JP2022512649A - 三重特異性抗ｃｄ３８、抗ｃｄ２８、および抗ｃｄ３結合タンパク質ならびにウイルス感染を処置するための使用方法 - Google Patents

三重特異性抗ｃｄ３８、抗ｃｄ２８、および抗ｃｄ３結合タンパク質ならびにウイルス感染を処置するための使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）、ＣＤ２８ポリペプチド、およびＣＤ３ポリペプチドに特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を使用してウイルス感染を処置する方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５５０８４号；２０１９年４月９日に出願された米国仮出願第６２／８３１，５７２号；２０１９年４月９日に出願された米国仮出願第６２／８３１，６０８号；および２０１９年９月１１日に出願されたＥＰ出願第１９３０６０９７．７号の優先権の利益を主張し；これらの全てを参照によってその全体として本明細書に組み入れる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容を参照によってその全体として本明細書に組み入れる：配列表のコンピュータで読み込み可能な形式（ＣＲＦ）（ファイル名：１８３９５２０３２１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１９年１０月２日、サイズ：１４４ＫＢ）。
本開示は、メモリーＴ細胞（例えば、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞）を拡大するおよび／または慢性ウイルス感染を処置するための、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）、ＣＤ２８ポリペプチド、およびＣＤ３ポリペプチドに特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を使用する方法に関する。
ヒト適応性免疫の一部として、Ｔ細胞免疫は、ウイルス感染の制御に極めて重大な役割を果たしており、感染した細胞を排除し、ウイルス感染のクリアランスをもたらす。慢性の感染性疾患、例えば、ヘルペスウイルス感染（ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶなど）、ＨＩＶ、およびＨＢＶでは、ウイルスは、免疫抑制、Ｔ細胞消耗（Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）、および潜伏確立（ｌａｔｅｎｃｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ）を含む様々な機構によって、それらのヒト中での持続性を確立している。それにもかかわらず、ウイルス感染は、一般的に、サイトカイン放出または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）介在性死滅プロセスによって制御または死滅させるために感染した細胞を容易に認識することができる抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞を含むウイルス抗原特異的免疫を誘導する。
したがって、インビボおよび／またはエクスビボでのウイルス抗原特異的Ｔ細胞活性化および／または増幅は、慢性ウイルス感染に対する治療戦略を提供し得る。
抗ＣＤ３８／ＣＤ２８ｘＣＤ３三重特異性抗体が本明細書において提供され、その抗体は、開発され、Ｔ細胞を活性化し、抗原特異的なＴ細胞の引き続く増殖および／または増幅する、それらの潜在性が評価された。これらの三重特異性Ａｂは、インビトロで、抗原特異的なＣＤ８ Ｔセントラルメモリーおよびエフェクターメモリー細胞を含む、ＣＤ４およびＣＤ８エフェクターおよびメモリー集団をより有効に拡大することができる。具体的には、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＩＶ－１、インフルエンザ特異的なＣＤ８セントラルメモリーおよびエフェクターメモリー細胞のインビトロ拡大が実証された。本明細書に記載の抗ＣＤ３８／ＣＤ２８ｘＣＤ３三重特異性抗体は、ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ３８をエンゲージすることによって新規の特性を示し、Ｔ細胞を刺激し、拡大するシグナル伝達経路を提供し、これにより、慢性感染性疾患、例えば、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＩＶ－１、およびＨＢＶ感染を処置する有効な戦略をもたらし得る。
これらおよび他の必要性を満たすために、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）、ＣＤ２８ポリペプチド、およびＣＤ３ポリペプチドに結合する結合タンパク質が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を拡大するための方法であって、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を結合タンパク質と接触させることを含み、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、方法が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞の拡大に使用するための、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、結合タンパク質が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞をインビトロまたはエクスビボで結合タンパク質と接触させる。一部の実施形態では、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を結合タンパク質と接触させることは、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞の活性化および／または増殖を引き起こす。
一部の実施形態では、Ｔ細胞を拡大するための方法であって、インビトロまたはエクスビボでＴ細胞を結合タンパク質と接触させることを含み、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、方法が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、Ｔ細胞を拡大するための方法に使用するための、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、結合タンパク質が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞またはエフェクターＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、その細胞表面に発現するまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、慢性ウイルス感染を処置するための方法であって、それを必要とする個体に有効量の結合タンパク質を投与することを含み、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、方法が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、慢性ウイルス感染を処置するための方法に使用するための、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成し、前記方法はそれを必要とする個体に有効量の結合タンパク質を投与することを含む、結合タンパク質が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、慢性ウイルス感染を処置する方法に使用するための結合タンパク質であって、前記方法は、それを必要とする個体に有効量の結合タンパク質を投与することを含み、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
で表される構造を含み、
結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
で表される構造を含み、
結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
で表される構造を含み、
結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
で表される構造を含み、式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、結合タンパク質が本明細書に提供される。
一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤中で個体に投与される。一部の実施形態では、結合タンパク質の投与は、個体においてウイルス特異的なメモリーＴ細胞の活性化および／または増殖をもたらす。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋メモリーＴ細胞である。一部の実施形態では、メモリーＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）またはエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）である。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドはヒトＣＤ２８ポリペプチドであり、ＣＤ３ポリペプチドはヒトＣＤ３ポリペプチドであり、ＣＤ３８ポリペプチドはヒトＣＤ３８ポリペプチドである。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＳＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＩＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号５）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＱＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２３）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＬＱＤＹＩＹＹＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＶＮＴ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＴＲＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＮＩＹＶＷ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＡＳ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＧＱＴＹＰＹ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、ＧＦＳＬＳＤＹＧ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＡＧＧＧＴ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＳＲＫＶＰＹＴ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＧＮＶＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＲＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４９）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＮＩＹＶＷＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインはＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＫＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ（配列番号５１）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬＭＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＡＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＮＤＶＡＮＹＹＣＱＱＳＲＫＶＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、ＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＳＬＶＨＮＮＡＮＴＹ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＶＳ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１２５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１２６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１２７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１２８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号１２９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＶＳ（配列番号１３０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインはＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＫＡＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＱＬＥＷＶＡＱＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５３）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインはＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＮＮＡＮＴＹＬＳＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＳＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＧＱＧＴＱＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインはＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＫＡＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＱＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８４）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインはＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹＬＳＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＧＱＧＴＱＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８５）のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は配列Ｓを含み、Ｌ４は配列ＲＴを含む。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３～２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。
ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせる一部の実施形態では、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、または単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－２）である。
本明細書に記載の様々な実施形態の特性の１つ、一部、または全てを本発明の他の実施形態を形成するために組み合わせることができることが理解されるべきである。本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者に明らかとなる。本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに記載される。
３つの標的タンパク質：ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ３８に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質の略図を提供する図である。ポリペプチドの第１の対は、ＣＤ３およびＣＤ２８を認識する２つの抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する二重可変ドメイン（ＶＨ１－ＶＨ２およびＶＬ２－ＶＬ１）を有し、ポリペプチドの第２の対は、ＣＤ３８を認識する単一抗原結合部位を形成する単一可変ドメイン（ＶＨ３およびＶＬ３）を有する。図１に示された三重特異性結合タンパク質は、単一可変ドメインを含むポリペプチドの第２の対にノブがある「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」変異を含むＩｇＧ４定常領域を使用する。 ＳＰＲによって測定された場合の、示された三重特異性結合タンパク質のその同族抗原（ヒトＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ３８）に対する結合親和性を要約する図である。 ＳＰＲまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定された場合の、ヒトＣＤ３８に対する示された抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３三重特異性結合タンパク質の結合親和性を要約する図である。 図４Ａ－４Ｄは、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ３ｍｉｄ×ＣＤ２８ｓｕｐ三重特異性抗体に応答したインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞サブセットの拡大の評価は、外因性サイトカインの非存在下、３５０ｎｇ／ウェルのＣＤ３８三重特異性Ａｂによる被覆ウェルによって行った。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。３つの変異抗原結合ドメインを有する三重特異性Ａｂを陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してセントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ４ Ｔ細胞（図４Ａ）、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ１７、Ｔｈ２）（図４Ｂ）、セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８ Ｔ細胞（図４Ｃ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｐｐ６５特異的ＣＤ８細胞（図４Ｄ）を実施例３に記載されているように決定した。ＣＭＶ特異的ｐｐ６５エフェクター細胞の解析を、ＣＤ３８三重特異性抗体またはトリプルネガティブ対照抗体で処置したＨＬＡ－Ａ２ ＣＭＶ＋ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の五量体染色によって行った。 図４－１の続き。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＣＭＶ感染ドナーＢから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ａ）、ならびにＣＭＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＣＭＶ感染ドナーＢから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ａ）、ならびにＣＭＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＣＭＶ感染ドナーＣから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ａ）、ならびにＣＭＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＣＭＶ感染ドナーＣから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ａ）、ならびにＣＭＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）感染ドナーＡから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）、ならびにＥＢＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）感染ドナーＡから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）、ならびにＥＢＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＥＢＶ感染ドナーＢから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ａ）、ならびにＥＢＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＥＢＶ感染ドナーＢから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ａ）、ならびにＥＢＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、ＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ベースライン（０日目；三重特異性抗体とのインキュベーションの前）でＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＰＥにコンジュゲートされたＡ＊０２：０１－ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（ＨＩＶ－１ ｇａｇ ｐ１７ ７６－８４）ペンタマー、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）についてアッセイされた、示されたヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）陽性ドナー由来のＰＢＭＣのフローサイトメトリープロファイル（下のパネルおよび右上のパネル）を示す図である。ＨＩＶ陰性ドナー由来のＰＢＭＣを陰性対照として使用した（左上のパネル）。Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団のパーセンテージが提供され、挿入ボックスとして示される。ベースラインでＨＩＶ陽性ドナー由来のＰＢＭＣは、ＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有している。図９のドナーＡ～Ｃは、図１０Ａ～１２Ｂに示されたドナーＤ～Ｆと同じである。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＨＩＶ陽性ドナーＤから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＨＩＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ａ）、ならびにＨＩＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＨＩＶ陽性ドナーＤから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＨＩＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ａ）、ならびにＨＩＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＨＩＶ陽性ドナーＥから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＨＩＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１１Ａ）、ならびにＨＩＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１１Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＨＩＶ陽性ドナーＥから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＨＩＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１１Ａ）、ならびにＨＩＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１１Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＨＩＶ陽性ドナーＦから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＨＩＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１２Ａ）、ならびにＨＩＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、ＨＩＶ陽性ドナーＦから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してＨＩＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１２Ａ）、ならびにＨＩＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１２Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、インフルエンザ感染ドナーＡから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してインフルエンザ（Ｆｌｕ）特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ａ）、ならびにＦｌｕ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、Ｔｅｍ ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、７、１１日目を参照のこと）およびＴｃｍ ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、７日目を参照のこと）の増殖を促進した。 ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体に応答した、インフルエンザ感染ドナーＡから採取されたＰＢＭＣにおけるインビトロでのＴ細胞サブセットの拡大の特徴を示す図である。Ｔ細胞集団は示された時点で測定した。トリプル変異体三重特異性抗体を陰性対照として使用した。フローサイトメトリーを使用してインフルエンザ（Ｆｌｕ）特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ａ）、ならびにＦｌｕ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｂ）を定量化した。ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体はＴ細胞を活性化し、Ｔｅｍ ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、７、１１日目を参照のこと）およびＴｃｍ ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、７日目を参照のこと）の増殖を促進した。
本開示は、メモリーＴ細胞（例えば、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞）を拡大するおよび／または慢性ウイルス感染を処置することに使用を見出すことができる、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）、ＣＤ２８ポリペプチド、およびＣＤ３ポリペプチドに特異的に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質を提供する。
Ｉ．一般的定義
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別段に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。文脈によって別段に要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。この明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容が別段に明確にそれ以外を指示しない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、場合により、２つまたはそれ以上のこのような分子の組合せなどを含む。
本明細書に記載の本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解される。
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０ヌクレオチド長の一本鎖または二本鎖核酸ポリマーを指す。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であってもよい。このような修飾には、ブロモウリジンなどの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間連結修飾が含まれる。具体的には、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。
「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）単離されたポリヌクレオチドが天然に見られるポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連していない、（２）天然に連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、または（３）より大きな配列の一部として天然に生じない、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源のポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組合せである。
「単離されたポリペプチド」は、以下のものである：（１）通常、ともに見られる少なくともいくつかの他のポリペプチドを含まない、（２）同じ供給源に由来する、例えば、同じ種に由来する他のポリペプチドを本質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、（４）天然に会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の材料のうち少なくとも約５０パーセントから分離されている、（５）「単離されたポリペプチド」が天然に会合しているポリペプチドの部分と会合していない（共有結合性または非共有結合性相互作用によって）、（６）天然には会合していないポリペプチドと作動可能に会合している（共有結合性または非共有結合性相互作用によって）、または（７）天然に生じない。このような単離されたポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡによってコードされるか、合成起源のものであるか、またはその任意の組合せであってもよい。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その使用（治療的、診断的、予防的、研究的または他の）を干渉するであろう、その天然環境において見られるポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
天然に存在する抗体は、典型的には、四量体を含む。このような四量体はそれぞれ、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの全長「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの全長「重」鎖（典型的には、約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。本明細書で使用される用語「重鎖」および「軽鎖」は、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識を担う約１００から１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能を担う定常ドメインを定義する。したがって、天然に存在する抗体では、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含み、ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ＶＬドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインは、カルボキシル末端にある。
ヒト軽鎖は、典型的には、カッパおよびラムダ軽鎖として分類され、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスに同様に細分される。全長軽鎖および重鎖内で、可変および定常ドメインは、典型的には、約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接続され、重鎖は約１０個多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、全ての目的のために参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には、抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって接続された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によってアラインされ、特定のエピトープとの結合を可能にし得る。軽鎖および重鎖可変ドメインの両方は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。
用語「ＣＤＲセット」は、抗原に結合することが可能な、単一可変領域中に生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なる系によって異なって定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））によって記載された系は、抗体のいかなる可変領域にも適用可能な明白な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称されることがある。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８３頁）は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定の一部分（ｓｕｂ－ｐｏｒｔｉｏｎ）が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションをとることを見出した。これらの一部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と表され、ここで、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を表す。これらの領域は、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと呼ばれることもあり、これは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ、１９９５、ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：１３３～３９頁；ＭａｃＣａｌｌｕｍ、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２６２（５）：７３２～４５頁；およびＬｅｆｒａｎｃ、２００３、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：５５～７７頁によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、本明細書の系のものを厳密にたどらない場合もあるが、それにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するが、それらは、特定の残基または残基の群または全ＣＤＲでさえも、抗原結合に有意に影響を与えないという予測または実験的知見を鑑みて、短縮されるかまたは延長される。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができるが、ある特定の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによって定義されるＣＤＲを使用する。アミノ酸配列を使用する予測されるＣＤＲの同定は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２巻． Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．、Ｄｕｂｅｌ Ｓ．編 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、３３～５１頁（２０１０）中の、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ」においてなど、当技術分野で周知である。重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列はまた、配列超可変性の領域を決定するために、他の従来方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列との比較によって、ＣＤＲの配列を同定するために検査される。番号付けされた配列は、目視によって、またはＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：４６７３～８０頁に記載されるようなＣＬＵＳＴＡＬスーツのプログラムのうちの１つのようなアラインメントプログラムを用いることによって、アラインすることができる。分子モデルは、フレームワークおよびＣＤＲ領域を正確に描写し、よって、配列ベースの割り当てを補正するために従来のように使用される。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴ定義（Ｌｅｆｒａｎｃら Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、２７（１）：５５～７７頁；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定される。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ」は、単量体形態であるか多量体形態であるかにかかわらず、抗体の消化に起因するかまたは他の手段によって産生され、ヒンジ領域を含有し得る非抗原結合断片の配列を含む分子を指す。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくは、ヒト起源のものであり、免疫グロブリンのいずれかであってもよい。Ｆｃ分子は、共有結合的（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合的会合によって二量体形態または多量体形態に連結される単量体ポリペプチドから構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２、およびＩｇＧ４）に応じて１から４の範囲である。Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化により生じるジスルフィド結合された二量体である。本明細書で使用される用語「天然Ｆｃ」は、単量体、二量体、および多量体形態に対して包括的である。
Ｆ（ａｂ）断片は、典型的には、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、Ｆ（ａｂ）断片のＶＨ－ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用される、Ｆ（ａｂ）断片はまた、アミノ酸リンカーによって分けられた２つの可変ドメインを含有する１つの軽鎖ならびにアミノ酸リンカーによって分けられた２つの可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１つの重鎖を含むことができる。
Ｆ（ａｂ’）断片は、典型的には、２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、１つの軽鎖および定常領域のより多く（ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの間）を含有する１つの重鎖の部分を含む。
本明細書で使用される用語「結合タンパク質」は、少なくとも１つの標的抗原、例えば、本開示のＣＤ３８ポリペプチドに特異的に結合する天然に存在しない（または組換えもしくは操作された）分子を指す。
「組換え」分子は、組換え手段によって、調製され、発現され、作製され、または単離されたものである。
本開示の一実施形態は、１から３つの間の標的抗原に対して生物学的および免疫学的特異性を有する結合タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のさらに別の実施形態は、このような結合タンパク質を発現する（すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子またはベクターを含む）宿主細胞を提供する。
本明細書で使用される用語「交換可能性（ｓｗａｐａｂｉｌｉｔｙ）」は、結合タンパク質形式内の、フォールディングおよび最終的な結合親和性を保持した可変ドメインの互換性を指す。「完全交換可能性（Ｆｕｌｌ ｓｗａｐａｂｉｌｉｔｙ）」は、結合親和性の保持によって証明されるような結合タンパク質の完全機能を維持しながら、式Ｉのポリペプチド鎖または式ＩＩのポリペプチド鎖中のＶＨ１およびＶＨ２ドメイン両方の順序、したがって、ＶＬ１およびＶＬ２ドメインの順序を交換する（すなわち、順序を逆転する）能力を指す。さらに、注目すべきは、命名ＶＨおよびＶＬは、最終形式における特定のタンパク質鎖上のドメインの位置のみを指すことである。例えば、ＶＨ１およびＶＨ２は、親抗体中のＶＬ１およびＶＬ２ドメインに由来し、結合タンパク質中のＶＨ１およびＶＨ２位置中に位置する可能性がある。同様に、ＶＬ１およびＶＬ２は、親抗体中のＶＨ１およびＶＨ２ドメインに由来し、結合タンパク質中のＶＨ１およびＶＨ２位置に位置する可能性がある。よって、ＶＨおよびＶＬ命名は、親抗体中の元の位置ではなく現在の位置を指す。したがって、ＶＨおよびＶＬドメインは、「交換可能」である。
本明細書で使用される用語「抗原」または「標的抗原」または「抗原標的」は、結合タンパク質によって結合されることができ、その抗原のエピトープに結合することが可能な抗体を産生するために動物において使用することがさらに可能な分子または分子の一部を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有する場合がある。結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、結合タンパク質は、標的抗原を認識する無傷の抗体と競合することが可能である。
「ＣＤ３８」は、表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）３８ポリペプチドであり、多くの免疫細胞の表面に見出される糖タンパク質である。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する。例示的なＣＤ３８細胞外ドメインポリペプチド配列として、限定されないが、ヒト３８の細胞外ドメイン（例えば、配列番号１で表されるような）およびカニクイザルＣＤ３８の細胞外ドメイン（例えば、配列番号３０で表されるような）が挙げられる。
用語「Ｔ細胞エンゲージャー」は、宿主の免疫系、より詳細にはＴ細胞の細胞傷害性活性を対象とする、ならびに腫瘍標的タンパク質を対象とする結合タンパク質を指す。
用語「単一特異性結合タンパク質」は、１つの抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
用語「一価の結合タンパク質」は、１つの抗原結合部位を有する結合タンパク質を指す。
用語「二重特異性結合タンパク質」は、２つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、２つの異なる抗原に結合する。一部の実施形態では、二重特異性結合タンパク質は、同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合する。
用語「二価の結合タンパク質」は、２つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。
用語「三重特異性結合タンパク質」は、３つの異なる抗原標的と特異的に結合する結合タンパク質を指す。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、３つの異なる抗原に結合する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、同じ抗原上の１つ、２つ、または３つの異なるエピトープに結合する。
用語「三価の結合タンパク質」は、３つの結合部位を有する結合タンパク質を指す。特定の実施形態では、三価の結合タンパク質は、１つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価の結合タンパク質は、２つの抗原標的に結合することができる。他の実施形態では、三価の結合タンパク質は、３つの抗原標的に結合することができる。
「単離された」結合タンパク質は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑物成分は、結合タンパク質の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む場合がある。一部の実施形態では、結合タンパク質は、（１）ローリー法によって決定される、抗体の９５重量％超、最も好ましくは、９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を使用して、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された結合タンパク質は、組換え細胞内にインサイチューの結合タンパク質を含むが、これは、結合タンパク質の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないからである。
本明細書で使用される用語「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」は、存在する優先種である（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）化合物または種を指す。一部の実施形態では、実質的に精製された画分は、種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種のうちの約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％超を含む。さらに他の実施形態では、種は、本質的に均一にまで精製され（夾雑物種を従来の検出方法によって組成物中で検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面グルーピングを含み、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な電荷特徴を有する。エピトープは、抗体または結合タンパク質が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するといわれる。一部の実施形態では、結合タンパク質は、平衡解離定数が≦１０－８Ｍである場合に、より好ましくは平衡解離定数が≦１０－９Ｍである場合に、最も好ましくは解離定数が≦１０－１０Ｍである場合に、抗原に特異的に結合するといわれる。
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。一般的に、表面プラズモン共鳴分析は、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と分析物（溶液中の結合タンパク質）の間のリアルタイム結合相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定する。表面プラズモン分析はまた、分析物（バイオセンサーマトリックス上の結合タンパク質）を固定化することおよびリガンド（標的抗原）を提示することによって実施することができる。本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、特定の結合タンパク質と標的抗原の間の相互作用の解離定数を指す。
結合タンパク質に言及して本明細書で使用される用語「に結合する」は、結合タンパク質またはその抗原結合断片の、少なくとも約１ｘ１０－６Ｍ、１ｘ１０－７Ｍ、１ｘ１０－８Ｍ、１ｘ１０－９Ｍ、１ｘ１０－１０Ｍ、１ｘ１０－１１Ｍ、１ｘ１０－１２Ｍ、もしくはそれ以上のＫｄでエピトープを含有する抗原に結合する能力、および／または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍より大きい親和性でエピトープに結合する能力を指す。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、２つまたはそれ以上の抗原、例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドに結合する。
一部の実施形態では、本開示の抗原結合ドメインおよび／または結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド、例えば、配列番号１（ヒトＣＤ３８アイソフォームＡ）、配列番号１０５（ヒトＣＤ３８アイソフォームＥ）および配列番号３０（カニクイザルＣＤ３８）などのＣＤ３８細胞外ドメインと「交差反応する」。抗原１（Ａｇ１）に結合する結合タンパク質は、ＥＣ５０が両方の抗原に対して同様の範囲内である場合、抗原２（Ａｇ２）に対して「交差反応性」である。本出願では、Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、Ａｇ１の親和性に対するＡｇ２の親和性の比が１０に等しいかまたは１０未満（例えば、５、２、１または０．５）である場合（親和性は両方の抗原に関して同じ方法で測定される）、Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、Ａｇ２に対して交差反応性である。
Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、親和性が２つの抗原に関して非常に異なる場合、Ａｇ２に対して「有意に交差反応性ではない」。Ａｇ２に関する親和性は、結合応答が低すぎる場合には測定不能であり得る。本出願では、Ａｇ１に結合する結合タンパク質は、Ａｇ２に対する結合タンパク質の結合応答が同じ実験設定でかつ同じ抗体濃度でＡｇ１に対する同じ結合タンパク質の結合応答の５％未満である場合、Ａｇ２に対して有意に交差反応性ではない。実際には、使用される結合タンパク質濃度は、ＥＣ５０またはＡｇ１で得られた飽和プラトーに達するのに必要とされる濃度であり得る。
本明細書で使用される用語「リンカー」は、軽鎖および重鎖のドメインがクロスオーバー二重可変領域免疫グロブリンにフォールディングするのに十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンドメイン間に挿入された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を指す。リンカーは、配列レベルで、それぞれ、可変ドメインの間または可変ドメインと定常ドメインの間の遷移部に挿入される。免疫グロブリンドメインのおよそのサイズが十分に理解されているため、ドメイン間の遷移部を特定することができる。ドメイン遷移部の正確な位置は、実験データによって実証されるように、またはモデリングもしくは二次構造予測の技法によって推定することができるように、ベータシートまたはアルファへリックスなどの二次構造エレメントを形成しないペプチドストレッチを位置付けることによって決定することができる。本明細書に記載のリンカーは、ＶＬ２のＣ末端とＶＬ１ドメインのＮ末端の間の軽鎖上に位置するＬ１；およびＶＬ１のＣ末端とＣＬドメインのＮ末端の間の軽鎖上に位置するＬ２と称される。重鎖リンカーは、ＶＨ１のＣ末端とＶＨ２ドメインのＮ末端の間に位置するＬ３；およびＶＨ２のＣ末端とＣＨ１ドメインのＮ末端の間に位置するＬ４として知られている。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、コーディング情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を含む。１つのタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に挿入することができるウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することが可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態である、用語「プラスミド」および「ベクター」は、本明細書において互換的に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
本明細書で使用される語句「組換え宿主細胞」（または「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことを意図する。変異または環境的影響のいずれかのために、特定の修飾が続く世代において起こる場合があるので、このような後代は、実際には、その親細胞と同一ではない場合があるが、このような細胞は、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。結合タンパク質を発現させるために、細菌、酵母、バキュロウイルス、および哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む多種多様な宿主細胞発現系を使用することができる。好適な細菌発現ベクターの一例は、ｐＵＣ１９である。結合タンパク質を組換えによって発現させるために、宿主細胞は、結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を運ぶ１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされ、その結果、宿主細胞においてポリペプチド鎖が発現され、好ましくは、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、その培地から、結合タンパク質を回収することができる。
本明細書で使用される用語「形質転換」は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞は、新規ＤＮＡを含有するように改変されている場合に形質転換されている。例えば、その天然状態から遺伝的に改変されている細胞は、形質転換されている。形質転換後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体中に物理的に組み込まれることによって細胞のものと組換えられるか、または複製されずにエピソームエレメントとして一過的に維持されるか、またはプラスミドとして独立して複製する場合がある。細胞は、ＤＮＡが細胞分裂とともに複製される場合に安定に形質転換されていると考えられる。本明細書で使用される用語「トランスフェクション」は、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されている場合に「トランスフェクトされている」。いくつかのトランスフェクション技法が当技術分野において周知である。このような技法を使用して、１つまたはそれ以上の外因性ＤＮＡ分子を好適な宿主細胞中に導入することができる。
本明細書で使用され、物体に対して適用される場合、用語「天然に存在する」は、その物体が自然の中で見出され、ヒトによって操作されていないという事実を指す。例えば、自然の中で供給源から単離することができ、ヒトによって意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に存在する。同様に、本明細書で使用される「天然に存在しない」は、自然の中で見出されない、または、ヒトによって構造的に改変または合成されている物体を指す。
本明細書で使用される、２０種の従来のアミノ酸およびその略語は、従来の利用に従う。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）；非天然アミノ酸およびα－，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来アミノ酸などの類似体も、結合タンパク質のポリペプチド鎖に関する好適な成分であり得る。非従来アミノ酸の例として、４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、ε－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、σ－Ｎ－メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表示法では、標準的な利用および慣習に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向が、カルボキシル末端方向である。
天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいてクラスに分けることができる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性：Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーから同じクラスの別のメンバーへの交換を含み得る。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーから別のクラスに由来するメンバーへの交換を含み得る。
当業者は、周知の技法を使用して、結合タンパク質のポリペプチド鎖の好適なバリアントを決定できる。例えば、当業者は、活性にとって重要であると考えられていない領域を標的とすることによって、活性を破壊することなく変更することができるポリペプチド鎖の好適な領域を同定することができる。あるいは、当業者は、同様のポリペプチドの間で保存されている残基および分子の部分を同定することができる。さらに、生体活性にとってまたは構造にとって重要であり得る領域でさえ、生体活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換に付される場合がある。
本明細書で使用される用語「患者」は、ヒトおよび動物対象（例えば、イヌ、ブタ、ウマ、ネコ、ウシなどの哺乳動物）を含む。
本明細書で使用される用語「処置」または「処置する」は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。処置を必要とするものには、障害を有するものならびに障害を有する傾向があるものまたは障害が防止されるべきものが含まれる。特定の実施形態では、慢性ウイルス感染を有するヒトを処置する、またはヒト対象において慢性ウイルス感染を寛解させるために、結合タンパク質を使用することができる。
本明細書で使用される用語「医薬組成物」または「治療用組成物」は、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することが可能な化合物または組成物を指す。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」は、結合タンパク質の送達を達成または増強するのに好適な１つまたはそれ以上の製剤化材料を指す。
用語「有効量」および「治療有効量」は、１つまたはそれ以上の結合タンパク質を含む医薬組成物に関連して使用される場合、所望の治療結果をもたらすのに十分な量または投薬量を指す。より詳細には、治療有効量は、処置されている状態に関連する臨床上定義された病理過程のうちの１つまたはそれ以上をしばらくの期間阻害するのに十分な結合タンパク質の量である。有効量は、使用されている特定の結合タンパク質に応じて変化し、また処置されている患者と関連する種々の因子および状態ならびに障害の重症度に依存し得る。例えば、結合タンパク質がインビボで投与される場合、これらの因子の中でも、患者の年齢、体重、および健康ならびに前臨床動物研究において得られた用量応答曲線および毒性データなどの因子が考慮される。所与の医薬組成物の有効量または治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
本開示の一実施形態は、薬学的に許容される担体および結合タンパク質の治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
三重特異性結合タンパク質
本開示のある特定の態様は、三重特異性結合タンパク質（例えば、ＣＤ３８、ＣＤ２８、およびＣＤ３ポリペプチドに結合する）に関する。本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれかの任意のＣＤＲまたは可変ドメインは、本開示の三重特異性結合タンパク質に使用を見出すことができる。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上（例えば、３つ）の異なる抗原標的または標的タンパク質に結合する３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］で表される構造を含み、
第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］で表される構造を含み、
第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］で表される構造を含み、
第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］で表される構造を含み、
式中：
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成する。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は、２つの別個の抗原結合部位を形成するクロスオーバー配向を有する。
一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、ヒトＣＤ２８ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドは、ヒトＣＤ３ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＣＤ３８ポリペプチドは、ヒトＣＤ３８ポリペプチドである。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、下に記載される１つまたはそれ以上の抗原結合部位を含む。
本開示の結合タンパク質は、例えば、ヒト、マウス、またはヒト化抗体を含む任意のヒトまたは非ヒト抗体から得られるかまたはそれに由来するドメインまたは配列を使用して調製することができる。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。
抗ＣＤ３８結合部位
本開示のある特定の態様は、ＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチド）に結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質に関する。
一部の実施形態では、結合タンパク質またはその抗原結合断片は、ヒトＣＤ３８（例えば、ヒトＣＤ３８アイソフォームＡおよび／またはアイソフォームＥポリペプチド）およびカニクイザルＣＤ３８と交差反応する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３８＋細胞のアポトーシスを誘導する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＤ３８＋細胞へとＴ細胞を動員し、場合によりＴ細胞を活性化する（例えば、ＴＣＲ刺激および／または同時刺激による）。
一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／またはＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／またはＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、表Ｇ、Ｈ、またはＩに示されるように、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ３－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ５－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ６－ＶＬ３、ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０（本明細書において抗ＣＤ３８＿１３７０とも称されることがある）、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ４ ＦＡＬＡ、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ ＮＮＳＡ、ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ４ ＦＡＬＡ、ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ、またはＣＤ３８ＨＨＹ１３７０ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ ＮＮＳＡの抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列に由来する１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）もしくはＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）もしくはＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；およびＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）もしくはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）もしくはＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／またはＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；およびＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／またはＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；およびＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３－ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８６）、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号８７）、またはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ（配列番号８８）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹ（配列番号９０）またはＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ（配列番号９１）を含み；ＦＲ３は、配列ＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９３）またはＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣ（配列番号９４）を含み；およびＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｌ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｌ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｌ３－ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳ（配列番号９７）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹ（配列番号９９）を含み；ＦＲ３は、配列ＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号１０１）を含み；およびＦＲ４は、配列ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１０３）を含む。
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；および／またはＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；および／またはＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；および／またはＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；およびＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；およびＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；およびＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；およびＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；およびＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および／または配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；および／またはＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８に結合する結合部位は：ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメイン；およびＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３－ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳ（配列番号８９）を含み；ＦＲ２は、配列ＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶ（配列番号９２）を含み；ＦＲ３は、配列ＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号９５）を含み；およびＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９６）を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｌ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｌ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｌ３－ＦＲ４を含み；ＦＲ１は、配列ＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳ（配列番号９８）を含み；ＦＲ２は、配列ＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１００）を含み；ＦＲ３は、配列ＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（配列番号１０２）を含み；およびＦＲ４は、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１０４）を含む。
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；および／またはＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む；およびＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖または配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む抗体重鎖および配列番号１２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。
抗ＣＤ２８結合部位
本開示のある特定の態様は、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８ポリペプチド）に結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質に関する。
一部の実施形態では、ＣＤ２８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＹＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＶＮＴ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＴＲＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび／またはＱＮＩＹＶＷ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＡＳ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＧＱＴＹＰＹ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８に結合する結合部位は：ＧＹＴＦＴＳＹＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＶＮＴ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＴＲＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよびＱＮＩＹＶＷ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＡＳ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＧＱＴＹＰＹ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ２８に結合する結合部位は：ＧＦＳＬＳＤＹＧ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＡＧＧＧＴ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび／またはＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＳＲＫＶＰＹＴ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８に結合する結合部位は：ＧＦＳＬＳＤＹＧ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＡＧＧＧＴ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよびＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＳＲＫＶＰＹＴ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
抗ＣＤ３結合部位
本開示のある特定の態様は、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３ポリペプチド）に結合する抗原結合部位を含む結合タンパク質に関する。
一部の実施形態では、ＣＤ３に結合する結合部位は：ＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび／またはＱＳＬＶＨＮＮＡＮＴＹ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＶＳ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１２５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３に結合する結合部位は：ＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよびＱＳＬＶＨＮＮＡＮＴＹ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＶＳ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１２５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
一部の実施形態では、ＣＤ３に結合する結合部位は：ＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１２６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１２７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１２８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび／またはＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号１２９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＶＳ（配列番号１３０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
本開示の三重特異性結合タンパク質のいずれかの一部の実施形態では、１つの抗原結合ドメインは、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３）に結合し、１つの抗原結合ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８）に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号４９または５１に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５０または５２に由来する３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号４９または５１に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５０または５２に由来する３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５３または８４に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ１ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５４または８５に由来する３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５３または８４に由来する３つのＣＤＲを含み、ＶＬ２ドメインは、表Ｈに示されているように、配列番号５４または８５に由来する３つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、およびＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、およびＶＬ１ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、およびＶＬ３ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＨ３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、およびＶＬ３ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含み、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｇに示される抗体配列の１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｈに示される抗体配列の、１、２、３、４、５、もしくは６個のＣＤＲ配列、ＶＨドメイン配列、および／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｉに示される抗体配列の、１、２、３、４、５、もしくは６個のＣＤＲ配列、ＶＨドメイン配列、および／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、表Ｉに示される１、２、３、または４個のポリペプチド配列を含む。
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ＣＤ３８ポリペプチド
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗原結合部位を含む。抗原結合部位が抗原に結合するかどうかを決定するための例示的なアッセイは、本明細書に記載され、当技術分野において知られている。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、ＳＰＲアッセイによって決定される。一部の実施形態では、結合は、例えば、下に記載されているように、それらの細胞表面にＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞を使用するフローサイトメトリーアッセイによって決定される。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１および／または３０のアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチドまたはその断片に結合する（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲによって測定されるように）。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、細胞の表面に発現される場合、配列番号１および／または３０のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する（例えば、フローサイトメトリーによって測定されるように）。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）ＣＤ３８アイソフォームＡポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むが配列番号１の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号１０５のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１０５のアミノ酸配列から本質的になる）ＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）ＣＤ３８アイソフォームＡポリペプチドおよび（例えば、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むが配列番号１の完全なアミノ酸配列を含まないか、配列番号１０５のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１０５のアミノ酸配列から本質的になる）ＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドに結合する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドへの結合は、例えば、本開示の結合タンパク質をＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチドを発現する細胞に対して標的とする際に、有利であると考えられる。
ヒトＣＤ３８アイソフォームＡ細胞外ドメインポリペプチド配列
ＲＷＲＱＱＷＳＧＰＧＴＴＫＲＦＰＥＴＶＬＡＲＣＶＫＹＴＥＩＨＰＥＭＲＨＶＤＣＱＳＶＷＤＡＦＫＧＡＦＩＳＫＨＰＣＮＩＴＥＥＤＹＱＰＬＭＫＬＧＴＱＴＶＰＣＮＫＩＬＬＷＳＲＩＫＤＬＡＨＱＦＴＱＶＱＲＤＭＦＴＬＥＤＴＬＬＧＹＬＡＤＤＬＴＷＣＧＥＦＮＴＳＫＩＮＹＱＳＣＰＤＷＲＫＤＣＳＮＮＰＶＳＶＦＷＫＴＶＳＲＲＦＡＥＡＡＣＤＶＶＨＶＭＬＮＧＳＲＳＫＩＦＤＫＮＳＴＦＧＳＶＥＶＨＮＬＱＰＥＫＶＱＴＬＥＡＷＶＩＨＧＧＲＥＤＳＲＤＬＣＱＤＰＴＩＫＥＬＥＳＩＩＳＫＲＮＩＱＦＳＣＫＮＩＹＲＰＤＫＦＬＱＣＶＫＮＰＥＤＳＳＣＴＳＥＩ（配列番号１）
ヒトＣＤ３８アイソフォームＥポリペプチド配列
ＲＷＲＱＱＷＳＧＰＧＴＴＫＲＦＰＥＴＶＬＡＲＣＶＫＹＴＥＩＨＰＥＭＲＨＶＤＣＱＳＶＷＤＡＦＫＧＡＦＩＳＫＨＰＣＮＩＴＥＥＤＹＱＰＬＭＫＬＧＴＱＴＶＰＣＮＫＩＬＬＷＳＲＩＫＤＬＡＨＱＦＴＱＶＱＲＤＭＦＴＬＥＤＴＬＬＧＹＬＡＤＤＬＴＷＣＧＥＦＮＴＳＫＩＮＹＱＳＣＰＤＷＲＫＤＣＳＮＮＰＶＳＶＦＷＫＴＶＳＲＲＨＦＷＥＣＧＳＰ（配列番号１０５）
一部の実施形態では、ヒトＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
カニクイザルＣＤ３８ポリペプチド配列
ＲＷＲＱＱＷＳＧＳＧＴＴＳＲＦＰＥＴＶＬＡＲＣＶＫＹＴＥＶＨＰＥＭＲＨＶＤＣＱＳＶＷＤＡＦＫＧＡＦＩＳＫＹＰＣＮＩＴＥＥＤＹＱＰＬＶＫＬＧＴＱＴＶＰＣＮＫＴＬＬＷＳＲＩＫＤＬＡＨＱＦＴＱＶＱＲＤＭＦＴＬＥＤＭＬＬＧＹＬＡＤＤＬＴＷＣＧＥＦＮＴＦＥＩＮＹＱＳＣＰＤＷＲＫＤＣＳＮＮＰＶＳＶＦＷＫＴＶＳＲＲＦＡＥＴＡＣＧＶＶＨＶＭＬＮＧＳＲＳＫＩＦＤＫＮＳＴＦＧＳＶＥＶＨＮＬＱＰＥＫＶＱＡＬＥＡＷＶＩＨＧＧＲＥＤＳＲＤＬＣＱＤＰＴＩＫＥＬＥＳＩＩＳＫＲＮＩＲＦＦＣＫＮＩＹＲＰＤＫＦＬＱＣＶＫＮＰＥＤＳＳＣＬＳＧＩ（配列番号３０）
リンカー
一部の実施形態では、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸なし（長さ＝０）から約１００アミノ酸長、または１００、５０、４０、３０、２０、または１５アミノ酸未満またはそれ以下の範囲である。リンカーはまた、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸長であってもよい。１つの結合タンパク質におけるＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、全て同じアミノ酸配列を有してもよく、または全て異なるアミノ酸配列を有してもよい。
好適なリンカーの例として、単一のグリシン（Ｇｌｙ）残基；ジグリシンペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；トリペプチド（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）；４つのグリシン残基を有するペプチド；５つのグリシン残基を有するペプチド；６つのグリシン残基を有するペプチド；７つのグリシン残基を有するペプチド；および８つのグリシン残基を有するペプチドが挙げられる。ペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ペプチドＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ペプチドＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびペプチドＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）などのアミノ酸残基の他の組合せが使用される場合もある。上記で列挙された例は、決して本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される無作為に選択されたアミノ酸を含むリンカーが、結合タンパク質において好適であることが示されている。リンカー配列のさらなる記載については、例えば、ＷＯ２０１２１３５３４５および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４８８号を参照されたい。
リンカー中のアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカーにおいて達成するのに必要な二次構造エレメントのタイプに応じて変わり得る。例えば、グリシン、セリン、およびアラニンは、最大の可動性を有するリンカーにとって最良である。より強固な延長したリンカーが必要である場合には、グリシン、プロリン、トレオニン、およびセリンのいくつかの組合せが有用である。所望の特性に応じて、必要に応じて、より大きなペプチドリンカーを構築するために、任意のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と組み合わせてリンカーとして考慮される。
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ独立して、少なくとも１アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１の長さは、Ｌ３の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ２の長さは、Ｌ４の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ１の長さは、Ｌ３の長さの少なくとも２倍であり、Ｌ２の長さは、Ｌ４の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ１は、３から１２個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、３から１４個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１から８個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、１から３個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は、５から１０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、５から８個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１から５個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、１から２個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は、７個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、５個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、１個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、２個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は、１０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は、１０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は、０個のアミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は、０個のアミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４はそれぞれ、０から１５個のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸）から独立に選択された長さを有し、リンカーのうち少なくとも２つは、１から１５個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸）の長さを有する。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４はそれぞれ、０アミノ酸長である。
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、および／またはＬ４は、抗体可変ドメインと抗体定常ドメインの間の接合部に、天然に存在する配列に由来する配列を含む（例えば、ＷＯ２０１２／１３５３４５に記載されるように）。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、内因性ＶＨおよびＣＨ１ドメインの間、または内因性ＶＬおよびＣＬドメイン（例えば、カッパまたはラムダ）の間の遷移部に見られる配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、内因性ヒトＶＨおよびＣＨ１ドメインの間、または内因性ヒトＶＬおよびＣＬドメイン（例えば、ヒトカッパまたはラムダ）の間の遷移部に見られる配列を含む。
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるかまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は配列Ｓを含み、Ｌ４は配列ＲＴを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ２は、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）を含み、Ｌ３は、０アミノ酸長であり、Ｌ４は、０アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｌ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ２は、０アミノ酸長であり、Ｌ３は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）を含み、Ｌ４は、０アミノ酸長である。
Ｆｃ領域および定常ドメイン
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、全長抗体重鎖またはＦｃ領域を含むポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、場合によりＣＨ４ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、下に記載された変異のうちの１つまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたは２つのＦｃバリアントを含む。本明細書で使用される用語「Ｆｃバリアント」は、天然Ｆｃから改変されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎ（新生児型Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む分子または配列を指す。例示的なＦｃバリアント、およびそれらのサルベージ受容体との相互作用は、当技術分野で公知である。したがって、用語「Ｆｃバリアント」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化されている分子または配列を含む場合がある。さらに、天然Ｆｃは、本発明の抗体様結合タンパク質にとって必要ではない構造的特徴または生物活性を提供するとの理由のため、除去することができる領域を含む。よって、用語「Ｆｃバリアント」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現の際のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすかまたはそれに関与している、１つもしくはそれ以上の天然Ｆｃ部位もしくは残基を欠くか、または１つもしくはそれ以上のＦｃ部位もしくは残基が改変されている分子または配列を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体結合および／またはＦｃ領域のエフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体介在性抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および／または３２９位に対応する位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および／またはＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および／または３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＹ３００Ｓである。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＩおよび／またはＦｃγＩＩ結合を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎ結合に影響を及ぼさないＦｃγＩおよび／またはＦｃγＩＩ結合を低減または排除する１つまたはそれ以上の変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および／または４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐおよび／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および／または２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、および／または４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３～２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３３～２３６、および／または４０９位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、Ｓ２２８Ｐ；Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失；ならびに／またはＲ４０９Ｋである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、精製試薬に対する親和性をモジュレートすることによって、精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ヘテロ二量体結合タンパク質は、ヘテロ二量体形態の２つのＦｃ領域のうち１つがプロテインＡへの結合を低減または排除する変異を含有する場合には、それらのホモ二量体形態から離して選択的に精製できることが知られており、これは、ヘテロ二量体形態が、いずれかのホモ二量体形態よりも、プロテインＡベースの精製に対して中間の親和性を有し、例えば、異なるｐＨの使用によってプロテインＡから選択的に溶出できるためである（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ら（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ． ５：１７９４３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第１および第２のＦｃ領域のうちの一方のみが、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、一方または両方のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３～２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３３～２３６、および／または４０９位に対応する置換にアミノ酸変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸変異は、Ｓ２２８Ｐ；Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失；ならびに／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、一方または両方のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および／または３２９位に対応する位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および／またはＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および／または３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＹ３００Ｓである。
一部の結合タンパク質（例えば、二重特異性または三重特異性結合タンパク質）の収率を改善するために、例えば、国際公開第ＷＯ９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７～２１頁；およびＭｅｒｃｈａｎｔら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７～８１頁においていくつかの実施例を用いて詳細に記載されている「ノブイントゥーホール」技術によって、ＣＨ３ドメインを変更することができる。詳細には、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、これら２つのＣＨ３ドメインを含有する両重鎖のヘテロ二量体化を増大するように変更される。２つのＣＨ３ドメインの（２つの重鎖の）それぞれは「ノブ」である場合があるが、もう一方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８；Ａｔｗｅｌｌら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６～３５頁）、収率を増大する。特定の実施形態では、ノブは、単一の可変ドメインを有するポリペプチドの第２の対上にある。他の実施形態では、ノブは、クロスオーバー配向を有するポリペプチドの第１の対上にある。さらに他の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ノブインホールを含まない。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質（例えば、三重特異性結合タンパク質）は、第２のポリペプチド鎖上に「ノブ」変異および第３のポリペプチド鎖上に「ホール」変異を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、第３のポリペプチド鎖上の「ノブ」変異および第２のポリペプチド鎖上の「ホール」変異を含む。一部の実施形態では、「ノブ」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および／または３６６位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ、またはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｙである。一部の実施形態では、「ノブ」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、「ホール」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４０７位、場合により、３４９、３６６、および／または３６８位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔ、場合により、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、および／またはＬ３６８Ａである。一部の実施形態では、「ホール」変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６および場合により、３５４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙ、場合によりＳ３５４Ｃであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４０７および場合により、３４９、３６６、および／または３６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔおよび場合により、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、および／またはＬ３６８Ａである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４０７および場合により、３４９、３６６、および／または３６８位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔおよび場合により、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、および／またはＬ３６８Ａであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６および場合により、３５４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙ、場合によりＳ３５４Ｃである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６、３６８、および／または４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６、３６８、および／または４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｗである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３５４、および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、およびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４、２３５、３５４、および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、およびＴ３６６Ｗである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、４０７、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８、２３４、２３５、３５４、３６６、および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、およびＲ４０９Ｋである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、血清半減期を改善するために１つまたはそれ以上の変異を含む（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（１）：３４６～５６頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み、第１および／または第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに血清半減期を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、ＩｇＧ４のヒンジ領域および／または二量体界面の、安定性を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．ら（２０１３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：２６５８３～２６５９３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第１および第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに安定性を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えば、精製試薬に対する親和性をモジュレートすることによって、精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。例えば、ヘテロ二量体結合タンパク質は、ヘテロ二量体形態の２つのＦｃ領域のうち１つがプロテインＡへの結合を低減または排除する変異を含有する場合には、それらのホモ二量体形態から離して選択的に精製できることが知られており、これは、ヘテロ二量体形態が、いずれかのホモ二量体形態よりも、プロテインＡベースの精製に対して中間の親和性を有し、例えば、異なるｐＨの使用によってプロテインＡから選択的に溶出できるためである（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ら（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ． ５：１７９４３頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第１および第２のＦｃ領域のうち一方のみは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに精製を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、血清半減期を改善するために１つまたはそれ以上の変異を含む（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ら（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（１）：３４６～５６頁を参照されたい）。一部の実施形態では、変異は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み、第１および／または第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４２８および４３４位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびに血清半減期を改善するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体媒介性抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／または抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第１および第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、Ｆｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第３のポリペプチド鎖は、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含み；第１および第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、Ｆｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、Ｆｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結された第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖であって、第１のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、ＣＨ１に連結された第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖であって、第２のＦｃ領域が免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第３のポリペプチド鎖とを含み；第１および第２のＦｃ領域はそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ノブおよびホール変異ならびにエフェクター機能を低減するための１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。３２９位のＦｃ変異についてのさらなる記載として、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１～６６０４頁およびＷＯ１９９９０５１６４２を参照されたい。
一部の実施形態では、上に記載された変異のタイプは、任意の順序または組合せで組み合わせることができる。例えば、本開示の結合タンパク質は、２つもしくはそれ以上の「ノブ」および「ホール」変異、血清半減期を改善するための１つもしくはそれ以上の変異、ＩｇＧ４の安定性を改善するための１つもしくはそれ以上の変異、精製を改善するための１つもしくはそれ以上の変異、ならびに／または上に記載されたエフェクター機能を低減するための１つまたはそれ以上の変異を含む場合がある。
核酸
結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、このようなベクターを宿主細胞に導入するために、標準組換えＤＮＡ方法が使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第３版）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野で通常達成されるように、または本明細書に記載されているように実施される。特別の定義が提供されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびにその実験手順および技法は、周知のものであり、当技術分野において通常使用される。同様に、従来の技法は、化学的合成、化学的分析、医薬品製造、製剤化、送達、および患者の処置のために使用される。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号６０～８３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である、および／または表Ｊに示されている配列を含む。
本開示のある特定の態様は、ポリヌクレオチドのキットに関する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのうちの１つまたはそれ以上は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。キットは、とりわけ、本明細書に記載の結合タンパク質のうちの１つまたはそれ以上、例えば、本開示の三重特異性結合タンパク質を産生する際に使用を見出すことができる。一部の実施形態では、キットは、表Ｊにおいて示されている１つ、２つ、３つ、または４つのポリヌクレオチドを含む（例えば、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ４ ＦＡＬＡ、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ ＮＮＳＡ、ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ４ ＦＡＬＡ、ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０ｘＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ａ、またはＣＤ３８ＨＨＹ１３７０ＣＤ２８ｓｕｐｘＣＤ３ｍｉｄ ＩｇＧ１ ＮＮＳＡのもの）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７４の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７７の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号７９の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号７５の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７２の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８０の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７６の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８２の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのキットは：配列番号７３の配列を含む第１のポリヌクレオチド、配列番号７８の配列を含む第２のポリヌクレオチド、配列番号８３の配列を含む第３のポリヌクレオチド、および配列番号８１の配列を含む第４のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、単離された核酸は、結合タンパク質をコードする核酸配列の転写を指示するために異種プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列を指すことができる。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関連して位置する場合に、第２の核酸配列に作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、結合タンパク質のコード配列に作動可能に連結される。プロモーターの例として、限定されないが、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得られたプロモーター、異種真核細胞プロモーターから得られたプロモーター（例えば、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなど）、ＣＡＧ－プロモーター（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ １０８（２）：１９３～９頁、１９９１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３：ｅ４３頁、２００５）、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母アルファ接合因子のプロモーターを挙げることができる。本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成プロモーター、誘導プロモーター、または本明細書に記載の任意の他の好適なプロモーターまたは当業者によって容易に認識される他の好適なプロモーターの制御下にあってもよい。
一部の実施形態では、単離された核酸は、ベクターに組み込まれる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つまたはそれ以上の調節配列を含む場合がある。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。好適なエンハンサーの例として、限定されないが、哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－胎児タンパク質、インスリンなど）に由来するエンハンサー配列、および真核細胞ウイルスに由来するエンハンサー配列（例えば、複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなど）を挙げることができる。好適なベクターの例として、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、麻疹、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を挙げることができる。発現ベクターは、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。宿主において発現および複製可能な生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当技術分野で公知であり、目的の任意の細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかの第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖をコードする１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系に関する。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖をコードする第２のベクター、結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖をコードする第３のベクター、および結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖をコードする第４のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第３および第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第３のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第２および第４のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１および第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクター、ならびに結合タンパク質の第２および第３のポリペプチド鎖をコードする第２のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、結合タンパク質の第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖をコードする第１のベクターを含む。ベクター系の１つまたはそれ以上のベクターは、本明細書に記載のベクターのいずれかであってもよい。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のベクターは、発現ベクターである。
単離された宿主細胞
本開示の他の態様は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞、ポリヌクレオチドのキット、ベクター、および／またはベクター系に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例として、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（例えば、Ｓ２細胞）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞（例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞）およびツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例えば、Ｓｆ２１またはＳｆ９細胞）を挙げることができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例として、例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭ細胞、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝細胞腫系統（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞）を挙げることができる。
結合タンパク質に関する方法および使用
本開示のある特定の態様は、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を拡大するための方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞と、本開示の結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質であって、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位、およびＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質を、接触させることを含む。
一部の実施形態では、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞をインビトロまたはエクスビボで結合タンパク質と接触させる。
一部の実施形態では、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を結合タンパク質と接触させることは、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞の活性化および／または増殖を引き起こす。
本開示の他の態様は、Ｔ細胞を拡大するための方法に関する。一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞と、本開示の結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質であって、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位、およびＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質を、接触させることを含む。
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞またはエフェクターＴ細胞である。
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、その細胞表面に発現するまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
本開示の他の態様は、慢性ウイルス感染（例えば、それを必要とする個体における）を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、方法は、それを必要とする個体に、有効量の本開示の結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質であって、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位、およびＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を含む三重特異性結合タンパク質を、投与することを含む。
一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、結合タンパク質は、結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤中で個体に投与される。
一部の実施形態では、結合タンパク質の投与は、個体においてウイルス特異的なメモリーＴ細胞の活性化および／または増殖をもたらす。
上記方法のいずれかで、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋メモリーＴ細胞であってもよい。上記方法のいずれかで、メモリーＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）またはエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）であってもよい。
本明細書に記載の結合タンパク質のいずれかは、本開示の方法に使用を見出すことができる。
結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の標的抗原の検出および定量化のための、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ方法において用いることができる。結合タンパク質は、用いられているアッセイ方法にとって適当である親和性で、１つまたはそれ以上の標的抗原と結合する。
診断適用のために、ある特定の実施形態では、結合タンパク質を検出可能な部分を用いて標識することができる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで産生可能である任意のものであり得る。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、もしくは６７Ｇａなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光もしくは化学発光化合物；またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であってもよい。
結合タンパク質はまた、インビボイメージングにとって有用である。検出可能な部分を用いて標識された結合タンパク質を、動物に、好ましくは、血流中に投与することができ、宿主における標識された抗体の存在および位置がアッセイされる。結合タンパク質を、核磁気共鳴、放射線学、または当技術分野で公知の他の検出手段によるかどうかにかかわらず、動物において検出可能である任意の部分を用いて標識することができる。
臨床または研究適用のために、ある特定の実施形態では、結合タンパク質を細胞毒製剤にコンジュゲートさせることができる。細胞毒製剤に連結された様々な抗体（すなわち、抗体－薬物コンジュゲート）を使用して、細胞毒性ペイロードが特定の腫瘍細胞に対して標的化されている。細胞毒製剤と抗体に対してその製剤をコンジュゲートするリンカーは、当技術分野で公知である；例えば、Ｐａｒｓｌｏｗ，Ａ．Ｃ．ら（２０１６） Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ４：１４頁およびＫａｌｉｍ，Ｍ．ら（２０１７） Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ． １１：２２６５～２２７６頁を参照されたい。
本開示はまた、結合タンパク質および生体サンプルにおける標的抗原レベルを検出するのに有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照サンプル、ならびに検出試薬を含んでもよい。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の任意の結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、ベクター系、および／または宿主細胞を含む組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、容器および容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書を含む。好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成される。容器は、それ自体でまたは別の組成物と組み合わせて、状態を処置、防止および／または診断するのに有効である組成物を保持し、かつ滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。一部の実施形態では、ラベルまたは添付文書は、選択した状態を防止、診断、および／または処置するために組成物が使用されることを示す。あるいは、またはさらに、製造品またはキットは、静菌性注射水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含む場合がある。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、およびシリンジを含む、商業的およびユーザー的観点から望まれる他の材料をさらに含む場合がある。
結合タンパク質治療用組成物およびその投与
結合タンパク質を含む治療用組成物または医薬組成物は、本開示の範囲内である。このような治療用組成物または医薬組成物は、治療有効量の結合タンパク質、または結合タンパク質－薬物コンジュゲートを、投与様式との適合性について選択された薬学的にまたは生理学的に許容される製剤と混合して含む場合がある。これらの医薬組成物は、本明細書に記載の任意の方法および使用（例えば、エクスビボ、インビトロ、および／またはインビボ）において使用を見出すことができる。
許容可能な製剤材料は、好ましくは、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変、維持、または保存するための製剤材料を含有することができる。好適な製剤材料として、限定されないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗微生物剤、抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、または他の有機酸）、嵩高剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリン）、増量剤、単糖類、二糖類、および他の炭化水素（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、矯味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（例えば、ナトリウム）、保存料（例えば、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、浸透圧増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物－好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム－またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバントが挙げられる（例えば、いずれかの目的のために、参照によって本明細書に組み入れる、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）および同一物のその後の版を参照されたい）。
最適医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に応じて、熟練した技術者によって決定される。このような組成物は、結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼす場合がある。
医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、本質的に、水性または非水性のいずれかであってもよい。例えば、注射用の好適なビヒクルまたは担体は、おそらくは非経口投与用組成物において一般的な他の材料を補充した、水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であってもよい。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な医薬組成物は、ソルビトールまたは好適な代用物をさらに含むことができる、約ｐＨ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含む。本開示の一実施形態では、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意選択の製剤と混合することによって、結合タンパク質組成物を保存のために調製することができる。さらに、結合タンパク質は、スクロースなどの適当な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
本開示の医薬組成物は、非経口送達または皮下用に選択することができる。あるいは、組成物は、吸入用または、経口的などの、消化管を介する送達用に選択することができる。このような薬学的に許容される組成物の調製は当業者の範囲内である。
製剤成分は、投与部位にとって許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液は、組成物を生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨに、典型的には、約５から約８のｐＨ範囲内で維持するために使用される。
非経口投与が企図される場合には、使用するための治療用組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に所望の結合タンパク質を含む、発熱物質不含の、非経口的に許容される水溶液の形態であってもよい。非経口注射用の特に好適なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中では、結合タンパク質が、適宜保存される滅菌等張性溶液として製剤化される。さらに別の調製は、製品の徐放または持続放出をもたらし、次いで、デポー注射によって送達することができる注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの薬剤を用いる、所望の分子の製剤化を含み得る。ヒアルロン酸も使用することができ、これは、循環における持続期間を促進する効果を有することができる。所望の分子の導入のための他の好適な手段として、埋め込み可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
一実施形態では、医薬組成物を吸入用に製剤化することができる。例えば、結合タンパク質を吸入用の乾燥散剤として製剤化することができる。エアゾール送達用に噴射剤を用いて、結合タンパク質吸入溶液も製剤化することができる。さらに別の実施形態では、溶液を噴霧することができる。
ある特定の製剤を経口投与することができることも企図される。本開示の一実施形態では、この様式で投与される結合タンパク質を、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の配合において習慣的に使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。例えば、カプセル剤は、バイオアベイラビリティが最大化され、前全身性（ｐｒｅ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ）分解が最小化されているときに、胃腸管において製剤の活性部分をその時点で放出するよう設計することができる。結合タンパク質の吸収を促進するために、追加の薬剤を含めることができる。希釈剤、矯味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も用いることができる。
別の医薬組成物は、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物における、有効量の結合タンパク質に関与する場合がある。滅菌水、または別の適当なビヒクル中に錠剤を溶解することによって、溶液を単位用量形態で調整することができる。好適な賦形剤として、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどの滑沢剤が挙げられる。
持続送達または制御送達製剤中の結合タンパク質に関与する製剤を含む、本開示の追加の医薬組成物が当業者には明らかである。リポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射液などの種々の他の持続送達または制御送達手段を製剤化するための技法も当業者に公知である。持続放出調製物の追加の例として、成型品形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスとして、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル、またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸を挙げることができる。持続放出組成物として、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも挙げることができる。
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、典型的には、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合には、凍結乾燥および再構成前または後のいずれかで、この方法を使用する滅菌法を行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存することができる。さらに、非経口組成物は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射ニードルによって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
医薬組成物が製剤化されると、医薬組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水されたもしくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中で保存することができる。このような製剤は、すぐに使える形態で、または投与に先立って再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥した）のいずれかで保存することができる。
本開示は、単回用量投与単位を産生するためのキットも包含する。キットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の両方を含有することができる。また、単一および複数チャンバーの事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットも、本開示の範囲内に含まれる。
治療上用いられる結合タンパク質医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に応じて変わる。よって、当業者であれば、処置のための適当な投薬量レベルは、幾分かは、送達される分子、結合タンパク質が使用されている適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または臓器の大きさ）および状態（年齢および全身の健康）に応じて変わることを認識する。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を用量設定し、投与経路を修正することができる。
投薬頻度は、使用されている製剤中の結合タンパク質の薬物動態パラメータに応じて変わる。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで組成物を投与することになる。したがって、組成物を、単回用量として、二回もしくはそれ以上の用量（同量の所望の分子を含有する場合も含有しない場合もある）として経時的に、または埋め込みデバイスもしくはカテーテルによる連続注入として投与することができる。適当な投薬量のさらなる精緻化は、当業者によって日常的に行われ、彼らによって日常的に実施される課題の範囲内である。適当な投薬量は、適当な用量応答データの使用によって確認することができる。
医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従うものであり、例えば、経口的；静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射；持続放出系；または埋め込みデバイスによる。所望の場合には、組成物をボーラス注射によって、または注入によって、もしくは埋め込みデバイスによって連続的に投与することができる。
組成物は、その上に所望の分子が吸収されているかまたはカプセル化されている膜、スポンジ、または他の適当な材料の埋め込みによって局所投与することもできる。埋め込みデバイスが使用される場合には、デバイスは、任意の好適な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、持効性ボーラス、または連続投与によってもよい。
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態、およびその様々な使用を例示するものである。それらは説明の目的のみで記載され、いかなる形でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の用語は、特定の抗ＣＤ３８抗原結合ドメインまたは抗体を指すのに本明細書の実施例および図面において互換的に使用され得る：
抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１またはＣＤ３８ＶＨ１
抗ＣＤ３８＿１３７０またはＣＤ３８ＨＨＹ１３７０
抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９またはイサツキシマブ
抗ＣＤ３８抗体の交差反応性およびアポトーシス誘導
ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドへの結合ならびにアポトーシスの誘導について、ヒト化抗ＣＤ３８バリアントを特徴付けた。
材料および方法
可溶性ＣＤ３８細胞外ドメインに対する結合親和性
抗ＣＤ３８ ｍＡｂの結合特性を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．、ウプサラ、ＮＪ）を使用して評価した。簡単には、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップを該機器にドッキングし、室温で１：１ＮＨＳ／ＥＤＣ ２５０μＬで活性化した。マウス抗ヒトＦｃ ＩｇＧ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＃ＢＲ－１００８－３９）（０．０５Ｍ酢酸緩衝液中１３．５μｇ／ｍＬ、ｐＨ５）をフローセル１で活性化チップに固定化した。固定化は流速５μＬ／分で実行した。チップを次いでエタノールアミン－ＨＣｌ ５５μＬ、ｐＨ８．５の注入によってブロックし、その後５０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌで５回洗浄した。ヒトＣＤ３８タンパク質またはカニクイザルＣＤ３８タンパク質への抗ＣＤ３８ ｍＡｂの結合を測定するために、抗体をＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液（ＨＢＳ－ＥＰ）に２μｇ／ｍＬで使用した。抗原（ヒトＣＤ３８－ｈｉｓｔａｇ（ＩＤ２）またはカニクイザルＣＤ３８－ｈｉｓｔａｇ（ＩＤ３））を３～１０００ｎＭ注入した。注入段階の完了後、解離をＢＩＡｃｏｒｅランニング緩衝液中、同じ流速で３６０秒間モニターした。５０ｍＭ ＮａＯＨ－１Ｍ ＮａＣｌ ３０μＬを使用して注入間で表面を再生した。ＢＩＡｓｉｍｕｌａｔｉｏｎソフトウェアを使用して個々のセンサーグラムを解析した。
ヒトＣＤ３８発現プレＢ細胞に対する結合親和性
組換えマウスプレＢ：：３００．１９細胞の表面で発現されたＣＤ３８への抗ＣＤ３８抗体の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。該組換え細胞株は、Ｊ． Ｄｅｃｋｋｅｔら ２０１４ Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０：４５７４～４５８３頁によって記載された。マウスプレＢ：：３００．１９ ＣＤ３８発現細胞を、９６ウェルＨｉｇｈ Ｂｉｎｄプレート（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ－３）で４０，０００細胞／ウェルで被覆し、抗ＣＤ３８抗体１００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ １％ＢＳＡで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；＃１０９－５４５－０９８）１００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ １％ＢＳＡで３回洗浄した。遠心分離、および２００μｌ／ウェルＰＢＳ １％ＢＳＡの添加による細胞の再懸濁、およびＧｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用した読み取り後に抗体結合を評価した。見かけのＫＤおよびＥＣ５０値を、それぞれＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＢＩＮＤＩＮＧおよびＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
組換えＣＤ３８タンパク質
異なるタグおよび点変異を有するアイソフォームＡに由来する様々な組換えＣＤ３８タンパク質（配列番号２、３、４、および２８）、およびＲ４５－Ｐ２０３由来のＣＤ３８細胞外ドメインを包含するＣＤ３８アイソフォームＥ（配列番号１０５）のタグ化バージョンを使用した。タンパク質は、哺乳動物細胞での一過性発現によって産生した。コードＤＮＡ配列を、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナル下で哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。製造者の説明書に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ ２９３発現系を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｋ９０００－１０）に発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした。
アポトーシス誘導アッセイ
細胞を完全培地（ＲＰＭＩ－１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン）中２×１０５細胞／ｍＬで、示された抗体１．５μｇ／ｍＬ（１０ｎＭ）と３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣで製造者の説明書に従って染色した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。取得制御およびデータ解析のために、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを用いたＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）フローサイトメーターでサンプルをフローサイトメトリーによって解析した（両方ともＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
ＥＬＩＳＡアッセイ
９６ウェルプレートをＣＤ３８でＰＢＳ中０．５μｇ／ウェルで被覆し、抗体１００μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で５回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒｅｆ：１０９－０３５－０９８）の１：２５，０００希釈液１００μＬを各ウェルに添加した。暗所で３７℃、１時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ－Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加して抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。ＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用してＥＣ５０値を推定した。
結果
可溶性ヒトＣＤ３８およびカニクイザルＣＤ３８に対する選択した抗ヒトＣＤ３８抗体の結合特性を、ＥＬＩＳＡ、およびＢＩＡｃｏｒｅシステムを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；ピスカタウェイ、ＮＪ）を使用して調べた。ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８への抗体結合のＥＣ５０を、ヒト化抗ＣＤ３８抗体の抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ３－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ５－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ６－ＶＬ３、およびヒト抗ＣＤ３８抗体の抗ＣＤ３８＿１３７０についてＥＬＩＳＡデータを使用して決定した。
ＣＤ３８へのヒト化抗ＣＤ３８バリアントまたはヒト抗ＣＤ３８ ｍＡｂの結合も、ＳＰＲアッセイを使用して評価した。ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８への抗体結合のＫＤおよびｋｏｆｆを、ヒト化抗ＣＤ３８抗体の抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ３－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ５－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ６－ＶＬ３、およびヒト抗ＣＤ３８抗体の抗ＣＤ３８＿１３７０についてＳＰＲデータを使用して決定した。表Ｋに要約された結合データは、抗ＣＤ３８ ｍＡｂの全てが類似した結合特性でＣＤ３８に結合することを示している。
Figure 2022512649000026
ヒト化抗ＣＤ３８バリアントのＣＤ３８発現細胞に結合する能力を、上記したＦＡＣＳベースの結合アッセイを使用して評価した。ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８への抗体結合のＥＣ５０を、ヒト化抗ＣＤ３８抗体の抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ３－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ５－ＶＬ３、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ６－ＶＬ３、およびヒト抗ＣＤ３８抗体の抗ＣＤ３８＿１３７０についてＦＡＣＳデータを使用して決定した。表Ｌに記載された結合データは、全てのヒト化抗ＣＤ３８バリアントが細胞表面ＣＤ３８に対して類似した結合親和性を示したことを示している。
Figure 2022512649000027
上記のＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、およびＦＡＣＳアッセイからの結合データを、ヒトＶ領域のＶＨおよびＶＬドメインの配列同一性と共に表Ｌ２に要約する。
Figure 2022512649000028
抗ＣＤ３８抗体のヒトＣＤ３８アイソフォームＡおよびＥの両方に結合する能力も調べた。ＣＤ３８アイソフォームＡおよびアイソフォームＥへの結合を評価するために、アイソフォームＡおよびアイソフォームＥタンパク質（上記のように製造した）を捕捉抗原として使用して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。９６ウェルプレートをどちらかのアイソフォームでＰＢＳ中０．５μｇ／ウェルで被覆し、抗体１００μＬ／ウェルをプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で５回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒｅｆ：１０９－０３５－０９８）の１：２５，０００希釈液１００μＬを各ウェルに添加した。暗所で３７℃、１時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ－Ｈ２Ｏ２緩衝液を添加して抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。ＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用してＥＣ５０値を推定した。
ＣＤ３８アイソフォームＡ（配列番号１）およびアイソフォームＥ（配列番号１０５）に対する様々な抗体の結合親和性を、表Ｌ３に示すように決定した。表Ｍは、様々な抗ＣＤ３８抗体に関する結合特性の比較を提供する。
Figure 2022512649000029
Figure 2022512649000030
結論として、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１のみがヒトおよびカニクイザルＣＤ３８の両方にナノモル以下の親和性で結合し、ＣＤ３８アイソフォームＡおよびＥに結合した。
三重特異性抗ＣＤ３８結合タンパク質の生成
次に、実施例１に記載した選択した抗ＣＤ３８抗体の抗原結合ドメインの結合特性を、図１に描いた三重特異性フォーマットにおいて解析した。
材料および方法
三重特異性結合タンパク質の産生および精製
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者のプロトコルに従って使用して、４つの発現プラスミドのＥｘｐｉ２９３細胞への一過性トランスフェクションによって三重特異性結合タンパク質を産生した。簡単には、各プラスミドの２５％（ｗ／ｗ）をＯｐｔｉ－ＭＥＭに希釈し、前希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬と室温で（ＲＴ）２０～３０分間混合し、Ｅｘｐｉ２９３細胞（２．５×１０６細胞／ｍｌ）に添加した。収率および純度の良い三重特異性結合タンパク質を産生するために、プラスミドの最良の比を決定するためのトランスフェクションの最適化をしばしば使用した。
トランスフェクション４～５日後、トランスフェクト細胞からの上清を回収し、０．４５μｍフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過した。上清中の三重特異性結合タンパク質を３段階の手順を使用して精製した。第一は、プロテインＡ親和性精製を使用し、「ＩｇＧ溶出緩衝液」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して結合Ａｂを溶出した。第二に、ＰＢＳ緩衝液を２回変更して産物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して一晩透析した。次の段階の前に、あらゆる沈殿物を０．４５μｍフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過により取り除いた。第三に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製（Ｈｉｌｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ、またはＨｉｌｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、調製物中の凝集物および異なる種を除去した。画分を還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析して、それらを混ぜ合わせる前に単量体三重特異性結合タンパク質を含有する画分を同定した。精製抗体はアリコートし、－８０℃で長期保管することができる。
ＥＬＩＳＡアッセイ
精製抗体の結合特性を、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲ方法のどちらかを使用して解析した。ＥＬＩＳＡに関しては、三重特異性結合タンパク質の各結合部位に対応する抗原を使用して、９６ウェルＩｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ ４３９４５４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２μｇ／ｍｌ各抗原を使用して被覆した。被覆プレートをＰＢＳ中５％脱脂乳＋２％ＢＳＡを使用してＲＴで１時間ブロックし、その後ＰＢＳ＋０．２５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した（Ａｑｕａ Ｍａｘ ４００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。抗体（三重特異性および対照Ａｂ）の連続希釈物を製造し、ＥＬＩＳＡプレートに添加し（１００μｌ／ウェル、二通り）、ＲＴで１時間インキュベートし、その後ＰＢＳ＋０．２５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄した。
洗浄後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗ヒトＦａｂ（１：５０００、カタログ番号１０９－０３５－０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）を各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．２５％Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄した後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、ゲイサーズバーグ、ＭＤ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加した。５０μｌ １Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を止め、ＯＤ４５０をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ６．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して解析した。最終データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に移し、示されているようにプロットした。同じソフトウェアを使用してＥＣ５０を算出した。
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗ＣＤ３８×ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体またはアイソタイプ対照抗体（ヒトＩｇＧ４）の、ヒトＣＤ３（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＬＬＣ カタログ番号０３－０１－００５１）、ＣＤ２８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＬＬＣ カタログ番号０３－０１－０３０３）、およびＣＤ３８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＬＬＣ カタログ番号０３－０１－０３６９）への結合を決定した。結合抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗Ｆａｂ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ ＃１０９－０３５－０９７）を使用して検出した。
結果
他の抗原結合ドメインがその同族リガンドに結合する場合のＣＤ３８に結合する能力について、抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを三重特異性フォーマット（抗ＣＤ３８×抗ＣＤ２８×抗ＣＤ３）でＳＰＲを使用してテストした。各三重特異性Ａｂへの３つの抗原の連続結合のために、各抗原の飽和濃度（＞１０ＫＤ）を８分間注入し、その後５分間解離させた。１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．５を３０μｌ／分で６０秒間注入して表面再生を行った。データを１：１速度論的結合モデルにフィットさせ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．０を使用して解析した。結合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を使用して平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。
このＳＰＲベースのアッセイは、三重特異性結合タンパク質が、ＣＤ３および／またはＣＤ２８抗原結合ドメインもその同族抗原に結合できるかどうかにかかわらずＣＤ３８に結合できることを示した。ＳＰＲによって測定した場合の速度論的パラメータを表Ｍ２に提供する。
Figure 2022512649000031
これらの結果は、３つの標的全てが同時に三重特異性結合タンパク質に結合できることを示している。三重特異性結合タンパク質をＣＤ２８、ＣＤ３、または両方（どちらの順でも）と事前結合させることは、ＣＤ３８に対する結合速度論または結合親和性を変化させなかった。
次に、ＣＤ３８ＳＢ１９×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質の各抗原結合ドメインを、飽和状態の他の２つの抗原結合ドメインの有無による同族抗原に結合する能力についてＳＰＲによって評価した。表Ｍ３およびＭ４は、これらのアッセイの結果を示す。
Figure 2022512649000032
Figure 2022512649000033
表Ｍ３およびＭ４に示したように、抗原との事前結合によって２つの標的を飽和させることは、ＣＤ３８またはＣＤ２８の第３の標的の速度論または結合親和性に影響を与えなかった。ＣＤ３結合の場合、事前結合したＣＤ３８および／またはＣＤ２８はより速い速度論をもたらした（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ値に対する約４倍の影響）。
抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを、２つの抗ＣＤ２８抗原結合ドメイン（スーパーアゴニスト、「ｓｕｐ」、および従来のアゴニスト、「ｃｖｎ」）および２つの抗ＣＤ３抗原結合ドメイン（「ｍｉｄ」および「ｌｏｗ」）を有する三重特異性フォーマットにおいてテストした。これらの抗原結合ドメインの可変ドメイン配列は、次のように提供される：抗ＣＤ２８ｓｕｐ：配列番号４９（ＶＨ）および配列番号５０（ＶＬ）； 抗ＣＤ２８ｃｖｎ：配列番号５１（ＶＨ）および配列番号５２（ＶＬ）；抗ＣＤ３ｍｉｄ：配列番号５３（ＶＨ）および配列番号５４（ＶＬ）； 抗ＣＤ３ｌｏｗ：配列番号８４（ＶＨ）および配列番号８５（ＶＬ）。三重特異性結合タンパク質の結合を調べたＳＰＲアッセイの結果を図２に示す。３つの抗ＣＤ３８結合ドメインは、単一特異性フォーマットとほぼ同じ結合親和性を三重特異性結合タンパク質フォーマットにおいて有した。ＣＤ３結合ドメインは両方とも、単一、二重、および三重特異性フォーマットにおいてほぼ同じ結合親和性を有した。ＣＤ２８結合ドメインは、単一特異性と比較して二重または三重特異性フォーマットにおいてわずかに低い（ただし、依然としてナノモルの）結合親和性を示した。他の２つの抗原結合ドメインを飽和させた場合、抗ＣＤ３８ＳＢ１９および抗ＣＤ２８ｓｕｐ結合ドメインは、他の２つの抗原結合ドメインが抗原に結合されなかった場合と比べて類似した結合親和性を有した。しかし、抗ＣＤ３ｍｉｄ結合ドメインは、他の２つの抗原結合ドメインを飽和させた場合、より速い速度論を示した。これらの結果は、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ３結合ドメインが、三重特異性結合タンパク質フォーマットによる使用に適合することを示している。
本明細書において生成された抗ＣＤ３８抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９の既存の抗ＣＤ３８抗原結合ドメインに対しても比較した（ＶＨ配列に対する配列番号４７およびＶＬ配列に対する配列番号４８をそれぞれ参照のこと）。組換えマウスプレＢ：：３００．１９細胞の表面で発現したＣＤ３８への三重特異性分子の結合をフローサイトメトリーによって決定し、対応する抗ＣＤ３８一価抗体を並行してアッセイした。該組換え細胞株は、Ｊ． Ｄｅｃｋｋｅｔら ２０１４ Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０：４５７４～４５８３頁によって記載された。マウスプレＢ：：３００．１９ ＣＤ３８発現細胞を、９６ウェルＨｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｐｌａｔｅ（ＭＳＤ Ｌ１５ＸＢ－３）で４０，０００細胞／ウェルで被覆し、三重特異性分子１００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ １％ＢＳＡで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；＃１０９－５４５－０９８）１００μＬ／ウェルを４℃で４５分間添加し、ＰＢＳ １％ＢＳＡで３回洗浄した。遠心分離、および２００μｌ／ウェルＰＢＳ １％ＢＳＡの添加による細胞の再懸濁、およびＧｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）８ＨＴフローサイトメトリーシステムを使用した読み取り後に抗体結合を評価した。見かけのＫＤおよびＥＣ５０値をそれぞれＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＢＩＮＤＩＮＧおよびＢＩＯＳＴ＠Ｔ－ＳＰＥＥＤソフトウェアを使用して推定した。
フローサイトメトリーを上記したように使用して、抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９抗体または抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含む三重特異性結合タンパク質の、細胞表面でヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現するマウスプレＢ細胞への結合を調べた。抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含むＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９単一特異性抗体（ＥＣ５０＝０．５ｎＭ）より８倍低い見かけの親和性（ＥＣ５０＝４ｎＭ）でヒトＣＤ３８を発現する細胞に結合した。抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９単一特異性抗体も、抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含む三重特異性結合タンパク質も、カニクイザルＣＤ３８を発現する細胞に結合しなかった。
ヒト化抗ＣＤ３８抗体抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１の結合ドメインも、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞への結合について三重特異性フォーマットにおいてテストした。抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９とは異なり、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含むＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄおよびＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質、ならびに抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１単一特異性抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドの両方に結合することができた。抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含むＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、親抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗体（ＥＣ５０＝０．５ｎＭ）より９倍低い見かけの親和性（ＥＣ５０＝４．４ｎＭ）でヒトＣＤ３８を発現する細胞に結合した。抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含むＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、親抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗体（ＥＣ５０＝１ｎＭ）より７．５倍低い見かけの親和性（ＥＣ５０＝７．５ｎＭ）でカニクイザルＣＤ３８を発現する細胞に結合した。抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含むＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含むＣＤ３８×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質（ＥＣ５０＝４．４ｎＭ）より２．５倍低い見かけの親和性（ＥＣ５０＝１１ｎＭ）でヒトＣＤ３８を発現する細胞に結合した。
ヒト化抗ＣＤ３８抗体抗ＣＤ３８＿１３７０の結合ドメインは、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞への結合について抗ＣＤ３８＿１３７０単一特異性抗体に対しても比較した。抗ＣＤ３８＿１３７０単一特異性抗体は、ヒト（ＥＣ５０＝１１．２ｎＭ）またはカニクイザル（ＥＣ５０＝６．６ｎＭ）ＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞にｎＭ範囲で結合したが、抗ＣＤ３８＿１３７０抗ＣＤ３８抗原結合ドメインを含むＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に飽和なしで結合した。
結論として、ヒトＣＤ３８に結合するＣＤ３８ＳＢ１９×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質（抗ＣＤ３８＿ＳＢ１９抗ＣＤ３８結合ドメイン）の親和性は、組換えヒトＣＤ３８への結合をＳＰＲによって調べようと、または細胞表面で発現したヒトＣＤ３８への結合をフローサイトメトリーによって調べようと、同程度であることが見出された（図３）。同様に、ＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ／ｌｏｗ（抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗ＣＤ３８結合ドメイン）およびＣＤ３８ＶＨ１×ＣＤ２８ｃｖｎ×ＣＤ３ｍｉｄ／ｌｏｗ三重特異性結合タンパク質（抗ＣＤ３８＿Ｃ２－ＣＤ３８－１＿ＶＨ１－ＶＬ１抗ＣＤ３８結合ドメイン）のヒトＣＤ３８に結合する親和性も、両方のアッセイにおいて同程度であった。ＣＤ３８ＨＨＹ１３７０×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ（抗ＣＤ３８＿１３７０抗ＣＤ３８結合ドメイン）に関して、ヒトＣＤ３８に結合するＫＤはＳＰＲによって１ｎＭと決定されたのに対し、正確なＥＣ５０値はフローサイトメトリーによって推定することができなかった（図３）。様々な抗ＣＤ３８結合ドメインを含む三重特異性結合タンパク質の見かけのＫＤ値（ＦＡＣＳ解析によって得られた）の概要を表M5に提供する。
Figure 2022512649000034
予想通り、抗ＣＤ３８結合ドメインを欠くΔＣＤ３８×ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性結合タンパク質は、ヒトまたはカニクイザルＣＤ３８ポリペプチドを発現する細胞に結合しなかった。これは、このアッセイで観察された結合がＣＤ３８抗原結合ドメインに特異的であったことを示すものである。
ＣＤ３８／ＣＤ３×ＣＤ２８ ＡｂはセントラルメモリーＣＤ４およびＣＤ８、Ｔｈ１ならびに抗原特異的応答を刺激する
ＣＤ３８／ＣＤ３×ＣＤ２８三重特異性Ａｂが細胞性免疫機能を増強し得るかどうかを決定するために、インビトロで拡大したＴ細胞の表現型を評価した。
材料および方法
末梢血単核細胞を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ（ボストン、ＭＡ）によって回収された健康なヒトドナーの血液から単離した。ＰＢＭＣを前述のように抗体被覆プレート（３５０ｎｇ／ウェル）（５×１０５細胞／ｍＬ）に添加し、３７℃で３日および７日間インキュベートした。細胞を特定の時点で回収し、Ｔ細胞サブセット：ナイーブ（ＣＣＲ７＋ ＣＤ４５ＲＯ－）、Ｔｃｍ（ＣＣＲ７＋ ＣＤ４５ＲＯ＋）、Ｔｅｍ（ＣＣＲ７－ ＣＤ４５ＲＯ＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３＋ ＣＤ２５ｈｉ）についてフローサイトメトリーによって解析した。細胞はまた、フロー染色の前にモネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）で少なくとも６時間処置して、細胞内サイトカイン発現：Ｔｈ１（ＣＤ４＋ ＩＦＮ－γ＋）、Ｔｈ２（ＣＤ４＋ ＩＬ－４＋）、およびＴｈ１７（ＣＤ４＋ ＩＬ－１７＋）を決定した。ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＢＭＣドナーのＨＬＡ（Ａ＊０２：０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、オックスフォード、ＵＫ）に限定された蛍光コンジュゲート五量体を使用して検出した。ＰＢＭＣは、既知のＣＭＶ陽性集団およびＨＬＡ型ドナーからＨｅｍａＣａｒｅ（バンナイズ、ＣＡ）から入手した。限定ＨＬＡ型に対して陰性のドナー由来のＰＭＢＣを陰性対照として使用した。染色は製造者のプロトコルに従って行った。
結果
ＣＭＶ感染ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、サイトカインの非存在下、三重特異性Ａｂまたは３つの変異抗原結合部位を有する陰性対照三重特異性抗体と７日間インキュベートした。ＣＤ４サブセットの解析は、セントラルメモリープールにおける最も大きな増殖と、エフェクターメモリー細胞のより小さな増加を明らかにした（図４Ａ）。ＣＤ４サブセットの解析はまた、Ｔｈ２またはＴｈ１７細胞と比べてＴｈ１細胞の最も大きな増殖（＞６倍）も明らかにした（図４Ｂ）。ＣＤ８サブセットでは、７日目までにセントラルメモリーＣＤ８サブセットの＞１５０倍の増加と、エフェクターメモリー細胞のより少ない増加があった（図４Ｃ）。重要なことには、ＣＭＶに対する（四量体染色を使用する血清陽性ＨＬＡ－Ａ２ドナーのｐｐ６５エピトープに対する）既存の抗原特異的ＣＤ８応答（Ｇｒａｔａｍａ ＪＷ、ｖａｎ Ｅｓｓｅｒ ＪＷら Ｂｌｏｏｄ ９８：１３５８～１３６４頁（２００１））は、ＣＤ３８三重特異性の存在下、陰性対照と比べて＞４４倍増加した（図４Ｄ）。
まとめると、これらのデータは、ＣＤ３８三重特異性Ａｂが抗腫瘍および抗ウイルス免疫をインビボで増強する可能性があるＴｈ１機能および防御的ＣＤ８メモリーＴ細胞応答を刺激することを示している。
ＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体はＣＭＶ特異的免疫応答を促進する
ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の活性化および／または増殖は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の感染などのウイルス感染に対する治療戦略を提供し得る。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の活性化および拡大を促進するＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体の能力を決定した。
材料および方法
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＣＤ３８／ＣＤ２８ｘＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャーによる各標的抗原に対する結合親和性をＥＬＩＳＡによって測定した。簡単には、各抗原を使用して、９６ウェルＩｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２００ｎｇ／ウェルの各抗原を使用して被覆した。被覆プレートをＰＢＳ中５％脱脂乳＋２％ ＢＳＡを使用してＲＴで１時間ブロックし、その後ＰＢＳ＋０．２５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した（Ａｑｕａ Ｍａｘ ４００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。抗体（三重特異性および対照Ａｂ）の連続希釈物を製造し、ＥＬＩＳＡプレートに添加し（１００μｌ／ウェル、二通り）、ＲＴで１時間インキュベートし、その後ＰＢＳ＋０．２５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄した。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗ヒトＦａｂ（１：５０００、カタログ番号１０９－０３５－０９７、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ）を各ウェルに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．２５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で５回洗浄した後、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ、ゲイサーズバーグ、ＭＤ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加した。５０μｌ １Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を止め、ＯＤ４５０をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ６．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して解析した。最終データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ＣＡ、ＵＳＡ）に移し、プロットした。同じソフトウェアを使用してＥＣ５０を算出した。
ＳＰＲアッセイ
完全速度論的解析には、ヒトＣＤ３８－Ｈｉｓ抗原を使用した（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ケンブリッジ、ＭＡ）。精製抗体の速度論的特徴付けは、ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲ技術を使用して行った。調査抗体のヒトＩｇＧ１特異的抗体捕捉および配向を使用する捕捉アッセイを使用した。タンパク質構築物を含有するＦｃの捕捉には、ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。Ｈｉｓタグ化抗原の捕捉には、抗Ｈｉｓ抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。捕捉抗体を、標準的な手順を使用して一級アミン基（１１０００ＲＵ）を介して研究グレードのＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化した。解析抗体を、典型的には３０ＲＵの最大アナライト結合シグナルをもたらす調整ＲＵ値を用いて流速１０μＬ／分で捕捉した。結合速度論を三重特異性抗体に対して測定した。アッセイ緩衝液として、ＨＢＳ ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を流速３０μｌ／分で使用した。チップ表面を、それぞれの捕捉キットの再生溶液で再生した。速度論的パラメータを解析し、参照として捕捉抗体なしのフローセルおよび物質移動を伴う１：１ラングミュア結合モデルを使用してＢＩＡ評価プログラムパッケージｖ４．１で算出した。
インビトロＴ細胞増殖測定
Ｔ細胞を、磁性Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して陰性選択によってヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ドナーから単離した。抗体を滅菌ＰＢＳで製造し、５０ｕＬを各ウェルに分注して（３５０ｎｇ／ウェル）、９６ウェル細胞培養プレートに抗体を被覆した。プレートを次いで３７℃で少なくとも２時間インキュベートし、次いで滅菌ＰＢＳで洗浄した。非接触Ｔ細胞を抗体被覆プレートに添加し（５×１０５細胞／ｍＬ）、３７℃で数日間インキュベートした。細胞を、４日目に新たな細胞培地で新鮮な抗体被覆プレートに継代した。７日間のインキュベーションを伴う特定の実験では、新鮮培地のみを新鮮な抗体被覆プレートに交換せずに添加した。細胞を特定の時点で回収し、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）計数ビーズを使用して細胞数を算出した。
インビトロＴ細胞増殖アッセイおよびＴ細胞サブセット決定
末梢血単核細胞を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ（ボストン、ＭＡ）によって回収された健康なヒトドナーの血液から単離した。ＰＢＭＣを前述のように抗体被覆プレート（３５０ｎｇ／ウェル）（５×１０５細胞／ｍＬ）に添加し、３７℃で３日および７日間インキュベートした。細胞を特定の時点で回収し、Ｔ細胞サブセット：ナイーブ（ＣＣＲ７＋ ＣＤ４５ＲＯ－）、Ｔｃｍ（ＣＣＲ７＋ ＣＤ４５ＲＯ＋）、Ｔｅｍ（ＣＣＲ７－ ＣＤ４５ＲＯ＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３＋ ＣＤ２５ｈｉ）についてフローサイトメトリーによって解析した。細胞はまた、フロー染色の前にモネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）で少なくとも６時間処置して、細胞内サイトカイン発現：Ｔｈ１（ＣＤ４＋ ＩＦＮ－γ＋）、Ｔｈ２（ＣＤ４＋ ＩＬ－４＋）、およびＴｈ１７（ＣＤ４＋ ＩＬ－１７＋）を決定した。ＣＭＶ ｐｐ６５特異的、ＥＢＶ ＢＭＬＦ特異的、インフルエンザＡ ＭＰ特異的およびＨＩＶ－１ Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＰＢＭＣドナーのＨＬＡ／ウイルスペプチド（Ａ＊０２：０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号２６）、（Ａ＊０２：０１／ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ； 配列番号２７）、（Ａ＊０２：０１／ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号２８）、および（Ａ＊０２：０１／ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ；配列番号２５）、それぞれ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、オックスフォード、ＵＫ）に限定された蛍光コンジュゲート五量体を使用して検出した。ＰＢＭＣは、既知のＣＭＶ、ＥＢＶ、またはＡ型インフルエンザドナーについてはＨｅｍａＣａｒｅ（バンナイズ、ＣＡ）から、および既知のＨＩＶ－１陽性およびＨＬＡ型ドナーについてはＢｉｏＩＶＴ（ウェストバリー、ＮＹ）から入手した。限定ＨＬＡ型に対して陰性のドナー由来のＰＭＢＣを陰性対照として使用した。染色は製造者のプロトコルに従って行った。
ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の定量化
上記したように、ＰＢＭＣを既知のＣＭＶ感染ヒトドナーの血液から単離し、三重特異性抗体または対照抗体を含有するプレートに添加した。プレートを３７℃でインキュベートした。細胞を示された時点で回収し、上記のように解析した。
結果
ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、ＣＭＶ感染ヒトドナーＢ（図５Ａ～５Ｂ）およびＣＭＶ感染ヒトドナーＣ（図６Ａ～６Ｂ）から単離したＰＢＭＣと最大１０日間のインキュベーション後、Ｔ細胞を活性化し、ＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。図５Ａ（ＣＭＶドナーＢ）および図６Ａ（ＣＭＶドナーＣ）に示したように、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてＣＭＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞／μｌ）の増加をもたらした。さらに、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてＣＭＶ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）およびセントラルメモリー（Ｔｃｍ）細胞のパーセンテージを増加させた（ＣＭＶドナーＢ、図５Ｂ；ＣＭＶドナーＣ、図６Ｂ）。
まとめると、これらのデータは、ＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体がＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＭＶ特異的エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＭＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＣＭＶ特異的Ｔ細胞の活性化および拡大を促進することを示している。
ＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体はＥＢＶ特異的免疫応答を促進する
次に、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）特異的Ｔ細胞の活性化および拡大を促進するＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体の能力を決定した。
材料および方法
ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の定量化
上記したように、ＰＢＭＣを既知のＥＢＶ感染ヒトドナーの血液から単離し、三重特異性抗体または対照抗体を含有するプレートに添加した。プレートを３７℃でインキュベートした。細胞を示された時点で回収し、上記したように解析した。
結果
ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、ＥＢＶ感染ヒトドナーＡ（図７Ａ～７Ｂ）およびＥＢＶ感染ヒトドナーＢ（図８Ａ～８Ｂ）から単離したＰＢＭＣと最大１１日間のインキュベーション後、Ｔ細胞を活性化し、ＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。図７Ａ（ＥＢＶドナーＡ）および図８Ａ（ＥＢＶドナーＢ）に示したように、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてＥＢＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞／μｌ）の増加をもたらした。さらに、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔｅｍ細胞およびＴｃｍ細胞のパーセンテージを増加させた（ＥＢＶドナーＡ、図７Ｂ；ＥＢＶドナーＢ、図８Ｂ、例えば７日目を参照のこと）。
まとめると、これらのデータは、ＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体がＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＥＢＶ特異的エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＥＢＶ特異的セントラルメモリー（Ｔｃｍ）ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＥＢＶ特異的Ｔ細胞の活性化および拡大を促進することを示している。
ＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体はＨＩＶ特異的免疫応答を促進する
次に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）特異的Ｔ細胞の活性化および拡大を促進するＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体の能力を決定した。
材料および方法
ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の定量化
上記したように、ＰＢＭＣを既知のＨＩＶ感染ヒトドナーの血液から単離し、三重特異性抗体または対照抗体を含有するプレートに添加した。プレートを３７℃でインキュベートした。細胞を示された時点で回収し、上記したように解析した。
結果
０日目（三重特異性抗体とのインキュベーションの前）、ＨＩＶ陽性ドナー由来のＰＢＭＣは、ＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＰＥにコンジュゲートされたＡ＊０２：０１－ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（ＨＩＶ－１ ｇａｇ ｐ１７ ７６－８４）ペンタマー、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を示した（図９）。例えば、３例のＨＩＶ陽性ＰＢＭＣドナーは、ＨＩＶ陰性ドナー由来のＰＢＭＣにおける０．３３％と比べて、０．８６％（ＨＩＶドナーＡ）、０．９５％（ＨＩＶドナーＢ）、および２．２７％（ＨＩＶドナーＣ）Ｇａｇ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有した。
ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体との最大１０日間のＰＢＭＣのインキュベーションは、Ｔ細胞を活性化し、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の増殖を促進した。図１０Ａ（ＨＩＶドナーＤ）、図１１Ａ（ＨＩＶドナーＥ）、および図１２Ａ（ＨＩＶドナーＦ）に示したように、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてＨＩＶ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞／μｌ）の増加をもたらした。さらに、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてＨＩＶ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリー（Ｔｅｍ）細胞（例えば、７および１０日目を参照のこと）、および程度は少ないもののＣＤ８＋セントラルメモリー（Ｔｃｍ）細胞についてもパーセンテージを増加させた（ＨＩＶドナーＤ、図１０Ｂ；ＨＩＶドナーＥ、図１１Ｂ；ＨＩＶドナーＦ、図１２Ｂ）。
ＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体はインフルエンザ特異的免疫応答を促進する
インフルエンザ特異的Ｔ細胞の活性化および拡大を促進するＣＤ３８／ＣＤ２８×ＣＤ３三重特異性抗体の能力を決定した。
材料および方法
インフルエンザ特異的Ｔ細胞の定量化
上記したように、ＰＢＭＣを既知のＡ型インフルエンザ感染ヒトドナーの血液から単離し、三重特異性抗体または対照抗体を含有するプレートに添加した。プレートを３７℃でインキュベートした。細胞を示された時点で回収し、上記したように解析した。
結果
ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、既知のインフルエンザ感染ヒトドナーから単離したＰＢＭＣと最大１１日間のインキュベーション後、Ｔ細胞を活性化し、インフルエンザ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した（図１３Ａ～１３Ｂ（インフルエンザドナーＡ））。図１３Ａに示したように、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてインフルエンザ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞／μｌ）の増加をもたらした。さらに、ＣＤ３８ＶＨ１／ＣＤ２８ｓｕｐ×ＣＤ３ｍｉｄ三重特異性抗体は、トリプル変異体対照抗体と比べてインフルエンザ（Ｆｌｕ）特異的ＣＤ８＋Ｔｅｍ細胞（例えば、７および１１日目を参照のこと）およびＴｃｍ細胞（例えば、７日目を参照のこと）のパーセンテージを増加させた（図１３Ｂ）。
まとめると、実施例１～７に提示したデータは、三重特異性抗ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８抗体が多様なウイルスに対する強力な抗ウイルス免疫を刺激することを示している。理論に縛られることを望むものではないが、ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８三重特異性抗体は、３つのリガンドの全てをＴ細胞に結合（ｅｎｇａｇｅ）させることにより、Ｔ細胞の増殖を活性化および促進することができると考えられる。特に、ＣＤ３８／ＣＤ３／ＣＤ２８三重特異性抗体によるＴ細胞へのＣＤ３／ＣＤ２８の結合は、Ｔ細胞活性化、増殖、およびメモリーＴ細胞への分化を開始すると考えられる。さらに、理論に縛られることを望むものではないが、ＣＤ２８の結合は、免疫応答の期間および程度を増強し、Ｔ細胞増殖および生存を促進する有利な同時刺激シグナルを提供すると考えられる。
本開示は様々な実施形態を含むが、変形形態および変更形態が当業者には思い浮かぶことが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲に入る全てのそのような同等の変形形態を包含することが意図される。さらに、本明細書で使用されるセクション見出しは構成目的のみのためであり、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書に記載された各実施形態は、明らかに反対の指示がない限り、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であるとして示された任意の特徴または実施形態は、明らかに反対の指示がない限り、好ましいまたは有利であるとして示された任意の他の特徴または実施形態と組み合わせることができる。
本出願において引用された全ての参考文献は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。

Claims (31)

  1. ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を拡大するための方法であって、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を結合タンパク質と接触させることを含み、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
    で表される構造を含み、第２のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
    で表される構造を含み、第３のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
    で表される構造を含み、第４のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
    で表される構造を含み、式中：
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
    式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
    ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、前記方法。
  2. ウイルス特異的なメモリーＴ細胞をインビトロまたはエクスビボで結合タンパク質と接触させる、請求項１に記載の方法。
  3. ウイルス特異的なメモリーＴ細胞を結合タンパク質と接触させることは、ウイルス特異的なメモリーＴ細胞の活性化および／または増殖を引き起こす、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. Ｔ細胞を拡大するための方法であって、Ｔ細胞をインビトロまたはエクスビボで結合タンパク質と接触させることを含み、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
    で表される構造を含み、第２のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
    で表される構造を含み、第３のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
    で表される構造を含み、第４のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
    で表される構造を含み、式中：
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
    式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
    ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、前記方法。
  5. Ｔ細胞はメモリーＴ細胞またはエフェクターＴ細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をその細胞表面に発現する、またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４または請求項５に記載の方法。
  7. 慢性ウイルス感染を処置するための方法であって、それを必要とする個体に有効量の結合タンパク質を投与することを含み、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
    で表される構造を含み、第２のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
    で表される構造を含み、第３のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
    で表される構造を含み、第４のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
    で表される構造を含み、式中：
    ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ヒンジは、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインに接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
    式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、クロスオーバー軽鎖－重鎖対を形成し；
    ＶＨ１およびＶＬ１は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合部位を形成する、前記方法。
  8. 個体はヒトである、請求項７に記載の方法。
  9. 結合タンパク質は、結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤中で個体に投与される、請求項７または請求項８に記載の方法。
  10. 結合タンパク質の投与は、個体においてウイルス特異的なメモリーＴ細胞の活性化および／または増殖をもたらす、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. メモリーＴ細胞はＣＤ８＋またはＣＤ４＋メモリーＴ細胞である、請求項１～６および１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. メモリーＴ細胞はセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）またはエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）である、請求項１～６、１０、および１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ＣＤ２８ポリペプチドはヒトＣＤ２８ポリペプチドであり、ＣＤ３ポリペプチドはヒトＣＤ３ポリペプチドであり、ＣＤ３８ポリペプチドはヒトＣＤ３８ポリペプチドである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. （ａ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＦＮ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＧＧＴ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦ（配列番号３４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＬＡＳ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含み；
    （ｂ）ＶＨ３ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＡ（配列番号３７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＱＧＧＴ（配列番号３８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹ（配列番号３３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＮＫＥＤＰＷＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む；または
    （ｃ）ＶＨ３ドメインは、ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ３ドメインは、ＱＧＩＲＮＤ（配列番号４４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＬＱＤＹＩＹＹＰＴ（配列番号４６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. （ａ）ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＳＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＩＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ（配列番号５）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号６）；のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ）ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＱＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＧＱＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）；のアミノ酸配列を含み、
    （ｃ）ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８）；のアミノ酸配列を含み、
    （ｄ）ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＳＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８）；のアミノ酸配列を含み、
    （ｅ）ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＮＭＨＷＶＫＥＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＮＧＧＴＮＹＮＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＡＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＩＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＴＧＧＬＲＲＡＹＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２３）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＧＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＬＡＳＳＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＰＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＫＥＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１８）；のアミノ酸配列を含む、または
    （ｆ）ＶＨ３ドメインはＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＧＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＦＲＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ３ドメインはＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＬＱＤＹＩＹＹＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. （ａ）ＶＨ１ドメインは、ＧＹＴＦＴＳＹＹ（配列番号１０８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＹＰＧＮＶＮＴ（配列番号１０９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＴＲＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶ（配列番号１１０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＱＮＩＹＶＷ（配列番号１１１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＡＳ（配列番号１１２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＧＱＴＹＰＹ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む；または
    （ｂ）ＶＨ１ドメインは、ＧＦＳＬＳＤＹＧ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＷＡＧＧＧＴ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ１ドメインは、ＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬ（配列番号１１７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＡＡＳ（配列番号１１８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＱＱＳＲＫＶＰＹＴ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. （ａ）ＶＨ１ドメインはＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＳＩＹＰＧＮＶＮＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＲＳＨＹＧＬＤＷＮＦＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４９）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＮＩＹＶＷＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５０）；のアミノ酸配列を含む、または
    （ｂ）ＶＨ１ドメインはＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＫＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ（配列番号５１）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ドメインはＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＰＧＱＲＡＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬＭＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＡＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＮＤＶＡＮＹＹＣＱＱＳＲＫＶＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. （ａ）ＶＨ２ドメインは、ＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１２２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＳＬＶＨＮＮＡＮＴＹ（配列番号１２３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＶＳ（配列番号１２４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１２５）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む；または
    （ｂ）ＶＨ２ドメインは、ＧＦＴＦＴＫＡＷ（配列番号１２６）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１配列、ＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴ（配列番号１２７）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２配列、およびＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹ（配列番号１２８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、ＶＬ２ドメインは、ＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹ（配列番号１２９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１配列、ＫＶＳ（配列番号１３０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２配列、およびＧＱＧＴＱＹＰＦＴ（配列番号１３１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. （ａ）ＶＨ２ドメインはＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＫＡＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＱＬＥＷＶＡＱＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５３）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインはＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＮＮＡＮＴＹＬＳＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＳＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＧＱＧＴＱＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５４）；のアミノ酸配列を含む、または
    （ｂ）ＶＨ２ドメインはＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＫＡＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＱＩＫＤＫＳＮＳＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＲＧＶＹＹＡＬＳＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８４）、のアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ドメインはＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹＬＳＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＧＱＧＴＱＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８５）のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４のうちの少なくとも１つは、独立して、０アミノ酸長である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. （ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、０アミノ酸長であるまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）；からなる群から選択される配列を含む；または（ｂ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）、およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５９）からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  22. Ｌ１は配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号５８）を含み、Ｌ２は配列ＴＫＧＰＳ（配列番号５７）を含み、Ｌ３は配列Ｓを含み、Ｌ４は配列ＲＴを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  23. 第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３４および２３５位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２３３－２３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、および２３６における欠失である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  25. 第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ４の２２８および４０９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２３４、２３５、および３２９位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａである、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  27. 第２および第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインはそれぞれ、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１の２９８、２９９、および３００位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａ、およびＹ３００Ｓである、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  28. 第２のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 第２のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖のヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従い、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  30. （ａ）第１のポリペプチド鎖は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号６３のアミノ酸配列を含み；
    （ｂ）第１のポリペプチド鎖は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号６５のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号６３のアミノ酸配列を含み；
    （ｃ）第１のポリペプチド鎖は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号６７のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号６３のアミノ酸配列を含み；
    （ｄ）第１のポリペプチド鎖は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号６９のアミノ酸配列を含み；
    （ｅ）第１のポリペプチド鎖は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号７０のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号６９のアミノ酸配列を含む；または
    （ｆ）第１のポリペプチド鎖は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号６６のアミノ酸配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号７１のアミノ酸配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号６９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
  31. ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、または単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－２）である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
JP2021519642A 2018-10-09 2019-10-08 三重特異性抗ｃｄ３８、抗ｃｄ２８、および抗ｃｄ３結合タンパク質ならびにウイルス感染を処置するための使用方法 Active JP7462621B2 (ja)

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