CN109803682A - 单价不对称串联Fab双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可以结合两个表位或两个抗原的单价、不对称串联Fab双特异性抗体，包含该抗体的组合物、该抗体的用途、制备该抗体的方法、编码该抗体的核酸和包含该核酸的宿主细胞。

Description

单价不对称串联Fab双特异性抗体
发明领域
本发明涉及工程化双特异性抗体、其组合物以及制备和使用这样的双特异性抗体的方法。
发明背景
过去五十年来在新形式抗体工程化方面的努力已经获得了各种双特异性和多特异性结合形式的证明和可用性。形式的多样性包括，例如，单链Fv抗体(scFv，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:5879-5883(1988))、四价IgG-scFv融合体(Coloma和Morrison，Nat.Biotechnol.，15:159-163(1997))、双链抗体(diabody)(Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))、串联scFv分子(参见，例如，Bargou等，Science321，974-977(2008))、四价IgG-样双可变结构域抗体(“DVD-Ig”，Wu等，Nat.Biotechnol.，25:1290-1297(2007))、四价Fab串联免疫球蛋白(“FIT-Ig”)，(WO 2015/103072，Epimab Biotheraupeutics)、二价大鼠/小鼠杂合双特异性IgG(Lindhofer等，J.Immunol.，155:219-225(1995))和双特异性crossmab结合蛋白(参见，例如，WO 2013/026831(Roche Glycart AG)；WO 2014/167022(Engmab AG))。对于可能用于治疗疾病特别感兴趣的是，设计和生产可以结合两个不同表位或抗原的各种工程化双特异性抗体，从而避免了对联合治疗的需要。参见，例如，Spiess等，Molec.Immunol.，67:95-106(2015)，Riethmüller，Cancer Immun.，12:12-18(2012)，Kontermann，Acta PharmacologicaSinica，26(1):1-9(2005)，Marvin等，Acta Pharmacologica Sinica，26(6):649-658(2005)中的综述。
越来越关注开发用于治疗各种癌症的双特异性抗体。特别感兴趣的是可以使用双特异性抗体以使T细胞重新靶向从而杀死各种肿瘤细胞。在这种“T细胞重新靶向”方法的实例中，可以设计双特异性抗体，使其结合靶癌细胞上的表面抗原，并且还结合未成熟T细胞上的T细胞受体(TCR)复合物的激活组分，如CD3。双特异性抗体与两种细胞类型的同时结合在靶细胞和T细胞之间提供暂时的关联(细胞与细胞的突触)，导致攻击靶向的癌细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活。因此，T细胞被人工重新靶向特定的靶癌细胞，但与靶细胞递呈的肽抗原或T细胞的特异性无关，而这些是MHC限制性激活CTL通常所需的。在这种情况下，尤为重要的是，CTL仅在靶细胞向其递呈双特异性抗体时被激活，即，当免疫突触被模拟时，但在只有抗体与T细胞抗原结合时不被激活。
对于将T细胞重新靶向肿瘤细胞一直有意义的双特异性抗体形式是“双特异性T细胞接合物”或“BiTE”抗体，例如，包含通过标准甘氨酸-丝氨酸(G4S)接头连接的两个scFv抗体，其中一个scFv提供肿瘤抗原(例如17-1A肿瘤抗原)的结合位点，而另一个scFv提供T细胞上CD3抗原的结合位点(Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7021-7025(1995))。抗CD3×抗CD19 BiTE抗体，blinatumomab，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗罕见形式的B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。已经研究的可能用于使T细胞重新靶向以附着癌细胞的其他双特异性抗体形式是四价串联双链抗体("TandAb,"Kipriyanov等，J.Mol.Biol.，293:41–56(1999)；Arndt等，Blood，94:2562-2568(1999))和双亲和性重新靶向蛋白("DART"，Johnson等，J.Mol.Biol.,399:436-449(2010))。还研究了双特异性抗体用于细胞毒性效应细胞，如NK细胞和巨噬细胞的重新靶向以攻击肿瘤细胞，例如，Weiner等，Cancer Res.,55:4586-4593(1995)。
目前尚不清楚，在人类受试者的治疗中，用于使T细胞或其他细胞重新靶向以攻击癌细胞的最优选方法是什么。例如，T细胞的激活可以引发强效细胞因子的强烈和持续的释放。这种“细胞因子风暴”不仅会对局部组织产生有害影响，而且对患者也会产生全身性有害影响。因此，重新靶向T细胞或其他细胞以治疗癌症的方法可能涉及在体外，离体或体内进行的一个或多个步骤。
许多双特异性形式，如BiTE、双链抗体、DART和TandAb，使用单链形式，通过肽接头连接不同的可变结构域以实现双特异性。由于这些形式不含Fc区，因此它们通常具有非常短的体内半衰期并且在物理上不稳定(Spiess等(2015)，前引文)。通常，设计含Fc的双特异性形式以增加半衰期并且还可以提供Fc效应子功能。各种这样的含Fc的双特异性形式采用杵臼进入孔洞(knobs-into-holes)(“KiH”)技术(Ridgway等，Protein Eng.，9：617-621(1996))来提高Fc区的组装和稳定性，以及促进来自两个不同抗体的重链CH3结构域之间的杂二聚化，导致双侧异质的双特异性抗体，但是一些形式仍然可能具有其他问题，例如对轻链错配的易感性。轻链错配可能导致预期形式的低效生产。因此，已经设计了各种形式以努力解决该问题。
从上面的讨论中可以明显看出，已经设计和研究了多种双特异性抗体形式作为研发新治疗性抗体的可能形式。然而，到目前为止，还没有一种形式出现，其可以提供一套全面的特性，从而使其自身可以用于研发治疗大多数疾病的新型治疗性抗体。鉴于双特异性结合蛋白递增数量的可能应用以及与目前可用形式相关的多变结果，仍然需要改进的形式，其可以工程化，以解决与研发治疗特定疾病的抗体相关的特定挑战。
发明概述
本发明通过提供串联连接的基于Fab的双特异性抗体解决了上述需要，所述双特异性抗体被工程化以结合两个不同的表位，所述表位可以存在于相同的靶抗原上也可以存在于两个不同的靶抗原上。根据本发明的双特异性抗体具有两个Fab单元，其中每个Fab单元仅结合抗体所结合的表位或抗原中的一个，并且该抗体被称为“单价不对称串联Fab双特异性抗体”或“MAT-Fab双特异性抗体”，或者，简单地说，“MAT-Fab抗体”。本发明的MAT-Fab双特异性抗体，针对该MAT-Fab抗体结合的两个不同表位或两个不同抗原中的每一个而言，是单价的(一个结合位点)。根据本发明的MAT-Fab双特异性抗体是四聚体蛋白，其包含：“重多肽链”(或“MAT-Fab重链”)、“Fc多肽链”(或“MAT-Fab Fc链”)和两条不同的轻链(“MAT-Fab第一轻链”和“MAT-Fab第二轻链”)。
免疫球蛋白的Fab片段由两个组分组成，其共价结合形成抗体结合位点。这两个组分各自是可变结构域-恒定结构域链(VH-CH1或VL-CL)，并且因此Fab的每条V-C链可以描述为Fab结合单元的“一半”。MAT-Fab抗体的重链包含串联融合的第一Fab单元的一半和第二Fab单元的一半，接着是包含铰链区、CH2结构域和C-末端CH3结构域的Fc区。MAT-Fab Fc链包含氨基端铰链区，其与CH2结构域连接，所述CH2结构域转而以与天然IgG分子中相同的顺序连接羧基端CH3结构域。然而，根据本发明的MAT-Fab双特异性抗体的Fc链不含有Fab单元的任何部分、或与其氨基末端铰链区或其羧基末端CH3结构域连接的、对于功能性Fab结合单元的形成是必需的任何其他功能结构域。两条MAT-Fab轻链分别提供各Fab结合单元的另一半(V-C)。设计MAT-Fab轻链和重链，使得每条轻链与重链上相应的V-C结合以形成预期的Fab结合单元，并防止轻链与重链上错误的V-C的干扰错配。由于期望MAT-Fab Fc链与MAT-Fab重链的Fc区二聚化，因此优选除了杵臼进入孔洞(KiH)突变外MAT-Fab Fc链与MAT-Fab重链的相应部分基本上相同，其中设计所述KiH突变以促进所述重链和MAT-Fab Fc链的CH3结构域配对，以使该配对优于两个MAT-Fab重链或两个MAT-Fab Fc链的同源二聚化。任选，MAT-Fab重链和Fc链的CH3结构域可以通过引入半胱氨酸残基进一步有利地修饰以促进另外的二硫键形成，或通过引入一个或多个盐桥进一步有利地修饰，这样的添加导致提高的异二聚体的稳定性。盐桥包括氢键和静电相互作用，如可以在谷氨酸和赖氨酸残基之间发生的盐桥。
本发明的功能性MAT-Fab双特异性抗体的装配，通过每条MAT-Fab轻链与其重链上的相应半个Fab片段结合形成完整的Fab结合单元以及通过重链Fc结构域与MAT-Fab Fc链的Fc结构域的杂二聚化来实现。可以使用一个或多个已知的“杵臼进入孔洞”(“KiH”)技术突变，指导和促进重链的Fc结构域与Fc链的Fc结构域的杂二聚化，其中一条链上的一个Fc区的CH3结构域被突变以形成突出的结构杵臼，该结构不利于相同的含有杵臼的链的同型二聚化。另一条链上的另一个Fc区的CH3结构域被突变以形成结构孔洞，其与具有提供结构杵臼的突变的CH3结构域有效配对，同时不利于与相同的含孔洞的链的同型二聚化(Ridgway等，Protein Eng.，9：617-621(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.，270：26-35(1997))。因此，四条多肽链的组装提供双特异性抗体，其对于每个表位或抗原是单价的并且在结构上不对称，因为所有Fab单元由与单条重链结合的轻链形成。
本发明提供一种单价不对称串联Fab双特异性抗体(“MAT-Fab抗体”、“MAT-Fab”)，其包含四条多肽链(a)，(b)，(c)和(d)：
(a)重多肽链(“重链”)，其中所述重链包含(从氨基端至羧基端)：VLA-CL-VHB-CH1-铰链-CH2-CH3m1，其中：
VLA是直接与CL连接(融合)的人免疫球蛋白轻链可变结构域，CL是人免疫球蛋白轻链恒定结构域，其中VLA-CL是第一Fab结合单元的一半(识别抗原或表位“A”)并与VHB直接连接(融合)，其中VHB是与CH1直接连接(融合)的人免疫球蛋白重链可变结构域，CH1是人免疫球蛋白重链CH1恒定结构域，其中VHB-CH1是第二Fab结合单元的一半(识别抗原或表位“B”)，并且其中VHB-CH1与铰链-CH2直接连接(融合)，其中铰链-CH2是免疫球蛋白重链的铰链-CH2区，并且其中铰链-CH2与CH3m1直接连接(融合)，CH3m1是第一人免疫球蛋白重链CH3恒定结构域，其已经用一个或多个杵臼进入孔洞(KiH)突变进行了突变，从而在所述CH3m1恒定结构域中形成结构杵臼或结构孔洞；
(b)包含VHA-CH1的第一轻链，其中VHA是与CH1直接连接(融合)的人免疫球蛋白重链可变结构域，CH1是人免疫球蛋白重链CH1恒定结构域，并且其中VHA-CH1是所述第一Fab结合单元的另一半；
(c)包含VLB-CL的第二轻链，其中VLB是与CL直接连接(融合)的人免疫球蛋白轻链可变结构域，CL是人免疫球蛋白轻链恒定结构域，并且其中VLB-CL是所述第二Fab结合单元的另一半；和
(d)包含铰链-CH2-CH3m2的Fc链，其中铰链-CH2是免疫球蛋白重链的铰链-CH2区并且其中铰链-CH2连接CH3m2，CH3m2是第二人免疫球蛋白重链CH3恒定结构域，其已经用一个或多个杵臼进入孔洞(KiH)突变进行了突变，从而在所述CH3m2恒定结构域中形成结构杵臼或结构孔洞；
条件是：
在重链的CH3m1结构域已经突变形成结构杵臼时，Fc链的CH3m2结构域突变形成结构孔洞，以促进CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对；和
在重链的CH3m1结构域已经突变形成结构孔洞时，Fc链的CH3m2结构域突变形成结构杵臼，以促进CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对；和
任选地(有或无)，在重链的CH3m1结构域和Fc链的CH3m2结构域两者中包含突变以引入半胱氨酸残基，促进CH3m1结构域与CH3m2结构域配对时的二硫键形成。
再一个可选方案是，通过突变任一个或两个结构域以在CH3m1和CH3m2结构域之间构建一个或多个盐桥，使得结构域之一中的残基能够与另一个结构域中的残基形成氢键和静电相互作用(键合)。例如，但不限于，可以通过如下方式引入盐桥：将CH3m1结构域中的一个残基改变(突变)成谷氨酸或天冬氨酸残基，并将CH3m2结构域中的一个残基改变(突变)成赖氨酸或精氨酸残基，从而使得CH3m1结构域中的谷氨酸或天冬氨酸残基可以与CH3m2结构域中的赖氨酸或精氨酸残基形成氢键和静电相互作用。
上述在重链的CH3m1结构域和Fc链的CH3m2结构域中形成的互补CH3结构域突变将促使杂二聚体的形成相对于同型二聚化更为有利，即，设计相应的CH3结构域突变，以相对于两条Fc链或两条重链的同型二聚化而有利于MAT-Fab Fc链和MAT-Fab重链的优先配对。
上述MAT-Fab双特异性抗体的结构的一个特征在于，所有邻近的免疫球蛋白重链和轻链可变和恒定结构域彼此直接连接，没有间插的氨基酸或肽接头。这样的邻近免疫球蛋白结构域的直接连接(也描述为一个结构域与邻近结构域“直接融合”)消除了潜在免疫原性位点，该位点可能通过引入一个或多个间插氨基酸形成对于给定受试者异源或“外源”并由此被受试者的免疫系统所识别的肽区段而引起。与抗体工程和生产领域的一般理解相反，MAT-Fab重链上的CL结构域和VHB结构域之间不存在接头，并且因此串联Fab结合单元之间不存在接头，并没有不利地影响MAT-Fab抗体中的任一个Fab结合单元的结合活性。
根据上述MAT-Fab双特异性抗体的结构，重链的CH3m1结构域或Fc链的CH3m2结构域包含杵臼进入孔洞(KiH)突变以形成结构杵臼，从而促进包含结构杵臼的CH3结构域之一(即，CH3m1或CH3m2)与包含结构孔洞的另一个CH3结构域(即，CH3m2或CH3m1)配对。优选，进行一个或多个突变，以在重链的CH3m1结构域中形成结构杵臼，用于与包含互补的结构孔洞的CH3m2结构域配对。改变氨基酸残基以在本文中所述的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构杵臼的突变的实例包括，但不限于，苏氨酸残基变成酪氨酸残基，或苏氨酸残基变成色氨酸残基。改变氨基酸残基以在本文中所述的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构杵臼的具体突变的实例包括，但不限于，苏氨酸366残基变成酪氨酸残基(T366Y)和苏氨酸366残基变成色氨酸残基(T366W)。Ridgway等，Protein Eng.，9:617-621(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.，270:26-35(1997)。
根据上述MAT-Fab双特异性抗体的结构，重链的CH3m1结构域或Fc链的CH3m2结构域包含杵臼进入孔洞(KiH)突变以形成结构孔洞，来促进包含结构孔洞的CH3结构域之一(即，CH3m1或CH3m2)与包含结构杵臼的另一个CH3结构域(即，CH3m2或CH3m1)的配对。优选，进行一个或多个突变，以在Fc多肽链的CH3m2结构域中形成结构孔洞，用于与包含结构杵臼的CH3m1配对。改变一个或多个残基以在本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的CH3结构域中形成结构孔洞的突变的实例包括，但不限于，酪氨酸残基变成苏氨酸残基，以及苏氨酸残基变成丝氨酸残基、亮氨酸残基变成丙氨酸残基和酪氨酸残基变成缬氨酸残基的组合。在本发明的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构孔洞的一个优选突变是，酪氨酸407残基变成苏氨酸残基(Y407T)。Ridgway等，Protein Eng.,9:617-621(1996)。在本发明的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构孔洞的一个优选突变组合包括，苏氨酸366残基变成丝氨酸残基(T366S)、亮氨酸368残基变成丙氨酸残基(L368A)和酪氨酸407残基变成缬氨酸残基(Y407V)。Atwell等，J.Mol.Biol.,270:26-35(1997)。
在另一个实施方案中，，可以在重链的CH3m1结构域和Fc多肽链的CH3m2结构域中进行进一步突变以提供半胱氨酸残基，如从丝氨酸残基变成半胱氨酸残基或从酪氨酸残基变成半胱氨酸，从而在本发明的MAT-Fab双特异性抗体的重链CH3m1结构域与Fc多肽链的CH3m2结构域配对时形成另外的二硫键。半胱氨酸插入的一个特定非限制性实例是，在互补链中，丝氨酸354置换成半胱氨酸(S354C)和酪氨酸349置换成半胱氨酸(Y349C)。Merchant等，Nat.Biotechnol.，16:677-681(1998)。
在优选实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合选自细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体的一个或多个靶抗原。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体能够调节一个或多个靶抗原的生物功能。更优选，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体能够抑制或中和一个或多个靶抗原。
在本发明的一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体能够结合两种不同的细胞因子。这样的细胞因子选自：淋巴因子、单核因子和多肽激素。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合至少一个在细胞表面上表达的靶抗原。更优选，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合两个细胞表面抗原。所述两个细胞表面抗原可以在同一细胞或相同类型的两个细胞上。然而，更优选，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合第一细胞的表面上表达的抗原和第二细胞的表面上表达的第二抗原，其中所述第一和第二细胞是不同类型的细胞。优选，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合在免疫系统的效应细胞上表达的第一细胞表面抗原，并且还结合在以下细胞的表面上表达的第二细胞表面抗原，所述细胞被认为对个体有害并且因此期望消除或实质性减少其群体。效应细胞包括T细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。对需要治疗的个体是有害的或可被认为有害的并且因此可以被本文中所述的MAT-Fab抗体结合的细胞包括，但不限于，癌细胞、自体反应性细胞和病毒感染的细胞。因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞表面上表达的抗原并结合癌细胞、自体反应性细胞或病毒感染的细胞的表面上表达的抗原。
在优选实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合选自以下抗原对的一对靶抗原：CD20和CD3、CD3和CD19、CD3和Fc-γ-RIIIA、CD3和TPBG、CD3和Epha10、CD3和IL-5Rα、CD3和TASCTD-2、CD3和CLEC12A、CD3和Prominin-1、CD3和IL-23R、CD3和ROR1、CD3和IL-3Rα、CD3和PSA、CD3和CD8、CD3和Glypican3、CD3和FAP、CD3和EphA2、CD3和ENPP3、CD3和CD33、CD3和CD133、CD3和EpCAM、CD3和CD19、CD3和Her2、CD3和CEA、CD3和GD2、CD3和PSMA、CD3和BCMA、CD3和A33、CD3和B7-H3、CD3和EGFR、CD3和P-钙粘蛋白、CD3和HMW-MAA、CD3和TIM-3、CD3和CD38、CD3和TAG-72、CD3和SSTR、CD3和FRA、CD16和CD30、CD64和Her2、CD137和CD20、CD138和CD20、CD19和CD20、CD38和CD20、CD20和CD22、CD40和CD20、CD47和CD20、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、PD-1和PD-L1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、VEGF和EGFR、HGF和VEGF、VEGF的第一表位和VEGF的不同第二表位、VEGF和Ang2、EGFR和cMet、PDGF和VEGF、VEGF和DLL-4、OX40和PD-L1、ICOS和PD-1、ICOS和PD-L1、Lag-3和PD-1、Lag-3和PD-L1、Lag-3和CTLA-4、ICOS和CTLA-4、CD138和CD40、CD38和CD138、CD38和CD40、CD-8和IL-6、CSPGs和RGMA、CTLA-4和BTN02、CTLA-4和PD-1、IGFl和IGF2、IGFl/2和Erb2B、IGF-IR和EGFR、EGFR和CD13、IGF-IR和ErbB3、EGFR-2和IGFR、Her2的第一表位和Her2的第二不同表位、因子IXa和Met、因子X和Met、VEGFR-2和Met、VEGF-A和促血管生成素-2(Ang-2)、IL-12和TWEAK、IL-13和IL-lβ、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、RGM A和RGM B、Te38和TNFα、TNFα和Blys、TNFα和CD22、TNFα和a CTLA-4、TNFα和GP130、TNFα和IL-12p40、以及TNFα和RANK配体。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞上的CD3。效应细胞的实例包括，但不限于，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞上表达的表面抗原。优选，所述表面抗原选自：CD3、CD16(也称为“FcγRIII”)和CD64(也称为“FcγRI”)。更优选，MAT-Fab抗体结合T细胞上表达的CD3、自然杀伤(NK)细胞上表达的CD16、或巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞上表达的CD64。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合是肿瘤相关抗原的表面抗原。优选的MAT-Fab实施方案可以识别肿瘤相关抗原，如选自但不限于以下的那些：CD19、CD20、人表皮生长因子受体2(“Her2”)、癌胚抗原(“CEA”)、表皮细胞粘附分子(“EpCAM”)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞上将激活该效应细胞的抗原并结合恶性B细胞上的细胞表面抗原。优选，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞上将激活该效应细胞的抗原并结合选自以下的癌症疾病的恶性B细胞上的细胞表面抗原：急性淋巴母细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤。
在优选实施方案中，MAT-Fab双特异性抗体结合靶抗原CD3和CD20。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞上表达的表面抗原和肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原。在优选实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合T细胞上的CD3和恶性B细胞上的CD20。更优选，MAT-Fab双特异性抗体在其外侧(N-端)Fab结合单元结合CD20并在其内侧(近C-端)Fab结合单元结合CD3。
在优选实施方案中，MAT-Fab双特异性抗体结合CD20和CD3并包含四条多肽链，其包含表1-4中的氨基酸序列或表5-8中的氨基酸序列。
在再另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合一种或两种细胞因子、细胞因子相关蛋白或细胞因子受体。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合一种或多种趋化因子、趋化因子受体和趋化因子相关蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合T细胞上的CD3以及源自病毒包膜蛋白的抗原或表位，其中所述病毒包膜蛋白递呈在病毒感染的细胞(如HIV感染的CD4+T细胞)表面上。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体还能够结合受体，包括趋化因子受体、单核因子受体和多肽激素受体。
在另一个实施方案中，上述MAT-Fab双特异性抗体是糖基化的。优选，所述糖基化是人糖基化模式。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的一条、两条、三条或全部四条多肽链的一个或多个分离核酸。在优选实施方案中，所述一个或多个核酸编码包含以下表1-4中所示的氨基酸序列或表5-8中所示的氨基酸序列的四条多肽链。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的一个、两个、三个或全部四个多肽的一个或多个分离核酸的载体。载体可以是自主复制载体、或可以是将载体中存在的该分离核酸整合至宿主细胞基因组中的载体。还可以将编码MAT-Fab抗体的一条、两条、三条或全部四条多肽链的分离核酸插入用于进行各种遗传分析、用于表达MAT-Fab抗体、或用于表征或改善本文中所述的MAT-Fab抗体的一个或多个特性的载体中。
在另一个实施方案中，根据本发明的载体可以用于复制分离的核酸，以提供更多核酸编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的一个或多个多肽。
在另一个实施方案中，根据本发明的载体可以用于表达编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的一条、两条、三条或全部四条多肽链的分离核酸。用于克隆和表达本文中所述的核酸的优选载体包括，但不限于，pcDNA、pTT(Durocher等，Nucleic Acids Res.，30(2e9):1-9(2002))、pTT3(具有另外的多克隆位点的pTT)、pEFBOS(Mizushima和Nagata，Nucleic Acids Res.，18(17):5322(1990))、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO和pBJ。
本发明还提供包含上述载体的分离宿主细胞。包含本文中所述载体的所述分离宿主细胞可以是分离的原核细胞或分离的真核细胞。
在本发明的一个实施方案中，包含本文中所述载体的分离原核宿主细胞是细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以是革兰氏阳性、革兰氏阴性或革兰氏可变细菌细胞。优选，包含本文中所述载体的细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌。甚至更优选，包含本文中所述载体的细菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
在本发明的一个实施方案中，包含本文中所述载体的分离宿主细胞是真核宿主细胞。优选的包含本文中所述载体的分离真核宿主细胞可以包括，不限于，哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。优选，包含本文中所述载体的分离哺乳动物宿主细胞选自：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。优选的包含本文中所述载体的分离真菌宿主细胞选自：曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和假丝酵母属(Candida)。更优选，包含本文中所述载体的酵母属宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
还提供生产本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的方法，包括：在足以产生MAT-Fab双特异性抗体的条件下，培养包含载体的分离宿主细胞，所述载体包含编码MAT-Fab双特异性抗体分子的全部四条多肽链的核酸。
本发明的另一个方面是通过上述方法产生的MAT-Fab双特异性抗体。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体可以与另外的化合物缀合，例如，以相似于其他缀合抗体的方式，缀合在配对的CH3m1和CH3m2结构域的任一者或两者的内部或C-末端。这样可以与MAT-Fab双特异性抗体缀合的化合物包括，但不限于，细胞毒性剂、成像剂和治疗剂。可以与MAT-Fab双特异性抗体缀合的优选成像剂包括，不限于，放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、生物素、链霉亲和素和亲和素。可以与本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体缀合的放射性标记包括，但不限于，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、131I、177Lu、166Ho和153Sm。可以与本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体缀合的优选细胞毒性或治疗性化合物包括，但不限于，抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和凋亡剂。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体可以是结晶的MAT-Fab抗体，其保留对由非结晶的MAT-Fab抗体结合的表位或抗原的结合活性。当给予个体时，这种结晶的MAT-Fab双特异性抗体还可以提供MAT-Fab的无载体受控释放。与非结晶形式相比，给予个体时，结晶的MAT-Fab双特异性抗体还可以呈现出更长的体内半衰期。
本发明的一个实施方案提供了用于结晶MAT-Fab双特异性抗体释放的组合物，其中所述组合物包含如本文中所述的结晶MAT-Fab双特异性抗体、赋形剂成分和至少一种聚合物载体。优选，赋形剂成分选自：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。优选，聚合物载体是选自以下的一种或多种的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二噁烷酮)；聚(乙二醇)、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸酐/烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖，其混合物、及其共聚物。
另一个实施方案提供一种用于治疗哺乳动物的方法，包括将有效量的包含如上所述的结晶MAT-Fab双特异性抗体的组合物施用于哺乳动物的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗个体疾病或疾患的方法，包括将MAT-Fab双特异性抗体施用于个体，其中所述MAT-Fab双特异性抗体结合一个或两个被认为对个体有害的表位或抗原，其中所述一个或两个表位或抗原与MAT-Fab双特异性抗体的结合提供对疾病或疾患的治疗。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体在治疗疾患的以下方法中特别有用，所述方法包括重新靶向(或“募集”)效应细胞(如T细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞)来攻击特定靶细胞，其中所述靶细胞被认为对人受试者有害并且因此期望消除或实质性减少该有害靶细胞的群体。这样的有害靶细胞的优选实例是肿瘤细胞，例如，血液(包括淋巴)肿瘤细胞和实体肿瘤细胞(Satta等，Future Oncol.，9(4):527-539(2013))；自身免疫疾病细胞，如自体反应性B细胞(Zocher等，Mol.Immunol.，41(5):511-518(2004))；以及病毒感染的细胞(如HIV感染的CD4+T细胞(Sung等，J.Clin.Invest.，125(11):4077-4090(2015))。在本发明的重新靶向方法中，MAT-Fab抗体结合效应细胞表面上表达的抗原以及对人受试者有害的靶细胞表面上表达的抗原，其中MAT-Fab抗体与效应细胞上的抗原以及与有害靶细胞上的抗原的结合介导了期望的或有益的细胞-细胞相互作用，例如，其中MAT-Fab双特异性结合可以激活效应细胞以攻击有害靶细胞。本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体与效应细胞上的单个靶抗原以及有害靶细胞上的单个靶抗原的同时结合，可以有利地激活效应细胞来攻击靶细胞，而且也不引发大量且不合希望的细胞因子释放(“细胞因子风暴”)；否则使用同时结合两个或多个效应细胞抗原的抗体，这样的细胞因子释放将在效应细胞抗原二聚化(即，效应细胞抗原交联)时可能发生。
因此，本发明提供了一种治疗人受试者疾患的方法，包括将本文中所述的结合效应细胞上的抗原和结合对人受试者有害的靶细胞上表达的疾患相关抗原的MAT-Fab双特异性抗体施用于人受试者的步骤，其中MAT-Fab双特异性抗体与效应细胞和有害靶细胞两者的结合引起治疗上有益的效应细胞和靶细胞之间的细胞-细胞相互作用。对于治疗许多疾患，这样有益的细胞-细胞相互作用将包括激活效应细胞以攻击有害靶细胞。在其他情况中，有益效果可以是调理(opsonize)和/或清除所结合的靶细胞中的一者或两者。
优选，本发明的用于重新靶向效应细胞来攻击有害靶细胞的方法包括：将效应细胞和有害靶细胞接触本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体，所述抗体结合效应细胞上表达的选自以下的抗原：CD3、CD16(也称为“FcγRIII”)和CD64(也称为“FcγRI”)。更优选，所述方法包括结合T细胞上表达的CD3、自然杀伤(NK)细胞上表达的CD16、或巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞上表达的CD64的MAT-Fab抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种在需要治疗的人受试者中治疗肿瘤的方法，包括将结合效应细胞上的抗原并且还结合靶肿瘤细胞上的抗原的MAT-Fab抗体施用于人受试者，其中MAT-Fab抗体与效应细胞和靶肿瘤细胞的结合激活效应细胞来攻击肿瘤细胞。优选，效应细胞上的抗原是T细胞上表达的CD3。
在优选实施方案中，在需要治疗的人受试者中治疗特征在于肿瘤细胞的癌症的方法包括：重新靶向效应细胞来攻击靶肿瘤细胞，包括使效应细胞和靶肿瘤细胞接触本文中所述的结合效应细胞上的抗原和靶肿瘤细胞上的抗原的MAT-Fab双特异性抗体，其中靶肿瘤细胞上的抗原是选自以下的肿瘤相关抗原：CD19、CD20、人表皮生长因子受体2(“Her2“)、癌胚抗原(“CEA”)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗人受试者的B细胞相关肿瘤的方法，包括将MAT-Fab双特异性抗体施用于需要这样的治疗的个体，所述抗体结合效应T细胞上将激活该T细胞的抗原且结合恶性B细胞上的抗原。优选，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合癌症疾患的恶性B细胞上的抗原，所述癌症疾患选自：急性淋巴母细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤。
在特别优选的实施方案中，所述的用于治疗人受试者的B细胞相关肿瘤的方法包括：施用本文中所述的结合T细胞上的CD3和结合恶性B细胞上的CD20的MAT-Fab双特异性抗体。更优选，所述MAT-Fab双特异性抗体在其外侧(N-端)Fab结合单元结合CD20并在其内侧(近C-端)Fab结合单元结合CD3。
在另一个实施方案中，根据本发明的治疗疾患的方法可以包括在离体程序中将MAT-Fab抗体接触效应细胞和有害靶细胞，其中将从需要治疗的人受试者提取的效应细胞在人受试者体外接触MAT-Fab抗体，并且在允许MAT-Fab抗体结合效应细胞的一段时间后，将结合MAT-Fab抗体的效应细胞施用于人受试者，由此结合效应细胞的MAT-Fab抗体的复合物随后可以在人受试者体内寻找结合有害靶细胞，如肿瘤细胞。在另一个实施方案中，将从需要治疗的人受试者提取的效应细胞和肿瘤细胞在人受试者体外接触MAT-Fab抗体，并且在允许MAT-Fab抗体结合效应细胞和肿瘤细胞的一段时间后，将结合MAT-Fab抗体的效应细胞和肿瘤细胞施用于人受试者。
在另一个实施方案中，还可以将MAT-Fab双特异性抗体工程化，以将细胞毒性剂递送至有害靶细胞，如肿瘤细胞。在这个实施方案中，MAT-Fab抗体的一个Fab结合单元含有针对有害靶细胞上的靶抗原的结合位点，而另一个Fab结合单元含有针对细胞毒性剂的结合位点。本发明这样的工程化MAT-Fab抗体可以与细胞毒性剂混合或接触，所述细胞毒性剂将在抗体的工程化的Fab结合单元结合抗体。随后可以将携带结合的细胞毒性剂的MAT-Fab抗体接触有害靶细胞，以将细胞毒性剂递送至有害靶细胞。这样的递送系统在如下情况特别有效：MAT-Fab抗体结合有害靶细胞并随后连同结合的细胞毒性剂被内在化至细胞中，由此细胞毒性剂可以在有害靶细胞内部释放时。
本发明提供包含本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体和药物学上可接受载体的药物组合物。包含MAT-Fab双特异性抗体的药物组合物还可以包含另外的选自治疗剂、成像剂和细胞毒性剂的试剂。另外，根据本文中所述的离体方法，根据本发明的药物组合物可以包含与效应细胞或细胞毒性剂复合的MET-Fab双特异性抗体。
在另一个实施方案中，包含本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的优选药物组合物可以进一步包含一种或多种用于治疗疾患的其他治疗活性化合物。可以并入本发明的药物组合物中的优选的其他治疗活性化合物的实例包括，但不限于，抗生素、抗病毒化合物、抗癌化合物(除了MAT-Fab双特异性抗体以外)、镇静剂、刺激剂、局部麻醉剂、皮质类固醇、止痛剂、抗组胺药、非类固醇抗炎药(NSAID)，及其合适的组合。
在另一个实施方案中，以上公开的药物组合物可以制备用于通过选自以下的至少一种方式施用于个体：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、动脉内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和透皮。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体可以用于本领域中可用于检测、定量或分离靶抗原或表达靶抗原的细胞的各种免疫检测分析试验或纯化形式。这样的分析试验和形式包括，但不限于，免疫印迹分析(例如，Western印迹)；免疫亲和性色谱，例如，其中将MAT-Fab双特异性抗体吸附或连接至色谱树脂或珠子；免疫沉淀分析；免疫芯片；组织免疫组织化学分析；流式细胞术(包括荧光激活细胞分选)；夹层免疫分析；免疫芯片，其中将MAT-Fab抗体固定或结合于基质；放射性免疫分析(RIA)；酶免疫分析(EIA)；酶联免疫吸附分析(ELISA)；竞争性-抑制免疫分析；荧光极化免疫分析(FPIA)；酶倍增免疫分析技术(EMIT)；生物发光共振能量转移(BRET)；和均相化学发光分析。本发明公开内容提供利用质谱的方法，所述方法包括但不限于MALDI(基质辅助激光解吸/电离)或SELDI(表面增强激光解吸/电离)，其包括结合靶抗原或抗原或抗原片段上的表位的MAT-Fab抗体。
本发明进一步提供了用于检测样品(例如，混合物、组合物、溶液或生物样品)中的抗原的方法，包括将样品接触本发明的MAT-Fab双特异性抗体，所述抗体结合存在于或怀疑存在于样品中存在的靶抗原(或表位)。可以用作本发明免疫检测分析试验的样品的生物样品包括，不限于，全血、血浆、血清、各种组织提取物、泪液、唾液、尿液和其他体液。
MAT-Fab双特异性抗体可以用可检测物质直接或间接标记，以促进检测结合的或未结合的MAT-Fab双特异性抗体。在优选实施方案中，检测分析试验中有用的MAT-Fab双特异性抗体是工程化的，其中Fab结合单元中的一个结合产生可检测信号的化合物，而另一个Fab结合单元结合存在于或怀疑存在于样品中的靶抗原(或表位)。合适的可检测物质是本领域中可获得的并且包括，不限于，各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。本发明的免疫检测分析试验中有用的优选酶是接触一种或多种试剂时能够提供可检测信号的酶。这样的酶包括，但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶、合适的辅基复合物的实例包括，不限于，链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。可以用于本发明的免疫检测分析试验中的合适的荧光材料的实例包括，但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白。可以用于本发明的免疫检测分析试验中的发光材料的实例是鲁米诺。可以用于本发明的免疫检测分析试验中的合适的放射性物质的实例包括，但不限于，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
由于二聚化Fc区的存在，本发明的MAT-Fab双特异性抗体还可以以与天然抗体分子(如IgG抗体)类似的方式在其Fc区中被标记。
附图简述
图1A显示MAT-Fab双特异性抗体的结构域结构。图1B描绘插入表达载体构建体中的结构基因的排列，所述构建体用于重组表达装配形成本发明的MAT-Fab结合蛋白的各条多肽链。图1C描绘用于组成图1A中所示的MAT-Fab结合蛋白的四条表达的多肽链(1-4)，显示了每条链从N-末端至C-末端的免疫球蛋白样结构域的顺序。
图2显示，使用大小排阻色谱(SEC)分析按照实施例1中所述制得的MAT-Fab KiH1双特异性抗体所获得的谱图和相关数据。SEC分析揭示，在蛋白A色谱的单步纯化后，98.19％的MAT-Fab KiH1抗体制备物作为单一物质存在，表明四聚体蛋白产物的同质性。
图3显示，使用大小排阻色谱(SEC)分析按照实施例1中所述制得的MAT-Fab KiH2双特异性抗体所获得的谱图和相关数据。SEC分析揭示，通过蛋白A色谱的单步纯化后，95.7％的MAT-Fab KiH2抗体制备物作为单一物质存在，表明四聚体蛋白产物的同质性。
图4显示，按照实施例1中所述，使用荧光激活细胞分选(FACS)分析MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2双特异性抗体结合Raji细胞表面上表达的CD20的能力的结果。
图5显示，按照实施例1中所述，使用荧光激活细胞分选(FACS)分析MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2双特异性抗体结合Jurkat细胞表面上表达的CD3的能力的结果。
图6显示，在B细胞耗尽试验的第2天，分析MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2双特异性抗体结合Raji细胞(B细胞)上的CD20并诱导T细胞介导的B细胞凋亡的能力的结果。图释：“奥伐单抗(Ofatumumab)”是完全人抗CD20单克隆抗体；“CD3 mAb”是抗CD3单克隆抗体；MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2如实施例1中所述；“奥伐单抗/CD3 mAb”是抗CD20奥伐单抗和抗CD3 mAb的等份混合物。到试验的第2天，两种MAT-Fab双特异性抗体都能够诱导T细胞介导的B细胞凋亡。
发明详述
对于许多免疫受体，细胞激活通过单价结合相互作用的交联来完成。交联机制通常通过抗体/抗原免疫复合物来介导，或通过效应细胞与靶细胞接合来介导。例如，介导细胞杀灭的低亲和性激活Fcγ受体(FcγR)，如CD16(FcγRIIIa)和CD32a(FcγRIIa)，单价地结合抗体Fc区。尽管单价结合不导致细胞信号传导，但在效应细胞与靶细胞接合(engagement)后，受体可以在细胞表面上交联并成簇，导致激活。在T细胞上，CD3激活发生在其相关的T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞上负载抗原的主要组织相容性复合物(MHC)在期望的细胞-细胞突触中接合时。靶向CD3的二价抗体可以引发大量细胞因子释放(常常称为“细胞因子风暴“)，并且随之而来的毒性对抗CD3抗体作为治疗药物的研发已经构成了挑战。相反，双特异性形式中的CD3的单价结合产生低得多的T细胞激活水平。对于二价单特异性抗体，这种生物学的结果是受体的二价交联可以导致在没有任何靶细胞的情况下效应细胞的非特异性激活。因此，当治疗目标是免疫受体的共接合时，单价结合通常是高度优于二价结合的。这种模式与典型二价抗体以及大多数的多特异性但多价抗体形式(如双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)和Fab串联免疫球蛋白(FIT-Ig))的使用，是不相容的。
本发明通过提供双特异性抗体形式提供了对上述这些问题的解决方案，所述双特异性抗体形式包含串联Fab重链与截短的Fc链的杵臼进入孔洞(KiH)Fc区杂二聚化，其能够实现两个不同抗原或表位的同时单价结合。本发明的双特异性抗体尤为适用于T细胞重新靶向，作为治疗癌症的机制。
本发明提供了包含串联融合的两个Fab结合单元的工程化双特异性抗体，并且其中一个Fab结合单元结合的表位或抗原不同于另一个Fab结合单元结合的表位或抗原。因此，将根据本发明的双特异性抗体相对于其结合的每个表位或抗原称为“单价的”。此外，尽管本发明的双特异性抗体包含二聚化的免疫球蛋白Fc恒定区(即，二聚化的铰链-CH2-CH3)，但串联Fab结合单元的各一半存在于单个多肽臂上，仅从Fc区的二聚化链之一伸出(参见图1A)。因此，根据本发明的双特异性抗体相对于结合的每个表位或抗原而言在结合位点上是“单价的”；就Fab单元相对于二聚化Fc区的位置而言，是“不对称的”；并且具有“串联”Fab结合单元，这些单元通过共同重链以N-末端到C-末端方向彼此直接连接。因此，根据本发明的双特异性抗体还可以称为“单价、不对称、串联Fab双特异性抗体”。对于本发明的双特异性抗体，可替换但同义的术语是“MAT-Fab双特异性抗体”、“MAT-Fab抗体”或简单地“MAT-Fab”。
如本文中使用的“晶体”和“结晶的”是指抗体，包括本发明的MAT-Fab双特异性抗体，以晶体形式存在。晶体是固态物质的一种形式，其不同于其他形式，例如无定形固态或液晶态。晶体由原子、离子、分子(例如，蛋白质，如抗体)或分子组装物(例如，抗原/抗体复合物)的规则、重复性三维阵列组成。这些三维阵列根据本领域公知的特定数学关系排列。在晶体中重复的基本单元或构件称为不对称单元。在符合给定的、十分明确的晶体对称性的排列中，不对称单元的重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有三个维度上的规律平移，晶胞的重复提供了晶体。参见Giegé等，第1章，见Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，第2版，Ducruix和Giegé编辑，(Oxford UniversityPress，New York，1999)pp.1-16。本发明的结晶MAT-Fab双特异性抗体可以根据本领域已知的方法制备，例如Shenoy及其同事在国际公开号No.WO 2002/072636中描述的方法，该文献按引用并入本文中。
除非本文另有定义，否则本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。然而，如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另外指出，“或”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不是限制性的。此外，除非另有明确说明，否则诸如“元件”或“组件”等术语涵盖包含一个单元的元件和组件以及包含一个以上子单元的元件和组件。
一般，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的用语和技术，是本领域已知和常用的。除非另有说明，本发明的方法和技术通常可以常规方法实施，这些常规方法是本领域熟知的并且在本说明书引用和讨论的各种一般性的和更具体的参考文献中进行了描述。酶促反应和纯化技术可以按照本领域通常的方式、根据制造商的说明书或如本文所述实施。与本文中描述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学相关的术语和实验室程序和技术，是本领域已知和常用的。标准技术包括用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗的技术。
如本文中使用的，术语“疾患”和“疾病”是同义的，并且是指病理生理状况。
如本文中使用的，表述“其中细胞上的抗原(或抗原活性)是有害的疾患(或疾病)”旨在包括这样的疾患，其中抗原在患有该疾患的人受试者中的存在已经被证实是或怀疑是造成该疾患的病理生理学的原因，或者已经被证明是或怀疑是导致疾患恶化的一个因素。因此，其中抗原或抗原活性是有害的疾患是这样的疾患，在该疾患中期望降低该抗原或抗原活性来减轻疾患的一种或多种症状或进展。这样的疾患可表现为，例如，在患有该疾患的人受试者的血液或其他生物流体中抗原浓度的提高。
除非另外表明，术语“肿瘤”和“癌症”是同义的。癌症或肿瘤可以是血液癌症或肿瘤(包括淋巴细胞)或实体癌症或肿瘤。
术语“个体”和“受试者”是指人受试者。
如本文中使用的，术语“Fab”、“Fab片段”或“Fab结合单元”是同义的，并且是指通过如下多肽链的缔合形成的免疫球蛋白(抗原)表位结合单元，所述多肽链为包含连接免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL结构域)的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)的多肽链和包含连接免疫球蛋白重链恒定结构域(CH1结构域)的免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)的多肽链，其中VL结构域与VH结构域配对形成表位(抗原)结合位点，而CL结构域与CH1结构域配对。因此，如本文中所述的，术语“Fab”、“Fab片段”和“Fab结合单元”包括由天然免疫球蛋白(如IgG)的木瓜蛋白酶消化产生的天然Fab片段，其中木瓜蛋白酶消化产生两个Fab片段，所述Fab片段包括包含VH-CH1的重链片段和包含VL-CL的轻链片段。如本文中使用的，该术语还包括重组Fab，其中选定的VL结构域连接选定的CL结构域，并且选定的VH结构域连接选定的CH1结构域。此外，如本文中所述的，术语还包括“交叉Fab”类型，其中VH-CH1作为轻链多肽存在，而VL-CL存在于较大的重链上。特别地，在本发明的MAT-Fab双特异性抗体中，N-端(外侧)Fab结合单元是这种“交叉Fab”，其中VL-CL存在于重多肽链上，并且与包含VH-CH1的轻链配对。相反，内侧(近C-端)Fab结合单元包含在重链上的VH-CH1，其与包含VL-CL的轻链配对。本发明的MAT-Fab双特异性抗体中的这种外侧和内侧Fab结合单元排列可以有利地促进每个VL-CL与其对应的VH-CH1的正确结合以形成两个功能性Fab结合单元，并且阻碍非功能性结合。
本文中被描述为“包含”一个或多个述及的元素或步骤的组合物或方法是开放式的，意味着所述的元素或步骤是必需的，但可以在组合物或方法的范围内添加其他元素或步骤。为了避免冗长，还应理解，被描述为“包含”(或“其包含”)一个或多个所述元素或步骤的任何组合物或方法也涵盖如下相应的、更为限制的组合物或方法，即，该组合物或方法“基本上由相同的所述元素或步骤组成”(或“其基本上由相同的所述元素或步骤组成”)，这意味着该组合物或方法包括所述的必需元素或步骤，并且还可以包括不会实质性影响组合物或方法的基础特征和新颖性特征的其它元素或步骤。还应理解，在本文中描述为“包含”一个或多个所述元素或步骤或“基本上由”一个或多个所述元素或步骤“组成”的任何组合物或方法，也涵盖如下相应的、更为限制的封闭式组合物或方法，即，该组合物或方法“由所述元素或步骤组成”(或“其由所述元素或步骤组成”)以排除任何其它未述及的元素或步骤。在本文公开的任何组合物和方法中，对于任何述及的必要元素或步骤，均可以用其已知的或公开的等同物替代该元素或步骤。
元素或步骤“选自”后随的一列元素或步骤，是指后随列表中的一个或多个元素或步骤，包括所列元素或步骤中的两个或更多个的组合。
MAT-Fab双特异性抗体的组织和产生
根据本发明的单价不对称串联Fab双特异性抗体(“MAT-Fab”双特异性抗体)包含：
(a)重多肽链(“重链”)，其中所述重链包含(从氨基(N-)端到羧基(C-)端)：VLA-CL-VHB-CH1-铰链-CH2-CH3m1，其中：VLA是连接CL的人免疫球蛋白轻链可变结构域，CL是人轻链恒定结构域，其中VLA-CL是第一Fab结合单元的一半(能够结合抗原或表位“A”)并且与VHB直接连接(融合)，其中VHB是连接CH1的人免疫球蛋白重链可变结构域，CH1是人免疫球蛋白重链CH1恒定结构域，其中VHB-CH1是第二Fab结合单元的一半(能够结合抗原或表位“B”)，并且其中VHB-CH1连接铰链-CH2，其中铰链-CH2是免疫球蛋白重链的铰链-CH2区，并且其中铰链-CH2连接CH3m1，CH3m1是第一人免疫球蛋白重链CH3恒定结构域，其已经用一个或多个杵臼进入孔洞(KiH)突变进行了突变以在所述CH3m1恒定结构域中形成结构杵臼或结构孔洞；
(b)包含VHA-CH1的第一轻链，其中VHA是连接CH1的人免疫球蛋白重链可变结构域，CH1是人免疫球蛋白重链CH1恒定结构域，并且其中VHA-CH1是所述第一Fab结合单元的另一半(能够结合抗原或表位“A”)；
(c)包含VLB-CL的第二轻链，其中VLB是连接CL的人免疫球蛋白轻链可变结构域，CL是人免疫球蛋白轻链恒定结构域，并且其中VLB-CL是所述第二Fab结合单元的另一半(能够结合抗原或表位“B”)；和
(d)包含铰链-CH2-CH3m2的Fc链，其中铰链-CH2是免疫球蛋白重链恒定区的铰链-CH2区并且其中铰链-CH2连接CH3m2，CH3m2是第二人免疫球蛋白重链CH3恒定结构域，其已经用一个或多个杵臼进入孔洞(KiH)突变进行了突变，从而在所述CH3m2恒定结构域中形成与重链(a)的CH3m1结构域的相应结构孔洞或结构杵臼互补的结构杵臼或结构孔洞；
条件是：
在重链(a)的CH3m1结构域已经突变形成结构杵臼时，Fc链(d)的CH3m2结构域突变形成互补结构孔洞，以促进CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对；或
在重链(a)的CH3m1结构域已经突变形成结构孔洞时，Fc链(d)的CH3m2结构域突变形成互补结构杵臼，以促进CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对；和
任选地(即，有或无)，在CH3m1结构域和CH3m2结构域两者中都包含突变以引入半胱氨酸残基，从而在CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对中促进二硫键形成。
重链的Fc区与Fc链可以任选修饰来调节Fc效应子功能。例如，已知CH2结构域的234LeuLeu235突变成例如234AlaAla235(EU编号)能降低或消除ADCC/CDC效应子功能。这样的改变在下文实施例的MAT-Fab中有举例说明，其中LeuLeu→AlaAla转换在MAT-Fab(KiH1)重链和Fc链以及MAT-Fab(KiH2)重链和Fc链中的铰链-CH2区的残基18-19处进行(即，参见，表1中SEQ ID NO:1的478AlaAla479和表5中SEQ ID NO:5的478AlaAla479；以及表4中SEQ ID NO:4的40AlaAla41和表8中SEQ ID NO:8的40AlaAla41)。
本文中所述MAT-Fab双特异性抗体的结构的一个特征在于，所有邻近的免疫球蛋白重链和轻链可变和恒定结构域彼此直接连接，没有间插的合成氨基酸或肽接头。邻近免疫球蛋白结构域的直接连接消除了可能由引入一个或多个间插氨基酸形成的潜在免疫原性位点。对于特征在于串联结合结构域的工程化抗体分子，本领域的共同理解是：为了允许相邻结合位点同时与抗原结合并避免在空间上彼此干扰，间插柔性肽接头(例如GGGGS及其重复序列)是必需的。与这样的教导相反，MAT-Fab形式中不存在任何接头，这并未对MAT-Fab抗体的任一个Fab结合单位的结合活性产生不利影响。特别地，已经发现，在重多肽链上的CL和VHB之间加入接头不会增强任一Fab结合单元的结合活性。这意味着，如上所述的MAT-Fab抗体的结构组织固有地提供了最佳的灵活性和三维构型，使得每个Fab结合单元都可接近并且可以结合其预期的抗原或表位。
根据上述的MAT-Fab双特异性抗体的结构，MAT-Fab重链的CH3m1结构域或MAT-FabFc链的CH3m2结构域包含杵臼进入孔洞(KiH)突变，以形成结构杵臼，来促进包含结构杵臼的一个CH3结构域(即，CH3m1或CH3m2)与包含结构孔洞的另一个CH3结构域(即，CH3m2或CH3m1)配对。优选，进行突变，以在重链的CH3m1结构域中形成结构杵臼，用于与包含互补的结构孔洞的Fc链CH3m2结构域配对。改变氨基酸残基以在本文中所述的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构杵臼的突变的实例包括，但不限于，从苏氨酸残基变成酪氨酸残基、或苏氨酸残基变成色氨酸残基。改变氨基酸残基以在本文中所述的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构杵臼的特定突变的实例包括，但不限于，苏氨酸366残基变成酪氨酸残基(T366Y)和苏氨酸366残基变成色氨酸残基(T366W)。Ridgway等，Protein Eng.，9:617-621(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.，270:26-35(1997)。这样的特定改变在下文的实施例的MAT-Fab中有举例说明，其中Thr→Tyr转换在MAT-Fab(KiH1)中的CH3结构域的残基21处实现，而Thr→Trp转换在MAT-Fab(KiH2)的CH3结构域的残基21处实现(即，参见，表1中的SEQ ID NO:1的Tyr610和表5中的SEQ ID NO:5的Trp610)。
根据上述MAT-Fab双特异性抗体的结构，重链的CH3m1结构域或Fc链的CH3m2结构域包含杵臼进入孔洞(KiH)突变，以形成结构孔洞，来促进包含结构孔洞的一个CH3结构域与包含结构杵臼的另一个CH3结构域配对。抗体Fc区的CH3结构域的各种杵臼进入孔洞突变是本领域已知的。参见。例如，Ridgway等，Protein Eng.,9:617-621(1996)；Atwell等，J.Mol.Biol.，270:26-35(1997)；Klein等，mAbs,4(6):653-663(2012)。改变CH3结构域中的一个或多个残基以在本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的CH3结构域中形成结构孔洞的突变的实例包括，但不限于，酪氨酸残基变成苏氨酸残基、以及苏氨酸残基变成丝氨酸残基、亮氨酸残基变成丙氨酸残基和酪氨酸残基变成缬氨酸残基的组合。在本发明的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构孔洞的一个优选突变是酪氨酸407残基变成苏氨酸残基(Y407T)。Ridgway等，Protein Eng.，9:617-621(1996)。这样的改变在下文实施例的MAT-Fab中有举例说明，其中Tyr→Thr转换在MAT-Fab(KiH1)中的CH3结构域的残基62处实现(即，参见，表4中的SEQ ID NO:4的Thr213)。在本发明的MAT-Fab抗体的CH3结构域中形成结构孔洞的一个优选突变组合包括苏氨酸366残基变成丝氨酸残基(T366S)、亮氨酸368残基变成丙氨酸残基(L368A)和酪氨酸407残基变成缬氨酸残基(Y407V)。Atwell等，J.Mol.Biol.，270:26-35(1997)。这样特定的3个氨基酸改变在下文实施例的MAT-Fab中有举例说明，其中Thr→Ser转换在MAT-Fab(KiH2)中的CH3结构域的残基21处实现，Leu→Ala转换在MAT-Fab(KiH2)的CH3结构域的残基23处实现，和Tyr→Val转换在MAT-Fab(KiH2)中的CH3结构域的残基62处实现(即，参见，表8中的SEQ ID NO:8的Ser172、Ala174和Val213)。优选，进行一个或多个突变，以在Fc多肽链的CH3m2结构域中形成结构孔洞，用于与包含结构杵臼的CH3m1配对。
可以在本文中所述的MAT-Fab抗体的CH3m1和CH3m2结构域中进行进一步的突变，来提供半胱氨酸残基，以在MAT-Fab重链的CH3m1结构域与MAT-Fab Fc链的CH3m2结构域配对时形成另外的二硫键，并且由此进一步稳定MAT-Fab抗体的Fc区杂二聚体。这样的突变的特定实例包括，不限于，丝氨酸354变成半胱氨酸(S354C)和酪氨酸349变成半胱氨酸(Y349C)。Merchant等，Nat.Biotechnol.，16:677-681(1998)。这样的Cys置换在下文实施例的MAT-Fab中有举例说明，其中Ser→Cys转换在MAT-Fab(KiH2)重链中的CH3结构域的残基9处实现，并且Tyr→Cys转换在MAT-Fab(KiH2)Fc链中的CH3结构域的残基4处实现(即，参见，表8中的SEQ ID NO:5的Cys598和SEQ ID NO:8的Cys155)。
再一个选择是通过如下方式在本文中所述的MAT-Fab抗体的CH3m1和CH3m2结构域之间构建一个或多个盐桥，其中突变任一个或两个结构域，使得结构域中的一个中的残基能够与另一个结构域中的残基形成氢键并静电相互作用(键合)。例如，可以通过如下方式引入盐桥：将CH3m1结构域中的一个氨基酸残基改变(突变)成谷氨酸或天冬氨酸残基，并将CH3m2结构域中的一个残基改变(突变)成赖氨酸或精氨酸残基，由此CH3m1结构域中的谷氨酸或天冬氨酸残基可以与CH3m2结构域中的赖氨酸或精氨酸残基形成氢键并静电相互作用。
除了以上讨论的用于MAT-Fab形成的恒定区修饰，以上所述的MAT-Fab双特异性抗体的重链和/或Fc链的恒定区各自可以任选地(即，有或没有)包含一个或多个突变以降低或消除至少一种Fc效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞毒性(CDC)。这样的突变包括，但不限于，亮氨酸234变成丙氨酸(L234A)和亮氨酸235变成丙氨酸(L235A)(Canfield等，J.Exp.Med.，173(6):1483-91(1991))。优选，MAT-Fab双特异性抗体在CH2结构域中包含重链和Fc链氨基酸修饰，以将亮氨酸234变成丙氨酸(L234A，EU编号)和将亮氨酸235变成丙氨酸(L235A，EU编号)。这样的改变在下文实施例的MAT-Fab中有举例说明，其中LeuLeu→AlaAla转换在MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)中的铰链-CH2区的残基18-19处实现(即，参见，表1中的SEQ ID NO:1的478AlaAla479和表5中的SEQ ID NO:5的478AlaAla479)。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体能够以高亲和性结合每个表位或抗原。具体地，本发明提供了一种使用两个亲本抗体来构建MAT-Fab双特异性抗体的方法，其中一个亲本抗体结合第一表位或抗原，而另一个亲本抗体结合第二表位或抗原。
用于本发明的MAT-Fab双特异性抗体中的免疫球蛋白重链和轻链可变结构域(VH，VL)以及重链和轻链恒定结构域(如CL、CH1、CH2、CH3)可以获自或源自已知或产生的免疫球蛋白或其遗传上改变(突变)的形式。例如，Fab结合单元、各可变结构域和各恒定结构域可以容易地源自结合MAT-Fab双特异性抗体所旨在结合的靶表位或抗原的“亲本”抗体。各免疫球蛋白恒定结构域也可以源自与目的MAT-Fab抗体结合不同表位或抗原的亲本抗体，由此恒定结构域可以与获自不同亲本抗体的可变结构域连接，其中所述不同亲本抗体结合目的MAT-Fab抗体的期望靶表位或抗原。Fab结合单元或各免疫球蛋白可变和恒定结构域的其他来源包括：结合MAT-Fab双特异性抗体旨在结合的一个或两个靶表位或抗原的、遗传工程化亲本抗体或结合蛋白。可以用作本发明的MAT-Fab抗体生产中Fab结合单元或各可变和恒定结构域的来源的亲本抗体包括临床上批准的治疗性抗体。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的抗原结合可变结构域和Fab结合单元可以获自亲本抗体，包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体和各种遗传工程化抗体中的任一种。这样的亲本抗体可以是天然产生的或可以通过重组技术产生。本领域技术人员熟知用于生产抗体的许多方法，包括，但不限于使用杂交瘤技术、选择淋巴细胞抗体方法(SLAM)、使用文库(例如，噬菌体、酵母或RNA-蛋白融合展示文库或其他文库)、免疫包含至少一些人免疫球蛋白基因座的非人动物、以及制备嵌合的、CDR嫁接的和人源化的抗体。参见，例如，Neuberger,M.S.等，Nature314(1985)268-270；Riechmann,L.等，Nature332(1988)323-327；和EP 2 443 154 B1(2013)。
还可以使用亲和力成熟技术来制备可变结构域。
根据本发明，制备MAT-Fab抗体的方法包括选择具有至少一种在MAT-Fab抗体中所需特性的亲本抗体。优选，所需的特性是用于表征MAT-Fab抗体的那些特性中的一种或多种，例如，抗原或表位特异性、对抗原或表位的亲和性、效力、生物功能、表位识别、稳定性、溶解性、生产效率、降低的免疫原性、药物动力学、生物利用率、组织交叉反应性、或直系同源抗原结合。
可以使用重组DNA技术从亲本抗体获得可变结构域。在一个实施方案中，可变结构域是小鼠重链或轻链可变结构域。在另一个实施方案中，可变结构域是CDR嫁接的或人源化重链或轻链可变结构域。在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab抗体中使用的可变结构域是人重链或轻链可变结构域。
可以使用重组DNA技术、PCR或本领域可利用的适用于重组免疫球蛋白结构域的其他方法，将一个或多个恒定结构域彼此连接或连接至可变结构域。在一个实施方案中，将包含重链可变结构域的序列连接至重链恒定结构域，并将包含轻链可变结构域的序列连接至轻链恒定结构域。在另一个实施方案中，这些恒定结构域分别是人免疫球蛋白重链恒定结构域和人免疫球蛋白轻链恒定结构域。
还可以改变可变和恒定结构域来改进目的MAT-Fab双特异性抗体的特性。例如，如上所述，本发明MAT-Fab抗体的Fc区的CH3结构域具有杵臼进入孔洞突变，其有利于MAT-Fab重多肽链的Fc区和MAT-Fab Fc多肽链正确结合。此外，CH3结构域可以进一步突变以引入半胱氨酸残基，其在两个CH3结构域结合并形成稳定的MAT-Fab抗体Fc杂二聚体时形成另外的二硫键。再进一步，MAT-Fab抗体的Fc区可以包含一个或多个氨基酸修饰以增强或降低Fc功能，包括，但不限于，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用(opsonizaiton)，或细胞或受体结合。
如上所述，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的两个Fc结构域中的每一个都包含杵臼进入孔洞(KiH)突变，以促进MAT-Fab重多肽链的Fc区域与MAT-Fab Fc链的结合。然而，Fc区的其他特性或修饰也可能是期望的。例如，MAT-Fab抗体的Fc区可以源自选自以下的免疫球蛋白的Fc区：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD。在另一个实施方案中，可以修饰Fc区中的一个或多个氨基酸，以相对于未修饰的Fc区增强或降低MAT-Fab双特异性抗体的Fc区对FcγR(Fc受体)的亲和性。例如，Fc区的修饰可以改变对FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII的亲和性。
在另一个实施方案中，可以修饰Fc区中的一个或多个氨基酸，以调节MAT-Fab双特异性抗体的体内功能或物理半衰期。
本发明MAT-Fab双特异性抗体的每条多肽链的结构组织，使得可以使用细胞内存在的天然蛋白表达、折叠和分泌机制正确地在细胞内装配MAT-Fab抗体，而不必使用生产后加工技术来获得功能性MAT-Fab抗体。特别优选的是使用分离的哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本文所述的期望MAT-Fab双特异性抗体的四条多肽链的一个或多个表达载体，用于产生和表达功能性MAT-Fab抗体。
靶抗原结合
本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合一个或两个靶表位或抗原。通常，将MAT-Fab双特异性抗体工程化，以结合一个抗原上的表位和一个不同抗原上的表位；由此使得MAT-Fab抗体能够作为两个抗原之间的人工连接，以实现由抗原的连接而产生的特定结果。本发明的MAT-Fab抗体可以工程化，以结合细胞因子、多肽配体、细胞表面受体、非受体细胞表面蛋白、酶、上述两种或多种的复合物，或其组合。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAR-Fab双特异性抗体能够调节一个或两个靶抗原的生物功能。更优选，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体能够中和一个或多个靶抗原。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体还能够结合两种不同的细胞因子。这样的细胞因子可以选自：淋巴因子、单核因子和多肽激素。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合细胞表面上表达的至少一种靶抗原。更优选，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合两种细胞表面抗原。两种细胞表面抗原可以在同一细胞或相同类型的两个细胞上。然而，更优选，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合第一细胞表面上表达的抗原并结合第二细胞表面上表达的第二抗原，其中第一和第二细胞是不同类型的细胞。优选，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合免疫系统的效应细胞上表达的第一细胞表面抗原，并且还结合在如下细胞表面上表达的第二细胞表面抗原，所述细胞被认为对个体有害并且因此希望消除或降低其群体的大小。由本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合的效应细胞包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。认为对个体有害的并且可以由本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合的细胞的实例包括肿瘤细胞、自体反应性细胞和病毒感染的细胞。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞上表达的表面抗原。优选，表面抗原选自：CD3、CD16(也称为“FcγRIII”)和CD64(也称为“FcγRI”)。更优选，MAT-Fab抗体结合T细胞上表达的CD3、自然杀伤(NK)细胞上表达的CD16、或巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞上表达的CD64。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合是肿瘤相关抗原的表面抗原。由本发明的MAT-Fab抗体结合的优选肿瘤相关抗原选自：CD19、CD20、人表皮生长因子受体2(“HER2”)、癌胚抗原(“CEA”)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合效应细胞上的CD3。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合癌细胞上存在的CD20。
在另一个实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合如本文中所述的效应细胞上表达的表面抗原和如本文中所述的肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原。在优选实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合T细胞上的CD3和恶性B细胞上的CD20。
在优选实施方案中，本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合CD3和CD20。更优选，MAT-Fab双特异性抗体在其外侧(N-端)Fab结合单元结合CD20并在其内侧(近C-端)Fab结合单元结合CD3。
在优选实施方案中，MAT-Fab双特异性抗体结合CD20和CD3，并且包含四条多肽链，所述多肽链包含表1-4中的氨基酸序列(SEQ ID NO:1、2、3、4)或表5-8中的氨基酸序列(SEQID NO:5、6、7、8)。
在优选实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合选自以下抗原对的一对靶抗原：CD20和CD3、CD3和CD19、CD3和Fc-γ-RIIIA、CD3和TPBG、CD3和Epha10、CD3和IL-5Rα、CD3和TASCTD-2、CD3和CLEC12A、CD3和Prominin-1、CD3和IL-23R、CD3和ROR1、CD3和IL-3Rα、CD3和PSA、CD3和CD8、CD3和Glypican3、CD3和FAP、CD3和EphA2、CD3和ENPP3、CD3和CD33、CD3和CD133、CD3和EpCAM、CD3和CD19、CD3和Her2、CD3和CEA、CD3和GD2、CD3和PSMA、CD3和BCMA、CD3和A33、CD3和B7-H3、CD3和EGFR、CD3和P-钙粘蛋白、CD3和HMW-MAA、CD3和TIM-3、CD3和CD38、CD3和TAG-72、CD3和SSTR、CD3和FRA、CD16和CD30、CD64和Her2、CD137和CD20、CD138和CD20、CD19和CD20、CD38和CD20、CD20和CD22、CD40和CD20、CD47和CD20、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、PD-1和PD-L1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、VEGF和EGFR、HGF和VEGF、VEGF的第一表位和VEGF的不同第二表位、VEGF和Ang2、EGFR和cMet、PDGF和VEGF、VEGF和DLL-4、OX40和PD-L1、ICOS和PD-1、ICOS和PD-L1、Lag-3和PD-1、Lag-3和PD-L1、Lag-3和CTLA-4、ICOS和CTLA-4、CD138和CD40、CD38和CD138、CD38和CD40、CD-8和IL-6、CSPGs和RGMA、CTLA-4和BTN02、CTLA-4和PD-1、IGFl和IGF2、IGFl/2和Erb2B、IGF-IR和EGFR、EGFR和CD13、IGF-IR和ErbB3、EGFR-2和IGFR、Her2的第一表位和Her2的第二不同表位、因子IXa和Met、因子X和Met、VEGFR-2和Met、VEGF-A和促血管生成素-2(Ang-2)、IL-12和TWEAK、IL-13和IL-lβ、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、RGM A和RGM B、Te38和TNFα、TNFα和Blys、TNFα和CD22、TNFα和a CTLA-4、TNFα和GP130、TNFα和IL-12p40、以及TNFα和RANK配体。
在再另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合一种或两种细胞因子、细胞因子相关蛋白或细胞因子受体。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体能够结合一种或多种趋化因子、趋化因子受体和趋化因子相关蛋白。
在另一个实施方案中，本发明的MAT-Fab双特异性抗体还能够结合受体，包括淋巴因子受体、单核因子受体和多肽激素受体。
糖基化的MAT-Fab双特异性抗体
本发明的MAT-Fab抗体可以包含一个或多个碳水化合物残基。优选，上述MAT-Fab双特异性抗体是糖基化的。更优选，糖基化是人糖基化模式。
新生体内蛋白产物可以经历进一步的加工，称为翻译后修饰。特别地，糖(糖基)残基可以通过酶添加，称为糖基化的过程。所得到的带有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。
天然产生的抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能具有重要的影响，而对抗体的抗原结合或半衰期具有微小的影响(Jefferis，Biotechnol.Prog.，21:11-16(2005))。相反，可变结构域的糖基化可对抗体的抗原结合活性具有影响。可变结构域中的糖基化可能因位阻而对抗原结合亲和性具有负面影响(Co,M.S.等，Mol.Immunol.,30:1361-1367(1993))，或可以导致提高的抗原亲和性(Wallick等，J.Exp.Med.,168:1099-1109(1988)；Wright,A.等，EMBO J.，10:2717-2723(1991))。
本发明的一个方面涉及产生糖基化位点突变体，其中MAT-Fab抗体的O-或N-连接的糖基化位点已经被突变。本领域技术人员可以使用标准的公知技术产生这样的突变体。保留生物活性但具有提高或降低的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的。
在再另一个实施方案中，修饰本发明的MAT-Fab抗体的糖基化。例如，可以制得失糖基化的MAT-Fab抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，例如，以提高MAT-Fab抗体对一个或两个抗原的亲和性。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以形成一个或多个氨基酸置换，以导致一个或多个可变区糖基化位点的消除，由此消除在该位点的糖基化。这样的失糖基化可以增加MAT-Fab抗体对抗原的亲和性。这样的方法进一步详细描述于国际公开No.WO 2003/016466和美国专利No.5,714,350和6,350,861中。
另外地，或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的本发明修饰的MAT-Fab抗体，如具有降低的岩藻糖残基含量的低岩藻糖基化抗体(参见Kanda等，J.Biotechnol.,130(3):300-310(2007))或具有增加的平分型GlcNAc结构的抗体。已经证明，这样改变的糖基化模式能提高抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可以例如，通过在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域已经有描述，并且可以用作宿主细胞，其中表达本发明的重组抗体，由此产生具有改变的糖基化的抗体。参见，例如，Shields等，J.Biol.Chem.,277:26733-26740(2002)；Umana等，Nat.Biotech.，17:176-180(1999)，以及欧洲专利No:EP 1 176 195；国际公开No.WO 2003/035835和WO 1999/54342。
蛋白糖基化取决于目标蛋白的氨基酸序列、以及用于表达蛋白的宿主细胞。不同的生物体可以产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同的可利用底物(核苷酸糖)。由于这些因素，蛋白糖基化模式和糖基残基的组成，可以根据用于表达特定蛋白的宿主系统而不同。本发明中有用的糖基残基可以包括，但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰基葡糖胺和唾液酸。优选，糖基化MAT-Fab抗体包含糖基残基，使得糖基化模式是人的。
本领域技术人员已知，不同的蛋白糖基化可能导致不同的蛋白特征。例如，与哺乳动物细胞(如CHO细胞系)中表达的相同蛋白相比，微生物宿主(如酵母)中产生的和利用酵母内源性途径糖基化的治疗性蛋白的功效可能降低。这样的糖蛋白在人体中还可能是免疫原性的并且在施用后显示出降低的体内半衰期。人和其他动物中的特定受体可以识别特定的糖基残基并促进蛋白从血流的快速清除。其他不利影响可能包括以下方面的改变：蛋白折叠、溶解性、对蛋白酶的易感性、运输、运送、区室化、分泌、被其他蛋白或因子的识别、抗原性或变应原性的改变。因此，从业者可能优选具有特定组成和糖基化模式的MAT-Fab抗体，例如，与人细胞或目的受试动物的物种特异性细胞中产生的糖基化组成和模式相同或至少相似的糖基化组成和模式。
可以通过遗传修饰宿主细胞来表达异源糖基化酶，实现表达不同于宿主细胞的糖基化的MAT-Fab抗体。使用本领域已知的技术，从业者可以产生呈现人蛋白糖基化的MAT-Fab抗体。例如，酵母菌株已经遗传修饰来表达非天然的糖基化酶，使得这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)呈现与动物细胞(尤其是人细胞)相同的蛋白糖基化(例如，美国专利公开No.2004/0018590和2002/0137134)。
核酸、载体、宿主细胞
本发明提供编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的一条、两条、三条或全部四条多肽链的一个或多个分离核酸。
本发明还提供载体，其包含编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的一条、两条、三条或全部四条多肽链的一个或多个分离核酸。载体可以是自主复制载体、或可以是将载体中存在的分离的核酸整合到宿主细胞基因组中的载体。还可以将编码MAT-Fab抗体的一条、两条、三条或全部四条多肽链的分离核酸插入用于进行各种遗传分析、用于表达MAT-Fab抗体、或用于表征或改善本文中所述的MAT-Fab抗体的一个或多个特性的载体中。
根据本发明的载体可以用于复制编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的一条、两条、三条或全部四条多肽链的分离核酸。
根据本发明的载体可以用于表达编码本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的分离核酸、或表达编码MAT-Fab抗体的一条或多条多肽链的一个或多个分离核酸。用于克隆和表达本文中所述核酸的优选载体包括，但不限于，pcDNA、pTT(Durocher等，Nucleic AcidsRes.,30(2e9):1-9(2002))，pTT3(具有另外的多克隆位点的pTT)、pEFBOS(Mizushima和Nagata，Nucleic Acids Res.,18(17):5322(1990))、pBV、pJV、pcDNA3.1TOPO、pEF6 TOPO和pBJ。
本发明还提供了包含本文中所述载体的分离宿主细胞。包含本文中所述载体的分离宿主细胞可以是分离的原核细胞或分离的真核细胞。
包含本文中所述载体的分离的原核细胞可以是细菌宿主细胞。所述细菌宿主细胞可以是革兰氏阳性、革兰氏阴性或革兰氏可变细菌宿主细胞。优选，包含本文中所述载体的细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌。甚至更优选，包含本文中所述载体的细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。
包含本文中所述载体的分离宿主细胞可以是真核宿主细胞。优选的包含本文中所述载体的分离真核宿主细胞可以包括，不限于，哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。优选，包含本文中所述载体的分离哺乳动物宿主细胞选自：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。优选的包含本文中所述载体的分离真菌宿主细胞选自：曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和假丝酵母属(Candida)。更优选，包含本文中所述载体的酵母属宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
还提供生产本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的方法，包括在足以产生MAT-Fab双特异性抗体的条件下培养包含载体的分离宿主细胞，所述载体包含编码MAT-Fab抗体的核酸。
本发明的另一个方面是通过上述方法产生的MAT-Fab双特异性抗体。
缀合物
主要由于存在二聚化的Fc区，本发明的MAT-Fab双特异性抗体可以缀合至目前与IgG抗体缀合的多种试剂中的任何一种。例如，上述MAT-Fab双特异性抗体可以与选自以下的物质缀合：免疫粘附分子、成像剂、治疗剂和细胞毒性剂。可以与本发明的MAT-Fab双特异性抗体缀合的优选成像剂选自：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、生物素、链霉亲和素或亲和素。可以与本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体缀合的放射性标记包括，但不限于，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、131I、177Lu、166Ho和153Sm。可以与本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体缀合的优选细胞毒性或治疗性化合物包括，但不限于，抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和凋亡剂。在一些情况中，将MAT-Fab抗体与所述试剂直接缀合。或者，通过接头将MAT-Fab与所述试剂缀合。合适的接头包括，但不限于，本文中所述的氨基酸和多肽接头。接头可以是可断裂的或不可断裂的。
结晶形式
本发明的MAT-Fab双特异性抗体可以作为结晶形式来使用，所述结晶形式可以使用大规模结晶方法来制备，例如，Shenoy和同事在国际公开No.WO 2002/072636中所述的方法，该文献按引用并入本文中。这样的方法提供了与经典X射线晶体学研究中使用的晶体明显不同的抗体分子晶体。虽然晶体质量对于X射线晶体学研究中的精确测量非常重要，但对于通过大规模结晶方法制造的用于药物应用的晶体则不是。使用大规模结晶方法生产的抗体分子晶体对于药物研究和制造而言是足够纯的，保持生物活性，特别适合于储存(因为抗体晶体较少接受不期望的相互作用，而这在溶液中可能发生)，可以提供含有非常高浓度的生物活性抗体分子的肠胃外施用制剂，可以提供有利的剂量制剂(包括在非水悬浮液中的高浓度)，可以提供提高的体内半衰期，并且可以与聚合物载体一起配制(被其包封)用于在体内控制释放抗体分子。
特别优选的是结晶的MAT-Fab抗体，其保留非晶形式的任何结合活性以及任何所需生物活性。当给予个体时，结晶的MAT-Fab双特异性抗体还可以提供MAT-Fab的无载体控制释放。
用于根据本发明的结晶MAT-Fab双特异性抗体释放的优选组合物包含本文中所述的结晶MAT-Fab双特异性抗体、赋形剂成分和至少一种聚合物载体。优选，赋形剂成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。优选，聚合物载体是选自以下的一种或多种的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二噁烷酮)；聚(乙二醇)、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸酐/烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖，其混合物、及其共聚物。
MAT-Fab双特异性抗体的用途
本发明提供了治疗人受试者疾病或疾患的方法，包括将结合对人受试者有害的一个或两个靶表位、一个或两个靶抗原、或靶表位和靶抗原组合的MAT-Fab双特异性抗体施用于个体，其中MAT-Fab双特异性抗体与表位或抗原的结合提供对所述疾病或疾患的治疗。
其中表位、抗原或抗原活性有害的疾患旨在包括这样的疾患，其中在患有所述疾患的人受试者中表位(例如，细胞表面蛋白或可溶性蛋白的表位)或抗原或抗原活性的存在已经被证实是或被怀疑是引起所述疾患的病理生理学的负责原因、或已经被证实是或怀疑是引起所述疾患恶化的一个因素。因此，其中表位、抗原或抗原活性有害的疾患是这样的疾患，其中预期表位、抗原或抗原活性的降低可以缓解所述疾患的一个或多个症状或所述疾患的进展，并由此提供对所述疾患的治疗。这样的疾患可以表现为，例如，在患有所述疾患的人受试者的血液或其他生物流体中抗原(或表位)浓度的增加。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有疾患的人受试者的方法，其中能够被本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体结合的一个或两个靶抗原或表位对人受试者是有害的，其中所述方法包括将本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体施用于人受试者，使得在人受试者中该一个或两个靶抗原(或表位)的活性得到抑制，并实现治疗。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体在治疗疾患的如下方法中特别有用，所述方法包括使效应细胞(如T细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞)“重新靶向”(或“募集”)以攻击特定靶细胞，其中所述靶细胞表达疾患相关抗原且对人受试者是有害的，并因此期望消除或实质性地减少该有害靶细胞的群体。这样的有害靶细胞的优选实例是肿瘤细胞(例如，血液(包括淋巴)肿瘤细胞和实体肿瘤细胞)、自体反应细胞和病毒感染的细胞。在本发明的重新靶向方法中，MAT-Fab抗体结合效应细胞表面上表达的抗原和对人受试者有害的靶细胞表面上表达的抗原，其中MAT-Fab抗体与效应细胞上的抗原和有害细胞上的抗原的结合激活效应细胞以攻击有害靶细胞。
因此，本发明提供治疗人受试者疾患的方法，包括将本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体施用于人受试者，所述抗体结合效应细胞上的抗原并结合对人受试者有害的靶细胞上表达的疾患相关抗原，其中MAT-Fab双特异性抗体与效应细胞和靶细胞两者的结合激活效应细胞以攻击有害靶细胞。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体与效应细胞上的单个靶抗原和有害靶细胞上的单个靶抗原的同时结合，可以激活效应细胞来有利地攻击靶细胞，并且还不引发细胞因子的大量有害释放(细胞因子风暴)。细胞因子的大量释放(细胞因子风暴)不仅可以对局部组织具有有害影响，而且对更远的患者身体组织也具有有害影响，导致潜在的并发症和不合需要的副作用。这样的细胞因子风暴可以发生在其中效应细胞(如T细胞)结合抗原递呈细胞(APC)的天然免疫反应中、或二价或多价抗体与效应细胞表面上的两个或多个抗原人工交联时。相反，由于可以工程化本发明的MAT-Fab双特异性抗体以使其仅一个Fab结合单元结合效应细胞上的抗原，因此很大程度上减少了非特异性T细胞活化和随后的细胞因子风暴的可能性，同时该抗体保留激活效应细胞来攻击被MAT-Fab抗体的另一个Fab结合单元结合的有害靶细胞的能力。
优选，重新靶向效应细胞来攻击有害靶细胞的方法包括将效应细胞和有害靶细胞接触本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的步骤，其中所述抗体结合有害靶细胞上的抗原并结合效应细胞上表达的抗原。优选的效应细胞抗原包括CD3、CD16(也称为“FcγRIII”)和CD64(也称为“FcγRI”)。更优选，所述方法包括结合T细胞上表达的CD3、自然杀伤(NK)细胞上表达的CD16、或巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞上表达的CD64的MAT-Fab抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了在需要治疗的人受试者中治疗肿瘤的方法，包括步骤：将结合效应细胞上的抗原并且还结合靶肿瘤细胞上的抗原的MAT-Fab抗体施用于人受试者，其中MAT-Fab抗体与效应细胞和肿瘤靶细胞的结合激活效应细胞来攻击肿瘤细胞。优选，效应细胞上的抗原是T细胞上表达的CD3。
在优选实施方案中，在需要治疗的人受试者中治疗肿瘤的方法包括重新靶向效应细胞来攻击肿瘤细胞，包括步骤：将本文中所述的结合效应细胞上的抗原和靶肿瘤细胞上的抗原的MAT-Fab双特异性抗体施用于人受试者，其中靶肿瘤细胞上的抗原是选自以下的肿瘤相关抗原：CD19、CD20、人表皮生长因子受体2(“HER2”)、癌胚抗原(“CEA”)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗人受试者的B细胞相关肿瘤的方法，包括步骤：将结合效应细胞上的抗原并结合恶性B细胞上的抗原的MAT-Fab双特异性抗体施用于需要这样治疗的人受试者。优选，本发明的MAT-Fab双特异性抗体结合选自以下的癌症疾患的恶性B细胞上的抗原：急性淋巴母细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤。
在特别优选的实施方案中，治疗人受试者的B细胞相关肿瘤的方法包括将本文中所述的结合T细胞上的CD3并结合靶肿瘤B细胞上的CD20的MAT-Fab双特异性抗体施用于人受试者。更优选，MAT-Fab双特异性抗体在其外侧(N-端)Fab结合单元结合CD20(例如，参见，在图1A中，包含结构域VHA-CH1和VLA-CL的Fab)并在其内侧(近C-端)Fab结合单元结合CD3(例如，在图1A中，包含结构域VHB-CH1和VLB-CL的Fab)。
在另一个实施方案中，根据本发明的治疗疾患的方法可以包括在一种离体程序中使MAT-Fab抗体接触效应细胞和有害靶细胞，其中将从需要治疗的人受试者提取的效应细胞在人受试者体外接触MAT-Fab抗体，并且在允许MAT-Fab抗体结合效应细胞的一段时间后，将结合MAT-Fab抗体的效应细胞随后施用于人受试者，使得结合效应细胞的MAT-Fab抗体复合物随后可以在人受试者体内寻找以结合有害靶细胞，如肿瘤细胞。在另一个实施方案中，将从需要治疗的人受试者提取的效应细胞和肿瘤细胞在人受试者体外接触MAT-Fab抗体，并且在允许MAT-Fab抗体结合效应细胞和肿瘤细胞的一段时间后，将结合MAT-Fab抗体的效应细胞和肿瘤细胞施用于人受试者。
在另一个实施方案中，还可以将MAT-Fab双特异性抗体工程化，以将细胞毒性剂递送至有害靶细胞，如肿瘤细胞。在这个实施方案中，MAT-Fab抗体的一个Fab结合单元含有用于有害靶细胞上的靶抗原的结合位点，而另一个Fab结合单元含有用于细胞毒性剂的结合位点。本发明这样的工程化MAT-Fab抗体可以与细胞毒性剂混合或接触，该细胞毒性剂将在抗体的工程化的Fab结合单元与抗体结合。随后可以将携带结合的细胞毒性剂的MAT-Fab抗体接触有害靶细胞，以将细胞毒性剂递送至有害靶细胞。这样的递送系统在如下情况下特别有效：其中MAT-Fab抗体结合有害靶细胞并且随后连同结合的细胞毒性剂一起内在化至细胞中，使得细胞毒性剂可以在有害靶细胞内部释放。
另外，本文中提供的MAT-Fab双特异性抗体可以用于组织特异性递送(靶向组织标志物和疾病介质，用于增强局部药物动力学和因此更高的功效和/或较低的毒性)，包括胞内递送(靶向内在化受体和胞内分子)、递送至脑内(例如，靶向转铁蛋白受体和中枢神经系统(CNS)疾病介质，用于穿过血脑屏障)。MAT-Fab抗体还可以用作载体蛋白，通过结合抗原的非中和表位将抗原递送至特定位置并且还提高抗原的半衰期。
此外，可以设计MAT-Fab双特异性抗体，以在物理上连接植入患者中的医疗装置或靶向这些医疗装置(参见，Burke等(2006)Advanced Drug Deliv.Rev.58(3):437-446；Hildebrand等(2006)Surface and Coatings Technol.200:6318-6324；"Drug/devicecombinations for local drug therapies and infection prophylaxis,"Wu,Peng等(2006)Biomaterials,27(11):2450-2467；"Mediation of the cytokine network in theimplantation of orthopedic devices,"Marques等，见Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine,Reis等编辑(CRC Press LLC，BocaRaton，2005)pp.377-397)。将适当类型的细胞导向医疗植入物的部位可以促进愈合和恢复正常组织功能。或者，MAT-Fab双特异性抗体可以用于抑制在装置植入后释放的介质(包括但不限于细胞因子)。本文的公开内容还提供了诊断应用，包括，但不限于，诊断分析方法、含有一种或多种结合蛋白的诊断试剂盒、和所述方法和试剂盒用于自动化和/或半自动化系统的适应化方案。这些方法、试剂盒和适应化方案可以用于个体中的疾病或疾患的检测、监测和/或治疗。这将在下面进一步阐明。
本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体易于适应本领域用于检测、定量或分离靶抗原或表达靶抗原的细胞的各种免疫检测分析试验和纯化形式中的任何一种。这样的形式包括，但不限于，免疫印迹分析(例如，Western印迹)；免疫亲和性色谱，例如，其中将MAT-Fab双特异性抗体吸附或连接在色谱树脂或珠子；免疫沉淀分析；免疫芯片；组织免疫组织化学分析；流式细胞术(包括荧光激活细胞分选)；夹层免疫分析；免疫芯片，其中将MAT-Fab抗体固定或结合于基质；放射性免疫分析(RIA)；酶免疫分析(EIA)；酶联免疫吸附分析(ELISA)；竞争性-抑制免疫分析；荧光极化免疫分析(FPIA)；酶倍增免疫分析技术(EMIT)；生物发光共振能量转移(BRET)；和均相化学发光分析。本发明公开内容提供了利用质谱的方法，所述方法包括,但不限于MALDI(基质辅助激光解吸/电离)或SELDI(表面增强激光解吸/电离)，其包括结合靶抗原或结合抗原或其片段上的表位的MAT-Fab抗体。
本发明进一步提供了用于检测样品(例如，混合物、组合物、溶液或生物样品)中的抗原的方法，包括将样品接触结合靶抗原的本发明MAT-Fab双特异性抗体。可以用作本发明免疫检测分析试验的样品的生物样品包括，不限于，全血、血浆、血清、各种组织提取物、泪液、唾液、尿液和其他体液。优选，本发明的免疫检测分析试验可以检测以下的任一项：结合靶抗原的MAT-Fab双特异性抗体、MAT-Fab双特异性抗体和靶抗原的复合物，或保持未结合的MAT-Fab双特异性抗体。检测包含靶抗原和MAT-Fab抗体的结合复合物的方法优选利用如下检测系统，所述检测系统使用一种或多种信号产生分子(可检测标记)，所述分子将产生通过人眼容易检测的或通过信号检测仪器(例如，分光光度计)容易检测或测量的信号。可以用可检测的信号产生系统直接或间接标记MAT-Fab双特异性抗体，以利于结合或未结合的MAT-Fab双特异性抗体的检测。可以用于检测包含靶抗原和MAT-Fab双特异性抗体的结合复合物的可检测信号包括，但不限于，荧光信号(例如，从荧光染料或花青苷分子产生的信号，其中所述染料或分子可以被MAT-Fab双特异性抗体的一个Fab结合单元结合、或通过其他方式连接至MAT-Fab抗体)；可见的颜色信号(例如，用酶或有色分子(例如，色素)产生的信号，所述酶或分子也可以直接或间接连接至MAT-Fab抗体)；放射性信号(例如，通过放射性同位素产生的信号，所述同位素可以直接或间接连接至MAT-Fab抗体)；和光信号(例如，通过化学发光或生物发光系统产生的信号)。生物发光系统的一个实例是萤光素-萤光素酶系统，其中萤光素酶可以直接或间接连接至MAT-Fab抗体或第二检测抗体，以在萤光素底物存在下产生可检测的光信号。
在本发明的免疫检测分析试验中有用的优选酶是接触一种或多种试剂时可以提供可检测信号的酶。这样的酶包括，但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。
可以用于本发明的免疫检测分析试验中的合适荧光材料的实例包括，但不限于，伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白。
可以用于本发明的免疫检测分析试验中的发光材料的实例是鲁米诺。
可以用于本发明的免疫检测分析试验中的合适的放射性物质的实例包括，但不限于，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
药物组合物
本发明提供了用于治疗人受试者的包含本文中所述的MAT-Fab双特异性抗体的药物组合物。可以使用本领域公知的用于制备将治疗性抗体施用于人受试者的药物组合物的技术和成分，制备这样的组合物。可以将包含本文中所述的MAT-Fab抗体的组合物配制成用于通过各种施用途径或方式中的任何一种来施用。可以将包含MAT-Fab抗体的组合物配制成用于胃肠外或非胃肠外施用。可以将用于治疗癌症、自身免疫疾病或炎性疾病的包含MAT-Fab抗体的组合物配制成用于胃肠外施用，例如，但不限于，静脉内、皮下、腹膜内或肌内施用。更优选，将组合物配制成用于静脉内施用。优选通过组合物的注射或输注来进行这样的胃肠外施用。
用于施用于人个体的包含MAT-Fab抗体的组合物可以包含有效量的MAT-Fab抗体以及一种或多种药物学上可接受的组分，如药物学上可接受的载体(溶媒、缓冲剂)、赋形剂或其他成分。“药物学上可接受的”表示，组合物的化合物、组分或成分与人受试者的生理学相容、并且对MAT-Fab抗体组分的有效活性无害、或对可能存在于待施用于人受试者的组合物中存在的任何其他组分的所需特性或活性无害。药物学上可接受的载体的实例包括，但不限于，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其组合。在一些情况中，优选包括等渗剂，包括，但不限于，糖类；多元醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；氯化钠；及其组合。药物学上可接受的载体可以进一步包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，以增强组合物的货架期或有效性。赋形剂通常是可以向组合物提供除主要治疗活性以外的其他期望特征的任何化合物或化合物组合。可以按照需要调节组合物的pH，例如，以促进或维持组成成分的溶解度、维持一种或多种成分在制剂中的稳定性，和/或阻止可能在制备过程中的某些点引入的微生物的不合需要的生长。
包含MAT-Fab抗体的组合物还可以包括一种或多种其他成分，如其他医疗剂(例如，抗癌剂、抗生素、抗炎化合物、抗病毒剂)、填充剂、配制助剂及其组合。
根据本发明的组合物可以是各种形式。这些包括，但不限于，液体、半固体和固体剂型、分散体、悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于所预期的施用途径。优选的组合物是可注射或可输注溶液的形式，如与批准用于人的治疗性抗体的施用中使用的组合物相似的组合物。在优选实施方案中，通过静脉内注射或输注来施用本文中所述的MAT-Fab抗体。在另一个实施方案中，通过肌内或皮下注射来施用MAT-Fab抗体。
治疗性组合物在制造和储存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或适用于高药物浓度的其他结构。可以通过在合适的溶剂中掺入所需量的活性化合物(即，MAT-Fab抗体)，以及任选地按照需要掺入向组合物提供有益特性的一种成分或成分的组合，接着无菌过滤，来制备无菌注射液。通常，通过将活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质(例如，无菌水、无菌等渗盐水等)和任选地一种或多种对于适当分散可能需要的其他成分。在用于配制无菌注射液的无菌冻干粉的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和喷雾干燥，从之前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何其他所需成分的粉末。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散体的情况中通过维持所需的颗粒大小、和通过使用表面活性剂，维持溶液适当的流动性。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和/或明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
可以通过本领域已知的各种方法来施用MAT-Fab抗体。如本领域技术人员所知的，施用的途径或方式将根据所需的结果而改变。在某些实施方案中，可以使用将保护抗体对抗快速释放的载体来配制MAT-Fab抗体，如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。各种用于制备这样的制剂的方法是本领域技术人员已知的。
可以制备以上公开的药物组合物，用于通过选自以下的至少一种方式施用于个体：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、动脉内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和透皮。
从以下的非限制性实施例将清楚本发明的其他实施方案和特征。
实施例
实施例1.CD20/CD3 MAT-Fab双特异性抗体的构建、表达、纯化和分析。
为了证明MAT-Fab技术，产生了在杵臼进入孔洞Fc区突变上不同的CD20/CD3 MAT-Fab双特异性抗体实例：MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)。
为了产生MAT-Fab抗体，从头合成了编码每条多肽链的DNA。
用于产生能够结合CD3和CD20的MAT-Fab抗体的该DNA构建体编码亲本单克隆抗体(mAb)的可变和恒定结构域。每个MAT-Fab抗体由以下所示的四个多肽组成：
重链：VLA-CL-VHB-CH1-铰链-CH2-CH3(KiH)
第一轻链：VHA-CH1
第二轻链：VLB-CL
Fc链：铰链-CH2-CH3(KiH)
其中“(KiH)”表示存在一个或多个促进或稳定重链和Fc链的CH3结构域杂二聚化的突变，抗原“A”是CD20，和抗原“B”是CD3。
制得两个构建体，称为MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)，差异仅在于Fc区中用于促进杂二聚化的杵臼进入孔洞突变。
简而言之，亲本mAb包括两个高亲和性抗体，抗CD20 mAb(奥伐单抗)和抗CD3 mAb(美国专利公开No.2009/0252683)。
用于MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2的重链的构建体
为了产生用于MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的重链，DNA构建体编码22个氨基酸信号肽，其连接亲本抗CD20 mAb(奥伐单抗)的轻链的VL-CL，该VL-CL连接亲本抗CD3 mAb(美国专利公开No.2009/0252683)的VH-CH1区的N-端，而该VH-CH1连接亲本抗CD3 mAb的铰链-CH2，该铰链-CH2连接衍生自亲本抗CD3 mAb的突变IgG1 CH3区。
将用于MAT-Fab(KiH1)双特异性抗体的重链的CH3结构域突变，将苏氨酸(T)残基变成酪氨酸(Y)残基，以在CH3结构域的残基21处形成结构杵臼。参见以下表1中SEQ ID NO:1的Y610(下划线的残基)，显示了该突变。将用于MAT-Fab(KiH1)的Fc链的CH3结构域中的相应位置突变，将酪氨酸(Y)残基变成苏氨酸(T)残基，以在该CH3结构域的残基62处形成结构杵臼。参见以下表4中的SEQ ID NO:4的T213(下划线的残基)，其反映了该突变。
将用于MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的重链的CH3结构域突变，将苏氨酸(T)残基变成色氨酸(W)残基，以在CH3结构域中形成结构杵臼。参见，以下表5中的SEQ ID NO:5的W610(下划线的残基)，其反映了该突变。将用于MAT-Fab(KiH2)的Fc链的CH3结构域突变，将苏氨酸(T)变成丝氨酸(S)、亮氨酸(L)变成丙氨酸(A)以及酪氨酸(Y)变成缬氨酸，以在该CH3结构域中形成结构孔洞。参见，以下表8中的SEQ ID NO:8的S172、A174和V213(下划线的残基)，其反映了该突变。
还将用于MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的重链的CH3结构域突变，将丝氨酸(S)残基变成半胱氨酸(C)残基；并在用于MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的Fc链中进行相应的突变，将酪氨酸(Y)残基变成半胱氨酸(C)残基。引入这些半胱氨酸(C)残基使得可以与Fc多肽链的互补突变CH3结构域形成二硫键，获得提高的杂二聚体稳定性。参见，以下表5中的SEQID NO:5的C598(下划线的残基)和以下表8中的SEQ ID NO:8的C155(下划线的残基)，其反映了这些半胱氨酸置换。
还将MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2两者的重链和Fc链突变，以将铰链-CH2区的位置18-19的亮氨酸-亮氨酸变成丙氨酸-丙氨酸，从而降低或消除ADCC/CDC效应子功能(Canfield等，J.Exp.Med.,173(6):1483-1491(1991))。表1中的SEQ ID NO:1的478AA479、表4中的SEQ ID NO:4的40AA41、表5中的SEQ ID NO:5的478AA479、和表8中的SEQ ID NO:8的40AA41，反映出这些亮氨酸到丙氨酸的突变。
用于MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2的第一轻链的构建体
为了生产用于MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的第一轻链，DNA构建体编码连接亲本抗CD20 mAb(奥伐单抗)的VH-CH1片段的19个氨基酸的信号肽。
用于MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2的第二轻链的构建体
为了生产用于MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的第二轻链，DNA构建体编码连接亲本抗CD3 mAb(美国专利公开No.2009/0252683)的VL-CL的20个氨基酸的信号肽。
用于MAT-Fab KiH1和MAT-Fab KiH2的Fc链的构建体
为了生产用于MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的Fc多肽链，DNA构建体编码22个氨基酸的信号肽(与用于重链构建体的相同)，其连接亲本抗CD3 mAb的铰链-CH2，所述铰链-CH2连接IgG1同种型的突变CH3区，所述突变CH3区包含前述于MAT-Fab重链构建体的讨论中论及的突变。
将用于MAT-Fab(KiH1)双特异性抗体的Fc链的CH3结构域突变，以将酪氨酸(Y)残基变成苏氨酸(T)残基，以在CH3结构域中形成结构孔洞，由此互补于重链CH3结构域中的结构杵臼突变(参见，上文)。
将用于MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的Fc链的CH3结构域突变，以将苏氨酸(T)残基变成丝氨酸(S)残基、将亮氨酸(L)残基变成丙氨酸(A)残基以及将酪氨酸(Y)残基变成缬氨酸(V)残基，以在该CH3结构域中形成结构孔洞。还将还CH3结构域突变，以将酪氨酸(Y)残基变成半胱氨酸(C)残基。半胱氨酸(C)残基的引入使得可以与上述的MAT-Fab(KiH2)重链的互补突变CH3结构域形成二硫键，这进一步稳定杂二聚化。
下表中显示了用于MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的四条多肽链的氨基酸序列。
表1.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH1)双特异性抗体的重链
表2.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH1)双特异性抗体的第一轻链
表3.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH1)双特异性抗体的第二轻链
表4.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH1)Fc多肽链
表5.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的重链
表6.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的第一轻链
表7.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的第二轻链
表8.CD20/CD3 MAT-Fab(KiH2)Fc多肽链
表达水平
将上述编码用于MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)的四条多肽链的每一条的DNA构建体通过标准方法克隆至pTT表达载体中。随后将所得到的编码SEQ ID NO:1-4或编码SEQID NO:5-8的重组pTT载体共同转染至HEK293E细胞中，用于MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)双特异性抗体的表达。细胞培养物中的表达水平显示于下表中。
表9.
构建体 表达水平
MAT-Fab(KiH1) 20.6mg/L
MAT-Fab(KiH2) 36.7mg/L
纯化和表征
一旦完成了生产阶段，收集细胞培养物并通过蛋白A亲和性色谱进行蛋白纯化。
通过大小排阻色谱(SEC)测定了通过蛋白A色谱单步纯化后的每个MAT-Fab抗体制备物的单体级分。SEC分析的结果显示于图2和图3中。
SEC分析揭示了98.19％的MAT-Fab(KiH1)抗体制备物和95.7％的MAT-Fab(KiH2)抗体制备物作为单一物质(“单体级分”)存在。
荧光激活细胞分选(FACS)
使用以下所述的实验方案，通过荧光激活细胞分选，检查了纯化的MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)结合细胞表面上表达的CD20和CD3靶抗原的能力。
设备
BD FACSVerse系列号：01131005894
Olympus CKX41系列号：01121005367
Eppendorf离心机5810R系列号：01121005414
Thermo Series II水套，系列号：01121005408
材料和试剂
BD Falcon圆底试管，目录号No.352052批号No.3070549
组织培养平板96孔，具有低蒸发的U底，目录号No.353077批号No.34285048
FBS，GIBCO目录号No.10099，批号1652792
PBS，GIBCO目录号No.10010，批号1710584
RPMI培养基1640(1×)，GIBCO目录号No.A10491，批号No.1747206
Alexa 488小鼠抗人IgG1，Invitrogen，目录号No.A-10631，批号1744792
细胞系
Jurkat，ATCC目录号No.TIB-152，是表达CD3表面抗原的T细胞白血病细胞系。
Raji，ATCC目录号No.CCL-86，批号60131961，是表达CD20表面抗原的伯基特淋巴瘤B细胞系。
用于FACS的抗体
FACS程序
1.在冰冷PBS中等分5×105个细胞。
2.将细胞在冰上在2％FBS/PBS中封闭30分钟。
3.用抗CD20抗体在冰上将细胞孵育1h。抗体的初始浓度为(133.33nM)20ug/ml，并连续1:5稀释。每个体积为200μL。
4.在PBS中洗涤3次，在4℃下2000rpm5min。
5.用小鼠抗人IgG1 Fc二抗，Alexa 488(AF488)小鼠抗人IgG1 100μL(10μg/mL)(1:100稀释)在冰上并避光孵育细胞1小时。
6.在PBS中洗涤3次，在4℃下2000rpm5min。
7.将细胞重悬浮于PBS中。通过BD FACSVerse流式细胞计数器检测平均荧光强度(MFI)。
结果
结果显示于图4和图5中。两种MAT-Fab双特异性抗体都能够结合B细胞(CD20 Raji细胞)和T细胞(CD3 Jurkat细胞)上的CD20和CD3。
在T细胞存在下诱导B细胞凋亡的功能活性
使用以下所述的实验方案，在B细胞凋亡分析试验中，检测纯化的MAT-Fab(KiH1)和MAT-Fab(KiH2)结合细胞表面上表达的CD20和CD3靶抗原的能力。
设备
BD FACSVerse系列号：01131005894
Olympus CKX41系列号：01121005367
Eppendorf离心机5810R系列号：01121005414
Thermo Series II水套，系列号：01121005408
材料和试剂
BD Falcon圆底试管，目录号No.352052批号No.3070549
组织培养平板96孔，具有低蒸发的U底，目录号No.353077批号No.4292046
FBS，GIBCO目录号No.10099，批号1652792
PBS，GIBCO目录号No.10010，批号1710584
RPMI培养基1640(1×)，GIBCO目录号No.11875，批号No.1731226
Ficoll Paque Plus，GE HEALTHCARE，目录号：GE17144002，批号：10237843
PE小鼠抗人CD19，BD Pharmingen，目录号.555413，批号：5274713
细胞系
Raji，ACTT目录号No.CCL-86，批号60131961
供体编号：00123
用于B细胞凋亡分析的抗体
抗体名称 批号No. 抗体特异性
MAT-Fab(KiH1) 160411002 CD20/CD3
奥伐单抗 20140225B CD20
CD3 mAb Pr2016012817 CD3
MAT-Fab(KiH2) 160429004 CD20/CD3
程序
用于分离单核细胞的程序
血样的制备
1.新鲜抽取100ml人血至抗凝剂处理过的试管。
2.将等体积的RPMI1640(100ml)加入血液中并温和混合。
3.使用前，将Ficoll-Paque密度梯度介质温热至18℃至20℃。
4.将Ficoll-Paque介质瓶颠倒几次，以确保彻底混合。
5.将Ficoll-Paque介质(15ml)加入50ml离心管中。
6.将稀释的血样(20ml)小心地层铺在Ficoll-Paque介质溶液上，不混合Ficoll-Paque介质溶液和稀释的血样。
7.将Ficoll-Paque与血样在400g下在18℃至20℃离心30至40min。
8.将单核细胞层从梯度转移至无菌离心管中。
洗涤细胞分离物
1.估算转移的单核细胞的体积并且将至少3体积的PBS加入离心管中的单核细胞。
2.将细胞和PBS在400至500×g下在18℃至20℃离心10min并且除去上清液。
3.重复洗涤。
4.除去上清液，并且将细胞沉淀物重悬浮于分析缓冲液中。
B细胞耗尽
分析介质是RPMI1640加10％FBS
1.收集对数生长期的靶细胞(Raji细胞)并且用分析介质洗涤一次。将细胞密度调节至5×105个细胞/ml，并且将100μl细胞悬浮液应用于分析平板的每个孔中。
2.将测试抗体连续稀释，并将50μl加入以上分析平板的每个孔中。最终的抗体起始浓度为50μg/ml并随后连续稀释。
3.将PBMC细胞密度调节至2.5×106个细胞/ml，并且将100μl细胞悬浮液应用于分析平板的每个孔中(效应细胞与靶比例为5:1)。
4.将分析平板在37℃与5％CO2下孵育1天、2天和3天。
在第1天、第2天和第3天，通过在2000rpm在4℃离心5min收集样品，并用PBS洗涤一次。
5.用50μl1:5稀释的缀合PE的抗人CD19检测抗体在冰上孵育每个样品30分钟。
6.用PBS洗涤样品并通过FACSVerse测试。
结果
结果显示于图6中。到细胞耗尽分析试验的第2天，两种MAT-Fab双特异性抗体都能够诱导T细胞介导的B细胞凋亡。
将上文中引用的所有专利、申请和出版物按引用并入本文中。
本文中描述的本发明的其他改变和实施方案现在对本领域技术人员将是明显的，而且没有脱离本发明的公开或以下的权利要求。

Claims (74)

1.包含多肽链(a)、(b)、(c)和(d)的单价不对称串联Fab双特异性抗体(MAT-Fab抗体)，其中：
(a)是重多肽链(“重链”)，其中所述重链包含(从氨基端至羧基端)：VLA-CL-VHB-CH1-铰链-CH2-CH3m1，其中：
VLA是直接与CL融合的人免疫球蛋白轻链可变结构域，CL是人轻链恒定结构域，其中VLA-CL是识别第一抗原或表位的第一Fab结合单元的免疫球蛋白轻链组分并与VHB直接融合，其中VHB是与CH1直接融合的人免疫球蛋白重链可变结构域，CH1是人免疫球蛋白重链CH1恒定结构域，其中VHB-CH1是识别第二抗原或表位的第二Fab结合单元的免疫球蛋白重链组分，并且其中VHB-CH1与铰链-CH2直接融合，其中铰链-CH2是免疫球蛋白重链的铰链-CH2区，并且其中铰链-CH2与CH3m1直接融合，CH3m1是第一人免疫球蛋白重链CH3恒定结构域，其已经用一个或多个杵臼进入孔洞(KiH)突变进行了突变以在所述CH3m1恒定结构域中形成结构杵臼或结构孔洞；
(b)是包含VHA-CH1的第一MAT-Fab轻链，其中VHA是与CH1直接融合的人免疫球蛋白重链可变结构域，CH1是人免疫球蛋白重链CH1恒定结构域，并且其中VHA-CH1是所述第一Fab结合单元的免疫球蛋白重链组分；
(c)是包含VLB-CL的第二MAT-Fab轻链，其中VLB是与CL直接融合的人免疫球蛋白轻链可变结构域，CL是人免疫球蛋白轻链CL结构域，并且其中VLB-CL是所述第二Fab结合单元的免疫球蛋白轻链组分；和
(d)是包含铰链-CH2-CH3m2的Fc多肽链(Fc链)，其中铰链-CH2是免疫球蛋白重链的铰链-CH2区并且其中铰链-CH2与CH3m2直接融合，CH3m2是第二人免疫球蛋白重链CH3恒定结构域，其已经用一个或多个杵臼进入孔洞(KiH)突变进行了突变以在所述CH3m2恒定结构域中形成结构杵臼或结构孔洞；
条件是：
在重链的CH3m1结构域已经突变形成结构杵臼时，Fc链的CH3m2结构域已突变形成互补的结构孔洞，以促进CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对；和
在重链的CH3m1结构域已经突变形成结构孔洞时，Fc链的CH3m2结构域已突变形成互补的结构杵臼，以促进CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对；和
所述MAT-Fab抗体任选地在CH3m1结构域和CH3m2结构域中包含突变以引入半胱氨酸残基，以在CH3m1结构域与CH3m2结构域的配对中促进二硫键形成。
2.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，其中，在CH3m1结构域或CH3m2结构域中形成结构杵臼的一个或多个KiH突变是苏氨酸残基变成酪氨酸残基或苏氨酸残基变成色氨酸残基。
3.根据权利要求2的MAT-Fab抗体，其中将苏氨酸残基变成酪氨酸残基的KiH突变将CH3结构域的位置21的苏氨酸变成酪氨酸。
4.根据权利要求2的MAT-Fab抗体，其中将苏氨酸残基变成色氨酸残基的KiH突变将CH3结构域的位置21的苏氨酸变成色氨酸。
5.根据权利要求2-4任一项的MAT-Fab抗体，其中形成结构杵臼的KiH突变是在重链的CH3m1结构域中。
6.根据权利要求1的MAT-Fab，其中，在CH3m1结构域或CH3m2结构域中形成结构孔洞的突变是酪氨酸残基变成苏氨酸残基、或是苏氨酸残基变成丝氨酸残基、亮氨酸残基变成丙氨酸残基和酪氨酸残基变成缬氨酸残基的组合。
7.根据权利要求6的MAT-Fab抗体，其中将酪氨酸残基变成苏氨酸残基的突变将CH3结构域的位置62的酪氨酸变成苏氨酸。
8.根据权利要求6的MAT-Fab抗体，其中，苏氨酸残基变成丝氨酸残基、亮氨酸残基变成丙氨酸残基和酪氨酸残基变成缬氨酸残基的组合是将CH3结构域的位置21的苏氨酸变成丝氨酸、CH3结构域的位置23的亮氨酸变成丙氨酸、和CH3结构域的位置62的酪氨酸变成缬氨酸的组合。
9.根据权利要求6-8任一项的MAT-Fab抗体，其中形成结构孔洞的一个或多个KiH突变是在Fc链的CH3m2结构域中。
10.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，其中CH3m1结构域和CH3m2结构域均进一步包含用半胱氨酸替代氨基酸残基的突变，以促进CH3m1和CH3m2结构域之间形成二硫键。
11.根据权利要求10的MAT-Fab抗体，其中突变是丝氨酸变成半胱氨酸或酪氨酸变成半胱氨酸。
12.根据权利要求11的MAT-Fab抗体，其中丝氨酸残基变成半胱氨酸残基是将CH3结构域的位置9的丝氨酸变成半胱氨酸。
13.根据权利要求11的MAT-Fab抗体，其中酪氨酸残基变成半胱氨酸残基是将CH3结构域的位置4的酪氨酸变成半胱氨酸。
14.根据权利要求10的MAT-Fab抗体，其中CH3m1结构域包含将CH3结构域的位置9的丝氨酸变成半胱氨酸的突变，并且CH3m2结构域包含将CH3结构域的位置4的酪氨酸变成半胱氨酸的突变。
15.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，其中重链(a)和Fc链(d)的CH2结构域各自包含一个或多个突变，来降低或消除至少一种Fc效应子功能。
16.根据权利要求15的MAT-Fab抗体，其中重链的CH2结构域和Fc链的CH2结构域各自包含两个突变，以将亮氨酸234变成丙氨酸以及将亮氨酸235变成丙氨酸(EU编号)。
17.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，包含：
(a)包含表1中的氨基酸序列的重链，
(b)包含表2中的氨基酸序列的第一轻链，
(c)包含表3中的氨基酸序列的第二轻链，和
(d)包含表4中的氨基酸序列的Fc链。
18.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，包含：
(a)包含表5中的氨基酸序列的重链，
(b)包含表6中的氨基酸序列的第一轻链，
(c)包含表7中的氨基酸序列的第二轻链，和
(d)包含表8中的氨基酸序列的Fc链。
19.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，其中MAT-Fab抗体结合两个不同的表位。
20.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，其中MAT-Fab抗体结合两个不同的靶抗原。
21.根据权利要求20的MAT-Fab抗体，其中两个不同的靶抗原是两种不同的靶细胞因子。
22.根据权利要求21的MAT-Fab抗体，其中两种不同的细胞因子选自：淋巴因子、单核因子和多肽激素。
23.根据权利要求20的MAT-Fab抗体，其中两个不同的靶抗原选自以下的抗原对：CD20和CD3、CD3和CD19、CD3和Fc-γ-RIIIA、CD3和TPBG、CD3和Epha10、CD3和IL-5Rα、CD3和TASCTD-2、CD3和CLEC12A、CD3和Prominin-1、CD3和IL-23R、CD3和ROR1、CD3和IL-3Rα、CD3和PSA、CD3和CD8、CD3和Glypican3、CD3和FAP、CD3和EphA2、CD3和ENPP3、CD3和CD33、CD3和CD133、CD3和EpCAM、CD3和CD19、CD3和Her2、CD3和CEA、CD3和GD2、CD3和PSMA、CD3和BCMA、CD3和A33、CD3和B7-H3、CD3和EGFR、CD3和P-钙粘蛋白、CD3和HMW-MAA、CD3和TIM-3、CD3和CD38、CD3和TAG-72、CD3和SSTR、CD3和FRA、CD16和CD30、CD64和Her2、CD137和CD20、CD138和CD20、CD19和CD20、CD38和CD20、CD20和CD22、CD40和CD20、CD47和CD20、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、PD-1和PD-L1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、VEGF和EGFR、HGF和VEGF、VEGF的第一表位和VEGF的不同第二表位、VEGF和Ang2、EGFR和cMet、PDGF和VEGF、VEGF和DLL-4、OX40和PD-L1、ICOS和PD-1、ICOS和PD-L1、Lag-3和PD-1、Lag-3和PD-L1、Lag-3和CTLA-4、ICOS和CTLA-4、CD138和CD40、CD38和CD138、CD38和CD40、CD-8和IL-6、CSPGs和RGM A、CTLA-4和BTN02、CTLA-4和PD-1、IGFl和IGF2、IGFl/2和Erb2B、IGF-IR和EGFR、EGFR和CD13、IGF-IR和ErbB3、EGFR-2和IGFR、Her2的第一表位和Her2的第二不同表位、因子IXa和Met、因子X和Met、VEGFR-2和Met、VEGF-A和促血管生成素-2(Ang-2)、IL-12和TWEAK、IL-13和IL-lβ、MAG和RGMA、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-1和CTLA-4、PD-1和TIM-3、RGM A和RGM B、Te38和TNFα、TNFα和Blys、TNFα和CD22、TNFα和a CTLA-4、TNFα和GP130、TNFα和IL-12p40、以及TNFα和RANK配体。
24.根据权利要求20的MAT-Fab抗体，其中由MAT-Fab抗体结合的两个不同靶抗原中的一个是在效应细胞的表面上表达的抗原，而被MAT-Fab抗体结合的另一个靶抗原是在认为对人受试者有害的靶细胞的表面上表达的疾患相关抗原。
25.根据权利要求24的MAT-Fab抗体，其中效应细胞选自：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。
26.根据权利要求24的MAT-Fab抗体，其中效应细胞上的抗原选自：CD3、CD16和CD64。
27.根据权利要求24的MAT-Fab抗体，其中有害靶细胞选自：肿瘤细胞、自体反应细胞和病毒感染的细胞。
28.根据权利要求24的MAT-Fab抗体，其中有害靶细胞的表面上表达的疾患相关抗原是在肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原。
29.根据权利要求28的MAT-Fab抗体，其中肿瘤相关抗原选自：CD19、CD20、人表皮生长因子受体2(HER2)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)。
30.根据权利要求28的MAT-Fab抗体，其中肿瘤细胞是恶性B细胞。
31.根据权利要求30的MAT-Fab抗体，其中恶性B细胞是选自以下的癌症疾患的细胞：急性淋巴母细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤。
32.根据权利要求28的MAT-Fab抗体，其中效应细胞上的抗原是T细胞上的CD3，而肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原是恶性B细胞上的CD20。
33.根据权利要求1的MAT-Fab抗体，其与选自以下的试剂缀合：治疗剂、成像剂和细胞毒性剂。
34.根据权利要求33的MAT-Fab抗体，其中成像剂选自：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、生物素、链霉亲和素和亲和素。
35.根据权利要求34的MAT-Fab抗体，其中放射性标记选自：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
36.根据权利要求33的MAT-Fab抗体，其中治疗剂或细胞毒性剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素和凋亡剂。
37.结晶形式的根据权利要求1的MAT-Fab抗体。
38.一种用于结晶的MAT-Fab抗体释放的组合物，其包含：
(a)根据权利要求37的结晶的MAT-Fab抗体；
(b)赋形剂成分，和
(c)聚合物载体。
39.根据权利要求38的用于结晶的MAT-Fab抗体释放的组合物，其中赋形剂成分选自：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
40.根据权利要求38或39的用于结晶的MAT-Fab抗体释放的组合物，其中聚合物载体是选自以下的一种或多种的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)或PLGA、聚(b-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二噁烷酮)；聚(乙二醇)、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)磷腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸酐/烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖，其混合物、及其共聚物。
41.一种药物组合物，其包含根据权利要求1、17和18任一项的MAT-Fab抗体和药物学上可接受的载体。
42.根据权利要求41的药物组合物，其配制用于通过选自以下的至少一种方式施用于个体：胃肠外、皮下、肌内、静脉内、动脉内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内和透皮。
43.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1的MAT-Fab抗体的一个、两个、三个或四个多肽。
44.载体，其包含根据权利要求43的分离核酸。
45.根据权利要求44的载体，其中所述载体选自：pcDNA、pTTpTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO和pBJ。
46.分离的宿主细胞，其包含根据权利要求45的载体。
47.分离的宿主细胞，其包含根据权利要求44的载体。
48.根据权利要求47的分离的宿主细胞，其中宿主细胞是原核宿主细胞或真核宿主细胞。
49.根据权利要求48的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核宿主细胞。
50.根据权利要求49的宿主细胞，其中所述原核宿主细胞是细菌宿主细胞。
51.根据权利要求50的宿主细胞，其中细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。
52.根据权利要求48的宿主细胞，其中宿主细胞是真核宿主细胞。
53.根据权利要求52的宿主细胞，其中真核宿主细胞选自：哺乳动物宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、线虫宿主细胞、原生动物宿主细胞和鱼宿主细胞。
54.根据权利要求53的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
55.根据权利要求54的宿主细胞，其中哺乳动物宿主细胞选自：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人胚肾(HEK293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、人B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。
56.根据权利要求55的宿主细胞，其中哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞或人胚肾(HEK293)细胞。
57.根据权利要求53的宿主细胞，其中真核宿主细胞是真菌细胞。
58.根据权利要求57的宿主细胞，其中真菌细胞选自：曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和假丝酵母属(Candida)。
59.根据权利要求58的宿主细胞，其中酵母属宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞。
60.根据权利要求53的宿主细胞，其中真核宿主细胞是昆虫细胞。
61.根据权利要求60的宿主细胞，其中昆虫细胞是Sf9昆虫细胞。
62.一种生产MAT-Fab抗体的方法，包括在足以产生所述结合蛋白的条件下在培养基中培养权利要求47-61任一项中所述的宿主细胞。
63.根据权利要求62的方法产生的MAT-Fab抗体。
64.一种治疗个体疾病或疾患的方法，包括将根据权利要求1的MAT-Fab抗体施用于个体，其中MAT-Fab抗体结合对个体有害的靶细胞的表面上表达的表位或抗原，其中MAT-Fab抗体与有害靶细胞的结合提供对疾病或疾患的治疗。
65.一种治疗人受试者疾患的方法，包括将根据权利要求1的MAT-Fab抗体施用于人受试者的步骤，其中所述MAT-Fab抗体结合效应细胞上的抗原并结合对人受试者有害的靶细胞上表达的疾患相关抗原，其中MAT-Fab抗体与效应细胞和靶细胞两者的结合介导效应细胞与所述有害靶细胞相互作用并提供对疾患的治疗。
66.根据权利要求65的方法，其中效应细胞选自：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。
67.根据权利要求65的方法，其中效应细胞上表达的抗原选自：CD3、CD16和CD64。
68.根据权利要求65的方法，其中有害靶细胞选自：肿瘤细胞、自体反应细胞和病毒感染的细胞。
69.根据权利要求65的方法，其中有害靶细胞的表面上表达的疾患相关抗原是在肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原。
70.根据权利要求69的方法，其中肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗选自：CD19、CD20、人表皮生长因子受体2(HER2)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、和受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)。
71.根据权利要求69的方法，其中肿瘤细胞是恶性B细胞。
72.根据权利要求71的方法，其中恶性B细胞是选自以下的癌疾患的细胞：急性淋巴母细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、成熟B细胞肿瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、皮肤滤泡中心淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、浆细胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和间变性大细胞淋巴瘤。
73.根据权利要求69的方法，其中效应细胞上表达的抗原是T细胞上表达的CD3，而肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原是恶性B细胞上的CD20。
74.根据权利要求73的方法，其中MAT-Fab抗体包含四条多肽链，其包含表1-4中的氨基酸序列或表5-8中的氨基酸序列。
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