CN107207609B - 共同轻链和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开一般涉及用于T细胞活化和重新定向到特定靶细胞的包含共同轻链的新的双特异性抗原结合分子。此外，本公开涉及编码这种双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含这种多核苷酸的载体和宿主细胞。本公开还涉及用于产生本公开的双特异性抗原结合分子的方法以及在疾病治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。

Description

共同轻链和使用方法
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且通过引用将其整体并入本文。所述的ASCII副本创建于2015年11月10日，名称为32398_SL.txt，大小为537,667字节。
发明领域
本发明一般涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。此外，本发明涉及编码这种双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含这种多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的方法以及在疾病治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。
背景
在各种临床环境中，常常期望单个细胞或特定细胞类型的选择性破坏。例如，癌症治疗的主要目标是特异性地破坏肿瘤细胞，同时保持健康的细胞和组织完好无损。
实现这一点的有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使免疫效应细胞如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击和破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有效的效应细胞，但是它们不能被常规治疗性抗体的Fc结构域介导的效应机制激活。
在这方面，双特异性抗体在最近几年已经变得有兴趣，其被设计为将一个“臂”与靶细胞上的表面抗原结合，第二个“臂”与T细胞受体(TCR)复合体的活化性不变组分结合。这种抗体同时结合其两个靶标，迫使靶细胞和T细胞之间暂时相互作用，引起任何细胞毒性T细胞的激活和靶细胞随后的裂解。因此，免疫应答被重新定向到靶细胞，并且独立于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性，所述靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性对于CTL的正常MHC限制性活化是相关的。在这种情况下，至关重要的是，当双特异性抗体结合靶细胞和CTL(即模拟免疫突触)时，CTL才被激活。特别期望的是不需要淋巴细胞预处理或共刺激以引发靶细胞的有效裂解的双特异性抗体。
已经开发了几种双特异性抗体形式，并研究了它们对T细胞介导的免疫治疗的适用性。在这些中，所谓的BiTE(双特异性T细胞衔接器)分子已经被很好地表征，并且已经在临床上显示了一些希望(在Nagorsen and
Figure BDA0001351705530000021
Exp Cell Res 317,1255-1260(2011)中综述)。BiTE是串联scFv分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合。评估T细胞衔接的其他双特异性形式包括双抗体(Holliger et al.,Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，例如串联双抗体(Kipriyanov et al.,J Mol Biol 293,41-66(1999))。最近的发展是所谓的DART(双重亲和力再靶向)分子，其基于双抗体形式，但特征是用于额外稳定化的C末端二硫键(Moore et al.,Blood 117,4542-51(2011))。所谓的Triomab是全杂合小鼠/大鼠IgG分子，目前正在临床试验中进行评估，代表较大尺寸的形式(参见Seimetz et al.,CancerTreat Rev 36,458-467(2010))。
正在开发的多种形式显示了归因于免疫治疗中T细胞重新定向和激活的巨大潜力。然而，产生适合其的双特异性抗体的任务绝不是微不足道的，而是涉及必须满足与抗体的功效，毒性，适用性和生产能力有关的许多挑战。
小的构建体，例如BiTE分子-尽管能够有效地交联效应细胞和靶细胞–但是具有非常短的血清半寿期，需要它们通过连续输注施用于患者。另一方面，IgG样的形式虽然具有长半寿期的巨大好处–但是遭受IgG分子固有的天然效应子功能有关的毒性。它们的免疫原性潜力构成IgG样双特异性抗体，特别是非人类形式抗体用于成功的治疗开发的另一个不利特征。最后，双特异性抗体的总体发展中的主要挑战是以临床足够量和纯度生产双特异性抗体构建体，由于在共表达时不同特异性的抗体重链和轻链的错配，降低正确组装的构建体的产量并导致许多非功能性副产物，期望的双特异性抗体可能难以与所述副产物分离。
鉴于与目前可用于T细胞介导的免疫治疗的双特异性抗体相关的困难和缺点，仍然需要这种分子的新的改进的形式。
发明概述
在第一方面，本发明提供了包含第一和第二抗原结合部分的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合部分包含第一轻链，并且其中所述第一抗原结合部分能够特异性结合活化T细胞抗原并且第二抗原结合部分包含第二轻链，其中第二抗原结合部分能够与靶细胞抗原特异性结合，其中第一和第二轻链的氨基酸序列是相同的。在一个实施方案中，第一抗原结合部分是Fab。在一个实施方案中，第二抗原结合部分是Fab。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合部分是Fab。
一方面，本发明提供了一种T细胞活化双特异性抗原结合分子，其包含第一和第二抗原结合部分，其中之一是能够与活化T细胞抗原特异性结合的Fab分子，另一个是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，其中第一和第二Fab分子具有相同的VLCL轻链。
在一个实施方案中，所述T细胞活化双特异性抗原结合分子还包含由能够稳定结合的第一和第二亚基组成的Fc结构域。
在一个实施方案中，所述T细胞活化双特异性抗原结合分子包含轻链，其包含SEQID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的轻链CDR。
在一个实施方案中，所述T细胞活化双特异性抗原结合分子包含含有SEQ ID NO:31的轻链。
在一个实施方案中，能够特异性结合活化T细胞抗原的Fab分子包含重链，其包含SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39的重链CDR。
在特定的实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子中存在不超过一个能够与活化T细胞抗原特异性结合的抗原结合部分(即T细胞活化双特异性抗原结合分子提供与活化T细胞抗原的单价结合)。
在一些实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合部分任选地经由肽接头彼此融合。在一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在另一个这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。在另一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab轻链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端。在又一个这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab轻链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab轻链的N末端。在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一个或第二个亚基的N末端。
在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在另一个实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的一个亚基的N末端。
在某些实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子包含第三抗原结合部分，其是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。在一个实施方案中，所述第三抗原结合部分是包含与第一和第二抗原结合部分相同的VLCL轻链的Fab分子。
在一个这样的实施方案中，第一，第二和第三抗原结合部分各自为包含SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的轻链CDR的Fab分子。
在一个这样的实施方案中，第一，第二和第三抗原结合部分各自是包含含有SEQID NO:31的轻链的Fab分子。
在一个实施方案中，第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。在一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合分子的第二和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的一个亚基的N末端，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。在另一个具体实施方案中，T细胞活化抗原结合分子的第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的一个亚基的N末端，以及第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。T细胞活化双特异性抗原结合分子的组分可以直接融合或通过合适的肽接头融合。在一个实施方案中，第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的一部分。在一个实施方案中，第一和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的一部分。在一个具体实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在更具体的实施方案中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。
在一个具体的实施方案中，Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一具体实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域。在更具体的实施方案中，Fc结构域是包含氨基酸取代S228P的IgG4Fc结构域。在甚至更具体的实施方案中，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P(SPLE)的IgG4Fc结构域。在特定实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。
在具体实施方案中，Fc结构域包含促进第一和第二Fc结构域亚基的缔合的修饰。在具体的这样的实施方案中，Fc结构域的第一个亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，其可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中。
在一个特定的实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，Fc结构域显示降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在某些实施方案中，与未工程化的Fc结构域相比，将Fc结构域工程化为具有对Fc受体降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个实施方案中，Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，Fc结构域中减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代位于选自L234，L235和P329(Kabat编号)的一个或多个位置。在具体实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的三个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是L234A，L235A和P329G。在一个这样的实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域，特别是人IgG1Fc结构域。在其它实施方案中，Fc结构域的每个亚基包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的两个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为L235E和P329G。在一个这样的实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域，特别是人IgG4Fc结构域。
在一个实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在具体实施方案中，Fc受体是人FcγRIIa，FcγRI和/或FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一个具体实施方案中，双特异性抗原结合分子能够结合的活化T细胞抗原是CD3。在其他实施方案中，双特异性抗原结合分子能够结合的靶细胞抗原是肿瘤细胞抗原。在一个实施方案中，靶细胞抗原选自:叶酸受体1(FolR1)，粘蛋白-1(MUC1-1)和B细胞成熟抗原(BCMA)。在一个具体实施方案中，靶细胞抗原不是BCMA。
另一方面，本发明提供了包含用于T细胞活化双特异性抗原结合分子的SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链，用于产生T细胞活化双特异性抗原结合分子的文库。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的分离的多肽。
另一方面，本发明提供了包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的分离的多肽。
根据本发明的另一方面，提供了编码本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。本发明还包括由本发明的多核苷酸编码的多肽。本发明还提供了包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体和包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。
在另一方面，提供了一种制备本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的方法，包括以下步骤:a)在适于表达T细胞活化双特异性抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及b)回收T细胞活化双特异性抗原结合分子。本发明还包括通过本发明的方法制备的T细胞活化双特异性抗原结合分子。
本发明还提供了包含本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还包括使用本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子和药物组合物的方法。一方面，本发明提供了用作药物的T细胞活化双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物。在一个方面，提供了一种用于治疗有需要的个体中的疾病的根据本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子或药物组合物。在具体实施方案中，该疾病是癌症。
还提供了本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子在制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药物中的用途；以及治疗个体疾病的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的药学上可接受的形式的包含本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的组合物。在具体实施方案中，该疾病是癌症。在任何上述实施方案中，个体优选是哺乳动物，特别是人。
本发明还提供诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，包括在T细胞，特别是细胞毒性T细胞存在下使靶细胞与本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子接触。
另一方面，本发明提供了用于鉴定用于T细胞活化抗原和靶细胞抗原特异性的双特异性抗原结合分子的可变重链的方法，其包括以下步骤:筛选包含可变重链与包含SEQID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链的组合文库。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
附图简述
图1A-I图解了本文公开的T细胞活化双特异性抗原结合分子(TCB)的示例性构型。(图1I)中除κ-λ形式之外的所有构建体都具有P329G LALA突变，并且包含具有旋钮入孔(knob-into-hole)修饰的旋钮入孔Fc片段。(图1A)“FolR1 TCB 2+1倒置(共同轻链)”的图示。将FolR1结合剂在Fab重链的C末端融合到包含旋钮修饰的Fc结构域的第一个亚基的N末端。这些构建体不是杂交的并且具有三倍相同VLCL轻链。(图1B)“FolR1 TCB 1+1头对尾(共同轻链)”的图示。这些构建体不被杂交并且具有两倍相同VLCL轻链。(图1C)“FolR1 TCB 1+1经典(共同轻链)”的图示。这些构建体不被杂交并且具有两倍相同的VLCL轻链。(图1D)“FolR1 TCB 2+1经典(共同轻链)”的图示。将CD3结合剂在Fab重链的C末端融合到包含旋钮修饰的Fc结构域的第一个亚基的N末端。这些构建体不是杂交的并且具有三倍相同的VLCL轻链。(图1E)“FolR1 TCB 2+1 crossfab经典”的图示。这些构建体包含用于CD3结合剂的Ck-VH链，而不是常规CH1-VH链。将CD3结合剂在Fab重链的C末端融合到包含旋钮修饰的Fc结构域的第一个亚基的N末端。(图1F)“FolR1 TCB 2+1 crossfab倒置”的图示。这些构建体包含用于CD3结合剂的Ck-VH链，而不是常规CH1-VH链。将FolR1结合剂在Fab重链的C末端融合到包含旋钮修饰的Fc结构域的第一个亚基的N末端。(图1G)“FolR1 TCB 1+1 crossfab头对尾”的图示。这些构建体包含用于CD3结合剂的Ck-VH链，而不是常规CH1-VH链。(图1H)“FolR1 TCB 1+1 crossfab经典”的图示。这些构建体包含用于CD3结合剂的Ck-VH链，而不是常规CH1-VH链。图1I图解CD3/FolR1κ-λ抗体形式。这些构建体包含杂交的共同轻链VLCH1和对CD3特异的一个杂交的VHCL链和对FolR1特异的一个杂交的VHCL链。
图2A-C描绘了总结FoLR1 IgG结合剂与HeLa细胞的结合的图。通过流式细胞术测定新产生的FolR1结合剂对HeLa细胞上表达的FolR1的结合。用荧光标记的抗人二级抗体检测结合的抗体。
图3A-B描述了总结FolR1结合剂对FolR1的特异性的图。通过流式细胞术分析FolR1 IgG与用FolR1或FolR2瞬时转染的HEK细胞的结合，以鉴定与FolR1特异性结合而不与FolR2特异性结合的克隆。用荧光标记的抗人二级抗体检测抗体。
图4A-B描绘了总结FolR1结合剂与cyFoLR1的交叉反应性的图。通过流式细胞术，在用cyFolR1瞬时转染的HEK细胞上处理FolR1抗体对cyno FolR1的交叉反应。用荧光标记的抗人二级抗体检测抗体。
图5描述了结合后FolR1 TCB的内化的图。在HeLa细胞上检测到与FolR1结合后的四种FolR1 TCB的内化。在37℃温育的指定时间点后，用荧光标记的抗人二级抗体检测表面上剩余的FolR1 TCB。计算内化百分比。
图6A-E描绘了总结FolR1 IgG与具有不同FolR1表达水平的细胞结合的图。通过流式细胞术分析9D11,16D5和Mov19 IgG与具有不同FolR1表达水平的肿瘤细胞的结合。包括DP47 IgG作为同种型对照，MKN-45被包括作为FolR1阴性细胞系。用荧光标记的抗人二级抗体检测抗体。
图7A-L描绘了总结T细胞介导的HT-29和SKOV3细胞杀伤的图。FolR1 TCB用于测试HT-29和SKOV3肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤，并在杀伤时T细胞上活化标记的上调。(图7A-D)在24h和48h后通过LDH释放测量在9D11 FolR1 TCB和16D5 FolR1 TCB存在下HT-29和SKOV3细胞的T细胞介导的杀伤。包括DP47 TCB作为阴性对照。温育48小时后，在杀死SKOV3(图7E-H)或HT-29(图7I-L)肿瘤细胞后，通过流式细胞术评估在CD8 T细胞和CD4 T细胞上活化标记CD25和CD69的上调。
图8显示了不存在抗-FluR1与红细胞结合的图。将红细胞门控为CD235a阳性群体，并通过流式细胞术测定9D11 IgG,16D5 IgG,Mov19 IgG和DP47 IgG与该群体的结合。用荧光标记的抗人二级抗体检测抗体。
图9A-D描绘了总结全血中活化标记上调的图。加入9D11 FolR1 TCB,16D5 FolR1TCB,Mov19 FolR1 TCB和DP47 TCB1后24h通过流式细胞术分析CD4 T细胞和CD8 T细胞的CD25和CD69活化标记上调。
图10 9D11 TCB a-glyco变体与HeLa细胞的结合。将9D11 FolR1 TCB a-glyco变体与Hela细胞的结合与HeLa细胞上原始9D11 TCB的结合进行了比较。用荧光标记的抗人二级抗体检测抗体，并通过流式细胞术测定结合。
图11A-F描绘了总结用肿瘤细胞的9D11 FolR1 TCB a-glyco变体进行T细胞介导的杀伤的图。9D11 FolR1 TCB a-glyco变体用于测试与原来的9D11 FolR1 TCB杀伤相比，SKOV3(图11A-D)，MKN-45(作为FolR1阴性对照)和(图11E-F)HT-29肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤。使用24h和48h后的读出LDH释放。
图12A-X描绘了总结原代上皮细胞的T细胞介导的杀伤的图。具有非常低水平的FolR1的原代上皮细胞用于测试16D5 FolR1 TCB和9D11 FolR1 TCB的T细胞介导的杀伤，DP47 TCB作为阴性对照，包括HT29细胞作为阳性对照。(图12A-H)在24小时和48小时后测定人视网膜色素(HRP)，人肾皮层(HRC)，人支气管(HB)和HT29细胞的LDH释放。48小时后通过流式细胞术测定(图12I-L)HRP，(图12M-P)HRC，(图12Q-T)HB和(图12U-X)HT29的杀伤时CD4T细胞和CD8T细胞上的CD25和CD69活化标记上调。
图13A-C显示了具有16D5的不同TCB形式的比较。在图13A中比较了含有FolR1结合剂16D5的四种不同的TCB形式与HeLa细胞的结合，图14B中，24小时48小时后SKOV3细胞的T细胞介导的杀伤，图14C中，杀伤后48小时在CD4T细胞和CD8T细胞上CD25和CD69活化标记的上调。
图14A-C描绘了具有9D11的不同TCB形式的比较。在A)与HeLa细胞的结合，B)在24小时和48小时后SKOV3细胞的T细胞介导的杀伤以及C)杀伤后48小时CD4 T细胞和CD8 T细胞上CD25和CD69活化标记上调中比较了含有FolR1结合剂9D11的三种不同的TCB形式。
图15描述了三种不同剂量的FOLR1 TCB在NOG小鼠中的PK-谱。
图16说明了使用FOLR1 TCB进行功效研究的实验方案。
图17A-B描绘肿瘤生长曲线。(图17A)不同治疗组中肿瘤体积的平均值和SEM。(图17B)所有治疗组中单个小鼠的肿瘤生长。TGI(肿瘤生长抑制)给出了与载体组相比平均肿瘤体积的百分比。
图18显示研究终止时的肿瘤重量。
图19A-B显示在研究第32天肿瘤浸润T细胞的FACS分析。(图19A)用抗人CD3/CD4/CD8染色并通过流式细胞术进行分析的肿瘤单细胞悬液。(图19B)不同治疗组中每毫克肿瘤组织的T细胞计数的平均值和SEM。
图20A-B显示了研究第32天T细胞活化/脱粒和细胞因子分泌的FACS分析。CD4+(图20A)和CD8+(图20B)肿瘤浸润性T细胞为细胞因子，活化和脱粒标记物染色。显示了不同治疗组中每毫克肿瘤组织的T细胞计数的平均值和SEM。
图21A-B显示肿瘤裂解百分比。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下将SKOV3细胞与PBMC一起温育。24小时(图21A)和48小时后(图21B)，通过测量LDH释放来测定肿瘤细胞的杀伤。
图22A-D显示CD4T细胞上的CD25和CD69上调。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下将SKOV3细胞与PBMC一起温育。48小时后，通过流式细胞术测量CD4 T细胞(图22A-B)和CD8 T细胞(图22C-D)上的CD25和CD69上调。
图23A-B显示肿瘤裂解百分比。24小时(图23A)和48小时(图23B)的温育(E:T＝10:1，效应子人PBMC)后，通过36F2 TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB诱导的SKov-3细胞(培养基FolR1)的T细胞杀伤。
图24A-C显示了由Hela(高FolR1)(图24A)，Skov-3(中FolR1)(图24B)和HT-29(低FolR1)(图24C)人肿瘤细胞(E:T＝10:1，效应子人PBMC，温育时间24小时)的36F2 TCB,16D5TCB,16D5 TCB经典，16D5 TCB 1+1和16D5 TCB HT诱导的T细胞杀伤。DP47 TCB被包括在内作为非结合对照。
图25A-C显示在通过36F2 TCB,16D5 TCB和DP47 TC(非结合对照)诱导的Hela细胞(高FolR1)(图25A)，SKov-3细胞(中等FolR1)(图25B)和HT-29细胞(低FolR1)(图25C)(E:T＝10:1,48小时温育)的T细胞介导的杀伤后，人CD8+(图25A，B)和CD4+(图25C)T细胞上CD25和CD69的上调。
图26A-F显示24小时(图26A,C,E)和48小时(图26B，D，F)温育(E:T＝10:1，效应子人PBMC)后，人肾皮质上皮细胞(图26A，B)，人视网膜色素上皮细胞(图26C，D)和HT-29细胞(图26E，F)的36F2 TCB,16D5 TCB和DP47 TCB诱导的T细胞杀伤。
图27描绘了总结了在各种正常和癌细胞系上FolR1结合位点的定量的表。
图28A-B显示了16D5 TCB及其相应的CD3去酰胺化变体16D5 TCB N100A和16D5TCB S100aA和9D11 TCB及其去酰胺化变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA与在Jurkat细胞上表达的人CD3的结合。
图29A-B显示了由16D5 TCB及其相应的CD3去酰胺化变体16D5 TCB N100A和16D5TCB S100aA(图29A)和9D11 TCB及其去酰胺化变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA(图29B)诱导的SKov-3(中等FolR1)人肿瘤细胞的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应子人PBMCs，温育时间24小时)。DP47 TCB作为非结合对照包括在内。
图30A-B显示由16D5 TCB及其相应的CD3去酰胺化变体16D5 TCB N100A和16D5TCB S100aA(图30A)和9D11 TCB及其去酰胺化变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA(图30B)诱导的HT-29(低FolR1)人肿瘤细胞的T细胞杀伤(E:T＝10:1，效应子人PBMCs，温育时间24小时)。DP47 TCB作为非结合对照包括在内。
图31显示3个鉴定的MUC1特异性结合剂的VH结构域的序列比对。所有三个克隆都是IGHV3-23种系(SEQ ID NO:136)的衍生物。克隆58D6(SEQ ID NO:60)和110A5(SEQ IDNO:64)源自仅在CDR3中随机化的文库，而从在所有3个CDR中随机化的文库中鉴定到克隆106D2(SEQ ID NO:62)。偏离种系序列的CDR1和2中的位置以斜体印刷。
图32A-B显示了CLC结合剂的表征结果。(图32A)SPR分析。3个特异性结合MUC1的克隆的基于SPR的动力学分析。平滑线代表数据对1:1交互作用模型的全局拟合。(图32B)动力学和热力学参数的总结。
图33描绘了生成的TCB构建体的示意图。CLC TCB构建体由3种不同的免疫球蛋白链组成:1)在Fc部分中含有“孔突变”并含有靶特异性VH结构域的IgG重链；2)由靶特异性VH和CH1结构域，随后是CD3特异性VH结构域和CH1结构域，随后是含有“旋钮”突变的Fc部分组成的Ig链；和3)与MUC1特异性和CD3特异性序列同时退火的共同轻链。
图34A-B描述了产生的MUC1特异性TCB的纯化和分析表征(图34A和图34B)。纯化方法涉及亲和步骤(蛋白A)，然后进行大小排阻层析法(Superdex 200，GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析(Superdex 200柱)和毛细管电泳分析和表征最终产物。
图35描述了TCB形式的MUC1特异性结合剂的SPR分析。显示了不同浓度(见文字)的两种MUC1特异性TCB与MUC1或无关抗原的结合。平滑线代表数据对1:1交互作用模型的全局拟合。
图36A-G描绘了仅包含如下所述的具有或不具有Fc部分的Fab片段(CD3和BCMA特异性的)的双特异性二价和三价抗体:(A)Fab BCMA-Fc-Fab CD3；(B)Fab BCMA-Fc-FabCD3-Fab BCMA；(C)Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3；(D)Fc-Fab CD3-Fab BCMA；(E)Fc-FabBCMA-Fab CD3；(F)Fab CD3-Fab BCMA-Fab BCMA；(G)Fab CD3-Fab BCMA。优选地，Fab CD3和Fab BCMA的LC是相同的(共同LC)，以避免LC错配并减少副产物。Fab CD3和Fab BCMA通过柔性接头相互连接。
图37描述了通过表面等离振子共振(SPR)检测到的BCMA IgG抗体与TACI受体的结合的缺乏。曲线1对应于参考通道上的信号，曲线2对应于发生结合的通道(结合通道)，曲线2-1是扣除的信号(结合通道-参考通道)，这意味着这是由于结合事件的信号。SPR结合测定清楚地证明pSCHLI372 IgG不结合人TACI受体。
图38A-C示出了BCMA-TCB CLC的生产和纯化。应用于(A)pSCHLI333-TCB CLC,(B)pSCHLI372-TCB CLC,(C)pSCHLI373-TCB CLC的蛋白A(PA)亲和层析和大小排阻层析(SEC)纯化步骤后最终蛋白制剂的CE-SDS图(非还原(顶部)和还原的(底部))。所有三种分子都是如图36B所述的分子形式。
图39A-B显示通过流式细胞术，BCMA-TCB CLC抗体在BCMAhi-阳性H929细胞上的结合。将BCMA-TCB CLC抗体的荧光强度中值作为抗体浓度(0.12到500nM)的函数作图；(A)H929细胞(A)和MKN45细胞(B)上的pSCHLI372-TCB CLC和pSCHLI373-TCB CLC。DP47-TCB是阴性对照TCB，其浓度低于100nM时不结合BCMA(参见实施例7)。
图40A-B显示如通过流式细胞术测量的CD3阳性Jurkat T细胞上BCMA-TCB CLC抗体的结合。BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI372-TCB CLC和pSCHLI373-TCB CLC)与Jurkat T细胞结合的荧光强度中值，并作为抗体浓度的函数作图。在低于100nM的浓度下不结合BCMA阴性和CD3阴性的MKN45细胞。
图41显示了通过流式细胞术检测的在H929细胞存在下BCMA-TCB CLC抗体介导的T细胞活化。在温育48小时后CD4+和CD8+T细胞上早期活化标记CD69和晚期活化标记CD25的表达水平。pSCHLI372-TCB CLC和pSCHLI373-TCB CLC抗体在BCMA阳性靶细胞存在下以浓度依赖性和特异性方式诱导CD69和CD25活化标记的上调。E:T比例用作10个PBMC:1个H929细胞；在测量CD69和CD25上调之前将细胞温育48小时。作为阴性对照TCB的DP47-TCB不诱导T细胞活化。代表性的结果来自两次独立实验。
图42A-B显示如通过比色LDH释放测定法检测的，BCMA-TCB CLC抗体诱导BCMAhi-阳性H929骨髓瘤细胞的T细胞重定向的杀伤。如通过LDH释放测量，BCMA-TCB CLC抗体pSCHLI372-TCB CLC(A,B)和pSCHLI373-TCB CLC(A)诱导BCMAhi阳性H929骨髓瘤细胞的浓度依赖性杀伤。作为不与BCMA结合而仅与CD3结合的阴性对照TCB的DP47-TCB不诱导H929细胞杀伤。E:T比例用作10个PBMCs:1个H929细胞；在测量LDH释放前，将细胞温育24小时。代表性的结果来自三次独立实验。
图43显示如通过比色LDH释放测定法检测的，BCMA-TCB CLC抗体诱导BCMAmed/lo-阳性U266骨髓瘤细胞的T细胞重定向杀伤。如通过LDH释放测量，BCMA-TCB CLC抗体pSCHLI372-TCB CLC和pSCHLI373-TCB CLC诱导BCMAmed/lo-阳性U266骨髓瘤细胞的浓度依赖性杀伤。作为不与BCMA结合而仅与CD3结合的阴性对照TCB的DP47-TCB不诱导H929细胞杀伤。E:T比例用作10个PBMC:1个U266细胞；在测量LDH释放前，将细胞温育24小时。代表性的结果来自两次独立实验。
发明详述
定义
本文中如本领域通常使用的使用术语，除非在下文中另有定义。
如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是免疫球蛋白和其衍生物，例如，片段。
术语“双特异性”是指抗原结合分子能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对于不同的抗原决定簇是特异性的。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，特别是在两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。
本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在特定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原的单价结合”表示在抗原结合分子中存在一个(且不超过一个)抗原特异性的抗原结合位点。
“抗原结合位点”是指提供与抗原相互作用的抗原结合分子的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基。天然免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。
如本文所用，术语“抗原结合部分”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合部分能够将其连接的实体(例如第二抗原结合部分)导向靶位点，例如导向具有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合部分能够通过其靶抗原(例如T细胞受体复合体抗原)活化信号传导。抗原结合部分包括本文进一步定义的抗体及其片段。具体的抗原结合部分包括抗体的抗原结合结构域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合部分可以包含如本文进一步限定和本领域已知的抗体恒定区。有用的重链恒定区包括以下五种同种型中的任何一种:α，δ，ε，γ或μ。有用的轻链恒定区包括以下两种同种型中的任一种:κ和λ。
如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构型)，抗原结合部分结合所述位点，形成抗原结合部分-抗原复合体。有用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞表面，病毒感染细胞表面，其他患病细胞表面，免疫细胞表面上，血清中游离存在和/或细胞外基质(ECM)中。称为本文抗原的蛋白质(例如MCSP，FAP，CEA，EGFR，CD33，CD3)可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，所述脊椎动物来源包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另有说明。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在本文中提及特定蛋白质的情况下，该术语包括“全长”，未加工的蛋白质以及细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。该术语还包括蛋白质的天然存在的变体，例如,剪接变体或等位基因变体。可用作抗原的示例性人蛋白包括但不限于叶酸受体1(FolR1，叶酸受体α(FRA)；叶酸结合蛋白(FBP)；人FolR1 UniProt号:P15328；小鼠FolR1 UniProt号:P35846；食蟹猴FolR1 UniProt no.:G7PR14),粘蛋白-1(MUC1),和B细胞成熟抗原(BCMA)和CD3，特别是CD3的ε亚基(对于人序列参见UniProt no.P07766(版本130))，NCBI RefSeqno.NP_000724.1；或对于食蟹猴[Macaca fascicularis]序列参见UniProt no.Q95LI5(版本49),NCBI GenBank no.BAB71849.1)。
在某些实施方案中，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子与来自不同物种的活化T细胞抗原或靶抗原之间保守的活化T细胞抗原或靶细胞抗原的表位结合。
“特异性结合”是指结合对抗原具有选择性，并且可以区别于不需要的或非特异性的相互作用。抗原结合部分结合特异性抗原决定簇的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量，例如，表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))和常规结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中，抗原结合部分与不相关蛋白的结合程度小于例如通过SPR测量的抗原结合部分与抗原的结合的约10％。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合部分或包含该抗原结合部分的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM的解离常数(KD)(例如10-8M或更小，例如10-8M到10-13M,例如10-9M到10-13M)。
“亲和性”是指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗原结合部分和抗原，或受体及其配体)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以通过解离常数(KD)来表示，解离常数(KD)是解离和结合速率常数的比率(分别为koff和kon)。因此，只要速率常数的比率保持相同，等效亲和力可以包括不同的速率常数。可以通过本领域已知的成熟方法(包括本文所述的方法)测量亲和力。用于测量亲和力的特定方法是表面等离振子共振(SPR)。
“减少的结合”，例如减少的与Fc受体的结合，是指例如通过SPR测量的对相应的相互作用的亲和力减少。为了清楚起见，该术语还包括将亲和力降低至零(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“增加的结合”是指相应相互作用的结合亲和力的增加。
本文所用的“活化T细胞抗原”是指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原决定簇，其能够在与抗原结合分子相互作用时诱导T细胞活化。具体地，抗原结合分子与活化T细胞抗原的相互作用可以通过触发T细胞受体复合体的信号级联来诱导T细胞活化。在一个具体实施方案中，活化T细胞抗原是CD3。
本文所用的“T细胞活化”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自:增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性和活化标记物的表达。本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。用于测量T细胞活化的合适的测定法是本文所述的领域中已知的。
本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面的抗原决定簇，例如肿瘤如癌细胞或肿瘤基质中的细胞。
如本文所用，关于抗原结合部分等，术语“第一”和“第二”用于在多于一种每种类型的部分的情况下方便区分。这些术语的使用并不旨在赋予T细胞活化双特异性抗原结合分子的特定顺序或取向，除非明确如此陈述。
本文所用的术语“BCMA”涉及人B细胞成熟靶，也称为BCMA；TR17_HUMAN，TNFRSF17(UniProt Q02223)，其是在分化的浆细胞中优先表达的肿瘤坏死受体超家族的成员。BCMA的细胞外结构域由根据UniProt的氨基酸1-54(或5-51)组成。本文所用的术语“针对BCMA的抗体，抗BCMA抗体”是指与BCMA特异性结合的抗体。
本文所用的术语“CD3ε或CD3”涉及UniProt P07766(CD3E_HUMAN)下描述的人CD3ε。术语“针对CD3的抗体，抗CD3抗体”涉及与CD3ε结合的抗体。
“Fab分子”是指由免疫球蛋白的重链的VH和CH1结构域(“Fab重链”)和轻链的VL和CL结构域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。术语“具有相同VLCL轻链的Fab分子”是指共享一个轻链但仍具有单独特异性的结合剂。本发明的T细胞活化双特异性分子包含至少两个具有相同VLCL轻链的Fab分子。相应的重链被重塑并分别赋予对T细胞活化双特异性抗原和靶细胞抗原的特异性结合。
“融合的”是指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)通过肽键直接或通过一个或多个肽接头连接。
本文所用的术语“共同轻链”是指在双特异性或多特异性分子内轻链与多于一个重链或其片段配对而形成至少第一和第二抗原结合位点，例如Fab，每个对不同的抗原特异。例如，共同轻链与抗原结合分子内第一重链或其片段配对以形成对肿瘤抗原特异性的第一结合位点，以及共同轻链的另一拷贝与抗原结合分子内的第二重链或其片段配对而形成对T细胞活化抗原(例如CD3)特异的第二结合位点。
术语“免疫球蛋白分子”是指具有天然存在抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成。从N到C末端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)，也称重链恒定区。类似地，从N到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，随后是恒定轻(CL)结构域，也称为轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以分配为五种类型之一，称为α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG),或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以分配为两种类型之一，称为κ和λ。免疫球蛋白基本上由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc结构域组成。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分与完整抗体结合的抗原结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2,双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)和单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。有关scFv片段的综述，请参见Plückthun,inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；另见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双抗体是具有可能是二价或双特异性的两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,NatMed 9,129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三抗体和四抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分抗体轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
术语“抗原结合结构域”是指包含与抗原的部分或全部特异性结合并与其互补的区域的抗体部分。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。特别地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,KubyImmunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列中是高变的，和/或形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1，H2，H3)，VL中三个(L1，L2，L3)。HVR通常包含来自高变环和/或互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。除了VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语在本文可互换地用于指形成抗原结合区的可变区的部分。Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)和Chothia et al.,J Mol Biol 196:901-917(1987)中描述了该特定区域，其中当相互比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指抗体的CDR或其变体时，意图在本文定义和使用的术语的范围内。作为比较，在下述表A中列出了包含上述引用的各参考文献中定义的CDR的合适的氨基酸残基。涵盖特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列时，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
表A.CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中所有CDR定义的编号根据Kabat等人提出的编号惯例(见下文)。
2表A中使用的具有小写“b”的“AbM”是指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以将这个“Kabat编号”系统明确地分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)提出的编号系统。除非另有说明，抗体可变区中特定氨基酸残基位置编号的提及是根据Kabat编号系统。
序列表的多肽序列不是根据Kabat编号系统编号的。然而，本领域技术人员能够将序列表的序列编号转换为Kabat编号。
“构架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成:FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以VH(或VL)中以下列顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体:IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。
本文中术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可能略有变化，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可能存在或不存在。除非另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU指数，如Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。本文所用的Fc结构域的“亚基”是指形成二聚Fc结构域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽，其能够稳定的自身结合。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。
“促进Fc结构域的第一个和第二个亚基的结合的修饰”是肽骨架的操作或Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或阻止包含Fc结构域亚基的多肽与相同的多肽结合以形成同二聚体。本文所用的促进结合的修饰特别包括对期望结合的两个Fc结构域亚基(即，Fc结构域的第一和第二亚基)中的每一个进行单独的修饰，其中所述修饰彼此互补以促进两个Fc结构域亚基的结合。例如，促进结合的修饰可以改变一个或两个Fc结构域亚基的结构或电荷，以使其结合分别在空间上或静电上是有利的。因此，(异)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，在与每个亚基(例如抗原结合部分)融合的其他组分不相同的意义上，所述多肽可能是不相同的。在一些实施方案中，促进结合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个具体实施方案中，促进结合的修饰包括在Fc结构域的两个亚基的每个中的单独的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。
术语“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，通过抗原呈递细胞的免疫复合体介导的抗原摄取，细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞活化。
如本文所用，术语“工程化，工程化的”被认为包括肽骨架的任何操作或天然存在或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括氨基酸序列，糖基化模式或单个氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。
本文所用的术语“氨基酸突变”意在包括氨基酸取代，缺失，插入和修饰。只要最终构建体具有所需的特征，例如与Fc受体的结合减少，或与另一个肽的增加的结合，就可以进行取代，缺失，插入和修饰的任何组合以达到最终构建体。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基末端缺失和氨基酸的插入。特定的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守氨基酸取代，即，将一个氨基酸用另一具有不同结构和/或化学性质的氨基酸取代。氨基酸取代包括通过非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸，3-甲基组氨酸，鸟氨酸，高丝氨酸，5-羟基赖氨酸)的替换。可以使用本领域公知的遗传或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变，PCR，基因合成等。预期通过除基因工程以外的方法(如化学修饰)改变氨基酸的侧链基团的方法也是有用的。本文可以使用多种设计来表示相同的氨基酸突变。例如，将Fc结构域329位的脯氨酸取代为甘氨酸可以表示为329G,G329,G329,P329G,或Pro329Gly。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸的任何链，并不指特定长度的产物。因此，“多肽”的定义中包括肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白质”，“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的链的任何其它术语，可以使用术语“多肽”代替这些术语中的任何一个，也可以互换使用。术语“多肽”还旨在表示多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团的衍生化，蛋白水解切割或通过非天然发生的氨基酸的修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。本发明的多肽可以是大约3或更多，5个或更多，10个或更多，20个或更多，25个或更多，50个或更多，75个或更多，100个或更多，200个或更多，500个或更多，1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不一定具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有限定的三维结构而是可以采用大量不同的构象的多肽被称为解折叠的。
“分离的”多肽或其变体或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其天然或自然环境中除去。为了本发明的目的，重组产生的多肽和在宿主细胞中表达的蛋白质被认为是分离的，已经通过任何合适的技术被分离，分级分离或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。
关于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为在比对序列和如果需要引入空位以达到最大百分比序列同一性，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现例如，使用公众可用的计算机软件诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，源代码已经在华盛顿特区20559号的美国版权局提交了用户文档，以美国版权注册号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech公司公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译为在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置，并且不改变。在使用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A与或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者备选地表述为与或针对给定氨基酸序列B具有或包含某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)计算如下:
100乘以分数X/Y
其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A至B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有说明，否则使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得本文使用的全部％氨基酸序列同一性值。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)，病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，例如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指从其天然环境中去除的核酸分子，DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，编码载体中所含多肽的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中纯化(部分或基本上)的多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常包含多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但多核苷酸分子在染色体外存在或在与其天然染色体位置不同的染色体位置存在。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式以及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这样的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子，核糖体结合位点或转录终止子。
通过具有与本发明的参考核苷酸序列至少95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，多核苷酸的核苷酸序列旨在与参考序列相同，只是多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列每100个核苷酸多达5个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可以被缺失或被另外的核苷酸取代或参考序列中总核苷酸的多达5％的多个核苷酸可插入参考序列。参考序列的这些改变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或这些末端位置之间的任何位置，分别在参考序列的残基中或参考序列中的一个或多个连续基团中散布。实际上，任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一性，可以常规地使用已知的计算机程序，例如上面针对多肽(例如ALIGN-2)所讨论的计算机程序确定。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，其具有允许靶细胞中特定核酸转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒，染色体，线粒体DNA，质体DNA，病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义，并且是指用于引入和指导其在靶细胞中有效结合的特定基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及掺入其已被引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质由细胞转录和/或翻译机制产生。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代的核酸含量与亲本细胞可能不完全相同，而是可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。宿主细胞是可用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养的细胞，例如CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞和植物细胞，仅列举少数，还包括转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。
“活化Fc受体”是Fc受体，其被抗体的Fc结构域衔接后，引发刺激携带受体的细胞进行效应子功能的信号事件。人活化Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是导致免疫效应细胞裂解抗体包被的靶细胞的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物特异性结合的细胞，通常通过Fc区N末端的蛋白质部分进行所述特异性结合。如本文所用，术语“减少的ADCC”定义为在给定时间内，在靶细胞周围的培养基中给定的抗体浓度下，通过上面定义的ADCC的机制裂解的靶细胞的数量的减少，以及/或通过ADCC机制，在给定时间内实现给定数目的靶细胞的裂解所需的靶细胞周围的培养基中的抗体浓度的增加。ADCC的减少是相对于使用相同标准生产，纯化，配制和储存方法(本领域技术人员已知的)，相同类型的宿主细胞产生的相同的但是没有被工程化的抗体介导的ADCC。例如，由在Fc结构域中包含减少ADCC的氨基酸取代的抗体介导的ADCC的减少是相对于在Fc结构域中没有这种氨基酸取代的相同抗体介导的ADCC。用于测量ADCC的合适测定法是本领域公知的(参见例如PCT公开号WO 2006/082515或PCT专利申请号PCT/EP2012/055393)。
活性剂的“有效量”是指导致其施用的细胞或组织中的生理变化所必需的量。
活性剂例如，药物组合物的“治疗有效量”是指在实现希望的治疗或预防结果必要的剂量和时间段内有效地的量。治疗有效量的活性剂例如消除，减少，延迟，最小化或预防疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如奶牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物如猴子)，兔子和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。特别地，个人或受试者是人类。
术语“药物组合物”是指如此形式的制剂，其以允许其中包含的活性成分的生物活性有效，并且不含有对于受试者具有不可接受的毒性的另外的组分，所述制剂制剂将会施用于所述受试者。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物中对受试者无毒的除活性成分以外的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗”(及其语法变型例如“治疗”或“治疗”)是指试图改变被治疗的个体中疾病的自然过程的临床干预，并且可以在预防或在临床病理过程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，症状的减轻，疾病的任何直接或间接的病理后果的减轻，预防转移，降低疾病进展速度，改善或缓解疾病状态，缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子用于延缓疾病的发展或减缓疾病进展。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症，用法，剂量，给药，组合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
具体实施方式
本发明提供设计用于T细胞活化和重新定向的双特异性抗原结合分子，其组合了良好的功效和生产性以及制备和使用它们的方法。特别地，本发明涉及双特异性分子，其中至少两个结合部分具有相同的轻链，和在一些实施方案中，相应的重建重链，其分别赋予对T细胞活化双特异性抗原和靶细胞抗原的特异性结合。使用这种所谓的“共同轻链”原理，即组合共享一个轻链但仍具有单独特异性的两种结合剂防止了轻链错配。因此，在生产过程中，副产物较少，有助于T细胞活化双特异性抗原结合分子的均匀制备。
本发明特别涉及预定义的稀有轻链，其显著有助于与不同结合配偶体(例如重链和其片段)的抗原结合和异源多聚体配对。因此，这种共同的轻链适合用于可以制备新的双特异性或多特异性抗原结合分子的文库中。有利地，与本文公开的抗原结合分子和方法有关的共同轻链可用于形成可用于T细胞活化的抗原结合分子。本领域技术人员可以认识到具有这样的轻链的有利效率，其可以在T细胞活化抗原结合部分和靶抗原结合部分两者中起作用。这允许有效地产生包含T细胞活化组分和靶抗原结合组分的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在一个具体实施方案中，共同轻链为λ恒定轻链结构域。在一个具体的实施方案中，共同轻链是人或人源化的λ轻链。在一个具体实施方案中，共同轻链是罕见的人λ7家族轻链。使用λ，特别是罕见的λ7家族的轻链是罕见的方法，预期会降低鉴定合适的重链结合配偶体以产生特异于各种靶标的抗原结合分子的可能性。因此，在本文公开的发明人的工作之前，还不知道可以针对各种不同的不相关的靶抗原(例如FolR1，MUC1和BCMA)开发具有合适性质的λ7轻链。还不知道可以开发λ轻链以产生稳定的，功能性的高亲和性结合剂，以改善具有CD3特异性和靶抗原特异性的T细胞活化双特异性抗原结合分子的产生，其中靶抗原是不相关的，例如，FolR1，MUC1和BCMA。在一个实施方案中，如下所述，这种共同的轻链可用于构建基于特异性CD3结合剂而不是种系抗体的共同轻链(CLC)文库，以产生对结合剂有贡献的特异性CD3结合剂。这种方法的优点在于其允许维持先前鉴定和验证的CD3结合剂，使得基于重链仅必须鉴定T细胞活化双特异性抗原结合分子的靶抗原结合部分的新靶抗原结合剂。这允许模块方法产生具有相同或高度同源的链的不同T细胞活化双特异性抗原结合分子。虽然轻链在给定的T细胞活化抗原结合分子内是相同的，但是不同T细胞活化双特异性抗原结合分子的轻链可以是相同的或高度同源的。“高度同源”是指由该模块方法产生的不同T细胞活化双特异性抗原结合分子的轻链包含至少约95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。优选地，本发明的高度同源的轻链具有相同的可变轻链区，并且仅在其恒定区域上不同。例如，在一些实施方案中，氨基酸变异局限于接头区域。在一些实施方案中，共同轻链包含κ恒定的轻链结构域。
除了上述优点之外，如上所述，由于在T细胞活化双特异性抗原结合分子的抗原结合部分内使用的轻链是相同的，因此增强了使用该方法的正确配对的异源多聚体分子的产量。换句话说，使用共同的轻链，促进了这些分子的生产，因为轻链与不正确的重链的任何错配被消除。因此，促进了高纯度T细胞活化双特异性抗原结合分子种类的分离。在一个具体实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子使用Fab作为构件。与其他形式相比，使用Fab片段作为构件而不是例如使用scFv片段导致更高的热稳定性和缺少scFv聚集和分子间scFv形成。
在本文所述的发明人的工作之前，还不知道可以产生共同的轻链，其不仅可以用作双特异性或多特异性分子中的共同轻链，而且还支持T细胞活化双特异性抗原结合分子的T细胞活化的功能性质。此外，在本文所述的本发明人的工作之前，还不知道可以产生显著促进T细胞活化双特异性抗原结合分子内的抗原结合部分的抗原结合特性的共同轻链。确定的策略是鉴定有助于大多数结合特性(例如强度和特异性)的重链或其片段。根据本发明，共同轻链显著有助于结合特性。
因此，在第一方面，本发明提供了包含第一和第二抗原结合部分的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合部分包含第一轻链，并且其中第一抗原结合部分能够特异性结合活化的T细胞抗原，其中所述第二抗原结合部分包含第二轻链，并且其中所述第二抗原结合部分能够特异性结合靶细胞抗原，其中所述第一和第二轻链的氨基酸序列是相同的。在一个实施方案中，第一抗原结合部分是Fab。在一个实施方案中，第二抗原结合部分是Fab。一方面，本发明提供了包含第一和第二抗原结合部分的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中之一是能够与活化T细胞抗原特异性结合的Fab分子，另一个是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，其中第一和第二Fab分子具有相同的轻链(可变轻链和恒定轻链区，VLCL)。在一个实施方案中，轻链(VLCL)包含SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:34的轻链CDR。在一个实施方案中，所述相同的轻链(VLCL)包含SEQ ID NO:35。
T细胞活化双特异性抗原结合分子形式
T细胞活化双特异性抗原结合分子的组分可以以各种构型彼此融合。示例性构型包括但不限于图1A-D所示的构型。
在一些实施方案中，所述T细胞活化双特异性抗原结合分子还包含由能够稳定缔合的第一和第二亚基组成的Fc结构域。描述了包含Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子的示例性实施方案。所有这些T细胞活化双特异性抗原结合分子包含具有相同轻链(VLCL)，并且具有赋予两种不同抗原特异性的不同重链(VHCL)的至少两个Fab片段，即一个Fab片段能够特异性结合于T细胞活化抗原并且另一个Fab片段能够特异性结合靶细胞抗原。
在一些实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的第一和第二抗原结合部分任选地经由肽接头彼此融合。在一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在另一个这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。在另一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab轻链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端。在又一个这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab轻链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab轻链的N末端。
在一个实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在特定的这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。在特定的这种实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子基本上由包含相同(VLCL)轻链的第一和第二抗原结合部分，由第一和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选的一个或更多的肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C-末端融合到Fc结构域的第一个或第二个亚基的N末端。
在另一种这样的实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。在特定的这样的实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子基本上由包含相同(VLCL)轻链的第一和第二抗原结合部分，由第一和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的一个亚基的N末端。
在另一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab轻链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab轻链的N末端。在特定的这样的实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子基本上由包含相同(VLCL)轻链的第一和第二抗原结合部分，由第一和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab轻链的N末端融合到第二抗原结合部分的Fab轻链的C末端，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一个或第二个亚基的N末端。
在其他实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在特定的这种实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在特定的这样的实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子基本上由包含相同(VLCL)轻链的第一和第二抗原结合部分，由第一和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一个或第二个亚基的N末端。
特别是在这些实施方案中，第一抗原结合部分能够与活化T细胞抗原特异性结合。在其它实施方案中，第一抗原结合部分能够特异性结合靶细胞抗原。
抗原结合部分可以直接或通过肽接头与Fc结构域融合或彼此融合，所述肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域已知的并且在本文描述。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n(SEQ ID NO:41),(SG4)n(SEQ ID NO:42),(G4S)n(SEQID NO:41)or G4(SG4)n(SEQ ID NO:43)肽接头。“n”通常为1至10之间，通常为2至4之间。用于将第一和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头是(G4S)2(SEQ IDNO:44)。另外，接头可以包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别是当抗原结合部分融合到Fc结构域亚基的N末端时，其可以通过免疫球蛋白铰链区或其部分，用或不用另外的肽接头融合。
具有能够与靶细胞抗原特异性结合的单个抗原结合部分的T细胞活化双特异性抗原结合分子是有用的，特别是在高亲和力抗原结合部分结合后期望靶细胞抗原内化的情况下。在这种情况下，多于一种对靶细胞抗原特异性的抗原结合部分的存在可以增强靶细胞抗原的内化，从而降低其可用性。
然而，在许多其它情况下，具有包含对靶细胞抗原特异的两个或多个抗原结合部分的T细胞活化双特异性抗原结合分子是有利的，例如以优化靶向靶点或允许靶细胞抗原的交联。
因此，在某些实施方案中，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子还包含第三抗原结合部分，其是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。在一个实施方案中，第三抗原结合部分能够与第一或第二抗原结合部分特异性结合相同的靶细胞抗原。在一个具体实施方案中，第一抗原结合部分能够特异性结合活化T细胞抗原，并且第二和第三抗原结合部分能够特异性结合靶细胞抗原。在优选的实施方案中，第一，第二和第三抗原结合部分包含相同的(VLCL)轻链。
在一个实施方案中，第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
在一个实施方案中，第一和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的一个亚基的N末端，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab重链的N末端。在特定的这样的实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子基本上由第一，第二和第三抗原结合部分(Fab片段)，由第一和第二亚基组成的Fc结构域，以及任选的一个或多个肽接头组成，其中所述第二抗原结合部分在所述Fab重链的C末端融合到所述第一抗原结合部分的Fab重链的N末端，并且所述第一抗原结合部分在所述Fab重链的C-末端融合到Fc结构域的第一亚基的N末端，并且其中第三抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的第二亚基的N末端。优选地，在所述实施方案中，第一抗原结合部分能够特异性结合活化T细胞抗原，并且第二和第三抗原结合部分能够特异性结合靶细胞抗原，其中第一，第二和第三抗原结合部分是包含相同(VLCL)轻链的Fab片段。
在一个实施方案中，第二和第三抗原结合部分各自在Fab重链的C末端融合到Fc结构域的一个亚基的N末端，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab重链的N末端。
在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子基本上由能够与靶细胞抗原特异性结合的免疫球蛋白分子和任选地经由肽接头融合到免疫球蛋白重链之一的N末端的能够与活化T细胞抗原特异性结合的Fab分子组成。优选地，在所述实施方案中，能够特异性结合靶细胞抗原的免疫球蛋白分子和能够特异性结合活化T细胞抗原的Fab分子包含相同的(VLCL)轻链。
可以将第一和第三抗原结合部分(或分别为第二和第三抗原结合部分)直接或通过肽接头融合到Fc结构域。在一个具体实施方案中，通过免疫球蛋白铰链区将第一和第三抗原结合部分(或分别为第二和第三抗原结合部分)分别与Fc结构域融合。
在一个具体实施方案中，所述免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。在一个实施方案中，第一和第三抗原结合部分(或分别为第二和第三抗原结合部分)和Fc结构域是免疫球蛋白分子的一部分。在一个具体实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在甚至更具体的实施方案中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在另一个具体实施方案中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
Fc结构域
T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定结合。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc结构域。
在本发明的一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgGFc结构域。在特定实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域。在另一个实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域。在更具体的实施方案中，Fc结构域是包含在位置S228处的氨基酸取代(Kabat编号)，特别是氨基酸取代S228P的IgG4Fc结构域。该氨基酸取代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(见Stubenrauch et al.,Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在另一个具体实施方案中，Fc结构域是人。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
根据本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合部分，因此Fc结构域的两个亚基通常包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两种多肽的几种可能的组合。为了提高重组生产中T细胞活化双特异性抗原结合分子的产量和纯度，因此在T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
因此，在具体实施方案中，根据本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体实施方案中，所述修饰是所谓的“旋钮入孔”修饰，其包括在Fc结构域的两个亚基之一中的“旋钮”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“孔”修饰。
旋钮入孔技术被例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,ProtEng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。通常，该方法涉及在第一多肽的界面中引入突起(“旋钮”)和第二多肽的界面中引入相应空腔(“孔”)，使得突起可以定位在腔中，以便促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)代替来自第一多肽的界面的小的氨基酸侧链构建突起。通过用较小的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)代替大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起相同或相似大小的互补腔。
因此，在一个具体实施方案中，在T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一个亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，由此在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可以位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被替换为具有较小的侧链体积的氨基酸残基，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位于所述空腔中。
突起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成制备。
在一个具体实施方案中，在Fc结构域的第一个亚基的CH3结构域中，第366位的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)所代替，在Fc结构域的第二个亚基的CH3结构域中，在位置407的酪氨酸残基用缬氨酸残基(Y407V)代替。在一个实施方案中，另外在Fc结构域的第二亚基中，将366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基(T366S)替代，并且将368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替代(L368A)。
在另一个实施方案中，在Fc结构域的第一个亚基中，另外将354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基(S354C)替代，另外在Fc结构域的第二个亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫键，进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个具体实施方案中，能够结合活化T细胞抗原的抗原结合部分融合(任选地通过能够结合靶细胞抗原的抗原结合部分)到Fc结构域的第一个亚基(包括“旋钮”修饰)。不希望受理论束缚，能够结合活化T细胞抗原的抗原结合部分与Fc结构域的含有旋钮的亚基的融合将(进一步)使包含能够结合活化T细胞抗原的两个抗原结合部分的抗原结合分子的产生最小化(两个含旋钮的多肽的空间冲突)。
在备选实施方案中，促进Fc结构域的第一和第二亚基的结合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如，如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法包括通过带电氨基酸残基在两个Fc结构域亚基的界面处替换一个或多个氨基酸残基，使得同二聚体形成变得静电上不利，但异二聚化是静电上有利的。
减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
Fc结构域赋予T细胞活化双特异性抗原结合分子有利的药代动力学性质，包括长期的血清半寿期，其有助于靶组织中的良好积聚和有利的组织-血液分配比。然而，同时可能导致T细胞活化双特异性抗原结合分子不利于靶向表达Fc受体的细胞而不是优选的抗原携带细胞。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放，其与抗原结合分子的T细胞活化性质和长半寿期组合，导致全身给药时细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。由于T细胞的潜在破坏(例如，通过NK细胞)，T细胞以外的免疫细胞的活化(携带Fc受体)可能甚至降低T细胞活化双特异性抗原结合分子的功效。
因此，在特定实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，根据本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个这样的实施方案中，与天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)相比，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)显示小于50％，优选小于20％，更优选小于10％，最优选小于5％的与Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)相比，小于50％，优选小于20％，更优选10％，最优选小于5％的效应子功能。在一个实施方案中，Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)基本上不结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在一个具体实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是选自CDC，ADCC，ADCP和细胞因子分泌中的一种或多种。在特定实施方案中，效应子功能是ADCC。在一个实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，Fc结构域显示出与新生Fc受体(FcRn)基本相似的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)显示大于约70％，特别是大于约80％，更特别地大于约90％的天然IgG1Fc结构域(或包含天然IgG1Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)对FcRn的亲和力结合时，实现与FcRn的基本相似的结合。
在某些实施方案中，与未工程化的Fc结构域相比，将Fc结构域工程化为具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在具体实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域与Fc受体和/或效应子功能的结合亲和力的一个或多个氨基酸突变。通常，Fc结构域的两个亚基中的每一个存在相同的一个或多个氨基酸突变。在一个实施方案中，氨基酸突变降低了Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，氨基酸突变将Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍或至少10倍。在存在多于一个降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施方案中，与包含非工程化Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子的T细胞相比，包含工程化的Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子显示与Fc受体的结合亲和力小于20％，特别是小于10％，更特别地小于5％。在一个具体实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中，Fc受体是活化Fc受体。在一个具体实施方案中，Fc受体是活化人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合减少。在一些实施方案中，与补体成分的结合亲和力，特别是与C1q的结合亲和力也降低。在一个实施方案中，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)显示大于约70％的Fc结构域的非工程化形式(或包含Fc结构域的所述非工程化形式的T细胞活化双特异性抗原结合分子)对FcRn的亲和力结合时，实现与FcRn的基本相似的结合，即保留Fc结构域与所述受体的结合亲和力。包含所述Fc结构域的本发明的Fc结构域或T细胞活化双特异性抗原结合分子可以表现出大于约80％，甚至大于约90％的这种亲和力。在某些实施方案中，与非工程化Fc结构域相比，T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域被工程化为具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下一种或多种:减少的补体依赖性细胞毒性(CDC)，减少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，减少的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，减少的细胞因子分泌，抗原呈递细胞的减少的免疫复合体介导的抗原摄取，减少的与NK细胞的结合，减少的与巨噬细胞的结合，减少的与单核细胞的结合，减少的与多形核细胞的结合，减少的直接信号传导诱导细胞凋亡，减少的靶结合抗体的交联，减少的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。在一个实施方案中，减少的效应子功能是选自减少的CDC，减少的ADCC，减少的ADCP和减少的细胞因子分泌的一种或多种。在一个具体实施方案中，减少的效应子功能是减少的ADCC。在一个实施方案中，减少的ADCC小于非工程化Fc结构域(或包含非工程化Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC的20％。
在一个实施方案中，减少Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施方案中，Fc结构域包含在选自E233，L234，L235，N297，P331和P329的位置的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，Fc结构域包含在选自L234，L235和P329的位置的氨基酸取代。在一些实施方案中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A。在一个这样的实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域，特别是人IgG1Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域包含位置P329处的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，氨基酸取代为P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，Fc结构域包含位置P329处的氨基酸取代和在选自E233，L234，L235，N297和P331的位置处进一步的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，进一步的氨基酸取代是E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D或P331S。在特定实施方案中，Fc结构域包含位置P329，L234和L235处的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A，L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个这样的实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域，特别是人IgG1Fc结构域。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除人IgG1Fc结构域的Fcγ受体结合，如PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中所述，其全部内容通过引用并入本文。PCT/EP2012/055393还描述了制备这种突变Fc结构域的方法以及确定其特性如Fc受体结合或效应子功能的方法。
与IgG1抗体相比，IgG4抗体显示对Fc受体的降低的结合亲和力和降低的效应子功能。因此，在一些实施方案中，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的Fc结构域是IgG4Fc结构域，特别是人IgG4Fc结构域。在一个实施方案中，IgG4Fc结构域包含位置S228处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应子功能，在一个实施方案中，IgG4Fc结构域包含位置L235处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代L235E。在另一个实施方案中，IgG4Fc结构域包含位置P329的氨基酸取代，特别是氨基酸取代P329G。在一个具体的实施方案中，IgG4Fc结构域包含位置S228，L235和P329处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代S228P，L235E和P329G。这种IgG4Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合性质在PCT专利申请号PCT/EP2012/055393中描述，其全部内容通过引用并入本文。
在特定实施方案中，与天然IgG1Fc结构域相比，显示出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能的Fc结构域是包含氨基酸取代L234A，L235A和任选的P329G的人IgG1Fc结构域，或包含氨基酸取代S228P，L235E和任选的P329G的人IgG4Fc结构域。
在某些实施方案中，已经消除了Fc结构域的N-糖基化。在一个这样的实施方案中，Fc结构域包含位置N297的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)代替天冬酰胺的氨基酸取代。
除了上文描述的Fc结构域和PCT专利申请号PCT/EP2012/055393，具有降低的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域还包括具有一个或多个Fc结构域残基238,265,269,270,297,327和329的取代的Fc结构域(美国专利号6,737,056)。这样的Fc突变体包括在两个或多个氨基酸位置265,269,270,297和327处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
突变Fc结构域可以通过本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸缺失，取代，插入或修饰来制备。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变，PCR，基因合成等。可以通过测序验证正确的核苷酸改变。
例如，通过ELISA，或通过表面等离振子共振(SPR)使用诸如BIAcore仪器(GEHealthcare)的标准仪器，可以容易地确定与Fc受体的结合，可以通过重组表达获得Fc受体。本文描述了这种合适的结合测定法。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可以通过本领域已知的方法测量Fc结构域或包含Fc结构域的T细胞活化双特异性抗原结合分子的效应子功能。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它实例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom etal.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom et al.,Proc Natl AcadSci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med166,1351-1361(1987)。或者，可以使用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Gampton View，CA)；和CytoTox
Figure BDA0001351705530000431
非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于这种测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可以在体内，例如，在Clynes etal.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣的分子的ADCC活性。
在一些实施方案中，Fc结构域与补体成分(特别是C1q)的结合被减少。因此，在其中将Fc结构域工程化以具有降低的效应子功能的一些实施方案中，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定T细胞活化双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q，因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro et al.,JImmunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Craggand Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
抗原结合部分
本发明的抗原结合分子是双特异性的，即其包含能够特异性结合两个不同抗原决定簇的至少两个抗原结合部分。根据本发明的一个实施方案，抗原结合部分是Fab分子(即，由重链和轻链组成的抗原结合结构域，每个包含可变区和恒定区)，其中所述至少两个Fab分子的轻链(VLCL)包含相同的序列。在一个实施方案中，所述能够分别与靶细胞抗原和T细胞活化抗原特异性结合的Fab分子的VLCL轻链分别包含SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33和SEQID NO:34的轻链CDR。
在一个实施方案中，能够分别与靶细胞抗原和T细胞活化抗原特异性结合的Fab分子的所述VLCL轻链包含SEQ ID NO:31。
在一个实施方案中，所述Fab分子是人的。在另一个实施方案中，所述Fab分子是人源化的。在另一个实施方案中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定区。
在根据本发明的特定实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子能够同时结合靶细胞抗原，特别是肿瘤细胞抗原和活化的T细胞抗原。在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子能够通过同时结合靶细胞抗原和活化T细胞抗原来交联T细胞和靶细胞。在甚至更具体的实施方案中，这种同时结合导致靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在一个实施方案中，这种同时结合导致T细胞的活化。在其它实施方案中，这种同时结合导致T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的选自下组的细胞应答:增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒活性和活化标记物的表达。在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子与活化T细胞抗原的结合而不同时结合靶细胞抗原不会导致T细胞活化。
在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒活性重定向到靶细胞。在一个具体实施方案中，所述重定向独立于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。
特别地，根据本发明的任何实施方案的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。
活化T细胞抗原结合部分
本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子包含能够结合活化T细胞抗原(本文也称为“活化T细胞抗原结合部分”)的至少一个抗原结合部分。在一个具体实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够与活化T细胞抗原特异性结合的抗原结合部分。在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子提供与活化T细胞抗原的单价结合。活化T细胞抗原结合部分是Fab分子，并且包含与能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合部分相同的VLCL轻链。
在一个具体实施方案中，活化T细胞抗原是CD3，特别是人CD3或食蟹猴CD3，最特别是人CD3。在一个具体的实施方案中，活化T细胞抗原结合部分与人和食蟹猴CD3交叉反应(即特异性结合)。在一些实施方案中，活化T细胞抗原是CD3的ε亚基(SEQ ID NO:56)。
在一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分可与单克隆抗体H2C(描述于PCT公开号WO2008/119567)竞争结合CD3的表位。在另一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分可与单克隆抗体V9(描述于Rodrigues等人，Int J Cancer Suppl 7,45-50(1992)和美国专利号6,054,297)竞争结合CD3的表位。在另一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分可以与单克隆抗体FN18(在Nooij et al.,Eur J Immunol 19,981-984(1986)中描述))竞争结合CD3的表位。在一个具体实施方案中，活化T细胞抗原结合部分可以与单克隆抗体SP34(Pessano et al.,EMBO J4,337-340(1985)中描述)竞争结合CD3的表位。在一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分与单克隆抗体SP34结合CD3的相同表位。
在一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分包含SEQ ID NO:14的重链CDR1，SEQID NO:15的重链CDR2，SEQ ID NO:16的重链CDR3，SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2和SEQ ID NO:34的轻链CDR3。在另一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分包含与SEQ ID NO:36有至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性的重链可变区序列，或其保留功能性的变体。
在另一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分包含与SEQ ID NO:31有至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性的轻链可变区序列，或其保留功能的变体。
在一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:36的序列的重链和含有SEQ ID NO:31序列的轻链。
在一个实施方案中，活化T细胞抗原结合部分包含SEQ ID NO:40的重链和包含SEQID NO:35的轻链。
靶细胞抗原结合部分
本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子包含能够结合靶细胞抗原的至少一个抗原结合部分(本文也称为“靶细胞抗原结合部分”)。在某些实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子包含能够结合靶细胞抗原的两个抗原结合部分。在特定的这种实施方案中，这些抗原结合部分中的每一个特异性结合相同的抗原决定簇。在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子包含能够与靶细胞抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子包含不超过两个能够结合靶细胞抗原的抗原结合部分。靶细胞抗原结合部分通常是Fab分子，其结合特异性抗原决定簇，并且能够将T细胞活化的双特异性抗原结合分子导向靶位点，例如导向具有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞。所述Fab分子具有与能够特异性结合T细胞活化抗原的Fab分子相同的VLCL轻链。在优选的实施方案中，能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的所述VLCL轻链和能够特异性结合T细胞活化抗原的Fab分子包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2和SEQ ID NO:34的轻链CDR3。在优选的实施方案中，所述能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的所述VLCL轻链和能够特异性结合T细胞活化抗原的Fab分子包含SEQ ID NO:31的VLCL轻链。
在另一个实施方案中，靶细胞抗原结合部分包含与SEQ ID NO:31有至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性的轻链可变区序列或其保留功能的变体。
在另一个实施方案中，靶细胞抗原结合部分包含与SEQ ID NO:35有至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性的轻链序列或其保留功能的变体。
在某些实施方案中，靶细胞抗原结合部分导向与病理状况相关的抗原，例如存在于肿瘤细胞或病毒感染细胞上的抗原。合适的抗原是细胞表面抗原，例如但不限于细胞表面受体。在具体实施方案中，抗原是人抗原。在一个具体实施方案中，靶细胞抗原选自叶酸受体1(FolR1)，粘蛋白-1(MUC1)和B细胞成熟抗原(BCMA)。
在一个具体实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子包含由多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:183,SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:263,SEQ ID NO:264,SEQ ID NO:191,SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:267,和SEQ ID NO:272的序列有至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％的同一性，包括其功能片段或变体。
多核苷酸
本发明还提供了编码如本文所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子或其片段的分离的多核苷酸。
本发明的多核苷酸包括与SEQ ID NO:183,SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:263,SEQID NO:264,SEQ ID NO:191,SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:267,和SEQ ID NO:272所示序列有至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性的那些多核苷酸，包括其功能片段或变体。
编码本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的多核苷酸可以表达为编码整个T细胞活化双特异性抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其它方式缔合以形成功能性T细胞活化双特异性抗原结合分子。例如，抗原结合部分的轻链部分可以由与T细胞活化双特异性抗原结合分子的部分分开的多核苷酸编码，该T细胞活化双特异性抗原结合分子的部分包含抗原结合部分的重链部分，Fc结构域亚基和任选的(部分的)另一抗原结合部分。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成抗原结合部分。在另一个实例中，包含两个Fc结构域亚基之一和任选(部分)一个或多个抗原结合部分的T细胞活化双特异性抗原结合分子的部分可以由与T细胞活化双特异性抗原结合分子的部分分离的多核苷酸编码，所述T细胞活化双特异性抗原结合分子的部分包含两个Fc结构域亚基中的另一个和任选(部分)抗原结合部分。当共表达时，Fc结构域亚基将缔合形成Fc结构域。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如为信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子可以通过例如固相肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，分离一种或多种编码如上所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸，并将其插入到一个或多个载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离和测序这样的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体，优选表达载体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有T细胞活化双特异性抗原结合分子(片段)以及适当的转录/翻译控制信号的编码序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y(1989)中描述的技术。表达载体可以是质粒，病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，其中编码T细胞活化双特异性抗原结合分子(片段)(即编码区)的多核苷酸与启动子和/或其他转录或翻译控制元件有效连接。如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的部分。虽然“终止密码子”(TAG，TGA或TAA)未翻译成氨基酸，但是如果存在的话，它可以被认为是编码区的一部分，但是任何侧翼序列，例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子，5’和3’非翻译区等不是编码区的一部分。两个或多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如，在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可以包含单个编码区，或者可以包含两个或多个编码区，例如，本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其通过蛋白水解切割在翻译后或翻译同时分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体，多核苷酸或核酸可以编码与编码本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合的异源编码区。异源编码区域包括但不限于特化的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。有效结合是当基因产物的编码区，例如一种多肽与一种或多种调节序列以这样的方式结合，以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果诱导启动子功能导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列指导基因产物的表达或不干扰DNA模板被转录的能力，那么这两个DNA片段(例如多肽编码区和与其结合的启动子)是“有效结合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，启动子区域将与编码多肽的核酸有效结合。启动子可以是仅在预定细胞中指导DNA的实质转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其它转录控制元件例如增强子，操纵基因，阻抑物和转录终止信号，可以与多核苷酸有效结合以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。各种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，与内含子-A连接)，猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)。其他转录控制区域包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和兔α-珠蛋白的那些，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如启动子诱导型四环素)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其它特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的附加编码区结合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌T细胞活化双特异性抗原结合分子，则可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子或其片段的核酸的上游。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链从粗糙内质网的输出已经开始，所述信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白质切割出来。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合到多肽的N末端的信号肽，其从翻译的多肽切割以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的功能性衍生物，其保留指导与其有效结合的多肽分泌的能力。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。
编码可用于促进后来纯化(例如组氨酸标签)或协助标记T细胞活化双特异性抗原结合分子的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码T细胞活化双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸的内部或末端。
在另一个实施方案中，提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可单独或组合地结合分别关于多核苷酸和载体描述的本文所述的任一特征。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的(部分)的多核苷酸的载体。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持T细胞活化双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域公知的。可以用特定的表达载体适当地转染或转导这样的细胞，并且可以生长大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的T细胞活化双特异性抗原结合分子。合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。表达后，多肽可以从可溶性级分中的细菌细胞糊中分离，并可进一步纯化。除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是用于多肽编码载体的合适的克隆或表达宿主，其包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已被“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的合适的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒菌株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人类胚胎肾细胞系(例如，在Graham et al.,J Gen Virol 36,59(1977)中描述的293或293T细胞，幼仓鼠肾细胞(BHK)，小鼠支持细胞(如在Mather，Biol Reprod 23,243-251(1980)所述的TM4细胞)，猴肾细胞(CV1)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76)，人宫颈癌细胞(HELA)，犬肾细胞(MDCK)，水牛鼠肝细胞(BRL 3A)，人肺细胞(W138)，人肝细胞(Hep G2)，小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)，TRI细胞(如在Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)，MRC 5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO，NS0，P3X63和Sp2/0。对于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养的细胞，酵母细胞，昆虫细胞，细菌细胞和植物细胞，仅列举少数，而且包括转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。
标准技术在本领域中是已知的，以在这些系统中表达外源基因。表达包含抗原结合结构域(例如抗体)的重链或轻链的多肽的细胞可以被工程化以便也表达另一个抗体链，使得所表达的产物是具有重链和轻链的抗体。
在一个实施方案中，提供了根据本发明产生T细胞活化双特异性抗原结合分子的方法，其中所述方法包括在适合于表达T细胞活化双特异性抗原结合分子的条件下培养包含编码本文提供的T细胞活化双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收T细胞活化双特异性抗原结合分子。
T细胞活化双特异性抗原结合分子的组分彼此遗传融合。T细胞活化双特异性抗原结合分子可以被设计成使得其组分彼此直接融合或通过接头序列间接融合。接头的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试其功效。T细胞活化双特异性抗原结合分子的不同组分之间的接头序列的实例见本文提供的序列。还可以包括另外的序列以掺入切割位点以在需要时分离融合物的各个组分，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，T细胞活化双特异性抗原结合分子的一个或多个抗原结合部分至少包含能够结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可以形成自然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并衍生自所述抗体及其片段。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如美国专利号4,186,567中所述)，或者可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库得到(参见McCafferty的美国专利号5,969,108)。
抗体，抗体片段，抗原结合结构域或可变区的任何动物物种都可用于本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。可用于本发明的非限制性抗体，抗体片段，抗原结合结构域或可变区可以是鼠，灵长类，或人来源的。如果T细胞活化双特异性抗原结合分子是供人使用的，则可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。抗体的人源化或完全人形式也可以根据本领域熟知的方法制备(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可以通过各种方法来实现，包括但不限于(a)将非人(例如，供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)构架和具有或不具有关键构架残基的保留的恒定区(例如，对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能是重要的那些残基)，(b)仅将非人特异性决定区域(SDR或a-CDRs；对于抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人构架和恒定区，或(c)移植整个非人类可变结构域，但通过更换表面残基，将其与人样部分“掩蔽”。人源化抗体及其制备方法综述于例如，Almagro and Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)，并且进一步描述于例如Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988)；Queen et al.,Proc Natl Acad Sci USA86,10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Jones et al.,Nature 321,522-525(1986)；Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiriet al.,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。可以使用本领域已知的各种技术来生产人抗体和人可变区。人抗体通常在van Dijk和van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg，Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中描述。人可变区可以形成由杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并衍生自人单克隆抗体(参见例如MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区也可以通过向转基因动物施用免疫原来制备，所述转基因动物已被修饰以应答抗原性攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列来产生人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom et al.inMethods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty et al.,Nature 348,552-554；Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。
在某些实施方案中，根据例如美国专利申请公开号2004/0132066中公开的方法(其全部内容通过引用并入本文)，可用于本发明的抗原结合部分被工程化以具有增强的结合亲和力。本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子结合特异性抗原决定簇的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如，表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad,et al.,Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))。竞争测定可用于鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗体，抗体片段，抗原结合结构域或可变结构域，例如与V9抗体竞争结合CD3的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合被参考抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methodsin Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供了用于映射抗体结合的表位的详细的示例性方法。在示例性竞争测定中，将固定化抗原(例如CD3)在溶液中温育，所述溶液包含与抗原结合的第一标记的抗体(例如V9抗体)，和第二未标记抗体，正测试其与第一抗体竞争结合抗原的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化抗原在包含第一标记抗体但不含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育后，除去过量未结合的抗体，并测量与固定化抗原结合的标记的量。如果在测试样品中与固定化抗原结合的标记的量相对于对照样品显著降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合抗原。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文所述制备的T细胞活化双特异性抗原结合分子可以通过本领域已知的技术如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析，大小排阻层析等进行纯化。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷，疏水性，亲水性等因素，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和层析纯化，可以使用T细胞活化双特异性抗原结合分子结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，对于本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本如实施例中所述，连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析可用于分离T细胞活化双特异性抗原结合分子。T细胞活化双特异性抗原结合分子的纯度可以通过各种众所周知的分析方法中的任何一种来测定，包括凝胶电泳，高压液相层析等。例如，如实施例中所述表达的重链融合蛋白被证明是完整的，并且如通过还原SDS-PAGE所阐明的正确组装。在约25,000，50,000和Mr75,000解析了三条带，对应于T细胞活化双特异性抗原结合分子轻链，重链和重链/轻链融合蛋白的预测分子量。
测定法
本文提供的T细胞活化双特异性抗原结合分子可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定，筛选或表征其物理/化学性质和/或生物活性。
亲和力测定法
T细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力可以使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)根据在实施例中阐述的方法来确定，以及可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，例如通过流式细胞术(FACS)来评估T细胞活化双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合。以下和下面的实施例描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
根据一个实施方案，使用
Figure BDA0001351705530000561
T100机器(GE Healthcare)在25℃下通过表面等离振子共振来测量KD。
为了分析Fc部分和Fc受体之间的相互作用，His标记的重组Fc受体被固定在CM5芯片上的抗Penta His抗体(Qiagen)(“Penta His”公开为SEQ ID NO:45)捕获，双特异性构建体用作分析物。简言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，GEHealthcare)。将抗Penta-His抗体(如SEQ ID NO:45所公开的“Penta His”)用10mM乙酸钠(pH5.0)稀释至40μg/ml，然后以5μl/min的流速注射以实现约6500个反应单位(RU)的偶联蛋白。注入配体后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。随后，Fc受体以4或10nM捕获60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体(500nM和4000nM之间的范围)的四倍连续稀释液在25℃下以30μl/min的流速120秒内注射在HBS-EP(GE Healthcare，10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中。
为了确定对靶抗原的亲和性，双特异性构建体被抗人Fab特异性抗体(GEHealthcare)捕获，所述抗体被固定在活化的CM5-传感器芯片表面上，如对抗Penta-His抗体(如SEQ ID NO:45公开的“Penta His”)所述。偶联蛋白质的最终量约为12000RU。以300nM捕获双特异性构建体90s。目标抗原以250至1000nM的浓度范围，流速30μl/min通过流动池180秒。监测解离180秒。
通过减去在参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。稳态响应用于通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合得出解离常数KD。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0001351705530000571
T100评估软件版本1.1.1)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/ko比。参见例如Chen etal.,J Mol Biol 293,865-881(1999)。
活性测定法
本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的生物学活性可以通过实施例中所述的各种测定法来测量。生物活性可以例如包括T细胞的增殖的诱导，T细胞中的信号传导的诱导，T细胞中活化标记物表达的诱导，T细胞的细胞因子分泌的诱导，靶细胞如肿瘤细胞的裂解的诱导，以及肿瘤消退的诱导和/或存活的改善。
组合物，制剂和施用途径
在另一方面，本发明提供包含本文提供的任何T细胞活化双特异性抗原结合分子的药物组合物，例如用于下列治疗方法中的任何一种。在一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何T细胞活化双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文提供的任何T细胞活化双特异性抗原结合分子和至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
还提供了以适于体内施用的形式制备本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括(a)获得本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子，和(b)用至少一种药学上可接受的载体配制T细胞活化双特异性抗原结合分子，由此配制T细胞活化双特异性抗原结合分子的制剂用于体内施用。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的溶解或分散在药学上可接受的载体中的一种或多种T细胞活化双特异性抗原结合分子。短语“药学上或药理学上可接受的”是指在所用剂量和浓度下通常对受体无毒的分子实体和组合物，即当施用于动物例如，(适当时)人时不产生不利的，过敏的或其它不利的反应。根据本公开内容，本发明的技术人员将知道包含至少一种T细胞活化双特异性抗原结合分子和任选的另外的活性成分的药物组合物的制备，如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990示例，将其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物标准局或其他国家相应部门要求的无菌性，致热原性，一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂，缓冲剂，分散介质，包衣，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗菌剂，抗真菌剂)，等渗剂，吸收延迟剂，盐，防腐剂，抗氧化剂，蛋白质，药物，药物稳定剂，聚合物，凝胶，结合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂，染料，诸如此类材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990,pp.1289-1329，通过引用并入本文)。除了任何常规载体与活性成分不相容之外，其在治疗或药物组合物中的用途是预期的。
组合物可以包含不同类型的载体，这取决于它是以固体，液体或气溶胶形式给药，以及是否需要对于如注射途径施用是无菌的。本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子(和任何另外的治疗剂)可以静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，损伤内，颅内，关节内，前列腺内,脾内，肾内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，肿瘤内，肌内，腹膜内，皮下，结膜下，囊内，粘膜，心包内，脐内，眼内，口腔，局部(topically)，局部(locally)，通过吸入(例如气溶胶吸入)，注射，输注，连续输注，直接局部灌注洗涤靶细胞，通过导管，通过灌洗，在乳剂中，用脂质组合物(例如脂质体)或如本领域普通技术人员所知道的其他方法或任何组合施用(参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.MackPrinting Company,1990，通过引用并入本文)。肠胃外给药，特别是静脉内注射最常用于施用多肽分子，例如本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。
肠胃外组合物包括通过注射给药，例如皮下，皮内，损伤内，静脉内，动脉内，肌内，鞘内或腹膜内注射而设计的那些,。对于注射，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子可以配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液，林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，T细胞活化双特异性抗原结合分子可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体例如无菌无热原的水构成。无菌注射溶液是通过将所需量的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子掺入在适当的溶剂中来制备的，根据需要所述溶剂具有下面列举的多种其它成分。无菌性可以容易地实现，例如通过无菌过滤膜过滤。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有碱性分散介质和/或其它成分的无菌载体中制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液，悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其产生活性成分和来自其先前无菌-过滤液体介质的额外的期望成分的粉末。如果需要，液体介质应适当缓冲，并且在注射足够的盐水或葡萄糖之前首先使液体稀释剂等渗。组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并且防止微生物如细菌和真菌的污染作用。应当理解，内毒素污染应该在安全水平保持最低限度，例如少于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学上可接受的载体包括但不限于:缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；盐形成抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白复合体)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的化合物，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，葡聚糖等。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或试剂，其增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液。此外，活性化合物的悬浮液可以作为适当的油性注射悬浮液来制备。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸酯，例如ethyl cleats或甘油三酯，或脂质体。
活性成分可以被包埋在例如通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)或在宏观乳剂中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这种技术在Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company，1990)中公开。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。在具体实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝，明胶或其组合，可以延长可注射组合物的吸收。
除了先前描述的组合物之外，T细胞活化双特异性抗原结合分子也可以配制成贮库制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌内注射施用。因此，例如，T细胞活化双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合物或疏水性材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶衍生物，例如微溶性盐配制。
包含本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的药物组合物可以通过常规的混合，溶解，乳化，包胶，包埋或冻干方法制备。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或辅助剂以常规方式配制，其有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。
T细胞活化双特异性抗原结合分子可以配制成游离酸或碱，中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保持游离酸或碱的生物活性的盐。这些包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或由无机酸形成的盐，例如盐酸或磷酸，或诸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸的有机酸。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠，钾，铵，钙或铁；或有机碱诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药物盐在水溶液和其他质子溶剂中的溶解度更高。
治疗方法和组合物
本文提供的任何T细胞活化双特异性抗原结合分子可用于治疗方法。本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子可用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。
为了在治疗方法中使用，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子将以与良好医学实践一致的方式配制，给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特定病症，待治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，病症的原因，药剂的递送部位，给药方法，给药方案，以及医生已知的其他因素。
一方面，提供用作药物的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在另外的方面，提供了用于治疗疾病的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗有需要的个体的疾病的本文所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有疾病的个体的方法的T细胞活化双特异性抗原结合分子，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性疾病。在特定实施方案中，该疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症)。在另外的实施方案中，本发明提供了用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的本文所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，本发明提供了用于诱导个体中靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法的T细胞活化双特异性抗原结合分子，所述方法包括向个体施用有效量的T细胞活化双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。根据任何上述实施方案的“个体”是哺乳动物，优选人。
在另一方面，本发明提供本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗有需要的个体中的疾病。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，包括向患有该疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性疾病。在特定实施方案中，该疾病是癌症。在一个实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症)。在另一个实施方案中，药物用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在又一个实施方案中，药物用于诱导个体中靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选人。
另一方面，本发明提供了治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，向所述个体施用组合物，其包含药学上可接受的形式的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性疾病。在特定实施方案中，该疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症)。根据任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选人。
另一方面，本发明提供诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，该方法包括在T细胞，特别是细胞毒性T细胞的存在下使靶细胞与本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子接触。在另一方面，提供了用于诱导个体中靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个这样的实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的T细胞活化双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”是人。
在某些实施方案中，待治疗的疾病是增生性疾病，特别是癌症。癌症的非限制性实例包括膀胱癌，脑癌，头颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，子宫颈癌，子宫内膜癌，食道癌，结肠癌，结肠直肠癌，直肠癌，胃癌，前列腺癌，血癌，皮肤癌，鳞状细胞癌，骨癌和肾癌。可以使用本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子治疗的其它细胞增殖病症包括但不限于位于腹部，骨骼，乳腺，消化系统，肝脏，胰腺，腹膜，内分泌腺(肾上腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼睛，头颈部，神经系统(中枢和外周神经系统)，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾脏，胸部区域和泌尿生殖系统中的赘生物。还包括癌前状况或病变和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌，皮肤癌，肺癌，结肠直肠癌，乳腺癌，脑癌，头颈癌。本领域技术人员容易认识到，在许多情况下，T细胞活化双特异性抗原结合分子可能不能提供治愈，但可能仅提供部分益处。在一些实施方案中，具有某些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此，在一些实施方案中，提供生理变化的T细胞活化双特异性抗原结合分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者，患者或个体通常是哺乳动物，更具体地是人。
在一些实施方案中，将有效量的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子施用于细胞。在其它实施方案中，将治疗有效量的本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子施用于个体以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，给药途径，患者的体重，T细胞活化双特异性抗原结合分子的类型，疾病的严重性和病程，T细胞活化双特异性抗原结合分子是用于预防还是治疗目的，以前或同时发生的治疗干预，患者的临床病史和对T细胞活化双特异性抗原结合分子的应答，以及主治医师的判断。在任何情况下，负责施用的从业者将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点上的单次或多次给药，推注给药和脉冲输注。
T细胞活化双特异性抗原结合分子在一次或一系列治疗中适当地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)T细胞活化双特异性抗原结合分子可以是施用于患者(无论是通过一个或多个单独的给药，还是通过连续输注)的起始候选剂量。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于几天或更长时间的反复给药，根据病情，治疗通常将持续到发生疾病症状的所需抑制。T细胞活化双特异性抗原结合分子的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他非限制性实例中，剂量还可以包含每次施用约1微克/kg体重，约5微克/kg体重，约10微克/kg体重，约50微克/kg体重，约100微克/kg体重,约200微克/kg体重，约350微克/kg体重，约500微克/kg体重，约1毫克/kg体重，约5毫克/kg体重，约10毫克/kg体重，约50毫克/kg体重，约100毫克/kg体重，约200毫克/kg体重，约350毫克/kg体重，约500毫克/kg体重，至约1000毫克/kg体重或更高，以及其中可导出的任何范围。在本文所列数量的可推导范围的非限制性实例中，可以基于上述数量来施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重，约5μg/kg体重至约500mg/kg体重的范围，等等。因此，可向患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一次或多次剂量。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20，或例如约6次剂量的T细胞活化双特异性抗原结合分子)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一次或多次较低剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法容易地监测该疗法的进展。
本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子通常以有效实现预期目的的量使用。为了用于治疗或预防疾病状况，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子或其药物组合物以治疗有效量施用或应用。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是鉴于本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，可以最初从体外测定法(例如细胞培养物测定)估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以实现循环浓度范围，其包括在细胞培养物中测定的IC50。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。
也可以使用本领域熟知的技术从体内数据(例如，动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以根据动物数据容易地优化对人的施用。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的T细胞活化双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的通常的患者剂量为约0.1至50mg/kg/天，通常为约0.5至1mg/kg/天。治疗有效的血浆水平可以通过每天施用多次剂量来实现。血浆中的水平可以例如通过HPLC测量。
在局部施用或选择性吸收的情况下，T细胞活化双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过多的实验。
本文所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质毒性。T细胞活化双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来测定。细胞培养测定和动物研究可用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50的比率。表现出大的治疗指数的T细胞活化双特异性抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中，根据本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制适用于人的一系列剂量。剂量优选在循环浓度范围内，其包括具有很少或没有毒性的ED50。剂量可以在该范围内变化，这取决于多种因素，例如所用的剂型，所用给药途径，受试者的状况等。鉴于患者的状况，个体医生可以选择确切的制剂，给药途径和剂量(参见例如Fingl et al.,1975,in:The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1,通过引用整体并入本文)。
用本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治医师将知道由于毒性，器官功能障碍等而怎样和何时终止，中断或调整给药。相反，如果临床反应不足(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。施用剂量在管理感兴趣的病症中的量值将随着待治疗状况的严重性，给药途径等而变化。状况的严重性可以例如部分地通过标准预后评价方法进行评估。此外，剂量和可能剂量频率也将根据个体患者的年龄，体重和反应而变化。
其他活性剂和治疗
本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子可与疗法中的一种或多种其它活性剂组合施用。例如，本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子可与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括用于治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病的任何治疗剂。这种另外的治疗剂可以包含适合于被治疗的特定适应证的任何活性成分，优选具有补充活性的那些，所述活性不会不利地影响彼此。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫调节剂，细胞抑制剂，细胞粘附抑制剂，细胞毒性剂，细胞凋亡活化剂或增加细胞对凋亡诱导剂敏感性的治疗剂。在一个具体实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏剂，抗代谢物，拓扑异构酶抑制剂，DNA嵌入剂，烷化剂，激素疗法，激酶抑制剂，受体拮抗剂，肿瘤细胞凋亡的激活剂或抗血管生成剂。
这样的其它活性剂合适地以对于预期目的有效的量组合存在。这些其它活性剂的有效量取决于所用T细胞活化双特异性抗原结合分子的量，病症或治疗的类型，以及上述讨论的其它因素。T细胞活化双特异性抗原结合分子通常以与本文所述相同的剂量和施用途径或本文所述的约1至99％的剂量，或以经验/临床确定合适的任何剂量和任何途径使用。
上述的组合疗法包括组合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的组合物中)和分开的给药，在这种情况下，施用本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子可以在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前，同时和/或随后发生。本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子也可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一方面，提供了含有用于治疗，预防和/或诊断上述病症的材料的制品。该制品包含容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器，IV溶液袋等。容器可以由各种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳组合物，其本身或与另一种有效治疗，预防和/或诊断病症的组合物组合，并且容器可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的病症。此外，制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的该实施方案中的制品可以进一步包含指示组合物可用于治疗特定病症的包装插页。或者或另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户的观点希望的其它材料，包括其它缓冲剂，稀释剂，过滤器，针头和注射器。
筛选方法
本文描述了使用单一轻链或其高度同源变体来鉴定合适的重链可变区以构建T细胞活化双特异性抗原结合分子的方法的有利效率。为了构建这些结合剂，轻链不仅必须能够与各种重链配对以产生不同特异性的结合部分，而且保留形成可以活化其结合的T细胞的结合部分的能力。
本文描述的轻链可以用作常见的轻链(CLC)，用于鉴定合适的重链可变区，例如通过筛选重链可变区的文库。这允许保持先前鉴定和验证的CD3结合剂，使得仅需要鉴定用于T细胞活化双特异性抗原结合分子的靶抗原结合部分的新靶抗原结合剂。
因此，在另一方面，本发明提供了用于鉴定用于T细胞活化抗原和靶细胞抗原特异性的双特异性抗原结合分子的可变重链的方法，其包括筛选包含可变重链与包含SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链的组合文库的步骤。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。该方法可用于开发稳定的，功能性的高亲和力结合剂，以改善T细胞活化双特异性抗原结合分子的产生，所述分子例如，具有CD3特异性和靶抗原特异性，其中靶抗原是不相关的，例如FolR1，MUC1和BCMA。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，根据上面提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
一般方法
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook et al.,Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989所述。分子生物学试剂根据制造商的说明使用。关于人类免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见:Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th ed.,NIH Publication No.91-3242。
DNA测序
通过在Synergene(Schlieren)上的标准双链测序测定DNA序列。
基因合成
需要时，所需的基因片段是通过PCR使用合适的模板产生的或由Geneart AG(Regensburg，Germany)从合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动化基因合成合成的。在没有确切基因序列的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从源自适当组织的RNA分离基因。将侧翼为单个限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化质粒DNA，并通过紫外光谱测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适的限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。用编码前导肽的5’端DNA序列设计所有构建体，所述前导肽靶向蛋白质以在真核细胞中分泌。
从PBMCs分离原代人类pan T细胞
通过Histopaque密度离心法从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)制备外周血单核细胞(PBMC)，从当地血库或来自健康人类供体的新鲜血液制备所述淋巴细胞制剂。简言之，用无菌PBS稀释血液，并在Histopaque梯度(Sigma，H8889)上仔细分层。在室温450×g离心30分钟后(制动器关闭)，弃去含有相间(interphase)的PBMC上方的部分血浆。将PBMC转移到新的50ml Falcon管中，并用PBS填充管至总体积为50ml。将混合物在室温下以400×g离心10分钟(制动器打开)。弃去上清液，PBMC沉淀用无菌PBS洗涤两次(在4℃下以350xg离心步骤10分钟)。自动计数所得的PBMC群体(ViCell)，并在37℃，5％CO2的培养箱中储存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直至测定开始。
根据制造商的说明书，使用Pan T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec#130-091-156)进行来自PBMC的T细胞富集。简言之，将细胞沉淀物每1000万个细胞稀释至40μl冷缓冲液中(含有0.5％BSA，2mM EDTA的PBS，无菌过滤)，与10μl生物素-抗体混合物/每1000万个细胞在4℃下温育10分钟。每1000万个细胞加入30μl冷缓冲液和20μl抗生物素磁珠，混合物在4℃下再温育15分钟。通过加入10-20倍的当前体积和随后的300×g 10分钟离心步骤洗涤细胞。将高达1亿个细胞重新悬浮于500μl缓冲液中。根据制造商的说明书，使用LS柱(Miltenyi Biotec#130-042-401)进行未标记的人pan T细胞的磁分离。自动计数所得的T细胞群(ViCell)，并在37℃，5％CO2的培养箱中储存在AIM-V培养基中，直到测定开始(不超过24小时)。
从PBMCs分离原代人初始T细胞
通过Histopaque密度离心法从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)制备外周血单核细胞(PBMC)，从当地血库或来自健康人类供体的新鲜血液制备所述淋巴细胞制剂。使用来自Miltenyi Biotec(#130-093-244)的初始CD8+T细胞分离试剂盒(#130-093-244)，根据制造商的说明进行PBMC的T细胞富集，但是跳过CD8+T细胞的最后一个分离步骤(也参见主要原代人T细胞的分离的描述)。
从脾细胞中分离鼠pan T细胞
从C57BL/6小鼠中分离脾脏，转移到含有MACS缓冲液(PBS+0.5％BSA+2mM EDTA)的GentleMACS C-Tube管(Miltenyi Biotech#130-093-237)中，并根据制造商的说明书，用GentleMACS Dissociator解离以获得单细胞悬浮液。使细胞悬浮液通过预分离过滤器以除去剩余的未解离的组织颗粒。在4℃下以400×g离心4分钟后，加入ACK裂解缓冲液以裂解红细胞(室温温育5分钟)。剩余的细胞用MACS缓冲液洗涤两次，计数并用于分离鼠pan T细胞。根据制造商的说明书，使用Miltenyi Biotec的Pan T细胞分离试剂盒(#130-090-861)进行阴性(磁性)选择。自动计数所得的T细胞群(ViCell)并立即用于进一步的测定。
从肝素化血液中分离原代食蟹猴PBMC
通过从健康食蟹者供体的新鲜血液密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)，如下:用无菌PBS将肝素化血液1:3稀释，用无菌PBS将Lymphoprep培养基(Axon Lab#1114545)稀释至90％。将两倍体积的稀释的血液层压在一倍体积的稀释密度梯度上，并通过在室温下以520×g离心30分钟而不用制动分离PBMC级分。将PBMC条带转移到新鲜的50ml Falcon管中，并通过在4℃以400×g离心10分钟用无菌PBS洗涤。进行一次低速离心以除去血小板(在150×g，4℃下15分钟)，并自动计数所得的PBMC群体(ViCell)并立即用于进一步测定。
示例性抗原生成
抗原以两种不同的形式表达。对于非含Fc构建体，细胞外结构域与连接到其C-末端的avi-His标签融合。对于含Fc的抗原，应用使用旋钮入孔技术将Fc融合到异二聚化Fc部分的N末端(Merchant等人)以便每个Fc二聚体仅具有一个分子的目的蛋白质。这样做是为了避免目的蛋白质的任何人造二聚结构的形成。此处的avi标签附着于Fc的C末端。这些蛋白质可以容易地在诸如HEK或CHO的哺乳动物细胞中瞬时表达，通过蛋白A层析纯化，生物素化，并可以根据标准方法通过生物素化的avi标签连接到链霉抗生物素蛋白珠用于噬菌体选择。
亲和力成熟
从CLC文库出来的Fab片段的亲和力成熟必须仅限于重链，以保持轻链以不变的方式保留CD3e结合亲和力。由于我们的初始文库仅在重链的CDR3中被随机化，所以我们专注于CDR1和2的成熟步骤。为此，我们为每个构架设计PCR引物，其分别在CDR1和CDR2中引入随机化。每个引物被设计为结合六个重链构架中的一个，并且可以以通用方式用于来自该特定噬菌体文库的每个抗体克隆。成熟过程按照Knappik或Steidl(Knappik et al.,J.Mol.Biol.(2000)296,57-86).S.Steidl et al.；Molecular Immunology 46(2008)135–144)的描述进行。如上所述进行噬菌体淘选，不同之处在于可溶性抗原的浓度以2x10^-8M使用并且最终浓度降至2x10^-10M。
CLC TCB的克隆，生产，纯化和生化表征
所得到的重链和轻链DNA序列的可变区用预先插入相应受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链进行亚克隆。抗体表达由MPSV启动子驱动并在CDS的3’末端携带合成的polyA信号序列。此外，每个载体含有用于在HEK293-EBNA细胞中瞬时表达的EBV OriP序列。作为抗体同种型使用IgG1 P329G LALA或IgG4 SPLE PG。
通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生CLC TCB。以相应表达载体以1:1.3比例的(“载体重链Fc(孔)”:“载体重链Fc(旋钮)-FabCrossfab”):“载体共同轻链”转染细胞。
对于转染，HEK293 EBNA细胞在CD CHO培养基中悬浮无血清培养。为了在500ml摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，通过210×g将细胞离心5分钟，用预热的20毫升CD CHO培养基代替上清液。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终量为200g DNA。加入540微升PEI后，溶液涡旋15秒，随后在室温下温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500ml摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育后，加入160ml F17培养基，培养细胞24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％进料1。7天后，收集培养上清液，通过在210×g离心15分钟进行纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，并加入终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠，并保持在4℃。
通过使用ProteinA的亲和层析从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质。将上清液装载在用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap ProteinAHP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤除去未结合的蛋白质。在超过20个柱体积中，从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度洗脱靶蛋白。通过加入1/10的0.5M磷酸钠(pH8)来中和蛋白质溶液。将靶蛋白浓缩并过滤，然后加载到用20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液pH6.0平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。
在存在和不存在还原剂的情况下，通过CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)。2ug样品用于分析。
使用TSKgel G3000SW XL分析大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸一氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液在25℃分析抗体样品的聚集物含量。
基于细胞的测定中的CLC TCB表征
CLC TCB与ECD肿瘤抗原和CD3表达细胞的结合
使用表达目的抗原X的肿瘤细胞和表达CD3e的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)测试CLC TCB的结合。简言之，收集细胞，计数，检查存活力，并以2x106个细胞/ml在FACS缓冲液(100μl PBS 0.1％BSA)中重新悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.2x106个细胞)在4℃在具有增加浓度的CLC TCB(3pM-200nM)的圆底96孔板中温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃下与PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性二级抗体(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)再温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，并使用FACS CantoII(软件FACS Diva)通过FACS门控活的DAPI阴性细胞立即分析。使用GraphPadPrism5获得结合曲线。
实施例1
生物素化叶酸受体-Fc融合物的纯化
为了产生针对人FolR1的新抗体，产生以下抗原和筛选工具作为单价Fc融合蛋白(与Fc-旋钮的铰链区连接的抗原的胞外结构域，其与Fc-旋钮分子共表达)。基于从GenBank或SwissProt获得的序列合成抗原基因(Geneart，Regensburg，Germany)并将其插入到表达载体中以产生与Fc-旋钮的融合蛋白，其具有用于体内或体外生物素化的C末端Avi标记。通过在生产过程中共表达编码细菌生物素连接酶的细菌birA基因来实现体内生物素化。所有基因的表达在嵌合MPSV启动子的控制下在质粒上进行，所述质粒含有用于在含有EBNA的细胞系中稳定维持质粒的oriP元件。
为了制备生物素化的单体抗原/Fc融合分子，用编码融合蛋白(旋钮和孔链)两个组分以及生物素化反应所必需的酶BirA的三种载体共转染指数生长的悬浮HEK293 EBNA细胞。相应的载体以9.5:9.5:1的比例(“抗原ECD-Fc旋钮-avi标记”:“Fc孔”:“BirA”)使用。
对于在500ml摇瓶中的蛋白质生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，将细胞在210g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。将表达载体重悬于含有200μg载体DNA的20mL CD CHO培养基中。加入540μL聚乙烯亚胺(PEI)后，将溶液混合15秒，并在室温下温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在具有5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL F17培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，向培养物中加入1mM丙戊酸和7％进料1(Lonza)。生产培养基中还补充有100μM生物素。培养7天后，通过以210g离心细胞15分钟收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和层析从细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质，然后进行大小排阻层析。对于亲和层析，将上清液装载在用40mL 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠pH7.5平衡的HiTrap ProteinA HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠pH7.5清洗，除去未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3.0上产生的线性pH梯度洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3.0洗涤。
通过加入1/10(v/v)0.5M磷酸钠，pH8.0调节收集的级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后加载到用20mM组氨酸，140mM氯化钠，pH 6.0平衡的HiLoad Superdex 200柱(GEHealthcare)上。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定蛋白质浓度。根据制造商的说明书(仪器Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)，在存在和不存在还原剂的情况下，通过SDS毛细管电泳分析FolR1-Fc-融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸一盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液中25℃下平衡的TSKgel G3000 SW XL分析大小排阻柱(Tosoh)分析样品的聚集物含量。
使用市售抗体通过表面等离振子共振测定来分析纯化的抗原-Fc-融合蛋白，以确认抗原的正确和自然构象(数据未显示)。
表1:用于人FolR1抗体的分离，选择和反选择产生的抗原
Figure BDA0001351705530000751
Figure BDA0001351705530000761
Figure BDA0001351705530000771
表2:FolR-Fc融合物的产量和最终单体含量的总结
Figure BDA0001351705530000772
实施例2
产生具有CD3ε特异性的共同轻链
本文所述的T细胞活化双特异性分子包含至少一个CD3结合部分。可以通过免疫实验动物，筛选噬菌体文库或使用已知的抗CD3抗体来产生该部分。通过人源化小鼠亲本抗CD3ε抗体(CH2527)的轻链产生具有CD3ε特异性的共同轻链。对于非人源抗体的人源化，来自非人抗体(供体)的CDR残基必须移植到人(受体)抗体的构架上。通常，通过将供体的序列与潜在受体序列的集合进行比对，并选择与供体具有合理同源性，或在对结构和活性至关重要的某些位置显示相似的氨基酸的受体序列，来选择受体构架序列。在目前的情况下，通过将亲本抗体的小鼠VL-结构域序列与人类种系序列的集合进行比对并选择显示高序列同一性的人序列来进行抗体受体构架的搜索。令人惊讶的是，在属于λ型的V结构域家族7的相当罕见的人类轻链中，更准确地说，在hVL_7_46(IMGT命名法，GenBank Acc No.Z73674)中发现了构架序列同源性方面的良好匹配。随后选择这种罕见的人类轻链作为CH2527轻链人源化的受体构架。将小鼠轻链可变结构域的三个互补决定区(CDR)移植到该受体构架上。由于构架4区域不是种系V基因的可变区的一部分，所以该区域(J-元件)的比对单独进行。因此，选择IGLJ3-02序列用于该轻链的人源化。
产生13个人源化变体(CH2527-VL7_46-1至VL7_46-10,VL7_46-12至VL7_46-14)。这些变体在构架残基(及其组合)中不同，所述构架残基回复突变为鼠V-结构域序列，或这些变体在CDR残基(Kabat定义)中不同，所述CDR残基可以保持与人种系序列相同。在CDR之外的以下构架残基在最终人源化VL结构域变体VL7_46-13中被回复突变为鼠残基(列出了鼠残基):V36，E38，F44，G46，G49和G57。人J元件IGLJ3-02与鼠亲本抗体的J-元件100％相同。
实施例3
具有CD3ε特异性的人源化变体的SPR评估
将人源化VL变体以2+1经典形式(图1D)评估为嵌合体，即人源化轻链V-结构域与鼠重链V结构域配对。在ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad)上进行SPR评估。更准确地说，在垂直取向上，在抗Fab衍生化的GLM传感器芯片((Goat Anti-Human IgG,F(ab’)2 FragmentSpecific,Jackson ImmunoResearch)上直接从培养上清液中捕获变体。随后将以下分析物以单一浓度水平注射以便评估与人和食蟹猴CD3ε:3μM hu CD3ε(-1-26)-Fc(knob)-avi(ID807)和2.5μM cy CD3ε-(-1-26)-Fc(knob)-Avi-Fc(hole)(ID873)的结合。结合反应与鼠控制构建体的结合进行定性比较并分级+(观察到可比较的结合)，+/-(观察到减少的结合)和-(没有观察到结合)。捕获抗体在配体捕获和分析物结合的每个循环后再生，并且在研究结束时重新注射小鼠构建体以确认捕获表面的活性。结果总结在表3中。
人源化VL变体 结合CD3ε
murine_CH2527-VL +
CH2527-VL7_46-1 -
CH2527-VL7_46-2 -
CH2527-VL7_46-3 -
CH2527-VL7_46-4 -
CH2527-VL7_46-5 -
CH2527-VL7_46-6 -
CH2527-VL7_46-7 -
CH2527-VL7_46-8 -
CH2527-VL7_46-9 -
CH2527-VL7_46-10 -
CH2527-VL7_46-12 +/-
CH2527-VL7_46-13 +
CH2527-VL7_46-14 -
表3基于SPR对与CH2527的鼠重链组合的人源化轻链变体的定性结合评估。仅最终选择的人源化轻链变体CH2527-VL7_46-13以粗体字突出显示，显示与人和食蟹猴CD3ε的可比的结合。
实施例4
具有CD3ε特异性的人源化共同轻链的性质
为人源化前导分子选择的轻链V-结构域变体为VL7_46-13。确定了人源化程度，即人源化V-结构域与人种系V-结构域序列的序列同源性。对于VL7_46-13，在人源化之前，与最接近的人种系同源物的总体序列同一性为65％，人源化之后为80％。省略CDR区，与最接近的人种系同源物的序列同一性为92％。从表3可以看出，VL7_46-13是显示与亲本鼠抗体相当的结合并且还保留其对食蟹猴CD3ε的交叉反应性的13个变体组中唯一的人源化VL变体。该结果表明，在不丧失与CD3ε的结合亲和力的情况下，人源化鼠VL结构域不是微不足道的，其需要在鼠构架残基(特别是G46)中的一些回复突变而在CD1中保留G24。此外，该结果表明VL结构域在靶标识别中起关键作用。重要的是，基于属于λ型的V结构域家族7的罕见的人种系并保留对CD3ε的亲和力和特异性的人源化VL结构域VL7_46-13也适合用作Fab-形式的噬菌体展示的抗体文库中的共同轻链，并且能够成功选择新的特异性，这极大地促进了结合CD3ε和例如肿瘤靶标并且共享相同的“共同”轻链的双特异性分子的产生和生产。
实施例5
使用源自HVK1-39的人种系共同轻链产生噬菌体展示抗体文库
产生类似于全长人IgG的双特异性抗体的几种方法利用诱导两种不同重链异二聚化的Fc区中的修饰。这样的例子包括旋钮入孔(Merchant et al.,NatBiotechnol.1998Jul；16(7):677-81)，SEED(Davis et al.,Protein Eng DesSel.2010Apr；23(4):195-202)和静电转向技术(Gunasekaran et al.,J BiolChem.2010Jun 18；285(25):19637-46)。尽管这些方法能够有效地对两个不同重链进行异二聚化，但同源轻链和重链的适当配对仍然是一个问题。共同轻链(LC)的使用可以解决这个问题(Merchant,et al.Nat Biotech 16,677–681(1998))。
在这里，我们描述了在M13噬菌体上展示的抗体文库的产生。本质上，我们为具有一个恒定(或“共同”)轻链的重链设计了多构架文库。设计该文库用于生成多特异性抗体，而不需要使用复杂的技术来避免轻链错配。
通过使用共同的轻链，可以促进这些分子的产生，因为不再发生错配，并且促进高纯度双特异性抗体的分离。与其他形式相比，使用Fab片段作为构件而不是例如使用scFv片段导致更高的热稳定性和缺乏scFv聚集和分子间scFv的形成。
文库产生
在下文中描述了用于在M13噬菌体上展示的抗体文库的产生。基本上，我们为重链与一个恒定(或“共同”)轻链设计了多构架文库。
我们在文库中使用了这些重链(GenBank检索号在括号中):
IGHV1-46*01(X92343)(SEQ ID NO:104),
IGHV1-69*06(L22583),(SEQ ID NO:105)
IGHV3-15*01(X92216),(SEQ ID NO:106)
IGHV3-23*01(M99660),(SEQ ID NO:107)
IGHV4-59*01(AB019438),(SEQ ID NO:108)
IGHV5-51*01(M99686),(SEQ ID NO:109)
所有重链均使用IGHJ2作为J元件，使用IGHJ6序列的IGHV1-69*06除外。随机化的设计包括CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3。对于CDR-H1和CDR-H2，选择“软”随机化策略，随机化寡核苷酸使得种系序列的氨基酸的密码子以50％存在。半胱氨酸除外，所有其他氨基酸总共占余下的50％。在由于存在遗传D元件而不存在种系氨基酸的CDR-H3中，设计了寡核苷酸，其允许V元件和J元件之间4到9个氨基酸长度的随机插入片段的使用。包含在其随机化部分中的那些寡核苷酸，例如三个氨基酸G/Y/S各自以15％存在，那些氨基酸A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E各自以4,6％存在。
在Hoogenboom et al.,Nucleic Acids Res.1991,19,4133–413；Lee et.,alJ.Mol.Biol.(2004)340,1073–1093中描述了用于产生抗体文库的示例性方法。轻链衍生自人序列hVK1-39，并且以未修饰和非随机化的方式使用。这将确保相同的轻链可以用于其他项目，而无需额外的修饰。
示例性文库选择:
使用靶抗原X的单体和生物素化的细胞外结构域，根据以下程序在溶液中进行所有亲和力成熟文库的选择。
1.每个文库的10^12个噬菌粒颗粒与100nM生物素化的可溶性抗原结合0.5小时，总体积为1ml。2.捕获生物素化抗原，通过加入约～5×10^7个链霉抗生物素蛋白包被的磁珠10分钟分离特异性结合的噬菌体颗粒。3.使用5-10x 1ml PBS/Tween20和5-10x 1ml PBS洗涤磁珠。4.通过加入1ml 100mM TEA(三乙胺)10分钟进行噬菌体颗粒的洗脱，并通过加入500ul 1M Tris/HCl pH 7.4进行中和，和5.再次感染指数生长的大肠杆菌TG1细菌，用辅助噬菌体VCSM13感染并在随后的选择轮中应用噬菌粒颗粒的随后的PEG/NaCl沉淀。使用恒定或降低(从10^-7M至2×10^-9M)的抗原浓度进行选择3-5轮。在第2轮中，使用中性抗生物素蛋白(neutravidin)板代替链霉抗生物素蛋白珠进行抗原/噬菌体复合体的捕获。所有结合反应均用100nM牛血清白蛋白或无脂奶粉补充，以便竞争由抗体与塑料支持物的纯粘性结合产生的不想要的克隆。
使用抗原从100nM开始递减的抗原浓度，并在最后一轮选择中降至5nM，进行三或四轮的选择。特定的结合剂定义为比背景高约5倍信号，并通过ELISA鉴定。如下通过ELISA鉴定特异性结合剂:将100μl每孔10nM生物素化的抗原包被在中性抗生物素蛋白平板上。加入含Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二级抗体通过其Flag标记检测结合Fab。ELISA阳性克隆被细菌表达为96孔形式的可溶性Fab片段，使用ProteOn XPR36(BioRad)通过SPR分析将上清液进行动力学筛选实验。鉴定表达具有最高亲和力常数的Fab的克隆，并对相应的噬菌粒进行测序。为了进一步表征，通过PCR从噬菌粒扩增Fab序列，并通过适当的限制性位点克隆到人IgG1表达载体中用于哺乳动物生产。
使用人源化CD3ε特异性共同轻链产生噬菌体展示的抗体文库
这里描述了用于在M13噬菌体上显示的抗体文库的产生。基本上，我们为重链与一个恒定(或“共同”)轻链设计了多构架文库。该文库设计用于产生IgG1 P329G LALA或IgG4SPLE PG同种型的含有Fc的但是FcgR结合无活性的T细胞双特异性抗体，其中一个或两个Fab识别在肿瘤细胞上表达的肿瘤表面抗原，而抗体剩余的Fab臂识别T细胞上的CD3e。
文库产生
在下文中描述了用于在M13噬菌体上展示的抗体文库的产生。基本上，我们为重链与一个恒定(或“共同”)轻链设计了多构架文库。设计该文库仅用于产生IgG1 P329G LALA或IgG4 SPLE PG同种型的含Fc的但FcgR结合无活性T细胞双特异性抗体。
通过随机化寡核苷酸仅在不同重链的CDR3中引入多样性。用于产生抗体文库的方法是本领域公知的，并描述于(Hoogenboom et al.,Nucleic Acids Res.1991,19,4133–413；or in:Lee et.,al J.Mol.Biol.(2004)340,1073–1093)。
我们在文库中使用了这些重链:
IGHV1-46*01(X92343),(SEQ ID NO:104)
IGHV1-69*06(L22583),(SEQ ID NO:105)
IGHV3-15*01(X92216),(SEQ ID NO:106)
IGHV3-23*01(M99660),(SEQ ID NO:107)
IGHV4-59*01(AB019438),(SEQ ID NO:108)
IGHV5-51*01(M99686),(SEQ ID NO:109)
我们在文库中使用源自人源化人和食蟹猴CD3ε特异性抗体CH2527的轻链:(VL7_46-13；SEQ ID NO:112)。该轻链未被随机化并且不经任何进一步修饰使用，以确保与不同双特异性结合剂的相容性。
所有重链均使用IGHJ2作为J元件，使用IGHJ6序列的IGHV1-69*06除外。随机化的设计只专注于CDR-H3上，设计PCR寡核苷酸，其允许使用在V元件和J元件之间长度为4至9个氨基酸的随机插入片段。
实施例6
从针对FolR1的共同轻链文库(包含具有CD3ε特异性的轻链)选择抗体片段
通过对FolR1的不同物种(人，食蟹猴和小鼠)的噬菌体展示选择获得包含具有CD3ε特异性的共同轻链VL7_46-13的抗体16A3,15A1,18D3,19E5,19A4,15H7,15B6,16D5,15E12,21D1,16F12,21A5,21G8,19H3,20G6和20H7。克隆16A3,15A1,18D3,19E5,19A4,15H7,15B6,21D1,16F12,19H3,20G6和20H7选自子文库，其中共同轻链与基于人种系VH1_46的重链所有组成成分配对。在该子文库中，VH1_46的CDR3已经基于6个不同的CDR3长度随机化。克隆16D5,15E12,21A5和21G8选自子文库，其中共同轻链与基于人种系VH3_15的重链所有组成成分配对。在该子文库中，VH3_15的CDR3已经基于6个不同的CDR3长度被随机化。为了获得物种交叉反应(或鼠FolR1反应性)抗体，不同种类的FolR1在以下3轮生物淘选中以不同的方式交替(或保持恒定):16A3和15A1(人-食蟹猴-人FolR1)；18D3(食蟹猴-人-小鼠FolR1)；19E5和19A4(对小鼠FolR1的3轮)；15H7,15B6,16D5,15E12,21D1,16F12,21A5,21G8(人-食蟹猴-人FolR1)；19H3,20G6和20H7(对小鼠FolR1的3轮)。
作为噬菌体展示选择以及基于ELISA和SPR的筛选的抗原的人，小鼠和食蟹猴FolR1在HEK EBNA细胞中瞬时表达为N末端单体Fc-融合物，并且通过在位于携带受体链(Fc旋钮链)的Fc部分的C末端的avi标记识别序列共表达BirA生物素连接酶在体内位点特异性生物素化。为了评估对FolR1的特异性，以相同的方式产生了两种相关受体:人FolR2和FolR3。
根据以下模式在溶液中进行选择轮(生物淘选):
1.在10μg/ml不相关人IgG包被的maxisorp平板上预先清除～1012个噬菌粒颗粒，以消耗识别抗原Fc部分的抗体文库。
2.在100nM不相关的非生物素化的Fc旋钮入孔构建体的存在下，用100nM生物素化的人，食蟹猴或小鼠FolR1温育非Fc结合噬菌粒颗粒0.5小时，以进一步耗尽总体积1ml中的Fc-结合剂。
3.通过转移到中性抗生物素蛋白预包被的微量滴定板的4孔中10分钟(在第1和第3轮)，捕获生物素化的FolR1和附着的特异性结合噬菌体。
4.使用5x PBS/Tween20和5x PBS清洗各孔。
5.通过每孔加入250μl 100mM TEA(三乙胺)洗脱噬菌体颗粒10分钟并通过向来自4个孔的合并的洗脱液中加入500ul 1M Tris/HCl pH 7.4中和。
6.通过在含有100nM生物素捕获的FolR2或FolR3的中性抗生物素蛋白预包被的微量滴定板上温育进行中和的洗脱物的后清除，用于最终去除Fc结合剂和非特异性结合剂。
7.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染，在30℃下振荡器上温育过夜，并随后PEG/NaCl沉淀将在下一个选择轮中使用的噬菌粒颗粒。
使用100nM的恒定抗原浓度进行3轮的选择。在第2轮中，为了避免中性抗生物素蛋白结合剂的富集，通过添加5.4×107个链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行抗原:噬菌体复合体的捕获。如下通过ELISA鉴定特异性结合剂:将100ul 25nM生物素化的人，食蟹猴或小鼠FolR1和10μg/ml的人IgG分别包被在中性抗生物素蛋白板和maxisorp板上。加入含Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二级抗体通过其Flag标记检测结合Fab。在人FolR1上显示信号并且对人IgG呈阴性的克隆入围用于进一步分析，并且以类似的方式对其余两种FolR1进行了测试。它们在0.5升培养体积中被细菌表达，亲和纯化并使用BioRad的ProteOnXPR36生物传感器通过SPR分析进一步表征。
使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)在25℃下用生物素化的人，食蟹猴和小鼠FolR1以及中性抗生物素蛋白捕获固定在NLC芯片上的人FolR2和FolR3(阴性对照)，通过表面等离振子共振(SPR)测量所选克隆的亲和力(KD)。抗原(配体)的固定:用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠，pH 7.4,0.005％Tween 20)稀释重组抗原至10μg/ml，然后以30μl/分钟在垂直方向注射。注射分析物:对于“一次性动力学”测量，注射方向改变为水平方向，纯化的Fab的两倍稀释系列(不同浓度范围)同时沿着单独的通道1-5注射，结合时间为200秒，解离时间600秒。沿着第六通道注入缓冲液(PBST)以提供用于参考的“线内”空白。在ProteOnManager v3.1软件中使用简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。表4列出了特异于FolR1的所选克隆的平衡解离常数(KD)。
表4：通过噬菌体展示从包含特异于CD3ε的人源化轻链VL7_46-13的共同轻链子文库选择的抗FolR1抗体(Fab-形式)的平衡解离常数(KD)。KD以nM计。
Clone huFolR1[nM] cyFolR1[nM] muFolR1[nM] huFolR2[nM] huFolR3[nM]
16A3 21.7 18 very weak no binding no binding
15A1 30.9 17.3 very weak no binding no binding
18D3 93.6 40.2 very weak no binding no binding
19E5 522 276 19.4 no binding no binding
19A4 2050 4250 43.1 no binding no binding
15H7 13.4 72.5 no binding no binding no binding
15B6 19.1 13.9 no binding no binding no binding
16D5 39.5 114 no binding no binding no binding
15E12 55.7 137 no binding no binding no binding
21D1 62.6 32.1 no binding no binding no binding
16F12 68 90.9 no binding no binding no binding
21A5 68.8 131 no binding no binding no binding
21G8 130 261 no binding no binding no binding
19H3 no binding no binding 89.7 no binding no binding
20G6 no binding no binding 78.5 no binding no binding
实施例7
从针对FolR1的通用多构架文库选择抗体片段
通过基于针对不同物种(人，食蟹猴和小鼠)的FolR1的通用多构架子文库的噬菌体展示选择获得抗体11F8，36F2，9D11，5D9，6B6和14E4。在这些多构架子文库中，具有随机化CDR3(3个不同长度)的不同VL结构域与具有随机化CDR3(6个不同长度)的不同VH结构域配对。选择的克隆具有以下VL/VH配对：11F8(Vk_1_5/VH_1_69)，36F2(Vk_3_20/VH_1_46)，9D11(Vk2D_28/VH1_46)，5D9(Vk3_20/VH1_46)，6B6(Vk3_20/VH1_46)，和14E4(Vk3_20/VH3_23)。为了获得物种交叉反应(或鼠FolR1反应性)抗体，通过3或4轮生物淘选以不同的方式交替(或保持不变)不同物种的FolR1：11F8(食蟹猴-小鼠-人FolR1)；36F2(人-小鼠-食蟹猴-小鼠FolR1)；9D11(食蟹猴-人-食蟹猴FolR1)；5D9(人-食蟹猴-人FolR1)；6B6(人-食蟹猴-人FolR1)和14E4(针对小鼠FolR1的3轮)。
作为噬菌体展示选择以及基于ELISA和SPR的筛选的抗原的人，小鼠和食蟹猴FolR1在HEK EBNA细胞中瞬时表达为N末端单体Fc-融合物，并且通过在位于携带受体链(Fc旋钮链)的Fc部分的C末端的avi标记识别序列共表达BirA生物素连接酶在体内位点特异性生物素化。为了评估对FolR1的特异性，以相同的方式产生了两种相关受体:人FolR2和FolR3。
根据以下模式在溶液中进行选择轮(生物淘选):
1.在10μg/ml不相关人IgG包被的maxisorp平板上预先清除～1012个噬菌粒颗粒，以消耗识别抗原Fc部分的抗体文库。
2.在100nM不相关的非生物素化的Fc旋钮入孔构建体的存在下，用100nM生物素化的人，食蟹猴或小鼠FolR1温育非Fc结合噬菌粒颗粒0.5小时，以进一步耗尽总体积1ml中的Fc-结合剂。
3.通过转移到中性抗生物素蛋白预包被的微量滴定板的4孔中10分钟(在第1和第3轮)，捕获生物素化的FolR1和附着的特异性结合噬菌体。
4.使用5x PBS/Tween20和5x PBS清洗各孔。
5.通过每孔加入250μl 100mM TEA(三乙胺)洗脱噬菌体颗粒10分钟并通过向来自4个孔的合并的洗脱液中加入500ul 1M Tris/HCl pH 7.4中和。
6.通过在含有100nM生物素捕获的FolR2或FolR3的中性抗生物素蛋白预包被的微量滴定板上温育进行中和的洗脱物的后清除，用于最终去除Fc结合剂和非特异性结合剂。
7.用洗脱的噬菌体颗粒的上清液再感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染，在30℃下振荡器上温育过夜，并随后PEG/NaCl沉淀将在下一个选择轮中使用的噬菌粒颗粒。
使用100nM的恒定抗原浓度进行3轮的选择。在第2和第4轮中，为了避免中性抗生物素蛋白结合剂的富集，通过添加5.4×107个链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行抗原:噬菌体复合体的捕获。如下通过ELISA鉴定特异性结合剂:将100ul 25nM生物素化的人，食蟹猴或小鼠FolR1和10μg/ml的人IgG分别包被在中性抗生物素蛋白板和maxisorp板上。加入含Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二级抗体通过其Flag标记检测结合Fab。在人FolR1上显示信号并且对人IgG呈阴性的克隆入围用于进一步分析，并且以类似的方式对其余两种FolR1进行了测试。它们在0.5升培养体积中被细菌表达，亲和纯化并使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR分析进一步表征。
使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)在25℃下用生物素化的人，食蟹猴和小鼠FolR1以及中性抗生物素蛋白捕获固定在NLC芯片上的人FolR2和FolR3(阴性对照)，通过表面等离振子共振(SPR)测量所选克隆的亲和力(KD)。抗原(配体)的固定:用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠，pH 7.4,0.005％Tween 20)稀释重组抗原至10μg/ml，然后以30μl/分钟在垂直方向注射。注射分析物:对于“一次性动力学”测量，注射方向改变为水平方向，纯化的Fab的两倍稀释系列(不同浓度范围)同时沿着单独的通道1-5注射，结合时间分别为150或200秒，解离时间分别为200或600秒。沿着第六通道注入缓冲液(PBST)以提供用于参考的“线内”空白。在ProteOn Manager v3.1软件中使用简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。表5列出了特异于FolR1的所选克隆的平衡解离常数(KD)。
表5:从通用多构架子文库通过噬菌体展示选择的抗FolR1抗体(Fab-形式)的平衡解离常数(KD)。KD以nM计。
Figure BDA0001351705530000891
实施例8
生产和纯化IgG和T细胞双特异性形式的新型FolR1结合剂
为了鉴定能够诱导选择的靶细胞的T细胞依赖性杀伤的FolR1结合剂，将从共同轻链或Fab文库分离的抗体转化为相应的人IgG1形式。简而言之，使用Fab克隆作为模板，通过标准PCR反应扩增来自噬菌体展示的独特的FolR1结合剂的可变重链和可变轻链。将PCR产物纯化并插入(通过限制性内切核酸酶和基于连接酶的克隆，或通过使用来自Invitrogen的InFusion试剂盒的“重组”(’recombineering’))到合适的表达载体，其中它们与适当的人恒定重链或人恒定轻链融合。这些载体中的表达盒由嵌合MPSV启动子和合成的多聚腺苷酸化位点组成。此外，质粒含有来自EB病毒的oriP区域，用于在携带EBV核抗原(EBNA)的HEK293细胞中稳定维持质粒。PEI介导的转染后，在HEK293 EBNA细胞中瞬时产生抗体，并通过标准蛋白A亲和层析，然后按照通过大小排阻层析纯化，如下所述:
瞬时转染和生产
使用如下所述的所需载体的PEI介导的转染方法，在HEK293 EBNA细胞中瞬时产生本文使用的所有(双特异性)抗体(如果不是从商业来源获得)。将HEK293 EBNA细胞在CDCHO培养基中悬浮无血清培养。为了在500ml摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿HEK293EBNA细胞(对于备选规模，所有量都相应地调整)。对于转染，以210×g将细胞离心5分钟，用预热的20ml CD CHO培养基代替上清液。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终量为200μg DNA。加入540μl PEI后，溶液涡旋15秒，随后在室温下温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500ml摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育后，加入160ml F17培养基，培养细胞24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％进料1。7天后，收集上清液，通过在210×g离心15分钟进行纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，并加入终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠，并保持在4℃。生产后，收集上清液，将含抗体的上清液通过0.22μm无菌过滤器过滤并在4℃下储存直至纯化。
抗体纯化
使用标准方法两步纯化所有分子，如蛋白A亲和纯化(
Figure BDA0001351705530000911
Explorer)和大小排阻层析。将从瞬时生产获得的上清液调节至pH8.0(使用2M TRIS pH 8.0)并施加到用8个柱体积(cv)缓冲液A(20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH7.5)平衡的HiTrap PA FF(GEHealthcare，柱体积(cv)＝5ml)。用10cv缓冲液A洗涤后，使用pH梯度在12cv内洗脱蛋白质到缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH3,100mM NaCl，100mM甘氨酸)。合并含有目的蛋白质的级分，并将溶液的pH温和调节到pH6.0(使用0.5M Na2HPO4pH 8.0)。
使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000MWCO HY,Sartorius)将样品浓缩至2ml，随后将其应用于用20mM组氨酸，pH 6.0,140mM NaCl,0.01％Tween-20平衡的HiLoadTM 16/60SuperdexTM 200制备级(GE Healthcare)。通过分析大小排阻层析分析洗脱级分的聚集物含量。因此，将30μl各级分施加到在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液中在25℃平衡的TSKgel G3000 SW XL分析大小排阻柱(Tosoh)。合并含有少于2％寡聚体的级分，并使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000 MWCOHY，Sartorius)将其浓缩至最终浓度为1-1.5mg/ml。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定蛋白质浓度。根据制造商的说明书(仪器Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)，在存在和不存在还原剂的条件下，通过SDS毛细管电泳分析构建体的纯度和分子量。纯化的蛋白质在液氮中冷冻并保存在-80℃。基于体外表征结果，所选择的结合剂被转化成T细胞双特异性形式。在这些分子中，FolR1:CD3结合部分以2:1的顺序排列，FolR1 Fab位于N末端。对于从标准Fab文库分离的克隆，CD3结合部分作为CrossFab(CH1Cκ杂交)产生，而对于来自共同轻链文库的克隆，不需要杂交。这些双特异性分子与IgG类似地产生和纯化。
表6:分别为IgG和TCB形式的新型FolR1结合剂的产量和单体含量。
Figure BDA0001351705530000921
CLC:共同轻链
实施例9
2+1和1+1 T-细胞双特异性形式
为一种共同轻链结合剂(16D5)制备了四种不同T细胞双特异性形式并为来自Fab文库(9D11)中一种结合剂制备了三种形式以比较它们在体外的杀伤性质。
标准形式是已经描述的2+1反向形式(FolR1:CD3结合部分以2:1的顺序排列，FolR1 Fab位于N末端)。在2+1经典形式中，FolR1:CD3结合部分以2:1的顺序排列，CD3 Fab位于N末端。还制备了两种单价形式。1+1头对尾具有在分子的同一臂上以1:1的顺序排列的FolR1:CD3结合部分，FolR1 Fab位于N末端。在1+1经典形式中，FolR1:CD3结合部分在分子的一个臂上各自存在一次。对于从标准Fab文库分离的9D11克隆，CD3结合部分作为CrossFab(CH1Cκ杂交)产生，而对于来自共同轻链文库的16D5，不需要杂交。类似于标准反向T细胞双特异性形式，产生和纯化了这些双特异性分子。
表7:不同T细胞双特异性形式的产量和最终单体含量的总结。
Figure BDA0001351705530000931
Figure BDA0001351705530000941
实施例10
通过表面等离振子共振对FolR1结合剂的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估FolR1结合剂作为IgG或以T细胞双特异性形式与不同的重组叶酸受体(人FolR1,2和3，小鼠FolR1和食蟹猴FolR1；全部为Fc融合体)的结合。所有SPR实验在25℃下在Biacore T200上用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)进行。
单次注射
首先通过单次注射(表1)分析抗FolR1 IgGs，以表征它们(对人，小鼠和食蟹猴FolR1)的交叉反应性和(对人FolR1，人FolR2，人FolR3的)特异性。人，食蟹猴和小鼠叶酸受体1(FolR1-Fc)或人叶酸受体2和3(FolR2-Fc，FolR3-Fc)的重组生物素化单体Fc融合物使用标准偶联说明(Biacore，弗赖堡/德国)直接偶联在SA芯片上。固定化水平约为300-400RU。以500nM的浓度注射IgG 60秒。结合huFolR2和huFolR3的IgG由于缺乏特异性而被拒绝。大多数结合剂仅在人和食蟹猴FolR1之间具有交叉反应性，与小鼠FolR1的附加交叉反应性大部分时间与丧失特异性相关。
表8:25种新的叶酸受体1结合剂(作为IgG)以及两种对照IgG(Mov19和Farletuzumab)的交叉反应性和特异性。+表示结合，-表示无结合，+/-表示弱结合。
Figure BDA0001351705530000942
Figure BDA0001351705530000951
与叶酸受体1的亲合力
如下所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性分子和重组叶酸受体之间相互作用的亲合力(表9)。
将人类，食蟹猴和小鼠叶酸受体1(FolR1-Fc)的重组生物素化单体Fc融合物使用标准偶联说明(Biacore，Freiburg/Germany)直接偶联在SA芯片上。固定化水平约为300-400RU。将抗FolR1 IgG或T细胞双特异性分子以浓度范围为2.1至500nM，流速为30μL/分钟通过流动池180秒。监测解离600秒。通过减去用重组生物素化的IL2受体Fc融合物固定的参考流动池上获得的应答来校正本体折射率差异。为了分析19H3 IgG和小鼠叶酸受体1的相互作用，将叶酸(Sigma F7876)以浓度2.3μM加入到HBS-EP运行缓冲液中。由IgG或T细胞双特异性分子的二价结合产生的结合曲线近似为1:1 Langmuir结合并用该模型拟合(这是不正确的，但给出了亲合力的想法)。使用Bia Evaluation软件(GE Healthcare)从拟合的速率常数得出相互作用的表观亲合力常数。
表9:选择的FolR1结合剂作为IgG或作为人和食蟹猴FolR1上的T细胞双特异性分子(TCB)的二价结合(亲合力与表观KD)。
Figure BDA0001351705530000961
对叶酸受体1的亲和力
如下所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性分子和重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表10)。
对于亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)在pH5.0下CM5芯片上进行约6000-7000个共振单位(RU)的抗人Fab特异性抗体(Fab捕获试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以10μl/min的流速以20nM捕获抗FolR1 IgGs或T细胞双特异性分子20或40秒，参考流动池未被捕获。将稀释系列(6.17至500nM或12.35至3000nM)的人或食蟹猴叶酸受体1Fc融合体以30μl/min穿过将所有流动池120或240秒，以记录结合期。监测解离期240秒，并从样品溶液切换到HBS-EP引发。在每次循环后，使用60秒10mM甘氨酸-盐酸pH2.1或pH1.5的双注射来再生芯片表面。通过减去在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率差异。通过使用Bia Evaluation软件(GE Healthcare)拟合1:1Langmuir结合，从速率常数得到相互作用的亲和力常数。
表10:选择的FolR1结合剂作为IgG或作为T细胞双特异性分子(TCB)在人和食蟹猴FolR1上的单价结合(亲和力)。
Figure BDA0001351705530000971
对CD3的亲和力
如下所述测定抗FolR1T细胞双特异性分子与重组人CD3εδ-Fc之间的相互作用的亲和力(表11)。
对于亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)在pH5.0下在CM5芯片上进行约9000个共振单位(RU)的抗人Fab特异性抗体(Fab捕获试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以10μl/min的流速以20nM捕获抗FolR1 T细胞双特异性分子40秒，参考流动池未被捕获。将人CD3εδ-Fc融合物的稀释系列(6.17至500nM)以30μl/min在所有流动池上通过240秒以记录结合期。监测解离期240秒，并通过从样品溶液切换到HBS-EP引发。在每次循环后，使用60秒10mM甘氨酸-盐酸pH2.1的双注射，再生芯片表面。通过减去在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率差异。通过使用Bia Evaluation软件(GE Healthcare)拟合1:1 Langmuir结合，从速率常数得出相互作用的亲和力常数。
表11:人CD3-Fc上选择的FolR1 T细胞双特异性分子(TCB)的单价结合(亲和力)。
配体 分析物 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
16D5 TCB huCD3 4.25E+04 3.46E-03 8.14E-08
21A5 TCB huCD3 3.72E+04 3.29E-03 8.8E-08
CD3结合部分对于所有构建体是相同的，并且对于所测量的T细胞双特异性分子(KD范围在60和90nM之间)，亲和力是相似的。
实施例11
在叶酸受体1和CD3上同时结合T细胞双特异性分子
通过如下所述的表面等离振子共振测定抗FolR1 T细胞双特异性分子在重组叶酸受体1和重组人CD3εδ-Fc上的同时结合。将人类，食蟹猴和小鼠叶酸受体1(FolR1-Fc)的重组生物素化单体Fc融合物使用标准偶联说明(Biacore，Freiburg/Germany)直接偶联在SA芯片上。固定水平约为300-400RU。将抗FolR1T细胞双特异性分子以500nM、30μL/分钟的流速通过流动池注射60秒，然后以500nM注射hu CDεδ-Fc 60秒。通过减去用重组生物素化的IL2受体Fc融合物固定的参考流动池获得的应答来校正本体折射率差异。测试的四种T细胞双特异性分子(16D5 TCB,21A5 TCB,51C7 TCB和45D2 TCB)能够按预期同时结合叶酸受体1和人CD3。
实施例12
表位分组(Epitope binning)
对于表位分组，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，将抗FolR1 IgG或T细胞双特异性分子直接固定在pH5.0的CM5芯片上，最终响应为约700RU。然后将500nM huFolR1-Fc捕获60秒，然后捕获500nM的不同结合剂30秒。用两次注射10mM甘氨酸pH 2每次30秒，再生表面。评估不同的结合剂是否可以结合在固定化的结合剂上捕获的huFolR1(表12)。
表12:选择的FolR1结合剂作为IgG或作为人类FolR1上的T细胞双特异性分子(TCB)的表位表征。+表示结合，-表示无结合，+/-表示弱结合
Figure BDA0001351705530000991
基于这些结果和在固定的huFolR1上同时结合的附加数据，将结合剂分成三组。不清楚9D11是否具有单独的表位，因为它替代所有其他结合剂。16D5和21A5似乎在同一组，Mov19，Farletuzumab(Coney et al.,Cancer Res.1991 Nov 15；51(22):6125-32；Kalliet al.,Curr Opin Investig Drugs.2007 Dec；8(12):1067-73)和36F2在另一组(表13)。然而，36F2与Mov 19和Farletuzumab结合不同的表位，因为它结合人，食蟹猴和小鼠的FolR1。
表13:选择的FolR1结合剂作为IgG或作为T细胞双特异性分子(TCB)在人FolR1上的表位分组
表位1 表位2 表位3
16D5 9D11 Mov19
21A5 Farletuzumab
36F2
实施例13
结合剂的选择
通过表面等离振子共振(SPR)和细胞上的体外测定筛选IgG形式的FolR1结合剂以选择最佳候选物。
通过SPR分析抗FolR1 IgGs，以表征它们(对人，小鼠和食蟹猴FolR1)的交叉反应性和(对人FolR1，人FolR2，人FolR3的)特异性。与人FolR2和3的非特异性结合被认为是排除因素。在细胞上证实了对人FolR1的结合和特异性。一些结合剂在表达FolR1的细胞上不结合，即使它们在SPR中识别重组人FolR1。测定聚集温度，其但不是排除因素，因为所选择的结合剂都是稳定的。在多反应性ELISA中测试所选择的结合剂以检查非特异性结合，其导致排除四种结合剂。该方法导致最初选择三种结合剂:36F2(Fab文库)，9D11(Fab文库)和16D5(共同轻链)。36F2从huFolR1快速解离，因此最初不受青睐。
实施例14
新生成的FolR1结合剂与人FolR1阳性肿瘤细胞的特异性结合
通过噬菌体展示使用Fab文库或共同轻链文库使用CD3轻链产生新的FolR1结合剂。将鉴定的结合剂转化为人IgG1形式，并处理对FolR1高表达HeLa细胞的结合。作为参考分子，包括人FolR1结合剂Mov19。在该测定中测试的大多数结合剂显示出与FolR1的中等到良好的结合，一些克隆与Mov19结合同样好(参见图2)。排除克隆16A3,18D3,15H7,15B6,21D1,14E4和16F12，因为不能通过流式细胞术证实与细胞上FolR1的结合。在下一步中，通过排除与密切相关的人类FolR2的结合，对所选克隆进行对人类FolR1的特异性测试。用人FolR1或人FolR2瞬时转染HEK细胞以解决特异性。源自Fab文库的克隆36F2和9D11以及源自CLC文库的克隆16D5和21A5特异性结合人FolR1而不与人FolR2结合(参见图3A-B)。所有其他测试的克隆显示至少一些与人类FolR2的结合(参见图3A-B)。因此，这些克隆被排除在进一步表征之外。通过对用食蟹猴FolR1瞬时转染的HEK细胞进行结合研究来解决FolR1克隆与食蟹猴FolR1的平行交叉反应性。所有测试的克隆能够结合食蟹猴FolR1，并且四个选择的人类FoLR1特异性克隆36F2,9D11,16D5和21A5相当好的结合人和食蟹猴FoLR1(图4)。随后将三种人FolR1特异性食蟹猴交叉反应性结合剂转化为TCB形式，并测试T细胞杀伤和T细胞活化的诱导。这些克隆是来自Fab文库的9D11和来自CLC文库的16D5和21A5。作为参考分子，Mov19 FolR1 TCB被纳入所有研究。然后将这些FolR1 TCB用于比较与HeLa细胞上FolR1结合后的内化的诱导。所有三个测试的克隆在与FolR1结合后被内化，与Mov19 FoLR1 TCB结合时的内化相当(图5)。21A5 FolR1 TCB由于多反应性的迹象而中断。
实施例15
通过FolR1 TCB抗体诱导的表达FolR1的肿瘤靶细胞的T细胞介导的杀伤
使用FolR1 TCB来确定表达FoLR1的肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤。使用一组潜在的靶细胞系通过Qifikit分析来测定FoLR1结合位点。
使用的肿瘤细胞组包含FolR1高表达，中表达和低表达的肿瘤细胞和FolR1阴性细胞系。
表14:肿瘤细胞上的FolR1结合位点
细胞系 来源 FolR1结合位点
Hela 宫颈腺癌 2’240’716
Skov3 卵巢腺癌 91’510
OVCAR5 卵巢腺癌 22’077
HT29 结肠直肠腺癌 10’135
MKN45 胃腺癌 54
测定了三种不同的FoLR1 TCB(含有9D11,16D5和Mov19结合剂)与该组肿瘤细胞系的结合，表明FolR1 TCB特异性结合表达FolR1的肿瘤细胞而不结合FoLR1阴性肿瘤细胞系。结合的构建体的量与FolR1表达水平成正比，并且构建体与可检测的FolR1低细胞系HT-29的结合仍然很好。另外没有阴性对照DP47 TCB与任何使用过的细胞系的结合(图6A-E)。
使用16D5 TCB和9D11 TCB，中间表达细胞系SKOV3和低表达细胞系HT-29进一步用于测试T细胞介导的杀伤和T细胞活化；DP47 TCB被纳入作为阴性对照。在存在已经很低水平的16D5 TCB和9D11 TCB的情况下，两种细胞系都被杀死，即使9D11 TCB与FolR1的结合比16D5 TCB更强地，两种TCB之间的活性也没有差异。与HT-29相比，SKOV3细胞的总体杀伤率更高，这反映了SKOV3细胞上FolR1的较高表达水平(图7A-D)。与此相符，检测到CD4+T细胞和CD8+T细胞上的活化标记物CD25和CD69的强烈上调。在SKOV3细胞和HT-29细胞存在下，T细胞的活化非常相似。阴性对照DP47 TCB在所用浓度不诱导任何杀伤，T细胞上CD25和CD69无明显上调。
表15:使用SKOV3细胞的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化的EC 50值
Figure BDA0001351705530001031
表16:使用HT-29细胞的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化的EC50值
Figure BDA0001351705530001032
Figure BDA0001351705530001041
实施例16
全血中结合红细胞和T细胞活化
为了证明在缺乏表达FoLR1的肿瘤细胞的情况下，没有自发激活，我们测试了是否存在FolR1克隆与可能潜在表达FolR1的红细胞的结合。我们无法观察到9D11 IgG，16D5IgG和Mov19 IgG与红细胞的任何特异性结合，因为包含了阴性对照DP47 IgG(图8)。
为了排除通过FoLR1 TCB与血细胞的任何进一步的非特异性结合或非特异性激活，将9D11 TCB,16D5 TCB和Mov19 TCB加入全血并通过流式细胞术分析CD4+T细胞和CD8+T细胞上的CD25和CD69的上调。DP47 TCB被纳入作为阴性对照。通过分析CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD25和CD69的上调，可以观察到用任何测试的构建体没有发生T细胞活化(图9)。
实施例17
去除9D11轻链中的N-糖基化位点
在分析不同的FolR1结合剂以鉴定潜在的序列热点时，在克隆9D11的CDR L3的末端，鉴定出推定的N-糖基化位点。通常，N-糖基化的共有基序定义为N-X-S/T-X(其中X不是P)。CDR L3的序列(MQASIMNRT(SEQ ID NO:46))完全匹配具有序列N-R-T的共有基序。由于糖基化在不同的生产批次中可能不是完全可再现的，如果CDR L3中的糖基化有助于抗原结合，则这可能影响FolR1结合。为了评估该N-糖基化位点对于FolR1结合是否是重要的，或者可以在不损害结合的情况下被替换，产生了9D11轻链的不同变体，其中通过位点特异性诱变交换N-糖基化位点。
1.瞬时转染和生产
使用PEI介导的转染方法对如下所述的所需的载体在HEK293 EBNA细胞中瞬时产生四种T细胞双特异性分子。将HEK293 EBNA细胞在CD CHO培养基中无血清悬浮培养。为了在500ml摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞(对于备选规模，相应调整所有量)。为了转染，通过210×g将细胞离心5分钟，用预热的20毫升CD CHO培养基代替上清液。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终量为200μg DNA。加入540μl PEI后，涡旋溶液15秒，随后在室温下温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500ml摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育后，加入160ml F17培养基，培养细胞24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％进料1。7天后，收集培养上清液，通过在210×g离心15分钟进行纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，并加入终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠，并保持在4℃。生产后，收获上清液，将含抗体的上清液通过0.22μm无菌过滤器过滤并在4℃下储存直至纯化。
2.抗体纯化
使用标准方法，如蛋白A亲和纯化(
Figure BDA0001351705530001051
Explorer)和大小排阻层析两步纯化所有分子。将从瞬时产生获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH 8.0)，并将其应用于用8个柱体积(cv)缓冲液A(20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M NaCl，0.01％Tween-20，pH7.5)平衡的HiTrap PA HP(GE Healthcare，柱体积(cv)＝5ml)。用10cv缓冲液A洗涤后，使用pH梯度在20cv内洗脱蛋白质至缓冲液B(20mM柠檬酸钠pH2.5,0.5M NaCl，0.01％Tween-20)。合并含有目的蛋白质的级分，将溶液的pH温和调节至pH 6.0(使用2M Tris pH8.0)。使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY，Sartorius)将样品浓缩至1ml，随后将其应用于用20mM组氨酸，pH 6.0,140mM NaCl，0.01％Tween-20平衡的SuperdexTM 20010/300GL(GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析分析洗脱级分的聚集物含量。因此，将30μl各级分施加到在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液25℃下平衡的TSKgel G3000 SW XL分析大小排阻柱(Tosoh)。合并含有少于2％寡聚体的级分，并使用超浓缩器(Vivaspin15R 30.000 MWCO HY，Sartorius)将其浓缩至最终浓度为1-1.5mg/ml。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定蛋白质浓度。根据制造商的说明书(仪器Caliper LabChipGX，Perkin Elmer)，在存在和不存在还原剂的条件下，通过SDS毛细管电泳分析构建体的纯度和分子量。纯化的蛋白质在液氮中冷冻并保存在-80℃。
3.聚集温度
通过以0.1℃/min从25℃至80℃的梯度加热，在Optim1000(Avacta,PALLCorporation)上测试四种构建体的稳定性。记录聚集开始时的温度。
表34:2+1反向T细胞双特异性形式中9D11结合剂的四个N-糖基化位点敲除突变体的产量，单体含量和聚集温度。所有四种突变体的表现类似于野生型9D11结合剂。
克隆 突变 产量[mg/L} 单体[％] 聚集温度
9D11 T102N 1.34 97 56°
9D11 T102A 1.29 100 56°
9D11 N100Q 2.5 100 56°
9D11 N100S 2.05 100 56°
9D11 - 2.6 100 57°
产生以下变体:N100S(N95S)；N100Q(N95Q),T102A(T97A)和T102N(T97N)(Kabat编号在括号内指出)，并转化成T细胞双特异性形式。在HEK293 EBNA细胞瞬时生产和纯化后，分析了与原始9D11克隆相比，不同变体的靶结合和细胞杀伤活性。
Figure BDA0001351705530001061
Figure BDA0001351705530001071
表17:用于去除9D11的CDR L3中N-糖基化位点的引物(序列见下文)
实施例18
9D11a-糖变体的结合和T细胞介导的杀伤
由于CDR中的糖基化位点，产生了具有去除糖基化位点的突变的四种不同的9D11变体(实施例17)。测试了与原始的9D11相比较，这四种变体对HeLa细胞上的FolR1的结合(图10)和SKOV3和HT-29上的肿瘤细胞杀伤的诱导(图11A-B，E-F)。没有一个变体显示结合或肿瘤细胞杀伤的诱导的差异。平行地解决了FolR1阴性细胞系MKN-45的非特异性杀伤(图11C-D)。此外，可以观察到变体和原始结合剂之间的差异。没有一个构建体诱导对FoLR1阴性肿瘤细胞的非特异性杀伤。
实施例19
在原代上皮细胞上的FolR1表达
FolR1在原代上皮细胞上以低水平表达。在这里，我们想测试这些水平是否足以在FolR1 TCB存在下诱导T细胞介导的杀伤。为了测试，我们使用原代人支气管上皮细胞，原代人类脉络丛上皮细胞，原代人肾皮质上皮细胞和原代人视网膜色素上皮细胞。包括了FolR1阳性SKOV3细胞或HT-29细胞作为阳性对照。首先，我们验证了FolR1在所用原代细胞上的表达，并确定了这些细胞上FolR1结合位点的量。支气管上皮细胞，肾皮质上皮细胞和视网膜色素上皮细胞与肿瘤细胞上表达的水平相比表达非常低但显著水平的FolR1。脉络丛神经上皮细胞不表达显著水平的FolR1。
表18:原代上皮细胞上的FolR1结合位点
细胞系 结合位点
支气管上皮 492
脉络丛上皮 104
肾皮质上皮 312
视网膜色素上皮 822
Skov3 69’890
在表面上显示FolR1表达的原代上皮细胞被用于解决在FoLR1 TCB存在下这些细胞是否可以被T细胞杀死的问题。没有测量到显著的杀死水平，但检测到在视网膜色素上皮细胞，支气管上皮细胞和肾皮层细胞存在下T细胞活化的诱导，导致CD25和CD69的上调。用视网膜色素上皮细胞观察到最强的活化，导致CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD25和CD69的上调。在支气管上皮细胞存在的情况下，CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD69的上调诱导T细胞的较低活化，但仅在CD4+T细胞而不是CD8+T细胞上CD25的上调非常低。在肾上皮细胞的存在下获得T细胞的最低活化，在CD4+T细胞和CD8+T细胞上没有CD25的上调，CD69仅在CD8+T细胞上被上调(图12A-X)。
实施例20
含有16D5或9D11结合剂的不同TCB形式的比较
为了确定TCB 2+1反向形式是否是使用所选择的FolR1粘合剂的最具活性的形式，产生了包含16D5或9D11的不同形式，并在靶细胞结合，T细胞介导的杀伤和T细胞活化中进行比较。在TCB 2+1反向(图1A)，TCB 2+1经典(图1D)，TCB 1+1经典(图1C)和TCB 1+1头对尾(图1B)形式中测试了16D5结合剂；在TCB 2+1反向(图1A)，TCB 1+1经典(图1C)和TCB 1+1头对尾(图1B)形式中测试了9D11结合剂。
测试所有构建体对HeLa细胞上FolR1的结合。结合FolR1的二价分子与单价构建体相比，由于亲合力而更强。二价对单价构建体之间的差异对于16D5更为显著。原因可能是由于16D5的亲和力较低，该结合剂的亲合力效应更强。在两个1+1 TCB之间，结合没有显著差异，但两个2+1构建体之间存在差异。反向2+1构建体与FolR1的结合比经典的2+1构建体更强。这表明在经典的2+1构建体中，与FoLR1的结合受到CD3 Fab的存在的影响，而在反向构建体中结合受影响较小。
通过用这些构建体测试T细胞介导的杀伤，我们可以显示，与2+1经典TCB相比，2+1反向TCB的更强的结合转化为更强的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化。16D5 FolR1 TCB 2+1经典比各自的1+1头对尾构建体仅仅更有活性一点。1+1头对尾构建体显著比1+1经典构建体更有活性。这并不反映在结合中看到的情况，并且可能是由于与头对尾构建体的更好的交联。总体肿瘤细胞杀伤和T细胞活化与所有测试的构建体相当，所见效力的差异仅在于EC50值。一般来说，可以得出结论，独立于所使用的结合剂，FolR1 TCB 2+1反向是诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化的优选形式(参见图13A-C和图14A-C)。
表19不同TCB形式的靶细胞结合和T细胞介导的杀伤的EC50值
Figure BDA0001351705530001091
Figure BDA0001351705530001101
表20在具有不同TCB形式的SKOV3细胞存在下T细胞活化的EC 50值
Figure BDA0001351705530001102
Figure BDA0001351705530001111
实施例21
肿瘤细胞系和原代细胞
从ATCC获得HeLa细胞(CCL-2)，并在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM中培养，从ATCC获得SKOV3(HTB-77)，并在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI中培养，从NCI获得OVCAR5并在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI中培养，从DSMZ获得HT-29(ACC-299)，并在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺，MKN-45(ACC-409)的McCoy’s 5A培养基中培养，从DSMZ获得MKN-45(ACC-409)并在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI中培养。
所有测试的原代上皮细胞均获自ScienCell Research Laboratories。将人支气管上皮细胞(HBEpiC，目录号3210)在支气管上皮细胞培养基(BEpiCM，目录号3211，ScienCell)中培养。将人结肠上皮细胞(HCoEpiC)，目录号2950在结肠上皮细胞培养基((CoEpiCM,Cat.No.2951,ScienCell)中培养。人类视网膜色素上皮细胞(HRPEpiC)，目录号6540在上皮细胞培养基(EpiCM，目录号4101，ScienCell)中培养。人肾皮质上皮细胞(HRCEpiC)，目录号4110在上皮细胞培养基(EpiCM，目录号4101，ScienCell)中培养。人类脉络丛上皮细胞(HCPEpiC)，目录号1310在上皮细胞培养基(EpiCM，目录号4101，ScienCell)中培养。
实施例22
通过流式细胞术靶向结合
用细胞解离缓冲液收获所示的靶细胞，用PBS洗涤并重悬浮于FACS缓冲液中。抗体染色在96孔圆底板中进行。因此，每孔接种200,000个细胞。将板在400g下离心4分钟，除去上清液。将测试抗体在FACS缓冲液中稀释，并将20μl抗体溶液在4℃下加入细胞30分钟。为了除去未结合的抗体，在加入稀释的二级抗体前(FITC缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG，Fcg片段，Jackson ImmunoResearch#109-096-098或PE-缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性，Jackson ImmunoResearch#109-116-170)用FACS缓冲液洗涤两次。在4℃温育30分钟后，将未结合的二级抗体洗去。测量前将细胞重悬于200μl FACS缓冲液，并使用BD Canto II或BD Fortessa通过流式细胞术分析。
实施例23
内化
收获细胞，并测定活力。将细胞以每ml 2Mio细胞重悬浮在新鲜的冷的培养基中，并将细胞悬浮液转移到每种抗体15ml falcon管中。向细胞加入终浓度为20微克/毫升的待测试内化的抗体。将管在冷室中振荡器上温育45分钟。温育后，用冷PBS洗涤细胞三次以除去未结合的抗体。将0.2Mio细胞/孔转移至FACS板作为时间点0。将标记的细胞重悬浮在温热的培养基中并在37℃下温育。在指定的时间点，将0.2Mio细胞/孔转移到冷PBS中，在FACS板上洗涤。为了检测残留在表面上的构建体，细胞用PE标记的抗人Fc二级抗体染色。因此，每孔加入20μl稀释的抗体，并将板在4℃下温育30分钟。然后将细胞洗涤两次以除去未结合的抗体，然后用1％PFA固定以防止任何进一步的内化。使用BD FACS CantoII测量荧光。
实施例24
Figure BDA0001351705530001121
分析
Figure BDA0001351705530001122
包含一系列直径为10μm的珠粒，并涂有不同但确定量的小鼠Mab分子(高亲和力抗人CD5，克隆CRIS-1，同种型IgG2a)。珠粒模拟具有不同抗原密度的细胞，其已用一级小鼠Mab，同种型IgG标记。简而言之，用针对目的抗原的一级小鼠单克隆抗体标记细胞。在单独的测试孔中，用无关小鼠单克隆抗体(同种型对照)标记细胞。然后，用包含在试剂盒中的荧光素缀合的抗小鼠二级抗体标记细胞、设置珠和校准珠。用于标记细胞的一级抗体必须在饱和浓度下使用。一级抗体可以是任何小鼠IgG同种型。在这些条件下，结合的一级抗体分子的数目对应于细胞表面上存在的抗原位点的数目。二级抗体也在饱和浓度下使用。因此，荧光与细胞上和珠粒上结合的一级抗体分子的数目相关。
实施例25
T细胞介导的肿瘤细胞杀伤和T细胞活化
用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，计数并检查细胞活力。将细胞重悬于各自的培养基中，终浓度为每毫升300,000个细胞。然后将100μl靶细胞悬浮液转移到96平底板的每个孔中。将板在37℃下在培养箱中温育过夜，以使细胞贴壁到培养板上。第二天从健康供体的全血中分离PBMC。将血液用PBS 2:1稀释，并在Leucosep管中15ml Histopaque-1077(#10771，Sigma-Aldrich)上覆盖，并以450g不间断离心30分钟。离心后，用10ml移液管收集含有细胞的带，并转移到50ml管中。将管充满PBS至50ml，并离心(400g，10分钟，室温)。除去上清液，将沉淀物重悬浮于PBS中。离心(300g，10分钟，室温)后，弃去上清液，合并2个管，重复洗涤步骤(此次离心350xg，室温10分钟)。然后将细胞重悬浮并将沉淀物合并在50ml PBS中用于细胞计数。在计数后，离心细胞(350g，10分钟，室温)，并以6Mio细胞/ml在含有2％FCS和2nM谷氨酰胺的RPMI中重悬浮。从铺板的靶细胞中除去培养基，并加入用具有2％FCS和2nM谷氨酰胺的RPMI稀释的测试抗体。将效应细胞溶液的300,000个细胞转移到每个孔中，得到10:1的E:T比。为了确定最大释放，靶细胞用Triton X-100裂解。使用细胞毒性检测试剂盒(#1644793，Roche Applied Science)在24小时和48小时后测定LDH释放。通过流式细胞术测量肿瘤细胞杀伤后T细胞上活化标记物上调。简言之，收集PBMC，转移到96孔圆底板中，用在FACS缓冲液中稀释的CD4 PE-Cy7(#3557852,BD Bioscience),CD8 FITC(#555634,BDBioscience),CD25 APC(#555434,BD Bioscience),CD69 PE(#310906,BioLegend)抗体染色。在4℃温育30分钟后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次。在使用BD Canto II测量荧光之前，将细胞重悬浮于200μl FACS缓冲液中。
实施例26
全血中T细胞活化
将280μl新鲜血液加入到96孔锥形深孔板中。然后将20μl稀释的TCB加入到血液中并通过摇动板充分混合。在培养箱中37℃温育24小时后，将血液混合并将35μl转移至96孔圆底板。然后加入20μl抗体染色混合物，其由CD4 PE-Cy7(#3557852,BD Bioscience),CD8FITC(#555634,BD Bioscience),CD25 APC(#555434,BD Bioscience),CD69 PE(#310906,BioLegend)和CD45 V500(#560777,BD Horizon)组成，并在室温下在黑暗中温育15分钟。在测量之前向血液中加入200μl新鲜制备的BD FACS裂解溶液(#349202，BD FCAS)。在室温下温育15分钟后，用BD Fortessa测量细胞。
实施例27
免疫缺陷NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)小鼠中人源化FOLR1 TCB(克隆16D5)的SDPK(单剂量药代动力学)研究
在实验开始时(在丹麦Taconic培育的)6-7周龄的雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)小鼠根据承诺的指导(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持在特异性无病原体条件下，每日循环12小时光/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府审查批准(P 2011/128)。抵达后，动物被维持一个星期，以习惯于新的环境和用于观察。定期进行持续健康监测。
小鼠静脉内注射10/1/0.1μg/小鼠的FOLR1 TCB，而3只小鼠每组和时间点取血。所有小鼠注射总体积为200μl的适当溶液。为了获得每200μl适量的FOLR1 TCB，必要时用PBS稀释储备溶液。治疗注射后5分钟，1小时，3小时，8小时，24小时，48小时，72小时，96小时和168小时收集血清样品。
图15显示，16D5 FOLR1 TCB显示具有缓慢清除的NOG小鼠中的典型和剂量比例的IgG样PK性质。
表21
Figure BDA0001351705530001151
实施例28
在携带Skov3的NOG小鼠中人PBMC转移后，FOLR1 TCB(克隆16D5)的体内功效
在人卵巢癌细胞系Skov3中测试FOLR1 TCB，皮下注射到PBMC移植的NOG小鼠。
Skov3卵巢癌细胞获自ATCC(HTB-77)。肿瘤细胞系在含有10％FCS(Gibco)的RPMI中，在37℃，5％CO2的水饱和气氛中培养。传代35用于移植，生存率>95％。在总共100μl的RPMI细胞培养基(Gibco)中皮下注射每只动物5x106个细胞到动物的右侧腹部。
在实验开始时(在丹麦Taconic培育的)6-7周龄的雌性NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG)小鼠根据承诺的指导(GV-Solas；Felasa；TierschG)保持在特异性无病原体条件下，每日循环12小时光/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府审查批准(P 2011/128)。抵达后，动物被维持一个星期，以习惯于新的环境和用于观察。定期进行持续健康监测。
根据方案(图16)，在研究第0天，对小鼠皮下注射5x106个Skov3。在研究第21天，通过Ficoll方法分离健康供体的人PBMC，腹膜内注射10x106个细胞到荷瘤小鼠。两天后，将小鼠随机化并平均分布于5个治疗组(n＝12)，随后静脉内注射10/1/0.1μg/小鼠的FOLR1 TCB或10μg/小鼠的DP47对照TCB，每周一次，持续三周。所有小鼠静脉内注射200μl适当的溶液。载体组中的小鼠用PBS注射。为了获得每200μl适量的TCB，必要时用PBS稀释储备溶液。使用卡尺每周一次测量肿瘤生长(图17)，并如下计算肿瘤体积:
Tv:(W2/2)x L (W:宽度,L:长度)
每周一次注射FOLR1 TCB导致剂量依赖性抗肿瘤效应。而10μg/小鼠和1μg/小鼠的剂量诱导肿瘤收缩和0.1μg/小鼠肿瘤停滞(图17，表22)。与非靶向对照DP47 TCB相比，以10μg/小鼠的剂量实现最大肿瘤收缩。
表22
化合物 剂量 肿瘤生长抑制
DP47 TCB对照TCB 10μg(对应于约0.5mg/kg) 7％
FOLR1 TCB(16D5) 10μg(对应于约0.5mg/kg) 90％
FOLR1 TCB(16D5) 1μg(对应于约0.05mg/kg) 74％
FOLR1 TCB(16D5) 0.1μg(对应于约0.005mg/kg) 56％
对于PD读数，在研究第32天，每个治疗组处死3只小鼠，移除肿瘤，并通过用胶原酶V，Dispase II和DNAse进行酶消化制备单细胞悬浮液用于随后的FACS分析(图19和20)。单细胞直接用于细胞外抗原染色和标记物的活化，或者在正常培养基中，在蛋白质转运抑制剂莫能星存在下使用5ng/ml PMA和500ng/ml离子霉素再刺激5小时。再刺激后，将细胞对表面抗原染色，然后进行固定和透化步骤。然后将固定的样品对TNF-α，IFN-γ，IL-10和IL-2细胞内染色，并通过流式细胞术分析。相同的程序用于细胞脱粒，但在再刺激期间加入抗CD107a抗体，固定的样品为细胞内穿孔蛋白和粒酶B含量染色。FACS分析显示，与载体和非靶向对照TCB相比，用FOLR1 TCB治疗后肿瘤组织中浸润性CD4+和CD8+T细胞的数量在统计学上更高。此外，在FOLR1 TCB治疗的肿瘤中检测到更多数目的TNF-α，IFN-γ和IL-2产生以及穿孔蛋白+/粒酶-B+CD4+和CD8+T细胞。用FOLR1 TCB治疗的肿瘤浸润性T细胞与对照组相比也显示较高的脱粒率。
在第38天研究终止时，处死所有动物；肿瘤被移除和称重(图18)。用10和1μg/小鼠的FOLR1 TCB治疗的肿瘤的重量与对照组相比显示出统计学上的显著差异。
表23
Figure BDA0001351705530001171
Figure BDA0001351705530001181
实施例29
产生双特异性FolR1/CD3-κ-λ抗体
为了不使用任何异二聚化方法(例如旋钮入孔技术)而产生同时可以结合人CD3和人叶酸受体α(FolR1)的双特异性抗体(每种抗原一价)，应用共同轻链文库与所谓的CrossMab技术的组合:人源化CD3结合剂(CH2527_VL7_46/13)的可变区与标准人IgG1抗体的CH1结构域融合，形成VLVH杂交分子(与Fc融合)，其对于两种特异性是常见的。为了产生杂交的对应物(VHCL)，将CD3特异性可变重链结构域(CH2527_VH_23/12)与恒定的人λ轻链融合，而对于人FolR1(克隆16D5，从共同轻链文库分离的)特异的可变重链结构域与恒定的人κ轻链融合。这使得能够通过应用KappaSelect和LambdaFabSelect柱(GE Healthcare)的随后的纯化步骤以除去不想要的同二聚体抗体，纯化所需的双特异性抗体。
所有抗体表达载体使用如Sambrook,J.et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中所述的标准重组DNA技术产生。分子生物学试剂根据制造商的建议使用。基因或基因片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增，或通过自动基因合成在Geneart AG(Regensburg，Germany)从合成的寡核苷酸产生。通过DNA测序(Synergene GmbH，Switzerland)确认PCR扩增或亚克隆的DNA片段。将质粒DNA转化到并在合适的大肠杆菌宿主菌株中扩增，用标准Maxiprep试剂盒(Qiagen)制备转染级质粒DNA。为了生产双特异性分子，使用基于标准聚乙烯亚胺(PEI)的方法，用编码各基因的质粒转染HEK293 EBNA细胞。三种表达载体的所用质粒比例为1:1:1。将转染的细胞培养7天，然后收获上清液用于纯化。如下制备和纯化双特异性FolR1/CD3-κ-λ抗体。
1.瞬时转染和生产
对如下所述所需载体使用PEI介导的转染方法在HEK293 EBNA细胞中瞬时产生κ-λ双特异性抗体。将HEK293 EBNA细胞在CD CHO培养基中无血清悬浮培养。为了在500ml摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞(对于备选规模，相应调整所有的量)。对于转染，细胞通过210×g离心5分钟，将上清液替换为预温热的20毫升CD CHO培养基。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终量为200μg DNA。加入540μl PEI后，溶液涡旋15秒，随后在室温下温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500ml摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育后，加入160ml F17培养基，培养细胞24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％进料1。7天后，收集培养上清液，通过在210×g离心15分钟进行纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，并加入终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠，并保持在4℃。
2.纯化
以三步纯化κ-λ双特异性抗体，使用对κ轻链特异性的亲和步骤，随后对λ轻链特异性的亲和步骤，最后通过大小排阻层析用于去除聚集体。将从瞬时产生获得的上清液调节至pH 8.0(使用2M TRIS pH8.0)，并应用于采用5个柱体积(cv)缓冲液A(50mM Tris，100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH8.0)平衡的捕获选择κ亲和基质或HiTrap KappaSelect，GEHealthcare，柱体积(cv)＝1ml。用15cv缓冲液A洗涤后，使用pH梯度在25cv内洗脱蛋白质至缓冲液B(50mM Tris，100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH2.0)。合并含有目的蛋白质的级分，将溶液的pH调至pH8.0(使用2M Tris pH 8.0)。将中和的合并的级分施加到用5个柱体积(cv)缓冲液A(50mM Tris，100mM甘氨酸，150mM NaCl,pH 8.0)平衡的捕获选择λ亲和基质(现为:HiTrap LambdaFabSelect，GE Healthcare，柱体积(cv)＝1ml)。用15cv缓冲液A洗涤后，使用pH梯度在25cv内洗脱蛋白质至缓冲液B(50mM Tris，100mM甘氨酸，150mM NaCl，pH2.0)。合并含有目的蛋白质的级分，将溶液的pH调至pH8.0(使用2M Tris pH 8.0)。使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius)浓缩该溶液，随后将其应用于用20mM组氨酸，pH 6.0,140mM NaCl，0.01％Tween-20平衡的SuperdexTM 200 10/300GL(GE Healthcare)。使用超浓缩器(Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY,Sartorius)再次浓缩大小排阻后的合并级分。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。根据制造商的说明书(仪器Caliper LabChipGX,Perkin Elmer)，在存在和不存在还原剂的条件下，通过SDS毛细管电泳分析构建体的纯度和分子量。只有少量蛋白质可以纯化，最终产量为0.17mg/L。
实施例30
双特异性FolR1/CD3-κ-λ抗体的T细胞介导的杀伤
在新鲜分离的PBMC存在下，在SKOV3细胞上测试κλFolR1 TCB的活性。纳入DP47TCB作为阴性对照。24小时和48小时后通过LDH释放测定SKOV3细胞的T细胞介导的杀伤。48小时后，收集T细胞，并通过流式细胞术测量CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD69和CD25上调。
κλFolR1构建体以浓度依赖性方式诱导SKOV3细胞的杀伤，其伴随着CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD69和CD25上调。
在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下，将SKOV3细胞与PBMC一起温育。在24小时和48小时后，通过测量LDH释放来确定肿瘤细胞杀伤(图21)。在κλFoLR1 TCB或DP47 TCB存在下，将SKOV3细胞与PBMC一起温育。48小时后，通过流式细胞术测量CD4 T细胞和CD8 T细胞上的CD25和CD69上调(图22)。
实施例31
通过表面等离振子共振对16D5和36F2 FolR1结合剂的生化表征
通过表面等离振子共振(SPR)评估以不同的一价或二价T细胞双特异性形式的抗FolR1 16D5和抗-FolR1 36F2作为IgG或T细胞双特异性分子对重组人，食蟹猴和小鼠叶酸受体1(均为Fc融合体)的结合。所有SPR实验在25℃下在Biacore T200上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,GE Healthcare)。
1.测试的分子
用于亲和力和亲合力测定的分子描述于表24中。
表24:SPR分析中使用的6种构建体的名称和描述
名称 描述
16D5 TCB 2+1 T-细胞双特异性,反向形式(共同轻链)
16D5 TCB经典 2+1 T-细胞双特异性,经典形式(共同轻链)
16D5 TCB 1+1 1+1 T-细胞双特异性(共同轻链)
16D5 TCB 1+1HT 1+1 T-细胞双特异性头对尾(共同轻链)
36F2 IgG 具有P329G LALA的人IgG1
36F2 TCB 2+1 T-细胞双特异性,反向形式,crossfab
2.对叶酸受体1的亲合力
如下所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性分子与重组叶酸受体之间相互作用的亲合力(表25)。
使用标准偶联说明书(Biacore，GE Healthcare)，将人，食蟹猴和小鼠叶酸受体1(FolR1-Fc)的重组生物素化单体Fc融合物直接偶联在SA芯片上。固定化水平约为300-400RU。抗-FL1R1 IgG或T细胞双特异性分子以3.7至900nM范围内的浓度以30μL/分钟的流速通过流动池180秒。监测解离240或600秒。使用30秒10mM甘氨酸-HCl pH2的双注射，在每个循环后再生芯片表面。通过减去用重组生物素化的鼠CD134 Fc融合物固定的参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。由IgG或T细胞双特异性分子的二价结合产生的结合曲线近似为1:1 Langmuir结合(即使它是1:2的结合)，并与该模型拟合得到表观KD，其表示二价结合的亲合力。使用Bia Evaluation软件(GE Healthcare)从拟合的速率常数得出相互作用的表观亲合力常数。对于1+1 T细胞双特异性形式，相互作用是实际的1:1，KD表示亲和力，因为在该构建体中只有一个FolR1结合剂。
表25:抗FolR1 16D5和36F2作为IgG或作为T细胞双特异性分子(TCB)在人，食蟹猴和小鼠FolR1上的二价结合(具有表观KD的亲合力)。
Figure BDA0001351705530001221
3.对叶酸受体1的亲和力
如下所述测定抗FolR1 IgG或T细胞双特异性分子与重组叶酸受体之间的相互作用的亲和力(表26)。
对于亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)在pH5.0下在CM5芯片上进行约12000个共振单位(RU)的抗人Fab特异性抗体(Fab捕获试剂盒，GE Healthcare)的直接偶联。以10μl/min的流速以20nM捕获抗FolR1IgG或T细胞双特异性分子40秒，参考流动池未被捕获。将人，食蟹猴或小鼠叶酸受体1Fc融合物的稀释系列(12.3至3000nM)以30μl/min在所有流动池上通过240秒以记录结合期。监测解离期300秒，并通过从样品溶液切换到HBS-EP来引发。在每次循环后，使用60秒10mM甘氨酸-HCl pH 1.5的双注射来再生芯片表面。通过扣除在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率差异。通过使用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)拟合1:1 Langmuir结合，从速率常数得到相互作用的亲和力常数。
表26:抗FolR1 16D5和36F2作为IgG或作为T细胞双特异性分子(TCB)在人，食蟹猴和小鼠FolR1上的单价结合(亲和力)。
Figure BDA0001351705530001231
Figure BDA0001351705530001241
36F2 TCB对人和食蟹猴FolR1-Fc的亲和力(单价结合)相似，对于两者均为约1000nM，而对小鼠FolR1-Fc的亲和力略好并且为约300nM。36F2可以用于鼠类和灵长类动物模型，不需要替代物。
36F2 TCB对人类FolR1的亲合力(表观KD)比16D5 TCB对人类FolR1的亲和力低30倍左右。在二价形式中，36F2 TCB处于低纳摩尔范围，而16D5 TCB处于低皮摩尔范围(1000倍差)。
FolR1在肿瘤细胞上表达，在多种上皮性恶性肿瘤(包括卵巢癌，乳腺癌，肾癌，结肠直肠癌，肺癌和其他实体癌)的癌细胞表面上以中等和高水平过表达，并且也在正常组织中极化上皮细胞的有限子集的顶端表面上表达。这些非肿瘤的正常细胞仅以低水平表达FolR1，并且包括例如细胞肺泡表面上的细支气管上皮细胞，肾小管细胞的肾皮质管腔边界，视网膜色素上皮(基底外侧膜)和脉络丛。
16D5 TCB结合表达少量FolR1的正常组织细胞，导致其T细胞介导的杀伤。这可能至少部分地解释了在食蟹猴中以10μg/kg观察到的有限的耐受性。发明人想要确定降低T细胞双特异性分子的亲和力是否可以增加高和低目标密度组织之间的分化，从而通过利用二价结合和亲合力降低毒性。低亲和性结合剂通常不被选择作为进一步分析的合适候选者，因为低亲和力通常与低效力和功效相关。然而，低亲和力FolR1结合剂36F2是以几种形式开发的，其特征在于其生物学性质。对于以二价T细胞双特异性形式使用的36F2，亲合力效应(单价和二价结合之间的差异)为约250倍(1000nM对4nM)。在低靶标密度下，亲和力定义了相互作用并且以1000nM导致TCB的低效力。然而，在高目标密度下，分子的亲合力发挥作用，4nM导致TCB的高活性(参见实施例32)。
在备选方法中，本发明人以二价格式生成16D5单价形式和16D5的低亲和力变体(亲和力约10-40nM)。以一价形式(1+1)使用的16D5结合剂具有约50nM的亲和力。通过利用亲合力效应可以更好地实现高和低靶标密度组织之间的区分。
实施例32
由36F2 TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB诱导的SKov-3细胞的T细胞杀伤
在SKov-3细胞(FolR1培养基)上评估由36F2 TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB介导的T细胞杀伤。将人PBMC用作效应物，并在与双特异性抗体温育的24小时和48小时时检测到杀伤。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，洗涤并用平底96孔板以25000个细胞/孔的密度铺板。细胞留置贴壁过夜。通过从健康人供体获得的富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)的Histopaque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。新鲜血液用无菌PBS稀释，并在Histopaque梯度上分层(Sigma，#H8889)。离心(450×g，30分钟，室温)后，弃去含PBMC的界面上方的血浆，转移到新的falcon管中的PBMC随后填充50ml的PBS。将混合物离心(400×g，10分钟，室温)，弃上清，用无菌PBS洗涤PBMC沉淀两次(离心步骤350×g，10分钟)。自动计数所得的PBMC群体(ViCell)，并在37℃，5％CO2的细胞培养箱中储存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直到进一步使用(不长于24小时)。对于杀伤试验，以指定浓度(0.005pM-5nM的范围，一式三份)加入抗体。将PBMC以最终的E:T比为10:1加入到靶细胞中。通过定量由细胞凋亡/坏死细胞(LDH检测试剂盒，RocheApplied Science，#11 644 793 001)释放到细胞上清液中的LDH，在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后评估靶细胞杀伤。通过用1％Triton X-100温育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与没有双特异性构建体的效应细胞共温育的靶细胞。
结果表明，与Mov19 TCB和21A5 TCB相比，由36F2引起的杀伤大大降低(图23A-B)。使用GraphPadPrism6计算的与杀伤试验相关的EC50值总结在表27中。
表27:由36F2 TCB，Mov19 TCB和21A5 TCB诱导的表达FolR1的SKov-3细胞的T细胞介导的杀伤的EC50值(pM)。
Figure BDA0001351705530001261
*曲线没有达到饱和，值是假设的
实施例33
由不同的单价和二价T细胞双特异性形式的36F2 TCB和16D5 TCB诱导的T细胞杀伤
评估了由36F2 TCB，16D5 TCB，16D5 TCB经典的，Hela的16D5 TCB 1+1和16D5 TCBHT抗体(高FolR1，约200万拷贝，表14，图27)，Skov-3(中等FolR1，约70000-90000拷贝，表14，图27)和HT-29(低FolR1，约10000，表14，图27)人肿瘤细胞介导的T细胞杀伤。纳入DP47TCB抗体作为阴性对照。将人PBMC用作效应物，并在与双特异性抗体温育24小时时检测到杀伤。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，洗涤并用平底96孔板以25000个细胞/孔的密度铺板。细胞留置贴壁过夜。通过从健康人供体获得的富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)的Histopaque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。新鲜血液用无菌PBS稀释，并在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上分层。离心(450×g，30分钟，室温)后，弃去含PBMC的界面上方的血浆，转移到新的falcon管中的PBMC随后填充50ml的PBS。将混合物离心(400×g，10分钟，室温)，弃上清，用无菌PBS洗涤PBMC沉淀两次(离心步骤350×g，10分钟)。自动计数(ViCell)所得的PBMC群体，并在37℃，5％CO2的细胞培养箱中储存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直到进一步使用(不长于24小时)。对于杀伤试验，以指定浓度(0.01pM-100nM的范围，一式三份)加入抗体。将PBMC以最终的E:T比为10:1加入到靶细胞中。通过定量通过凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644 793 001)，在37℃,5％CO2温育24小时后评估靶细胞杀伤。通过用1％Triton X-100温育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与没有双特异性构建体的效应细胞共温育的靶细胞。
结果表明，与16D5 TCB诱导的杀伤相比，由36F2 TCB诱导的所有三种FolR1+靶细胞系的靶特异性杀伤弱得多(图24A-C，表29)。与二价16D5 TCB(16D5 TCB和16D5 TCB经典)相比，由单价16D5 TCB(16D5 HT和16D5 1+1)诱导的靶特异性杀伤较差。使用GraphPadPrism6计算的与杀伤测定相关的EC50值总结在表28中。重要的是，该数据显示，与16D5 FOLR1 TCB相比，使用二价2+1 TCB形式的36F2 FolR1结合剂扩大了治疗窗口(图24A-C)。而对于Hela细胞，16D5和36F2 FOLR1 TCB之间的效力降低约为45倍(高FOLR1表达，参见表28:16D5 TCB＝0.8对36F2 TCB 36.0)，对于Skov3细胞为约297倍(中等FOLR1表达，见表28:16D5 TCB＝0.6对36F2 TCB 178.4)，对于具有低FOLR1表达的HT29，这种减少几乎为7000倍(参见表28:16D5 TCB＝5.7对36F2 TCB39573)。因此，36F2 FOLR1 TCB区分高表达和低表达细胞，这对于降低毒性特别重要，因为一些正常的非肿瘤组织的细胞表达非常低水平的FolR1(大约每个细胞少于1000个拷贝)。与此观察结果一致，下文实施例35中讨论的结果显示36F2 TCB不诱导原代细胞的T细胞杀伤(图26A-D)，而对于16D5 TCB，48小时温育后，在HRCEpiC和HRPEpiC细胞上可以观察到一些杀伤(图26B和C)。36F2 TCB的这个重要特征允许用于治疗FolR1阳性肿瘤的给药，以便其介导具有高或中等FOLR1表达的肿瘤组织而不是具有低(部分极化)表达的正常组织的有效杀伤。值得注意的是，这种特征似乎是以二价2+1反向形式的36F2 TCB的亲合力介导的，因为当使用携带相同的低亲和力36F2结合剂的1+1单价形式时没有观察到该特征。
换句话说，二价2+1形式的36F2 TCB包括相对低亲和力的FolR1结合部分，但它具有允许在高和低FolR1表达细胞之间分化的亲合力效应。因为肿瘤细胞以高水平或中等水平表达FolR1，所以该TCB选择性地结合肿瘤细胞，而不是表达低水平的FolR1或完全不表达FolR1的正常的非癌细胞
除了上述有利的特征之外，二价2+1反向形式的36F2 TCB还具有不需要化学交联或其他混合方法的优点。这使得它适合于制备治疗患者的药物，例如具有FolR1阳性癌性肿瘤的患者。二价2+1反向形式的36F2 TCB可以使用具有低聚集体的标准CHO方法制备。此外，二价2+1中的36F2 TCB包含人和人源化序列，使其优于使用大鼠和小鼠多肽的分子，所述分子当施用于人时具有高度免疫原性。此外，二价2+1形式的36F2 TCB被工程化以消除FcgR结合，因此不引起FcgR交联和输注反应，当施用于患者时进一步增强其安全性。
如上述结果所证实的，其头对尾几何形状使得二价2+1反向形式的36F2 TCB成为诱导绝对靶细胞杀伤的高效分子。其二价性增强亲合力和效力，而且还允许高表达和低表达细胞之间的分化。由于其亲合力，其对高表达或中等靶标表达细胞的偏好降低正常细胞的T细胞介导的杀死的毒性，所述正常细胞以低水平表达FolR1。
本文公开的二价2+1形式和其他实施方案中的36F2 TCB的另一个优点是它们的临床开发不需要使用替代分子，因为它们结合人，食蟹猴和小鼠FolR1。因此，本文公开的分子与先前描述的针对FolR1的抗体识别不同的表位，所述先前描述的针对FolR1的抗体不识别来自所有三种物种的FolR1。
表28:温育24小时后，不同的单价和二价T细胞双特异性形式的36F2 TCB和16D5TCB诱导表达FolR1的肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤的EC50值(pM)。
Figure BDA0001351705530001291
*曲线没有达到饱和，只有假设值
表29显示了在测试的不同细胞系上16D5 TCB和36F2 TCB的EC50值的比较。在获得的EC50值之外，计算Δ(16D5 TCB的EC50减去36F2 TCB的EC50)和x倍差异(16D5 TCB的EC50除以36F2 TCB的EC50)。
表29:16D5 TCB和36F2 TCB的EC50值的比较。
Figure BDA0001351705530001292
*曲线没有达到饱和，只有假设值
计算的EC50值清楚地表明，36F2 TCB和16D5 TCB之间的差异越大，靶细胞上的FolR1表达越低。
对于16D5 TCB和36F2 TCB的EC50值的比较与对于16D5 TCB和两个一价16D5 TCB(16D5 TCB HT和16D5 1+1)的比较进行了相同的计算。表30和31显示了16D5 TCB对16D5TCB HT(表30)和16D5 TCB对16D5 TCB 1+1(表31)的EC50值的比较以及相应的Δ(16D5 TCB的EC50减去16D5 TCB HT/1+1的EC50)和x倍差异(16D5 TCB的EC50除以16D5 TCB HT/1+1的EC50)。
表30:16D5 TCB(2+1反向)和16D5 TCB HT的EC50值的比较。
Figure BDA0001351705530001301
表31:16D5 TCB和16D5 TCB 1+1的EC50值的比较。
Figure BDA0001351705530001302
*曲线没有达到饱和，只有假设值
16D5 TCB和36F2 TCB的EC50值的比较(表29)表明，EC50值的差异越大，靶细胞上的FolR1表达越低。在16D5 TCB和单价16D5 TCB(表29和表30)的比较中不能看到这种效果。对于16D5 TCB 1+1(表31)，16D5 TCB的EC50与16D5 TCB 1+1之间的差异略有增加，而FolR1表达下降，但远远不如在16D5 TCB与36F2 TCB的比较中看到的那样明显。
实施例34
在36F2 TCB和16D5 TCB抗体诱导的表达FolR1的肿瘤细胞的T细胞杀伤后CD8+和CD4+效应细胞上的CD25和CD69上调
通过FACS分析，使用识别T细胞活化标记物CD25(晚期活化标记物)和CD69(早期活化标记物)的抗体进行FACS分析，评估了由36F2 TCB和16D5 TCB介导的表达FolR1的Hela，SKov-3和HT-29肿瘤细胞的T细胞杀伤后CD8+和CD4+T细胞的活化。DP47 TCB作为非结合对照被包括在内。抗体和杀伤测定条件基本上如上所述(实施例32)，使用相同的抗体浓度范围(0.01pM-100nM，一式三份)，E:T比例为10:1，温育时间为48小时。
温育后，将PBMC转移到圆底96孔板中，以400×g离心4分钟，并用含有0.1％BSA的PBS洗涤两次。CD8(PE抗人CD8，BD#555635)，CD4(Brilliant Violet 421TM抗人CD4，Biolegend#300532)，CD69(FITC抗人CD69，BD#555530)和CD25(APC-抗人CD25BD#555434)的表面染色根据制造商的说明进行。细胞用含有0.1％BSA的150μl/孔PBS洗涤两次。离心后，将样品重悬浮于200μl/孔PBS 0.1％中用于FACS测量。在BD FACS Canto II分析样品。
36F2 TCB在杀死Hela(图25A)和SKov-3(图25B)细胞后，诱导CD8+和CD4+T细胞上的活化标记物(CD25，CD69)的靶标特异性上调。与16D5 TCB相比，由36F2诱导的CD8+和CD4+T细胞上的CD25和CD69的上调弱得多。
在HT-29(低FolR1)上，活化标记物的上调只能在最高浓度的36F2 TCB下看到。相比之下，CD25和CD69的16D5 TCB上调已经可以在低得多的抗体浓度下看到(图25C)。
在肿瘤裂解实验中也可以看出，杀伤后T细胞(CD4+和CD8+)上的活化标记物(CD25和CD69)的分析清楚地表明，16D5 TCB和36F2 TCB之间的差异变得越大，靶细胞上FolR1表达水平越低。
实施例35
由36F2 TCB和16D5 TCB诱导的原代细胞的T细胞杀伤
在原代细胞(人肾皮质上皮细胞(HRCEpiC)(ScienCell Research Laboratories；Cat No 4110)和人视网膜色素上皮细胞(HRPEpiC)(ScienCell Research Laboratories；Cat No 6540))上评估由36F2 TCB和16D5 TCB介导的T细胞杀伤。包括HT-29细胞(低FolR1)作为对照细胞系。DP47 TCB作为非结合对照。将人PBMC用作效应物，并在与双特异性抗体温育24小时和48小时时检测到杀死。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，洗涤并用平底96孔板以25000个细胞/孔的密度铺板。细胞留置贴壁过夜。通过从健康人供体获得的富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)的Histopaque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。新鲜血液用无菌PBS稀释，并在Histopaque梯度上分层(Sigma，#H8889)。离心(450×g，30分钟，室温)后，弃去含PBMC的界面上方的血浆，PBMC转移到新的falcon管中，随后填充50ml的PBS。将混合物离心(400×g，10分钟，室温)，弃上清液，用无菌PBS洗涤PBMC沉淀两次(离心步骤350×g，10分钟)。自动计数所得的PBMC群体(ViCell)，并在37℃，5％CO2的细胞培养箱中储存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直到进一步使用(不长于24小时)。对于杀死试验，以指定的浓度(0.01pM-10nM的范围，一式三份)加入抗体。将PBMC以最终的E:T比为10:1加入到靶细胞中。通过定量由细胞凋亡/坏死细胞(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644 793 001)释放到细胞上清液中的LDH，在37℃，5％CO2温育24小时和48小时后评估靶细胞杀伤。通过用1％Triton X-100温育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与没有双特异性构建体的效应细胞共温育的靶细胞。
结果显示，36F2 TCB不诱导原代细胞的T细胞杀伤(图26A-D)，而对于16D5 TCB，温育48小时后可以在HRCEpiC和HRPEpiC细胞上观察到一些杀伤(图26B和D)。如上所述，在16D5 TCB和36F2 TCB之间观察到HT-29细胞之间的T细胞杀伤的强烈差异(图26E，F)。
实施例36
制备DP47 GS TCB
(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA反向的＝“非靶向TCB”)
在上述实验中使用“非靶向TCB”作为对照。双特异性抗体与CD3e衔接但不与任何其他抗原结合，因此不能将T细胞交联至任何靶细胞(并且随后不能诱导任何杀伤)。因此，它在测定中用作阴性对照以监测任何非特异性T细胞活化。如WO2014/131712中所述制备该未靶向的TCB。简而言之，重链和轻链DNA序列的可变区已经与预先插入相应的受体哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链被亚克隆在框内。抗体表达由MPSV启动子驱动，并在CDS的3’末端携带合成的多聚A信号序列。此外，每个载体含有EBV OriP序列。
使用聚乙烯亚胺通过与哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生该分子。用相应的表达载体以1:2:1:1的比例转染细胞(“载体重链Fc(孔)”:“载体轻链”:“载体轻链Crossfab”:“载体重链Fc(旋钮)-FabCrossfab”)。
对于转染，HEK293 EBNA细胞在CD CHO培养基中悬浮无血清培养。为了在500ml摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞。对于转染，通过210×g将细胞离心5分钟，将上清液替换为预热的20毫升CD CHO培养基。将表达载体在20ml CD CHO培养基中混合至最终量为200μg DNA。加入540μl PEI后，溶液涡旋15秒，随后在室温下温育10分钟。然后将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500ml摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中37℃温育3小时。温育后，加入160ml F17培养基，培养细胞24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％进料1。7天培养后，收集上清液，通过在210×g离心15分钟进行纯化，将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，并加入终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠，并保持在4℃。
使用蛋白A通过亲和层析从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质。将上清液装载在用40ml 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5平衡的HiTrap ProteinA HP柱(CV＝5mL，GE Healthcare)上。用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5洗涤除去未结合的蛋白质。在20个柱体积内从20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5至20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH2.5的梯度洗脱靶蛋白。通过加入1/10的0.5M磷酸钠(pH8)中和蛋白质溶液。将靶蛋白浓缩并过滤，然后在用pH6.0的20mM组氨酸，140mM氯化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上装载。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。
在存在和不存在还原剂的情况下，通过CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。根据制造商的说明使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)。2ug样品用于分析。
使用TSKgel G3000 SW XL分析大小排阻柱(Tosoh)在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单盐酸盐，0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液中在25℃分析抗体样品的聚集物含量。
表32:DP47 GS TCB的生产和纯化概述。
Figure BDA0001351705530001341
表33:DP47 GS TCB的CE-SDS分析.
Figure BDA0001351705530001342
Figure BDA0001351705530001351
实施例37
16D5 TCB和9D11 TCB及其相应的CD3脱酰胺变体N100A和S100aA与表达CD3的Jurkat细胞的结合
在表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上评估16D5 TCB和相应的CD3脱酰胺化变体16D5 TCB N100A和16D5 TCB S100aA和9D11 TCB以及脱酰胺化变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA与人CD3的结合。简言之，收集细胞，计数，检查活力，并以2x106个细胞/ml重悬浮于FACS缓冲液(100μl PBS 0.1％BSA)中。在不同浓度的双特异性抗体(686pM-500nM)下，将100μl细胞悬浮液(含有0.2x106个细胞)在4℃的圆底96孔板中温育30分钟。在用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次后，样品在4℃下用PE-缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性二级抗体(Jackson Immuno Research Lab PE#109-116-170)再温育30分钟。用冷PBS 0.1％BSA洗涤样品两次后，使用FACS CantoII(Software FACS Diva)通过FACS立即分析样品。使用GraphPadPrism6获得结合曲线(图28A-B)。
与亲本抗体16D5 TCB(图28A)和9D11 TCB(图28B)相比，结果显示脱酰胺化变体N100A和S100aA与CD3的结合减少。
实施例38
由16D5 TCB和9D11 TCB及其CD3脱酰胺变体N100A和S100aA诱导的SKov-3和HT-29细胞的T细胞杀伤
在SKov-3(中等FolR1)和HT-29(低FolR1)细胞上评估由16D5 TCB和相应的CD3脱酰胺化变体16D5 TCB N100A和16D5 TCB S100aA和9D11 TCB和脱酰胺变体9D11 TCB N100A和9D11 TCB S100aA介导的T细胞杀伤。将人PBMC用作效应物，并在与双特异性抗体温育24小时时检测到杀死。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，洗涤并用平底96孔板以25000个细胞/孔的密度铺板。细胞留置贴壁过夜。通过从健康人供体获得的富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层)的Histopaque密度离心制备外周血单核细胞(PBMC)。新鲜血液用无菌PBS稀释，并在Histopaque梯度上分层(Sigma，#H8889)。离心(450×g，30分钟，室温)后，弃去含PBMC的界面上方的血浆，PBMC转移到新的猎falcon管中，随后填充50ml的PBS。将混合物离心(400×g，10分钟，室温)，弃上清，用无菌PBS洗涤PBMC沉淀两次(离心步骤350×g，10分钟)。自动计数所得的PBMC群体(ViCell)，并在37℃,5％CO2的细胞培养箱中储存在含有10％FCS和1％L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中，直到进一步使用(不长于24小时)。对于杀死试验，以指定的浓度(0.01pM-10nM的范围，一式三份)加入抗体。将PBMC以最终的E:T比为10:1加入到靶细胞中。通过定量通过凋亡/坏死细胞释放到细胞上清液中的LDH(LDH检测试剂盒，Roche Applied Science，#11 644 793 001)，在37℃,5％CO2温育24小时后评估靶细胞杀伤。通过用1％Triton X-100温育靶细胞来实现靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)是指与没有双特异性构建体的效应细胞共温育的靶细胞。
结果表明，在SKov-3细胞上，CD3脱酰胺化变体16D5 TCB N100A和16D5 S100aA诱导的杀伤与16D5 TCB诱导的杀伤相当(图29A)。9D11 TCB及其变体9D11 TCB N100A和9D11TCB S100aA也是如此(图29B)。在FolR1低表达HT-29细胞上，S100aA变体显示了杀伤效率受损，对于16D5 TCB(图30A)以及对于9D11 TCB(图30B)是如此。使用GraphPadPrism6计算的与杀伤测定相关的EC50值在表35中给出。
表35:由16D5 TCB和9D11 TCB及其脱酰胺化变体N100A和A100aA诱导的表达FolR1的SKov-3和HT-29细胞的T细胞介导的杀伤的EC50值(pM)。
Figure BDA0001351705530001361
Figure BDA0001351705530001371
*未测定
实施例39
产生含有共同轻链的粘蛋白-1T细胞双特异性构建体
基因合成
所需基因片段由Geneart AG(Regensburg，Germany)从合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动基因合成方法合成。
MUC1抗原的生产和纯化
为了生成针对人粘蛋白-1(MUC1)的“海胆精子蛋白，肠激酶和集聚蛋白”(SEA)结构域的共同轻链(CLC)抗体，合成了编码SEA结构域的DNA片段(Uniprot P15941，氨基酸1041-1151)。为了防止位置G1097和S1098之间的SEA的自体蛋白水解，上述方法由Ligtenber et al.(1992).Cell-associated episialin is a complex containing twoproteins derived from a common precursor.J Biol Chem 267,6171-7所述。Parry etal.,Identification of MUC1Proteolytic Cleavage Sites in Vivo.Biochem BiophysRes Commun 283,715-20，在G1097和S1098之间插入了四个另外的甘氨酸残基。该插入导致构象应力的减轻，蛋白质保持完整。将DNA片段插入到可诱导细菌表达载体pETXX中。所得质粒表达具有C末端avi标签和His6标签(SEQ ID NO:47)的SEA结构域。当avi标签用于BirA介导的体内生物素化时，使用His6标签(SEQ ID NO:47)进行纯化。
用细菌菌株BL21D3接种500ml培养物，用相应的质粒和表达BirA的质粒转化，并用1mM IPTG在OD600 0.8下诱导。然后将培养物在25℃下温育过夜并通过离心收获。将细菌沉淀物用25ml
Figure BDA0001351705530001381
Protein Extraction Reagent(Millipore)重悬浮，并按照方案中所述在室温下温育20分钟。在16000xg离心20分钟后，将上清液过滤并装载在IMAC柱(His gravitrap，GE Healthcare)上。将柱用40ml洗涤缓冲液(500mM NaCl，20mM咪唑，20mMNaH2PO4pH 7.4)洗涤。从柱(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM NaH2PO4pH 7.4)洗脱后，使用PD10柱(GE Healthcare)重新缓冲洗脱液。
从CLC Fab文库中选择抗人MUC1 SEA结构域结合剂
使用大肠杆菌衍生和体内生物素化的MUC1进行针对人MUC1的SEA结构域的选择。通过生物素连接酶BirA经C-末端avi标签共表达来将抗原酶促生物素化。根据以下模式在溶液中进行淘选轮：1.将CLC文库的噬菌粒颗粒与100nM生物素化抗原蛋白质结合0.5小时，总体积为1ml，2.通过加入5.4×107个链霉抗生物素蛋白包被的磁珠10分钟捕获生物素化抗原和特异性附着的结合噬菌体，3.使用5x1ml PBS/Tween20和5×1ml PBS洗涤珠粒，4.通过加入1ml 100mM三乙胺(TEA)洗脱噬菌体颗粒10分钟并通过加入500ul 1M Tris/HCl pH7.4中和，5.用上清液中的噬菌体颗粒重新感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染并随后PEG/NaCl沉淀待用于随后的选择轮的噬菌粒颗粒。使用恒定或降低(10- 7M至2x10-9M)抗原浓度进行3轮选择。在第2轮中，使用中性抗生物素蛋白板代替链霉抗生物素蛋白珠进行抗原:噬菌体复合体捕获。通过ELISA如下鉴定特异性结合剂:将100μl每孔50nM生物素化抗原包被在中性抗生物素蛋白(neutravidin)平板上。加入含Fab的细菌上清液，并使用抗Flag/HRP二级抗体通过其Flag标签检测结合Fab。在背景上显示显著信号的克隆的VH结构域被入围用于测序(58D6 VH,106D2 VH,110A5 VH)并进一步分析。所有克隆源自IGHV3-23种系序列(图31)。值得注意的是，克隆58D6和110A5来自仅在CDR3中随机化的文库，而从所有3个CDR中随机化的文库中鉴定出克隆106D2。偏离种系序列的CDR1和2中的位置以斜体印刷。所有VH变体与相同的共同轻链(共同轻链VL)组合表达。
Fab的纯化
将来自细菌培养物的Fab(58D6VH，106D2VH，110A5VH的可变重链结构域的蛋白质序列，表达与SEQ ID NO:31所列相同的CLC可变结构域的所有克隆)纯化，以精确地分析动力学参数。对于每个克隆，用含有相应噬菌粒的细菌接种500ml培养物，并用1mM IPTG在OD600 0.9下诱导。然后将培养物在25℃下温育过夜并通过离心收获。在25ml PPB缓冲液(30mM Tris-HCl pH8,1mM EDTA，20％蔗糖)中温育重悬浮的沉淀物20分钟后，将细菌再次离心并收获上清液。该温育步骤用25ml 5mM MgSO4溶液重复一次。将两个温育步骤的上清液合并，过滤并装载在IMAC柱(His gravitrap，GE Healthcare)上。随后，用40ml洗涤缓冲液(500mM NaCl，20mM咪唑，20mM NaH2PO4pH 7.4)洗涤柱。洗脱(500mM NaCl，500mM咪唑，20mM NaH2PO4pH 7.4)后，洗脱液用PD10柱(GE Healthcare)重新缓冲。然后通过SPR分析(Proteon XPR36，Biorad)在范围为100nM至6.25nM的稀释行中研究纯化的Fab的动力学参数。
使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR进行亲和测定
通过使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)在25℃下通过表面等离振子共振测量所选Fab克隆的亲和力(KD)，并通过中性抗生物素蛋白捕获固定在NLC芯片上的生物素化的MUC1抗原。重组抗原(配体)的固定:将抗原用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠，pH 7.4，0.005％Tween 20)稀释至10μg/ml，然后以不同的接触时间以30μl/分钟注射，以达到在垂直方向约200响应单位(RU)的固定化水平。分析物的注射:对于单次动力学测量，将注射方向改变为水平方向，将双倍稀释系列的纯化的Fab(不同浓度范围在100和6.25nM之间)同时以50μl/min分别沿着通道1-5注射，结合时间为250或300s，解离时间为300s。沿着第六通道注入缓冲液(PBST)以提供用于参考的“线内”空白。在ProteOn Manager v3.1软件中使用简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。使用10mM甘氨酸(pH 1.5)以100ul/min的流速在水平方向进行再生，接触时间为30s。3个克隆特异性结合MUC1(图32A)，但不特异性结合“线内”空白，表明这些结合剂的特异性。所有测量的动力学和热力学数据总结在图32B中。
基于MUC1的克隆，表达和表征
通过SPR表现出对MUC1的特异性结合的所有Fab被转化为T细胞双特异性(TCB)形式。为此，将重链和轻链VH结构域的PCR扩增的DNA片段框内插入到产生TCB所需的含Fc的Ig链中(图33)。抗体链表达由MPSV启动子驱动，转录由位于CDS下游的合成的多聚A信号序列终止。除了表达盒之外，每个载体含有用于EBV-EBNA表达细胞系中自主复制的EBV oriP序列。将得到的DNA构建体与CLC(克隆58D6；克隆110A5)组合共表达并从哺乳动物来源的细胞培养上清液(克隆58D6:克隆110A5)纯化。两个双特异性抗体的分析数据的总结显示在图34A和B中。
使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器对MUC1特异性TCB的结合分析
使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)在25℃下通过表面等离振子共振测量所产生的MUC1特异性TCB的结合。生物素化的MUC1抗原和不相关的生物素化抗原通过中性抗生物素蛋白捕获固定在NLC芯片上。如前所述进行抗原的固定。对于单次动力学测量，将注射方向改变为水平方向，将两倍稀释系列的纯化构建体(不同浓度范围在30和1.88nM之间或在100和6.25nM之间)以50μl/min沿着分开的通道1-5同时注射，结合时间120s，解离时间长达600s。沿着第六通道注入缓冲液(PBST)以提供用于参考的“线内”空白。
使用10mM甘氨酸(pH 1.5)以100ul/min的流速以水平方向进行再生，接触时间为30s。3个克隆特异性结合MUC1(图35)，但不能特异性结合“线内”空白，表明这些结合剂的特异性。由于二价TCB形式的亲合效应，观察到与MUC1非常强的结合。相比之下，没有检测到与不相关抗原的结合，表明TCB构建体的特异性结合。
实施例40
产生抗BCMA抗体
1.1:生产抗原和工具试剂
1.1.1:重组，可溶性，人类BCMA细胞外结构域
用作噬菌体展示选择抗原的人，食蟹猴和小鼠BCMA的细胞外结构域在HEK EBNA细胞中瞬时表达为N末端单体Fc融合体，并且在位于携带受体链(Fc旋钮链)的Fc部分的C末端的avi标签识别序列处，通过BirA生物素连接酶的共表达在体内位点特异性生物素化。人，食蟹猴和小鼠BCMA的细胞外结构域分别包含甲硫氨酸4至天冬酰胺53，甲硫氨酸4至天冬酰胺52和丙氨酸2至苏氨酸49。这些与人IgG1的铰链N-末端融合，通过旋钮入孔技术使得能够与未融合的人IgG1 Fc部分(孔链)进行二聚化。
为了回收BCMA的细胞外结构域，使用以下引物:
AAGCTTGGATCCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCC-3(SEQ ID NO:48)，其掺入BamH1位点(粗体，带下划线)和
反向引物
5-GAATTCGCGGCCGCTCATCCTTTCACTGAATTGGTCACACTTGCATTAC-3(SEQ ID NO:49)
引物5-ACGTTAGATCTCCACTCAGTCCTGCATCTTGTTCCAGTTAAC-3(SEQ ID NO:50)和反向引物5-AACGTTGCGGCCGCTAGTTTCACAAACCCCAGG-3(SEQ ID NO:51)
GAATTCAAGCTTGCCACCATGTTGCAGATGGCTGGGCAGTGCTCC-3(SEQ ID NO:52)，其包括HindIII限制性位点(粗体，下划线)和Kozak共有序列
和
反向引物
5-GAATTCTCTAGATTACCTAGCAGAAATTGATTTCTCTATCTCCGTAGC-3(SEQ ID NO:53)
基因合成也可用于获得BCMA的细胞外结构域。
1.2:BCMA表达细胞作为工具
1.2.1:在其表面表达BCMA的人骨髓瘤细胞系
通过流式细胞术评估四种人骨髓瘤细胞系(NCI-H929，RPMI-8226，U266B1和L-363)上的BCMA表达。将NCI-H929细胞((H929)
Figure BDA0001351705530001423
CRL-9068TM)在具有10-20％热灭活的FCS的并且可以含有2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和50μM巯基乙醇的80-90％RPMI 1640中培养。RPMI-8226细胞((RPMI)
Figure BDA0001351705530001421
CCL-155TM)在含有90％RPMI 1640和10％热灭活FCS的培养基中培养。将U266B1((U266)
Figure BDA0001351705530001422
TIB-196TM)细胞在修饰成含有2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，1mM丙酮酸钠，4500mg/L葡萄糖和1500mg/L碳酸氢钠和15％的热灭活FCS的RPMI-1640培养基中培养。在85％RPMI 1640和15％热灭活的FCS中培养L-363细胞系(Leibniz Institute DSMZ-德意志微生物和细胞培养物保藏中心；DSMZ号ACC49)。简言之，收获细胞，洗涤，计数活力，以50,000细胞/孔重悬浮在96孔圆底板中，并与10μg/ml的抗人BCMA抗体(Abcam，#ab54834，小鼠IgG1)4℃下温育30min(以防止内化)。使用小鼠IgG1作为同种型对照(BD Biosciences，#554121)。然后将细胞离心(350xg 5分钟)，洗涤两次，并在4℃下与FITC-缀合的抗小鼠二级抗体温育30分钟。在温育时间结束时，将细胞离心(350xg 5分钟)，用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于100μl FACS缓冲液中，并在运行FACS Diva软件的CantoII装置上进行分析。通过QIFIKIT分析(Dako，#K0078，按照制造商的说明书)评估H929，U266B1，RPMI-8226和L-363骨髓瘤细胞系的表面膜上BCMA受体数量的相对定量。H929细胞表达最高密度的人BCMA，高达其他骨髓瘤细胞系的3.8～27倍。与作为BCMAmed/lo-表达骨髓瘤细胞的U266和作为BCMAlo-表达骨髓瘤细胞的RPMI-8226和L363相比，H929被认为是BCMAhi-表达骨髓瘤细胞系。表36总结了人多发性骨髓瘤细胞系的细胞表面上的相对BCMA受体数。
表36:NCI-H929，U266B1，RPMI-8226和L-363人骨髓瘤细胞系的细胞表面上BCMA受体数目的定量
Figure BDA0001351705530001431
1.3:从体外重组文库获得BCMA结合剂
1.3.1:构建共同轻链Fab-文库
在人源化抗CD3抗体轻链的基础上构建了Fab形式的抗体文库。仅在重链中引入多样性。使用六种不同的重链构架:VH1-46,VH1-69,VH3-15,VH3-23,VH4-59和VH5-1。CDR1,2和3被随机化，每个重链文库与非随机化轻链组合。如Nissim et al EMBO J.1994 Feb 1；13(3):692-8,和Silacci et al.Proteomics.2005Jun；5(9):2340-50描述的那样产生文库。
1.3.2:选择抗BCMA Fab克隆
通过噬菌体展示从由一个恒定VL和六个不同的人VH序列组成的合成Fab文库建立抗BCMA Fab
表37:抗BCMA克隆和各自的VL/VH配对
Figure BDA0001351705530001441
根据以下模式在溶液中进行选择轮(生物淘选):1)在用10ug/ml不相关的人IgG包被的免疫管中，每个文库池预先清除～1012个噬菌粒颗粒，以消耗识别抗原Fc-部分的抗体文库；2)在100nM不相关的非生物素化Fc旋钮入孔构建体的存在下，将非Fc结合噬菌粒颗粒与100nM生物素化BCMA温育0.5小时，以进一步耗尽总体积2ml中的Fc结合剂；3)在振荡器上通过将淘选反应物分流并转移到中性抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白预包被的微量滴定板上16个孔中20分钟，捕获生物素化BCMA和特异性结合噬菌体；4)使用洗板机用PBS/Tween20洗涤各孔10-30次和PBS洗涤10-30次；5)通过加入230nM鼠APRIL来替代识别天然配体结合位点的Fab克隆，从而选择APRIL非竞争性噬菌体抗体的非竞争性洗涤步骤；6)通过每孔加入125ul 100mM TEA(三乙胺)5-10分钟，并通过加入等体积的1M Tris/HCl pH 7.4中和，洗脱噬菌体颗粒；7)用洗脱的噬菌体颗粒重新感染对数期大肠杆菌TG1细胞，用辅助噬菌体VCSM13感染，在30℃下在振荡器上温育过夜，随后PEG/NaCl沉淀待在下一次选择轮中使用的噬菌粒颗粒。
使用100nM的恒定抗原浓度进行3至5轮的选择。除了仅使用人类BCMA作为抗原的选择运动之外，还进行了另外的选择运动，其间食蟹猴或小鼠BCMA与人类BCMA交替使用以选择交叉反应性抗体。此外，作为链霉亲和素板基捕获的备选方案，通过将5.4×107个链霉抗生物素蛋白包被的磁珠加入到淘选反应中，然后在上述条件下使用各自的磁体进行洗涤步骤，进行抗原:噬菌体复合体的捕获。
使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过表面等离振子共振筛选含Fab的细菌培养物上清液鉴定特异性结合剂。简言之，在用洗脱的噬菌体颗粒感染对数期大肠杆菌TG1细胞后，平板接种单个菌落形成单位(cfu)，挑取用于在96深孔板中接种1ml表达培养物。从ProteOn GLM芯片上的上清液捕获Fab，所述芯片在垂直方向上以8.000-10.000RU山羊抗人IgG,F(ab’)2片段特异性多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch，#109-005-006)衍生化。随后，将人，食蟹猴和小鼠BCMA以及不相关的Fc旋钮入孔构建体作为分析物以水平方向注射。对BCMA显示出显著的结合反应并且不结合抗原的Fc部分的克隆在0.5升培养体积中进行细菌表达，亲和纯化并通过使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器上的单次动力学方案的SPR分析进行动力学表征。
实施例41
BCMA结合测定:表面等离振子共振
通过表面等离振子共振(SPR)如下评估抗BCMA抗体与重组BCMA的结合。所有SPR实验在25℃在Biacore T200上用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)进行。测定抗BCMA抗体与重组BCMA Fc(kih)(人，食蟹猴和小鼠)之间相互作用的亲合力(表38-40)。生物素化重组人，食蟹猴和小鼠BCMA Fc(kih)按照说明书(Biacore，Freiburg/Germany)直接偶联在SA芯片上。固定化水平范围为80至120RU。抗-BCMA抗体在120秒内以4倍浓度范围(1.95至500nM)以30μL/分钟的流速通过流动池。监测解离180秒。通过减去在参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。这里，抗-BCMA抗体在先前活化的空表面上流动并如标准胺偶联试剂盒所述去活化。尽管用于比较目的的相互作用的二价性，但是使用Biacore T200评估软件(v 1.0，Biacore AB，Uppsala/Sweden)获得表观动力学常数，以便通过数值积分拟合1:1Langmuir结合的速率方程。
表38.仅用于比较的亲合力值(实验1)
Figure BDA0001351705530001461
表39.仅用于比较目的的亲合力值(实验2)
Figure BDA0001351705530001462
Figure BDA0001351705530001471
表40.仅用于比较目的的亲合力值(实验3)
Figure BDA0001351705530001472
还测定了抗BCMA抗体或BCMA-TCB CLC抗体与重组人BCMA Fc(kih)之间的相互作用的亲和力。使用标准胺偶联试剂盒(Biacore，Freiburg/Germany)将抗人Fab抗体(GEHealthcare)直接偶联在pH5.0的CM5芯片上。固定水平约为6500RU。在25nM下捕获抗BCMA抗体或BCMA-TCB CLC抗体90秒。重组人BCMA Fc(kih)在120或180秒内以4倍浓度范围(1.95至500nM)30μL/分钟的流速通过流动池。监测解离120或400秒。通过减去参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。这里，重组BCMA在固定的抗人Fab抗体的表面上流过，而在其上注射了HBS-EP，而不是抗BCMA抗体或BCMA-TCB CLC抗体。使用Biacore T200评估软件(v1.0，Biacore AB，Uppsala/Sweden)得到动力学常数，以通过数值积分拟合1:1 Langmuir结合的速率方程(表41)。
表41.通过1:1 Langmuir结合的拟合速率方程确定的亲和力常数
Figure BDA0001351705530001481
Figure BDA0001351705530001491
实施例42
产生具有共同轻链的二价抗BCMA IgG抗体
为了验证共同轻链的使用可以应用于任何BCMA抗体的假设，通过用共同轻链(CD3LC(CLC))取代先前在WO/2014/122143中描述的二价BCMA抗体83A10的天然轻链来生成83A10-CLC二价BCMA抗体。使用如材料和通用方法部分中所述的用于产生二价IgG抗体的一般技术制备包含83A10的两个重链和两个共同轻链的抗BCMA抗体。通过与实施例41中所述相似的方法，通过SPR测量83A10-CLC IgG抗体对人BCMA的亲和力。表42描述了重组人BCMAFc(kih)与83A10-CLC BCMA IgG抗体的结合。
表42.通过拟合速率方程确定1:1Langmuir结合的亲和力常数:重组BCMA Fc(kih)与83A10-CLC抗-BCMA抗体的结合
Figure BDA0001351705530001492
实施例43
抗BCMA IgG抗体对huTACI-R和huBAFF-R的特异性检测
作为TNF-TNF-R超家族的成员，TACI和BAFF受体与BCMA受体有关，胞外结构域中分别具有22％和18.5％的同源性。因此，进行表面等离振子共振(SPR)结合实验以检测抗BCMAIgG抗体的特异性。所有SPR实验在25℃下在Biacore T200(GE Healthcare)上进行，HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20)。使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，在Biacore CM5传感器芯片的不同流动通道上pH5.0下，将Fc融合的huBCMA，huBAFF-R和huTACI-R以高固定水平(
Figure BDA0001351705530001501
5000UU)进行化学固定。首先注射抗BCMA IgG pSCHLI372以及a-huTACI-R IgG或a-huBAFF-R IgG的高浓度溶液(3μM，溶于HBS-EP)作为阳性对照(结合时间:80s，解离时间:600s，流速:30μl/min)，以检查是否发生结合。a-huTACI-R IgG对huTACI-R以及hu-PAH-IgG对huBCFF-R和抗BCMA IgG抗体对huBCMA的阳性结合事件表明，所有受体在固定后仍然被识别。对于与huBAFF-R和/或huTACI-R以快速动力学速率常数结合的抗BCMA IgG抗体，在新的CM5传感器芯片上进行了具有低固定水平(300RU)的动力学参数的仔细检查。注射浓度为3000-93.75nM(HBS-EP中2倍稀释度)的抗BCMA IgG抗体稀释液(结合时间:80s，解离时间:300s，流速:30μl/min)，并一式两份测试样品。适用时还可以进行再生，即无快速和完全解离。通过将数据全局拟合到包括质量运输术语(Biacore T200评估版本1.0)的1:1相互作用模型，进行抗BCMA IgG抗体与huBAFF-R或huTACI-R之间相互作用的动力学评估。还进行了稳态分析。如图37所示，曲线1对应于参考通道上的信号，曲线2对应于发生结合的通道(结合通道)，曲线2-1是减法信号(结合通道-参考通道)，这意味着这是由于结合事件引起的信号。如图37所示，SPR结合测定清楚地表明pSCHLI372 IgG不结合人TACI受体。作为结合的阳性对照，使用已知略微结合TACI受体但具有非常快的结合和解离速率的另一种BCMA IgG(数据未显示)。
实施例44
生产和纯化含BCMA-TCB CLC Fc(2+1)的抗体
为了生产双特异性抗体，通过在HEK293-EBNA细胞中的各自哺乳动物表达载体的基于聚合物的瞬时共转染来表达双特异性抗体，所述细胞悬浮培养。在转染前一天，将HEK293-EBNA细胞在补充有6mM L-谷氨酰胺的Ex-Cell培养基中以1.5Mo活细胞/mL接种。对于每一毫升的最终生产体积，将2.0Mio活细胞离心(在210xg下5分钟)。吸出上清液，将细胞重悬于100μL的CD CHO培养基中。通过在100μL的CD CHO培养基中混合1μg DNA(双特异性抗体生产比例:重链:修饰的重链:轻链:修饰的轻链＝1:1:2:1；标准抗体比例:重链:轻链＝1:1比例)制备每mL最终生产体积的DNA。加入0.27μL PEI溶液(1mg/mL)后，将混合物涡旋15秒，并在室温下放置10分钟。10分钟后，重悬浮的细胞和DNA/PEI混合物放在一起，然后转移到合适的容器中，将容器放入摇动装置(37℃，5％CO2)中。3小时温育时间后，每毫升最终生产体积中加入800μL Ex-Cell培养基，其补充有6mM L-谷氨酰胺，1.25mM丙戊酸和12.5％Pepsoy(50g/L)。24小时后，每毫升最终生产量加入70μL进料溶液。7天后或细胞存活率等于或低于70％时，通过离心和无菌过滤从上清液中分离出细胞。通过亲和步骤和一个精炼步骤大小排阻层析纯化抗体。
对于亲和力步骤，将上清液加载到用6CV 20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH7.5平衡的蛋白A柱(HiTrap Protein A FF，5mL，GE Healthcare)上。在用相同缓冲液的洗涤步骤后，用20mM磷酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3.0逐步洗脱从柱洗脱该抗体。将所需抗体的级分立即用0.5M磷酸钠，pH8.0(1:10)中和，合并并通过离心浓缩。将浓缩物无菌过滤，并通过大小排阻层析进一步处理。
对于大小排阻步骤，将浓缩的蛋白质注入XK16/60 HiLoad Superdex 200柱(GEHealthcare)和20mM组氨酸，140mM氯化钠，pH 6.0，含或不含Tween20作为制剂缓冲液。合并含有单体的级分，通过离心浓缩，无菌过滤至无菌小瓶中。
使用0.1％的抗体溶液的吸光度的理论值，通过测量280nm处的吸光度来测定抗体浓度。该值基于氨基酸序列，并通过GPMAW软件(Lighthouse数据)计算。
分别通过CE-SDS(Caliper LabChip GXII系统(Caliper Life Sciences))和HPLC(TSKgel G3000 SW XL分析大小排阻柱(Tosoh))在25mM磷酸钾，125mM氯化钠，200mM L-精氨酸一盐酸盐，0.02％(w/v)叠氮化钠，pH6.7缓冲液中测定最终蛋白质制备物的纯度和单体含量。图38A-C描述了蛋白A(PA)亲和层析和大小排阻层析(SEC)纯化步骤后的最终蛋白质制备物的CE-SDS图(未还原(上图))和还原(下图))。(图38B)pSCHLI333-TCB CLC(图38B)pSCHLI372-TCB CLC(图38C)pSCHLI373-TCB CLC。应用于pSCHLI333-TCB CLC抗体的PA亲和层析和SEC纯化步骤产生纯度为89.2％和100％的单体含量(图38A)，pSCHLI372-TCB CLC抗体的纯度为88.5％和100％的单体含量(图38B)，pSCHLI372-TCB CLC抗体的纯度为91.8％和100％单体含量(图38C)。表43总结了PA亲和层析和SEC纯化步骤后pSCHLI333-TCB CLC,pSCHLI372-TCB CLC,和pSCHLI373-TCB CLC抗体的性质。在所有BCMA-TCB CLC抗体中，始终达到>88％的纯度和100％的单体含量。总体结果清楚地表明，对TCB抗体使用共同的轻链(CLC)可以实现生产/纯化特征的优势，并且仅需要两个纯化步骤(即PA亲和层析和SEC)来实现已经高质量的蛋白质制剂，其具有非常好的可开发性。
表43:蛋白A亲和层析和大小排阻层析纯化步骤后BCMA-TCB CLC抗体的生产/纯化谱
Figure BDA0001351705530001521
实施例44
BCMA-TCB CLC抗体与BCMA阳性多发性骨髓瘤细胞系的结合
通过流式细胞术分析BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333，pSCHLI372，pSCHLI373)对表达BCMAhi的H929细胞上的人BCMA的结合。MKN45(不表达BCMA的人胃腺癌细胞系)用作阴性对照。简言之，收获培养的细胞，计数并使用ViCell评估细胞活力。然后在含BSA的FACS染色缓冲液(BD Biosciences)中将活细胞调节至每毫升2x106个细胞。将100μl该细胞悬浮液每孔进一步等分到圆底96孔板中，并与30μl的BCMA-TCB CLC抗体或相应的TCB对照在4℃温育30分钟。滴定所有BCMA-TCB CLC抗体(和TCB对照)，并在0.12-500nM的终浓度范围内分析。然后将细胞离心(5分钟，350×g)，用120μl/孔FACS染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤，重悬浮，并在4℃下用荧光染料缀合的PE缀合的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fc片段特异性分子(Jackson Immuno Research Lab；109-116-170)再温育30分钟。然后将细胞用染色缓冲液(Stain Buffer)(BD Biosciences)洗涤两次，使用每孔100μl BD固定缓冲液(#BD Biosciences，554655)在4℃固定20分钟，重悬于120μl FACS缓冲液中，并使用BD FACSCantoII进行分析。如图39A-B所示，BCMA-TCB CLC抗体的平均荧光强度以抗体浓度的函数作图；(图39A)H929细胞上的pSCHLI372-TCB CLC和pSCHLI373-TCB CLC；(图39B)在MKN45细胞上的pSCHLI372-TCB CLC和pSCHLI373-TCB CLC。BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333,pSCHLI372,pSCHLI373)在低于100nM的浓度下不结合BCMA阴性和CD3阴性的MKN45细胞。适用时，使用Prism GraphPad(LaJolla，CA，USA)计算EC50，并且在表44中总结EC50值，其表示达到抗BCMA/抗CD3 TCB抗体与H929细胞结合的最大结合的50％所需的抗体浓度。
表44:BCMA-TCB CLC抗体与H929细胞结合的EC50值
Figure BDA0001351705530001531
Figure BDA0001351705530001541
实施例45
BCMA-TCB CLC抗体与CD3阳性Jurkat T细胞系的结合(流式细胞术)
还通过流式细胞术分析BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333，pSCHLI372，pSCHLI373)与人白血病T细胞Jurkat(ATCC TIB-152)上表达的人CD3的结合特性。Jurkat T细胞在补充有10％热灭活FCS的RPMI中培养。简言之，收获培养的细胞，计数并使用ViCell评估细胞活力。然后将活细胞在含有0.1％BSA的FACS染色缓冲液(BD Biosciences)中调节至每毫升2x106个细胞。将100μl该细胞悬浮液每孔进一步等分到圆底96孔板中。将30μl BCMA-TCB CLC抗体或相应的TCB对照加入到含细胞的孔中以获得0.12nM至500nM的终浓度。以相同的摩尔浓度使用BCMA-TCB CLC抗体和对照IgG。在4℃下温育30分钟后，将细胞离心(5分钟，350×g)，用含有150μl/孔BSA的FACS染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤两次，然后每孔使用100μlBD固定缓冲液(#BD Biosciences，554655)在4℃下固定细胞20分钟，重悬于120μl FACS缓冲液中，并使用BD FACS CantoII进行分析。评估BCMA-TCB CLC抗体与T细胞的结合，并测定表达CD3的Jurkat T细胞上选通的荧光强度中值，并绘成直方图或点图。图40A-B显示结合Jurkat T细胞(图40A)或MKN45细胞(图40B)的BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333，pSCHLI372，pSCHLI373)的荧光强度中值，并以抗体浓度的函数绘制。未达到抗-BCMA/抗CD3 TCB抗体与CD3阳性Jurkat T细胞的EC50值和最大结合。同种型对照抗体不结合Jurkat T细胞，BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI333，pSCHLI372，pSCHLI373)在低于100nM的浓度下不结合BCMA阴性和CD3阴性MKN45细胞。
实施例46
BCMA-TCB CLC抗体与CD3阳性T细胞和BCMA阳性多发性骨髓瘤细胞系结合时人T细胞的活化
通过流式细胞术，通过在存在或不存在表达人BCMA的MM细胞的情况下评估CD4+和CD8+T细胞上的早期活化标记物CD69或晚期活化标记物CD25的表面表达，分析BCMA-TCBCLC抗体(pSCHLI372，pSCHLI373)诱导T细胞活化的能力。简言之，用细胞解离缓冲液收获BCMA阳性H929细胞，计数并检查活力。将细胞在修饰的RPMI-1640培养基中调节至0.3x106(存活)细胞/ml，将100μl该细胞悬浮液每孔移入圆底96孔板(如所示)。将50μl(稀释的)BCMA-TCB CLC抗体加入到含细胞的孔中以获得0.012pM-100nM的终浓度。从健康供体的新鲜血液中分离人PBMC效应细胞，并在修饰的RPMI-1640培养基中调节至每ml 6x106(存活)细胞。测定平板的每孔加入50μl该细胞悬浮液，以获得10:1的PBMC与骨髓瘤肿瘤细胞的最终E:T比。为了分析在表达人BCMA的靶细胞的存在下，BCMA-TCB CLC抗体是否能够特异性地激活T细胞，包括含有3至10nM的各自BCMA-TCB CLC抗体分子以及PBMC但没有靶细胞的孔。在37℃，5％CO2温育48小时后，将细胞离心(5分钟，350×g)，并用含有0.1％BSA的150μl/孔PBS洗涤两次。CD4(小鼠IgGl,K；克隆RPA-T4),CD8(小鼠IgGl,K；克隆HIT8a；BD#555635),CD69(小鼠IgGl；克隆L78；BD#340560)和CD25(小鼠IgGl,K；克隆M-A251；BD#555434)的表面染色根据供应商的建议在4℃进行30分钟。将细胞用含有0.1％BSA的150μl/孔PBS洗涤两次，并在4℃下使用100μl/孔固定缓冲液(BD#554655)固定15分钟。离心后，将样品重悬浮于含有0.1％BSA的200μl/孔PBS中，并使用FACS CantoII机器(Software FACS Diva)进行分析。图41描绘了温育48小时后CD4+和CD8+T细胞上的早期活化标记物CD69和晚期活化标记物CD25的表达水平(来自两个独立实验的代表性结果)。pSCHLI372-TCB CLC和pSCHLI373-TCBCLC抗体在BCMA阳性靶细胞存在下以浓度依赖性和特异性方式诱导CD69和CD25活化标记物的上调。当使用DP47-TCB对照抗体处理人PBMC时，没有观察到CD4+和CD8+T细胞的活化，这表明尽管与T细胞上的CD3结合，但是当TCB抗体不结合BCMA阳性靶细胞时，不发生T细胞活化。
实施例47
由抗BCMA/抗CD3 T细胞双特异性抗体诱导的表达BCMAhi的H929骨髓瘤细胞的重定向T细胞毒性(比色LDH释放测定)
还分析了BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI372，pSCHLI373)在通过抗原结合部分与细胞上BCMA结合交联构建体时在BCMA-高表达MM细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的潜力。简言之，用细胞解离缓冲液(Cell Dissociation Buffer)收获表达人BCMA的H929多发性骨髓瘤靶细胞，洗涤并重新悬浮于补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI中。将约30,000个细胞/孔接种在圆底96孔板中，并将构建体的相应稀释液加入所希望的最终浓度(一式三份)；终浓度范围为0.12pM至100nM。为了进行适当的比较，将所有TCB构建体和对照调节至相同的摩尔浓度。将人总T细胞(效应子)加入到孔中以获得5:1的最终E:T比。当使用人PBMC作为效应细胞时，使用10:1的最终E:T比。阴性对照组仅由效应细胞或靶细胞代表。作为人pan T细胞活化的阳性对照，使用1μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过温育靶细胞与最终浓度为1％的Triton X-100，诱导细胞死亡，测定H929MM靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)由仅与效应细胞共温育的靶细胞表示，即没有任何T细胞双特异性抗体。在37℃，5％CO2下温育20-24小时或48小时后，按照制造商的说明书，用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science)测定从凋亡/坏死的MM靶细胞释放到上清液中的LDH。在浓度–应答曲线中，将LDH释放的百分比针对BCMA-TCB CLC抗体的浓度作图。使用Prism软件(GraphPad)测量EC 50值，并将其确定为导致最大LDH释放的50％的TCB抗体浓度。如图42A-B所示，BCMA-TCB CLC抗体，pSCHLI372-TCB CLC(图42A，B)和pSCHLI373-TCB CLC(图42B)诱导BCMA阳性H929骨髓瘤细胞的浓度依赖性杀伤，如通过LDH释放所测量。H929细胞的杀伤是特异性的，因为即使在100nM的最高测试浓度下，不与BCMA阳性靶细胞结合的DP47-TCB对照抗体也不诱导LDH释放。表45总结了由BCMA-TCB CLC抗体诱导的BCMA阳性H929细胞的重定向T细胞杀伤的EC 50值。
表45:由BCMA-TCB CLC抗体诱导的H929细胞的重定向T细胞杀伤的EC 50值
抗-BCMA/抗-CD3 TCB分子 EC50(pM) EC50(μg/ml)
pSCHLI333-TCB CLC 980 0.19
pSCHLI372-TCB CLC(实验1) 450 0.08
pSCHLI373-TCB CLC 1590 0.31
pSCHLI372-TCB CLC(实验2) 900 0.17
实施例48
由BCMA-TCB CLC抗体诱导的表达BCMAmed/lo的U266骨髓瘤细胞的重定向T细胞毒性(LDH释放试验)
分析BCMA-TCB CLC抗体(pSCHLI372，pSCHLI373)在通过抗原结合部分与细胞上BCMA结合交联构建体时在表达BCMAmed/lo的MM细胞中诱导T细胞介导的细胞凋亡的能力。简言之，用细胞解离缓冲液(Cell Dissociation Buffer)收获表达人BCMAmed/lo的U266多发性骨髓瘤靶细胞，洗涤并重新悬浮于补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI中。将约30,000个细胞/孔接种在圆底96孔板中，并将构建体的相应稀释液加入所希望的最终浓度(一式三份)；终浓度范围为0.12pM至100nM。为了进行适当的比较，将所有TCB构建体和对照调节至相同的摩尔浓度。将人总T细胞(效应子)加入到孔中以获得5:1的最终E:T比。当使用人PBMC作为效应细胞时，使用10:1的最终E:T比。阴性对照组仅由效应细胞或靶细胞代表。作为人T细胞活化的阳性对照，使用1μg/ml PHA-M(Sigma#L8902)。为了归一化，通过温育靶细胞与最终浓度为1％的Triton X-100，诱导细胞死亡，测定MM靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)由仅与效应细胞共温育的靶细胞表示，即没有任何T细胞双特异性抗体。在37℃，5％CO2下温育20-24小时后，按照制造商的说明书，用LDH检测试剂盒(RocheApplied Science)测定从凋亡/坏死的MM靶细胞释放到上清液中的LDH。在浓度–应答曲线中，将LDH释放的百分比针对BCMA-TCB CLC抗体的浓度作图。使用Prism软件(GraphPad)测量EC 50值，并将其确定为导致最大LDH释放的50％的TCB抗体浓度。表46总结了由BCMA-TCBCLC抗体诱导的BCMA阳性U266细胞的重定向T细胞杀伤的EC 50值。
表46:由BCMA-TCB CLC抗体诱导的U266细胞的重定向T细胞杀伤的EC 50值
抗-BCMA/抗-CD3 TCB分子 EC50(pM) EC50(μg/ml)
pSCHLI372-TCB CLC 5700 1.1
示例性实施方案的氨基酸序列
1)以共同轻链形式使用的FoR结合剂，可变重链
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2)CD3结合剂共同轻链(CLC)
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3)CD3结合剂，重链
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4)共同轻链形式的MUC1结合剂，可变重链
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5)以共同轻链形式使用的BCMA结合剂,可变重链
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6)未靶定的DP47
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7)示例性靶序列
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8)示例性实施方案的核苷酸序列
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9)额外的共同轻链蛋白质和核苷酸序列
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10)DNA序列人源化的CD3CH2527(CDR/VH/VL)
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虽然为了清楚理解的目的，通过说明和实施例的方式对前述发明进行了详细描述，但是说明和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用明确地完整并入本文。
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Claims (49)

1.一种T细胞活化双特异性抗原结合分子，其包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含第一轻链，并且其中所述第一抗原结合部分能够特异性结合活化T细胞抗原，其中所述活化T细胞抗原是CD3，其中第二抗原结合部分包含第二轻链，并且其中第二抗原结合部分能够特异性结合靶细胞抗原，其中所述靶细胞抗原是叶酸受体1(FolR1)，其中第一和第二轻链的氨基酸序列是相同的，其中所述第一轻链和所述第二轻链包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1,SEQ ID NO:33的轻链CDR2和SEQ ID NO:34的轻链CDR3，
其中第一抗原结合部分是Fab，包含SEQ ID NO:37的重链CDR1,SEQ ID NO:38的重链CDR2和SEQ ID NO:39的重链CDR3；且
其中第二抗原结合部分是Fab，且包含：
-SEQ ID NO:8的重链CDR1,SEQ ID NO:9的重链CDR2,和选自以下的重链CDR3：NYYAGVTPFDY,NYYTGGSSAFDY,
NYYLFSTSFDY,NYYIGIVPFDY,NYYVGVSPFDY,NFTVLRVPFDY,NYYIGVVTFDY,GEWRRYTSFDY,GGWIRWEHFDY,
TGWSRWGYMDY,GEWIRYYHFDY,VGWYRWGYMDY,或
-SEQ ID NO:16的重链CDR1,SEQ ID NO:17的重链CDR2,和选自以下的重链CDR3：PWEWSWYDY,PWEWSYFDY,PWEWAWFDY,
PWEWAYFDY。
2.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其还包含能够特异性结合靶细胞抗原的第三抗原结合部分。
3.权利要求1的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其还包含由能够稳定结合的第一和第二亚基组成的Fc结构域。
4.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链包含κ恒定轻链结构域。
5.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链包含λ恒定轻链结构域。
6.权利要求5的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链是人或人源化λ轻链。
7.权利要求6的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链是人或人源化的λ7轻链。
8.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
9.权利要求8的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链包含SEQID NO:35的氨基酸序列。
10.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合FolR1的抗原结合部分包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:16的重链CDR1，SEQ ID NO:17的重链CDR2和SEQ ID NO:18的重链CDR3。
11.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其包含不超过一个能够特异性结合活化T细胞抗原的抗原结合部分。
12.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二抗原结合部分，任选地经由肽接头，彼此融合。
13.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合部分在所述Fab的重链的C末端与所述第一抗原结合部分的Fab的重链的N末端融合。
14.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合部分在所述Fab的重链的C末端与所述第二抗原结合部分的Fab的重链的N末端融合。
15.权利要求1或6所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述分子还包含由能够稳定结合的第一和第二亚基组成的Fc结构域，且其中所述第二抗原结合部分在所述Fab的重链的C末端融合到所述Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
16.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述分子还包含由能够稳定结合的第一和第二亚基组成的Fc结构域，且其中所述第一抗原结合部分在所述Fab的重链的C-末端融合到所述Fc结构域的第一或第二亚基的N-末端。
17.权利要求1所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述分子还包含由能够稳定结合的第一和第二亚基组成的Fc结构域，且其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分各自在所述Fab的重链的C末端融合到所述Fc结构域的一个亚基的N末端。
18.权利要求2的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一、第二和第三抗原结合部分各自是包含相同VLCL轻链的Fab分子。
19.权利要求2的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一、第二和第三抗原结合部分各自是包含SEQ ID NO:32的轻链CDR1，SEQ ID NO:33的轻链CDR2和SEQ ID NO:34的轻链CDR3的Fab分子。
20.权利要求2的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一、第二和第三抗原结合部分各自是包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链的Fab分子。
21.权利要求2所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述分子还包含由能够稳定结合的第一和第二亚基组成的Fc结构域，且其中所述第三抗原结合部分在所述Fab的重链的C末端融合到所述Fc结构域的第一或第二亚基的N末端。
22.权利要求2所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述分子还包含由能够稳定结合的第一和第二亚基组成的Fc结构域，且其中所述第二和第三抗原结合部分各自在所述Fab的重链的C末端融合到所述Fc结构域的一个亚基的N末端，并且第一抗原结合部分在Fab的重链的C末端融合到第二抗原结合部分的Fab的重链的N末端。
23.权利要求22的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的一部分。
24.权利要求23的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第二和第三抗原结合部分和Fc结构域是IgG类免疫球蛋白的一部分。
25.权利要求2所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第三抗原结合部分各自在所述Fab的重链的C末端融合到Fc结构域的一个亚基的N末端，并且第二抗原结合部分在Fab的重链的C末端融合到第一抗原结合部分的Fab的重链的N末端。
26.权利要求25的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第三抗原结合部分和Fc结构域是免疫球蛋白分子的一部分。
27.权利要求25的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第三抗原结合部分和Fc结构域是IgG类免疫球蛋白的一部分。
28.权利要求3所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域是IgG Fc结构域。
29.权利要求28所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域是IgG1或IgG4 Fc结构域。
30.权利要求3所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。
31.权利要求3所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基的结合的修饰。
32.权利要求31的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，其可定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中。
33.权利要求3所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中与天然IgG1 Fc结构域相比，所述Fc结构域显示出对Fc受体的降低的结合亲和力和/或降低的效应子功能。
34.权利要求3所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。
35.权利要求34的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述一个或多个氨基酸取代位于选自L234，L235和P329的一个或多个位置。
36.权利要求34的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域的每个亚基包含减少与活化Fc受体的结合和/或效应子功能的三个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为L234A，L235A和P329G。
37.权利要求33到36中任一项所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述Fc受体是Fcγ受体。
38.权利要求33至36中任一项所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
39.权利要求1中所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链是人源化轻链。
40.权利要求1中所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二轻链能够用于具有不同抗原特异性的多于两个的抗原结合部分。
41.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至40中任一项所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子或其片段。
42.由权利要求41的分离的多核苷酸编码的多肽。
43.一种载体，其包含权利要求41的分离的多核苷酸。
44.权利要求43的载体，其中所述载体是表达载体。
45.一种宿主细胞，其包含权利要求41的分离的多核苷酸或权利要求43或44的载体。
46.一种生产权利要求1至40中任一项的T细胞活化双特异性抗原结合分子的方法，包括以下步骤:a)在适于表达T细胞活化双特异性抗原结合分子的条件下培养权利要求45的宿主细胞，以及b)回收T细胞活化双特异性抗原结合分子。
47.权利要求46的方法制备的T细胞活化双特异性抗原结合分子。
48.一种药物组合物，其包含权利要求1至40中任一项所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体。
49.权利要求1至40中任一项所述的T细胞活化双特异性抗原结合分子的用途，用于制造治疗需要其的个体中疾病的药物，其中所述疾病是选自卵巢癌、子宫癌、非小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌和肾癌的癌症。
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