존 및 사멸 효과기 세포의 비율은 CMV-펩티드-로딩된 표적 세포의 특이적인 용해를 나타내는 FACS 분석 사이에서 두드러지게 변경되지 않았다.

효과기 대 표적 세포의 비율에 따른, CMV 펩티드로 로딩된 MN60 종양 세포의 용해를 통한 자극 CTL 의 세포용해 능력을 분석하기 위한 유세포 분석:

상기 기재한 바와 같이 세포독성 검정을 수행하였다. 상이한 효과기 세포 대 표적 세포 비율을 표적 세포 당 0.5 개 효과기 세포 내지 표적 세포 당 4 개 효과기 세포의 범위로 적용하였다. 인큐베이션 시간은 4 시간이었다. CMV-유래 펩티드로 로딩되지 않은 MN60 세포는 증가된 효과기 대 표적 비율로의 증가된 수의 사멸 세포 (즉, 비율 0.5:1 내지 4:1 로의 8% 내지 13% 범위) 를 나타내지 않았다.

CMV-유래 펩티드로 로딩된 거의 20% 의 MN60 세포는 낮은 효과기 대 표적 비율 0.5:1 로, 4 시간 내에 이미 사멸되었다. 사멸 세포의 수는 표적 세포 당 4:1 효과기 세포의 비율로 83% 까지 도달하여, 효과기 대 표적 비율 증가와 함께 가파르게 증가하였다.

실시예 3

DNA 제조, 트랜스펙션, 발현, 정제 및 분석

DNA 제조

250 ml 의 밤샘 박테리아 LB 배양물을 수확하고 플라스미드 DNA 를 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다 (High speed Maxi kit, Qiagen, 카탈로그 번호 12663). 생성된 플라스미드 DNA 를 1 ml TE 완충액 중 용리하고 DNA 농도를 분광광도 측정에 의해 측정하였다 (Epoch, BioTek).

최종 발현 벡터는 하기의 요소를 포함하였다:

- 엔도뉴클레오리틱 제한 위치 HindIII, NheI,

- CMV-프로모터,

- 5'UTR 1 (인간 CMV 에서 유래),

- 인트론 A,

- 5'UTR 2,

- 암피실린-저항성 유전자,

- BGH 폴리 A 위치 (소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호),

- pUC Ori.

CMV-유래 펩티드 및 IGF1R 결합 특이부 (항-IGF1R 항체) 를 포함하는 다관능 단백질의 요소의 아미노산 서열:

CMV pp65 펩티드: SEQ ID NO: 01

NLVPMVATV

링커 1: SEQ ID NO: 82

GGGGSGGGGSGGGGS

β2-마이크로글로불린: SEQ ID NO: 71

링커 2: SEQ ID NO: 83

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

HLA-A*0201 α1-α3: SEQ ID NO: 72

링커 3: SEQ ID NO: 73

GS

링커 4: SEQ ID NO: 83

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

링커 13: SEQ ID NO: 136

GSG

Ig 경쇄: SEQ ID NO: 120

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체): SEQ ID NO: 121

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (놉 변이를 가짐)): SEQ ID NO: 122

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)): SEQ ID NO: 123

Ig 중쇄 Fc-부위 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (Fc-부위 놉 변이를 가짐)): SEQ ID NO: 124

scFv: SEQ ID NO: 125

CMV-유래 펩티드 및 MCSP 결합 특이부 (항-MCSP 항체) 를 포함하는 다관능 단백질의 요소의 아미노산 서열:

CMV pp65 펩티드: SEQ ID NO: 01

NLVPMVATV

링커 1: SEQ ID NO: 82

GGGGSGGGGSGGGGS

β2-마이크로글로불린: SEQ ID NO: 71

링커 2: SEQ ID NO: 83

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

HLA-A*0201 α1 - α3: SEQ ID NO: 72

링커 3: SEQ ID NO: 73

GS

링커 4: SEQ ID NO: 83

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

링커 13: SEQ ID NO: 136

GSG

Ig 경쇄: MHCI-0008

SEQ ID NO: 126

Ig 경쇄: MHCI-0030 및 MHCI-0031

SEQ ID NO: 127

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체):

MHCI-0008

SEQ ID NO: 128

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체):

MHCI-0030 및 MHCI-0031

SEQ ID NO: 129

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (놉 변이를 가짐)):

MHCI-0008

SEQ ID NO: 130

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (놉 변이를 가짐)):

MHCI-0030 및 MHCI-0031

SEQ ID NO: 131

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)):

MHCI-0008

SEQ ID NO: 132

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)):

MHCI-0030 및 MHCI-0031

SEQ ID NO: 133

Ig 중쇄 Fc-부위 (IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-부위 놉 변이체):

SEQ ID NO: 124

scFv: MHCI-0008

SEQ ID NO: 134

scFv: MHCI-0030 및 MHCI-0031

SEQ ID NO: 135

트랜스펙션

HEK 293 세포를 트랜스펙션 1 일 전에 8 x 10⁵ 세포/ml 로 희석하였다. 약 1 내지 1.6 x 10⁶ 세포/ml 을 제조사의 프로토콜에 따라 트랜스펙션하였다. 최종 트랜스펙션 부피 30 ml 에 대해서, 30 ㎍ DNA 를 Opti-MEM® I 감소 혈청 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 31985070) 를 사용하여 최종 부피 1 ml 로 희석하였다. 1 ㎍ DNA 당 2 ㎕ 의 293fectin^TM 시약 (Invitrogen, 카탈로그 번호 12347019) 을 Opti-MEM® 배지를 사용하여 최종 부피 1 ml 로 동일하게 희석하고, 5 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 희석된 DNA 를 희석된 293fectin^TM 시약에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 추가 20-30 분 동안 인큐베이션하고 그후 28 ml 의 HEK 293 세포로 적가 피펫팅하여 최종 부피 30 ml 를 수득하였다. 상기 세포를 세포 배양 조건 (37℃, 8% CO₂, 80% 습도) 하에 125 rpm 에서 회전시키는 궤도 진탕기 상에서 인큐베이션하고 72 시간 후 수확하였다. 수확물을 10 분 동안 1000 rpm 에서, 10 분 동안 3000 rpm 에서 원심분리하고 22 ㎛ 멸균 필터 (Millipore, 카탈로그 번호 SCGPU05RE) 를 통해 여과하였다.

웨스턴 블롯팅

500 ㎕ 의 세포 배양 상청액을 Pall Nanosep Omega-Membrane 30KD 원심분리 장치 (Pall, 카탈로그 번호 OD030C33) 를 사용하여 50 ㎕ 의 부피로 농축하였다. 17.5 ㎕ 의 각 농축물을 4x XT 샘플 완충액 (Bio Rad, 카탈로그 번호 161-0791) 및 20x XT 환원제 (BioRad, 카탈로그 번호 161-0792) 를 사용하여 최종 부피 25 ㎕ 로 희석하고, 8 분 동안 96℃ 에서 가열하고 4-12% Criterion XT Precast Gel (카탈로그 번호 345-0124) 상에 적용하였다. Trans-Blot SD semi-dry Transfer Cell (BioRad) 을 20 V 에서 30 분 동안 사용하여 Trans-blot Pure Nitrocellulose 멤브레인 (0.45 μm) (BioRad, 카탈로그 번호 162-0117) 상에서 블롯팅을 수행하였다. 멤브레인의 블로킹을 1x 웨스턴 블로킹 시약 (Roche, 카탈로그 번호 11921681001) 을 사용하여 1 시간 동안 실온에서 수행하였다. 퍼옥시다아제 접합 다클론 토끼 항-인간 κ-경쇄 (DAKO, 카탈로그 번호 P0129, 1:3000 희석) 및 다클론 토끼 항-인간 IgG 항체 HRP 접합체 (DAKO, 카탈로그 번호 P0214, 1:5000 희석) 를 사용하여 1 시간 동안 실온에서 염색을 수행하였다. LUMI-Imager F1 (Roche) 으로 발광 검출을 실행하였다.

정제

원심분리에 의해 세포를 배양 배지로부터 제거하였다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (AKTA-Avant 상에서 MabSelect-Sepharose) 에 의해 다관능 단백질을 상청액으로부터 정제하였다. 용리된 다관능 단백질을, Amicon 원심분리 튜브를 사용하여 3 mg/ml 의 단백질 농도로 농축하였다. 분취액을 크기 배제 크로마토그래피 (HPLC TSKgel GFC300 Sys89) 상에서 분석하였다. Superdex 200 상의 분취용 SEC 를 수행하여 응집물을 제거하고 융합 단백질을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중에서 완충하였다. 용리된 다관능 단백질을, Amicon 원심분리 튜브를 사용하여 1 mg/ml 의 단백질 농도로 농축하고 멸균 여과하였다 (0.2 μm 기공 크기).

분석

다관능 단백질 샘플을 UV 분광광도계를 사용하여 OD280 에 의해 분석하여, 용액 중 단백질 농도를 측정하였다. 이에 필요한 흡광 계수를 Pace (Pace, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423) 에 따른 아미노산 서열로부터 계산하였다. 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC) 를 TSK-Gel300SWXL 또는 Superdex 200 컬럼 상에서 0.25 M KCl, pH 7.0 을 이동상으로서 포함하는 0.2 M 인산칼륨 완충액으로 수행하여, 샘플 중의 단량체성의, 응집되고 분해된 종류의 함량을 측정하였다. 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (환원 및 비-환원) 을 수행하여, 미관련 불순물 및 생성물-관련 분해 생성물에 관해 다관능 단백질 제조물의 순도를 분석하였다. 전기분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS) 을 환원 (TCEP) 및 탈글리코실화 (N-글리코시다아제 F) 샘플로 수행하여, 각 사슬의 올바른 질량/동일성을 확인하고 화학적 개질을 검출하였다. 탈글리코실화 샘플의 ESI-MS 를 실행하여, 전체 조립된 단백질의 성질 및 품질을 분석하고 잠재적 생성물-관련 부산물을 검출하였다.

방법 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색

장치: Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell

겔: 4-20% 트리스-글리신 겔, Invitrogen EC6025BOX

완충액: 트리스-글리신 SDS 실행 완충액 (10x), Invitrogen LC2675-5

샘플 완충액: 트리스-글리신 SDS 샘플 완충액 (2x), Invitrogen LC2676

환원 완충액: NuPAGE 샘플 환원제 (10x), Invitrogen NP0004

분자량 마커: Mark 12, MW 표준품, Invitrogen LC5677

단백질 샘플 제조

완충액으로 샘플을 1 mg/ml 의 단백질 농도로 조정하였다. 샘플 환원을 위해서 하기 절차를 실행하였다:

- 환원 완충액: 4 ml 샘플 완충액 (2x) 및 1 ml 환원 완충액 (10x)

- 환원 완충액과 샘플을 1:1 로 희석함

- 5 분 동안 70℃ 에서 인큐베이션함

겔 전기영동을 125 V 에서 90 분 동안 실행하였다. 겔을 Simply Blue Safe Stain (Invitrogen, 카탈로그 번호 LC6065) 으로 염색하였다.

결과

표.

이전의 표에 따른 번호 1, 2A 및 3A 에 상응하는 구조를 갖는 선택된 다관능 단백질의 쿠마시 염색한 SDS 겔 및 상응하는 SEC 크로마토그램을 도 5 및 6 에서 나타낸다. 규정된 다관능 단백질이 수득될 수 있다는 것을 볼 수 있다.

실시예 4

인간 IGF-1R 양성 세포주에 대한 MHC-I-항-IGF-1R 다관능 단백질의 결합

H460M2 세포를 AIM-V 배지 (Gibco, 카탈로그 번호 0870112DK) 중에서 8 x 10⁵ 세포/ml 로 희석하였다. 500 ㎕ 의 세포 현탁액을 10 ㎍ 의 본원에 보고한 바와 같은 MHC-I-항-IGF-1R 다관능 단백질로 4℃ 에서, 또는 37℃ 에서 1 시간 동안 염색하였다. 그후 세포를 빙냉 AIM-V 배지로 1 회 세척하고, R-PE 에 접합된 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG (H+L) 항체 (Dianova, 카탈로그 번호 109-116-088, 1:50 희석) 인 제 2 항체로 30 분 동안 4℃ 에서 염색하였다. 그후, 세포를 빙냉 AIM-V 배지로 1 회 세척하고, 생존 세포에 개방되는 FACS Canto II (BD Bioscience) 를 통해 형광을 측정하였다. 이중특이적 항체가 동기준 대조군으로서 역할하였고, 항 IGF-1R 항체 (예를 들어 WO 2004/087756 및 WO 2007/115814 참조) 가 양성 대조군으로서 역할하였다.

결과

PE-형광 측정 (X-축) 에 있어서의 이동을 고려하여, MHC-I-항-IGF-1R 다관능 단백질은 대조군 항체와 비교하여 H460M2 표적 세포에 대한 결합에 있어서 가시적인 차이는 나타내지 않았다. MHC-I-항-IGF-1R 다관능 단백질과의 인큐베이션을 4℃ 또는 37℃ 에서 수행하는지 여부에 따라서도 차이는 없었다. 동기준 대조군과의 인큐베이션도, 형광 표지된 2 차 항체 단독과의 인큐베이션도 PE 형광 측정에 있어서 어떠한 이동도 나타내지 않았다. 클래스 I MHC 분자의 융합에도 불구하고, 본원의 MHC-I-항-IGF-1R 다관능 단백질의 항체 가변 도메인은 여전히 H460M2 표적 세포에 결합하였다.

실시예 5

시험관내 항원 발현 세포 제거

I24 표적 세포 (1x10⁵ 세포/ml) 를 WillCo 유리 바닥 디쉬 (FA. WillCo Wells BV, REF GWST-3522) 상에서 24 내지 48 시간 동안 세포 배양 배지 (2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM NEAA 및 10% (v/w) FCS 가 보충된 RPMI 1640) 에 시딩하였다. WillCo 유리 바닥 디쉬를 디쉬 당 50 ㎍/ml 폴리-L-리신 히드로클로라이드 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 P2658) 로 30 분 동안 사전 코팅하였다. 코팅 후 디쉬를 멸균 조직 배양 등급수로 꼼꼼히 헹구고 2 시간 동안 건조시켰다.

배양 후, 세포 배양 배지를 제거하고, 하나의 [CMV-pp65-펩티드]-[링커 1]-[β2-마이크로글로불린]-[링커 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[링커 3]-[IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)] 융합 폴리펩티드, 하나의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-부위 놉 변이체 디술피드-연결 폴리펩티드 및 하나의 Ig 경쇄를 포함하는 IGF-1R 결합 다관능 단백질 (이때, 상기 다관능 단백질은 본원에 보고한 바와 같이 인간 IGF-1R 에 특이적으로 결합함 (예를 들어 실시예 3 참조)) 을, 3 mM K⁺ Krebs Ringer HEPES 완충액 pH 7.3 (0.5 mM DL-디티오트레이톨, 1 mM 아스코르브산 및 4 mM 글루타티온이 보충됨) 중에서 최종 농도 5 ㎍/ml 로 첨가하였다.

T-세포를 1:10 의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 첨가하였다. Zeiss Axiovert 135 현미경을 사용하여 4 시간 동안 영상화를 수행하였다.

결과

IGF-1R 결합 다관능 단백질은 인간 IGF-1R 발현 I24 3T3 세포 (거대 착생 세포) 의 용해를 매개하였다. 용해는 인간 CMV-특이적 T-세포 (둥근 형상이거나 아메바상인 이동 세포인 소 세포) 에 의해 매개되었다. I24 세포를 5 ㎍/ml 농도의 다관능 단백질 및 인간 CMV-특이적 T-세포 (HLA-A0201⁺/CMV 펩티드 펄스화 APC 로 사전 활성화됨) 와 함께 인큐베이션하였다. 56 분 및 76 분에서의 I24 세포와 T-세포와의 상호작용 및 이후, 125 분 후 I24 세포의 붕괴를 주목한다.

본원에 보고한 바와 같은 항원 결합 다관능 단백질의 부재 하에 인간 CMV-특이적 T-세포 (둥근 형상이거나 아메바상인 이동 세포인 소 세포) 를 통한 I24 3T3 세포 (거대 착생 세포, 백색 화살표) 의 용해의 부재를 나타내는 대조군 실험을 수행하였다. I24 세포를 특이적 세포독성 T-세포 (HLA-A0201⁺/CMV 펩티드 펄스화 APC 로 사전 활성화됨) 와 함께 인큐베이션하였다. 하기 각각의 도면에서 시간 차이를 나타낸다.

실시예 6

세포독성 검정

세포 배양 배지 (50 ㎕) 를 Xcelligence 96well E-plate (Roche, 카탈로그 번호 05232368001) 의 각 웰에 피펫팅하여, 배경 측정을 수행하였다.

I24 세포를 세포 배양 배지 (RPMI 1640, 2 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM NEAA, 10% (v/w) FCS) 중에서 1x10⁶ 세포/ml 로 희석하고, 50 ㎕ (2x10⁴세포/웰) 를 Xcelligence 96 웰 플레이트의 각 웰에서 100 ㎕ 의 최종 부피로 피펫팅하고, 24 시간 동안 배양하였다 (37℃, 8% CO₂, 80% 습도). 24 시간 후 배지를 제거하고, 세포를 200 ㎕ AIM-V (무혈청 배지 (Invitrogen) T-세포 배지 (카탈로그 번호): 12055-083) 배지로 세척하였다. 하나의 [CMV-pp65-펩티드]-[링커 1]-[β2-마이크로글로불린]-[링커 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[링커 3]-[IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)] 융합 폴리펩티드, 하나의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-부위 놉 변이체 디술피드-연결 폴리펩티드 및 하나의 Ig 경쇄를 포함하는 IGF-1R 결합 다관능 단백질 (이때, 상기 다관능 단백질은 인간 IGF-1R 에 특이적으로 결합함) 을, AIM-V 배지 중 1 ㎍/ml 의 최종 농도로, 세척한 표적 세포에 첨가하였다. 상당 비율로의 효과기 세포를 AIM-V 배지에 150 ㎕ 의 최종 부피로 첨가하였다. 인간 IGF-1R 에 대해 유도된 비-푸코실화 IgG1 단일클론 항체 (항-IGF-1R 항체-비-푸코실화) 및 비-결합 인간 항-디곡시게닌 항체 (항-디곡시게닌 항체) 는 동기준 대조군 및 특이적 항체 대조군으로서 각각 역할하였다. Xcelligence System (Roche) 을 사용하여 각각 6 내지 9 시간 동안 측정을 수행하였다.

결과

IGF-1R 결합 다관능 단백질은 인간 CMV-특이적 T-세포를 통해 H460M2 종양 세포의 용해를 촉발하였다.

종양 세포를 하나의 [CMV-pp65-펩티드]-[링커 1]-[β2-마이크로글로불린]-[링커 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[링커 3]-[IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)] 융합 폴리펩티드, 하나의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-부위 놉 변이체 디술피드-연결 폴리펩티드 및 하나의 Ig 경쇄를 포함하는 1 ㎍/ml 의 다관능 단백질 (이때, 상기 다관능 단백질은 인간 IGF-1R 에 특이적으로 결합함), 및 특이적인 T-세포와 함께 각각의 비율 (1:1.5 내지 1:0.5) 로 4 시간 동안 인큐베이션하였다 (도 8 참조). 용해 백분율은 각각의 막대 위인 것으로 나타난다. 인간 IGF-1R (MAB IGF-1R-afu) 에 대해 유도된 비-푸코실화 IgG1 단일클론 항체는 유의한 종양 세포 용해를 촉발하지 않았다.

본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질은 인간 CMV-특이적 T-세포를 통한 I24 3T3 표적 세포의 용해를 촉발한다.

표적 세포를 하나의 [CMV-pp65-펩티드]-[링커 1]-[β2-마이크로글로불린]-[링커 2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[링커 3]-[IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)] 융합 폴리펩티드, 하나의 IgG1-L234A, L235A 돌연변이체 Fc-부위 놉 변이체 디술피드-연결 폴리펩티드 및 하나의 Ig 경쇄를 포함하는 1 ㎍/ml 의 항원 결합 다관능 단백질 (이때, 상기 다관능 단백질은 인간 IGF-1R 에 특이적으로 결합함), 및 특이적인 T-세포와 함께 각각의 비율 (1:1.5 내지 1:0.5) 로 4 시간 동안 인큐베이션하였다 (도 9 참조). 용해 백분율은 각각의 막대 위인 것으로 나타난다. 인간 IGF-1R 에 대해 유도된 비-푸코실화 IgG1 단일클론 항체 (항-IGF-1R 항체-비-푸코실화) 및 비-결합 인간 항-디곡시게닌 항체 (항-디곡시게닌 항체) 는 유의한 표적 세포 용해를 촉발하지 않았다.

실시예 7

시험관내 효능

IGF-1R 양성 폐 선암종 세포주 H460M2 를 hCMV-유래 펩티드 및 항-IGF-1R 항체를 포함하는 1 ㎍/ml 의 다관능 단백질 및 인간 CMV-특이적 CD8-양성 T-세포와 함께 낮은 효과기 세포 대 표적 세포 비율 (종양 세포 당 1.5 내지 0.5 특이적 T-세포) 로 인큐베이션하였다. 대조군 항체는 글리코-조작 항-IGF-1R 항체였다. 인큐베이션 시간은 6 시간이었다. 다관능 단백질과의 인큐베이션은 H460M2 종양 세포의 강력한 제거를 초래하였다.

실시예 8

상이한 MHC-I-항-MCSP 다관능 단백질의 MCSP 양성 표적 세포에 대한 결합

Colo38 세포를 5 분 동안 Accutase (PAA, 카탈로그 번호 L11-007) 와 함께 인큐베이션하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 바이알 당 2x10⁵ 세포를 1 ㎍/ml MHC-I-항-MCSP 다관능 단백질 구축물과 함께 100 ㎕ PBS/2%FCS 중에서 45 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 세포를 1 ml 냉각 PBS/2%FCS 로 세척하고 7 분 동안 910 rpm 으로 원심분리하였다. 세포를 2 ㎍/ml 에서 2 차 항체 (염소 항-인간 IgG1 항체-PE 접합체, Jackson Lab., 카탈로그 번호 109-116-088) 와 함께 100 ㎕ PBS/2%FCS 중 재현탁하고, 추가 45 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션하였다. 세포를 1 ml PBS%2%FCS 로 2 회 세척하고, BD Canto II 유세포분석기로 측정하였다. 그 결과를 도 7 에 나타낸다.

실시예 9

MCSP 양성 세포와 MHC-I-항-MCSP 다관능 단백질과의 인큐베이션

Colo38 또는 WM266-4 세포를 Accutase (PAA, 카탈로그 번호 L11-007) 와 함께 5 분 동안 인큐베이션하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 웰 당 2x10⁴ 세포의 Colo38 세포주 또는 1x10⁴ 세포의 WM266-4 세포주를 100 ㎕ 의 각각의 세포 배양 배지 (Colo38 세포주: 2 mM 글루타민, 10% FCS 로 보충된 RPMI1640; WM-266-4 세포주: 2 mM 글루타민, 10% FKS, 2 mM 나트륨 피루베이트, 2 mM NEAA 로 보충된 RPMI1640) 중에서 Eplates96 (Roche, 카탈로그 번호 05232368001) 에서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 부착 (임피던스) 을 ACEA technology (Xcelligence RTCA) 로 15 분 마다 측정하였다. 24 시간 후 (미교란 증식기) 세포를 200 ㎕ 의 AIMV-배지 (Gibco, 카탈로그 번호 0870112DK) 로 세척하였다. MHC-I-항-MCSP 다관능 단백질을, 1 ㎍/ml 의 최종 농도로, 자극된 T-세포 또는 PBMC 와 함께, 상이한 비율로 AIMV-배지 중 150 ㎕ 의 최종 부피로, 세포에 첨가하였다. 5 분 마다 동시 ACEA 측정과 함께, 추가 4 내지 48 시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. 판독은, Eplate 하부로부터 분리된 바와 같이 용해 또는 붕괴된 세포를 측정하는 임피던스 측정을 기반으로 한다. 다관능 단백질을 첨가한 후 첫 번째 측정 시점에서 세포 지수를 1 로 정규화하였다. 1 ㎍/ml 다관능 단백질 농도 (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), MHCI-0030 (3), MHCI-0031 (4)), 효과기 대 표적 세포 비율 10:1; 공여자 3 으로부터의 PBMC (200.000 세포, 공여자 3 은 CMV-양성이었으나 EBV 음성임) 및 흑색종 종양 세포주 Colo38 (20.000 세포) 에 대한 결과 및 96 웰 당 결과, 삼반복한 데이터를 도 14 에 나타낸다. 1 ㎍/ml 다관능 단백질 농도 (MHCI-0008 (1), MHCI-0010 (2), PBMC 단독 (3)), 효과기 대 표적 세포 비율 10:1; 공여자 3 으로부터의 PBMC (200.000 세포, 공여자 3 은 CMV-양성이지만 EBV 음성임) 및 흑색종 종양 세포주 Colo38 (20.000 세포) 에 대한 결과 및 96 웰 당 결과, 삼반복한 데이터를 도 15A (Colo38) 및 15B (WM266) 에 나타낸다.

실시예 10

세포독성 검정

세포 배양 배지 (50 ㎕) 를 Xcelligence 96 웰 E-plate (Roche, 카탈로그 번호 05232368001) 의 각 웰에 피펫팅하여, 배경 측정을 수행하였다.

Colo38 세포를 세포 배양 배지 (2 mM 글루타민, 10% FCS 로 보충된 RPMI1640) 중에서 1x10⁶ 세포/ml 로 희석하고 50 ㎕ (2x10⁴세포/웰) 을 Xcelligence 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 의 최종 부피로 피펫팅하고 24 시간 동안 배양하였다 (37℃, 8% CO₂, 80% 습도). 24 시간 후 배지를 제거하고 세포를 200 ㎕ AIM-V (무혈청 배지 (Invitrogen) T-세포 배지 (카탈로그 번호): 12055-083) 배지로 세척하였다. MCSP 결합 다관능 단백질 MHCI-0008 (1 가, CMV 펩티드 로딩), MHCI-0010 (1 가, EBV 펩티드 로딩 대조군), MHC-0026 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 미-결합 대조군), MHCI-0030 (1 가, CMV 펩티드 로딩, 활성) 및 MHCI-0031 (2 가, CMV 펩티드 로딩, 활성) 을 AIM-V 배지 중 1 ㎍/ml 의 최종 농도로, 세척된 표적 세포에 개별적으로 첨가하였다. 10:1 (E:T) 의 상당한 비율로의 효과기 세포를 AIM-V 배지에 150 ㎕ 의 최종 부피로 첨가하였다. 첨가 42 시간 후 Xcelligence System (Roche) 으로 측정을 수행하였다.

20.000 부착 Colo38 세포와 함께 동시 배양한 (삼반복한 96 웰 플레이트) 공여자 3 으로부터 새로이 단리한 200.000 PBMC (효과기 세포) 에 대해 수득한 결과를 도 16 에서 나타낸다 (다관능 단백질과 함께 인큐베이션하고 42 시간 후 세포의 용해). 25% 의 PBMC 는 CD8-양성 T 세포이며 이의 3% 는 20.000 Colo38 표적 세포 당 대략 1.500 CMV-pp65-펩티드-특이적 CD8+ T 세포를 초래하는 CMV-pp65-펩티드 특이적인 것이다 (실제 E:T (효과기 대 표적 세포 비율) = 1:13).

결과

MCSP 결합 다관능 단백질은 인간 CMV-특이적 T-세포를 통한 Colo38 종양 세포의 용해를 촉발하였다.

실시예 11

LDH 배출 검정

ACEA 플레이트를 7 분 동안 910 rpm 에서 원심분리하였다. 50 ㎕ 의 ACEA 상청액을 또 다른 96 웰 평평 바닥 플레이트 (Costar) 에 옮겼다. LDH 시약 (세포독성 검출 키트, Roche, 카탈로그 번호 11644793001) 1 및 2 를 제조사의 지시사항에 따라 희석하고 50 ㎕ 의 용액을 상청액에 첨가하였다. 5 내지 25 분의 인큐베이션 기간 후 Tecan Reader Sunrise (Tecan) 에서 흡수를 검출하였다. 원심분리하기 전, 1% Triton X-100 (Sigma, 카탈로그 번호 T-8787) 을 표적 세포에 첨가하여 총 용해를 검출하였다.

20.000 부착 Colo38 세포와 함께 동시 배양한 (삼반복한 96 웰 플레이트) 공여자 3 으로부터 새로이 단리한 200.000 PBMC (효과기 세포) 에 대해 수득한 결과를 도 17 (다관능 단백질과 함께 48 시간 인큐베이션한 후 LDH 가 배출됨) 에 나타낸다. 공여자 3 으로부터 새로이 단리한 200.000 PBMC 를 20.000 부착 Colo38 세포와 함께 동시 배양하였다 (삼반복한 96 웰 플레이트). 25% 의 PBMC 는 CD8-양성 T 세포이며 이의 3% 는 20.000 Colo38 표적 세포 당 대략 1.500 CMV-pp65-펩티드-특이적 CD8+ T 세포를 초래하는 CMV-pp65-펩티드 특이적인 것이다 (E:T (효과기 대 표적 세포 비율) = 1:13).

결과

실시예 12

세포독성 검정

PBMC 를 Ficoll 원심분리를 통해 전혈로부터 수득하였다. 1 ml 당 1x10⁷ PBMC 를 T-세포 배지 (10% HS, 2 mM 글루타민으로 보충된 RPMI 1640) 중 희석하고, 50 ㎍/ml CMV pp65 펩티드를 현탁액에 첨가하여 HLA-A0201 분자에서의 펩티드 교환을 수행하였다. 2-3 시간 인큐베이션 후 PBMC 를 1:10 으로 희석하고 200 ㎕ 을 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 넣었다. 제 3 일에 20 U/ml IL-2, 25 ng/ml IL-7 및 IL-15 를 첨가하였다. 14 일 후 재자극을 수행하였다.

자극된 T-세포를 96 웰 플레이트에서 2 회 세척하고 200 ㎕ T-세포 배지 중 희석하고, 그로부터 80 ㎕ 를 새 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 옮겼다.

PBMC 를 상기 프로토콜에 따라 자극하였다. 자극된 PBMC 를 4000 Gray 로의 펩티드 교환 후 방사선조사하고, T-세포 배지로 2 회 세척하고 1x10⁵ PBMC 를 80 ㎕ 의 T-세포에 피펫팅하였다. 제 3 일에 20 U/ml IL-2, 25 ng/ml IL-7 및 IL-15 를 첨가하였다. Xcelligence 세포독성 검정을 제 11 일에 재자극한 T-세포를 사용하여 수행하였다.

63% 의 효과기 세포는 CMV-pp65-펩티드 특이적 CD8⁺ T-세포였다.

표적 세포 대 효과기 세포 비율은 1:3.5 였다. 각각의 다관능 단백질을 첨가한 후 10 시간에 세포 용해를 측정하였다. 다관능 융합 단백질을 1 ㎍/ml 의 최종 농도로 첨가하였다.

그 결과를 Colo38 세포에 대해서는 도 18A 에, WM266 세포에 대해서는 도 18B 에 나타낸다.

실시예 13

디술피드-안정화 다관능 단백질

본원에 보고한 바와 같은 다관능 단백질에서의 항원 제시 도메인의 위치 11 과 227 사이 디술피드-브릿지를 도입하였다.

디술피드 안정화 항원 제시 도메인의 아미노산 서열을 하기의 것이다:

디술피드 안정화 부재 하에, 6.4 mg 의 다관능 단백질을, 단백질 A 친화성 정제 후에 1 l 배양 상청액으로부터 수득할 수 있다. 응집물 분리를 위한 크기 배제 크로마토그래피 후 최종 수율은 2.2 mg 이었다.

디술피드 안정화 존재 하에, 17.8 mg 의 다관능 단백질을, 단백질 A 친화성 정제 후에 1 l 배양 상청액으로부터 수득할 수 있다. 도입된 디술피드 브릿지에 의한 열 안정성 증가로 인해, 크기 배제 크로마토그래피 후 최종 수율은, 11.4 mg 이었다.

단백질 A 친화성 크로마토그래피 후, 분취용 크기 배제 크로마토그래피에 의한 응집물 제거 전, 분석적 크기 배제 크로마토그램을 도 19 에 나타낸다.

디술피드-연결 다관능 단백질은 비-디술피드-연결 다관능 단백질과 동일한 관능성을 나타낸다 (도 20 참조).

PBMC 를 Ficoll 원심분리를 통해 전혈로부터 수득하였다. 1 ml 당 1x10⁷ PBMC 를 T-세포 배지 (10% HS, 2 mM 글루타민으로 보충된 RPMI 1640) 중 희석하고, 50 ㎍/ml CMV pp65 펩티드를 현탁액에 첨가하여 HLA-A0201 분자에서의 펩티드 교환을 수행하였다. 2-3 시간 인큐베이션 후 PBMC 를 1:10 으로 희석하고 200 ㎕ 을 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 넣었다. 제 3 일에 20 U/ml IL-2, 25 ng/ml IL-7 및 IL-15 를 첨가하였다. 1 차 자극 후 11 일에 세포를 채취하였고; 45% 의 세포가 CMV 특이적이었다. 표적 세포 대 효과기 세포 비율 1:3 에 대한 결과를 도 20 에 나타낸다.

디술피드-연결 다관능 단백질은 열 안정성 증가를 나타낸다 (도 21).

실시예 14

DNA 제조, 트랜스펙션, 발현, 정제 및 분석

DNA 제조

250 ml 의 밤샘 박테리아 LB 배양물을 수확하고 플라스미드 DNA 를 제조사의 프로토콜 (High speed Maxi kit, Qiagen, 카탈로그 번호 12663) 에 따라 추출하였다. 생성된 플라스미드 DNA 를 1 ml TE 완충액 중에서 용리하고 분광광도 측정 (Epoch, BioTek) 에 의해 DNA 농도를 측정하였다.

최종 발현 벡터는 하기 요소를 포함하였다:

- 엔도뉴클레오리틱 제한 위치 HindIII, NheI,

- CMV-프로모터,

- 5'UTR 1 (인간 CMV 에서 유래),

- 인트론 A,

- 5'UTR 2,

- 암플리신-저항성 유전자,

- BGH 폴리 A 부위 (소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호),

- pUC Ori.

CMV-유래 펩티드 및 MCSP 결합 특이부 (항-MCSP 항체) 를 포함하는 예시적 1 가 디술피드-연결 다관능 단백질의 요소의 아미노산 서열:

CMV pp65 펩티드: SEQ ID NO: 01

NLVPMVATV

링커 1: SEQ ID NO: 139

GCGGSGGGGSGGGGS

β2-마이크로글로불린: SEQ ID NO: 71

링커 2: SEQ ID NO: 83

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

HLA-A*0201 α 1 - α3: SEQ ID NO: 140

링커 13: SEQ ID NO: 136

GSG

Ig 경쇄: SEQ ID NO: 127

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A, P329 G 돌연변이체 (놉 변이를 가짐)):

SEQ ID NO: 141

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A, P329 G 돌연변이체 (홀 변이를 가짐)):

SEQ ID NO: 142

Ig 중쇄 Fc-부위 (IgG1-L234A, L235A, P329G 돌연변이체 Fc-부위 놉 변이체):

SEQ ID NO: 98

CMV-유래 펩티드 및 MCSP 결합 특이부 (항-MCSP 항체) 를 포함하는 예시적 2 가 디술피드-연결 다관능 단백질의 요소의 아미노산 서열:

CMV pp65 펩티드: SEQ ID NO: 01

NLVPMVATV

링커 1: SEQ ID NO: 139

GCGGSGGGGSGGGGS

β2-마이크로글로불린: SEQ ID NO: 71

링커 2: SEQ ID NO: 83

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

HLA-A*0201 α1 - α3: SEQ ID NO: 140

링커 13: SEQ ID NO: 136

GSG

Ig 경쇄: SEQ ID NO: 127

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A, P329 G 돌연변이체 (놉 변이를 가짐)):

SEQ ID NO: 142

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A, P329 G 돌연변이체 (홀 돌연변이를 가짐)):

SEQ ID NO: 141

CMV pp65 펩티드: SEQ ID NO: 01

NLVPMVATV

링커 1: SEQ ID NO: 139

GCGGSGGGGSGGGGS

HLA-A*0201 α1 - α3: SEQ ID NO: 140

링커 2: SEQ ID NO: 77

β2-마이크로글로불린: SEQ ID NO: 71

링커 13: SEQ ID NO: 81

GGGGSGGGGS

Ig 경쇄: SEQ ID NO: 127

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A, P329 G 돌연변이체 (놉 변이를 가짐)):

SEQ ID NO: 142

Ig 중쇄 (IgG1-L234A, L235A, P329 G 돌연변이체 (홀 변이를 가짐):

SEQ ID NO: 141

트랜스펙션

웨스턴 블롯팅

정제

분석

방법 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색

장치: Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell

겔: 4-20% 트리스-글리신 겔, Invitrogen EC6025BOX

완충액: 트리스-글리신 SDS 실행 완충액 (10x), Invitrogen LC2675-5

환원 완충액: NuPAGE 샘플 환원제 (10x), Invitrogen NP0004

분자량 마커: Mark 12, MW 표준품, Invitrogen LC5677

단백질 샘플 제조

- 환원 완충액: 4 ml 샘플 완충액 (2x) 및 1 ml 환원 완충액 (10x)

- 환원 완충액과 샘플을 1:1 로 희석함

- 5 분 동안 70℃ 에서 인큐베이션함

결과

표.

규정된 다관능 단백질이 수득될 수 있다는 것을 관찰할 수 있다.

실시예 15

2 개의 항원 제시 도메인을 포함하는 복합체와 비교하여, 1 개의 항원 제시 도메인을 포함하는 복합체의 T-세포 활성화

AIM-V 배지 (Gibco) 중 웰 당 2 만 개의 PBMC 를 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 1 ㎍/ml, 100 ng/ml 의 최종 농도에서 MHCI-0054 [2 가 항-MCSP 결합제, 1-완형, 디술피드 안정화 CMV-MHCI] 또는 MHCI-0065 [2 가 항-MCSP 결합제, 2-완형, 디술피드 안정화 CMV-MHCI] 구축물로 150 ㎕ AIM-V 배지의 부피로 16 시간 동안 자극하였다. 4 개 웰의 PBMC 를 풀링하고 얼음 상에서 45 분 동안 하기로 염색하고:

1) PE-Cy7 (BD#557746) 로 표지된 항-CD8 항체 (5 ㎕/100 ㎕ PBS/2% FCS), 또는

2) FITC (BD#555346) 로 표지된 항-CD4 항체 (20 ㎕/100 ㎕ PBS/2% FCS), 또는

3) Dextramer CMV APC (Immudex#WB2132) (10 ㎕/100 ㎕ PBS/2% FCS), 또는

4) PE (BioLegend#302606) 로 표지된 항-CD25 항체 (5 ㎕/100 ㎕ PBS/2% FCS), 또는

5) PerCP/Cy5.5 로 표지된 항-CD69 항체 (BioLegend#310925) (5 ㎕/100 ㎕ PBS/2% FCS),

그후 PBS/2% FCS 로 2 회 세척하였다 (500 x g, 10 분).

T 세포 활성화를 측정하기 위해서, 하기의 판독값을 사용하였다:

1) 모든 CMV-특이적 (NLVPMVATV pp65) CD8+ 세포의 CD25+ 세포의 빈도,

2) CMV-특이적 (NLVPMVATV pp65) CD8+ 세포의 CD69+ 세포의 빈도, 및

3) CD8+ 세포에서 HLA A*0201 MHC 클래스 I 복합체에서의 CMV (NLVPMVATV pp65) 의 NLVPMVATV pp65 펩티드에 대한 동족 TCR 의 하향-조절.

결과:

1) pp65-CMV-HLA A*0201 특이적 CD8 T 세포에서의 CD25 상향-조절:

따라서, MHCI-0054 와 비교하여, 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml MHCI-0065 을 사용하여 CD25 발현의 상향-조절을 관찰할 수 있다 (각각 4.4 배 및 1.9 배).

2) pp65-CMV-HLA A*0201 특이적 CD8 T 세포에서의 CD69 상향-조절:

따라서, MHCI-0054 와 비교하여, 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml MHCI-0065 를 사용하여 CD69 발현의 상향-조절을 관찰할 수 있다 (각각 9.0 배 및 1.8 배).

3) pp65-CMV-HLA A*0201 특이적 CD8 T 세포에서의 TCR 하향-조절:

따라서, MHCI-0054 와 비교하여, 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml MHCI-0065 를 사용하여 TCR 발현의 하향-조절을 관찰할 수 있다 (각각 6.5 배 및 1.8 배).

따라서, CMV-특이적 CD8 T-세포의 활성화는 단일 MHC 복합체만을 갖는 2 가 이형이량체 항체 융합물과 비교하여, 2 개의 MHC 복합체를 갖는 2 가 동형이량체 항체 융합물을 사용하였을 때 더 강하다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Disulfide-linked multivalent MHC class I comprising multi-function proteins <130> 31397 WO <150> EP12198904.0 <151> 2012-12-21 <150> EP13175469.9 <151> 2013-07-08 <160> 142 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 1 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 2 Val Thr Glu His Asp Thr Leu Leu Tyr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 3 Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 4 Cys Val Glu Thr Met Cys Asn Glu Tyr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 5 Val Leu Glu Glu Thr Ser Val Met Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 6 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 7 Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu Gly Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 8 Ile Ile Tyr Thr Arg Asn His Glu Val 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 9 Val Leu Ala Glu Leu Val Lys Gln Ile 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 10 Ala Val Gly Gly Ala Val Ala Ser Val 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 11 Thr Val Arg Ser His Cys Val Ser Lys 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 12 Ile Met Arg Glu Phe Asn Ser Tyr Lys 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 13 Gly Pro Ile Ser His Gly His Val Leu Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 14 Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 15 Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 16 Ala Tyr Ala Gln Lys Ile Phe Lys Ile Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 17 Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 18 Tyr Val Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 19 Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 20 Val Phe Glu Thr Ser Gly Gly Leu Val Val 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 21 Lys Ala Arg Asp His Leu Ala Val Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 22 Gln Ala Arg Leu Thr Val Ser Gly Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 23 Lys Ala Arg Ala Lys Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 24 Gln Ile Lys Val Arg Val Asp Met Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 25 Arg Arg Arg His Arg Gln Asp Ala Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 26 Ala Arg Val Tyr Glu Ile Lys Cys Arg 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 27 Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 28 Asn Val Arg Arg Ser Trp Glu Glu Leu 1 5 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 29 Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 30 Lys Pro Gly Lys Ile Ser His Ile Met Leu Asp Val Ala 1 5 10 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 31 Glu Leu Arg Arg Lys Met Met Tyr Met 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 32 Ile Pro Ser Ile Asn Val His His Tyr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 33 Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 34 Tyr Ala Tyr Ile Tyr Thr Thr Tyr Leu 1 5 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 35 Gln Glu Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 36 Tyr Glu Gln His Lys Ile Thr Ser Tyr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 37 Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr Val Tyr 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 38 Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 39 Gln Ala Ile Arg Glu Thr Val Glu Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 40 Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 41 Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 42 Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 43 His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu 1 5 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 44 Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu 1 5 10 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 45 Gln Met Trp Gln Ala Arg Leu Thr Val 1 5 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 46 His Glu Leu Leu Val Leu Val Lys Lys Ala Gln Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 47 Asp Asp Tyr Ser Asn Thr His Ser Thr Arg Tyr Val 1 5 10 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 48 Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 4 <400> 49 Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 50 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 51 Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Human T-cell lymphotropic virus type 1 <400> 52 Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V-jun Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog (JUN) <400> 53 Phe Ala Glu Gly Phe Val Arg Ala Leu 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Human adenovirus type 3 <400> 54 Leu Ile Val Ile Gly Ile Leu Ile Leu 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 55 Ile Leu His Thr Pro Gly Cys Val 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 56 Trp Tyr Ala Gln Ile Gln Pro His Trp 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 57 Ala Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 58 Ile Leu Ile Gly Val Val Ile Thr Trp 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 59 Met Met Ile Pro Thr Val Val Ala Phe 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 60 Pro Phe Pro Gln Ser Asn Ala Pro Ile 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 61 Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala Thr Val 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 62 Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 63 Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asn Gly Val 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 64 Pro Leu Asn Glu Ala Ile Met Ala Val 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 65 Asn Leu Val Arg Leu Gln Ser Gly Val 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 66 Leu Val Ile Ser Gly Leu Phe Pro Val 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 67 Leu Leu Leu Val Ala His Tyr Ala Ile 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 68 Leu Ala Leu Leu Ala Ala Phe Lys Val 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 69 Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro Val 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 70 His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val 1 5 <210> 71 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu 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His 180 185 190 Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp <210> 73 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 1 <400> 73 Gly Ser 1 <210> 74 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 2 <400> 74 Gly Gly Ser 1 <210> 75 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 3 <400> 75 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 4 <400> 76 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 5 <400> 77 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 6 <400> 78 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 7 <400> 79 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 8 <400> 80 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 9 <400> 81 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 10 <400> 82 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 83 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 11 <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 84 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide 12 <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 85 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 <210> 86 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn 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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 88 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with the mutations L234A, L235A <400> 88 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 89 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a hole mutation <400> 89 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 90 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a knob mutation <400> 90 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 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L235A and P329G mutation <400> 94 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 95 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a P239G and hole mutation <400> 95 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe 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L235A, P329G and knob mutation <400> 98 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 103 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG4 isotype with a S228P, L235E and P329G mutation <400> 103 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Gly Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 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Y407V mutant amino acid sequence <400> 117 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln 20 25 30 Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn 35 40 45 Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu 50 55 60 Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe 65 70 75 80 Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro 85 90 95 Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser 100 105 110 Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe 165 170 175 Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala 180 185 190 Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu 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Leu Arg 405 410 415 Trp Gly Ser Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 420 425 430 Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser 435 440 445 Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 450 455 460 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr 465 470 475 480 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 485 490 495 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 500 505 510 Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 515 520 525 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 530 535 540 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 545 550 555 560 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 565 570 575 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 580 585 590 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 595 600 605 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 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Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 120 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig Light Chain <400> 120 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 122 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig Heavy Chain (IgG1-L234A, L235A mutant with knob variation) <400> 122 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 123 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig Heavy Chain (IgG1-L234A, L235A mutant with hole variation) <400> 123 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp 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anti-MCSP monoclonal light chain antibody amino acid sequence (kappa) <400> 126 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Met Gln Ser Gly Pro Arg Pro Pro Leu Pro Ala Pro Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Thr Leu Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ser Phe 20 25 30 Phe Gly Glu Asn His Leu Glu Val Pro Val Ala Thr Ala Leu Thr Asp 35 40 45 Ile Asp Leu Gln Leu Gln Phe Ser Thr Ser Gln Pro Glu Ala Leu Leu 50 55 60 Leu Leu Ala Ala Gly Pro Ala Asp His Leu Leu Leu Gln Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Arg Leu Gln Val Arg Leu Val Leu Gly Gln Glu Glu Leu Arg Leu 85 90 95 Gln Thr Pro Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ser Ile Pro His Thr Val 100 105 110 Val Leu Thr Val Val Glu Gly Trp Ala Thr Leu Ser Val Asp Gly Phe 115 120 125 Leu Asn Ala Ser Ser Ala Val Pro Gly Ala Pro Leu Glu Val Pro Tyr 130 135 140 Gly Leu Phe Val Gly Gly Thr Gly Thr Leu Gly Leu Pro Tyr Leu Arg 145 150 155 160 Gly Thr Ser Arg Pro Leu Arg Gly Cys Leu His Ala Ala Thr Leu Asn 165 170 175 Gly Arg Ser Leu Leu Arg Pro Leu Thr Pro Asp Val His Glu Gly Cys 180 185 190 Ala Glu Glu Phe Ser Ala Ser Asp Asp Val Ala Leu Gly Phe Ser 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Ser Ala Val Val Asn Val Thr Val Arg Ala Leu Leu His 2035 2040 2045 Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly Ala Thr Leu Arg Leu Asp 2050 2055 2060 Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu Leu Ala Asn Arg Thr Gly Ser Val 2065 2070 2075 2080 Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly Pro Arg His Gly Arg Val Val Arg 2085 2090 2095 Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly Gly Ser Gln Leu Val Glu Gln 2100 2105 2110 Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu Glu Val Gly 2115 2120 2125 Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser Leu Thr Leu 2130 2135 2140 Glu Leu Trp Ala Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser Leu Asp Phe 2145 2150 2155 2160 Ala Thr Glu Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val Ala Leu Leu 2165 2170 2175 Ser Val Pro Glu Ala Ala Arg Thr Glu Ala Gly Lys Pro Glu Ser Ser 2180 2185 2190 Thr Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro Glu Pro Ala 2195 2200 2205 Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn Met Phe Ser 2210 2215 2220 Val Ile Ile Pro Met Cys Leu Val Leu Leu Leu Leu Ala 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Claims

하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:
- 1 또는 2 개의 항원 제시 도메인,
- 하나의 항체 Fc-부위, 및
- 하나 이상의 항원 결합 부위,
이때, 상기 항원 제시 도메인은 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함함:
(i) β2-마이크로글로불린, 및
(ii) 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,
또는
(i) 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
(ii) β2-마이크로글로불린,
또는
(i) T-세포 반응 유도 펩티드,
(ii) β2-마이크로글로불린, 및
(iii) 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,
또는
(i) T-세포 반응 유도 펩티드,
(ii) 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3, 및
(iii) β2-마이크로글로불린,
이때, 상기 항원 결합 부위는 암 세포 표면 항원에 결합하고,
상기 항원 제시 도메인은 사슬내/도메인간 디술피드 결합을 형성하는 2 개 이상의 비-자연 발생 시스테인 잔기를 가짐.
제 1 항에 있어서, 항원 제시 도메인에서의 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기가 T-세포 반응 유도 펩티드 사이의 링커 내에 있고, 하나의 비-자연 발생 시스테인 잔기가 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3 중 하나 내에 있는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 하기를 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:
항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 227 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성하거나,
항원 제시 도메인은 적어도 위치 11 및 위치 108 에서 시스테인 잔기를 갖고 위치 11 및 위치 108 에서의 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 형성함.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 Fc-부위가 제 1 및 제 2 디술피드-연결 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하며, 이에 대해 항원 결합 부위 또는 항원 결합 부위들 중 하나가 제 1 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하고, 존재하는 경우, 제 2 항원 결합 부위가 제 2 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부위가 i) 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 한 쌍, 또는 ii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFv 항체 단편 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFv 융합 폴리펩티드, 또는 iii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFab 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFab 융합 폴리펩티드를 포함하거나,
항원 결합 부위가 서로 독립적으로 i) 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 한 (동족) 쌍 {이에 대해 개별적 사슬이 야생형 사슬 또는 개질된 사슬 (치환, 돌연변이화 또는 도메인 교환된) 일 수 있음}, 또는 ii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFv 항체 단편 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFv 융합 폴리펩티드, 또는 iii) N- 에서 C-말단 방향으로 scFab 및 항체 Fc-부위 폴리펩티드를 포함하는 scFab 융합 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, i) 항원 제시 도메인이 항원 결합 부위의 중쇄의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 연결되거나, ii) 하나의 항원 제시 도메인이 각 항원 결합 부위의 중쇄의 각 N-말단 또는 경쇄의 각 N-말단에 연결되거나, iii) 항원 제시 도메인이 항원 결합 부위의 중쇄의 C-말단 또는 경쇄의 C-말단에 연결되거나, vi) 하나의 항원 제시 도메인이 각 항원 결합 부위의 중쇄의 각 C-말단 또는 경쇄의 각 C-말단에 연결되거나, v) 항원 제시 도메인이 scFv 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나, vi) 하나의 항원 제시 도메인이 각 scFv 융합 폴리펩티드의 각 N- 또는 C-말단에 연결되거나, vii) 항원 제시 도메인이 scFab 융합 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나, viii) 하나의 항원 제시 도메인이 각 scFab 융합 폴리펩티드의 각 N- 또는 C-말단에 연결되거나, ix) 항원 제시 도메인이 제 2 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되거나, x) 하나의 항원 제시 도메인이 제 1 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되고 하나의 항원 제시 도메인이 제 2 Fc-부위 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 반응 유도 펩티드가 인간 거대세포 바이러스-유래 펩티드인 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스-유래 펩티드가 SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상대 빈도 1% 이상인 클래스 I MHC 분자가 HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*340101, HLA-C*0304, HLA-C*0401, 및 HLA-C*0702 를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상대 빈도 1% 미만인 클래스 I MHC 분자가 HLA-B*4201, HLA-B*5901, HLA-B*6701, 및 HLA-B*7802 를 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 도메인이 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:
(i) 바이러스-유래 펩티드,
(ii) β2-마이크로글로불린,
(iii) 가용성 HLA-A 대립형질 A*0201, 및
(iv) 적어도 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기가 디술피드 결합을 형성함.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 도메인이 N- 에서 C-말단 방향으로 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 디술피드-연결 다가 다관능 단백질:
(i) SEQ ID NO: 01 ~ SEQ ID NO: 70 을 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 바이러스-유래 펩티드,
(ii) SEQ ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 84, 및 139 를 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 1 링커 펩티드,
(iii) SEQ ID NO: 71 의 아미노산 서열을 갖는 β2-마이크로글로불린,
(iv) SEQ ID NO: 77, 78, 79, 82, 83, 및 84 를 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 2 링커 펩티드,
(v) SEQ ID NO: 140 의 아미노산 서열을 갖는 클래스 I MHC 분자의 세포외 도메인 α1, α2 및 α3,
(vi) SEQ ID NO: 73, 77, 78, 79, 82, 83, 84, 및 136 을 포함하는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제 3 링커 펩티드, 및
(vii) 적어도 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 및 위치 11 및 위치 227 에서의 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 디술피드-연결 다가 다관능 단백질 및 임의로는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에 사용하기 위한 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 개인의 바이러스-특이적 세포독성 T-세포를 표적에 유도하는데 사용하기 위한 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포 또는 바이러스 감염 세포 제거에 사용하기 위한 디술피드-연결 다가 다관능 단백질.