CN117083297A - 抗PD-L1单克隆抗体以及与白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-15受体15α或白细胞介素-2的融合蛋白 - Google Patents

抗PD-L1单克隆抗体以及与白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-15受体15α或白细胞介素-2的融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本公开提供了具有抗体重链可变结构域和轻链可变结构域的蛋白质，所述抗体重链可变结构域和轻链可变结构域可以被配对以形成与PD‑L1特异性地结合的抗原结合位点。在某些实施方案中，所述蛋白质或抗原结合位点形成抗体或双功能抗体，诸如，例如PD‑L1/IL‑2Rβ双功能抗体。还提供了包含此类蛋白质的药物组合物、用于使用此类蛋白质及其药物组合物的治疗方法，包括用于治疗癌症的治疗方法。

Description

抗PD-L1单克隆抗体以及与白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介 素-15受体15α或白细胞介素-2的融合蛋白
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并据此通过引用方式并入说明书中。含有序列表的文本文件的名称是300096_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为220KB，创建于2021年1月20日，并正通过EFS网以电子方式提交。
背景技术
PD-L1(程序性死亡配体1)，也称为CD274或B7同源物1(B7-H1)，是一种1型跨膜蛋白，该1型跨膜蛋白抑制TCR介导的IL-2产生活化以及当PD-L1与T细胞上的PD-1结合时的T细胞增殖。抗PD-L1抗体已被用作治疗癌症的治疗剂。然而，仍然需要生物治疗剂来更有效地调节肿瘤生长。
发明内容
本公开提供了具有抗体重链可变结构域和轻链可变结构域的蛋白质，该抗体重链可变结构域和轻链可变结构域可以被配对以形成与PD-L1特异性地结合的抗原结合位点。本公开的蛋白质或抗原结合位点可以形成抗体或双功能抗体，诸如，例如PD-L1/IL-2Rβ双功能抗体。本公开的蛋白质或抗原结合位点可以用于治疗或预防癌性或感染性病状和病症。
在一些实施方案中，本文公开了结合PD-L1的抗原结合位点，该抗原结合位点包含：重链可变结构域(VH)，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:3、11、19、33、52或63的互补决定区1(CDR1)序列；SEQ ID NO:4、12、20、34、41、53或64的互补决定区2(CDR2)序列；以及SEQID NO:5、13、21、27、35、46、54、65、71、74、77、80、83、86或89的互补决定区3(CDR3)序列；和轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:6、14、22、28、36、47、55或66的CDR1序列；SEQ ID NO:7、15、23、29、37、42、48、56、60或67的CDR2序列；以及SEQ ID NO:8、16、24、30、38、43、49、57或68的CDR3序列。
在一些实施方案中，抗原结合位点存在于单链片段可变片段(scFv)、抗原结合片段(Fab)、抗体或类似抗原结合蛋白中。
在一些实施方案中，本文公开了双功能蛋白，该双功能蛋白包含：
(a)结合PD-L1的抗原结合位点，该抗原结合位点包含：
(i)重链可变结构域(VH)，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:3、11、19、33、52或63的互补决定区1(CDR1)；SEQ ID NO:4、12、20、34、41、53或64的互补决定区2(CDR2)；和SEQID NO:55、13、21、27、35、46、54、65、71、74、77、80、83、86或89的互补决定区3(CDR3)；以及
(ii)轻链可变结构域(VL)，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:6、14、22、28、36、47、55或66的CDR1序列；SEQ ID NO:7、15、23、29、37、42、48、56、60或67的CDR2序列；和SEQID NO:8、16、24、30、38、43、49、57或68的CDR3序列；以及
(b)白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽、野生型白细胞介素-2(IL-2)多肽或工程化IL-2多肽或它们的功能片段或变体。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗原结合位点、蛋白质或抗体、双功能蛋白或抗体，或它们的药物组合物。在某些方面，该疾病是癌症。
本公开的这些方面和其他方面通过参考以下具体实施方式和附图将变得显而易见。本文公开的所有参考文献均通过引用方式以其整体特此并入，如同每一篇参考文献单独并入。
附图说明
图1示出了已鉴定的scFv与PD-L1的ELISA结合。
图2A和图2B示出了已鉴定的scFv与K562细胞结合的FACS分析，该K562细胞被工程化成表达高水平的细胞表面人PD-L1。
图3A和图3B示出了PD-1和PD-L1在HTRF中对已鉴定scFv的竞争结果。
图4示出了针对已鉴定scFv的Jurkat细胞NFAT报告基因测定的结果。
图5示出了亲和力成熟的scFv与PD-L1的ELISA结合。
图6示出了亲和力成熟的scFv与被工程化成表达高水平的细胞表面人PD-L1K562细胞的结合的FACS分析。
图7示出了PD-1和PD-L1在HTRF中对亲和力成熟的scFv的竞争结果。
图8示出了针对亲和力成熟的scFv的Jurkat细胞NFAT报告基因测定。
图9示出了抗体、双功能抗体和替代分子格式。双功能格式包括分别与PD-L1结合并包含IL-2细胞因子的那些或者与PD-L1结合并包含IL-15细胞因子的那些。
图10示出了抗PD-L1 IgG抗体与被工程化成表达高水平的细胞表面人PD-L1的K562细胞结合的FACS分析。
图11示出了针对抗PD-L1/IL-15融合抗体的Jurkat细胞NFAT报告基因测定。
图12A至图12D示出了抗PD-L1/IL-15融合抗体的p-STAT5活化结果。图12A示出了CD4+FoxP3-T细胞中的p-STAT5活化。图12B示出了NK细胞中的p-STAT5活化。图12C示出了CD8+T细胞中的p-STAT5活化。图12D示出了T调控性细胞中的p-STAT5活化。
图13A和图13B示出了IL-2-Fc克隆与IL-2受体的ELISA结合。图13A示出了IL-2-Fc克隆与IL-2Rα受体的ELISA结合。图13B示出了IL-2-Fc与IL-2Rβ受体的ELISA结合。
图14A至图14H示出了对来自两个单独供体的人PBMC的细胞进行的IL-2-Fc克隆的p-STAT5活化测定。图14A示出了来自供体126的CD4+T细胞中的p-STAT5活化。图14B示出了来自供体126的CD8+T细胞中的p-STAT5活化。图14C示出了来自供体126的NK细胞中的p-STAT5活化。图14D示出了来自供体126的T调控性细胞中的p-STAT5活化。图14E示出了来自供体359的CD4+T细胞中的p-STAT5活化。图14F示出了来自供体359的CD8+T细胞中的p-STAT5活化。图14G示出了来自供体359的NK细胞中的p-STAT5活化。图14H示出了来自供体359的T调控性细胞中的p-STAT5活化。
图15A至图15C示出了IL-2/抗PD-L1 scFv Fc变体与IL-2受体(IL-2Rα或IL-2Rβ)和PD-L1的ELISA结合。图15A示出了IL-2/抗PD-L1 scFv Fc变体与IL-2Rα的ELISA结合。图15B示出了IL-2/抗PD-L1 scFv Fc变体与IL-2Rβ的ELISA结合。图15C示出了IL-2/抗PD-L1scFv Fc变体与PD-L1的ELISA结合。
图16示出了针对IL-2/抗PD-L1 scFv Fc变体的PD-1和PD-L1相互作用阻断活性的Jurkat细胞NFAT报告基因测定。
图17A至图17H示出了IL-2/抗PD-L1 scFv Fc变体对来自两个单独供体的人PBMC的CD8+T细胞、NK细胞和T调控性细胞的p-STAT5活化。图17A示出了来自供体359的CD4+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图17B示出了来自供体359的CD8+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图17C示出了来自供体359的NK细胞的p-STAT5谱分析曲线。图17D示出了来自供体359的T调控性细胞的p-STAT5谱分析曲线。图17E示出了来自供体126的CD4+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图17F示出了来自供体126的CD8+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图17G示出了来自供体126的NK细胞的p-STAT5谱分析曲线。图17H示出了来自供体126的T调控性细胞的p-STAT5谱分析曲线。
图18至图18C示出了IL-2/抗PD-L1 Fab变体与IL-2受体(IL-2Rα或IL-2Rβ)和PD-L1的ELISA结合。图18A示出了IL-2/抗PD-L1 Fab变体与IL-2Rα的ELISA结合。图18B示出了IL-2/抗PD-L1 Fab变体与IL-2Rβ的ELISA结合。图18C示出了IL-2/抗PD-L1 Fab变体与PD-L1的ELISA结合。
图19示出了针对IL-2/抗PD-L1 Fab变体的PD-1和PD-L1相互作用阻断活性的Jurkat细胞NFAT报告基因测定。
图20示出了IL-2/抗PD-L1 Fab双功能变体与PD-L1和IL-2受体(IL-2Rα或IL-2Rβ)同时结合的传感图。
图21A至图21H示出了IL-2/抗PD-L1 Fab变体对来自两个单独供体的人PBMC的CD8+T细胞、NK细胞和T调控性细胞的p-STAT5活化。图21A示出了来自供体857的CD4+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图21B示出了来自供体857的CD8+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图21C示出了来自供体857的NK细胞的p-STAT5谱分析曲线。图21D示出了来自供体857的T调控性细胞的p-STAT5谱分析曲线。图21E示出了来自供体359的CD4+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图21F示出了来自供体359的CD8+细胞的p-STAT5谱分析曲线。图21G示出了来自供体359的NK细胞的p-STAT5谱分析曲线。图21H示出了来自供体359的T调控性细胞的p-STAT5谱分析曲线。
图22A至图22D示出了IL-2/抗PD-L1 Fab变体对小鼠脾细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和T调控性细胞的p-STAT5活化。图22A示出了CD4+T细胞的p-STAT5活化。图22B示出了CD8+T细胞的p-STAT5活化。图22C示出了NK细胞的p-STAT5活化。图22D示出了T调控性细胞的p-STAT5活化。
图23示出了用工程化抗PD-L1 mAb(EP205/EP206)Q3D或阿替利珠单抗治疗20天后由人源化小鼠MB-231模型中的抑制数据绘制的肿瘤生长抑制曲线。
图24A至图24B示出了用抗PD-L1 mAb(EP205/EP206)Q3D或阿替利珠单抗治疗20天后来自人源化小鼠MB-231模型的血浆中人TNFα(图24A)和IFNγ(图24B)的水平。
图25A至图25D示出了用IL-2/抗PD-L1 Fab变体治疗11天后荷有MC38肿瘤的小鼠的血液免疫细胞谱分析。图25A示出了CD4+FOXP3-T细胞(对照)的谱分析。图25B示出了CD8+T细胞的谱分析。图25C示出了NK细胞的谱分析。图25D示出了T调控性细胞的谱分析。
图26A至图26D示出了用IL-2/抗PD-L1 Fab变体治疗11天后荷有MC38肿瘤的小鼠的脾细胞免疫细胞谱分析。图26A示出了CD4+FOXP3-T细胞(对照)的谱分析。图26B示出了CD8+T细胞的谱分析。图26C示出了NK细胞的谱分析。图26D示出了T调控性细胞的谱分析。
图27示出了由用IL-2/抗PD-L1 Fab变体或阿替利珠单抗治疗20天的hPD1转基因小鼠中B16F10-PD-L1肿瘤的抑制数据获得的随时间推移的肿瘤体积抑制数据绘制的肿瘤生长抑制曲线。
图28示出了由用IL-2/抗PD-L1 Fab变体或阿替利珠单抗治疗20天的MB-231肿瘤NCG小鼠模型获得的随时间推移的肿瘤体积抑制数据绘制的肿瘤生长抑制曲线。
图29A至图29B示出了用抗PD-L1-Fab/IL2融合蛋白治疗人PBMC后T细胞中PD-1的表达水平。图29A示出了用EP290/EP325/EP205或EP415/EP325/EP205治疗5天后CD8+T细胞中PD-1的表达。图29B示出了用EP290/EP325/EP205或EP415/EP325/EP205治疗5天后T调控性细胞中PD-1的表达。
图30A至图30B示出了抗PD-L1-Fab/IL2融合蛋白与IL2Rβγ的结合。图30A示出了HEK Blue IL2细胞系中CD25、CD122和PD-L1的表达水平。图30B示出了在存在或不存在抗CD25抗体的情况下EP290/EP325/EP205、EP415/EP325/EP205与IL2R的结合。
图31A至图31B示出了荧光标记的EP415/EP325/EP205的体内肿瘤定位。图31A示出了注射荧光标记的EP415/EP325/EP205后24小时荷有C57BL/6N和B6N白化肿瘤的小鼠的代表性图像。图31B示出了EP415/EP325/EP205向MC-38-hPD-L1和MC-38肿瘤部位的时间依赖性富集。
图32A至图32E示出了随时间推移的人源化NCG小鼠的肿瘤体积并量化了肿瘤部位处存在的免疫细胞。图32A示出了EP415/EP325/EP205的针对人源化NCG小鼠中的抗PD1/PD-L1响应性癌细胞MDA-MB-231的肿瘤生长抑制曲线。图32B示出了肿瘤部位中CD4+T细胞的水平。图32C示出了肿瘤部位中CD8+T细胞的水平。图32D示出了肿瘤部位中NK细胞的水平。图32E示出了肿瘤部位中TReg细胞的水平。
图33A至图33B示出了在冷肿瘤的鼠模型中进行的实验的结果。图33A示出了EP415/EP325/EP205与媒介物对照和抗PD-L1EP205/EP206相比的针对人源化小鼠中的COLO205肿瘤的肿瘤生长抑制曲线。图33B示出了图33A中小鼠的相应体重变化。
图34A至图34F示出了在抗PD1抗体耐药肿瘤的鼠模型中进行的实验的结果。图34A示出了EP415/EP325/EP205的针对人源化小鼠中的H1975癌细胞肿瘤的肿瘤生长抑制曲线。图34B示出了图34B中小鼠的相应体重变化。图34C示出了每mm3肿瘤的hCD45表达细胞的数目。图34D示出了CD8+T细胞与Treg细胞的比率。图34E示出了每mm3肿瘤的CD8+T细胞的数目。图34F示出了NK细胞与T调控性细胞的比率。
图35A至图35C示出了在食蟹猴模型中进行的实验的结果。图35A示出了在猴血浆中通过ELISA检测到并对时间绘图的EP415/EP325/EP205浓度。图35B示出了给药0.1mg/kgEP415/EP325/EP205后猴血液中免疫细胞群的百分比。图35C示出了施用0.5mg/kg EP415/EP325/EP205后猴血液中免疫细胞群的百分比。
具体实施方式
抗PD-L1抗体已是一种有前途的免疫疗法，但仍然需要利用生物治疗剂来更有效地调节肿瘤。使用细胞因子(诸如IL-2和IL-15)的免疫疗法已被证明在癌症治疗中有效。因此，当进一步靶向IL-2和IL-15时，靶向PD-L1的抗体可能被证明是一种有用的免疫调节剂。本文提供了新的抗PD-L1抗体、scFv和Fab多肽。另外，本文提供了双功能融合蛋白，其包含(a)抗PD-L1抗体、scFv或Fab多肽，和(b)(i)IL-15、IL-15Rα或两者，或(ii)IL-2或其工程化变体。
本公开提供了结合人PD-L1的抗原结合位点。这些抗原结合位点可以结合PD-L1胞外结构域中的各种表位。含有此类抗原结合位点的蛋白质和蛋白质缀合物，诸如抗体、双功能抗体、抗体-药物缀合物、免疫细胞因子和双特异性T细胞衔接器以及表达含有此种抗原结合位点的蛋白质(例如，嵌合抗原受体(CAR))的免疫效应细胞(例如，T细胞)可用于治疗与PD-L1相关的疾病，诸如癌症。本公开还提供了包含此类蛋白质、蛋白质缀合物、免疫效应细胞的药物组合物，以及用于使用此类蛋白质、蛋白质缀合物、免疫效应细胞和药物组合物的治疗方法，包括但不限于癌症治疗。本公开中描述的抗原结合位点的各个方面描述在以下章节中；然而，本公开的特定章节中描述的抗原结合位点的方面不应被视为限制于任何特定章节。
定义
在更详细地阐述本公开之前，提供本文中使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。在本公开全文中阐述了另外的定义。
除非本文另有定义，科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
在本说明书中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所列举的范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括它们的分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。此外，除非另有说明，否则本文所列举的涉及任何物理特征(诸如聚合物亚单元、尺寸或厚度)的任何数字范围应理解为包括所列举范围内的任何整数。如本文所用，术语“约”意指所指示的范围、值或结构的±20％，除非另有说明。应当理解，如本文中所用的术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”是指列举的组分中的“一个/种或多个/种组分”。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个替代方案、两个替代方案或它们的任何组合。如本文中所用，术语“包括(include)”、“具有(have)”和“包括/包含(comprise)”用作同义词，该术语及其变化形式旨在解释为非限制性的。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的要素、组成部分、事件或情况可能会或可能不会发生，并且该描述包括当要素、组成部分、事件或情况发生时的实例和当要素、组成部分、事件或情况不发生时的实例。
此外，应当理解，本申请公开了衍生自本文所述的结构和亚单元的各种组合的各个构建体或构建体组，其引用程度如同每个构建体或构建体组被单独阐述。因此，特定结构或特定亚单元的选择在本公开的范围内。
术语“基本上由…组成(consisting essentially of)”并不等同于“包含/包括(comprising)”，并且是指权利要求的特定材料或步骤，或者指那些对所要求保护的主题的基本特征没有实质性影响的材料或步骤。例如，当结构域、区域、模块或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或它们的组合(例如，氨基末端或羧基末端或结构域之间的氨基酸)，该延伸、缺失、突变或它们的组合组合起来贡献了结构域、区域、模块或蛋白质长度的至多20％(例如，至多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)，并且不会实质上影响一个或多个结构域、一个或多个区域、一个或多个模块或蛋白质的活性(例如，结合蛋白质的靶结合亲和力))(即，不会使该活性降低超过50％，诸如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)时，蛋白质结构域、区域或模块(例如，结合结构域、铰链区或接头)或蛋白质(该蛋白质可能具有一个或多个结构域、区域或模块)“基本上由”特定的氨基酸序列组成。
如本文所用，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后期被修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即，与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α-碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指这样的化学化合物，该化学化合物具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。
如本文所用，“突变”是指分别如与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比核酸分子或多肽分子的序列的变化。突变可导致几种不同类型的序列变化，包括一种或多种核苷酸或一种或多种氨基酸的取代、插入或缺失。
“保守取代”是指不显著影响或改变特定蛋白质的结合特征的氨基酸取代。一般地，“保守取代”是这样的取代，其中所取代的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。保守取代包括在下列组之一中发现的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；第2组：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；第3组：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)；第4组：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；第5组：异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；以及第6组：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。另外地或替代地，氨基酸可以通过相似的功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂族、芳族或含硫)分为保守取代。例如，脂族分组对于取代的目的可以包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其他保守取代基基团包括：含硫：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性：Asp、Glu、Asn和Gln；小脂族、非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及大芳族残基：Phe、Tyr和Trp。另外的信息可在Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman andCompany中找到。
如本文所用，“蛋白质”或“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。“蛋白质”适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，和非天然存在的氨基酸聚合物。还涵盖了本公开的蛋白质、肽和多肽的变体。在某些实施方案中，变体蛋白质、肽和多肽包含与如本文所述的所定义氨基酸序列或参考氨基酸序列的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一的氨基酸序列或者由该氨基酸序列组成。
如本文所用，“核酸分子”或“多核苷酸”或“多核酸”是指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物，其可以由天然亚单元(例如，嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚单元(例如，吗啉环)组成。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，并且嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包括：包括mRNA、微RNA、siRNA、病毒基因组RNA和合成RNA的聚核糖核酸(RNA)以及包括cDNA、基因组DNA和合成DNA的聚脱氧核糖核酸(DNA)，其中的任一者都可以是单链的或双链的。如果是单链的，则核酸分子可以是编码链或非编码(反义)链。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的一些型式还可以包括一种或多种内含子到该一种或多种内含子将通过共转录或转录后机制被去除的程度。换句话说，由于遗传密码的冗余性或简并性或通过剪接，不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。
还涵盖了本公开的核酸分子的变体。变体核酸分子与如本文所述的所定义或参考多核苷酸的核酸分子至少70％、75％、80％、85％、90％同一，并且优选95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一，或在约65-68℃下在0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠的严格杂交条件或在约42℃下在0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺的严格杂交条件下与多核苷酸杂交。核酸分子变体保留了编码其具有本文所述的功能性(诸如结合靶分子)的结合结构域的能力。
如本文所用，“序列同一性百分比”是指如通过比较两个或更多个序列所确定的该两个或更多个序列之间的关系。用于确定序列同一性的优选方法被设计为给出正在比较的序列之间的最佳匹配。例如，为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位)。进一步地，出于比较目的，可以忽略非同源序列。除非另有说明，本文提及的序列同一性百分比是在参考序列的长度上计算的。确定序列同一性和相似性的方法可以在可公开获取的计算机程序中找到。序列比对和同一性百分比计算可以使用BLAST程序(例如BLAST 2.0、BLASTP、BLASTN或BLASTX)进行。BLAST程序中使用的数学算法可以在Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997中找到。在本公开的上下文中，应当理解，当使用序列分析软件进行分析时，分析结果基于所提及程序的“默认值”。“默认值”意指首次初始化时随软件一起最初加载的任何一组值或参数。
术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果该原始环境是天然存在的，则为自然环境)移出。例如，活体动物中存在的天然存在的核酸或多肽不是经分离的，但从天然系统中的一些或全部共存材料分离的相同核酸或多肽是经分离的。此种核酸可以是载体的一部分并且/或者此种核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞裂解物)的一部分，并且仍然是经分离的，因为此种载体或组合物不是该核酸或多肽的天然环境的一部分。
“功能变体”是指与本公开的母体或参考化合物在结构上相似或基本上在结构上相似但在组成上略有不同(例如，一个碱基、原子或官能团不同、被添加或被去除)的多肽或多核苷酸，使得该多肽或编码的多肽能够以至少50％效率，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的母体多肽活性水平执行母体多肽的至少一种功能。换言之，当本公开的多肽或编码的多肽的功能变体如与母体或参考多肽相比在选定的测定，诸如用于测量结合亲和性(例如，测量缔合常数(Ka)或解离常数(KD)的或四聚体染色)的测定中表现出不超过50％的性能降低时，该功能变体具有“相似的结合”、“相似的亲和力”或“相似的活性”。
如本文所用，“功能部分”或“功能片段”是指仅包含母体或参考化合物的结构域、部分或片段的多肽或多核苷酸，并且该多肽或编码的多肽保留了与母体或参考化合物的结构域、部分或片段相关的至少50％活性，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的母体多肽活性水平，或提供生物学益处(例如，效应物功能)。当本公开的多肽或编码的多肽的“功能部分”或“功能片段”如与母体或参考多肽相比在选择的测定中表现出不超过50％的性能降低(优选地，如就亲和力而言与母体或参考相比表现出不超过20％或10％，或不超过1个对数的差异)时，该功能部分或片段具有“相似的结合”或“相似的活性”。
如本文所用，术语“工程化”、“重组的”或“非天然的”是指包含至少一种遗传改变或已通过引入外源性或异源性核酸分子而被修饰的生物体、微生物体、细胞、核酸分子或载体，其中此类改变或修饰是通过基因工程化(即，人为干预)引入的。遗传改变包括例如引入编码功能性RNA、蛋白质、融合蛋白或酶的可表达核酸分子的修饰，或细胞遗传物质的其他核酸分子添加、缺失、取代或其他功能性破坏。另外的修饰包括例如非编码调控区，其中该修饰改变多核苷酸、基因或操纵子的表达。
如本文所用，“异源(的)”或“非内源(的)”或“外源(的)”是指对于宿主细胞或受试者而言非原生的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性，或者已被改变的对宿主细胞或受试者而言原生的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。异源的、非内源的或外源的包括这样的基因、蛋白质、化合物或核酸分子，该基因、蛋白质、化合物或核酸分子已经被突变或以其他方式被改变，从而使得结构、活性或两者在原生的基因、蛋白质、化合物或核酸分子和改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子之间不同。在某些实施方案中，异源的、非内源的或外源的基因、蛋白质或核酸分子(例如，受体、配体等)对于宿主细胞或受试者而言可能不是内源的，而编码此类基因、蛋白质或核酸分子的核酸可能已通过缀合、转化、转染、电穿孔等添加到宿主细胞中，其中所添加的核酸分子可整合到宿主细胞基因组中或可作为染色体外遗传物质(例如，作为质粒或其他自我复制载体)存在。术语“同源(的)”或“同源物”是指在宿主细胞、物种或菌株中发现或衍生自宿主细胞、物种或菌株的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与原生多核苷酸或基因同源并且编码同源多肽或活性，但该多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或它们的任何组合。非内源多核苷酸或基因以及所编码的多肽或活性可以来自相同物种、不同物种或它们的组合。
在某些实施方案中，如果对宿主细胞而言原生的核酸分子或其部分已经被改变或突变，则其将被认为对于宿主细胞而言是异源的，或者如果对宿主细胞而言原生的核酸分子已被改变成具有异源表达控制序列或者已被改变成具有通常与对宿主细胞而言原生的核酸分子不相关的内源表达控制序列，则该对宿主细胞而言原生的核酸分子可被认为是异源的。另外，术语“异源(的)”可以指对宿主细胞而言不同的、改变的或非内源的生物活性。如本文所述，可以将多于一种的异源性核酸分子作为单独的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单一核酸分子，或以这些方式的任意组合引入到宿主细胞中。
如本文所用，术语“内源的”或“原生的”是指通常存在于宿主细胞或受试者中的多核苷酸、基因、蛋白质、化合物、分子或活性。
如本文所用的术语“表达”是指基于核酸分子(诸如基因)的编码序列产生多肽的过程。该过程可包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或它们的任何组合。表达的核酸分子通常可操作地连接至表达控制序列(例如，启动子)。
术语“可操作地连接”是指单一核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，其使得一个核酸分子的功能受到另一个核酸分子的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制之下)时，则启动子与编码序列可操作地连接。“未连接”意指相关的遗传元件彼此之间不紧密缔合，并且其中一个遗传元件的功能不影响另一个遗传元件的功能。
如本文所述，可以将多于一种的异源性核酸分子作为单独的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单一核酸分子，或以这些方式的任意组合引入到宿主细胞中。当两个或更多个异源核酸分子被引入到宿主细胞中时，应当理解，该两个或更多个异源核酸分子可以作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)、在单独的载体上、以在单个位点或多个位点处整合到宿主染色体中的方式，或以这些的任何组合被引入。所提及的异源核酸分子或蛋白质活性的数目是指编码核酸分子的数目或蛋白质活性的数目，而不是被引入到宿主细胞中的分开的核酸分子的数目。
术语“构建体”是指含有重组核酸分子(或者，当上下文明确指出时，本公开的融合蛋白)的任何多核苷酸。(多核苷酸)构建体可以存在于载体(例如，细菌载体、病毒载体)中或者可以被整合到基因组中。“载体”是能够运输另一种核酸分子的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，该分子可以包括染色体、非染色体、半合成或合成核酸分子。本公开的载体还包括转座子系统(例如，Sleeping Beauty,参见，例如，Geurts等人，Mol.Ther.8:108,2003:Mátés，Nat.Genet.41:753,2009)。示例性载体是那些能够自主复制的载体(附加型载体)、能够将多核苷酸递送至细胞基因组的载体(例如，病毒载体)或者能够表达它们所连接至的核酸分子的载体(表达载体)。
如本文所用，“表达载体”是指含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子的DNA构建体，该控制序列能够影响合适的宿主中核酸分子的表达。此类控制序列包括实现转录的启动子、控制此种转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。该载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅为潜在的基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中，该载体可以独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在一些情况下，可以整合到基因组本身中或者将载体中包含的多核苷酸递送到不含载体序列的基因组中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”经常可互换使用。
术语“被引入”在将核酸分子插入到细胞中的上下文中意指“转染”、“转化”或“转导”，并且包括对将核酸分子掺入到真核或原核细胞中的提及，其中该核酸分子可以被掺入到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
在某些实施方案中，本公开的多核苷酸可以可操作地连接至载体的某些元件。例如，影响其所连结至的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列可以被可操作地连接。表达控制序列可以包括适当的转录启动、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA加工信号，诸如剪接和多聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定化的序列；提高翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及可能增强蛋白质分泌的序列。如果表达控制序列与感兴趣的基因以及以反式或远距离起作用从而控制感兴趣的基因的表达控制序列相邻，则该表达控制序列可以是可操作地连接的。
在某些实施方案中，载体包括质粒载体或病毒载体(例如，慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体)。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病病毒和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒(诸如小核糖核酸病毒和甲病毒)，以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型、Epstein-Barr病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘))。其他病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽白血病肉瘤、哺乳动物C型病毒、哺乳动物B型病毒、哺乳动物D型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and theirreplication,In Fundamental Virology,第三版，B.N.Fields等人编，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia,1996)。
“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒，该RNA基因组使用逆转录酶逆转录成DNA，然后经逆转录的DNA被掺入到宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。γ逆转录病毒的实例包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮增生病毒。
“慢病毒载体”包括用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，该载体可以是整合的或非整合的，具有相对大的包装能力，并且可以转导一系列不同的细胞类型。慢病毒载体通常是在将三种(包装、包膜和转移)或更多质粒瞬时转染到生产细胞中后产生的。与HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上受体的相互作用进入靶细胞。病毒RNA进入后会发生逆转录，该逆转录是由病毒逆转录酶复合体介导的。逆转录的产物是双链线性病毒DNA，该双链线性病毒DNA是病毒整合到受感染细胞的DNA中的底物。
在某些实施方案中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如，Moloney小鼠白血病病毒(MLV)衍生的载体。在其他实施方案中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒衍生的载体，例如，慢病毒衍生的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。其他实例包括衍生自HIV-2、FIV、马感染性贫血病毒、SIV和Maedi-Visna病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒病毒载体和包装细胞用含有转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的，并且先前已经描述于例如：美国专利8,119,772；Walchli等人,PLoSOne6:327930,2011；Zhao等人,J.Immunol.174:4415,2005；Engels等人,Hum.GeneTher.14:1155,2003；Frecha等人,Mol.Ther.18:1748,2010；以及Verhoeyen等人,MethodsMol.Biol.506:97,2009中。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也可商购获得。其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；衍生自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(Krisky等人,Gene Ther.5:1517,1998)。
可以与本公开的组合物和方法一起使用的其他载体包括衍生自杆状病毒和甲病毒的那些载体(Jolly,D J.1999.Emerging Viral Vectors.第209-40页，Friedmann T编，The Development of Human Gene Therapy.New York:Cold Spring Harbor Lab)，或质粒载体(诸如睡美人或其他转座子载体)。
当病毒载体基因组包含多个待在宿主细胞中作为分开的转录物表达的多核苷酸时，病毒载体还可以包含介于两个(或更多个)转录物之间的附加序列，从而允许双顺反子或多顺反子表达。用于病毒载体中的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2A肽或它们的任何组合。
如本文所用，术语“宿主”是指被靶向用于用异源核酸分子进行遗传修饰以产生感兴趣多肽(例如，本公开的抗体)的细胞或微生物体。
宿主细胞可以包括任何可以接受载体或核酸或表达蛋白质掺入的个体细胞或细胞培养物。该术语还涵盖宿主细胞的后代，无论在遗传或表型上相同或不同。合适的宿主细胞可取决于载体并且可包括哺乳动物细胞、动物细胞、人细胞、猿细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。这些细胞可通过使用病毒载体，经磷酸钙沉淀的转化、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射，或其他方法来诱导成掺有载体或其他材料。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,1989)。
如本文所用，“抗原”或“Ag”是指激发免疫响应的免疫原性分子。此免疫响应可涉及抗体产生、特异性的有免疫能力的细胞的活化、补体的活化、抗体依赖性细胞毒性或它们的任何组合。抗原(免疫原性分子)可以是例如肽、糖肽、多肽、糖多肽、多核苷酸、多糖、脂质等。显而易见的是，抗原可以合成的、重组产生的或衍生自生物样本。可含有一种或多种抗原的示例性生物样本包括组织样本、粪便样本、细胞、生物流体或它们的组合。抗原可以由被修饰或基因工程化成表达抗原的细胞产生。
术语“表位”或“抗原表位”包括被同源结合分子诸如免疫球蛋白或其他结合分子、结构域或蛋白质识别并特异性地结合的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白质决定簇。表位决定簇通常含有分子的化学活性表面基团(grouping)，诸如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定电荷特征。在抗原是肽或蛋白质或者包含肽或蛋白质的情况下，表位可以由连续的氨基酸(例如，线性表位)组成，或者可以由来自因蛋白质折叠而接近的蛋白质的不同部分或区域的氨基酸(例如，不连续或构象表位)或无论蛋白质折叠如何都非常接近的非连续氨基酸组成。
术语“抗原结合位点”或“抗原结合部分”在本文中可互换使用，并且是指参与与抗原和/或表位结合的抗体和/或免疫球蛋白分子的部分。在人抗体中，抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N末端可变区(“V”)的氨基酸残基形成。“高变区”是插入在“框架区”(“FR”)之间的重链和轻链的V区内的三个高度分歧的延伸段(stretch)，这些延伸段是相对保守的侧翼延伸段。术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白的高变区之间和与之邻近的氨基酸序列。在人抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与被结合抗原的三维表面互补。重链(“H”)和轻链(“L”)中每一者的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、存在于保留抗原结合表面的抗体的抗原结合片段中，或存在于重组多肽诸如scFv中，从而使用肽接头将单一多肽中的重链可变结构域连接至轻链可变结构域。抗原结合位点可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文所用的术语“抗体”涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体)、抗体融合蛋白、工程化蛋白中异二聚体的抗体，以及抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
术语“抗体片段”是指不同于完整抗体的多肽或蛋白，该多肽或蛋白包含完整抗体的结合完整抗体所结合至的抗原的部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
CDR和构架区的编号可以是根据任何已知的方法或方案，诸如Kabat、Chothia、EU、IMGT和AHo编号方案(参见，例如，Kabat等人，"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,USDept.Health and Human Services,Public Health Service NationalInstitutes of Health,1991,第5版；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003；Honegger和Plückthun，J.Mol.Bio.309:657-670(2001))。可以使用抗原受体编号和受体分类(ANARCI)软件工具(2016,Bioinformatics 15:298-300)对等效残基位置进行注释并对不同分子进行比较。抗原结合位点的CDR可以根据已知的方法，诸如如上所述的Kabat、Chothia、EU、IMGT和AHo确定。根据这些定义确定的CDR通常包括当相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。抗体的重链CDR和轻链CDR可以使用不同的编号惯例来定义。例如，在某些实施方案中，重链CDR是根据Chothia(同上)定义，并且轻链CDR是根据Kabat(同上)定义。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。
如本文所用，PD-L1(在人中也被称为“程序性死亡配体1”或CD274)是指UniProt登录号Q0GN75(人)的蛋白质以及相关亚型和直系同源物。
如本文所用的术语“取代”或“残基取代”是指用不同的残基替换原生或野生型残基。
“亲和力”是指分子(例如，配体、抗体、scFv)的单一结合位点与其结合伴侣(例如，受体、抗原、表位)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子-X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表示，该常数是解离和缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，只要速率常数的比率保持不变，等效亲和力可以包括不同的速率常数。亲和力可通过本领域技术人员已知的方法(包括本文中描述的那些方法)进行测量。
如本文中所用的“Fc结构域”或“Fc区”是指这样的多肽，该多肽来源于免疫球蛋白重链C端区域的多肽，其含有至少一部分恒定区。该术语包括具有原生序列Fc区的多肽或其变体。尽管IgG重链的Fc区的边界可能略有不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在，也可以不存在。美国专利第7,317,091号、美国专利第8,735,545号、美国专利第7,371,826号、美国专利第7,670,600号和美国专利第9,803,023号(所有专利通过引用以其整体并入)中公开了Fc区的实例。
“免疫球蛋白”是指具有抗体结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由至少一个二硫键接合的两条轻链和两条重链的异源四聚糖蛋白。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，接着是恒定轻链(CL)结构域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入五类中的一类，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚类，例如，γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以被指定为两种类型(称为卡巴(κ)和兰姆达(λ))之一。免疫球蛋白包括通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc结构域。
“Fab分子”或“抗原结合片段”是抗体的抗原结合片段，其包括轻链的可变结构域和恒定结构域，以及重链的可变结构域和CH1结构域。
“单链可变结构域”或“scFv”是指抗原结合部分，其包括重链和轻链的可变区，它们通过接头肽连接。
“双特异性抗体”、“双功能蛋白”和“双功能抗体”在本公开全文中可互换使用，并且是指具有两个不同抗原结合位点的人工抗体和/或包含至少一个抗原结合位点和至少一个功能结构域的抗体-融合蛋白。双特异性抗体可以指具有两个不同抗原结合位点的完全免疫球蛋白，或者可以指具有两个抗原结合部分的其它分子，诸如包含两个Fab或两个scFv的融合蛋白。在某些实施方案中，双功能蛋白和/或双功能抗体可以指包含一个或多个功能结构域的蛋白质、融合蛋白质和/或异二聚体蛋白对。功能结构域的实例包括抗原结合位点、抗体片段(例如Fab、scFv等)、抗体重链和轻链、细胞因子(例如，IL-2、IL-15)。双功能蛋白或双功能抗体可以指包含与非抗体多肽诸如细胞因子的融合体的抗体。例如，双功能蛋白可包括抗体重链和轻链，其中重链恒定区与IL-2、工程化IL-2、IL-15、工程化IL-15、IL-15受体或工程化IL-15受体，或它们的功能片段融合。另外，双功能蛋白可包含抗体重链和轻链，其中重链恒定区可与不包含抗原结合位点的多肽或蛋白质形成异二聚体。例如，双功能蛋白可包含重链、轻链和IL-2或工程化IL-2融合蛋白，该融合蛋白包含能够与抗体重链的Fc结构域形成异二聚体的抗体Fc结构域。
“调节免疫响应”可包括以下一种或多种：效应T细胞响应(例如，针对肿瘤细胞和病毒感染的细胞的细胞毒性)增加、B细胞活化增加、淋巴细胞活化和增殖的恢复、IL-2受体表达增加、T细胞响应增加、天然杀伤细胞活性或淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞活性增加、调控性T细胞对其它T细胞的响应减弱等。
“治疗(Treatment)”、“治疗(treating)”或“改善(ameliorating)”是指对受试者(例如，患者)的病状、疾病或病症的医学管理，该医学管理可以是治疗性的、导致一种或多种症状减轻、导致肿瘤大小和/或严重程度降低、抑制可测量的肿瘤生长或症状发作，或它们的任何组合。
“有效量”或“治疗有效量”可以指提供所需生理变化(诸如免疫调节和/或抗癌效果)的治疗剂的量。期望的生理变化例如可以是疾病症状的减轻，或者疾病严重性的减轻，或者可以是疾病进展的减缓。关于癌症，期望的生理变化可以包括，例如，肿瘤消退、肿瘤进展速度降低、癌症生物标志物水平降低、与癌症相关的症状减轻、转移的预防或延迟，或临床缓解。
如本文所用，术语“抑制”是指特定活性(例如，免疫压制或肿瘤生长)的降低。除非另外指定，如果如通过本文公开的或本领域已知的方法所测量活性被降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％，则可认为该活性受到抑制。
“癌抗原”是指优先被癌细胞表达的分子。癌抗原的实例包括CD19、CD20、ROR1、成纤维细胞活化蛋白-α和癌胚抗原(CEA)。
“肿瘤微环境抑制剂”是指抑制一种或多种促进肿瘤生长并存在于肿瘤周围局部环境中的条件或细胞类型的剂。例如，贝伐珠单抗可以通过减少肿瘤微环境中的血管生成来抑制肿瘤微环境。
本公开中使用的重组DNA、分子克隆和基因表达技术是本领域已知的，并描述于参考文献，诸如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版，ColdSpring Harbor Laboratory,New York,2001和Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley和Sons,Baltimore,MD,1999中。
在本公开全文中提供了另外的定义。
结合PD-L1的抗原结合位点
一方面，本申请提供了结合PD-L1(例如，人PD-L1)的抗原结合位点。表1中列出了可用于或用作诸如CDR、VH、VL和scFv序列的抗原结合位点的实例序列。氨基酸位置和CDR序列是根据IMGT编号方案来标识的。
表1：结合PD-L1的示例性抗原结合位点的序列
在某些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点包含：抗体重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:11、3、19、33、52或63的互补决定区1(CDR1)序列，SEQ ID NO:12、4、20、34、41、53或64的互补决定区2(CDR2)序列，和SEQ ID NO:89、5、13、21、27、35、46、54、65、71、74、77、80、83或86的互补决定区3(CDR3)序列；以及轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ IDNO:47、6、14、22、28、36、55或66的CDR1序列，SEQ ID NO:48、7、15、23、29、37、42、56、60或67的CDR2序列，和SEQ ID NO:49、8、16、24、30、38、43、57或68的CDR3序列。
在某些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点包含：抗体重链可变结构域(VH)，其包含与如表1中所公开的抗体的VH至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一的氨基酸序列；和抗体轻链可变结构域(VL)，其包含与如表1中所公开的相同抗体的VL至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含如表1中所公开的抗体的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，如在IMGT系统、EU系统、Kabat系统(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,NIHPublication No.91-3242,Bethesda)、Chothia系统(参见，例如，Chothia C&Lesk A M,(1987),J.Mol.Biol.196:901-917)、MacCallum(参见MacCallum R M等，(1996)J.Mol.Biol.262：732-745)或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的。在某些实施方案中，抗原结合位点包含如表1中所公开的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP164-F04。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:2至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:1和2的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:3、4和5的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP170-E06。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:10至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:9和10的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和13的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:14、15和16的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和13的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:14、15和16的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP161-G08。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:18至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:17和18的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP161-F08。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:26至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:25和26的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:19、20和27的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:28、29和30的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:19、20和27的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:28、29和30的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP161-F04。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:32至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:31和32的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:33、34和35的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:36、37和38的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP280-E04。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:40至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:39和40的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:3、41和5的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:6、42和43的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:3、41和5的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:6、42和43的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP171-H02。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:44的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:45至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:44和45的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和46的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和46的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP173-H11。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:51至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:50和51的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:55、56和57的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:55、56和57的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP172-F10。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:59至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:58和59的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和46的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、60和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和46的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、60和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2018EP280-E01。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:62至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:61和62的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:63、64和65的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:66、67和68的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:63、64和65的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:66、67和68的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2019EP69-E02。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:70至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:69和70的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和71的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和71的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2019EP69-E10。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:73至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:72和73的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和74的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和74的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2019EP69-C05。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:76至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:75和76的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和77的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和77的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2019EP69-F02。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:79至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:78和79的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和80的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和80的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2019EP69-B01。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:82至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:81和82的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和83的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和83的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2019EP69-H10。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:84的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:85至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:84和85的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和86的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和86的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点衍生自2019EP69-F03。例如，在某些实施方案中，本申请中描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:87的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:88至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含分别是SEQ ID NO:87和88的VH和VL序列的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3(根据IMGT、EU、Kabat、Chothia、MacCallum或本领域已知的任何其他CDR确定方法所确定的)。在某些实施方案中，该VH包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和89的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:11、12和89的氨基酸序列；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文描述的抗原结合位点包含VH，其包含与SEQ ID NO:87的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一的氨基酸序列；和VL，其包含与SEQ ID NO:88至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列，并且VH包含CDR3，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列变体，该变体与SEQ ID NO:89相比至少1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些实施方案中，VH CDR3包含SEQ ID NO:71、74、77、80、83或86，或者由SEQ ID NO:71、74、77、80、83或86组成。在某些实施方案中，VH进一步包含CDR1和CDR2，该CDR1和CDR2分别包含SEQ ID NO:11和12的氨基酸序列。在某些实施方案中，该VL包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合位点包含(a)VH，其包含具有SEQ ID NO:11的序列的CDR1、具有SEQ ID NO:12的序列的CDR2和包含SEQID NO:89的变体的CDR3，该变体与SEQ ID NO:89相比具有至少1、2、3、4或5个氨基酸取代；和(b)VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3，该CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48和49的氨基酸序列。
在前述实施方案的每一实施方案中，本文预期结合PD-L1的VH和/或VL序列可在VH和/或VL的框架区中含有氨基酸改变(例如，至少1、2、3、4、5或10个氨基酸取代、缺失或添加)，而不影响它们与PD-L1结合的能力。例如，本文预期结合PD-L1的VH和VL序列(例如，在scFv中)可以含有促进scFv的VH和VL之间二硫键的形成的半胱氨酸异二聚化突变。
在一些实施方案中，本文公开的抗原结合位点如通过表面等离子体共振(SPR)所测量，以小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.8nM、小于约0.6nM、小于约0.4nM、小于约0.2nM或小于约0.1nM的KD结合人PD-L1。
在一些实施方案中，本文公开的抗原结合位点如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量，以小于约160nM、小于约10nM、小于约1.5nM、小于约1.2nM、小于约1.0nM、小于约0.8nM、小于约0.7nM、小于约0.6nM、小于约0.5nM或小于约0.4nM的EC50结合人PD-L1。
在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点以小于或等于以下的的KD值(大于或等于以下的亲和力)结合人PD-L1或其胞外区：100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或0.5nM。在某些实施方案中，本申请的抗原结合位点以小于或等于5nM的KD值(大于或等于5nM的亲和力)结合人PD-L1或其胞外区。在某些实施方案中，本申请的抗原结合位点以小于或等于以下的KD值(大于或等于以下的亲和力)结合人PD-L1或其胞外区：约2.0nM、2.1nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.1nM、3.2nM、3.3nM、3.4nM、3.5nM、3.6nM、3.7nM、3.8nM、3.9nM、4.0nM、4.1nM、4.2nM、4.3nM、4.4nM、4.5nM、4.6nM、4.7nM、4.8nM、4.9nM或5.0nM。在某些实施方案中，本申请的抗原结合位点以约1.0-3.5nM、1.0-4.0nM、1.0-4.5nM、1.0-5.0nM、1.5-3.5nM、1.5-4.0nM、1.5-4.5nM、1.5-5.0nM、2.0-3.5nM、2.0-4.0nM、2.0-4.5nM、2.0-5.0nM、2.5-3.5nM、2.5-4.0nM、2.5-4.5nM、2.5-5.0nM、3.0-3.5nM、3.0-4.0nM、3.0-4.5nM或3.0-5.0nM范围内的KD值结合人PD-L1或其胞外区。这些KD值是如使用标准结合测定(例如SPR或ELISA)测量的。
在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点如通过荧光活化细胞分选(FACS)所测量，以小于约40nM、小于约10nM、小于约8nM、小于约6nM、小于约4nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.5nM、小于约0.3nM、小于约0.2nM、小于约0.1nM的EC50结合表达人PD-L1的细胞。
在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点以小于或等于以下的EC50值(大于或等于以下的亲和力)结合在细胞膜(例如，细胞的质膜)表面上存在的人PD-L1：50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或0.5nM。在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点以小于或等于1nM的EC50值(大于或等于1nM的亲和力)结合在细胞膜(例如，细胞的质膜)表面上存在的人PD-L1。这些EC50值可以在使用重组或内源表达PD-L1的细胞的结合测定，诸如下面的一个或多个实施例中公开的测定中测量。在某些实施方案中，抗体结合来自受试者的体液、组织和/或细胞的PD-L1。
在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点与PD-1竞争结合PD-L1或者抑制PD-L1与PD-1的结合。在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点作为单链片段可变片段(scFv)存在。在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点作为抗原结合片段(Fab)存在。
具有结合PD-L1的抗原结合位点的蛋白质
在某些实施方案中，本公开提供了包含本文公开的结合人PD-L1的抗原结合位点的蛋白质。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含一个或多个抗体重链恒定区。在某些实施方案中，抗体重链恒定区是人IgG重链恒定区。在某些实施方案中，抗体重链恒定区是人IgG1重链恒定区。在某些实施方案中，抗体重链恒定区包含与SEQ ID NO:90至少90％同一的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体重链恒定区包含相对于人IgG的一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A、P329G、Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A、F405K、K409A和Y407V的突变。在一些实施方案中，人IgG是IgG1。在一些实施方案中，人IgG包含SEQ ID NO:90的序列，或与SEQ ID NO:90具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，重链恒定区包含LALAPG突变。LALAPG突变是指人IgG重链恒定区(例如IgG1)的CH2-CH3区中的L234A、L235A和P329G改变(参见，例如，Schlothauer等人,Protein Engineering,Design&Selection.29(10):457-466,2016；Lo等人,J.Biol.Chem.292(9):3900-3908,2017，其特此通过引用方式并入)。在一些实施方案中，抗体重链恒定区包含杵突变或臼突变。杵-臼突变(Knob-into-hole mutation)是对IgG恒定结构域的修饰，其允许分别包含杵突变和臼突变的Fc结构域的异二聚化。杵突变或臼突变允许在体外优先形成具有低水平的同二聚体污染物的异二聚体。杵-臼突变公开于Merchant等人Nat.Biotechnol.16:677–681,1998；以及Wei等人,Oncotarget.8(31):51037-51049,2017中，其特此通过引用方式并入。杵突变的实例包括IgG重链恒定区中的S354C、T366W和K409A突变。臼突变的实例包括IgG重链恒定区中的Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V突变。在一些实施方案中，抗体重链恒定区包含LALAPG突变和臼突变或杵突变。例如，在一些实施方案中，抗体重链恒定区可包含L234A、L235A、P329G、S354C、T366W和K409A突变。在一些实施方案中，抗体重链恒定区可包含L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V突变。在某些实施方案中，抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:91或92的氨基酸序列。在某些实施方案中，蛋白质包含第一抗体重链恒定区，该第一抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的S354C、T366W和K409A的突变；和第二抗体重链恒定区，该第二抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V的突变。在某些实施方案中，蛋白质包含第一抗体重链恒定区，该第一抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A、P329G、S354C、T366W和K409A的突变；和第二抗体重链恒定区，该第二抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A、P329G、Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V的突变。
表2.IgG序列实例。
在一些实施方案中，包含结合PD-L1的抗原结合位点的蛋白质是抗体。在一些实施方案中，抗体包含：(a)包含与SEQ ID NO:148至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的重链(HC)和包含与SEQ IDNO:149至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的轻链(LC)；(b)包含与SEQ ID NO:150至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的HC和包含与SEQ ID NO:151至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的LC；(c)包含与SEQ ID NO:152至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的HC和包含与SEQ ID NO:153至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的LC；(d)包含与SEQ ID NO:154至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的HC和包含与SEQ ID NO:155至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的LC；(e)包含与SEQ ID NO:156至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的HC和包含与SEQ ID NO:157至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的LC；或(f)包含与SEQ ID NO:159至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的HC和包含与SEQ ID NO:160至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的LC。
在一些实施方案中，抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列或由SEQ IDNO:148的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列或由SEQ ID NO:149的氨基酸序列组成的LC；(b)包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列或由SEQ ID NO:150的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列或由SEQ ID NO:151的氨基酸序列组成的LC；(c)包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列或由SEQ ID NO:152的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列或由SEQ ID NO:153的氨基酸序列组成的LC；(d)包含SEQID NO:154的氨基酸序列或由SEQ ID NO:154的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列或由SEQ ID NO:155的氨基酸序列组成的LC；(e)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列或由SEQ ID NO:156的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列或由SEQ ID NO:157的氨基酸序列组成的LC；或(f)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列或由SEQID NO:159的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或由SEQ ID NO:160的氨基酸序列组成的LC。
具有PD-L1抗原结合位点的示例性蛋白的HC和LC序列列于下表3中。氨基酸位置是根据IMGT编号方案来标识的。
表3：可形成抗PD-L1抗体的HC和LC的序列
在一些实施方案中，本文公开的抗原结合位点可以存在于抗体或其抗原结合片段中。抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、双抗体、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段、Fv、双特异性抗体、双功能抗体、双特异性Fab2、双特异性(mab)2、人源化抗体、人工生成的人抗体、双特异性T细胞衔接器、双特异性NK细胞衔接器、单链抗体(例如，单链Fv片段或scFv)、三功能单抗(triomab)、具有共同轻链的杵-臼突变(KiH)IgG、crossmab、正-Fab IgG、DVD-Ig、2合1-IgG(2in 1-IgG)、IgG-scFv、sdFv2-Fc、双纳米抗体、双亲和力重靶向抗体(DART)、DART-Fc、scFv-HSA-scFv(其中HSA＝人血清白蛋白)或对接和锁定(dock-and-lock)(DNL)-Fab3。
在某些实施方案中，本文公开的抗原结合位点被连接到与抗体恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE的重链恒定区；特别地，选自例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如，人)重链恒定区的重链恒定区)至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本文公开的抗原结合位点可被连接到选自例如κ或λ的(例如人)轻链恒定区的轻链恒定区。该恒定区可被改变，例如突变或工程化，以修饰抗体的性质(例如，以增加或减少以下一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能和/或补体功能)。在一些实施方案中，抗体具有效应物功能并且可以固定补体。在一些实施方案中，抗体不募集效应细胞或固定补体。在一些实施方案中，抗体结合Fc受体的能力降低或没有结合Fc受体的能力。例如，它是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，它具有诱变的或缺失的Fc受体结合区。
在某些实施方案中，抗原结合位点被连接至IgG恒定区，该IgG恒定区包括铰链、CH2和CH3结构域，具有或不具有CH1结构域。在一些实施方案中，该恒定区的氨基酸序列与人抗体恒定区诸如人IgG1恒定区、人IgG2恒定区、人IgG3恒定区或人IgG4恒定区至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一。在一些实施方案中，足以结合CD16的抗体Fc结构域或其一部分包含与野生型人IgG1 Fc至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列，该野生型人IgG1 Fc包含以下序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:90)。
在一些实施方案中，一种或多种突变可被掺入到该恒定区中(如与人IgG1恒定区相比)，例如掺入在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。
在某些实施方案中，抗原结合位点被连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域的一部分。在Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1内，与CD16的相互作用主要集中在CH2结构域中的氨基酸残基Asp 265–Glu 269、Asn 297–Thr 299、Ala 327–Ile 332、Leu 234–Ser 239和碳水化合物残基N-乙酰基-D-葡糖胺上(参见，Sondermann等人，Nature,406(6793):267-273)。基于已知的结构域，突变可以诸如通过使用噬菌体展示的文库或酵母表面展示的cDNA文库被选择为增强或降低与CD16的结合亲和力，或者可以基于相互作用的已知三维结构来进行设计。
在某些实施方案中，可被掺入到人IgG1恒定区的CH1中的突变可位于氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方案中，可被掺入到人IgG1恒定区的Cκ中的突变可位于氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。
在一些实施方案中，抗体恒定结构域包含IgG抗体例如人IgG1抗体的CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，在抗体恒定结构域中引入突变以能够进行与另一个抗体恒定结构域的异二聚化。例如，如果抗体恒定结构域衍生自人IgG1的恒定结构域，则该抗体恒定结构域可包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一的氨基酸序列，并且在一个或多个选自由以下组成的组的位置处不同：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439。本文公开的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置都根据EU编号进行编号。
在一些其他实施方案中，恒定区的氨基酸序列与来自另一种哺乳动物诸如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)同一。
本文描述的蛋白质可以使用本领域已知的重组DNA技术来制备。例如，可以将编码第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码第一免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；可以将编码第二免疫球蛋白轻链的第四核酸序列克隆到第四表达载体中；可以将第一、第二、第三和第四表达载体一起稳定转染到宿主细胞中以产生多聚体蛋白质。
为了获得最高的蛋白质收率，可以探索第一、第二、第三和第四表达载体的不同比率，以确定用于转染到宿主细胞中的最佳比率。转染后，可以使用本领域已知的方法，诸如有限稀释、ELISA、FACS、显微镜检查分离单一克隆用于细胞库生成。
可以在适合于生物反应器放大的条件下培养克隆并且可维持该克隆的包含本文公开的抗原结合位点的蛋白质的表达。可以使用本领域已知的方法分离和纯化蛋白质，该已知方法包括离心、深层过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用交换色谱和混合模式色谱。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了一种或多种经分离的核酸，该经分离的核酸包含编码本文所公开抗体中任何一种抗体的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链可变区的序列。本公开提供了一种或多种表达载体，该表达载体表达本文所公开抗体中任何一种抗体的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链可变区。类似地，本申请提供了包含一种或多种前述表达载体和/或经分离的核酸的宿主细胞。
用于确定抗体是否与所公开抗体结合至相同的表位或者是否与所公开抗体竞争结合的竞争测定是本领域已知的。示例性竞争测定包括免疫测定(例如，ELISA测定、RIA测定)、表面等离子体共振(例如，BIAcore分析)、生物层干涉测定法和流式细胞术。
通常，竞争测定涉及使用结合至固体表面或在细胞表面上表达的抗原(例如，人PD-L1蛋白或其片段)、测试PD-L1结合抗体和参考抗体。参考抗体被标记，并且测试抗体未被标记。竞争性抑制是通过确定在测试抗体存在的情况下与固体表面或细胞结合的经标记参考抗体的量来测量。通常测试抗体以过量存在(例如1x、5x、10x、20x或100x)。通过竞争测定(例如，竞争抗体)鉴定的抗体包括与参考抗体结合至相同表位或相似(例如，重叠)表位的抗体，以及结合至与参考抗体所结合表位足够接近的相邻表位以便产生空间位阻的抗体。
竞争测定可以在这两个方向上进行，以确保标记的存在不会干扰或以其他方式抑制结合。例如，在第一方向上，参考抗体被标记并且测试抗体未被标记，而在第二方向上，测试抗体被标记并且参考抗体未被标记。
如果一种抗体的过量(例如，1x、5x、10x、20x或100x)如在竞争性结合测定中所测量抑制另一种抗体的结合例如达至少50％、75％、90％、95％或99％，则测试抗体与参考抗体竞争与抗原的特异性结合。
如果减少或消除一种抗体的结合的抗原中基本上所有的氨基酸突变都减少或消除另一种抗体的结合，则可以确定该两种抗体与相同的表位结合。如果仅减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗体的结合，则可以确定该两种抗体与重叠的表位结合。
本文公开的抗体可以被进一步优化(例如，亲和力成熟)以改善生化特征(包括亲和力和/或特异性)、改善生物物理性质(包括聚集、稳定性、沉淀和/或非特异性相互作用)和/或降低免疫原性。例如，可以通过DNA改组、链改组、CDR改组、随机诱变和/或位点特异性诱变将多样性引入到免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链中。
在某些实施方案中，经分离的人抗体含有一种或多种体细胞突变。在这些情况下，可以将抗体修饰为人种系序列以优化抗体(例如，通过称为种系化的过程)。
一般而言，经优化的抗体具有与该经优化抗体所衍生自的非优化(母体)抗体至少相同或基本上相同的抗原亲和力。例如，在某些实施方案中，经优化的抗体与母体抗体相比时具有更高的抗原亲和力。
如果抗体用作治疗剂，则可以使用标准体外缀合化学将该抗体缀合至效应剂，诸如小分子毒素或放射性核素。如果效应剂是多肽，则该抗体可以化学缀合至效应物或作为融合蛋白接合至效应物。融合蛋白的构建属于本领域普通技术人员的范围。
可以使用标准体外缀合化学将抗体缀合至效应物部分，诸如小分子毒素或放射性核素。如果效应物部分是多肽，则可以将抗体化学缀合至效应物或作为融合蛋白接合至效应物。融合蛋白的构建属于本领域普通技术人员的范围。
在一些实施方案中，蛋白质是抑制体内肿瘤生长的抗体。
在某些实施方案中，蛋白质是以如与阿替利珠单抗相比相当或更增强的水平在体内诱导IFNγ和TNFα分泌的抗体。
双功能蛋白
在某些实施方案中，本文公开了双功能蛋白，例如，双功能抗体。该双功能蛋白可包含结合PD-L1的抗原结合位点、IgG Fc结构域和/或功能结构域。在一些实施方案中，该双功能蛋白是单一蛋白序列。在其他实施方案中，该双功能蛋白是由至少两个蛋白序列形成的异二聚体。结合PD-L1的抗原结合位点可以是本文公开的抗PD-L1抗原结合位点、抗体和/或scFv序列中的任一者。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点可以包含由抗体重链和轻链形成的Fab。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点可包含scFv。IgG Fc结构域可包含野生型抗体恒定区或经修饰的抗体恒定区。本文提供了经修饰的抗体恒定区的实例，并且该实例包括例如杵突变或臼突变以及LALAPG突变。该功能结构域可包含细胞因子、细胞因子受体或它们的功能片段。功能结构域的实例包括IL-2多肽(诸如表4中公开的IL-2和工程化IL-2多肽)、IL-15和IL-15Rα。双功能蛋白的实例如图9和表7所示，并且包括IL-2-Fc/抗PD-L1-scFv-Fc异二聚体；缺少Fc结构域的IL-2-抗PD-L1-scFv融合蛋白；IL-2-Fc/抗PD-L1-Fab-Fc异二聚体；抗PD-L1-Fab-Fc-IL-2-融合/抗PD-L1-Fab-Fc异二聚体；抗PD-L1-Fab-Fc-IL-2-融合/抗PD-L1-Fab-Fc-IL-2-融合二聚体或异二聚体；抗PD-L1-scFv-Fc-IL-2-融合/抗PD-L1-scFv-Fc-IL-2-融合二聚体或异二聚体；抗PD-L1-scFv-Fc-IL-2-融合/抗PD-L1-scFv-Fc异二聚体；抗PD-L1-scFv-Fc-IL-2-融合/抗PD-L1-Fab-Fc-IL-2-融合异二聚体；抗PD-L1-scFv-Fc/抗PD-L1-Fab-Fc-IL-2-融合异二聚体；抗PD-L1-scFv-Fc-IL-2-融合/抗PD-L1-Fab-Fc异二聚体；抗PD-L1-Fab-Fc-IL-15-融合/抗PD-L1-Fab-Fc-IL-15Rα-融合异二聚体；抗PD-L1-scFv-Fc-IL-15-融合/抗PD-L1-scFv-Fc-IL-15Rα-融合异二聚体；抗-PD-L1-Fab-Fc-IL-15-融合/抗-PD-L1-scFv-Fc-IL-15Rα-融合异二聚体；和抗PD-L1-scFv-Fc-IL-15-融合/抗PD-L1-Fab-Fc-IL-15Rα-融合异二聚体。
在某些实施方案中，该双功能蛋白包含结合PD-L1的抗原结合位点，该抗原结合位点包含：(i)包含CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域(VH)，该CDR1包含SEQ ID NO:11、3、19、33、52或63的序列，该CDR2包含SEQ ID NO:12、4、20、34、41、53或64的序列，并且该CDR3包含SEQ ID NO:89、5、13、21、27、35、46、54、65、71、74、77、80、83或86的序列；和(ii)包含CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)，该CDR1包含SEQ ID NO:47、6、14、22、28、36、55或66的序列，该CDR2包含SEQ ID NO:48、7、15、23、29、37、42、56、60或67的序列，并且该CDR3包含SEQ ID NO:49、8、16、24、30、38、43、57或68的序列。在某些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点包含(a)-(q)中的至少一者，其中：(a)VH包含与SEQ ID NO:1至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(b)VH包含与SEQ ID NO:9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(c)VH包含与SEQID NO:17至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:18至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(d)VH包含与SEQ ID NO:25至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:26至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(e)VH包含与SEQ ID NO:31至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ IDNO:32至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(f)VH包含与SEQ ID NO:39至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:40至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(g)VH包含与SEQ ID NO:44至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:45至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(h)VH包含与SEQ ID NO:50至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:51至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(i)VH包含与SEQ ID NO:58至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:59至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(j)VH包含与SEQ ID NO:61至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:62至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(k)VH包含与SEQ ID NO:69至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:70至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(l)VH包含与SEQ ID NO:72至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:73至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(m)VH包含与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(n)VH包含与SEQ ID NO:78至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:79至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(o)VH包含与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:82至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；(p)VH包含与SEQ ID NO:84至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:85至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成；和/或(q)VH包含与SEQ ID NO:87至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，并且VL包含与SEQ ID NO:88至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，该双功能蛋白包含抗体重链恒定区，该抗体重链恒定区是人IgG重链恒定区。在一些实施方案中，该抗体重链恒定区是人IgG1重链恒定区。在一些实施方案中，该抗体重链恒定区包含与SEQ ID NO:90至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A、P329G、Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A、F405K、K409A和Y407V的突变。在一些实施方案中，该抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自S354C、T366W和K409A的突变。在一些实施方案中，该抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V的突变。在一些实施方案中，该双功能蛋白是异二聚体，并且包含第一和第二抗体重链恒定区，其中该第一抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的根据EU编号系统编号的突变S354C、T366W和K409A；并且第二重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的根据EU编号系统编号的突变Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V。在一些实施方案中，该抗体重链恒定区包含L234A、L235A和P329G突变。在一些实施方案中，第一和第二抗体重链恒定区之一包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，并且第二抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该双功能蛋白包含功能结构域，其中该功能结构域是IL-15或IL-15Rα，或它们的功能片段。IL-15是含有四个α螺旋束的细胞因子的成员。IL-15通常在与T细胞和NK细胞上的功能性IL-15受体β和γ单位结合之前与APC上表达的IL-15受体α形成复合物。IL-15可以通过表达与受体α链的膜形式结合的细胞因子本身的细胞以反式呈递至表达IL-2Rβ(IL15RB或CD122)和IL-2Rγ(CD132)的响应细胞。不希望受理论限制，IL-15受体αsushi结构域被认为是在与受体β和γ适当接合之前与IL-15形成复合物所必需的。IL-15和IL-15Rα复合物以及IL-15/IL-15Rαsushi结构域融合蛋白据报道对刺激CD8 T细胞和NK细胞具有很强的效力。
在某些实施方案中，本文公开的双功能蛋白包含：(a)第一亚单位，其包含结合PD-L1的抗原结合位点、第一抗体重链恒定区和IL-15多肽或其功能片段或变体；和(b)第二亚单位，其包含结合PD-L1的抗原结合位点、第二抗体重链恒定区和IL-15Rα多肽或其功能片段或变体。在一些实施方案中，IL-15多肽包含SEQ ID NO:93或其功能片段或变体。在一些实施方案中，IL-15多肽包含SEQ ID NO:93的氨基酸50-162或其功能片段或变体。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:94或其功能片段或变体。在一些实施方案中，IL-15Rα多肽包含SEQ ID NO:94的氨基酸31-97或其功能片段或变体。
在一些实施方案中，本文公开的双功能蛋白是包含抗PD-L1-Fab-Fc-IL-15-融合蛋白和抗PD-L1-Fab-Fc-IL-15Rα-融合蛋白的异二聚体。例如，在一些实施方案中，该双功能蛋白包含：第一亚单位，其包含与SEQ ID NO:186(EP203)至少90％同一的氨基酸序列；第二亚单位，其包含与SEQ ID NO:187(EP204)至少90％同一的氨基酸序列；以及第三亚单位，其包含与SEQ ID NO:181(EP205)至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一亚单位包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列或由SEQ ID NO:186的氨基酸序列组成，第二亚单位包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或由SEQ ID NO:187的氨基酸序列组成；并且第三亚单位包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列或由SEQ ID NO:181的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文公开的双功能蛋白是包含抗PD-L1-scFv-Fc-IL-15-融合蛋白和抗PD-L1-scFv-Fc-IL-15Rα-融合蛋白的异二聚体。例如，在一些实施方案中，该双功能蛋白包含：第一亚单位，其包含与SEQ ID NO:188(EP207)至少90％同一的氨基酸序列；和第二亚单位，其包含与SEQ ID NO:189(EP208)至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含：第一亚单位，其包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或由SEQ IDNO:188的氨基酸序列组成；和第二亚单位，其包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列或由SEQ IDNO:189的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，本文公开的双功能蛋白包含功能结构域，其中该功能结构域是IL-2(例如野生型IL-2或工程化IL-2)或它们的功能片段或变体。除非另有说明，否则本文使用的术语“白细胞介素-2”或“IL-2”是指来自包括哺乳动物在内的任何脊椎动物来源(诸如人或小鼠)的IL-2。该术语涵盖前体或未加工的IL-2，以及由细胞加工产生的任何形式的IL-2。该术语还涵盖IL-2的天然存在的变体，诸如剪接变体或等位基因变体。示例性成熟人IL-2的氨基酸序列示于SEQ ID NO:191中。“野生型”或“原生的”在提及IL-2时被使用时意指成熟的IL-2分子(例如，SEQ ID NO:191)。如本文中所用的术语“工程化IL-2”或“工程化IL-2多肽”涵盖具有至少一个与原生或野生型IL-2不同的残基的IL-2，并包括全长IL-2、IL-2的截短形式以及其中IL-2与另一分子(诸如另一多肽)连接或融合的形式。工程化IL-2的各种形式的特征在于具有至少一个影响IL-2与IL-2Rβ和/或IL-2Rα相互作用的氨基酸取代。如本文所述的IL-2的各种工程化形式的鉴定是针对例如SEQ ID NO:192中所示的序列进行的。在一些实施方案中，IL-2被修饰成包括T3A取代。该T3A取代可以是针对野生型序列制作的。另外，该T3A取代可以是针对本文公开的工程化IL-2序列制作的。野生型和工程化IL-2多肽的实例描述于PCT/US2020/046244中，其通过引用方式以其整体并入本文。
IL-2调节淋巴细胞增殖和活化。IL-2通过与IL-2受体(IL-2R)结合介导它的作用，该受体包括至多三个单独的亚单位。所有三个亚单位(白细胞介素-2受体α链(IL-2Rα，或CD25)、白细胞介素-2受体β链(IL-2Rβ，或CD122)和白细胞介素-2受体γ链(IL-2Rγ，或CD132))的缔合产生了三聚体IL-2Rαβγ，其为IL-2的高亲和力受体。IL-2Rβ与IL-2Rγ亚单位的缔合产生二聚体受体IL-2Rβγ，并被称为中间亲和力IL-2R。IL-2Rα亚单位形成单体低亲和力IL-2受体。IL-2Rα的表达参与免疫压制调控性T细胞(Treg)的扩增；而二聚体IL-2Rβγ在IL-2Rα不存在的情况下可导致细胞裂解性CD8+T细胞和NK细胞增殖和杀伤。
在一些实施方案中，该双功能蛋白包含结合PD-L1的抗原结合位点并包含野生型IL-2(例如SEQ ID NO:191)。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含结合PD-L1的抗原结合位点并包含工程化IL-2(例如SEQ ID NO:192)。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含结合PD-L1的抗原结合位点并包含工程化IL-2，其中该工程化IL-2多肽包含：
(a)IL-2受体α(IL-2Rα)结合区1，其包含相对于野生型IL-2的选自以下的一个或多个位于一个或多个位置处的突变：
位于位置K35处的选自K35G、K35L、K35S、K35V、K35D、K35E和K35C的突变；
位于位置R38处的选自R38V、R38D、R38E、R38S、R38I、R38A、R38Y、R38G、R38C或R38N的突变；
位于位置F42处的选自F42A、F42R、F42G、F42I、F42L、F42P和F42H的突变；以及
位于位置Y45处的选自Y45S、Y45P、Y45A、Y45V、Y45C、Y45T和Y45F的突变，和/或
(b)IL-2受体β(IL-2Rβ)结合区2基序，其包含：
X1-X2-X3-D-X4-X-5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID NO:95)，
其中：
X1选自C、T、G、W、I、S、E和K；
X2选自Y、P、V、W、L、A和G；
X3选自S、T、Q、G、M、E、R和K；
X4选自A、V、S和T；
X5选自I、L、T和V；
X6选自S、T、E、D和R；
X7选自I、A、M和V；
X8选自S、T、N、Q、I、G、E、K和R；
X9选自V、L和I；
X10选自N、T、I和L；
X11选自V、A和I；
X12选自Q、L、G、K和R；和
X13选自A、D和E。
在一些实施方案中，该双功能蛋白包含结合PD-L1的抗原结合位点并包含工程化IL-2，其中该工程化IL-2多肽包含：(a)IL-2Rα结合区1，其包含与选自SEQ ID NO:124-147的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；和/或(b)IL-2Rβ结合区2基序，其包含与选自SEQ ID NO:96-123的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含结合PD-L1的抗原结合位点并包含工程化IL-2，其中：(a)IL-2Rα结合区1包含选自SEQ ID NO:124-147的氨基酸序列；并且/或者(b)IL-2Rβ结合区2基序包含选自SEQ IDNO:96-123的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点是scFv或Fab。
在某些实施方案中，该双功能蛋白是融合蛋白，该融合蛋白包含：(a)第一亚单位，其包含结合PD-L1的抗原结合位点；(b)第二亚单位，其包含野生型或工程化IL-2多肽或其功能片段或变体。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点是scFv或Fab。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含与选自SEQ ID NO:160-164的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含选自SEQ ID NO:160-164(分别为EP199、EP200、EP201和EP461)的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该双功能蛋白包含异二聚体，该异二聚体包含：(a)第一亚单位，其包含结合PD-L1的抗原结合位点和第一抗体重链恒定区；和(b)第二亚单位，其包含野生型或工程化IL-2多肽或其功能片段或变体和第二抗体重链恒定区。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点是scFv或Fab。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含异二聚体，其中第一亚单位是抗PD-L1-scFv-Fc融合蛋白并且第二亚单位是IL-2-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，第一亚单位包含与SEQ ID NO:176(EP326)至少90％同一的氨基酸序列，并且第二亚单位包含与选自SEQ ID NO:165-175(分别为EP290、EP291、EP297、EP412、EP413、EP414、EP415、EP416、EP417、EP418、EP419)的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一亚单位包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列或由SEQ ID NO:176的氨基酸序列组成；并且第二亚单位包含选自SEQ ID NO:165-175的氨基酸序列或由选自SEQ IDNO:165-175的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含蛋白质的异二聚体，该蛋白质的异二聚体包含：(a)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:165；(b)SEQ ID NO:176和SEQID NO:166；(c)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:167；(d)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:168；(e)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:169；(f)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:170；(g)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:171；(h)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:172；(i)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:173；(j)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:174；或(k)SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:175。
在一些实施方案中，该双功能蛋白包含异二聚体，其中第一亚单位是抗PD-L1-Fab-Fc融合蛋白并且第二亚单位是IL-2-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，第一亚单位包含与选自SEQ ID NO:177-180(分别为EP325、EP462、EP463、EP464)的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，并且第一亚单位进一步包含与SEQ ID NO:181(EP205)至少90％同一的氨基酸序列，并且第二亚单位包含与选自SEQ ID NO:165-175(分别为EP290、EP291、EP297、EP412、EP413、EP414、EP415、EP416、EP417、EP418、EP419)的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一亚单位包含选自SEQ ID NO:177-180的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:177-180的氨基酸序列组成；并且LC结构域包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列或由SEQ ID NO:181的氨基酸序列组成，并且第二亚单位包含选自SEQ ID NO:165-175的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:165-175的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含蛋白质的异二聚体，该蛋白质的异二聚体包含：(a)第一亚单位，其包含SEQ IDNO:177和SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:181；SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:181；或SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181；和(b)第二亚单位，其包含选自SEQ ID NO:165-175的氨基酸序列。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含蛋白质的异二聚体，该蛋白质的异二聚体包含：具有选自以下的氨基酸序列的多肽：(a)SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(b)SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(c)SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(d)SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(e)SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(f)SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(g)SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(h)SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(i)SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(j)SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(k)SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181；(l)SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:181；(m)SEQ IDNO:171、SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:181；和(n)SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:180和SEQ IDNO:181。
在某些实施方案中，该双功能蛋白包含：(a)第一亚单位，其包含结合PD-L1的抗原结合位点和第一抗体重链恒定区；和(b)第二亚单位，其包含结合PD-L1的抗原结合位点、工程化白细胞介素2(IL-2)多肽或其功能片段或变体和第二抗体重链恒定区。在一些实施方案中，结合PD-L1的抗原结合位点是scFv或Fab。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含异二聚体，其中第一亚单位是抗PD-L1-Fab-Fc并且第二亚单位是抗PD-L1-Fab-Fc-IL-2-融合蛋白。在一些实施方案中，第一亚单位包含与SEQ ID NO:182(EP362)至少90％同一的氨基酸序列，并且第二亚单位包含与选自SEQ ID NO:183-185(EP363、EP364、EP365)的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；任选地其中该第一亚单位和该第二亚单位各自独立地进一步包含与SEQ ID NO:181(EP205)至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一亚单位包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列或由SEQ ID NO:182的氨基酸序列组成，并且第二亚单位包含选自SEQ ID NO:183-185的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:183-185的氨基酸序列组成；任选地其中该第一亚单位和第二亚单位各自独立地进一步包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。在一些实施方案中，该双功能蛋白包含蛋白质的异二聚体，该蛋白质的异二聚体包含：具有选自以下的氨基酸序列的多肽：(a)SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:183；和SEQ IDNO:181；(b)SEQ ID NO:182；SEQ ID NO:184；和SEQ ID NO:181；和(c)SEQ ID NO:182；SEQID NO:185；和SEQ ID NO:181。
在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约1nM的KD或以如与所包含的结合PD-L1的抗原结合位点相比相当或更低的KD结合人PD-L1。在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约65nM或小于约50nM的KD结合IL-2Rβ。
在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约40nM的KD结合IL-2Rα。在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约100nM、小于约80nM、小于约50nM、小于约10nM或小于约5nM的KD结合IL-2Rβ。在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约0.5nM或小于约0.1nM的KD结合PD-L1。在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过ELISA所测量，以小于约1nM的EC50结合IL-2Rα。在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过ELISA所测量，以小于约5nM、小于约2.5nM、小于约1.5nM、小于约1nM或小于约0.6nM的EC50结合IL-2Rβ。在一些实施方案中，该双功能蛋白如通过ELISA所测量，以小于约0.4nM的EC50结合PD-L1。
在一些实施方案中，该双功能蛋白与PD-1竞争结合PD-L1或者抑制PD-L1与PD-1的结合。
在一些实施方案中，该双功能蛋白在免疫细胞中诱导p-STAT5表达。在一些实施方案中，该双功能蛋白如在分离的人外周血单核细胞(PBMC)中所测量，以小于约1nM、小于约0.6nM、0.5nM或小于约0.1nM的EC50在免疫细胞中诱导p-STAT5表达，并且其中该免疫细胞是T细胞、NK细胞或Treg。在某些实施方案中，如在小鼠脾细胞中所测量，该双功能蛋白在免疫细胞中诱导p-STAT5表达，并且其中该免疫细胞是T细胞、NK细胞或Treg。
在一些实施方案中，该双功能蛋白抑制体内肿瘤生长。
在一些实施方案中，该双功能蛋白诱导体内免疫细胞增殖。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
表4：IL-2亚单位的序列。
表5：包含抗PD-L1 scFv和IL-2亚单位的双功能蛋白的序列。
表6：包含IgG1 Fc杵突变或臼突变、抗PD-L1抗原结合位点和/或IL-2、IL-15或IL15Rα的双功能蛋白的组成部分的序列。
本公开的各种抗体、双功能蛋白和替代格式的实例示于图9中并提供在表7中。
表7：抗体实例。双功能抗体和替代格式。
载体和生产方法
在某些实施方案中，本公开进一步包括经分离的多核苷酸，其编码如本文公开的抗原结合位点、蛋白质和/或抗体，和/或双功能蛋白和/或抗体，或它们的任何片段、变体或组合。在某些实施方案中，本公开进一步包括包含本公开的多核苷酸的表达载体。在某些实施方案中，本公开进一步包括包含本公开的经分离的多核苷酸或本公开的表达载体的经修饰的细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了经分离的多核苷酸，该经分离的多核苷酸编码本公开的PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体中的任何一种。在某些实施方案中，该多核苷酸经受了针对在宿主细胞中的表达的密码子优化。一旦已知或鉴定出编码序列后，就可以使用已知的技术和工具进行密码子优化，例如，使用GenScriptOptimiumGene工具；还可参见Scholtenet等人,Clin.Immunol.119:135,2006)。经密码子优化的序列包括经部分密码子优化的序列(即，一个或多个密码子经受了针对在宿主细胞中的表达的优化)和经完全密码子优化的序列。
还应当理解，本公开的编码PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体的多核苷酸可以具有不同的核苷酸序列，同时由于例如遗传密码简并性、剪接等仍编码相同的PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体。
还提供了载体，其中该载体包含或含有如本文公开的多核苷酸(即，编码PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体的多核苷酸)。载体可包含本文公开的载体中的任何一种或多种载体。
在进一步的方面，本公开还提供了表达根据本公开的PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体；或者包含或含有根据本公开的载体或多核苷酸的宿主细胞。
此类细胞的实例包括但不限于真核细胞，例如，酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞；和原核细胞，包括大肠杆菌。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在某些此类实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞系，诸如CHO细胞(例如，DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，PNAS 77:4216(1980))、人胚肾细胞(例如，HEK293T细胞)、PER.C6细胞、Y0细胞、Sp2/0细胞。NS0细胞、人肝细胞，例如Hepa RG细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。哺乳动物宿主细胞系的其他实例包括小鼠塞托利细胞(例如，TM4细胞)；由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；猴肾细胞(CV1)；人宫颈癌细胞(HELA)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A))；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞；MRC 5细胞和FS4细胞。适合于抗体生产的哺乳动物宿主细胞系还包括那些描述于例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,编著,Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)中的哺乳动物宿主细胞系。
在某些实施方案中，宿主细胞是原核细胞，诸如大肠杆菌。原核细胞诸如大肠杆菌中肽的表达已被充分确立(参见，例如，Pluckthun,A.Bio/Technology 9:545-551(1991)。例如，可以在细菌中生产抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应物功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如，美国专利第5,648,237号；第5,789,199号；和第5,840,523号。
在具体实施方案中，该细胞可以用根据本说明书的具有表达载体的载体转染。术语“转染”是指将核酸分子诸如DNA或RNA(例如mRNA)分子引入到诸如真核细胞的细胞中。在本说明书的上下文中，术语“转染”涵盖技术人员已知的用于将核酸分子引入到细胞中，诸如引入到真核细胞(包括引入到哺乳动物细胞中)的任何方法。此类方法涵盖例如电穿孔、脂转染(例如，基于阳离子脂质和/或脂质体)、磷酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染或基于阳离子聚合物(诸如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)的转染等。在某些实施方案中，引入是非病毒的。
此外，本公开的宿主细胞可以用根据本公开的载体稳定地或瞬时转染，例如以用于表达根据本公开的PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体。在此类实施方案中，可以用如本文所述的载体稳定地转染细胞。替代地，可以用根据本公开的编码如本文公开的抗体或抗原结合片段的载体瞬时转染细胞。在当前所公开的实施方案中的任何实施方案中，多核苷酸对于宿主细胞来说可以是异源的。
因此，本公开还提供了异源表达本公开的PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体的重组宿主细胞。例如，该细胞可以属于与从中完全或部分获得抗体的物种不同的物种(例如，表达人抗体或工程化人抗体的CHO细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞的细胞类型本质上不表达PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体。此外，宿主细胞可以在PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体上赋予在该抗体或抗原结合片段的原生状态下(或在该抗体或抗原结合片段所工程化自或衍生自的母体抗体的原生状态下)不存在的翻译后修饰(PTM；例如，糖基化或岩藻糖基化)。此种PTM可能导致功能差异(例如，免疫原性降低)。因此，由如本文公开的宿主细胞产生的本公开的PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体可以包括一种或多种与处于原生状态的抗体(或母体抗体)不同的翻译后修饰(例如，由CHO细胞产生的人抗体可以包含与从人分离时和/或由原生人B细胞或浆细胞产生时的抗体不同的更多翻译后修饰)。
在相关方面，本公开提供了用于产生PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体的方法，其中该方法包括在足以产生PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体的条件和时间下培养本公开的宿主细胞。可用于分离和纯化重组产生的PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体的方法，例如，可以包括从将重组抗体分泌到培养基中的合适宿主细胞/载体系统获得上清液，以及然后使用可商购获得的过滤器浓缩培养基。浓缩后，可将浓缩物施加至单一的合适纯化基质或一系列合适的基质，诸如亲和基质或离子交换树脂中。可以采用一个或多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。当从其天然环境中分离免疫原时，也可以采用这些纯化方法。用于大规模生产一种或多种本文所述的经分离抗体/重组抗体的方法包括分批细胞培养，对分批细胞培养进行监测和控制以维持适当的培养条件。可溶性PD-L1抗原结合位点、特异性抗体、抗原结合片段或它们的变体的纯化可以根据本文描述的和本领域已知的并且符合国内外监管机构的法律和指南的方法进行。
药物组合物
在某些实施方案中，本公开进一步提供了药物组合物，其包含本公开的抗原结合位点、本公开的蛋白质和/或抗体，或本公开的双功能蛋白和/或抗体，以及药学上可接受的一种或多种稀释剂、一种或多种赋形剂或一种或多种载剂。在一些实施方案中，药物组合物包含另外的治疗剂(例如，组合疗法)。药物组合物可以使用一种或多种药学上可接受的载剂以常规方式配制，该载剂包括有利于将本公开的抗原结合位点、本公开的蛋白质和/或抗体，或本公开的双功能蛋白和/或抗体加工成可以在药学上使用的制备物的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。任何药学上可接受的技术、载剂和赋形剂都适用于配制本文所述的药物组合物：Remington:The Science an d Practice of Pharmacy，第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Com pany,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.，编辑，Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decke r,NewYork,N.Y.,1980和Pharmaceutical Dosage Forms and Drμg Delivery Systems，第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。IL-2组合物的实例描述于美国专利第4,604,377号和第4,766,106号中，所述专利通过引用并入本文。
如本文中所用，“药学上可接受的载剂”和“生理上可接受的载剂”可互换使用，并且包括如本领域普通技术人员所知的任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、此类类似材料以及它们的组合，并且是在所用的剂量和浓度下一般对受者无毒即，当在适当的情况下施用于动物例如人时，不产生不良、过敏或其它不利反应的分子实体和组合物(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版Mack PrintingCompany,1990，第1289-1329页，其通过引用并入本文)。除了任何常规载剂与活性成分不相容的情况之外，考虑了载剂在治疗或药物组合物中的应用。
药物组合物可以包含不同类型的载剂，这取决于药物组合物是以固体、液体还是以气溶胶形式施用，以及对于诸如注射的施用途径是否需要无菌。本公开的抗原结合位点、本公开的蛋白质和/或抗体，或本公开的双功能蛋白和/或抗体(以及任何另外的治疗剂)可通过以下途径施用：静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、脾内、肾内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用(topical)、局部、通过吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部化灌注浸浴(localized perfusion bathing)靶细胞、经由导管、经由灌洗、在乳膏剂(creme)中、在脂质组合物(例如，脂质体)中或通过如本领域普通技术人员已知的其它方法或前述方法的任何组合(参见，例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990，通过引用并入本文)。肠胃外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子，诸如本公开的抗原结合位点、本公开的蛋白质和/或抗体，或本公开的双功能蛋白和/或抗体。
治疗方法或用途
在一些实施方案中，本文提供了治疗方法或用途，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文公开的抗原结合位点、本文公开的蛋白质或抗体，或本文公开的双功能蛋白或抗体，从而调节免疫响应。在一些实施方案中，调节免疫响应包括增强T细胞活性或增强NK细胞活性中的至少一者。在一些实施方案中，治疗方法或用途是治疗有需要的受试者的疾病。在某些实施方案中，该疾病是癌症。在一些实施方案中，该癌症包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌或黑色素瘤。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、肾细胞癌和肾癌。还包括癌前状态或病变和癌症转移。其它细胞增殖性病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部区域和泌尿生殖系统。类似地，还可治疗其它细胞增殖性病症诸如高丙种球蛋白血症、淋巴增殖性病症、副蛋白血症、紫癜、结节病、塞扎里综合征、瓦尔登斯特朗巨球蛋白血症(Waldenstron's Macroglobulinemia)、戈谢病(Gaucher'sDisease)、组织细胞增多症以及除了赘生物形成以外的位于上面所列器官系统中的任何其它细胞增殖性疾病。
在一些实施方案中，用途或治疗方法或调节免疫响应进一步包括向受试者施用治疗有效量的至少一种附加治疗剂(例如，组合疗法)。在某些实施方案中，该另外的治疗剂是抗癌剂。抗癌剂的实例包括检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)、化学治疗剂、抑制肿瘤微环境的剂、癌症疫苗(例如，Sipuleucel-T)、溶瘤病毒(例如，塔利莫基尼拉珀帕瑞韦克(talimogene laherparepvec))、表达嵌合抗原受体的免疫细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。在某些实施方案中，该另外的治疗剂是包括抗原结合部分在内的分子。在某些具体实施方案中，抗原结合部分选自单结构域抗体、Fab分子、scFv、双抗体、纳米抗体、双特异性T细胞接合物或免疫球蛋白。在某些实施方案中，抗原结合部分对肿瘤抗原(例如，癌胚抗原、成纤维细胞活化蛋白-α、CD20)或检查点蛋白(例如，CTLA-4、PD-1)是特异性的。在一些实施方案中，该另外的治疗剂包括表达嵌合抗原受体的免疫细胞、表达工程化T细胞受体的免疫细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞。
其他实施方案将从下文的公开中变得清楚。
实施例
以下实施例是通过说明而非限制的方式提供的。
实施例1.抗PD-L1抗体的开发
此实施例描述了与人PD-L1特异性地结合的抗体的开发和表征。
Scfv mRNA展示筛查和选择
使用mRNA展示技术从1012-13天然人scFv文库中鉴定PD-L1结合剂。简言之，与所报告的程序(美国专利第6,258,558号)类似地，首先将DNA文库转录成mRNA文库，然后通过经由嘌呤霉素接头共价偶联将其翻译成mRNA-scFv融合体文库。首先用人IgG(阴性蛋白)对融合体文库进行反向选择以去除非特异性结合剂，随后针对重组PD-L1-Fc融合蛋白对融合体文库进行选择，然后将其捕获在蛋白G磁珠上。为了富集阻断PD-1和PD-L1相互作用的scFv，利用PD-1从蛋白G磁珠竞争出PD-L1结合剂，并使用文库特异性寡核苷酸通过PCR扩增来富集结合剂。总共执行了4轮选择，以生成高度富集的PD-L1结合库用于筛查。
抗PD-L1 scFv的鉴定和表征
经4轮选择后，将PD-L1富集的scFv文库克隆到细菌周质表达载体pET22b中，并且转化到TOP10感受态细胞中。scFv分子中的每种scFv分子被工程化为具有用于纯化和测定检测的C末端标签和6xHis标签。汇集来自TOP10细胞的克隆，制备miniprep DNA，随后将其转化到细菌Rosetta II菌株中以进行表达。挑选单一克隆，使该克隆生长，并用0.1mM IPTG在96孔板中诱导该克隆的表达。在30℃下诱导16-24小时后收集上清液，以用于鉴定抗PD-L1 scFv的测定。
PD-L1结合筛查ELISA被开发用于鉴定单个抗PD-L1 scFv。简言之，以25μL/孔的总体积用最终浓度为2μg/mL的在1X PBS中的人Fc和人PD-L1-Fc对384孔板进行固定化。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL的超级封闭液封闭1小时。将25μL上清液加入到经人Fc和人PD-L1-Fc固定化的孔中，并在振荡下温育1小时。通过加入25μL以1:5000在1X PBST中稀释的抗FLAG HRP来检测PD-L1结合。在每个步骤之间，在洗板机中用1X PBST洗涤板3次。然后用20μL TMB底物将板显影5分钟，并通过加入20μL 2N硫酸停止显影。在OD450 nmBiotek板读数器上读取板，并用Excel柱形图分析结合和选择性。对与人Fc对照相比具有大于2倍的PD-L1靶标结合的克隆进行DNA测序。产生独特的克隆并将其纯化用于进一步表征。
大肠杆菌中的ScFv生产
从甘油储备液板中挑选指定的抗PD-L1克隆，并使其在带有透气膜的Thomson 24孔板中的5mL培养物中过夜生长。除非另有说明，使此培养物以及下文描述的所有后续培养物在TB完全培养基加100μg/mL羧苄西林和34μg/mL氯霉素(也加入了1:5000的消泡剂204稀释液)中在37℃和225rpm振荡下生长。然后将此过夜起子培养物(starter culture)用于接种到更大的培养物中(起子培养物按1:100稀释到指示的生产培养物中)，并使该培养物生长至OD600介于0.5-0.8之间。此时，用最终浓度为0.1mM的IPTG诱导培养物，并将其在30℃下温育过夜。第二天，将培养物以5,000x g离心30分钟以沉淀细胞，然后通过0.2μm灭菌PES膜过滤灭菌上清液。
对于纯化，每1mL经过滤的上清液使用3μL Ni琼脂糖Excel树脂(GE Healthcare)。使用一次性10mL或20mL BioRad Econo-Pac柱。使用至少20倍柱体积(CV)缓冲液A(1X PBS，pH 7.4，加入额外NaCl至500mM)平衡树脂。经相同的经填充树脂床，通过重力流通过控制流量至1mL/min或倾倒两次来纯化经过滤灭菌的上清液。然后用缓冲液10CV缓冲液A和20CV缓冲液B(1X PBS，pH 7.4，加入额外的NaCl至500mM，和30mM咪唑)洗涤柱。如果需要，作为任选步骤，使用两种去毒(Detox)缓冲液去除内毒素。对于250mL表达培养物纯化，依次用20CV缓冲液C(1X PBS，pH 7.4，加入额外的NaCl至500mM，1％ TX114)、20CV缓冲液D(1X PBS，pH7.4，加入额外的NaCl至500mM，1％ TX100+0.2％ TNBP)和40CV缓冲液E(1X PBS，pH 7.4，加入额外的NaCl至500mM)洗涤抗体结合柱。以总共六个级分(0.5CV洗脱物前级分，5×1个CV洗脱物)，用洗脱缓冲液F(1X PBS，pH 7.4，加入额外的NaCl至500mM，和500mM咪唑)洗脱蛋白质。在Bradford测定中运行各级分(100μL经稀释的Bradford溶液+10μL样本)。合并具有亮蓝色的级分。通过A280延伸系数测量蛋白质浓度。使用SDS-PAGE凝胶分析经纯化的抗体的纯度。在大多数情况下，进行热位移测定来测量经纯化的抗体的热稳定性。
PD-L1结合ELISA
开发了ELISA测定法来确定抗PD-L1 scFv的EC50。简言之，以25μL/孔的总体积用最终浓度为2μg/mL的在1X PBS中的人PD-L1-Fc对384孔板进行固定化。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL的超级封闭液封闭1小时。将经纯化的抗PD-L1 scFv从200nM开始进行2倍连续滴定。向经人PD-L1固定化的孔中加入25μL并在振荡下温育1小时。通过加入25μL以1:5000在1X PBST中稀释的抗FLAG HRP来检测PD-L1结合。在每个步骤之间，在洗板机中用1X PBST洗涤板3次。然后用20μLTMB底物将板显影5分钟，并通过加入20μL 2N硫酸停止显影。使用Biotek板读数器在在OD450nm处读取板，然后在Prism 8.1软件中绘图。计算EC50，其示于表8中。图1示出了所选scFv的PD-L1结合ELISA曲线。
表8.抗PD-L1 scFv结合ELISA的EC50值。
scFv EC50(nM)
2018EP161-G08 1.161
2018EP161-F08 1.152
2018EP170-E06 157.7
2018EP171-H02 0.4292
2018EP172-F10 0.6152
2018EP164-F04 1.271
2018EP161-F04 ND
2018EP280-E04 NA
2018EP173-H11 NA
2018EP280-E01 8.095
ND：未确定，
NA：不可用。
SPR中ScFv与PD-L1的结合
已使用Biacore T200通过表面等离子共振(SPR)技术评估了抗PD-L1 scFv的动力学分析。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。将抗人Fc抗体在CM5传感器芯片的流动池1和2上固定化。对于每个循环，在抗hFc传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10μl/min的流速捕获1μg/mL的人PD-L1-Fc，持续60秒。将2倍连续稀释的HIS标记纯化的抗PD-L1 scFv以30μl/min的流速注射到参考流动池1和PD-L1-Fc捕获流动池2，持续150秒，随后洗涤300秒。然后用抗体再生缓冲液(GE Healthcare)以30μl/min的流速将流动池再生30秒。在96孔板中每个抗PD-L1 scFv测定从300nM至0nM的8个浓度点。用Biacore T200评估软件3.0版分析了scFv与PD-L1蛋白的结合的动力学。特异性结合响应单位是从PD-L1捕获流动池2中减去与参考流动池1的结合而得出的。所选scFv的结合动力学(Ka、Kd和KD)是由传感图分析确定，并示于表9中。
表9.在SPR中抗PD-L1 scFv与PD-L1结合的动力学参数。
scFv Ka(1/ms) Kd(1/s) KD(M)
2018EP161-G08 NA NA NA
2018EP161-F08 2.51E+05 1.25E-03 4.97E-09
2018EP170-E06 NA NA NA
2018EP171-H02 1.06E+06 1.90E-03 1.81E-09
2018EP172-F10 9.29E+05 1.99E-03 2.14E-09
2018EP164-F04 2.45E+05 7.22E-04 2.94E-09
2018EP161-F04 NA NA NA
2018EP280-E04 NA NA NA
2018EP173-H11 NA NA NA
2018EP280-E01 NA NA NA
在FACS中ScFv与细胞表面PD-L1的结合
在pCMV6-Entry载体中用编码具有C末端FLAG和Myc标记的全长人PD-L1的构建体转染K562细胞(ATCC)。G418药物选择过程产生了PD-L1靶标表达细胞的多克隆耐药库。同时，生成空载体转染母体系作为阴性对照。通过FACS对PD-L1靶标表达细胞进行分选，以产生表达PD-L1靶标的多克隆库。在G418药物选择下扩大了该库。然后进行单一细胞分选，接着进行进一步的药物选择以形成克隆细胞系。通过FACS筛查克隆系的PD-L1表达。然后使用高表达PD-L1细胞系进行筛查和测定。
为了确定抗PD-L1 scFv是否与PD-L1表达细胞结合，将200nM的经纯化的抗PD-L1scFv在完全培养基中稀释，并在冰上的96孔板中与PD-L1/K562和K562细胞一起温育1小时。将细胞在4℃下以1200rpm的转速离心5分钟以去除一抗。然后用每孔200μL完全培养基洗涤细胞一次。通过加入100μL经稀释的二抗来用预混合的抗His生物素抗生蛋白链菌素AlexaFluor 647检测样本，并且将样本在4℃下置暗处温育30分钟。将样本在4℃下以1200rpm的速度离心5分钟，并用每孔200μL的1X PBS洗涤两次。将样本在200μL 1X PBS中重构，并在Attune NxT细胞仪上读取。通过Attune NxT软件进行分析，绘制抗PD-L1 scFv在阴性细胞系和靶细胞系上的结合的叠加直方图。计算所选scFv的细胞表面PD-L1结合EC50，其示于表10中。图2A至图2B示出了所选scFv的PD-L1/K562细胞表面结合FACS曲线。
表10.抗PD-L1 scFv与经工程化成表达高水平的细胞表面人PD-L1的K562细胞结合的EC50值。
ScFv在HTRF中与PD-L1和PD-1相互作用的竞争
PD-1/PD-L1 TR-FRET(HTRF)测定试剂盒(BPS，72038)被用于评估抗PD-L1 scFv的PD-1中和活性。简言之，制备了1X免疫缓冲液1。用缓冲液1稀释染料标记的受体、PD-1-Eu、生物素化PD-L1和scFv。对于384孔板中的每个孔，根据制造商推荐的体积加入系列稀释的scFv和试剂。将样本在室温下温育1.5小时，然后使用Biotek Neo2板读数器使用制造商的测定仪器设置读取荧光强度。使用665nm发射/620nm发射的TR-FRET比率进行数据分析，并使用Prism 8.0进行绘图。计算所选scFv的PD-1和PD-L1竞争IC50，其示于表11。图3A至图3B示出了PD-1和PD-L1对所选scFv的竞争结果。
表11.PD-1和PD-L1对scFv的竞争的HTRF IC50。
PD-1和PD-L1 HTRF IC50(nM)
2018EP161-G08 NA
2018EP161-F08 90.79
2018EP170-E06 NA
2018EP171-H02 91.85
2018EP172-F10 96.97
2018EP164-F04 172.9
2018EP161-F04 NA
2018EP280-E04 38.51
2018EP173-H11 NA
2018EP280-E01 76.80
Jurkat细胞NFAT报告基因测定中的ScFv
还使用PD-1/PD-L1阻断生物测定试剂盒(Promega,J1250)在细胞测定中评估了抗PD-L1 scFv的PD-1中和活性。按照制造商的方案，将PD-L1 aAPC/CHOK1细胞解冻并铺在白色平底测定板上。将细胞在37℃下用CO2 5％温育过夜。第二天，从每个孔中除去培养基。从500nM开始对PD-L1 scFv克隆进行5倍连续稀释，并向孔中加入40μL的2倍浓度的经稀释scFv和对照。将板在37℃下温育30分钟，以使scFv结合到PD-L1细胞表面上。按照制造商的方案解冻PD-1效应细胞，并将40μL加入到含有具有抗PD-L1 scFv的PD-L1 aAPC/CHOK1细胞的每个孔中。将板在37℃下用5％ CO2下温育16小时。然后将测定板平衡至室温10分钟。向每个孔和对照孔中加入80μL室温Bio-Glo试剂。将板在室温下在振荡下温育30分钟并避光。使用Biotek Neo2板读数器对发光进行定量，并使用Prism 8.0软件进行绘图。计算所选scFv的NFAT报告基因测定EC50，并提供在表12中。图4示出了报告基因测定结果。
表12.抗PD-L1 scFv的Jurkat NFAT报告基因测定的EC50值。
序列ID EC50(nM)
2018EP164-F04 129.3
2018EP280-E01 399.9
2018EP172-F10 365.1
2018EP161-F08 426.7
2018EP170-E06 NA
2018EP161-G08 NA
2018EP161-F04 NA
2018EP173-H11 NA
2018EP280-E04 133.0
2018EP171-H02 115.3
抗PD-L1 scFv 2018EP171-H02的亲和力成熟
为了进一步改善抗PD-L1 scFv的亲和力和生物活性，构建了合理设计的2018EP171-H02的HCDR3诱变scFv文库，该文库经受了严格的筛查条件。将HCDR3(SEQ IDNO:46)残基以70％:30％的WT:突变体比率进行诱变，gtg tat tac tgt gcg aga gat aaaggg tat ggc agt ggc tgg agg ggt gac tac tgg ggc cag gga(SEQ ID NO:190)。利用框架和VL通过重叠PCR构建诱变文库。mRNA展示被用于通过两轮选择来富集更高亲和力的scFv结合剂。第一轮选择对PD-L1/CHOK1细胞系进行，以确保分子结合在PD-L1的原生表位上。第二轮与10nM PD-L1-Fc蛋白结合，随后在500nM作为竞争剂的经固定化的PD-L1的存在下进行16小时的解离速率选择。将经固定化的PD-L1与更弱的结合剂一起去除。然后用蛋白G磁珠捕获具有更高亲和力scFv结合剂的PD-L1 Fc，将该PD-L1 Fc洗脱掉并对其进行PCR扩增。
在2轮的诱变文库选择后，将库克隆到pET22b载体中并如上所述对该库进行筛查。
如上所述进行所选亲和力成熟的scFv克隆的产生、结合和所有表征测定。对数据进行分析并列在以下表格中：ELISA结合数据列于表13中，SPR动力学分析列于表14中，PD-L1/K6562细胞表面FACS结合列于表15中，以及Jurkat NFAT报告基因测定表面PD-L1结合结果列于表16中。图5示出了ELISA结合结果。图6示出了PD-L1/K6562细胞表面FACS结合。图7示出了PD-1和PD-L1竞争HTRF结果。图8示出了所选经优化scFv的Jurkat NFAT报告基因测定结果。
表13.抗PD-L1 scFv结合ELISA的EC50值。
表14.在SPR中抗PD-L1 scFv与PD-L1结合的动力学参数。
Ka(1/ms) Kd(1/s) KD(M)
2018EP171-H02 7.09E+05 1.753E-3 2.47E-09
2019EP69-E02 NA NA NA
2019EP69-E10 1.16E+06 1.137E-3 9.83E-10
2019EP69-C05 1.76E+06 4.541E03 2.58E-09
2019EP69-F02 3.93E+05 2.44E-04 6.22E-10
2019EP69-B01 NA NA NA
2019EP69-H10 9.41E+05 1.226E-3 1.30E-09
2019EP69-F03 1.24E+06 9.87E-05 7.97E-11
表15.抗PD-L1 scFv与经工程化成表达高水平的细胞表面人PD-L1的K562细胞结合的EC50值。
表16.抗PD-L1 scFv的Jurkat NFAT报告基因测定的EC50值。
实施例2.抗体和双功能抗体结构
将2019EP69-F03的可变VH和VL序列与人重链IgG1主链和轻链λ主链(分别为EP206和EP205)的恒定框序列融合，从而生成抗PD-L1单克隆抗体。
为了生成抗PD-L1/IL-15融合双功能抗体，用(G4S)4接头将抗PD-L1的一条重链的C末端与人IL-15(50-162)[P40933]融合。引入S354C、T366W和K409A突变(Wei等人,Oncotarget,2017；Xu等人,mAbs,2015)以使该链成为杵分子(EP203)。用(G4S)4接头将抗PD-L1的另一条重链的C末端与人IL-15Rα(31-97)[Q13261]融合。引入Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V突变(Wei等人,Oncotarget,2017；Xu等人,mAbs,2015)以使该链成为臼分子(EP204)。轻链EP205被用于分别与杵和臼抗PD-L1链配对。
在另一种情况下，2019EP69-F03的整个scFv链与人重链IgG1主链的恒定Fc框序列融合。用(G4S)4接头将scFv-Fc分子中的一个scFv-Fc分子的C末端与人IL-15(50-162)[P40933]融合。此分子携带S354C、T366W和K409A突变作为杵分子。用(G4S)4接头(EP207)将另一个scFv-Fc分子的C末端与人IL-15Rα(31-97)[Q13261]融合。此分子携带Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V突变作为臼分子(序列EP208)。在杵分子和臼分子中引入了L234A、L235A和P329G突变以消除补体结合和Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应(Lo等人,JBC 2017)。
在另一个实施例中，将S354C、T366W和K409A突变引入到抗PD-L1序列(例如，EP205)的重链以生成杵分子(例如，EP362)。用(G4S)4接头将编码工程化IL-2多肽的蛋白质序列融合至抗PD-L1序列(例如，EP205)的重链恒定框序列的C末端位点。引入Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V突变以使该链成为臼分子(例如，EP363、EP364、EP365)。在某些实施方案中，在Fc中引入L234A、L235A和P329G突变以消除补体结合和Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应(Lo等人,JBC,2017)。
在各种格式中，用(G4S)4接头将抗PD-L1的一条重链的C末端与人IL-15(50-162)融合。引入S354C、T366W和K409A突变以使该链成为杵分子(例如，EP203)。用(G4S)4接头将抗PD-L1的另一条重链的C末端与人IL-15Rα(31-97)融合。引入Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V突变以使该链成为臼分子(例如，EP204)。在杵分子和臼分子中引入了L234A、L235A和P329G突变以消除补体结合和Fc-γ依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应(Lo等人,JBC 2017)。轻链EP205被用于分别与杵和臼抗PD-L1链配对。
然后用针对哺乳动物细胞表达优化的密码子合成编码完整的上面设计的序列的DNA，并将其亚克隆到pCDNA3.4(Invitrogen)中。图9示出了所选抗PD-L1抗体的格式的示意图。
实施例3.IL-2-Fc和抗体生产
抗PD-L1单克隆抗体按照标准方案在Free style系统(Invitrogen)中在ExpiHEK293-F细胞中瞬时表达，重链和轻链的质粒DNA的比率为1:2。使细胞生长五天，之后进行收获。通过离心收集上清液，并将其通过0.2μm PES膜过滤。通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GE Health)纯化抗体。用100mM Gly pH2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并将其用20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl快速中和。然后使用Superdex 200 16/600柱进一步纯化抗体。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质具有低于10EU/mg的最终内毒素水平，并被保存在20mM组氨酸pH 6.0+150mM NaCl中。
对于抗PD-L1/IL-15双功能融合抗体生产，根据标准方案将呈各自IgG1主链格式的“杵”和“臼”构建体在free style系统(Invitrogen)中转染至ExpiHEK293-F细胞。使细胞生长五天，之后进行收获。通过离心收集上清液，并将其通过0.2μm PES膜过滤。通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GE Health)纯化抗体。用100mM Gly pH2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并将其用20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl快速中和。然后使用Superdex200Increase 16/600柱进一步纯化抗体。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质具有低于10EU/mg的最终内毒素水平，并且被保存在1X PBS缓冲液中。
对于单价IL-2-Fc融合蛋白生产，将呈各自IgG1主链格式的“杵”和“臼”构建体以1:1的比率转染至ExpiHEK293-F细胞中。使细胞生长五天，然后通过离心收集上清液并将其通过0.2μm PES膜过滤。首先通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GE Health)纯化Fc融合激动剂。用100mM Gly pH2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并将其用20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mMNaCl快速中和。然后将激动剂蛋白浓缩至1mL，并通过Superdex 200 16/600凝胶过滤柱进一步纯化。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质具有低于10EU/mg的最终内毒素水平，并且被保存在1X PBS中。将经纯化的单价IL-2-Fc融合激动剂在SDS凝胶(4-12％ Bis-Tris Bolt凝胶，含有MES电泳缓冲液)上运行。
对于单价(呈Fab格式)抗PD-L1/IL-2双功能抗体生产，将呈各自IgG1主链格式的“杵”和“臼”构建体以及相应的轻链构建体根据标准方案以1:4:4的杵:臼:轻链比率在freestyle系统(Invitrogen)中转染至ExpiHEK293-F细胞。使细胞生长五天，之后进行收获。通过离心收集上清液，并将其通过0.2μm PES膜过滤。通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GEHealth)纯化抗体。用100mM Gly pH 2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并将其用20mM组氨酸pH5.0+150mM NaCl快速中和。然后使用Superdex 200 16/600柱进一步纯化抗体。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质具有低于10EU/mg的最终内毒素水平，并且被保存在20mN组氨酸、150mM NaCl缓冲液中。
对于单价(呈scFv格式)抗PD-L1/IL-2双功能抗体生产，将呈各自IgG1主链格式的“杵”和“臼”构建体根据标准方案以1:2的杵:臼比率在free style系统(Invitrogen)中转染至ExpiHEK293-F细胞。使细胞生长五天，之后进行收获。通过离心收集上清液，并将其通过0.2μm PES膜过滤。通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GE Health)纯化抗体。用100mMGly pH 2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并将其用20mM组氨酸pH 5.0+150mM NaCl快速中和。然后使用Superdex 20016/600柱进一步纯化抗体。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质具有低于10EU/mg的最终内毒素水平，并且被保存在20mN组氨酸、150mM NaCl缓冲液中。
对于二价(呈Fab格式)抗PD-L1/IL-2双功能抗体生产，将呈各自IgG1主链格式的“杵”和“臼”构建体以及相应的轻链构建体根据标准方案以1:2:2的杵:臼:轻链比率在freestyle系统(Invitrogen)中转染至ExpiHEK293-F细胞。使细胞生长五天，之后进行收获。通过离心收集上清液，并将其通过0.2μm PES膜过滤。通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(GEHealth)纯化抗体。用100mM Gly pH 2.5+150mM NaCl洗脱蛋白质，并将其用20mM组氨酸pH5.0+150mM NaCl快速中和。然后使用Superdex 200 16/600柱进一步纯化抗体。将单体峰级分汇集并浓缩。最终纯化的蛋白质具有低于10EU/mg的最终内毒素水平，并且被保存在20mN组氨酸、150mM NaCl缓冲液中。
对于抗PD-L1/IL-2双功能融合抗体生产，根据标准方案将构建体在free style系统(Invitrogen)中转染至ExpiHEK293-F细胞。使细胞生长五天，之后进行收获。通过离心收集上清液，并将其通过0.2μm PES膜过滤。根据制造商的方案，通过Ni-琼脂糖(GEHealthcare)亲和柱纯化抗体。使用Superdex 200 16/600柱进一步纯化抗体。将激动剂的高同源性单体峰级分各自汇集并浓缩。最终的内毒素水平低于10EU/mg。将蛋白质各自储存在1X PBS缓冲液中，以用于结合和功能分析。
实施例4.抗PD-L1抗体IgG表征
在ELISA中抗PD-L1 IgG抗体与PD-L1的结合
开发了ELISA测定来确定抗PD-L1 IgG抗体的EC50。简言之，以25μL/孔的总体积用最终浓度为2μg/mL的在1x PBS中的人PD-L1-HIS标识的重组蛋白对384孔结构进行固定化。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL的超级封闭液封闭1小时。经纯化的PD-L1 IgG的滴定是从200nM开始进行2倍连续稀释。向经人PD-L1固定化的孔中加入25μL并将其在振荡下温育1小时。通过加入25μL以1:5000在1X PBST中稀释的抗hFc HRP来检测PD-L1结合。在每个步骤之间，在洗板机中用1X PBST洗涤板3次。然后用20μL TMB底物将板显影5分钟，并通过加入20μL 2N硫酸停止显影。使用Biotek板读数器在在OD450 nm处读取板，然后在Prism8.1软件中绘图。表17示出了抗PD-L1 IgG抗体的ELISA结合EC50。
表17.抗PD-L1 IgG抗体的ELISA结合EC50。
抗体 构建体对 PD-L1结合ELISA(nM)
PD-L1 EP205/EP206 0.1635
阿替利珠单抗 - 0.1571
在SPR中抗PD-L1 IgG抗体与PD-L1的结合动力学
已使用Biacore T200通过SPR技术评估了抗PD-L1 IgG的动力学分析。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白质A传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10μl/min的流速捕获1μg/mL的抗hPD-L1-IgG，持续60秒。将2倍连续的hPD-L1-HIS标识的蛋白质以30μl/min的流速注射到参考流动池1和抗PD-L1 IgG捕获流动池2中，持续150秒，随后洗涤300秒。然后以30μl/min的流速用甘氨酸pH 2将流动池再生60秒。在96孔板中每个抗PD-L1 IgG测定从100nM至0nM的8个浓度点。用Biacore T200评估软件3.0版分析了抗PD-L1 IgG与PD-L1蛋白的结合的动力学。特异性结合响应单位是从抗体捕获流动池2减去与参考流动池1的结合而得出的。下表18示出了根据SPR的抗PD-L1IgG抗体的结合动力学。
表18.根据SPR的抗PD-L1 IgG抗体的结合动力学。
抗体 构建体对 Kon Koff KD(nM)
2019EP69-F03 EP205/EP206 9.561E+5 3.472E-4 3.631E-10
2018EP164-F04 EP480/EP481 1.245E+5 7.142E-4 5.734E-9
2018EP280-E04 EP486/EP489 2.741E+5 7.565E-4 2.760E-9
2018EP171-H02 EP488/EP489 4.093E+5 0.003889 9.501E-9
阿替利珠单抗 - NA NA NA
NA：数据不可用
在FACS中抗PD-L1 IgG抗体与细胞表面PD-L1的结合
将200nM的经纯化的抗PD-L1 IgG抗体在完全培养基中稀释，并在冰上与96孔板中的PD-L1/K562和K562细胞一起温育1小时。将细胞在4℃下以1200rpm的转速离心5分钟以去除一抗。然后用每孔200μL完全培养基洗涤细胞一次。通过加入100μL经稀释的二抗来用抗hFc Alexa Fluor 647检测样本并且将该样本在4℃下置暗处温育30分钟。将样本在4℃下以1200rpm的速度离心5分钟，并用每孔200μL的1X PBS洗涤两次。将样本在200μL 1X PBS中重构，并在Attune NxT细胞仪上读取。通过Attune NxT软件进行分析，绘制抗PD-L1抗体在阴性细胞系和靶细胞系上的结合的叠加直方图。
抗PD-L1 IgG抗体在HTRF测定中与PD-L1和PD-1相互作用的结合竞争以及免疫细胞在Jurkat细胞NFAT报告基因测定中的活化与scFv表征中所述相同。下表19示出了Jurkat细胞报告基因测定EC50、PD-L1/K562细胞表面结合EC50以及HTRF PD-1和PD-L1对IgG抗体的竞争结果。图10示出了PD-L1/K562细胞表面FACS结合结果。表19.Jurkat细胞报告基因测定EC50、PD-L1/K562细胞表面结合EC50以及HTRF PD-1和PD-L1对IgG抗体的竞争结果。
实施例5.抗PD-L1/IL-15融合抗体表征
在ELISA中抗PD-L1/IL-15与PD-L1和IL-15受体的结合
开发了ELISA测定来确定抗PD-L1抗体的EC50。简言之，以25μL/孔的总体积用最终浓度为2μg/mL的在1X PBS中的人IL-15Rα-His标识的或PD-L1 HIS标识的蛋白质对384孔板进行固定化。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL的超级封闭液封闭1小时。将经纯化的抗PD-L1/IL-15从200nM开始进行3倍连续滴定。向经人PD-L1/IL-15固定化的孔中加入25μL并在振荡下温育1小时。通过加入25μL以1:10000在1x PBST中稀释的抗人HRP来检测IL-15或PD-L1结合。在每个步骤之间，在洗板机中用1X PBST洗涤板3次。然后用20μL TMB底物对板显影5分钟，并通过加入20μL 2N硫酸停止显影。使用Biotek板读数器在OD450 nm处读取板，然后在Prism 8.1软件中绘图以计算EC50。表20示出了抗体的PD-L1 ELISA结合EC50。
表20.在ELISA中抗PD-L1/IL-15与PD-L1和IL-15受体的结合。
在SPR中抗PD-L1/IL-15与IL-2Rb和PD-L1的结合动力学
已使用Biacore T200通过SPR技术评估了抗PD-L1-IgG/IL-15和抗PD-L1-scFv-Fc/IL-15双功能体(bifunctional)与IL-15Rβ和PD-L1的动力学分析。请注意，IL-15受体与IL-2受体共享相同的β亚单位。因此，IL-15Rβ也称为IL-2Rβ和CD122。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白A传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10μl/min的流速捕获1μg/mL的抗hPD-L1-IgG/IL-15或抗PD-L1 scFv-Fc/IL-15，持续60秒。将2倍连续稀释的IL-15Rβ-HIS或hPD-L1-HIS标识的蛋白质以30μl/min的流速注射到参考流动池1和抗PD-L1/IL-15双功能捕获流动池2中，持续150秒，随后洗涤300秒。然后以30μl/min的流速用甘氨酸pH 2将流动池再生60秒。在96孔板中每个抗PD-L1 IgG测定从100nM至0nM(IL-15Rβ-HIS)或从300nM至0nM(PD-L1-HIS)的8个浓度点。用Biacore T200评估软件3.0版分析了抗PD-L1/IL-15双功能体与IL-15Rβ和PD-L1蛋白结合的动力学。特异性结合响应单位是从抗体捕获流动池2减去与参考流动池1的结合而得出的。表21示出了抗PD-L1/IL-15与IL-2Rβ和PD-L1的结合动力学结果。
表21.在SPR中抗PD-L1/IL-15与IL-2Rβ和PD-L1的结合动力学。
NFAT报告基因测定中的抗PD-L1/IL-15抗体
Jurkat细胞NFAT报告基因测定(Promega，J1250)中免疫细胞的活化与scFv表征中所述相同。双功能抗体的EC50示于表22中。图11示出了NFAT报告基因测定结果。
表22.双功能抗PD-L1/IL-15抗体在NFAT报告基因测定中的EC50。
抗PD-L1/IL-15抗体的p-STAT5活性
从两个单独供体的白细胞去除系统(LRS)锥体中分离出人PBMC，并将其在90μL的培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔板中。将细胞在37℃下静置1小时。将细胞在10μL中用10X浓度的抗PD-L1/IL-15抗体在37℃下刺激20分钟。立即将经刺激的PBMC固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-CD56+。T调控性细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。确定p-STAT5+细胞的％，并将其对每种抗体或IL-15(Peprotech)滴度作图。使用Prism软件确定p-STAT5活化的EC50值。p-STAT5的EC50示于表23中。图12示出了CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和T调控性细胞中的p-STAT5活化结果。
表23.抗PD-L1/IL-15抗体的p-STAT5活性
实施例6.单价IL-2-Fc表征
与IL-2Rα和IL-2Rβ受体结合ELISA
对于单价IL-2Fc融合蛋白，将重组His标识的人IL-2Rα和IL-2Rβ于25μL 1X PBS中加入到384孔板的孔中，并在4℃下温育过夜以包被板。用0.05％吐温20/1X PBS洗涤板三次。在室温下用100μL超级封闭液封闭板1小时，然后将其用0.05％吐温20/1X PBS洗涤3次。将IL-2突变体在0.05％吐温20/1X PBS中从1000nM稀释至0nM，并在室温下加入至板中保持2小时。然后用0.05％吐温20/1X PBS洗涤板6次。将抗HisTag-HRP以1:5000在0.05％吐温20/1X PBS中稀释，并在室温下加入到板中，持续1小时。然后用0.05％吐温20/1X PBS洗涤板6次，并加入TMB以显蓝色。用2N硫化氢停止反应，并且在BioTek板读数器上在450nm处读取吸光度。对人IL-2Rα和IL-2Rβ进行吸光度对IL-2浓度作图。ELISA结合的EC50值的概述示于表24中。图13A和图13B分别示出了单价IL-2Fc蛋白与IL-2Rα和IL-2Rβ受体的结合。
表24.针对单价IL-2Fc与IL-2Rα和IL-2Rβ受体的结合的ELISA的EC50值。
与IL-2Rα和IL-2Rβ受体结合SPR
单价IL-2RβFc融合蛋白的结合动力学已利用Biacore T200通过SPR技术进行了分析。简言之，将抗hFc抗体在流动池1和流动池2上固定化。对于每个循环，在经抗hFc固定化的芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10μL/min的流速捕获1μg/mL的IL-2Fc融合蛋白，持续60秒。将100nM IL-2Rα-HIS标识的或IL-2Rβ-HIS标识的进行2倍连续稀释并注射到参考流动池1上，并在流动池2中以30μL/min的流速捕获IL-2Fc融合蛋白，持续150秒。最后一次注射后进行300秒洗涤。以96孔格式用8个连续稀释浓度点设置了该测定。用BiacoreT200评估软件3.0分析动力学数据。特异性结合响应单位是从靶流动池2减去与参考流动池1的结合而得出的。单价IL-2-Fc融合蛋白与IL-2受体的结合动力学的概述示于表25中。
表25.与IL-2Rα和IL-2Rβ受体结合SPR。
*稳态亲和力。ND：无法检测的结合
P-STAT5谱(Profile)
从两个单独供体的LRS锥体中分离出人PBMC，并将其在90μL的培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔板中。将细胞在37℃下静置1小时。将细胞用10μL的10倍浓度的人IL-2-Fc WT和工程化IL-2-Fc突变体在37℃下刺激20分钟。立即将经刺激的PBMC固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-CD56+。T调控性细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。确定p-STAT5+细胞的％，并将其对每种IL-2滴度作图。使用Prism软件确定p-STAT5活化的EC50值，其示于表26中。图14A至图14D示出了来自供体126的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和T调控性细胞的p-STAT5谱分析曲线。图14E至图14H示出了来自供体359的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和T调控性细胞的p-STAT5谱分析曲线。
表26.p-STAT5活化的EC50值。
实施例7.IL-2/抗PD-L1-scFv双功能表征
在ELISA中IL-2/抗PD-L1 scFv抗体的IL-2受体和PD-L1结合活性
以25μL/孔的总体积用最终浓度为2μg/mL的在1X PBS中的抗人Fc对384孔板进行固定化。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL的超级封闭液封闭1小时。将25μL体积的以50nM开始的一定滴度的IL-2/抗PD-L1 scFv添加到孔中，并在振荡下温育1小时。洗涤后，向每孔中加入25μL 30nM生物素化PD-L1。通过加入25μL以1:10000在1X PBST中稀释的抗生蛋白链菌素HRP来检测IL-2/抗-PD-L1 scFv的PD-L1结合。在每个步骤之间，在洗板机中用1XPBST洗涤板3次。然后用25μL TMB底物将板显影5分钟，并通过加入25μL 2N硫酸停止显影。使用Biotek板读数器在OD450 nm处读取板，并用Prism 8.1软件对结合相关性绘图。如实施例6中所述进行抗体与IL-2Rα和IL-2Rβ受体的ELISA结合测定。ELISA结合EC50值示于表27中。图15A、图15B和图15C分别示出了抗体与IL-2Rα、IL-2Rβ和PD-L1的ELISA结合曲线。
表27.在ELISA中IL-2/抗PD-L1 scFv抗体的IL-2受体和PD-L1结合活性。
抗PD-L1 IgG抗体在HTRF测定中与PD-L1和PD-1相互作用的结合竞争以及免疫细胞在Jurkat细胞NFAT报告基因测定中的活化如scFv表征中所述进行。HTRF IC50和NFAT报告基因测定EC50值示于表28中。图16示出了NFAT报告基因测定结果。
表28.IL-2/抗PD-L1 ScFv和抗PD-L1 IgG抗体在HTRF测定中与PD-L1和PD-1相互作用的结合竞争以及免疫细胞在Jurkat细胞NFAT
报告基因测定中的活化。
在SPR中与IL-2Rα、IL-2Rβ受体和PD-L1的结合
已使用Biacore T200通过SPR技术评估了抗PD-L1/IL-2双功能体与IL-2Rα、IL-2Rβ和PD-L1的动力学分析。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白A传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10μL/min的流速捕获1μg/mL的抗hPD-L1/IL-2，持续60秒。将2倍连续稀释的IL-2Rα-HIS或IL-2Rβ-HIS或hPD-L1-HIS标识的蛋白质以30μl/min的流速注射到参考流动池1和抗PD-L1/IL-2双功能捕获流动池2中，持续150秒，随后洗涤300秒。然后用甘氨酸pH 2以30μL/min的流速将流动池再生60秒。在96孔板中每个抗PD-L1 IgG测定从100nM至0nM(IL-2Rα-HIS和IL-2Rβ-HIS)或从300nM至0nM(PD-L1-HIS)的8个浓度点。用Biacore T200评估软件3.0版分析了抗PD-L1/IL-2双功能体与IL-2Rα、IL-2Rβ和PD-L1结合的动力学。特异性结合响应单位是从抗体捕获流动池2减去与参考流动池1的结合而得出的。抗体与相应的IL-2和PD-L1的结合动力学示于表29中。
表29.IL-2/抗PD-L1 ScFv双功能体与IL-2Rα、IL-2Rβ和PD-L1的动力学分析。
*稳态亲和力
ND：无法检测的结合
人PBMC中的IL-2/抗PD-L1 scFv p-STAT5活化
从两个单独供体的LRS锥体中分离出人PBMC，并将其在90μL的培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔板中。将细胞在37℃下静置1小时。将细胞用10μL的10倍浓度的人IL-2/抗PD-L1 scFv WT和工程化IL-2/抗PD-L1 scFv突变体在37℃下刺激20分钟。立即将经刺激的PBMC固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-CD56+。T调控性细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。确定p-STAT5+细胞的百分比，并将其对每种IL-2滴度作图。使用Prism软件确定p-STAT5活化的EC50值，其示于表30中。图17A至图17D示出了来自供体359的PBMC细胞的p-STA T5结果。图17E至图17H示出了来自供体126的PBMC细胞的p-S TAT5结果。
表30.来自供体#359和#126的人PBMC中IL-2/抗PD-L1 scFv p-STAT5活化。
实施例8.IL-2/抗PD-L1-Fab双功能和抗PD-L1/IL-2融合体表征
IL-2/抗PD-L1 Fab PD-L1结合ELISA、HTRF竞争和Jurkat报告基因测定
以25μL/孔的总体积用最终浓度为2μg/mL的在1X PBS中的抗人Fc对384孔板进行固定化。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL的超级封闭液封闭1小时。将25μL体积的以50nM开始的一定滴度的IL-2/抗PD-L1 FAB添加到孔中，并在振荡下温育1小时。洗涤后，向每孔中加入25μL 30nM生物素化PD-L1。通过加入25μL以1:10000在1X PBST中稀释的抗生蛋白链菌素HRP来检测IL-2/抗PD-L1 FAB的PD-L1结合。在每个步骤之间，在洗板机中用1XPBST洗涤板3次。然后用25μL TMB底物对板显影5分钟，并通过加入25μL 2N硫酸停止显影。抗体与IL-2Rα和IL-2Rβ受体的ELISA结合测定与实施例6中所述相同。使用Biotek板读数器在OD450 nm处读取板并用Prism 8.1软件对结合相关性绘图。ELISA结合EC50值示于表31中。图18A、图18B和图18C分别示出了IL-2Fc/抗PD-L1Fab变体与IL-2Rα、IL-2Rβ和PD-L1的ELISA结合曲线。
表31.来自IL-2Fc/抗PD-L1 Fab的ELISA结合测定的EC50值。
双功能蛋白在HTRF测定中与PD-L1和PD-1相互作用的结合竞争以及免疫细胞在Jurkat细胞NFAT报告基因测定中的活化与scFv表征中所述相同。HTRF IC50和NFAT报告基因测定EC50值示于表32中。图19示出了NFAT报告基因测定曲线。
表32.HTRF IC50和NFAT报告基因测定EC50值。
与IL-2Rα、IL-2Rβ受体和PD-L1结合SPR
已使用Biacore T200通过SPR技术评估了抗PD-L1/IL-2双功能体与IL-2Rα、I2Rβ和PD-L1的动力学分析。使用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在蛋白A传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中，在流动池2上以10μl/min的流速捕获1μg/mL的抗hPD-L1/IL-2，持续60秒。将2倍连续稀释的IL-2Rα-HIS或IL-2Rβ-HIS或hPD-L1-HIS标识的蛋白质以30μl/min的流速注射到参考流动池1和抗PD-L1/IL-2双功能捕获流动池2中，持续150秒，随后洗涤300秒。然后用甘氨酸pH 2以30μl/min的流速将流动池再生60秒。在96孔板中每个抗PD-L1 IgG测定从100nM至0nM(IL-2Rα-HIS和IL-2Rβ-HIS)或从300nM至0nM(PD-L1-HIS)的8个浓度点。用Biacore T200评估软件3.0版分析了抗PD-L1/IL-2双功能体与IL-2Rα、IL-2Rβ和PD-L1结合的动力学。特异性结合响应单位是从抗体捕获流动池2减去与参考流动池1的结合而得出的。
为了评估双功能抗体是否可以同时结合IL-2受体和PD-L1，将抗PDL1/IL2双功能在蛋白A传感器芯片上于1X HBSP缓冲液中以10μL/min的流速在流动池2中捕获60秒。将hPD-L1-HIS标识的蛋白质注射到参考流动池1和抗PD-L1/IL-2双功能捕获流动池2，持续60秒，随后将IL-2Rα-HIS或IL-2Rβ-HIS蛋白以30μl/min的流速注射到参考流动池1和hPD-L1结合的抗PD-L1/IL-2双功能捕获流动池2，持续90秒，随后洗涤120秒。图20显示PD-L1和IL-2Rα和IL-2Rβ在单一浓度下与抗体同时结合。如上所述测量抗PDL1/IL2双功能体与IL-2受体和PD-L1的结合动力学，并且数据示于表33中。
表33.在SPR中IL-2Fc/抗PD-L1 Fab与IL-2Rα、IL-2Rβ和PD-L1的结合动力学。
*稳态亲和力。ND：无法检测的结合
人PBMC中的IL-2/抗PD-L1 Fab p-STAT5活化从两个单独供体的LRS锥体中分离出人PBMC，并将其在90μL的培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔板中。将细胞在37℃下静置1小时。将细胞用10μL的10倍浓度的人IL-2/抗PD-L1 Fab WT和工程化IL-2/抗PD-L1 Fab突变体在37℃下刺激20分钟。立即将经刺激的PBMC固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-CD56+。T调控性细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。确定p-STAT5+细胞的百分比，并将其对每种IL-2滴度作图。使用Prism软件确定p-STAT5活化的EC50值，其示于表34中。图21A至图21D示出了供体857中的p-STAT5活化曲线。图21E至图21H示出了供体359中的p-STAT5活化曲线。
表34.人PBMC中的IL-2/抗PD-L1 FAB p-STAT5活化。
小鼠脾细胞中的IL-2/抗PD-L1 Fab p-STAT5活化
将购得的小鼠脾细胞于90μL培养基中以250,000个细胞/孔铺在96孔板中。将细胞在37℃下静置1小时。将细胞用10μL的10倍浓度的鼠IL-2、人IL-2/抗PD-L1 Fab WT和工程化IL-2/抗PD-L1 Fab突变体在37℃下刺激20分钟。立即将经刺激的PBMC固定，透化，对细胞谱系标志物(CD3、NKp46、CD4、CD8、FOXP3)和p-STAT5进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+NKp46-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD3-NKp46+。T调控性细胞被定义为CD3+NKp46-CD4+CD8-FOXP3+。确定p-STAT5+细胞的％，并将其对每种IL-2滴度作图。使用Prism软件确定p-STAT5活化的EC50值，其示出表35中。小鼠IL2(PeproTech,mIL-2)用作参考。图22A至图22D示出了小鼠脾细胞中的p-STAT5活化曲线。
表35.小鼠脾细胞中的IL-2/抗PD-L1 FAB p-STAT5活化。
实施例9.抗PD-L1 mAb肿瘤生长抑制(MB-231肿瘤)
在用来自单一供体的CD34+脐带血人源化的7周龄雌性NCG小鼠的背侧皮下注射500,000个于50％基质胶中的MDA-MB-231细胞。用测径器测量肿瘤。平均体积达到100mm3后，用200μg阿替利珠单抗或工程化抗PD-L1 mAb EP204/EP206 Q3D治疗小鼠，持续20天。每周测量肿瘤体积和小鼠体重3次。与媒介物治疗组相比随时间对肿瘤体积和体重绘图。图23示出了肿瘤生长抑制曲线。
对于细胞因子谱分析，通过末期放血处死小鼠，并立即将血液离心以分离出血浆。使用Duoset人TNFα和IFNγELISA试剂盒确定血浆中人IFNγ和TNFα的浓度。图24A和图24B分别示出了血浆中人TNFα和IFNγ水平。
实施例10.MC38肿瘤小鼠中IL-2/抗PD-L1-Fab候选物血液和脾细胞免疫谱分析
在7周龄雌性C57BL/6小鼠的背侧皮下注射100,000个于50％基质胶中的MC38细胞。用测径器测量肿瘤。平均体积达到100mm3后，用2μg人IL-2/抗PD-L1 Fab WT(EP290/EP325/EP205)或工程化IL-2/抗PD-L1 Fab突变体(EP412/EP325/EP205；EP415/EP325/EP205；EP416/EP325/EP205；EP417/EP325/EP205；和EP418/EP325/EP205)Q4D治疗小鼠，持续11天。第11天时处死小鼠并经由尾静脉放血分离外周血。裂解红细胞，并使用Attune流式细胞仪分析免疫细胞。CD4+T细胞被定义为CD45+CD3+NKp46-CD4+CD8-。CD8+T细胞被定义为CD45+CD3+NKp46-CD4-CD8+。NK细胞被定义为CD45+CD3-NKp46+。T调控性细胞NK细胞被定义为CD45+CD3+NKp46-CD4+CD8-FOXP3+。对于每个治疗组，对CD45+群体内每种亚型的百分比绘图。图25A至图25D示出了血液中的免疫细胞谱分析结果。图26A至图26D示出了脾细胞中的免疫细胞谱分析结果。
实施例11.IL-2/抗PD-L1-Fab候选物肿瘤生长抑制(hPD-1转基因小鼠中的B16F10-hPD-L1肿瘤)
以下实施例描述了在体内鼠模型中评估IL-2/抗PD-L1-Fab的肿瘤生长抑制的实验。在7周龄雌性hPD-1转基因小鼠的背侧皮下注射500,000个于50％基质胶中的B16F10-hPD-L1细胞。用测径器测量肿瘤。平均体积达到70-90mm3后，用200μg阿替利珠单抗Q3D或10μg工程化IL-2/抗PD-L1-Fab双功能蛋白(EP415/EP325/EP205；EP418/EP325/EP205)Q5D治疗小鼠，持续20天。每周测量肿瘤体积和小鼠体重3次。与媒介物治疗组相比随时间对肿瘤体积和体重绘图。图27示出了肿瘤生长抑制曲线。
实施例12.IL-2/抗PD-L1-Fab候选物肿瘤生长抑制(MB-231肿瘤)
以下实施例描述了在体内鼠模型中评估IL-2/抗PD-L1-Fab的肿瘤生长抑制的实验。在用来自单一供体的CD34+脐带血人源化的7周龄雌性NCG小鼠的背侧皮下注射500,000个于50％基质胶中的MDA-MB-231细胞。用测径器测量肿瘤。平均体积达到80-100mm3后，用200μg工程化抗PD-L1 mAb EP205/EP206 Q3D或5μg IL-2/抗PD-L1-Fab双功能蛋白(EP290/EP325/EP205；EP412/EP325/EP205；EP415/EP325/EP205；EP418/EP325/EP205)Q5D治疗小鼠，持续20天。每周测量肿瘤体积和小鼠体重3次。与媒介物治疗组相比随时间对肿瘤体积和体重绘图。图28示出了肿瘤生长抑制曲线。
实施例13.用IL2/抗PD-L1-Fab抗体对人PBMC的处理导致体外CD8+T细胞中PD-1表达增加
从来自单一供体的LRS锥体中分离出人PBMC，并将其在180μL完全培养基中以100,000个细胞/孔铺在96孔板中。将细胞在5％ CO2培养箱中在37℃下静置1小时。通过加入20μL的包含EP415/EP325/EP205或EP290/EP325/EP205的组合组分的IL-2Fc/抗PD-L1 Fab来刺激细胞，该IL-2Fc/抗PD-L1 Fab在培养基中被稀释，从而使在孔中的最终浓度介于100nM和0.0001nM IL2之间。将细胞在培养箱中静置5天。5天后，在PBS中洗涤PBMC，并将其在生存力染料中温育。在随后的洗涤后，将细胞固定并透化，然后针对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)和PD-1进行染色，并在Attune流式细胞仪上进行可视化。CD8+T细胞被定义为CD3+CD56-CD4-CD8+，TReg细胞被定义为CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+。计算表达PD-1的CD8+T细胞和TReg细胞的百分比，并将其对IL2浓度绘图。图29A示出了分别是EP415/EP325/EP205和EP290/EP325/EP205处理后的剂量依赖性PD-1阳性CD8+T细胞。图29B示出了分别是EP415/EP325/EP205和EP290/EP325/EP205处理后的PD-1阳性Treg细胞。
实施例14.EP415/EP325/EP205是强IL2Rβ受体激动剂
HEK-Blue IL-2细胞购自InvivoGen，并根据制造商的说明书对该细胞进行培养。为了量化这些细胞对CD25、CD122和PD-L1的表面表达，将HEK Blue IL2细胞于200μL培养基中以每孔100,000个细胞的密度接种在96孔板中。让细胞在培养箱中恢复至少1小时。然后洗涤细胞并用针对CD25、CD122或PD-L1的荧光抗体对细胞进行染色。同时，也用相同的抗体对Quantum Simply Cellular微球标准品(Bangs Laboratories,Inc.)进行染色。再次洗涤后，在Attune流式细胞仪上将细胞和微球可视化。计算适当的荧光通道中每个微球的中位荧光强度(MFI)，从而生成MFI与抗体结合含量(ABC)关系的标准曲线。将每种抗体的细胞的MFI与适当的标准进行比较，并对中位受体数进行计算和绘图。
将HEK-Blue IL-2细胞于100μL培养基中以每孔100,000个细胞的密度接种在96孔板中。让细胞在培养箱中恢复至少1小时。将板离心，除去培养基，并将细胞重悬于以1:100稀释度含有抗CD25抗体的新鲜培养基或单独的培养基中。将细胞在4℃下在振荡下温育30分钟。温育后，将细胞离心，弃去培养基，并将它们重悬于含有一定滴度的EP415/EP325/EP205或EP290/EP325/EP205的新鲜培养基中。然后将细胞在4℃下在振荡下温育1小时。然后除去培养基并且用含有与Alex Fluor 647缀合的抗人Fc抗体的培养基替换。将细胞在4℃下在振荡下温育30分钟。洗涤细胞，并使用Attune流式细胞仪确定结合的EP415/EP325/EP205或EP290/EP325/EP205的存在。将结合有EP415/EP325/EP205或EP290/EP325/EP205的HEK Blue IL2细胞的百分比对IL2浓度进行绘图。图30A示出了HEK-Blue IL-2细胞上CD25、CD122和PD-L1的表达水平。图30B示出了在有和没有抗CD25抗体干扰的情况下EP415/EP325/EP205和EP290/EP325/EP205与HEK-Blue IL-2细胞的FACS结合活性。CD-25抗体减少了EP290/EP325/EP205与HEK-Blue IL-2细胞的结合，而它对EP415/EP325/EP205结合没有影响。该数据表明EP415/325/205偏向于IL2Rβγ受体结合，因为抗CD25抗体似乎不干扰EP415/325/205与细胞系的相互作用。相比之下，EP290/EP325/EP205表现出由IL2-WT序列的存在所致的更高的与IL2Rαβγ的结合水平以及由抗CD25抗体的干扰所致的结合减少。
实施例15.对EP415/EP325/EP205进行体内肿瘤定位
对C57BL/6N和B6N白化小鼠双侧皮下接种250,000个MC38细胞(左下侧)和1,000,000个MC38-hPD-L1细胞(右下侧)。一旦这两个肿瘤的体积达到最小300mm3，就经由腹膜内注射(IP)给小鼠给药1mg/kg的已用Alexa Fluor 750荧光标记的EP415/EP325/EP205。使用IVIS Lumina III LT(Perkin Elmer)系统确定肿瘤部位处经荧光标记的EP415/EP325/EP205的存在。在成像过程中经由附接到内部麻醉歧管的鼻锥体给小鼠维持3％异氟醚，并将小鼠放在成像室的加热(37℃)架上以进行落射照明图像采集(epi-illumination imageacquisition)。扫描后，将小鼠取出并放回它们各自的笼子中进行恢复。在给药后的以下时间点对小鼠进行成像：15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时。计算每个肿瘤的总通量并将其对时间绘图。图31A示出了在注射EP415/EP325/EP205后24小时时荷有肿瘤的小鼠的代表性成像结果。图31B示出了分别是EP415/EP325/EP205向MC-38-hPD-L1和MC-38肿瘤部位的时间依赖性富集。这些结果表明EP415/EP325/EP205优先定位于MC-38-hPD-L1肿瘤部位，而不是MC-38肿瘤部位。
实施例16.EP415/EP325/EP205在MDA-MB-231细胞热肿瘤模型中有效
在用来自2-3个供体的CD34+脐带血人源化的28-29周龄雌性NCG小鼠的背侧皮下注射500,000个于50％基质胶中的MDA-MB-231细胞。用测径器测量肿瘤。平均肿瘤体积达到100mm3后，用抗PD-L1 EP205/EP206(200μg,Q3D)、EP290/EP325/EP205 IL2/抗PD-L1(5ug,Q5D)或EP415/EP325/EP205 IL2/抗PD-L1(5ug,Q5D)对小鼠进行IP治疗。每周测量肿瘤体积2-3次，并与媒介物对照组相比随时间对肿瘤体积绘图。
给药启动后第24天，处死小鼠并取出肿瘤。将肿瘤解离成单细胞悬浮液并与生存力染料一起温育。洗涤后，将肿瘤细胞固定、透化并且针对细胞谱系标志物(CD3、CD56、CD4、CD8、FOXP3)进行染色。对EP415/EP325/EP205和EP290/EP325/EP205治疗组计算作为占总活细胞的百分比的CD4+T细胞(CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3-)、CD8+T细胞(CD3+CD56-CD4-CD8+)、NK细胞(CD3-CD56+)和TRe g细胞(CD3+CD56-CD4+CD8-FOXP3+)的百分比，并将其与媒介物治疗的小鼠进行比较。图32A示出了EP415/EP325/EP205的针对人源化NCG小鼠中抗PD1/PD-L1响应性癌细胞MDA-MB-231的肿瘤生长抑制曲线。EP415/EP325/EP205表现出比抗PD-L1抗体和EP290/EP325/EP205两者都优越的肿瘤生长抑制活性。因此，图32B至图32E示出了肿瘤部位中免疫细胞的水平。肿瘤部位中CD8 T和NK细胞的活化与观察到的功效相关。
实施例17.EP415/EP325/EP205在COLO205细胞冷肿瘤模型中有效
在用来自2-3个供体的CD34+脐带血人源化的28-29周龄雌性NCG小鼠的背侧皮下注射5,000,000个于50％基质胶中的COLO205细胞。用测径器测量肿瘤。平均肿瘤体积达到100mm3后，用抗PD-L1(200ug,EP205/EP206,Q3D)、EP415/EP325/EP205(5ug,Q5D)或EP415/EP325/EP205(20ug单剂量)对小鼠进行IP治疗。每周测量肿瘤体积2-3次，并与媒介物对照组相比随时间对肿瘤体积绘图。每天测量小鼠体重并将其对时间绘图。图33A示出了EP415/EP325/EP205的针对人源化小鼠中癌细胞COLO205的肿瘤生长抑制曲线。图33B示出了小鼠的相应体重变化。图33A至图33D中的数据支持EP415/EP325/EP205在压制肿瘤生长方面比抗PD-L1抗体更有效。
实施例18.EP415/EP325/EP205在抗PD1耐药NCI-H1975细胞肿瘤中有效
在用来自2-3个供体的CD34+脐带血人源化的20-24周龄雌性NOG小鼠的右背侧皮下注射8×106个于100μL无血清培养基与基质胶混合物(v/v 1:1)中的NCI-H1975细胞。用测径器测量肿瘤。平均肿瘤体积达到100mm3后，用EP415/EP325/EP205(10ug,Q10D)、EP415/EP325/EP205(5ug,Q6D)或帕博利珠单抗(200ug,Q4D)对小鼠进行IP治疗。每周测量肿瘤体积两次，并与媒介物对照组相比随时间对肿瘤体积绘图。每周测量小鼠体重3-5次并将小鼠体重对时间绘图。
给药启动后第20天，处死小鼠并取出肿瘤。将肿瘤解离成单细胞悬浮液并与生存力染料一起温育。洗涤后，将细胞固定、透化并针对细胞谱系标志物(mCD45、hCD45、hCD3、hCD56、hCD4、hCD8、hFOXP3)进行染色。对治疗组中的每个治疗组计算每mm3肿瘤的活hCD45细胞(mCD45-hCD45+)和活hCD8+T细胞(mCD45-hCD45+hCD3+hCD56-hCD4-hCD8+)的数目，并将其与媒介物对照组进行比较。还对治疗组中的每个治疗组计算肿瘤内的hCD8+T和NK细胞(mCD45-hCD45+hCD3-hCD56+)与hTReg细胞(mCD45-hCD45+hCD3+hCD56-hCD8-hCD4+hFOXP3+)的比率，并将其与媒介物对照组进行比较。图34A示出了EP415/EP325/EP205的针对人源化小鼠中癌细胞H1975的肿瘤生长抑制曲线。图34B示出了小鼠的相应体重变化。图34C至图34F示出了肿瘤浸润免疫细胞的谱分析结果。EP415/EP325/EP205保留了其对H1975细胞的肿瘤生长抑制活性，该细胞对抗PD1抗体帕博利珠单抗具有耐药性。
实施例19.Ep415/Ep325/Ep205食蟹猴PK/PD研究
对体重范围为3.0–5.0kg的2-5岁非初始(non-)食蟹猴静脉推注给药单剂量的0.1mg/kg或0.5mg/kg的EP415/EP325/EP205。给药后，在每个选定的时间点采集血液。通过ELISA测定对血浆中构建体的浓度进行定量并以ng/mL表示浓度。对猴血浆中检测到的EP415/EP325/EP205的浓度对时间绘图。将每只动物在每个时间点的血浆浓度用于药代动力学(PK)计算。使用梯形法估计曲线下面积(AUC)。使用已建立的方程估计其他参数。
对于药效学(PD)分析，每天分离出血液(第0天和第7天给药前)，并将该血液针对免疫细胞谱系标志物(CD3、CD4、CD8、CD16、CD 45、FOXP3、CD20)进行染色，并通过流式细胞术进行定量。对以下免疫群体进行定量：CD4+FOXP3-T细胞(CD45+CD3+CD16-CD4+CD8-FOXP3-)、CD4+FOXP3+T调控性细胞(CD45+CD3+CD16-CD 4+CD8-Foxp3+)、CD8+T细胞(CD45+CD3+CD16-CD4-CD8+)、B细胞(CD45+CD3-CD16-CD20+)和自然杀伤(NK)细胞(CD45+CD3-CD16+CD20-)。将这些群体中每个群体的原始数据针对观察到的细胞事件总数作归一化并对时间绘图。图35A示出了在猴血浆中通过ELISA检测到并对时间绘图的EP415/EP325/EP205浓度。图35B至图35C示出了给药EP415/EP325/EP205后猴血液中免疫细胞群体的百分比。虽然每次给药后观察到CD8+T细胞群体增加，但CD4+FOXP3+Tre g细胞的水平仍保持在基线。
通过引用方式并入
除非有相反说明，本文引用的每个专利文献和科学文章的全部公开内容均出于所有目的通过引用方式并入。
等效方案
本申请中描述的抗原结合位点可以通过其它特定形式来实施而不会脱离其精神或基本特性。因此，前述实施方案应在所有方面均被视为说明性的，而非是对本文所描述的抗原结合位点的限制。因此，本申请的范围由所附权利要求而非由前面的说明书来指示，且在权利要求的含义和等效范围内的所有变化都被旨在涵盖在权利要求中。
本申请要求2021年1月22日提交的美国临时申请第63/140,749号的优先权权益，该临时申请据此通过引用方式以其整体并入。
序列表
<110> 艾佩斯瑞生物制药公司(Elpis Biopharmaceuticals)
<120> 抗PD-L1单克隆抗体以及与白细胞介素-15 (IL-15)、
白细胞介素-15受体15α或白细胞介素-2的融合蛋白
<130> 300096.402WO
<140> PCT
<141> 2022-01-21
<150> US 63/140,749
<151> 2021-01-22
<160> 192
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
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<220>
<223> 合成序列
<400> 1
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Ala Ala Tyr Asn Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser His Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
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Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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<223> 合成序列
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
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Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
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<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Asp Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Ile Pro Leu
85 90 95
Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg
100 105
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
Lys Ala Gly Ser Trp Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
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1 5
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<220>
<223> 合成序列
<400> 29
Leu Leu Ile Phe Asp Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5 10
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<211> 9
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
Gln Gln Ser Tyr Arg Ile Pro Leu Ser
1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
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Ala Thr Asp Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Leu Thr Leu Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成序列
<400> 32
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Pro Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro
20 25 30
Tyr Gly Ile Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asn Ser Glu Asn His Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Asp Ala Ser Ala Asn Val Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Thr Val Leu
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<211> 16
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<220>
<223> 合成序列
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1 5 10 15
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Met Ile Trp His Ser Ser Ala Trp Val
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<220>
<223> 合成序列
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ile Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Ser Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser His Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
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Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
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<211> 13
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<220>
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<211> 11
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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Val Val Val Tyr Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Tyr Val
1 5 10
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
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<220>
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<400> 45
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
Arg Asp Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
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<211> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
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1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
Leu Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5 10
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<211> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Ser Leu Gln Trp Leu Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 51
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Gly
35 40 45
His Asp Thr Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Thr Ser Gly His His
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Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 52
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
Arg Asp Ser Leu Gln Trp Leu Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val His
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
Leu Val Ile Gly His Asp Thr Asp Arg Pro Ser
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
Gln Val Trp Asp Thr Ser Gly His His Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 59
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
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100 105 110
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 60
Leu Leu Ile His Phe Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Thr Ile Val Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Pro Val Phe Phe
100 105 110
Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 62
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 62
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Ala Thr Asn
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Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Arg Asn His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Val
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Asn Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 63
Leu Thr Phe Ser Asn Ala Trp Met Ser
1 5
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 64
Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 65
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1 5 10 15
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 66
Asp Ser Asn Ile Ala Thr Asn Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 67
Leu Leu Ile Tyr Arg Asn His Gln Arg Pro Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 68
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<210> 69
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 70
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
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Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 71
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 71
Arg Asn Lys Gly Tyr Val Ser Gly Trp Arg Ser Asp Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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100 105 110
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115 120
<210> 73
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 73
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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100 105 110
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 74
Arg Asp Lys Gly Phe Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 75
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Phe Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 76
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 77
Arg Asp Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Phe Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 79
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 80
Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ile Arg Ile Gly Thr Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 82
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 82
Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg
1 5 10 15
Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Phe
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys
85 90 95
Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 83
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 83
Arg Arg Ile Arg Ile Gly Thr Gly Trp Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Phe Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 85
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 86
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 86
Arg Asp Lys Trp Phe Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 87
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 88
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 89
Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 91
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 91
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 92
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 92
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 93
<211> 162
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 94
<211> 267
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr
20 25 30
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
35 40 45
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
65 70 75 80
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
85 90 95
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
100 105 110
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
115 120 125
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
130 135 140
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
145 150 155 160
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
165 170 175
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
180 185 190
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
195 200 205
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
210 215 220
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
225 230 235 240
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
245 250 255
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
260 265
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> 1
<223> Xaa = C T G W I S E 和 K
<220>
<221> misc_feature
<222> 2
<223> Xaa = Y P V W L A 和 G
<220>
<221> misc_feature
<222> 3
<223> Xaa = S T Q G M E R 和 K
<220>
<221> misc_feature
<222> 5
<223> Xaa = A V S 和 T
<220>
<221> misc_feature
<222> 6
<223> Xaa = I L T 和 V
<220>
<221> misc_feature
<222> 7
<223> Xaa = S T E D 和 R
<220>
<221> misc_feature
<222> 9
<223> Xaa = I A M 和 V
<220>
<221> misc_feature
<222> 10
<223> Xaa = S T N Q I G E K 和 R
<220>
<221> misc_feature
<222> 11
<223> Xaa = V L 和 I
<220>
<221> misc_feature
<222> 12
<223> Xaa = N T I 和 L
<220>
<221> misc_feature
<222> 13
<223> Xaa = V A 和 I
<220>
<221> misc_feature
<222> 14
<223> Xaa = Q L G K 和 R
<220>
<221> misc_feature
<222> 15
<223> Xaa = A D 和 E
<400> 95
Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 96
Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu
1 5 10 15
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 97
Lys Trp Gly Asp Ala Val Ser Asn Ala Arg Val Leu Ala Gly Glu
1 5 10 15
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 98
Lys Trp Gly Asp Ala Val Ser Asn Ala Arg Val Leu Ala Gly Ala
1 5 10 15
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 99
Thr Leu Met Asp Thr Thr Asp Asn Ile Gly Val Leu Val Arg Glu
1 5 10 15
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 100
Glu Pro Ser Asp Val Ile Ser Asn Ile Asn Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 101
Ser Pro Gln Asp Ser Ile Glu Asn Ile Ser Val Leu Val Arg Glu
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 102
Trp Ala Ser Asp Ser Ile Glu Asn Ile Thr Leu Leu Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 103
Cys Pro Thr Asp Thr Ile Glu Asn Ile Thr Val Leu Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 104
Arg Tyr Lys Asp Ser Leu Glu Asn Met Gln Ile Ile Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 105
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu
1 5 10 15
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 106
Thr Pro Arg Asp Val Val Glu Asn Met Asn Val Leu Val Leu Glu
1 5 10 15
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 107
Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Asn Met Glu Val Leu Ile Leu Asp
1 5 10 15
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 108
Thr Pro Ser Asp Ala Ile Glu Asn Ile Asn Val Leu Ile Arg Glu
1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 109
Thr Pro Ser Asp Val Ile Glu Asn Ile Thr Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 110
Gly Val Gly Asp Thr Ile Asp Asn Ile Asn Val Leu Val Lys Glu
1 5 10 15
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 111
Ile Gly Arg Asp Ser Ile Asp Asn Ile Lys Val Ile Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 112
Trp Ala Thr Asp Thr Ile Arg Asn Val Glu Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 113
Thr Ala Glu Asp Val Val Thr Asn Ile Thr Val Leu Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 114
Thr Ala Glu Asp Val Ile Ser Asn Ile Arg Val Asn Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 115
Thr Pro Ser Asp Val Ile Asp Asn Val Ser Ile Thr Val Gln Glu
1 5 10 15
<210> 116
<211> 15
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<223> 合成序列
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<210> 117
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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<211> 12
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 147
Pro Lys Leu Thr Asn Met Leu Thr Phe Lys Phe Ser
1 5 10
<210> 148
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 149
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 149
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 150
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 150
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ile Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Ala Ala Tyr Asn Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 151
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 151
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser His Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 152
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 152
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Ser Gly Trp Tyr Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 153
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 153
Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Asn Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Ile Pro Leu
85 90 95
Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 154
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Ser Trp Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 155
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 155
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Asp Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Ile Pro Leu
85 90 95
Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 156
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 156
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ile Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Ala Ala Tyr Asn Trp Phe
100 105 110
Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 157
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 157
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Ser Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser His Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 158
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 159
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 159
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 160
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
260 265 270
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
275 280 285
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
290 295 300
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
305 310 315 320
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
325 330 335
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
340 345 350
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
355 360 365
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
370 375 380
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
385 390 395
<210> 161
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 161
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe
195 200 205
Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr
210 215 220
Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly
245 250 255
Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly
290 295 300
Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser
305 310 315 320
Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
325 330 335
Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
340 345 350
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
355 360 365
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser
370 375 380
Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
385 390 395
<210> 162
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
260 265 270
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
275 280 285
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Glu
290 295 300
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
305 310 315 320
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
325 330 335
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Thr Ala Arg Asp Ala Val
340 345 350
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355 360 365
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
370 375 380
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
385 390 395
<210> 163
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 163
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Glu Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe
195 200 205
Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr
210 215 220
Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
225 230 235 240
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly
245 250 255
Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly
290 295 300
Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser
305 310 315 320
Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
325 330 335
Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
340 345 350
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
355 360 365
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser
370 375 380
Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
385 390 395
<210> 164
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
260 265 270
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
275 280 285
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Leu Leu Thr Asp
290 295 300
Met Leu Thr Arg Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
305 310 315 320
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
325 330 335
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
340 345 350
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
355 360 365
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
370 375 380
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
385 390 395 400
<210> 165
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 165
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 166
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 166
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 167
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 167
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 168
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 168
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
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260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 169
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 169
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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Thr Ala Arg Asp Ala Val Asp Asn Met Arg Val Ile Ile Gln Glu Leu
85 90 95
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Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
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165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 170
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 170
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Gly Val Thr Asp Ser Ile Ser Asn Ala Ile Val Leu Ala Arg Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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Ile Ser Thr Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
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260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 171
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 171
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
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35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ala Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Asn Val Ile Val Gln Glu Leu
85 90 95
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100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
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130 135 140
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
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195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
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260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 172
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 172
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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130 135 140
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 173
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 173
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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100 105 110
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130 135 140
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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225 230 235 240
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 174
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 174
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Asn Pro Leu Leu Thr Asp Met Leu Thr Arg Lys Phe Tyr Met Pro Lys
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 175
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 175
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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Thr Pro Arg Asp Ala Ile Asp Asn Ile Arg Val Ile Val Gln Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
130 135 140
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 176
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 176
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
355 360 365
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370 375 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
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420 425 430
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 178
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
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340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
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370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
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420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 179
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Gly Phe Gly Ser Gly Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 180
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 181
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 181
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 182
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 182
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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275 280 285
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ala Leu Thr Val
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 183
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 183
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala
530 535 540
Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile
545 550 555 560
Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys
565 570 575
Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp
580 585 590
Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
595 600
<210> 184
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 184
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Lys Trp Tyr Gly Ser Ala Trp Arg Gly Asp Tyr Trp Gly
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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435 440 445
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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595 600
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<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 185
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50 55 60
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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595 600
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 186
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
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485 490 495
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Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
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Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
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Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
580
<210> 187
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 187
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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450 455 460
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515 520 525
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530 535
<210> 188
<211> 606
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 188
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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35 40 45
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115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
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Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
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Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
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195 200 205
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
405 410 415
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595 600 605
<210> 189
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 189
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Phe Asn Asn Gln Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Ser Thr Trp Asp Asp Ser Leu Lys Gly Pro Ile Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
245 250 255
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
275 280 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
290 295 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
325 330 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
435 440 445
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450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys
485 490 495
Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr
500 505 510
Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg
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Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr
530 535 540
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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caggga 66
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<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 191
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20 25 30
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115 120 125
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130
<210> 192
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_feature
<222> 81
<223> Xaa = C T G W I S E 和 K
<220>
<221> misc_feature
<222> 82
<223> Xaa = Y P V W L A 和 G
<220>
<221> misc_feature
<222> 83
<223> Xaa = S T Q G M E R 和 K
<220>
<221> misc_feature
<222> 85
<223> Xaa = A V S 和 T
<220>
<221> misc_feature
<222> 86
<223> Xaa = I L T 和 V
<220>
<221> misc_feature
<222> 87
<223> Xaa = S T E D 和 R
<220>
<221> misc_feature
<222> 89
<223> Xaa = I A M 和 V
<220>
<221> misc_feature
<222> 90
<223> Xaa = S T N Q I G E K 和 R
<220>
<221> misc_feature
<222> 91
<223> Xaa = V L 和 I
<220>
<221> misc_feature
<222> 92
<223> Xaa = N T I 和 L
<220>
<221> misc_feature
<222> 93
<223> Xaa = V A 和 I
<220>
<221> misc_feature
<222> 94
<223> Xaa = Q L G K 和 R
<220>
<221> misc_feature
<222> 95
<223> Xaa = A D 和 E
<400> 192
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130

Claims (93)

1.一种结合PD-L1的抗原结合位点，其包含：
重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:11、3、19、33、52或63的互补决定区1(CDR1)序列；SEQ ID NO:12、4、20、34、41、53或64的互补决定区2(CDR2)序列；和SEQ ID NO:89、5、13、21、27、35、46、54、65、71、74、77、80、83或86的互补决定区3(CDR3)序列；以及
轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:47、6、14、22、28、36、55或66的CDR1序列；SEQID NO:48、7、15、23、29、37、42、56、60或67的CDR2序列；和SEQ ID NO:49、8、16、24、30、38、43、57或68的CDR3序列。
2.如权利要求1所述的抗原结合位点，其包含：
(a)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和89的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)VH，其包含分别是SEQ ID NO:3、4和5的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(c)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和13的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:14、15和16的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(d)VH，其包含分别是SEQ ID NO:19、20和21的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:22、23和24的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(e)VH，其包含分别是SEQ ID NO:19、20和27的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:28、29和30的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(f)VH，其包含分别是SEQ ID NO:33、34和35的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:36、37和38的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(g)VH，其包含分别是SEQ ID NO:3、41和5的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:6、42和43的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(h)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和46的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(i)VH，其包含分别是SEQ ID NO:52、53和54的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:55、56和57的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(j)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和46的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、60和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(k)VH，其包含分别是SEQ ID NO:63、64和65的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:66、67和68的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(l)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和71的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(m)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和74的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(n)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和77的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(o)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和80的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；
(p)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和83的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列；或者
(q)VH，其包含分别是SEQ ID NO:11、12和86的CDR1、CDR2和CDR3序列；以及VL，其包含分别是SEQ ID NO:47、48和49的CDR1、CDR2和CDR3序列。
3.如权利要求1或2所述的抗原结合位点，其中：
(a)所述VH包含与SEQ ID NO:87至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:88至少90％同一的氨基酸序列；
(b)所述VH包含与SEQ ID NO:1至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:2至少90％同一的氨基酸序列；
(c)所述VH包含与SEQ ID NO:9至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:10至少90％同一的氨基酸序列；
(d)所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:18至少90％同一的氨基酸序列；
(e)所述VH包含与SEQ ID NO:25至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:26至少90％同一的氨基酸序列；
(f)所述VH包含与SEQ ID NO:31至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:32至少90％同一的氨基酸序列；
(g)所述VH包含与SEQ ID NO:39至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:40至少90％同一的氨基酸序列；
(h)所述VH包含与SEQ ID NO:44至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:45至少90％同一的氨基酸序列；
(i)所述VH包含与SEQ ID NO:50至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:51至少90％同一的氨基酸序列；
(j)所述VH包含与SEQ ID NO:58至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:59至少90％同一的氨基酸序列；
(k)所述VH包含与SEQ ID NO:61至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:62至少90％同一的氨基酸序列；
(l)所述VH包含与SEQ ID NO:69至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:70至少90％同一的氨基酸序列；
(m)所述VH包含与SEQ ID NO:72至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:73至少90％同一的氨基酸序列；
(n)所述VH包含与SEQ ID NO:75至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:76至少90％同一的氨基酸序列；
(o)所述VH包含与SEQ ID NO:78至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:79至少90％同一的氨基酸序列；
(p)所述VH包含与SEQ ID NO:81至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:82至少90％同一的氨基酸序列；或者
(q)所述VH包含与SEQ ID NO:84至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:85至少90％同一的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗原结合位点，其中：
(a)所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列或由SEQ ID NO:87的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列或由SEQ ID NO:88的氨基酸序列组成
(b)所述VH包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；
(c)所述VH包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；
(d)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；
(e)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成；
(f)所述VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成；
(g)所述VH包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由SEQ IDNO:39的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；
(h)所述VH包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成；
(i)所述VH包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或由SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成；
(j)所述VH包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或由SEQ ID NO:58的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或由SEQ ID NO:59的氨基酸序列组成；
(k)所述VH包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或由SEQ ID NO:61的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或由SEQ ID NO:62的氨基酸序列组成；
(l)所述VH包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或由SEQ ID NO:69的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成；
(m)所述VH包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列或由SEQ ID NO:72的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或由SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成；
(n)所述VH包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列或由SEQ ID NO:75的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或由SEQ ID NO:76的氨基酸序列组成；
(o)所述VH包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列或由SEQ ID NO:78的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列或由SEQ ID NO:79的氨基酸序列组成；
(p)所述VH包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列或由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或由SEQ ID NO:82的氨基酸序列组成；或者
(q)所述VH包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列或由SEQ ID NO:84的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列或由SEQ ID NO:85的氨基酸序列组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点是单链片段可变片段(scFv)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点是抗原结合片段(Fab)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点如通过表面等离子体共振(SPR)所测量，以小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.8nM、小于约0.6nM、小于约0.4nM、小于约0.2nM或小于约0.1nM的KD结合人PD-L1。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)所测量，以小于约160nM、小于约10nM、小于约1.5nM、小于约1.2nM、小于约1.0nM、小于约0.8nM、小于约0.7nM、小于约0.6nM、小于约0.5nM或小于约0.4nM的EC50结合人PD-L1。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点如通过荧光活化细胞分选(FACS)所测量，以小于约40nM、小于约10nM、小于约8nM、小于约6nM、小于约4nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.5nM、小于约0.3nM、小于约0.2nM或小于约0.1nM的EC50结合表达人PD-L1的细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点与PD-1竞争结合PD-L1或者抑制PD-L1与PD-1的结合。
11.一种包含权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点的蛋白质。
12.如权利要求11所述的蛋白质，其包含一个或多个抗体重链恒定区。
13.如权利要求12所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区是人IgG重链恒定区。
14.如权利要求12或13所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区是人IgG1重链恒定区。
15.如权利要求12-14中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区包含与SEQ IDNO:90至少90％同一的氨基酸序列。
16.如权利要求12-15中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A、P329G、Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A、F405K、K409A和Y407V的突变。
17.如权利要求12-16中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体重链恒定区包含SEQ IDNO:91或SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
18.如权利要求12-17中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含第一抗体重链恒定区，所述第一抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的S354C、T366W和K409A的突变；和第二抗体重链恒定区，所述第二抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V的突变。
19.如权利要求11-18中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质是抗体。
20.如权利要求19所述的蛋白质，其中所述抗体包含：
(a)包含与SEQ ID NO:148至少90％同一的氨基酸序列的重链(HC)和包含与SEQ IDNO:149至少90％同一的氨基酸序列的轻链(LC)；
(b)包含与SEQ ID NO:150至少90％同一的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:151至少90％同一的氨基酸序列的LC；
(c)包含与SEQ ID NO:152至少90％同一的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:153至少90％同一的氨基酸序列的LC；
(d)包含与SEQ ID NO:154至少90％同一的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:155至少90％同一的氨基酸序列的LC；
(e)包含与SEQ ID NO:156至少90％同一的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:157至少90％同一的氨基酸序列的LC；或者
(f)包含与SEQ ID NO:159至少90％同一的氨基酸序列的HC和包含与SEQ ID NO:160至少90％同一的氨基酸序列的LC。
21.如权利要求19或20所述的蛋白质，其中所述抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列或由SEQ ID NO:148的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列或由SEQ ID NO:149的氨基酸序列组成的LC；
(b)包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列或由SEQ ID NO:150的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列或由SEQ ID NO:151的氨基酸序列组成的LC；
(c)包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列或由SEQ ID NO:152的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列或由SEQ ID NO:153的氨基酸序列组成的LC；
(d)包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列或由SEQ ID NO:154的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列或由SEQ ID NO:155的氨基酸序列组成的LC；
(e)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列或由SEQ ID NO:156的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列或由SEQ ID NO:157的氨基酸序列组成的LC；或者
(f)包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列或由SEQ ID NO:159的氨基酸序列组成的HC和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或由SEQ ID NO:160的氨基酸序列组成的LC。
22.如权利要求19-21中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体如通过SPR所测量，以小于约10nM、小于约6nM、小于约3nM、小于约1nM或小于约0.4nM的KD结合人PD-L1。
23.如权利要求19-22中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体如通过ELISA所测量，以小于约0.2nM的EC50结合人PD-L1。
24.如权利要求19-23中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体如通过FACS所测量，以小于约7nM的EC50结合表达人PD-L1的细胞。
25.如权利要求19-24中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体抑制体内肿瘤生长。
26.如权利要求19-25中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体以如与阿替利珠单抗单抗相比相当或更增强的水平在体内诱导IFNγ和TNFα分泌。
27.一种双功能蛋白，其包含：
(a)结合PD-L1的抗原结合位点，所述抗原结合位点包含：
(i)重链可变结构域(VH)，其包含SEQ ID NO:11、3、19、33、52或63的互补决定区1(CDR1)；SEQ ID NO:12、4、20、34、41、53或64的互补决定区2(CDR2)；和SEQ ID NO:89、5、13、21、27、35、46、54、65、71、74、77、80、83或86的互补决定区3(CDR3)；以及
(ii)轻链可变结构域(VL)，其包含SEQ ID NO:47、6、14、22、28、36、55或66的CDR1序列；SEQ ID NO:48、7、15、23、29、37、42、56、60或67的CDR2序列；和SEQ ID NO:49、8、16、24、30、38、43、57或68的CDR3序列；以及
(b)白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽、野生型白细胞介素-2(IL-2)多肽或工程化IL-2多肽或它们的功能片段或变体。
28.如权利要求27所述的双功能蛋白，其进一步包含一个或多个抗体重链恒定区。
29.如权利要求27-28中任一项所述的双功能蛋白，其中所述结合PD-L1的抗原结合位点包含：
(a)所述VH包含与SEQ ID NO:87至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:88至少90％同一的氨基酸序列；
(b)所述VH包含与SEQ ID NO:1至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:2至少90％同一的氨基酸序列；
(c)所述VH包含与SEQ ID NO:9至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:10至少90％同一的氨基酸序列；
(d)所述VH包含与SEQ ID NO:17至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:18至少90％同一的氨基酸序列；
(e)所述VH包含与SEQ ID NO:25至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:26至少90％同一的氨基酸序列；
(f)所述VH包含与SEQ ID NO:31至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:32至少90％同一的氨基酸序列；
(g)所述VH包含与SEQ ID NO:39至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:40至少90％同一的氨基酸序列；
(h)所述VH包含与SEQ ID NO:44至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:45至少90％同一的氨基酸序列；
(i)所述VH包含与SEQ ID NO:50至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:51至少90％同一的氨基酸序列；
(j)所述VH包含与SEQ ID NO:58至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:59至少90％同一的氨基酸序列；
(k)所述VH包含与SEQ ID NO:61至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:62至少90％同一的氨基酸序列；
(l)所述VH包含与SEQ ID NO:69至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:70至少90％同一的氨基酸序列；
(m)所述VH包含与SEQ ID NO:72至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:73至少90％同一的氨基酸序列；
(n)所述VH包含与SEQ ID NO:75至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:76至少90％同一的氨基酸序列；
(o)所述VH包含与SEQ ID NO:78至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:79至少90％同一的氨基酸序列；
(p)所述VH包含与SEQ ID NO:81至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:82至少90％同一的氨基酸序列；或者
(q)所述VH包含与SEQ ID NO:84至少90％同一的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQID NO:85至少90％同一的氨基酸序列。
30.如权利要求27-29中任一项所述的双功能蛋白，其中所述结合PD-L1的抗原结合位点包含：
(a)所述VH包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列或由SEQ ID NO:87的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列或由SEQ ID NO:88的氨基酸序列组成；
(b)所述VH包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；
(c)所述VH包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；
(d)所述VH包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；
(e)所述VH包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成；
(f)所述VH包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由SEQ IDNO:31的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成；
(g)所述VH包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列或由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；
(h)所述VH包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列或由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列或由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成；
(i)所述VH包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列或由SEQ ID NO:50的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或由SEQ ID NO:51的氨基酸序列组成；
(j)所述VH包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或由SEQ ID NO:58的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列或由SEQ ID NO:59的氨基酸序列组成；
(k)所述VH包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列或由SEQ ID NO:61的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或由SEQ ID NO:62的氨基酸序列组成；
(l)所述VH包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列或由SEQ ID NO:69的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成；
(m)所述VH包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列或由SEQ ID NO:72的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列或由SEQ ID NO:73的氨基酸序列组成；
(n)所述VH包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列或由SEQ ID NO:75的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或由SEQ ID NO:76的氨基酸序列组成；
(o)所述VH包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列或由SEQ ID NO:78的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列或由SEQ ID NO:79的氨基酸序列组成；
(p)所述VH包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列或由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或由SEQ ID NO:82的氨基酸序列组成；或者
(q)所述VH包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列或由SEQ ID NO:84的氨基酸序列组成，并且所述VL包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列或由SEQ ID NO:85的氨基酸序列组成。
31.如权利要求27-30中任一项所述的双功能蛋白，其包含：
(a)第一亚单位，其包含所述结合PD-L1的抗原结合位点、白细胞介素-15(IL-15)多肽或其功能片段或变体以及第一抗体重链恒定区；和
(b)第二亚单位，其包含所述结合PD-L1的抗原结合位点、白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或其功能片段或变体以及第二抗体重链恒定区。
32.如权利要求27-31中任一项所述的双功能蛋白，其中所述IL-15多肽包含SEQ IDNO:93的氨基酸50-162或其功能片段或变体。
33.如权利要求27-32中任一项所述的双功能蛋白，其中所述IL-15Rα多肽包含SEQ IDNO:94的氨基酸31-97或其功能片段或变体。
34.如权利要求27-33中任一项所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含与SEQ IDNO:186至少90％同一的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含与SEQ ID NO:187至少90％同一的氨基酸序列；任选地其中所述第一亚单位进一步包含与SEQ ID NO:181至少90％同一的氨基酸序列。
35.如权利要求34所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列；任选地其中所述第一亚单位进一步包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
36.如权利要求27-33中任一项所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含与SEQ IDNO:188至少90％同一的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含与SEQ ID NO:189至少90％同一的氨基酸序列。
37.如权利要求36所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或由SEQ ID NO:188的氨基酸序列组成，并且所述第二亚单位包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列或由SEQ ID NO:189的氨基酸序列组成。
38.如权利要求27-30中任一项所述的双功能蛋白，其中所述工程化IL-2多肽包含：
(a)IL-2受体α(IL-2Rα)结合区1，其包含相对于野生型IL-2的选自以下的一个或多个位于一个或多个位置处的突变：
位于位置K35处的选自K35G、K35L、K35S、K35V、K35D、K35E和K35C的突变；
位于位置R38处的选自R38V、R38D、R38E、R38S、R38I、R38A、R38Y、R38G、R38C或R38N的突变；
位于位置F42处的选自F42A、F42R、F42G、F42I、F42L、F42P和F42H的突变；以及
位于位置Y45处的选自Y45S、Y45P、Y45A、Y45V、Y45C、Y45T和Y45F的突变，和/或
(b)IL-2受体β(IL-2Rβ)结合区2基序，其包含：
X1-X2-X3-D-X4-X-5-X6-N-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13(SEQ ID NO:95)，
其中：
X1选自C、T、G、W、I、S、E和K；
X2选自Y、P、V、W、L、A和G；
X3选自S、T、Q、G、M、E、R和K；
X4选自A、V、S和T；
X5选自I、L、T和V；
X6选自S、T、E、D和R；
X7选自I、A、M和V；
X8选自S、T、N、Q、I、G、E、K和R；
X9选自V、L和I；
X10选自N、T、I和L；
X11选自V、A和I；
X12选自Q、L、G、K和R；以及
X13选自A、D和E。
39.如权利要求38所述的双功能蛋白，其中所述工程化IL-2多肽包含：
(a)IL-2Rα结合区1，其包含与选自SEQ ID NO:124-147的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；和/或
(b)IL-2Rβ结合区2基序，其包含与选自SEQ ID NO:96-123的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
40.如权利要求38-39中任一项所述的双功能蛋白，其中：
(a)所述IL-2Rα结合区1包含选自SEQ ID NO:124-147的氨基酸序列；和/或
(b)所述IL-2Rβ结合区2基序包含选自SEQ ID NO:96-123的氨基酸序列。
41.如权利要求27-30中任一项所述的双功能蛋白，其包含与选自SEQ ID NO:160-164的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
42.如权利要求41中任一项所述的双功能蛋白，其包含选自SEQ ID NO:160-164的氨基酸序列。
43.如权利要求27-30和38-40中任一项所述的双功能蛋白，其包含：
(a)第一亚单位，其包含所述结合PD-L1的抗原结合位点和第一抗体重链恒定区；和
(b)第二亚单位，其包含野生型白细胞介素-2(IL-2)或工程化IL-2多肽或其功能片段或变体和第二抗体重链恒定区。
44.如权利要求43所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含与SEQ ID NO:176至少90％同一的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含与选自SEQ ID NO:165-175的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
45.如权利要求43-44中任一项所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含SEQ IDNO:176的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含选自SEQ ID NO:165-175的氨基酸序列。
46.如权利要求43所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含与选自SEQ ID NO:177-180的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含与选自SEQID NO:165-175的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，任选地其中所述第一亚单位进一步包含与SEQ ID NO:181至少90％同一的氨基酸序列。
47.如权利要求46所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含选自SEQ ID NO:177-180的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含选自SEQ ID NO:165-175的氨基酸序列，任选地其中所述第一亚单位进一步包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
48.如权利要求46或47所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列。
49.如权利要求27-30和38-40中任一项所述的双功能蛋白，其包含：
(a)第一亚单位，其包含所述结合PD-L1的抗原结合位点和第一抗体重链恒定区；和
(b)第二亚单位，其包含所述结合PD-L1的抗原结合位点、野生型白细胞介素-2(IL-2)或工程化IL-2多肽或其功能片段或变体以及第二抗体重链恒定区。
50.如权利要求49所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含与SEQ ID NO:182至少90％同一的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含与选自SEQ ID NO:183-185的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；任选地其中所述第一亚单位和所述第二亚单位各自独立地进一步包含与SEQ ID NO:181至少90％同一的氨基酸序列。
51.如权利要求49-50中任一项所述的双功能蛋白，其中所述第一亚单位包含SEQ IDNO:182的氨基酸序列，并且所述第二亚单位包含选自SEQ ID NO:183-185的氨基酸序列；任选地其中所述第一亚单位和所述第二亚单位各自独立地进一步包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
52.如权利要求28-51中任一项所述的双功能蛋白，其中所述抗体重链恒定区是人IgG重链恒定区。
53.如权利要求28-52中任一项所述的双功能蛋白，其中所述抗体重链恒定区是人IgG1重链恒定区。
54.如权利要求28-53中任一项所述的双功能蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含与SEQ ID NO:90至少90％同一的氨基酸序列。
55.如权利要求28-54中任一项所述的双功能蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的L234A、L235A、P329G、Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A、F405K、K409A和Y407V的突变。
56.如权利要求31-55中任一项所述的双功能蛋白，其中所述第一抗体重链恒定区和所述第二抗体重链恒定区中的一种抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的S354C、T366W和K409A的突变；并且另一种抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的一个或多个选自根据EU编号系统编号的Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V的突变。
57.如权利要求31-56中任一项所述的双功能蛋白，其中所述第一抗体重链恒定区和所述第二抗体重链恒定区中的一种抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的根据EU编号系统编号的突变S354C、T366W和K409A；并且另一种抗体重链恒定区包含相对于SEQ ID NO:90的根据EU编号系统编号的突变Y349C、T366S、L368A、F405K和Y407V。
58.如权利要求31-57中任一项所述的双功能蛋白，其中所述第一抗体重链恒定区和所述第二抗体重链恒定区中的一种抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，并且另一种抗体重链恒定区包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
59.如权利要求27-58中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约1nM的KD或以如与所包含的结合PD-L1的抗原结合位点相比相当或更低的KD结合人PD-L1。
60.如权利要求27-59中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约0.5nM或小于约0.1nM的KD结合PD-L1。
61.如权利要求27-60中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过ELISA所测量，以小于约0.4nM的EC50结合PD-L1。
62.如权利要求27-61中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白与PD-1竞争结合PD-L1或者抑制PD-L1与PD-1的结合。
63.如权利要求27-62中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白抑制PD-L1与PD-1的结合。
64.如权利要求27-30和38-63中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约100nM、小于约80nM、小于约50nM、小于约10nM，或小于约5nM的KD结合IL-2Rβ。
65.如权利要求27-30和38-64中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约65nM或小于约50nM的KD结合IL-2Rβ。
66.如权利要求27-30和38-65中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过SPR所测量，以小于约40nM的KD结合IL-2Rα。
67.如权利要求27-30和38-66中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过ELISA所测量，以小于约1nM的EC50结合IL-2Rα。
68.如权利要求27-30和38-67中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如通过ELISA所测量，以小于约5nM、小于约2.5nM、小于约1.5nM、小于约1nM或小于约0.6nM的EC50结合IL-2Rβ。
69.如权利要求27-68中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白诱导免疫细胞中的p-STAT5表达。
70.如权利要求27-69中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如在经分离的人外周血单核细胞(PBMC)中所测量，以小于约1nM、小于约0.6nM或小于约0.1nM的EC50诱导免疫细胞中的p-STAT5表达，并且其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或Treg细胞。
71.如权利要求27-70中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如在经分离的PBMC中所测量，以小于约0.5nM或小于约0.1nM的EC50诱导免疫细胞中的p-STAT5表达，并且其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或Treg细胞。
72.如权利要求27-71中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白如在小鼠脾细胞中所测量诱导免疫细胞中的p-STAT5表达，并且其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或Treg细胞。
73.如权利要求27-72中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白抑制体内肿瘤生长。
74.如权利要求27-73中任一项所述的双功能蛋白，其中所述双功能蛋白诱导体内免疫细胞增殖。
75.如权利要求74所述的双功能蛋白，其中所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。
76.如权利要求75所述的双功能蛋白，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
77.一种包含VH和VL的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:87的多肽序列，并且所述VH包含SEQ ID NO:88的多肽序列。
78.如权利要求77所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:181的多肽序列。
79.一种经分离的多核苷酸，其编码权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白或权利要求77或78所述的抗体。
80.一种表达载体，其包含权利要求79所述的多核苷酸。
81.一种经修饰的细胞，其包含权利要求79所述的经分离的多核苷酸或权利要求80所述的表达载体。
82.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白或权利要求77或78所述的抗体，以及药学上可接受的载剂。
83.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、如权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、如权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白，或如权利要求77或78所述的抗体，其用于调节有需要的受试者的免疫响应的方法。
84.如权利要求83所述的方法，其中调节所述免疫响应包括增强T细胞活性或增强NK细胞活性中的至少一者。
85.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、如权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、如权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白，或如权利要求77或78所述的抗体，其用于治疗有需要的受试者的疾病的方法。
86.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、如权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、如权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白，或如权利要求77或78所述的抗体，其用于根据权利要求85使用，其中所述疾病包括癌症。
87.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、如权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、如权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白，或如权利要求77或78所述的抗体，其用于根据权利要求86使用，其中所述癌症包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌或黑色素瘤。
88.如权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、如权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、如权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白，或如权利要求77或78所述的抗体，其用于根据权利要求83-87中任一项使用，其中所述受试者用另外的治疗剂治疗。
89.一种调节有需要的受试者的免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白，或权利要求77或78所述的抗体，或它们的药物组合物。
90.如权利要求89所述的方法，其中调节所述免疫响应包括以下中的至少一者：增强效应T细胞活性、增强NK细胞活性和压制调控性T细胞活性。
91.一种治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的抗原结合位点、权利要求11-26中任一项所述的蛋白质、权利要求27-76中任一项所述的双功能蛋白，或权利要求77或78的抗体，或它们的药物组合物。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述疾病为癌症。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌或黑色素瘤。
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