JP2022515424A - 突然変異ｆａｂドメインを有する多重特異性結合タンパク質 - Google Patents

突然変異ｆａｂドメインを有する多重特異性結合タンパク質 Download PDF

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Abstract

ＶＨ領域と対合したＶＬ領域、およびＣＬ領域と対合したＣＨ１領域を含む結合タンパク質であって、ＶＬ領域およびＶＨ領域は対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は対合を促進するための突然変異を含む結合タンパク質が提供される。１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するためのＶＨ／ＶＬ対に組み込まれた１つまたはそれ以上のシステイン残基を含む結合タンパク質もまた提供される。多重特異性結合タンパク質、結合タンパク質および多重特異性結合タンパク質をコードする核酸、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物、ならびに本明細書に記載される結合タンパク質または多重特異性結合タンパク質を投与する治療方法もまた提供される。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１２月２４日に出願された欧州出願第１８３０６８４３．６号、および２０１９年６月２１日に出願されたＥＰ出願第１９３０５８１２．０号に対する優先権を主張し、それらの内容は、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
古典的抗体は、Ｙ字型タンパク質または免疫グロブリンであり、これらは軽鎖部分および重鎖部分からなる２つのヘテロ二量体で形成されるヘテロ四量体である。抗体の「アーム」は抗原結合部位を含み、Ｆａｂ領域と呼ばれる。古典的な抗体（例えば、宿主の免疫系によって産生される抗体）は２つの同一のＦａｂを有し、特異的抗原を認識して結合することができる。天然の抗体構造における非対称性の生成は、２つの（例えば、二重特異性抗体）またはより多くの結合特異性を有する多重特異性結合タンパク質の生成のための前提条件である。例えば、異なる非対称結合アームまたはＦａｂ上で１つまたはそれ以上のＦｖを分離することによって、２つの異なる抗原を同時に結合する柔軟性を有する二重特異性抗体を作製することができる。しかしながら、これらの利点にもかかわらず、多種多様な多重特異性抗体技術は、種々の非対称な重鎖および軽鎖の誤対合のために、プロセスおよび製造上の問題に悩まされている。例えば、これらの技術の多くは、いわゆる「軽鎖問題」に悩まされ、２つの異なる軽鎖と重鎖とのランダムな対合は、所望の組合せ以外の種々の組合せの鎖対合を生成する。場合によっては、軽鎖の問題は、両方の抗原への結合を可能にする共通の軽鎖の使用によって回避できることがある。しかしながら、このフォーマットは、トランスジェニックマウスにおけるデノボ抗体の生成またはディスプレイ技術を必要とするため、多くの抗体で不可能なことがあり得る。さらに、ヒト患者由来の広く中和する抗ＨＩＶ抗体のような稀な抗体は、このようなフォーマットに適合させることができない。したがって、誤対合問題に対する代替的で創造的な解決策が依然として必要である。二量体界面における一連の突然変異は、これらの抗体のヘテロ二量体化を可能にするように注意深く設計されている。
本開示は、場合により、抗原結合タンパク質の効率的なヘテロ二量体化を可能にする二量体界面に沿った種々の突然変異を任意に含み得る抗原結合タンパク質を提供する。
一態様では、本開示は、以下：
抗原結合部位を形成するためのＶＨ領域と対合したＶＬ領域；および
ＣＬ領域と対合したＣＨ１領域
を含む抗原結合タンパク質を提供し、
ＶＬ領域およびＶＨ領域は対合を促進するための反対荷電突然変異（ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｃｈａｒｇｅｄ ｍｕｔａｔ）を含み、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は対合を促進するための突然変異を含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域と対合した第２のＶＬ領域と、第２のＣＬ領域と対合した第２のＣＨ１領域とをさらに含む。
一部の実施形態では、第１のＶＨとＶＬ対および第２のＶＨとＶＬ対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、第１のＣＨ１とＣＬ対および第２のＣＨ１とＣＬ対の一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含む。
一部の実施形態では、一方または両方のＣＨ１領域はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、一方または両方のＣＬ領域はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、一方または両方のＣＨ１領域はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、一方または両方のＣＬ領域はＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、一方または両方のＣＨ１領域はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、一方または両方のＣＬ領域はＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、一方または両方のＣＨ１領域はＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、一方または両方のＣＬ領域はＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１における突然変異はＣＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、一方または両方のＣＨ１領域はＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、一方または両方のＣＬ領域はＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１における突然変異はＣＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、一方または両方のＶＨ領域は３９Ｅ、３９Ｄ、３９Ｋ、３９Ｒまたは３９Ｈ突然変異を含み、一方または両方のＶＬ領域は３８Ｅ、３８Ｄ、３８Ｋ、３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨにおける突然変異はＶＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、一方または両方のＶＨ領域はＱ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、一方または両方のＶＬ領域はＱ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨにおける突然変異はＶＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するためにＶＨ／ＶＬ対の一方または両方に組み込まれた１つまたはそれ以上のシステイン残基をさらに含む。
一部の実施形態では、一方または両方のＶＨ領域は４４Ｃおよび１０５Ｃ突然変異の一方または両方を含み、一方または両方のＶＬ領域は１００Ｃおよび４３Ｃ突然変異の一方または両方を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ領域の一方または両方は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ領域の一方または両方は１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、一方または両方のＶＨ領域は１０５Ｃ突然変異を含み、一方または両方のＶＬ領域は４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質はＣＨ１／ＣＬ対の一方または両方における反対荷電突然変異をさらに含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ対の一方または両方における反対荷電突然変異は、ＣＨ１領域におけるＫ２２１ＥおよびＣＬ領域におけるＥ１２３Ｋ；ＣＨ１領域におけるＫ２２８ＤおよびＣＬ領域におけるＤ１２２Ｋ；ＣＨ１領域におけるＬ１４５ＥおよびＣＬ領域におけるＳ１７６Ｋ；ならびにＣＨ１領域におけるＬ１２８ＥおよびＣＬ領域におけるＶ１３３Ｋからなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、少なくとも２つの抗原結合部位を形成するための少なくとも２つのＶＨ領域とそれぞれ対合した少なくとも２つのＶＬ領域と、２つのＣＬ領域とそれぞれ対合した少なくとも２つのＣＨ１領域とを含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、少なくとも１つのＣＨ１／ＣＬ対は、以下：
（１）Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異ならびにＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（２）Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（３）Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（４）Ｋ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異およびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（５）Ｔ１９２ＥおよびＫ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４ＡおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（６）Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲもしくはＬ１４３Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲもしくはＳ１７６Ｈ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（７）Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ（ＣＬ）突然変異、ならびに
（８）２つのＣＨ１／ＣＬ対が２つの異なるＶＨ／ＶＬ対の対合を促進するための突然変異を含む場合、２つのＣＨ１／ＣＬ対は同じ突然変異を含まない
から選択される対合を促進するためのＣＨ１／ＣＬ突然変異を含み、
少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、ＶＨ領域の突然変異残基はＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する。
別の態様では、本開示は、少なくとも２つの抗原結合部位を形成するための少なくとも２つのＶＨ領域とそれぞれ対合した少なくとも２つのＶＬ領域と、２つのＣＬ領域それぞれ対合した少なくとも２つのＣＨ領域とを含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、
少なくとも１つのＣＨ１／ＣＬ対は、以下：
（１）Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ（ＣＬ）突然変異、ならびに
（２）Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、ならびに
（３）Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
（４）Ｋ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異およびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
（５）Ｔ１９２ＥおよびＫ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４ＡおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
（６）Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６Ｒ、またはＳ１７６Ｈ（ＣＬ）突然変異、
（７）Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ（ＣＬ）突然変異、
（８）Ｋ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異およびＤ１２２Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに
（９）Ｋ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異
のうちの１つまたはそれ以上からなる群から選択される対合を促進するためのＣＨ１／ＣＬ突然変異を含み、
２つのＣＨ１／ＣＬ対が２つの異なるＶＨ／ＶＬ対についての対合を促進するための突然変異を含む場合、２つのＣＨ１／ＣＬ対は同じ突然変異を含まず、
少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対は対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、
ＶＨ領域の突然変異残基はＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質において、少なくとも２つの異なるＶＨ／ＶＬ対が対合を促進するための突然変異セットを含む場合、少なくとも２つの異なるＶＨ／ＶＬ対は同じ突然変異セットを含まない。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも２つの抗原結合部位を形成するための少なくとも２つのＶＨ領域とそれぞれ対合した少なくとも２つのＶＬ領域と、２つのＣＬ領域とそれぞれ対合した少なくとも２つのＣＨ１領域とを含み、
少なくとも１つのＣＨ１／ＣＬ対は、以下：
（１）Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（２）Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（３）Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（４）Ｋ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異およびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（５）Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ（ＣＬ）突然変異、ならびに／または
（６）Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ（ＣＬ）突然変異、ならびに
（７）２つのＣＨ１／ＣＬ対が２つの異なるＶＨ／ＶＬ対の対合を促進するための突然変異を含む場合、２つのＣＨ１／ＣＬ対は同じ突然変異を含まない
のうちの１つまたはそれ以上からなる群から選択される対合を促進するためのＣＨ１／ＣＬ突然変異を含み、
少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対は、３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異、およびＱ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異から選択される対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、ＶＨにおける突然変異は、ＶＬにおける突然変異とは反対荷電であり；ＶＬまたはＶＨが同じポリペプチド鎖内にないいくつかのＶＨ／ＶＬ対が異なるＶＨ／ＶＬ対の対合を促進するための突然変異を含む場合、各ＶＨ／ＶＬ対は同じ反対荷電突然変異を含まない。
一部の実施形態では、一方または両方のＣＨ１領域は、ヘテロ二量体化ドメインに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは、第１のＦｃドメインを含む。
一部の実施形態では、第１のＦｃドメインは第２のＦｃドメインとヘテロ二量体化し、第１のＦｃドメインは第１のＣＨ３領域を含み、第２のＦｃドメインは第２のＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、第１のＣＨ３領域は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含み、第２のＣＨ３領域は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、突然変異は、Ｆｃドメインヘテロ二量体化を促進する。
別の態様では、本開示は、以下
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）および第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）および第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗体を提供し、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、対合を促進するためのＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、対合を促進するためのＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗体を提供し、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、対合を促進するためのＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は対合を促進するためのＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
別の態様では、本開示は、
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の少なくとも一方または両方は対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域中の突然変異残基を含み、ＶＨ領域の突然変異残基は、ＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の少なくとも一方または両方は対合を促進するための突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、対合を促進するためのＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、対合を促進するためのＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ１はＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ１はＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬ２はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ２はＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ２はＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方は、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、３９Ｅ、３９Ｄ、３９Ｋ、３９Ｒまたは３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、３８Ｅ、３８Ｄ、３８Ｋ、３８Ｒまたは３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するためにＶＨ１／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に組み込まれた１つまたはそれ以上のシステイン残基をさらに含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は４４Ｃおよび１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は１００Ｃおよび４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ２は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ２は１００Ｃを含む。
一部の実施形態では、ＶＨ２は１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ２は４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は３９Ｅおよび４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は３８Ｋおよび１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は３９Ｅおよび１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は３８Ｋおよび４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＨ１－１／ＣＬ１対における反対荷電突然変異をさらに含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１／ＣＬ１対における反対荷電突然変異は、ＣＨ１－１領域におけるＫ２２１ＥおよびＣＬ１領域におけるＥ１２３Ｋ；ＣＨ１－１領域におけるＫ２２８ＤおよびＣＬ１領域におけるＤ１２２Ｋ；ＣＨ１－１領域におけるＬ１４５ＥおよびＣＬ１領域におけるＳ１７６Ｋ；ならびにＣＨ１－１領域におけるＬ１２８ＥおよびＣＬ１領域におけるＶ１３３Ｋからなる群から選択される。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＨ１－２／ＣＬ２対における反対荷電突然変異をさらに含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２／ＣＬ２対における反対荷電突然変異は、ＣＨ１－２領域におけるＫ２２１ＥおよびＣＬ２領域におけるＥ１２３Ｋ；ＣＨ１－２領域におけるＫ２２８ＤおよびＣＬ２領域におけるＤ１２２Ｋ；ＣＨ１－２領域におけるＬ１４５ＥおよびＣＬ２領域におけるＳ１７６Ｋ；ならびにＣＨ１－２領域におけるＬ１２８ＥおよびＣＬ２領域におけるＶ１３３Ｋからなる群より選択される。
一部の実施形態では、第１および第２のヘテロ二量体化ドメインはＦｃドメインを含む。
一部の実施形態では、第１のヘテロ二量体化ドメインは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含む第１のＣＨ３ドメインを含み、第２のヘテロ二量体化ドメインは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異の一方または両方を含む第２のＣＨ３ドメインを含み、突然変異はＦｃドメインヘテロ二量体化を促進する。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１ドメインは、第１のＣＨ２および第１のＣＨ３ドメインに連結され、ＣＨ１－２ドメインは、第２のＣＨ２および第２のＣＨ３ドメインに連結され、第１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに第２のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは二量体化して、Ｆｃドメインを形成する。
一部の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、突然変異はＦｃドメインのヘテロ二量体化を促進する。
別の態様では、本開示は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する抗原結合タンパク質または多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、
１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
で表される構造を含み、１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；ならびに
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、
ＣＨ１およびＣＬドメイン対は対合を促進するための突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１はＶＬ１と対合し、ＶＨ２はＶＬ２と対合し、ＣＨ１はＣＬと対合する。
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
で表される構造を含み、１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；ならびに
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
ＶＨ１はＶＬ１と対合し、ＶＨ２はＶＬ２と対合し、ＣＨ１はＣＬと対合し、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、ＶＨ領域の突然変異残基はＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
ＣＨ１およびＣＬドメイン対は、対合を促進するための突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ４４ＣおよびＶＨ１０５Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ４３ＣおよびＶＬ１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬはＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬはＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬはＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬはＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１における突然変異は、ＣＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬはＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１における突然変異は、ＣＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、３９Ｅ、３９Ｄ、３９Ｋ、３９Ｒまたは３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、３８Ｅ、３８Ｄ、３８Ｋ、３８Ｒまたは３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＣＨ１は二量体化ドメインに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、二量体化ドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインである。
別の態様では、本開示は、４つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、２つのポリペプチド鎖は、各々、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
で表される構造を含み、２本のポリペプチド鎖は、各々、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
ＶＨ１はＶＬ１と対合して第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２はＶＬ２と対合して第２の抗原結合部位を形成し、ＣＨ１はＣＬと対合し、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
ＶＬ１とＶＨ１対およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は対合を促進する反対荷電突然変異を含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、ＶＨ領域の突然変異残基はＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
ＣＨ１およびＣＬドメイン対の一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
少なくとも２つのＣＨ１／ＣＬ対が対合を促進するための突然変異を含む場合、一方のＣＨ１／ＣＬ対における突然変異セットは、他方のＣＨ１／ＣＬ対における突然変異セットとは異なる。
別の態様では、本開示は、４つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む抗原結合タンパク質を提供し、２つのポリペプチド鎖は、各々、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
で表される構造を含み、２つのポリペプチド鎖は、各々、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１はＶＬ１と対合して第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２はＶＬ２と対合して第２の抗原結合部位を形成し、ＣＨ１はＣＬと対合し、より具体的にはＶＨ１／ＶＬ１対は第１の抗原結合特異性を含み、ＶＨ２／ＶＬ２対は第２の抗原結合特異性を含み、
ＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
ＶＬ１とＶＨ１対およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、
ＣＨ１およびＣＬドメイン対の一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
ＣＨ１およびＣＬ対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、一方のＣＨ１およびＣＬ対における突然変異は、対合を促進するための他方のＣＨ１およびＣＬ対における突然変異とは異なる。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ４４ＣおよびＶＨ１０５Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ４３ＣおよびＶＬ１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬはＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬはＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬはＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬはＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１における突然変異はＣＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＣＨ１はＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬはＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１における突然変異はＣＬにおける突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は３９Ｅ、３９Ｄ、３９Ｋ、３９Ｒまたは３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、３８Ｅ、３８Ｄ、３８Ｋ、３８Ｒまたは３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＱ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＱ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
別の態様では、本開示は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、
第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－２－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ２［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１－１は第１の免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１－２は第２の免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジはＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインを連結する免疫グロブリンヒンジ領域であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１／ＶＬ１対、ＶＨ２／ＶＬ２対およびＶＨ３／ＶＬ３対のうちの１つまたはそれ以上に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
ＶＬ１とＶＨ１対およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、
ＶＨ領域の突然変異残基は、ＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
ＣＬ１とＣＨ１－１対およびＣＬ２とＣＨ１－２対の一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、ＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異はＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ４４ＣおよびＶＨ１０５Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ４３ＣおよびＶＨ１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１およびＣＬ１の一方または両方は対合を促進するための突然変異を含み、ＣＨ１－２およびＣＬ２の一方または両方は対合を促進するための突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ１はＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ１はＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬ２はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ２はＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ２はＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方は、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３のうちの１つまたはそれ以上は、３９Ｅ、３９Ｄ、３９Ｋ、３９Ｒまたは３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３のうちの１つまたは以上は、３８Ｅ、３８Ｄ、３８Ｋ、３８Ｒまたは３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３のうちの１つまたはそれ以上における突然変異は、ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３のうちの１つまたは以上における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３のうちの１つまたはそれ以上は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３のうちの１つまたはそれ以上は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３のうちの１つまたはそれ以上における突然変異は、ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３のうちの１つまたはそれ以上における突然変異とは反対荷電である。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＣＨ１－１のＣ末端はＶＨ２のＮ末端に作動可能に連結され、
ＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
ＶＬ１とＶＨ１対およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、ＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、ＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ１はＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ１はＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬ２はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ２はＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬ２はＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方は、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、３９Ｅ、３９Ｄ、３９Ｋ、３９Ｒまたは３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、３８Ｅ、３８Ｄ、３８Ｋ、３８Ｒまたは３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、
ＣＨ１－１のＣ末端はＶＨ２のＮ末端に作動可能に連結され、
ＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
ＶＬ１とＶＨ１対およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、
ＶＨ領域の突然変異残基は、ＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、ＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、ＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するためにＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に組み込まれた１つまたはそれ以上のシステイン残基をさらに含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は４４Ｃおよび１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は１００Ｃおよび４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ２は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ２は１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ２は１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ２は４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は３９Ｅおよび４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は３８Ｋおよび１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は３９Ｅおよび１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は３８Ｋおよび４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＨ１－１／ＣＬ１対における反対荷電突然変異をさらに含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１／ＣＬ１対における反対荷電突然変異は、ＣＨ１－１領域におけるＫ２２１ＥおよびＣＬ１領域におけるＥ１２３Ｋ；ＣＨ１－１領域におけるＫ２２８ＤおよびＣＬ１領域におけるＤ１２２Ｋ；ＣＨ１－１領域におけるＬ１４５ＥおよびＣＬ１領域におけるＳ１７６Ｋ；ならびにＣＨ１－１領域におけるＬ１２８ＥおよびＣＬ１領域におけるＶ１３３Ｋからなる群から選択される。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＨ１－２／ＣＬ２対における反対荷電突然変異をさらに含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２／ＣＬ２対における反対荷電突然変異は、ＣＨ１－２領域におけるＫ２２１ＥおよびＣＬ２領域におけるＥ１２３Ｋ；ＣＨ１－２領域におけるＫ２２８ＤおよびＣＬ２領域におけるＤ１２２Ｋ；ＣＨ１－２領域におけるＬ１４５ＥおよびＣＬ２領域におけるＳ１７６Ｋ；ならびにＣＨ１－２領域におけるＬ１２８ＥおよびＣＬ２領域におけるＶ１３３Ｋからなる群より選択される。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１ドメインは、第１のＣＨ２ドメインおよび第１のＣＨ３ドメインに連結され、ＣＨ１－２ドメインは、第２のＣＨ２ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインに連結され、第１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインならびに第２のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは二量体化して、Ｆｃドメインを形成する。
一部の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｆｃドメインヘテロ二量体化を促進するために、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異の一方または両方を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１のＣ末端は、ペプチドリンカーを介してＶＨ２のＮ末端に機能的に連結される。
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号Ｘ）リンカーを含み、ｎは１～５の任意の整数である。
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＤから選択される１またはそれ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部または一部を含む。
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、以下の配列：
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＧＧ（配列番号Ｘ）
を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するためのＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）および第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）および第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｋ２２１Ｅ、Ｋ２２１Ｄ、Ｋ２２１Ｋ、Ｋ２２１ＲまたはＫ２２１Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｅ１２３Ｅ、Ｅ１２３Ｄ、Ｅ１２３Ｋ、Ｅ１２３ＲまたはＥ１２３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）および第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）および第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｋ２２１Ｅ、Ｋ２２１Ｄ、Ｋ２２１Ｋ、Ｋ２２１ＲまたはＫ２２１Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｅ１２３Ｅ、Ｅ１２３Ｄ、Ｅ１２３Ｋ、Ｅ１２３ＲまたはＥ１２３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｋ２２１Ｅ、Ｋ２２１Ｄ、Ｋ２２１Ｋ、Ｋ２２１ＲまたはＫ２２１Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｅ１２３Ｅ、Ｅ１２３Ｄ、Ｅ１２３Ｋ、Ｅ１２３ＲまたはＥ１２３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）および第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）および第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｋ２２１Ｅ、Ｋ２２１Ｄ、Ｋ２２１Ｋ、Ｋ２２１ＲまたはＫ２２１Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方は、Ｅ１２３Ｅ、Ｅ１２３Ｄ、Ｅ１２３Ｋ、Ｅ１２３ＲまたはＥ１２３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は１００Ｃ突然変異を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）および第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）および第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、対合を促進するために、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、
ＶＨ１およびＶＨ２の少なくとも一方または両方は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は１００Ｃ突然変異を含む。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）および第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）および第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
別の態様では、本開示は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）および第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）および第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含む多重特異性抗原結合タンパク質または抗体を提供し、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２の少なくとも一方または両方は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２の少なくとも一方または両方は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１はＴ１９２Ｅ突然変異をさらに含み、ＣＬ１はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－２はＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬ２はＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するためにＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に組み込まれた１つまたはそれ以上のシステイン残基をさらに含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は４４Ｃおよび１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は１００Ｃおよび４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ２は４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ２は１００Ｃを含む。
一部の実施形態では、ＶＨ２は１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ２は４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は３９Ｅおよび４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は３８Ｋおよび１００Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１は３９Ｅおよび１０５Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１は３８Ｋおよび４３Ｃ突然変異を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＨ１－１／ＣＬ１対およびＣＨ１－２／ＣＬ２対の一方または両方における反対荷電突然変異をさらに含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１／ＣＬ１対およびＣＨ１－２／ＣＬ２対の一方または両方における反対荷電突然変異は、ＣＨ１－１領域およびＣＨ２－２領域の一方または両方におけるＫ２２１Ｅ、ならびにＣＬ１領域およびＣＬ２領域の一方または両方におけるＥ１２３Ｋを含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１－１ドメインは、第１のＣＨ２ドメインおよび第１のＣＨ３ドメインを含む第１のＦｃドメインに作動可能に連結され、ＣＨ１－２ドメインは、第２のＣＨ２ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインを含む第２のＦｃドメインに作動可能に連結され、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは二量体化する。
一部の実施形態では、第１のＣＨ３ドメインはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含み、第２のＣＨ３ドメインはＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、突然変異はＦｃドメインのヘテロ二量体化を促進する。
別の態様では、本開示は、
抗原結合ドメインおよび定常軽鎖ＣＬ領域と対合した定常重鎖ＣＨ１領域
を含む抗原結合タンパク質を提供し、
抗原結合ドメインは標的抗原に選択的に結合し、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は、以下：
ａ）ＣＨ１領域におけるＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異；および
ｂ）ＣＨ１領域におけるＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異
の一方または両方を含み、
ＣＨ１領域の突然変異残基は、ＣＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する。
別の態様では、本開示は、
タンパク質結合ドメイン；および
ＣＬ領域と対合したＣＨ１領域
を含む結合タンパク質を提供し、
タンパク質結合ドメインは、標的抗原に選択的に結合し、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は、以下：
ａ）ＣＨ１領域におけるＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異；ならびに
ｂ）ＣＨ１領域におけるＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異、
のうちの一方または両方を含み、ＣＨ１領域における突然変異は、ＣＬ領域における突然変異とは反対荷電である。
別の態様では、本開示は、
定常軽鎖ＣＬ領域と対合した定常重鎖ＣＨ１領域
を含む抗原結合タンパク質を提供し、
抗原結合ドメインは標的抗原に選択的に結合し、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は、以下：
ａ）ＣＨ１領域におけるＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異；ならびに
ｂ）ＣＨ１領域におけるＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異、ならびにＣＬ領域におけるＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異
の一方または両方を含み、
ＣＨ１領域における突然変異残基は、ＣＬ領域における突然変異残基とは反対荷電を有する。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１領域におけるＫ２２１Ｅ突然変異、およびＣＬ領域におけるＥ１２３Ｋ突然変異をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示は、第１のＦａｂおよび第２のＦａｂを含む多重特異性抗原結合タンパク質を提供し、上記第１のＦａｂはＣＨ１－１、ＶＨ１、ＣＬ１およびＶＬ１ドメインを含み、上記第２のＦａｂはＣＨ１－２、ＶＨ２、ＣＬ２およびＶＬ２ドメインを含み、第１のＦａｂおよび第２のＦａｂは、以下の選択肢のうちの１つから選択される：
ｉ．第１のＦａｂは、ＣＨ１－１における１４３Ｒ突然変異、ＶＨ１における３９Ｋ突然変異、ＣＬ１における１７６Ｅ突然変異、ＶＬ１における３８Ｅ突然変異を含み、第２のＦａｂは、ＣＨ１－２における１４３Ｅ突然変異、ＶＨ２における３９Ｅ突然変異、ＣＬ２における１７６Ｒ突然変異およびＶＬ２における３８Ｋ突然変異を含む；
ｉｉ．第１のＦａｂは、ＣＨ１－１における１４３Ｋ突然変異、ＶＨ１における３９Ｋ突然変異、ＣＬ１における１７６Ｅ突然変異、ＶＬ１における３８Ｅ突然変異を含み、第２のＦａｂは、ＣＨ１－２における１４３Ｅ突然変異、ＶＨ２における３９Ｅ突然変異、ＣＬ２における１７６Ｋ突然変異およびＶＬ２における３８Ｋ突然変異を含む；
ｉｉｉ．第１のＦａｂは、ＣＨ１－１における１４３Ｈ突然変異、ＶＨ１における３９Ｋ突然変異、ＣＬ１における１７６Ｅ突然変異、ＶＬ１における３８Ｅ突然変異を含み、第２のＦａｂは、ＣＨ１－２における１４３Ｅ突然変異、ＶＨ２における３９Ｅ突然変異、ＣＬ２における１７６Ｈ突然変異およびＶＬ２における３８Ｋ突然変異を含む；
ｉｖ．第１のＦａｂは、ＣＨ１－１における１４３Ｒ突然変異、ＶＨ１における３９Ｋ突然変異、ＣＬ１における１７６Ｄ突然変異、ＶＬ１における３８Ｅ突然変異を含み、第２のＦａｂは、ＣＨ１－２における１４３Ｄ突然変異、ＶＨ２における３９Ｅ突然変異、ＣＬ２における１７６Ｒ突然変異およびＶＬ２における３８Ｋ突然変異を含む；
ｖ．第１のＦａｂは、ＣＨ１－１における１４３Ｋ突然変異、ＶＨ１における３９Ｋ突然変異、ＣＬ１における１７６Ｄ突然変異、ＶＬ１における３８Ｅ突然変異を含み、第２のＦａｂは、ＣＨ１－２における１４３Ｄ突然変異、ＶＨ２における３９Ｅ突然変異、ＣＬ２における１７６Ｋ突然変異およびＶＬ２における３８Ｋ突然変異を含む；
ｖｉ．第１のＦａｂは、ＣＨ１－１における１４３Ｈ突然変異、ＶＨ１における３９Ｋ突然変異、ＣＬ１における１７６Ｄ突然変異、ＶＬ１における３８Ｅ突然変異を含み、第２のＦａｂは、ＣＨ１－２における１４３Ｄ突然変異、ＶＨ２における３９Ｅ突然変異、ＣＬ２における１７６Ｈ突然変異およびＶＬ２における３８Ｋ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ１領域はヘテロ二量体化ドメインに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは第１のＦｃドメインを含む。
一部の実施形態では、第１のＦｃドメインは第２のＦｃドメインとヘテロ二量体化し、第１のＦｃドメインは第１のＣＨ３領域を含み、第２のＦｃドメインは第２のＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、第１のＣＨ３領域は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異の一方または両方を含み、第２のＣＨ３領域は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、突然変異はＦｃドメインヘテロ二量体化を促進する。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含む少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対をさらに含み、上記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、ＶＨ領域の突然変異残基はＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質は、各ＶＨ領域について３つのＨＣＤＲ、および各ＶＬ領域について３つのＬＣＤＲを含み、さらに、１つもしくはそれ以上の標的抗原または１つもしくはそれ以上の標的エピトープに対する結合特異性を含む。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲおよび／または抗原は本明細書に開示される。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲおよび／または抗原は当該技術分野において公知である。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ、ＬＣＤＲおよび／または抗原は、新たに同定または発見された。
一部の実施形態では、本開示は、
抗原結合ドメイン；および
定常軽鎖ＣＬ領域と対合した定常重鎖ＣＨ１領域
を含む抗原結合タンパク質を提供し、
抗原結合ドメインは標的抗原に選択的に結合し、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は、以下：
ａ）ＣＨ１領域におけるＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異；ならびに
ｂ）ＣＨ１領域におけるＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異
の一方または両方を含み、
ＣＨ１領域の突然変異残基はＣＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、以下：
（１）Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ（ＣＬ）突然変異、
（２）Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
（３）Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
（４）Ｋ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異およびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
（５）Ｋ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異およびＤ１２２Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに
（６）Ｋ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異
のうちの１つまたはそれ以上からなる群から選択される対合を促進するためのＣＨ１／ＣＬ突然変異をさらに含み、
２つのＣＨ１／ＣＬ対が２つの異なるＶＨ／ＶＬ対についての対合を促進するための突然変異を含む場合、２つのＣＨ１／ＣＬ対は同じ突然変異を含まない。
一部の実施形態では、ＣＨ１領域はＦｃドメインに作動可能に連結される。
一部の実施形態では、多重特異性抗体または抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む１つまたはそれ以上の単離された核酸分子を含むキットが提供される。
一部の実施形態では、核酸分子を含む発現ベクターが提供される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸分子を含む１つまたはそれ以上の発現ベクターを含むキットが提供される。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の核酸分子または１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む単離された宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、核酸分子のキットまたは発現ベクターのキットを含む単離された宿主細胞が提供される。
一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞または昆虫細胞である。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体と、治療有効量の多重特異性抗体または抗原結合タンパク質とを含む医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、抗原活性が有害である障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量の多重特異性抗体または抗原結合タンパク質を投与することを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、多重特異性抗体または抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
一部の実施形態では、多重特異性抗体または抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞が提供される。
一部の実施形態では、多重特異性抗体または抗原結合タンパク質が発現されるような条件下で宿主細胞を培養することを含む、多重特異性抗体または抗原結合タンパク質を産生する方法が提供される。一部の実施形態では、薬剤として使用するための多重特異性抗体または抗原結合タンパク質が提供される。
上記される開示の概要は、非限定的であり、開示された抗原結合タンパク質および方法の他の特徴および利点は、以下の図面の簡単な説明、本開示の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかでなる。
図１Ａ～図１Ｃは、ヘテロ二量体化を促進するために、いくつかの異なる突然変異を有する交差二重可変（ＣＯＤＶ）抗原結合タンパク質フォーマットを模式的に示す図である。図１Ａは、ＣＯＤＶ－Ｆａｂ（ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）上の「Ｏ」およびＦａｂ２（ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）上の「Δ」のＣＨ１／カッパ突然変異を示す。図１Ｂは、ＣＯＤＶ－Ｆａｂ（ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ＋Ｏ）およびＦａｂ２（ＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ＋Δ）上の突然変異を示す。図１Ｃは、ＣＯＤＶ－Ｆａｂ（［ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ＋Ｏ］＋［ＶＨ４４Ｃｙｓ／ＶＬ１００Ｃｙｓ］または［ＶＨ１０５Ｃｙｓ／ＶＬ４３Ｃｙｓ］）およびＦａｂ２（［ＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ＋Δ］＋［ＶＨ４４Ｃｙｓ／ＶＬ１００Ｃｙｓ］または［ＶＨ１０５Ｃｙｓ／ＶＬ４３Ｃｙｓ］）上の突然変異を示す。 図２Ａ～図２Ｇは、表５の結果を図式的に示す図である。図２Ａは、ＷＴ ＣＯＤＶ抗体についての結果を示す。図２Ｂは、ＣＨ１／Ｃｋ突然変異のみを有するＣＯＤＶ抗体についての結果を示す。図２Ｃは、ＣＨ１／Ｃｋと荷電突然変異（ＣＭ）の組合せの結果を示す。図２Ｄは、ジスルフィド安定化された（ｄｓ）だけのＣＯＤＶ抗体についての結果を示す。図２Ｅは、ＣＨ１／Ｃｋとｄｓ突然変異の組合せの結果を示す。図２Ｆは、ＣＭとｄｓ突然変異の組合せの結果を示す。図２Ｇは、ＣＯＤＶ抗体中の３つの突然変異セットＣＨ１／Ｃｋ、ＣＭおよびｄｓ安定化の組合せについての結果を示す。 図２－１の続き。 図２－２の続き。 図３Ａ～図３Ｄは、開放立体配置（図３Ａ、図３Ｂ）および閉鎖立体配置（図３Ｃ、図３Ｄ）でのタンデムＦａｂｓ抗体フォーマットを概略的に示す図である。図３Ａは、Ｆａｂ１上のＣＨ１／カッパ突然変異「Δ」（ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）、およびＦａｂ２上のＣＨ１／カッパ突然変異「Ｏ」（ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）を伴う開放立体配置を示す。図３Ｂは、Ｆａｂ１上の突然変異（ＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ＋Δ）およびＦａｂ２上の突然変異（ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ＋Ｏ）を伴う開放立体配置を示す。図３Ｃは、Ｆａｂ１上のＣｈ１／カッパ突然変異Δ（ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）、およびＦａｂ２上のＣＨ１／カッパ突然変異Ｏ（ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）を伴う閉鎖立体配置を示す。図３Ｄは、Ｆａｂ１上の突然変異（ＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ＋Δ）およびＦａｂ２上の突然変異（ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ＋Ｏ）を伴う閉鎖立体配置を示す。 図３－１の続き。 図４は、ＷＴ、ＣＨ１／ＣｋおよびＣＨ１／Ｃｋ＋ＣＭフォーマットの開放立体配置におけるタンデムＦａｂのＳＥＣおよびＨＩＣ分析の結果を示す。 図５Ａ～図５Ｄは、開放および閉鎖立体配置における抗ＣＤ４０×抗ＰＤ－Ｌ１タンデムＦａｂ抗体についてのＨＩＣ分析、収量および結合親和性の結果を示す図である。図５Ａは、ＣＨ１／Ｃｋ突然変異のみを伴う閉鎖立体配置を示す。図５Ｂは、ＣＨ１／Ｃｋ突然変異のみを伴うＦａｂドメイン交換を伴う閉鎖立体配置を示す。図５Ｃは、ＣＨ１／ＣｋおよびＣＭ突然変異を伴う閉鎖立体配置を示す。図５Ｄは、ＣＨ１／ＣｋおよびＣＭ突然変異を伴う開放立体配置を示す。 図６Ａ～図６Ｃは、開放および閉鎖立体配置における抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０タンデムＦａｂ抗体についてのＨＩＣ分析、収量および結合親和性の結果を示す図である。図６Ａは、ＣＨ１／Ｃｋ突然変異のみを伴う閉鎖立体配置を示す。図６Ｂは、ＣＨ１／Ｃｋ突然変異のみを伴う開放立体配置を示す。図６Ｃは、ＣＨ１／ＣｋおよびＣＭ突然変異を伴う開放立体配置を示す。 図７Ａ～図７Ｂは、抗４－１ＢＢ×抗ＰＤ－Ｌ１タンデムＦａｂ抗体（図７Ａ）、および抗４－１ＢＢ×抗ＰＤ－１タンデムＦａｂ抗体（図７Ｂ）の純度結果を示す図である。いずれの抗体もＣＨ１／ＣｋおよびＣＭ突然変異を伴う開放立体配置である。 図８Ａ～図８Ｂは、ヘテロ二量体化を増強するためのいくつかの異なる突然変異を有するＹ字型二重特異性抗体フォーマットを模式的に示す図である。図８Ａは、Ｆａｂ１上のＣＨ１／カッパ突然変異「Ｏ」（ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）およびＦａｂ２上のＣＨ１／カッパ突然変異「Δ」（ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）を示す。図８Ｂは、Ｆａｂ１上の突然変異（ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ＋Ｏ）およびＦａｂ２上の突然変異（ＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ＋Δ）を示す。 図９Ａ～図９Ｃは、抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０抗体についての純度結果を示す図である。ＮａｎｏＤＳＦ（示差走査蛍光測定）を用いて、Ｔ開始に対する抗体の熱安定性を測定した。ＨＩＣを用いて純度を測定した。野生型抗体を図９Ａに示す。ＣＨ１／Ｃｋ突然変異（Ｆａｂ１＝ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）および（Ｆａｂ２＝ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）を図９Ｂに示す。ＣＨ１／ＣｋおよびＣＭ突然変異（Ｆａｂ１＝ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ；ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ）および（Ｆａｂ２＝ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ；ＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ）を図９Ｃに示す。 図９－１の続き。 図１０Ａ～図１０Ｌは、突然変異のいくつかの異なる組合せを有する種々の抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０抗体についてのＳＥＣおよびＨＩＣプロファイルを示す図である。特異的な突然変異を下記の表９に列挙する。 図１０－１の続き。 図１０－２の続き。 図１０－３の続き。 図１１Ａ～図１１Ｅは、種々のＹ字型抗体についての鎖誤対合データを示す図である。図１１Ａは、抗ＰＤ－１×抗ＧＩＴＲ抗体についての誤対合データを示す。 図１１Ａ～図１１Ｅは、種々のＹ字型抗体についての鎖誤対合データを示す図である。図１１Ｂは、抗ＴＮＦ×抗ＧＩＴＲ抗体についての誤対合データを示す。 図１１Ａ～図１１Ｅは、種々のＹ字型抗体についての鎖誤対合データを示す図である。図１１Ｃは、抗ＴＮＦ×抗ＯＸ４０抗体についての誤対合データを示す。 図１１Ａ～図１１Ｅは、種々のＹ字型抗体についての鎖誤対合データを示す図である。図１１Ｄは、抗ＣＤ４０×抗ＰＤ－Ｌ１抗体についての誤対合データを示す。 図１１Ａ～図１１Ｅは、種々のＹ字型抗体についての鎖誤対合データを示す図である。図１１Ｅは、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１２３抗体についての誤対合データを示す。特異的な突然変異および生物物理学的特徴付けデータを下記の表１１に列挙する。 図１２は、二重特異性ＣＤ３×ＣＤ１２３－ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡ分子とともに同時インキュベートされたＴＨＰ－１標的細胞に対するヒト汎Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイを示す図である。エフェクター細胞およびＣＦＳＥ標識されたＴＨＰ－１標的細胞を１０：１のエフェクター対標的比で播種し、それぞれの二重特異性分子（１０ｎＭ～０ｎＭ）の連続希釈液とともに２０時間、３７℃で同時インキュベートした。死細胞を７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーにより測定した。細胞毒性活性は、死ＴＨＰ－１標的細胞のパーセンテージ（７－ＡＡＤ／ＣＦＳＥ二重陽性）に基づいて計算した。データは、２つの代表的な健康なドナーの平均として、二重特異性分子の濃度［ｐＭ］に対する死標的細胞［％］を示す。
Ｉ．定義
開示をより容易に理解できるように、選択された用語を以下に定義する。
本明細書で使用される配列位置番号は、Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２号、６６２頁、６８０頁、６８９頁、１９９１年）を参照する。
本明細書で使用される場合、２０個の慣用的なアミノ酸およびそれらの略語は慣用的な用法に従う。２０個の慣用的アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）；非天然アミノ酸、例えば、α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸および他の非慣用的アミノ酸はまた、本明細書に記載される結合タンパク質のポリペプチド鎖に適した成分であり得る。非慣用的アミノ酸の例としては、４－ヒドロキシプロリン、ｙ－カルボキシグルタミン酸、ｃ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ｃ－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、ｕ－Ｎ－メチルアルギニン、ならびに他の類似アミノ酸およびイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記において、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシル末端方向であり、標準的な用法および慣例に従う。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてクラスに分けることができる（表１を参照されたい）。
Figure 2022515424000002
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを同じクラスのうちの別のメンバーとの交換を伴うことができる。保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基を包含することができ、典型的には、生体系における合成によるのではなく、化学的ペプチド合成によって取り込まれる。これらには、ペプチド模倣物、およびアミノ酸残基の他の復帰または反転の形態が含まれる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのうちのメンバーと交換することを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「突然変異」または「突然変異型」とは、１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換によるアミノ酸配列の変化を指す。特にこれは置換を指す。突然変異は、所定の配列、例えば、第１の抗原を特異的に認識するＶＬ１および／またはＶＨ１対のアミノ酸配列に対して導入される。
本明細書で使用される場合、「Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異」とは、Ｋａｂａｔ位置１９２における、抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインにおけるグルタミン酸（Ｅ）残基に対するスレオニン（Ｔ）残基の置換を指す。
本明細書で使用される場合、「突然変異セット」とは、配列中に存在する異なる突然変異のグループを指す。
本明細書で使用される場合、用語「変異体」とは、それが由来するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を指す。２つの配列間の同一性パーセントの決定は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻、５８７３～５８７７頁、１９９３年の数学的アルゴリズムを用いて達成される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３～４１０頁のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻、３３８９～３４０２頁に記載されているように使用する。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータが使用される。あるいは、変異体はまた、最大２０、１５、１０、５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、特に保存的アミノ酸置換を有するものとして定義することができる。保存的置換は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。アミノ酸の物理的および化学的特性の概要を上記の表１に示す。特定の実施形態では、保存的置換は、共通の（すなわち、カラム１および／または２の）表１に従う少なくとも１つの特性を有するアミノ酸で行われる置換である。用語「変異体」はまた、断片を含む。断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端欠失が、合計で最大２０、１５、１０、５、４、３、２または１個のアミノ酸（複数可）を有する。さらにまたは代替的に、変異体は、例えば、合計で最大５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１個のアミノ酸のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸付加によって修飾される。
本明細書で使用される場合、用語「抗原」または「標的抗原」または「抗原標的」とは、本明細書に記載される結合タンパク質によって特異的に結合することができ、さらに、動物において、その抗原のエピトープに特異的に結合することができる抗体を産生するために使用することができる分子または分子の一部（例えば、エピトープ）を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有することができる。結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、結合タンパク質は、標的抗原を認識する無傷の抗体と競合することができる。
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合することができる任意の決定基、例えば、ポリペプチド決定基を指す。ある種の実施形態では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面グループ化、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基を含み、ある種の実施形態では、特定の三次元構造特性および／または特定の荷電特性を有することができる。エピトープは、抗体によってもしくは抗体の抗原結合断片によって、または結合タンパク質によって結合される抗原の領域である。ある種の実施形態では、結合タンパク質は、それがタンパク質および／または高分子の複雑な混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、平衡解離定数が１０－８Ｍ未満である場合、平衡解離定数が１０－９Ｍ未満である場合、または解離定数が１０－１０Ｍ未満である場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合タンパク質」または「結合タンパク質」または「結合ポリペプチド」とは、対象の標的抗原（例えば、ヒト抗原）への選択的結合に関与する少なくとも１つの結合部位を含むポリペプチド（例えば、抗体またはその断片）を指す。結合部位の例としては、限定されないが、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、またはリガンドの受容体結合部位が挙げられる。ある種の態様では、結合ポリペプチドは、複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の）結合部位を含む。ある種の態様では、結合タンパク質は治療用酵素ではない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体化ドメイン」または「ＨＤ」とは、それぞれの軽鎖または重鎖の誤対合を防止しながら、所望のタンパク質をもたらすように軽鎖およびそれらの同族重鎖の正しいアセンブリを容易にし、指向しまたは強制する二重特異性、三重特異性または多重特異性結合タンパク質のサブユニットを指す。
本明細書中で使用される場合、「多重特異性」結合タンパク質は、２つまたはそれ以上の抗原、および／または２つまたはそれ以上の異なるエピトープに結合する結合タンパク質である。２つの抗原、および／または２つの異なるエピトープに結合する多重特異性結合タンパク質はまた、本明細書では「二重特異性」結合タンパク質とも呼ばれる。３つの抗原、および／または３つの異なるエピトープに結合する多重特異性結合タンパク質はまた、本明細書では「三重特異性」結合タンパク質とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ二量体化Ｆｃ」または「ヘテロ二量体化Ｆｃの機能的断片」とは、定常ドメインの突然変異体形態、例えば、ＣＨ２－ＣＨ３またはＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４の突然変異体形態を指し、それはもはやホモ二量体を形成しないが、対応する突然変異型Ｆｃ部分を有するヘテロ二量体を形成するという点で、天然に存在するＦｃ部分に関して突然変異型である。したがって、この用語は、ヘテロ二量体を形成する２つの鎖のうちの１つの部分を指す。このような部位のいくつかは、当該技術分野で公知であり、例えば、ノブ－イン－ホール（ＫＩＨ）変異体またはＥＶ－ＲＷＴ変異体を含む。
Ｒｉｄｇｅｗａｙおよび共同研究者は、一方のＣＨ３界面上の小さな側鎖をより大きな側鎖に置換してノブを作り、他方のＣＨ３ドメイン上の大きな側鎖をより小さな側鎖に置き換えて孔を生成することにより、ヘテロ二量体アセンブリに有利なＣＨ３界面を生成した。このような突然変異体の試験は、選択的ヘテロ二量体化を示した。元のノブ－イントゥ－ホール突然変異をさらに拡張して、ジスルフィド結合形成を可能にするさらなる置換を試験する二重特異性ＩｇＧ抗体を生成するために使用されたファージディスプレイによりさらに適切な組合せを同定した。ノブ－イン－ホール変異体は、本明細書に参考により組み入れられる米国特許第５，７３２，１６８号および米国特許第８，２１６，８０５号にさらに記載される。したがって、ある実施形態では、１つのＦｃドメインまたはヘテロ二量体化ドメインのＣＨ３ドメインは、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、別のＦＣドメインまたはヘテロ二量体化ドメインのＣＨ３ドメインは、突然変異Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含む（アミノ酸位置はＩｇＧ１配列を参照することによって示される）。
本明細書で使用される場合、用語「ホモ二量体化ドメイン」とは、同様のドメイン、例えば２つの重鎖へのホモ二量体化を媒介するドメインを指す。重鎖対合は、定常領域の最後のドメイン、すなわち、ＩｇＧ分子中のＣＨ３によって媒介され、高親和性ホモ二量体複合体（約１０ｐＭのＫＤ）を形成する。重鎖のアセンブリ後に形成される２本の重鎖の共有結合に関与するヒンジ領域には、さらなる相互作用が存在する。ＣＨ３ホモ二量体における相互作用は、ヒトγ１のＣＨ３に関して示されるように、ＣＨ３界面で約１６残基が関与し、６残基（Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｆ４０５、Ｙ４０７およびＫ４０９）が界面の中心に形成されたパッチが安定性に強く寄与している。ホモ二量体化ドメインは、限定されないが、Ｆｃ領域およびそのエフェクター修飾された変異体またはいずれかの断片、ならびにＣＨ２ドメインまたはその断片、ＣＨ３ドメインまたはその断片、ＣＨ４ドメインまたは断片などを含む。
天然に存在する抗体は、典型的には四量体を含む。このような四量体は、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成され、各対は、１つの全長「軽鎖」（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重鎖」（典型的には約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。用語「重鎖」および「軽鎖」とは、本明細書で使用される場合、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に関与する約１００～１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与する定常ドメインを規定する。したがって、天然に存在する抗体では、全長重鎖ＩｇＧ免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ＶＬドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインはカルボキシル末端にある。
一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合タンパク質は、表２、３および４に列挙されたＶＨドメイン配列のうちのいずれか１つからの１つまたはそれ以上のＶＨドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合タンパク質は、表２、３および４に列挙されたＶＬドメイン配列のうちのいずれか１つからの１つまたはそれ以上のＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合タンパク質は、表２、３および４に列挙されたＶＨドメイン配列のうちのいずれか１つからの１つまたはそれ以上のＶＨドメインを含み、表２、３および４に列挙されたＶＬドメイン配列のうちのいずれか１つからの１つまたはそれ以上のＶＬドメインと対合にされる。
ヒト軽鎖は、典型的にはカッパおよびラムダ軽鎖として分類され、ヒト重鎖は、典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡも同様に、限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスに細分される。完全長の軽鎖および重鎖内では、可変ドメインおよび定常ドメインは、典型的には、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、すべての目的で全体として参照により組み入れられる基本免疫学（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９年）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって接続された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープへの結合を可能にし得る。アミノ末端からカルボキシル末端まで、軽鎖と重鎖可変ドメインの両方は、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」とは、抗原に結合することができる単一の可変領域内に存在する３つのＣＤＲのグループを指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムによって異なるように定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７年）および（１９９１年））によって記載されたシステムは、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基番号を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界を提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと呼ばれる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．Ａｆｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１～１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７７～８３頁）は、アミノ酸配列レベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤ内のある種のサブ部分が、ほぼ同一のペプチド骨格構造を採用することを見出した。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と命名され、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を示す。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップする境界を有するＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと呼ばれる。Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップするＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ、１９９５年、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９巻：１３３～３９頁；ＭａｃＣａｌｌｕｍ、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２巻（５号）：７３２～４５頁；Ｌｅｆｒａｎｃ、２００３年、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７巻：５５～７７頁によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、本明細書に記載されるシステムの１つに厳密に従うことはできないが、それにもかかわらず、特定の残基もしくは残基のグループ、またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響しないという予測または実験的知見に照らして、それらは短縮または延長されるが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができるが、ある種の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲを使用する。アミノ酸配列を用いた予測ＣＤＲの同定は、当該分野において、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２巻、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．、Ｄｉｋｅｌ Ｓ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、３３～５１頁（２０１０年）において周知である。重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列もまた検査して、他の慣用的方法、例えば、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の公知のアミノ酸配列と比較して、配列超可変性の領域を決定することによりＣＤＲの配列を同定することができる。番号付けされた配列は、目視によって、またはＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻：４６７３～８０頁に記載されるように、アラインメントプログラム、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムスイートのうちの１つを用いることによって整列されることができる。分子モデルは、慣用的には、フレームワークおよびＣＤＲ領域を正確に描写し、したがって、配列ベースの割り当てを修正するために使用される。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のＣＤＲ／ＦＲは、ＩＭＧＴ定義（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年、２７巻（１号）：５５～７７頁；ウェブサイト：ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定される。
一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合タンパク質は、表２、３および４に列挙された可変重鎖配列のうちのいずれか１つからの３つの可変重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合タンパク質は、表２、３および４に列挙された可変軽鎖配列のうちのいずれか１つからの３つの可変軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合タンパク質は、表２、３および４に列挙された可変重鎖配列のうちのいずれか１つからの３つのＨＣＦＲ、ならびに表２、３および４に列挙された可変軽鎖配列のうちのいずれか１つからの３つのＬＣＦＲを含む。表２、３および４の重鎖および軽鎖可変配列からのＣＤＲ配列は、ＣＤＲ配列を同定する、当業者に認識された方法を用いて容易に決定される。
用語「Ｆｃ」とは、本明細書で使用される場合、抗体の消化から生じるか、または他の手段によって産生される非抗原結合断片の配列を含む分子を指し、単量体形態であるか多量体形態であるかを問わず、ヒンジ領域を含むことができる。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、典型的にはヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれかであり得るが、例示的な実施形態ではＩｇＧ１およびＩｇＧ２が使用される。Ｆｃ分子は、共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合によって二量体または多量体の形態に連結することができる単量体ポリペプチドから構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に依存して１～４の範囲である。Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によって生じるジスルフィド結合二量体である。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書で使用される場合、単量体、二量体および多量体形態であることが一般的である。
Ｆａｂ断片は、典型的には、１つの軽鎖、ならびに１つの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、Ｆ（ａｂ）断片のＶＨ－ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用される場合、Ｆａｂ断片はまた、アミノ酸リンカーおよびＣＬドメインによって分離された２つの可変ドメインを含む１つの軽鎖、およびアミノ酸リンカーおよびＣＨ１ドメインによって分離された２つの可変ドメインを含む１つの重鎖を含むことができる。
Ｆ（ａｂ’）断片は、典型的には、１つの軽鎖、および（ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間の）より多くの定常領域を含む１つの重鎖の一部を含み、それにより、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
用語「結合タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの標的抗原に特異的に結合する天然に存在しない（または組換え、操作されたもしくは置換された）分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔｍ」とは、結合タンパク質、抗原結合タンパク質、抗体の融解温度を指し、抗原結合タンパク質の熱安定性に対して重要なパラメータである。Ｔｍとは、一般的に、Ｆｖ断片、すなわち可変領域重鎖および軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）の熱安定性を指す。Ｔｍは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）によって測定することができる。
本開示の一実施形態は、１～４個の標的抗原に対する生物学的および免疫学的特異性、ならびに／または１～４個の標的エピトープに対する特異性を有する結合タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のさらに別の実施形態は、このような結合タンパク質を発現する（すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子またはベクターを含む）宿主細胞を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、０～１００個の連続したアミノ酸残基を指す。リンカーは、存在するかまたは存在せず、および同一であるかまたは異なる。タンパク質またはポリペプチドに含まれるリンカーは、すべて同じアミノ酸配列を有することができるか、または異なるアミノ酸配列を有することができる。
一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、以下の配列：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＧＧ（配列番号Ｘ）を含む。
一部の実施形態では、用語「リンカー」とは、１～１５個の連続するアミノ酸残基を指す。典型的には、リンカーは、２つのアミノ酸間または２つのポリペプチドドメイン間の柔軟性および空間的分離を提供する。リンカーをＶＨ、ＶＬ、ＣＨおよび／またはＣＬドメインの間に挿入して、分子のフォーマットに応じて、例えば、二重可変領域免疫グロブリンに折り畳まれるように、軽鎖および重鎖のドメインに対して十分な柔軟性および可動性を提供することができる。リンカーは、典型的には、アミノ配列レベルで、それぞれ、可変ドメイン間、可変ドメインとノックアウトドメイン間、または可変ドメインと定常ドメイン間の遷移で挿入される。ドメイン間の遷移は、免疫グロブリンドメインの大きさが十分に理解されているため、同定することができる。ドメイン遷移の正確な位置は、実験データによって示されるように、またはモデリングもしくは二次構造予測の技術によって決定されるように、二次構造エレメント、例えばベータ－シートまたはアルファ－ヘリックスを形成しないペプチドストレッチを配置することによって決定することができる。ある種の例示的な実施形態では、リンカーは、Ｆａｂドメイン間に挿入され、タンデムＦａｂ抗体を作製することができる。特定の実施形態では、リンカーは、第１のＦａｂのＶＨドメインのＮ末端と第２のＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端の間に挿入される。
リンカー中のアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカー中で達成するのに必要な二次構造エレメント（複数可）のタイプに依存して変化し得る。例えば、グリシン、セリンおよびアラニンは、最大の柔軟性を有するリンカーに適している。グリシン、プロリン、スレオニンおよびセリンのある種の組合せは、より剛性であり、伸長されたリンカーが望まれる場合に有用である。任意のアミノ酸残基は、所望の特性に応じて必要とされる場合、より大きなペプチドリンカーを構築するために、他のアミノ酸残基と組み合わせたリンカーとみなすことができる。
一部の実施形態では、リンカーは、単一のグリシン（Ｇｌｙ）残基；ジグリシンペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；トリペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；４つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；５つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；６つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；７つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）；および８つのグリシン残基を有するペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；配列番号ｘ）を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒのような小さなアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＳｅｒ（Ｓ）、またはＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳもしくはＧＧＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、ペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、ペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）およびペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、単一のＳｅｒ残基；単一のＶａｌ残基；Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｇｌｎ－Ｐｒｏ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ、Ｔｈｒ－ＬｙｓおよびＳｅｒ－Ｌｅｕから選択されるジペプチド；またはＴｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ、（配列番号ｘ）、Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）；Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ａｒｇ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、Ｈｉｓ－Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ（配列番号ｘ）およびＡｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（配列番号ｘ）から選択されるポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、２つのタンデムＦａｂは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２リンカーを介して連結される。
Ｌ１およびＬ２が軽鎖上にあり、Ｌ３およびＬ４が重鎖上にあるＣＯＤＶ－Ｆａｂ部分を有する一部の実施形態では、Ｌ１は３～１２個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は３～１４個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は１～８個のアミノ酸残基長であり、Ｌ４は１～３個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１は５～１０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は５～８個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は１～５個のアミノ酸残基長であり、Ｌ４は１～２個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１は７個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は５個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は１個のアミノ酸残基であり、Ｌ４は２個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１は１０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ２は１０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ３は０個のアミノ酸残基長であり、Ｌ４は０個のアミノ酸残基長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、各々、０～１５個のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸）から独立に選択される長さを有し、リンカーの少なくとも２つは１～１５個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ（配列番号ｘ）である。一部の実施形態では、リンカーは、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は、配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は、配列Ｓｅｒを含み、Ｌ４は、配列Ａｒｇ－Ｔｈｒを含む。一部の実施形態では、Ｌ３は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列Ｓｅｒを含み、Ｌ２は、配列Ａｒｇ－Ｔｈｒを含み、Ｌ３は、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ４は、配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ（配列番号ｘ）を含む。
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、各々、独立して、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（ｎは０～５の整数である；配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｓｅｒ、Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、およびＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は配列Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は配列Ｓｅｒを含み、Ｌ４は配列Ａｒｇ－Ｔｈｒを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は０個のアミノ酸長であり、Ｌ４は０個のアミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ３は０個のアミノ酸長であり、Ｌ４は０個のアミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ２は０個のアミノ酸長であり、Ｌ３は配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）を含み、Ｌ４は０個のアミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、０個のアミノ酸長であり、Ｌ３およびＬ４は、各々、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号ｘ）（ｎは０～５の整数である；配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｓｅｒ、Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、およびＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）から独立して選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ３およびＬ４は、０個のアミノ酸長であり、Ｌ１およびＬ２は、各々、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（ｎは０～５の整数である；配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｓｅｒ、Ａｒｇ－Ｔｈｒ、Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号ｘ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号ｘ）、およびＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）から独立して選択される配列を含む。
一部の実施形態では、リンカー（複数可）は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインとの間の接合部において天然に存在する配列から誘導される配列を含む（例えば、参照により組み入れられた国際公開第２０１２／１３５３４５号に記載されているもの）。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、内因性ＶＨとＣＨ１ドメインの間、または内因性ＶＬとＣＬドメイン（例えばκまたはλ）の間の遷移で見出される配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、内因性ヒトＶＨとＣＨ１ドメインの間、または内因性ヒトＶＬとＣＬドメイン（例えば、ヒトκまたはλ）の間の遷移で見出される配列を含む。
上記で列挙された例は、いかなる方法でも開示の範囲を限定することを意図するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシンおよびプロリンからなる群から選択されるランダムに選択されたアミノ酸を含むリンカーは、本明細書に記載の結合タンパク質における使用に適している。リンカー配列のさらなる記載については、例えば、参照により組み入れられる国際公開第２０１２／１３５３４５号、国際公開第２０１７／１８０９１３号を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「原子価」とは、結合タンパク質、エピトープ、抗原結合タンパク質または抗体の結合部位の数を指す。例えば、用語「一価結合タンパク質」とは、１つの抗原結合部位を有する結合タンパク質を指す。用語「二価結合タンパク質」とは、２つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。用語「三価結合タンパク質」とは、３つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。用語「四価結合タンパク質」とは、４つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。特定の実施形態では、二価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、二価結合タンパク質は、２つの異なる抗原標的に結合することができる。特定の実施形態では、三価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができ、すなわち、単一特異的である。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、２つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、二重特異性である。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、３つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、三重特異性である。特定の実施形態では、四価結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができ、すなわち、単一特異的である。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、２つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、二重特異性である。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、３つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、三重特異性である。他の実施形態では、四価結合タンパク質は、４つの異なる抗原標的に結合することができ、すなわち、四重特異性である。
本明細書で使用される場合、用語「特異性」とは、結合タンパク質、エピトープ、抗原結合タンパク質または抗体の結合特異性の数を指す。例えば、用語「単一特異的結合タンパク質」とは、１つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。用語「二重特異性結合タンパク質」とは、２つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。用語「三重特異性結合タンパク質」とは、３つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。用語「四重特異性結合タンパク質」とは、４つの異なる抗原標的などに特異的に結合する結合タンパク質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「選択的認識部位」とは、選択的認識部位に結合する親和性試薬によって選択的に認識されることを可能にする結合タンパク質における修飾を指す。選択的認識部位の例は、免疫グロブリンのＦｃ部分におけるプロテインＡの結合部位を含む。
本明細書で使用される場合、用語「親和性試薬」とは、マトリックス上に固定化され、分子、例えばアミノ酸または糖側鎖の表面グループ化に特異的に結合し、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な荷電特性を有するリガンドを含む試薬を指す。親和性試薬はアフィニティークロマトグラフィーのツールであり、リガンドと生成物の間の特異的相互作用によって精製が可能になる。「プロテインＬ」とは、親和性試薬の例であり、マトリックス上に固定化され、免疫グロブリンカッパ軽鎖の可変ドメインのサブセットに対して親和性を有するリガンドを形成する組換えタンパク質Ｌを指す。このようなマトリックスはレジンであり得る。親和性試薬の別の例は、「ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ」であり、これは、マトリックス上に固定化され、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖の定常ドメインに対して親和性を有するリガンドを形成する組換え１３ｋＤａのラクダ科由来の一本鎖抗体を指す。親和性試薬の別の例はプロテインＡである。プロテインＡは、細菌の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁にもともと見出される４２ｋＤａの表面タンパク質である。タンパク質Ａの主要な結合部位は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間のＦｃ領域上にあることが、結晶学的精密化によって示されている。さらに、プロテインＡは、ヒトＶＨ３遺伝子ファミリー由来のＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を含むヒトＩｇＧ分子と結合することが示されている。プロテインＡは、ある種の免疫グロブリンのＦｃ部分に強い親和性で結合することができる。
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。一般的に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と分析物（溶液中の結合タンパク質）の間のリアルタイム結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオセンサーマトリックス上の結合タンパク質）を固定化し、リガンド（標的抗原）を提示することによって行うことができる。用語「ＫＤ」とは、本明細書で使用される場合、特定の結合タンパク質と標的抗原の間の相互作用の解離定数を指す。
本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」とは、結合タンパク質またはその抗原結合断片が、少なくとも約１×１０－６Ｍ、１×１０－７Ｍ、１×１０－８Ｍ、１×１０－９Ｍ、１×１０－１０Ｍ、１×１０－１１Ｍ、１×１０－１２Ｍまたはそれ以上のＫｄでエピトープを含む抗原に結合する能力、および／または非特異的抗原に対するその親和性より少なくとも２倍高い親和性でエピトープに結合する能力を指す。結合タンパク質または抗体に対する抗原の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行うことができる。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、すべての公知の生命形態に不可欠である、高分子もしくはオリゴマー高分子または大きな生体分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含む核酸はヌクレオチドとして公知である単量体からできている。ほとんどの天然に存在するＤＮＡ分子は、互いに巻きついた２つの相補的な生体高分子鎖からなり、二重らせんを形成する。ＤＮＡ鎖はまた、ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドとして公知である。各ヌクレオチドは、窒素含有核酸塩基、ならびにデオキシリボースまたはリボースと呼ばれる単糖およびリン酸基で構成される。天然に存在する核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）またはシトシン（Ｃ）を含む。ヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの糖と次のヌクレオチドのリン酸の間の共有結合によって、鎖中で互いに接続され、その結果、糖－リン酸骨格が交互に変わる。糖がデオキシリボースの場合、ポリマーはＤＮＡである。糖がリボースの場合、ポリマーはＲＮＡである。典型的には、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合を介して形成される。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖核酸ポリマーを指す。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドであり得るか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得ることが理解される。このような修飾には、塩基修飾、例えばブロムリジン、リボース修飾、例えばアラビノシドおよび２’，３’－ジデオキシリボース、ならびにヌクレオチド間結合修飾、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデートおよびホスホロアミデートが含まれる。用語「ポリヌクレオチド」は、特に、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡを含む。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源のポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組合せであり、（１）単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と結合せず；（２）天然に連結されないポリヌクレオチドに結合され；または（３）より大きな配列の一部として天然に存在しない。
「単離されたポリペプチド」とは、（１）それが通常見出される少なくともいくつかの他のポリペプチドを含まない、（２）同じ供給源、例えば、同一種からの他のポリペプチドを実質的に含まない、（３）異種からの細胞により発現される、（４）それが天然において結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）「単離されたポリペプチド」が天然において結合しているポリペプチドの一部と（共有結合または非共有結合によって）結合していない、（６）それが天然において結合していないポリペプチドと操作可能に（共有結合または非共有結合によって）結合している、または（７）天然に存在しないものである。このような単離されたポリペプチドは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せによってコードされる。例示的な実施形態では、単離されたポリペプチドは、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）を妨げるその天然環境中に見出されるポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」とはまた、発現構築物とも呼ばれ、通常、細胞におけるタンパク質発現のために設計されたプラスミドまたはウイルスを指す。用語「ベクター」とは、細胞にタンパク質および／またはベクターに含まれる核酸を導入することができるかまたは導入するものであるタンパク質もしくはポリヌクレオチドまたはその混合物を指す。ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が挙げられる。特に、ベクターは、目的の遺伝子産物、例えば、外来性または異種性ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために使用される。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含み得る。外来ＤＮＡは、宿主細胞において天然に見出されないＤＮＡであって、例えば、ベクター分子を複製し、選択マーカーもしくはスクリーニング可能マーカーをコードし、または導入遺伝子をコードする異種ＤＮＡとして定義される。一度宿主細胞内に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立にまたはそれと同時的に複製することができ、ベクターおよびその挿入されたＤＮＡの数コピーを作製することができる。さらに、ベクターはまた、挿入されたＤＮＡをｍＲＮＡ分子に転写することを可能にするか、またはそうでなければ挿入されたＤＮＡをＲＮＡの複数のコピーに複製させる、必要なエレメントを含むことができる。ベクターはさらに、目的の遺伝子の発現を調節する「発現制御配列」を包含することができる。典型的には、発現制御配列は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えば、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーターまたはリプレッサーである。１つまたはそれ以上の目的の遺伝子産物をコードする１を超えるポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現は、一緒にまたは１つもしくはそれ以上の発現制御配列によって別々に制御される。より具体的には、ベクター上に含まれる各ポリヌクレオチドは、別個の発現制御配列によって制御されるか、またはベクター上に含まれるすべてのポリヌクレオチドは、単一の発現制御配列によって制御される。単一の発現制御配列によって制御される単一ベクター上に含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成し得る。いくつかの発現ベクターは、発現されたｍＲＮＡの半減期を増加させ、および／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入されたＤＮＡに隣接する配列エレメントをさらに含む。したがって、挿入されたＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多くの分子が迅速に合成される。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことが意図される。ある種の修飾は突然変異または環境の影響のいずれかにより次世代に起こる可能性があるため、このような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合もあるが、このような細胞は本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。細菌、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物の発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む、広範な宿主細胞発現系を使用して、結合タンパク質を発現させることができる。適切な細菌発現ベクターの例はｐＵＣ１９である。結合タンパク質を組換え的に発現させるために、宿主細胞は、結合タンパク質のポリペプチド鎖が宿主細胞内で発現されるように、結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を担持する１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、例示的な実施形態では、宿主細胞が培養される培地中に分泌させ、そこから結合タンパク質を回収することができる。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」とは、対象、例えばヒト対象に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物または組成物を指す。
用語「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」とは、本明細書で使用される場合、結合タンパク質の送達を達成または増強するのに適した１つまたはそれ以上の製剤材料を指す。
用語「有効量」および「治療有効量」とは、１つまたはそれ以上の結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を含む医薬組成物に関して使用される場合、所望の治療結果をもたらすのに十分な量または投薬量を指す。
より具体的には、治療有効量は、ある期間、治療される状態に関連付けられた臨床的に定義された病理学的プロセスの１つまたはそれ以上を阻害するのに十分な量の結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）である。有効量は、使用されている特異的抗体様結合タンパク質に依存して変化することができ、また、治療される患者および障害の重症度に関連する種々の因子および状態に依存する。例えば、結合タンパク質または多重特異性結合タンパク質をインビボで投与する場合、因子、例えば患者の年齢、体重および健康、ならびに前臨床動物研究で得られた用量反応曲線および毒性データは、これらの因子の中で考慮される。所与の医薬組成物の有効量または治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
本明細書で使用される場合、用語「結合タンパク質を生成する方法」とは、当該技術分野において周知である技術を使用するタンパク質発現の組換え方法を指す。
ＩＩ．対合を促進するＣＨ１／ＣＬ突然変異
ある種の実施形態では、突然変異は、特定の対合を促進し、ＣＨ１／ＣＬ誤対合を防止するために、ＣＨ１およびＣＬ界面において作製される。このような突然変異は、以下に記載され、各々が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１３／００５１９４号およびＧｏｌａｙら、（２０１６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９６巻、３１９９～３２１１頁においてさらに詳細に記載される。
第１のセットの突然変異は、ＣＨ１およびＣＬドメイン内の相互作用する一対の極性界面アミノ酸に対して作製される。このような極性アミノ酸は、一対の中性および塩形成アミノ酸と交換することができる。ある種の実施形態では、第１のセットの突然変異は、Ｔ１９２Ｅ ＣＨ１突然変異およびＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。Ｔ１９２Ｅ ＣＨ１突然変異およびＮ１３７Ｋ ＣＬカッパ突然変異は塩橋を形成し、これは会合の特異性を強化する可能性があるが、野生型と変異体ＣＨ１およびＣＬカッパドメイン間の立体的および荷電相補性の欠如により望ましくない対合は回避されるべきである。さらに、ＣＬカッパドメイン上のＳ１１４Ａ突然変異は、より大きなリシン側鎖との立体的衝突を避けるためになされる。ＣＨ１ Ｔ１９２ＥおよびＣＬ Ｎ１３７Ｋ／Ｓ１１４Ａ突然変異セットは、代わりに「ＣＲ３」突然変異セットと呼ばれ得る。
第２のセットの突然変異は、ＣＨ１およびＣＬカッパドメインにおける相互作用する疎水性および極性界面アミノ酸残基の対に対して作製される。１つの突然変異は疎水性相互作用から極性相互作用へのスイッチを構成し得る。ある種の実施形態では、第２のセットの突然変異は、Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ ＣＨ１突然変異およびＶ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。Ｌ１３４Ｑ ＣＨ１突然変異およびＶ１３３Ｔ ＣＬカッパ突然変異は、疎水性相互作用から極性相互作用へのスイッチを構成する。同時Ｓ１８８Ｖ ＣＨ１突然変異およびＳ１７６Ｖ ＣＬカッパ突然変異は、極性相互作用から疎水性相互作用へのスイッチを構成する。界面相互作用の極性／疎水性特性の交換は、突然変異型ＣＨ１ドメインとＣＬカッパドメインの間の親和性を変化させずに維持するが、一方、他の野生型対応ＣＨ１ドメインおよびＣＬカッパドメインに対するそれらのそれぞれの親和性を減少させ、したがって、ミスマッチ（変異体／野生型）ドメインに生じる好ましくない相互作用のために誤対合を防止することが期待される。ＣＨ１ Ｌ１４３Ｑ／Ｓ１８８ＶおよびＣＬ Ｖ１３３Ｔ／Ｓ１７６Ｖ突然変異セットは、代わりに「ＭＵＴ４」突然変異セットと呼ばれ得る。
第３および第４のセットの突然変異は、「ノブイントゥホール」突然変異である。より具体的には、第３のセットの突然変異（ＫＨ１）において、Ｌ１２４Ａ、Ｌ１４３Ｅ ＣＨ１突然変異が作製され、Ｖ１３３Ｗ ＣＬカッパ突然変異が作製される。第４のセットの突然変異（ＫＨ２）において、Ｖ１９０Ａ ＣＨ１突然変異が作製され、Ｌ１３５Ｗ、Ｎ１３７Ａ ＣＬカッパ突然変異が作製される。第１、第２、第３および第４のセットの突然変異は、国際公開第２０１３／００５１９４Ａ１号にさらに詳細に記載される。
ＣＨ１およびＣＬカッパドメインの静電荷を交換するために、第５および第６のセットの突然変異を作製することができる。ある種の実施形態では、第５のセットの突然変異は、Ｋ２２１Ｅ ＣＨ１突然変異およびＥ１２３Ｋ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。第５のセットの突然変異は、代わりに、「Ｋ２２１Ｅ／Ｅ１２３Ｋ反対荷電」突然変異セットまたは「ＮＮ１」突然変異セットと呼ばれる。ある種の実施形態では、第６のセットの突然変異は、Ｋ２２８Ｄ ＣＨ１突然変異およびＤ１２２Ｋ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。第６のセットの突然変異は、代わりに、「Ｋ２２８Ｄ／Ｄ１２２Ｋ反対荷電」突然変異セットまたは「ＮＮ２」突然変異セットと呼ばれる。第５および第６の突然変異セットは、国際公開第２００７／１４７９０１Ａ１号にさらに詳細に記載される。ある種の実施形態では、「Ｋ２２１Ｅ／Ｅ１２３Ｋ反対荷電」突然変異セットおよび「Ｋ２２８Ｄ／Ｄ１２２Ｋ反対荷電」突然変異セットを組み合わせることができる。したがって、この組合せは、Ｋ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ ＣＨ１突然変異対、ならびにＥ１２３ＫおよびＤ１２２Ｋ ＣＬカッパ突然変異対を含み得る。組み合わされたセットの突然変異は、代わりに、「Ｋ２２１Ｅ：Ｋ２２８Ｄ／Ｅ１２３Ｋ：Ｄ１２２Ｋ反対荷電」突然変異セットまたは「ＮＮ３」突然変異セットと呼ばれる。
ＣＨ１およびＣＬカッパドメインの静電荷を交換するために、第７および第８のセットの突然変異を作製することができる。ある種の実施形態では、第７のセットの突然変異は、ＣＨ１突然変異がＣＬカッパ突然変異とは反対荷電を有することを条件として、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｒ、Ｌ１４３ＫまたはＬ１４３Ｈ ＣＨ１突然変異、およびＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｒ、Ｓ１７６ｋまたはＳ１７６Ｈ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。第７のセットの突然変異は、代替的に「Ｌ１４３／Ｓ１７６反対荷電」突然変異セットと呼ばれる。ある種の実施形態では、ＣＨ１ Ｌ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異は、ＣＬ Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異と対合し、「ＣＭ３」突然変異セットと呼ばれる。ある種の実施形態では、ＣＨ１ Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異は、ＣＬ Ｓ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異と対合し、「ＣＭ４」突然変異セットと呼ばれる。ある種の実施形態では、第８のセットの突然変異は、ＣＨ１突然変異がＣＬカッパ突然変異とは反対荷電を有することを条件として、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｒ、Ｌ１２４ＫまたはＬ１２４Ｈ ＣＨ１突然変異、およびＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｒ、Ｖ１３３ＫまたはＶ１３３Ｈ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。第８のセットの突然変異は、代替的に「Ｌ１２４／Ｖ１３３反対荷電」突然変異セットと呼ばれる。ある種の実施形態では、ＣＨ１ Ｌ１２４ＥまたはＬ１２４Ｄ突然変異は、ＣＬ Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｋ突然変異と対合し、「ＣＭ５」突然変異セットと呼ばれる。ある種の実施形態では、ＣＨ１ Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｋ突然変異は、ＣＬ Ｖ１３３ＥまたはＶ１３３Ｄ突然変異と対合し、「ＣＭ６」突然変異セットと呼ばれる。
さらなる実施形態では、上述の突然変異のうちのいずれか１つまたはそれ以上を、互いの突然変異および／または下記の突然変異と組み合わせることができる。一例として、第１のＦａｂのＣＨ１ドメインは、Ｔ１９２Ｅ、Ｋ２２１Ｅ突然変異を含み、第１のＦａｂのＣＬカッパドメインは、Ｅ１２３Ｋ、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ突然変異を含む。第２のＦａｂのＣＨ１ドメインは、Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ突然変異をさらに含み得、第２のＦａｂのＣＬカッパドメインは、Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ突然変異を含み得る。あるいは、第２のＦａｂは野生型である。
ＣＨ１およびＣＬカッパドメインについて本明細書で使用される配列位置番号は、カバット番号付け（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２号、６６２頁、６８０頁、６８９頁、１９９１年）に言及する。
ＩＩＩ．対合を促進するためのＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異
ある種の実施形態では、突然変異は、ＶＨおよびＶＬ界面において作製され、特定の対合を促進し、ＶＨ／ＶＬの誤対合を防止することができる。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインになされた突然変異は、静電相互作用を介してヘテロ二量体化を促すための反対荷電アミノ酸残基を導入する。
ある種の実施形態では、一組の反対荷電突然変異は、Ｋａｂａｔ位置３９におけるＶＨドメインの突然変異およびＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬドメインの突然変異を含み得る。ＶＬ Ｋａｂａｔ位置３８に導入された突然変異が反対荷電を有することを条件として、ＶＨ Ｋａｂａｔ位置３９に任意の公知の正電荷または負電荷残基を導入することができる。例えば、１つの可能な突然変異対は、ＶＨ Ｋ３９突然変異残基（正電荷を導入する）およびＶＬ Ｅ３８突然変異残基（負電荷を導入する）を含む。あるいは、復帰突然変異セットを作製することができ、ＶＨ Ｅ３９突然変異残基（負電荷を導入する）およびＶＬ Ｋ３８突然変異残基（正電荷を導入する）を導入する。ある種の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨに突然変異された残基をＫａｂａｔ位置３９に含み得、ＶＬドメインは、ＶＨドメイン中の突然変異された残基がＶＬドメインに突然変異された残基と反対荷電であることを条件として、Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨに突然変異された残基をＫａｂａｔ位置３８に含み得る。例えば、ＶＨドメインがＫａｂａｔ位置３９において突然変異残基ＥまたはＤを含む場合、ＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置３８に突然変異残基Ｋ、ＲまたはＨを含む。あるいは、ＶＨドメインがＫａｂａｔ位置３９に突然変異した残基Ｋ、ＲまたはＨを含む場合、ＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置３８に突然変異した残基ＥまたはＤを含む。２つのＶＨ／ＶＬ対が同じポリペプチド鎖に存在しないある種の実施形態では、１つのＶＨ／ＶＬ対がＶＨ３９に正電荷（例えば、ＥまたはＤ）、およびＶＬ３８に負電荷（例えば、Ｋ、ＲまたはＨ）を含む場合、別のＶＨ／ＶＬ対はＶＨ３９に負電荷（例えば、Ｋ、ＲまたはＨ）およびＶＬ３８に正電荷（例えば、ＥまたはＤ）を含み得る。例えば、第１のＶＨ／ＶＬ対がＶＨ３９ＫおよびＶＬ３８Ｅ突然変異を含む場合、第２のＶＨ／ＶＬ対はＶＨ３９ＥおよびＶＬ３８Ｋ突然変異を含み得る。このセットの反対荷電突然変異は、代わりに「ＶＨ３９／ＶＬ３８反対荷電」突然変異セットと呼ぶことができる。このセットの反対荷電突然変異は、Ｔａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ．７５巻、１４７３～１４８２頁、１９９８年にさらに詳細に記載される。
ある種の実施形態では、一組の反対荷電突然変異は、ＶＨドメインにおけるＱ３９突然変異およびＶＬドメインにおけるＱ３８突然変異を含み得る。ＶＬ Ｑ３８位置に導入された突然変異が反対荷電を有することを条件として、任意の公知の正電荷または負電荷残基をＶＨ Ｑ３９位置に導入することができる。例えば、１つの可能な突然変異対は、ＶＨ Ｑ３９Ｋ突然変異（正電荷を導入する）およびＶＬ Ｑ３８Ｅ突然変異（負電荷を導入する）を含む。あるいは、ＶＨ Ｑ３９Ｅ突然変異（負電荷を導入する）およびＶＬ Ｑ３８Ｋ突然変異（正電荷を導入する）を導入する復帰突然変異セットを作製する。ある種の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み得、ＶＬドメインは、ＶＨドメインにおける突然変異がＶＬドメインにおける突然変異とは反対荷電であることを条件として、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み得る。
さらなる実施形態では、上述の突然変異のうちのいずれか１つまたはそれ以上を、互いの突然変異および／または下記の突然変異と組み合わせることができる。
ＩＶ．ＶＨ／ＶＬジスルフィド安定化突然変異
ある種の実施形態では、ＶＨ／ＶＬ界面間の安定性を改善するために、ＶＨおよびＶＬ界面に突然変異を作製することができる。ＶＨドメインおよびＶＬドメインにおける特異的な一連のアミノ酸突然変異は、ジスルフィド架橋を形成する非天然システイン残基の導入を介して安定性を改善し得る。
第１のセットのジスルフィド安定化突然変異をＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸残基に対して作製することができる。ある種の実施形態では、第１のセットのジスルフィド安定化突然変異は、ＶＨドメインにおける４４Ｃ突然変異およびＶＬドメインにおける１００Ｃ突然変異を含み得る。第１のセットのジスルフィド安定化突然変異は、代替的に「ＶＨ４４Ｃ／ＶＬ１００Ｃ」突然変異セットと呼ばれる。第１のセットのジスルフィド安定化突然変異は、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられるＲｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４巻、１２３９～１２４５頁、１９９６年においてさらに詳細に記載される。
第２のセットのジスルフィド安定化突然変異は、ＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸残基に対して作製することができる。ある種の実施形態では、第２のセットのジスルフィド安定化突然変異は、ＶＨドメインにおける１０５Ｃ突然変異およびＶＬドメインにおける４３Ｃ突然変異を含み得る。第２のセットのジスルフィド安定化突然変異は、代替的に「ＶＨ１０５Ｃ／ＶＬ４３Ｃ」突然変異セットと呼ばれる。
第２のセットのジスルフィド安定化突然変異は、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられる米国特許第９，５２７，９２７号においてさらに詳細に記載される。
Ｖ．抗体突然変異の組合せ
ある種の実施形態では、突然変異セットの組合せは、ＣＨ１およびＣＬカッパ界面ならびに／またはＶＨおよびＶＬ界面にあり、対合をさらに促進し、安定性を改善することができる。
特定の実施形態では、抗体中の第１のＦａｂドメインは、ＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットと組み合わせて、ＣＲ３およびＭＵＴ４突然変異セットの一方または両方を含み得る。さらなる実施形態では、抗体中の第２のＦａｂドメインは、ＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットと組み合わせて、ＣＲ３およびＭＵＴ４突然変異セットの一方または両方を含み得る。
特定の実施形態では、第１のＦａｂドメインは、ＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットおよびジスルフィド安定化突然変異セットと組み合わせて、ＣＲ３およびＭＵＴ４突然変異セットの一方または両方を含み得る。さらなる実施形態では、抗体中の第２のＦａｂドメインは、ＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットおよびジスルフィド安定化突然変異セットと組み合わせて、ＣＲ３およびＭＵＴ４突然変異セットの一方または両方を含み得る。
上記の実施形態のいずれも、ＣＨ１／ＣＬ界面に反対荷電突然変異セットをさらに含むことができる。例えば、第１のＦａｂは、Ｋ２２１Ｅ ＣＨ１突然変異およびＥ１２３Ｋ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。第２のＦａｂは、Ｋ２２１Ｅ ＣＨ１突然変異およびＥ１２３Ｋ ＣＬカッパ突然変異を含み得る。
ＶＩ．抗体フォーマットおよびそこにおける突然変異セット
上記される突然変異セットおよびそれらの組合せのいずれかを本明細書に記載される多重特異性抗原結合タンパク質に適用することができる。
クロスオーバー二重変数
特定の実施形態では、「クロスオーバー二重変数」または「ＣＯＤＶ」とは、少なくとも１つの標的抗原または少なくとも１つの標的エピトープに特異的に結合し、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む抗原結合ドメインを指し、少なくとも１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、少なくとも１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、交差軽鎖－重鎖対を形成する。
特定の実施形態では、ＣＯＤＶ抗原結合ドメインは、少なくとも１つの標的抗原または少なくとも１つの標的エピトープに特異的に結合し、４つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、２つのポリペプチド鎖は、各々、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、２つのポリペプチド鎖は、各々、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは免疫グロブリンヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１／ＶＬ１対は第１の抗原結合特異性を含み、ＶＨ２／ＶＬ２対は第２の抗原結合特異性を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の異なる抗原標的に特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性および／または３価の抗原結合タンパク質であり、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジはＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；および
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成する。
ある種の実施形態では、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を形成する交差配向を有する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は、結合対を形成し、第１の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２は、結合対を形成し、第２の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは、第３の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ３およびＶＬ３は、結合対を形成し、第３の抗原結合部位を形成する。
このような抗原結合タンパク質は、少なくとも３つの抗原結合部位を含む。それは少なくとも３価の抗原結合分子である。特定の実施形態では、それは１つの抗原標的に特異的に結合し、すなわち、それは単一特異的抗原結合分子である。別の実施形態では、それは２つの異なる抗原標的に特異的に結合し、すなわち、それは二重特異性抗原結合分子である。別の実施形態では、それは３つの異なる抗原標的に特異的に結合し、すなわち、それは三重特異性抗原結合分子である。
上記で列挙された例は、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することを意図せず、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシンおよびプロリンからなる群からランダムに選択されるアミノ酸を含むリンカーは、本明細書に記載される抗体様結合タンパク質に適していることが示されている。
ＣＯＤＶ抗体フォーマット、ＣＯＤＶ抗体フォーマットの種々の置換、およびリンカーに関するさらなる詳細は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２／１３５３４５Ａ１号および国際公開第２０１７／１８０９１３Ａ２号においてさらに記載される。
タンデムＦａｂ
特定の実施形態では、「タンデムＦａｂ」とは、抗原結合タンパク質を指し、第１のＦａｂドメインの１つのＣＨ１領域のＣ末端は、第２のＦａｂドメインのＶＨ領域のＮ末端に作動可能に連結される。ある種の実施形態では、タンデムｆａｂ抗体は、四価および単一特異的であり得る（４つのＦａｂの各々は同じ抗原に結合する）。ある種の実施形態では、タンデムｆａｂ抗体は、四価および二重特異性であり得る（４つのＦａｂのうちの２つは、第１の抗原またはエピトープに結合するが、他の２つのＦａｂは、第２の抗原またはエピトープに結合する）。
タンデムｆａｂは、２つまたはそれ以上の抗原結合ドメインを連結するために使用される技術分野への任意の公知のペプチドリンカーと作動可能に連結される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー、すなわち、グリシンアミノ酸（複数可）およびセリンアミノ酸（複数可）のみを含むリンカーである。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号ｘ）リンカーであり、ｎは１～５の任意の整数である。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３（配列番号ｘ）リンカーである。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）２（配列番号ｘ）リンカーである。
あるいは、または上記されるＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーと組み合わせて、ペプチドリンカーは、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＤから選択される１つまたはそれ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部または一部を含み得る。ヒトＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤのヒンジ領域の配列を以下に示す：
ＩｇＡ１（配列番号Ｘ）：
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
ＩｇＡ２（配列番号Ｘ）：
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ
ＩｇＤ（配列番号Ｘ）：
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ
ＩｇＧ１（配列番号Ｘ）：
Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ
ＩｇＡＧ２（配列番号Ｘ）：
Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ
ＩｇＧ３：
Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号Ｘ）の後に、Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号Ｘ）の０または１～４個の繰り返し
ＩｇＧ４：
Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ（配列番号Ｘ）
上記ペプチドリンカーは、ただ１つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部または一部を含み得る。この場合、上記免疫グロブリンは、隣接するＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプおよびサブクラス、または異なるアイソタイプもしくはサブクラスに属し得る。
あるいは、上記ペプチドリンカーは、異なるアイソタイプまたはサブクラスの少なくとも２つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部または一部を含み得る。この場合、ＣＨ１ドメインに直接従うペプチドリンカーのＮ末端部分は、上記ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプおよびサブクラスに属する免疫グロブリンのヒンジ領域の全部または一部からなることができる。所望により、上記ペプチドリンカーは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインの２～１５個または５～１０個のＮ末端アミノ酸の配列をさらに含み得る。
ある種の実施形態では、天然ヒンジ領域由来の配列を使用することができる。他の実施形態では、点突然変異は、不所望な鎖内または鎖間ジスルフィド結合を回避するために、これらの配列、特に天然ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３ヒンジ配列中の１つまたはそれ以上のシステイン残基をアラニンまたはセリンで置換することができる。
本開示の抗原結合タンパク質において使用することができるペプチドリンカーの非限定的な例は、以下の配列：Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）を有するペプチドリンカーである。上記ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ１ヒンジの全長配列、続いてヒトＩｇＧ１ ＣＨ２の９個のＮ末端アミノ酸（Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ、配列番号Ｘ）、続いてヒトＩｇＡ１ヒンジの配列の一部（Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ、配列番号Ｘ）、およびジペプチドＧＧからなり、リンカーに補足的な柔軟性を提供するために付与される。特定の実施形態では、ペプチドリンカーＧｌｕ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号ｘ）は、ジスルフィド結合形成を排除するために置換された１つまたはそれ以上のシステイン残基を有することができる。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、以下の配列：Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｈｉｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号Ｘ）を含む。ヒンジ由来のペプチドリンカーは、国際公開第２０１３／００５１９４Ａ２号にさらに記載され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ＶＩＩ．例示的な抗体突然変異および抗体フォーマットの組合せ
上記される抗体突然変異のいずれかを上記の抗体フォーマットのいずれかと組み合わせることができる。
特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＲ３突然変異セット、ＭＵＴ４突然変異セット、Ｌ１４３／Ｓ１７６反対荷電突然変異セット、およびＬ１２４／Ｖ１３３反対荷電突然変異セットのうちの１つまたはそれ以上を有するＣＯＤＶ抗体フォーマットを含み得る。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットは、限定されないが、ＶＨ３９／ＶＬ３８反対荷電突然変異セットを含む。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬジスルフィド安定化突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬジスルフィド突然変異セットは、限定されないが、ＶＨ４４Ｃ／ＶＬ１００Ｃ突然変異セットおよびＶＨ１０５Ｃ／ＶＬ４３Ｃ突然変異セットを含む。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＨ１／ＣＬ反対荷電突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＣＨ１／ＣＬ反対荷電突然変異セットは、限定されないが、Ｋ２２１Ｅ／Ｅ１２３Ｋ反対荷電突然変異セットを含むことができる。
特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、２つの抗原結合部位を形成し、１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
で表される構造を有し、１つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
で表される構造を有し、
式中、
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；ならびに
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドが交差軽鎖－重鎖対を形成し、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方はＶＨ４４Ｃ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方はＶＬ１００Ｃ突然変異を含み、ジスルフィド結合を形成し、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１ドメインは、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬドメインは、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＲ３突然変異セット、ＭＵＴ４突然変異セット、Ｌ１４３／Ｓ１７６反対荷電突然変異セット、およびＬ１２４／Ｖ１３３反対荷電突然変異セットのうちの１つまたはそれ以上を有するタンデムＦａｂ抗体フォーマットを含み得る。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットは、限定されないが、ＶＨ３９／ＶＬ３８反対荷電突然変異セットを含む。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬジスルフィド安定化突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬジスルフィド突然変異セットは、限定されないが、ＶＨ４４Ｃ／ＶＬ１００Ｃ突然変異セットおよびＶＨ１０５Ｃ／ＶＬ４３Ｃ突然変異セットを含む。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＨ１／ＣＬ反対荷電突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＣＨ１／ＣＬ反対荷電突然変異セットは、限定されないが、Ｋ２２１Ｅ／Ｅ１２３Ｋ反対荷電突然変異セットを含み得る。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
（４）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＣＨ１－１のＣ末端は、ＶＨ２のＮ末端に操作可能に連結され、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、
対合を促進するためのＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、対合を促進するためのＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＲ３突然変異セット、ＭＵＴ４突然変異セット、Ｌ１４３／Ｓ１７６反対荷電突然変異セット、およびＬ１２４／Ｖ１３３反対荷電突然変異セットを有する従来のＹ字型抗体フォーマットを含み得る。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬ反対荷電突然変異セットは、限定されないが、ＶＨ３９／ＶＬ３８反対荷電突然変異セットを含む。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬジスルフィド安定化突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬジスルフィド安定化突然変異セットは、限定されないが、ＶＨ４４Ｃ／ＶＬ１００Ｃ突然変異セットおよびＶＨ１０５Ｃ／ＶＬ４３Ｃ突然変異セットを含む。抗原結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＨ１／ＣＬ反対荷電突然変異セットをさらに含み得る。１つまたはそれ以上のＣＨ１／ＣＬ反対荷電突然変異セットは、限定されないが、Ｋ２２１Ｅ／Ｅ１２３Ｋ反対荷電突然変異セットを含み得る。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１ドメインおよびＣＨ１－２ドメインの一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、
対合を促進するためのＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、対合を促進するためのＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１ドメインおよびＣＨ１－２ドメインの一方または両方は、Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方は、Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異のうちの１つまたはそれ以上を含み、
対合を促進するためのＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、対合を促進するためのＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方は、Ｋ２２１Ｅ突然変異をさらに含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方は、Ｅ１２３Ｋ突然変異をさらに含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方は、Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方は、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方は、Ｑ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方は、Ｑ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含み、ＶＨ１およびＶＨ２の一方または両方における突然変異は、ＶＬ１およびＶＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電であり、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方は、Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含み、ＣＨ１－１またはＣＨ１－２の一方または両方における突然変異は、ＣＬ１およびＣＬ２の一方または両方における突然変異とは反対荷電である。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＤ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＥ１２３Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＥ１２３Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＥ１２３Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方がＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方がＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）；
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；および
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含む。
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１ドメインはＬ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ突然変異を含み、ＣＨ１－２ドメインはＬ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ突然変異を含み、ＣＬ１ドメインはＳ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異を含み、ＣＬ２ドメインはＳ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異を含み、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、以下：
ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
（２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
（３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
（５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
（６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
を含むことができ、
ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
ＣＨ１－１およびＣＨ１－２ドメインの一方または両方はＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬ１およびＣＬ２ドメインの一方または両方はＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含み、
ＶＨ１ドメインはＶＨ３９Ｋ突然変異を含み、ＶＬ１ドメインはＶＬ３８Ｅ突然変異を含み、
ＶＨ２ドメインはＶＨ３９Ｅ突然変異を含み、ＶＬ２ドメインはＶＬ３８Ｋ突然変異を含む。
ＶＩＩＩ．製剤／医薬組成物
ある種の実施形態では、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載される治療有効量の抗原結合タンパク質とを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態は、本明細書に記載される結合タンパク質のうちのいずれか１つの治療有効量、または結合タンパク質－薬物コンジュゲートを、投与様式との適合性のために選択される薬学的または生理学的に許容される製剤と混合して含む医薬組成物を含む。
許容される製剤材料は、典型的には、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性である。
一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透性を修飾、維持、または防ぐための製剤材料を含み得る。適切な製剤材料には、限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン）、充填剤、単糖、二糖および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニクス；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０；Ｔｒｉｔｏｎ；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル）、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、等張化増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、例えば、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬補助剤が挙げられる（例えば、すべての目的で参照により本明細書に組み入れられるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０年）。およびその後続の版を参照されたい）。
一部の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図された投与経路、送達フォーマットおよび所望の投薬量に依存して、当業者によって決定される。このような組成物は、結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響を与え得る。
一部の実施形態では、医薬組成物中の一次ビヒクルまたは担体は、天然において水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のための適切なビヒクルまたは担体は、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得、場合によっては、非経口投与のための組成物中に一般的な他の物質を補足することができる。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらに例示的なビヒクルである。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、これはさらにソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本開示の１つの実施形態では、結合タンパク質組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤と混合することによって、保存のために調製することができる。さらに、結合タンパク質は、適切な賦形剤、例えばショ糖を用いて凍結乾燥剤として製剤化することができる。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、非経口送達または皮下のために選択することができる。あるいは、組成物は、吸入させるために、または消化管を通じて、例えば経口的に送達させるために選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。
一部の実施形態では、製剤成分は、投与部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
非経口投与が意図される場合、使用するための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の結合タンパク質を含む、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、無菌蒸留水であり、結合タンパク質が、適切に保存された無菌の等張溶液として製剤化される。さらに別の調製物は、薬剤、例えば、注射用ミクロスフェア、生物浸食性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームを用いた所望の分子の製剤化を含むことができ、次に、デポ注射を介して送達される生成物の制御されたまたは持続的な放出を提供する。ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは循環中の持続時間を促進する効果を有することができる。所望の分子を導入するための他の適切な手段は、埋込み可能な薬物送達デバイスを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、吸入のために製剤化することができる。例えば、結合タンパク質は、吸入のための乾燥粉末として製剤化することができる。結合タンパク質吸入溶液はまた、エアロゾル送達用の噴射剤とともに製剤化することができる。さらに別の実施形態では、溶液を噴霧することができる。
また、ある種の製剤を経口投与し得ることが企図される。本開示の一実施形態では、この様式で投与される多重特異性結合タンパク質は、固形投薬形態、例えば、錠剤およびカプセルの配合において慣用的に使用される担体を伴ってまたは伴わずに製剤化することができる。例えば、カプセルは、生物学的利用能が最大化され、全身前の分解が最小化される場合、胃腸管内の点で製剤の活性部分を放出するように設計することができる。結合タンパク質の吸収を促進にするために、さらなる物質を含めることができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用することができる。
別の医薬組成物は、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤との混合物中の有効量の多重特異性結合タンパク質を伴うことができる。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することにより、溶液を単位投薬形態で調製することができる。適切な賦形剤としては、限定されないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸塩、ラクトースもしくはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンもしくはアカシア；または潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクが挙げられる。
本開示のさらなる医薬組成物は、当業者には明らかであり、持続性または制御された送達製剤中に結合タンパク質を伴う製剤が含まれる。種々の他の持続性または制御された送達手段、例えば、リポソーム担体、生物侵食性微粒子または多孔性ビーズおよびデポ注射を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。持続放出調製物のさらなる例には、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、エチレンビニルアセテート、またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸の共重合体が含み得る。持続放出組成物はまた、リポソームを含むことができ、当該技術分野において公知であるいくつかの方法のいずれかによって調製することができる。
一部の実施形態では、医薬組成物は、インビボでの投与のために使用されるべきであり、典型的には、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通して濾過することによって達成することができる。組成物を凍結乾燥する場合は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに、この方法を用いた滅菌を行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保存することができる。さらに、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通され得るストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。
医薬組成物が製剤化されていると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアル中に保存することができる。このような製剤は、直ぐに使える形態、または投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存することができる。
本開示はまた、単回投薬単位を生成するためのキットを包含する。キットは、各々、乾燥された多重特異性結合タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を含むことができる。また、本開示の範囲には、単一および複数チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含むキットが含まれる。
治療的に使用される有効量の結合タンパク質の医薬組成物は、例えば、治療的背景および目的に依存する。したがって、治療のための適切な用量レベルは、送達された分子、結合タンパク質が使用されている適応、投与経路、および患者のサイズ（体重、体表面または臓器サイズ）および状態（年齢および全身健康）に部分的に依存して変化することを当業者は理解する。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し、投与経路を修飾することができる。
投薬頻度は、使用される製剤中の結合タンパク質の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単回投薬として、２回またはそれ以上の投薬（所望の分子と同量を含有し得るか、または含有し得ない）として、経時的に、または移植デバイスもしくはカテーテルを介した持続注入として投与することができる。適切な投薬量のさらなる精密化は、当業者によって日常的になされ、当業者よって日常的に行われるタスクの範囲内にある。適切な投薬量は、適切な用量－反応データを使用することによって確認することができる。
医薬組成物の投与経路は、公知の方法、例えば、経口；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内もしくは病変内経路による注射；持続放出システムによる；または移植デバイスによるものに従う。所望であれば、組成物は、ボーラス注射によって、または注入によって連続的に、または移植デバイスによって投与することができる。
一部の実施形態では、組成物はまた、所望の分子が吸収またはカプセル化されているメンブレン、スポンジまたは他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、任意の適切な組織または臓器に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与を介して行うことができる。
ＶＩＩＩ．治療／使用方法
本開示の別の態様は、薬剤としての使用のために本明細書に記載される多重特異性抗体および／または抗原結合タンパク質である。
特定の実施形態では、抗原活性が有害である疾患を治療する方法が提供され、それを必要とする対象に、本明細書に記載される有効量の抗原結合タンパク質を投与することを含む。
結合タンパク質は、任意の公知のアッセイ方法、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに１つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量のための免疫沈降アッセイにおいて使用することができる。結合タンパク質は、使用されるアッセイ方法に適した親和性で１つまたはそれ以上の標的抗原に結合する。
診断用途のために、一部の実施形態では、結合タンパク質は、検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成することができる任意のものであり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎもしくは６７Ｇａ；蛍光性または化学発光性化合物、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン；または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼであり得る。
結合タンパク質はまた、インビボでのイメージングに有用である。検出可能な部分で標識された結合タンパク質は、動物に、例えば、血流中に投与することができ、宿主中の標識抗体の存在および位置がアッセイされる。結合タンパク質は、核磁気共鳴、放射線学、または当該技術分野において公知である他の検出手段による否かにかかわらず、動物において検出可能な任意の部分で標識することができる。
臨床または研究用途のために、一部の実施形態では、結合タンパク質は、細胞毒性剤にコンジュゲートされる。細胞毒性剤（すなわち、抗体－薬物コンジュゲート）に結合された種々の抗体が、特定の腫瘍細胞に細胞毒性ペイロードを標的化するために使用されている。細胞毒性剤、および薬剤を抗体にコンジュゲートするリンカーは、当該技術分野において公知である；例えば、Ｐａｒｓｌｏｗ，Ａ．Ｃ．ら、（２０１６年）Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ４巻：１４頁、およびＫａｌｉｍ，Ｍ．ら、（２０１７年）Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．１１巻：２２６５～２２７６頁を参照されたい。
本開示はまた、生物学的試料中の標的抗原レベルを検出するのに有用な結合タンパク質および他の試薬を含むキットを指す。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照試料、ならびに検出試薬を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される任意の結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、ベクターシステム、および／または宿主細胞を含む組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、容器と、容器上または容器と関連するラベルまたはパッケージ挿入物とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成される。容器は、それ自体で、または状態を治療、予防および／もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有するバイアルであり得る）。一部の実施形態では、ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が、選択される状態を予防、診断および／または治療するために使用されることを示す。あるいはまたはさらに、製造物品またはキットは、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含むことができる。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、癌を治療または予防するために、それを必要とする患者に投与される。一部の実施形態では、本開示は、増殖性疾患または障害（例えば、癌）を予防および／または治療する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される結合タンパク質またはそれに関連する医薬組成物のうちの少なくとも１つの治療有効量を患者に投与することを含む。一部の実施形態では、患者はヒトである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗癌療法（例えば、当該技術分野において公知である任意の抗癌療法化学療法剤または療法）と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗癌療法の前に投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗癌療法と同時に投与される。一部の実施形態では、少なくとも１つの結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の抗癌療法の後に投与される。
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、これらが変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるべきである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施態様では、本明細書で使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．およびＫｏｌｂ，Ｈ．編集、（１９９５年）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されるように定義される。本明細書に別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。いずれかの潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に提供される定義は、任意の辞書または外来的定義よりも優先される。文脈上別段の要求がない限り、単数語は複数を含み、複数語は単数語を含むものとする。「または」の使用は、特に断らない限り、「および／または」を意味する。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、限定するものではない。本明細書で使用される場合、特に断りのない限り、単数形は、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数の参照を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のタンパク質分子を含む。
さらに、本明細書に記載された実験は、特に断らない限り、当業者の範囲内で従来の分子および細胞生物学的ならびに免疫学的技術を使用する。このような技術は、熟練作業者に周知であり、文献で十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９８７～２００８年）、補遺含む、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第４版）、ＭＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１４章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２０１３年、第２版）を参照されたい。
本明細書の本文中には、いくつかの文献が引用されている。本明細書に引用される各文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、説明書などを含む）は、上述のものであれ下記のものであれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明によりこのような開示に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。
以下において、本発明のエレメントを説明する。これらのエレメントは、特定の実施形態で記載されるが、しかしながら、追加の実施形態を作製するために、任意の方法および任意の数で組み合わせることができることを理解するべきである。様々に説明された実施例および特定の実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するものと解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明された実施形態を任意の数の開示されたエレメントと組み合わせる実施形態を支持し、包含するものと理解されるべきである。さらに、文脈上別段の指示がない限り、本出願に記載されたすべてのエレメントの置換および組合せは、本出願の明細書によって開示されたものとみなされるべきである。
一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本明細書に提供される方法および技術は、一般的に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、ならびに他に指示されない限り、本明細書全体を通じて引用されおよび検討される、種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載されるように行われる。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に達成されるかまたは本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および医薬化学と関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製物、製剤、および送達、患者の治療には標準的な技術が用いられる。
Ｆａｂアセンブリは、ＶＨ／ＶＬおよびＣＨ１／ＣＬドメイン相互作用によって駆動される。異なるＦａｂ界面突然変異を含む異なる構造体を有する種々の多重特異性構築体を作製した。ＣＨ１／ＣＬおよびＶＨ／ＶＬ界面内の組み合わされた突然変異対が正しい対合を指示する能力を調査し、以下の実施例において説明する。
一般的な発現および精製スキーム
二重特異性および三重特異性分子の発現
Ｆ１７血清不含懸濁培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖するＨＥＫ２９３－ＦＳ細胞は、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬を用いて、指示された軽鎖および重鎖をコードするプラスミドでトランスフェクトされた。３７℃で７日間の培養後、細胞を遠心分離により除去し、上清を０．２２μｍフィルター上に通過させて粒子を除去した。
精製のために、抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（カタログ番号：１１－００３４－９３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉し、０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出し、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（カタログ番号：１７－０５０８７－０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて直接脱塩した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ２６／６０（ＧＥ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および最終の限外濾過濃縮工程によりタンパク質を最終精製（ｐｏｌｉｓｈ）した後、タンパク質をさらに特徴付けるために使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
分析用ＳＥＣは、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）およびＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ ＨＰＬＣガードカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて２５℃でＢｉｏＳＥＣｃｕｒｉｔｙ装置（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて行われた。２５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａ－リン酸塩ｐＨ６．７を用いて０．２５μｍ／分の流速で分析を行い、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍで検出した。静的光散乱を４３６ｎｍで検出した。５μｌのタンパク質試料（１ｍｇ／ｍｌ）をカラムに適用した。データ評価は、ＷｉｎＧＰＣソフトウェアｖ８．１（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて行われた。分子量の推定のために、ＳＥＣカラムは、６．５～６７０ｋＤａの分子量範囲のタンパク質標準で較正された。
分析用疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ １０μｍ、２×７５ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＬＣ１０ ＨＰＬＣ装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて２５℃で分析ＨＩＣを行った。０．１ｍｌ／分の流速で分析を行い、２８０ｎｍで検出した。５μｇの未希釈タンパク質試料をカラムに適用した。勾配溶出は０～３０分（０％～１００％Ｂ）であり、続いて１００％Ｂで１０分間、および１５分間、再平衡化した。緩衝液Ａは、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成された。緩衝液Ｂは、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成された。データ評価はＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアｖ５．８５（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて行われた。
質量分析（ＭＳ）
タンパク質完全性をＬＣ－ＭＳによって分析した。タンパク質試料は、３７℃で１５時間、０．５μｌのＰＮＧａｓｅＦ（グリセロール不含、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理されたＤ－ＰＢＳ緩衝液中で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈された１２．５μｇのタンパク質で脱グリコシル化された。ＬＣ－ＭＳ分析は、６５４０ＵＨＤ精密質量Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行われた。１８０μＬ／分でガードカラムＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ８ ５μｍ、２．１×１２．５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ－Ｃ８、５μｍ、７５×０．５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーを行った。溶出液は、ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ａ）および９０％アセトニトリル、１０％ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ｂ）であった。２μｇのタンパク質をカラムに注入し、０％から１００％Ｂの直線勾配を用いて１３分で溶出させた。データ分析は、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアＢ．０６（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行われた。分子量は、ＧＰＭＡＷソフトウェアバージョン９．１３ａ２（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ Ｄａｔａ）を用いて、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算された。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
抗体構築物への抗原の結合をＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定した。抗ヒトＦｃ捕捉抗体（ヒト抗体捕捉キット、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、標準手順を用いて研究グレードＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の第１級アミン基（１１０００ＲＵ）を介して固定化した。リガンドは、流速１０μｌ／分で、調整されたＲＵ値を用いて捕捉され、３０ＲＵの最大分析物結合をもたらした。試験された抗体構築物を分析物として使用し、３０μＬ／分の流速で、１００ｎＭ濃度で２４０秒間注入され、解離時間は３００秒であった。結合動力学測定は、捕捉抗体を用いて、３ｎＭから１００ｎＭの分析物の２倍系列希釈液を注入して行われた。チップ表面を捕捉キットとともに提供された再生緩衝液の２分間の注入により再生した。センサグラムは、ブランクチップ表面およびＨＢＳ－ＥＰ緩衝液ブランクで二重参照された。データ分析は、ＢＩＡ評価ソフトウェアｖ４．１を用いて行われた。
示差走査蛍光測定測定（ＤＳＦ）
融点Ｔｍデータは、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を用いて測定した。試料をＤ－ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で希釈して、白色セミスカート９６ウェルプレート（ＢＩＯＲＡＤ）中のＤ－ＰＢＳ中のＳＹＰＲＯ－Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤＭＳＯ中の５０００倍ストック）の４×濃縮溶液を含む最終濃度０．２μｇ／μｌとした。すべての測定をＭｙｉＱ２リアルタイムＰＣＲ装置（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて二重に行った。融解曲線の負の一次微分曲線（－ｄ（ＲＦＵ）／ｄＴ）をｉＱ５ソフトウェアｖ２．１（ＢＩＯＲＡＤ）で生成した。次に、データをＥｘｃｅｌにエクスポートして、Ｔｍの決定およびデータのグラフィック表示を行った。
選択されたタンデムＦａｂ抗体、三重特異性ＣＯＤＶ抗体および二重特異性Ｙ型抗体のための配列を以下の表２、３および４に記載する。
Figure 2022515424000003
Figure 2022515424000004
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ＣＯＤＶフォーマットの突然変異を可能にするヘテロ二量体化
ＣＯＤＶ抗体フォーマットの３つの異なる突然変異体について、発現、収率および均一性について調査した。第１のフォーマットは、ＣＯＤＶ－ＦａｂにおけるＣＨ１／カッパＭＵＴ４突然変異（ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）、およびＦａｂ２におけるＣＨ１／カッパＣＲ３突然変異（ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）を伴うＦｃドメインにおけるノブ－イン－ホール突然変異を有するＣＯＤＶ抗体を含んだ（図１Ａ）。第２のフォーマットは、ＣＯＤＶ－ＦａｂとＦａｂ２の両方における静電突然変異ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋと組み合わせて、第１のフォーマットのＭＵＴ４／ＣＲ３突然変異を伴うＦｃドメインにおけるノブ－イン－ホール突然変異を有するＣＯＤＶ抗体を含んだ（図１Ｂ）。第３のフォーマットは、ＣＯＤＶ－Ｆａｂ上のジスルフィド安定化突然変異ＶＨ４４Ｃ／ＶＬ１００Ｃと組み合わせて、ＭＵＴ４／ＣＲ３突然変異および第２のフォーマットの静電突然変異を伴うＦｃドメインにおけるノブ－イン－ホール突然変異を有するＣＯＤＶ抗体を含んだ（図１Ｃ）。
可変領域における静電的およびジスルフィド結合形成突然変異の概要を表４に示す。ＣＨ１／ＣＬカッパ突然変異の概要を表５に示す。発現および精製スキームの詳細な説明は、実施例１に記載される。図２Ａ～図２Ｇは、試験した種々のＣＯＤＶ抗体フォーマットからのデータをグラフで示す。
下記の表５は、（［ＯＸ４０×ＰＤ１］＋ＧＩＴＲ）三重特異性ＣＯＤＶ抗体で試験した種々のＣＯＤＶ抗体フォーマットの特徴付けの結果を概要する。ＣＨ１／Ｃｋ突然変異：ＣＯＤＶ－Ｆａｂ（ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）およびＦａｂ（ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）。ＣＭ（荷電突然変異）：ＣＯＤＶ－Ｆａｂ（ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ）およびＦａｂ２（ＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ）。ｄｓ（ジスルフィド結合安定化突然変異）：ＶＨ４４Ｃｙｓ／ＶＬ１００Ｃｙｓ。下記の表５に示されるように、ＣＨ１／ＣＬ界面内への突然変異の導入は、開始融点（Ｔｍ開始）を増加させ、熱安定性の増加が示された。ＶＨ／ＶＬ修飾のさらなる取り込みは、ＨＩＣおよびＭＳによって示されるように、正しい対合を有意に増加させた（図２Ａ～図２Ｇを参照されたい）。ＣＨ１／ＣＬカッパ突然変異セット（ＣＲ３およびＭＵＴ４）とジスルフィド安定化突然変異の組合せは有望な結果を示し、高いＨＩＣ単量体含量および増加した熱安定性を示した。ＣＨ１／ＣＬカッパ突然変異セット（ＣＲ３およびＭＵＴ４）、ジスルフィド安定化突然変異、および反対荷電突然変異の組合せもまた有望な結果を示した。
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ヘテロ二量体化はタンデムＦａｂフォーマットの突然変異が可能にする
タンデムＦａｂ抗体の２つのコンホメーションを調べた。各コンホメーションを効率的な発現、精製および均一性についてさらに試験した。第１のフォーマットは、ＶＨドメイン上の可撓性リンカーを介して別のＦａｂ断片にＹ字型抗体が結合されるタンデムＦａｂの開放コンホメーションからなる（図３Ａおよび図３Ｂを参照されたい）。第２のタンデムＦａｂは、上記されるＶＨドメイン内のリンカーがジスルフィド結合を形成し得るタンデムＦａｂの閉鎖コンホメーションからなる（図３Ｃおよび図３Ｄを参照されたい）。
２つの突然変異体は、１つは開放タンデムＦａｂおよび閉鎖タンデムＦａｂコンホメーションの各々に対して、効率的な発現、精製および均一性のために探索された。第１の突然変異体は、ＭＵＴ４およびＣＲ３突然変異のみを有する開放ｆａｂからなっていた（図３Ａ）。第２の突然変異体は、反対荷電突然変異と組み合わせて、ＭＵＴ４およびＣＲ３突然変異を有する開放ｆａｂからなっていた（図３Ｂ）。
２つの突然変異体は、各々の閉鎖タンデムＦａｂコンホメーションについて、効率的な発現、精製および均一性のために探索された。第１の突然変異体は、ＭＵＴ４およびＣＲ３突然変異のみを有する閉鎖ｆａｂからなっていた（図３Ｃ）。第２の突然変異体は、反対荷電突然変異を組み合わせて、ＭＵＴ４およびＣＲ３突然変異を有する閉鎖ｆａｂからなっていた（図３Ｄ）。
下記の表６に示されるように、ＣＨ１／ＣＬとＶＨ／ＶＬ界面突然変異との組合せは、ＣＨ１／ＣＬ修飾のみが導入された例と比較して、標的ＨＩＣプロファイルを増加させた。したがって、コンビナトリアル突然変異は、不正確に対合した種の量を減少させ、正しく対合した分子の量を増加させた（標的ＨＩＣピーク）。対合結果の強度は、抗体配列およびドメインアラインメントに依存した。
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ＭＵＴ４／ＣＲ３突然変異のみを有する開放立体配置タンデムＦａｂは、約６８％の正しい対合をもたらした。しかしながら、反対荷電突然変異の導入は、正しいポリペプチドの収率および均一性を６８％から９６％に増加させることが観察された（図４）。
開放および閉鎖立体配置は、抗ＣＤ４０×抗ＰＤ－Ｌ１抗体と並行して比較された。図５Ａ～５Ｄに見ることができるように、閉鎖立体配置は、開放立体配置と比較して、ＨＩＣで測定した場合、より低い収率および純度をもたらした。ＣＨ１／ＣＬカッパ突然変異（ＣＲ３／ＭＵＴ４）と組み合わせた反対荷電突然変異の添加も同様に純度を改善した。これらの効果は、図６Ａ～図６Ｃに示されるように、抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０抗体によって支持された。開放立体配置は、より高い収率および純度をもたらした。反対荷電突然変異を含めることにより、収率および純度がさらに改善された。
Ｙ字型抗体突然変異
Ｙ字型構造体を有する二重特異性抗体における直交Ｆａｂ設計は、それぞれの重鎖のＣＨ３ドメインにノブ－イントゥ－ホール突然変異（ノブ：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ；ホール：Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を導入することにより達成された。２つの異なるＦａｂアームは、図８Ａおよび図８Ｂに記載された突然変異、ならびに下記の表７～９に示される突然変異を含んでいた。図８Ａ中の突然変異は、Ｆａｂ１におけるＣＨ１／カッパＭＵＴ４突然変異（ＣＨ１：Ｌ１４３Ｑ、Ｓ１８８Ｖ；Ｃｋ：Ｖ１３３Ｔ、Ｓ１７６Ｖ）、およびＦａｂ２におけるＣＨ１／カッパＣＲ３突然変異（ＣＨ１：Ｔ１９２Ｅ；Ｃｋ：Ｎ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ）である。図８Ｂ中の突然変異は、Ｆａｂ１とＦａｂ２の両方における静電突然変異ＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋと組み合わせて、図８ＡのＭＵＴ４／ＣＲ３突然変異である。
種々の突然変異を有する抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０抗体を試験した。下記の表７は、そのＦａｂ界面突然変異において変化するＰＤ－１×ＯＸ４０二重特異性抗体の変異体の発現および生物物理学的特徴付けの概要を提供する。ＣＨ１／ＣＬのみまたはＶＨ／ＶＬのみの修飾は、誤対合を防止するのに有効ではなかった。提案されたＣＨ１／ＣＬ突然変異とＶＨ３９／ＶＬ３８界面突然変異の組合せは、ＨＩＣおよびＭＳによって決定した場合、ガイドされた対合に有意に影響を及ぼした（図９Ａ～図９Ｃを参照されたい）。
Figure 2022515424000097
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種々の突然変異を有する抗ＣＤ４０×抗ＰＤ－Ｌ１抗体を試験した。下記の表８は、そのＦａｂ界面突然変異において変化するＣＤ４０×ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の突然変異体の発現および生物物理学的特徴付けの概要を提供する。ＣＨ１／ＣＬのみまたはＶＨ／ＶＬのみの修飾は、誤対合を防止するのに有効ではなかった。ＣＨ１／ＣＬ突然変異とＶＨ３９／ＶＬ３８界面突然変異の組合せは、ＨＩＣおよびＭＳによって決定した場合、ガイドされた対合に有意に影響を及ぼした。
Figure 2022515424000099
Figure 2022515424000100
先の抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０抗体とは異なる突然変異を有する抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０抗体を試験した。下記の表９は、多様なＦａｂ界面突然変異を有するＰＤ１×ＯＸ４０二重特異性抗体の変異体の発現および生物物理学的特徴付けの概要を提供する。表９に示されるように、ＶＨ３８／ＶＬ３９位におけるＶＨ／ＶＬ界面突然変異と組み合わせた対Ｌ１４３／Ｓ１７６またはＬ１２４／Ｖ１３３におけるＣＨ１／ＣＬ突然変異は、ＨＩＣプロファイルによって観察され、ＭＳ分析によって検証されるように、正しい対合種の量を有意に増加させた（図９Ａ～図９Ｃおよび図１０Ａ～図１０Ｌ）。
Figure 2022515424000101
表７～９のＳＰＲデータにおける抗原結合レベルは、構築物間の比較を良好にするために捕捉された抗体レベル（ＲＵ抗原／ＲＵ Ｆｃ捕捉）に対して報告される。表７～９のＳＰＲデータは、すべての試験された抗体構築物が、同等の結合レベルでそれらのそれぞれの抗原に結合したことを示す。
実施例６および実施例７の一般的な発現および精製スキーム
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
分析ＳＥＣは、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ３００カラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）およびＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ３００ガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えたＢｉｏＳＥＣｃｕｒｉｔｙ装置（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて２５℃で行われた。２×濃縮したＤ－ＰＢＳ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて０．５ｍｌ／分の流速で分析を行い、２８０ｎｍで検出した。１０μｌのタンパク質試料（１ｍｇ／ｍｌ）をカラムに適用した。データ評価はＷｉｎＧＰＣソフトウェアｖ８．１（ＰＳＳ Ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて行った。分子量を推定するために、ＳＥＣカラムをタンパク質較正標準ミックス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で較正した。
分析用疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
分析用ＨＩＣは、ＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲカラム（２．５μｍ、４．６×３５ｍｍ）（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を備えたＬＣ１０ ＨＰＬＣ装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）またはＶａｎｑｕｉｓｈ ＨＰＬＣ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２５℃で行われた。流速１ｍｌ／分で分析を行い、２８０ｎｍで検出した。５μｇの未希釈タンパク質試料をカラムに適用した。勾配溶出は、１５％Ｂから８５％Ｂまで７分間、続いて１００％Ｂまで１分間、次に１５％Ｂまで１分間とし、次に１５％Ｂで３分間平衡化した。緩衝液Ａは、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成される。緩衝液Ｂは、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で構成された。データ評価は、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェア ｖ５．８５（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）またはＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを用いて行われた。
質量分析（ＭＳ）
ヘテロ二量体構築物のタンパク質完全性および潜在的誤対合をＬＣ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。タンパク質試料は、３７℃で１６時間、０．５μｌのＰＮＧａｓｅＦ（グリセロール不含、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理されたＬＣ－ＭＳグレード水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で０．１７ｍｇ／ｍｌに希釈された１２．５μｇのタンパク質で脱グリコシル化された。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｌｕｍｏｓ ＬＣ／ＭＳ装置を用いてＬＣ－ＭＳ分析を行った。逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーは、３００μＬ／分で、ＭａｂＰａｃ ＲＰ ＨＰＬＣカラム、分析用４μｍ粒子サイズ、２．１×１００ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行われた。溶出液は、ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ａ）、および９０％アセトニトリル、１０％ＬＣ水、０．１％ギ酸（Ｂ）であった。２μｇのタンパク質をカラムに注入し、０％から９５％Ｂの直線勾配を用いて１２分で溶出させた。データ分析をＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔソフトウェア １３．０．３（Ｇｅｎｅｄａｔａ）を用いて行った。分子量は、ＧＰＭＡＷソフトウェアバージョン１０．３２ｂ１（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅデータ）を用いて、タンパク質のアミノ酸配列に基づいて計算された。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
抗体構築物への抗原の結合をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定した。それらのそれぞれの抗原に対する抗体の相対的な結合レベル（Ｒｍａｘ％）を評価するために、抗体をセンサーチップへの抗Ｆｃ親和性捕捉によって捕捉した。このアッセイでは、組換えヒト抗原を使用した（ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ（９０４９－Ｂ７－１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ４０－Ｈｉｓ（１０７７４－Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＴＮＦα（１３０－０９４－０２２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＧＩＴＲ－Ｈｉｓ（社内調製）、ＰＤ１－Ｈｉｓ（８９８６－ＰＤ－１００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ３εδ－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓ（＃ＣＴ０３８－Ｈ２５０８Ｈ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびヒトＣＤ１２３（＃３０１－Ｒ３／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））。抗ヒトＦｃ捕捉抗体（ヒト抗体捕捉キット、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、標準手順を用いて研究グレードＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の第１級アミン基（１１０００ＲＵ）を介して固定化した。抗体は、流速１０μｌ／分で、調整されたＲＵ値を用いて捕捉され、１０～３０ＲＵの最大分析物結合をもたらした。抗原を分析物として使用し、ＣＤ３εδ－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓについては４００ｎＭおよび１００ｎＭ濃度のいずれかで、または使用した他のすべての抗原については１００ｎＭ濃度で注入した。３００秒の解離時間、３０μＬ／分の流速で抗原を２４０秒間注入した。チップ表面を捕捉キットとともに提供された再生緩衝液の２分間の注入により再生した。センサグラムは、ブランクチップ表面およびＨＢＳ－ＥＰ緩衝液ブランクで二重参照された。データ分析および結合レベルの決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ１．１１．７４４２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行われた。Ｒｍａｘ％値は、理論的Ｒｍａｘ値で割った最大結合レベルを用いて計算された。Ｒｍａｘ値は、捕捉レベルＲ捕捉、結合化学量論Ｎ、および抗体Ｍｗ（Ａｂ）と抗原Ｍｗ（Ａｇ）の分子量から計算され、Ｒｍａｘ＝Ｒ捕捉×Ｎ×（Ｍｗ（Ａｇ）／Ｍｗ（Ａｂ））であった。
ナノ示差走査蛍光測定（ｎａｎｏＤＳＦ）
タンパク質変性の開始温度（Ｔ開始）および融点（Ｔｍ）をナノ示差走査蛍光測定（ｎａｎｏＤＳＦ）を用いて測定した。試料を製剤緩衝液中で０．５μｇ／μｌの最終濃度に希釈し、ナノＤＳＦキャピラリー（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に二重に装填した。すべての測定は、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．ｐｌｅｘナノＤＳＦデバイス（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。加熱速度は２０℃～９５℃で１℃／分であった。データは、ＰＲ．ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．３．１（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて記録され、ＰＲ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．０．３（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを用いて分析された。
さらなるＹ字型抗体突然変異
Ｙ字型構造体を有するさらなる二重特異性抗体を作製し、異なる突然変異セットを用いて試験した。具体的には、抗ＰＤ－１×抗ＯＸ４０抗体を下記の表１０に列挙した突然変異とともに使用した。下記のデータは、Ｆａｂ突然変異を有するすべてのＹ字型抗体が、野生型対照と比較して誤対合を減少させたことを示す。ＶＨ３９／ＶＬ３８の反対荷電突然変異セット、Ｌ１４３／Ｓ１７６の反対荷電突然変異セット、およびＫ２２１Ｅ：Ｋ２２８Ｄ／Ｅ１２３Ｋ：Ｄ１２２Ｋの組合せの反対荷電突然変異セットを有する抗体（タンパク質ＩＤ Ｙ６１）は優れた結果を示し、誤対合は検出されなかった。
Figure 2022515424000102
Ｙ字型抗体フォーマットの突然変異を可能にするさらなるヘテロ二量体化
異なるヘテロ二量体化突然変異セットを有するさらなるＹ字型抗体を試験した。下記の表１１は、試験された各Ｙ字型抗体の生物物理学的特徴付けデータを記載する。表１１および図１１Ａ～図１１Ｅに記載されるように、「ＣＭ１」はＶＨ３９Ｋ／ＶＬ３８Ｅ突然変異対を指し、「ＣＭ２」はＶＨ３９Ｅ／ＶＬ３８Ｋ突然変異対を指し、「ＣＭ３」はＣＨ１ Ｌ１４３ＥまたはＬ１４３Ｄ／ＣＬ Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｋ突然変異対を指し、「ＣＭ４」はＣＨ１ Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｋ／ＣＬ Ｓ１７６ＥまたはＳ１７６Ｄ突然変異対を指し、「ＮＮ３」はＣＨ１ Ｋ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ／ＣＬ Ｄ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異対を指す。
Figure 2022515424000103
表１１および図１１Ａ～１１Ｅに示されるように、使用される種々のヘテロ二量体化突然変異は、各々、野生型抗体と比較して誤対合を減少させる。野生型立体配置において誤対合を有さないことが公知である抗ＴＮＦ×抗ＯＸ４０抗体（Ｙ４９）の場合、ヘテロ二量体化突然変異の含有は誤対合に負の影響を及ぼさなかった（図１１Ｃ）。
上記の生物物理学的特徴付けに加えて、Ｔ細胞誘導（ｅｎｇａｇｅｒ）抗体であるＣＤ３×ＣＤ１２３は、細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいてであった。二重特異性抗体分子は、初代ヒトＴ細胞を用いた細胞毒性アッセイにおいて分析された。健康なドナーの血液からのヒト末梢単核細胞を１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃１０７７１）および１０分間、１０００×ｇでの遠心分離を用いてＬｅｕｃｏｓｅｐ－Ｔｕｂｅｓ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、＃２２７２９０）中で単離した。単離されたＰＢＭＣを５％ＭＡＣＳ ＢＳＡストック溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９１－３７０）が補足されたａｕｔｏＭＡＣＳリンシング緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９１－２２２）中で２回洗浄した。一次ヒトＴ細胞をＭＡＣＳｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＰａｎ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０－０９６－５３５）を用いて、製造業者のプロトコルを用いてヒトＰＢＭＣから単離した。単離されたヒトＴ細胞を１０％ＦＣＳ ＨＩ（Ｇｉｂｃｏ、＃１００８２－１４７）が補足されたＲＰＭＩ ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ、＃７２４００）に５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞毒性アッセイに先立って、ＴＨＰ－１標的細胞（ＡＤＣＣ ＴＩＢ－２０２）を１μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｃ１１５７）で１５分間、３７℃にて染色した。細胞をＲＰＭＩ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ培地中で２回洗浄し、４００×ｇで５分間遠心分離した。ＴＨＰ－１標的細胞を１０％ＦＣＳ ＨＩが補足されたＲＰＭＩ培地に５×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。ＣＦＳＥ標識されたＴＨＰ－１細胞およびヒトパンＴ細胞を１０：１のエフェクター対標的比で混合し、９６ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ、＃６５０１８５）中で１００μｌ／ウェルの全体積で播種した。５μＬ／ウェルの体積で１０ｎＭ～０ｎＭ（１：６希釈）から開始した１１希釈系列において二重特異性抗体分子を細胞に添加し、２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を５μｇ／ｍｌの７－ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１３１０）で３０分間、４℃にて染色した。細胞毒性を決定するために、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）上でＣＦＳＥ／７－ＡＡＤ二重陽性ＴＨＰ－１細胞をゲートすることにより死細胞を測定し、ＥＣ５０値をＸｌｆｉｔソフトウェアを用いて決定した。
図１２に示されるように、３つすべてのＣＤ３×ＣＤ１２３二重特異性抗体は同等の強力な活性を示した。Ｙ５６およびＹ５７におけるヘテロ二量体化突然変異の存在は、鎖の誤対合を減少させながら、活性に負の影響を及ぼさなかった。

Claims (30)

  1. 少なくとも２つの抗原結合部位を形成するための少なくとも２つのＶＨ領域とそれぞれ対合した少なくとも２つのＶＬ領域と、２つのＣＬ領域とそれぞれ対合した少なくとも２つのＣＨ１領域とを含む多重特異性抗原結合タンパク質であって、
    少なくとも１つのＣＨ１／ＣＬ対はＣＨ１／ＣＬ突然変異を含み、
    （１）Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ（ＣＬ）突然変異、ならびに
    （２）Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、ならびに
    （３）Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
    （４）Ｋ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異およびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
    （５）Ｔ１９２ＥおよびＫ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４ＡおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
    （６）Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ（ＣＬ）突然変異、
    （７）Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ（ＣＬ）突然変異、
    （８）Ｋ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異およびＤ１２２Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに
    （９）Ｋ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異
    のうちの１つまたはそれ以上からなる群から選択される対合を促進し、
    ２つのＣＨ１／ＣＬ対が２つの異なるＶＨ／ＶＬ対についての対合を促進するための突然変異を含む場合、２つのＣＨ１／ＣＬ対は同じ突然変異を含まず、
    少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、前記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基と、（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基とを含み、
    ＶＨ領域における突然変異残基はＶＬ領域における突然変異残基とは反対荷電を有する、前記多重特異性抗原結合タンパク質。
  2. 多重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
    （２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）；ならびに
    （３）第１のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ１）
    を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対；ならびに
    ｂ）（４）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；
    （５）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）；ならびに
    （６）第２のヘテロ二量体化ドメイン（ＨＤ２）
    を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
    を含み、
    ＨＤ１およびＨＤ２はヘテロ二量体化し、
    ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、前記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、ＶＨ領域における突然変異残基はＶＬ領域における突然変異残基とは反対荷電を有し、
    ＣＬ１およびＣＨ１－１対、ならびにＣＬ２およびＣＨ１－２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
    ＣＬ１およびＣＨ１－１対、ならびにＣＬ２およびＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、対合を促進するためのＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異は、対合を促進するためのＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる、前記多重特異性抗原結合タンパク質。
  3. 少なくとも１つのＣＨ１領域がヘテロ二量体化ドメインに作動可能に連結されている、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  4. 少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、少なくとも２つの抗原結合部位を形成する多重特異性抗原結合タンパク質であって、１つのポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
    で表される構造を含み、１つのポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１［ＩＩ］
    で表される構造を含み
    式中、
    ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；ならびに
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
    ＶＨ１はＶＬ１と対合し、ＶＨ２はＶＬ２と対合し、ＣＨ１はＣＬと対合し、
    式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、交差軽鎖－重鎖対を形成し、
    ＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
    ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の少なくとも一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、前記反対荷電突然変異が、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、
    ＶＨ領域の突然変異残基はＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
    ＣＨ１およびＣＬドメイン対は対合を促進するための突然変異を含む、前記多重特異性抗原結合タンパク質。
  5. ４つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む多重特異性抗原結合タンパク質であって、２つのポリペプチド鎖は、各々、式：
    ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
    で表される構造を含み、２つのポリペプチド鎖は、各々、式：
    ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ［ＩＩ］
    で表される構造を含み、
    式中、
    ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    Ｆｃは、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；ならびに
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
    ＶＨ１はＶＬ１と対合して第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２はＶＬ２と対合して第２の抗原結合部位を形成し、ＣＨ１はＣＬと対合し、
    式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、
    ＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
    ＶＬ１とＶＨ１対およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、前記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、
    ＶＨ領域の突然変異残基は、ＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、ならびに
    ＣＨ１およびＣＬドメイン対の一方または両方は、対合を促進するための突然変異を含み、
    少なくとも２つのＣＨ１／ＣＬ対が対合を促進するための突然変異を含む場合、１つのＣＨ１／ＣＬ対における突然変異セットは、他方のＣＨ１／ＣＬ対における突然変異セットとは異なる、前記多重特異性抗原結合タンパク質。
  6. ３つの抗原結合部位を形成する、４つのポリペプチド鎖を含む多重特異性抗原結合タンパク質であって、
    第１のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ１［Ｉ］、
    で表される構造を含み、
    第２のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩ］
    で表される構造を含み、
    第３のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ３－ＣＨ１－２－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
    で表される構造を含み、
    第４のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ３－ＣＬ２［ＩＶ］
    で表される構造を含み、
    式中、
    ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１－１は第１の免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１－２は第２の免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ヒンジはＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメインを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；ならびに
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり、
    式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成し、ならびに
    ＶＨ１／ＶＬ１対、ＶＨ２／ＶＬ２対、およびＶＨ３／ＶＬ３対のうちの１つまたはそれ以上に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
    ＶＬ１とＶＨ１対、およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、前記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、
    ＶＨ領域の突然変異残基は、ＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
    ＣＬ１とＣＨ１－１対およびＣＬ２とＣＨ１－２対の一方または両方は対合を促進するための突然変異を含み、
    ＣＬ１とＣＨ１－１対およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、ＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異はＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる、前記多重特異性抗原結合タンパク質。
  7. ａ）（１）第１の抗原結合部位を形成するための第１のＶＨ領域（ＶＨ１）と対合した第１のＶＬ領域（ＶＬ１）；
    （２）ＶＨ１に作動可能に連結された第１の定常重鎖領域１（ＣＨ１－１）およびＶＬ１に作動可能に連結された第１の定常軽鎖領域（ＣＬ１）
    を含む第１の軽鎖（ＬＣ１）／重鎖（ＨＣ１）対、ならびに
    ｂ）（３）第２の抗原結合部位を形成するための第２のＶＨ領域（ＶＨ２）と対合した第２のＶＬ領域（ＶＬ２）；ならびに
    （４）ＶＨ２に作動可能に連結された第２の定常重鎖領域１（ＣＨ１－２）およびＶＬ２に作動可能に連結された第２の定常軽鎖領域（ＣＬ２）
    を含む第２の軽鎖（ＬＣ２）／重鎖（ＨＣ２）対
    を含む多重特異性抗原結合タンパク質であって、
    ＣＨ１－１のＣ末端はＶＨ２のＮ末端に作動可能に連結され、
    ＶＨ１／ＶＬ１対およびＶＨ２／ＶＬ２対の一方または両方に、１つまたはそれ以上のシステイン残基が組み込まれて、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成し、
    ＶＬ１とＶＨ１対およびＶＬ２とＶＨ２対の一方または両方は、対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、前記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、
    ＶＨ領域の突然変異残基はＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有し、
    ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の一方または両方は対合を促進するための突然変異を含み、
    ＣＬ１とＣＨ１－１対、およびＣＬ２とＣＨ１－２対の両方が対合を促進するための突然変異を含む場合、ＣＨ１－１およびＣＬ１における突然変異はＣＨ１－２およびＣＬ２における突然変異とは異なる、前記多重特異性抗原結合タンパク質。
  8. ＣＨ１がＴ１９２Ｅ突然変異を含み、ＣＬがＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ突然変異を含む、請求項２～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  9. ＣＨ１がＬ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬがＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む、請求項２～８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  10. ＣＨ１がＴ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ突然変異を含み、ＣＬがＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ突然変異を含む、請求項２～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  11. ＣＨ１がＫ２２１Ｅ突然変異を含み、ＣＬがＥ１２３Ｋ突然変異を含む、請求項２～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  12. ＣＨ１がＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬがＤ１２２Ｋ突然変異を含む、請求項２～１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  13. ＣＨ１がＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異を含み、ＣＬがＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異を含む、請求項２～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  14. ＣＨ１がＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異を含み、ＣＬがＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異を含む、請求項２～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  15. ＣＨ１がＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異を含み、ＣＬがＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異を含む、請求項２～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  16. ＶＨがＱ３９Ｅ、Ｑ３９Ｄ、Ｑ３９Ｋ、Ｑ３９ＲまたはＱ３９Ｈ突然変異を含み、ＶＬがＱ３８Ｅ、Ｑ３８Ｄ、Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８ＲまたはＱ３８Ｈ突然変異を含む、請求項２～１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  17. 少なくとも１つのＣＨ１／ＣＬ対がＣＨ１／ＣＬ突然変異を含み、以下：
    （１）Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ（ＣＬ）突然変異、
    （２）Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
    （３）Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
    （４）Ｋ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異およびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
    （５）Ｔ１９２ＥおよびＫ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４ＡおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
    （６）Ｌ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ（ＣＬ）突然変異、
    （７）Ｌ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ（ＣＨ１）突然変異、およびＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ（ＣＬ）突然変異、
    （８）Ｋ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異およびＤ１２２Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに
    （９）Ｋ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異
    のうちの１つまたはそれ以上からなる群から選択される対合を促進する多重特異性抗原結合タンパク質であって、
    少なくとも２つのＣＨ１／ＣＬ対が２つの異なるＶＨ／ＶＬ対についての対合を促進するための突然変異セットを含む場合、少なくとも２つのＣＨ１／ＣＬ対は同じ突然変異を含まず、
    少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対が対合を促進するための反対荷電突然変異を含み、前記反対荷電突然変異が、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、ＶＨ領域の突然変異残基がＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する、請求項２～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  18. 抗原結合ドメイン；および
    定常軽鎖ＣＬ領域と対合した定常重鎖ＣＨ１領域
    を含む抗原結合タンパク質であって、
    該抗原結合ドメインは標的抗原に選択的に結合し、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は、以下：
    ａ）ＣＨ１領域におけるＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異；ならびに
    ｂ）ＣＨ１領域におけるＬ１２４Ｅ、Ｌ１２４Ｄ、Ｌ１２４Ｋ、Ｌ１２４ＲまたはＬ１２４Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＶ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｄ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３ＲまたはＶ１３３Ｈ突然変異
    のうちの１つまたはその両方を含み、
    ＣＨ１領域の突然変異残基は、ＣＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する、前記抗原結合タンパク質。
  19. （１）Ｔ１９２Ｅ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７ＫおよびＳ１１４Ａ（ＣＬ）突然変異、
    （２）Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＶ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
    （３）Ｔ１９２Ｅ、Ｌ１４３ＱおよびＳ１８８Ｖ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＮ１３７Ｋ、Ｓ１１４Ａ、Ｖ１３３ＴおよびＳ１７６Ｖ（ＣＬ）突然変異、
    （４）Ｋ２２１Ｅ（ＣＨ１）突然変異およびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異、
    （５）Ｋ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異およびＤ１２２Ｋ（ＣＬ）突然変異、ならびに
    （６）Ｋ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ（ＣＨ１）突然変異、ならびにＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ（ＣＬ）突然変異
    のうちの１つまたはそれ以上からなる群から選択される対合を促進するためのＣＨ１／ＣＬ突然変異をさらに含み、
    ２つのＣＨ１／ＣＬ対が２つの異なるＶＨ／ＶＬ対についての対合を促進するための突然変異を含む場合、２つのＣＨ１／ＣＬ対は同じ突然変異を含まない、請求項１８に記載の抗原結合タンパク質。
  20. 対合を促進するための反対荷電突然変異を含む少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対をさらに含み、前記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、前記ＶＨ領域の突然変異残基は前記ＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する、請求項１８または１９に記載の抗原結合タンパク質。
  21. 抗原結合ドメイン；および
    定常軽鎖ＣＬ領域と対合した定常重鎖ＣＨ１領域
    を含む抗原結合タンパク質であって、
    該抗原結合ドメインは標的抗原に選択的に結合し、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は、以下：
    ａ）ＣＨ１領域におけるＬ１４３Ｅ、Ｌ１４３Ｄ、Ｌ１４３Ｋ、Ｌ１４３ＲまたはＬ１４３Ｈ突然変異、およびＣＬ領域におけるＳ１７６Ｅ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｋ、Ｓ１７６ＲまたはＳ１７６Ｈ突然変異；ならびに
    ｂ）ＣＨ１領域におけるＫ２２１ＥおよびＫ２２８Ｄ突然変異、ならびにＣＬ領域におけるＤ１２２ＫおよびＥ１２３Ｋ突然変異
    の一方または両方を含み、
    ＣＨ１領域の突然変異残基はＣＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する、前記抗原結合タンパク質。
  22. 対合を促進するための反対荷電突然変異を含む少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対をさらに含み、前記反対荷電突然変異は、（１）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３９におけるＶＨ領域の突然変異残基、および（２）Ｅ、Ｄ、Ｋ、ＲまたはＨから選択されるＫａｂａｔ位置３８におけるＶＬ領域の突然変異残基を含み、前記ＶＨ領域の突然変異残基は前記ＶＬ領域の突然変異残基とは反対荷電を有する、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
  23. １つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するための１つまたはそれ以上のＶＨ／ＶＬ対に組み込まれた１つまたはそれ以上のシステイン残基をさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  24. 一方または両方のＶＨ領域が４４Ｃおよび１０５Ｃ突然変異の一方または両方を含み、一方または両方のＶＬ領域が１００Ｃおよび４３Ｃ突然変異の一方または両方を含む、請求項２３に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
  25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む、１つまたはそれ以上の単離された核酸分子を含むキット。
  26. 請求項２５に記載の１つまたはそれ以上の核酸分子を含む１つまたはそれ以上の発現ベクターを含むキット。
  27. 請求項２５に記載の１つまたはそれ以上の核酸分子、または請求項２６に記載の１つまたはそれ以上の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
  28. 薬学的に許容される担体と、請求項１～２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質とを含む医薬組成物。
  29. 抗原活性が有害である障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～２４のいずれか１項に記載の有効量の多重特異性抗原結合タンパク質を投与することを含む前記方法。
  30. 各ＶＨ領域について３つのＨＣＤＲおよび各ＶＬ領域について３つのＬＣＤＲを含み、さらに１つもしくはそれ以上の標的抗原または１つもしくはそれ以上の標的エピトープに対する結合特異性を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質。
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