TW202104257A - 具有突變型Ｆａｂ結構域的多特異性結合蛋白 - Google Patents

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Abstract

提供結合蛋白，所述結合蛋白包含與VH區配對的VL區和與CL區配對的CH1區，其中所述VL區和所述VH區包含帶相反電荷的突變以促進配對，並且其中所述CH1區和所述CL區包含突變以促進配對。還提供結合蛋白，所述結合蛋白包含一個或多個半胱胺酸殘基，所述一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到所述VH/VL對中以形成一個或多個雙硫鍵。還提供多特異性結合蛋白、編碼結合蛋白和多特異性結合蛋白的核酸、表現載體、宿主細胞、醫藥組成物以及投予本文所述的結合蛋白或多特異性結合蛋白的治療方法。

Description

具有突變型Fab結構域的多特異性結合蛋白
相關申請的交叉引用
本申請案要求2018年12月24日提交的歐洲專利申請號18306843.6和2019年6月21日提交的歐洲專利申請號19305812.0的優先權，出於所有目的將所述申請的內容通過引用併入本文。
傳統抗體是Y形蛋白或免疫球蛋白，它們是由兩個異二聚體形成的異四聚體，所述異二聚體由輕鏈部分和重鏈部分組成。抗體的「臂」包含抗原結合位點並且稱為Fab區。傳統抗體(例如，由宿主免疫系統產生的那些)具有兩個相同的Fab並且可以識別並結合特定抗原。天然抗體結構中不對稱性的產生是產生具有兩種(例如，雙特異性抗體)或更多種結合特異性的多特異性結合蛋白的先決條件。例如，通過分離Fab或不同的不對稱結合臂上的一種或多種Fv，可以使雙特異性抗體具有同時結合兩種不同抗原的靈活性。然而，儘管有這些優點，眾多多特異性抗體技術由於各條不對稱重鏈和輕鏈的錯誤配對而具有工藝和製造問題。例如，這些技術中許多具有所謂的「輕鏈問題」，其中兩條不同輕鏈與重鏈的隨機配對產生除了所需組合以外的各種鏈配對組合。在一些情況下，可以通過使用共同輕鏈來避免輕鏈問題，所述共同輕鏈使得能結合至兩種抗原。然而，這對於許多抗體可能是不可行的，因為這種形式要求在轉基因小鼠中或通過展示技術重新(de novo)產生抗體。此外，罕見抗體如源自人類患者的廣泛中和性抗HTV抗體不能適應於這樣的形式。因此，仍然需要針對錯誤 配對問題的替代性和創造性解決方案。已經謹慎設計了二聚體介面中的一系列突變以使得這些抗體能發生異二聚化。
本文提供抗原結合蛋白，其沿二聚體介面可以任選地包含多個突變，所述突變使得所述抗原結合蛋白能有效地發生異二聚化。
在一個態樣，本文提供抗原結合蛋白，其包含
VL區，所述VL區與VH區配對以形成抗原結合位點；和
CH1區，所述CH1區與CL區配對，
其中所述VL區和所述VH區包含帶相反電荷的突變以促進配對，並且其中所述CH1區和所述CL區包含突變以促進配對。
在一些實施例中，抗原結合蛋白進一步包含第二VL區，所述第二VL區與第二VH區配對以形成第二抗原結合位點；以及第二CH1區，所述第二CH1區與第二CL區配對。
在一些實施例中，所述第一VH和VL對以及所述第二VH和VL對中的一個或兩個包含帶相反電荷的突變以促進配對，並且所述第一CH1和CL對以及所述第二CH1和CL對中的一個或兩個包含突變以促進配對。
在一些實施例中，一個或兩個CH1區包含T192E突變，並且一個或兩個CL區包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，一個或兩個CH1區包含L143Q和S188V突變，並且一個或兩個CL區包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，一個或兩個CH1區包含T192E、L143Q和S188V突變，並且一個或兩個CL區包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，一個或兩個CH1區包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，並且一個或兩個CL區包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，其中CH1中的所述突變與CL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，一個或兩個CH1區包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，並且一個或兩個CL區包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，其中CH1中的所述突變與CL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，一個或兩個VH區包含39E、39D、39K、39R或39H突變，並且一個或兩個VL區包含38E、38D、38K、38R或Q38H突變，其中VH中的所述突變與VL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，一個或兩個VH區包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且一個或兩個VL區包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中VH中的所述突變與VL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，抗原結合蛋白進一步包含一個或多個半胱胺酸殘基，所述半胱胺酸殘基被工程化到VH/VL對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵。
在一些實施例中，一個或兩個VH區包含44C和105C突變中的一個或兩個，並且一個或兩個VL區包含100C和43C突變中的一個或兩個。
在一些實施例中，一個或兩個VH區包含44C突變，並且一個或兩個VL區包含100C突變。
在一些實施例中，一個或兩個VH區包含105C突變，並且一個或兩個VL區包含43C突變。
在一些實施例中，抗原結合蛋白進一步包含在一個或兩個所述CH1/CL對中的帶相反電荷的突變。
在一些實施例中，在一個或兩個所述CH1/CL對中帶相反電荷的突變選自：CH1區中的K221E和CL區中的E123K；CH1區中的K228D和CL區中的D122K；CH1區中的L145E和CL區中的S176K；以及CH1區中的L128E和CL區中的V133K。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白，其包含至少兩個VL區以及至少兩個CH1區，所述至少兩個VL區與至少兩個VH區分別配對以形成至 少兩個抗原結合位點，所述至少兩個CH1區與兩個CL區分別配對，其中至少一個CH1/CL對包含選自以下的CH1/CL突變以促進配對：
(1)T192E(CH1)突變以及N137K和S114A(CL)突變，和/或
(2)L143Q和S188V(CH1)突變、以及V133T和S176V(CL)突變，和/或
(3)T192E、L143Q和S188V(CH1)突變以及N137K、S114A、V133T和S176V(CL)突變，和/或
(4)K221E(CH1)突變以及E123K(CL)突變，和/或
(5)T192E和K221E(CH1)突變以及N137K、S114A和E123K(CL)突變，和/或
(6)L143E、L143D、L143K、L143R或L143H(CH1)突變以及S176E、S176D、S176K、S176R或S176H(CL)突變，和/或
(7)L124E、L124D、L124K、L124R或L124H(CH1)突變以及V133E、V133D、V133K、V133R或V133H(CL)突變，和
(8)其中當兩個CH1/CL對包含突變以促進兩個不同VH/VL對的配對時，所述兩個CH1/CL對不包含相同的突變，
並且
其中至少一個VH/VL對包含帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白，其包含至少兩個VL區以及至少兩個CH1區，所述至少兩個VL區與至少兩個VH區分別配對以形成至少兩個抗原結合位點，所述至少兩個CH1區與兩個CL區分別配對，
其中至少一個CH1/CL對包含選自以下中的一個或多個的CH1/CL突變以促進配對：
(1)T192E(CH1)突變以及N137K和S114A(CL)突變，和
(2)L143Q和S188V(CH1)突變、以及V133T和S176V(CL)突變，和
(3)T192E、L143Q和S188V(CH1)突變以及N137K、S114A、V133T和S176V(CL)突變，
(4)K221E(CH1)突變以及E123K(CL)突變，
(5)T192E和K221E(CH1)突變以及N137K、S114A和E123K(CL)突變，
(6)L143E、L143D、L143K、L143R或L143H(CH1)突變以及S176E、S176D、S176K、S176R或S176H(CL)突變，
(7)L124E、L124D、L124K、L124R或L124H(CH1)突變以及V133E、V133D、V133K、V133R或V133H(CL)突變，
(8)K228D(CH1)突變以及D122K(CL)突變，和
(9)K221E和K228D(CH1)突變以及D122K和E123K(CL)突變，
其中當兩個CH1/CL對包含突變以促進兩個不同VH/VL對的配對時，所述兩個CH1/CL對不包含相同的突變，並且
其中至少一個VH/VL對包含帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，
並且
其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷。
在一些實施例中，在多特異性抗原結合蛋白中，當至少兩個不同VH/VL對包含突變組以促進配對時，則所述至少兩個不同VH/VL對不包含相同的突變組。
在一些實施例中，多特異性抗原結合蛋白包含至少兩個VL區以及至少兩個CH1區，所述至少兩個VL區與至少兩個VH區分別配對以形成至少兩個抗原結合位點，所述至少兩個CH1區與兩個CL區分別配對，
其中至少一個CH1/CL對包含選自以下中的一個或多個的CH1/CL突變以促進配對：
(1)T192E(CH1)突變以及N137K和S114A(CL)突變，和/或
(2)L143Q和S188V(CH1)突變、以及V133T和S176V(CL)突變，和/或
(3)T192E、L143Q和S188V(CH1)突變以及N137K、S114A、V133T和S176V(CL)突變，和/或
(4)K221E(CH1)突變以及E123K(CL)突變，和/或
(5)L143E、L143D、L143K、L143R或L143H(CH1)突變以及S176E、S176D、S176K、S176R或S176H(CL)突變，和/或
(6)L124E、L124D、L124K、L124R或L124H(CH1)突變以及V133E、V133D、V133K、V133R或V133H(CL)突變，和
(7)當兩個CH1/CL對包含突變以促進兩個不同VH/VL對的配對時，所述兩個CH1/CL對不包含相同的突變，
並且
其中至少一個VH/VL對包含選自以下的帶相反電荷的突變以促進配對：39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變以及Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，並且其中VH中的所述突變與VL中的所述突變帶相反電荷；並且當幾個VH/VL對(其中VL或VH不在同一多肽鏈中)包含突變以促進不同VH/VL對的配對時，則每個VH/VL對不包含相同的帶相反電荷的突變。
在一些實施例中，一個或兩個CH1區與異二聚化結構域可操作地連接。
在一些實施例中，異二聚化結構域包含第一Fc結構域。
在一些實施例中，第一Fc結構域與第二Fc結構域異二聚化，並且其中所述第一Fc結構域包含第一CH3區，並且所述第二Fc結構域包含第二CH3區。
在一些實施例中，所述第一CH3區包含S354C和T366W突變中的一個或兩個，並且所述第二CH3區包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突變中的一個或多個，其中所述突變促進Fc結構域異二聚化。
在另一態樣，本文提供多特異性抗體，其包含
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)第一恆定重鏈區1(CH1-1)和第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)第二恆定重鏈區1(CH1-2)和第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VL1和VH1對中的至少一個或兩個以及VL2和VH2對中的至少一個或兩個包含帶相反電荷的突變以促進配對，
其中CL1和CH1-1對中的至少一個或兩個以及CL2和CH1-2對中的至少一個或兩個包含突變以促進配對，並且
其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，CH1-1和CL1中促進配對的突變與CH1-2和CL2中促進配對的突變是不同的。
在另一態樣，本文提供多特異性抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的 第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VL1和VH1對中的至少一個或兩個以及VL2和VH2對中的至少一個或兩個包含帶相反電荷的突變以促進配對，
其中CL1和CH1-1對中的至少一個或兩個以及CL2和CH1-2對中的至少一個或兩個包含突變以促進配對，並且
其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，CH1-1和CL1中促進配對的突變與CH1-2和CL2中促進配對的突變是不同的。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對 包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VL1和VH1對中的至少一個或兩個以及VL2和VH2對中的至少一個或兩個包含帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，
其中CL1和CH1-1對中的至少一個或兩個以及CL2和CH1-2對中的至少一個或兩個包含突變以促進配對，並且
其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，CH1-1和CL1中促進配對的突變與CH1-2和CL2中促進配對的突變是不同的。
在一些實施例中，CH1-1包含T192E突變，並且CL1包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1-1包含L143Q和S188V突變，並且CL1包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-1包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL1包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-2包含T192E突變，並且CL2包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1-2包含L143Q和S188V突變，並且CL2包含 V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-2包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL2包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-1和CH1-2中的一個或兩個包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，並且CL1和CL2中的一個或兩個包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，CH1-1和CH1-2中的一個或兩個包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，並且CL1和CL2中的一個或兩個包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含39E、39D、39K、39R或39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含38E、38D、38K、38R或38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含一個或多個半胱胺酸殘基，所述半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含44C和105C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含100C和43C突變。
在一些實施例中，VH1包含44C突變，並且VL1包含100C突變。
在一些實施例中，VH1包含105C突變，並且VL1包含43C突變。
在一些實施例中，VH2包含44C突變，並且VL2包含100C。
在一些實施例中，VH2包含105C突變，並且VL2包含43C突變。
在一些實施例中，VH1包含39E和44C突變，並且VL1包含38K和100C突變。
在一些實施例中，VH1包含39E和105C突變，並且VL1包含38K和43C突變。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含在CH1-1/CL1對中的帶相反電荷的突變。
在一些實施例中，在CH1-1/CL1對中的帶相反電荷的突變選自：CH1-1區中的K221E和CL1區中的E123K；CH1-1區中的K228D和CL1區中的D122K；CH1-1區中的L145E和CL1區中的S176K；以及CH1-1區中的L128E和CL1區中的V133K。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含在CH1-2/CL2對中的帶相反電荷的突變。
在一些實施例中，在CH1-2/CL2對中的帶相反電荷的突變選自：CH1-2區中的K221E和CL2區中的E123K；CH1-2區中的K228D和CL2區中的D122K；CH1-2區中的L145E和CL2區中的S176K；以及CH1-2區中的L128E和CL2區中的V133K。
在一些實施例中，第一異二聚化結構域和第二異二聚化結構域包含Fc結構域。
在一些實施例中，第一異二聚化結構域包含第一CH3結構域，所述第一CH3結構域包含S354C和T366W突變中的一個或兩個，並且第二異二聚化結構域包含第二CH3結構域，所述第二CH3結構域包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突變中的一個或兩個，其中所述突變促進Fc結構域異二聚化。
在一些實施例中，CH1-1結構域與第一CH2結構域和第一CH3結構域連接，CH1-2結構域與第二CH2結構域和第二CH3結構域連接，並且其中所述第 一CH2和CH3結構域以及所述第二CH2和CH3結構域二聚化以形成Fc結構域。
在一些實施例中，第一CH3結構域包含S354C和T366W突變中的一個或兩個，第二CH3結構域包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突變中的一個或多個，並且其中所述突變促進Fc結構域異二聚化。
在另一態樣，本文提供包含至少兩條多肽鏈並形成至少兩個抗原結合位點的抗原結合蛋白或多特異性抗原結合蛋白，其中一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
並且一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
其中VL1和VH1對中的至少一個或兩個以及VL2和VH2對中的至少一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，並且
其中所述CH1和CL結構域對包含促進配對的突變。
在一些實施例中，VH1與VL1配對，VH2與VL2配對，並且CH1與CL配對。
在一些實施例中，本文提供包含至少兩條多肽鏈並形成至少兩個抗原結合位點的多特異性抗原結合蛋白，其中一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
並且一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，
其中VH1與VL1配對，VH2與VL2配對，並且CH1與CL配對，
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
其中VL1和VH1對中的至少一個或兩個以及VL2和VH2對中的至少一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，並且
其中所述CH1和CL結構域對包含促進配對的突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH44C和VH105C突變。
在一些實施例中，VL1和VL2中的一個或兩個包含VL43C和VL100C突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH44C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含VL100C突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH105C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含VL43C突變。
在一些實施例中，CH1包含T192E突變，並且CL包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1包含L143Q和S188V突變，並且CL包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，CL包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，並且其中CH1中的所述突變與CL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，CH1包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，CL包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，並且其中CH1中的所述突變與CL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含39E、39D、39K、39R或39H突變，VL1和VL2中的一個或兩個包含38E、38D、38K、38R或38H突變，並且其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，並且其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，CH1與二聚化結構域可操作地連接。
在一些實施例中，二聚化結構域是包含CH2結構域和CH3結構域的Fc結構域。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白，其包含形成四個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
並且兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
Fc包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，
其中VH1與VL1配對以形成第一抗原結合位點，VH2與VL2配對以形成第二抗原結合位點，並且CH1與CL配對，
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
其中VL1和VH1對以及VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基 具有相反電荷，並且
其中所述CH1和CL結構域對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
其中當至少兩個CH1/CL對包含突變以促進配對時，則在一個CH1/CL對中的突變組與在另一個CH1/CL對中的突變組是不同的。
在另一態樣，本文提供抗原結合蛋白，其包含形成四個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
並且兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
Fc包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
其中VH1與VL1配對以形成第一抗原結合位點，VH2與VL2配對以形成第二抗原結合位點，並且CH1與CL配對，並且更具體地，VH1/VL1對包含第一抗原結合特異性並且VH2/VL2對包含第二抗原結合特異性，
其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
其中VL1和VH1對以及VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，並且
其中所述CH1和CL結構域對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
其中當兩個CH1和CL對都包含突變以促進配對時，則在一個CH1和CL對中的所述突變與在另一個CH1和CL對中的所述突變是不同的，以促進配對。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH44C和VH105C突變。
在一些實施例中，VL1和VL2中的一個或兩個包含VL43C和VL100C突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH44C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含VL100C突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH105C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含VL43C突變。
在一些實施例中，CH1包含T192E突變，並且CL包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1包含L143Q和S188V突變，並且CL包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，CL包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，並且其中CH1中的所述突變與CL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，CH1包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，CL包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，並且其中CH1中的所述突變與CL中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含39E、39D、39K、39R或39H突變，VL1和VL2中的一個或兩個包含38E、38D、38K、38R或38H突變，並且其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一 個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，並且其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白，其包含形成三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中
第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL1 [I]，
第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]，
第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-2-鉸鏈-CH2-CH3 [III]，並且
第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL2 [IV]，
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1-1是第一免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
CH1-2是第二免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1結構域和所述CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，並且
其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對、VH2/VL2對和VH3/VL3對中的一個或多個中以形成一個或多個雙硫鍵，
其中VL1和VH1對以及VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，
其中所述CL1和CH1-1對中的一個或兩個以及所述CL2和CH1-2對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，在CH1-1和CL1中的突變與在CH1-2和CL2中的突變是不同的。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH44C和VH105C突變。
在一些實施例中，VL1和VL2中的一個或兩個包含VL43C和VH100C突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH44C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含VL100C突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含VH105C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含VL43C突變。
在一些實施例中，CH1-1和CL1中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且CH1-2和CL2中的一個或兩個包含促進配對的突變。
在一些實施例中，CH1-1包含T192E突變，並且CL1包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1-1包含L143Q和S188V突變，並且CL1包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-1包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL1包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-2包含T192E突變，並且CL2包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1-2包含L143Q和S188V突變，並且CL2包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-2包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL2包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-1和CH1-2中的一個或兩個包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，CL1和CL2中的一個或兩個包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2兩者中的一個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，CH1-1和CH1-2中的一個或兩個包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，CL1和CL2中的一個或兩個包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1、VH2和VH3中的一個或多個包含39E、39D、39K、39R或39H突變，VL1、VL2和VL3中的一個或多個包含38E、38D、38K、38R或38H突變，並且其中在VH1、VH2和VH3中的一個或多個中的所述突變與在VL1、VL2和VL3中的一個或多個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1、VH2和VH3中的一個或多個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，VL1、VL2和VL3中的一個或多個包含Q38E、Q38D、 Q38K、Q38R或Q38H突變，並且其中在VH1、VH2和VH3中的一個或多個中的所述突變與在VL1、VL2和VL3中的一個或多個中的所述突變帶相反電荷。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含：
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)，以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含：
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)，
其中CH1-1的C末端可操作地連接至VH2的N末端，並且
其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
其中VL1和VH1對以及VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，
其中所述CL1和CH1-1對中的一個或兩個以及所述CL2和CH1-2對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，在CH1-1和CL1中的突變與在CH1-2和CL2中的突變是不同的。
在一些實施例中，CH1-1包含T192E突變，並且CL1包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1-1包含L143Q和S188V突變，並且CL1包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-1包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL1包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-2包含T192E突變，並且CL2包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1-2包含L143Q和S188V突變，並且CL2包含V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-2包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL2包含N137K、S114A、V133T和S176V突變。
在一些實施例中，CH1-1和CH1-2中的一個或兩個包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，CL1和CL2中的一個或兩個包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，CH1-1和CH1-2中的一個或兩個包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，CL1和CL2中的一個或兩個包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含39E、39D、39K、39R或39H突變，VL1和VL2中的一個或兩個包含38E、38D、38K、38R或38H突變，並且其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，並且其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，本文提供多特異性抗原結合蛋白，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含：
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)，以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含：
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)，
其中CH1-1的C末端可操作地連接至VH2的N末端，並且
其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
其中VL1和VH1對以及VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，
其中所述CL1和CH1-1對以及所述CL2和CH1-2對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，在CH1-1和CL1中的突變與在CH1-2和CL2中的突變是不同的。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含一個或多個半胱胺酸殘 基，所述半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含44C和105C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含100C和43C突變。
在一些實施例中，VH1包含44C突變，並且VL1包含100C突變。
在一些實施例中，VH1包含105C突變，並且VL1包含43C突變。
在一些實施例中，VH2包含44C突變，並且VL2包含100C突變。
在一些實施例中，VH2包含105C突變，並且VL2包含43C突變。
在一些實施例中，VH1包含39E和44C突變，並且VL1包含38K和100C突變。
在一些實施例中，VH1包含39E和105C突變，並且VL1包含38K和43C突變。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含在CH1-1/CL1對中的帶相反電荷的突變。
在一些實施例中，在CH1-1/CL1對中的帶相反電荷的突變選自下列所組成的群組：CH1-1區中的K221E和CL1區中的E123K；CH1-1區中的K228D和CL1區中的D122K；CH1-1區中的L145E和CL1區中的S176K；以及CH1-1區中的L128E和CL1區中的V133K。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含在CH1-2/CL2對中的帶相反電荷的突變。
在一些實施例中，在CH1-2/CL2對中的帶相反電荷的突變選自下列所組成的群組：CH1-2區中的K221E和CL2區中的E123K；CH1-2區中的K228D和CL2區中的D122K；CH1-2區中的L145E和CL2區中的S176K；以及CH1-2區中的L128E和CL2區中的V133K。
在一些實施例中，CH1-1結構域與第一CH2結構域和第一CH3結構域連接，CH1-2結構域與第二CH2結構域和第二CH3結構域連接，並且其中所述第 一CH2和CH3結構域以及所述第二CH2和CH3結構域二聚化以形成Fc結構域。
在一些實施例中，第一CH3結構域包含S354C和T366W突變中的一個或兩個，並且第二CH3結構域包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突變中的一個或兩個，以促進Fc結構域異二聚化。
在一些實施例中，CH1-1的C末端經由肽連接子與VH2的N末端可操作地連接。
在一些實施例中，所述肽連接子包含(GGGGS)n (SEQ ID NO：X)連接子，其中n是1至5的任何整數。
在一些實施例中，所述肽連接子包含選自IgA、IgG和IgD的一種或多種免疫球蛋白的鉸鏈區的全部或部分序列。
在一些實施例中，所述肽連接子包含以下序列： EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO：X)。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)第一恆定重鏈區1(CH1-1)和第一恆定輕鏈區(CL1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)第二恆定重鏈區1(CH1-2)和第二恆定輕鏈區(CL2)；
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和 S176V突變中的一個或多個。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含K221E、K221D、K221K、K221R或K221H突變，並且CL1和CL2中的一個或兩個包含E123E、E123D、E123K、E123R或E123H突變，其中在CH1-1和CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對 包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)第一恆定重鏈區1(CH1-1)和第一恆定輕鏈區(CL1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)第二恆定重鏈區1(CH1-2)和第二恆定輕鏈區(CL2)；
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含K221E、K221D、K221K、K221R或K221H突變，並且CL1和CL2中的一個或兩個包含E123E、E123D、E123K、E123R或E123H突變，其中在CH1-1和CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含K221E、K221D、K221K、K221R或K221H突變，並且CL1和CL2中的一個或兩個包含E123E、E123D、E123K、E123R或E123H突變，其中在CH1-1和CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)第一恆定重鏈區1(CH1-1)和第一恆定輕鏈區(CL1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形 成第二抗原結合位點；和
(4)第二恆定重鏈區1(CH1-2)和第二恆定輕鏈區(CL2)；
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含K221E、K221D、K221K、K221R或K221H突變，並且CL1和CL2中的一個或兩個包含E123E、E123D、E123K、E123R或E123H突變，其中在CH1-1和CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的 第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個，並且
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含44C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含100C突變。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)第一恆定重鏈區1(CH1-1)和第一恆定輕鏈區(CL1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)第二恆定重鏈區1(CH1-2)和第二恆定輕鏈區(CL2)；
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個 或兩個中的所述突變帶相反電荷，以促進配對，並且
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個，並且
其中VH1和VH2中的至少一個或兩個包含44C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含100C突變。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)第一恆定重鏈區1(CH1-1)和第一恆定輕鏈區(CL1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)第二恆定重鏈區1(CH1-2)和第二恆定輕鏈區(CL2)；
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在另一態樣，本文提供多特異性抗原結合蛋白或抗體，其包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)第一恆定重鏈區1(CH1-1)和第一恆定輕鏈區(CL1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)第二恆定重鏈區1(CH1-2)和第二恆定輕鏈區(CL2)；
其中CH1-1和CH1-2中的至少一個或兩個包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，並且CL1和CL2中的至少一個或兩個包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，CH1-1進一步包含T192E突變，並且CL1包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，CH1-2包含T192E突變，並且CL2包含N137K和S114A突變。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含一個或多個半胱胺酸殘基，所述半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵。
在一些實施例中，VH1和VH2中的一個或兩個包含44C和105C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含100C和43C突變。
在一些實施例中，VH1包含44C突變，並且VL1包含100C突變。
在一些實施例中，VH1包含105C突變，並且VL1包含43C突變。
在一些實施例中，VH2包含44C突變，並且VL2包含100C。
在一些實施例中，VH2包含105C突變，並且VL2包含43C突變。
在一些實施例中，VH1包含39E和44C突變，並且VL1包含38K和100C突變。
在一些實施例中，VH1包含39E和105C突變，並且VL1包含38K和43C突變。
在一些實施例中，多特異性抗體進一步包含CH1-1/CL1對和CH1-2/CL2對中的一個或兩個中的帶相反電荷的突變。
在一些實施例中，CH1-1/CL1對和CH1-2/CL2對中的一個或兩個中的帶相反電荷的突變包含在CH1-1區和CH2-2區中的一個或兩個中的K221E，以及在CL1區和CL2區中的一個或兩個中的E123K。
在一些實施例中，CH1-1結構域與包含第一CH2結構域和第一CH3結構域的第一Fc結構域可操作地連接，並且CH1-2結構域與包含第二CH2結構域和第二CH3結構域的第二Fc結構域可操作地連接，並且其中所述第一Fc結構域和所述第二Fc結構域二聚化。
在一些實施例中，第一CH3結構域包含S354C和T366W突變中的一個或兩個，第二CH3結構域包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突變中的一個或多個，並且其中所述突變促進Fc結構域異二聚化。
在另一態樣，本文提供抗原結合蛋白，其包含：
抗原結合結構域，和與恆定輕鏈CL區配對的恆定重鏈CH1區，
其中所述抗原結合結構域選擇性地結合目標抗原，並且其中所述CH1區和所述CL區包含以下中的一個或兩個：
a)所述CH1區中的L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變以及所述CL區中的S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變；和
b)所述CH1區中的L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變以及所述CL區中的V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，
其中所述CH1區中的突變殘基與所述CL區中的突變殘基具有相反電荷。
在另一態樣，本文提供結合蛋白，其包含
蛋白質結合結構域；和
CH1區，所述CH1區與CL區配對，
其中所述蛋白質結合結構域選擇性地結合目標抗原，並且其中所述CH1區和所述CL區包含以下中的一個或兩個：
a)所述CH1區中的L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變以及所述CL區中的S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變；和
b)所述CH1區中的L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變以及所述CL區中的V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，
其中所述CH1區中的所述突變與所述CL區中的所述突變帶相反電荷。
在另一態樣，本文提供抗原結合蛋白，其包含
與恆定輕鏈CL區配對的恆定重鏈CH1區，
其中所述抗原結合結構域選擇性地結合目標抗原，並且其中所述CH1區和所述CL區包含以下中的一個或兩個：
a)所述CH1區中的L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變以及所述CL區中的S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變；和
b)所述CH1區中的K221E和K228D突變以及所述CL區中的D122K和E123K突變，
其中所述CH1區中的突變殘基與所述CL區中的突變殘基具有相反電荷。
在一些實施例中，結合蛋白進一步包含所述CH1區中的K221E突變以及所述CL區中的E123K突變。
在一些實施例中，本文提供多特異性抗原結合蛋白，其包含第一Fab，所述第一Fab包含CH1-1、VH1、CL1和VL1結構域；以及第二Fab，所述第二Fab包含CH1-2、VH2、CL2和VL2結構域，其中第一Fab和第二Fab選自以下替代物中的一種：
i.第一Fab包含CH1-1中的143R突變、VH1中的39K突變、CL1中的176E突變、VL1中的38E突變，並且第二Fab包含CH1-2中的143E突變、VH2中的39E突變、CL2中的176R突變和VL2中的38K突變；
ii.第一Fab包含CH1-1中的143K突變、VH1中的39K突變、CL1中的176E突變、VL1中的38E突變，並且第二Fab包含CH1-2中的143E突變、VH2中的39E突變、CL2中的176K突變和VL2中的38K突變；
iii.第一Fab包含CH1-1中的143H突變、VH1中的39K突變、CL1中的176E突變、VL1中的38E突變，並且第二Fab包含CH1-2中的143E突變、VH2中的39E突變、CL2中的176H突變和VL2中的38K突變；
iv.第一Fab包含CH1-1中的143R突變、VH1中的39K突變、CL1中的176D突變、VL1中的38E突變，並且第二Fab包含CH1-2中的143D突變、VH2中的39E突變、CL2中的176R突變和VL2中的38K突變；
v.第一Fab包含CH1-1中的143K突變、VH1中的39K突變、CL1中的176D突變、VL1中的38E突變，並且第二Fab包含CH1-2中的143D突變、VH2中的39E突變、CL2中的176K突變和VL2中的38K突變；
vi.第一Fab包含CH1-1中的143H突變、VH1中的39K突變、CL1中的176D突變、VL1中的38E突變，並且第二Fab包含CH1-2中的143D突變、VH2中的39E突變、CL2中的176H突變和VL2中的38K突變。
在一些實施例中，CH1區與異二聚化結構域可操作地連接。
在一些實施例中，異二聚化結構域包含第一Fc結構域。
在一些實施例中，第一Fc結構域與第二Fc結構域異二聚化，並且其中所述第一Fc結構域包含第一CH3區，並且所述第二Fc結構域包含第二CH3區。
在一些實施例中，第一CH3區包含S354C和T366W突變中的一個或兩個，並且第二CH3區包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突變中的一個或多個，其中所述突變促進Fc結構域異二聚化。
在一些實施例中，抗原結合蛋白進一步包含至少一個VH/VL對，該 至少一個VH/VL對含有促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷。
在一些實施例中，多特異性抗原結合蛋白或抗原結合蛋白在每個VH區包含三個HCDR和在每個VL區包含三個LCDR，並且進一步包含結合特異性，該結合特異性係對一種或多種目標抗原或一種或多種目標抗原決定基。在一些實施例中，HCDR、LCDR和/或抗原公開於本文中。在一些實施例中，HCDR、LCDR和/或抗原是業內已知的。在一些實施例中，HCDR、LCDR和/或抗原是新鑒定的或新發現的。
在一些實施例中，本文提供抗原結合蛋白，其包含：
抗原結合結構域；和
與恆定輕鏈CL區配對的恆定重鏈CH1區，
其中所述抗原結合結構域選擇性地結合目標抗原，並且其中所述CH1區和所述CL區包含以下中的一個或兩個：
a)所述CH1區中的L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變以及所述CL區中的S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變；和
b)所述CH1區中的L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變以及所述CL區中的V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，
其中所述CH1區中的突變殘基與所述CL區中的突變殘基具有相反電荷。
在一些實施例中，抗原結合蛋白進一步包含選自以下所構成之群組中的一個或多個的CH1/CL突變以促進配對：
(1)T192E(CH1)突變以及N137K和S114A(CL)突變，
(2)L143Q和S188V(CH1)突變、以及V133T和S176V(CL)突變，
(3)T192E、L143Q和S188V(CH1)突變以及N137K、S114A、V133T和S176V(CL)突變，
(4)K221E(CH1)突變以及E123K(CL)突變，
(5)K228D(CH1)突變以及D122K(CL)突變，和
(6)K221E和K228D(CH1)突變以及D122K和E123K(CL)突變，
其中當兩個CH1/CL對包含突變以促進兩個不同VH/VL對的配對時，所述兩個CH1/CL對不包含相同的突變。
在一些實施例中，CH1區與Fc結構域可操作地連接。
在一些實施例中，提供經分離的核酸分子，其包含編碼多特異性抗體或抗原結合蛋白的核苷酸序列。在一些實施例中，提供包含一種或多種經分離的核酸分子的套組，所述一種或多種經分離的核酸分子包含一種或多種核苷酸序列，該一種或多種核苷酸序列編碼多特異性抗原結合蛋白或抗原結合蛋白。
在一些實施例中，提供包含所述核酸分子的表現載體。在一些實施例中，提供包含一種或多種表現載體的套組，所述一種或多種表現載體包含一種或多種核酸分子。
在一些實施例中，提供經分離的宿主細胞，其包含所述一種或多種核酸分子或所述一種或多種表現載體。在一些實施例中，提供經分離的宿主細胞，其包含核酸分子的套組或表現載體的套組。
在一些實施例中，宿主細胞是哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
在一些實施例中，提供醫藥組成物，其包含醫藥上可接受的載劑和治療有效量的多特異性抗體或抗原結合蛋白。
在一些實施例中，提供治療病症的方法，在該病症中抗原活性是有害的，所述方法包括向有需要的個體投予有效量的多特異性抗體或抗原結合蛋白。
在一些實施例中，提供編碼多特異性抗體或抗原結合蛋白的多核苷酸。
在一些實施例中，提供表現多特異性抗體或抗原結合蛋白的宿主細 胞。
在一些實施例中，提供產生多特異性抗體或抗原結合蛋白的方法，所述方法包括在使得多特異性抗體或抗原結合蛋白被表現的條件下培養宿主細胞。在一些實施例中，提供用作藥物的多特異性抗體或抗原結合蛋白。
上述本文的概述是非限制性的，並且根據下述圖式簡單說明、對本文的詳細描述和申請專利範圍，所公開的抗原結合蛋白和方法的其他特徵和優點將係為明顯。
圖1A至圖1C 示意性地描繪了具有幾種不同的突變以增強異二聚化的交叉雙重可變(CODV)抗原結合蛋白形式。圖1A 描繪了CH1/κ突變：CODV-Fab上的「O」(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab2上的「△」(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)。圖1B 描繪了CODV-Fab上的突變(VH39E/VL38K+O)和Fab2上的突變(VH39K/VL38E+△)。圖1C 描繪CODV-Fab上的突變([VH39E/VL38K+O]+[VH44Cys/VL100Cys]或[VH105Cys/VL43Cys])和Fab2上的突變([VH39K/VL38E+△]+[VH44Cys/VL100Cys]或[VH105Cys/VL43Cys])。
圖2A至圖2G 以圖的形式描繪了表5 的結果。圖2A 描繪了WT CODV抗體的結果。圖2B 描繪了僅具有CH1/Ck突變的CODV抗體的結果。圖2C 描繪了CH1/Ck和電荷突變(CM)組合的結果。圖2D 描繪了僅雙硫鍵穩定的(ds)CODV抗體的結果。圖2E 描繪了CH1/Ck和ds突變組合的結果。圖2F 描繪了CM和ds突變組合的結果。圖2G 描繪了CODV抗體中所有三個突變組(即CH1/Ck、CM、和ds穩定的)的組合的結果。
圖3A至圖3D 示意性地描繪了呈開放組態(圖3A 、圖3B )和閉合組態(圖3C 、圖3D )的串聯Fab抗體形式。圖3A 示出了具有CH1/κ突變(Fab1上的「△」(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)和Fab2上的「O」(CH1：L143Q、 S188V；Ck：V133T、S176V))的開放組態。圖3B 示出了具有Fab1上的突變(VH39K/VL38E+△)和Fab2上的突變(VH39E/VL38K+O)的開放組態。圖3C 示出了具有CH1/κ突變(Fab1上的△(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)和Fab2上的O(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V))的閉合組態。圖3D 示出了具有Fab1上的突變(VH39K/VL38E+△)和Fab2上的突變(VH39E/VL38K+O)的閉合組態。
圖4 描繪了呈具有WT、CH1/Ck、和CH1/Ck+CM形式的開放組態的串聯Fab的SEC和HIC分析的結果。
圖5A至圖5D 描繪了呈開放組態和閉合組態的抗CD40 x抗PD-L1串聯Fab抗體的HIC分析、產量和結合親和力的結果。圖5A 示出了僅具有CH1/Ck突變的閉合組態。圖5B 示出了僅具有CH1/Ck突變的具有Fab結構域交換的閉合組態。圖5C 示出了具有CH1/Ck和CM突變的閉合組態。圖5D 示出了具有CH1/Ck和CM突變的開放組態。
圖6A至圖6C 描繪了呈開放組態和閉合組態的抗PD-1 x抗OX40串聯Fab抗體的HIC分析、產量和結合親和力的結果。圖6A 示出了僅具有CH1/Ck突變的閉合組態。圖6B 示出了僅具有CH1/Ck突變的開放組態。圖6C 示出了具有CH1/Ck和CM突變的開放組態。
圖7A至圖7B 描繪了抗4-1BB x抗PD-L1串聯Fab抗體(圖7A) 和抗4-1BB x抗PD-1串聯Fab抗體(圖7B) 的純度結果。兩種抗體都呈具有CH1/Ck和CM突變的開放組態。
圖8A至圖8B 示意性地描繪了具有幾種不同的突變以增強異二聚化的Y形雙特異性抗體形式。圖8A 示出了CH1/κ突變：Fab1上的「O」(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab2上的「△」(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)。圖8B 示出了Fab1上的突變(VH39E/VL38K+O)和Fab2上的突變(VH39K/VL38E+△)。
圖9A至圖9C 描繪了抗PD-1 x抗OX40抗體的純度結果。使用 NanoDSF(差式掃描螢光測定法)量測抗體在T起始時的熱穩定性。使用HIC量測純度。野生型抗體示於圖9A 中。CH1/Ck突變(Fab1=CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和(Fab2=CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)示於圖9B 中。CH1/Ck和CM突變(Fab1=CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V；VH39E/VL38K)和(Fab2=CH1：T192E；Ck：N137K、S114A；VH39K/VL38E)示於圖9C 中。
圖10A至圖10L 描繪了具有幾種不同的突變組合的各種抗PD-1 x抗OX40抗體的SEC和HIC譜。具體突變列舉於下文表9 中。
圖11A至圖11E 描繪了各種Y形抗體的鏈錯誤配對資料。圖11A 描繪了抗PD-1 x抗GITR抗體的錯誤配對資料。圖11B 描繪了抗TNF x抗GITR抗體的錯誤配對資料。圖11C 描繪了抗TNF x抗OX40抗體的錯誤配對資料。圖11D 描繪了抗CD40 x抗PD-L1抗體的錯誤配對資料。圖11E 描繪了抗CD3 x抗CD123抗體的錯誤配對資料。具體突變和生物物理學特徵資料列舉於下文表11 中。
圖12 描繪了人類panT細胞對THP-1目標細胞的細胞毒性測定，其與雙特異性CD3 x CD123-hIgG1-LALA分子共孵育。將T效應細胞和CFSE標記的THP-1目標細胞以10：1的效應與靶標比率接種，並與相應雙特異性分子的連續稀釋液(10nM-0nM)在37℃下共孵育20h。將死細胞用7-AAD染色並通過流式細胞術量測。基於死的THP-1目標細胞(7-AAD/CFSE雙陽性)的百分比計算細胞毒殺活性。資料示出了作為兩名代表性健康供體的平均值的針對雙特異性分子濃度[pM]的死目標細胞[%]。
I.定義
為了可以更容易地理解本文，所選定的術語之定義如下。
本文使用的序列位置編號參考Kabat編號(Kabat,E.A.等人，Sequences of proteins of immunological interest.第5版-美國衛生與公眾服務部(US Department of Health and Human Services),NIH出版號91-3242，第662、680、689頁，1991)。
如本文所用，二十種習知胺基酸及其縮寫遵循習知用法。二十種習知胺基酸的立體異構物(例如，D-胺基酸)；非天然胺基酸(如a-二取代的胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸和其他非習知胺基酸)也可以是本文所述結合蛋白的多肽鏈的合適組分。非習知胺基酸的例子包括：4-羥基脯胺酸、y-羧基麩胺酸、c-N,N,N-三甲基離胺酸、c-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、u-N-甲基精胺酸、以及其他類似的胺基酸和亞胺基酸(例如，4-羥基脯胺酸)。在本文所用的多肽標記法中，根據標準用法和慣例，左手方向是胺基末端方向並且右手方向是羧基末端方向。可以基於常見側鏈特性將天然存在的殘基分為多個類別(參見表1)。
Figure 108147272-A0202-12-0042-1
Figure 108147272-A0202-12-0043-2
保守胺基酸取代可以涉及這些類別中一個類別的成員與同一類別中另一個成員的交換。保守胺基酸取代可以涵蓋非天然存在的胺基酸殘基，它們通常通過化學肽合成而不是通過生物系統合成而摻入。這些包括擬肽以及胺基酸殘基的其他反轉或倒轉形式(reversed or inverted forms)。非保守取代可以涉及這些類別中一個類別的成員與另一個類別的成員的交換。
如本文所用，術語「突變」或「突變的」是指通過缺失、插入和/或取代一個或多個胺基酸而對胺基酸序列的改變。特別地，所述術語是指取代。突變是關於給定序列(例如，特異性地識別第一抗原的VL1和/或VH1對的胺基酸序列)引入的。
如本文所用，「T192E(CH1)突變」是指在抗原結合蛋白的免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域中在Kabat位置192處將蘇胺酸(T)殘基取代為麩胺酸(E)殘基。
如本文所用，「突變組」是指序列中存在的一組不同突變。
如本文所用，術語「變異體」是指與衍生出它的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。使用Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5877,1993的數學演算法來完成兩個序列之間的同一性百分比的確定。這樣的演算法被併入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215,403-410的BLASTN和BLASTP程式中。為了獲得用於比較目的的空位化比對，利用空位化BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402中所述。當利用BLAST和空位化BLAST程式時，使用相應程式的預設參數。可替代地，也可以將變異體定義為具有多達20、15、10、5、4、3、2或1個胺基酸取代，特別是保守胺基酸取代。保守取代是業內熟知的(參見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。在上文表1中給出 了胺基酸的物理和化學特性的概述。在特定實施例中，保守取代是用共同具有根據表1(即，第1欄和/或第2欄)的至少一種特性的胺基酸進行的取代。術語「變異體」還包括片段。片段具有總計多達20、15、10、5、4、3、2或1個胺基酸的N末端和/或C末端缺失。另外地或可替代地，變異體可以被修飾，例如通過總計多達50、40、30、20、10、5、4、3、2或1個胺基酸的N末端和/或C末端胺基酸添加來修飾。
如本文所用，術語「抗原」或「目標抗原」或「抗原目標」是指分子或分子的一部分(例如，抗原決定基)，其能夠被本文所述的結合蛋白特異性地結合，並且另外能夠用於動物中以產生能夠與該抗原的抗原決定基特異性地結合的抗體。目標抗原可具有一個或多個抗原決定基。關於由結合蛋白識別的每種目標抗原，結合蛋白能夠與識別所述目標抗原的完整抗體競爭。
如本文所用，術語「抗原決定基」是指能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性地結合的任何決定簇，例如多肽決定簇。在某些實施例中，抗原決定基決定簇包括分子的化學活性表面基團(grouping)，如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，並且在某些實施例中，可以具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。抗原決定基是由抗體或由抗體的抗原結合片段或由結合蛋白結合的抗原區域。在某些實施例中，當結合蛋白在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中優先識別其目標抗原時，稱結合蛋白特異性地結合抗原。在一些實施例中，當平衡解離常數為<10-8 M時，當平衡解離常數為<1-9 M時，或者當解離常數為<10-10 M時，稱結合蛋白特異性地結合抗原。
如本文所用，術語「抗原結合蛋白」或「結合蛋白」或「結合多肽」是指含有負責與感興趣的目標抗原(例如，人抗原)選擇性地結合的至少一個結合位點的多肽(例如，抗體或其片段)。示例性結合位點包括但不限於抗體可變結構域、受體的配位體結合位點、或配位體的受體結合位點。在某些態樣，結合多肽包含多個(例如，兩個、三個、四個或更多個)結合位點。在某些態樣，結合蛋白不是治療性酶。
如本文所用，「異二聚化結構域」或「HD」是指雙特異性、三特異性或多特異性結合蛋白的亞基，所述亞基促進、引導或迫使輕鏈及其同源重鏈正確組裝以在防止相應輕鏈或重鏈錯誤配對的同時產生所需的蛋白質。
如本文所用，「多特異性」結合蛋白是結合兩種或更多種抗原、和/或兩種或更多種不同抗原決定基的結合蛋白。結合兩種抗原和/或兩種不同抗原決定基的多特異性結合蛋白在本文中也被稱為「雙特異性」結合蛋白。結合三種抗原和/或三種不同抗原決定基的多特異性結合蛋白在本文中也被稱為「三特異性」結合蛋白。
如本文所用，術語「異二聚化Fc」或「異二聚化Fc的功能片段」是指恆定結構域(例如，CH2-CH3或CH2-CH3-CH4)的突變體形式，所述突變體形式關於天然存在的Fc部分是突變的，其中其不再形成同二聚體，而是與對應的突變Fc部分形成異二聚體。因此，所述術語是指形成異二聚體的兩條鏈的一部分。幾個此類對是業內已知的並且包含例如杵臼結構(knob-in-hole，KIH)變異體或EV-RWT變異體。
Ridgeway和同事通過以下方式產生有利於異二聚體組裝的CH3介面：用較大側鏈替代一個CH3介面上的小側鏈以產生杵，並用較小側鏈替代另一個CH3結構域上的大側鏈以產生臼。測試此類變異體展示出優先的異二聚化。通過噬菌體展示進一步擴展原始杵臼結構突變以鑒定另外的合適組合，所述組合用於產生雙特異性IgG抗體，從而測試允許雙硫鍵形成的另外的取代。杵臼結構變異體進一步描述於美國專利號5,732,168和美國專利號8,216,805中，將所述專利通過引用併入本文。因此，在一個實施例中，一個Fc結構域或異二聚化結構域的CH3結構域含有突變Y349C、T366S、L368A和Y407V，並且另一個FC結構域或異二聚化結構域的CH3結構域含有突變S354C和T366W(胺基酸位置通過參考IgG1序列來指示)。
如本文所用，術語「同二聚化結構域」是指介導兩個相似結構域(例如，兩條重鏈)的同二聚化的結構域。重鏈配對是由恆定區的最後一個結構域 (即，IgG分子中的CH3)介導，所述最後一個結構域形成高親和力同二聚體複合物(KD 為大約10pM)。另外的交互作用存在於負責重鏈組裝後形成的兩條重鏈的共價連接的鉸鏈區中。CH3同二聚體中的交互作用涉及CH3-CH3介面處的大約16個殘基，如針對人γ1 CH3所示，其中由介面中心處的6個殘基(T366、L368、F405、Y407和K409)形成的補丁(patch)強烈促進穩定性。同二聚化結構域包括但不限於Fc區及其效應子修飾的變異體以及Fc區和其效應子修飾的變異體中任一者的片段、CH2結構域或其片段、CH3結構域或其片段、CH4結構域或其片段等。
天然存在的抗體通常包含四聚體。每個這種四聚體通常由兩個相同的多肽鏈對構成，每一對具有一條全長「輕」鏈(通常具有約25kDa的分子量)和一條全長「重」鏈(通常具有約50至70kDa的分子量)。如本文所用，術語「重鏈」和「輕鏈」是指具有足以賦予對目標抗原的特異性的可變結構域序列的任何免疫球蛋白多肽。每條輕鏈和重鏈的胺基末端部分通常包括約100至110或更多個胺基酸的可變結構域，所述可變結構域通常負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分通常限定負責效應子功能的恆定結構域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈IgG免疫球蛋白多肽包括一個可變結構域(VH)和三個恆定結構域(CH1、CH2和CH3)，其中所述VH結構域位於多肽的胺基末端並且所述CH3結構域位於羧基末端，並且全長輕鏈免疫球蛋白多肽包括一個可變結構域(VL)和一個恆定結構域(CL)，其中所述VL結構域位於多肽的胺基末端並且所述CL結構域位於羧基末端。
在一些實施例中，本文的多特異性抗原結合蛋白包含來自在表2、3和4中列舉的VH結構域序列中的任一個的一個或多個VH結構域。在一些實施例中，本文的多特異性抗原結合蛋白包含來自在表2、3和4中列舉的VL結構域序列中的任一個的一個或多個VL結構域。在一些實施例中，本文的多特異性抗原結合蛋白包含來自在表2、3和4中列舉的VH結構域序列中的任一個的一個或多個VH結構域，所述VH結構域與來自在表2、3和4中列舉的VL結構域序列中的任一 個的一個或多個VL結構域配對。
通常將人輕鏈分類為κ和λ輕鏈，並且通常將人重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，並將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾個次分類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多個次分類，包括但不限於IgM1和IgM2。IgA被類似地細分為多個次分類，包括但不限於IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內，可變結構域和恆定結構域通常通過約12個或更多個胺基酸的「J」區接合，並且重鏈還包括約10個或更多個胺基酸的「D」區。參見例如，Fundamental Immunology(Paul,W.，編輯，Raven Press，第2版，1989)，出於所有目的將所述文獻通過引用以其整體併入。每個輕/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變結構域通常展現通過三個高度變異區(也稱為互補決定區或CDR)接合的相對保守的架構區(FR)的相同總體結構。來自每一對的兩條鏈的CDR通常通過架構區對齊，這可以使得能夠結合至特定抗原決定基。從胺基末端到羧基末端，輕鏈和重鏈可變結構域二者通常均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
如本文所用，術語「CDR組」是指存在於能夠結合抗原的單一可變區中的一組三個CDR。這些CDR的確切邊界已經根據不同系統以不同方式加以定義。由Kabat所述的系統(Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)，貝塞斯達(Bethesda)，馬里蘭州)(1987)和(1991))不僅提供適用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，還提供定義三個CDR的準確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,1987,J.Affol.Biol.196：901-17；Chothia等人，1989,Nature 342：877-83)發現，雖然在胺基酸序列水準上具有顯著多樣性，但是Kabat CDR內的某些子部分採用幾乎相同的肽骨架構形。這些子部分被命名為L1、L2和L3或者H1、H2和H3，其中「L」和「H」分別指定輕鏈區和重鏈區。這些區域可以被稱為Chothia CDR，它們具有與Kabat CDR重疊的邊界。與Kabat CDR重疊的、定義CDR的其他邊界已經描述於以下文 獻中：Padlan,1995,FASEB J.9：133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5)：732-45；以及Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27：55-77。仍有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循本文所述的系統，但仍然會與Kabat CDR重疊，不過鑒於特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗發現，所述其他CDR邊界可能會被縮短或延長。本文所用的方法可以利用根據這些系統中的任一個系統定義的CDR，但是某些實施例使用Kabat或Chothia定義的CDR。使用胺基酸序列鑒定所預測的CDR是業內(例如在以下文獻中)熟知的：Martin,A.C.“Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains”，於Antibody Engineering，第2卷.Kontermann R.,Dikel S.，編輯Springer-Verlag，柏林，第33-51頁(2010)。還可以通過其他習知方法(例如，通過與其他重鏈和輕鏈可變區的已知胺基酸序列進行比較以確定具有序列超變性的區域)來檢查重鏈和/或輕鏈可變結構域的胺基酸序列以鑒定CDR的序列。可以通過目測，或通過採用比對程式(如CLUSTAL程式套件中的一種)來比對已編號的序列，如以下文獻中所述：Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22：4673-80。便捷地使用分子模型來正確描繪架構和CDR區域，並由此校正基於序列的分配。
在一些實施例中，基於IMGT定義來確定免疫球蛋白輕鏈或重鏈的CDR/FR(Lefranc等人Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1)：55-77；網址：imgt.org)。
在一些實施例中，本文的多特異性抗原結合蛋白包含來自在表2、3和4中列舉的可變重鏈序列中的任一個的3個可變重鏈CDR(HCDR)。在一些實施例中，本文的多特異性抗原結合蛋白包含來自在表2、3和4中列舉的可變輕鏈序列中的任一個的3個可變輕鏈CDR(LCDR)。在一些實施例中，本文的多特異性抗原結合蛋白包含來自在表2、3和4中列舉的可變重鏈序列中的任一個的3個HCDR以及來自在表2、3和4中列舉的可變輕鏈序列中的任一個的3個LCDR。來自表2、3和4的重鏈和輕鏈可變序列的CDR序列可由熟習此項技術者使用業內公認的鑒定CDR序列的方法容易地確定。
如本文所用，術語「Fc」是指包含由抗體消化產生或通過其他手段 產生的非抗原結合片段的序列的分子(所述分子呈單體或多聚體形式)，並且可以含有鉸鏈區。雖然在示例性實施例中使用IgG1和IgG2，但是天然Fc的原始免疫球蛋白來源通常是人源的，並且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由可通過共價(即，雙硫鍵)和非共價結合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽組成。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間雙硫鍵的數目範圍為1至4，這取決於類(例如，IgG、IgA和IgE)或次分類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。Fc的一個例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化產生的雙硫鍵合的二聚體。如本文所用，術語「天然Fc」對於單體、二聚和多聚體形式是通用的。
Fab片段通常包括一條輕鏈以及一條重鏈的VH和CH1結構域，其中F(ab)片段的VH-CH1重鏈部分不能與另一個重鏈多肽形成雙硫鍵。如本文所用，Fab片段還可以包括含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域和一個CL結構域的一條輕鏈，以及含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域和一個CH1結構域的一條重鏈。
F(ab')片段通常包括一條輕鏈和含有更多恆定區的一條重鏈的一部分(在CH1與CH2結構域之間)，使得可以在兩條重鏈之間形成鏈間雙硫鍵以形成F(ab')2分子。
如本文所用，術語「結合蛋白」是指與至少一種目標抗原特異性地結合的非天然存在的(或重組的、工程化的或取代的)分子。
如本文所用，術語「Tm」是指結合蛋白、抗原結合蛋白、抗體的熔解溫度，並且是抗原結合蛋白的熱穩定性的關鍵參數。Tm一般涉及Fv片段(即，可變區重鏈和輕鏈(VH/VL))的熱穩定性。Tm可以通過差式掃描量熱法(DSC)或差式掃描螢光測定法(DSF)來量測。
本文的一個實施例提供結合蛋白，其具有對介於一個與四個之間的目標抗原的生物和免疫特異性和/或對介於一個與四個之間的目標抗原決定基的特異性。本文的另一個實施例提供核酸分子，其包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列。本文的另一個實施例提供包含核酸分子的表現載體，所 述核酸分子包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列。本文的又另一個實施例提供宿主細胞，其表現此類結合蛋白(即，包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核酸分子或載體)。
如本文所用，術語「連接子」是指0至100個連續的胺基酸殘基。連接子是存在的或不存在的，並且是相同的或不同的。蛋白質或多肽中所包含的連接子可以全部都具有相同的胺基酸序列或者可以具有不同的胺基酸序列。
在一些實施例中，肽連接子包含以下序列：EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO：X)。
在一些實施例中，術語「連接子」是指1至15個連續的胺基酸殘基。通常，連接子提供兩個胺基酸之間或兩個多肽結構域之間的可撓性和空間分離。可以根據分子的形式將連接子插入VH、VL、CH和/或CL結構域之間，以為輕鏈和重鏈的所述結構域提供足夠的可撓性和可動性，例如，以折疊成交叉雙可變區免疫球蛋白。在胺基序列水準上，通常分別在可變結構域之間、在可變結構域與敲除結構域之間、或在可變結構域與恆定結構域之間的過渡處插入連接子。由於免疫球蛋白結構域的大致尺寸已被充分理解，因此可以鑒定結構域之間的過渡。結構域過渡的準確位置可以通過定位沒有形成(如通過實驗資料所顯示或者如通過建模或二級結構預測的技術可以假定的)二級結構元件(如β摺板或α螺旋)的肽延伸段來確定。在某些示例性實施例中，可以將連接子插入Fab結構域之間以產生串聯Fab抗體。在特定實施例中，可以將連接子插入第一Fab的VH結構域的N末端與第二Fab的CH1結構域的C末端之間。
連接子中胺基酸殘基的身份和序列可以根據連接子中需要實現的一種或多種二級結構元件的類型而變化。例如，甘胺酸、絲胺酸和丙胺酸對於具有最大可撓性的連接子是合適的。如果需要剛性更強且延長的連接子，則甘胺酸、脯胺酸、蘇胺酸和絲胺酸的某些組合是有用的。根據所需的特性，必要時可以將任何胺基酸殘基與其他胺基酸殘基的組合視為連接子，以構建較大肽連接子。
在一些實施例中，連接子包含：單一甘胺酸(Gly)殘基；二甘胺酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：x)；具有五個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：x)；具有六個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：x)；具有七個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：x)；和具有八個甘胺酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO：x)。
在一些實施例中，連接子包含小胺基酸，如Gly、Ala或Ser。
在一些實施例中，連接子包含Gly(G)和Ser(S)，或者GS、GGS、GGGS或GGGGS。在一些實施例中，連接子包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (即，(GGGGS)2 )。在一些實施例中，連接子包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (即，(GGGGS)3 )。
在一些實施例中，連接子包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)。
在一些實施例中，連接子包含單一Ser殘基；單一Val殘基；選自以下的二肽：Arg-Thr、Gln-Pro、Ser-Ser、Thr-Lys和Ser-Leu；或選自以下的多肽：Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：x)、Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)、Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO：x)、Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO：x)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：x)、Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO：x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)、His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO：x)和Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：x)。
在一些實施例中，兩個串聯Fab通過(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 連接子連接。
在具有CODV-Fab部分的一些實施例中，其中L1和L2位於輕鏈上並 且L3和L4位於重鏈上，L1的長度為3至12個胺基酸殘基，L2的長度為3至14個胺基酸殘基，L3的長度為1至8個胺基酸殘基，並且L4的長度為1至3個胺基酸殘基。在一些實施例中，L1的長度為5至10個胺基酸殘基，L2的長度為5至8個胺基酸殘基，L3的長度為1至5個胺基酸殘基，並且L4的長度為1至2個胺基酸殘基。在一些實施例中，L1的長度為7個胺基酸殘基，L2的長度為5個胺基酸殘基，L3的長度為1個胺基酸殘基，並且L4的長度為2個胺基酸殘基。在一些實施例中，L1的長度為10個胺基酸殘基，L2的長度為10個胺基酸殘基，L3的長度為0個胺基酸殘基，並且L4的長度為0個胺基酸殘基。在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自具有0至15個胺基酸(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸)的獨立選擇的長度，其中至少兩個連接子具有1至15個胺基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸)的長度。在一些實施例中，L1、L2、L3和L4是Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO：x)。在一些實施例中，一個或多個連接子包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)。在一些實施例中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)。在一些實施例中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：x)，L3包含序列Ser，並且L4包含序列Arg-Thr。在一些實施例中，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)。在一些實施例中，L1包含序列Ser，L2包含序列Arg-Thr，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)，並且L4包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO：x)。
在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自獨立地包含選自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (其中n是介於0與5之間的整數；SEQ ID NO：x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)。 在一些實施例中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：x)，L3包含序列Ser，並且L4包含序列Arg-Thr。在一些實施例中，L1包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)，L2包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：10)，L3的長度為0個胺基酸，並且L4的長度為0個胺基酸。在一些實施例中，L1包含序列Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)，L2包含序列Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)，L3的長度為0個胺基酸，並且L4的長度為0個胺基酸。在一些實施例中，L1包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)，L2的長度為0個胺基酸，L3包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)，並且L4的長度為0個胺基酸。在一些實施例中，L1和L2的長度為零個胺基酸，並且L3和L4各自包含獨立地選自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (其中n是介於0與5之間的整數；SEQ ID NO：x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)。在一些實施例中，L3和L4的長度為零個胺基酸，並且L1和L2各自包含獨立地選自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (其中n是介於0與5之間的整數；SEQ ID NO：x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：x)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO：x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO：x)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)。
在一些實施例中，一個或多個連接子包含從天然存在的序列衍生的 序列，所述天然存在的序列位於抗體可變結構域與抗體恆定結構域之間的接合處(例如，如WO 2012/135345中所述，將所述專利通過引用併入)。例如，在一些實施例中，連接子包含在內源VH結構域與CH1結構域之間或在內源VL結構域與CL結構域(例如，κ或λ)之間的過渡處發現的序列。在一些實施例中，連接子包含在內源人VH結構域與CH1結構域之間或在內源人VL結構域與CL結構域(例如，人κ或λ)之間的過渡處發現的序列。
上文列出的例子並不意圖以任何方式限制本文的範圍，並且包含隨機選擇的胺基酸的連接子適合用於在本文所述的結合蛋白中使用，所述隨機選擇的胺基酸選自擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸和脯胺酸。關於連接子序列的另外描述，參見例如WO 2012/135345、WO 2017/180913，將所述專利通過引用併入。
如本文所用，術語「價」是指結合蛋白、抗原決定基、抗原結合蛋白或抗體的結合位點數量。例如，術語「單價結合蛋白」是指具有一個抗原結合位點的結合蛋白。術語「二價結合蛋白」是指具有兩個結合位點的結合蛋白。術語「三價結合蛋白」是指具有三個結合位點的結合蛋白。術語「四價結合蛋白」是指具有四個結合位點的結合蛋白。在特定實施例中，二價結合蛋白可以結合一種抗原目標。在其他實施例中，二價結合蛋白可以結合兩種不同的抗原目標。在特定實施例中，三價結合蛋白可以結合一種抗原目標，即，是單特異性的。在其他實施例中，三價結合蛋白可以結合兩種不同的抗原目標，即，是雙特異性的。在其他實施例中，三價結合蛋白可以結合三種不同的抗原目標，即，是三特異性的。在特定實施例中，四價結合蛋白可以結合一種抗原目標，即，是單特異性的。在其他實施例中，四價結合蛋白可以結合兩種不同的抗原目標，即，是雙特異性的。在其他實施例中，四價結合蛋白可以結合三種不同的抗原目標，即，是三特異性的，在其他實施例中，四價結合蛋白可以結合四種不同的抗原目標，即，是四特異性的。
如本文所用，術語「特異性」是指結合蛋白、抗原決定基、抗原結合蛋白或抗體的結合特異性的數量。例如，術語「單特異性結合蛋白」是指與一種抗原目標特異性地結合的結合蛋白。術語「雙特異性結合蛋白」是指與兩種不同的抗原目標特異性地結合的結合蛋白。術語「三特異性結合蛋白」是指與三種不同的抗原目標特異性地結合的結合蛋白。術語「四特異性結合蛋白」是指與四種不同的抗原目標特異性地結合的結合蛋白，如此等等。
如本文所用，術語「選擇性識別位點」是指結合蛋白中的修飾，所述修飾允許由與選擇性識別位點結合的親和試劑選擇性地識別。選擇性識別位點的例子包含免疫球蛋白的Fc部分中針對蛋白質A的結合位點。
如本文所用，術語「親和試劑」是指含有配位體的試劑，所述配位體固定在基質上並且與分子的表面基團如胺基酸或糖側鏈特異性地結合，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。親和試劑是親和層析中的工具，在親和層析中通過配位體與產物之間的特異性交互作用而使得能純化。作為親和試劑的例子的「蛋白質L」是指重組蛋白L，其被固定在基質上以形成對免疫球蛋白κ輕鏈的可變結構域的亞組具有親和力的配位體。此類基質可以是樹脂。親和試劑的另一個例子是「KappaSelect」，它是指重組的駱駝衍生的13kDa單鏈抗體，所述單鏈抗體被固定在基質上以形成對人免疫球蛋白κ輕鏈的恆定結構域具有親和力的配位體。親和試劑的另一個例子是蛋白質A。蛋白質A是最初在細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )的細胞壁上發現的42kDa表面蛋白。已經經由晶體學精細化示出，蛋白質A的主要結合位點位於Fc區上，位於CH2結構域與CH3結構域之間。另外，已經示出蛋白質A結合含有來自人VH3基因家族的IgG F(ab')2片段的人IgG分子。蛋白質A可以以強的親和力與某些物種的免疫球蛋白的Fc部分結合。
例如，可以通過表面電漿共振確定結合蛋白的解離常數(KD)。通常，表面電漿共振分析通過表面電漿共振(SPR)使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor；皮斯卡塔韋(Piscataway)，新澤西州)量測配位體(生物感測器基 質上的目標抗原)與分析物(溶液中的結合蛋白)之間的即時結合交互作用。表面等離子體分析還可以通過固定分析物(生物感測器基質上的結合蛋白)並呈遞配位體(目標抗原)來進行。如本文所用，術語「KD」是指特定結合蛋白與目標抗原之間的交互作用的解離常數。
如本文所用，術語「特異性地結合」是指結合蛋白或其抗原結合片段以至少約1 x 10-6 M、1 x 10-7 M、1 x 10-8 M、1 x 10-9 M、1 x 10-10 M、1 x 10-11 M、1 x 10-12 M或更大的Kd結合含有抗原決定基的抗原的能力，和/或以比所述結合蛋白或其抗原結合片段對非特異性抗原的親和力大至少兩倍的親和力結合抗原決定基的能力。可以使用BIAcore儀器通過表面電漿共振(SPR)來進行抗原對結合蛋白或抗體的結合親和力。
如本文所用，術語「核酸」是指對於所有已知的生命形式都是必需的聚合或寡聚大分子，或生物大分子。包括DNA(去氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的核酸是由稱為核苷酸的單體制得。大多數天然存在的DNA分子由兩條互補的生物聚合物鏈組成，所述生物聚合物鏈圍繞彼此盤繞以形成雙螺旋。DNA鏈還被稱為由核苷酸組成的多核苷酸。每個核苷酸由含氮核鹼基以及稱為去氧核糖或核糖的單糖和磷酸基構成。天然存在的核鹼基包含鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。核苷酸在鏈中通過一個核苷酸的糖與相鄰核苷酸的磷酸之間的共價鍵彼此接合，從而導致交替的糖-磷酸骨架。如果所述糖是去氧核糖，則所述聚合物是DNA。如果所述糖是核糖，則所述聚合物是RNA。通常，多核苷酸是通過單獨核苷酸單體之間的磷酸二酯鍵形成的。
如本文所用，術語「多核苷酸」是指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。應理解，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。此類修飾包括鹼基修飾(如溴尿苷)、核糖修飾(如阿糖胞苷和2',3'-二去氧核糖)以及核苷酸間連接修飾(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸 酯、硫代縮苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、縮苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和胺基磷酸酯(phosphoroamidate))。術語「多核苷酸」具體地包括DNA的單鏈和雙鏈形式。
「經分離的多核苷酸」是基因組、cDNA或合成來源的多核苷酸或其某種組合的多核苷酸，所述經分離的多核苷酸：(1)不與在自然界中發現其所在的多核苷酸的全部或一部分締合，(2)與在自然界中其並不連接的多核苷酸連接，或(3)在自然界中不作為更大序列的一部分存在。
「經分離的多肽」是如下多肽，其：(1)不含通常與其一起被發現的至少一些其他多肽，(2)基本上不含來自相同來源(例如，來自相同物種)的其他多肽，(3)由來自不同物種的細胞表現，(4)已經從至少約50%的在自然界中與所述經分離的多肽結合的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5)不與在自然界中與所述「經分離的多肽」結合的多肽的部分(通過共價或非共價交互作用)結合，(6)與在自然界中不與所述經分離的多肽結合的多肽可操作地(通過共價或非共價交互作用)結合，或(7)在自然界中不存在。這種經分離的多肽可以由基因組DNA、cDNA、mRNA或具有合成來源的其他RNA或其任何組合來編碼。在示例性實施例中，經分離的多肽基本上不含在其自然環境中發現的會干擾其應用(治療、診斷、預防、研究或其他應用)的多肽或其他污染物。
如本文所用，術語「表現載體」還被稱為表現構建體，通常是指設計用於細胞中的蛋白質表現的質體或病毒。術語「載體」是指能夠被引入細胞中或者能夠將其中所包含的蛋白質和/或核酸引入細胞中的蛋白質或多核苷酸或其混合物。載體的例子包括但不限於質體、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。特別地，使用載體將感興趣的基因產物(如例如，外來或異源DNA)轉運至合適的宿主細胞中。載體可以含有促進載體在宿主細胞中的自主複製的「複製子」多核苷酸序列。外來DNA被定義為異源DNA，所述異源DNA是並非在宿主細胞中天然發現的DNA，所述異源DNA例如複製載體分子，編碼可選擇或可篩選標記，或編碼轉基因。一旦進入宿主細胞，載體可以獨立於宿主染色體DNA複製 或與宿主染色體DNA同時複製，並且可以產生幾個拷貝的載體及其插入的DNA。另外，載體還可以含有必需元件，所述必需元件允許將插入的DNA轉錄成mRNA分子或者以其他方式導致插入的DNA複製到多個拷貝的RNA中。載體可以進一步涵蓋調節感興趣的基因的表現的「表現控制序列」。通常，表現控制序列是多肽或多核苷酸，例如但不限於啟動子、強化子、沉默子、絕緣子或阻遏物。在包含編碼感興趣的一種或多種基因產物的多於一種多核苷酸的載體中，可以通過一種或多種表現控制序列一起或單獨控制表現。更具體地，載體上所包含的每種多核苷酸可以通過單獨的表現控制序列來控制，或者載體上所包含的所有多核苷酸可以通過單一表現控制序列來控制。通過單一表現控制序列控制的單一載體上所包含的多核苷酸可以形成開放閱讀框。一些表現載體另外含有與插入的DNA相鄰的序列元件，所述序列元件增加所表現的mRNA的半衰期和/或允許將mRNA翻譯成蛋白質分子。因此可以快速地合成由插入的DNA編碼的許多mRNA和多肽分子。
如本文所用，術語「宿主細胞」是指其中已經引入了重組表現載體的細胞。重組宿主細胞或宿主細胞意圖不僅是指特定的個體細胞，而且是指這種細胞的子代。因為後代中可能由於突變或環境影響而發生某些修飾，所以這種子代可能實際上與親代細胞不同，但是此類細胞仍包括在如本文所用的術語「宿主細胞」的範圍內。眾多種宿主細胞表現系統可以用於表現結合蛋白，所述表現系統包括細菌、酵母、杆狀病毒和哺乳動物表現系統(以及噬菌體展示表現系統)。合適的細菌表現載體的例子是pUC19。為了重組表現結合蛋白，用攜帶編碼結合蛋白多肽鏈的DNA片段的一種或多種重組表現載體轉化或轉染宿主細胞，使得在所述宿主細胞中表現所述多肽鏈並且在示例性實施例中分泌到培養所述宿主細胞的培養基中，從而可以從所述培養基回收所述結合蛋白。
如本文所用，術語「醫藥組成物」是指當適當地投予至個體(例如，人類個體)時能夠誘導所需治療效果的化合物或組成物。
如本文所用，術語「醫藥上可接受的載劑」或「生理學上可接受的 載劑」是指適合用於實現或增強結合蛋白的遞送的一種或多種配製材料。
術語「有效量」和「治療有效量」當關於包含一種或多種結合蛋白(例如，抗體或其抗原結合片段)的醫藥組成物使用時是指足以產生所需治療結果的量或劑量。更具體地，治療有效量是足以將與所治療病症相關的一種或多種臨床上定義的病理過程抑制一定時間段的結合蛋白(例如，抗體或其抗原結合片段)的量。有效量可以根據所使用的特定抗體樣結合蛋白而變化，並且還取決於與所治療患者和病症嚴重程度相關的多種因素和狀況。例如，如果要在體內投予結合蛋白或多特異性結合蛋白，則諸如患者的年齡、體重和健康狀況以及在臨床前動物工作中獲得的劑量反應曲線和毒性資料等因素將屬於所考慮的那些因素。給定的醫藥組成物的有效量或治療有效量的確定是熟習此項技術者熟練掌握的。
如本文所用，術語「產生結合蛋白的方法」是指使用業內熟知的技術進行的重組蛋白質表現方法。
II.促進配對的CH1/CL突變
在某些實施例中，可以在CH1和CL介面中進行突變以促進特異性配對並防止CH1/CL錯誤配對。此類突變描述於下文中並且進一步詳細描述於以下文獻中：WO 2013/005194和Golay等人(2016)J.Immunol.第196卷.第3199-3211頁，將所述文獻的每一個通過引用併入本文。
可以對CH1和CL結構域中的交互作用極性介面胺基酸對進行第一組突變。可以將所述極性胺基酸交換為中性和成鹽胺基酸對。在某個實施例中，第一組突變可以包含T192E CH1突變以及N137K、S114A CL κ突變。T192E CH1突變和N137K CL κ突變形成可以加強締合特異性的鹽橋，然而不希望的配對應該通過缺乏野生型與變異體CH1和CL κ結構域之間的空間和電荷互補性來避免。另外，進行CL κ結構域上的S114A突變以避免與較大的離胺酸側鏈的空間衝突。可替代地，CH1 T192E和CL N137K/S114A突變組可以被稱為「CR3」突變組。
可以對CH1和CL κ結構域中的交互作用疏水性和極性介面胺基酸殘基對進行第二組突變。一個突變可以構成從疏水性交互作用到極性交互作用的開關。在某個實施例中，第二組突變可以包含L143Q、S188V CH1突變以及V133T、S176V CL κ突變。L134Q CH1突變和V133T CL κ突變構成從疏水性交互作用到極性交互作用的開關。同時存在的S188V CH1突變和S176V CL κ突變構成從極性交互作用到疏水性交互作用的開關。預期介面交互作用的極性/疏水性特徵的交換使突變的CH1與CL κ結構域之間的親和力保持不變，同時降低它們對其他野生型對應物CH1和CL κ結構域的相應親和力，由此借助在錯配的(變異體/野生型)結構域上出現的不利交互作用來防止錯誤配對。可替代地，CH1 L143Q/S188V和CL V133T/S176V突變組可以被稱為「MUT4」突變組。
第三組和第四組突變是「杵臼結構」突變。更具體地，在第三組突變(KH1)中，進行L124A、L143E CH1突變並進行V133W CL κ突變。在第四組突變(KH2)中，進行V190A CH1突變並進行L135W、N137A CL κ突變。第一組、第二組、第三組和第四組突變進一步詳細描述於WO 2013/005194 A1中。
可以進行第五組和第六組突變以交換CH1和CL κ結構域中的靜電電荷。在某個實施例中，第五組突變可以包含K221E CH1突變以及E123K CL κ突變。可替代地，第五組突變可以被稱為「K221E/E123K相反電荷」突變組或「NN1」突變組。在某個實施例中，第六組突變可以包含K228D CH1突變以及D122K CL κ突變。可替代地，第六組突變可以被稱為「K228D/D122K相反電荷」突變組或「NN2」突變組。第五組和第六組突變進一步詳細描述於WO 2007/147901 A1中。在某些實施例中，可以將「K221E/E123K相反電荷」突變組和「K228D/D122K相反電荷」突變組進行組合。因此，所述組合可以包含K221E和K228D CH1突變對以及E123K和D122K CL κ突變對。可替代地，組合的突變組可以被稱為「K221E：K228D/E123K：D122K相反電荷」突變組或「NN3」突變組。
可以進行第七組和第八組突變以交換CH1結構域和CL κ結構域中的靜電電荷。在某個實施例中，第七組突變可以包含L143E、L143D、L143R、L143K 或L143H CH1突變以及S176E、S176D、S176R、S176K或S176H CL κ突變，條件是CH1突變與CL κ突變帶相反電荷。可替代地，第七組突變可以被稱為「L143/S176相反電荷」突變組。在某些實施例中，CH1 L143E或L143D突變可以與CL S176R或S176K突變配對，並且可以被稱為「CM3」突變組。在某些實施例中，CH1 L143R或L143K突變可以與CL S176E或S176D突變配對，並且可以被稱為「CM4」突變組。在某個實施例中，第八組突變可以包含L124E、L124D、L124R、L124K或L124H CH1突變以及V133E、V133D、V133R、V133K或V133H CL κ突變，條件是CH1突變與CL κ突變帶相反電荷。可替代地，第八組突變可以被稱為「L124/V133相反電荷」突變組。在某些實施例中，CH1 L124E或L124D突變可以與CL V133R或V133K突變配對，並且可以被稱為「CM5」突變組。在某些實施例中，CH1 L124R或L124K突變可以與CL V133E或V133D突變配對，並且可以被稱為「CM6」突變組。
在另外的實施例中，上文所提及的突變中的任何一個或多個可以相互組合和/或與下文所述的突變組合。作為例子，第一Fab的CH1結構域包含T192E、K221E突變，並且第一Fab的CL κ結構域包含E123K、N137K、S114A突變。第二Fab的CH1結構域可以進一步包含L143Q、S188V突變，並且第二Fab的CL κ結構域可以包含V133T、S176V突變。可替代地，第二Fab可以是野生型的。
本文關於CH1結構域和CL κ結構域使用的序列位置編號參考Kabat編號(Kabat,E.A.等人，Sequences of proteins of immunological interest.第5版-美國衛生與公眾服務部(US Department of Health and Human Services),NIH出版號91-3242，第662、680、689頁，1991)。
III.促進配對的VH/VL相反電荷突變
在某些實施例中，可以在VH和VL介面中進行突變以促進特異性配對並防止VH/VL錯誤配對。在特定實施例中，對VH和VL結構域進行的突變引入帶相反電荷的胺基酸殘基以通過靜電交互作用促進異二聚化。
在某個實施例中，一組相反電荷突變可以包含在VH結構域中在Kabat位置39處的突變和在VL結構域中在Kabat位置38處的突變。可以在VH Kabat位置39處引入任何已知的帶正電荷或帶負電荷的殘基，條件是在VL Kabat位置38處引入的突變帶相反電荷。例如，一個可能的突變對包含VH K39突變殘基(引入正電荷)和VL E38突變殘基(引入負電荷)。可替代地，可以進行回復突變組，其中引入VH E39突變殘基(引入負電荷)和VL K38突變殘基(引入正電荷)。在某些實施例中，VH結構域可以在Kabat位置39處包含突變為E、D、K、R或H的殘基，並且VL結構域可以在Kabat位置38處包含突變為E、D、K、R或H的殘基，條件是VH結構域中的突變殘基與VL結構域中的突變殘基帶相反電荷。例如，當VH結構域在Kabat位置39處包含突變殘基E或D時，則VL結構域在Kabat位置38處包含突變殘基K、R或H。可替代地，當VH結構域在Kabat位置39處包含突變殘基K、R或H時，則VL結構域在Kabat位置38處包含突變殘基E或D。在其中兩個VH/VL對不在同一多肽鏈中的某個實施例中，如果一個VH/VL對包含VH39中的正電荷(例如E或D)和VL38中的負電荷(例如K、R或H)，則另一個VH/VL對可以包含VH39中的負電荷(例如K、R或H)和VL38中的正電荷(例如E或D)。例如，如果第一VH/VL對包含VH39K和VL38E突變，則第二VH/VL對可以包含VH39E和VL38K突變。可替代地，這組相反電荷突變可以被稱為「VH39/VL38相反電荷」突變組。這組帶相反電荷的突變進一步詳細描述於以下文獻中：Tan等人，Biophysical Journal.第75卷.第1473-1482頁.1998。
在某個實施例中，一組相反電荷突變可以包含VH結構域中的Q39突變和VL結構域中的Q38突變。可以在VH Q39位置處引入任何已知的帶正電荷或帶負電荷的殘基，條件是在VL Q38位置處引入的突變帶相反電荷。例如，一個可能的突變對包含VH Q39K突變(引入正電荷)和VL Q38E突變(引入負電荷)。可替代地，可以進行回復突變組，其中引入VH Q39E突變(引入負電荷)和VL Q38K突變(引入正電荷)。在某些實施例中，VH結構域可以包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL結構域可以包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R 或Q38H突變，條件是VH結構域中的突變與VL結構域中的突變帶相反電荷。
在另外的實施例中，上文所提及的突變中的任何一個或多個可以相互組合和/或與下文所述的突變組合。
IV.VH/VL雙硫鍵穩定突變
在某些實施例中，可以在VH和VL介面中進行突變以改進VH/VL介面之間的穩定性。VH結構域和VL結構域中特定的胺基酸突變組可以通過引入形成二硫橋的非天然半胱胺酸殘基來改進穩定性。
可以對VH和VL結構域中的胺基酸殘基進行第一組雙硫鍵穩定突變。在某個實施例中，第一組雙硫鍵穩定突變可以包含VH結構域中的44C突變和VL結構域中的100C突變。可替代地，第一組雙硫鍵穩定突變可以被稱為「VH44C/VL100C」突變組。第一組雙硫鍵穩定的突變進一步詳細描述於以下文獻中：Reiter等人Nature Biotechnology.第14卷.第1239-1245頁.1996，出於所有目的將所述文獻通過引用併入本文。
可以對VH和VL結構域中的胺基酸殘基進行第二組雙硫鍵穩定突變。在某個實施例中，第二組雙硫鍵穩定突變可以包含VH結構域中的105C突變和VL結構域中的43C突變。可替代地，第二組雙硫鍵穩定突變可以被稱為「VH105C/VL43C」突變組。第二組雙硫鍵穩定的突變進一步詳細描述於美國專利號9,527,927中，出於所有目的將所述專利通過引用併入本文。
V.抗體突變組合
在某些實施例中，突變組的組合可以位於CH1和CL κ介面中和/或位於VH和VL介面中，以進一步促進配對和改進穩定性。
在特定實施例中，抗體中的第一Fab結構域可以包含CR3和MUT4突變組中的一個或兩個與VH/VL相反電荷突變組的組合。在另外的實施例中，抗體中的第二Fab結構域可以包含CR3和MUT4突變組中的一個或兩個與VH/VL 相反電荷突變組的組合。
在特定實施例中，第一Fab結構域可以包含CR3和MUT4突變組中的一個或兩個與VH/VL相反電荷突變組和雙硫鍵穩定突變組的組合。在另外的實施例中，抗體中的第二Fab結構域可以包含CR3和MUT4突變組中的一個或兩個與VH/VL相反電荷突變組和雙硫鍵穩定突變組的組合。
上文實施例中的任一個可以進一步包含CH1/CL介面中的相反電荷突變組。例如，第一Fab可以包含K221E CH1突變和E123K CL κ突變。第二Fab可以包含K221E CH1突變和E123K CL κ突變。
VI.抗體形式和其中的突變組
上文列舉的突變組及其組合的任一種可以應用於本文所述的多特異性抗原結合蛋白。
交叉雙可變
在特定實施例中，「交叉雙可變」或「CODV」是指與至少一種目標抗原或至少一種目標抗原決定基特異性地結合的抗原結合結構域，並且包含形成至少兩個抗原結合位點的至少兩條多肽鏈，其中至少一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
並且至少一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，並且
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在特定實施例中，CODV抗原結合結構域與至少一種目標抗原或至少一種目標抗原決定基特異性地結合，並且包含形成四個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
並且兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
Fc是免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，並且
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
其中VH1/VL1對包含第一抗原結合特異性，並且VH2/VL2對包含第二抗原結合特異性。
在特定實施例中，本文所述的抗原結合蛋白是三特異性和/或三價抗原結合蛋白，其包含形成與一種或多種不同的抗原目標特異性地結合的三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]，
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1結構域和所述CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，並且
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。
在某些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈具有形成兩個不同抗原結合位點的交叉取向。在一些實施例中，VH1和VL1形成結合對並形成第一抗原結合位點。在一些實施例中，VH2和VL2形成結合對並形成第二抗原結合位點。在一些實施例中，第三多肽和第四多肽形成第三抗原結合位點。在一些實施例中，VH3和VL3形成結合對並形成第三抗原結合位點。
這種抗原結合蛋白包含至少三個抗原結合位點。所述抗原結合蛋白 至少是三價抗原結合分子。在特定實施例中，所述抗原結合蛋白與一種抗原目標特異性地結合，即，所述抗原結合蛋白是單特異性抗原結合分子。在另一個實施例中，所述抗原結合蛋白與兩種不同抗原目標特異性地結合，即，所述抗原結合蛋白是雙特異性抗原結合分子。在另一個實施例中，所述抗原結合蛋白與三種不同抗原目標特異性地結合，即，所述抗原結合蛋白是三特異性抗原結合分子。
上文列出的例子並不意圖以任何方式限制本發明的範圍，並且已經顯示包含隨機選擇的胺基酸的連接子在本文所述的抗體樣結合蛋白中是合適的，該隨機選擇的胺基酸係選自由下列所組成的群組：擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸和脯胺酸。
CODV抗體形式、CODV抗體形式的各種排列以及關於連接子的其他細節進一步描述於WO 2012/135345A1和WO 2017/180913A2中，將所述專利通過引用以其整體併入本文。
串聯Fab
在特定實施例中，「串聯Fab」是指抗原結合蛋白，其中第一Fab結構域的一個CH1區的C末端與第二Fab結構域的VH區的N末端可操作地連接。在某些實施例中，串聯fab抗體可以是四價和單特異性的(四個Fab中的每一個結合相同抗原)。在某些實施例中，串聯fab抗體可以是四價和雙特異性的(四個Fab中的兩個結合第一抗原或抗原決定基，而另兩個fab結合第二抗原或抗原決定基)。
串聯fab可以用業內用於連接兩個或更多個抗原結合結構域的任何已知肽連接子可操作地連接。在特定實施例中，肽連接子是Gly-Ser連接子，即，僅包含一個或多個甘胺酸胺基酸和一個或多個絲胺酸胺基酸的連接子。在特定實施例中，肽連接子是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO：x)連接子，其中n 是1至5的任何整數。在特定實施例中，肽連接子是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO：x)連接子。在特定實施例中，肽連接子是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2 (SEQ ID NO：x)連接子。
可替代地，或者與上文列舉的Gly-Ser連接子組合，肽連接子可以包含選自IgA、IgG和IgD的一種或多種免疫球蛋白的鉸鏈區的全部或部分序列。下文指出了人IgG、IgA和IgD的鉸鏈區的序列：
IgA1(SEQ ID NO：x)：Val-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser。
IgA2(SEQ ID NO：x)：Val-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro。
IgD(SEQ ID NO：x)：
Figure 108147272-A0202-12-0068-3
IgG1(SEQ ID NO：x)：Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro。
IgG2(SEQ ID NO：x)：Glu-Arg-Lys-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro。
IgG3：Glu-Leu-Lys-Thr-Pro-Leu-Gly-Asp-Thr-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Arg-Cys-Pro(SEQ ID NO：x)，隨後是Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Thr-Pro-Pro-Pro-Cys-Pro-Arg-Cys-Pro的0或1至4個重複(SEQ ID NO：x)。
IgG4：Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO：x)。
所述肽連接子可以包含僅一種免疫球蛋白的鉸鏈區的全部或部分序列。在這種情況下，所述免疫球蛋白可以與從其衍生出相鄰CH1結構域的免疫球蛋白屬於相同的同種型和次分類，或者屬於不同的同種型或次分類。
可替代地，所述肽連接子可以包含不同的同種型或次分類的至少兩種免疫球蛋白的鉸鏈區的全部或部分序列。在這種情況下，直接跟在CH1結構域之後的肽連接子的N末端部分可以由免疫球蛋白的鉸鏈區的全部或部分組成，所述免疫球蛋白與從其衍生出所述CH1結構域的免疫球蛋白屬於相同的同種型和次分類。任選地，所述肽連接子可以進一步包含免疫球蛋白的CH2結構域的2至15個或5至10個N末端胺基酸的序列。
在某些實施例中，可以使用來自天然鉸鏈區的序列。在其他實施例中，可以向這些序列引入點突變，特別是用丙胺酸或絲胺酸替代天然IgG1、IgG2或IgG3鉸鏈序列中的一個或多個半胱胺酸殘基，以便避免不希望的鏈內或鏈間雙硫鍵。
可以用於本文的抗原結合蛋白中的肽連接子的非限制性例子是具有以下序列的肽連接子：Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)。所述肽連接子由以下組成：人IgG1鉸鏈的全長序列，隨後是人IgG1 CH2的9個N末端胺基酸(Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser，SEQ ID NO：X)，隨後是人IgA1鉸鏈的一部分序列(Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser，SEQ ID NO：X)，並且隨後是被添加以向所述連接子提供補充可撓性的二肽GG。在特定實施例中，肽連接子Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：x)可以有一個或多個半胱胺酸殘基被替代以消除雙硫鍵形成。在特定實施例中，肽連接子包含以下序列： Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO：X)。鉸鏈衍生的肽連接子進一步描述於WO 2013/005194 A2中，將所述專利通過引用以其整體併入本文。
VII.示例性抗體突變和抗體形式組合
上文列舉的抗體突變中的任一種可以與上文列舉的抗體形式中的任一種組合。
在特定實施例中，本文的抗原結合蛋白可以包含CODV抗體形式，所述CODV抗體形式具有CR3突變組、MUT4突變組、L143/S176相反電荷突變組和L124/V133相反電荷突變組中的一個或多個。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個VH/VL相反電荷突變組。所述一個或多個VH/VL相反電荷突變組包括但不限於VH39/VL38相反電荷突變組。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個VH/VL雙硫鍵穩定突變組。所述一個或多個VH/VL雙硫鍵突變組包括但不限於VH44C/VL100C突變組和VH105C/VL43C突變組。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個CH1/CL相反電荷突變組。所述一個或多個CH1/CL相反電荷突變組可以包括但不限於K221E/E123K相反電荷突變組。
在特定實施例中，本文的抗原結合蛋白包含兩條多肽鏈並形成兩個抗原結合位點，其中一條多肽鏈具有由下式表示的結構：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
並且一條多肽鏈具有由下式表示的結構：
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子，
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
其中VH1和VH2中的一個或兩個包含VH44C突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含VL100C突變以形成雙硫鍵，
其中VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，並且
其中CH1結構域包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL結構域包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個。
在特定實施例中，本文的抗原結合蛋白可以包含串聯Fab抗體形式，所述串聯Fab抗體形式具有CR3突變組、MUT4突變組、L143/S176相反電荷突變組和L124/V133相反電荷突變組中的一個或多個。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個VH/VL相反電荷突變組。所述一個或多個VH/VL相反電荷突變組包括但不限於VH39/VL38相反電荷突變組。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個VH/VL雙硫鍵穩定突變組。所述一個或多個VH/VL雙硫鍵突變組包括但不限於VH44C/VL100C突變組和VH105C/VL43C突變組。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個CH1/CL相反電荷突變組。所述一個或多個CH1/CL相反電荷突變組可以包括但不限於K221E/E123K相反電荷突變組。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對 包含：
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含：
(3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
(4)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)，
其中CH1-1的C末端與VH2的N末端可操作地連接，並且
其中VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，並且
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個，
其中在CH1-1和CL1中促進配對的突變與在CH1-2和CL2中促進配對的突變是不同的。
在特定實施例中，本文的抗原結合蛋白可以包含傳統的Y形抗體形式，所述傳統的Y形抗體形式具有CR3突變組、MUT4突變組、L143/S176相反電荷突變組和L124/V133相反電荷突變組中的一個或多個。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個VH/VL相反電荷突變組。所述一個或多個VH/VL相反電荷突變 組包括但不限於VH39/VL38相反電荷突變組。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個VH/VL雙硫鍵穩定突變組。所述一個或多個VH/VL雙硫鍵穩定突變組包括但不限於VH44C/VL100C突變組和VH105C/VL43C突變組。抗原結合蛋白可以進一步包含一個或多個CH1/CL相反電荷突變組。所述一個或多個CH1/CL相反電荷突變組可以包括但不限於K221E/E123K相反電荷突變組。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突 變中的一個或多個，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含N137K、S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個，並且
其中在CH1-1和CL1中促進配對的突變與在CH1-2和CL2中促進配對的突變是不同的。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含T192E、L143Q和S188V突變中的一個或多個，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含N137K、 S114A、V133T和S176V突變中的一個或多個，並且
其中在CH1-1和CL1中促進配對的突變與在CH1-2和CL2中促進配對的突變是不同的，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個進一步包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個進一步包含E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的 第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含L143E、L143D、L143K、 L143R或L143H突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2中的一個或兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中VH1和VH2中的一個或兩個包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL1和VL2中的一個或兩個包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變，其中在VH1和VH2中的一個或兩個中的所述突變與在VL1和VL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，並且其中在CH1-1或CH1-2中的一個或 兩個中的所述突變與在CL1和CL2中的一個或兩個中的所述突變帶相反電荷。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對 包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對 包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變，
其中VH1結構域包含VH39E突變，並且VL1結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的 第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K 突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39E突變，並且VL1結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含E123K突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K突變，
其中VH1結構域包含VH39E突變，並且VL1結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或 L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K228D突變，並且CL1結 構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176E或S176D突變，
其中VH1結構域包含VH39E突變，並且VL1結構域包含VL38K突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的 第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域包含L143E或L143D突變，並且CH1-2結構域包含L143R或L143K突變，並且CL1結構域包含S176R或S176K突變，並且CL2結構域包含S176E或S176D突變，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變。
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39E突變，並且VL1結構域包含VL38K突變，
在特定實施例中，本文的多特異性抗體可以包含：
a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含
(1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
(2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
(3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含
(4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
(5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
(6)第二異二聚化結構域(HD2)；
其中HD1和HD2發生異二聚化，
其中CH1-1結構域和CH1-2結構域中的一個或兩個包含K221E和K228D突變，並且CL1結構域和CL2結構域中的一個或兩個包含D122K和E123K突變，
其中VH1結構域包含VH39K突變，並且VL1結構域包含VL38E突變，
其中VH2結構域包含VH39E突變，並且VL2結構域包含VL38K突變。
VIII.調配物/醫藥組成物
在某些實施例中，提供醫藥組成物，其包含醫藥上可接受的載劑和治療有效量的本文所述的抗原結合蛋白。一些實施例包括醫藥組成物，其包含與針對與投予方式的適合性選擇的醫藥上或生理學上可接受的配製劑混合的、治療有效量的任一種如本文所述的結合蛋白、或結合蛋白-藥物綴合物。
可接受的配製材料在所用劑量和濃度下對接受者通常是無毒的。
在一些實施例中，醫藥組成物可以含有用於改良、維持或保持例如組合物的pH、莫耳滲透壓濃度、粘度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的配製材料。合適的配製材料包括但不限於胺基酸(如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝液(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、膨脹劑(如甘露醇或甘胺酸)、螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、填充劑、單糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調味劑和稀釋劑、乳化劑、親水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成鹽抗衡離子(如鈉)、防腐劑(如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑(如普朗尼克(pluronics)；PEG；脫水山梨糖醇酯；聚山梨酯(如聚山梨酯20或聚山梨酯80)；triton；氨丁三醇；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、穩定性增強劑(如蔗糖或山梨醇)、張力增強劑(如鹼金屬鹵化物(例如，氯化鈉或氯化鉀)或甘露醇山梨醇)、遞送媒劑、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(參見例如，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版，A.R.Gennaro，編輯，Mack Publishing Company 1990)和其後續版本，所述文獻出於任何目的通過引用併入本文)。
在一些實施例中，最佳醫藥組成物將由技術人員根據例如預期投予途徑、遞送形式和所需劑量來決定。此類組合物可能影響結合蛋白的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。
在一些實施例中，醫藥組成物中的主要媒劑或載劑的性質可以是水性或非水性的。例如，適用於注射的媒劑或載劑可以是水、生理鹽水溶液或人 工腦脊液，可能補充有用於腸胃外投予的組合物中常用的其他材料。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其他示例性媒劑。其他示例性醫藥組成物包含約pH 7.0至8.5的Tris緩衝液或約pH 4.0至5.5的乙酸鹽緩衝液，它們可以進一步包括山梨醇或合適的取代物。在本文的一個實施例中，結合蛋白組合物可以通過將具有所需純度的所選組合物與呈凍乾餅或水溶液形式的可選配製劑混合來製備用於儲存。此外，可以使用諸如蔗糖的適當賦形劑將結合蛋白配製為凍乾物。
在一些實施例中，可以選擇本文的醫藥組成物用於腸胃外遞送或皮下遞送。可替代地，可以選擇組合物用於吸入或用於經消化道遞送，如口服。此類醫藥上可接受的組合物的製備在業內技術範圍內。
在一些實施例中，配製組分是以投予位點可接受的濃度存在。例如，使用緩衝液將組合物維持在生理pH或略低的pH，通常在約5至約8的pH範圍內。
在考慮腸胃外投予時，所用治療組合物可以呈無熱原的、腸胃外可接受的水溶液形式，其包含在醫藥上可接受的媒劑中的所需結合蛋白。用於腸胃外注射的特別合適的媒劑是無菌蒸餾水，其中將結合蛋白配製為適當保存的無菌等滲溶液。又另一種製備可以涉及用提供產物的受控或持續釋放的試劑(如可注射微粒、生物蝕解性顆粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂質體)配製所需分子，隨後可將所述分子通過積存注射來遞送。還可以使用透明質酸，並且這可以具有促進在迴圈中的持久持續時間的作用。用於引入所需分子的其他合適的手段包括可植入的藥物遞送裝置。
在一個實施例中，可以將醫藥組成物配製用於吸入。例如，可以將結合蛋白配製為吸入用乾粉。結合蛋白吸入溶液也可以用用於氣溶膠遞送的推進劑來配製。在又另一個實施例中，可以將溶液霧化。
還考慮到可以將某些調配物口服投予。在本文的一個實施例中，可以將以這種方式投予的多特異性結合蛋白用或不用在固體劑型(如錠劑和膠囊)的混配中通常使用的那些載劑來配製。例如，膠囊可以設計為在胃腸道中在生 物利用度最大化且前系統性降解最小化時釋放調配物的活性部分。可以包括其他試劑以有利於結合蛋白的吸收。還可以採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑和粘合劑。
另一種醫藥組成物可以涉及在具有適合於製造錠劑的無毒賦形劑的混合物中的有效量的多特異性結合蛋白。通過將錠劑溶解於無菌水或另一種適當媒劑中，可以以單位劑量形式製備溶液。合適的賦形劑包括但不限於惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或者結合劑，如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或者潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
本文的另外的醫藥組成物對於熟習此項技術者將是明顯的，所述醫藥組成物包括在持續或控制遞送調配物中包含結合蛋白的調配物。用於配製多種其他持續或控制遞送手段的技術(如脂質體載劑、生物蝕解性微粒或多孔珠粒和積存注射)也是熟習此項技術者已知的。持續釋放製劑的另外的例子包括呈成型物品(例如薄膜)或微膠囊形式的半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯的共聚物、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羥丁酸。持續釋放組合物還可以包括脂質體，所述脂質體可以通過業內已知的幾種方法中的任何方法來製備。
在一些實施例中，將用於體內投予的醫藥組成物通常必須是無菌的。這可以通過經無菌濾膜過濾來實現。在將組合物凍乾的情況下，可以在凍乾和回溶(reconstitution)之前或之後使用這種方法進行滅菌。用於腸胃外投予的組合物可以以凍乾形式或在溶液中儲存。此外，通常將腸胃外組合物置入具有無菌進入口的容器中，所述容器例如具有可以由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
一旦已經配製醫藥組成物，可以將其作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。可以將此類調配物以即用形式或以需要在投予前回溶的形式(例如，凍乾)儲存。
本文還涵蓋用於產生單一劑量投予單元的套組。套組可以各自含有具有乾燥的多特異性結合蛋白的第一容器和具有水性調配物的第二容器二者。本文的範圍內還包括含有單室和多室預填充注射器(例如，液體注射器和冷凍注射器(lyosyringe))的套組。
將治療性地採用的結合蛋白醫藥組成物的有效量將取決於例如治療背景和目標。熟習此項技術者將瞭解，治療的適當劑量水準將因此部分根據以下而變：所遞送的分子、結合蛋白所用於的適應證、投予途徑以及患者的大小(體重、體表或器官大小)和狀況(年齡和一般健康狀況)。因此，臨床醫師可以滴定劑量並修改投予途徑以獲得最佳治療效果。
給藥頻率將取決於所用調配物中結合蛋白的藥代動力學參數。通常，臨床醫師將投予組合物直至達到實現所需效果的劑量為止。因此，組合物可以作為單一劑量、作為隨時間的兩次或更多次劑量(它們可以含有或不含等量的所需分子)或作為通過植入裝置或導管進行的連續輸注來投予。適當劑量的進一步精細化是由一般技術者以習知方式進行，並且在一般技術者習知進行的任務範圍內。適當劑量可以通過使用適當的劑量-反應資料來確定。
醫藥組成物的投予途徑與已知方法一致，例如，口服；通過靜脈內、腹膜內、大腦內(腦實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑注射；通過持續釋放系統；或者通過植入裝置。在需要時，組合物可以通過推注注射投予，或通過輸注連續投予，或通過植入裝置來投予。
在一些實施例中，還可以將組合物通過已經使所需分子吸附或包封於其上的膜、海綿狀物或其他適當材料的植入局部投予。在使用植入裝置時，可以將所述裝置植入任何合適的組織或器官中，並且所需分子的遞送可以通過擴散、定時釋放推注或連續投予來進行。
VIII.治療方法/用途
本文的另一態樣是如本文所述用作藥物的多特異性抗體和/或抗原結 合蛋白。
在特定實施例中，提供治療病症的方法，在該病症中抗原活性是有害的，所述方法包括向有需要的個體投予有效量的本文所述的抗原結合蛋白。
結合蛋白可以用於任何已知的測定方法，如競爭性結合測定、直接和間接夾心式測定、和免疫沈澱測定，所述測定方法用於一種或多種目標抗原的偵測和定量。結合蛋白將以適合於所用測定方法的親和力結合一種或多種目標抗原。
對於診斷應用，在一些實施例中，可以用可偵測部分標記結合蛋白。可偵測部分可以是能夠直接或間接產生可偵測信號的任何部分。例如，可偵測部分可以是放射性同位素，如3 H、14 C、32 P、35 S、125 I、99 Tc、111 In或67 Ga；螢光或化學發光化合物，如異硫氰酸螢光素、羅丹明或螢光素；或者酶，如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。
結合蛋白也可用於體內成像。可以將用可偵測部分標記的結合蛋白投予至動物，例如投予至血流中，並測定宿主中經標記的抗體的存在和位置。可以用在動物中通過核磁共振、放射學或業內已知的其他偵測手段可偵測的任何部分標記結合蛋白。
對於臨床或研究應用，在一些實施例中，可以將結合蛋白與細胞毒性劑混合。與細胞毒性劑偶聯的多種抗體(即，抗體-藥物綴合物)已經用於將細胞毒性有效負載靶向特異性腫瘤細胞。細胞毒性劑和將所述藥劑與抗體綴合的連接子是業內已知的；參見例如Parslow,A.C.等人(2016)Biomedicines 4：14；以及Kalim,M.等人(2017)Drug Des.Devel.Ther.11：2265-2276。
本文還涉及包含結合蛋白和可用於偵測生物樣品中的目標抗原位準的其他試劑的套組。此類試劑可以包括可偵測標記、阻隔用血清、陽性和陰性對照樣品以及偵測試劑。在一些實施例中，套組包含組合物，所述組合物包含本文所述的任何結合蛋白、多核苷酸、載體、載體系統和/或宿主細胞。在一些實施例中，套組包含容器以及在所述容器上或與所述容器相連的標籤或包裝說 明書。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。所述容器容納組合物，所述組合物(本身或與另一種組合物組合)可有效治療、預防和/或診斷病症，並且所述容器可以具有無菌進入口(例如，所述容器可以是靜脈輸液袋或具有可以由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。在一些實施例中，標籤或包裝說明書指示，所述組合物用於預防、診斷和/或治療所選病症。可替代地或另外地，製品或套組可以進一步包含含有醫藥上可接受的緩衝液(如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。所述製品或套組可以進一步包括從商業和用戶角度所需的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾紙、針和注射器。
在一些實施例中，將本文的結合蛋白投予至有需要的患者用於治療或預防癌症。在一些實施例中，本文涉及預防和/或治療增殖性疾病或障礙(例如，癌症)的方法。在一些實施例中，所述方法包括向患者投予治療有效量的至少一種本文所述的結合蛋白或與其相關的醫藥組成物。在一些實施例中，患者是人。
在一些實施例中，所述至少一種結合蛋白是與一種或多種抗癌療法(例如，業內已知的任何抗癌療法，如化學治療劑或療法)組合投予。在一些實施例中，所述至少一種結合蛋白是在一種或多種抗癌療法之前投予。在一些實施例中，所述至少一種結合蛋白是與一種或多種抗癌療法同時投予。在一些實施例中，所述至少一種結合蛋白是在一種或多種抗癌療法之後投予。
實例
在下文詳細描述本發明之前，應理解，本發明並不限於本文所述的特定方法、方案和試劑，因為這些可以改變。還應理解，本文使用的術語僅用於描述特定實施例的目的，並且不意圖限制本發明的範圍，本發明的範圍將僅受所附的申請專利範圍限制。除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學 術語都具有與一般技術者通常所理解的相同含義。在特定實施例中，本文所述用的術語如以下文獻中所述來定義：“A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations),”Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Kolb,H.編輯.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010巴塞爾(Basel)，瑞士(Switzerland)。除非本文中另有定義，否則本文中所用的科學和技術術語具有一般技術者一般理解的含義。在任何潛在歧義的事件中，本文所提供的定義優先於任何字典或非固有定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。除非另外陳述，否則「或」的使用意指「和/或」。術語「包括(including)」以及其他形式如「包括」(「includes」和「included」)的使用不是限制性的。如本文所用，除非另外說明，否則單數形式「一個」、「一種」和「所述」包括多個提及物。因此，例如，提及「一個/一種蛋白質」時包括多個/多種蛋白質分子。
此外，除非另有說明，否則本文所述的實驗使用業內技術範圍內的習知分子和細胞生物學和免疫學技術。此類技術為熟練工作者所熟知，並且在文獻中已充分解釋。參見例如Ausubel，等人，編輯，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有增刊，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第四版)MR Green和J.Sambrook和Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013，第2版)。
在本說明書的整個正文中引用若干文件。本文在上文或下文中引用的每個檔(包括所有專利、專利申請、科學出版物、製造商說明書、指導等)都是通過引用以其整體特此併入。本文中的任何內容都不應視為承認本發明因在先發明而無權早於這種披露內容。
在下文中，將描述本發明的要素。這些要素是用具體實施例來列出，然而，應理解，這些具體實施例可以以任一方式和以任一數量組合以產生另外的實施例。差異性描述的實例和特定實施例不應視為將本發明限制於僅明確描 述的實施例。本說明書應理解為支援並涵蓋組合明確描述的實施例與任一數目的所公開要素的實施例。此外，除非上下文另有指示，否則應考慮本申請的說明書公開本申請中所有所述要素的任何排列和組合。
通常，本文所述的結合細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質和核酸化學和雜交使用的術語是業內熟知並且一般使用的術語。除非另有指示，否則本文提供的方法和技術通常是根據業內熟知並且如本說明書通篇引用和討論的各個通用和更具體參考文獻中所述的習知方法來進行。酶反應和純化方法是根據製造商說明書來進行，如業內一般所完成的或如本文所述。關於本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫藥和藥物化學的術語以及實驗室程式和技術是業內公知和常用的那些術語、實驗室程式和技術。對於化學合成、化學分析、醫藥製備、配製和遞送以及患者的治療，使用標準技術。
Fab組裝是通過VH/VL和CH1/CL結構域交互作用所驅動的。產生多種多特異性構建體，它們具有含有不同Fab介面突變的不同結構。研究CH1/CL和VH/VL介面內組合的突變對引導正確配對的能力，並描述在下文實例中。
實例1：通用表現和純化方案
雙特異性和三特異性分子的表現
使用聚乙烯亞胺轉染試劑用所指示的輕鏈編碼質體和重鏈編碼質體轉染在F17無血清懸浮培養液(Invitrogen)中生長的HEK 293-FS細胞。在37℃下培養7天之後，通過離心去除細胞，並使上清液通過0.22μm濾紙以去除顆粒。
對於純化，在MabSelect SuRe管柱(目錄號：11-0034-93，GE Healthcare)上捕獲抗體並用0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.0)溶離，並使用HiPrep 26/10脫鹽管柱(目錄號：17-05087-02，GE Healthcare)直接脫鹽。在通過尺寸排阻層析(SEC)使用Superdex200 26/60(GE)精細純化(polishing)蛋白質和最終的超 濾濃縮步驟之後，將蛋白質用於進一步表徵。
分析型尺寸排阻層析(SEC)
使用BioSECcurity儀器(PSS Polymer)用TSKgel SuperSW3000柱(4,6mm x 300mm)和TSKgel SuperSW HPLC保護柱(Tosoh Bioscience)在25℃下進行分析型SEC。所述分析是以0.25ml/min的流速使用250mM NaCl、100mM磷酸鈉(pH 6.7)來運行，在280nm和260nm下偵測。在436nm下偵測靜態光散射。將5μl蛋白質樣品(1mg/ml)施加至管柱。使用WinGPC軟體8.1版(PSS Polymer)進行資料評估。對於分子量的估計，用分子量範圍為6.5至670kDa的蛋白質標準品校正SEC管柱。
分析型疏水性交互作用層析(HIC)
使用LC10 HPLC儀器(Shimadzu)用TSKgel Ether-5PW 10μm(2 x 75mm)(Tosoh Bioscience)在25℃下進行分析型HIC。所述分析是以0.1ml/min的流速來運行，在280nm下偵測。將5μg未稀釋的蛋白質樣品施加至管柱。梯度溶離是從0至30min(0%至100% B)，隨後是10min的100% B和15min的再平衡。緩衝液A由1.5M硫酸銨、25mM磷酸鈉(pH7.0)構成。緩衝液B由25mM磷酸鈉(pH 7.0)構成。使用LabSolutions軟體5.85版(Shimadzu)進行資料評估。
質譜分析(MS)
通過LC-MS分析蛋白質完整性。使用12.5μg蛋白質(在用0.5μl PNGaseF(無甘油，New England Biolabs)處理的D-PBS緩衝液中稀釋至0.5mg/ml)將蛋白質樣品在37℃下脫糖基15小時。使用6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS儀器(Agilent)進行LC-MS分析。使用Poroshell 300SB-C8 5μm(75 x 0.5mm)(Agilent)和保護管柱Poroshell 300SB-C8 5μm(2.1 x 12.5mm)(Agilent)以180μL/min進行反相(RP)層析。溶離劑是LC水、0.1%甲酸(A)、以及90% 乙腈、10% LC水、0.1%甲酸(B)。將2μg蛋白質注射到管柱上，並在13分鐘內使用從0%至100% B的線性梯度進行溶離。使用MassHunter軟體B.06(Agilent)進行資料分析。使用GPMAW軟體9.13a2版(Lighthouse Data)基於蛋白質的胺基酸序列計算分子品質。
表面電漿共振(SPR)
使用表面電漿共振(SPR)用BIAcore 3000儀器(GE Healthcare)和HBS-EP緩衝液(GE Healthcare)量測抗原與抗體構建體的結合。在研究級CM5晶片(GE Life Sciences)上使用標準程式經由伯胺基團(11000RU)固定抗人類Fc捕獲抗體(人類抗體捕獲套組(human antibody capture kit)，GE Life Sciences)。以導致30RU的最大分析物結合的經調節的RU值以10μl/min的流速捕獲配位體。將所測試的抗體構建體用作分析物，並且在300秒的解離時間和30μL/min的流速下以100nM濃度注射240秒。通過注射3nM至100nM的分析物的兩倍連續稀釋液使用捕獲的抗體進行結合動力學量測。通過用捕獲套組所提供的再生緩衝液的2min注射使晶片表面再生。用空白晶片表面和HBS-EP緩衝液空白對傳感圖進行雙重參照。使用BIAevaluation軟體4.1版進行資料分析。
差式掃描螢光測定法(DSF)
使用差式掃描螢光測定法(DSF)確定熔點Tm資料。將樣品在白色96孔半裙板(BIORAD)中在D-PBS緩衝液(Invitrogen)中稀釋至0.2μg/μl的最終濃度，包括SYPRO-Orange染料(Invitrogen，DMSO中的5000x原液)在D-PBS中的4x濃縮溶液。所有量測都是使用MyiQ2即時PCR儀器(BIORAD)以一式雙份進行。在iQ5軟體2.1版(BIORAD)中產生熔解曲線的負一階導數曲線(-d(RFU)/dT)。然後將資料匯出至Excel中進行Tm確定和資料的圖形顯示。
選擇串聯Fab抗體、三特異性CODV抗體和雙特異性Y形抗體的序列列舉於下文表2、表3和表4中。
Figure 108147272-A0202-12-0112-4
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Figure 108147272-A0202-12-0114-6
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Figure 108147272-A0202-12-0120-12
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實例2：致使CODV形式中發生突變的異二聚化
針對表現、產量和同質性探索CODV抗體形式的三種不同的突變體。第一種形式包含如下CODV抗體，所述CODV抗體具有Fc結構域中的杵臼結構突變以及CODV-Fab中的CH1/κ MUT4突變(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab2中的CH1/κ CR3突變(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)(圖1A )。第二種形式包含如下CODV抗體，所述CODV抗體具有Fc結構域中的杵臼結構突變以及第一種形式的MUT4/CR3突變，與在CODV-Fab和Fab2二者中的靜電突變VH39E/VL38K組合(圖1B )。第三種形式包含如下CODV抗體，所述CODV 抗體具有Fc結構域中的杵臼結構突變以及第二種形式的MUT4/CR3突變和靜電突變，與CODV-Fab上的雙硫鍵穩定突變VH44C/VL100C組合(圖1C )。
可變區中的靜電突變和雙硫鍵形成突變的概述示於表4 中。CH1/CL κ突變的概述示於表5 中。表現和純化方案的詳細描述如實例1所述。圖2A 至圖2G 以圖的形式描繪來自所測試的各種CODV抗體形式的資料。
下文表5 概述對在([OX40 x PD1]+GITR)三特異性CODV抗體上測試的各種CODV抗體形式的表徵的結果。CH1/Ck突變：CODV-Fab(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)。CM(帶電荷的突變)：CODV-Fab(VH39E/VL38K)和Fab2(VH39K/VL38E)。ds(雙硫鍵穩定突變)：VH44Cys/VL100Cys。如下文在表5 中所示，在CH1/CL介面內引入突變增加起始熔點(Tm起始)，從而指示熱穩定性的增加。進一步摻入VH/VL修飾顯著增加正確配對，如通過HIC和MS所示(參見圖2A至圖2G )。CH1/CL κ突變組(CR3和MUT4)與雙硫鍵穩定突變的組合示出了有前景的結果，表明高的HIC單體含量和增加的熱穩定性。CH1/CL κ突變組(CR3和MUT4)、雙硫鍵穩定突變和相反電荷突變的組合也示出有前景的結果。
Figure 108147272-A0202-12-0203-1120
Figure 108147272-A0202-12-0204-1121
實例3：致使串聯Fab形式中發生突變的異二聚化
探索了串聯Fab抗體的兩種構形。針對有效表現、純化和同質性進一步測試每種構形。第一種形式由串聯Fab的開放構形組成，其中Y形抗體通過VH結構域上的可撓性連接子附接至另一個Fab片段(參見圖3A 和圖3B )。第二種串聯Fab由串聯fab的閉合構形組成，其中上述VH結構域中的連接子可以形成雙硫鍵(參見圖3C 和圖3D )。
針對有效表現、純化和同質性探索兩種突變體，開放-串聯Fab構形和閉合-串聯Fab構形各一種。第一突變體由僅具有MUT4和CR3突變的開放fab組成(圖3A )。第二突變體由具有MUT4和CR3突變與帶相反電荷的突變的組合的開放fab組成(圖3B )。
針對有效表現、純化和同質性探索兩種突變體，每種具有閉合-串聯Fab構形。第一突變體由僅具有MUT4和CR3突變的閉合fab組成(圖3C )。第二突變體由具有MUT4和CR3突變與帶相反電荷的突變的組合的閉合fab組成(圖3D )。
如下文表6 中所示，與其中僅引入CH1/CL修飾的實例相比，CH1/CL突變與VH/VL介面突變的組合增加靶標HIC譜。因此，組合突變減少錯誤配對種類的量並增加正確配對分子(靶標HIC峰)的量。配對結果的強度取決於抗體序列和結構域比對。
Figure 108147272-A0202-12-0205-1122
Figure 108147272-A0202-12-0206-1123
Figure 108147272-A0202-12-0207-1124
僅具有MUT4/CR3突變的開放組態串聯Fab產生大約68%正確配對。然而，觀察到引入帶相反電荷的突變將正確多肽的產量和同質性從68%增加至96%(圖4 )。
使用抗CD40 x抗PD-L1抗體並排比較開放組態和閉合組態。如在圖5A至圖5D 中可見，如通過HIC所量測，與開放組態相比，閉合組態導致較低的產量和純度。與CH1/CL κ突變(CR3/MUT4)組合的帶相反電荷的突變的添加也改進了純度。抗PD-1 x抗OX40抗體支持這些作用，如圖6A 至圖6C 中所示。開放組態導致較高的產量和純度。包括相反電荷突變進一步改進了產量和純度。
實例4：Y形抗體突變
具有Y形結構的雙特異性抗體中的正交Fab設計是通過將杵臼結構突變(杵：S354C、T366W；臼：Y349C、T366S、L368A、Y407V)引入相應重鏈的CH3結構域中來實現。兩個不同的Fab臂含有如圖8A 和圖8B 中所述的突變，以及在下文表7-9 中所示的突變。圖8A 中的突變是Fab1中的CH1/κ MUT4突變(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab2中的CH1/κ CR3突變(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)。圖8B 中的突變是圖8A 的MUT4/CR3突變，與Fab1和Fab2二者中的靜電突變VH39E/VL38K組合。
測試具有多種突變的抗PD-1 x抗OX40抗體。下文表7 提供對PD-1 x OX40雙特異性抗體的變異體的表現和生物物理學表徵的概述，所述變異體的 Fab介面突變是變化的。僅CH1/CL的修飾或僅VH/VL的修飾對於防止錯誤配對是無效的。所提出的CH1/CL突變與VH39/VL38介面突變的組合顯著影響引導的配對，如通過HIC和MS所確定(參見圖9A至圖9C )。
Figure 108147272-A0202-12-0208-1125
Figure 108147272-A0202-12-0209-1126
測試具有多種突變的抗CD40 x抗PD-L1抗體。下文表8 提供對CD40 x PD-L1雙特異性抗體的變異體的表現和生物物理學表徵的概述，所述變異體的Fab介面突變是變化的。僅CH1/CL的修飾或僅VH/VL的修飾對於防止錯誤配對是無效的。CH1/CL突變與VH39/VL38介面突變的組合顯著影響引導的配對，如通過HIC和MS所確定。
Figure 108147272-A0202-12-0209-1127
Figure 108147272-A0202-12-0210-1128
Figure 108147272-A0202-12-0211-1129
測試與先前抗PD-1 x抗OX40抗體具有不同的多種突變的抗PD-1 x抗OX40抗體。下文表9 提供對PD1 x OX40雙特異性抗體的變異體的表現和生物物理學表徵的概述，所述變異體具有變化的Fab介面突變。表9 中所示，與位置VH38/VL39處的VH/VL介面突變組合的成對CH1/CL突變L143/S176或L124/V133顯著增加正確配對種類的量，如依據HIC譜所觀察和通過MS分析所驗證(圖9A至圖9C和圖10A至圖10L )
Figure 108147272-A0202-12-0211-1130
Figure 108147272-A0202-12-0212-1131
為了在構建體之間更好地比較，表7至9 中SPR資料中的抗原結合水準是相對於所捕獲的抗體水準(RU抗原/RUFc捕獲)來報告的。表7至9 中的SPR資料示出，所測試的所有抗體構建體都以相當的結合水準與其相應抗原結合。
實例5：用於實例6和實例7的通用表現和純化方案
分析型尺寸排阻層析(SEC)
使用BioSECcurity儀器(PSS Polymer)以及AdvanceBio 300柱(4.6mm x 300mm)和AdvanceBio 300保護管柱(Agilent Technologies)在25℃下進行分析型SEC。所述分析是以0.5ml/min的流速使用2x濃縮的D-PBS緩衝液(Thermo Fisher Scientific)來運行，在280nm下偵測。將10μl蛋白質樣品(1mg/ml)施加至柱。使用WinGPC軟體8.1版(PSS Polymer)進行資料評估。對於分子量的估計，用蛋白質校正標準混合物(Agilent Technologies)校正SEC柱。
分析型疏水性交互作用層析(HIC)
使用配備有TSKgel丁基-NPR管柱(2.5μm，4.6 x 35mm)(Tosoh Bioscience)的LC10 HPLC儀器(Shimadzu)或Vanquish HPLC儀器(Thermo Fisher Scientific)在25℃下進行分析型HIC。所述分析是以1ml/min的流速運行，在280nm下偵測。將5μg未稀釋的蛋白質樣品施加至管柱。梯度溶離是在7min內從15% B至85% B，隨後是1min至100% B，然後1min至15% B，然後3分鐘在15% B下平衡。緩衝液A由1.5M硫酸銨、25mM磷酸鈉(pH 7.0)構成。緩衝液B由25mM磷酸鈉(pH 7.0)構成。使用LabSolutions軟體5.85版(Shimadzu)或Chromeleon 7軟體(Thermo Fisher Scientific)進行資料評估。
質譜分析(MS)
通過LC-質譜(LC-MS)分析異二聚體構建體的蛋白質完整性和潛在錯誤配對。使用12.5μg蛋白質(在用0.5μl PNGaseF(無甘油，New England Biolabs)處理的LC-MS級水(Thermo Scientific)中稀釋至0.17mg/ml)將蛋白質樣品在37℃下脫糖基16小時。使用Thermo Fisher Orbitrap Lumos LC/MS儀器進行LC-MS分析。使用MabPac RP HPLC柱(分析型4μm粒徑，2.1 x 100mm)(Thermo Scientific)以300μL/min進行反相(RP)層析。溶離劑是LC水、0.1%甲酸(A)、以及90%乙腈、10% LC水、0.1%甲酸(B)。將2μg蛋白質注射到柱上，並在12分鐘中用從0%至95% B的線性梯度溶離。使用Expressionist軟體13.0.3(Genedata)進行資料分析。使用GPMAW軟體10.32b1版(Lighthouse data)基於蛋白質的胺基酸序列計算分子品質。
表面電漿共振(SPR)
使用表面電漿共振(SPR)用BIAcore T200儀器(GE Healthcare)和HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare)量測抗原與抗體構建體的結合。對於抗體對其相應抗原的相對結合水準(%Rmax)的評估，通過抗Fc親和捕獲將抗體捕獲 至感測器晶片。在這個測定中，使用重組人抗原(PD-L1-His(9049-B7-100，R&D Systems)、CD40-His(10774-H08H，Sino Biological)、TNFα(130-094-022，Miltenyi)、GITR-His(內部生產)、PD1-His(8986-PD-100，R&D Systems)、CD3εδ-FLAG-His(#CT038-H2508H，Sino Biological)和人CD123(#301-R3/CF，R&D Systems))。在研究級CM5晶片(GELife Sciences)上使用標準程式經由伯胺基團(11000 RU)固定抗人類Fc捕獲抗體(人抗體捕獲套組(humanantibody capture kit)，GE Life Sciences)。用導致10至30 RU的最大分析物結合的經調節的RU值以10μl/min的流速捕獲抗體。將抗原用作分析物並以400nM和100nM濃度(對於CD3εδ-FLAG-His)或以100nM濃度(對於所有其他所用抗原)注射。在300秒的解離時間和30μL/min的流速下，將抗原注射240秒。通過用捕獲套組所提供的再生緩衝液的2min注射使晶片表面再生。用空白晶片表面和HBS-EP緩衝液空白對傳感圖進行雙重參照。使用Biacore 8K評估軟體1.11.7442版(GE Healthcare)進行資料分析和結合水準確定。使用最大結合水準除以理論Rmax值來計算%Rmax值。從捕獲水準R捕獲、結合化學計量學N以及抗體分子量Mw(Ab)和抗原分子量Mw(Ag)，根據Rmax=R捕獲*N*(Mw(Ag)/Mw(Ab)來計算Rmax值。
奈米差式掃描螢光測定法(奈米DSF)
使用奈米差式掃描螢光測定法(奈米DSF)確定蛋白質變性的起始溫度(T起始)和熔點(Tm)。將樣品在配製緩衝液中稀釋至0.5μg/μl的最終濃度並以一式雙份載入到奈米DSF毛細管(Nanotemper Technologies)中。使用Prometheus NT.plex奈米DSF裝置(Nanotemper Technologies)進行所有量測。從20℃到95℃，加熱速率為1℃/分鐘。使用PR.ThermControl軟體2.3.1版(Nanotemper Technologies)記錄資料並使用PR.穩定性分析軟體1.0.3版(Nanotemper Technologies)進行分析。
實例6：另外的Y形抗體突變
產生具有Y形結構的另外的雙特異性抗體並用不同的突變組測試。具體地，採用具有下文表10 中列舉的突變的抗PD-1 x抗OX40抗體。下文資料示出，與野生型對照相比，具有Fab突變的所有Y形抗體具有減少的錯誤配對。具有VH39/VL38相反電荷突變組、L143/S176相反電荷突變組和組合的K221E：K228D/E123K：D122K相反電荷突變組的抗體(蛋白質ID Y61)展示出極佳的結果，未接測到錯誤配對。
Figure 108147272-A0202-12-0215-1132
實例7：致使Y形抗體形式中發生突變的另外的異二聚化
測試具有不同的異二聚化突變組的另外的Y形抗體。下文表11 列舉所 測試的每種Y形抗體的生物物理學表徵資料。如表11 和圖11A至圖11E 中所列舉，「CM1」是指VH39K/VL38E突變對，「CM2」是指VH39E/VL38K突變對，「CM3」是指CH1 L143E或L143D/CL S176R或S176K突變對，「CM4」是指CH1 L143R或L143K/CL S176E或S176D突變對，並且「NN3」是指CH1 K221E和K228D/CL D122K和E123K突變對。
Figure 108147272-A0202-12-0216-1133
Figure 108147272-A0202-12-0217-1134
如表11 和圖11A至11E 中所示，與野生型抗體相比，所用的各種異二聚化突變每種都減少錯誤配對。在已知其野生型組態中不具有錯誤配對的抗TNF x抗OX40抗體(Y49)的情況下，包括異二聚化突變對錯誤配對沒有負面影響(圖11C )。
除了上文的生物物理學表徵以外，將T細胞接合器抗體CD3 x CD123處於基於細胞的細胞毒性測定中。在細胞毒性測定中使用初級人T細胞分析雙特異性抗體分子。在Leucosep管(Greiner Bio-One，#227290)中使用15ml Histopaque(Sigma-Aldrich，#10771)和以1000xg離心10min分離來自健康供體血液的人外周單核細胞。將分離的PBMC在補充有5% MACS BSA原液(Miltenyi Biotec，#130-091-370)的autoMACS沖洗緩衝液(Miltenyi Biotec，#130-091-222)中洗滌兩次。用MACSpro分離器(Miltenyi Biotec)和Pan T細胞分離套組(Miltenyi Biotec，#130-096-535)使用製造商的方案從人類PBMC分離初級人類T細胞。將分離的人類T細胞以5 x 106 個細胞/mL重懸於補充有10% FCS HI(Gibco， #10082-147)的RPMI GlutaMAX I培養基(Gibco，#72400)中。在細胞毒性測定之前，將THP-1目標細胞(ADCC TIB-202)用1μM CFSE(Invitrogen，#C1157)在37℃下染色15min。將細胞在RPMI+GlutaMAX I培養基中洗滌兩次，並以400 x g離心5min。將THP-1目標細胞以5 x 105 個細胞/mL重懸於補充有10% FCS HI的RPMI培養基中。將CFSE標記的THP-1細胞與人pan T細胞以10：1的效應與目標比率混合並以100μl/孔的總體積接種於96孔測定盤(Greiner BioOne，#650185)中。將雙特異性抗體分子在從10nM開始至0nM(1：6稀釋)的11個稀釋系列中以5μL/孔的體積添加到細胞中，並在37℃和5% CO2 下孵育20小時。在孵育之後，將細胞用5μg/ml 7-AAD(Invitrogen，#A1310)在4℃下染色30min。為了確定細胞毒性，通過在LSRII流式細胞儀(BD)上對CFSE/7-AAD雙陽性THP-1細胞進行門控來量測死的目標細胞，並用Xlfit軟體確定EC50值。
如圖12 中所示，所有三種CD3 x CD123雙特異性抗體都表現現出相當的且穩健的活性。Y56和Y57中異二聚化突變的存在對活性沒有負面影響，然而減少鏈錯誤配對。
<110> 賽諾菲(SANOFI)
<120> 具有突變型Fab結構域的多特異性結合蛋白
<130> 617913：SA9-243TW
<140> 108147272
<141> 2019-12-24
<150> EP 19305812.0
<151> 2019-06-21
<150> EP 18306843.6
<151> 2018-12-24
<160> 334
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(25)
<223> 這個序列可以涵蓋1-5個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元
<400> 1
Figure 108147272-A0202-12-0219-1135
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 2
Figure 108147272-A0202-12-0220-1136
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 3
Figure 108147272-A0202-12-0220-1137
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 4
Figure 108147272-A0202-12-0220-1138
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 5
Figure 108147272-A0202-12-0220-1139
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 6
Figure 108147272-A0202-12-0221-1140
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 7
Figure 108147272-A0202-12-0221-1141
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 8
Figure 108147272-A0202-12-0221-1142
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 9
Figure 108147272-A0202-12-0221-2074
Figure 108147272-A0202-12-0222-1144
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 10
Figure 108147272-A0202-12-0222-1145
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 11
Figure 108147272-A0202-12-0222-1146
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 12
Figure 108147272-A0202-12-0222-1147
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 13
Figure 108147272-A0202-12-0223-1148
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 14
Figure 108147272-A0202-12-0223-1149
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 15
Figure 108147272-A0202-12-0223-1150
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 16
Figure 108147272-A0202-12-0223-1151
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 17
Figure 108147272-A0202-12-0224-1152
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 18
Figure 108147272-A0202-12-0224-1153
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 19
Figure 108147272-A0202-12-0224-1154
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 20
Figure 108147272-A0202-12-0224-1155
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 21
Figure 108147272-A0202-12-0225-1156
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 22
Figure 108147272-A0202-12-0225-1157
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(25)
<223> 這個序列可以涵蓋0-5個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元
<400> 23
Figure 108147272-A0202-12-0225-1158
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Figure 108147272-A0202-12-0225-1159
Figure 108147272-A0202-12-0226-1160
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Figure 108147272-A0202-12-0226-1161
<210> 26
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Figure 108147272-A0202-12-0226-1162
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Figure 108147272-A0202-12-0226-1163
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Figure 108147272-A0202-12-0227-1164
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Figure 108147272-A0202-12-0227-1165
<210> 30
<211> 60
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (1)..(60)
<223> 這個序列可以涵蓋0-4個「Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro」重複單元
<400> 30
Figure 108147272-A0202-12-0227-1166
<210> 31
<211> 77
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<222> (18)..(77)
<223> 這個區域可以涵蓋1-4個「Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro」重複單元或者可以完全不存在
<400> 31
Figure 108147272-A0202-12-0228-1167
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Figure 108147272-A0202-12-0228-1168
<210> 33
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 33
Figure 108147272-A0202-12-0228-1169
Figure 108147272-A0202-12-0229-1170
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Figure 108147272-A0202-12-0229-1171
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Figure 108147272-A0202-12-0229-1172
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 36
Figure 108147272-A0202-12-0229-1173
<210> 37
<211> 1130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Figure 108147272-A0202-12-0230-1174
Figure 108147272-A0202-12-0231-1175
Figure 108147272-A0202-12-0232-1176
Figure 108147272-A0202-12-0233-1177
Figure 108147272-A0202-12-0234-1178
Figure 108147272-A0202-12-0235-1179
<210> 38
<211> 1125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Figure 108147272-A0202-12-0235-1180
Figure 108147272-A0202-12-0236-1181
Figure 108147272-A0202-12-0237-1182
Figure 108147272-A0202-12-0238-1183
Figure 108147272-A0202-12-0239-1184
Figure 108147272-A0202-12-0240-1185
<210> 39
<211> 1125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 39
Figure 108147272-A0202-12-0241-1186
Figure 108147272-A0202-12-0242-1187
Figure 108147272-A0202-12-0243-1188
Figure 108147272-A0202-12-0244-1189
Figure 108147272-A0202-12-0245-1190
Figure 108147272-A0202-12-0246-1191
<210> 40
<211> 1125
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 40
Figure 108147272-A0202-12-0246-1192
Figure 108147272-A0202-12-0247-1193
Figure 108147272-A0202-12-0248-1194
Figure 108147272-A0202-12-0249-1195
Figure 108147272-A0202-12-0250-1196
Figure 108147272-A0202-12-0251-1197
Figure 108147272-A0202-12-0252-1198
<210> 41
<211> 1125
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Figure 108147272-A0202-12-0252-1199
Figure 108147272-A0202-12-0253-1200
Figure 108147272-A0202-12-0254-1201
Figure 108147272-A0202-12-0255-1202
Figure 108147272-A0202-12-0256-1203
Figure 108147272-A0202-12-0257-1204
<210> 42
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 42
Figure 108147272-A0202-12-0257-1205
Figure 108147272-A0202-12-0258-1206
Figure 108147272-A0202-12-0259-1207
Figure 108147272-A0202-12-0260-1208
Figure 108147272-A0202-12-0261-1209
Figure 108147272-A0202-12-0262-1210
Figure 108147272-A0202-12-0263-1211
<210> 43
<211> 1125
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 43
Figure 108147272-A0202-12-0263-1212
Figure 108147272-A0202-12-0264-1213
Figure 108147272-A0202-12-0265-1214
Figure 108147272-A0202-12-0266-1215
Figure 108147272-A0202-12-0267-1216
Figure 108147272-A0202-12-0268-1217
<210> 44
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Figure 108147272-A0202-12-0268-1218
Figure 108147272-A0202-12-0269-1219
Figure 108147272-A0202-12-0270-1220
Figure 108147272-A0202-12-0271-1221
Figure 108147272-A0202-12-0272-1222
Figure 108147272-A0202-12-0273-1223
Figure 108147272-A0202-12-0274-1224
<210> 45
<211> 1125
<212> PRT
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<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Figure 108147272-A0202-12-0274-1225
Figure 108147272-A0202-12-0275-1226
Figure 108147272-A0202-12-0276-1227
Figure 108147272-A0202-12-0277-1228
Figure 108147272-A0202-12-0278-1229
Figure 108147272-A0202-12-0279-1230
<210> 46
<211> 1119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 46
Figure 108147272-A0202-12-0280-1231
Figure 108147272-A0202-12-0281-1232
Figure 108147272-A0202-12-0282-1233
Figure 108147272-A0202-12-0283-1234
Figure 108147272-A0202-12-0284-1235
Figure 108147272-A0202-12-0285-1236
<210> 47
<211> 1130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 47
Figure 108147272-A0202-12-0285-1237
Figure 108147272-A0202-12-0286-1238
Figure 108147272-A0202-12-0287-1239
Figure 108147272-A0202-12-0288-1240
Figure 108147272-A0202-12-0289-1241
Figure 108147272-A0202-12-0290-1242
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<211> 1133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 48
Figure 108147272-A0202-12-0291-1243
Figure 108147272-A0202-12-0292-1244
Figure 108147272-A0202-12-0293-1245
Figure 108147272-A0202-12-0294-1246
Figure 108147272-A0202-12-0295-1247
Figure 108147272-A0202-12-0296-1248
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<211> 1133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 49
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Figure 108147272-A0202-12-0297-1250
Figure 108147272-A0202-12-0298-1251
Figure 108147272-A0202-12-0299-1252
Figure 108147272-A0202-12-0300-1253
Figure 108147272-A0202-12-0301-1254
Figure 108147272-A0202-12-0302-1255
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<211> 1133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Figure 108147272-A0202-12-0302-1256
Figure 108147272-A0202-12-0303-1257
Figure 108147272-A0202-12-0304-1258
Figure 108147272-A0202-12-0305-1259
Figure 108147272-A0202-12-0306-1260
Figure 108147272-A0202-12-0307-1261
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<211> 1119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 51
Figure 108147272-A0202-12-0308-1262
Figure 108147272-A0202-12-0309-1263
Figure 108147272-A0202-12-0310-1264
Figure 108147272-A0202-12-0311-1265
Figure 108147272-A0202-12-0312-1266
Figure 108147272-A0202-12-0313-1267
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 52
Figure 108147272-A0202-12-0313-1268
Figure 108147272-A0202-12-0314-1269
Figure 108147272-A0202-12-0315-1270
Figure 108147272-A0202-12-0316-1271
Figure 108147272-A0202-12-0317-1272
Figure 108147272-A0202-12-0318-1273
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<211> 1133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 53
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Figure 108147272-A0202-12-0320-1275
Figure 108147272-A0202-12-0321-1276
Figure 108147272-A0202-12-0322-1277
Figure 108147272-A0202-12-0323-1278
Figure 108147272-A0202-12-0324-1279
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0327-1283
Figure 108147272-A0202-12-0328-1284
Figure 108147272-A0202-12-0329-1285
Figure 108147272-A0202-12-0330-1286
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<212> PRT
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<220>
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<400> 55
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Figure 108147272-A0202-12-0331-1288
Figure 108147272-A0202-12-0332-1289
Figure 108147272-A0202-12-0333-1290
Figure 108147272-A0202-12-0334-1291
Figure 108147272-A0202-12-0335-1292
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0338-1295
Figure 108147272-A0202-12-0339-1296
Figure 108147272-A0202-12-0340-1297
Figure 108147272-A0202-12-0341-1298
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0343-1301
Figure 108147272-A0202-12-0344-1302
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Figure 108147272-A0202-12-0346-1304
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0348-1306
Figure 108147272-A0202-12-0349-1307
Figure 108147272-A0202-12-0350-1308
Figure 108147272-A0202-12-0351-1309
Figure 108147272-A0202-12-0352-1310
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 59
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Figure 108147272-A0202-12-0354-1313
Figure 108147272-A0202-12-0355-1314
Figure 108147272-A0202-12-0356-1315
Figure 108147272-A0202-12-0357-1316
Figure 108147272-A0202-12-0358-1317
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0359-1319
Figure 108147272-A0202-12-0360-1320
Figure 108147272-A0202-12-0361-1321
Figure 108147272-A0202-12-0362-1322
Figure 108147272-A0202-12-0363-1323
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Figure 108147272-A0202-12-0365-1326
Figure 108147272-A0202-12-0366-1327
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Figure 108147272-A0202-12-0371-1333
Figure 108147272-A0202-12-0372-1334
Figure 108147272-A0202-12-0373-1335
Figure 108147272-A0202-12-0374-1336
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Figure 108147272-A0202-12-0375-1338
Figure 108147272-A0202-12-0376-1339
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0377-1341
Figure 108147272-A0202-12-0378-1342
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 65
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Figure 108147272-A0202-12-0379-1344
Figure 108147272-A0202-12-0380-1345
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Figure 108147272-A0202-12-0381-1347
Figure 108147272-A0202-12-0382-1348
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<400> 67
Figure 108147272-A0202-12-0382-1349
Figure 108147272-A0202-12-0383-1350
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Figure 108147272-A0202-12-0385-1352
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 70
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Figure 108147272-A0202-12-0388-1356
Figure 108147272-A0202-12-0389-1357
Figure 108147272-A0202-12-0390-1358
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Figure 108147272-A0202-12-0391-1360
Figure 108147272-A0202-12-0392-1361
Figure 108147272-A0202-12-0393-1362
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<213> 人工序列
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Figure 108147272-A0202-12-0394-1364
Figure 108147272-A0202-12-0395-1365
Figure 108147272-A0202-12-0396-1366
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0396-1367
Figure 108147272-A0202-12-0397-1368
Figure 108147272-A0202-12-0398-1369
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<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 74
Figure 108147272-A0202-12-0399-1370
Figure 108147272-A0202-12-0400-1371
Figure 108147272-A0202-12-0401-1372
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0403-1374
Figure 108147272-A0202-12-0404-1375
<210> 76
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0405-1377
Figure 108147272-A0202-12-0406-1378
Figure 108147272-A0202-12-0407-1379
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 77
Figure 108147272-A0202-12-0407-1380
Figure 108147272-A0202-12-0408-1381
Figure 108147272-A0202-12-0409-1382
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<212> PRT
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<220>
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<400> 78
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Figure 108147272-A0202-12-0411-1384
Figure 108147272-A0202-12-0412-1385
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 79
Figure 108147272-A0202-12-0412-1386
Figure 108147272-A0202-12-0413-1387
Figure 108147272-A0202-12-0414-1388
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0414-1389
Figure 108147272-A0202-12-0415-1390
Figure 108147272-A0202-12-0416-1391
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 81
Figure 108147272-A0202-12-0417-1392
Figure 108147272-A0202-12-0418-1393
Figure 108147272-A0202-12-0419-1394
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 82
Figure 108147272-A0202-12-0419-1395
Figure 108147272-A0202-12-0420-1396
Figure 108147272-A0202-12-0421-1397
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 83
Figure 108147272-A0202-12-0421-1398
Figure 108147272-A0202-12-0422-1399
Figure 108147272-A0202-12-0423-1400
Figure 108147272-A0202-12-0424-1401
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 84
Figure 108147272-A0202-12-0424-1402
Figure 108147272-A0202-12-0425-1403
<210> 85
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 85
Figure 108147272-A0202-12-0425-1404
Figure 108147272-A0202-12-0426-1405
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 86
Figure 108147272-A0202-12-0426-1406
Figure 108147272-A0202-12-0427-1407
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 87
Figure 108147272-A0202-12-0428-1408
Figure 108147272-A0202-12-0429-1409
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 88
Figure 108147272-A0202-12-0429-1410
Figure 108147272-A0202-12-0430-1411
<210> 89
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 89
Figure 108147272-A0202-12-0430-1412
Figure 108147272-A0202-12-0431-1414
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 90
Figure 108147272-A0202-12-0431-1413
Figure 108147272-A0202-12-0432-1415
<210> 91
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 91
Figure 108147272-A0202-12-0433-1416
Figure 108147272-A0202-12-0434-1417
<210> 92
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 92
Figure 108147272-A0202-12-0434-1418
Figure 108147272-A0202-12-0435-1419
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 93
Figure 108147272-A0202-12-0435-1420
Figure 108147272-A0202-12-0436-1422
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 94
Figure 108147272-A0202-12-0436-1421
Figure 108147272-A0202-12-0437-1423
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 95
Figure 108147272-A0202-12-0438-1424
Figure 108147272-A0202-12-0439-1425
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 96
Figure 108147272-A0202-12-0439-1426
Figure 108147272-A0202-12-0440-1427
<210> 97
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 97
Figure 108147272-A0202-12-0440-1428
Figure 108147272-A0202-12-0441-1429
<210> 98
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 98
Figure 108147272-A0202-12-0441-1430
Figure 108147272-A0202-12-0442-1431
<210> 99
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 99
Figure 108147272-A0202-12-0443-1432
Figure 108147272-A0202-12-0444-1433
<210> 100
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 100
Figure 108147272-A0202-12-0444-1434
Figure 108147272-A0202-12-0445-1435
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 101
Figure 108147272-A0202-12-0445-1436
Figure 108147272-A0202-12-0446-1437
<210> 102
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 102
Figure 108147272-A0202-12-0446-1438
Figure 108147272-A0202-12-0447-1439
<210> 103
<211> 214
<212> PRT
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<220>
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<400> 103
Figure 108147272-A0202-12-0447-1440
Figure 108147272-A0202-12-0448-1441
<210> 104
<211> 214
<212> PRT
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<220>
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<400> 104
Figure 108147272-A0202-12-0449-1442
Figure 108147272-A0202-12-0450-1443
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 105
Figure 108147272-A0202-12-0450-1444
Figure 108147272-A0202-12-0451-1445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 106
Figure 108147272-A0202-12-0451-1446
Figure 108147272-A0202-12-0452-1447
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 107
Figure 108147272-A0202-12-0452-1448
Figure 108147272-A0202-12-0453-1449
<210> 108
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 108
Figure 108147272-A0202-12-0454-1450
Figure 108147272-A0202-12-0455-1451
<210> 109
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 109
Figure 108147272-A0202-12-0455-1452
Figure 108147272-A0202-12-0456-1453
<210> 110
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 110
Figure 108147272-A0202-12-0456-1454
Figure 108147272-A0202-12-0457-1455
<210> 111
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 111
Figure 108147272-A0202-12-0457-1456
Figure 108147272-A0202-12-0458-1457
<210> 112
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 112
Figure 108147272-A0202-12-0459-1458
Figure 108147272-A0202-12-0460-1460
<210> 113
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 113
Figure 108147272-A0202-12-0460-1459
Figure 108147272-A0202-12-0461-1461
<210> 114
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 114
Figure 108147272-A0202-12-0461-1462
Figure 108147272-A0202-12-0462-1464
<210> 115
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 115
Figure 108147272-A0202-12-0462-1463
Figure 108147272-A0202-12-0463-1465
<210> 116
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 116
Figure 108147272-A0202-12-0464-1466
Figure 108147272-A0202-12-0465-1467
<210> 117
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 117
Figure 108147272-A0202-12-0465-1468
Figure 108147272-A0202-12-0466-1469
<210> 118
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 118
Figure 108147272-A0202-12-0466-1470
Figure 108147272-A0202-12-0467-1471
<210> 119
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 119
Figure 108147272-A0202-12-0467-1472
Figure 108147272-A0202-12-0468-1473
<210> 120
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 120
Figure 108147272-A0202-12-0469-1474
Figure 108147272-A0202-12-0470-1475
<210> 121
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 121
Figure 108147272-A0202-12-0470-1476
Figure 108147272-A0202-12-0471-1477
<210> 122
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 122
Figure 108147272-A0202-12-0471-1478
Figure 108147272-A0202-12-0472-1479
<210> 123
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 123
Figure 108147272-A0202-12-0472-1480
Figure 108147272-A0202-12-0473-1481
<210> 124
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 124
Figure 108147272-A0202-12-0474-1482
Figure 108147272-A0202-12-0475-1483
<210> 125
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 125
Figure 108147272-A0202-12-0475-1484
Figure 108147272-A0202-12-0476-1486
<210> 126
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 126
Figure 108147272-A0202-12-0476-1485
Figure 108147272-A0202-12-0477-1487
<210> 127
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 127
Figure 108147272-A0202-12-0477-1488
Figure 108147272-A0202-12-0478-1489
<210> 128
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 128
Figure 108147272-A0202-12-0479-1490
Figure 108147272-A0202-12-0480-1491
<210> 129
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 129
Figure 108147272-A0202-12-0480-1492
Figure 108147272-A0202-12-0481-1494
<210> 130
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 130
Figure 108147272-A0202-12-0481-1493
Figure 108147272-A0202-12-0482-1495
<210> 131
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 131
Figure 108147272-A0202-12-0482-1496
Figure 108147272-A0202-12-0483-1497
<210> 132
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 132
Figure 108147272-A0202-12-0484-1498
Figure 108147272-A0202-12-0485-1499
<210> 133
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 133
Figure 108147272-A0202-12-0485-1500
Figure 108147272-A0202-12-0486-1502
<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 134
Figure 108147272-A0202-12-0486-1501
Figure 108147272-A0202-12-0487-1503
<210> 135
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 135
Figure 108147272-A0202-12-0487-1504
Figure 108147272-A0202-12-0488-1505
<210> 136
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 136
Figure 108147272-A0202-12-0489-1506
Figure 108147272-A0202-12-0490-1508
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 137
Figure 108147272-A0202-12-0490-1507
Figure 108147272-A0202-12-0491-1509
<210> 138
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 138
Figure 108147272-A0202-12-0491-1510
Figure 108147272-A0202-12-0492-1512
<210> 139
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 139
Figure 108147272-A0202-12-0492-1511
Figure 108147272-A0202-12-0493-1513
<210> 140
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 140
Figure 108147272-A0202-12-0494-1514
Figure 108147272-A0202-12-0495-1515
<210> 141
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 141
Figure 108147272-A0202-12-0495-1516
Figure 108147272-A0202-12-0496-1517
<210> 142
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 142
Figure 108147272-A0202-12-0496-1518
Figure 108147272-A0202-12-0497-1519
<210> 143
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 143
Figure 108147272-A0202-12-0497-1520
Figure 108147272-A0202-12-0498-1521
<210> 144
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 144
Figure 108147272-A0202-12-0499-1522
Figure 108147272-A0202-12-0500-1523
<210> 145
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 145
Figure 108147272-A0202-12-0500-1524
Figure 108147272-A0202-12-0501-1526
<210> 146
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 146
Figure 108147272-A0202-12-0501-1525
Figure 108147272-A0202-12-0502-1527
<210> 147
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 147
Figure 108147272-A0202-12-0502-1528
Figure 108147272-A0202-12-0503-1529
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 148
Figure 108147272-A0202-12-0503-1530
Figure 108147272-A0202-12-0504-1531
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 149
Figure 108147272-A0202-12-0505-1532
Figure 108147272-A0202-12-0506-1533
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 150
Figure 108147272-A0202-12-0506-1534
Figure 108147272-A0202-12-0507-1535
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<211> 214
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 151
Figure 108147272-A0202-12-0507-1536
Figure 108147272-A0202-12-0508-1537
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 152
Figure 108147272-A0202-12-0508-1538
Figure 108147272-A0202-12-0509-1539
Figure 108147272-A0202-12-0510-1540
Figure 108147272-A0202-12-0511-1541
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0511-1542
Figure 108147272-A0202-12-0512-1543
Figure 108147272-A0202-12-0513-1544
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 154
Figure 108147272-A0202-12-0513-1545
Figure 108147272-A0202-12-0514-1546
Figure 108147272-A0202-12-0515-1547
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0515-1548
Figure 108147272-A0202-12-0516-1549
Figure 108147272-A0202-12-0517-1550
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0518-1551
Figure 108147272-A0202-12-0519-1552
Figure 108147272-A0202-12-0520-1553
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0520-1554
Figure 108147272-A0202-12-0521-1555
Figure 108147272-A0202-12-0522-1556
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0522-1557
Figure 108147272-A0202-12-0523-1558
Figure 108147272-A0202-12-0524-1559
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0525-1560
Figure 108147272-A0202-12-0526-1561
Figure 108147272-A0202-12-0527-1562
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0527-1563
Figure 108147272-A0202-12-0528-1564
Figure 108147272-A0202-12-0529-1565
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Figure 108147272-A0202-12-0529-1566
Figure 108147272-A0202-12-0530-1567
Figure 108147272-A0202-12-0531-1568
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Figure 108147272-A0202-12-0531-1569
Figure 108147272-A0202-12-0532-1570
Figure 108147272-A0202-12-0533-1571
Figure 108147272-A0202-12-0534-1572
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0534-1573
Figure 108147272-A0202-12-0535-1574
Figure 108147272-A0202-12-0536-1575
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 164
Figure 108147272-A0202-12-0536-1576
Figure 108147272-A0202-12-0537-1577
Figure 108147272-A0202-12-0538-1578
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 165
Figure 108147272-A0202-12-0538-1579
Figure 108147272-A0202-12-0539-1580
Figure 108147272-A0202-12-0540-1581
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0541-1582
Figure 108147272-A0202-12-0542-1583
Figure 108147272-A0202-12-0543-1584
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0543-1585
Figure 108147272-A0202-12-0544-1586
Figure 108147272-A0202-12-0545-1587
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0545-1588
Figure 108147272-A0202-12-0546-1589
Figure 108147272-A0202-12-0547-1590
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0548-1591
Figure 108147272-A0202-12-0549-1592
Figure 108147272-A0202-12-0550-1593
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0550-1594
Figure 108147272-A0202-12-0551-1595
Figure 108147272-A0202-12-0552-1596
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0552-1597
Figure 108147272-A0202-12-0553-1598
Figure 108147272-A0202-12-0554-1599
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0556-1601
Figure 108147272-A0202-12-0557-1602
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 108147272-A0202-12-0557-1603
Figure 108147272-A0202-12-0558-1604
Figure 108147272-A0202-12-0559-1605
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 108147272-A0202-12-0559-1606
Figure 108147272-A0202-12-0560-1607
Figure 108147272-A0202-12-0561-1608
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0562-1609
Figure 108147272-A0202-12-0563-1610
Figure 108147272-A0202-12-0564-1611
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0565-1613
Figure 108147272-A0202-12-0566-1614
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0567-1616
Figure 108147272-A0202-12-0568-1617
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Figure 108147272-A0202-12-0569-1618
Figure 108147272-A0202-12-0570-1619
Figure 108147272-A0202-12-0571-1620
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0572-1622
Figure 108147272-A0202-12-0573-1623
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Figure 108147272-A0202-12-0574-1625
Figure 108147272-A0202-12-0575-1626
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0577-1628
Figure 108147272-A0202-12-0578-1629
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0579-1631
Figure 108147272-A0202-12-0580-1632
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<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0580-1633
Figure 108147272-A0202-12-0581-1634
Figure 108147272-A0202-12-0582-1635
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0583-1636
Figure 108147272-A0202-12-0584-1637
Figure 108147272-A0202-12-0585-1638
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 185
Figure 108147272-A0202-12-0585-1639
Figure 108147272-A0202-12-0586-1640
Figure 108147272-A0202-12-0587-1641
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0587-1642
Figure 108147272-A0202-12-0588-1643
Figure 108147272-A0202-12-0589-1644
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0590-1645
Figure 108147272-A0202-12-0591-1646
Figure 108147272-A0202-12-0592-1647
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0592-1648
Figure 108147272-A0202-12-0593-1649
Figure 108147272-A0202-12-0594-1650
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0594-1651
Figure 108147272-A0202-12-0595-1652
Figure 108147272-A0202-12-0596-1653
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0597-1654
Figure 108147272-A0202-12-0598-1655
Figure 108147272-A0202-12-0599-1656
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0599-1657
Figure 108147272-A0202-12-0600-1658
Figure 108147272-A0202-12-0601-1659
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0601-1660
Figure 108147272-A0202-12-0602-1661
Figure 108147272-A0202-12-0603-1662
<210> 193
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 193
Figure 108147272-A0202-12-0604-1663
Figure 108147272-A0202-12-0605-1664
Figure 108147272-A0202-12-0606-1665
<210> 194
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 194
Figure 108147272-A0202-12-0606-1666
Figure 108147272-A0202-12-0607-1667
Figure 108147272-A0202-12-0608-1668
<210> 195
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 195
Figure 108147272-A0202-12-0608-1669
Figure 108147272-A0202-12-0609-1670
Figure 108147272-A0202-12-0610-1671
<210> 196
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 196
Figure 108147272-A0202-12-0611-1672
Figure 108147272-A0202-12-0612-1673
Figure 108147272-A0202-12-0613-1674
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 197
Figure 108147272-A0202-12-0613-1675
Figure 108147272-A0202-12-0614-1676
Figure 108147272-A0202-12-0615-1677
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 198
Figure 108147272-A0202-12-0615-1678
Figure 108147272-A0202-12-0616-1679
Figure 108147272-A0202-12-0617-1680
Figure 108147272-A0202-12-0618-1682
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 199
Figure 108147272-A0202-12-0618-1681
Figure 108147272-A0202-12-0619-1683
Figure 108147272-A0202-12-0620-1684
<210> 200
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 200
Figure 108147272-A0202-12-0620-1685
Figure 108147272-A0202-12-0621-1686
Figure 108147272-A0202-12-0622-1687
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0623-1688
Figure 108147272-A0202-12-0624-1689
Figure 108147272-A0202-12-0625-1690
<210> 202
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0625-1691
Figure 108147272-A0202-12-0626-1692
Figure 108147272-A0202-12-0627-1693
<210> 203
<211> 455
<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0627-1694
Figure 108147272-A0202-12-0628-1695
Figure 108147272-A0202-12-0629-1696
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<211> 455
<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0630-1697
Figure 108147272-A0202-12-0631-1698
Figure 108147272-A0202-12-0632-1699
<210> 205
<211> 455
<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0632-1700
Figure 108147272-A0202-12-0633-1701
Figure 108147272-A0202-12-0634-1702
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0634-1703
Figure 108147272-A0202-12-0635-1704
Figure 108147272-A0202-12-0636-1705
Figure 108147272-A0202-12-0637-1706
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0637-1707
Figure 108147272-A0202-12-0638-1708
Figure 108147272-A0202-12-0639-1709
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Figure 108147272-A0202-12-0639-1710
Figure 108147272-A0202-12-0640-1711
Figure 108147272-A0202-12-0641-1712
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<211> 442
<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0642-1713
Figure 108147272-A0202-12-0643-1714
Figure 108147272-A0202-12-0644-1715
<210> 210
<211> 442
<212> PRT
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Figure 108147272-A0202-12-0644-1716
Figure 108147272-A0202-12-0645-1717
Figure 108147272-A0202-12-0646-1718
<210> 211
<211> 442
<212> PRT
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<220>
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<400> 211
Figure 108147272-A0202-12-0646-1719
Figure 108147272-A0202-12-0647-1720
Figure 108147272-A0202-12-0648-1721
<210> 212
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 212
Figure 108147272-A0202-12-0648-1722
Figure 108147272-A0202-12-0649-1723
Figure 108147272-A0202-12-0650-1724
Figure 108147272-A0202-12-0651-1725
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<212> PRT
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<220>
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<400> 213
Figure 108147272-A0202-12-0651-1726
Figure 108147272-A0202-12-0652-1727
<210> 214
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0652-1728
Figure 108147272-A0202-12-0653-1729
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 215
Figure 108147272-A0202-12-0653-1730
Figure 108147272-A0202-12-0654-1731
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<211> 214
<212> PRT
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<220>
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<400> 216
Figure 108147272-A0202-12-0654-1732
Figure 108147272-A0202-12-0655-1733
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<212> PRT
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<220>
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<400> 217
Figure 108147272-A0202-12-0656-1734
Figure 108147272-A0202-12-0657-1736
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 218
Figure 108147272-A0202-12-0657-1735
Figure 108147272-A0202-12-0658-1737
<210> 219
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 219
Figure 108147272-A0202-12-0658-1738
Figure 108147272-A0202-12-0659-1739
<210> 220
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 220
Figure 108147272-A0202-12-0659-1740
Figure 108147272-A0202-12-0660-1741
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<211> 214
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0661-1742
Figure 108147272-A0202-12-0662-1743
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 222
Figure 108147272-A0202-12-0662-1744
Figure 108147272-A0202-12-0663-1745
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 223
Figure 108147272-A0202-12-0663-1746
Figure 108147272-A0202-12-0664-1747
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 224
Figure 108147272-A0202-12-0664-1748
Figure 108147272-A0202-12-0665-1749
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 225
Figure 108147272-A0202-12-0666-1750
Figure 108147272-A0202-12-0667-1751
Figure 108147272-A0202-12-0668-1752
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<211> 446
<212> PRT
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<400> 226
Figure 108147272-A0202-12-0668-1753
Figure 108147272-A0202-12-0669-1754
Figure 108147272-A0202-12-0670-1755
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 227
Figure 108147272-A0202-12-0670-1756
Figure 108147272-A0202-12-0671-1757
Figure 108147272-A0202-12-0672-1758
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 228
Figure 108147272-A0202-12-0673-1759
Figure 108147272-A0202-12-0674-1760
Figure 108147272-A0202-12-0675-1761
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 229
Figure 108147272-A0202-12-0675-1762
Figure 108147272-A0202-12-0676-1763
Figure 108147272-A0202-12-0677-1764
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 230
Figure 108147272-A0202-12-0677-1765
Figure 108147272-A0202-12-0678-1766
Figure 108147272-A0202-12-0679-1767
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 231
Figure 108147272-A0202-12-0679-1768
Figure 108147272-A0202-12-0680-1769
Figure 108147272-A0202-12-0681-1770
Figure 108147272-A0202-12-0682-1771
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 232
Figure 108147272-A0202-12-0682-1772
Figure 108147272-A0202-12-0683-1773
Figure 108147272-A0202-12-0684-1774
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 233
Figure 108147272-A0202-12-0684-1775
Figure 108147272-A0202-12-0685-1776
Figure 108147272-A0202-12-0686-1777
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 234
Figure 108147272-A0202-12-0686-1778
Figure 108147272-A0202-12-0687-1779
Figure 108147272-A0202-12-0688-1780
<210> 235
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 235
Figure 108147272-A0202-12-0689-1781
Figure 108147272-A0202-12-0690-1782
Figure 108147272-A0202-12-0691-1783
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 236
Figure 108147272-A0202-12-0691-1784
Figure 108147272-A0202-12-0692-1785
Figure 108147272-A0202-12-0693-1786
<210> 237
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 237
Figure 108147272-A0202-12-0693-1787
Figure 108147272-A0202-12-0694-1788
Figure 108147272-A0202-12-0695-1789
<210> 238
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 238
Figure 108147272-A0202-12-0696-1790
Figure 108147272-A0202-12-0697-1791
Figure 108147272-A0202-12-0698-1792
<210> 239
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 239
Figure 108147272-A0202-12-0698-1793
Figure 108147272-A0202-12-0699-1794
Figure 108147272-A0202-12-0700-1795
<210> 240
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 240
Figure 108147272-A0202-12-0700-1796
Figure 108147272-A0202-12-0701-1797
Figure 108147272-A0202-12-0702-1798
<210> 241
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 241
Figure 108147272-A0202-12-0702-1799
Figure 108147272-A0202-12-0703-1800
Figure 108147272-A0202-12-0704-1801
Figure 108147272-A0202-12-0705-1802
<210> 242
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 242
Figure 108147272-A0202-12-0705-1803
Figure 108147272-A0202-12-0706-1804
Figure 108147272-A0202-12-0707-1805
< 210> 243
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 243
Figure 108147272-A0202-12-0707-1806
Figure 108147272-A0202-12-0708-1807
Figure 108147272-A0202-12-0709-1808
<210> 244
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 244
Figure 108147272-A0202-12-0709-1809
Figure 108147272-A0202-12-0710-1810
Figure 108147272-A0202-12-0711-1811
<210> 245
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 245
Figure 108147272-A0202-12-0712-1812
Figure 108147272-A0202-12-0713-1813
Figure 108147272-A0202-12-0714-1814
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 246
Figure 108147272-A0202-12-0714-1815
Figure 108147272-A0202-12-0715-1816
Figure 108147272-A0202-12-0716-1817
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 247
Figure 108147272-A0202-12-0716-1818
Figure 108147272-A0202-12-0717-1819
Figure 108147272-A0202-12-0718-1820
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 248
Figure 108147272-A0202-12-0719-1821
Figure 108147272-A0202-12-0720-1822
Figure 108147272-A0202-12-0721-1823
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<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 249
Figure 108147272-A0202-12-0721-1824
Figure 108147272-A0202-12-0722-1825
Figure 108147272-A0202-12-0723-1826
<210> 250
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 250
Figure 108147272-A0202-12-0723-1827
Figure 108147272-A0202-12-0724-1828
Figure 108147272-A0202-12-0725-1829
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 251
Figure 108147272-A0202-12-0725-1830
Figure 108147272-A0202-12-0726-1831
Figure 108147272-A0202-12-0727-1832
Figure 108147272-A0202-12-0728-1833
<210> 252
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 252
Figure 108147272-A0202-12-0728-1834
Figure 108147272-A0202-12-0729-1835
Figure 108147272-A0202-12-0730-1836
<210> 253
<211> 447
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 253
Figure 108147272-A0202-12-0730-1837
Figure 108147272-A0202-12-0731-1838
Figure 108147272-A0202-12-0732-1839
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 254
Figure 108147272-A0202-12-0732-1840
Figure 108147272-A0202-12-0733-1841
Figure 108147272-A0202-12-0734-1842
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<211> 453
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 255
Figure 108147272-A0202-12-0735-1843
Figure 108147272-A0202-12-0736-1844
Figure 108147272-A0202-12-0737-1845
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<211> 453
<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0737-1846
Figure 108147272-A0202-12-0738-1847
Figure 108147272-A0202-12-0739-1848
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<211> 453
<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0739-1849
Figure 108147272-A0202-12-0740-1850
Figure 108147272-A0202-12-0741-1851
Figure 108147272-A0202-12-0742-1852
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<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 258
Figure 108147272-A0202-12-0742-1853
Figure 108147272-A0202-12-0743-1854
Figure 108147272-A0202-12-0744-1855
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<212> PRT
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<400> 259
Figure 108147272-A0202-12-0744-1856
Figure 108147272-A0202-12-0745-1857
Figure 108147272-A0202-12-0746-1858
<210> 260
<211> 453
<212> PRT
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<220>
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<400> 260
Figure 108147272-A0202-12-0747-1859
Figure 108147272-A0202-12-0748-1860
Figure 108147272-A0202-12-0749-1861
<210> 261
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 261
Figure 108147272-A0202-12-0749-1862
Figure 108147272-A0202-12-0750-1863
Figure 108147272-A0202-12-0751-1864
<210> 262
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Figure 108147272-A0202-12-0751-1865
Figure 108147272-A0202-12-0752-1866
Figure 108147272-A0202-12-0753-1867
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0754-1868
Figure 108147272-A0202-12-0755-1869
Figure 108147272-A0202-12-0756-1870
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<212> PRT
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<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0756-1871
Figure 108147272-A0202-12-0757-1872
Figure 108147272-A0202-12-0758-1873
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<211> 447
<212> PRT
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<220>
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<400> 265
Figure 108147272-A0202-12-0758-1874
Figure 108147272-A0202-12-0759-1875
Figure 108147272-A0202-12-0760-1876
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<211> 447
<212> PRT
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<400> 266
Figure 108147272-A0202-12-0760-1877
Figure 108147272-A0202-12-0761-1878
Figure 108147272-A0202-12-0762-1879
Figure 108147272-A0202-12-0763-1880
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 267
Figure 108147272-A0202-12-0763-1881
Figure 108147272-A0202-12-0764-1882
Figure 108147272-A0202-12-0765-1883
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 108147272-A0202-12-0765-1884
Figure 108147272-A0202-12-0766-1885
Figure 108147272-A0202-12-0767-1886
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 269
Figure 108147272-A0202-12-0768-1887
Figure 108147272-A0202-12-0769-1888
Figure 108147272-A0202-12-0770-1889
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<212> PRT
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<220>
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<400> 270
Figure 108147272-A0202-12-0770-1890
Figure 108147272-A0202-12-0771-1891
Figure 108147272-A0202-12-0772-1892
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<211> 446
<212> PRT
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<400> 271
Figure 108147272-A0202-12-0772-1893
Figure 108147272-A0202-12-0773-1894
Figure 108147272-A0202-12-0774-1895
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<212> PRT
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<400> 272
Figure 108147272-A0202-12-0774-1896
Figure 108147272-A0202-12-0775-1897
Figure 108147272-A0202-12-0776-1898
Figure 108147272-A0202-12-0777-1899
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<212> PRT
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<220>
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<400> 273
Figure 108147272-A0202-12-0777-1900
Figure 108147272-A0202-12-0778-1901
Figure 108147272-A0202-12-0779-1902
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<212> PRT
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<220>
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<400> 274
Figure 108147272-A0202-12-0779-1903
Figure 108147272-A0202-12-0780-1904
Figure 108147272-A0202-12-0781-1905
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<212> PRT
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<220>
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<400> 275
Figure 108147272-A0202-12-0781-1906
Figure 108147272-A0202-12-0782-1907
Figure 108147272-A0202-12-0783-1908
Figure 108147272-A0202-12-0784-1909
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 276
Figure 108147272-A0202-12-0784-1910
Figure 108147272-A0202-12-0785-1911
Figure 108147272-A0202-12-0786-1912
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 277
Figure 108147272-A0202-12-0786-1913
Figure 108147272-A0202-12-0787-1914
Figure 108147272-A0202-12-0788-1915
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 278
Figure 108147272-A0202-12-0789-1916
Figure 108147272-A0202-12-0790-1917
Figure 108147272-A0202-12-0791-1918
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 279
Figure 108147272-A0202-12-0791-1919
Figure 108147272-A0202-12-0792-1920
Figure 108147272-A0202-12-0793-1921
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<212> PRT
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<220>
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<400> 280
Figure 108147272-A0202-12-0793-1922
Figure 108147272-A0202-12-0794-1923
Figure 108147272-A0202-12-0795-1924
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<211> 451
<212> PRT
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<220>
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<400> 281
Figure 108147272-A0202-12-0796-1925
Figure 108147272-A0202-12-0797-1926
Figure 108147272-A0202-12-0798-1927
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<212> PRT
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<220>
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<400> 282
Figure 108147272-A0202-12-0798-1928
Figure 108147272-A0202-12-0799-1929
Figure 108147272-A0202-12-0800-1930
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<211> 451
<212> PRT
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<220>
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<400> 283
Figure 108147272-A0202-12-0800-1931
Figure 108147272-A0202-12-0801-1932
Figure 108147272-A0202-12-0802-1933
Figure 108147272-A0202-12-0803-1934
<210> 284
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 284
Figure 108147272-A0202-12-0803-1935
Figure 108147272-A0202-12-0804-1936
Figure 108147272-A0202-12-0805-1937
<210> 285
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 285
Figure 108147272-A0202-12-0805-1938
Figure 108147272-A0202-12-0806-1939
Figure 108147272-A0202-12-0807-1940
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 286
Figure 108147272-A0202-12-0808-1941
Figure 108147272-A0202-12-0809-1942
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 287
Figure 108147272-A0202-12-0809-1943
Figure 108147272-A0202-12-0810-1944
<210> 288
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 288
Figure 108147272-A0202-12-0810-1945
Figure 108147272-A0202-12-0811-1946
<210> 289
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 289
Figure 108147272-A0202-12-0811-1947
Figure 108147272-A0202-12-0812-1948
<210> 290
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 290
Figure 108147272-A0202-12-0813-1949
Figure 108147272-A0202-12-0814-1950
<210> 291
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 291
Figure 108147272-A0202-12-0814-1951
Figure 108147272-A0202-12-0815-1952
<210> 292
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 292
Figure 108147272-A0202-12-0815-1953
Figure 108147272-A0202-12-0816-1954
<210> 293
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 293
Figure 108147272-A0202-12-0816-1955
Figure 108147272-A0202-12-0817-1956
<210> 294
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 294
Figure 108147272-A0202-12-0818-1957
Figure 108147272-A0202-12-0819-1958
<210> 295
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 295
Figure 108147272-A0202-12-0819-1959
Figure 108147272-A0202-12-0820-1960
<210> 296
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 296
Figure 108147272-A0202-12-0820-1961
Figure 108147272-A0202-12-0821-1962
<210> 297
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 297
Figure 108147272-A0202-12-0821-1963
Figure 108147272-A0202-12-0822-1964
<210> 298
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 298
Figure 108147272-A0202-12-0823-1965
Figure 108147272-A0202-12-0824-1966
<210> 299
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 299
Figure 108147272-A0202-12-0824-1967
Figure 108147272-A0202-12-0825-1968
<210> 300
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 300
Figure 108147272-A0202-12-0825-1969
Figure 108147272-A0202-12-0826-1970
<210> 301
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 301
Figure 108147272-A0202-12-0826-1971
Figure 108147272-A0202-12-0827-1972
<210> 302
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 302
Figure 108147272-A0202-12-0828-1973
Figure 108147272-A0202-12-0829-1974
<210> 303
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 303
Figure 108147272-A0202-12-0829-1975
Figure 108147272-A0202-12-0830-1976
<210> 304
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 304
Figure 108147272-A0202-12-0830-1977
Figure 108147272-A0202-12-0831-1978
<210> 305
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 305
Figure 108147272-A0202-12-0831-1979
Figure 108147272-A0202-12-0832-1980
<210> 306
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 306
Figure 108147272-A0202-12-0832-1981
Figure 108147272-A0202-12-0833-1982
<210> 307
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 307
Figure 108147272-A0202-12-0834-1983
Figure 108147272-A0202-12-0835-1984
<210> 308
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 308
Figure 108147272-A0202-12-0835-1985
Figure 108147272-A0202-12-0836-1986
<210> 309
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 309
Figure 108147272-A0202-12-0836-1987
Figure 108147272-A0202-12-0837-1988
<210> 310
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 310
Figure 108147272-A0202-12-0837-1989
Figure 108147272-A0202-12-0838-1990
<210> 311
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 311
Figure 108147272-A0202-12-0839-1991
Figure 108147272-A0202-12-0840-1993
<210> 312
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 312
Figure 108147272-A0202-12-0840-1992
Figure 108147272-A0202-12-0841-1994
<210> 313
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 313
Figure 108147272-A0202-12-0841-1995
Figure 108147272-A0202-12-0842-1997
<210> 314
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 314
Figure 108147272-A0202-12-0842-1996
Figure 108147272-A0202-12-0843-1998
<210> 315
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 315
Figure 108147272-A0202-12-0844-1999
Figure 108147272-A0202-12-0845-2001
<210> 316
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 316
Figure 108147272-A0202-12-0845-2000
Figure 108147272-A0202-12-0846-2002
<210> 317
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 317
Figure 108147272-A0202-12-0846-2003
Figure 108147272-A0202-12-0847-2005
<210> 318
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 318
Figure 108147272-A0202-12-0847-2004
Figure 108147272-A0202-12-0848-2006
<210> 319
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 319
Figure 108147272-A0202-12-0849-2007
Figure 108147272-A0202-12-0850-2009
<210> 320
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 320
Figure 108147272-A0202-12-0850-2008
Figure 108147272-A0202-12-0851-2010
<210> 321
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 321
Figure 108147272-A0202-12-0851-2011
Figure 108147272-A0202-12-0852-2012
<210> 322
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 322
Figure 108147272-A0202-12-0852-2013
Figure 108147272-A0202-12-0853-2014
<210> 323
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 323
Figure 108147272-A0202-12-0854-2015
Figure 108147272-A0202-12-0855-2016
<210> 324
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 324
Figure 108147272-A0202-12-0855-2017
Figure 108147272-A0202-12-0856-2019
<210> 325
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 325
Figure 108147272-A0202-12-0856-2018
Figure 108147272-A0202-12-0857-2020
<210> 326
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 326
Figure 108147272-A0202-12-0857-2021
Figure 108147272-A0202-12-0858-2022
<210> 327
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 327
Figure 108147272-A0202-12-0859-2023
Figure 108147272-A0202-12-0860-2024
<210> 328
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 328
Figure 108147272-A0202-12-0860-2025
Figure 108147272-A0202-12-0861-2026
<210> 329
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 329
Figure 108147272-A0202-12-0861-2027
Figure 108147272-A0202-12-0862-2028
<210> 330
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 330
Figure 108147272-A0202-12-0862-2029
Figure 108147272-A0202-12-0863-2030
<210> 331
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 331
Figure 108147272-A0202-12-0864-2031
Figure 108147272-A0202-12-0865-2032
<210> 332
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 332
Figure 108147272-A0202-12-0865-2033
Figure 108147272-A0202-12-0866-2075
<210> 333
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 333
Figure 108147272-A0202-12-0866-2076
Figure 108147272-A0202-12-0867-2077
<210> 334
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 334
Figure 108147272-A0202-12-0867-2078
Figure 108147272-A0202-12-0868-2079

Claims (30)

  1. 一種多特異性抗原結合蛋白，所述多特異性抗原結合蛋白包含至少兩個VL區以及至少兩個CH1區，所述至少兩個VL區與至少兩個VH區分別配對以形成至少兩個抗原結合位點，所述至少兩個CH1區與兩個CL區分別配對，其中至少一個CH1/CL對包含選自以下中的一個或多個的CH1/CL突變以促進配對：
    (1)T192E(CH1)突變以及N137K和S114A(CL)突變，和
    (2)L143Q和S188V(CH1)突變、以及V133T和S176V(CL)突變，和
    (3)T192E、L143Q和S188V(CH1)突變以及N137K、S114A、V133T和S176V(CL)突變，
    (4)K221E(CH1)突變以及E123K(CL)突變，
    (5)T192E和K221E(CH1)突變以及N137K、S114A和E123K(CL)突變，
    (6)L143E、L143D、L143K、L143R或L143H(CH1)突變以及S176E、S176D、S176K、S176R或S176H(CL)突變，
    (7)L124E、L124D、L124K、L124R或L124H(CH1)突變以及V133E、V133D、V133K、V133R或V133H(CL)突變，
    (8)K228D(CH1)突變以及D122K(CL)突變，和
    (9)K221E和K228D(CH1)突變以及D122K和E123K(CL)突變，
    其中當兩個CH1/CL對包含突變以促進兩個不同VH/VL對的配對時，所述兩個CH1/CL對不包含相同的突變，並且
    其中至少一個VH/VL對包含帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且
    其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷。
  2. 一種多特異性抗原結合蛋白，所述多特異性抗原結合蛋白包含：
    a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含：
    (1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
    (2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)；和
    (3)第一異二聚化結構域(HD1)；以及
    b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含：
    (4)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；
    (5)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)；和
    (6)第二異二聚化結構域(HD2)；
    其中HD1和HD2發生異二聚化，
    其中VL1和VH1對中的至少一個或兩個以及VL2和VH2對中的至少一個或兩個包含帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，
    其中CL1和CH1-1對中的至少一個或兩個以及CL2和CH1-2對中的至少一個或兩個包含突變以促進配對，並且
    其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，CH1-1和CL1中促進配對的突變與CH1-2和CL2中促進配對的突變是不同的。
  3. 如請求項1所述的多特異性抗原結合蛋白，其中至少一個CH1區與異二聚化結構域可操作地連接。
  4. 一種多特異性抗原結合蛋白，所述多特異性抗原結合蛋白包含至少兩條多肽鏈並形成至少兩個抗原結合位點，其中一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
    VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
    並且一條多肽鏈包含由下式表示的結構：
    VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II]
    其中：
    VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
    VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
    VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
    VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
    CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
    CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；並且
    L2、L3和L4是胺基酸連接子，
    其中VH1與VL1配對，VH2與VL2配對，並且CH1與CL配對，
    其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
    其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
    其中VL1和VH1對中的至少一個或兩個以及VL2和VH2對中的至少一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，
    其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，並且
    其中所述CH1和CL結構域對包含促進配對的突變。
  5. 一種多特異性抗原結合蛋白，所述多特異性抗原結合蛋白包含形成四個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
    VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
    並且兩條多肽鏈各自包含由下式表示的結構：
    VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II]
    其中：
    VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
    VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
    VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
    VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
    CL是免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
    CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
    Fc包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恆定結構域；並且
    L2、L3和L4是胺基酸連接子，
    其中VH1與VL1配對以形成第一抗原結合位點，VH2與VL2配對以形成第二抗原結合位點，並且CH1與CL配對，
    其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，
    其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
    其中所述VL1和VH1對以及所述VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、 K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，並且
    其中所述CH1和CL結構域對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
    其中當至少兩個CH1/CL對包含突變以促進配對時，則在一個CH1/CL對中的突變組與在另一個CH1/CL對中的突變組是不同的。
  6. 一種多特異性抗原結合蛋白，所述多特異性抗原結合蛋白包含形成三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中
    第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
    VL2-L1-VL1-L2-CL1 [I]，
    第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
    VH1-L3-VH2-L4-CH1-1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]，
    第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
    VH3-CH1-2-鉸鏈-CH2-CH3 [III]，並且
    第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
    VL3-CL2 [IV]，
    其中：
    VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
    VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
    VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
    VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
    VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
    VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
    CL1是第一免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
    CL2是第二免疫球蛋白輕鏈恆定結構域；
    CH1-1是第一免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
    CH1-2是第二免疫球蛋白CH1重鏈恆定結構域；
    CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恆定結構域；
    CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恆定結構域；
    鉸鏈是連接所述CH1結構域和所述CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
    L2、L3和L4是胺基酸連接子，
    其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對，並且
    其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對、VH2/VL2對和VH3/VL3對中的一個或多個中以形成一個或多個雙硫鍵，
    其中所述VL1和VH1對以及所述VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，
    其中所述CL1和CH1-1對以及所述CL2和CH1-2對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
    其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，在CH1-1和CL1中的突變與在CH1-2和CL2中的突變是不同的。
  7. 一種多特異性抗原結合蛋白，所述多特異性抗原結合蛋白包含
    a)第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對，所述第一輕鏈(LC1)/重鏈(HC1)對包含：
    (1)第一VL區(VL1)，所述第一VL區(VL1)與第一VH區(VH1)配對以形成第一抗原結合位點；
    (2)與VH1可操作地連接的第一恆定重鏈區1(CH1-1)和與VL1可操作地連接的第一恆定輕鏈區(CL1)，以及
    b)第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對，所述第二輕鏈(LC2)/重鏈(HC2)對包含：
    (3)第二VL區(VL2)，所述第二VL區(VL2)與第二VH區(VH2)配對以形成第二抗原結合位點；和
    (4)與VH2可操作地連接的第二恆定重鏈區1(CH1-2)和與VL2可操作地連接的第二恆定輕鏈區(CL2)，
    其中CH1-1的C末端與VH2的N末端可操作地連接，
    其中一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到VH1/VL1對和VH2/VL2對中的一個或兩個中以形成一個或多個雙硫鍵，
    其中所述VL1和VH1對中的一個或兩個以及所述VL2和VH2對中的一個或兩個包含促進配對的帶相反電荷的突變，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷，
    其中所述CL1和CH1-1對中的一個或兩個以及所述CL2和CH1-2對中的一個或兩個包含促進配對的突變，並且
    其中當CL1和CH1-1對中的兩個以及CL2和CH1-2對中的兩個都包含突變以促進配對時，在CH1-1和CL1中的突變與在CH1-2和CL2中的突變是不同的。
  8. 如請求項2至7中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含T192E突變，並且CL包含N137K和S114A突變。
  9. 如請求項2至8中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含L143Q和S188V突變，並且CL包含V133T和S176V突變。
  10. 如請求項2至9中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含T192E、L143Q和S188V突變，並且CL包含N137K、S114A、V133T和S176V 突變。
  11. 如請求項2至10中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含K221E突變，並且CL包含E123K突變。
  12. 如請求項2至11中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含K228D突變，並且CL包含D122K突變。
  13. 如請求項2至12中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含K221E和K228D突變，並且CL包含D122K和E123K突變。
  14. 如請求項2至13中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變，並且CL包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變。
  15. 如請求項2至14中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中CH1包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變，並且CL包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變。
  16. 如請求項2至15中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中VH包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突變，並且VL包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突變。
  17. 如請求項2至16中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，其中至少一個CH1/CL對包含選自以下中的一個或多個的CH1/CL突變以促進配對：
    (1)T192E(CH1)突變以及N137K和S114A(CL)突變，
    (2)L143Q和S188V(CH1)突變、以及V133T和S176V(CL)突變，
    (3)T192E、L143Q和S188V(CH1)突變以及N137K、S114A、V133T和S176V(CL)突變，
    (4)K221E(CH1)突變以及E123K(CL)突變，
    (5)T192E和K221E(CH1)突變以及N137K、S114A和E123K(CL)突變，
    (6)L143E、L143D、L143K、L143R或L143H(CH1)突變以及S176E、S176D、S176K、S176R或S176H(CL)突變，
    (7)L124E、L124D、L124K、L124R或L124H(CH1)突變以及V133E、V133D、V133K、V133R或V133H(CL)突變，
    (8)K228D(CH1)突變以及D122K(CL)突變，和
    (9)K221E和K228D(CH1)突變以及D122K和E123K(CL)突變，
    其中當至少兩個CH1/CL對包含突變組以促進兩個不同VH/VL對的配對時，則所述至少兩個CH1/CL對不包含相同的突變，並且
    其中至少一個VH/VL對包含帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷。
  18. 一種抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包含：
    抗原結合結構域；和
    與恆定輕鏈CL區配對的恆定重鏈CH1區，
    其中所述抗原結合結構域選擇性地結合目標抗原，並且其中所述CH1區和所述CL區包含以下中的一個或兩個：
    a)所述CH1區中的L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變以及所述CL區中的S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變；和
    b)所述CH1區中的L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突變以及所述CL區中的V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突變，
    其中所述CH1區中的突變殘基與所述CL區中的突變殘基具有相反電荷。
  19. 如請求項18所述的抗原結合蛋白，進一步包含選自以下中的一個或多個的CH1/CL突變以促進配對：
    (1)T192E(CH1)突變以及N137K和S114A(CL)突變，
    (2)L143Q和S188V(CH1)突變、以及V133T和S176V(CL)突變，
    (3)T192E、L143Q和S188V(CH1)突變以及N137K、S114A、V133T和S176V(CL)突變，
    (4)K221E(CH1)突變以及E123K(CL)突變，
    (5)K228D(CH1)突變以及D122K(CL)突變，和
    (6)K221E和K228D(CH1)突變以及D122K和E123K(CL)突變，
    其中當兩個CH1/CL對包含突變以促進兩個不同VH/VL對的配對時，所述兩個CH1/CL對不包含相同的突變。
  20. 如請求項18或19所述的抗原結合蛋白，進一步包含至少一個VH/VL對，該至少一個VH/VL對含有帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷。
  21. 一種抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白包含：
    抗原結合結構域；和
    與恆定輕鏈CL區配對的恆定重鏈CH1區，
    其中所述抗原結合結構域選擇性地結合目標抗原，並且其中所述CH1區和所述CL區包含以下中的一個或兩個：
    a)所述CH1區中的L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突變以及所述CL區中的S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突變；和
    b)所述CH1區中的K221E和K228D突變以及所述CL區中的D122K和E123K突變，
    其中所述CH1區中的突變殘基與所述CL區中的突變殘基具有相反電荷。
  22. 如請求項21所述的抗原結合蛋白，進一步包含至少一個VH/VL對，該至少一個VH/VL對含有帶相反電荷的突變以促進配對，所述帶相反電荷的突變包含(1)選自E、D、K、R或H的在所述VH區中在Kabat位置39處的突變殘基，和(2)選自E、D、K、R或H的在所述VL區中在Kabat位置38處的突變殘基，並且 其中所述VH區中的突變殘基與所述VL區中的突變殘基具有相反電荷。
  23. 如請求項1至22中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白，進一步包含一個或多個半胱胺酸殘基，所述一個或多個半胱胺酸殘基被工程化到一個或幾個VH/VL對中以形成一個或多個雙硫鍵。
  24. 如請求項23所述的多特異性抗原結合蛋白，其中一個或兩個VH區包含44C和105C突變中的一個或兩個，並且一個或兩個VL區包含100C和43C突變中的一個或兩個。
  25. 一種包含一種或多種經分離的核酸分子的套組，所述一種或多種經分離的核酸分子包含一種或多種核苷酸序列，所述一種或多種核苷酸序列編碼如請求項1至24中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白。
  26. 一種包含一種或多種表現載體的套組，所述一種或多種表現載體包含如請求項25所述的一種或多種核酸分子。
  27. 一種經分離的宿主細胞，所述經分離的宿主細胞包含如請求項25所述的一種或多種核酸分子或者如請求項26所述的一種或多種表現載體。
  28. 一種醫藥組成物，所述醫藥組成物包含醫藥上可接受的載劑和如請求項1至24中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白。
  29. 一種治療病症的方法，在該病症中抗原活性是有害的，所述方法包括向有需要的個體投予有效量的如請求項1至24中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白。
  30. 如請求項1至24中任一項所述的多特異性抗原結合蛋白或抗原結合蛋白，所述多特異性抗原結合蛋白或抗原結合蛋白在每個VH區包含三個HCDR和在每個VL區包含三個LCDR，並且進一步對一種或多種目標抗原或一種或多種目標抗原決定基包含結合特異性。
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