JP2024507693A - 二重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、第１抗原結合部分のペアードドメインが、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列及び工学的改変β２Ｍのアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。二重特異性抗体の発現方法、前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有するベクター及びホスト細胞、前記二重特異性抗体を含む医薬組成物、並びに融合タンパク質及びコンジュゲートをさらに提供する。提供される二重特異性抗体は、異なる特異性を有する重鎖及び軽鎖のミスマッチを防止又は低減させる。

Description

本発明は、抗体に関し、特に、抗体の軽鎖及び重鎖のミスマッチを改善する二重特異性抗体に関する。

１９６０年代初頭、Ｎｉｓｏｎｏｆｆらは、２つの異なる抗原結合部分を持つ人工抗体分子－二重特異性抗体（ＢｓＡｂ，ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の概念を初めて提出した（Ｎｉｓｏｎｏｆｆら， Ｓｃｉｅｎｃｅ １３２， １７７０－１７７１（１９６０））。彼らはわずかな再酸化で異なる特異性を持つウサギ抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を結合させ、この２つの抗原結合フラグメントが媒介する２つの異なるタイプの細胞の凝集作用を表現させた（Ｆｕｄｅｎｂｅｒｇら， Ａ． Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １１９， １５１－１６６ （１９６４））。一連の概念や技術革新が行われてから、抗体工学と抗体生物学の画期的な進展に伴い、二重特異性抗体の概念は、革新的でユニークな治療法を生み出すために、バイオテクノロジー企業や製薬企業によって商業化されつつある。

二重特異性抗体の研究開発設計において、臨床治療目的を基礎とし、特異性の異なる２対の軽鎖と重鎖の正確なペアリングを確保する必要があり、また、各モノクローナル抗体のそれぞれの結合ドメインの独立性を維持し、異なるエピトープに結合する際に立体障害の干渉が生じないことを確保する必要があり、さらに、抗体分子が哺乳動物細胞で発現しやすく、複雑なタンパク質修飾技術が必要でないことも必要である。ここで非対称性分子設計形態の二重特異性抗体は、関連する機能的特徴と有利な品質の特性を維持するために、天然抗体の天然構造をできるだけ保持する。抗体Ｈ２Ｌ２エレメントの対称性を破壊することにより、鎖ミスマッチの問題を解決する。

二重特異性抗体は、その二重標的性の優位性により、現在腫瘍治療の新規薬物研究領域の１つになり、二重特異性抗体の構築と製造技術も、一連の革新を経験し、その目的の１つはミスマッチ問題を解決し、生産効率を高めることである。いくつかの二重特異性抗体は、２本の異なる重鎖と２本の異なる軽鎖を共発現する必要があり、しかも多種の組換え産物の中から目的の二重特異性抗体を選択しなければならず、これもずっと二重特異性抗体の開発における難題の１つである。鎖ミスマッチを解決するために、近年、科学者は多くの戦略と技術プラットフォームを開発し、様々な構造の二重特異性抗体を設計し、表現することを可能にする。現在、二重特異性抗体の構造は、すでに、異なる製造プラットフォームによる数十種類も多く、比較的成熟したのはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ、Ａｍｇｅｎ ＢｉＴｅ、Ｃｈｕｇａｉ／Ｒｏｃｈｅ ＡＲＴ－Ｉｇプラットフォームであり、その中で、Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅは重鎖ミスマッチの問題を解決する古典的な技術であり、その他の技術プラットフォーム、例えばＤＶＤ－Ｉｇ、ＴｒｉｏＭａｂ、ＤＡＲＴ、ＦＩＴ－Ｉｇ、ＷｕＸｉＢｏｄｙなどがある。

ほとんどの非対称形態の二重特異性抗体は、Ｆｃ領域に突然変異（Ｒｉｄｇｗａｙら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ９（７）， ６１７－６２１．）を導入し、重鎖間のペアリングを強制的に矯正し、促進することによって、２つの異なる重鎖のヘテロダイマーの集合を達成する。次に、分化型Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ結合設計精製戦略と、逐次アフィニティークロマトグラフィー、分子量差クロマトグラフィー精製戦略とを組み合わせることにより、所望の最終産物を分離する。軽鎖と重鎖のミスマッチを回避する戦略としては、通常、二重特異性分子を半分子として、或いは親抗体として別々に発現し、それから、抗体半分子を集合するのが一般的であり、重鎖の突然変異を設計することによって重鎖のヘテロ二量体を実現することができる。しかし、個々の抗体のそれぞれの軽鎖と重鎖の選択的なペアリングは依然として困難である。

Ｓｃｉｅｎｃｅ，（米），１９６０，Ｖｏｌ．１３２，Ｎｏ．３４４１，ｐ．１７７０－１７７１ Ｊｏｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，（米），１９６４，Ｖｏｌ．１１９（１），ｐ．１５１－１６６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，（英），１９９６，Ｖｏｌ．９（７），ｐ．６１７－６２１．

本発明は、異なる特異性を有する重鎖及び軽鎖のミスマッチを防止又は低減させる、構造設計を改良した二重特異性抗体を提供する。

一態様では、本発明は、
２つの異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、前記第１抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１重鎖可変ドメイン及び前記第１重鎖可変ドメインに作動可能に連結された第１ペアードドメインを含む第１ポリペプチドと、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１軽鎖可変ドメイン及び前記第１軽鎖可変ドメインに作動可能に連結された第２ペアードドメインを含む第２ポリペプチドと、を含み、
ここで、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインのうちの一方のペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、他方のペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体を提供する。

いくつかの実施形態では、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインは二量体を形成でき、前記第１ペアードドメインと第２ペアードドメインとの間に少なくとも１つの非天然鎖間結合を形成でき、且つ前記非天然鎖間結合は前記二量体を安定化させることができる。

いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有し、前記工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。

いくつかの具体的な実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの具体的な実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記第２抗原結合部分は、第２重鎖可変ドメイン及び第２軽鎖可変ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、前記第２抗原結合部分はＦａｂを含む。前記Ｆａｂは、前記第２重鎖可変ドメイン及び第２軽鎖可変ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、２つの異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、前記第１抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１重鎖可変ドメイン及び前記第１重鎖可変ドメインに作動可能に連結された第１ペアードドメインを含む第１ポリペプチドと、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１軽鎖可変ドメイン及び前記第１軽鎖可変ドメインに作動可能に連結された第２ペアードドメインを含む第２ポリペプチドと、を含み、
ここで、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインのうちの一方のペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、他方のペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む二重特異性抗体を提供し、
前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列、工学的改変β２ミクログロブリンは、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、前記第２抗原結合部分は、Ｆａｂを含む。このようないくつかの実施形態では、ＥＵ番号により、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸がアラニンで置換されている。いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、２つの異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、前記第１抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１重鎖可変ドメイン及び前記第１重鎖可変ドメインに作動可能に連結された第１ペアードドメインを含む第１ポリペプチドと、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１軽鎖可変ドメイン及び前記第１軽鎖可変ドメインに作動可能に連結された第２ペアードドメインを含む第２ポリペプチドと、を含み、
ここで、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインのうちの一方のペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、他方のペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む二重特異性抗体を提供し、
前記第２抗原結合部分はＦａｂを含み、ＥＵ番号により、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸がアラニンで置換されている。いくつかのこのような実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列、工学的改変β２ミクログロブリンは、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。さらに、いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む。

上記のいくつかの実施形態では、前記第１ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む。

上記のいくつかの実施形態では、前記第１ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含む。

上記のいくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体はＦｃを含む。

一態様では、本発明は、本発明に記載の二重特異性抗体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。

一態様では、本発明は、本発明に記載のポリヌクレオチドを含む単離ベクターを提供する。

一態様では、本発明は、本発明に記載の単離ポリヌクレオチド又は単離ベクターを含むホスト細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、前記二重特異性抗体の発現方法であって、前記二重特異性抗体が発現される条件下で前記ホスト細胞を培養することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明に記載の二重特異性抗体と、前記二重特異性抗体に連結又はコンジュゲートする治療薬と、を含むコンジュゲートを提供する。

別の態様では、本発明は、融合して発現された融合成分と、前記二重特異性抗体とを含む融合タンパク質を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、本発明に記載の二重特異性抗体、医薬組成物、コンジュゲート又は融合タンパク質の治療有効量を被験体に投与することを含む、これを必要とする被験体において疾患を治療するための方法を提供する。

本発明の二重特異性抗体では、第１抗原結合部分におけるペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３及び工学的改変β２ミクログロブリンを利用することにより、鎖のミスマッチを改善することができ、例えば、第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分が共に天然Ｆａｂの対応部分である場合に比べて、前記第１抗原結合部分及び前記第２抗原結合部分にミスマッチが起こりにくいようにし、これにより、目的抗体の収率及び純度を向上させることができる。

特に、設計された二重特異性抗体は、抗原に対して良好な親和性又は／及び熱安定性を維持する。いくつかの側面では、設計された二重特異性抗体は免疫原性リスクを低減する。

ＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子α鎖の定常領域の一致性配列である。 ＭＨＣ－Ｉエレメントに基づいて構築された抗ＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体の構造概略図である。 ＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１の分子構造の概略図である。 ＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１分子のＳＥＣ精製マップである。 ＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１の完全な分子量の質量スペクトルである。 ＭＨＣＩＣα、ＭＨＣＩＣβ、ＣＨ１、ＣＬドメインを含む重鎖と軽鎖が互いにペアリングして組み合わされて発現する非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥである。 ＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－ＩｇＫ又はそれにアミノ酸突然変異を導入したものとＨＺ１４Ａ９ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１との組み合わせ発現産物の非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥである。 ＭＨＣ－Ｉエレメントに基づいて構築されたＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ二重特異性抗体の構造概略図である。 ＭＨＣ－Ｉエレメントに基づいて構築されたＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａ二重特異性抗体の構造概略図である。 異なる濃度の二重特異性抗体ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔとＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａが赤血球凝集に及ぼす影響である。 抗体ＨＺ５Ｇ１１とＨＺ１４Ａ９のＣＬにＦ１１８Ａを導入した後の非還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥである。 本発明の二重特異性抗体のいくつかの例示的な構造形態図であり、（Ａ）ＦｃポリペプチドのＮ末端にそれぞれ連結された特異性の異なるＭＨＣ修飾抗原結合部分（第１抗原結合部分）とＦａｂの「１＋１」の形態であり、（Ｂ）Ｆｃポリペプチドにそれぞれ連結された特異性の異なるＭＨＣ修飾抗原結合部分（第１抗原結合部分であって、Ｃα及びＣβの配向が（Ａ）と異なる）とＦａｂの「１＋１」の形態であり、（Ｃ）第１抗原結合部分と一方のＦａｂがそれぞれＦｃポリペプチドに連結され、他方のＦａｂが第１抗原結合部分のＮ末端に連結された「２＋１」の形態であり、（Ｄ）（Ｃ）とは異なり、２つのＦａｂが直列連結された「２＋１」の形態であり、（Ｅ）２つのＦａｂがそれぞれＦｃポリペプチドに連結され、第１抗原結合部分が１つのＦａｂのＮ末端に連結された「２＋１」の形態であり、（Ｆ）（Ｅ）とは異なり、第１抗原結合部分がＦｃポリペプチドのＣ末端に連結された「２＋１」の形態であり、（Ｇ）抗原結合部分がＦｃのＮ末端に連結された「２＋２」の形態であり、（Ｈ）第１抗原結合部分がすべてＦｃのＣ末端に連結された「２＋２」の形態である。Ｆｃドメインはまた、ＫＩＨなどのアミノ酸置換を持ってもよく、ＣＬはＦ１１８Ａを持ってもよいが、この例では、アミノ酸置換が示されていない。

［用語］
「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、抗原結合部分を含むタンパク質を指し、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、一本鎖抗体などを含むが、これらに限定されない、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を包含する。

「多重特異性」という用語は、抗体が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般に、二重特異性抗体は２つの抗原結合部分を含み、それぞれが異なる抗原決定基に特異的である。異なる抗原決定基は、同一又は異なる細胞上で発現することができる。異なる抗原決定基は抗原の種類（例えば結合抗原ＰＤＬ１とＣＤ４７）によって異なってもよいし、同じ種類の抗原上に存在してもよい。抗原決定基は、抗原物質分子の表面やその他の部位で一定の組成と構造の特殊な化学基を持ち、それに対応する抗体や感作性リンパ球と特異的に結合する構造である。抗原決定基の一例として、抗原決定基ＣＤ４７は、構造が決定された複数の抗原決定基又は構造が決定されていない複数の抗原決定基を有する抗原物質である。１つの特定の二重特異性抗体は、例えばＰＤＬ１及びＣＤ４７に結合することができる。

用語「特異的結合」は、結合が抗原に対して選択的であり、不必要又は非特異的な相互作用から区別できることを意味する。

「…価」抗体という用語は、抗体中に存在する抗原結合部位の数を意味する。「２価」抗体は抗体に２つの抗原結合部位が存在すること、「３価」は抗体に３つの抗原結合部位が存在することを意味する。天然のヒト免疫グロブリン分子は通常２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂは通常１つの抗原結合部位を有する。単一可変ドメイン、ＳｃＦｖは通常単一抗原結合部位を有する。

「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。具体的な抗原結合部分は、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、単一可変ドメインなどであってもよい。本明細書における抗原決定基は抗原エピトープと同義である。

抗原結合部分、抗原、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、Ｆｃポリペプチドなどに関して本発明で使用される用語「第１」、「第２」、又は「第３」は、それぞれのタイプの部分が１つ以上存在する場合の区別を容易にするために使用される。明示的に示されない限り、これらの用語は、二重特異性抗体の特定の順序又は配向を与えることを意図して使用されるものではない。

「作動可能に連結される」又は「作動的に連結される」という用語は、スペーサー又はリンカーの有無にかかわらず、目的の方法で作用させるような関係にあるように、２つ以上の目的生物学的配列が並列されていることを意味する。ポリペプチドについて使用する場合、この用語は、連結された産物が目的の生物学的機能を有するように、ポリペプチド配列が連結されていることを意味することを意図している。例えば、抗体可変領域は、抗原結合活性を有する安定な産物を形成するために、定常領域に作動可能に連結され得る。前記用語は、ポリヌクレオチドについても使用することができる。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結されている場合、この用語は、前記ポリヌクレオチド配列が、前記ポリペプチドが前記ポリヌクレオチドによって調節された発現を可能にするように連結されていることを意味することを意図する。

主要組織適合性複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）は動物の主要組織適合性抗原をコードする遺伝子群の総称である。マウスのＭＨＣはＨ－２遺伝子複合体と呼ばれ、ヒトのＭＨＣはＨＬＡ（ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）遺伝子複合体と呼ばれ、そのコード産物はＨＬＡ分子、ＨＬＡ抗原やヒト白血球抗原と呼ばれる。ＨＬＡ遺伝子複合体はヒト６番染色体の短腕６ｐ２１．３に位置し、同時に２２０以上の機能の異なる遺伝子を含む。これらの遺伝子の多くは免疫系のタンパク質をコードしている。ＭＨＣ－クラスＩ分子はほぼすべての有核細胞表面に発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に認識される。ＭＨＣ－クラスＩＩ分子は抗原提示細胞表面に発現し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に認識される。ＭＨＣは多型性を持ち、大部分の人は主に６種類の古典的なＭＨＣ分子、すなわち、３種類の古典的なＭＨＣ－クラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）と３種類の古典的なＭＨＣ－クラスＩＩ分子（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ）を含む。ヒトのＭＨＣ－クラスＩ分子（ＨＬＡ－１）は重鎖（α鎖）とβ_２ミクログロブリン（β_２ｍ、又はβ鎖）からなり、その中、α鎖の細胞外セグメントに３つのドメイン（α１、α２、α３）があり、膜の遠端の２つのドメインα１とα２は抗原結合溝を構成し、ドメインα３はヒト免疫グロブリンの定常領域と相同である。

「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗体と抗原との結合に関する抗体のドメインを意味する。例えば、天然の４本鎖抗体（例えば、ヒト、マウスなどに由来する）は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、ラクダ科又はサメなどの動物に由来する重鎖抗体のみは、単一可変ドメインを有する。天然抗体の各可変ドメインは、実質的に４つの「フレームワーク領域」と３つの「相補性決定領域」からなる。４つのフレームワーク領域は、それぞれフレームワーク領域１（又はＦＲ１）、フレームワーク領域２（又はＦＲ２）、フレームワーク領域３（又はＦＲ３）、及びフレームワーク領域４（又はＦＲ４）と呼ばれる。前記フレームワーク領域は、当技術分野及び以下では、それぞれ相補性決定領域１（又はＣＤＲ１）、相補性決定領域２（又はＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（又はＣＤＲ３）と呼ばれる３つの相補性決定領域（又はＣＤＲ）によって間隔をあけて配置される。したがって、可変ドメインの一般的な構造は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４と表される。可変ドメインは、抗原結合部位を有することにより、抗原に対する特異性を抗体に付与する。

「ＣＤＲ」（相補性決定領域）は、「超可変領域（ＨＶＲ）」とも呼ばれる。天然の４本鎖抗体は、一般に６つのＣＤＲを含み、３つは重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）にあり、３つは軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）にある。重鎖抗体のみ又は単一可変ドメインは、通常、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を有する。

現在、ＣＤＲを分割して定義する方法はいくつかある。その中で、Ｋａｂａｔ定義は配列可変性に基づいてＣＤＲを分割し、最も一般的に使用されている（Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ， ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ， Ｍｄ ．（１９９１））。一方、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループの位置に基づいている（Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ， Ｊ ．Ｍｏｌ ．Ｂｉｏｌ ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭ定義は、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の間のトレードオフであり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている。「接触（ｃｏｎｔａｃｔ）」がＣＤＲを定義する基礎は、利用可能な複合体の結晶構造の解析である。ただし、異なる方法に基づいて定義され得られた同一抗体可変領域のＣＤＲの境界は異なる可能性があること、すなわち、異なる方法に基づいて定義され得られた同一抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる可能性がある。したがって、本発明で定義された特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を限定することに関連する場合、前記抗体の範囲は、他の任意の定義（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ定義など）に変換されたＣＤＲ配列によって限定された抗体をも包含する。

「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」という用語は、本明細書で定義されるＣＤＲ残基以外の可変ドメインのアミノ酸残基である。

「Ｆａｂ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨとＣＨ１、軽鎖のＶＬとＣＬドメインからなるタンパク質を指す。本明細書において、Ｆａｂは、その天然型の又は修飾されたＦａｂを意味し、これは、重鎖可変領域及び定常領域ＣＨ１からなるＦａｂ重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ－Ｃ末端方向）と、軽鎖可変領域及び定常領域ＣＬからなるＦａｂ軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ－Ｃ末端方向）とを含む。修飾Ｆａｂは、例えば、ＣＨ１／ＣＬドメイン又は／及びＶＨ／ＶＬドメインにアミノ酸置換が導入されたＦａｂであってもよく、具体例として、修飾Ｆａｂは、ＣＬドメインにアミノ酸置換が導入されたＦａｂであってもよい。

「Ｆｃ構造ドメイン」、「Ｆｃ」又は「Ｆｃドメイン」という用語は、本明細書では、少なくとも部分的に定常領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、自然配列Ｆｃ及びバリアントＦｃが含まれる。ＦｃのＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在していても、存在しなくてもよい。特に明記されていない限り、Ｆｃ中のアミノ酸残基の番号は、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに基づいており、（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ （１９９１） ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）に記載されている。第１ペアードドメインと第２ペアードドメインがアミノ酸位置の記述に関わる場合、対応する配列の開始アミノ酸を第１位として順次番号を付けることを指し、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＲ６０Ｃ置換とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における最初のアミノ酸を位置１として順次番号を付け、当該配列における第６０位のＲをＣに置換することを指す。本明細書で使用されるＦｃドメインのうちの１つの「Ｆｃポリペプチド」は、ダイマーＦｃ構造ドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つを指す。例えば、ＩｇＧ ＦｃドメインのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常領域を含む。

「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、平衡解離定数を指し、モル濃度（Ｍ）で表される。抗体のＫＤ値は、当業者に公知の方法を用いて測定することができる。抗体ＫＤの測定方法の１つとして、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムのようなバイオセンサシステムを用いる。抗体ＫＤの測定方法の１つとして、例えばＦｏｒｔｅＢｉｏシステムのような生物層干渉法（ＢＬＩ：Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を用いる。

「治療」という用語は、治療対象の疾患の自然なプロセスを変更しようとする試みを指し、予防的又は臨床病理学のプロセスの間に実施される臨床的介入とすることができる。治療の期待される効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患のいかなる直接的又は間接的な病理学的結果の低下、転移の予防、疾患の進行率の低下、疾患状態の改善又は軽減、及び退治又は予後改善が含まれるが、これらに限定されるものではない。

「被験体」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、哺乳類、及び非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの非哺乳類などのすべての脊椎動物を含む。本発明に係る被験体は、ヒトであることが好ましい。明示されていない限り、「患者」又は「被験体」という用語は、交換して使用されてもよい。

「単離」という用語は、その天然環境から単離された標的化合物（例えば、ＶＨＨ、多重特異性抗体、抗体、又は核酸）を意味する。

アミノ酸配列の「同一性のパーセント（％）」とは、アラインメントすべき配列を本明細書に示す特定のアミノ酸配列とアラインメントし、必要に応じて配列同一性の最大パーセントを達成するためにキャップを導入した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換を考慮せずに、アラインメントすべき配列のうち本明細書に示す特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセントをいう。同一性のアミノ酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、当該分野における多くの方法で実施できる。当業者は、比較配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要ないかなるアルゴリズムを含む、配列のアラインメントに用いる適切なパラメータを決定することができる。

本発明の文脈において、アミノ酸置換は、原アミノ酸－位置－置換アミノ酸として表され、アミノ酸残基は、コードＸａａ及びＸを含む３文字コード又は１文字コードを使用して表される。したがって、例えば「Ｈ４３５Ｒ」は、４３５位でのアミノ酸Ｈをアミノ酸Ｒに置換することを意味し、置換されたアミノ酸は、１つより多く含むことができ、例えば、Ｔ３６６Ｙ／Ｗは、３６６位でのアミノ酸Ｔをアミノ酸Ｙ又はＷに置換することを意味する。

用語「含む」、「含有」、又は「包含」、及びそれらの変形は、「含むが限定されない」と理解されるべきであり、記載されたエレメント、構成エレメント、及びステップに加えて、他の不特定のエレメント、構成エレメント、及びステップが含まれ得ることを意味する。

本明細書では、文脈上別段に明示的に規定されない限り、単数の用語は複数形をカバーし、その逆も同様である。

すべての特許、特許出願及び他の特定された出版物は、説明及び開示の目的のために、ここにおいて明示的に本明細書に引用によって組み込まれる。これらの出版物は、その公開が出願の出願日より前であることのみを理由として提供される。これらの文献の日付又は文献の内容に関するすべての表示は、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、文献の日付又は文献の内容の正当性に関するいかなる承認も構成しないものとする。さらに、いずれの国においても、本明細書におけるこれらの出版物へのいかなる引用も、その出版物がその分野の公知の常識の一部であるという認識を構成するものではない。本発明の様々な態様は、以下のセクションにおいてさらに詳細に説明される。

本発明の様々な態様について、以下のセクションでさらに詳細に説明する。

［二重特異性抗体］
本発明は、抗原結合部分のうちの１つの定常領域を改変することにより、異なる特異性の重鎖及び軽鎖のミスマッチを防止又は低減させることができる二重特異性抗体を構築し、目的抗体の収率又は／及び純度を向上させることができる。具体的には、ヒトＭＨＣ－Ｉ分子のα３ドメインとβ２ミクログロブリンを工学的に改変し、第１ペアードドメインと第２ペアードドメインを構築して抗体のＣＨ１とＣＬドメインを置換することで、例えば第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分がすべて天然Ｆａｂの対応部分である場合に比べて、前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分にミスマッチが発生しにくいように、鎖のミスマッチを改善する。

現在、生物薬の免疫原性の由来は主に内因性と外因性に分けられる。内因性免疫原性は、非ヒト由来のアミノ酸配列、非ヒト由来の構造形態、及び一連の化学修飾（点突然変異、ドメイン融合、糖型改変など）に由来する。外因性免疫原性は主に生産技術、薬品輸送、患者の遺伝背景、薬剤使用量、投与頻度や方式などに由来する。生物薬の種類と量が次第に増加し、その応用が広がるのに伴い、免疫原性と関連する問題も人々により高く注目されてきた。ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）は免疫系による識別の基礎であり、生体の適応免疫プロセスに関与する。ＭＨＣ分子組成に基づいて二重特異性抗体を設計することは人体免疫環境と良好な互換性がある。ＭＨＣ－クラスＩＩ分子に対して、ＭＨＣ－クラスＩ分子は広く分布しており、ほぼすべての有核細胞表面に発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に認識される。ＨＬＡ－Ｉ分子のうち、ＨＬＡ－Ｉ－ＢクラスのヒトのＭＨＣ－Ｉ分子の数が最も多いため、ＨＬＡ－Ｉ－ＢクラスのヒトのＭＨＣ－Ｉ分子の定常領域に基づいて二重特異性抗体の構造エレメントを構築することで、免疫原性リスクを低減することができる。

さらに、ＨＬＡ－Ｉ－ＢクラスのヒトのＭＨＣ－Ｉ分子の定常領域は、Ｎ－が連結するとともにＯ－が連結するグリコシル化部位を含まず、開発性が良好で免疫原性が低い。

実験により、改変して構築した二重特異性抗体は依然として良好な抗原結合性能を持っていることを発見した。

本発明による二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分を含み、前記第１抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１重鎖可変ドメイン及び前記第１重鎖可変ドメインに作動可能に連結された第１ペアードドメインを含む第１ポリペプチドと、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１軽鎖可変ドメイン及び前記第１軽鎖可変ドメインに作動可能に連結された第２ペアードドメインを含む第２ポリペプチドと、を含み、
ここで、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインのうちの一方のペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、他方のペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインは二量体を形成でき、前記第１ペアードドメインと第２ペアードドメインとの間に少なくとも１つの非天然鎖間結合を形成でき、且つ前記非天然鎖間結合は前記二量体を安定化させることができる。

第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインは、第１抗原結合部分の異なる位置に配向している（例えば、軽鎖可変領域又は重鎖可変領域に連結している）場合にも、抗原に対して優れた結合親和性を有する二量体を形成することができる。

一実施形態では、前記第１ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、前記第１ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含む。

非天然鎖間結合は、第１ペアードドメインと第２ペアードドメインとによって形成される二量体を安定化させることができ、前記非天然鎖間結合を形成するアミノ酸残基は、第１ペアードドメインと第２ペアードドメインとの接触界面にあり、効果的に結合を形成し得る。「接触界面」という用語は、前記ポリペプチドが相互に作用／会合する、前記ポリペプチドの特定の領域を意味する。接触界面は１つ又は複数のアミノ酸残基を含み、相互作用の際に接触又は会合した対応するアミノ酸残基と相互作用することができる。接触界面でのアミノ酸残基は、連続した配列に存在していてもよいし、存在していなくてもよい。例えば、前記界面が３次元である場合、前記界面内のアミノ酸残基は、線状配列上の異なる位置に個別に配置されていてもよい。

前記非天然鎖間結合の数は１～３個、例えば１個、２個又は３個であってもよく、天然抗体にできるだけ類似するように、前記非天然鎖間結合の数は１個であることが好ましい。一実施形態では、前記非天然鎖間結合はジスルフィド結合である。

いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、前記工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列、工学的改変β２ミクログロブリンは、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列は複数のＨＬＡ－Ｉ－Ｂクラス分子の定常領域配列をアライメントして生成した一致性配列に由来し、それを利用するか或いはそれを改変してペアードドメインを形成することには良好な汎用性がある。

いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。

工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３、工学的改変β２ミクログロブリン中の前記アミノ酸置換は、非天然鎖間結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成するアミノ酸置換、又は／及びペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体を向上させるアミノン酸置換を含む。

いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３と工学的改変β２ミクログロブリン中の前記アミノ酸置換はいずれも両方の接触界面で発生し、且つ互いにジスルフィド結合を形成し得るシステイン残基置換を含む。１つの具体的な実施形態では、前記システイン残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＲ６０Ｃ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＹ２６Ｃに置換される。１つの具体的な実施形態では、前記システイン残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＡ６２Ｃ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＲ１２Ｃに置換される。１つの具体的な実施形態では、前記システイン残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＧ６３Ｃ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＹ６７Ｃに置換される。別の具体的な実施形態では、前記システイン残基置換は、上記のＲ６０Ｃ／Ｙ２６Ｃ、Ａ６２Ｃ／Ｒ１２Ｃ、Ｇ６３Ｃ／Ｙ６７Ｃから選択される２対又は３対であってもよい。

いくつかの実施形態では、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３又は／及び工学的改変β２ミクログロブリン中のアミノ酸置換は、ペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体の等電点を向上させるアミノ酸置換を含む。これらのアミノ酸置換は、２つのペアードドメインの両方、又はいずれか１つのペアードドメインで発生することができる。生産プロセスの開発を容易にし、薬剤化性を改善するために、一般的に、ペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体の等電点を６．５～９．０に向上させる。いくつかの実施形態では、ペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体の等電点を、６．５～８．５、７．０～８．５、７．０～９．０、７．０～７．８、７．０～８．０、７．５～７．８又は７．５～８．０に向上させる。いくつかの具体的な実施形態では、ペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体の等電点を、６．５、６．７、６．９、７．１、７．３、７．５、７．７、７．８、７．９、８．０、８．２、８．３、８．５、８．７又は９．０に向上させる。等電点は実験的に測定し、理論的に計算することができ、等電点の理論的な計算は、例えば、オンライン計算解析ツールＥｘｐａｓｙ－Ｃｏｍｐｕｔｅ ｐＩ／Ｍｗ ｔｏｏｌ （ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／）を使用することができる。

いくつかの実施形態では、等電点を向上させるアミノ酸置換は、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列のＥ３、Ｄ２２、Ｅ４８、Ｄ５３、Ｅ９０、Ｅ１０１のうちの１つ又は複数位置で正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含む。

いくつかの実施形態では、等電点を向上させるアミノ酸置換は、工学的改変β２ミクログロブリンにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のＥ７４、Ｅ４７、Ｅ６９、Ｄ３４、Ｅ１６、Ｄ５３、Ｅ４４、Ｅ５０、Ｅ３６のうちの１つ又は複数の位置で正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含む。

いくつかの具体的な実施形態では、等電点を向上させるアミノ酸置換は、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列のＤ２２、Ｅ４８及びＤ５３の位置で正に帯電したアミノ酸により置換され、前記工学的改変β２ミクログロブリンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のＥ６９の位置で正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含む。

いくつかの実施形態では、正の電気的アミノ酸はＫ又はＲである。

１つのより具体的な実施形態では、等電点を向上させるアミノ酸置換は、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列でアミノ酸置換Ｄ２２Ｒ、Ｅ４８Ｋ及びＤ５３Ｋを含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列でアミノ酸置換Ｅ６９Ｒを含むことを含む。

いくつかのより具体的な実施形態では、前記アミノ酸置換は、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列においてアミノ酸置換Ａ６２Ｃ、Ｄ２２Ｒ、Ｅ４８Ｋ及びＤ５３Ｋを含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列においてアミノ酸置換Ｒ１２Ｃ、Ｅ６９Ｒを含むことを含む。さらなる形態では、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のカルボキシル末端に付加された「ＧＰ」を含む。

具体例として、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む。

別の例として、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記第２抗原結合部分は、第２重鎖可変ドメイン及び第２軽鎖可変ドメインを含む。前記第２抗原結合部分は、本発明に記載の第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインを含まない。１つの具体的な実施形態では、前記第２抗原結合部分はＦａｂを含む。前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分は、２つの異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合し、いくつかの実施形態では、前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分は、それぞれの抗原に１価で結合する。

いくつかの実施形態では、ＥＵ番号により、前記ＦａｂのＣＬドメインのＴ／Ｓ１１４、Ｔ／Ｆ１１６、Ｆ１１８位にある１つ又は複数が疎水性アミノ酸に置換され、いくつかの実施形態では、前記疎水性アミノ酸は、メチオニン、アラニン、バリン、イソロイシン、又はロイシンなどの非芳香族から選択される。第２抗原結合部分のＦａｂのＣＬドメインに適切なアミノ酸置換を導入することにより、軽鎖と重鎖のミスマッチをさらに低減することができる。具体例としては、ＥＵ番号により、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸はアラニン（Ａ）に置換されている。別の実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインはＥＵ番号によるＦ１１８位でアラニンに置換され、前記ＣＬドメインは、例えば、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３を含むペアードドメインとのＣＬのミスマッチをさらに低減するような他の置換も含む。

いくつかの実施形態では、前記ＣＬドメインは、ヒトκ軽鎖ＣＬドメイン又はヒトλ軽鎖ＣＬドメインに由来することができる。具体例として、Ｆ１１８Ａを含むＣＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示されるアミノ酸配列を含む。具体例として、Ｆ１１８Ａを含むＣＬドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示される。

いくつかの実施形態では、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１－４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥのＣＨ１ドメインであってもよく、具体例としては、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインである。具体例として、ＣＨ１のドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されるアミノ酸配列を含む。具体例として、ＣＨ１のドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示される。具体例として、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ４のＣＨ１ドメインである。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されるアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で示されるアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示されるアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＡＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

いくつかの具体的な実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸はアラニンに置換され、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは１２８位（ＥＵ番号）、１４１位（ＥＵ番号）、１８５位（ＥＵ番号）、１１位（ＩＭＧＴ番号）、２８位（ＩＭＧＴ番号）、又は１３９位（Ｋａｂａｔ番号）にアミノ酸置換を含まない。別の実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインは、ＥＵ番号によるＦ１１８位でアラニンに置換され、前記ＣＬドメインは、他の置換（例えば、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３を含むペアードドメインとのＣＬのミスマッチをさらに低減する置換）をさらに含み、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは、１２８位（ＥＵ番号）、１４１位（ＥＵ番号）、１８５位（ＥＵ番号）、１１位（ＩＭＧＴ番号）、２８位（ＩＭＧＴ番号）、又は１３９位（Ｋａｂａｔ番号）にアミノ酸置換を含まない。

いくつかの具体的な実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸はアラニンに置換され、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８Ｆ（ＥＵ番号）、Ａ１４１Ｌ位（ＥＵ番号）、Ｖ１８５Ａ／Ｌ（ＥＵ番号）、Ｌ１１Ｋ／Ｆ／Ｗ（ＩＭＧＴ番号）、Ｌ２８Ｎ／Ｒ（ＩＭＧＴ番号）、又はＡ１３９Ｗ／Ｖ／Ｉ（Ｋａｂａｔ番号）のアミノ酸置換を含まない。別の実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインは、ＥＵ番号によるＦ１１８位でアラニンに置換され、前記ＣＬドメインは他の置換（例えば、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３を含むペアードドメインとのＣＬのミスマッチをさらに低減する置換）をさらに含み、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８Ｆ（ＥＵ番号）、Ａ１４１Ｌ位（ＥＵ番号）、Ｖ１８５Ａ／Ｌ（ＥＵ番号）、Ｌ１１Ｋ／Ｆ／Ｗ（ＩＭＧＴ番号）、Ｌ２８Ｎ／Ｒ（ＩＭＧＴ番号）、又はＡ１３９Ｗ／Ｖ／Ｉ（Ｋａｂａｔ番号）のアミノ酸置換を含まない。

いくつかの具体的な実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸はアラニンに置換され、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは、野生型免疫グロブリンのＣＨ１ドメイン、例えばヒトＩｇＧのＣＨ１ドメインを用いる。別の実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインはＥＵ番号によるＦ１１８位でアラニンに置換され、前記ＣＬドメインは他の置換（例えば、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３を含むペアードドメインとのＣＬのミスマッチをさらに低減する置換）をさらに含み、前記ＦａｂのＣＬドメインは、野生型免疫グロブリンのＣＨ１ドメイン、例えばヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＣＨ１ドメインを用いる。

いくつかの具体的な実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに、本実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインは、Ｆ１１８Ａを含む。さらに、本実施形態では、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは野生型免疫グロブリンのＣＨ１ドメインであり、又は、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインは、１２８位（ＥＵ番号）、１４１位（ＥＵ番号）、１８５位（ＥＵ番号）、１１位（ＩＭＧＴ番号）、２８位（ＩＭＧＴ番号）、又は１３９位（Ｋａｂａｔ番号）にアミノ酸置換を含まない。

いくつかの具体的な実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されるアミノ酸配列を含む。

いくつかの具体的な実施形態では、前記ＦａｂのＣＬドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示され、前記ＦａｂのＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示される。

いくつかの実施形態では、前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分の一方はＴ細胞特異的受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞特異的受容体分子に結合し、他方は腫瘍関連抗原に結合する。

Ｔ細胞特異的受容体分子は、Ｔ細胞の結合を可能にし、追加のシグナルが存在する場合、抗原提示細胞又はＡＰＣと呼ばれる別の細胞によって提示されたエピトープ／抗原によって活性化され、それに応答する。Ｔ細胞特異的受容体分子は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０とも呼ばれる）、４－１ＢＢ、ＣＤ５、又はＣＤ９５（Ｆａｓ受容体とも呼ばれる）であり得る。

ＮＫ細胞特異的受容体分子の例としては、ＣＤ１６、低親和性Ｆｃ受容体とＮＫＧ２Ｄ、及びＣＤ２が含まれる。

「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍細胞の表面に提示されるか、又は腫瘍細胞の表面に提示され得るとともに、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞内に存在する抗原を意味する。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、正常細胞すなわち非腫瘍細胞ではなく、腫瘍細胞のみによって提示されてもよい。他のいくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞上でのみ発現することができ、又は非腫瘍細胞と比較して腫瘍特異的突然変異を表すことができる。他のいくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞において見出されてもよいが、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞上で過剰に発現され、又は非腫瘍組織と比較して腫瘍組織のあまり密でない構造のために、腫瘍細胞内で抗体に結合してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍の脈管系上に位置する。いくつかの例示的な腫瘍関連抗原は、ＣＤ３８、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１などである。

いくつかの実施形態では、前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分の一方はＣＤ３に特異的に結合し、他方は腫瘍関連抗原に特異的に結合する。例えば、第１抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合し、第２抗原結合部分は腫瘍関連抗原に特異的に結合し、又は、第２抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合し、第１抗原結合部分は腫瘍関連抗原に特異的に結合する。いくつかの具体例では、第１抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＣＤ３８に特異的に結合し、又は、前記第１抗原結合部分はＣＤ３８に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合する。

いくつかの実施形態では、前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分は、いずれも腫瘍関連抗原に特異的に結合する。いくつかの具体例では、前記第１抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＣＤ４７に特異的に結合し、又は、前記第１抗原結合部分はＣＤ４７に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。

いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、安定に会合可能なる２つのＦｃポリペプチドからなるＦｃドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は２価である。

いくつかの実施形態では、前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される。いくつかのより具体的な実施形態では、前記第１抗原結合部分の第１ポリペプチドは、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、Ｆａｂを含み、そのＦａｂ重鎖がそのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される。いくつかのより具体的な実施形態では、第１抗原結合部分の第１ポリペプチドは、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、第２抗原結合部分は、Ｆａｂを含み、そのＦａｂ軽鎖がそのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される。

いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、第３抗原結合部分をさらに含む。いくつかの具体的な実施形態では、前記二重特異性抗体の抗原に対する結合は３価である。

いくつかの実施形態では、前記第３抗原結合部分は、第２抗原結合部分と同じ抗原エピトープに結合し、好ましくは、前記第３抗原結合部分は、第２抗原結合部分と同一である。別の実施形態では、前記第３抗原結合部分は、第１抗原結合部分と同じ抗原エピトープに結合し、好ましくは、前記第３抗原結合部分は、第１抗原結合部分と同一である。

いくつかの実施形態では、前記第３抗原結合部分は、第１抗原結合部分のＮ末端又はＣ末端に作動的に連結される。

別の実施形態では、前記第３抗原結合部分は、第２抗原結合部分のＮ末端又はＣ末端に作動的に連結される。

いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、第３抗原結合部分を含み、安定に会合可能な２つのＦｃポリペプチドからなるＦｃドメインをさらに含む。

いくつかの具体的な実施形態では、前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において第１抗原結合部分のＮ末端又は第２抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結される。

他の具体的な実施形態では、前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において前記第３抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結され、第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される。

他の具体的な実施形態では、前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において前記第３抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結され、第１抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される。

第１抗原結合部分への上記第３抗原結合部分の作動的な連結は、ペプチドリンカーを介した連結であってもよい。

第２抗原結合部分への上記第３抗原結合部分の作動的な連結は、ペプチドリンカーを介した連結であってもよい。ペプチドリンカーは、任意の適切なものを用いることができ、例えば、帯電性及び／又は柔軟なリンカーポリペプチドとしてもよい。具体的な実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して連結された１～５０個のアミノ酸からなり、前記アミノ酸は、天然に存在する２０個のアミノ酸から選択され、より好ましい実施形態では、１～５０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、セリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。したがって、例示的なペプチドリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２、（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４、ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ、又は特許出願ＷＯ２０１９１９５５３５の表４に開示されているものなどであり得る。いくつかの実施形態では、前記ペプチドリンカーはグリシン及びセリンからなるペプチドリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、前記ペプチドリンカーが含むアミノ酸の数は、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２０個以上であってもよい。

抗原結合部分がＦｃドメイン又はＦｃポリペプチドに作動的に連結される場合、典型的にはヒンジ領域を介して連結する。ヒンジは、例えば、ヒトＩｇＧのヒンジ領域のアミノ酸を含む。

［Ｆｃドメイン］
二重特異性抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各ＦｃポリペプチドはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常領域を含む。Ｆｃドメインの２つのＦｃポリペプチドは、互いに安定に会合することができる。例えば、２つのＦｃポリペプチドは、リンカー、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、疎水性－親水性相互作用のうちの１つ又はいくつかを介して安定に会合する。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、１つのＦｃドメインを含む。

一実施形態では、二重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。１つの具体的な実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。１つのより具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、このアミノ酸置換はＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換を減少させる。さらに別の具体的な実施形態では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。より具体的な実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。

いくつかの実施形態では、前記Ｆｃドメインは、アミノ酸置換などの修飾を含む。前記修飾は、例えば、ヘテロ二量化を促進する修飾、エフェクターの機能を変化させる修飾、Ａタンパク質との結合能を変化させる修飾などであってもよい。

いくつかの実施形態では、前記Ｆｃドメインはヘテロ二量化を促進する修飾を含む。

本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの２つのＦｃポリペプチドの一方又は他方に融合する異なる抗原結合部分を含み、したがって、２つのＦｃポリペプチドは、通常、２つの異なるポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量化は、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせを生成する。組換え産生における多重特異性抗体の収率及び純度を向上させるためには、この二重特異性抗体のＦｃドメインに所望のポリペプチド結合を促進する修飾を導入することが有利である。したがって、具体的な実施形態では、前記Ｆｃドメインは、前記Ｆｃドメインの２つのＦｃポリペプチドの会合を促進するアミノ酸置換を含む。

ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのＦｃポリペプチド間の最も広範なタンパク質－タンパク質相互作用部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一実施形態では、この修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。

具体的な実施形態では、この修飾は、Ｆｃドメインの２つのＦｃポリペプチドのうちの１つにおける「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのＦｃポリペプチドのうちの他方における「ホール」修飾とを含む、いわゆるノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）修飾である。一般に、この方法は、一方のＦｃポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を導入し、他方のＦｃポリペプチドの界面に対応する凹部（「ホール」）を導入し、この凹部内に突起が位置決めされることで、ヘテロダイマー形成を促進し、ホモダイマー形成を妨げることを可能にする。一方のＦｃポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファンなど）に置換することにより、突起が構築される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニンなど）に置換することにより、他方のＦｃポリペプチドの界面に突起と同一又は類似の大きさを有する相補的な凹部が形成される。

したがって、具体的な実施形態では、この二重特異性抗体の一方のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基を側鎖体積のより大きなアミノ酸残基で置換することにより、当該ＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて他方のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインの凹部に位置決めすることができる突起を形成し、他方のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基を側鎖体積のより小さなアミノ酸残基で置換することにより、当該ＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて凹部を形成することができる。

いくつかの特定実施形態では、Ｆｃドメインの一方のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｙ／Ｗ又は／及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃポリペプチドは、Ｙ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ又は／及びＬ３６８Ａを含む。より具体例として、前記Ｆｃドメインの一方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａを含む。より具体例では、ＦｃはヒトＩｇＧ１のＦｃであってもよい。

いくつかの実施形態では、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン内の１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とＡタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）との結合を減少又は排除する修飾を含む。いくつかの実施形態では、この修飾はアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、前記Ｆｃドメインは、一方のＦｃポリペプチドでのみ発生し、他方のＦｃポリペプチドでは発生しないアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを含む。１つの具体的な実施形態では、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃポリペプチドの一方でのみ発生するアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを含む。このような具体的な実施形態では、このＦｃはＩｇＧ１Ｆｃであり、特にヒトＩｇＧ１Ｆｃである。

［組成物］
本発明は、二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、１種又は複数種の薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体は、例えば、賦形剤、希釈剤、カプセル化剤、充填剤、緩衝剤、又は他の試薬を含む。

［単離核酸］
本発明は、前記二重特異性抗体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの二重特異性抗体のポリペプチド鎖の核酸配列が、配列表に例示的に列挙されている。

［ベクター］
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む単離ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、前記ベクターはクローニングベクターであり、別の実施形態では、前記ベクターは発現ベクターであり、具体例として、発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１である。前記発現ベクターは、本明細書に記載の多重特異性抗体を発現することができる任意の発現ベクターであってもよい。

［ホスト細胞］
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のベクター又はポリヌクレオチドを含むホスト細胞を提供し、このホスト細胞は、多重特異性抗体をクローニング又はコードするのに適切なホスト細胞である。いくつかの実施形態では、ホスト細胞は原核細胞である。別の実施形態では、ホスト細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、ホスト細胞は、酵母細胞、哺乳細胞、又は多重特異性抗体の製造に適した他の細胞から選択される。哺乳細胞は、例えば、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）卵巣細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞である。

［二重特異性抗体の発現方法］
本発明は、本発明の二重特異性抗体の発現方法であって、前記二重特異性抗体が発現される条件下でホスト細胞を培養することを含む方法を提供する。

前記二重特異性抗体を産生するために、前記二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、ホスト細胞内でさらにクローニング又は／及び発現するために１つ又は複数のベクターに挿入する。前記ポリヌクレオチドは、遺伝子スプライシング、化学合成など、当業者に周知の様々な方法を用いて取得することができる。

［コンジュゲート］
本発明は、本発明に記載の二重特異性抗体と、前記二重特異性抗体に結合又はコンジュゲートする治療薬と、を含む、コンジュゲートを提供する。

［融合タンパク質］
本発明は、融合成分が本発明に記載の二重特異性抗体と融合して発現する融合タンパク質を提供する。遺伝子工学手段により融合タンパク質分子の構築と発現を実現することができる。

［使用］
本発明は、本発明に記載の二重特異性抗体、医薬組成物、コンジュゲート又は融合タンパク質の治療有効量を被験体に投与することを含む、必要とされる被験体における疾患を治療するための方法を提供する。

前記疾患の例は、癌であってもよく、いくつかの癌の例は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、気管支癌、骨癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、腎細胞癌、甲状腺癌、頭頸部癌、精巣癌、内分泌腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、軟部組織癌、血管癌、脳癌、神経癌、眼癌、髄膜癌、中咽頭癌、下咽頭癌、子宮頸部癌、子宮癌、神経膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群又は肉腫から選択されるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、また、以下のいくつかの具体的な実施形態を提供するが、これらに限定されるものではない。

実施形態１．２つの異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、
前記第１抗原結合部分は、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１重鎖可変ドメイン及び前記第１重鎖可変ドメインに作動可能に連結された第１ペアードドメインを含む第１ポリペプチドと、
Ｎ末端からＣ末端まで、第１軽鎖可変ドメイン及び前記第１軽鎖可変ドメインに作動可能に連結された第２ペアードドメインを含む第２ポリペプチドと、を含み、
ここで、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインのうちの一方のペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、他方のペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体。
実施形態２．前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインは二量体を形成でき、前記第１ペアードドメインと第２ペアードドメインとの間に少なくとも１つの非天然鎖間結合を形成でき、且つ前記非天然鎖間結合は前記二量体を安定化させることができる、実施形態１に記載の二重特異性抗体。
実施形態３．前記第１ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載の二重特異性抗体。
実施形態４．前記第１ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載の二重特異性抗体。
実施形態５．前記非天然鎖間結合は１～３個、好ましくは１個である、実施形態１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態６．前記非天然鎖間結合を形成するアミノ酸残基は、第１ペアードドメインと第２ペアードドメインとの接触界面にある、実施形態１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態７．前記非天然鎖間結合はジスルフィド結合である、実施形態１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態８．前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有し、前記工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する、実施形態１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態９．前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態１０．工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３及び工学的改変β２ミクログロブリン中の前記アミノ酸置換は、いずれも、両方の接触界面で発生し、互いにジスルフィド結合を形成し得るシステイン残基置換を含む、実施形態９に記載の二重特異性抗体。
実施形態１１．前記システイン残基置換は次の群から選択される１対から複数対である、実施形態１０に記載の二重特異性抗体。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＲ６０ＣとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＹ２６Ｃ
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＡ６２ＣとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＲ１２Ｃ
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＧ６３ＣとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＹ６７Ｃ
実施形態１２．工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３又は／及び工学的改変β２ミクログロブリン中のアミノ酸置換は、ペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体の等電点を向上させるアミノ酸置換を含む、実施形態９～１１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態１３．ペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体の等電点を６．５～９．０に向上させる、実施形態１２に記載の二重特異性抗体。
実施形態１４．等電点を向上させるアミノ酸置換は、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列のＥ３、Ｄ２２、Ｅ４８、Ｄ５３、Ｅ９０、Ｅ１０１のうちの１つ又は複数の位置で正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含む、実施形態１２～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態１５．等電点を向上させるアミノ酸置換は、工学的改変β２ミクログロブリンにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のＥ７４、Ｅ４７、Ｅ６９、Ｄ３４、Ｅ１６、Ｄ５３、Ｅ４４、Ｅ５０、Ｅ３６のうちの１つ又は複数の位置が正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含む、実施形態１２～１４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態１６．等電点を向上させるアミノ酸置換は、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列のＤ２２、Ｅ４８及びＤ５３位が正に帯電したアミノ酸により置換され、前記工学的改変β２ミクログロブリンにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のＥ６９位が正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含む、実施形態１５に記載の二重特異性抗体。
実施形態１７．前記正に帯電したアミノ酸はＫ又はＲである、実施形態１４～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態１８．等電点を向上させるアミノ酸置換は、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列でアミノ酸置換Ｄ２２Ｒ、Ｅ４８Ｋ及びＤ５３Ｋを含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列でアミノ酸置換Ｅ６９Ｒを含むことを含む、実施形態１２～１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態１９．前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２０．前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２１．前記第２抗原結合部分は、第２重鎖可変ドメイン及び第２軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２２．前記第２抗原結合部分はＦａｂを含む、実施形態１～２１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２３．ＥＵ番号により、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸がアラニンで置換されている、実施形態２２に記載の二重特異性抗体。
実施形態２４．前記ＣＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態２３に記載の二重特異性抗体。
実施形態２５．前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分の一方はＴ細胞特異的受容体分子及び／又はナチュラルキラー細胞特異的受容体分子に結合し、他方は腫瘍関連抗原に結合する、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２６．前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分の一方はＣＤ３に特異的に結合し、他方は腫瘍関連抗原に特異的に結合する、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２７．前記第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分の両方は腫瘍関連抗原に特異的に結合する、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２８．前記腫瘍関連抗原はＣＤ３８、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－１である、実施形態２５～２７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態２９．前記第１抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＣＤ３８に特異的に結合し、又は、第１抗原結合部分はＣＤ３８に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＣＤ３に特異的に結合する、実施形態２６に記載の二重特異性抗体。
実施形態３０．前記第１抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＣＤ４７に特異的に結合し、又は、第１抗原結合部分はＣＤ４７に特異的に結合し、第２抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、実施形態２７に記載の二重特異性抗体。
実施形態３１．前記二重特異性抗体が２価である、実施形態１～３０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態３２．第２抗原結合部分と同じ抗原エピトープに結合する第３抗原結合部分をさらに含み、好ましくは、前記第３抗原結合部分は、第２抗原結合部分と同一である、実施形態１～３０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態３３．第１抗原結合部分と同じ抗原エピトープに結合する第３抗原結合部分をさらに含み、好ましくは、前記第３抗原結合部分は、第１抗原結合部分と同一である、実施形態１～３０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態３４．前記第３抗原結合部分は第１抗原結合部分のＮ末端又はＣ末端に作動的に連結される、実施形態３２又は３３に記載の二重特異性抗体。
実施形態３５．前記第３抗原結合部分は第２抗原結合部分のＮ末端又はＣ末端に作動的に連結される、実施形態３２又は３３に記載の二重特異性抗体。
実施形態３６．前記二重特異性抗体が３価である、実施形態３２～３５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態３７．安定に会合可能な２つのＦｃポリペプチドからなるＦｃドメインをさらに含む、実施形態１～３１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態３８．前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される、実施形態３７に記載の二重特異性抗体。
実施形態３９．前記第１抗原結合部分の第１ポリペプチドは、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、Ｆａｂを含み、そのＦａｂ重鎖がそのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される、実施形態３８に記載の二重特異性抗体。
実施形態４０．安定に会合可能な２つのＦｃポリペプチドからなるＦｃドメインをさらに含む、実施形態３２～３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態４１．前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において第１抗原結合部分のＮ末端又は第２抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結される、実施形態４０に記載の二重特異性抗体。
実施形態４２．前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において前記第３抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結され、第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される、実施形態４０に記載の二重特異性抗体。
実施形態４３．前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において前記第３抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結され、第１抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される、実施形態４０に記載の二重特異性抗体。
実施形態４４．第１抗原結合部分への前記第３抗原結合部分の作動的な連結はペプチドリンカーを介した連結であるか、又は第２抗原結合部分への前記第３抗原結合部分の作動的な連結はペプチドリンカーを介した連結である、実施形態４１～４３に記載の二重特異性抗体。
実施形態４５．前記ＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである、実施形態３７～４４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態４６．前記ＩｇＧ ＦｃドメインはヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである、実施形態４５に記載の二重特異性抗体。
実施形態４７．２つのＦｃポリペプチドは、リンカー、ジスルフィド結合、水素結合、静電的相互作用、塩橋、疎水性－親水性相互作用のうちの１つ又はいくつかを介して安定に会合する、実施形態３７～４６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態４８．前記Ｆｃドメインは、前記Ｆｃドメインの２つのＦｃポリペプチドの会合を促進する修飾を含む、実施形態３７～４７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態４９．ＥＵ番号により、前記Ｆｃポリペプチドの一方のＦｃポリペプチドはＴ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃポリペプチドはＹ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａを含む、実施形態３７～４８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態５０．前記Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン内の１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とＡタンパク質との結合を減少又は排除する修飾を含む、実施形態３７～４９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態５１．ＥＵ番号により、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃポリペプチドの一方でのみ発生するアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを含む、実施形態３７～５０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
実施形態５２．実施形態１～５１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
実施形態５３．実施形態５２に記載のポリヌクレオチドを含む単離ベクター。
実施形態５４．実施形態５２に記載の単離ポリヌクレオチド、又は実施形態５１に記載の単離ベクターを含むホスト細胞。
実施形態５５．二重特異性抗体が発現される条件下で実施形態５２に記載のホスト細胞を培養することを含む、実施形態１～５１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の発現方法。
実施形態５６．実施形態１～５１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
実施形態５７．実施形態１～５１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、該二重特異性抗体に結合又はコンジュゲートする治療薬と、を含むコンジュゲート。
実施形態５８．融合して発現された融合成分と、実施形態１～５１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と、を含む融合タンパク質。
実施形態５９．必要とされる被験体における疾患を治療するための方法であって、実施形態１～５１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、実施形態５６に記載の医薬組成物、実施形態５７に記載のコンジュゲート、又は実施形態５８に記載の融合タンパク質の治療有効量を被験体に投与することを含む、方法。

〔ＭＨＣ－Ｉエレメント配列の設計〕
ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ｓｔａｔｓ．ｈｔｍｌ）データベース（バージョン３．４２）の統計（表１）によると、ＨＬＡ－ＩはＨＬＡ－ＩＩよりもアリルの数が多く、分布が広いので、ＨＬＡ－Ｉ分子を用いて二重特異性抗体の構造エレメントを設計することで、免疫原性リスクを低減する。
ＩＰＤ－ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（バージョン３．４２）の統計（表２）によると、ＨＬＡ－Ｉ分子では、ＨＬＡ－Ｉ－Ｂアレルの数が最も多いので、ＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子を用いて二重特異性抗体の構造エレメントを設計することで、免疫原性リスクをさらに低減する。

（１．１ ＭＨＣ－Ｉエレメントの初期配列の決定）
Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）データベースから、一連の天然ＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子α鎖の全長配列（表３）を取得した。Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから、ＨＬＡ－Ｉ分子のβ鎖（βミクログロブリンとも呼ばれる）の全長配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ６１７６９）を取得した。Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースページのクロスインデックスシステムにより、さらにＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子α鎖を含有するタンパク質結晶データの情報を取得し、結晶データの正確性を確保するために、高解像度の結晶構造（Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ＜２Å）を選択した（表４）。
配列解析を行い、これらの結晶構造の情報を組み合わせて、天然ＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子α鎖の定常領域（ここでは、ＭＨＣＩＣα、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ａｌｐｈａ ｏｆ ＭＨＣ Ｉと定義され、又はＣαと略する）の相対的な開始位置を決定した。ＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子α鎖の定常領域には一定の配列多様性があり、オンラインアラインメントツールＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ／ｓｉｍｐｌｅ＿ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ／）を用いて表３の配列について複数配列のアラインメントを行い、アラインメント結果をｗｅｂ Ｌｏｇｏ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／）で解析して表示し、各位置におけるアミノ酸の出現頻度からＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子α鎖の定常領域の一貫性配列を得て（図１）、且つＨＬＡ－Ｉ－Ｂ分子α鎖の定常領域の一貫性配列をその後の操作や改変のための初期配列とした。ヒトのβ２ミクログロブリンには配列の多様性がないため、配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ６１７６９）を解析することにより、天然β２ミクログロブリンとＭＨＣＩＣαとのペアリング領域（ここでは、ＭＨＣＩＣβ、ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｂｅｔａ ｏｆ ＭＨＣ Ｉと定義され、又はＣβと略する）の配列を決定した。
ＭＨＣ－Ｉエレメントの初期配列は次のとおりである。
＞ ＭＨＣＩＣαｏｒｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＧＫＥＴＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＲＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥＰＳ
＞ＭＨＣＩＣβｏｒｉ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲ

（１．２ ＭＨＣ－Ｉエレメントの初期配列の最適化）
｛１．２．１、ＭＨＣ－Ｉエレメントのペアリング安定性を高めるための鎖間ジスルフィド結合の導入｝
上記のＭＨＣＩＣα ｏｒｉとＭＨＣＩＣβ ｏｒｉアミノ酸配列を同時にＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）ソフトウェアにロードし、ＭＯＥのＨｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇモジュールを通じてそれに対してヘテロダイマーモデリングを行い、それによって、ＭＨＣ－Ｉエレメントのシミュレーション構造を取得した。天然状態では、ＭＨＣ分子の定常領域間にジスルフィド結合は存在しない。ＭＨＣ－Ｉ定常領域のペアリング安定性を高め、その開発性を最適化するために、ＭＨＣＩＣαとＭＨＣＩＣβのドメインの接触界面で、ＭＨＣＩＣα ｏｒｉに対して、Ｒ６０、Ａ６２又はＧ６３位にシステイン（Ｃｙｓ）を導入することができ、ＭＨＣＩＣβ ｏｒｉに対して、Ｙ２６、Ｒ１２又はＹ６７位にシステイン（Ｃｙｓ）を導入することができる。ＭＯＥのＤｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｃａｎモジュールを通じて、ジスルフィド結合導入後のｄｅｌｔａ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙをシミュレーションして計算し、ＭＨＣＩＣα ｏｒｉにＡ６２Ｃ突然変異を導入し、ＭＨＣＩＣβ ｏｒｉにＲ１２Ｃ突然変異を導入したところ、ｄｅｌｔａ ｓｔａｂｉｌｉｔｙが－１．６２ｋｃａｌ／ｍｏｌと最も低くなり、この２つの位置の突然変異がＣαとＣβの界面で最も安定なジスルフィド結合を形成できることを示した（表５）。

｛１．２．２、等電点の最適化｝
初期配列にジスルフィド結合（表５のＡ６２ＣとＲ１２Ｃ）を導入したＭＨＣ－Ｉエレメントの理論等電点（ｐＩ、ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ）は５．８０であり、後続のプロセスの開発には不利であった。そのため、ＭＨＣ－Ｉエレメントに対して関連する電荷変更を行い、その薬剤形成性を改善した。ＭＯＥソフトウェアのＰｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓモジュールを通じてＭＨＣ－Ｉエレメントの溶媒可接触表面（ＳＡＳ、ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ）や帯電アミノ酸残基などについて解析を行った。ＭＨＣ－Ｉエレメントでは、アミノ酸残基の溶媒暴露程度が＞４０％であり、且つ負帯電／酸性を示すアミノ酸残基を表６に示す。また、関連する残基が置かれている構造環境、化学環境及び応用目的に合わせて、これらの酸性アミノ酸残基のうち１つ又は複数を塩基性アミノ酸残基（アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ））に置換し、ＭＨＣ－Ｉエレメントの理論等電点を６．５～９．０に向上させた。具体的な形態として、ＭＨＣＩＣαにＤ２２Ｒ、Ｅ４８Ｋ、及びＤ５３Ｋの３つの部位の突然変異を導入し、ＭＨＣＩＣβにＥ６９Ｒ単一点突然変異を導入し、ＭＨＣ－Ｉエレメントの理論等電点を７．８まで向上させた。

｛１．２．３、その他の最適化｝
Ｃ領域の末尾にある４つのアミノ酸（－ＫＷＤＲ）の側鎖が大きいことを考慮すると、潜在的な立体障害効果をもたらす可能性がある。可撓性のＧ４Ｓ連結ペプチドを用いるとタンパク質のコンホメーションの安定性が低下する。グリシン（Ｇ）とプロリン（Ｐ）の構造的特徴により、この２つのアミノ酸は主に規則性なくカール又は曲がった位置にあり、また、グリシンは側鎖基がなくて、立体障害効果をよく緩和することができ、一方、プロリンは側鎖が５員環構造で、一定の剛性を持って、立体障害効果を高めることができ、従って、最終的にＣβ領域のカルボキシル末端にＧＰを追加することで、潜在的な立体障害効果とコンホメーションの安定性のバランスを取る。
ＭＨＣ－Ｉエレメントの最適化配列は以下のとおりである。
＞ Ｃα（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＧＫＥＴＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＲＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＫＤＱＴＱＫＴＥＬＶＥＴＲＰＣＧＤＲＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＥＰＳ
＞Ｃβ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＣＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＲＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＧＰ

〔ＭＨＣ－Ｉエレメント修飾二重特異性ＩｇＧ４抗体の構築及び特徴付け〕
ＭＨＣ－Ｉエレメントが二重特異性抗体に使用できることを確実にするために、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）抗体とヒトを標的とするＣＤ３抗体ＳＰ３４を選択して、ＣＤ３とＣＤ３８を標的とする二重特異性抗体を構築し、概念初期を検証し、ＣαとβＣの相対配向がＭＨＣ－Ｉエレメント修飾抗原結合部分に与える影響を検討した。ＩｇＧ重鎖間のミスマッチを回避或いは緩和するために、後続に構築した二重特異性抗体はすべて「ノブイントゥーホール」」構造（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）を用いた。ＳＰ３４ ＦａｂのＩｇＧ定常領域のドメインＣＨ１／ＣＬはそれぞれ対応するＣα／ＣβとＣβ／Ｃαで置換され、相対配向の異なるＭＨＣ－Ｉ修飾抗原結合部分を構築し、ＳＰ３４アームの重鎖は「ホール」構造、すなわちＣＨ３－ｈｏｌｅを用いた。ダラツムマブのＦａｂはそのままに保持され、その重鎖は「ノブ」構造、すなわちＣＨ３－ｋｎｏｂを用いた。ＭＨＣ－Ｉで修飾されたＣＤ３を標的とする抗原結合部分をダラツムマブと組み合わせることにより、それぞれＭＨＩ３８３－１１２２－ＩｇＧ４とＭＨＩ３８３－１１３３－ＩｇＧ４（分子構造は図２を参照）と命名された２種類の異なる二重特異性抗体を生成し、これらの配列を表７に示す。ＭＨＣ－Ｉエレメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列のＣαとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列のＣβを用いた。

各二重特異性抗体について、抗体を構成する各ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列をそれぞれベクターに挿入し、対応するポリペプチド鎖を発現する発現ベクターを得た。各種の多重特異性抗体ポリペプチド鎖をコードする発現ベクターを２５μｇずつＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（メーカー：上海医薬工業研究院、品番：１２７２００００５）に共トランスフェクションし、トランスフェクション発現体積は１００ｍｌ、細胞密度は６Ｅ＋０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。
トランスフェクション後、細胞を３２℃、５％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの条件下で発現して培養し、８日目に細胞上清を採取し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ磁気ビーズ（メーカー：ジェンスクリプト社、品番：Ｌ００６９５－２０）で抗体タンパク質を一段で精製した。細胞上清を４ｍｌ磁気ビーズに加えて５０ ｍｌ遠心分離管に入れ、回転式脱色ロッカー（メーカー：上海智城社、型番：ＺＨＷＹ－３０４）に置いた。室温で２時間インキュベーションした。磁気スタンドベースで磁気ビーズを吸着し、上清を捨て、緩衝液で磁気ビーズを十分に洗浄し、ｐＨ ３．０の０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン（メーカー：国薬集団社、品番：６２０１１５１６）を用いて抗体タンパク質を溶出し、溶出液を限外濾過管（メーカー：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、品番：ＵＦＣ５０１０９６）に入れて濃縮し、１×ＰＢＳ（メーカー：上海生工社、品番：Ｂ０４０１００－０００５）で緩衝液を置換し、精製してＭＨＩ３８３－１１２２－ＩｇＧ４とＭＨＩ３８３－１１３３－ＩｇＧ４を得た。

（２．１ ＢＬＩによる二重特異性抗体と抗原との結合親和性の検出）
それぞれヒトのＣＤ３８タンパク質（北京ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、品番：ＣＤ８－Ｈ５２２４）とヒトのＣＤ３Ｅ（北京ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、品番：ＣＤＥ－Ｈ５２２３）を抗原とし、生物干渉膜技術（ＢＬＩ）によりそれぞれヒトのＣＤ３８とＣＤ３Ｅタンパク質に対するＭＨＩ３８３－１１２２－ＩｇＧ４とＭＨＩ３８３－１１３３－ＩｇＧ４の親和性を測定した。具体的な実験方法は以下のとおりである。
親和性アッセイはヒトのＣＤ３８及びＣＤ３Ｅタンパク質に対するＭＨＩ３８３－１１２２－ＩｇＧ４及びＭＨＩ３８３－１１３３－ＩｇＧ４の親和性を評価することに用いた。親和性アッセイは主にＢＬＩ技術によって行われた。ＭＨＩ３８３－１１２２－ＩｇＧ４又はＭＨＩ３８３－１１３３－ＩｇＧ４をそれぞれセンサーに固定し、センサーをそれぞれ一定濃度勾配のヒトのＣＤ３８及びＣＤ３Ｅタンパク質溶液に浸漬し、Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ １１．０．０．６４で結合解離曲線をリアルタイムで収集し、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ １１．０でデータ解析を行い、結合速度定数Ｋａ、解離速度定数Ｋｄ、平衡定数ＫＤを得て、平衡定数ＫＤは親和性を示した。

実験結果により、Ｃα／Ｃβ配向の異なる二重特異性抗体ＭＨＩ３８３－１１２２－ＩｇＧ４及びＭＨＩ３８３－１１３３－ＩｇＧ４は、いずれもヒトのＣＤ３８とＣＤ３Ｅタンパク質に対して良好な親和性を示し、相互間の親和性ＫＤ数値の差は＜３倍であり、主にその解離速度定数Ｋｄの損失による（表８）。したがって、ＭＨＣ－Ｉエレメント（Ｃα及びＣβ）は、ＣＨ１及びＣＬドメインの代わりに二重特異性抗体を構築することができる。

〔ＭＨＣ－Ｉエレメント修飾二重特異性ＩｇＧ１抗体の構築及び特徴付け〕
ＩｇＧ重鎖間のミスマッチを回避或いは緩和するために、構築した二重特異性抗体はすべて「ノブイントゥーホール」構造（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）を用いた。ＭＨＣ－Ｉエレメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される配列のＣαとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される配列のＣβ）が異なるＩｇＧサブタイプの二重特異性抗体に与える影響を調べるために、上記のＭＨＩ３８３－１１２２－ＩｇＧ４をＩｇＧ１の形態にし、ＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１と命名した新しい二重特異性抗体を生成した（構築構造は図３のようである）。この抗体の２本の重鎖のＣＨ２ドメインはいずれもＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）二重突然変異を用いて、潜在的なＦｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒ効果を除去した。本実施例では、ＭＨＣ－Ｉエレメント修飾重鎖のＣＨ３ドメインにＨ４３５Ｒ＋Ｙ４３６Ｆ（ＥＵ番号）二重突然変異を導入すると、Ｈ４３５Ｒ＋Ｙ４３６Ｆ二重突然変異を含有する重鎖ミスマッチ産物はｐｒｏｔｅｉｎ Ａに結合しないので、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー精製において除去され、目的とする二重特異性抗体の純度及び精製効率が向上する。
ＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１は、以下の配列を有する４本のポリペプチド鎖（Ｈｃ、Ｌｃ、Ｈｆ及びＬｆ）を有する。
Ｈｃ：アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示され、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示される。
Ｌｃ：アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示され、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示される。
Ｈｆ：アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示され、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示される。
Ｌｆ：アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示され、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示される。
溶出した目的タンパク質ピークはＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム及びＧＥのＡＫＴＡシステムを用いて分取サイズ排除クロマトグラフィーにより精製を続けた。この精製実験は平衡液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＡｃ，１５０ｍＭ Ｌ－Ａｒｇ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を用い、０．８ｍｌ／ｍｉｎの流速で行った。図４はＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１分子のＳＥＣ精製マップであり、ＳＥＣの主ピーク（保持時間ＲＴ＝７．１７４ ｍｉｎ）を収集し、その後の質量分析に用いた。前記ＳＥＣの主ピークについて液体クロマトグラフィー－質量分析法により完全な分子量同定を行った。

Ｗａｔｅｒｓ ＬＣ－ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，ＵＳＡ，ＵＫ）を用いて完全な分子量解析を行った。ＭＡｂＰａｃ ＲＰ ４μｍ ２．１×５０ ｍｍ （Ｔｈｅｒｍｏ， ＵＳＡ）カラムを用いて、Ａ相（０．１％ギ酸水溶液）、Ｂ相（０．１％ギ酸アセトニトリル水溶液）を移動相とし、検出波長を２８０ｎｍとした。タンパク質１μｇを液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、勾配を５．５分以内、５％Ｂ～１００％Ｂとした。質量分析計は正イオンモードを用い、走査範囲が２００～４０００ｍ／ｚであった。ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１でデータを収集し、ＵＮＩＦＩ １．８．２．１６９でデータを処理した。質量分析の結果、１４９９３４Ｄａでのピーク（図５）は、所望の正しく集合された二重特異性抗体ＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１の完全な分子量と一致することが示された。

配列パターンに基づいてＭＨＣ－Ｉエレメントのアミノ酸配列を解析したところ、Ｎ－連結グリコシル化部位モチーフ（ＮＸＳ／Ｔ、Ｘ＝プロリン以外の任意のアミノ酸）は認められなかった。しかし、Ｏ－連結グリコシル化部位は配列から予測することが困難であった。そこで、さらに、上記ＳＥＣの主ピークタンパク質に存在するＮ糖を、グリコシダーゼＰＮＧａｓｅＦを用いて加水分解により切断した。タンデム質量分析法を用いて、Ｎ糖切断後のタンパク質をペプチドグラムで特徴付け（タンパク質配列決定）、Ｏ－グリコシル化部位の可能性の有無を調べた。

Ｗａｔｅｒｓ ＬＣ－ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，ＵＳＡ，ＵＫ）を用いてペプチド配列カバレッジ解析を行った。ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐ ２．１×１５０ ｍｍ ２．７－Ｍｉｃｒｏｎ（Ａｇｌｉｅｎｔ，ＵＳＡ）カラムを用いて、Ａ相（０．１％ギ酸水溶液）、Ｂ相（０．１％ギ酸アセトニトリル水溶液）を移動相とし、検出波長を２１４ｎｍとした。ＰＮＧａｓｅＦで処理されたタンパク質を変性、還元、アルキル化した後、トリプシンで一晩酵素消化した。酵素消化後のタンパク質を適量で液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入して検出した。溶出勾配を１３ｍｉｎ以内、０％Ｂ～１５％Ｂ；４５ｍｉｎ以内：１５％Ｂ～４０％Ｂとした。質量分析計は正イオンモードを用い、走査範囲が１００～２０００ｍ／ｚであった。ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１でデータを収集し、ＵＮＩＦＩ １．８．２．１６９でデータを処理した。
ペプチドマッピング実験の実験結果は、また、ＭＨＩ３８３－ｃｃｆｆ－ＩｇＧ１分子中にいかなるＯ－連結グリコシル化の修飾も存在しないことを明らかにし、それによって、ＭＨＣ－Ｉエレメント中にいかなるＯ－連結グリコシル化部位も存在しないことを明らかにした。ＭＨＣ－Ｉエレメント修飾二重特異性抗体は、ＴＣＲ修飾に基づく二重特異性抗体よりもグリコフォームの不均一性が低く、下流のプロセス開発と品質管理により有利である。

〔突然変異部位の設計及び鎖ミスマッチの検証〕
抗体ＨＺ５Ｇ１１はヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質の細胞外セグメントを標的とし、抗体ＨＺ１４Ａ９はヒトＣＤ４７タンパク質の細胞外セグメントを標的とし、いずれも対応する抗原でマウスを免疫した後、ハイブリドーマでスクリーニングし、そしてヒト化して得られたモノクローナル抗体である。
ヒトを標的とするＰＤ－Ｌ１モノクローナルＩｇＧ１Ｋ抗体ＨＺ５Ｇ１１は、重鎖ＨＺ５Ｇ１１ＶＨ－ＣＨ１－ＩｇＧ１（重鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示される）と軽鎖ＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－ＩｇＫ（軽鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示される）からなり、ヒトを標的とするＣＤ４７モノクローナルＩｇＧ１Ｋ抗体ＨＺ１４Ａ９は、重鎖ＨＺ１４Ａ９ＶＨ－ＣＨ１－ＩｇＧ１（重鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５で示される）と軽鎖ＨＺ１４Ａ９ＶＬ－ＩｇＫ（軽鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６で示される）からなる。さらに、ＭＨＣ－Ｉエレメントに基づくＨＺ１４Ａ９とＨＺ５Ｇ１１に関連するバリアントを構築し、すなわち、ＨＺ１４Ａ９抗体重鎖のＩｇＧ１定常領域のドメインＣＨ１を対応するＭＨＣ－Ｉエレメント中のＭＨＣＩＣα（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で置換し、重鎖ＨＺ１４Ａ９ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１を生成し（重鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で示される）、ＨＺ１４Ａ９抗体軽鎖のＩｇＫ定常領域のドメインＣＬを対応するＭＨＣ－Ｉエレメント中のＭＨＣＩＣβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で置換し、軽鎖ＨＺ１４Ａ９ＶＬ－Ｃβを生成し（軽鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示される）、ＨＺ５Ｇ１１抗体重鎖のＩｇＧ１定常領域のドメインＣＨ１を対応するＭＨＣ－Ｉエレメント中のＭＨＣＩＣαで置換し、重鎖ＨＺ５Ｇ１１ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１を生成し（重鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示される）、ＨＺ５Ｇ１１抗体軽鎖のＩｇＫ定常領域のドメインＣＬを対応するＭＨＣ－Ｉ定常領域エレメントのＭＨＣＩＣβで置換し、軽鎖ＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－Ｃβを生成した（軽鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示される）。

ＭＨＣ－ＩエレメントＭＨＣＩＣα、ＭＨＣＩＣβと抗体定常領域ＣＨ１、軽鎖定常領域ＣＬとの間に可能な相互作用があるか否かを検証するために、表９に示すように、異なる重鎖又は軽鎖をコードするプラスミドをそれぞれ構築し、これらを組み合わせた後にペアリングして発現させ、精製を行った。具体的には、ＤＮＡ配列を合成し、重鎖と軽鎖をコードするＤＮＡ配列をそれぞれベクター（例えば、ＣＮ１０７００１４６３Ａに開示されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター、ＣＮ１０９４２２８１１Ａに開示されたｐＣＨＯ１．０ベクターなど）に挿入し、対応する重鎖又は軽鎖を発現する組換え発現ベクターを得た。重鎖と軽鎖を発現する組換え発現ベクターを質量比１：１でＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（メーカー：上海医薬工業研究院、品番：１２７２００００５）に共トランスフェクションし、発現体積が０．１～１Ｌ、細胞密度が６Ｅ＋０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（メーカー：上海医薬工業研究院、品番：１２７２００００５）にトランスフェクションした。
トランスフェクション後に細胞をＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ培地（メーカー：Ｔｈｅｒｍｏ社、品番：Ａ２９１０００１）に入れて、３２℃、５％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの条件で発現して培養し、１０日目に細胞上清を採取し、ＧＥ社製のＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｌシステム及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ充填材を用いて目的タンパク質をｐｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。溶出後、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて溶出により得られたタンパク質濃度を測定し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより溶出タンパク質純度を検出し、試験に用いたサンプルタンパク質純度は８０％以上であった。サンプルごとに総量５ｍｇのタンパク質を取り、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルー染色を行った後、電気泳動結果を観察した。

図６に示すように、実験結果により、ＨＺ５Ｇ１１とＨＺ１４Ａ９モノクローナル抗体の間でそれぞれ軽重鎖を交換することに基づいて、依然としてヘテロ接合ペアリング産物が生成され、しかも、ヘテロ接合ペアリング産物の分子量はＨＺ５Ｇ１１とＨＺ１４Ａ９モノクローナル抗体の間にあることを示した。ＨＺ５Ｇ１１ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１とＨＺ１４Ａ９ＶＬ－ＩｇＫ、及びＨＺ１４Ａ９ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１とＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－ＩｇＫの共発現精製後、多種の産物が生成された。その中、ＨＺ５Ｇ１１ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１とＨＺ１４Ａ９ＶＬ－ＩｇＫの組み合わせは、ヘテロ接合ペアリング産物の分子量が１３０～１８０ｋＤａの間にあり、ＨＺ５Ｇ１１とＨＺ１４Ａ９モノクローナル抗体に近い。しかし、ＨＺ１４Ａ９ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１とＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－ＩｇＫの組み合わせは、ヘテロ接合ペアリング産物の分子量が１００～１３０ｋＤａの間にあり、ＨＺ５Ｇ１１とＨＺ１４Ａ９モノクローナル体と区別しやすい。以上より、ＣＬドメインとＭＨＣＩＣαとの間にある相互作用が存在し、さらに軽重鎖ミスマッチ産物の産生を促進することを示した。ＨＺ１４Ａ９ＶＨ－ＣＨ１－ＩｇＧ１とＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－Ｃβ、及びＨＺ５Ｇ１１ＶＨ－ＣＨ１－ＩｇＧ１とＨＺ１４Ａ９ＶＬ－Ｃβの共発現精製後、対応する非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥのレーンに明らかなバンドを発見しなかった、すなわち、明らかなヘテロ接合ペアリング産物の生成がなく、ＣＨ１ドメインとＭＨＣＩＣβとの間に顕著な相互作用がないことを示した。

ＭＨＣＩＣαを含む重鎖とＣＬドメインを含む軽鎖のミスマッチの問題を解決するために、ＭＨＣＩＣα（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）／ＭＨＣＩＣβ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びＩｇＧ１定常領域ＣＨ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）／ＩｇＫ定常領域ＣＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）のドメインの接触界面について構造解析を行い、配列解析と組み合わせると、ＣＬドメインの１１４（ＥＵ番号）、１１６（ＥＵ番号）、１１８（ＥＵ番号）の部位が、後続の二重特異性抗体集合におけるＭＨＣＩＣβとＣＬドメインの交換プロセスに関与して、交換ミスマッチ産物を生成する可能性があると考える。ＩｇＫ定常領域のＣＬドメインのＳ１１４（ＥＵ番号）、Ｆ１１６（ＥＵ番号）、Ｆ１１８（ＥＵ番号）の単一点突然変異がＭＨＣＩＣαとＣＬドメインのペアリング過程に及ぼす影響を検証するために、軽鎖ＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－ＩｇＫのＣＬドメインのＳ１１４（ＥＵ番号）、Ｆ１１６（ＥＵ番号）又はＦ１１８（ＥＵ番号）の部位にそれぞれ非芳香族の疎水性アミノ酸（Ｍ：メチオニン、Ａ：アラニン、Ｖ：バリン、Ｉ：イソロイシン、又は、Ｌ：ロイシン）を導入し、重鎖ＨＺ１４Ａ９ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１と組み合わせて発現させた。構築された突然変異を含む抗体の一部の軽鎖配列情報を表１０に、異なる重鎖／軽鎖のペアリング発現の組み合わせの一部を表１１に示す。

二重特異性抗体の開発に関しては、分子量＞１００ｋＤａのミスマッチ産物は目的産物から効果的に分離できないか、分離が困難になり、二重特異性抗体産物の品質に影響を及ぼす可能性がある。結果により、ＨＺ５Ｇ１１ＶＬ－ＩｇＫ－Ｆ１１８ＡとＨＺ１４Ａ９ＶＨ－Ｃα－ＩｇＧ１のペアリング組み合わせは分子量＞１００ｋＤａのペアリング産物の生成を著しく減少させることができ（図７）、Ｆ１１８Ａの単一点突然変異はＭＨＣＩＣαとＣＬドメインとの間の作用力を低減させることができ、それによって、後続の二重特異性抗体集合におけるＭＨＣＩＣβとＣＬドメインの交換をさらに解決或いは緩和し、それによって、二重特異性抗体製品の品質を向上できることを明らかにした。

〔ＣＬドメインにおけるＦ１１８Ａ突然変異がモノクローナル抗体集合に及ぼす影響〕
ＩｇＫ定常領域のＣＬドメインにおけるＦ１１８Ａ（ＥＵ番号）の単一点突然変異がモノクローナル抗体集合に及ぼす影響を検証するために、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体（ＨＺ１４Ａ９及びＨＺ５Ｇ１１）の軽鎖ＩｇＫ定常領域にそれぞれＦ１１８Ａ単一点突然変異を行い、突然変異した軽鎖をそれぞれ本来のそれぞれの重鎖とペアリングして発現させ、ＨＺ１４Ａ９－Ｆ１１８Ａ及びＨＺ５Ｇ１１－Ｆ１１８Ａを得た。また、ＣＤ４７及びＰＤ－Ｌ１を標的とする野生型のモノクローナル抗体（ＨＺ１４Ａ９とＨＺ５Ｇ１１）をそれぞれ発現して対照とした。抗体の構築及び発現方法は、実施例４を参照する。
図１１に示すように、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ実験の結果は、すべての検出サンプルのバンドが１５０ｋＤａ付近にあることを示した。ＩｇＫ定常領域のＣＬドメインにおけるＦ１１８Ａ（ＥＵ番号）の単一点突然変異がモノクローナル抗体の集合に影響しないことが示された。

〔ａｎｔｉ－ＰＤＬ１＊ＣＤ４７二重特異性抗体の構築及び性能の特徴付け〕
（５．１ 構築及び表現）
ＩｇＫ定常領域のＣＬドメインにおけるＦ１１８Ａ（ＥＵ番号）の単一点突然変異が二重特異性抗体に及ぼす影響を検証するために、ＣＤ４７とＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性抗体を２種類構築し、ここで、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗原結合部分はＭＨＣ－Ｉエレメント修飾抗原結合部分であり、抗体ＨＺ５Ｇ１１のＣＨ１／ＣＬはＭＨＣＩＣα／ＭＨＣＩＣβに置換され、ＣＤ４７を標的とする抗原結合部分はＦａｂであり、抗体ＨＺ１４Ａ９に基づいて構築され、Ｆａｂ軽鎖の定常領域のＣＬドメインでは、Ｆ１１８（ＥＵ番号）部位に突然変異がなく、Ｆ１１８Ａ単一点突然変異が持たされなかった。すべての抗体の２本の重鎖のＣＨ２ドメインはＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａ）二重突然変異を採用し、潜在的なＦｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒ効果を除去し、ＣＨ３ドメインはＫＩＨ突然変異を持ってヘテロダイマーの形成を促進する。これにより、ＣＤ４７とＰＤ－Ｌ１を同時に標的とする２種類の二重特異性抗体、すなわち、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ（分子構造図８参照）とＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａ（分子構造図９参照）が生成された。

各ポリペプチド鎖を構成するＤＮＡ配列をそれぞれベクター（例えば、ＣＮ１０７００１４６３Ａに開示されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター、ＣＮ１０９４２２８１１Ａに開示されたｐＣＨＯ１．０ベクターなど）に挿入して、対応するポリペプチド鎖を発現する発現ベクターを得た。各種のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターをそれぞれ等質量比でＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（メーカー：上海医薬工業研究院、品番：１２７２００００５）に共トランスフェクションし、発現体積が０．１～１Ｌ、細胞密度が６Ｅ＋０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（メーカー：上海医薬工業研究院、品番：１２７２００００５）にトランスフェクションした。トランスフェクション後に細胞をＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭ培地（メーカー：Ｔｈｅｒｍｏ社、品番：Ａ２９１０００１）に入れて、３２℃、５％ＣＯ_２、１３０ｒｐｍの条件で発現して培養し、１０日目に細胞上清を採取し、ＧＥ社製のＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｌシステム及びＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ充填材を用いて目的タンパク質のｐｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーを行った。溶出後、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、溶出により得られたタンパク質濃度を測定し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより溶出タンパク質純度を検出した。

１段ｐｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによる精製の結果、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８ＡはＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔよりも高い発現量と純度を示し（表１２）、ＣＬドメインにおけるＦ１１８Ａ（ＥＵ番号）の単一点突然変異は、細胞内での二重特異性抗体の集合やペアリングの過程を改善し、ミスマッチ産物の形成を減少させ、二重特異性抗体の発現量と純度を向上させることができた。

（５．２ 熱安定性）
Ｎａｎｏ ＤＳＦ（Ｎａｎｏ Ｔｅｍｐｅｒ社）により、ＨＺ１４Ａ９、ＨＺ５Ｇ１１、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ及びＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａの熱安定性を特徴付けた。測定対象サンプルの濃度を１．０ｍｇ／ｍｌ程度に調整し、それから、石英毛細管で少量のサンプルをそれぞれ吸引し、Ｎａｎｏ ＤＳＦサンプルサスペンションに置き、一定速度１．０℃／ｍｉｎで２０．０℃～９５．０℃区間においてプログラム昇温を行い、タンパク質サンプルの光学信号変化を収集し、タンパク質の熱安定性を解析した。

Ｎａｎｏ ＤＳＦ実験の結果、ＨＺ１４Ａ９、ＨＺ５Ｇ１１、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ及びＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａは、いずれも良好な熱安定性を持ち、すべてのサンプルの融解温度Ｔｍ１は６５℃より高かった（表１３）。ＣＬドメインにおけるＦ１１８Ａ（ＥＵ番号）の単一点突然変異は、二重特異性抗体の熱安定性に有意な影響を及ぼさなかった。

（５．３ 親和性）
Ｂｉａｃｏｒｅにより、ＨＺ５Ｇ１１モノクローナル抗体、ＨＺ１４Ａ９モノクローナル抗体、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ及びＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａの二重特異性抗体の親和性を特徴付けた。捕獲法により、ＨＺ５Ｇ１１モノクローナル抗体、ＨＺ１４Ａ９モノクローナル抗体、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ及びＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａ二重特異性抗体をそれぞれセンサーチップに固定し、一定濃度勾配のヒトＰＤＬ１（メーカー：ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、品番：ＰＤ１－Ｈ５２Ｈ３）やヒトのＣＤ４７（メーカー：ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、品番：ＣＤ７－Ｈ５２２７）タンパク質抗原溶液を注入し、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０で結合解離曲線をリアルタイムで採集し、そしてＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０でデータ解析を行い、結合速度定数Ｋａ、解離速度定数Ｋｄ及び平衡定数ＫＤを得た。

実験の結果、二重特異性抗体ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ及びＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａは、いずれもヒトのＰＤＬ１とＣＤ４７タンパク質に対して良好な親和性を示した（表１５、表１６）。

（５．４ 赤血球凝集実験）
ヒト赤血球凝集実験により、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ及びＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａの潜在的な血液安全性を特徴付けた。赤血球を十分に洗浄して、赤血球膜の表面に付着した血漿を除去した。等張希釈液を用いて赤血球を３回洗浄し、最初の２回では２０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、最後の１回では２０００ｒｐｍ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた。ＰＢＳを用いて赤血球を２％細胞懸濁液とし、１００μＬを吸引し９６ウェルＵプレートに入れ、１５００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔ、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８Ａ及びアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１サンプルを８つの濃度勾配（０、０．１、０．２、０．７、２、６、１７、５０μｇ／ｍｌ）に調整し、９６ウェルＵプレートに抗体希釈液を加え、反応総体積を１００μＬとし、再懸濁させて均一に混合した後、３７℃インキュベータで２ｈ静置し、２ｈインキュベートした後、結果を観察した。図１０に示すように、二重特異性抗体濃度が≧２μｇ／ｍｌの条件下では、ＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－Ｆ１１８ＡはＭＨＬ１４７－３３２２－ＩｇＧ１－ｗｔよりも赤血球凝集能が弱いことから、ＩｇＫ定常領域のＣＬドメインにおけるＦ１１８Ａ（ＥＵ番号）変異はミスマッチ産物の生成を効果的に減少させ、二重特異性抗体の均一性を向上させることが示唆された。

Claims (17)

1. ２つの異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合する第１抗原結合部分及び第２抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、
   前記第１抗原結合部分は、
   Ｎ末端からＣ末端まで、第１重鎖可変ドメイン及び前記第１重鎖可変ドメインに作動可能に連結された第１ペアードドメインを含む第１ポリペプチドと、
   Ｎ末端からＣ末端まで、第１軽鎖可変ドメイン及び前記第１軽鎖可変ドメインに作動可能に連結された第２ペアードドメインを含む第２ポリペプチドと、を含み、
   ここで、前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインのうちの一方のペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、他方のペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体。
2. 前記第１ペアードドメイン及び第２ペアードドメインは二量体を形成でき、前記第１ペアードドメインと第２ペアードドメインとの間に少なくとも１つの非天然鎖間結合を形成でき、且つ前記非天然鎖間結合は前記二量体を安定化させることができる、請求項１に記載の二重特異性抗体。
3. 前記第１ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含み、又は、
   前記第１ペアードドメインは、工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列を含み、前記第２ペアードドメインは、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
4. 前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、前記工学的改変β２ミクログロブリンのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
5. 前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
6. 工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３及び工学的改変β２ミクログロブリン中の前記アミノ酸置換は、いずれも、両方の接触界面で発生し、互いにジスルフィド結合を形成し得るシステイン残基置換を含み、
   前記システイン残基置換は、次の群から選択される１対から複数対である、請求項５に記載の二重特異性抗体。
   （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＲ６０ＣとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＹ２６Ｃ
   （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＡ６２ＣとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＲ１２Ｃ
   （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるＧ６３ＣとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２におけるＹ６７Ｃ
7. 工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３又は／及び工学的改変β２ミクログロブリン中のアミノ酸置換は、ペアードドメインによって形成された二量体又は二重特異性抗体の等電点を向上させるアミノ酸置換を含み、
   ここで等電点を向上させるアミノ酸置換は、工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列のＥ３、Ｄ２２、Ｅ４８、Ｄ５３、Ｅ９０、Ｅ１０１のうちの１つ又は複数の位置で正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含むか、又は／及び
   等電点を向上させるアミノ酸置換は、工学的改変β２ミクログロブリンにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列のＥ７４、Ｅ４７、Ｅ６９、Ｄ３４、Ｅ１６、Ｄ５３、Ｅ４４、Ｅ５０、Ｅ３６のうちの１つ又は複数の位置で正に帯電したアミノ酸により置換されていることを含み、好ましくは、
   等電点を向上させるアミノ酸置換は、前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列でアミノ酸置換Ｄ２２Ｒ、Ｅ４８Ｋ及びＤ５３Ｋを含み、且つ前記工学的改変β２ミクログロブリンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２配列でアミノ酸置換Ｅ６９Ｒを含むことを含む、請求項５～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
8. 前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含み、又は、
   前記工学的改変ＨＬＡ－Ｉα３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、前記工学的改変β２ミクログロブリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
9. 前記第２抗原結合部分はＦａｂを含み、好ましくは、
   ＥＵ番号により、前記ＦａｂのＣＬドメインのＦ１１８位にあるアミノ酸がアラニンで置換されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
10. 前記二重特異性抗体が２価である、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
11. 第２抗原結合部分と同じ抗原エピトープに結合し、又は、
    第１抗原結合部分と同じ抗原エピトープに結合する
    第３抗原結合部分をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
12. 前記二重特異性抗体が３価である、請求項１０に記載の二重特異性抗体。
13. 安定に会合可能な２つのＦｃポリペプチドからなるＦｃドメインをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
14. 前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、又は、
    前記第１抗原結合部分の第１ポリペプチドは、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、Ｆａｂを含み、そのＦａｂ重鎖がそのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
15. 安定に会合可能な２つのＦｃポリペプチドからなるＦｃドメインをさらに含む、請求項１１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
16. 前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において第１抗原結合部分のＮ末端又は第２抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結され、又は、
    前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第１抗原結合部分は、そのＣ末端において前記第３抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結され、第２抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、又は、
    前記第３抗原結合部分は、そのＣ末端において一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結され、前記第２抗原結合部分は、そのＣ末端において前記第３抗原結合部分のＮ末端に作動的に連結され、第１抗原結合部分は、そのＣ末端において他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動的に連結される、請求項１５に記載の二重特異性抗体。
17. 必要とされる被験体において疾患を治療するための方法であって、
    治療有効量の請求項１～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を被験体に投与することを含み、
    好ましくは、前記疾患は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、気管支癌、骨癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、腎細胞癌、甲状腺癌、頭頸部癌、精巣癌、内分泌腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、軟部組織癌、血管癌、脳癌、神経癌、眼癌、髄膜癌、中咽頭癌、下咽頭癌、子宮頸部癌、子宮癌、神経膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群又は肉腫を含む、方法。