JP7033328B2 - 一価の非対称タンデムFab二重特異性抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、改変された二重特異性抗体、その組成物、ならびにそのような二重特異性抗体を製造および使用する方法に関する。
ここ50年間にわたる新型抗体の改変の取り組みは、様々な二重特異性および多重特異性結合フォーマットの実証および利用可能性を導いた。その多様なフォーマットは、例えば、単鎖Fv抗体(scFv、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)(非特許文献1))、四価のIgG-scFv融合体(Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol., 15: 159-163 (1997)(非特許文献2))、ダイアボディ(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)(非特許文献3))、タンデムscFv分子(例えば、Bargou et al., Science 321, 974-977 (2008)(非特許文献4)を参照のこと)、四価のIgG様二重可変ドメイン抗体(「DVD-Ig」、Wu et al., Nat. Biotechnol., 25: 1290-1297 (2007)(非特許文献5))、四価のFabs-in-tandem免疫グロブリン(「FIT-Ig」)(WO 2015/103072, Epimab Biotheraupeutics(特許文献1))、二価のラット/マウスハイブリッド二重特異性IgG(Lindhofer et al., J. Immunol., 155: 219-225 (1995)(非特許文献6))、および二重特異性クロスマブ結合タンパク質(例えば、WO 2013/026831 (Roche Glycart AG)(特許文献2);WO 2014/167022 (Engmab AG)(特許文献3)を参照のこと)を含む。疾患の処置における使用の可能性に関連して特に関心が高いのは、2種の異なるエピトープまたは抗原に結合できる種々の改変された二重特異性抗体を設計および生産し、それによって併用療法の必要性をなくすことであった。例えば、Spiess et al., Molec. Immunol., 67: 95-106 (2015)(非特許文献7)、Riethmuller, Cancer Immun., 12: 12-18 (2012)(非特許文献8)、Kontermann, Acta Pharmacologica Sinica, 26 (1): 1-9 (2005)(非特許文献9)、Marvin et al., Acta Pharmacologica Sinica, 26(6): 649-658 (2005)(非特許文献10)の概説を参照のこと。
(a)(アミノ末端からカルボキシル末端へ)VLA-CL-VHB-CH1-ヒンジ-CH2-CH3m1を含む重ポリペプチド鎖(重鎖)であって、
ここで、
VLAは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト軽鎖定常ドメインであるCLに直接融合されており、
VLA-CLは、第一の抗原またはエピトープを認識する第一のFab結合ユニットの免疫グロブリン軽鎖構成部分であり、かつ、VHBに直接融合されており、
VHBは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に直接融合されており、
VHB-CH1は、第二の抗原またはエピトープを認識する第二のFab結合ユニットの免疫グロブリン重鎖構成部分であり、かつ、ヒンジ-CH2に直接融合されており、
ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ-CH2領域であり、かつ、CH3m1に直接融合されており、
CH3m1は、第一のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、CH3m1定常ドメイン中に構造的ノブまたは構造的ホールを形成している、
重鎖;
(b)VHA-CH1を含む第一のMAT-Fab軽鎖であって、
ここで、
VHAは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に直接融合されており、
VHA-CH1は、前記第一のFab結合ユニットの免疫グロブリン重鎖構成部分である、
第一のMAT-Fab軽鎖;
(c)VLB-CLを含む第二のMAT-Fab軽鎖であって、
ここで、
VLBは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン軽鎖CLドメインであるCLに直接融合されており、
VLB-CLは、前記第二のFab結合ユニットの免疫グロブリン軽鎖構成部分である、
第二のMAT-Fab軽鎖;および
(d)ヒンジ-CH2-CH3m2を含むFcポリペプチド鎖(Fc鎖)であって、
ここで、
ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ-CH2領域であり、かつ、CH3m2に直接融合されており、
CH3m2は、第二のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、CH3m2定常ドメイン中に構造的ノブまたは構造的ホールを形成している、
Fc鎖;
但し:
重鎖のCH3m1ドメインが構造的ノブを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖のCH3m2ドメインは、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く構造的ホールを形成するよう突然変異されており;
重鎖のCH3m1ドメインが構造的ホールを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖のCH3m2ドメインは、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く構造的ノブを形成するよう突然変異されており;
任意で(あってもなくても)、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合においてジスルフィド結合形成に有利に働くシステイン残基を導入する突然変異を、重鎖のCH3m1ドメインとFc鎖のCH3m2ドメインの両方に含む。
[本発明1001]
ポリペプチド鎖(a)、(b)、(c)および(d)を含む、一価の非対称タンデムFab二重特異性抗体(MAT-Fab抗体)であって:
(a)が、(アミノ末端からカルボキシル末端へ)VL A -CL-VH B -CH1-ヒンジ-CH2-CH3m1を含む重ポリペプチド鎖(重鎖)であり、
ここで、
VL A は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト軽鎖定常ドメインであるCLに直接融合されており、
VL A -CLは、第一の抗原またはエピトープを認識する第一のFab結合ユニットの免疫グロブリン軽鎖構成部分であり、かつ、VH B に直接融合されており、
VH B は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に直接融合されており、
VH B -CH1は、第二の抗原またはエピトープを認識する第二のFab結合ユニットの免疫グロブリン重鎖構成部分であり、かつ、ヒンジ-CH2に直接融合されており、
ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ-CH2領域であり、かつ、CH3m1に直接融合されており、
CH3m1は、第一のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、CH3m1定常ドメイン中に構造的ノブまたは構造的ホールを形成しており;
(b)が、VH A -CH1を含む第一のMAT-Fab軽鎖であり、
ここで、
VH A は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に直接融合されており、
VH A -CH1は、前記第一のFab結合ユニットの免疫グロブリン重鎖構成部分であり;
(c)が、VL B -CLを含む第二のMAT-Fab軽鎖であり、
ここで、
VL B は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン軽鎖CLドメインであるCLに直接融合されており、
VL B -CLは、前記第二のFab結合ユニットの免疫グロブリン軽鎖構成部分であり;かつ
(d)が、ヒンジ-CH2-CH3m2を含むFcポリペプチド鎖(Fc鎖)であり、
ここで、
ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ-CH2領域であり、かつ、CH3m2に直接融合されており、
CH3m2は、第二のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、CH3m2定常ドメイン中に構造的ノブまたは構造的ホールを形成しており;
但し:
重鎖のCH3m1ドメインが構造的ノブを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖のCH3m2ドメインが、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く相補的な構造的ホールを形成するよう突然変異されており;
重鎖のCH3m1ドメインが構造的ホールを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖のCH3m2ドメインが、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く相補的な構造的ノブを形成するよう突然変異されており;
該MAT-Fab抗体が、任意で、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合におけるジスルフィド結合形成に有利に働くシステイン残基を導入する突然変異を、CH3m1ドメインおよびCH3m2ドメインに含む、
MAT-Fab抗体。
[本発明1002]
CH3m1ドメインまたはCH3m2ドメイン中の、構造的ノブを形成する1以上のKiH突然変異が、トレオニン残基からチロシン残基への変化またはトレオニン残基からトリプトファン残基への変化である、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1003]
トレオニン残基からチロシン残基へ変化させるKiH突然変異が、CH3ドメインの位置21のトレオニンをチロシンへ変化させる、本発明1002のMAT-Fab抗体。
[本発明1004]
トレオニン残基からトリプトファン残基へ変化させるKiH突然変異が、CH3ドメインの位置21のトレオニンをトリプトファンへ変化させる、本発明1002のMAT-Fab抗体。
[本発明1005]
構造的ノブを形成するKiH突然変異が、重鎖のCH3m1ドメイン中にある、本発明1002~1004のいずれかのMAT-Fab抗体。
[本発明1006]
構造的ホールを形成するCH3m1ドメインまたはCH3m2ドメイン中の突然変異が、チロシン残基からトレオニン残基への変化、または、トレオニン残基からセリン残基への変化と、ロイシン残基からアラニン残基への変化と、チロシン残基からバリン残基への変化との組み合わせである、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1007]
チロシン残基をトレオニン残基へ変化させる突然変異が、CH3ドメインの位置62のチロシンをトレオニンへ変化させる、本発明1006のMAT-Fab抗体。
[本発明1008]
トレオニン残基からセリン残基への変化と、ロイシン残基からアラニン残基への変化と、チロシン残基からバリン残基への変化との組み合わせが、CH3ドメインの位置21のトレオニンからセリンへの変化と、CH3ドメインの位置23のロイシンからアラニンへの変化と、CH3ドメインの位置62のチロシンからバリンへの変化との組み合わせである、本発明1006のMAT-Fab抗体。
[本発明1009]
構造的ホールを形成する1以上のKiH突然変異が、Fc鎖のCH3m2ドメイン中にある、本発明1006~1008のいずれかのMAT-Fab抗体。
[本発明1010]
CH3m1ドメインおよびCH3m2ドメインの各々が、アミノ酸残基をシステインと置き換えてCH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの間のジスルフィド結合形成を促進する突然変異をさらに含む、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1011]
突然変異が、セリンからシステインへの変化またはチロシンからシステインへの変化である、本発明1010のMAT-Fab抗体。
[本発明1012]
セリン残基からシステイン残基の変化が、CH3ドメインの位置9のセリンをシステインへ変化させる、本発明1011のMAT-Fab抗体。
[本発明1013]
チロシン残基からシステイン残基の変化が、CH3ドメインの位置4のチロシンをシステインへ変化させる、本発明1011のMAT-Fab抗体。
[本発明1014]
CH3m1ドメインが、CH3ドメインの位置9のセリンをシステインへ変化させる突然変異を含み、CH3m2ドメインが、CH3ドメインの位置4のチロシンをシステインへ変化させる突然変異を含む、本発明1010のMAT-Fab抗体。
[本発明1015]
重鎖(a)およびFc鎖(d)のCH2ドメインが各々、少なくとも1つのFcエフェクター機能を低減または排除する1以上の突然変異を含む、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1016]
重鎖のCH2ドメインおよびFc鎖のCH2ドメインが各々、(EUナンバリングで)ロイシン234をアラニンへ変化させ、またロイシン235をアラニンへ変化させる2つの突然変異を含む、本発明1015のMAT-Fab抗体。
[本発明1017]
(a)表1のアミノ酸配列を含む重鎖、
(b)表2のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖、
(c)表3のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖、および
(d)表4のアミノ酸配列を含むFc鎖
を含む、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1018]
(a)表5のアミノ酸配列を含む重鎖、
(b)表6のアミノ酸配列を含む第一の軽鎖、
(c)表7のアミノ酸配列を含む第二の軽鎖、および
(d)表8のアミノ酸配列を含むFc鎖
を含む、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1019]
2種の異なるエピトープに結合する、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1020]
2種の異なる標的抗原に結合する、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1021]
2種の異なる標的抗原が、2種の異なる標的サイトカインである、本発明1020のMAT-Fab抗体。
[本発明1022]
2種の異なるサイトカインが、リンホカイン、モノカイン、およびポリペプチドホルモンからなる群より選択される、本発明1021のMAT-Fab抗体。
[本発明1023]
2種の異なる標的抗原が、以下からなる抗原ペアの群より選択される、本発明1020のMAT-Fab抗体:
CD20とCD3、CD3とCD19、CD3とFc-ガンマ-RIIIA、CD3とTPBG、CD3とEpha10、CD3とIL-5Rα、CD3とTASCTD-2、CD3とCLEC12A、CD3とプロミニン-1、CD3とIL-23R、CD3とROR1、CD3とIL-3Rα、CD3とPSA、CD3とCD8、CD3とグリピカン3、CD3とFAP、CD3とEphA2、CD3とENPP3、CD3とCD33、CD3とCD133、CD3とEpCAM、CD3とCD19、CD3とHer2、CD3とCEA、CD3とGD2、CD3とPSMA、CD3とBCMA、CD3とA33、CD3とB7-H3、CD3とEGFR、CD3とP-カドヘリン、CD3とHMW-MAA、CD3とTIM-3、CD3とCD38、CD3とTAG-72、CD3とSSTR、CD3とFRA、CD16とCD30、CD64とHer2、CD137とCD20、CD138とCD20、CD19とCD20、CD38とCD20、CD20とCD22、CD40とCD20、CD47とCD20、CD137とEGFR、CD137とHer-2、CD137とPD-1、CD137とPDL-1、PD-1とPD-L1、VEGFとPD-L1、Lag-3とTIM-3、OX40とPD-1、TIM-3とPD-1、TIM-3とPDL-1、EGFRとDLL-4、VEGFとEGFR、HGFとVEGF、VEGFの第一のエピトープとVEGFの異なる第二のエピトープ、VEGFとAng2、EGFRとcMet、PDGFとVEGF、VEGFとDLL-4、OX40とPD-L1、ICOSとPD-1、ICOSとPD-L1、Lag-3とPD-1、Lag-3とPD-L1、Lag-3とCTLA-4、ICOSとCTLA-4、CD138とCD40、CD38とCD138、CD38とCD40、CD-8とIL-6、CSPGとRGM A、CTLA-4とBTN02、CTLA-4とPD-1、IGFlとIGF2、IGFl/2とErb2B、IGF-IRとEGFR、EGFRとCD13、IGF-IRとErbB3、EGFR-2とIGFR、Her2の第一のエピトープとHer2の第二の異なるエピトープ、第IXa因子とMet、第X因子とMet、VEGFR-2とMet、VEGF-Aとアンジオポエチン-2(Ang-2)、IL-12とTWEAK、IL-13とIL-lβ、MAGとRGM A、NgRとRGM A、NogoAとRGM A、OMGpとRGM A、PDL-1とCTLA-4、PD-1とTIM-3、RGM AとRGM B、Te38とTNFα、TNFαとBlys、TNFαとCD-22、TNFαとCTLA-4、TNFαとGP130、TNFαとIL-12p40、およびTNFαとRANKリガンド。
[本発明1024]
MAT-Fab抗体が結合する2種の異なる標的抗原の一方が、エフェクター細胞の表面上に発現される抗原であり、MAT-Fab抗体が結合する他方の標的抗原が、ヒト対象にとって有害であると見なされる標的細胞の表面上に発現される障害関連抗原である、本発明1020のMAT-Fab抗体。
[本発明1025]
エフェクター細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、好中球、およびマクロファージからなる群より選択される、本発明1024のMAT-Fab抗体。
[本発明1026]
エフェクター細胞上の抗原が、CD3、CD16、およびCD64からなる群より選択される、本発明1024のMAT-Fab抗体。
[本発明1027]
有害な標的細胞が、腫瘍細胞、自己反応性細胞、およびウイルス感染細胞からなる群より選択される、本発明1024のMAT-Fab抗体。
[本発明1028]
有害な標的細胞の表面上に発現される障害関連抗原が、腫瘍細胞上に発現される腫瘍関連抗原である、本発明1024のMAT-Fab抗体。
[本発明1029]
腫瘍関連抗原が、CD19、CD20、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、および受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)からなる群より選択される、本発明1028のMAT-Fab抗体。
[本発明1030]
腫瘍細胞が悪性B細胞である、本発明1028のMAT-Fab抗体。
[本発明1031]
悪性B細胞が、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、前駆B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫、成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞型リンパ腫からなる群より選択されるがん障害の細胞である、本発明1030のMAT-Fab抗体。
[本発明1032]
エフェクター細胞上の抗原が、T細胞上のCD3であり、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原が、悪性B細胞上のCD20である、本発明1028のMAT-Fab抗体。
[本発明1033]
治療剤、造影剤、および細胞毒性剤からなる群より選択される作用物質にコンジュゲートされている、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1034]
造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、ビオチン、ストレプトアビジン、およびアビジンからなる群より選択される、本発明1033のMAT-Fab抗体。
[本発明1035]
放射性標識が、 3 H、 14 C、 35 S、 90 Y、 99 Tc、 111 In、 131 I、 177 Lu、 166 Ho、および 153 Smからなる群より選択される、本発明1034のMAT-Fab抗体。
[本発明1036]
治療剤または細胞毒性剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素、およびアポトーシス剤からなる群より選択される、本発明1033のMAT-Fab抗体。
[本発明1037]
結晶化形態の、本発明1001のMAT-Fab抗体。
[本発明1038]
(a)本発明1037の結晶化されたMAT-Fab抗体、
(b)賦形剤成分、および
(c)ポリマー担体
を含む、結晶化されたMAT-Fab抗体の放出のための組成物。
[本発明1039]
賦形剤成分が、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、本発明1038の結晶化されたMAT-Fab抗体の放出のための組成物。
[本発明1040]
ポリマー担体が、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリラート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)またはPLGA、ポリ(b-ヒドロキシブチラート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン); ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸/アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギナート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、それらのブレンド、ならびにそれらの共重合体からなる群のうちの1種以上から選択されるポリマーである、本発明1038または1039の結晶化されたMAT-Fab抗体の放出のための組成物。
[本発明1041]
本発明1001、1017、および1018のいずれかのMAT-Fab抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1042]
非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内(intracavitary)、腔内(intracelial)、小脳内、側脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、ボーラス、経膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、および経皮からなる群より選択される少なくとも1つの様式による個体への投与のために調製される、本発明1041の医薬組成物。
[本発明1043]
本発明1001のMAT-Fab抗体のポリペプチドの1つ、2つ、3つ、または4つをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1044]
本発明1043の単離された核酸を含む、ベクター。
[本発明1045]
pcDNA、pTT pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、およびpBJからなる群より選択される、本発明1044のベクター。
[本発明1046]
本発明1045のベクターを含む、単離された宿主細胞。
[本発明1047]
本発明1044のベクターを含む、単離された宿主細胞。
[本発明1048]
原核宿主細胞または真核宿主細胞である、本発明1047の単離された宿主細胞。
[本発明1049]
原核宿主細胞である、本発明1048の宿主細胞。
[本発明1050]
原核宿主細胞が細菌宿主細胞である、本発明1049の宿主細胞。
[本発明1051]
細菌宿主細胞が大腸菌(Escherichia coli)細胞である、本発明1050の宿主細胞。
[本発明1052]
真核宿主細胞である、本発明1048の宿主細胞。
[本発明1053]
真核宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、線虫宿主細胞、原生動物宿主細胞、および魚類宿主細胞からなる群より選択される、本発明1052の宿主細胞。
[本発明1054]
哺乳動物宿主細胞である、本発明1053の宿主細胞。
[本発明1055]
哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、ベロ細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓(HEK293)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞、およびMDCK細胞からなる群より選択される、本発明1054の宿主細胞。
[本発明1056]
哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、またはヒト胎児腎臓(HEK293)細胞である、本発明1055の宿主細胞。
[本発明1057]
真核宿主細胞が真菌細胞である、本発明1053の宿主細胞。
[本発明1058]
真菌細胞が、アスペルギルス属(Aspergillus)、ニューロスポーラ属(Neurospora)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、およびカンジダ属(Candida)からなる群より選択される、本発明1057の宿主細胞。
[本発明1059]
サッカロミセス属宿主細胞が、サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、本発明1058の宿主細胞。
[本発明1060]
真核宿主細胞が昆虫細胞である、本発明1053の宿主細胞。
[本発明1061]
昆虫細胞がSf9昆虫細胞である、本発明1060の宿主細胞。
[本発明1062]
本発明1047~1061のいずれかの宿主細胞を、結合タンパク質を生産するのに十分な条件下で、培養培地中にて培養する工程を含む、MAT-Fab抗体を生産する方法。
[本発明1063]
本発明1062の方法に従って生産される、MAT-Fab抗体。
[本発明1064]
本発明1001のMAT-Fab抗体を個体に投与する工程を含む、個体における疾患または障害を処置する方法であって、MAT-Fab抗体が、個体にとって有害である標的細胞の表面上に発現されるエピトープまたは抗原に結合し、有害な標的細胞へのMAT-Fab抗体の結合が、疾患または障害に対する処置を提供する、方法。
[本発明1065]
エフェクター細胞上の抗原に結合しかつヒト対象にとって有害である標的細胞上に発現される障害関連抗原に結合する本発明1001のMAT-Fab抗体を、ヒト対象に投与する工程を含む、ヒト対象における障害を処置する方法であって、エフェクター細胞と標的細胞との両方へのMAT-Fab抗体の結合が、エフェクター細胞と有害な標的細胞との相互作用を媒介し、障害に対する処置を提供する、方法。
[本発明1066]
エフェクター細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、好中球、およびマクロファージからなる群より選択される、本発明1065の方法。
[本発明1067]
エフェクター細胞上に発現される抗原が、CD3、CD16、およびCD64からなる群より選択される、本発明1065の方法。
[本発明1068]
有害な標的細胞が、腫瘍細胞、自己反応性細胞、およびウイルス感染細胞からなる群より選択される、本発明1065の方法。
[本発明1069]
有害な標的細胞の表面上に発現される障害関連抗原が、腫瘍細胞上に発現される腫瘍関連抗原である、本発明1065の方法。
[本発明1070]
腫瘍細胞上に発現される腫瘍関連抗原が、CD19、CD20、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、および受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)からなる群より選択される、本発明1069の方法。
[本発明1071]
腫瘍細胞が悪性B細胞である、本発明1069の方法。
[本発明1072]
悪性B細胞が、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、前駆B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫、成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞型リンパ腫からなる群より選択されるがん障害の細胞である、本発明1071の方法。
[本発明1073]
エフェクター細胞上に発現される抗原が、T細胞上に発現されるCD3であり、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原が、悪性B細胞上のCD20である、本発明1069の方法。
[本発明1074]
MAT-Fab抗体が、表1~4のアミノ酸配列または表5~8のアミノ酸配列を含む4つのポリペプチド鎖を含む、本発明1073の方法。
多くの免疫受容体にとって、細胞活性化は、一価の結合相互作用の架橋によって達成される。架橋の機構は、典型的には、抗体/抗原免疫複合体によって媒介されるか、またはエフェクター細胞の標的細胞への会合を介してのものである。例えば、細胞殺傷を媒介するCD16(FcγRIIIa)およびCD32a(FcγRIIa)などの、低親和性で活性化型のFcガンマ受容体(FcγR)は、抗体Fc領域に一価で結合する。一価の結合は、細胞シグナル伝達をもたらさないが、エフェクター細胞と標的細胞との会合によって、受容体は、細胞表面で架橋およびクラスター化され、活性化を導く。T細胞では、その関連するT細胞受容体(TCR)が、親和性の高い細胞間シナプスにおいて、抗原提示細胞上の抗原結合主要組織適合性複合体(MHC)と会合したときに、CD3活性化が起こる。CD3を標的とする二価抗体は、大量のサイトカイン放出(しばしば「サイトカインストーム」と呼ばれる)を引き起こすことがあり、結果として生じる毒性は、抗CD3抗体の治療薬としての開発に課題を提示している。対照的に、二重特異性フォーマットでのCD3の一価の結合は、はるかに低いレベルのT細胞活性化を起こす。二価の単一特異性抗体について、生物学のこの結果は、受容体の二価架橋が、標的細胞の非存在下でエフェクター細胞の非特異的活性化を引き起こし得ることである。したがって、治療目標が免疫受容体の共会合(co-engagement)であるとき、一般的に一価の結合が二価の結合よりもはるかに好ましい。この様式は、典型的な二価抗体および大部分の多重特異性であるが多価の抗体フォーマット、例えば二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD-Ig)およびFabs-in-tandem免疫グロブリン(FIT-Ig)の使用と適合しない。
本発明に係る一価の非対称タンデムFab二重特異性抗体(「MAT-Fab」二重特異性抗体)は、以下:
(a)重ポリペプチド鎖(「重鎖」)であって、(アミノ(N-)末端からカルボキシル(C-)末端へ):VLA-CL-VHB-CH1-ヒンジ-CH2-CH3m1
(式中:VLAは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト軽鎖定常ドメインであるCLに連結されており、ここで、VLA-CLは、第一のFab結合ユニット(抗原またはエピトープ「A」に結合することができる)の一方の半分であり、かつ、VHBに直接連結(融合)されており、ここで、VHBは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に連結されており、ここで、VHB-CH1は、第二のFab結合ユニット(抗原またはエピトープ「B」に結合することができる)の一方の半分であり、ヒンジ-CH2に連結されており、ここで、ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ-CH2領域であり、CH3m1に直接連結されており、CH3m1は、第一のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、前記CH3m1定常ドメイン中に構造的ノブまたは構造的ホールを形成している)を含む、前記重鎖;
(b)VHA-CH1を含む第一の軽鎖(ここで、VHAは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に連結されており、そして、ここで、VHA-CH1は、前記第一のFab結合ユニット(抗原またはエピトープ「A」に結合することができる)の他方の半分である);
(c)VLB-CLを含む第二の軽鎖(ここで、VLBは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであるCLに連結されており、そして、ここで、VLB-CLは、前記第二のFab結合ユニット(抗原またはエピトープ「B」に結合することができる)の他方の半分である);および
(d)ヒンジ-CH2-CH3m2を含むFc鎖(ここで、ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖定常領域のヒンジ-CH2領域であり、CH3m2に連結されており、CH3m2は、第二のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、重鎖(a)のCH3m1ドメインの対応する構造的ホールまたは構造的ノブに相補的である構造的ノブまたは構造的ホールを、前記CH3m2定常ドメイン中に形成している);
を含むが、
但し:
重鎖(a)のCH3m1ドメインが構造的ノブを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖(d)のCH3m2ドメインは、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く相補的な構造的ホールを形成するよう突然変異されているか;または
重鎖(a)のCH3m1ドメインが構造的ホールを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖(d)のCH3m2ドメインは、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く相補的な構造的ノブを形成するよう突然変異されており;そして
任意で(すなわち、あってもなくても)、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合においてジスルフィド結合形成に有利に働くシステイン残基を導入する突然変異を、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインの両方に含む。
本発明のMAT-Fab二重特異性抗体は、1または2種の標的エピトープまたは抗原に結合することができる。通常、MAT-Fab二重特異性抗体は、1つの抗原上のエピトープおよび異なる抗原上のエピトープに結合するように改変され;それによって、MAT-Fab抗体が2種の抗原間の人工的な連結として役立つことが可能となり、抗原の連結に起因して特定の結果を達成する。本発明のMAT-Fab抗体を、サイトカイン、ポリペプチドリガンド、細胞表面受容体、非受容体細胞表面タンパク質、酵素、前述のものの2種以上の複合体、またはそれらの組み合わせに結合するように改変してよい。
本発明のMAT-Fab抗体は、1以上の炭水化物残基を含んでよい。好ましくは、上記のMAT-Fab二重特異性抗体は、グリコシル化される。より好ましくは、グリコシル化は、ヒトグリコシル化パターンである。
本発明は、本明細書に記載のMAT-Fab二重特異性抗体のポリペプチド鎖の1つ、2つ、3つ、または4つ全てをコードする1以上の単離された核酸を提供する。
二量化したFc領域の存在に主に起因して、本発明のMAT-Fab二重特異性抗体を、現在はIgG抗体にコンジュゲートされている様々な作用物質のいずれかにコンジュゲートすることができる。例えば、上記のMAT-Fab二重特異性抗体を、イムノアドヘシン(immunoadhesion)分子、造影剤、治療剤、および細胞毒性剤からなる群より選択される作用物質にコンジュゲートすることができる。本発明のMAT-Fab二重特異性抗体にコンジュゲートしてよい好ましい造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、ビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジンからなる群より選択される。本明細書に記載のMAT-Fab二重特異性抗体にコンジュゲートしてよい放射性標識は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、131I、177Lu、166Ho、および153Smを含むが、これらに限定されない。本明細書に記載のMAT-Fab二重特異性抗体にコンジュゲートしてよい好ましい細胞毒性または治療用化合物は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素、およびアポトーシス剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの場合には、MAT-Fab抗体は、作用物質に直接コンジュゲートされている。代替的に、MAT-Fab抗体は、リンカーを介して、作用物質にコンジュゲートされている。好適なリンカーは、本明細書に開示のアミノ酸およびポリペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。リンカーは、切断可能であっても切断不可能であってもよい。
本発明のMAT-Fab二重特異性抗体を、例えば、Shenoyおよび共同研究者によって国際公開公報第WO 2002/072636号(参照によって本明細書に組み入れられる)に記載されているような、大規模結晶化法を使用して調製される結晶化形態として使用してよい。そのような方法は、従来のX線結晶学研究で用いられるものとは大きく異なる抗体分子の結晶を提供する。X線結晶学研究では、正確な測定に結晶品質が非常に重要であるが、製薬使用のための大規模結晶化法によって生産される結晶の場合には当てはまらない。大規模結晶化法を使用して生産される抗体分子の結晶は、製薬研究および製造にとっては十分に純粋であり、生物学的活性を保持し、保存には特によく適しており(抗体結晶は、溶液中で起こり得る望ましくない相互作用を受けにくいため)、極めて高濃度の生物学的に活性な抗体分子を含有する、非経口的に投与可能な製剤を提供することができ、有利な用量製剤を提供することができ(非水性懸濁液中で高濃度であることを含む)、増加したインビボ半減期を提供することができ、そして、抗体分子のインビボでの制御放出のために、ポリマー担体で製剤化(カプセル化)することができる。
本発明は、ヒト対象にとって有害である1または2種の標的エピトープ、1または2種の標的抗原、または標的エピトープと標的抗原との組み合わせに結合するMAT-Fab二重特異性抗体を個体に投与する工程を含む、ヒト対象における疾患または障害を処置する方法であって、MAT-Fab二重特異性抗体によるエピトープまたは抗原の結合が、疾患または障害に対する処置を提供する方法を提供する。
本発明は、本明細書に記載のMAT-Fab二重特異性抗体を含む、ヒト対象を処置する際に使用するための医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療用抗体をヒト対象に投与するための医薬組成物を調製するための当技術分野において周知の技術および成分を使用して調製される。本明細書に記載のMAT-Fab抗体を含む組成物を、多様な投与経路または様式のいずれかによって投与するために製剤化してよい。MAT-Fab抗体を含む組成物を、非経口または非経口以外の投与のために製剤化してよい。がん、自己免疫疾患、または炎症疾患を処置する際に使用するためのMAT-Fab抗体を含む組成物を、非経口投与、例えば、限定されないが、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与のために製剤化してよい。より好ましくは、組成物は、静脈内投与のために製剤化される。そのような非経口投与は、好ましくは、組成物の注射または注入によって行われる。
MAT-Fab技術を実証するために、ノブ-イントゥ-ホールFc領域突然変異が異なるCD20/CD3 MAT-Fab二重特異性抗体の例を作製した:MAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)。
重鎖:VLA-CL-VHB-CH1-ヒンジ-CH2-CH3(KiH)
第一の軽鎖:VHA-CH1
第二の軽鎖:VLB-CL
Fc鎖:ヒンジ-CH2-CH3(KiH)
ここで、「(KiH)」は、重鎖およびFc鎖のCH3ドメインヘテロ二量化に有利に働き、またはこれを安定化させる1以上の突然変異の存在を示し、抗原「A」はCD20であり、そして、抗原「B」はCD3である。
MAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)二重特異性抗体の重鎖を生産するために、DNA構築物は、次のものをコードするものであった:親抗CD20 mAb(オファツムマブ)の軽鎖のVL-CLに連結された、22アミノ酸シグナルペプチドであり、このVL-CLは、親抗CD3 mAb(米国特許公開公報第2009/0252683号)のVH-CH1領域のN末端に連結されており、このVH-CH1領域は、親抗CD3 mAbのヒンジ-CH2に連結されており、このヒンジ-CH2は、親抗CD3 mAbに由来する突然変異IgG1 CH3領域に連結されている。
MAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)二重特異性抗体の第一の軽鎖を生産するために、DNA構築物は、親抗CD20 mAb(オファツムマブ)のVH-CH1断片に連結された、19アミノ酸シグナルペプチドをコードするものとした。
MAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)二重特異性抗体の第二の軽鎖を生産するために、DNA構築物は、親抗CD3 mAb(米国特許公開公報第2009/0252683号)の軽鎖のVL-CLに連結された、20アミノ酸シグナルペプチドをコードするものとした。
MAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)二重特異性抗体のFcポリペプチド鎖を生産するために、DNA構築物は、MAT-Fab重鎖構築物の考察において上で考察した突然変異を含む、IgG1アイソタイプの突然変異CH3領域に連結された、親抗CD3 mAbのヒンジ-CH2に連結された22アミノ酸シグナルペプチド(重鎖構築物に使用されるものと同じ)をコードするものとした。
MAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)の4つのポリペプチド鎖の各々をコードする上記のDNA構築物を、標準的な方法によってpTT発現ベクター内にクローニングした。次いで、SEQ ID NO:1~4をコードするまたはSEQ ID NO:5~8をコードする、得られた組換えpTTベクターを、MAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)二重特異性抗体のそれぞれの発現のために、HEK 293E細胞に共トランスフェクトした。細胞培養物中の発現のレベルを以下の表に示す。
生産段階が完了したら、細胞培養物を収集し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製に供した。
精製されたMAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)の、細胞の表面上に発現されるCD20およびCD3標的抗原に結合する能力を、下記のプロトコルを使用した蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって調べた。
BD FACSVerse 製造番号:01131005894
Olympus CKX41 製造番号:01121005367
Eppendorf centrifuge 5810R 製造番号:01121005414
Thermo Series II water jacket、製造番号:01121005408
BD Falcon丸底チューブ、カタログ番号352052 ロット番号3070549
組織培養プレート96ウェル、U底、低蒸発性、カタログ番号353077 ロット番号34285048
FBS、GIBCO カタログ番号10099、ロット番号1652792
PBS、GIBCO カタログ番号10010、ロット番号1710584
RPMI Medium 1640(1×)、GIBCO カタログ番号A10491、ロット番号1747206
Alexa Fluor(登録商標)488マウス抗ヒトlgG1. Invitrogen、カタログ番号A-10631、ロット番号1744792
Jurkat(ATCCカタログ番号TIB-152)は、CD3表面抗原を発現するT細胞白血病細胞株である。
Raji(ATCCカタログ番号CCL-86、ロット60131961)は、CD20表面抗原を発現するバーキットリンパ腫B細胞株である。
1. 氷冷PBS中の5×105個の細胞に等分した。
2. 細胞を2% FBS/PBS中で30分間氷上にてブロッキングした。
3. 細胞を抗CD20抗体と1時間氷上でインキュベートした。抗体の初期濃度は、(133.33nM)20ug/mlであり、これを1:5に段階希釈した。各用量は200μLであった。
4. 4℃にて2000rpmで5分間、PBS中で3回洗浄した。
5. 細胞を、マウス抗ヒトIgG1 Fc二次抗体、Alexa Fluor(登録商標)488(AF488)マウス抗ヒトlgG1 100μL(10μg/mL)(1:100希釈)と氷上で1時間インキュベートし、遮光した。
6. 4℃にて2000rpmで5分間、PBS中で3回洗浄した。
7. 細胞をPBSに再懸濁した。平均蛍光強度(MFI)をBD FACSVerseフローサイトメトリーによって検出した。
結果を図4および5に示す。両MAT-Fab二重特異性抗体は、B細胞(CD20 Raji細胞)およびT細胞(CD3 Jurkat細胞)上のCD20およびCD3それぞれに結合することができた。
精製されたMAT-Fab(KiH1)およびMAT-Fab(KiH2)の、細胞表面上に発現されるCD20およびCD3標的抗原に結合する能力を、下記のプロトコルを使用したB細胞アポトーシスアッセイによって調べた。
BD FACSVerse 製造番号:01131005894
Olympus CKX41 製造番号:01121005367
Eppendorf centrifuge 5810R 製造番号:01121005414
Thermo Series II water jacket、製造番号:01121005408
BD Falcon丸底チューブ、カタログ番号352052 ロット番号3070549
組織培養プレート96ウェル、U底、低蒸発性、カタログ番号353077 ロット番号4292046
FBS、GIBCO カタログ番号10099、ロット番号1652792
PBS、GIBCO カタログ番号10010、ロット番号1710584
RPMI Medium 1640(1×)、GIBCO カタログ番号11875、ロット番号1731226
Ficoll Paque Plus、GE HEALTHCARE、カタログ番号:GE17144002、ロット番号:10237843
PEマウス抗ヒトCD19、BD Pharmingen、カタログ番号555413、ロット番号:5274713
Raji、ATCCカタログ番号CCL-86、ロット番号60131961
ドナー番号:00123
単核細胞の単離手順
1. 抗凝血処理チューブにヒト血液100mlを新たに抽出した。
2. 等用量のRPMI1640(100ml)を血液に加えて、穏やかに混合した。
3. Ficoll-Paque密度勾配培地を使用前に18℃~20℃に温めた。
4. Ficoll-Paque培地ボトルを数回反転させ、確実に十分混合させた。
5. Ficoll-Paque培地(15ml)を50ml遠心チューブに加えた。
6. 希釈した血液試料(20ml)をFicoll-Paque培地溶液上に、Ficoll-Paque培地溶液と希釈した血液試料を混合しないように、慎重に層にした。
7. Ficoll-Paqueを血液試料と共に、400gで30~40分間18℃~20℃にて遠心分離した。
8. 単核細胞の層を勾配から滅菌遠心チューブへ移した。
1. 移した単核細胞の用量を推定し、少なくとも3用量のPBSを、遠心チューブ中の単核細胞に加えた。
2. 細胞およびPBSを400~500×gで10分間18℃~20℃にて遠心分離し、上清を除去した。
3. 洗浄を繰り返した。
4. 上清を除去し、細胞ペレットをアッセイ緩衝液に再懸濁した。
アッセイ培地はRPMI1640+10% FBSであった。
1. 標的細胞(Raji細胞)を対数増殖期で採取し、アッセイ培地で1回洗浄した。細胞密度を細胞5×105個/mlに調整し、細胞懸濁液100μlをアッセイプレートの各ウェルにアプライした。
2. 試験抗体を段階希釈し、50μlを上記アッセイプレートの各ウェルに加えた。抗体の最終出発濃度は50μg/mlであり、次いでこれを段階希釈した。
3. PBMC細胞密度を細胞2.5×106個/mlに調整し、細胞懸濁液100μlをアッセイプレートの各ウェルにアプライした(エフェクター対標的の比5:1)。
4. アッセイプレートを、37℃、5% CO2で、1日間、2日間、および3日間インキュベートした。1日目、2日目、および3日目に、4℃にて2000rpmで5分間遠心分離することによって試料を収集し、PBSで1回洗浄した。
5. 各試料を、1:5希釈したPEコンジュゲート抗ヒトCD19検出抗体50μlと、氷上で30分間インキュベートした。
6. 試料をPBSで洗浄し、FACSVerseによって試験した。
結果を図6に示す。細胞枯渇アッセイの2日目までに、両MAT-Fab二重特異性抗体は、 B細胞のT細胞媒介アポトーシスを誘導することができた。
Claims (34)
- ポリペプチド鎖(a)、(b)、(c)および(d)を含む、一価の非対称タンデムFab二重特異性抗体(MAT-Fab抗体)であって:
(a)が、(アミノ末端からカルボキシル末端へ)VLA-CL-VHB-CH1-ヒンジ-CH2-CH3m1を含む重ポリペプチド鎖(重鎖)であり、
ここで、
VLAは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト軽鎖定常ドメインであるCLに直接融合されており、
VLA-CLは、第一の抗原またはエピトープであるAを認識する第一のFab結合ユニットの免疫グロブリン軽鎖構成部分であり、かつ、VHBに直接融合されており、
VHBは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に直接融合されており、
VHB-CH1は、第二の抗原またはエピトープであるBを認識する第二のFab結合ユニットの免疫グロブリン重鎖構成部分であり、かつ、ヒンジ-CH2に直接融合されており、
ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ-CH2領域であり、かつ、CH3m1に直接融合されており、
CH3m1は、第一のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、CH3m1定常ドメイン中に構造的ノブまたは構造的ホールを形成しており、
AおよびBは、異なる抗原であるか、または同じ抗原の異なるエピトープであり;
(b)が、VHA-CH1を含む第一のMAT-Fab軽鎖であり、
ここで、
VHAは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン重鎖CH1定常ドメインであるCH1に直接融合されており、
VHA-CH1は、前記第一のFab結合ユニットの免疫グロブリン重鎖構成部分であり;
(c)が、VLB-CLを含む第二のMAT-Fab軽鎖であり、
ここで、
VLBは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであって、ヒト免疫グロブリン軽鎖CLドメインであるCLに直接融合されており、
VLB-CLは、前記第二のFab結合ユニットの免疫グロブリン軽鎖構成部分であり;かつ
(d)が、ヒンジ-CH2-CH3m2を含むFcポリペプチド鎖(Fc鎖)であり、
ここで、
ヒンジ-CH2は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ-CH2領域であり、かつ、CH3m2に直接融合されており、
CH3m2は、第二のヒト免疫グロブリン重鎖CH3定常ドメインであって、1以上のノブ-イントゥ-ホール(KiH)突然変異を変異導入されて、CH3m2定常ドメイン中に構造的ノブまたは構造的ホールを形成しており;
但し:
重鎖のCH3m1ドメインが構造的ノブを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖のCH3m2ドメインが、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く相補的な構造的ホールを形成するよう突然変異されており;
重鎖のCH3m1ドメインが構造的ホールを形成するよう突然変異されているとき、Fc鎖のCH3m2ドメインが、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合に有利に働く相補的な構造的ノブを形成するよう突然変異されている、
MAT-Fab抗体。 - CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの対合においてジスルフィド結合を形成するシステイン残基を導入する突然変異を、CH3m1ドメインおよびCH3m2ドメインに含む、請求項1記載のMAT-Fab抗体。
- CH3m1ドメインまたはCH3m2ドメイン中の、構造的ノブを形成する1以上のKiH突然変異が、トレオニン残基からチロシン残基への変化またはトレオニン残基からトリプトファン残基への変化であり、および
構造的ホールを形成するCH3m1ドメインまたはCH3m2ドメイン中の突然変異が、
トレオニン残基からセリン残基への変化と、ロイシン残基からアラニン残基への変化と、チロシン残基からバリン残基への変化との組み合わせ、
または
チロシン残基からトレオニン残基への変化
である、請求項1または2記載のMAT-Fab抗体。 - トレオニン残基からチロシン残基へ変化させるKiH突然変異が、MAT-Fab抗体の重鎖のCH3m1ドメインのトレオニンをSEQ ID NO:1の位置610のチロシンへ変化させ、および
チロシン残基からトレオニン残基へ変化させる突然変異が、MAT-Fab抗体のFc鎖のCH3m2ドメインのチロシンをSEQ ID NO:4の位置213のトレオニンへ変化させるか、または
トレオニン残基からトリプトファン残基へ変化させるKiH突然変異が、MAT-Fab抗体の重鎖のCH3m1ドメインのトレオニンをSEQ ID NO:5の位置610のトリプトファンへ変化させ、および
トレオニン残基からセリン残基への変化と、ロイシン残基からアラニン残基への変化と、チロシン残基からバリン残基への変化との組み合わせが、MAT-Fab抗体のFc鎖のCH3m2ドメインのトレオニンのSEQ ID NO:8の位置172のセリンへ変化と、MAT-Fab抗体のFc鎖のCH3m2ドメインのロイシンのSEQ ID NO:8の位置174のアラニンへ変化と、MAT-Fab抗体のFc鎖のCH3m2ドメインのチロシンのSEQ ID NO:8の位置213のバリンへ変化との組み合わせである、
請求項3記載のMAT-Fab抗体。 - CH3m1ドメインおよびCH3m2ドメインの各々が、CH3m1ドメインとCH3m2ドメインとの間にジスルフィド結合を形成する突然変異をさらに含み、該突然変異が、セリンまたはチロシン残基のシステインへの置換である、請求項1乃至4のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体。
- MAT-Fab抗体の重鎖のCH3m1ドメインが、SEQ ID NO:5の位置598のセリンからシステインへの変化を含み、および
MAT-Fab抗体のFc鎖のCH3m2ドメインが、SEQ ID NO:8の位置155のチロシンからシステインへの変化を含む、請求項5記載のMAT-Fab抗体。 - 重鎖(a)およびFc鎖(d)のCH2ドメインが各々、少なくとも1つのFcエフェクター機能を低減または排除する1以上の突然変異を含む、請求項1乃至6のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体。
- 重鎖のCH2ドメインおよびFc鎖のCH2ドメインが各々、(EUナンバリングで)ロイシン234をアラニンへ変化させ、またロイシン235をアラニンへ変化させる2つの突然変異を含む、請求項7記載のMAT-Fab抗体。
- SEQ ID NO:1のアミノ酸残基23~691からなるアミノ酸配列を含む重鎖、
SEQ ID NO:2のアミノ酸残基20~244からなるアミノ酸配列を含む第一のMAT-Fab軽鎖、
SEQ ID NO:3のアミノ酸残基21~235からなるアミノ酸配列を含む第二のMAT-Fab軽鎖、および
SEQ ID NO:4のアミノ酸残基23~253からなるアミノ酸配列を含むFc鎖、
または
SEQ ID NO:5のアミノ酸残基23~691からなるアミノ酸配列を含む重鎖、
SEQ ID NO:6のアミノ酸残基20~244からなるアミノ酸配列を含む第一のMAT-Fab軽鎖、
SEQ ID NO:7のアミノ酸残基21~235からなるアミノ酸配列を含む第二のMAT-Fab軽鎖、および
SEQ ID NO:8のアミノ酸残基23~253からなるアミノ酸配列を含むFc鎖
を含む、請求項1または2記載のMAT-Fab抗体。 - 異なる抗原が、異なるサイトカインである、請求項1乃至3のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体。
- 異なるサイトカインが、IL-12とTWEAK、IL-13とIL-lβ、TNFαとBlys、およびTNFαとIL-12p40からなる群より選択される、請求項10記載のMAT-Fab抗体。
- 異なる抗原が、以下からなる抗原ペアの群より選択される、請求項1乃至4のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体:
CD20とCD3、CD3とCD19、CD3とFc-ガンマ-RIIIA、CD3とTPBG、CD3とEpha10、CD3とIL-5Rα、CD3とTASCTD-2、CD3とCLEC12A、CD3とプロミニン-1、CD3とIL-23R、CD3とROR1、CD3とIL-3Rα、CD3とPSA、CD3とCD8、CD3とグリピカン3、CD3とFAP、CD3とEphA2、CD3とENPP3、CD3とCD33、CD3とCD133、CD3とEpCAM、CD3とCD19、CD3とHer2、CD3とCEA、CD3とGD2、CD3とPSMA、CD3とBCMA、CD3とA33、CD3とB7-H3、CD3とEGFR、CD3とP-カドヘリン、CD3とHMW-MAA、CD3とTIM-3、CD3とCD38、CD3とTAG-72、CD3とSSTR、CD3とFRA、CD16とCD30、CD64とHer2、CD137とCD20、CD138とCD20、CD19とCD20、CD38とCD20、CD20とCD22、CD40とCD20、CD47とCD20、CD137とEGFR、CD137とHer-2、CD137とPD-1、CD137とPD-L1、PD-1とPD-L1、VEGFとPD-L1、Lag-3とTIM-3、OX40とPD-1、TIM-3とPD-1、TIM-3とPD-L1、EGFRとDLL-4、VEGFとEGFR、HGFとVEGF、VEGFとAng2、EGFRとcMet、PDGFとVEGF、VEGFとDLL-4、OX40とPD-L1、ICOSとPD-1、ICOSとPD-L1、Lag-3とPD-1、Lag-3とPD-L1、Lag-3とCTLA-4、ICOSとCTLA-4、CD138とCD40、CD38とCD138、CD38とCD40、CD-8とIL-6、CSPGとRGM A、CTLA-4とBTN02、CTLA-4とPD-1、IGFlとIGF2、IGFl/2とErb2B、IGF-IRとEGFR、EGFRとCD13、IGF-IRとErbB3、EGFR-2とIGFR、第IXa因子とMet、第X因子とMet、VEGFR-2とMet、VEGF-Aとアンジオポエチン-2(Ang-2)、MAGとRGM A、NgRとRGM A、NogoAとRGM A、OMGpとRGM A、PD-L1とCTLA-4、PD-1とTIM-3、RGM AとRGM B、Te38とTNFα、TNFαとCD-22、TNFαとCTLA-4、TNFαとGP130、およびTNFαとRANKリガンド。 - 同じ抗原の異なるエピトープが、VEGFの第一のエピトープとVEGFの異なる第二のエピトープ、またはHer2の第一のエピトープとHer2の第二の異なるエピトープである、請求項1乃至4のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体。
- MAT-Fab抗体が結合する異なる抗原の一方が、エフェクター細胞の表面上に発現される抗原であり、MAT-Fab抗体が結合する他方の抗原が、ヒト対象にとって有害であると見なされる標的細胞の表面上に発現される障害関連抗原であり、
エフェクター細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、好中球、およびマクロファージからなる群より選択され、および
有害であると見なされる標的細胞が、腫瘍細胞、自己反応性細胞、およびウイルス感染細胞からなる群より選択される、
請求項1乃至4のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体。 - エフェクター細胞上の抗原が、CD3、CD16、およびCD64からなる群より選択される、請求項14記載のMAT-Fab抗体。
- 有害であると見なされる標的細胞の表面上に発現される障害関連抗原が、腫瘍細胞上に発現される腫瘍関連抗原である、請求項15記載のMAT-Fab抗体。
- 腫瘍関連抗原が、CD19、CD20、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、がん胎児性抗原(CEA)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、および受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1)からなる群より選択される、請求項16記載のMAT-Fab抗体。
- 腫瘍細胞が、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL)、前駆B細胞リンパ芽球性白血病/リンパ腫、成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞型リンパ腫からなる群より選択されるがん障害の悪性B細胞である、請求項16記載のMAT-Fab抗体。
- 治療剤、造影剤、および細胞毒性剤からなる群より選択される作用物質にコンジュゲートされており、
造影剤が、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、ビオチン、ストレプトアビジン、およびアビジンからなる群より選択され、および
治療剤または細胞毒性剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素、およびアポトーシス剤からなる群より選択される、
請求項1乃至18のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体。 - 請求項1乃至19のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。
- 非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内(intracavitary)、腔内(intracelial)、小脳内、側脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、ボーラス、経膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、および経皮からなる群より選択される少なくとも1つの様式による個体への投与のために調製される、請求項20に記載の医薬組成物。
- 請求項1乃至18のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体の該重鎖、該第一のMAT-Fab軽鎖、該第二のMAT-Fab軽鎖、および該Fc鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項22記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、およびpBJからなる群より選択される、請求項23記載のベクター。
- 請求項23または24記載のベクターを含む、真核宿主細胞または原核宿主細胞である、単離された宿主細胞。
- 真核宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、線虫宿主細胞、原生動物宿主細胞、および魚類宿主細胞からなる群より選択される、請求項25記載の単離された宿主細胞。
- 哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、ベロ細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓(HEK293)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞、およびMDCK細胞からなる群より選択される、請求項26記載の単離された宿主細胞。
- 請求項1乃至18のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体の該重鎖、該第一のMAT-Fab軽鎖、該第二のMAT-Fab軽鎖、および該Fc鎖をコードする1以上の発現ベクターを含む単離された哺乳動物宿主細胞。
- 宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項28記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
- 請求項25乃至29のいずれか一項記載の宿主細胞を、培養培地中にて培養する工程を含む、MAT-Fab抗体を生産する方法。
- 個体における疾患または障害を処置するための医薬の製造における請求項1乃至18のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体の使用。
- エフェクター細胞上の抗原に結合しかつヒト対象にとって有害である標的細胞上に発現される障害関連抗原に結合する障害の処置における使用のための請求項1乃至9または12乃至18のいずれか一項記載のMAT-Fab抗体であって、エフェクター細胞と有害である標的細胞との両方へのMAT-Fab抗体の結合が、エフェクター細胞と有害である標的細胞との相互作用を媒介し、障害に対する処置を提供し、
エフェクター細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、好中球、およびマクロファージからなる群より選択され、および
有害である標的細胞が、腫瘍細胞、自己反応性細胞、およびウイルス感染細胞からなる群より選択される、
MAT-Fab抗体。 - エフェクター細胞上に発現される抗原が、T細胞上に発現されるCD3であり、障害関連抗原が、悪性B細胞上のCD20である、請求項32記載の使用のためのMAT-Fab抗体。
- MAT-Fab抗体が、
SEQ ID NO:1のアミノ酸残基23~691からなるアミノ酸配列を含む重鎖、
SEQ ID NO:2のアミノ酸残基20~244からなるアミノ酸配列を含む第一のMAT-Fab軽鎖、
SEQ ID NO:3のアミノ酸残基21~235からなるアミノ酸配列を含む第二のMAT-Fab軽鎖、および
SEQ ID NO:4のアミノ酸残基23~253からなるアミノ酸配列を含むFc鎖、
または
SEQ ID NO:5のアミノ酸残基23~691からなるアミノ酸配列を含む重鎖、
SEQ ID NO:6のアミノ酸残基20~244からなるアミノ酸配列を含む第一のMAT-Fab軽鎖、
SEQ ID NO:7のアミノ酸残基21~235からなるアミノ酸配列を含む第二のMAT-Fab軽鎖、および
SEQ ID NO:8のアミノ酸残基23~253からなるアミノ酸配列を含むFc鎖
を含む、請求項33記載の使用のためのMAT-Fab抗体。
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