ES2963385T3

ES2963385T3 - Anticuerpos biespecíficos Fab en tándem asimétricos monovalentes

Info

Publication number: ES2963385T3
Application number: ES17841965T
Authority: ES
Inventors: Chengbin Wu
Original assignee: Epimab Biotherapeutics Inc
Current assignee: Epimab Biotherapeutics Inc
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: JP2019533985A; AU2017312974A1; BR112019002579A2; CN109803682A; EP3500301B1; EP3500301A4; TW201808999A; RU2019103230A3; RU2019103230A; TWI672317B; CN109803682B; AU2017312974B2; EP3500301A1; JP7033328B2; WO2018035084A8; CA3032430A1; US20190177439A1; WO2018035084A1

Abstract

La invención proporciona anticuerpos biespecíficos Fab en tándem asimétricos y monovalentes que pueden unirse a dos epítopos o dos antígenos, composiciones que comprenden dichos anticuerpos, usos de dichos anticuerpos, métodos para producir dichos anticuerpos, ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos biespecíficos Fab en tándem asimétricos monovalentes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos modificados, a composiciones de los mismos, y a métodos de preparación y utilización de dichos anticuerpos biespecíficos.

Antecedentes de la invención

Los esfuerzos realizados a lo largo de los últimos cincuenta años en la ingeniería de nuevas formas de anticuerpos han llevado a la demostración y disponibilidad de una diversidad de formatos de unión biespecíficos y multiespecíficos. La diversidad de formatos incluye, por ejemplo, anticuerpos Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)), fusiones IgG-scFv tetravalentes (Coloma y Morrison, Nat. Biotechnol., 15: 159-163 (1997)), diacuerpos (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448, 1993), moléculas de scFv en tándem (ver, p. ej., Bargou et al., Science 321, 974-977, 2008), anticuerpos de tipo IgG de doble dominio variable tetravalentes ("DVD-Ig", por sus siglas en inglés; Wu et al., Nat. Biotechnol., 25: 1290-1297, 2007), Fab de inmunoglobulina en tándem tetravalentes ("FIT-Ig", por sus siglas en inglés), (documento n.° WO 2015/103072, Epimab Biotheraupeutics), IgG biespecíficos híbridos de rata/ratón bivalentes (Lindhofer et al., J. Immunol., 155: 219 225, 1995) y proteínas de unión CrossMAb biespecíficas (ver, p. ej., el documento n.° WO 2013/026831 (Roche Glycart AG) y el documento n.° WO 2014/167022 (Engmab AG)). Resulta de particular interés para el posible uso en el tratamiento de enfermedades, el diseño y producción de diversos anticuerpos biespecíficos modificados que puedan unirse a dos epítopos o antígenos diferentes, evitando de esta manera la necesidad de terapias de combinación. Ver, por ejemplo, las revisiones en Spiess et al., Molec. Immunol., 67: 95-106, 2015; Riethmüller, Cancer Immun., 12: 12 18, 2012; Kontermann, Acta Pharmacologica Sinica, 26 (1): 1-9, 2005; Marvin et al., Acta Pharmacologica Sinica, 26(6): 649-658, 2005).

Existe un creciente interés en el desarrollo de anticuerpos biespecíficos para el tratamiento de diversos cánceres. Resulta de particular interés el posible uso de los anticuerpos biespecíficos para redirigir linfocitos T para la eliminación de diversas células tumorales. En un ejemplo de dicho enfoque de "redireccionamiento de linfocitos T", puede diseñarse un anticuerpo biespecífico que se une a un antígeno de superficie sobre una célula de cáncer diana y que también se une a un componente activador del complejo de receptor de linfocito T (RLT) sobre un linfocito T inmaduro, tal como CD3. La unión simultánea del anticuerpo biespecífico a ambos tipos celulares proporciona una asociación temporal (sinapsis célula a célula) entre las células diana y los linfocitos T, conduciendo a la activación de linfocitos T citotóxicos (LTC) que atacan a las células cáncer reconocidas. Por lo tanto, los linfocitos T han sido artificialmente redirigidos a células diana de cáncer específicas independientemente de la presentación de antígenos peptídicos por la célula diana o de la especificidad de los linfocitos T, tal como se requiere normalmente para la activación restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de los LTC. En el presente contexto, resulta especialmente importante que los LTC solo sean activados cuando una célula diana les esté presentando el anticuerpo biespecífico, es decir, cuando se esté mimetizando la sinapsis inmunitaria, y no simplemente con la unión del anticuerpo al antígeno de los linfocitos T.

Un formato de anticuerpo biespecífico que ha continuado siendo de interés para el redireccionamiento de los linfocitos T a las células tumorales es el "acoplador de linfocitos T biespecífico" o anticuerpo "BiTE", por sus siglas en inglés, por ejemplo, que comprende dos anticuerpos scFv unidos mediante un conector estándar de glicina-serina (G<4>S) en el que un scFv proporciona un sitio de unión para un antígeno tumoral (tal como el antígeno tumoral 17-1A) y el otro scFv proporciona un sitio de unión para el antígeno CD3 sobre los linfocitos T (Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7021-7025, 1995). Un anticuerpo BiTE anti-CD3 x anti-CD19, el blinatumomab, ha sido aprobado por la Administración de alimentos y fármacos de Estados Unidos (FDA) para el tratamiento de una forma rara de leucemia linfoblástica aguda (LLA) de los linfocitos B. Otros formatos de anticuerpo biespecífico que se han investigado para el posible uso en el redireccionamiento de los linfocitos T para unirse a células de cáncer son los diacuerpos en tándem tetravalentes ("TandAb", Kipriyanov et al., J. Mol. Biol., 293: 41-56, 1999; Arndt et al., Blood, 94: 2562-2568, 1999) y la proteína de redireccionamiento de doble afinidad ("DART", Johnson et al., J. Mol. Biol., 399: 436-449, 2010). Los anticuerpos biespecíficos también se han estudiado para la utilización en el redireccionamiento de células efectoras citotóxicas, tales como las células NK y los macrófagos, para que ataquen las células tumorales (por ejemplo, Weiner et al., Cancer Res., 55: 4586-4593, 1995).

Actualmente no está claro cuál es el enfoque más preferente que debe utilizarse para el redireccionamiento de los linfocitos T u otras células para que ataquen las células de cáncer en el tratamiento de un sujeto humano. Por ejemplo, la activación de los linfocitos T puede desencadenar una intensa liberación sostenida de potentes citoquinas. Dicha "tormenta de citoquinas" puede presentar efectos perjudiciales no solo sobre el tejido local sino también sistémicamente en un paciente. De acuerdo con lo anterior, los métodos de redireccionamiento de linfocitos T u otras células para tratar un cáncer pueden comprender una o más etapas llevadas a caboin vitro, ex vivooin vivo.

Muchos formatos biespecíficos, tales como BiTE, diacuerpos, DART y TandAb, utilizan un formato de cadena sencilla para unir diferentes dominios variables mediante conectores peptídicos para conseguir la biespecificidad. Debido a que dichos formatos no contienen una región Fc, normalmente presentan semividasin vivomuy cortas y son físicamente inestables (Spiess et al. (2015),op. cit.).Normalmente, se diseñan formatos biespecíficos que contienen Fc para incrementar la semivida y podrían proporcionar, además, función de efector Fc. Varios formatos biespecíficos que contienen dichos Fc utilizan la tecnología de "botones en ojales" ("KiH", por sus siglas en inglés) (Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621, 1996) para mejorar el ensamblaje y la estabilidad de la región Fc, así como para estimular la heterodimerización entre los dominios CH3 de las cadenas pesadas de dos anticuerpos diferentes, conduciendo a un anticuerpo biespecífico bilateralmente heterogéneo, aunque algunos de los formatos todavía podrían presentar otros problemas, tales como la susceptibilidad al apareamiento incorrecto de cadenas ligeras. El apareamiento incorrecto de cadenas ligeras puede llevar a una producción ineficiente del formato pretendido. De acuerdo con lo anterior, se ha diseñado una variedad de formatos en un esfuerzo por tratar este problema.

El documento n.° WO2013026831 se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas, a polinucleótidos codificantes de dichas moléculas, a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos, a métodos para producir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas y a métodos de utilización de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas en el tratamiento de enfermedades.

El documento n.° WO2016020309 se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas para la activación y redireccionamiento de linfocitos T a células diana específicas, a polinucleótidos codificantes de dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas, a vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos, a métodos para producir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas y a métodos de utilización de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas en el tratamiento de enfermedades.

Tal como se pone de manifiesto a partir de las explicaciones anteriores, existe una amplia diversidad de formatos de anticuerpo biespecífico que se han diseñado y estudiado como posibles formatos para desarrollar nuevos anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, hasta la fecha, no ha aparecido ningún formato que proporcione el juego completo de propiedades que se prestaría al desarrollo de nuevos anticuerpos terapéuticos para el tratamiento de la mayoría de enfermedades. Dado el creciente número de posibles aplicaciones de las proteínas de unión biespecíficas y los variados resultados asociados a los formatos disponibles actualmente, sigue existiendo una necesidad de formatos mejorados que puedan manipularse para resolver los retos particulares relacionados con el desarrollo de anticuerpos para tratar enfermedades específicas.

Sumario

La presente invención, que se define en las reivindicaciones, satisface la necesidad anteriormente señalada mediante la provisión de anticuerpos biespecíficos basados en Fab y unidos en tándem que se han manipulado para unirse a dos epítopos diferentes, estén presentes en el mismo antígeno diana o en dos antígenos diana diferentes. Un anticuerpo biespecífico según la invención, según se reivindica en la presente memoria, presenta dos unidades Fab en las que cada unidad de Fab se une únicamente a uno de los epítopos o antígenos a los que se une el anticuerpo y se denomina "anticuerpo biespecíficos Fab en tándem asimétricos monovalentes" o "anticuerpo biespecífico Fab-MAT", por sus siglas en inglés, o simplemente, "anticuerpo Fab-MAT". Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención, según se reivindica en la presente memoria, es monovalente (un sitio de unión) para cada uno de los dos epítopos diferentes o dos antígenos diferentes a los que se une el anticuerpo Fab-MAT. Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según la invención, tal como se reivindica en la presente memoria, es una proteína tetramérica que comprende: una "cadena polipeptídica pesada" (o "cadena pesada Fab-MAT"), una "cadena polipeptídica Fc" (o "cadena Fc Fab-MAT") y dos cadenas ligeras diferentes ("primera cadena ligera de Fab-MAT" y "segunda cadena ligera de Fab-MAT").

Un fragmento Fab de una inmunoglobulina está compuesto de dos componentes que se asocian covalentemente para formar un sitio de unión a anticuerpo. Los dos componentes son, cada uno, una cadena de dominio variable-dominio constante (VH-CH1 o VL-CL) y, por lo tanto, cada cadena V-C de un Fab puede describirse como una "mitad" de una unidad de unión de Fab. La cadena pesada del anticuerpo Fab-MAT comprende la mitad de una primera y la mitad de una segunda unidad de Fab (V-C) fusionadas en tándem, seguidas de una región Fc que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 C-terminal. La cadena Fc Fab-MAT comprende una región bisagra aminoterminal, que está unida a un dominio CH2, que a su vez está unido a un dominio CH3 carboxiloterminal en el mismo orden que el observado en una molécula de IgG natural. La cadena Fc de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según la invención no contiene, sin embargo, ninguna parte de las unidades Fab o cualquier otro dominio funcional unido a su región bisagra aminoterminal o su dominio CH3 carboxiloterminal que resulte esencial para la formación de las unidades de unión de Fab funcionales. Cada una de las dos cadenas ligeras de Fab-MAT proporciona la otra mitad (V-C) de cada unidad de unión de Fab. Las cadenas ligeras de Fab-MAT y la cadena pesada están diseñadas de manera que cada cadena ligera se asocie con su V-C correspondiente en la cadena pesada para formar las unidades de unión de Fab pretendidas y para evitar el apareamiento incorrecto e interfiriente de cadenas ligeras con el V-C incorrecto en la cadena pesada. Debido a que la cadena Fc de Fab-MAT se desea que dimerice con la región Fc de la cadena pesada de Fab-MAT, resulta preferente que la cadena Fc de Fab-MAT sea esencialmente idéntica a la parte correspondiente de la cadena pesada de Fab-MAT, excepto por mutaciones de botones-en-ojales (KiH) diseñadas para facilitar el apareamiento preferente de los dominios CH3 de la cadena pesada y la cadena Fc de Fab-MAT frente a la homodimerización de dos cadenas pesadas de Fab-MAT o dos cadenas Fc de Fab-MAT. Opcionalmente, los dominios CH3 de las cadenas pesada y Fc de Fab-MAT ventajosamente pueden modificarse adicionalmente mediante la introducción de uno o más puentes salinos, de manera que dichas adiciones conduzcan a una estabilidad mejorada del heterodímero. Un puente salino comprende un enlace de hidrógeno y una interacción electrostática tal como la que puede ocurrir entre los residuos de glutamato y lisina.

El ensamblaje de un anticuerpo biespecífico de Fab-MAT funcional de la invención se consigue mediante asociación de cada cadena ligera de Fab-MAT con su correspondiente segmento de medio Fab en la cadena pesada para formar una unidad de unión de Fab completa y la heterodimerización del dominio Fc de la cadena pesada con el dominio Fc de la cadena Fc de Fab-MAT. La heterodimerización del dominio Fc de la cadena pesada con el dominio Fc de la cadena Fc se dirige y favorece utilizando una o más mutaciones conocidas de la tecnología de "botones-en-ojales" ("KiH") en la que el dominio CH3 de una región Fc en una cadena se hace mutar para formar un botón estructural protuberante que desfavorece la homodimerización con cadenas que contienen botón idénticas. El dominio CH3 de la otra región Fc de la otra cadena se hace mutar para formar un ojal estructural que se empareja eficientemente con el dominio CH3 que presenta una mutación que proporciona un botón estructural, desfavoreciendo simultáneamente también la homodimerización con cadenas que contienen ojal idénticas (Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621, 1996; Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35, 1997). De esta manera, el ensamblaje de las cuatro cadenas polipeptídicas proporciona un anticuerpo biespecífico que es monovalente para cada epítopo o antígeno y estructuralmente asimétrico en el aspecto de que todas las unidades Fab están formadas por cadenas ligeras que se asocian con la cadena pesada única.

La invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab en tándem asimétrico monovalente ("anticuerpo Fab-MAT", "Fab-MAT") que comprende cuatro cadenas polipeptídicas, (a), (b), (c) y (d):

(a) una cadena polipeptídica pesada ("cadena pesada"), en la que dicha cadena pesada comprende (de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal): VLA-CL-VHB-CH1-bisagra-CH2-CH3m1, en la que:

VLa es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que se une (se fusiona) directamente con CL, que es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana, en el que VL<a>-CL es una mitad de una primera unidad de unión Fab (que reconoce el antígeno o epítopo "A") y se une (se fusiona) directamente a VH, en donde VH<a>es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se une (se fusiona) directamente a CH1, que es un dominio constante CH1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde VH-CH1 es una mitad de una segunda unidad de unión Fab (que reconoce el antígeno o epítopo "B"), y en donde VHb-CH1 se une (se fusiona) directamente a una bisagra-CH2, en donde bisagra-CH2 es la región bisagra-CH2 de una cadena pesada de inmunoglobulina y en donde la bisagra-CH2 se une (se fusiona) directamente a CH3m1, que es un primer dominio constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se ha mutado con una o más mutaciones de botones-en-ojales (KiH) para formar un botón estructural o un ojal estructural en dicho dominio constante CH3m1, en donde A y B son diferentes antígenos o diferentes epítopos; (b) una primera cadena ligera que comprende VHA-Ch1, en donde VHa es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se une (se fusiona) directamente a CH1, que es un dominio constante CH1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana y en donde VHA-CH1 es la otra mitad de dicha primera unidad de unión de Fab;

(c) una segunda cadena ligera que comprende VL-CL, en donde VLes un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que se une (se fusiona) directamente a CL, que es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana y en donde VLb-CL es la otra mitad de dicha segunda unidad de unión de Fab, y

(d) una cadena Fc que comprende bisagra-CH2-cH3m2, en donde la bisagra-CH2 es la región bisagra-CH2 de una cadena pesada de inmunoglobulina y en donde la bisagra-CH2 se une a CH3m2, que es un segundo dominio constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se ha mutado con una o más mutaciones de botones-en-ojales (KiH) para formar un botón estructural o un ojal estructural en dicho dominio constante CH3m2;

con la condición de que:

cuando el dominio CH3m1 de la cadena pesada se ha mutado para formar un botón estructural, entonces el dominio CH3m2 de la cadena Fc se ha mutado para formar un ojal estructural para favorecer el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2, y

cuando el dominio CH3m1 de la cadena pesada se ha mutado para formar un ojal estructural, entonces el dominio CH3m2 de la cadena Fc se ha mutado para formar un botón estructural para favorecer el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2, y

opcionalmente (con o sin), que comprende una mutación tanto en el dominio CH3m1 de la cadena pesada como en el dominio CH3m2 de la cadena Fc para introducir un residuo de cisteína para favorecer la formación de enlace disulfuro en el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2.

Una opción adicional es modificar uno o más puentes salinos entre los dominios CH3m1 y CH3m2 mediante la mutación de uno de los dos dominios o ambos, de manera que un residuo en uno de los dominios es capaz de establecer puente de hidrógeno e interactuar electrostáticamente (formar enlace) con un residuo en el otro dominio.

Por ejemplo, aunque sin limitación, puede introducirse un puente salino mediante modificación (mutando) un residuo aminoácido en el dominio CH3m1 para formar un residuo de glutamato o aspartato y modificación (mutando) un residuo en el dominio CH3m2 para formar un residuo de lisina o arginina, de manera que el residuo de glutamato o aspartato en el dominio CH3m1 puede establecer un puente de hidrógeno e interactuar electrostáticamente con el residuo de lisina o arginina en el dominio CH3m2.

Las mutaciones del dominio CH3 complementarias anteriormente mencionadas que se realizan en el dominio CH3m1 de la cadena pesada y en el dominio CH3m2 de la cadena Fc favorecen la formación de heterodímero sobre la homodimerización, es decir, las mutaciones respectivas del dominio CH3 se diseñan para estimular el apareamiento preferente de la cadena Fc de Fab-MAT y de la cadena pesada de Fab-MAT sobre la homodimerización de dos cadenas de Fc o dos cadenas pesadas.

Una característica de la estructura de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrita anteriormente es que todos los dominios variables y constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina contiguos se unen directamente entre sí sin ningún conector aminoácido o peptídico intermedio. Dicha unión directa de dominios de inmunoglobulina contiguos (también descritos como presentando un dominio "fusionado directamente" con el dominio contiguo) elimina los sitios potencialmente inmunogénicos que podrían formarse por la introducción de uno o más aminoácidos intermedios, creando un segmento peptídico que sería heterogéneo o "foráneo" respecto a un sujeto dado y que sería reconocido como tal por el sistema inmunitario del sujeto. Al contrario que la comprensión general del campo de la ingeniería y producción de anticuerpos, la ausencia de conectores entre el dominio CL y el dominio VHB en la cadena pesada de Fab-MAT, y por lo tanto, entre las unidades de unión de Fab en tándem, no afecta adversamente a la actividad de unión de cualquiera de las unidades de unión de Fab en el anticuerpo Fab-MAT.

Según la estructura del anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrita anteriormente, el dominio CH3m1 de la cadena pesada o el dominio CH3m2 de la cadena Fc comprende una mutación de botones-en-ojales (KiH) para formar un botón estructural para favorecer el apareamiento de uno de los dominios CH3 (es decir, CH3m1 o CH3m2) que comprenden el botón estructural con el otro dominio CH3 (es decir, CH3m2 o CH3m1) que comprende un ojal estructural. Preferentemente, la mutación o mutaciones se realizan para formar un botón estructural en el dominio CH3m1 de la cadena pesada para el apareamiento con un dominio CH3m2 que comprende un ojal estructural complementario. Entre los ejemplos de mutaciones que cambian un residuo aminoácido para formar un botón estructural en el dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, un cambio de un residuo de treonina a un residuo de tirosina, o un cambio de un residuo de treonina a un residuo de triptófano. Entre los ejemplos de mutaciones particulares que cambian un residuo aminoácido para formar un botón estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, un cambio de un residuo de treonina<366>a un residuo de tirosina (T366Y) y un cambio de un residuo de treonina<366>a un residuo de triptófano (T366W). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997).

Según la estructura de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrita anteriormente, el dominio CH3m1 de la cadena pesada o el dominio CH3m2 de la cadena Fc comprende una mutación de botones-en-ojales (KiH) para formar un ojal estructural para favorecer el apareamiento de uno de los dominios CH3 (es decir, CH3m1 o CH3m2) que comprende un ojal estructural con el otro dominio CH3 (es decir, CH3m2 o CH3m1) que comprende un botón estructural. Preferentemente, la mutación o mutaciones se realizan para formar un ojal estructural en el dominio CH3m12 de la cadena polipeptídica de Fc para el apareamiento con un CH3m1 que comprende un botón estructural. Entre los ejemplos de mutaciones que cambian uno o más residuos para formar un ojal estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de treonina, y una combinación de un cambio de un residuo de treonina a un residuo de serina, un cambio de un residuo de leucina a un residuo de alanina, y un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de valina. Una mutación preferente para formar un ojal estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT de la invención es un cambio de un residuo de tirosina407 a un residuo de treonina (Y407T). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996). Una combinación preferente de mutaciones para formar un ojal estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT de la invención comprende un cambio de un residuo de treonina<366>a un residuo de serina (T366S), un cambio de un residuo de leucina<368>a un residuo de alanina (L368A) y un cambio de un residuo de tiros ina^ a un residuo de valina (Y407V). Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997).

En otra realización, puede realizarse una mutación adicional para proporcionar un residuo de cisteína, tal como un cambio de un residuo de serina a un residuo de cisteína, o un cambio de un residuo de tirosina a una cisteína, en el dominio CH3m1 de la cadena pesada y en el dominio CH3m2 de la cadena polipeptídica de Fc para formar un enlace disulfuro adicional en el caso de que el dominio CH3m1 de la cadena pesada se aparee con el dominio CH3m2 de la cadena polipeptídica Fc de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención. Un ejemplo no limitativo específico de una inserción de cisteína es una sustitución de serina<354>a cisteína (S354C) y una sustitución de tirosina<349>a cisteína (Y349C), en cadenas complementarias. Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16: 677-681 (1998).

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención es capaz de unir uno o dos antígenos diana seleccionados del grupo que consiste en: citoquinas, proteínas de superficie celular, enzimas y receptores.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria es capaz de modular una función biológica de uno o dos antígenos diana. Más preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria es capaz de inhibir o neutralizar uno o más antígenos diana.

En una realización de la invención, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria es capaz de unir dos citoquinas diferentes. Dichas citoquinas se seleccionan del grupo que consiste en: linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención es capaz de unir por lo menos un antígeno diana expresado sobre una superficie de una célula. Más preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a dos antígenos de la superficie celular. Los dos antígenos de superficie celular pueden encontrarse en la misma célula o en dos células del mismo tipo. Más preferentemente, sin embargo, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno expresado sobre la superficie de una primera célula y se une a un segundo antígeno expresado sobre la superficie de una segunda célula, en donde la primera y segunda células son tipos diferentes de células. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a un primer antígeno de superficie celular expresado sobre una célula efectora del sistema inmunitario y también se une a un segundo antígeno de superficie celular que se expresa sobre la superficie de una célula que se considera perjudicial para el individuo y, por lo tanto, que se desea eliminar o reducir sustancialmente su población. Entre las células efectoras se incluyen linfocitos T, células NK, monocitos, neutrófilos y macrófagos. Entre las células que son perjudiciales o pueden considerarse perjudiciales para un individuo que requiere de tratamiento, y por lo tanto, que podrían unirse a un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, células de cáncer, células autorreactivas y células infectadas por virus. De acuerdo con lo anterior, en una realización particularmente preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno expresado sobre la superficie de una célula efectora y se une a un antígeno expresado sobre la superficie de una célula de cáncer, una célula autorreactiva o una célula infectada por virus.

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un par de antígenos diana seleccionados del grupo de pares de antígenos que consiste en: CD20 y CD3, CD3 y CD19, CD3 y Fc-gamma-RIIIA, CD3 y TPBG, CD3 y Epha10, CD3 y IL-5Ra, CD3 y TASCTD-2, CD3 y CLEC12A, CD3 y prominina-1, CD3 y IL-23R, CD3 y ROR1, CD3 y IL-3Ra, CD3 y PSA, CD3 y CD8, CD3 y glipicano-3, CD3 y FAP, CD3 y EphA2, CD3 y ENPP3, CD3 y CD33, CD3 y CD133, CD3 y EpCAM, CD3 y CD19, CD3 y Her2, CD3 y CEA, CD3 y GD2, CD3 y PSMA, CD3 y BCMA, CD3 y A33, CD3 y B7-H3, CD3 y EGFR, CD3 y P-cadherina, CD3 y HMW-MAA, CD3 y TIM-3, CD3 y CD38, CD3 y TAG-72, CD3 y SSTR, CD3 y FRA, CD16 y CD30, CD64 y Her2, CD 137 y CD20, CD138 y CD20, CD19 y CD20, CD38 y CD20, CD20 y CD22, CD40 y CD20, CD47 y CD20, CD 137 y EGFR, CD137 y Her-2, CD 137 y PD-1, CD 137 y PDL-1, PD-1 y PD-L1, VEGF y PD-L1, Lag-3 y TIM- 3, OX40 y PD-1, TIM-3 y PD-1, TIM-3 y PDL-1, EGFR y DLL-4, VEGF y EGFR, HGF y VEGF, un primer epítopo de VEGF y un segundo epítopo diferente de VEGF, VEGF y Ang2, EGFR y cMet, PDGF y VEGF, VEGF y DLL-4, OX40 y PD-L1, ICOS y PD-1, ICOS y PD-L1, Lag-3 y PD-1, Lag-3 y PD-L1, Lag-3 y CTLA-4, ICOS y CTLA- 4, CD138 y CD40, CD38 y CD138, CD38 y CD40, CD-8 y IL-6, CSPGs y RGM A, CTLA-4 y BTN02, CTLA-4 y PD-1, IGFl y IGF2, IGFl/2 y Erb2B, IGF-IR y EGFR, EGFR y CD13, IGF-IR y ErbB3, EGFR-2 yG<f>R, un primer epítopo de Her2 y un segundo epítopo diferente de Her2, Factor IXa y Met, factor X y Met, VEGFR-2 y Met, VEGF-A y angiopoyetina-2 (Ang-2), IL-12 y TWEAK, IL-13 y IL-lp, MAG y RGM A, NgR y RGM A, NogoA y RGM A, OMGp y RGM A, PDL-1 y CTLA-4, PD-1 y TIM-3, RGM A y RGM B, Te38 y TNFa, TNFa y Blys, TNFa y CD22, TNFa y a CTLA-4, TNFa y GP130, TNFa y IL-12p40, y TNFa y ligando RANK.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a CD3 sobre una célula efectora. Entre los ejemplos de células efectoras se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, linfocitos T, células asesinas naturales (NK), monocitos, neutrófilos y macrófagos.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno de superficie expresado sobre una célula efectora. Preferentemente, el antígeno de superficie se selecciona del grupo que consiste en: CD3, CD16 (también denominado "FcyRIN") y CD64 (también denominado "FcyRI"). Más preferentemente, un anticuerpo Fab-MAT se une a CD3 tal como se expresa sobre un linfocito T, CD16 tal como se expresa sobre una célula asesina natural (NK, por sus siglas en inglés) o un CD64 tal como se expresa sobre un macrófago, neutrófilo o monocito.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno de superficie que es un antígeno asociado a tumor. Las realizaciones preferentes de Fab-MAT pueden reconocer antígenos asociados a tumor, tales como aquellos seleccionados de, sin limitación, el grupo que consiste en: CD 19, CD20, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano ("Her2", por sus siglas en inglés), antígeno carcinoembrionario ("CEA", por sus siglas en inglés), molécula de adhesión a células epiteliales ("EpCAM") y receptor huérfano 1 similar a receptor de tirosina quinasa (ROR1).

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno sobre una célula efectora que activará la célula efectora y se unirá a un antígeno de superficie celular sobre un linfocito B maligno. Preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno sobre una célula efectora que activará la célula efectora y se unirá a un antígeno de superficie celular sobre un linfocito B maligno de un trastorno de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Hodgkin, linterna no de Hodgkin (LNH), leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores, neoplasmas de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma linfocítico de células pequeñas, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de linfocitos B, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postransplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes.

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a los antígenos diana CD3 y CD20.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a un antígeno de superficie expresado sobre una célula efectora y a un antígeno asociado a tumor expresado sobre una célula tumoral. En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a CD3 sobre un linfocito T y a CD20 sobre un linfocito B maligno. Más preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a CD20 sobre su unidad de unión a Fab externa (N-terminal) y se une a CD3 en su unidad de unión a Fab interna (C-proximal).

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a CD20 y CD3 y comprende cuatro cadenas polipeptídicas que comprenden las secuencias de aminoácidos en las Tablas 1 a 4 o las secuencias de aminoácidos en las Tablas 5 a 8.

En todavía otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención es capaz de unirse a una o dos citoquinas, proteínas relacionadas con citoquinas o receptores de citoquinas.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención es capaz de unirse a una o más quimioquinas, receptores de quimioquina y proteínas relacionadas con quimioquina.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención es capaz de unirse a CD3 sobre los linfocitos T, así como un antígeno o epítopo derivado de proteínas de cubierta vírica que se presentan sobre la superficie de las células infectadas por virus, tales como las células T CD4+ infectados por el VIH.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención también es capaz de unirse a receptores, incluyendo receptores de linfoquina, receptores de monoquina y receptores de hormona polipeptídica.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito anteriormente está glucosilado. Preferentemente, la glucosilación es un patrón de glucosilación humano.

En otra realización, la invención proporciona un polinucleótido aislado o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de las cuatro cadenas polipeptídicas de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria. En una realización preferente, el ácido nucleico o ácidos nucleicos codifican cuatro cadenas polipeptídicas que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las Tablas 1 a 4 o las secuencias de aminoácidos mostradas en las Tablas 5 a 8, posteriormente.

En otra realización, la invención proporciona un vector que comprende uno o más polinucleótidos aislados o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de los cuatro polipéptidos de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria. Un vector puede ser un vector de replicación autónoma o un vector que incorpore el ácido nucleico aislado que está presente en el vector en un genoma de célula huésped. Puede insertarse, además, un polinucleótido o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de las cuatro cadenas polipeptídicas de un anticuerpo Fab-MAT en un vector a fin de llevar a cabo análisis genéticos, expresar un anticuerpo Fab-MAT, o caracterizar o mejorar una o más propiedades de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria.

En otra realización, puede utilizarse un vector según la invención para replicar el polinucleótido aislado o polinucleótidos aislados para proporcionar más polinucleótido o polinucleótidos codificantes de los polipéptidos de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria.

En otra realización, un vector según la invención puede utilizarse para expresar un polinucleótido aislado o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de las cuatro cadenas polipeptídicas de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria. Entre los vectores preferentes para clonar y expresar ácidos nucleicos descritos en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, pcADN, pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Res., 30(2e9): 1-9 (2002)), pTT3 (pTT con múltiples sitios de clonación adicionales), pEFBOS (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990)), pBV, pJV, pcADN3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ.

La invención proporciona, además, una célula huésped aislada que comprende un vector indicado anteriormente. Dicha célula huésped aislado que comprende un vector indicado en la presente memoria puede ser una célula procariótica aislada o una célula eucariótica aislada.

En una realización de la invención, una célula huésped procariótica aislada que comprende un vector indicado en la presente memoria es una célula huésped bacteriana. La célula huésped bacteriana puede ser una célula bacteriana Gram-positiva, Gram-negativa o Gram-variable. Preferentemente, la célula huésped bacteriana que comprende un vector descrito en la presente memoria es una bacteria Gram-negativa. Todavía más preferentemente, una célula huésped bacteriana que comprende un vector indicado en la presente memoria es una célula deEscherichia coli.

En una realización de la invención, una célula huésped aislada que comprende un vector indicado en la presente memoria es una célula huésped eucariótica. Entre las células huésped eucarióticas aisladas preferentes que comprende un vector indicado en la presente memoria pueden incluirse, sin limitación, una célula huésped de mamífero, una célula huésped de insecto, una célula huésped vegetal, una célula huésped fúngica, una célula huésped algal eucariótica, una célula huésped de nemátodo, una célula huésped protozoaria y una célula huésped de pez. Preferentemente, una célula huésped de mamífero aislada que comprende un vector indicado en la presente memoria se selecciona del grupo que consiste en: una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula COS, una célula Vero, una célula SP2/20, una célula de mieloma NS/0, una célula renal embrionaria humana (HEK293), una célula renal de hámster neonato (BHK), una célula HeLa, una célula B humana, una célula CV-1/EBNA, una célula L, una célula 3T3, una célula HEPG2, una célula PerC6 y una célula MDCK. Las células huésped aisladas preferentes que comprenden un vector indicado en la presente memoria se seleccionan del grupo que consiste en:Aspergillus, Neurospora, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia,yCandida.Más preferentemente, una célula huésped deSaccharomycesque comprende un vector indicado en la presente memoria es una célula deSaccharomyces cerevisiae.

Se proporciona, además, un método para producir un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria que comprende cultivar una célula huésped aislada que comprende un vector que comprende ácido nucleico codificante de la totalidad de las cuatro cadenas polipeptídicas de una molécula de anticuerpo biespecífico Fab-MAT bajo condiciones suficientes para producir un anticuerpo biespecífico Fab-MAT.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico Fab-MAT producido mediante un método descrito anteriormente.

Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria puede conjugarse con otro compuesto, por ejemplo, dentro o en el extremo C-terminal de uno cualquiera de los dominios CH3m1 y CH3m2 o en ambos, de una manera similar a la de otros anticuerpos conjugados. Entre dichos compuestos que pueden conjugarse con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un agente citotóxico, un agente de obtención de imágenes y un agente terapéutico. Entre los agentes de obtención de imágenes preferentes que pueden conjugarse con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un marcaje radioactivo, un enzima, un marcaje fluorescente, un marcaje luminiscente, un marcaje bioluminiscente, un marcaje magnético, biotina, estreptavidina y avidina. Entre los marcajes radioactivos que pueden conjugarse con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm. Entre los compuestos citotóxicos o terapéuticos preferentes que pueden conjugarse con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descritos en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un agente antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoqquina, un agente antiangiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria puede ser un anticuerpo Fab-MAT cristalizado que conserva actividad de unión para los epítopos o los antígenos a los que se une el anticuerpo Fab-MAT no cristalizado. Dicho anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado puede proporcionar, además, una liberación controlada sin portador del Fab-MAT al administrarlo en un individuo. Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado puede mostrar, además, una mayor semividain vivoal administrarlo en un individuo en comparación con la forma no cristalizada.

Una realización de la invención proporciona una composición para la liberación de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado en el que la composición comprende un anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado tal como se describe en la presente memoria, un ingrediente excipiente y por lo menos un portador polimérico. Preferentemente el ingrediente excipiente se selecciona del grupo que consiste en albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol. Preferentemente el portador polimérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste en poli(ácido acrílico), poli(cianoacrilatos9, poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptido), poli(ésteres), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(b-hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona), polietilenglicol, poli(hidroxipropil)metacrilamida, poli[(organo)fosfaceno], poli(ortoésteres), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico/éter alquilvinílico, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, mezclas de los mismos, y copolímeros de los mismos.

Otra realización proporciona una composición que comprende un anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado según se reivindica en la presente memoria para el uso como un medicamento.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo, en el que dicho anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a uno o dos epítopos o antígenos que se consideran perjudiciales para el individuo, en el que la unión de dicho uno o dos epítopos o antígenos al anticuerpo biespecífico Fab-MAT proporciona un tratamiento para la enfermedad o trastorno.

Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria resulta particularmente útil en un método de tratamiento de un trastorno que comprende redireccionar (o "reclutar") células efectoras (tales como linfocitos T, células NK, monocitos, neutrófilos y macrófagos) para atacar células diana específicas que se consideran perjudiciales para un sujeto humano y, por lo tanto, en las que resulta deseable eliminar o sustancialmente reducir la población de las células diana perjudiciales. Los ejemplos preferentes de dichas células diana perjudiciales con células tumorales, por ejemplo, células tumorales sanguíneas (incluyendo linfáticas) y células tumorales sólidas (Satta et al., Future Oncol. 9(4): 527-539 (2013)); células de enfermedad autoinmunitaria, tales como linfocitos B autorreactivos (Zocher et al., Mol. Immunol., 41(5): 511-518, 2004), así como células infectadas por virus (tales como linfocitos T CD4+ infectados por VIH (Sung et al., J. Clin. Invest., 125(11): 4077-4090 (2015)). En un método de redireccionamiento de la invención, un anticuerpo Fab-MAT se une a un antígeno expresado sobre la superficie de una célula efectora y un antígeno expresado sobre la superficie de una célula diana que resulta perjudicial para un sujeto humano, en el que la unión del anticuerpo Fab-MAT al antígeno sobre la célula efectora y al antígeno sobre la célula diana perjudicial media en una interacción célula-célula que resulta deseable o beneficiosa, por ejemplo, en la que la unión biespecífica de Fab-MAT activa la célula efectora para atacar la célula diana perjudicial. La unión simultánea de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria a un único antígeno diana sobre una célula efectora y a un único antígeno diana sobre una célula diana perjudicial puede activar la célula efectora para atacar la célula diana ventajosamente sin inducir además una liberación masiva y no deseable de citoquinas ("tormenta de citoquinas") que de otro modo ocurriría al dimerizarse antígenos de células efectora utilizando anticuerpos que se unen a dos o más antígenos de células efectora simultáneamente (es decir, entrecruzamiento de antígenos de célula efectora).

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria que se une a un antígeno sobre una célula efectora y que se une a un antígeno asociado a un trastorno, expresado sobre una célula diana que resulta perjudicial para un sujeto humano, para el uso en el tratamiento de un trastorno en dicho sujeto humano, en el que la unión del anticuerpo biespecífico Fab-MAT a tanto la célula efectora como a la célula diana perjudicial causa una interacción célula-célula terapéuticamente beneficiosa entre las células efectoras y las células diana. Para el tratamiento de muchos trastornos, este tipo de interacción célulacélula beneficiosa comprenderá la activación de la célula efectora para atacar la célula diana perjudicial. En otras situaciones, el efecto beneficioso puede ser la opsonización y/o eliminación de una o ambas células diana unidas.

Preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de la invención para el redireccionamiento de una célula efectora a atacar una célula diana perjudicial comprende poner en contacto la célula efectora y la célula diana perjudicial con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria que se une a un antígeno expresado sobre una célula efectora seleccionada del grupo que consiste en: CD3, CD16 (también denominado "FcyRIII") y CD64 (también denominado "FcyRI"). Más preferentemente, el anticuerpo Fab-MAT se une a CD3 tal como se expresa sobre un linfocito T, CD16 tal como se expresa sobre una célula asesina natural (NK) o un CD64 tal como se expresa sobre un macrófago, neutrófilo o monocito.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un tumor en un sujeto humano, en el que dicho anticuerpo Fab-MAT se une a un antígeno sobre una célula efectora y también se une a un antígeno sobre una célula tumoral diana, en el que la unión del anticuerpo Fab-MAT a la célula efectora y la célula tumoral diana activa la célula efectora para atacar la célula tumoral. Preferentemente, el antígeno sobre la célula efectora es CD3 tal como se expresa sobre un linfocito T.

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un cáncer caracterizado por células tumorales en un sujeto humano comprende redireccionar una célula efectora para atacar una célula tumoral diana que comprende la etapa de poner en contacto la célula efectora y la célula tumoral diana con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrita en la presente memoria que se une a un antígeno sobre la célula efectora y un antígeno sobre la célula tumoral diana, en el que el antígeno sobre la célula tumoral diana es un antígeno asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en: CD19, CD20, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM) y receptor huérfano 1 similar a receptor de tirosina quinasa (ROR1).

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un sujeto humano para un tumor asociado a linfocitos B, en el que dicho anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a un antígeno sobre un linfocito T efector que activará el linfocito T y que se une a un antígeno sobre linfocitos B malignos. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno sobre los linfocitos B malignos de un trastorno de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (LNH), leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores, neoplasmas de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/ linfoma linfocítico de células pequeñas, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de linfocitos B, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postransplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes.

En una realización particularmente preferente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un sujeto humano para un tumor asociado a linfocitos B que comprende administrar un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria que se une a un linfocito T y que se une a CD20 sobre un linfocito B maligno. Más preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a CD20 sobre su unidad de unión a Fab externa (N-terminal) y se une a CD3 en su unidad de unión a Fab interna (C-proximal).

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un trastorno según la invención puede comprender poner en contacto un anticuerpo Fab-MAT reivindicado en la presente memoria con células efectoras y células diana perjudiciales en un procedimientoex vivoen el que las células efectoras extraídas de un sujeto humano en necesidad de tratamiento se ponen en contacto con el anticuerpo Fab-MAT fuera del sujeto humano y, tras proporcionar tiempo para la unión del anticuerpo Fab-MAT a las células efectoras, las células efectoras unidas al anticuerpo Fab-MAT seguidamente se administran en el sujeto humano de manera que los complejos de anticuerpo Fab-MAT unidos a células efectoras a continuación pueden buscar la unión a las células diana perjudiciales, tales como células tumorales, dentro del sujeto humano. En otra realización, las células efectoras y las células tumorales extraídas de un sujeto humano que requiere tratamiento se ponen en contacto con el anticuerpo Fab-MAT fuera del sujeto humano y, tras proporcionar tiempo para la unión del anticuerpo Fab-MAT a las células efectoras y a las células tumorales, las células efectoras y tumorales unidas al anticuerpo Fab-MAT se administran en el sujeto humano.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT tal como se reivindica en la presente memoria también puede manipularse para llevar un agente citotóxico hasta una célula diana perjudicial, tal como una célula tumoral. En la presente realización, una unidad de unión Fab de un anticuerpo Fab-MAT contiene un sitio de unión para un antígeno diana sobre una célula diana perjudicial y la otra unidad de unión Fab contiene un sitio de unión para un agente citotóxico. Dicho anticuerpo Fab-MAT manipulado de la invención puede mezclarse o de otro modo ponerse en contacto con el agente citotóxico al que se unirá en su unidad de unión Fab manipulada. El anticuerpo Fab-MAT que porta el agente citotóxico unido seguidamente puede ponerse en contacto con la célula diana perjudicial para llevar el agente citotóxico hasta la célula diana perjudicial. Dicho sistema de transporte resulta particularmente eficaz en el caso de que el anticuerpo Fab-MAT se une a la célula diana perjudicial y después se internalice en la célula junto con el agente citotóxico unido de manera que el agente citotóxico pueda ser liberado dentro de la célula diana perjudicial.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas. que comprenden un anticuerpo biespecífico Fab-MAT reivindicado en la presente memoria y un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria puede comprender, además, un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: un agente terapéutico, un agente de captación de imágenes y un agente citotóxico. Además, de acuerdo con los métodosex vivodescritos en la presente memoria, una composición farmacéutica según la invención puede comprender un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria acomplejado con una célula efectora o un agente citotóxico.

En otra realización, una composición farmacéutica preferente que comprende un anticuerpo biespecífico Fab-MAT reivindicado en la presente memoria puede comprender, además, otro u otros compuestos terapéuticamente activos para el tratamiento de un trastorno. Entre los ejemplos de compuestos terapéuticamente activos adicionales preferentes que pueden incorporarse en una composición farmacéutica de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un antibiótico, un compuesto antivírico un compuesto anticáncer (diferente del anticuerpo biespecífico Fab-MAT), un sedante, un estimulante, un anestésico local, un corticoesteroide, un analgésico, un antihistamínico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINES) y combinaciones apropiadas de los mismos.

En otra realización, una composición farmacéutica dada a conocer anteriormente puede prepararse para la administración en un individuo mediante por lo menos un modo seleccionado del grupo que consiste en: las vías parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelular, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT reivindicado en la presente memoria puede utilizarse en cualquiera de una diversidad de ensayos de inmunodetección o formatos de purificación disponibles de la técnica para detectar, cuantificar o aislar un antígeno diana o células que expresan un antígeno diana. Entre dichos ensayos y formatos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ensayos de inmunotransferencia (por ejemplo, una transferencia Western); cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo, en la que un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se adsorbe o se une a una resina o perla de cromatografía; ensayos de inmunoprecipitación; inmunochips; ensayos de inmunohistoquímica en tejido; citometría de flujo (incluyendo la separación de células activada por fluorescencia); inmunoensayos de tipo sándwich; inmunochips, en los que se inmoviliza o se une un anticuerpo Fab-MAT a un sustrato; radioinmunoensayos (RIA); inmunoensayos enzimáticos (EIA); ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés); inmunoensayos de inhibición competitiva; inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA, por sus siglas en inglés); técnica de inmunoensayo por multiplicación enzimática (EMIT, por sus siglas en inglés); transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET, por sus siglas en inglés); y ensayos quimioluminiscentes homogéneos. La presente exposición proporciona métodos que utilizan la espectrometría de masas y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, MALDI (por sus siglas en inglés, desorción/ionización láser asistida por matriz) o SELDI (desorción/ionización láser potenciada por superficie) que comprende un anticuerpo Fab-MAT que se une a un antígeno o epítopo diana sobre un antígeno o fragmento de antígeno.

La invención proporciona, además, un método para detectar un antígeno en una muestra (tal como, por ejemplo, una mezcla, composición, solución o muestra biológica) que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT reivindicado en la presente memoria que se une a un antígeno (o epítopo) diana presente, o que se sospecha que está presente, en la muestra. Entre las muestras biológicas que pueden servir como muestra para un ensayo de inmunodetección de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, sangre completa, plasma, suero, diversos extractos de tejidos, lágrimas, saliva, orina y otros líquidos corporales.

El anticuerpo biespecífico Fab-MAT puede marcarse directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo biespecífico Fab-MAT unido o no unido. En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT útil en un ensayo de detección se manipula de manera que una de las unidades de unión Fab se une a un compuesto, generando una señal detectable, y la otra unidad de unión Fab se une al antígeno (o epítopo) diana que está presente, o que se sospecha que está presente, en una muestra. Se encuentran disponibles sustancias detectables adecuadas en la técnica y entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, diversos enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Un enzima preferente que resulta útil en un ensayo de inmunodetección de la invención es un enzima que puede proporcionar una señal detectable al ponerlo en contacto con uno o más reactivos. Entre dichos enzimas se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa. Entre los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados se incluyen, aunque sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Entre los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados que pueden utilizarse en un ensayo de inmunodetección de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina. Un ejemplo de un material luminiscente que puede utilizarse en un ensayo de inmunodetección de la invención es el luminol. Entre los ejemplos de especies radioactivas adecuadas que pueden utilizarse en un ensayo de inmunodetección de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm.

Debido a la presencia de una región Fc dimerizada, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención también puede marcarse en su región Fc de una manera análoga a las moléculas de anticuerpo naturales, tales como los anticuerpos IgG.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es un diagrama que muestra la estructura de dominios de un anticuerpo biespecífico de Fab-MAT. La figura 1B es un diagrama que ilustra la organización de genes estructurales insertados en constructos de vector de expresión para la expresión recombinante de cada una de las cadenas polipeptídicas que se ensamblan para formar una proteína de unión Fab-MAT de la presente invención. La figura iC es un diagrama que ilustra las cuatro cadenas polipeptídicas expresadas (1-4) para formar una proteína de unión a Fab-MAT ilustrada en la fig. 1A, que muestra el orden de los dominios de tipo inmunoglobulina de extremo N-terminal a extremo C-terminal para cada cadena.

La figura 2 muestra un perfil y datos relacionados de un análisis del anticuerpo biespecífico Fab-MAT KiH1 preparado tal como se describe en el Ejemplo 1, utilizando cromatografía de exclusión por tamaños (CET). El análisis de CET reveló que 98,19 % de la preparación de anticuerpo Fab-MAT KiH1 después de la purificación en una sola etapa mediante cromatografía de proteína A está presente en forma de una sola especie, indicando homogeneidad del producto de proteína tetramérica.

La figura 3 muestra un perfil y datos relacionados de un análisis del anticuerpo biespecífico Fab-MAT KiH2 preparado tal como se describe en el Ejemplo 1, utilizando cromatografía de exclusión por tamaños (CET). El análisis de CET reveló que 95,7 % de la preparación de anticuerpo Fab-MAT KiH2 después de la purificación en una sola etapa mediante cromatografía de proteína A está presente en forma de una sola especie, indicando homogeneidad del producto de proteína tetramérica.

La figura 4 muestra los resultados de un análisis de la capacidad de los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2 de unirse a CD20 expresado sobre la superficie de células Raji utilizando la separación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) tal como se describe en el Ejemplo 1.

La figura 5 muestra los resultados de un análisis de la capacidad de los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2 de unirse a CD3 expresado sobre la superficie de células Jurkat utilizando la separación celular activada por fluorescencia (FACS) tal como se describe en el Ejemplo 1.

La figura 6 muestra los resultados de un análisis de la capacidad de los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2 de unirse a CD20 sobre células Raji (linfocitos B) y de inducir apoptosis mediada por linfocitos T de los linfocitos B el día 2 de un ensayo de depleción de linfocitos B. Leyenda del gráfico: "ofatumumab" es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 totalmente humano; "mAb CD3" es un anticuerpo monoclonal anti-CD3; Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2 son tal como se describe en el Ejemplo 1, y "ofatumumab/mAb CD3" es una mezcla en partes iguales del anticuerpo anti-CD20 ofatumumab y del mAb anti-CD3. Ambos anticuerpos biespecíficos Fab-MAT eran capaces de inducir apoptosis mediada por linfocitos T de los linfocitos B alcanzado el día 2 del ensayo.

Descripción detallada

La exposición técnica proporcionada a continuación en algunos aspectos va más allá del alcance según las reivindicaciones. Los elementos de la exposición que no se encuentran comprendidos dentro del alcance según las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.

Para muchos receptores inmunitarios, la activación celular se consigue mediante entrecruzamiento de una interacción de unión monovalente. El mecanismo de entrecruzamiento normalmente está mediado por complejos inmunitarios de anticuerpo/antígeno, o mediante el acoplamiento de células efectoras con células diana. Por ejemplo, los receptores Fc gamma activadores (FcyR) de baja afinidad, tales como CD16 (FcYRIIIa) y CD32a (FcYRIIa) que median en la eliminación celular, se unen monovalentemente a la región Fc de anticuerpo. Aunque la unión monovalente no resulta en señalización celular, con el acoplamiento de la célula efectora con la célula diana, se entrecruzan los receptores y se agregan sobre la superficie celular, conduciendo a la activación. Sobre los linfocitos T, la activación de CD3 ocurre cuando su receptor de linfocito T (RLT) asociado se acopla con el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) cargado con antígeno sobre las células presentadoras de antígenos en una sinapsis célula-a-célula ávida. Los anticuerpos bivalentes con diana en CD3 pueden inducir una liberación masiva de citoquinas (con frecuencia llamada "tormenta de citoquinas") y la consecuente toxicidad ha supuesto un reto para el desarrollo de anticuerpos anti-CD3 como fármacos terapéuticos. En contraste, la unión monovalente de CD3 en formatos biespecíficos genera niveles mucho menores de activación de linfocitos T. Para los anticuerpos monoespecíficos bivalentes, una consecuencia de dicha biología es que el entrecruzamiento bivalente de receptores puede conducir a una activación no específica de una célula efectora en ausencia de cualquier célula diana. De esta manera, en el caso de que el objetivo terapéutico sea el coacoplamiento de un receptor inmunitario, la unión monovalente resulta habitualmente muy preferente sobre la unión bivalente. Este modo es incompatible con la utilización de los anticuerpos bivalentes típicos y la mayoría de formatos de anticuerpo multiespecíficos pero multivalentes, tales como las inmunoglobulinas de dominio variable dual (Ig-DVD, por sus siglas en inglés) y las inmunoglobulinas de Fab en tándem (Ig-FIT, por sus siglas en inglés).

La presente invención proporciona una solución a problemas tales como los descritos anteriormente mediante la provisión de un formato de anticuerpo biespecífico según se reivindica en la presente memoria que comprende la heterodimerización de región Fc de botones-en-ojales (KiH) de una cadena pesada de Fab en tándem con una cadena Fc truncada que permite la unión monovalente simultánea de dos antígenos o epítopos diferentes. Un anticuerpo biespecífico de la invención resulta especialmente adecuado para el redireccionamiento de los linfocitos T como un mecanismo para el tratamiento del cáncer.

La presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos manipulados, tal como se reivindica en la presente memoria, que comprenden dos unidades de unión de Fab fusionadas en tándem y en las que una unidad de unión Fab se une a un epítopo o antígeno que es diferente del epítopo o antígeno que se une a la otra unidad de unión Fab. De esta manera, un anticuerpo biespecífico según la invención, según se reivindica en la presente memoria, se denomina "monovalente" con respecto a cada epítopo o antígeno al que se une. Además, aunque un anticuerpo biespecífico de la invención, según se reivindica en la presente memoria, comprende una región constante Fc de inmunoglobulina dimerizado (es decir, bisagra-CH2-CH3 dimerizado), en el que cada mitad de las unidades de unión de Fab en tándem está presente en un único brazo polipeptídico que se extiende desde solo una de las cadenas dimerizadas de la región Fc (ver la fig. 1A). Por lo tanto, un anticuerpo biespecífico según la invención, según se reivindica en la presente memoria, es "monovalente" con respecto a sitios de unión de cada epítopo o antígeno unido; es "asimétrico" con respecto a la ubicación de las unidades de Fab respecto a la región Fc dimerizada y presenta unidades de unión de Fab "en tándem" unidas directamente entre sí, en dirección del extremo N-terminal al extremo C-terminal, mediante una cadena pesada común. De acuerdo con lo anterior, un anticuerpo biespecífico según la invención, según se reivindica en la presente memoria, también se denomina "anticuerpo biespecífico Fab en tándem asimétrico y monovalente". Los términos alternativos, aunque sinónimos, para un anticuerpo biespecífico de la invención son "anticuerpo biespecífico Fab-MAT", "anticuerpo Fab-MAT" o simplemente "Fab-MAT".

Los términos "cristal" y "cristalizado", tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención que existe en la forma de un cristal. Un cristal es una forma del estado sólido de la materia que es diferente de otras formas, tales como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales están compuestos de matrices tridimensionales repetitivas y regulares de átomos, iones, moléculas (p. ej., proteínas, tales como anticuerpos) o ensamblajes moleculares (p. ej., complejos de antígeno/anticuerpo). Dichas matrices tridimensionales están dispuestas de acuerdo con relaciones matemáticas específicas que son bien entendidas en el campo. La unidad fundamental, o bloque constructivo, que se repite en un cristal se llama "unidad asimétrica". La repetición de la unidad asimétrica en una organización que se ajusta a una simetría cristalográfica bien definida dada proporciona la "celda unidad" del cristal. La repetición de la celda unidad mediante traslaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Ver Giegé et al., capítulo 1, en: Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed., Ducruix y Giegé, eds. (Oxford University Press, New York, 1999) páginas 1 a 16. Los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT de la invención cristalizados pueden producirse de acuerdo con métodos conocidos de la técnica, tales como los descritos por Shenoy y colaboradores en la publicación de patente internacional n.° WO 2002/072636, incorporada en la presente memoria como referencia.

A menos que se defina de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención presentarán los significados habitualmente entendidos por el experto ordinario en la materia. Sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente memoria prevalecerán sobre cualquier diccionario o definición extrínseca. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán los términos en plural, y los términos en plural incluirán el singular. En la presente solicitud, el uso de "o" significa "y/o", a menos que se indique lo contrario. Además, el uso de la expresión "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, algunos términos tales como "elemento" o "componente" comprenden ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Generalmente, las nomenclaturas y técnicas utilizadas en relación con el cultivo celular y de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y la química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritos en la presente memoria son los conocidos y utilizados comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención generalmente se llevan a cabo según métodos convencionales bien conocidos de la técnica y tal como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se comentan a lo largo de toda la presente especificación, a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo tal como se llevan a cabo habitualmente en la técnica, de acuerdo con las especificaciones de un fabricante, o tal como se describe en la presente memoria. Las nomenclaturas utilizadas y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritos en la presente memoria son los conocidos y utilizados habitualmente en la técnica. Entre las técnicas estándares se incluyen las utilizadas para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación y la administración y el tratamiento de pacientes.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos "trastorno" y "enfermedad" son sinónimos y se refieren a una condición fisiopatológica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "un trastorno (o enfermedad) en el que un antígeno sobre una célula (o una actividad de un antígeno) es perjudicial" pretende incluir un trastorno en el que la presencia del antígeno en un sujeto humano que sufre el trastorno se ha mostrado que es responsable, o se sospecha que es responsable, de la fisiopatología del trastorno, o se ha mostrado que es un factor, o se sospecha que es un factor, que contribuye a un empeoramiento del trastorno. De acuerdo con lo anterior, un trastorno en el que un antígeno o una actividad de antígeno es perjudicial es un trastorno en el que la reducción del antígeno o de la actividad de antígeno se espera que alivie uno o más síntomas del trastorno o la progresión del trastorno. Dichos trastornos pueden ponerse de manifiesto, por ejemplo, en un incremento de la concentración del antígeno en la sangre u otro líquido biológico de un sujeto humano que sufre del trastorno.

Los términos "tumor" y "cáncer" son sinónimos, a menos que se indique lo contrario. Un cáncer o tumor puede ser un cáncer o tumor hemático (que incluye las células linfoides) o un cáncer o tumor sólido.

Los términos "individuo" y "sujeto" se refieren a un sujeto humano.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "Fab", "fragmento Fab" o "unidad de unión de Fab" son sinónimos y se refieren a una unidad de unión de un epítopo (de un antígeno) de inmunoglobulina que se forma mediante la asociación de una cadena polipeptídica que comprende un dominio variable de cadena ligera (dominio VL) de inmunoglobulina unido a un dominio constante de cadena ligera (dominio CL) de inmunoglobulina y una cadena polipeptídica que comprende un dominio variable de cadena pesada (dominio VH) de inmunoglobulina unido a un dominio constante de cadena pesada (dominio CH1) de inmunoglobulina, en el que un dominio VL se aparea con un dominio VH para formar el sitio de unión de epítopo (antígeno) y un dominio CL se aparea con un dominio CH1. De esta manera, tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "Fab", "fragmento Fab" y "unidad de unión de Fab" comprenden fragmentos de Fab naturales producidos mediante digestión con papaína de una inmunoglobulina natural, tal como IgG, en donde la digestión con papaína rinde dos fragmentos Fab que comprenden un fragmento de cadena pesada que comprende VH-CH1 y un fragmento de cadena ligera que comprende VL-CL. Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos comprenden, además, Fab recombinantes en los que un dominio VL seleccionado se une a un dominio CL seleccionado y un dominio VH seleccionado se une a un dominio CH1 seleccionado. Además, tal como se utiliza en la presente memoria, los términos comprenden, además, un tipo de "Fab cruzado" en el que VH-CH1 está presente en forma de un polipéptido de cadena ligera y VL-CL está presente en una cadena pesada más grande. En particular, en un anticuerpo biespecífico Fab-MAT DE la invención, la unidad de unión de Fab N-terminal (externa) es este tipo de "Fab cruzado" en el que está presente un VL-CL en la cadena polipeptídica pesada y se aparea con una cadena ligera que comprende VH-CH1. En contraste, la unidad de unión de Fab interna (C-proximal) comprende VH-CH1 en la cadena pesada que se aparea con una cadena ligera que comprende VL-CL. Dicha organización de unidades de unión de Fab externa e interna en un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención favorece ventajosamente la asociación apropiada de cada VL-CL con su VH-CH1 correspondiente para formar dos unidades de unión de Fab funcionales y desfavorece asociaciones no funcionales.

Una composición o método descrito en la presente memoria como "que comprende" uno o más elementos o etapas nombrados es abierta, lo que significa que los elementos o etapas nombrados son esenciales, pero que pueden añadirse otros elementos o etapas dentro del alcance de la composición o método. En aras de la brevedad, también se entiende que cualquier composición o método descrito como "que comprende" (o "comprendiendo") uno o más elementos o etapas nombrados también describe la composición o método correspondiente, más limitado, "que consiste esencialmente en" (o "consistente esencialmente en") los mismos elementos o etapas nombrados, lo que significa que la composición o método incluye los elementos o etapas esenciales nombrados y también incluye elementos o etapas adicionales que no afectan materialmente a la una o más características básicas y nuevas de la composición o método. Se entiende, además, que cualquier composición o método descrito en la presente memoria como "que comprende" o "que consiste esencialmente en" uno o más elementos o etapas nombrados también describe la correspondiente, más limitada y cerrada composición o método "que consiste en" (o "consistente en") los elementos o etapas nombrados, excluyendo cualquier otro elemento o etapa no nombrado. En cualquier composición o método dado a conocer en la presente memoria, pueden sustituirse equivalentes conocidos o dados a conocer de cualquier elemento o etapa esencial nombrado, por dicho elemento o etapa.

Un elemento o etapa "seleccionado del grupo que consiste en" seguido de una lista de elementos o etapas se refiere a uno o más de los elementos o etapas en la lista siguiente, que incluye combinaciones de dos o más de los elementos o etapas enumerados.

Organización y generación de anticuerpos biespecíficos Fab-MAT.

Un anticuerpo biespecífico Fab en tándem asimétrico monovalente (anticuerpo biespecífico "Fab-MAT") según la invención comprende:

(a) una cadena polipeptídica pesada ("cadena pesada"), en la que dicha cadena pesada comprende (de extremo amino (N-)terminal a extremo carboxilo (C-)terminal): VLA-CL-VHB-CH1-bisagra-CH2-CH3m1,

en la que: VL<a>es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que se une a CL, que es un dominio constante de cadena ligera humano, en el que VL<a>-CL es una mitad de una primera unidad de unión de Fab (capaz de unión a l antígeno o epítopo "A") y se une (se fusiona) directamente a VHb, en donde VHa es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se une a CH1, que es un dominio constante CH1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde VH-CH1 es una mitad de una segunda unidad de unión de Fab (capaz de unión al antígeno o epítopo "B"), y en donde VHb-CH1 se une a bisagra-CH2, en donde bisagra-CH2 es la región bisagra-CH2 de una cadena pesada de inmunoglobulina y en donde la bisagra-CH2 se une a CH3m1, que es un primer dominio constante<c>H3 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se ha mutado con una o más mutaciones de botones-en-ojales (KiH) para formar un botón estructural o un ojal estructural en dicho dominio constante CH3m1, en donde A y B son diferentes antígenos o diferentes epítopos; (b) una primera cadena ligera que comprende VHa-CH1, en donde VHa es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se une a CH1, que es un dominio constante CH1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana y en donde VHa-CH1 es la otra mitad de dicha primera unidad de unión de Fab (capaz de unión al antígeno o epítopo "A");

(c) una segunda cadena ligera que comprende VL-CL, en donde VLes un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que se une a CL, que es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana y en donde VLb-CL es la otra mitad de dicha segunda unidad de unión de Fab (capaz de unión al antígeno o epítopo "B"), y

(d) una cadena Fc que comprende bisagra-CH2-CH3m2, en donde la bisagra-CH2 es la región bisagra-CH2 de una cadena pesada de inmunoglobulina y en donde la bisagra-CH2 se une a CH3m2, que es un segundo dominio constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se ha mutado con una o más mutaciones de botones-en-ojales (KiH) para formar un botón estructural o un ojal estructural en dicho dominio constante CH3m2 que es complementario al ojal estructural o botón estructural correspondiente del dominio CH3m1 de la cadena pesada (a);

con la condición de que:

cuando el dominio CH3m1 de la cadena pesada (a) se ha mutado para formar un botón estructural, entonces el dominio CH3m2 de la cadena Fc (d) se ha mutado para formar un ojal estructural complementario para favorecer el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2, o

cuando el dominio CH3m1 de la cadena pesada (a) se ha mutado para formar un ojal estructural, entonces el dominio CH3m2 de la cadena Fc (d) se ha mutado para formar un botón estructural complementario para favorecer el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2, y

opcionalmente (es decir, con o sin), que comprende una mutación tanto en el dominio CH3m1 como en el dominio CH3m2 para introducir un residuo de cisteína a fin de favorecer la formación de enlace disulfuro en el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2.

Las regiones Fc de la cadena pesada y la cadena Fc pueden modificarse opcionalmente para modular la función efectora de Fc. Por ejemplo, la mutación<234>LeuLeu<235>del dominio CH2, p. ej., a<234>AlaAla<235>(numeración UE) es conocido que reduce o elimina las funciones efectoras de ADCC/CDC. Dicho cambio se ilustra en los Fab-MAT de los ejemplos, posteriormente, en los que se realiza un cambio LeuLeu ^ AlaAla en los residuos 18-19 de la región bisagra-CH2 en la cadena pesada y cadena Fc de Fab-MAT (KiH1) y en la cadena pesada y cadena Fc de Fab-MAT (KiH2) (es decir, ver<47>sAlaAla<479>de SEC ID n.° 1 en la Tabla 1 y<478>AlaAla<479>de SEC ID n.° 5 en la Tabla 5, y<4>oAlaAla<4>i de SEC ID n.° 4 en la Tabla 4 y<4>oAlaAla<41>de SEC ID n.° 8 en la Tabla 8).

Una característica de la estructura de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrita en la presente memoria es que todos los dominios variables y constantes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina contiguos se unen directamente entre sí sin ningún conector aminoácido o peptídico intermedio. Dicha unión directa de dominios de inmunoglobulina contiguos elimina los sitios potencialmente inmunogénicos que podrían formarse mediante la introducción de uno o más aminoácidos intermedios. En las moléculas de anticuerpo manipuladas que presentan dominios de unión unidos en tándem, se ha entendido habitualmente en la técnica que los conectores peptídicos flexibles intermedios (tales como GGGGS y repeticiones del mismo) son necesarios para permitir que los sitios de unión contiguos se unan a antígenos simultáneamente y eviten la interferencia estérica entre ellos. En contraste con dichas enseñanzas, la ausencia de cualquier conector en el formato Fab-MAT no afecta adversamente a la actividad de unión de cualquiera de las unidades de unión de Fab del anticuerpo Fab-MAT. En particular, se ha encontrado que la adición de conectores entre CL y VHb en la cadena polipeptídica pesada no potencia la actividad de unión de cualquiera de las unidades de unión de Fab. Lo anterior significa que la organización estructural de un anticuerpo Fab-MAT tal como se ha descrito anteriormente proporciona inherentemente una flexibilidad óptima y una configuración tridimensional para que cada unidad de unión de Fab resulte accesible y pueda unirse a su antígeno o epítopo pretendido.

De acuerdo con la estructura del anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrita anteriormente, el dominio CH3m1 de la cadena pesada de Fab-MAT o el dominio CH3m2 de la cadena Fc de Fab-MAT comprende una mutación de botonesen-ojales (KiH) para formar un botón estructural para favorecer el apareamiento de uno de los dominios CH3 (es decir, CH3m1 o CH3m2) que comprende el botón estructural con el otro dominio CH3 (es decir, CH3m2 o CH3m1) que comprende un ojal estructural. Preferentemente, se realiza una mutación para formar un botón estructural en el dominio CH3m1 de la cadena pesada para el apareamiento con un dominio CH3m2 de la cadena Fc que comprende un ojal estructural complementario. Entre los ejemplos de mutaciones que cambian un residuo aminoácido para formar un botón estructural en el dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, un cambio de un residuo de treonina a un residuo de tirosina, o un cambio de un residuo de treonina a un residuo de triptófano. Entre los ejemplos de mutaciones particulares que cambian un residuo aminoácido para formar un botón estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitación, un cambio de un residuo de treonina366 a un residuo de tirosina (T366Y) y un cambio de un residuo de treonina366 a un residuo de triptófano (T366W). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997). Dicho cambio particular se ilustra en los Fab-MAT de los ejemplos, posteriormente, en los que se realiza un cambio Thr ^ Tyr en el residuo 21 del dominio CH3 en Fab-MAT (KiH1) y se realiza un cambio Thr ^ Trp en el residuo 21 del dominio CH3 en Fab-MAT (KiH2) (es decir, ver Tyr610 de SEC ID n.° 1 en la Tabla 1 y Trp610 de SEC ID n.° 5 en la Tabla 5).

De acuerdo con la estructura del anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrita anteriormente, el dominio CH3m1 de la cadena pesada o el dominio CH3m2 de la cadena Fc comprende una mutación de botones-en-ojales (KiH) para formar un ojal estructural para favorecer el apareamiento de uno de los dominios CH3 que comprende el ojal estructural con el otro dominio CH3 que comprende un botón estructural. Se conoce de la técnica una diversidad de mutaciones de botones-en-ojales de los dominios CH3 de las regiones Fc de anticuerpos. Ver, por ejemplo, Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996); Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997); Klein et al., mAbs, 4(6): 653-663 (2012). Entre los ejemplos de mutaciones que cambian uno o más residuos en un dominio CH3 para formar un ojal estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de treonina, y una combinación de un cambio de un residuo de treonina a un residuo de serina, un cambio de un residuo de leucina a un residuo de alanina, y un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de valina. Una mutación preferente para formar un ojal estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT de la invención es un cambio de un residuo de tirosina407 a un residuo de treonina (Y407T). Ridgway et al., Protein Eng., 9: 617-621 (1996). Dicho cambio se ilustra en un Fab-MAT de los ejemplos, posteriormente, en el que se realiza un cambio Tyr ^ Thr en el residuo 62 del dominio CH3 en Fab-MAT (KiH1) (es decir, ver Thr<2>i<3>de s Ec ID n.° 4 en la Tabla 4). Una combinación preferente de mutaciones para formar un ojal estructural en un dominio CH3 de un anticuerpo Fab-MAT de la invención comprende un cambio de un residuo de treonina<366>a un residuo de serina (T366S), un cambio de un residuo de leucina<368>a un residuo de alanina (L368A) y un cambio de un residuo de tirosina<407>a un residuo de valina (Y407V). Atwell et al., J. Mol. Biol., 270: 26-35 (1997). Dicho cambio particular de 3 aminoácidos se ilustra en un Fab-MAT de los ejemplos, posteriormente, en el que se realiza un cambio Thr ^ Ser en el residuo 21 del dominio CH3 en Fab-MAT (KiH2), se realiza un cambio Leu ^ Ala en el residuo 23 del dominio CH3 en Fab-MAT (KiH2) y se realiza un cambio Tyr ^ Val en el residuo 62 del dominio CH3 en Fab-MAT (KiH2) (es decir, ver Ser<172>, Ala<174>y Val<213>de SEC ID n.° 8 en la Tabla 8). Preferentemente, la mutación o mutaciones se realizan para formar un ojal estructural en el dominio CH3m2 de la cadena polipeptídica de Fc para el apareamiento con un CH3m1 que comprende un botón estructural.

Puede realizarse una mutación adicional en los dominios CH3m1 y CH3m2 de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria para proporcionar un residuo de cisteína para formar un enlace disulfuro adicional al aparearse el dominio CH3m1 de la cadena pesada de Fab-MAT con el dominio CH3m2 de la cadena Fc de Fab-MAT y, de esta manera, estabilizar adicionalmente el heterodímero de región Fc del anticuerpo Fab-MAT. Entre los ejemplos específicos de dichas mutaciones se incluyen, aunque sin limitación, un cambio de una serina<354>a cisteína (S354C) y una tirosina<349>a cisteína (Y349C). Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16: 677-681 (1998). Dichas sustituciones de Cys se ilustran en un Fab-MAT de los ejemplos, posteriormente, en los que se realiza un cambio Ser ^ Cys en el residuo 9 del dominio CH3 en la cadena pesada de Fab-MAT (KiH2) y se realiza un cambio Tyr ^ Cys en el residuo 4 del dominio CH3 en la cadena Fc de Fab-MAT (KiH2) (es decir, ver Cys<598>de SEC ID n.° 5 y Cys<155>de SEC ID n.° 8 en la Tabla 8).

Una opción adicional es manipular uno o más puentes salinos entre los dominios CH3m1 y CH3m2 de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria, mediante la mutación de uno de los dos dominios o ambos, de manera que un residuo en uno de los dominios sea capaz de establecer puente de hidrógeno e interactuar electrostáticamente (formar enlace) con un residuo en el otro dominio. Por ejemplo, puede introducirse un puente salino mediante modificación (mutando) un residuo aminoácido en el dominio CH3m1 para formar un residuo de glutamato o aspartato y modificación (mutando) un residuo en el dominio CH3m2 para formar un residuo de lisina o arginina, de manera que el residuo de glutamato o aspartato en el dominio CH3m1 pueda establecer un puente de hidrógeno e interactuar electrostáticamente con el residuo de lisina o arginina en el dominio CH3m2.

Además de las modificaciones de la región constante para la formación de Fab-MAT comentadas anteriormente, las regiones constantes de la cadena pesada y/o de la cadena Fc del anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito anteriormente comprenden, cada una opcionalmente (es decir, con o sin), una o más mutaciones para reducir o eliminar por lo menos una función efectora de Fc, tal como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) o la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC, por sus siglas en inglés). Entre dichas mutaciones se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, un cambio de una leucina<234>a alanina (L234A) y un cambio de una leucina<235>a una alanina (L235A) (Canfield et al., J. Exp. Med., 173(6): 1483-91,1991). Preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT comprende modificaciones de aminoácido de cadena pesada y de cadena Fc en los dominios CH2 para cambiar la leucina<234>a alanina (L234A, numeración UE) y para cambiar la leucina<235>a una alanina (L235A, numeración UE). Dicho cambio se ilustra en los Fab-MAT de los ejemplos, posteriormente, en los que se realiza un cambio LeuLeu ^ AlaAla en los residuos 18-19 de la región bisagra-CH2 en Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2) (es decir, ver<47>sAlaAla<479>de SEC ID n.° 1 en la Tabla 1 y<47>sAlaAla<479>de SEC ID n.° 5 en la Tabla 5).

Los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT descritos en la presente memoria son capaces de unirse a cada epítopo o antígeno con alta afinidad. Específicamente, la presente invención proporciona un enfoque para construir un anticuerpo biespecífico Fab-MAT utilizando dos anticuerpos parentales, en el que un anticuerpo parental se una a un primer epítopo o antígeno y el otro anticuerpo parental se une a un segundo epítopo o antígeno.

Los dominios variables de cadenas pesada y ligera (VH, VL) de inmunoglobulina y los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera (tales como CL, CH1, CH2 y CH3) para la utilización en un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención pueden obtenerse o derivarse a partir de inmunoglobulinas conocidas o producidas o versiones genéticamente alteradas (mutadas) de las mismas. Por ejemplo, las unidades de unión de Fab, dominios variables individuales y dominios constantes individuales pueden derivarse fácilmente a partir de anticuerpos "parentales" que se unen a epítopos o antígenos diana a los que se pretende que se una un anticuerpo biespecífico Fab-MAT. También pueden derivarse dominios constantes de inmunoglobulina individuales a partir de anticuerpos parentales que no se unen al mismo epítopo o antígeno del anticuerpo Fab-MAT pretendido, ya que dichos dominios constantes pueden unirse a dominios variables obtenidos de un anticuerpo parental diferente que se une a un epítopo o antígeno deseado del anticuerpo Fab-MAT pretendido. Entre otras fuentes de unidades de unión de Fab o dominios variables y constantes de inmunoglobulina individuales se incluyen anticuerpos parentales manipulados genéticamente o proteínas de unión que se unen a uno o dos epítopos o antígenos diana a los que se pretenda que se una un anticuerpo biespecífico Fab-MAT. Entre los anticuerpos parentales que pueden utilizarse como fuentes de unidades de unión de Fab o dominios variables y constantes individuales para el uso en la producción de un anticuerpo Fab-MAT de la invención se incluyen anticuerpos terapéuticos clínicamente aprobados.

Los dominios variables de unión a antígeno y las unidades de unión a Fab de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria pueden obtenerse a partir de anticuerpos parentales, incluyendo, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y cualquiera de una diversidad de anticuerpos de ingeniería genética. Dichos anticuerpos parentales pueden ser naturales o pueden generarse mediante tecnología recombinante. Al experto en la materia le resultarán familiares muchos métodos para producir anticuerpos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, la utilización de técnicas de hibridoma, el método de anticuerpos de linfocitos seleccionados (SLAM, por sus siglas en inglés), la utilización de bibliotecas (por ejemplo, bibliotecas fágicas, de levaduras, o de expresión por fusión de ARN-proteína, u otras bibliotecas), la inmunización de un animal no humano que comprende por lo menos algunos de los loci de inmunoglobulina humanos, y la preparación de anticuerpos quiméricos, con injertación de CDR y humanizados. Ver, p. ej., Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; y el documento n.° EP 2443 154 B1 (2013).

También pueden prepararse dominios variables utilizando técnicas de maduración de la afinidad.

Según la invención, un método para preparar un anticuerpo Fab-MAT comprende seleccionar anticuerpos parentales con por lo menos una propiedad deseada en el anticuerpo Fab-MAT. Preferentemente, la propiedad deseada es una o más de las utilizadas para caracterizar el anticuerpo Fab-MAT, tal como, por ejemplo, la especificidad de antígeno o epítopo, la afinidad para un antígeno o epítopo, la potencia, la función biológica, el reconocimiento de epítopos, la estabilidad, la solubilidad, la eficiencia de producción, la inmunogenicidad reducida, la farmacocinética, la biodisponibilidad, la reactividad cruzada entre tejidos o la unión de antígenos ortólogos.

Pueden obtenerse dominios variables utilizando técnicas de ADN recombinante de anticuerpos parentales. En una realización, un dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera murina. En otra realización, un dominio variable es un dominio variable de cadena pesada o ligera injertado con CDR o humanizado. En otra realización, un dominio variable utilizado en un anticuerpo Fab-MAT de la invención es un dominio variable de cadena pesada o ligera humano.

Uno o más dominios constantes pueden unirse entre sí o a dominios variables utilizando técnicas de ADN recombinante, PCR u otros métodos disponibles de la técnica adecuados para recombinar dominios de inmunoglobulina. En una realización, una secuencia que comprende un dominio variable de cadena pesada se une a un dominio constante de cadena pesada y una secuencia que comprende un dominio variable de cadena ligera se une a un dominio constante de cadena ligera. En otra realización, los dominios constantes son dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina humana y dominios constantes de cadena ligera de inmunoglobulina humana, respectivamente.

Los dominios variables y constantes también pueden alterarse para mejorar una característica del anticuerpo biespecífico Fab-MAT pretendido. Por ejemplo, tal como se ha indicado anteriormente, los dominios CH3 de las regiones Fc de un anticuerpo Fab-MAT de la invención poseen mutaciones de botón-en-ojal que favorecen la asociación correcta de las regiones Fc de la cadena polipeptídica pesada de Fab-MAT y la cadena polipeptídica Fc de Fab-MAT. Además, los dominios CH3 pueden mutarse adicionalmente para introducir residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro adicional al asociar los dos dominios CH3 y formar un heterodímero de Fc estable del anticuerpo Fab-MAT. Todavía adicionalmente, una región Fc de un anticuerpo Fab-MAT puede comprender una o más modificaciones de aminoácido para potenciar o reducir una función de Fc, incluyendo, aunque sin limitación, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC), la fagocitosis, la opsonización o la unión celular o de receptores.

Tal como se ha indicado anteriormente, cada uno de los dos dominios Fc de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria comprende mutaciones de botones-en-ojales (KiH) para favorecer la asociación de la región Fc de la cadena polipeptídica pesada de Fab-MAT con la cadena Fc de Fab-MAT. Sin embargo, también pueden desearse características o modificaciones adicionales de las regiones Fc. Por ejemplo, la región Fc de un anticuerpo Fab-MAT puede derivarse de una región Fc de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD. En otra realización, puede modificarse uno o más aminoácidos en una región Fc para potenciar o reducir la afinidad de la región Fc de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT para un FcyR (receptor de Fc) respecto a la región Fc no modificada. Por ejemplo, la modificación o modificaciones de la región Fc pueden alterar la afinidad para F<cy>RI, F<cy>RII y/o F<cy>RIII.

En otra realización, puede modificarse uno o más aminoácidos en una región Fc con el fin de modular la semivida funcional o físicain vivode un anticuerpo biespecífico Fab-MAT.

La organización estructural de cada una de las cadenas polipeptídicas para un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención permite el ensamblaje intracelular correcto del anticuerpo biespecífico Fab-MAT utilizando los mecanismos naturales de expresión, plegamiento y secreción de proteínas presentes dentro de la célula, sin necesidad de utilizar técnicas de procesamiento postproducción para obtener el anticuerpo Fab-MAT funcional. Resulta particularmente preferente la utilización de una célula huésped de mamífero aislada que comprende uno o más vectores de expresión codificantes de las cuatro cadenas polipeptídicas de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT deseado descrito en la presente memoria para producir y expresar un anticuerpo Fab-MAT funcional.

Unión a antígenos diana.

Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención es capaz de unirse a uno o dos epítopos o antígenos diana. Habitualmente, se manipula un anticuerpo biespecífico Fab-MAT para unirse a un epítopo en un antígeno y a un epítopo en un antígeno diferente, permitiendo de esta manera que el anticuerpo Fab-MAT sirva de enlace artificial entre los dos antígenos a fin de conseguir un resultado particular debido a la unión de los antígenos. Puede manipularse un anticuerpo Fab-MAT de la invención para unirse a una citoquina, a un ligando polipeptídico, a un receptor de superficie celular, a una proteína de superficie celular no receptora, a un enzima, a un complejo de dos o más de los anteriormente indicados, o combinaciones de los mismos.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria es capaz de modular una función biológica de uno o dos antígenos diana. Más preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria es capaz de neutralizar uno o más antígenos diana.

Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria es capaz de unir dos citoquinas diferentes. Dichas citoquinas se seleccionan del grupo que consiste en: linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención es capaz de unir por lo menos un antígeno diana expresado sobre una superficie de una célula. Más preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a dos antígenos de la superficie celular. Los dos antígenos de superficie celular pueden encontrarse en la misma célula o en dos células del mismo tipo. Más preferentemente, sin embargo, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno expresado sobre la superficie de una primera célula y se une a un segundo antígeno expresado sobre la superficie de una segunda célula, en donde la primera y segunda células son tipos diferentes de células. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a un primer antígeno de superficie celular expresado sobre una célula efectora del sistema inmunitario y también se une a un segundo antígeno de superficie celular que se expresa sobre la superficie de una célula que se considera perjudicial para el individuo y, por lo tanto, que se desea eliminar o reducir sustancialmente el tamaño de su población. Entre las células efectoras que pueden unirse a un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se incluyen linfocitos T, células asesinas naturales (NK), monocitos, neutrófilos y macrófagos. Entre los ejemplos de células que se consideran perjudiciales para un individuo y a las que puede unirse un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se incluyen células tumorales, células autorreactivas y células infectadas por virus.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno de superficie expresado sobre una célula efectora. Preferentemente, el antígeno de superficie se selecciona del grupo que consiste en: CD3, CD16 (también denominado "FcyRIN") y CD64 (también denominado "FcyRI"). Más preferentemente, un anticuerpo Fab-MAT se une a CD3 tal como se expresa sobre un linfocito T, CD16 tal como se expresa sobre una célula asesina natural (NK) o un CD64 tal como se expresa sobre macrófagos, neutrófilos o monocitos.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno de superficie que es un antígeno asociado a tumor. Los antígenos asociados a tumor preferentes a los que se une un anticuerpo Fab-MAT de la invención se seleccionan del grupo que consiste en: CD19, CD20, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM) y receptor huérfano 1 similar a receptor de tirosina quinasa (ROR1).

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a CD3 sobre una célula efectora.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a CD20 presente sobre una célula de cáncer.

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a un antígeno de superficie expresado sobre una célula efectora tal como se describe en la presente memoria y a un antígeno asociado a tumor expresado sobre una célula tumoral tal como se describe en la presente memoria. En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a CD3 sobre un linfocito T y a CD20 sobre un linfocito B maligno.

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a CD3 y a CD20. Más preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a CD20 sobre su unidad de unión a Fab externa (N-terminal) y se une a CD3 en su unidad de unión a Fab interna (C-proximal).

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a CD20 y CD3 y comprende cuatro cadenas polipeptídicas que comprenden las secuencias de aminoácidos en las Tablas 1 a 4 (SEC ID n.° 1, 2, 3 y 4) o las secuencias de aminoácidos en las Tablas 5 a 8 (SEC ID n.° 5, 6, 7 y 8).

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un par de antígenos diana seleccionados del grupo de pares de antígenos que consiste en: CD20 y CD3, CD3 y CD19, CD3 y Fc-gamma-RIIIA, CD3 y TPBG, CD3 y Epha10, CD3 y IL-5Ra, CD3 y TASCTD-2, CD3 y CLEC12A, CD3 y prominina-1, CD3 y IL-23R, CD3 y ROR1, CD3 y IL-3Ra, CD3 y PSA, CD3 y CD8, CD3 y glipicano-3, CD3 y FAP, CD3 y EphA2, CD3 y ENPP3, CD3 y CD33, CD3 y CD133, CD3 y EpCAM, CD3 y CD19, CD3 y Her2, CD3 y CEA, CD3 y GD2, CD3 y PSMA, CD3 y BCMA, CD3 y A33, CD3 y B7-H3, CD3 y EGFR, CD3 y P-cadherina, CD3 y HMW-MAA, CD3 y TIM-3, CD3 y CD38, CD3 y TAG-72, CD3 y SSTR, CD3 y FRA, CD16 y CD30, CD64 y Her2, CD 137 y CD20, CD138 y CD20, CD19 y CD20, CD38 y CD20, CD20 y CD22, CD40 y CD20, CD47 y CD20, CD 137 y EGFR, CD137 y Her-2, CD 137 y PD-1, CD 137 y PDL-1, PD-1 y PD-L1, VEGF y PD-L1, Lag-3 y TIM- 3, OX40 y PD-1, TIM-3 y PD-1, TIM-3 y PDL-1, EGFR y DLL-4, VEGF y EGFR, HGF y VEGF, un primer epítopo de VEGF y un segundo epítopo diferente de VEGF, VEGF y Ang2, EGFR y cMet, PDGF y VEGF, VEGF y DLL-4, OX40 y PD-L1, ICOS y PD-1, ICOS y PD-L1, Lag-3 y PD-1, Lag-3 y PD-L1, Lag-3 y CTLA-4, ICOS y CTLA-4, CD138 y CD40, CD38 y CD138, CD38 y CD40, CD-8 y IL-6, CSPGs y RGM A, CTLA-4 y BTN02, CTLA-4 y PD-1, IGFl y IGF2, IGFl/2 y Erb2B, IGF-IR y EGFR, EGFR y CD13, IGF-IR y ErbB3, EGFR-2 y iGf R, un primer epítopo de Her2 y un segundo epítopo diferente de Her2, Factor IXa y Met, factor X y Met, VEGFR-2 y Met, VEGF-A y angiopoyetina-2 (Ang-2), IL-12 y TWEAK, IL-13 y IL-lp, MAG y RGM A, NgR y RGM A, NogoA y RGM A, OMGp y RGM A, PDL-1 y CTLA-4, PD-1 y TIM-3, RGM A y RGM B, Te38 y TNFa, TNFa y Blys, TNFa y CD22, TNFa y a CTLA-4, TNFa y GP130, TNFa y IL-12p40, y TNFa y ligando RANK.

Anticuerpos biespecíficos Fab-MAT glucosilados.

Un anticuerpo Fab-MAT de la invención puede comprender uno o más residuos de carbohidrato. Preferentemente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito anteriormente está glucosilado. Más preferentemente, la glucosilación es un patrón de glucosilación humano.

La producción de proteínasin vivonacientes puede someterse a procesamiento adicional, conocido como modificación post-traduccional. En particular, pueden añadirse enzimáticamente residuos de azúcar (glucosilo), un proceso conocido como "glucosilación". Las proteínas resultantes que portan cadenas laterales de oligosacárido unidas covalentemente se conocen como proteínas glucosiladas o glucoproteínas.

Los anticuerpos naturales son glucoproteínas, con uno o más residuos de carbohidrato en el dominio Fc, así como el dominio variable. Los residuos de carbohidrato en el dominio Fc presentan importantes efectos sobre la función efectora del dominio Fc, con un efecto mínimo sobre la unión de antígenos o la semivida del anticuerpo (Jefferis, Biotechnol. Prog., 21: 11-16 (2005)). En contraste, la glucosilación del dominio variable puede presentar un efecto sobre la actividad de unión a antígenos del anticuerpo. La glucosilación en el dominio variable puede presentar un efecto negativo sobre la afinidad de unión de los antígenos, probablemente debido a impedimentos estéricos (Co, M.S., et al., Mol. Immunol., 30: 1361- 1367 (1993)), o puede resultar en una afinidad incrementada para el antígeno (Wallick et al., J. Exp. Med., 168:1099-1109 (1988); Wright, A., et al., EMBO J., 10: 2717-2723 (1991)).

Un aspecto de la presente invención se refiere a generar mutantes de sitio de glucosilación en los que el sitio de glucosilación unido a O o a N de un anticuerpo Fab-MAT ha sido mutado. El experto en la materia puede generar dichos mutantes utilizando tecnologías bien conocidas convencionales. Los mutantes de sitio de glucosilación que conservan la actividad biológica pero que presentan una actividad de unión incrementada o reducida son otro objeto de la presente invención.

En todavía otra realización, se ha modificado la glucosilación de un anticuerpo Fab-MAT de la invención. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo Fab-MAT aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación puede alterarse, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo Fab-MAT para uno o ambos antígenos. Dichas modificaciones de carbohidrato pueden conseguirse mediante, por ejemplo, la alteración de uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, puede realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que resulten en la eliminación de uno o más sitios de glucosilación en la región variable, a fin de eliminar de esta manera la glucosilación en ese sitio. Dicha aglucosilación puede incrementar la afinidad de un anticuerpo Fab-MAT para el antígeno. Dicho enfoque se describe en mayor detalle en la publicación de patente internacional n.° WO 2003/016466 y en las patentes US n.° 5.714.350 y n.° 6.350.861.

Adicional o alternativamente, puede producirse un anticuerpo Fab-MAT modificado de la invención que presente un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado con cantidades reducidas de residuos fucosilo (ver Kanda et al., J. Biotechnol. 130(3): 300-310, 2007) o un anticuerpo con mayor número de estructuras GIcNAc bisectadas. Dichos patrones de glucosilación alterada se ha demostrado que incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidrato pueden llevarse a cabo, por ejemplo, mediante expresión del anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria de glucosilación alterada. Las células con maquinaria de glucosilación alterada se han descrito en la técnica y pueden utilizarse como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de esta manera un anticuerpo con glucosilación alterada. Ver, por ejemplo, Shields et al., J. Biol. Chem., 277: 26733-26740 (2002); Umana et al., Nat. Biotech., 17: 176-180 (1999), así como la patente europea n.° EP 1176195; las publicaciones de patente internacional n.° WO 2003/035835 y n.° WO 1999/54342.

La glucosilación de las proteínas depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como de la célula huésped en la que se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glucosilación (p. ej., glucosiltransferasas y glucosidasas) y disponer de diferentes sustratos (azúcares de nucleótidos). Debido a dichos factores, el patrón de glucosilación de las proteínas y la composición de residuos glucosilo pueden diferir dependiendo del sistema huésped en el que se expresa la proteína particular. Entre los residuos glucosilo útiles en la invención pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, N-acetilglucosamina y ácido siálico. Preferentemente, el anticuerpo Fab-MAT glucosilado comprende residuos de glucosilo, de manera que el patrón de glucosilación sea humano.

Es conocido por el experto en la materia que una glucosilación diferente de la proteína puede resultar en diferentes características de la misma. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un microorganismo huésped, tal como una levadura, y glucosilado utilizando la ruta endógena de la levadura, puede reducirse en comparación con la de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea celular CHO. Dichas glucoproteínas también pueden ser inmunogénicas en el ser humano y muestra una semivida reducidain vivotras la administración. Algunos receptores específicos en el ser humano y otros animales pueden reconocer residuos glucosilo específicos y estimular una rápida eliminación de la proteína del torrente sanguíneo. Entre otros efectos adversos pueden incluirse cambios en el plegamiento de la proteína, susceptibilidad frente a proteasas, tráfico, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad o alergenicidad. De acuerdo con lo anterior, el profesional podría preferir un anticuerpo Fab-MAT con una composición y patrón específicos de glucosilación, por ejemplo, una composición y patrón de glucosilación idénticos, o por lo menos similares, a los producidos en células humanas o en las células específicas de especie del animal sujeto pretendido.

La expresión de anticuerpos Fab-MAT glucosilados diferentes de los de una célula huésped puede conseguirse mediante la modificación genética de la célula huésped para expresar enzimas de glucosilación heterólogos. Utilizando técnicas conocidas, el profesional puede generar un anticuerpo Fab-MAT que muestre una glucosilación de proteínas humana. Por ejemplo, se han modificado genéticamente cepas de levadura para expresar enzimas de glucosilación no naturales, de manera que las proteínas glucosiladas (glucoproteínas) producidas en dichas cepas de levadura muestren una glucosilación de las proteínas idéntica a las de las células animales, especialmente las células humanas (por ejemplo, publicaciones de patente US n.° 2004/0018590 y n.° 2002/0137134).

Ácidos nucleicos, vectores y células huésped.

La invención proporciona un polinucleótido aislado o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de las cuatro cadenas polipeptídicas de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria.

La invención proporciona, además, un vector que comprende uno o más polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de los cuatro polipéptidos de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria. Un vector puede ser un vector de replicación autónoma o un vector que incorpore el ácido nucleico aislado que está presente en el vector en un genoma de célula huésped. El polinucleótido o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de las cuatro cadenas polipeptídicas de un anticuerpo Fab-MAT también pueden insertarse en un vector a fin de llevar a cabo diversos análisis genéticos, para expresar un anticuerpo Fab-MAT, o para caracterizar o mejorar una o más propiedades de un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria.

Puede utilizarse un vector según la invención para replicar el polinucleótido o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de las cuatro cadenas polipeptídicas de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria.

Puede utilizarse un vector según la invención para expresar el polinucleótido o polinucleótidos aislados codificantes de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria o para expresar el polinucleótido o polinucleótidos aislados codificantes de una o más cadenas polipeptídicas del anticuerpo Fab-MAT. Entre los vectores preferentes para clonar y expresar ácidos nucleicos descritos en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, pcADN, pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Res., 30(2e9): 1-9 (2002)), pTT3 (pTT con múltiples sitios de clonación adicionales), pEFBOS (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990)), pBV, pJV, pcADN3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ.

La invención proporciona, además, una célula huésped aislada que comprende un vector indicado anteriormente. Dicha célula huésped aislado que comprende un vector descrito en la presente memoria puede ser una célula procariótica aislada o una célula eucariótica aislada.

Una célula huésped procariótica aislada que comprende un vector descrito en la presente memoria puede ser una célula huésped bacteriana. La célula huésped bacteriana puede ser una célula bacteriana Gram-positiva, Gramnegativa o Gram-variable. Preferentemente, la célula huésped bacteriana que comprende un vector descrito en la presente memoria es una bacteria Gram-negativa. Todavía más preferentemente, una célula huésped bacteriana que comprende un vector indicado en la presente memoria es una célula deEscherichia coli.

Una célula huésped aislada que comprende un vector descrito en la presente memoria puede ser una célula huésped eucariótica. Entre las células huésped eucarióticas aisladas preferentes que comprende un vector indicado en la presente memoria pueden incluirse, sin limitación, una célula huésped de mamífero, una célula huésped de insecto, una célula huésped vegetal, una célula huésped fúngica, una célula huésped algal eucariótica, una célula huésped de nemátodo, una célula huésped protozoaria y una célula huésped de pez. Preferentemente, una célula huésped de mamífero aislada que comprende un vector indicado en la presente memoria se selecciona del grupo que consiste en: una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula COS, una célula Vero, una célula SP2/20, una célula de mieloma NS/0, una célula renal embrionaria humana (HEK293), una célula renal de hámster neonato (BHK), una célula HeLa, una célula B humana, una célula CV-1/EBNA, una célula L, una célula 3T3, una célula HEPG2, una célula PerC6 y una célula MDCK. Las células huésped aisladas preferentes que comprenden un vector indicado en la presente memoria se seleccionan del grupo que consiste en:Aspergillus, Neurospora, Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia,yCandida.Más preferentemente, una célula huésped deSaccharomycesque comprende un vector indicado en la presente memoria es una célula deSaccharomyces cerevisiae.

Se proporciona, además, un método para producir un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria que comprende cultivar una célula huésped aislada que comprende un vector que comprende ácido nucleico codificante del anticuerpo Fab-MAT bajo condiciones suficientes para producir el anticuerpo Fab-MAT.

Conjugados.

Principalmente debido a la presencia de una región Fc dimerizada, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención puede conjugarse con cualquiera de una diversidad de agentes que actualmente se conjugan con anticuerpos IgG. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito anteriormente puede conjugarse con un elemento seleccionado del grupo que consiste en: una molécula de inmunoadhesión, un agente de obtención de imágenes, un agente terapéutico y un agente citotóxico. Un agente de obtención de imágenes preferentes que puede conjugarse con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se selecciona del grupo que consiste en: un marcaje radioactivo, un enzima, un marcaje fluorescente, un marcaje luminiscente, un marcaje bioluminiscente, un marcaje magnético, biotina, estreptavidina o avidina. Entre los marcajes radioactivos que pueden conjugarse con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm. Entre los compuestos citotóxicos o terapéuticos preferentes que pueden conjugarse con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descritos en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un agente antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente antiangiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico. En algunos casos, se conjuga un anticuerpo Fab-MAT directamente con el agente. Alternativamente, se conjuga un anticuerpo Fab-MAT con el agente mediante un conector. Entre los conectores adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, conectores de aminoácidos y polipéptidos dados a conocer en la presente memoria. Los conectores pueden ser escindibles o no escindibles.

Formas cristalizadas.

Puede utilizarse un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención como una forma cristalizada preparada utilizando un método de cristalización a gran escala, tal como, por ejemplo, el descrito por Shenoy y colaboradores en la publicación de patente internacional n.° WO 2002/072636, incorporada en la presente memoria como referencia. Dichos métodos proporcionan cristales de moléculas de anticuerpos que difieren considerablemente de los utilizados en los estudios cristalográficos de rayos X clásicos. Mientras que la calidad del cristal es muy importante para las mediciones precisas en los estudios cristalográficos de rayos X, este no es el caso para los cristales producidos mediante métodos de cristalización a gran escala para el uso farmacéutico. Los cristales de moléculas de anticuerpo producidos utilizando métodos de cristalización a gran escala son suficientemente puros para estudios y producción farmacéutica, conservan la actividad biológica, resultan particularmente adecuados para el almacenamiento (debido a que los cristales de anticuerpos están menos sujetos a interacciones no deseables que pueden ocurren en solución), pueden proporcionar preparaciones administrables por vía parenteral que contienen concentraciones muy altas de la molécula de anticuerpo biológicamente activa, pueden proporcionar preparaciones de dosis ventajosas (incluyendo concentraciones elevadas en suspensiones no acuosas), pueden proporcionar una semividain vivoincrementada y pueden formularse con (encapsuladas por) portadores poliméricos para la liberación controlada de las moléculas de anticuerpoin vivo.

Resulta particularmente preferente un anticuerpo Fab-MAT cristalizado que conserve cualquier actividad de unión, así como cualquier actividad biológica deseable de la forma no cristalizada. Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado puede proporcionar, además, una liberación controlada sin portador del Fab-MAT al administrarlo en un individuo.

Una composición preferente para la liberación de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado según la invención comprende un anticuerpo biespecífico Fab-MAT cristalizado tal como se describe en la presente memoria, un ingrediente excipiente y por lo menos un portador polimérico. Preferentemente el ingrediente excipiente se selecciona del grupo que consiste en albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol. Preferentemente el portador polimérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste en poli(ácido acrílico), poli(cianoacrilatos), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptido), poli(ésteres), poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(b-hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona), poli(etilenglicol), poli(hidroxipropil)metacrilamida, poli[(organo)fosfaceno], poli(ortoésteres), poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico/éter alquilvinílico, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glicaminoglicanos, polisacáridos sulfatados, mezclas de los mismos, y copolímeros de los mismos.

Usos de los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT.

La invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo, en el que dicho anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a uno o dos epítopos, a uno o dos antígenos, o a una combinación de un epítopo diana y un antígeno diana que resultan perjudiciales para un sujeto humano, en el que la unión de dichos epítopos o antígenos al anticuerpo biespecífico Fab-MAT proporciona un tratamiento para la enfermedad o trastorno.

Un trastorno en el que un epítopo, un antígeno o una actividad de un antígeno resulte perjudicial pretende incluir un trastorno en el que la presencia de un epítopo (por ejemplo, un epítopo de una proteína de superficie celular o de una proteína soluble), de un antígeno o la actividad de un antígeno en un sujeto humano que sufre el trastorno se ha mostrado que es responsable, o se sospecha que es responsable, de la fisiopatología del trastorno, o se ha mostrado que es un factor, o se sospecha que es un factor, que contribuye a un empeoramiento del trastorno. De acuerdo con lo anterior, un trastorno en el que un epítopo, un antígeno o una actividad de antígeno resulte perjudicial es un trastorno en el que la reducción del epítopo, antígeno o actividad de antígeno se espera que alivie uno o más síntomas del trastorno o de la progresión del trastorno, proporcionando de esta manera un tratamiento del trastorno. Dichos trastornos pueden ponerse de manifiesto, por ejemplo, en un incremento de la concentración del antígeno (o epítopo) en la sangre u otro líquido biológico de un sujeto humano que sufre del trastorno.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un sujeto humano que sufre de un trastorno en el que uno o dos antígenos o epítopos diana capaces de unirse a un anticuerpo biespecífico Fab-MAT resultan perjudiciales para el sujeto humano, en el que el método comprende administrar en el sujeto humano, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT de manera que la actividad del antígeno o antígenos (o epítopos) diana en el sujeto humano resulta inhibida y se consigue el tratamiento.

Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria resulta particularmente útil en un método de tratamiento de un trastorno que comprende "redireccionar" (o "reclutar") células efectoras (tales como linfocitos T, células NK, monocitos, neutrófilos y macrófagos) para atacar células diana específicas que expresan un antígeno asociado a un trastorno y que resultan perjudiciales para un sujeto humano y, por lo tanto, en las que resulta deseable eliminar o sustancialmente reducir la población de las células diana perjudiciales. Los ejemplos preferentes de dichas células diana perjudiciales con células tumorales (p. ej., células tumorales hemáticas (incluyendo linfáticas) y células de tumor sólido), células autorreactivas y células infectadas por virus. En un método de redireccionamiento de la invención, un anticuerpo Fab-MAT se une a un antígeno expresado sobre la superficie de una célula efectora y un antígeno expresado sobre la superficie de una célula diana que resulta perjudicial para un sujeto humano, en el que la unión del anticuerpo Fab-MAT al antígeno sobre la célula efectora y al antígeno sobre la célula perjudicial activa la célula efectora para atacar la célula diana perjudicial.

De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un trastorno en un sujeto humano, en el que el anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria se une a un antígeno sobre una célula efectora y también se une a un antígeno asociado al trastorno expresado sobre una célula diana que resulta perjudicial para el sujeto humano, en el que la unión del anticuerpo biespecífico Fab-MAT a tanto la célula efectora como la célula diana activa la célula efectora a atacar la célula diana perjudicial.

La unión simultánea de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria a un único antígeno diana sobre una célula efectora y a un único antígeno diana sobre una célula diana perjudicial puede activar la célula efectora a que ataque la célula diana ventajosamente sin inducir también una liberación masiva perjudicial de citoquinas (tormenta de citoquina). Una liberación masiva de citoquinas (tormenta de citoquinas) puede presentar efectos perjudiciales no solo sobre el tejido local sino también sobre tejidos más alejados del cuerpo del paciente, resultando en posibles complicaciones y efectos secundarios no deseados. Dicha tormenta de citoquinas puede ocurrir en una respuesta inmunitaria natural en la que una célula efectora, tal como un linfocito T, se une a una célula presentadora de antígenos (CPA) o cuando un anticuerpo bivalente o multivalente entrecruza artificialmente dos o más antígenos sobre la superficie de una célula efectora. En contraste, debido al hecho de que un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención puede manipularse de manera que solo uno de sus unidades de unión de Fab se una a un antígeno sobre la célula efectora, se reduce en gran medida la posibilidad de una activación no específica de los linfocitos T y la consiguiente tormenta de citoquinas, conservando simultáneamente la capacidad de activar la célula efectora para que ataque la célula diana perjudicial a l que está unida la otra unidad de unión de Fab del anticuerpo Fab-MAT.

Preferentemente, un método de redireccionamiento de una célula efectora a atacar una célula diana perjudicial comprende poner en contacto la célula efectora y la célula diana perjudicial con un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria que se une a un antígeno sobre la célula diana perjudicial y se une a un antígeno expresado sobre una célula efectora. Entre los antígenos de célula efectora preferentes se incluyen CD3, CD16 (también denominado "FcyRIN") y CD64 (también denominado "FcyRI"). Más preferentemente, el método comprende un anticuerpo Fab-MAT que se une a CD3 tal como se expresa sobre un linfocito T, CD16 tal como se expresa sobre una célula asesina natural (NK) o un CD64 tal como se expresa sobre un macrófago, neutrófilo o monocito.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un tumor en un sujeto humano, en el que dicho anticuerpo Fab-MAT se une a un antígeno sobre una célula efectora y también se une a un antígeno sobre una célula tumoral diana, en el que la unión del anticuerpo Fab-MAT a la célula efectora y la célula tumoral diana activa la célula efectora para atacar la célula tumoral. Preferentemente, el antígeno sobre la célula efectora es CD3 tal como se expresa sobre un linfocito T.

En una realización preferente, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un tumor en un sujeto humano comprende redireccionar una célula efectora para que ataque una célula tumoral diana que comprende la etapa de administrar en el sujeto humano un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria que se une a un antígeno sobre la célula efectora y un antígeno sobre la célula tumoral diana, en el que el antígeno sobre la célula tumoral diana es un antígeno asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en: CD19, CD20, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM) y receptor huérfano 1 similar a receptor de tirosina quinasa (ROR1).

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria que se une a un antígeno sobre una célula efectora y que se une a un antígeno sobre linfocitos B malignos, para la utilización en un método de tratamiento de un sujeto humano para un tumor asociado a linfocitos B. Preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT de la invención se une a un antígeno sobre los linfocitos B malignos de un trastorno de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (LNH), leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores, neoplasmas de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/ linfoma linfocítico de células pequeñas, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de linfocitos B, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postransplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes.

En una realización particularmente preferente, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria que se une a CD3 sobre un linfocito T y que se une a CD20 sobre un linfocito B tumoral diana, para la utilización en un método de tratamiento de un sujeto humano para un tumor asociado a linfocitos B. Más preferentemente, el anticuerpo biespecífico Fab-MAT se une a CD20 sobre su unidad de unión de Fab externa (N-terminal) (p. ej., ver en la fig. lA, Fab que comprende los dominios VH<a>-CH1 y VL<a>-CL) y se une a CD3 en su unidad de unión de Fab interna (C-proximal) (p. ej., en la fig. 1A, Fab que comprende los dominios VH-CH1 y VL-CL).

En otra realización, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método de tratamiento de un trastorno según la invención puede comprender poner en contacto el anticuerpo Fab-MAT con células efectoras y células diana perjudiciales en un tipo de procedimientoex vivoen el que las células efectoras extraídas de un sujeto humano en necesidad de tratamiento se ponen en contacto con el anticuerpo Fab-MAT fuera del sujeto humano y, tras dejar tiempo para la unión del anticuerpo Fab-MAT a las células efectoras, las células efectoras unidas al anticuerpo Fab-MAT seguidamente se administran en el sujeto humano de manera que los complejos de anticuerpo Fab-MAT unidos a células efectoras a continuación pueden buscar la unión a las células diana perjudiciales, tales como células tumorales, dentro del sujeto humano. En otra realización, las células efectoras y las células tumorales extraídas de un sujeto humano que requiere tratamiento se ponen en contacto con el anticuerpo Fab-MAT fuera del sujeto humano y, tras dejar tiempo para la unión del anticuerpo Fab-MAT a las células efectoras y a las células tumorales, las células efectoras y tumorales unidas al anticuerpo Fab-MAT se administran en el sujeto humano.

Además, pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos Fab-MAT proporcionados en la presente memoria para la administración específica de tejido (reconocimiento de un marcador tisular y un mediador de la enfermedad para potenciar la farmacocinética local y, de esta manera, conseguir una mayor eficacia y/o una menor toxicidad), incluyendo la administración intracelular (reconocimiento de un receptor de internalización y una molécula intracelular), llegando al interior del cerebro (por ejemplo, con diana en el receptor de transferrina y un mediador de enfermedad en el sistema nervioso central (SNC) para el cruce de la barrera hematocefálica). Los anticuerpos Fab-MAT también pueden servir de proteína portadora para el transporte de un antígeno hasta una ubicación específica mediante la unión a un epítopo no neutralizante de ese antígeno y también para incrementar la semivida del antígeno.

Además, pueden diseñarse anticuerpos biespecíficos Fab-MAT para unirlos físicamente a dispositivos médicos implantados en el paciente o para que estos sean su diana (ver Burket et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200: 6318-6324; "Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis", Wu, Peng, et al., (2006) Biomaterials, 27(11):2450-2467; "Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices", Marques et al., in Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Reis et al., eds. (CRC Press LLC, Boca Raton, 2005) pp. 377-397). El direccionamiento de los tipos apropiados de células al sitio del implante médico puede estimular la cicatrización y restauración de la función tisular normal. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos Fab-MAT para inhibir mediadores (incluyendo, aunque sin limitación, citoquinas) que resultan liberados con la implantación del dispositivo. La exposición en la presente memoria proporciona, además, aplicaciones diagnósticas, incluyendo, aunque sin limitación, métodos de ensayo diagnóstico, kits diagnósticos que contienen una o más proteínas de unión, y la adaptación de los métodos y kits para el uso en sistemas automatizados y/o semiautomatizados. Los métodos, kits y adaptaciones proporcionados pueden utilizarse en la detección, seguimiento y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo. Lo anterior se aclara adicionalmente a continuación.

Un anticuerpo biespecífico Fab-MAT descrito en la presente memoria se adapta fácilmente a cualquiera de entre una diversidad de ensayos de inmunodetección y formatos de purificación disponibles de la técnica para detectar, cuantificar o aislar un antígeno diana o células que expresan un antígeno diana. Entre dichos formatos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ensayos de inmunotransferencia (por ejemplo, una transferencia Western); cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo, en la que un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se adsorbe o se une a una resina o perla de cromatografía; ensayos de inmunoprecipitación; inmunochips; ensayos de inmunohistoquímica de tejidos; citometría de flujo (incluyendo la separación de células activada por fluorescencia); inmunoensayos de tipo sándwich; inmunochips, en los que se inmoviliza o se une un anticuerpo Fab-MAT a un sustrato; radioinmunoensayos (RIA); inmunoensayos enzimáticos (EIA); ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA); inmunoensayos de inhibición competitiva; inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA); técnica de inmunoensayo por multiplicación enzimática (EMIT); transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BREt ); y ensayos quimioluminiscentes homogéneos. La presente exposición proporciona métodos que utilizan la espectrometría de masas y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, MALDI (desorción/ionización láser asistida por matriz) o SELDI (desorción/ionización láser potenciada por superficie) que comprende un anticuerpo Fab-MAT que se une a un antígeno o epítopo diana sobre un antígeno o fragmento del mismo.

La invención proporciona, además, un anticuerpo biespecífico Fab-MAT según se reivindica en la presente memoria para la utilización en un método para detectar un antígeno en una muestra (tal como, por ejemplo, una mezcla, composición, solución o muestra biológica) que comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo biespecífico Fab-MAT que se une a un antígeno diana. Entre las muestras biológicas que pueden servir como muestra para un ensayo de inmunodetección de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, sangre completa, plasma, suero, diversos extractos de tejidos, lágrimas, saliva, orina y otros líquidos corporales. Preferentemente, un ensayo de inmunodetección de la invención detecta cualquiera de los siguientes: el anticuerpo biespecífico Fab-MAT unido al antígeno diana, el complejo del anticuerpo biespecífico Fab-MAT y el antígeno diana, o el anticuerpo biespecífico Fab-MAT que se conserva no unido. Los métodos para detectar un complejo de unión que comprende un antígeno diana y un anticuerpo Fab-MAT preferentemente utilizan un sistema de detección que utiliza una o más moléculas generadoras de señal (marcajes detectables) que generarán una señal que resulta fácilmente detectada por el ojo humano o que resulta fácilmente detectada o medida por un instrumento de detección de señales (por ejemplo, un espectrofotómetro). El anticuerpo biespecífico Fab-MAT puede marcarse directa o indirectamente con un sistema generador de señal detectable para facilitar la detección del anticuerpo biespecífico Fab-MAT unido o no unido. Entre las señales detectables que pueden utilizarse para detectar un complejo de unión que comprende un antígeno diana y un anticuerpo biespecífico Fab-MAT se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, una señal fluorescente (por ejemplo, tal como la generada por un pigmento fluorescente o molécula de cianina que puede estar unida a una de las unidades de unión de Fab de un anticuerpo Fab-MAT o unida por otros medios al anticuerpo Fab-MAT), una señal de color visible (p. ej., generada con un enzima o molécula coloreada (p. ej., un pigmento) que también puede unirse directa o indirectamente al anticuerpo Fab-MAT), una señal radioactiva (p. ej., generada por un isótopo radioactivo que puede unirse directa o indirectamente a un anticuerpo Fab-MAT) y una señal lumínica (p. ej., tal como la generada por un sistema quimioluminiscente o bioluminiscente). Un ejemplo de un sistema bioluminiscente es un sistema de luciferinaluciferasa en el que puede unirse una luciferasa directa o indirectamente a un anticuerpo Fab-MAT o a un anticuerpo de detección secundario para generar una señal lumínica detectable en la presencia del sustrato de luciferina.

Un enzima preferente que resulta útil en un ensayo de inmunodetección de la invención es un enzima que puede proporcionar una señal detectable al ponerlo en contacto con uno o más reactivos. Entre dichos enzimas se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa.

Entre los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados que pueden utilizarse en un ensayo de inmunodetección de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina.

Un ejemplo de un material luminiscente que puede utilizarse en un ensayo de inmunodetección de la invención es el luminol.

Entre los ejemplos de especies radioactivas adecuadas que pueden utilizarse en un ensayo de inmunodetección de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm.

Composiciones farmacéuticas.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas para la utilización en el tratamiento de un sujeto humano que comprenden un anticuerpo biespecífico Fab-MAT tal como se reivindica en la presente memoria. Dichas composiciones se preparan utilizando técnicas e ingredientes bien conocidos de la técnica para la preparación de composiciones farmacéuticas para la administración de un anticuerpo terapéutico en sujetos humanos. Una composición que comprende un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria puede formularse para la administración mediante cualquiera de una diversidad de vías o modos de administración. Una composición que comprende un anticuerpo Fab-MAT puede formularse para la administración parenteral o no parenteral. Una composición que comprende un anticuerpo Fab-MAT para la utilización en el tratamiento de un cáncer, enfermedad autoinmunitaria o enfermedad inflamatoria puede formularse para la administración parenteral, por ejemplo, aunque sin limitación, para la administración intravenosa, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Más preferentemente, se formula una composición para la administración intravenosa. Dicha administración parenteral se lleva a cabo preferentemente mediante inyección o infusión de la composición.

Las composiciones que comprenden un anticuerpo Fab-MAT para la administración en un individuo humano pueden comprender una cantidad eficaz del anticuerpo Fab-MAT en combinación con uno o más componentes farmacéuticamente aceptables, tal como un portador (vehículo, tampón), excipiente u otro ingrediente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que un compuesto, componente o ingrediente de una composición es compatible con la fisiología de un sujeto humano y, además, no resulta perjudicial para la actividad eficaz del componente anticuerpo Fab-MAT o para la propiedad o actividad deseada de cualquier otro componente que puede estar presente en una composición que debe administrarse en un sujeto humano. Entre los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunos casos, puede resultar preferente incluir agentes isotónicos, incluyendo, aunque sin limitación, azúcares; polialcoholes, tales como manitol o sorbitol; cloruro sódico, y combinaciones de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender, además, cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones para potenciar el tiempo de almacenamiento o la eficacia de la composición. Un excipiente es, de manera general, cualquier compuesto o combinación de compuestos que proporciona una característica deseada a una composición, aparte de una actividad terapéutica primaria. El pH puede ajustarse en la composición según se requiera, por ejemplo, para estimular o mantener la solubilidad de los ingredientes componentes, para mantener la estabilidad de uno o más ingredientes en la formulación y/o para detener el crecimiento no deseado de microorganismos que potencialmente podrían introducirse en algún punto del procedimiento.

Las composiciones que comprenden un anticuerpo Fab-MAT pueden incluir, además, otro u otros ingredientes, tales como otros agentes medicinales (por ejemplo, un agente anticáncer, un antibiótico, un compuesto antiinflamatorio o un agente antiviral), agentes de carga, adyuvantes de formulación y combinaciones de los mismos.

Las composiciones según la invención pueden presentar una diversidad de formas. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, líquida, semisólida y formas de dosis sólidas, dispersiones, suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferente depende de la vía de administración deseada. Las composiciones preferentes se presentan en la forma de soluciones inyectables o infusionables, tales como composiciones similares a las utilizadas en la administración de anticuerpos terapéuticos aprobados para el uso en seres humanos. En una realización preferente, un anticuerpo Fab-MAT descrito en la presente memoria se administra mediante inyección o infusión intravenosa. En otra realización, se administra un anticuerpo Fab-MAT mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura adecuada para una concentración elevada de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles mediante la incorporación del compuesto activo, es decir, un anticuerpo Fab-MAT, en la cantidad requerida en un solvente apropiado, opcionalmente con un ingrediente o una combinación de ingredientes que proporciona una característica beneficiosa a la composición, según se requiera, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del ingrediente activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico (por ejemplo, agua estéril, solución salina isotónica estéril y similares) y opcionalmente otro u otros ingredientes que pueden resultar necesarios para la dispersión adecuada. En el caso de los polvos liofilizados estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, entre los métodos preferentes de preparación se incluyen el secado al vacío y el secado por pulverización, que produce unos polvos del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante la utilización de surfactantes. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede conseguirse mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, una sal monoestearato y/o gelatina.

Puede administrarse un anticuerpo Fab-MAT mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En determinadas realizaciones, puede prepararse un anticuerpo Fab-MAT con un portador que protegerá al anticuerpo frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, un polianhídrido, un ácido poliglicólico, un colágeno, un poliortoéster y un ácido poliláctico. El experto en la materia conocerá una diversidad de métodos para la preparación de dichas formulaciones.

Puede prepararse una composición farmacéutica dada a conocer anteriormente para la administración en un individuo mediante por lo menos un modo seleccionado del grupo que consiste en: las vías parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelular, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.

Resultarán evidentes realizaciones y características adicionales de la invención a partir de los ejemplos no limitativos a continuación.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción, expresión, purificación y análisis del anticuerpo biespecífico Fab-MAT de CD20/CD3.

Con el fin de demostrar la tecnología de Fab-MAT, se generaron ejemplos de un anticuerpo biespecífico Fab-MAT de CD20/CD3, que variaba en las mutaciones de botón-en-ojal en la región Fc: Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2).

Con el fin de generar los anticuerpos Fab-MAT, se sintetizóde novoun ADN codificante de cada cadena polipeptídica.

El constructo de ADN utilizado para generar los anticuerpos Fab-MAT capaces de unirse a CD3 y CD20 codificaba los dominios variable y constante de los anticuerpos monoclonales (mAb) parentales. Cada anticuerpo Fab-MAT consistía en cuatro polipéptidos, tal como se representa esquemáticamente a continuación:

Cadena pesada: VLA-CL-VHB-CH1-bisagra-CH2-CH3 (KiH)

Primera cadena ligera: VHa-CH1

Segunda cadena ligera: VLb-CL

Cadena Fc: bisagra-CH2-CH3 (KiH)

en donde "(KiH)" indica la presencia de una o más mutaciones para favorecer o estabilizar la heterodimerización de dominios CH3 de la cadena pesada y de la cadena Fc; el antígeno "A" es CD20 y el antígeno "B" es CD3.

Se prepararon dos constructos, llamados Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2), que diferían únicamente en las mutaciones de botón-en-ojal realizadas en las regiones Fc para favorecer la heterodimerización.

Brevemente, los mAb parentales incluían dos anticuerpos de alta afinidad, un mAb anti-CD20 (ofatumumab) y un mAb anti-CD3 (publicación de patente US n.° 2009/0252683).

Constructos para cadenas pesadas de Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2.

Para producir cadenas pesadas para los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT (KiH) y Fab-MAT (KiH2), un constructo de a Dn codificaba un péptido de señal de 22 aminoácidos unido a VL-CL de la cadena ligera del mAb anti-CD20 parental (ofatumumab), que se unió al extremo N-terminal de la región VH-CH1 del mAb anti-CD3 parental (publicación de patente US n.° 2009/0252683), que se unió a la bisagra-CH2 del mAb anti-CD3 parental, que se unió a una región CH3 de IgG1 mutada, derivada del mAb anti-CD3 parental.

El dominio CH3 de la cadena pesada para el anticuerpo biespecífico Fab-MAT (Kih1) se mutó para cambiar un residuo de treonina (T) a un residuo de tirosina (Y) para formar un botón estructural en el residuo 21 del dominio CH3. Ver Y610 en la SEC ID n.° 1 en la Tabla 1, a continuación (residuo subrayado), que refleja dicha mutación. La posición correspondiente en el dominio CH3 de la cadena Fc para Fab-MAT (KiH1) se mutó para cambiar un residuo de tirosina (Y) a un residuo de treonina (T) para formar un botón estructural en el residuo 62 del dominio CH3. Ver T<213>en la SEC ID n.° 4 en la Tabla 1, a continuación (residuo subrayado), que refleja dicha mutación.

El dominio CH3 de la cadena pesada para el anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH2) se mutó para cambiar un residuo de treonina (T) a un residuo de triptófano (W) para formar un botón estructural en dominio CH3. Ver W<610>en la SEC ID n.° 5 en la Tabla 5, posteriormente (residuo subrayado), que refleja dicha mutación. El dominio CH3 de la cadena Fc para Fab-MAT (KiH2) se mutó para cambiar la treonina (T) a una serina (S), una leucina (L) a una alanina (A), y una tirosina (Y) a una valina, para formar un ojal estructural en el dominio CH3. Ver S<172>, A<174>y V<213>en la SEC ID n.° 8 en la Tabla 8, a continuación (residuo subrayado), que refleja dichas mutaciones.

El dominio CH3 de la cadena pesada para el anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH2) también se mutó para cambiar un residuo de serina (S) a un residuo de cisteína (C), y se realizó una mutación correspondiente en la cadena Fc del anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH2) para cambiar un residuo de tirosina (Y) a un residuo de cisteína (C). La introducción de dichos residuos de cisteína (C) permite la formación de enlaces disulfuro con el dominio CH3 mutado complementario de la cadena de polipéptido Fc, resultando en una estabilid0add mejorada del heterodímero. Ver C<598>en SEC ID n.° 5 en la Tabla 5 (residuo subrayado) y C<155>en SEC ID n.° 8 en la Tabla 8, posteriormente (residuo subrayado), que refleja dichas sustituciones de cisteína.

Las cadenas pesadas y cadenas Fc tanto en Fab-Mat KiH1 como en Fab-MAT KiH2 también se mutaron para cambiar leucina-leucina en las posiciones 18 y 19 de la región bisagra-CH2 a alanina-alanina para reducir o eliminar las funciones de ADCC/CDC del efecto (Canfield et al., J. Exp. Med., 173(6): 1483-1491 (1991)).<478>AA<479>en SEC ID n.° 1 en la Tabla 1,<40>AA<41>en la SEC ID n.° 4 en la Tabla 4,<478>AA<479>en la SEC ID n.° 5 en la Tabla 5, y<40>AA<41>en la SEC ID n.° 8 en la Tabla 8, que reflejan dichas mutaciones de leucina a alanina.

Constructos para las cadenas ligeras de Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2.

Para producir las primeras cadenas ligeras para los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2), un constructo de ADN codificaba un péptido de señal de 19 aminoácidos unido al fragmento VH-CH<1>del mAb anti-CD20 parental (ofatumumab).

Constructos para las segundas cadenas ligeras de Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2.

Para producir las segundas cadenas ligeras para los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2), un constructo de ADN codificaba un péptido de señal de 20 aminoácidos unido a VL-CL de la cadena ligera del mAb anti-CD3 parental (publicación de patente US n.° 2009/0252683).

Constructos para cadenas Fc de Fab-MAT KiH1 y Fab-MAT KiH2.

Para producir las cadenas del polipéptido Fc para los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2), un constructo de ADN codificaba un péptido de señal de 22 aminoácidos (igual al utilizado para los constructos de cadena pesada) unido a la región bisagra-CH2 del mAb anti-CD3 parental, que se unió a una región CH3 mutada de un isotipo de IgG1 que comprendía las mutaciones comentadas anteriormente en el comentario de los constructos de cadena pesada de Fab-MAT.

El dominio CH3 de la cadena pesada de la cadena Fc para el anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH1) se mutó para cambiar un residuo de tirosina (Y) a un residuo de treonina (T) para formar un ojal estructural en el dominio CH3, complementando de esta manera la mutación de botón estructural en el dominio CH3 de la cadena pesada (ver, anteriormente).

El dominio CH3 de la cadena Fc para el anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH2) se mutó para cambiar un residuo de treonina (T) a un residuo de serina (S), para cambiar un residuo de leucina (L) a un residuo de alanina (A), y para cambiar un residuo de tirosina (Y) a un residuo de valina, para formar un ojal estructural en el dominio CH3. El dominio CH3 también se mutó para cambiar un residuo de tirosina (Y) a un residuo de cisteína (C). La introducción del residuo de cisteína (C) permite la formación de un enlace disulfuro con el dominio CH3 mutado complementario de la cadena pesada de Fab-MAT (KiH2) indicada anteriormente, lo que estabiliza adicionalmente la heterodimerización.

Las secuencias de aminoácidos de las cuatro cadenas polipeptídicas para los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2) se muestran en las tablas, a continuación.

Tabla 1. Cadena pesada del anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH1) de CD20/CD3.

Tabla 2. Primera cadena ligera del anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH1) de CD20/CD3.

(continuación)

Tabla 3. Segunda cadena ligera del anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH1) de CD20/CD3

Tabla 4. Cadena del polipéptido Fc de Fab-MAT (KiH1) de CD20/CD3.

Tabla 5. Cadena pesada del anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH2) de CD20/CD3

(continuación)

Tabla 6. Primera cadena ligera del anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH2) de CD20/CD3.

Tabla 7. Segunda cadena ligera del anticuerpo biespecífico Fab-MAT (KiH2) de CD20/CD3.

Tabla 8. Cadena del polipéptido Fc de Fab-MAT (KiH2) de CD20/CD3.

Niveles de expresión.

Los constructos de ADN indicados anteriormente codificantes de cada una de las cuatro cadenas polipeptídicas para Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2) se clonaron en el vector de expresión pTT mediante métodos estándares. Los vectores pTT recombinantes resultantes codificantes de SEC ID n.° 1 a 4 o codificantes de SEC ID n.° 5 a<8>a continuación se cotransfectaron en células HEK 293E para la expresión de los anticuerpos biespecíficos Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2) respectivos. Los niveles de expresión en cultivo celular se muestran en la tabla, posteriormente.

Tabla 9.

Purificación y caracterización.

Una vez se había completado la fase de producción, se recogieron los cultivos celulares y se sometieron a purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad de proteína A.

La fracción monomérica de cada una de las preparaciones de anticuerpo Fab-MAT tras una purificación de una sola etapa mediante cromatografía de proteína A se determinó medinate cromatografía de exclusión por tamaños (CET). Los resultados de los análisis de CET se muestran en las figuras 2 y 3.

El análisis de CET reveló que 98,19 % de la preparación de anticuerpo Fab-MAT (KiH1) y 95,7 % de la preparación de anticuerpo Fab-MAT (KiH2) estaba presente en forma de una sola especie ("fracción monomérica").

Separación celular activada por fluorescencia (FACS).

La capacidad de Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2) purificados de unirse a los antígenos diana CD20 y CD3 expresados sobre la superficie de las células se examinó mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando los protocolos descritos posteriormente.

Equipo.

BD FACSVerse, número de serie: 01131005894

Olympus CKX41, número de serie: 01121005367

Centrífuga Eppendorf 5810R, número de serie: 01121005414

Camisa de agua Thermo Series II, número de serie: 01121005408

Materiales y reactivos.

Tubo de fondo redondo BD Falcon, n.° de cat. 352052 Lote n.° 3070549

Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos, fondo en U y baja evaporación, n.° de cat. 353077, lote n.° 34285048, FBS, GIBO, n.° de cat. 0099, Lote n.° 1652792

PBS, GIBCO n.° de cat. 10010, n.° de lote 1710584

Medio RPMI 1640(1*), GIBCO n.° de cat. A10491, n.° de lote 1747206 ;IgG1 de ratón antihumano Alexa Fluor® 488. Invitrogen, n.° de cat. A-10631, lote n.° 1744792 ;;Líneas celulares. ;;Jurkat, ATCC n.° de cat. TIB-152, es una línea celular de leucemia de linfocitos T que expresa el antígeno de superficie CD3. Raji, ATCC n.° de cat. CCL-<8 6>, lote n.° 60131961, es una línea celular de leucemia de linfocitos B de Burkitt que expresa el antígeno de superficie CD20. ;;Anticuerpos para FACS. ;;; ;;; Procedimiento de FACS. ;;1. Alícuotas de 5x10<5>células en PBS helado. ;2. Las células se bloquearon en FBS/PBS al 2 % durante 30 minutos sobre hielo. ;3. Las células se incubaron con anticuerpos anti-CD20 durante 1 h sobre hielo. La concentración inicial del anticuerpo era (133,33 nM) 20 pg/ml y se diluyó 1:5 en serie. Cada volumen era de 200 pl. ;4. Se lavaron en PBS 3 veces, 2000 rpm durante 5 min a 4 °C. ;5. Las células se incubaron con anticuerpo secundario Fc anti-IgG1 humana, IgG1 de ratón antihumano Alexa Fluor® 488 (AF488), 100 pl (10 pg/ml) (diluido 1:100) durante 1 hora sobre hielo y resguardado de la luz. ;6. Se lavaron en PBS 3 veces, 2000 rpm durante 5 min a 4 °C. ;7. Las células se resuspendieron en PBS. Se detectó la intensidad media de fluorescencia (IMF) mediante un citómetro de flujo BD FACSVerse. ;;Resultados. ;;Los resultados se muestran en las figuras 4 y 5. Ambos anticuerpos biespecíficos Fab-MAT fueron capaces de unirse a CD20 y CD3 sobre los linfocitos B (células Raji CD20) y linfocitos T (células Jukat CD3), respectivamente. ;;Actividad funcional para inducir la apoptosis de los linfocitos T en la presencia de linfocitos T.;;La capacidad de Fab-MAT (KiH1) y Fab-MAT (KiH2) purificados de unirse a los antígenos diana CD20 y CD3 expresados sobre las superficies celulares se examinó mediante ensayo de apoptosis de linfocitos B utilizando los protocolos descritos posteriormente. ;;Equipo. ;;BD FACSVerse, número de serie: 01131005894 ;Olympus CKX41, número de serie: 01121005367 ;Centrífuga Eppendorf 5810R, número de serie: 01121005414 ;Camisa de agua Thermo Series II, número de serie: 01121005408 ;;Materiales y reactivos. ;;Tubo de fondo redondo BD Falcon, n.° de cat. 352052 Lote n.° 3070549 ;Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos, fondo en U y baja evaporación, n.° de cat. 353077, lote n.° 4292046, FBS, GIBO, n.° de cat. 10099, Lote n.° 1652792 ;PBS, GIBCO n.° de cat. 10010, Lote n.° 1710584 ;Medio RPMI 1640(1*), GIBCO n.° de cat. 11875, Lote n.° 1731226

Ficoll Paque Plus, GE HEALTHCARE, n.° de cat: GE17144002, lote n.°:10237843

anticuerpo de ratón anti-CD19 humano PE, BD Pharmingen, n.° de cat. 555413, n.° de lote: 5274713

Líneas celulares.

Raji, ATCC n.° de cat. CCL-86, lote n.° 60131961.

Número de donante: 00123

Anticuerpos para el ensayo de apoptosis de linfocitos B.

Procedimientos.

Procedimiento de aislamiento de células mononucleares

Preparación de muestras de sangre.

1. Se extrajeron 100 ml de sangre humana y se introdujeron inmediatamente en tubos tratados con anticoagulante.

2. Se añadió un volumen igual de RPMI1640 (100 ml) a la sangre y se mezcló suavemente.

3. Se calentó medio en gradiente de densidad de Ficoll-Paque hasta una temperatura de entre 18 °C y 20 °C antes de su uso.

4. La botella de medio Ficoll-Paque se invirtió varias veces para garantizar una mezcla a fondo.

5. Se añadió medio Ficoll-Paque (15 ml) al tubo de centrífuga de 50 ml.

6. Se añadió en capas cuidadosamente la muestra de sangre diluida (20 ml) sobre la solución de medio de Ficoll-Paque sin mezclar la solución de medio de Ficoll-Paque y la muestra de sangre diluida.

7. Se centrifugó la muestra de Ficoll-Paque y sangre a 400g durante 30 a 40 min a una temperatura de entre 18 °C y 20 °C.

8. La capa de células mononucleares se transfirió del gradiente a un tubo de centrífuga estéril.

Lavado de aislados celulares.

1. Se estimó el volumen de células mononucleares transferidas y se añadieron por lo menos 3 volúmenes de PBS a las células mononucleares en el tubo de centrífuga.

2. Las células y el PBS se centrifugaron a 400 a 500XG durante 10 min a una temperatura de entre 18 °C y 20 °C y se eliminó el sobrenadante.

3. Se repitió el lavado.

4. Se eliminó el sobrenadante y el pellet celular se resuspendió en tampón de ensayo.

Depleción de linfocitos B.

El medio de ensayo era RPMI1640 más FBS al 10 %.

1. Se recolectaron las células diana (células Raji) en fase de crecimiento logarítmico y se lavaron una vez con medio de ensayo. Se ajustó la densidad celular a 5x105 células/ml y se añadieron 100 pl de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de ensayo.

2. El anticuerpo de ensayo se diluyó en serie y se añadieron 50 l a cada pocillo de la placa de ensayo anteriormente indicada. La concentración inicial final de anticuerpo era de 50 pg/ml y después se diluyó en serie.

3. Se ajustó la densidad celular de PBMC a 2,5x106 células/ml y se añadieron 100 pl de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de ensayo (proporción de efectores a diana de 5:1).

4. Las placas de ensayo se incubaron a 37 °C con 5 % de CO<2>durante 1 día, 2 días y 3 días. Transcurrido 1 día, 2 días y 3 días, se recogieron las muestras mediante centrifugación a 2000 rpm durante 5 min a 4 °C y se lavaron una vez con PBS.

5. Se incubó cada muestra con 50 pl de anticuerpo de detección anti-CD19 humano conjugado con PE y diluido 1:5, durante 30 minutos sobre hielo.

6. Las muestras se lavaron con PBS y se analizaron con FACSVerse.

Resultados.

Los resultados se muestran en la figura 6. En el día 2 del ensayo de depleción celular, ambos anticuerpos biespecíficos Fab-MAT eran capaces de inducir la apoptosis mediada por linfocitos T de los linfocitos B.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo biespecífico Fab en tándem asimétrico monovalente (anticuerpo Fab-MAT) que comprende cadenas polipeptídicas (a), (b), (c) y (d), en el que:

(a) es una cadena polipeptídica pesada (cadena pesada), en la que dicha cadena pesada comprende (de extremo aminoterminal a extremo carboxiloterminal): VLA-CL-VHB-CH1-bisagra-CH2-CH3m1, en la que: VLa es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que se fusiona directamente con CL, que es un dominio constante de cadena ligera humano, en el que VL<a>-CL es un componente cadena ligera de inmunoglobulina de una primera unidad de unión de Fab que reconoce un primer antígeno o epítopo y se fusiona directamente con VHb, en donde VHb es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se fusiona directamente con CH1, que es un dominio constante CH1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en donde VH-CH1 es el componente cadena pesada de inmunoglobulina de una segunda unidad de unión Fab que reconoce un segundo antígeno o epítopo, y en donde VH-CH1 se fusiona directamente con una bisagra-CH2, en donde la bisagra-CH2 es la región bisagra-CH2 de una cadena pesada de inmunoglobulina y en donde la bisagra-CH2 se fusiona directamente con CH3m1, que es un primer dominio constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se ha mutado con una o más mutaciones de botones-en-ojales (KiH) para formar un botón estructural o un ojal estructural en dicho dominio constante CH3m1, en donde A y B son diferentes antígenos o diferentes epítopos;

(b) es una primera cadena ligera de Fab-MAT que comprende VHa-CH1, en donde VHa es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se fusiona directamente con CH1, que es un dominio constante CH1 de cadena pesada de inmunoglobulina humana y en donde VHa-CH1 es el componente cadena pesada de inmunoglobulina de dicha primera unidad de unión Fab;

(c) una segunda cadena ligera de Fab-MAT que comprende VLb-CL, en donde VLb es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana que se fusiona directamente con CL, que es un dominio constante de cadena ligera CL de inmunoglobulina humana y en donde VLb-CL es el componente cadena ligera de inmunoglobulina de dicha segunda unidad de unión Fab, y

(d) es una cadena de polipéptido Fc (cadena Fc) que comprende bisagra-CH2-CH3m2, en donde la bisagra-CH2 es la región bisagra-CH2 de una cadena pesada de inmunoglobulina y en donde la bisagra-CH2 se fusiona directamente con CH3m2, que es un segundo dominio constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se ha mutado con una o más mutaciones de botones-en-ojales (KiH) para formar un botón estructural o un ojal estructural en dicho dominio constante CH3m2;

con la condición de que:

cuando el dominio CH3m1 de la cadena pesada se ha mutado para formar un botón estructural, entonces el dominio CH3m2 de la cadena Fc se ha mutado para formar un ojal estructural complementario para favorecer el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2, y

cuando el dominio CH3m1 de dicha cadena pesada se ha mutado para formar un ojal estructural, entonces el dominio CH3m2 de la cadena Fc se ha mutado para formar un botón estructural complementario para favorecer el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2, y

dicho anticuerpo Fab-MAT opcionalmente comprende una mutación tanto en el dominio CH3m1 y en el dominio CH3m2 para introducir un residuo de cisteína a fin de favorecer la formación de enlace disulfuro en el apareamiento del dominio CH3m1 con el dominio CH3m2.

2. Anticuerpo Fab-MAT según la reivindicación 1, en el que una o más mutaciones KiH en el dominio CH3m1 o en el dominio CH3m2 para formar un botón estructural son un cambio de un residuo de treonina a un residuo de tirosina o un cambio de un residuo de treonina a un residuo de triptófano,

preferentemente:

(i) en el que la mutación KiH cambia una treonina a una tirosina en la posición 610 de SEC ID n.° 1 del dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo Fab-MAT, o

(ii) en el que la mutación KiH cambia una treonina a un triptófano en la posición 610 de SEC ID n.° 5 del dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo Fab-MAT.

3. Anticuerpo Fab-MAT según la reivindicación 1, en el que una mutación en el dominio CH3m1 o en el dominio CH3m2 para formar un ojal estructural es un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de treonina o una combinación de un cambio de un residuo de treonina a un residuo de serina, un cambio de un residuo de leucina a un residuo de alanina, y un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de valina, preferentemente:

(i) en el que la mutación para cambiar un residuo de tirosina a un residuo de treonina cambia la tirosina a treonina en la posición 213 de SEC ID n.° 4 del dominio CH3 de la cadena Fc del anticuerpo Fab-MAT, o

(ii) en el que la combinación de un cambio de un residuo de treonina a un residuo de serina, un cambio de un residuo de leucina a un residuo de alanina y un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de valina es una combinación de un cambio de una treonina a una serina en la posición 172 de SEC ID n.° 8, un cambio de una leucina a una alanina en la posición 174 de SEC ID n.° 8 y un cambio de una tirosina a una valina en la posición 213 de SEC ID n.° 8 del dominio CH3 de la cadena Fc del anticuerpo Fab-MAT.

4. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada uno de los dominios CH3m1 y CH3m2 comprende, además, una mutación para sustituir un residuo aminoácido por una cisteína a fin de fomentar la formación de un enlace disulfuro entre los dominios CH3m1 y CH3m2, preferentemente:

(i) en el que la mutación es un cambio de una serina a una cisteína o un cambio de una tirosina a una cisteína, o

(ii) en el que la mutación es un cambio de un residuo de serina a un residuo de cisteína en la posición 598 de SEC ID n.° 5 del dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo Fab-MAT y/o en el que la mutación es un cambio de un residuo de tirosina a un residuo de cisteína en la posición 155 de SEC ID n.° 8 del dominio CH3 de la cadena Fc del anticuerpo Fab-MAT.

5. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los dominios CH2 de la cadena pesada (a) y la cadena Fc (d) comprenden, cada uno, una o más mutaciones para reducir o eliminar por lo menos una función efectora de Fc,

preferentemente en el que el dominio CH2 de la cadena pesada y el dominio CH2 de la cadena Fc comprenden, cada uno, dos mutaciones para cambiar leucina234 a alanina y para cambiar leucina235 a alanina (numeración UE).

6. Anticuerpo Fab-MAT según la reivindicación 1, que comprende:

(a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 23 a 691 de SEC ID n.° 1,

(b) una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 20 a 244 de SEC ID n.° 2,

(c) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 21 a 235 de SEC ID n.° 3, y

(d) una cadena Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 23 a 253 de SEC ID n.° 4,

o

(a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 23 a 691 de SEC ID n.° 5,

(b) una primera cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 20 a 244 de SEC ID n.° 6,

(c) una segunda cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 21 a 235 de SEC ID n.° 7, y

(d) una cadena Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de residuos aminoácidos 23 a 253 de SEC ID n.° 8.

7. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo Fab-MAT se une a dos antígenos diana diferentes o a dos epítopos diferentes, preferentemente en el que los dos antígenos diana diferentes o los dos epítopos diferentes se seleccionan del grupo de pares de antígenos que consiste en: CD20 y CD3, CD3 y CD19, CD3 y Fc-gamma-RIIIA, CD3 y TPBG, CD3 y Epha10, CD3 y IL-5Ra, CD3 y TASCTD-2, CD3 y CLEC12A, CD3 y prominina-1, CD3 y IL-23R, CD3 y ROR1, CD3 y IL-3Ra, CD3 y PSA, CD3 y CD8, CD3 y glipicano-3, CD3 y FAP, CD3 y EphA2, CD3 y ENPP3, CD3 y CD33, CD3 y CD133, CD3 y EpCAM, CD3 y CD19, CD3 y Her2, CD3 y CEA, CD3 y GD2, CD3 y PSMA, CD3 y BCMA, CD3 y A33, CD3 y B7-H3, CD3 y EGFR, CD3 y P-cadherina, CD3 y HMW-MAA, CD3 y TIM-3, CD3 y CD38, CD3 y TAG-72, CD3 y SSTR, CD3 y FRA, CD16 y CD30, CD64 y Her2, CD 137 y CD20, CD138 y CD20, CD19 y CD20, CD38 y CD20, CD20 y CD22, CD40 y CD20, CD47 y CD20, CD 137 y EGFR, CD137 y Her-2, CD 137 y PD-1, CD 137 y PDL-1, PD-1 y PD-L1, VEGF y PD-L1, Lag-3 y TIM- 3, OX40 y PD-1, TIM-3 y PD-1, TIM-3 y PDL-1, EGFR y DLL-4, VEGF y EGFR, HGF y VEGF, un primer epítopo de<v>E<g>F y un segundo epítopo diferente de VEGF, VEGF y Ang2, EGFR y cMet, PDGF y VEGF, VEGF y DLL-4, OX40 y PD-L1, ICOS y PD-1, ICOS y PD-L1, Lag-3 y PD-1, Lag-3 y PD-L1, Lag-3 y CTLA-4, ICOS y CTLA- 4, CD138 y CD40, CD38 y CD138, CD38 y CD40, CD-8 y IL-6, CSPGs y RGM A, CTLA-4 y BTN02, CTLA-4 y PD-1, IGFl y IGF2, IGFl/2 y Erb2B, IGF-IR y EGFR, EGFR y CD13, Ig F-IR y ErbB3, EGFR-2 y IGFR, un primer epítopo de Her2 y un segundo epítopo diferente de Her2, Factor IXa y Met, factor X y Met, VEGFR-2 y Met, VEGF-A y angiopoyetina-2 (Ang-2), IL-12 y TWEAK, IL-13 y IL-lp, MAG y RGM A, NgR y RGM A, NogoA y RGM A, OMGp y RGM A, PDL-1 y CTLA-4, PD-1 y TIM-3, RGM A y RGM B, Te38 y TNFa, TNFa y Blys, TNFa y CD22, TNFa y a CTLA-4, TNFa y GP130, TNFa y IL-12p40, y TNFa y ligando RANK.

8. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que uno de los dos antígenos diana diferentes al que se une el anticuerpo Fab-MAT es un antígeno,

en el que dicho antígeno se selecciona preferentemente del grupo que consiste en: CD3, CD16 y CD64 expresados sobre la superficie de una célula efectora, y

en el que dicha célula efectora se selecciona preferentemente del grupo que consiste en: un linfocito T, una célula asesina natural (NK), un monocito, un neutrófilo y un macrófago, y

en el que el otro antígeno diana al que se une el anticuerpo Fab-MAT es un antígeno asociado a un trastorno, que se expresa sobre la superficie de una célula diana que se considera perjudicial para un sujeto humano, y

en el que dicha célula diana perjudicial se selecciona preferentemente del grupo que consiste en: una célula tumoral, una célula autorreactiva y una célula infectada por virus.

9. Anticuerpo Fab-MAT según la reivindicación 8, en el que el antígeno asociado a un trastorno que se expresa sobre la superficie de la célula diana perjudicial es un antígeno asociado a tumor expresado sobre una célula tumoral,

preferentemente:

(i) en el que el antígeno asociado a tumor se selecciona del grupo que consiste en: CD19, CD20, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM) y receptor huérfano 1 similar a receptor de tirosina quinasa (ROR1), y/o

(ii) en el que dicha célula tumoral es un linfocito B maligno y más preferentemente en el que dicho linfocito B maligno es una célula de un trastorno de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (LNH), leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores, neoplasmas de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/ linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de linfocitos B, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postransplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes.

10. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, conjugado con un agente seleccionado del grupo que consiste en: un agente terapéutico, un agente de obtención de imágenes y un agente citotóxico, preferentemente:

(i) en el que el agente de obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en: un marcaje radioactivo, un enzima, un marcaje fluorescente, un marcaje luminiscente, un marcaje bioluminiscente, un marcaje magnético, biotina, estreptavidina y avidina,

y

(ii) en el que el agente terapéutico o citotóxico se selecciona del grupo que consiste en: un agente antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente antiangiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.

11. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que dicha composición farmacéutica se prepara para la administración parenteral o no parenteral en un individuo, y

preferentemente para por lo menos un modo de administración seleccionado del grupo que consiste en: las vías parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelular, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, de bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.

12. Polinucleótido aislado o polinucleótidos aislados codificantes de la totalidad de los cuatro polipéptidos de un anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Vector que comprende el polinucleótido aislado o polinucleótidos aislados según la reivindicación 12, preferentemente en el que dicho vector se selecciona del grupo que consiste en: pcADN, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pcADN3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ.

14. Célula huésped aislada que comprende un vector según la reivindicación 13.

15. Célula huésped aislada según la reivindicación 14, que es una célula huésped de mamífero.

16. Método para producir un anticuerpo Fab-MAT que comprende cultivar una célula huésped descrita en la reivindicación 14 o 15 en medio de cultivo bajo condiciones suficientes para producir el anticuerpo Fab-MAT.

17. Anticuerpo Fab-MAT producido de acuerdo con el método según la reivindicación 16.

18. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 17 o una composición farmacéutica según la reivindicación 11 para la utilización a modo de un medicamento.

19. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 17 o una composición según la reivindicación 11 para la utilización en terapia de una enfermedad o trastorno en un individuo, en el que el anticuerpo Fab-MAT se une a un epítopo o antígeno expresado sobre la superficie de una célula de cáncer, una célula autorreactiva o una célula infectada por un virus, en el que la unión del anticuerpo Fab-MAT a la célula de cáncer, a una célula autorreactiva o a una célula infectada por virus proporciona un tratamiento para la enfermedad o trastorno.

20. Anticuerpo Fab-MAT según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 17 o una composición según la reivindicación 11 para la utilización en un método de tratamiento de un sujeto humano para un tumor de linfocitos B malignos, en el que dicho método comprende administrar en el individuo que necesita dicho tratamiento, dicho anticuerpo Fab-MAT que se une a un antígeno sobre una célula efectora, en el que preferentemente la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en: un linfocito T, una célula asesina natural (NK), un monocito, un neutrófilo y un macrófago, y que se une a un antígeno de superficie celular sobre un linfocito B maligno,

preferentemente en el que dicho anticuerpo Fab-MAT se une a un antígeno sobre los linfocitos B malignos de un trastorno de cáncer seleccionado del grupo que consiste en: leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin (LNH), leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores, neoplasmas de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/ linfoma linfocítico de células pequeñas, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de la zona marginal, leucemia de células pilosas, linfoma difuso de linfocitos B, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postransplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico de células grandes.