BR112021006558A2

BR112021006558A2 - proteínas de ligação triespecíficas anti-cd38, anti-cd28 e anti-cd3 e métodos de uso para o tratamento de infecção viral

Info

Publication number: BR112021006558A2
Application number: BR112021006558-0A
Authority: BR
Inventors: Lan Wu; Catherine Prades; Ling Xu; Edward Seung; Ronnie Wei; Gary Nabel; Zhi-Yong Yang; Tarik Dabdoubi; Béatrice Cameron; Cendrine Lemoine
Original assignee: Sanofi
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2021-07-13
Also published as: TW202035458A; US20200140552A1; CO2021004534A2; WO2020076853A1; AU2019357467A1; JP7462621B2; CA3115679A1; CN113166254A; MX2021004147A; SG11202103478RA; EP3864043A1; US20230357401A1; JP2022512649A; IL282126A; KR20210075129A; US11530268B2

Abstract

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO TRIESPECÍFICAS ANTI-CD38, ANTI-CD28 E ANTI-CD3 E MÉTODOS DE USO PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÃO VIRAL. A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de infecção viral utilizando proteínas de ligação triespecíficas que compreendem quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação ao antígeno e que se ligam especificamente a um polipeptídeo CD38 (por exemplo, polipeptídeos de CD38 humano e/ou de macaco cynomolgus), um polipeptídeo CD28 e um polipeptídeo CD3.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROTEÍ- NAS DE LIGAÇÃO TRIESPECÍFICAS ANTI-CD38, ANTI-CD28 E ANTI-CD3 E MÉTODOS DE USO PARA O TRATAMENTO DE INFEC- ÇÃO VIRAL”. REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS DE PATENTERELACIONA-

DOS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade deste ao Pedido de Patente Internacional No PCT/US2018/055084, de- positado em 09 de outubro de 2018; ao Pedido de Patente U.S. Provi- sório No de Série 62/831 572, depositado em 09 de abril de 2019; ao Pedido de Patente U.S. Provisório No de Série 62/831 608, depositado em 09 de abril de 2019; e ao Pedido de Patente EP No 19306097.7, depositado em 11 de setembro de 2019; cujos conteúdos são aqui in- corporados, em sua totalidade, por referência.

APRESENTAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[0002] O conteúdo da seguinte apresentação em arquivo de texto ASCII é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome do ar- quivo: 183952032140SEQLIST.TXT, data de registro: 02 de outubro de 2019, tamanho: 144 KB).

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se a métodos para utilização de proteínas de ligação triespecíficas que compreendem quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação ao antígeno que se li- gam especificamente a um polipeptídeo CD38 (por exemplo, polipeptí- deos CD38 humano e/ou de macaco cynomolgus), um polipeptídeo CD28 e um polipeptídeo CD3 para expansão de células T de memória (por exemplo, células T de memória vírus-específicas) e/ou o tratamento de infecção viral crônica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Como parte da imunidade adaptativa humana, a imunidade de células T desempenha um papel crucial no controle da infecção viral, eliminando as células infectadas, o que resulta na depuração da infec- ção viral. Em doenças infecciosas crônicas, como infecção por herpes- vírus (HSV, CMV, EBV etc.), HIV e HBV, os vírus estabelecem sua per- sistência nos humanos por vários mecanismos, incluindo supressão imune, exaustão de células T e estabelecimento de latência. Não obs- tante, a infecção viral em geral induz uma imunidade específica ao an- tígeno viral, incluindo células T CD8 antígeno-específicas que podem reconhecer prontamente as células infectadas e controlar ou eliminar processos de morte mediados pela liberação de citocinas ou por células T citotóxicas (CTL).

[0005] Desse modo, a ativação e/ou amplificação de células T es- pecíficas para antígenos virais in vivo e/ou ex vivo pode proporcionar estratégias terapêuticas contra infecções virais crônicas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção provê anticorpos triespecíficos anti- CD38/CD28xCD3 que foram desenvolvidos e avaliados quanto ao seu potencial para ativar células T e subsequente proliferação e/ou amplifi- cação de células T antígeno-específicas. Esses Abs triespecíficos po- dem expandir efetivamente populações de CD4 e CD8 efetoras e de memória, incluindo células de memória efetora e células T CD de me- mória central antígeno-específicas in vitro. Especificamente, foi de- monstrada a expansão in vitro de células CD8 de memória efetora e de memória central específicas para CMV, EBV, HIV-1, Influenza. Os anti- corpos triespecíficos anti-CD38/CD28xCD3 aqui descritos exibiram no- vas propriedades ao envolverem CD3/CD28/CD38, fornecendo vias de sinalização para estimular e expandir células T, e que podem oferecer uma estratégia eficaz para o tratamento de doenças infecciosas crôni- cas tais como infecções por HSV, CMV, EBV, HIV-1 e HBV.

[0007] Para atender a essas e a outras necessidades, são aqui pro- vidas proteínas de ligação que se ligam a um polipeptídeo CD38 (por exemplo, polipeptídeos CD38 humano e de macaco cynomolgus), um polipeptídeo CD28 e um polipeptídeo CD3.

[0008] Em algumas modalidades, provê-se um método para expan- dir células T de memória vírus-específicas, o qual compreende colocar uma célula T de memória vírus-específica em contato com uma proteína de ligação, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam os três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina;

VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge (dobradiça) de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes (linkers) aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

[0009] Em algumas modalidades, provê uma proteína de ligação que compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam os três sí- tios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I]

e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina;

hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38 para uso na expansão de células T de memória vírus-específicas.

[0010] Em algumas modalidades, a célula T de memória vírus-es- pecífica é colocada em contato com a proteína de ligação in vitro ou ex vivo. Em algumas modalidades, o contato da célula T de memória vírus- específica com a proteína de ligação provoca ativação e/ou proliferação de células T de memória vírus-específicas.

[0011] Em algumas modalidades, provê-se um método para expan- dir células T, o qual compreende colocar uma célula T em contato com uma proteína de ligação in vitro ou ex vivo, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam os três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compre- ende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III]

e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

[0012] Em algumas modalidades, provê-se uma proteína de ligação que compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam os três sí- tios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina;

VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38 para uso em um método para ex- pansão de células T.

[0013] Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T de me- mória ou uma célula T efetora. Em algumas modalidades, a célula T expressa um receptor de antígeno quimérico (CAR) na sua superfície celular ou compreende um polinucleotídeo que codifica um CAR.

[0014] Em algumas modalidades, provê-se um método para tratar infecção viral crônica, o qual compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias poli- peptídicas que formam os três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina;

CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

[0015] Em algumas modalidades, provê-se uma proteína de ligação que compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam os três sí- tios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que:

VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38 para uso em um método para o tratamento de infec- ção viral crônica, em que o dito método compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da prote- ína de ligação.

Em algumas modalidades, provê-se uma proteína de li- gação para uso em um método para o tratamento de infecção viral crô- nica, em que o dito método compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da proteína de ligação, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias polipeptídicas que formam os três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica da proteína de ligação compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica da proteína de ligação compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica da proteína de ligação compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica da proteína de ligação compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina;

VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

[0016] Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em al- gumas modalidades, a proteína de ligação é administrada ao indivíduo em uma formulação farmacêutica compreendendo a proteína de ligação e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, administração da proteína de ligação resulta na ativação e/ou prolifera- ção de células T de memória vírus-específicas no indivíduo.

[0017] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, as células T de memória são células T CD8+ ou CD4+ de memória. Em algumas modalidades, as células T de memória são células T de memória central (TCM) ou cé- lulas T de memória efetora (TEM).

[0018] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, o polipeptídeo CD28 é um polipeptídeo CD28 humano, em que o polipeptídeo CD3 é um polipeptí- deo CD3 humano e em que o polipeptídeo CD38 é um polipeptídeo CD38 humano.

[0019] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, o domínio VH3 compre- ende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), uma sequência CDR-H2 com- preendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de ami- noácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), e o domínio VL3 com- preende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de ami- noácidos de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LAS (SEQ ID NO:35) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). Em algumas modalidades, o domí- nio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a se- quência de aminoácidos de GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), uma sequên- cia CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGQGGT (SEQ ID NO:38) e uma sequência CDR-H3 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de GAS (SEQ ID NO:40) e uma sequência CDR-L3 compre- endendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID

NO:36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma se- quência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFT- FSSYG (SEQ ID NO:41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IWYDGSNK (SEQ ID NO:42) e uma se- quência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), e o domínio VL3 compreende uma se- quência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QGIRND (SEQ ID NO:44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AAS (SEQ ID NO:45) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLQQSGAELVRSGASVK- MSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:5) e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGV-

PARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:6). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compre- ende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGAS- VKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13) e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS- QSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRATGI-

PARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:14). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compre- ende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGAS- VKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT

YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17) e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSG- TDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a se- quência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS- GYTFTSFNMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSG- TDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a se- quência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS- GYTFTSFNMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSG- TDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a se- quência de aminoácidos de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG- FTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYD-

GSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMF RGAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácidos de AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS- QGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-

RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:10).

[0020] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, o domínio VH1 compre- ende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), uma sequência CDR-H2 com- preendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNVNT (SEQ ID NO:109) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QNIYVW (SEQ ID NO:111), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de KAS (SEQ ID NO:112) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQGQTYPY (SEQ ID NO:113). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IWAGGGT (SEQ ID NO:115) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116), e o do- mínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a se- quência de aminoácidos de ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), uma se- quência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AAS (SEQ ID NO:118) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVR- QAPGQGLEWIGSIYPGN-

VNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRSHYG LDWNFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:49, e o domínio VL1 compre- ende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSAS- VGDRVTITCQASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPS-

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:50). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLQESGPGLVKPSQTLS- LTCTVSGFSLSDYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNPS-

LKSRKTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDKGYSYYYSMDY WGQGTTVTVS (SEQ ID NO:51) e o domínio VL1 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASES- VEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV-

PARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDVANYYCQQSRKVPYTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO:52).

[0021] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, o domínio VH2 compre- ende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de GFTFTKAW (SEQ ID NO:120), uma sequência CDR-H2 com- preendendo a sequência de aminoácidos de IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:121) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de KVS (SEQ ID NO:124) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125). Em algumas modali- dades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de GFTFTKAW (SEQ ID NO:126), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:127) e uma sequência CDR-H3 compre- endendo a sequência de aminoácidos de GVYYALSPFDY (SEQ ID NO:128), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compre- endendo a sequência de aminoácidos de QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO:129), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de KVS (SEQ ID NO:130) e uma sequência CDR-L3 compre- endendo a sequência de aminoácidos de GQGTQYPFT (SEQ ID

NO:131). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende a se- quência de aminoácidos de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG- FTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKD-

KSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRG VYYALSPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:53) e o domínio VL2 com- preende a sequência de aminoácidos de DIVMTQTPLSLSVTPGQPA- SISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSN-

RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFG SGTKVEIK (SEQ ID NO:54). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVES- GGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVR- QAPGKGLEWVAQIKD-

KSNSYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRG VYYALSPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:84) e o domínio VL2 com- preende a sequência de aminoácidos de DIVMTQTPLSLSVTPGQPA- SISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSN-

RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFG GGTKVEIK (SEQ ID NO:85).

[0022] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, pelo menos um dentre L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4 têm cada um independente- mente zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequên- cia selecionada a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4 compreendem independentemente uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID

NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO:57), L3 compreende a sequência S e L4 compreende a sequência RT.

[0023] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, os domínios hinge-CH2- CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são os domínios IgG4 hinge-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições cor- respondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A e L235A. Em algumas modalidades, os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são os domínios hinge-CH2-CH3 da IgG4 hu- mana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posi- ções 233-236 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são E233P, F234V, L235A e uma deleção em 236. Em algumas modalidades, os domínios hinge-CH2-CH3 da se- gunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 da IgG4 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às po- sições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P e R409K. Em algumas mo- dalidades, os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 da IgG1 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de ami- noácidos em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são L234A, L235A e P329A. Em algumas modalidades, os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 da IgG1 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 298, 299 e 300 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S298N, T299A e Y300S. Em algumas modalidades, o domínio hinge-CH2-CH3 da segunda cadeia polipeptídica compreende substitui- ções de aminoácidos em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que o domínio hinge-CH2-CH3 da terceira cadeia polipeptí- dica compreende substituições de aminoácidos em posições correspon- dentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S354C e T366W. Em algumas modalidades, o domínio hinge-CH2-CH3 da segunda cadeia polipeptídica compreende substituições de aminoácidos em po- sições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 hu- mana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoá- cidos são S354C e T366W; e em que o domínio hinge-CH2-CH3 da ter- ceira cadeia polipeptídica compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A e Y407V.

[0024] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:62 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas modalidades,

a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a terceira cadeia polipep- tídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:65 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptí- dica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a se- gunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67 e a quarta cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas mo- dalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:68 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:69. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a terceira cadeia polipeptídica compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:71 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69.

[0025] Em algumas modalidades que podem ser combinadas com quaisquer outras modalidades aqui descritas, o vírus é um vírus da imu- nodeficiência humana (HIV), vírus Influenza, citomegalovírus (CMV), ví- rus da hepatite B (HBV), papilomavírus humano (HPV), vírus Epstein- Barr (EBV), vírus espumoso humano (HFV), vírus herpes simples tipo 1 (HSV-1) ou vírus herpes simples tipo 1 [sic] (HSV-2).

[0026] Deverá ser entendido que uma, algumas ou todas as propri- edades das várias modalidades aqui descritas podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Esses e outros aspectos da invenção ficarão evidentes para o técnico no assunto. Es- sas e outras modalidades da invenção são descritas mais detalhada- mente pela descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] A Figura 1 fornece uma representação esquemática de uma proteína de ligação triespecífica compreendendo quatro cadeias poli- peptídicas que formam três sítios de ligação ao antígeno que se ligam a três proteínas alvo: CD28, CD3 e CD38. Um primeiro par de polipeptí- deos possui domínios variáveis duplos com uma orientação cruzada (VH1-VH2 e VL2-VL1) e formando dois sítios de ligação ao antígeno que reconhecem CD3 e CD28, e um segundo par de polipeptídeos que pos- sui um único domínio variável (VH3 e VL3) formando um único sítio de ligação ao antígeno que reconhece CD38. A proteína de ligação tries- pecífica mostrada na Figura 1 usa uma região constante de IgG4 com uma mutação “knobs-into-holes”, onde o knob está no segundo par de polipeptídeos com um único domínio variável.

[0028] A Figura 2 resume as afinidades de ligação das proteínas de ligação triespecíficas indicadas contra seus antígenos cognatos (CD3, CD28 e CD38 humanos) como medidas por SPR.

[0029] A Figura 3 resume a afinidade de ligação das proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3 por CD38 hu- mano, como medida por SPR ou citometria de fluxo (FACS).

[0030] As Figuras 4A-4D mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em resposta a anticorpos triespecí- ficos contra CD38VH1/CD3midxCD28sup. A avaliação da expansão do subconjunto de células T foi realizada revestindo os poços com 350 ng/poço do Ab triespecífico contra CD38 na ausência de citocinas exó- genas. As populações de células T foram medidas nos momentos indi- cados. Um Ab triespecífico tendo três domínios de ligação ao antígeno modificados por mutação foi usado como controle negativo. Usou-se ci- tometria de fluxo para determinar células T CD4 de memória central (Tcm) e efetora (Tem) (Figura 4A), células T helper (Th1, Th17, Th2) (Fi- gura 4B), células T CD8 de memória central (Tcm) e efetora (Tem) (Figura 4C) e células CD8 específicas para pp65 de citomegalovírus (CMV) (Fi- gura 4D) como descrito no Exemplo 3. A análise de células efetoras es- pecíficas para pp65 de CMV foi realizada por coloração de pentâmeros de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores HLA-A2 CMV+ tratadas com o anticorpo triespecífico contra CD38 ou o anticorpo triplo controle negativo.

[0031] As Figuras 5A-5B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador B infectado por CMV em resposta ao anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medi- das nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quanti- ficar as células T CD8+ de memória específicas para CMV (Figura 5A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e memória efetora (Tem) específicas para CMV (Figura 5B). O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a prolife- ração de células T CD8+ de memória específica para CMV.

[0032] As Figuras 6A-6B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador C infectado por CMV em resposta ao anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medi- das nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quanti- ficar células T CD8+ de memória específicas para CMV (Figura 6A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e memória efetora (Tem) específicas para CMV (Figura 6B). O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a prolife- ração de células T CD8+ de memória específica para CMV.

[0033] As Figuras 7A-7B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador A infectado pelo vírus Epstein-Barr (EBV) em resposta ao anticorpo tries- pecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medidas nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mu- tante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quantificar células T CD8+ de memória específicas para EBV (Figura 7A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e memória efetora (Tem) específicas para EBV (Figura 7B). O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a prolife- ração de células T CD8+ de memória específicas para EBV.

[0034] As Figuras 8A-8B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador B infectado por EBV em resposta ao anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medi- das nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quanti- ficar células T CD8+ de memória específicas para EBV (Figura 8A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e memória efetora (Tem) específicas para EBV (Figura 8B). O anticorpo triespecífico

CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a prolife- ração de células T CD8+ de memória específicas para EBV.

[0035] A Figura 9 mostra perfis de citometria de fluxo de PBMCs dos doadores indicados positivos para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) (painéis inferiores e painel superior direito) analisados quanto a células T CD8+ específicas para Gag do HIV (A*02:01 - SLYNTVATL (HIV-1 gag p17 76-84) Pentâmero conjugado a PE, ProImmune) no ba- sal (Dia 0; antes da incubação com anticorpos triespecíficos). PBMCs de um doador negativo para HIV foram usadas como controle negativo (painel superior esquerdo). As porcentagens da população de células T CD8+ específicas para Gag são fornecidas e mostradas como caixas de inserção. No basal, as PBMCs de doadores positivos para HIV contêm células T CD8+ específicas para Gag do HIV. Os Doadores A-C na Fi- gura 9 são os mesmos doadores D-F mostrados nas Figuras 10A-12B.

[0036] As Figuras 10A-10B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador D positivo para HIV em resposta ao anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medi- das nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quanti- ficar Células T CD8+ de memória específicas para HIV (Figura 10A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e memória efetora (Tem) específicas para HIV (Figura 10B). O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a prolife- ração de células T CD8+ de memória efetora (Tem).

[0037] As Figuras 11A-11B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador E positivo para HIV em resposta ao anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medi- das nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quanti- ficar as células T CD8+ de memória específicas para HIV (Figura 11A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e memória efetora (Tem) específicas para HIV (Figura 11B). O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a prolife- ração de células T CD8+ de memória efetora (Tem).

[0038] As Figuras 12A-12B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador F positivo para HIV em resposta ao anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medi- das nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quanti- ficar células T CD8+ de memória específicas para HIV (Figura 12A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e memória efetora (Tem) específicas para HIV (Figura 12B). O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a prolife- ração de células T CD8+ de memória efetora (Tem).

[0039] As Figuras 13A-13B mostram a caracterização da expansão de um subconjunto de células T in vitro em PBMCs coletadas do Doador A infectado pelo vírus Influenza em resposta ao anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid. As populações de células T foram medi- das nos momentos indicados. O anticorpo triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Usou-se citometria de fluxo para quanti- ficar células T CD8+ de memória específica para o vírus Influenza (Flu) (Figura 13A), bem como células T CD8+ de memória central (Tcm) e me- mória central (Tem) específicas para Flu (Figura 13B). O anticorpo tries- pecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a proliferação de células T CD8+ Tem (por exemplo, ver os Dias 7, 11) e células T CD8+ Tcm (por exemplo, ver o Dia 7).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0040] A invenção provê proteínas de ligação triespecíficas compre- endendo quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a um polipeptídeo CD38 (por exemplo, polipeptídeos CD38 humano e de macaco cynomolgus), um polipeptídeo CD28 e um polipeptídeo CD3, e que podem encontrar uti- lidade, por exemplo, na expansão de células T de memória (por exem- plo, células T de memória vírus-específicas) e/ou no tratamento de in- fecção viral crônica. I. Definições gerais

[0041] Como utilizados de acordo com a presente invenção, será entendido que os termos seguintes, a menos que indicado o contrário, terão os significados a seguir. A menos que requerido de outra forma pelo contexto, termos no singular incluirão pluralidades e termos no plu- ral incluirão o singular. Neste relatório descritivo e nas reivindicações anexadas, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referen- tes no plural a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a “uma molécula” inclui opcional- mente uma combinação de duas ou mais de tais moléculas e semelhan- tes.

[0042] Entende-se que aspectos e modalidades da presente inven- ção aqui descritos incluem “compreendendo”, “consistindo” e “consis- tindo essencialmente em” aspectos e modalidades.

[0043] O termo “polinucleotídeo”, neste relatório descritivo, refere- se a polímeros de ácidos nucleico de fita simples ou fita dupla com pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, os nu- cleotídeos compreendidos no polinucleotídeo podem ser ribonucleotí- deos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Tais modificações incluem modificações na base como bromuridina, modificações na ribose como arabinosídeo e 2',3'-

didesoxirribose, e modificações na ligação internucleotídeo como fosfo- rotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforo- anilotioato, fosforoaniladato e fosforoamidato. O termo “polinucleotídeo” inclui especificamente formas de fita simples e fita dupla de DNA.

[0044] Um “polinucleotídeo isolado” é um polinucleotídeo de DNA genômico, cDNA ou de origem sintética ou alguma combinação dos mesmos, que: (1) não está associado com todo ou uma parte de um polinucleotídeo no qual o polinucleotídeo isolado é encontrado na natu- reza, (2) está ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[0045] Um “polipeptídeo isolado” é aquele que: (1) está livre de pelo menos alguns outros polipeptídeos com os quais seria normalmente en- contrado, (2) está essencialmente livre de outros polipeptídeos da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separado de pelo menos cerca de 50 por cento dos polinucleotídeos, lipídios, carboidratos ou outros materiais com os quais está associado na natureza, (5) não está asso- ciado (por interação covalente ou não covalente) com partes de um po- lipeptídeo com as quais o “polipeptídeo isolado” está associado na na- tureza, (6) está operacionalmente associado (por interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual não está associado na natureza ou (7) não ocorre na natureza. Tal polipeptídeo isolado pode ser codificado por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, o polipeptídeo isolado é substancialmente livre de polipeptídeos ou ou- tros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interferiria com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, em pes- quisa ou outro qualquer).

[0046] Os anticorpos naturais compreendem tipicamente um tetrâ- metro. Cada um de tais tetrâmetros é composto tipicamente por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par com uma cadeia “leve” completa (tipicamente com peso molecular de aproximadamente 25 kDa) e uma cadeia “pesada” completa (tipicamente com peso mole- cular de aproximadamente 50-70 kDa). Os termos “cadeia pesada” e “cadeia leve”, neste relatório descritivo, referem-se a qualquer polipep- tídeo de imunoglobulina tendo uma sequência de domínio variável sufi- ciente para conferir especificidade para um antígeno alvo. A porção amino-terminal de cada cadeia leve e pesada inclui tipicamente inclui um domínio variável com cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos e é tipicamente responsável pelo reconhecimento do antígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define tipicamente um domínio cons- tante responsável pela função efetora. Assim, em um anticorpo natural, um polipeptídeo completo da cadeia pesada de uma imunoglobulina in- clui um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2, e CH3), em que o domínio VH está na terminação amino do polipeptídeo e o domínio CH3 está na terminação carboxila, e um polipeptídeo completo da cadeia pesada de uma imunoglobulina inclui um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), em que o domínio VL está na terminação amino do polipeptídeo e o domínio CL está na terminação carboxila.

[0047] As cadeias leves humanas são classificadas tipicamente como cadeias leves kappa e lambda, e as cadeias pesadas humanas são classificadas tipicamente como mu, delta, gama, alfa, ou épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respecti- vamente. IgG possui várias subclasses, incluindo, entre outras, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM possui subclasses incluindo, entre outras, IgM1 e IgM2. IgA é igualmente dividida em subclasses incluindo, entre outras, IgA1 e IgA2. Nas cadeias leves e pesadas completes, os domínios vari-

áveis e constantes são unidos tipicamente por uma região “J” de apro- ximadamente 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região “D” com aproximadamente 10 ou mais aminoáci- dos. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., Raven Press, 2a ed., 1989), que é aqui incorporado, em sua totalidade, por re- ferência para todos os efeitos. As regiões variáveis de cada par de ca- deia pesada/leve formam tipicamente um sítio de ligação ao antígeno. Os domínios variáveis de anticorpos naturais exibem tipicamente a mesma estrutura geral de regiões framework (arcabouço) (FR) relativa- mente conservadas, unidas por três regiões hipervariáveis, também de- nominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par tipicamente são alinhadas pelas regiões framework, o que pode permitir a ligação a um epítopo especí- fico. Da terminação amino à terminação carboxila, ambos os domínios variáveis da cadeia leve e pesada compreendem tipicamente os domí- nios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.

[0048] O termo “conjunto de CDRs” refere-se a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de se ligar ao antígeno. Os limites exatos dessas CDRs foram definidos diferente- mente de acordo com sistemas diferentes. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) e (1991)) não só proporciona um sistema inequívoco de numeração dos resíduos aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também fornece limites precisos de resíduos que definem as três CDRs. Essas CDRs podem ser referi- das como CDRs de Kabat. Chothia e colaboradores (Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877- 83) verificaram que certas subporções dentro das CDRs de Kabat ado- tam conformações quase idênticas no esqueleto peptídico, apesar de haver grande diversidade em nível da sequência de aminoácidos. Essas subporções foram designadas L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3, onde o “L” e o “H” designam as regiões da cadeia leve e da cadeia pesada, respec- tivamente.

Essas regiões podem ser referidas como CDRs de Chothia, cujos limites se sobrepõem às CDRs de Kabat.

Outros limites que defi- nem CDRs sobrepondo-se às CDRs de Kabat foram descritos por Pa- dlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39; MacCallum, 1996, J.

Mol.

Biol. 262(5): 732-45; e Lefranc, 2003, Dev.

Comp.

Immunol. 27: 55-77. Outras defi- nições ainda para limites de CDRs podem não seguir rigorosamente um desses sistemas acima, mas, não obstante, ainda se sobreporão às CDRs de Kabat, embora possam ser encurtadas ou prolongadas à luz da predição ou achados experimentais de que resíduos particulares ou grupos de resíduos ou mesmos CDRs inteiras não afetam significativa- mente a ligação ao antígeno.

Os métodos aqui usados podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora certas modalidades usem CDRs definidas por Kabat ou Chothia.

A iden- tificação de CDRs previstas usando a sequência de aminoácidos é bem conhecida no campo, tal como em Martin, A.C. “Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains”, In Antibody Enginee- ring, Vol. 2. Kontermann R., Dübel S., eds.

Springer-Verlag, Berlin, p. 33–51 (2010). A sequência de aminoácidos do domínio variável da ca- deia pesada e/ou da cadeia leve pode também ser inspecionada para identificar as sequências das CDRs por outros métodos convencionais, por exemplo, por comparação a sequências conhecidas de aminoácidos de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade da sequência.

As sequências numeradas podem ser alinhadas visualmente, ou empregando um programa de ali- nhamento, tal como aquele da suíte de programas CLUSTAL, como descrito em Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Modelos moleculares são usados convencionalmente para delinear corretamente regiões framework e de CDRs e, assim, corrigir as atribuições com base na sequência.

[0049] Em algumas modalidades, a definição de CDR/FR em uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina deverá ser determinada com base na definição IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).

[0050] O termo “Fc”, neste relatório descritivo, refere-se a uma mo- lécula compreendendo a sequência de um fragmento que não se liga ao antígeno, resultante da digestão de um anticorpo ou produzido por ou- tros meios, quer em forma monomérica ou multimérica, e pode conter a região hinge (dobradiça). A fonte da imunoglobulina original da Fc nativa é de preferência de origem humana e pode ser qualquer uma das imu- noglobulinas. As moléculas de Fc são compostas por polipeptídeos mo- noméricos que podem se ligar em formas diméricas ou multiméricas por associação covalente (ou seja, ligações dissulfeto) e não covalente. O número de ligações dissulfeto intermoleculares entre as subunidades monoméricas de moléculas nativas de Fc varia de 1 a 4 dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA e IgE) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2 e IgG4). Um exemplo de Fc é um dímero unido por ligação dissulfeto resultante da digestão por papaína de uma IgG. O termo “Fc nativa”, neste relatório descritivo, é genérico para formas mo- noméricas, diméricas e multiméricas.

[0051] Um fragmento F(ab) inclui tipicamente inclui uma cadeia leve e os domínios VH e CH1 de uma cadeia pesada, em que a porção da cadeia pesada VH-CH1 do fragmento F(ab) não pode formar uma ligação dissulfeto com outro polipeptídeo da cadeia pesada. Neste relatório des- critivo, um fragmento F(ab) pode também incluir uma cadeia leve con- tendo dois domínios variáveis separados por um ligante aminoácido e uma cadeia pesada contendo dois domínios variáveis separados por um ligante aminoácido e um domínio CH1.

[0052] Um fragmento F(ab') inclui tipicamente inclui uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém a maior parte da re- gião constante (entre os domínios CH1 e CH2), de tal modo que uma li- gação dissulfeto intercadeia pode ser formada entre as duas cadeias pesadas para formar uma molécula de F(ab')2.

[0053] O termo “proteína de ligação”, neste relatório descritivo, re- fere-se a uma molécula não natural (ou recombinante ou projetada) que se liga especificamente a pelo menos um antígeno alvo, por exemplo, um polipeptídeo CD38 da presente invenção

[0054] Uma molécula “recombinante” é aquela que foi preparada, expressa, criada ou isolada por meios recombinantes.

[0055] Uma modalidade da invenção provê proteínas de ligação com especificidade biológica e imunológica para entre um e três antíge- nos alvo. Outra modalidade da invenção provê moléculas de ácido nu- cleico compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam ca- deias polipeptídicas que formam tais proteínas de ligação. Outra moda- lidade da invenção provê vetores de expressão compreendendo molé- culas de ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam cadeias polipeptídicas que formam tais proteínas de liga- ção. Ainda outra modalidade da invenção provê células hospedeiras que expressam tais proteínas de ligação (ou seja, compreendendo molécu- las de ácidos nucleicos ou vetores que codificam cadeias polipeptídicas que formam tais proteínas de ligação).

[0056] O termo “swapability”, neste relatório descritivo, refere-se à permutabilidade de domínios variáveis dentro do formato de proteína de ligação e com retenção do dobramento e afinidade de ligação final. “Swapability completa” refere-se à capacidade para trocar a ordem de ambos os domínios VH1 e VH2 e, portanto, a ordem de domínios VL1 e VL2, na cadeia polipeptídica de fórmula I ou na cadeia polipeptídica de fórmula II (ou seja, reverter a ordem) enquanto mantendo funcionalidade completa da proteína de ligação como evidenciado pela retenção da afi- nidade de ligação. Além disso, deve-se ressaltar que as designações VH e VL referem-se somente à localização do domínio em uma determinada cadeia proteica no formato final. Por exemplo, VH1 e VH2 poderiam ser derivados de domínios VL1 e VL2 em anticorpos precursores e colocados nas posições de VH1 e VH2 na proteína de ligação. Do mesmo modo, VL1 e VL2 poderiam ser derivados de domínios VH1 e VH2 em anticorpos pre- cursores e colocados nas posições de VH1 e VH2 na proteína de ligação. Assim, as designações VH e VL referem-se à presente localização e não a localização original em um anticorpo precursor. Os domínios VH e VL são, portanto, “swappable” (permutáveis).

[0057] O termo “antígeno” ou “antígeno alvo” ou “alvo antigênico”, neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula ou uma parte de uma molécula que é capaz de ser ligada por uma proteína de ligação e, além disso, é capaz de ser usada em um animal para produzir anticor- pos capazes de se ligar a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno alvo pode ter um ou mais epítopos. Em relação a cada antígeno alvo reconhecido por uma proteína de ligação, a proteína de ligação é capaz de competir com um anticorpo intacto que reconhece o antígeno alvo.

[0058] “CD38” é um polipeptídeo do cluster de diferenciação 38 e é uma glicoproteína encontrada na superfície de muitas células imunes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente inven- ção liga-se ao domínio extracelular de um ou mais polipeptídeos CD38. Sequências polipeptídicas exemplares do domínio extracelular de CD38 incluem, entre outros, o domínio extracelular de CD38 humano (por exemplo, como representado por SEQ ID NO:1) e o domínio extracelular de CD38 de macaco cynomolgus (por exemplo, como representado por SEQ ID NO:30).

[0059] O termo “células T engager” refere-se a proteínas de ligação direcionadas para o sistema imune de um hospedeiro, mais especifica- mente para a atividade de células T, bem como direcionadas para uma proteína tumoral alvo.

[0060] O termo “proteína de ligação monoespecífica” refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a um antígeno alvo.

[0061] O termo “proteína de ligação monovalente” refere-se a uma proteína de ligação que possui um sítio de ligação ao antígeno.

[0062] O termo “proteína de ligação biespecífica” refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a dois alvos antigênicos diferentes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação biespe- cífica liga-se a dois antígenos diferentes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação biespecífica liga-se a dois epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[0063] O termo “proteína de ligação bivalente” refere-se a uma pro- teína de ligação que possui dois sítios de ligação.

[0064] O termo “proteína de ligação triespecífica” refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a três alvos antigênicos diferentes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação triespe- cífica liga-se a três antígenos diferentes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação triespecífica liga-se a um, dois ou três epítopos di- ferentes no mesmo antígeno.

[0065] O termo “proteína de ligação trivalente” refere-se a uma pro- teína de ligação que possui três sítios de ligação. Em modalidades es- pecíficas, a proteína de ligação trivalente pode ligar-se a um alvo anti- gênico. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode ligar-se a dois alvos antigênicos. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode ligar-se a três alvos antigênicos.

[0066] Uma proteína de ligação “isolada” é aquela que foi identifi- cada e separada e/ou recuperada de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são ma- teriais que interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos da pro- teína de ligação, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em algumas modalidades, a prote- ína de ligação será purificada: (1) até mais de 95% em peso do anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry e, de maior preferência, mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência interna de aminoácidos ou N-terminal pelo uso de um sequenciador spinning cup ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras utilizando corante azul de Coomassie, de preferência, e prata. As proteínas de ligação iso- ladas incluem a proteína de ligação in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína de ligação não esteja presente.

[0067] Os termos “substancialmente puro” ou “substancialmente pu- rificado”, neste relatório descritivo, referem-se a um composto ou espé- cie que é a espécie predominante presente (ou seja, em base molar, é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composi- ção). Em algumas modalidades, uma fração substancialmente purifi- cada é uma composição em que a espécie compreende pelo menos cerca de 50% (em base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em outras modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentes. Em ainda outras modalidades, a espécie é purificada até a homogeneidade es- sencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na compo- sição por métodos convencionais de detecção), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.

[0068] O termo “epítopo” inclui qualquer determinante, de preferên- cia, um determinante polipeptídico, capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em certas modalidades, os epítopos ou determinantes incluem agrupamentos quimicamente ativos na superfície de moléculas como aminoácidos, cadeias laterais de açú- cares, grupos fosforila ou grupos sulfonila e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas de carga. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo ou proteína de ligação. Em cer- tas modalidades, diz-se que uma proteína de ligação se liga especifica- mente a um antígeno quando esta reconhece preferencialmente seu an- tígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromolécu- las. Em algumas modalidades, diz-se que uma proteína de ligação se liga especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação no equilíbrio é ≤ 10-8 M, mais preferivelmente quando a constante de dissociação no equilíbrio é ≤ 10-9 M e, o de maior preferência, quando a constante de dissociação é ≤ 10-10 M.

[0069] A constante de dissociação (KD) de uma proteína de ligação pode ser determinada, por exemplo, por ressonância plasmônica de su- perfície. Em geral, a análise por ressonância plasmônica de superfície mede as interações de ligação em tempo real entre o ligando (ligand) (um antígeno alvo em uma matriz biossensora) e o analito (uma proteína de ligação em solução) pela ressonância plasmônica de superfície (SPR) usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). A análise por ressonância plasmônica de superfície pode também ser realizada imobilizando o analito (proteína de ligação em uma matriz biossensora) e apresentando o ligando (antígeno alvo). O termo “KD”, neste relatório descritivo, refere-se à constante de dissociação da inte- ração entre uma proteína de ligação em particular e um antígeno alvo.

[0070] O termo “liga-se a”, neste relatório descritivo, em referência a uma proteína de ligação refere-se à capacidade de uma proteína de ligação ou um fragmento de ligação ao antígeno da mesma ligar-se a um antígeno contendo um epítopo com Kd pelo menos próxima ou su- perior a 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10- 11 M, 1 x 10-12 M e/ou ligar-se a um epítopo com uma afinidade pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade por um antígeno não específico. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção liga-se a dois ou mais antígenos, por exemplo, um poli- peptídeo CD38 humano e um de macaco cynomolgus.

[0071] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno e/ou proteína de ligação da presente invenção “reage de modo cruzado” com polipeptídeos CD38 humano e de macaco cynomolgus, por exemplo, domínios extracelulares de CD38 tais como SEQ ID NO:1 (isoforma A de CD38 humano), SEQ ID NO:105 (isoforma E de CD38 humano) e SEQ ID NO:30 (CD38 de macaco cynomolgus). Uma prote- ína de ligação que se liga ao antígeno 1 (Ag1) exibe “reatividade cru- zada” com o antígeno 2 (Ag2) quando as EC50s estão em uma faixa semelhante para ambos os antígenos. No presente pedido de patente, uma proteína de ligação que se liga ao antígeno Ag1 exibe reatividade cruzada com Ag2 quando a razão de afinidade de Ag2 para afinidade de Ag1 é igual ou inferior a 10 (por exemplo, 5, 2, 1 ou 0,5), sendo as afinidades medidas com o método para ambos os antígenos.

[0072] Uma proteína de ligação que se liga ao antígeno Ag1 “não exibe reatividade cruzada significativa” com Ag2 quando as afinidades são muito diferentes para os dois antígenos. A afinidade por Ag2 pode não ser mensurável se a resposta de ligação for baixa demais. No pre- sente pedido de patente, uma proteína de ligação que se liga a Ag1 não exibe reatividade cruzada significativa com Ag2, quando a resposta de ligação da proteína de ligação a Ag2 é inferior a 5% da resposta de ligação da mesma proteína de ligação a Ag1 na mesma configuração experimental e na mesma concentração de anticorpo. Na prática, a con-

centração usada da proteína de ligação pode ser a EC50 ou a concen- tração necessária para atingir o platô de saturação obtido com Ag1.

[0073] O termo “ligante” (linker), neste relatório descritivo, refere-se a um ou mais resíduos de aminoácidos inseridos entre domínios da imu- noglobulina para proporcionar mobilidade suficiente aos domínios das cadeias leves e pesadas para se dobrarem em imunoglobulinas de re- giões variáveis duplas cruzadas. Um ligante é inserido na transição en- tre domínios variáveis ou entre domínios variáveis e constantes, respec- tivamente, em nível da sequência. A transição entre domínios pode ser identificada porque o tamanho aproximado dos domínios das imunoglo- bulinas é bem entendido. A localização precisa de uma transição de do- mínios pode ser determinada localizando trechos peptídicos que não formam elementos estruturais secundários, tais como folhas beta ou hé- lices alfa, como demonstrado por dados experimentais ou como pode ser pressuposto por técnicas de modelamento ou predição da estrutura secundária. Os ligantes aqui descritos são referidos como L1, que está localizado na cadeia leve entre o C-terminal do VL2 e o N-terminal do domínio VL1; e L2, que está localizado na cadeia leve entre o C-terminal do VL1 e o N-terminal do domínio CL. Os ligantes da cadeia pesada são conhecidos como L3, que está localizado entre o C-terminal do VH1 e o N-terminal do domínio VH2; e L4, que está localizado entre o C-terminal do VH2 e o N-terminal do domínio CH1.

[0074] O termo “vetor”, neste relatório descritivo, refere-se a qual- quer molécula (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo ou vírus) que é usada para transferir informações de codificação a uma célula hospe- deira. O termo “vetor” inclui uma molécula de ácido nucleico que seja capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma molécula de DNA circular de fita dupla na qual segmentos adicionais de DNA podem ter sido in-

seridos. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicio- nais de DNA podem ser inseridos no genoma viral. Certos vetores são capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de re- plicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissomais de mamíferos) podem ser inte- grados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma do hos- pedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expres- são de genes aos quais estão ligados operativamente. Tais vetores são referidos no presente como “vetores de expressão recombinante” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, os vetores de expres- são de utilidade nas técnicas do DNA recombinante estão frequente- mente na forma de plasmídeos. Os termos “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados alternadamente no presente, pois um plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção destina-se a incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados com defeito de replicação), que servem funções equivalentes.

[0075] A expressão “célula hospedeira recombinante” (ou “célula hospedeira”) neste relatório descritivo refere-se a uma célula na qual tenha sido introduzido um vetor de expressão pretende referir-se não só à célula individual em questão, mas também à progênie de tal célula. Por certas modificações poderem ocorrer em gerações sucessivas de- vido à mutação ou a influências ambientais, tal progênie pode, de fato, não ser idêntica à célula precursora, mas tais células ainda são abran- gidas pelo âmbito do termo “célula hospedeira” neste relatório descritivo. Uma grande variedade de sistemas de expressão em célula hospedeira pode ser utilizada para expressar as proteínas de ligação, incluindo sis- temas de expressão em bactérias, leveduras, baculovírus e mamíferos

(bem como sistemas de expressão de exibição em fagos). Um exemplo de um vetor de expressão bacteriano adequado é pUC19. Para expres- sar uma proteína de ligação por recombinação, uma célula hospedeira é transformada ou transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinante carregando fragmentos de DNA que codificam as cadeias polipeptídicas da proteína de ligação, de tal modo que as cadeias poli- peptídicas são expressas na célula hospedeira e, de preferência, secre- tadas no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas e a prote- ína de ligação pode ser recuperada desse meio.

[0076] O termo “transformação”, neste relatório descritivo, refere-se a uma mudança nas características genéticas de uma célula, e uma cé- lula foi transformada quando foi modicada para conter um novo DNA. Por exemplo, uma célula é transformada quando é modificada genetica- mente de seu estado nativo. Após a transformação, o DNA transforma- dor pode recombinar-se com aquele da célula por integração física em um cromossomo da célula, ou pode ser mantido transitoriamente como um elemento epissomal sem ser replicado, ou pode replicar-se indepen- dentemente como um plasmídeo. Considera-se que uma célula tenha sido transformada estavelmente quando o DNA é replicado com a divi- são da célula. O termo “transfecção”, neste relatório descritivo, refere- se à absorção de um DNA estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi “transfectada” quando o DNA exógeno foi introduzido para dentro da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são conhe- cidas na técnica. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais moléculas do DNA exógeno em células hospedeiras adequa- das.

[0077] O termo “de ocorrência natural”, neste relatório descritivo, e aplicado a um objeto refere-se ao fato de que o objeto pode ser encon- trado na natureza e não foi manipulado pelo homem. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que está presente em um organismo (in- cluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e não tendo sido modificado intencionalmente pelo homem é de ocorrência natural. Do mesmo modo, “de ocorrência não natural”, neste relatório descritivo, refere-se a um objeto que não é encontrado na natureza ou que foi modificado estruturalmente ou sintetizado pelo homem.

[0078] Neste relatório descritivo, os vinte aminoácidos convencio- nais e suas abreviações seguem o uso convencional. Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais; aminoácidos não naturais e análogos como aminoácidos , -dissubs- tituídos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para as ca- deias polipeptídicas da proteínas de ligação. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, -carboxiglutamato, - N,N,N-trimetil-lisina, -N-acetil-lisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N- formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, -N-metilarginina e ou- tros aminoácidos semelhantes e iminoácidos (por exemplo, 4-hidroxi- prolina). Em uma anotação usada neste relatório descritivo para poli- peptídeos, a direção para a esquerda é a direção do terminal amino, e a direção para a direita é a direção do terminal carboxila, de acordo com o uso padrão e a convenção.

[0079] Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes tendo por base as propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrofóbicos: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro; (2) hidrofílicos polares: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr; (3) alifáticos: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro; (4) hidrofóbicos alifáticos: Ala, Ile, Leu, Val, Pro; (5) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (6) ácidos: Asp, Glu;

(7) básicos: His, Lys, Arg; (8) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (9) aromáticos: His, Trp, Tyr, Phe; e (10) hidrofóbicos aromáticos: Phe, Trp, Tyr.

[0080] As substituições conservadoras de aminoácidos podem en- volver a troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. Substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.

[0081] O técnico no assunto será capaz de determinar variantes adequadas das cadeias polipeptídicas das proteínas de ligação por meio de técnicas bem conhecidas. Por exemplo, o técnico no assunto pode identificar áreas adequadas de uma cadeia polipeptídica que pode ser trocada sem destruir a atividade com direcionamento para regiões que se acredita não sejam importantes para atividade. Alternativamente, o técnico no assunto pode identificar resíduos e partes das moléculas que são conservadas entre polipeptídeos semelhantes. Além disso, mesmo áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para estrutura podem ser submetidas a substituições conservadoras de aminoácidos sem destruir a atividade biológica ou sem afetar adversa- mente a estrutura do polipeptídeo.

[0082] O termo “paciente”, neste relatório descritivo, inclui sujeitos humanos e animais (por exemplo, mamíferos, como cães, porcos, ca- valos, gatos, vacas etc.).

[0083] Os termos “tratamento” ou “tratar” neste relatório descritivo referem-se a tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventi- vas. Aqueles com necessidade de tratamento incluem aqueles portado- res de um transtorno, bem como aqueles propensos a apresentar o transtorno ou aqueles nos quais o transtorno deve ser prevenido. Em modalidades específicas, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar humanos com infecção viral crônica, ou melhorar a infecção viral crônica em um humano.

[0084] Os termos “composição farmacêutica” ou “composição tera- pêutica” neste relatório descritivo referem-se a um composto ou compo- sição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando devida- mente administrado a um paciente.

[0085] O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” ou “carreador fisiologicamente aceitável”, neste relatório descritivo, refere-se a um ou mais materiais da formulação, adequados para conseguir ou intensificar a entrega de uma proteína de ligação.

[0086] Os termos “quantidade eficaz” e “quantidade terapeutica- mente eficaz”, quando usados em referência a uma composição farma- cêutica que compreende uma ou mais proteínas de ligação, referem-se a uma quantidade ou dose suficiente para produzir um resultado tera- pêutico desejado. Mais especificamente, uma quantidade terapeutica- mente eficaz é uma quantidade de uma proteína de ligação suficiente para inibir, por algum período de tempo, um ou mais processos patoló- gicos clinicamente definidos associados com a condição em tratamento. A quantidade eficaz pode variar dependendo da proteína de ligação es- pecífica usada, e também depende de uma variedade de fatores e con- dições relacionados ao paciente em tratamento e a gravidade do trans- torno. Por exemplo, se a proteína de ligação tiver que ser administrada in vivo, fatores como a idade, peso e saúde do paciente bem como cur- vas de dose-resposta e dados de toxicidade obtidos no trabalho pré- clínico com animais devem estar entre esses fatores considerados. A determinação de uma quantidade eficaz ou quantidade terapeutica- mente eficaz de uma dada composição farmacêutica está bem ao al- cance da capacidade dos técnicos no assunto.

[0087] Uma modalidade da invenção provê uma composição farma- cêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação. Proteínas de ligação triespecíficas

[0088] Certos aspectos da presente invenção referem-se a proteí- nas de ligação triespecíficas (por exemplo, que se ligam a polipeptídeos CD38, CD28 e CD3). Qualquer uma das CDRs ou domínios variáveis de qualquer uma das proteínas de ligação ao antígeno aqui descritos podem encontrar uso em uma proteína de ligação triespecífica da pre- sente invenção.

[0089] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da invenção é uma proteína de ligação triespecífica compreendendo quatro cadeias polipeptídicas que formam três sítios de ligação ao antígeno que se li- gam a um ou mais (por exemplo, três) alvos antigênicos ou proteínas alvo diferentes. Em algumas modalidades, uma primeira cadeia polipep- tídica compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina;

VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada. Em algumas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a segunda cadeia poli- peptídica têm uma orientação cruzada que forma dois sítios distintos de ligação ao antígeno.

[0090] Em algumas modalidades, VH1 e VL1 formam um primeiro sí- tio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD28 é um polipeptídeo CD28 humano. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD3 é um polipeptídeo CD3 humano. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD38 é um polipep- tídeo CD38 humano. Em algumas modalidades, a proteína de ligação triespecífica compreende um ou mais sítios de ligação ao antígeno des- critos abaixo.

[0091] As proteínas de ligação da invenção podem ser preparadas usando domínios ou sequências obtidas ou derivadas de qualquer anti- corpo humano ou não humano, incluindo, por exemplo, anticorpos hu- manos, murinos ou humanizados. Em algumas modalidades, uma pro- teína de ligação da presente invenção é um anticorpo. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modali- dades, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Sítios de ligação anti-CD38

[0092] Certos aspectos da presente invenção referem-se a proteí- nas de ligação que compreendem um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38 (por exemplo, polipeptídeos CD38 hu- mano e de macaco cynomolgus).

[0093] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação ou frag- mento de ligação ao antígeno da mesma exibe reatividade cruzada com CD38 humano (por exemplo, um polipeptídeo da isoforma A e/ou iso- forma E de CD38 humano) e CD38 de macaco cynomolgus. Em algu- mas modalidades, uma proteína de ligação induz apoptose de uma cé- lula CD38+. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação recruta uma célula T para uma célula CD38+ e opcionalmente ativa a célula T (por exemplo, através de estimulação e/ou coestimulação de TCR).

[0094] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO:38) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de ami- noácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); e/ou um domínio va- riável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESV- DSYGNGF (SEQ ID NO:34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LAS (SEQ ID NO:35) ou GAS (SEQ ID NO:40) e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de an- ticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a se- quência de aminoácidos de GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO:38) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequên- cia CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESV- DSYGNGF (SEQ ID NO:34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO:132), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LAS (SEQ ID NO:35) ou GAS (SEQ ID NO:40) e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs de uma sequência do domínio VH e/ou VL dos anticorpos antiCD38_C2-CD38-1, antiCD38_C2-CD38- 1_VH1-VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2-CD38-

1_VH5-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3, CD38HHY1370 (pode tam- bém ser referido como antiCD38_1370), antiCD38_C2-CD38-1_VH1- VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, antiCD38_C2-CD38-1_VH1- VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, antiCD38_C2-CD38- 1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, CD38HHY1370xCD28su- pxCD3mid IgG4 FALA, CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A ou CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, como mostra- dos nas Tabelas G, H ou I.

[0095] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSFN (SEQ ID NO:31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO:38) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de ami- noácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); e um domínio variá- vel de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESV- DSYGNGF (SEQ ID NO:34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LAS (SEQ ID NO:35) ou GAS (SEQ ID NO:40) e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

[0096] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequên- cia CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESV- DSYGNGF (SEQ ID NO:34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LAS (SEQ ID NO:35) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQNKED- PWT (SEQ ID NO:36). Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), uma se- quência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) e uma sequência CDR-H3 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); e um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LAS (SEQ ID NO:35) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de ami- noácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). Em outras modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGQGGT (SEQ ID NO:38) e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLR- RAYFTY (SEQ ID NO:33); e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GAS (SEQ ID NO:40) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a se-

quência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36). Em algu- mas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), uma sequência CDR-H2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de IYPGQGGT (SEQ ID NO:38) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33); e um domínio variável de ca- deia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GAS (SEQ ID NO:40) e uma sequência CDR-L3 com- preendendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36).

[0097] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a se- quência, do N-terminal ao C-terminal, FR1—CDR-H1—FR2—CDR- H2—FR3—CDR-H3—FR4; onde FR1 compreende a sequência QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:86), QVQLVQSGA- EVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO:87) ou QVQLVQSGAEVVK- PGASVKMSCKAS (SEQ ID NO:88); onde FR2 compreende a sequên- cia MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO:90) ou MHWVKEA- PGQGLEWIGY (SEQ ID NO:91); onde FR3 compreende a sequência NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:93) ou NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO:94); e onde FR4 compreende a sequência WGQG- TLVTVSS (SEQ ID NO:96). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência, do N-terminal ao C-terminal, FR1—CDR- L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4; onde FR1 compreende a sequência DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS (SEQ ID NO:97); onde FR2 compreende a sequência MHWYQQKPGQPPRLLIY (SEQ ID

NO:99); onde FR3 compreende a sequência SRATGIPARFSGSGSG- TDFTLTISPLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:101); e onde FR4 compre- ende a sequência FGGGTKLEIK (SEQ ID NO:103).

[0098] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6. Em algu- mas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de ami- noácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:21; e/ou o domínio VL compre- ende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo me- nos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH com- preende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO:23; e/ou o domínio VL compreende uma sequên- cia de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo me- nos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma se- quência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos

96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.

[0099] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:5; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6. Em algumas mo- dalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos

97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:21; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:23; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13; e o do- mínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo me- nos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.

[0100] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:5; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6. Em algumas modalida- des, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:17; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:21; e o domínio VL compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:18. Em algumas mo- dalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:23; e o domínio VL compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, o domínio VH com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14.

[0101] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: uma cadeia pesada de anticorpo que compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e/ou uma cadeia leve de an- ticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente inven- ção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19 e/ou uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22 e/ou uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com-

preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24 e/ou uma ca- deia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15 e/ou uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

[0102] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19 e uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:22 e uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24 e uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:15 e uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

[0103] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IWYDGSNK (SEQ ID NO:42) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43); e/ou um domínio va- riável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QGIRND (SEQ ID NO:44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AAS (SEQ ID NO:45) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46). Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD38 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFTFSSYG (SEQ ID NO:41), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IWYDGSNK (SEQ ID NO:42) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43); e um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QGIRND (SEQ ID NO:44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de AAS (SEQ ID NO:45) e uma sequência CDR-L3 compre- endendo a sequência de aminoácidos de LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

[0104] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a se- quência, do N-terminal ao C-terminal, FR1—CDR-H1—FR2—CDR- H2—FR3—CDR-H3—FR4; onde FR1 compreende a sequência QVQL- VESGGGVVQPGRSLRLSCAAS (SEQ ID NO:89); onde FR2 compre- ende a sequência MHWVRQAPGKGLEWVAV (SEQ ID NO:92); onde FR3 compreende a sequência YYADSVKGRFTIS- GDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:95); e onde FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:96). Em algu- mas modalidades, o domínio VL compreende a sequência, do N-termi- nal ao C-terminal, FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3— FR4; onde FR1 compreende a sequência AIQMTQSPSSLSAS- VGDRVTITCRAS (SEQ ID NO:98); onde FR2 compreende a sequência GWYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:100); onde FR3 compreende a se- quência SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC (SEQ ID NO:102); e onde FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:104).

[0105] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10.

[0106] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos

92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9; e o domínio VL compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO:10.

[0107] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11 ou uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:11 e uma cadeia leve de anticorpo que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12. Sítios de ligação anti-CD28

[0108] Certos aspectos da presente invenção referem-se a proteí- nas de ligação que compreendem um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD28 (por exemplo, um polipeptídeo CD28 humano).

[0109] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD28 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNVNT (SEQ ID NO:109) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110) e/ou um domí- nio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma se- quência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QNIYVW (SEQ ID NO:111), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de KAS (SEQ ID NO:112), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQGQTYPY (SEQ ID NO:113). Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD28 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), uma se- quência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IYPGNVNT (SEQ ID NO:109) e uma sequência CDR-H3 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110) e um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QNIYVW (SEQ ID NO:111), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de KAS (SEQ ID NO:112) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQGQTYPY (SEQ ID NO:113).

[0110] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD28 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IWAGGGT (SEQ ID NO:115) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116) e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), uma sequência CDR-L2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de AAS (SEQ ID NO:118) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119). Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD28 compreende: um domínio variável de cadeia pe-

sada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IWAGGGT (SEQ ID NO:115) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116) e um domínio variável de cadeia leve (VL) de anti- corpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a se- quência de aminoácidos de ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), uma se- quência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AAS (SEQ ID NO:118) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119). Sítios de ligação anti-CD3

[0111] Certos aspectos da presente invenção referem-se a proteí- nas de ligação que compreendem um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 (por exemplo, um polipeptídeo CD3 hu- mano).

[0112] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD3 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFTFTKAW (SEQ ID NO:120), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IKD- KSNSYAT (SEQ ID NO:121) e uma sequência CDR-H3 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122) e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de KVS (SEQ ID NO:124) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125). Em algumas modali-

dades, um sítio de ligação que liga CD3 compreende: um domínio vari- ável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequên- cia CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFTFT- KAW (SEQ ID NO:120), uma sequência CDR-H2 compreendendo a se- quência de aminoácidos de IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:121) e uma se- quência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122) e um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de KVS (SEQ ID NO:124) e uma sequência CDR-L3 compre- endendo a sequência de aminoácidos de GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125).

[0113] Em algumas modalidades, um sítio de ligação que liga CD3 compreende: um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de GFTFTKAW (SEQ ID NO:126), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de IKD- KSNSYAT (SEQ ID NO:127) e uma sequência CDR-H3 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de GVYYALSPFDY (SEQ ID NO:128) e/ou um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo que compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO:129), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de KVS (SEQ ID NO:130) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GQGTQYPFT (SEQ ID NO:131).

[0114] Em algumas modalidades de qualquer uma das proteínas de ligação triespecíficas da presente invenção, um domínio de ligação ao antígeno liga-se a um polipeptídeo CD3 (por exemplo, CD3 humano) e um domínio de ligação ao antígeno liga-se a um polipeptídeo CD28 (por exemplo, CD28 humano). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:49 ou 51 como mostradas na Tabela H, e o domínio VL1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:50 ou 52 como mostradas na Tabela H. Em algumas modalidades, o domí- nio VH2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:49 ou 51 como mostra- das na Tabela H, e o domínio VL2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:50 ou 52 como mostradas na Tabela H. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:53 ou 84 como mostradas na Tabela H, e o domínio VL1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:54 ou 85 como mostradas na Tabela H. Em algumas modalida- des, o domínio VH2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:53 ou 84 como mostradas na Tabela H e o domínio VL2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs:54 ou 85 como mostradas na Tabela H.

[0115] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:50, o domínio VH2 compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53 e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54. Em algu- mas modalidades, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO:49, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:50, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53 e o domínio VL1 compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:54. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:51, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:52, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53 e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO:54. Em algumas modalidades, o domínio VH2 com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:51, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:52, o domínio

VH1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53 e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54.

[0116] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:50, o domínio VH2 compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:13 e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, o domínio VL1 compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:53, o domínio VL2 compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9 e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10.

[0117] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica com- preende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia poli- peptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:62 e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptí- dica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idên- tica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo me- nos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a ter- ceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:65 e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência po- lipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptí- dica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda ca- deia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67 e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência po- lipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptí- dica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda ca- deia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:68 e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência po- lipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptí- dica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda ca- deia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70 e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência po- lipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptí- dica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda ca- deia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência polipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:71 e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência po- lipeptídica que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69.

[0118] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:62 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a terceira cadeia polipep- tídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:65 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptí- dica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a se- gunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67 e a quarta cadeia polipeptídica com-

preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:63. Em certas mo- dalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:68 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:69. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a terceira cadeia polipeptídica compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69. Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compre- ende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:71 e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:69.

[0119] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências de CDRs de uma sequência de anticorpo mostrada na Tabela G. Em algumas mo- dalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências de CDR, uma sequência do domínio VH e/ou uma sequência do domínio VL de uma sequência de anticorpo mostrada na Tabela H. Em algumas modalidades, uma proteína de liga- ção da presente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências de CDR, uma sequência do domínio VH e/ou uma sequência do domínio VL de uma sequência de anticorpo mostrada na Tabela I. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compre- ende 1, 2, 3 ou 4 sequências polipeptídicas mostras na Tabela I.

Tabela G. Sequências de CDR de proteínas de ligação anti-CD38 Ab CDR_H1 CDR_H2 CDR_H3 CDR_L1 CDR_L2 CDR_L3

GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF LAS QQNKEDPWT antiCD38_C2-CD38-1 (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:32) (SEQ ID NO:33) (SEQ ID NO:34) (SEQ ID NO:35) (SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38- GYTFTSYA IYPGQGGT ARTGGLRRAYFTY QSVSSYGQGF GAS QQNKEDPWT 1_VH1-VL1 (SEQ ID NO:37) (SEQ ID NO:38) (SEQ ID NO:33) (SEQ ID NO:39) (SEQ ID NO:40) (SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38- GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF LAS QQNKEDPWT 1_VH3-VL3 (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:32) (SEQ ID NO:33) (SEQ ID NO:34) (SEQ ID NO:35) (SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38- GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF LAS QQNKEDPWT 1_VH5-VL3 (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:32) (SEQ ID NO:33) (SEQ ID NO:34) (SEQ ID NO:35) (SEQ ID NO:36) antiCD38_C2-CD38- GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF LAS QQNKEDPWT 71/149 1_VH6-VL3 (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:32) (SEQ ID NO:33) (SEQ ID NO:34) (SEQ ID NO:35) (SEQ ID NO:36)

GFTFSSYG IWYDGSNK ARMFRGAFDY QGIRND AAS CD38HHY1370 LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46) (SEQ ID NO:41) (SEQ ID NO:42) (SEQ ID NO:43) (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO:45)

Tabela H. Sequências de domínios variáveis de proteínas de ligação anti-CD38 e outras Ab VH (proteína) VL (proteína) QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFN- DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNG- MHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN- FMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGV- antiCD38_C2-CD38-1

QKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTG PARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWT GLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:5) FGGGTKLEIK (SEQ ID NO:6 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYT- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQG- antiCD38_C2-CD38- FTSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGTNYN- FMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRAT 1_VH1-VL1 QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTG GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKED- GLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13) PWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:14) QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFN- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNG- antiCD38_C2-CD38- MHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN- FMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT 1_VH3-VL3 QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTG GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKED- GLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17) PWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFN- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNG- antiCD38_C2-CD38- MHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN- FMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT 1_VH5-VL3 QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTG GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKED- GLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) PWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFN- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNG- antiCD38_C2-CD38- MHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN- FMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT 1_VH6-VL3 QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTG GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKED- GLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23) PWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYG- AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQK- MHWVRQAPGKGLEWVAVIWYD- PGKAPKLLIYAASSLQSGVPS- CD38HHY1370

GSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQ YYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) GTKVEIK (SEQ ID NO:10) QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYW- DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKAS- MQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGD- QDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVP- antiCD38_SB19

GDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVY DRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTF YCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:47) GGGTKLEIK (SEQ ID NO:48) QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVR- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIY- QAPGQGLEWIGSIYPGN- VWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPS- Anti-CD28sup

VNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYY RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQ CTRSHYGLDWNFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:49) GTKLEIK (SEQ ID NO:50) QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSDYGVHWVR- DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVEYYVTS- QPPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNPS- LMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV- Anti-CD28cvn

LKSRKTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDKGYS PARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDVANYYCQQSRKVPYT YYYSMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:51) FGQGTKLEIK (SEQ ID NO:52) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAW- DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNAN- MHWVRQAPGKQLEWVAQIKD- TYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSN- Anti-CD3mid KSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAED RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGT TAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID QYPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO:54) NO:53) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAW- DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQS- MHWVRQAPGKGLEWVAQIKD- LVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSN- Anti-CD3low KSNSYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGT TAVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID QYPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) NO:84) Observação: As sequências de CDR estão em negrito e sub- linhadas nas sequências de aminoácidos acima. Tabela I. Sequências completas de proteínas de ligação antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLE- SEQ ID NO: 60 IgG4(hole) FALA WIGSIYPGN- (por exemplo, uma segunda cadeia poli- VNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRSHYGLDWNFDV peptídica de uma proteína de ligação tri- WGKGTTVTVSSSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVR- específica da presente invenção) QAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDT

AVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPCSRSTSES- TAALGCLVK- DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVV- DVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKG- FYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSLG Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQS- SEQ ID NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia poli- LIYKVSN- peptídica de uma proteína de ligação tri- RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEIKG específica da presente invenção) QPKAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYVWLNWYQQK- PGKAPKLLIYKASN-

LHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKTK GPSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL- QSGNSQESVTE-

QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Cadeia pesada 2 de antiCD38_C2- QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLE- SEQ ID NO: 62 CD38-1_VH1-VL1 IgG4(knob) FALA WIGYIYPGQGGTNYN- (por exemplo, uma terceira cadeia poli- QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTL peptídica de uma proteína de ligação tri- VTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- específica da presente invenção) TSGVHTFPA-

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD- GVEVHNAKTK- PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG Cadeia leve 2 de antiCD38_C2-CD38- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPR- SEQ ID NO: 63 1_VH1-VL1 LLIYGASSRATGI- (por exemplo, uma quarta cadeia poli- PARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAP peptídica de uma proteína de ligação tri- SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE- específica da presente invenção) QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLE- SEQ ID NO: 64 IgG1(hole) LALA P329A WIGSIYPGN- (por exemplo, uma segunda cadeia poli- VNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRSHYGLDWNFDV peptídica de uma proteína de ligação tri- WGKGTTVTVSSSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVR- específica da presente invenção) QAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG- TAALGCLVK-

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG- FYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Cadeia pesada 2 de antiCD38_C2- QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLE- SEQ ID NO: 65 CD38-1_VH1-VL1 IgG1(knob) LALA WIGYIYPGQGGTNYN- P329A QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTL (por exemplo, uma terceira cadeia poli- VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- peptídica de uma proteína de ligação tri- TSGVHTFPA- específica da presente invenção) VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKT-

KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve 2 de antiCD38_C2-CD38- Ver acima. SEQ ID NO: 63 1_VH1-VL1 (por exemplo, uma quarta cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLE- SEQ ID NO: 66 IgG1(hole) NNSA WIGSIYPGN- (por exemplo, uma segunda cadeia poli- VNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRSHYGLDWNFDV peptídica de uma proteína de ligação tri- WGKGTTVTVSSSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVR- específica da presente invenção) QAPGKQLEWVAQIKDKSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCRGVYYALSPFDYWGQGTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG- TAALGCLVK-

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNNASRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG- FYPSDIA- VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPG CD28supxCD3mid Light Chain 1 Ver acima. SEQ ID NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLE- SEQ ID NO: 67 IgG1(knob) NNSA Heavy Chain 2 WIGYIYPGQGGTNYN- (por exemplo, uma terceira cadeia poli- QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTL peptídica de uma proteína de ligação tri- VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- específica da presente invenção) TSGVHTFPA-

VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKT- KPREEQYNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve 2 de CD38VH1 Ver acima. SEQ ID NO: 63 (por exemplo, uma quarta cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO: 60 IgG4(hole) FALA (por exemplo, uma segunda cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Cadeia pesada 2 de CD38HHY1370 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVI- SEQ ID NO: 68 IgG4(knob) FALA WYD- (por exemplo, uma terceira cadeia poli- GSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWG peptídica de uma proteína de ligação tri- QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS- específica da presente invenção) GALTSGVHT-

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD- GVEVHNAKT- KPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG Leve 2 de CD38HHY1370 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASS- SEQ ID NO: 69

(por exemplo, uma quarta cadeia poli- LQSGVPS- peptídica de uma proteína de ligação tri- RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI específica da presente invenção) FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC CD38HHY1370 xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO: 64 IgG1(hole) LALA P329A (por exemplo, uma segunda cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Cadeia pesada 2 de CD38HHY1370 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVI- SEQ ID NO: 70 IgG1(knob) LALA P329A WYD- (por exemplo, uma terceira cadeia poli- GSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWG peptídica de uma proteína de ligação tri- QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS- específica da presente invenção) GALTSGVHT-

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV- D- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPG Leve 2 de CD38HHY1370 Ver acima. SEQ ID NO: 69 (por exemplo, uma quarta cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO: 66 IgG1(hole) NNSA (por exemplo, uma segunda cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Cadeia pesada 2 de CD38HHY1370 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVI- SEQ ID NO: 71 IgG1(knob) NNSA WYD- (por exemplo, uma terceira cadeia poli- GSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWG peptídica de uma proteína de ligação tri- QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS- específica da presente invenção) GALTSGVHT-

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPG Leve 2 de CD38HHY1370 Ver acima. SEQ ID NO: 69 (por exemplo, uma quarta cadeia poli- peptídica de uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção) Anticorpo monovalente antiCD38_C2-CD38-1 Cadeia pesada antiCD38_C2-CD38-1 QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKETPGQGLE- SEQ ID NO: 7 WIGYIYPGNGGTNYN-

QKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKT- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve antiCD38_C2-CD38-1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQK- SEQ ID NO: 8

PGQPPKLLIYLASNLES GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGT- KLEIKRTVAAP- SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD

SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Anticorpo monovalente antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 Cadeia pesada antiCD38_C2-CD38- QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEAPGQRLE- SEQ ID NO: 15 1_VH1-VL1 WIGYIYPGQGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKT- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve antiCD38_C2-CD38- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPR- SEQ ID NO: 16 1_VH1-VL1 LLIYGASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGT-

KLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Anticorpo monovalente antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 Cadeia pesada antiCD38_C2-CD38- QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLE- SEQ ID NO: 19 1_VH3-VL3 WIGYIYPGNGGTNYN-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve antiCD38_C2-CD38- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPR- SEQ ID NO: 20 1_VH3-VL3 LLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGT-

KLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Anticorpo monovalente antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 Cadeia pesada antiCD38_C2-CD38- QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQGLE- SEQ ID NO: 22 1_VH5-VL3 WIGYIYPGNGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKT- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve antiCD38_C2-CD38- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPR- SEQ ID NO: 20 1_VH5-VL3 LLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGT-

KLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Anticorpo monovalente antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 Cadeia pesada antiCD38_C2-CD38- QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEAPGQRLE- SEQ ID NO: 24 1_VH6-VL3

WIGYIYPGNGGTNYN- QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPA- VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKT- KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL-

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Cadeia leve antiCD38_C2-CD38- DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDSYGNGFMHWYQQKPGQPPR- SEQ ID NO: 20 1_VH6-VL3 LLIYLASSRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGT-

KLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Anticorpo monovalente CD38HHY1370 Cadeia pesada CD38HHY1370 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVI- SEQ ID NO: 11 WYD-

GSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMFRGAFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS- GALTSGVHT- FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPG Cadeia leve CD38HHY1370 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASS- SEQ ID NO: 12

LQSGVPS RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIKRTVAAP- SVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Anticorpo monovalente antiCD38_SB19 Cadeia pesada antiCD38_SB19 QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIG- SEQ ID NO: 107 TIYPGD-

GDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDY WGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS- GAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK- FNWYVD- GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

KSLSLSPGK Cadeia leve antiCD38_SB19 DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRR- SEQ ID NO: 106 LIYSASYRYIGVP-

DRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKRTVAAPS VFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK-

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Tabela J. Sequências polinucleotídicas completas de proteí- nas de ligação antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCG- SEQ ID NO:72 IgG4(hole) FALA CCTCTGTGAAGGTG- (por exemplo, codificando uma segunda TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACTACATCCACTGGGTGC cadeia polipeptídica de uma proteína de GCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATCGGCAGCATCTACCCCGG- ligação triespecífica da presente inven- CAACGTGAACAC- ção) CAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGACCGTGGACACCAGC

ATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGAGAAGCGACGACACCG- CCGTGTACTACTG- CACCCGGTCCCACTACGGCCTGGATTGGAACTTCGACGTGTGGGGCAAGGGC ACCACCGTGACAGTGTCTAGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGG- CGGAGTGGTGCA- GCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCACC AAGGCCTGGATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGAAAGCAGCTGGAA- TGGGTGGCCCAGAT- CAAGGACAAGAGCAACAGCTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA- TGAACAGCCTG- CGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTCGGGGCGTGTACTATGCCCTGA GCCCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACCGTGTCTAGTCGGA- CCGCCAGCA- CAAAGGGCCCATCGGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCAGCAGAAGCACCAGCGA ATCTACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCG- TGACCGTG- TCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGC TCCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCA- GCAGCCTGGG- CACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCAG- CCCCTGAAGCTG- CCGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGAT GATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGA- AGATCCCGAGG- TGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAA GCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGAC- CGTGCTGCAC- CAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCC TGCCCAGCTCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCG- CGAGCCTCAAGTG- TGTACCCTGCCCCCTAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGA GCTGTGCCGTGAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAATGGGA- GAGCAACGGCCAG- CCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCAT TCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGG- CAACGTGTTCAG- CTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTG

TCTCTGTCCCTGGGC Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid GACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGAGCGTGACACCTGGACAG- SEQ ID NO:73 (por exemplo, codificando uma primeira CCTGCCAGCAT- cadeia polipeptídica de uma proteína de CAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGGTGCACAACAACGCCAACACCTACCTG ligação triespecífica da presente inven- AGCTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCCAGTCCCTGATCTA- ção) CAAGGTGTCCAACA-

GATTCAGCGGCGTGCCCGACAGATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTT CACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTG- TGGCCAGGG- CACCCAGTACCCCTTCACCTTTGGCAGCGGCACCAAGGTGGAAATCAAGGGC CAGCCCAAGGCCGCCCCCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTG- TCTGCCAGCG- TGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCAGGCCAGCCAGAACATCTACGTGTG GCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTA- CAAGGCCAG- CAACCTGCACACCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACC GACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACATTGCCACCTAC- TACTGCCAGCA- GGGCCAGACCTACCCCTACACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAG ACCAAGGGCCCCAGCCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTT- CCCACCTAGCGA- CGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTC TACCCCCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAG- CGGCAACAGCCA- GGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAG CACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTG- CGAAGTGAC-

CCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGT Cadeia pesada 3 de antiCD38_C2- CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCG- SEQ ID NO:74 CD38-1_VH1-VL1 IgG4(knob) FALA CCTCCGTGAAGGTG- (por exemplo, codificando uma terceira TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACGCCATGCACTGGGTCA cadeia polipeptídica de uma proteína de AAGAGGCCCCTGGCCAGAGACTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCGG- ligação triespecífica da presente inven- CCAGGGCGGCAC- ção) CAACTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGACCGCCGATACAAGC GCCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGATACCG- CCGTGTACTTCTG-

TGCCAGAACAGGCGGCCTGAGGCGGGCCTACTTTACCTATTGGGGCCAGGG CACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTAGCACAAAGGGCCCATCGGTGTT- CCCTCTGG- CCCCTTGCAGCAGAAGCACCAGCGAATCTACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGT GAAGGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCG- CTCTGACAAGCGGCG- TGCACACCTTTCCAGCCGTGCTCCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAG CGTCGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTG- TAACGTGGACCA- CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCT CCCTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTGAAGCTGCCGGCGGACCCTCCGTGTT- CCTGTT- CCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGG- TACGTGGACGG- CGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGC ACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGG- CTGAACGGCAAAGAGTA- CAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAAGTGTATACCCTG- CCCCCTTGCCAGGAAGA- GATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCA GCGACATTGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTA- CAAGACCAC- CCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACC GTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATG- CACGAGG-

CCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGC Cadeia leve 2 de antiCD38_C2-CD38- GACATCGTGCTGACACAGAGCCCTGCCACCCTGTCTCTGAGCCCTGG- SEQ ID NO:75 1_VH1-VL1 CGAGAGAGCCACCAT- (por exemplo, codificando uma quarta CAGCTGTAGAGCCAGCCAGAGCGTGTCCAGCTACGGCCAGGGCTTCATGCAC cadeia polipeptídica de uma proteína de TGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAGACTGCTGATCTATGGCG- ligação triespecífica da presente inven- CCAGCAGCAGAG- ção) CCACAGGCATCCCCGCCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCAC CCTGACAATCAGCCCCCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAG- CAGAA-

CAAAGAGGACCCCTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGT ACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGACGAGCAG- CTGAAGTCCGGCA- CAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGT GCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCG- TGACCGAGCAG- GACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGTCCAAGG CCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGG-

CCTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCG- SEQ ID NO:76 IgG1(hole) LALA P329A CCTCTGTGAAGGTG- (por exemplo, codificando uma segunda TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACTACATCCACTGGGTGC cadeia polipeptídica de uma proteína de GCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATCGGCAGCATCTACCCCGG- ligação triespecífica da presente inven- CAACGTGAACAC- ção) CAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGACCGTGGACACCAGC ATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGAGAAGCGACGACACCG- CCGTGTACTACTG-

CACCCGGTCCCACTACGGCCTGGATTGGAACTTCGACGTGTGGGGCAAGGGC ACCACCGTGACAGTGTCTAGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGG- CGGAGTGGTGCA- GCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCACC AAGGCCTGGATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGAAAGCAGCTGGAA- TGGGTGGCCCAGAT- CAAGGACAAGAGCAACAGCTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA- TGAACAGCCTG- CGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTCGGGGCGTGTACTATGCCCTGA GCCCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACCGTGTCTAGTCGGA- CCGCCAGCA- CAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGG CGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCG- TGACCGTG- TCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGC TGCAGTCCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCA- GCTCTCTGGG- CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTG- TCCCCCTTGTCCTG- CCCCCGAAGCCGCCGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAA GGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGA- TGTG- TCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAG TGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTAC- CGGGTGGTG- TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGT GCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG- CAAGGCCAAGGG- CCAGCCCCGCGAACCCCAGGTGTGCACACTGCCCCCAAGCAGGGACGAGCT GACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGTGCCGTGAAAGGCTTCTAC- CCCTCCGATATCGCCG- TGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCC TGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACAGTGGA- CAAGTCCCGG- TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACA

ACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGC Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia pesada 2 de antiCD38_C2- CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCG- SEQ ID NO:77 CD38-1_VH1-VL1 IgG1(knob) LALA CCTCCGTGAAGGTG- P329A TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACGCCATGCACTGGGTCA (por exemplo, codificando uma terceira AAGAGGCCCCTGGCCAGAGACTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCGG- cadeia polipeptídica de uma proteína de CCAGGGCGGCAC- ligação triespecífica da presente inven- CAACTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGACCGCCGATACAAGC ção) GCCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGATACCG- CCGTGTACTTCTG-

TGCCAGAACAGGCGGCCTGAGGCGGGCCTACTTTACCTATTGGGGCCAGGG CACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTAGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTT- CCCTCTGGCCCC- TAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAG GACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACCA- GCGGCGTGCA- CACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTC GTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG- TGAACCACAAG- CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGA CCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCCGAAGCCGCCGGAGGCCCTTCCG- TGTTCCTGTT- CCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACC TGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGG- TACGTGGACGG- CGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAACAGTACAACAGC ACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGG- CTGAACGGCAAAGAGTA- CAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCGCCCCCATCGAGAAAACCATC AGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAACCCCAGGTGTACACACTG- CCCCCATGCAGGGA- CGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTGAAAGGCTTCTAC CCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC- TACAAGACCAC- CCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACA GTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATG- CACGAGG-

CCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGC Cadeia leve 2 de antiCD38_C2-CD38- Ver acima. SEQ ID NO:75 1_VH1-VL1 (por exemplo, codificando uma quarta cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAGGTCGTGAAACCTGGCG- SEQ ID NO:78 IgG1(hole) NNSA CCTCTGTGAAGGTG- (por exemplo, codificando uma segunda TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACTACATCCACTGGGTGC cadeia polipeptídica de uma proteína de GCCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGGATCGGCAGCATCTACCCCGG- ligação triespecífica da presente inven- CAACGTGAACAC- ção) CAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGACCGTGGACACCAGC ATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCCGGCTGAGAAGCGACGACACCG- CCGTGTACTACTG-

CACCCGGTCCCACTACGGCCTGGATTGGAACTTCGACGTGTGGGGCAAGGGC ACCACCGTGACAGTGTCTAGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGG- CGGAGTGGTGCA- GCCTGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCACC AAGGCCTGGATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGAAAGCAGCTGGAA- TGGGTGGCCCAGAT- CAAGGACAAGAGCAACAGCTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGC CGGTTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGA- TGAACAGCCTG- CGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTCGGGGCGTGTACTATGCCCTGA GCCCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTCGTGACCGTGTCTAGTCGGA- CCGCCAGCA- CAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGG CGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCCG- TGACCGTG- TCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGC TGCAGTCCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCA- GCTCTCTGGG- CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTG GACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTG- TCCCCCTTGTCCTG- CCCCCGAACTGCTGGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAA GGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGA- TGTG- TCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAG TGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAACAGTACAACAATG- CCTCCCGGGTGGTG- TCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGT GCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG- CAAGGCCAAGGG- CCAGCCCCGCGAACCCCAGGTGTGCACACTGCCCCCAAGCAGGGACGAGCT GACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGTGCCGTGAAAGGCTTCTAC- CCCTCCGATATCGCCG- TGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCC TGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGGTGTCCAAGCTGACAGTGGA- CAAGTCCCGG- TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACA ACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGC

Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia pesada 2 de antiCD38_C2- CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTCGTGAAACCTGGCG- SEQ ID NO:79 CD38-1_VH1-VL1 IgG1(knob) NNSA CCTCCGTGAAGGTG- (por exemplo, codificando uma terceira TCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCTACGCCATGCACTGGGTCA cadeia polipeptídica de uma proteína de AAGAGGCCCCTGGCCAGAGACTGGAATGGATCGGCTACATCTACCCCGG- ligação triespecífica da presente inven- CCAGGGCGGCAC- ção) CAACTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGACCGCCGATACAAGC GCCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGATACCG- CCGTGTACTTCTG-

TGCCAGAACAGGCGGCCTGAGGCGGGCCTACTTTACCTATTGGGGCCAGGG CACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTAGCACAAAGGGCCCATCGGTCTT- CCCCCTGGCAC- CCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA- CCAGCGGCGTG- CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG- TGAATCACAAG- CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAG- TCTTCCTCTT- CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGG- TATGTTGACGG- CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAAT GCCTCCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA- TGGCAAGGAGTA- CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG- CCCCCATGCCGGGATGAG- CTGACCAAGAATCAAGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTAAAAGGCTTCTATCCCAG CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA- GACCACG- CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCAAAACTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG- CATGAGGCTCTG-

CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Cadeia leve 2 de antiCD38_C2-CD38- Ver acima. SEQ ID NO:75 1_VH1-VL1 (por exemplo, codificando uma quarta cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:72 IgG4(hole) FALA (por exemplo, codificando uma segunda cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia pesada 2 de CD38HHY1370 CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGAGGCGTGGTGCAGCCTGGCAGG- SEQ ID NO:80 IgG4(knob) FALA TCTCTGAGACTGAG- (por exemplo, codificando uma terceira CTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGAATGCACTGGGTGCGC cadeia polipeptídica de uma proteína de CAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGG- ligação triespecífica da presente inven- CAGCAACAAG- ção) TACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCGGCGACAACAGCA

AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCG- TGTACTACTG- CGCCAGAATGTTCAGAGGCGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTG ACCGTGTCTAGTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTGTTCCCTCTGG- CCCCTTGCAGCAGAAG- CACCAGCGAATCTACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCC GAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACAAGCGGCGTGCA- CACCTTTCCAG- CCGTGCTCCAGAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCC CAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAG- CCCAGCAACAC- CAAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGC CCAGCCCCTGAAGCTGCCGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAG- CCCAAGGACAC- CCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCC CAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG- CACAACGCCAA- GACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTG CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTG- CAAGGTGTCCAA- CAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAG CCCCGCGAGCCTCAAGTGTATACCCTGCCCCCTTGCCAGGAAGAGATGAC- CAAGAACCAGG- TGTCCCTGTGGTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAA TGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTG- CTGGACAGCGA- CGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAG GAAGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCAC-

TACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGC Leve 2 de CD38HHY1370 GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGA- SEQ ID NO:81 (por exemplo, codificando uma quarta CAGAGTGACCAT- cadeia polipeptídica de uma proteína de CACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCCGGAACGACCTGGGCTGGTATCAGCAG ligação triespecífica da presente inven- AAGCCTGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCTAGCTCTCTGCAG- ção) TCCGGCGTG-

CCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCT CTGGCCTGCAGCCCGAGGACAGCGCCACCTACTACTGTCTGCAAGACTACA- TCTACTAC- CCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTC CCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAG- CCTCTGTCGTG- TGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGG ACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGGACA- GCAAGGAC- TCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGA AGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCCCG-

TGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGT CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:76 IgG1(hole) LALA P329A (por exemplo, codificando uma segunda cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia pesada 2 de CD38HHY1370 CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGAGGCGTGGTGCAGCCTGGCAGG- SEQ ID NO:82 IgG1(knob) LALA P329A TCTCTGAGACTGAG- (por exemplo, codificando uma terceira CTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGAATGCACTGGGTGCGC cadeia polipeptídica de uma proteína de CAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGG- ligação triespecífica da presente inven- CAGCAACAAG- ção) TACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCGGCGACAACAGCA

AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCG- TGTACTACTG- CGCCAGAATGTTCAGAGGCGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTG ACCGTGTCTAGTGCGTCGACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCC- TAGCAGCAAGAG- CACATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCC GAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA- CACCTTTCCAG- CTGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCC CAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG- CCCAGCAACAC- CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGT CCCCCTTGTCCTGCCCCCGAAGCCGCCGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTT- CCCCCCAAAG- CCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGG TGGATGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGG- CGTGGAAGTG- CACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGG TGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAG- TACAAGTG- CAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAG GCCAAGGGCCAGCCCCGCGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCATGCAGG- GACGAGCTGAC- CAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATA TCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGAC- CACCCCCCCTGTG- CTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTC CCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGG-

CCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGC Leve 2 de CD38HHY1370 Ver acima. SEQ ID NO:81 (por exemplo, codificando uma quarta cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA Cadeia pesada 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:78 IgG1(hole) NNSA (por exemplo, codificando uma segunda cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia leve 1 de CD28supxCD3mid Ver acima. SEQ ID NO:73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Cadeia pesada 1 de CD38HHY1370 CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGAGGCGTGGTGCAGCCTGGCAGG- SEQ ID NO:83 IgG1(knob) NNSA TCTCTGAGACTGAG- (por exemplo, codificando uma terceira CTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGAATGCACTGGGTGCGC cadeia polipeptídica de uma proteína de CAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGG- ligação triespecífica da presente inven- CAGCAACAAG- ção) TACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCGGCGACAACAGCA AGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCG- TGTACTACTG-

CGCCAGAATGTTCAGAGGCGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACACTCGTG ACCGTGTCTAGTGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC- CCTCCTCCAAGAG- CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA- CACCTTCCCGG- CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCC CTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG- CCCAGCAACAC- CAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTT- CCCCCCAAAAC- CCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATGTTGACGG- CGTGGAGGTG- CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAATGCCTCCCGTG TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA- CAAGTG- CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATGCCGG- GATGAGCTGAC- CAAGAATCAAGTCAGCCTGTGGTGCCTGGTAAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC- CACGCCTCCCGTG- CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCAAAACTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG-

CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT Leve 2 de CD38HHY1370 Ver acima. SEQ ID NO:81 (por exemplo, codificando uma quarta cadeia polipeptídica de uma proteína de ligação triespecífica da presente inven- ção) Polipeptídeos CD38

[0120] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende um sítio de ligação ao antígeno que liga um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cynomolgus. Ensaios exemplares para determinar se um sítio de ligação ao antígeno liga-se a um antígeno são aqui descritos e conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a ligação é determinada por ensaio ELISA, por exemplo, como descrito abaixo. Em algumas modalidades, a ligação é determi- nada por ensaio de SPR, por exemplo, como descrito abaixo. Em algu- mas modalidades, a ligação é determinada por ensaio de citometria de fluxo por meio de células que expressam um polipeptídeo CD38 na sua superfície celular, por exemplo, como descrito abaixo.

[0121] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção liga-se a um polipeptídeo purificado ou fragmento da mesma compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 e/ou 30 (por exemplo, como medida por ELISA ou SPR). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga-se a um polipeptídeo ou que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 e/ou 30 quando expresso na superfície de uma célula (por exemplo, como medida por citometria de fluxo).

[0122] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção liga-se a um polipeptídeo de isoforma A de CD38 (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção um polipeptídeo de isoforma E de CD38 (por exemplo, com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105 e não com- preendendo a sequência completa de aminoácidos de SEQ ID NO:1, consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105 ou con- sistindo essencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção liga-se a um polipeptídeo de isoforma A de CD38 (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1) e um polipeptídeo de isoforma E de CD38 (por exemplo, compre- endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105 e não com- preendendo a sequência completa de aminoácidos de SEQ ID NO:1, consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105 ou con- sistindo essencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:105). Sem a intenção de estar preso à teoria, acredita-se que a li- gação a um polipeptídeo de isoforma E de CD38 pode ser vantajosa, por exemplo, no direcionamento de uma proteína de ligação da presente invenção para célula(s) que expressa(m) um polipeptídeo de isoforma E de CD38. Sequência polipeptídica do domínio extracelular da isoforma A de CD38 humano RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHV- DCQSVWDAFKGAFISKHPCNI-

TEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDT LLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVS- RRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEA

WVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDK- FLQCVKNPEDSSCTSEI (SEQ ID NO:1) Sequência polipeptídica da isoforma E de CD38 humano RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHV- DCQSVWDAFKGAFISKHPCNI-

TEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDT LLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVS- RRHFWECGSP (SEQ ID NO:105)

[0123] Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um po- lipeptídeo de CD38 humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um polipeptídeo de CD38 de macaco cynomolgus compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO:30. Sequência polipeptídica de CD38 de macaco Cynomolgus RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHV- DCQSVWDAFKGAFISKYPCNI-

TEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDM LLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVS- RRFAETA-

CGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGG REDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKN- PEDSSCLSGI (SEQ ID NO:30) Ligantes

[0124] Em algumas modalidades, os ligantes L1, L2, L3 e L4 variam de nenhum aminoácido (comprimento=0) a cerca de 100 aminoácido de comprimento, ou menos de 100, 50, 40, 30, 20 ou 15 aminoácidos ou menos. Os ligantes podem também ter 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácido de comprimento. L1, L2, L3 e L4 em uma proteína de ligação podem ter todos a mesma sequência de aminoácidos ou podem ter to- dos sequências diferentes de aminoácidos.

[0125] Os exemplos de ligantes adequados incluem um resíduo único de glicina (Gly); um peptídeo diglicina (Gly-Gly); um tripeptídeo (Gly-Gly-Gly); um peptídeo com quatro resíduos de glicina; um peptídeo com cinco resíduos de glicina; um peptídeo com seis resíduos de glicina; um peptídeo com sete resíduos de glicina; e um peptídeo com oito resí- duos de glicina. Outras combinações de resíduos de aminoácidos po- dem ser usadas tal como o peptídeo GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), o peptídeo GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), o peptídeo TKGPS (SEQ ID NO: 57), o peptídeo GQPKAAP (SEQ ID NO:58) e o peptídeo GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). Os exemplos listados abaixo não se destinam a limitar o âmbito da invenção de maneira al- guma, e os ligantes compreendem aminoácidos selecionados aleatoria- mente a partir do grupo que consiste em valina, leucina, isoleucina, se- rina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, aspara- gina, glutamina, glicina e prolina demonstraram ser adequados nas pro- teínas de ligação. Para descrições adicionais de sequências de ligantes, ver, por exemplo, WO2012135345 e Pedido de Patente Internacional No PCT/US2017/027488.

[0126] A identidade e sequências dos resíduos de aminoácido no ligante podem variar dependendo do necessário para alcançar o tipo de elemento estrutural secundário necessário no ligante. Por exemplo, gli- cina, serina e alanina são melhores para ligantes com flexibilidade má- xima. Algumas combinações de glicina, prolina, treonina e serina são úteis se um ligante mais rígido e prolongado for necessário. Qualquer resíduo de aminoácido pode ser considerado um ligante em combina- ção com outros resíduos de aminoácido resíduos para construir ligantes maiores de peptídeos conforme necessário dependendo das proprieda- des desejadas.

[0127] Em algumas modalidades, pelo menos um dentre L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácido de comprimento. Em algu- mas modalidades, L1, L2, L3 ou L4 têm cada um independentemente pelo menos um aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o comprimento de L1 é pelo menos duas vezes o comprimento de L3. Em algumas modalidades, o comprimento de L2 é pelo menos duas vezes o comprimento de L4. Em algumas modalidades, o comprimento de L1 é pelo menos duas vezes o comprimento de L3, e o comprimento de L2 é pelo menos duas vezes o comprimento de L4. Em algumas modalida- des, L1 tem 3 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 3 a 14 resíduos de aminoácidos de comprimento, L3 tem 1 a 8 resíduos de aminoácidos de comprimento e L4 tem 1 a 3 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 5 a 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 5 a 8 resíduos de aminoácidos de comprimento, L3 tem 1 a 5 resíduos de aminoácidos de comprimento e L4 tem 1 a 2 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 7 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 5 resíduos de aminoácidos de comprimento, L3 tem 1 aminoácido resí- duo de comprimento e L4 tem 2 resíduos de aminoácidos de compri- mento. Em algumas modalidades, L1 tem 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, L2 tem 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, L3 tem resíduo de 0 aminoácido de comprimento e L4 tem 0 resíduo de aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3, e L4 têm cada um independentemente um comprimento selecionado dentre 0 a 15 aminoácidos (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos), em que pelo menos dois dos ligantes têm um comprimento de 1 a 15 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos). Em algumas modalidades, L1, L2, L3, e L4 têm cada um 0 aminoácido de comprimento.

[0128] Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e/ou L4 compreendem uma sequência derivada de uma sequência natural na junção entre um domínio variável de anticorpo e um domínio constante de anticorpo (por exemplo, como descrito em WO2012/135345). Por exemplo, em algu- mas modalidades, o ligante compreende uma sequência encontrada na transição entre um domínio VH e CH1 endógenos, ou um domínio VL e CL endógenos (por exemplo, kappa ou lambda). Em algumas modalida- des, o ligante compreende uma sequência encontrada entre um domínio VH e CH1 humano endógeno, ou entre um domínio VL e CL humano en- dógeno (por exemplo, kappa ou lambda humano).

[0129] Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4 têm cada um inde- pendentemente zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59). Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4 compreendem cada um independentemente uma sequência sele- cionada a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59).

[0130] Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO:57), L3 compreende a sequência S e L4 compreende a sequência RT. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), L2 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), L3 tem 0 aminoácido de comprimento e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59), L2 compre- ende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59), L3 tem 0 aminoá- cido de comprimento e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algu- mas modalidades, L1 compreende a sequência

GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), L2 tem 0 aminoácido de comprimento, L3 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56) e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Regiões Fc e domínios constantes

[0131] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma cadeia pesada completa de anticorpo ou uma cadeia polipeptídica compreendendo uma região Fc. Em algu- mas modalidades, a região Fc é uma região Fc humana, por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. Em algumas mo- dalidades, a região Fc inclui uma região hinge (dobradiça) de anticorpo e os domínios CH1, CH2, CH3 e, opcionalmente, CH4. Em algumas moda- lidades, a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana. Em algu- mas modalidades, a região Fc inclui um ou mais das mutações descritas abaixo.

[0132] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção inclui uma ou duas variantes de Fc. O termo “variante de Fc”, neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula ou sequên- cia que é modificada de uma Fc nativa, mas que ainda compreende um sítio de ligação para o receptor de salvamento, FcRn (receptor Fc neo- natal). As variantes exemplares de Fc, e a sua interação com o receptor de salvamento, são conhecidas na técnica. Assim, o termo “variante de Fc” pode compreender uma molécula ou sequência que é humanizada em relação a uma Fc nativa não humana. Além disso, uma Fc nativa compreende regiões que podem ser removidas por proporcionarem ca- racterísticas estruturais ou atividade biológica que não são necessárias para as proteínas de ligação da invenção do tipo anticorpo. Assim, o termo “variante de Fc” compreende uma molécula ou sequência despro- vida de um ou mais sítios ou resíduos nativos de Fc, ou nas quais um ou mais sítios ou resíduos de Fc foram modificados, que afetam ou es- tão envolvidos em: (1) formação de ligações dissulfeto, (2) incompatibi- lidade com uma célula hospedeira selecionada, (3) heterogeneidade N- terminal quando da expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com o complemento, (6) ligação a um re- ceptor Fc além de um receptor de salvamento ou (7) citotoxicidade ce- lular dependente de anticorpo (ADCC).

[0133] Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam a ligação ao receptor Fc e/ou função efetora da região Fc (por exemplo, fagocitose celular dependente de anticorpo mediada por receptor Fc (ADCP), citotoxicidade depen- dente do complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)).

[0134] Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana compreendendo um ou mais substituições de aminoáci- dos em posições correspondentes às posições 234, 235 e/ou 329 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são L234A, L235A e/ou P329A. Em algu- mas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana que compreende substituições de aminoácidos em posições corresponden- tes às posições 298, 299 e/ou 300 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são S298N, T299A e/ou Y300S.

[0135] Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana que compreende uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam a ligação a FcI e/ou FcII. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana que compreende uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam a ligação a FcI e/ou FcII, mas não afetam a ligação a FcRn. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana que compreende substituições de aminoáci- dos em posições correspondentes às posições 228 e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as subs- tituições de aminoácidos são S228P e/ou R409K. Em algumas modali- dades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana que compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posi- ções 234 e/ou 235 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são F234A e/ou L235A. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana que compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 228, 234, 235 e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são S228P, F234A, L235A e/ou R409K. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana que com- preende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em al- gumas modalidades, as substituições de aminoácidos são E233P, F234V, L235A e uma deleção em 236. Em algumas modalidades, a re- gião Fc é uma região Fc de IgG4 humana que compreende mutações de aminoácidos em substituições correspondentes às posições 228, 233-236 e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em al- gumas modalidades, as mutações em aminoácidos são S228P; E233P, F234V, L235A e uma deleção em 236; e/ou R409K.

[0136] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a purificação, por exemplo, ao modular a afinidade por um reagente de purificação. Por exemplo, sabe-se que proteínas heterodiméricas de li- gação podem ser purificadas seletivamente e separadas de suas formas heterodiméricas se uma das duas regiões Fc da forma heterodimérica contiver mutação(ões) que reduza(m) ou elimine(m) a ligação à Proteína

A, pois a forma heterodimérica terá uma afinidade intermediária para purificação com base na Proteína A, em comparação a qualquer forma homodimérica, e pode ser eluída seletivamente desde a Proteína A, por exemplo, pelo uso de um pH diferente (Ver, por exemplo, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são H435R e Y436F. Em algumas mo- dalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia poli- peptídica que compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e os domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobu- lina, e uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo ainda uma se- gunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pe- sada CH2 e CH3 de imunoglobulina; e em que apenas uma dentre a pri- meira e a segunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de amino- ácidos são H435R e Y436F. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações do tipo knob and hole e uma ou mais mutações para melhorar a purificação. Em al- gumas modalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a se- gunda região Fc são regiões Fc de IgG4 Fc humana.

[0137] Em algumas modalidades, uma ou ambas as regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana que compreendem substituições de amino- ácidos em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 hu- mana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substi- tuições de aminoácidos são E233P, F234V, L235A e uma deleção em

236. Em algumas modalidades, as regiões Fcs são regiões Fc de IgG4 Fc humana que compreendem mutações de aminoácidos em substitui- ções correspondentes às posições 228, 233-236 e/ou 409 de IgG4 hu- mana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, a muta- ções em aminoácidos são S228P; E233P, F234V, L235A e uma deleção em 236; e/ou R409K. Em algumas modalidades, uma ou ambas as re- giões Fc são regiões Fc de IgG1 humana que compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos em posições correspondentes às po- sições 234, 235 e/ou 329 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são L234A, L235A e/ou P329A. Em algumas modalidades, as regiões Fcs são regi- ões Fc de IgG1 humana que compreendem substituições de aminoáci- dos em posições correspondentes às posições 298, 299 e/ou 300 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são S298N, T299A e/ou Y300S.

[0138] Para melhorar o rendimento de algumas proteínas de ligação (por exemplo, proteínas de ligação biespecíficas ou triespecíficas), os domínios CH3 podem ser alterados pela tecnologia “knob-into-holes” que é descrita detalhadamente com diversos exemplos em, por exemplo, A Publicação Internacional No WO 96/027011, Ridgway et al., 1996, Pro- tein Eng. 9: 617-21; e Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 677-

81. Especificamente, as superfícies de interação dos dois domínios CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerização de ambas as cadeias pesadas contendo esses dois domínios CH3. Cada um dos dois domínios CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser o “knob”, enquanto o outro é o “hole”. A introdução de uma ponte dissulfeto estabiliza mais os hete- rodímeros (Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) e aumenta o rendimento. Em modalidades específicas, o knob está no segundo par de polipeptídeos com um único domínio variável. Em outras modalidades, o knob está no primeiro par de polipeptídeos com a orientação cruzada. Em ainda outras modalidades, os domínios CH3 não incluem um knob in hole.

[0139] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção (por exemplo, uma proteína de ligação triespecífica) compreende uma mutação “knob” na segunda cadeia polipeptídica e uma mutação “hole” na terceira cadeia polipeptídica. Em algumas mo- dalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma mutação “knob” na terceira cadeia polipeptídica e uma mutação “hole” na segunda cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, a mutação “knob” mutação compreende uma substituição(ões) em posi- ções correspondentes às posições 354 e/ou 366 de IgG1 ou IgG4 hu- mana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substi- tuições de aminoácidos são S354C, T366W, T366Y, S354C e T366W, ou S354C e T366Y. Em algumas modalidades, a mutação “knob” com- preende substituições em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são S354C e T366W. Em algumas modalidades, a mutação “hole” mutação compreende substi- tuição(ões) em posições correspondentes às posições 407 e, opcional- mente, 349, 366, e/ou 368 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são Y407V ou Y407T e opcionalmente Y349C, T366S e/ou L368A. Em algumas modalidades, a mutação “hole” compreende substituições em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A e Y407V.

[0140] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira re- gião Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compreende substituição(ões) de aminoácidos em posições correspondentes às posições 366 e opcionalmente 354 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substitui- ções de aminoácidos são T366W ou T366Y e opcionalmente S354C; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma re- gião hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compre- ende substituição(ões) de aminoácidos em posições correspondentes às posições 407 e opcionalmente 349, 366 e/ou 368 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de amino- ácidos são Y407V ou Y407T e opcionalmente Y349C, T366S e/ou L368A.

[0141] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira re- gião Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios de regiões constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglo- bulina, em que a primeira região Fc compreende substituição(ões) de aminoácidos em posições correspondentes às posições 407 e opcional- mente 349, 366 e/ou 368 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y407V ou Y407T e opcionalmente Y349C, T366S e/ou L368A; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imu- noglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substitui- ção(ões) de aminoácidos em posições correspondentes às posições 366 e opcionalmente 354 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são T366W ou T366Y e opcionalmente S354C.

[0142] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira re- gião Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição correspondente à posição 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que a substituição de aminoácido é T366W; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma se- gunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substituição(ões) de aminoácidos em posições correspon- dentes às posições 366, 368 e/ou 407 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são T366S, L368A e/ou Y407V.

[0143] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira re- gião Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compreende substituição(ões) de aminoácidos em posições correspondentes às posições 366, 368 e/ou 407 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são T366S, L368A e/ou Y407V; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imu- noglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende uma substi- tuição de aminoácido na posição correspondente à posição 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que a substituição de aminoácido é T366W.

[0144] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira re- gião Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 hu- mana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoá- cidos são S354C e T366W; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A e Y407V.

Em algumas modali- dades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma re- gião hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compre- ende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que a terceira cadeia polipeptídica com- preende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posi- ções correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S354C e T366W. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a se- gunda região Fc são regiões de IgG1 humana. Em algumas modalida- des, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões de IgG4 Fc hu- mana.

[0145] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a pri- meira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pe- sada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc com- preende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 228, 354, 366 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P, S354C, T366W e R409K; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substitui- ções de aminoácidos em posições correspondentes às posições 228, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K. Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compre- endendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspon- dentes às posições 228, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios cons- tantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a se- gunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posi- ções correspondentes às posições 228, 354, 366 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P, S354C, T366W e R409K.

[0146] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a pri- meira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pe- sada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc com- preende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234, 235, 354 e 366 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A, L235A, S354C e T366W; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234, 235, 349, 366, 368 e 407 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compre- endendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspon- dentes às posições 234, 235, 349, 366, 368 e 407 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios cons- tantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a se- gunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posi- ções correspondentes às posições 234, 235, 354 e 366 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A, L235A, S354C e T366W.

[0147] Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a pri- meira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pe- sada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc com- preende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 228, 234, 235, 354, 366 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P, F234A, L235A, S354C, T366W e R409K; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compre- endendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspon- dentes às posições 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de amino- ácidos são S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K. Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica com- preende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posi- ções 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K; e em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda re- gião Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 228, 234, 235, 354, 366 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substitui- ções de aminoácidos são S228P, F234A, L235A, S354C, T366W e R409K.

[0148] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende um ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica (Ver, por exemplo, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immu- nol. 176(1):346-56). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substitui- ções de aminoácidos são M428L e N434S. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira re- gião Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, e uma terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira e/ou a segunda região Fc com- preendem substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são M428L e N434S. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob and hole e uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas mo- dalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG4 humana.

[0149] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a estabilidade, por exemplo, da região hinge e/ou da interface entre os dímeros de IgG4 (Ver, por exemplo, Spiess, C. et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:26583-26593). Em algumas modalidades, a mutação com- preende substituições em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substitui- ções de aminoácidos são S228P e R409K. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia polipeptídica compreendendo ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, e uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina; em que a primeira e a segunda região Fc são regiões Fc de IgG4 humana; e em que a primeira e a segunda região Fc com- preendem cada uma substituições de aminoácidos em posições corres- pondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P e

R409K. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob and hole e uma ou mais muta- ções para melhorar a estabilidade. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG4 humana.

[0150] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a purificação, por exemplo, modulando a afinidade por um reagente de purificação. Por exemplo, sabe-se que proteínas heterodiméricas de li- gação podem ser purificadas seletivamente e separadas de suas formas homodiméricas se uma das duas regiões Fc da forma heterodimérica contiver mutação(ões) que reduza(m) ou elimine(m) a ligação à Proteína A, pois a forma heterodimérica terá uma afinidade intermediária para purificação com base na seletivamente a partir da Proteína A, por exem- plo, pelo uso de um pH diferente (Ver, por exemplo, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943). Em algumas modalidades, a mutação com- preende substituições em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são H435R e Y436F. Em algumas moda- lidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia poli- peptídica compreendendo ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina e uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina; e em que apenas uma dentre a primeira e a segunda região Fc compreende substituições de aminoácidos em posi- ções correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são H435R e Y436F. Em algumas modalidades, uma proteína de liga- ção da presente invenção compreende mutações knob and hole e uma ou mais mutações para melhorar a purificação. Em algumas modalida- des, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG1 hu- mana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG4 humana.

[0151] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica (Ver, por exemplo, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immu- nol. 176(1):346-56). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substitui- ções de aminoácidos são M428L e N434S. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia polipeptídica compreendendo ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina e uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, em que a primeira e/ou a segunda região Fc com- preendem substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são M428L e N434S. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob and hole e uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas mo- dalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG4 humana.

[0152] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende uma ou mais mutações para reduzir a fun- ção efetora, por exemplo, fagocitose celular dependente de anticorpo mediada pelo receptor Fc (ADCP), citotoxicidade dependente do com- plemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira re- gião Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina; em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda re- gião Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina; em que a primeira e a segunda região Fc são regiões Fc de IgG1 humana; e em que a primeira e a segunda região Fc compreendem cada uma substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são L234A e L235A.

Em algumas modalidades, as regiões Fcs da segunda e da ter- ceira cadeia polipeptídica são regiões Fc de IgG1 humana, e em que as regiões Fc compreendem cada uma substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são L234A e L235A.

Em algumas modalidades, a segunda cadeia polipeptí- dica compreende ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domí- nios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina; em que a terceira cadeia polipeptídica compreende ainda uma segunda re- gião Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina; em que a primeira e a segunda região Fc são regiões Fc de IgG1 humana; e em que a primeira e a segunda região Fcs compreendem cada uma substituições de aminoácidos em posi- ções correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são L234A, L235A e P329A. Em algumas modalidades, as regiões Fc da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são regiões Fc de IgG1 hu- mana, e em que as regiões Fc compreendem cada uma substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU, em que as substitui- ções de aminoácidos são L234A, L235A e P329A. Em algumas modali- dades, as regiões Fc da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são regiões Fc de IgG4 humana, e as regiões Fc compreendem cada uma substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posi- ções 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A e L235A. Em algumas mo- dalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia poli- peptídica compreendendo ainda uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina, e uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo ainda uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região hinge de imunoglobulina e domínios constantes da cadeia pesada CH2 e CH3 de imunoglobulina; e em que a primeira e a segunda região Fcs compreendem cada uma substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A e L235A.

[0153] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da pre- sente invenção compreende mutações knob and hole e uma ou mais mutações para reduzir a função efetora. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda região Fc são regiões Fc de IgG4 humana. Para descrição adicional de mutações em Fc na position 329, ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 e WO1999051642.

[0154] Em algumas modalidades, os tipos de mutações descritas acima podem ser combinados em qualquer ordem ou combinação. Por exemplo, uma proteína de ligação da presente invenção pode compre- ender duas ou mais das mutações “knob” e “hole”, uma ou mais muta- ções para melhorar a meia-vida sérica, uma ou mais mutações para me- lhorar a estabilidade de IgG4, uma ou mais mutações para melhorar a purificação e/ou uma ou mais mutações para reduzir a função efetora descrita acima. Ácidos nucleicos

[0155] Metodologias padrão do DNA recombinante são utilizadas para construir os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que formam as proteínas de ligação, incorporar esses polinucleotídeos em vetores de expressão recombinante e introduzir tais vetores em células hospedeiras. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comu- mente realizado na técnica ou como aqui descritas. A menos que forne- cidas definições específicas, a nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, quí- mica orgânica sintética e química medicina e farmacêutica aqui descri- tos são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados na técnica. Do mesmo modo, técnicas convencionais podem ser utilizadas para as sín- teses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formula- ção, entrega e tratamento de pacientes.

[0156] Outros aspectos da presente invenção referem-se a molécu- las de ácidos nucleicos isolados que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codificam qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas. Em algumas modalidades, as moléculas de ácidos nucleicos isolados compreendem uma sequência que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a SEQ ID NOs:60-83 e/ou mostrada na Tabela J.

[0157] Certos aspectos da presente invenção referem-se a kits de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucle- otídeos é um vetor (por exemplo, um vetor de expressão). Os kits podem encontrar utilidade, inter alia, na produção de uma ou mais das proteí- nas de ligação aqui descritas, por exemplo, uma proteína de ligação tri- específica da presente invenção. Em algumas modalidades, o kit com- preende um, dois, três ou quatro polinucleotídeos mostrados na Tabela J (por exemplo, de antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, ou CD38HHY1370CD28supxCD3mid IgG1 NNSA). Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:73, um segundo polinucle- otídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:72, um terceiro po- linucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:74 e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:75. Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID

NO:73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NO:77 e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:75. Em algumas modalidades, um kit de poli- nucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:73, um segundo polinucleotídeo compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO:78, um terceiro polinucleotídeo com- preendendo a sequência de SEQ ID NO:79 e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:75. Em algumas modalida- des, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotí- deo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:73, um segundo poli- nucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:72, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:80 e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:81. Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequên- cia de SEQ ID NO:82 e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:81. Em algumas modalidades, um kit de poli- nucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:73, um segundo polinucleotídeo compreen- dendo a sequência de SEQ ID NO:78, um terceiro polinucleotídeo com- preendendo a sequência de SEQ ID NO:83 e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:81.

[0158] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é opera- cionalmente ligado a um promotor heterólogo para direcionar a transcri- ção da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de ligação. Um promotor pode referir-se a sequências controle de ácido nucleico que direcionam a transcrição de um ácido nucleico. Uma primeira se- quência de ácido nucleico é operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nu- cleico é colocada em relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação de uma proteína de ligação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Os exemplos de promotores podem incluir, entre outros, promotores obti- dos dos genomas de vírus (tais como poliomavírus, poxvírus aviário, adenovírus (como Adenovírus 2), papilomavírus bovino, vírus do sar- coma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B, vírus símio 40 (SV40) e semelhantes), de promotores eucarióticos heterólo- gos (como o promotor de actina, um promotor de imunoglobulina, de promotores do choque térmico e semelhantes), o promotor CAG (Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991), o promotor da fosfoglicerato quinase (PGK), um promotor induzível por tetraciclina (Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005), o sistema lac, o sistema trp, o sistema tac, o sistema trc, regiões maiores do operador e promotor do fago lambda, o promotor de 3-fosfoglicerato quinase, os promotores de fosfatase ácida de leve- duras e o promotor dos fatores de alfa-cruzamento entre leveduras. Os polinucleotídeos que codificam as proteínas de ligação da presente in- venção podem estar sob o controle de um promotor constitutivo, um pro- motor induzível ou qualquer outro promotor adequado aqui descrito ou outro promotor adequado que será prontamente reconhecido pelo téc- nico no assunto.

[0159] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é incor- porado em um vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão. Os vetores de expressão podem incluir uma ou mais se- quências reguladoras operacionalmente ligadas ao polinucleotídeo a ser expresso. O termo “sequência reguladora” inclui promotores, refor- çadores (enhancers) e outros elementos de controle da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Os exemplos de reforçadores ade- quados podem incluir, entre outros, sequências de reforçadores para genes de mamíferos (como globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, insulina e semelhantes), e sequências de reforçadores de um vírus para célula eucariótica (com reforçador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o reforçador do promotor precoce do citome- galovírus, o reforçador de polioma no lado tardio da origem de replica- ção, reforçadores de adenovírus e semelhantes). Os exemplos de veto- res adequados podem incluir, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, epissomas, transposons e vetores virais (por exemplo, vetores de ade- novírus, vírus Vaccinia, vírus Sindbis, vírus do sarampo, herpesvírus, lentivírus, retrovírus e vírus adenoassociados etc.). Os vetores de ex- pressão podem ser usados para transfectar células hospedeiras, como, por exemplo, células bacterianas, células de leveduras, células de inse- tos e células de mamíferos. Vetores de DNA viral e plasmidial biologica- mente funcionais capazes de expressão e replicação em um hospedeiro são conhecidos na técnica e podem ser usados para transfectar qual- quer célula de interesse.

[0160] Outros aspectos da presente invenção referem-se a um sis- tema de vetores que compreende um ou mais vetores que codificam uma primeira, uma segunda, uma terceira e uma quarta cadeia polipep- tídica de qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas. Em al- gumas modalidades, o sistema de vetores compreende um primeiro ve- tor que codifica a primeira cadeia polipeptídica da proteína de ligação, um segundo vetor que codifica a segunda cadeia polipeptídica da pro- teína de ligação, um terceiro vetor que codifica a terceira cadeia poli- peptídica da proteína de ligação e um quarto vetor que codifica a quarta cadeia polipeptídica da proteína de ligação. Em algumas modalidades,

o sistema de vetores compreende um primeiro vector que codifica a pri- meira e a segunda cadeia polipeptídica da proteína de ligação, e um segundo vector que codifica a terceira e a quarta cadeia polipeptídica da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetores compreende um primeiro vetor que codifica a primeira e a terceira ca- deia polipeptídica da proteína de ligação, e um segundo vetor que codi- fica a segunda e a quarta cadeia polipeptídica da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetores compreende um pri- meiro vetor que codifica a primeira e a quarta cadeia polipeptídica da proteína de ligação, e um segundo vetor que codifica a segunda e a terceira cadeia polipeptídica da proteína de ligação. Em algumas moda- lidades, o sistema de vetores compreende um primeiro vetor que codi- fica a primeira, a segunda, a terceira e a quarta cadeia polipeptídica da proteína de ligação. Um ou mais vetores do sistema de vetores pode ser qualquer um dos vetores aqui descritos. Em algumas modalidades, um ou mais vetores são vetores de expressão. Células hospedeiras isoladas

[0161] Outros aspectos da presente invenção referem-se a uma cé- lula hospedeira isolada que compreende um ou mais polinucleotídeos isolados, kits de polinucleotídeos, vetores e/ou sistemas de vetores aqui descritos. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana (por exemplo, uma célula de E. coli). Em algumas modalida- des, a célula hospedeira é uma célula de levedura (por exemplo, uma célula de S. cerevisiae). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de inseto. Os exemplos de células hospedeiras de inseto podem incluir, por exemplo, células de Drosophila (por exemplo, células S2), células de Trichoplusia ni (por exemplo, células High Five™) e cé- lulas de Spodoptera frugiperda (por exemplo, células Sf21 ou Sf9). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Os exemplos de células hospedeiras de mamíferos podem incluir, por exemplo, células renais embrionárias humanas (por exemplo, células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura suspensa), célu- las Expi293TM, células CHO, células renais de hamster recém-nascido (por exemplo, BHK, ATCC CCL 10), células de Sertoli de camundongos (por exemplo, células TM4), células renais de macaco (por exemplo, CV1 ATCC CCL 70), células renais do macaco verde africano (por exemplo, VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma cervical humano (por exemplo, HELA, ATCC CCL 2), células renais caninas (por exemplo, MDCK, ATCC CCL 34), células hepáticas de rato búfalo (por exemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442), células pulmonares humanas (por exemplo, W138, ATCC CCL 75), células hepáticas humanas (por exem- plo, Hep G2, HB 8065), células de tumor mamário de camundongo (por exemplo, MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, cé- lulas FS4, uma linhagem de hepatoma humano (por exemplo, Hep G2) e células de mieloma (por exemplo, células NS0 e Sp2/0). Métodos e usos de proteínas de ligação

[0162] Certos aspectos da presente invenção referem-se a métodos para expansão de células T de memória vírus-específicas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem colocar uma célula T de me- mória vírus-específica em contato com uma proteína de ligação da pre- sente invenção, por exemplo, uma proteína de ligação triespecífica que compreende um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

[0163] Em algumas modalidades, a célula T de memória vírus-es- pecífica é colocada em contato com a proteína de ligação in vitro ou ex vivo.

[0164] Em algumas modalidades, o contato da célula T de memória vírus-específica com a proteína de ligação provoca ativação e/ou proli- feração de células T de memória vírus-específicas.

[0165] Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para expansão de células T. Em algumas modalidades, os métodos compreendem colocar uma célula T em contato com uma proteína de ligação da presente invenção, por exemplo, uma proteína de ligação tri- específica que compreende um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, um segundo sítio de ligação ao antí- geno que se liga a um polipeptídeo CD3 e um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

[0166] Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T de me- mória ou uma célula T efetora.

[0167] Em algumas modalidades, a célula T expressa um receptor de antígeno quimérico (CAR) na sua superfície celular ou compreende um polinucleotídeo que codifica um CAR.

[0168] Outros aspectos da presente invenção referem-se a métodos para o tratamento de infecção viral crônica, por exemplo, em um indiví- duo com necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, os méto- dos compreendem administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação da presente invenção, por exemplo, uma proteína de ligação triespecífica que com- preende um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um poli- peptídeo CD28, um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

[0169] Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.

[0170] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é adminis- trada ao indivíduo em uma formulação farmacêutica que compreende a proteína de ligação e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0171] Em algumas modalidades, a administração da proteína de ligação resulta na ativação e/ou proliferação de células T de memória vírus-específicas no indivíduo.

[0172] Em qualquer um dos métodos acima, as células T de memó- ria podem ser células T CD8+ ou CD4+ de memória. Em qualquer um dos métodos acima, as células T de memória podem ser células T de memória central (TCM) ou células T de memória efetora (TEM).

[0173] Qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas pode encontrar utilidade nos métodos da presente invenção.

[0174] As proteínas de ligação podem ser empregadas em qualquer método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitiva, en- saios do tipo sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipita- ção para a detecção e quantificação de um ou mais antígenos alvo. As proteínas de ligação se ligarão a um ou mais antígenos alvo com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio empregado.

[0175] Para aplicações diagnósticas, em certas modalidades, as proteínas de ligação podem ser marcadas com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, quer direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, como 3H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I, 99 Tc, 111 In ou 67Ga; um composto fluorescente ou quimioluminescente, como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, como fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de rábano.

[0176] As proteínas de ligação são igualmente úteis para imagem in vivo. Uma proteína de ligação marcada com uma porção detectável pode ser administrada a um animal, de preferência na corrente sanguí- nea, e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro analisado. A proteína de ligação pode ser marcada com uma porção que seja detectável em um animal, quer por ressonância magnética nuclear, radiologia ou outros meios de detecção conhecidos na técnica.

[0177] Para aplicações clínicas ou de pesquisa, em certas modali- dades, as proteínas de ligação podem ser conjugadas a um agente ci- totóxico. Uma variedade de anticorpos acoplados a agentes citotóxicos (ou seja, conjugados anticorpo-fármaco) tem sido utilizada para direcio- nar cargas citotóxicas para células tumorais específicas. Agentes cito- tóxicos e ligantes que conjugam os agentes a um anticorpo são conhe- cidos na técnica; ver, por exemplo, Parslow, A.C. et al. (2016) Biomedi- cines 4:14 e Kalim, M. et al. (2017) Drug Des. Devel. Ther. 11:2265-

2276.

[0178] A invenção também se refere a um kit que compreende uma proteína de ligação e outros reagentes úteis para detectar níveis do an- tígeno alvo em amostras biológicas. Tais reagentes podem incluir uma marcação detectável, soro bloqueador, amostras de controle positivo e negativo e reagentes de detecção. Em algumas modalidades, o kit com- preende uma composição compreendendo qualquer proteína de liga- ção, polinucleotídeo, vetor, sistema de vetores e/ou célula hospedeira aqui descritos. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipi- ente e uma bula ou folheto informativo sobre ou associado com o reci- piente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, frascos, fras- cos-ampolas, seringas, bolsas de solução IV etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plás- tico. O recipiente contém uma composição que é eficaz por si só ou combinada com outra composição para tratar, prevenir e/ou diagnosti- car uma condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco- ampla com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica). Em algumas modalidades, a bula ou folheto informativo indica que a composição é utilizada para prevenir, diagnosticar e/ou tra- tar a condição de escolha. Alternativa ou adicionalmente, o artigo ma-

nufaturado ou kit pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) re- cipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina com tam- pão fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. Composições terapêuticas da proteína de ligação e administração das mesmas

[0179] Composições terapêuticas ou farmacêuticas compreen- dendo proteínas de ligação são abrangidas pelo âmbito da invenção. Tais composições terapêuticas ou farmacêuticas podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação, ou de um conjugado proteína de ligação-fármaco, em mistura com um agente para formulação farmacêutica ou fisiologicamente aceitável, se- lecionado para adequação com o modo de administração. Essas com- posições farmacêuticas podem encontrar utilidade em qualquer um dos métodos e usos aqui descritos (por exemplo, ex vivo, in vitro e/ou in vivo).

[0180] Os materiais aceitáveis para formulação são não tóxicos para os receptores nas doses e concentrações empregadas.

[0181] A composição farmacêutica pode conter materiais de formu- lação para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, a osmo- laridade, viscosidade, transparência, cor, isotonicidade, odor, esterili- dade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou pene- tração da composição. Tais materiais adequados para formulação in- cluem, entre outros, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (como ácido ascór- bico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio), tampões (como bo- rato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgâni- cos), agentes de volume (como manitol ou glicina), agentes quelantes

(como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)), agentes de complexa- ção (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipro- pil-beta-ciclodextrina), materiais de preenchimento, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos (como glicose, manose ou dextri- nas), proteínas (como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas), agentes corantes, aromatizantes e diluentes, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona) polipeptídeos de baixo peso molecular, contraíons formadores de sais (como sódio), conser- vantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio), solventes (como glicerina, pro- pilenoglicol ou polietilenoglicol), álcoois de açúcares (como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, tensoativos ou agentes hidratantes (como Pluronics; PEG; ésteres de sorbitana; polissorbatos como polis- sorbato 20 ou polissorbato 80; Triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes reforçadores da estabilidade (como sacarose ou sorbitol), agentes reforçadores da tonicidade (como haletos de metais alcalinos - de preferência, cloreto de sódio ou potássio - ou manitol, sor- bitol), veículos de liberação, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes far- macêuticos (ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18a Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), e edições subsequentes do mesmo, aqui incorporado por referência para qualquer efeito).

[0182] A composição farmacêutica ótima será determinada pelo téc- nico no assunto dependendo de, por exemplo, a via de administração, o formato de liberação e a dose desejada. Tais composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo da proteína de ligação.

[0183] O veículo ou carreador primário em uma composição farma- cêutica pode ser aquoso ou não aquoso por natureza. Por exemplo, um veículo ou carreador adequado para injeção pode ser água, solução sa- lina fisiológica ou líquido cefalorraquidiano artificial, possivelmente su- plementado com outros materiais comuns em composições para admi- nistração parenteral. Solução salina tamponada neutral ou solução sa- lina misturada com albumina sérica são adicionalmente veículos exem- plares. Outras composições farmacêuticas exemplares compreendem tampão Tris com pH de aproximadamente 7,0-8,5, tampão acetato com pH de aproximadamente 4,0-5,5, os quais pode incluir ainda sorbitol ou um substituto adequado. Em uma modalidade da invenção, as compo- sições da proteína de ligação podem ser preparadas para armazena- mento misturando a composição desejada, tendo o grau de pureza de- sejada, com agentes de formulação opcionais na forma de bolo liofili- zado ou uma solução aquosa. Além disso, a proteína de ligação pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes adequados como sacarose.

[0184] As composições farmacêuticas da invenção podem ser sele- cionadas para entrega parenteral ou subcutânea. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para liberação através do trato digestivo, como oralmente. A preparação de tais com- posições farmaceuticamente aceitáveis é abrangida pela competência na técnica.

[0185] Os componentes da formulação estão presentes em concen- trações que são aceitáveis para o local de administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou pH ligeiramente menor, tipicamente dentro de uma faixa de pH entre aproximadamente 5 e 8.

[0186] Quando se contempla administração parenteral, as compo- sições terapêuticas para uso podem estar na forma de uma solução aquosa, livre de pirógenos, aceitável para via parenteral, compreen-

dendo a proteína de ligação desejada em um veículo farmaceutica- mente aceitável. Um veículo especialmente adequado para injeção pa- renteral é água estéril destilada na qual uma proteína de ligação é for- mulada como uma solução estéril, isotônica, devidamente conservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula dese- jada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bioerosí- veis, compostos poliméricos (como ácido poliláctico ou ácido poliglicó- lico), beads ou lipossomas, que proporciona liberação controlada ou sustentada do produto que pode então ser liberado por uma injeção de depósito. Ácido hialurônico pode também ser utilizado, e pode ter o efeito de promover a duração sustentada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositi- vos implantáveis de liberação do fármaco.

[0187] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, uma proteína de ligação pode ser formulada como pó seco para inalação. Soluções para inala- ção da proteína de ligação podem igualmente ser formuladas com um propelente para liberação de aerossóis. Em ainda outra modalidade, as soluções podem ser nebulizadas.

[0188] Contempla-se também que certas formulações possam ser administradas por via oral. Em uma modalidade da invenção, as proteí- nas de ligação que são administradas dessa maneira podem ser formu- ladas com ou sem aqueles veículos costumeiramente usados na com- posição de formas farmacêuticas sólidas, como comprimidos e cápsu- las. Por exemplo, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal quando a biodis- ponibilidade estiver no máximo e a degradação pré-sistêmica no mí- nimo. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da proteína de ligação. Diluentes, aromatizantes, ceras com baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes desintegrantes de comprimidos e aglutinantes podem também ser em- pregados.

[0189] Outra composição farmacêutica pode envolver uma quanti- dade eficaz de proteínas de ligação em uma mistura com excipientes não tóxicos que sejam adequados para a produção de comprimidos. Com a dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veículo adequado, as soluções podem ser preparados em forma de dose unitá- ria. Os excipientes adequados incluem, entre outros, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lac- tose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

[0190] Composições farmacêuticas adicionais da invenção serão evidentes para os técnicos no assunto, incluindo formulações envol- vendo proteínas de ligação em formulações de liberação sustentada ou controlada. Técnicas para formular uma variedade de outros meios de liberação sustentada ou controlada, como lipossomas de transporte, mi- cropartículas bioerosíveis ou esferas porosas e injeções de depósito, são também conhecidos pelos técnicos no assunto. Exemplos adicio- nais de preparados de liberação sustentada incluem matrizes semiper- meáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou mi- crocápsulas. As matrizes de liberação sustentada podem incluir poliés- teres, hidrogéis, polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e etil- L-glutamato gama, poli(2-hidroxietil-metacrilato), acetato de vinil etileno ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico. As composições de liberação sus- tentada podem também incluir lipossomas, os quais podem ser prepa- rados por qualquer um de diversos métodos conhecidos na técnica.

[0191] As composições farmacêuticas a serem utilizadas para ad- ministração in vivo tipicamente precisam ser estéreis. Isso pode ser re- alizado por filtração através de membranas filtrantes estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização empregando esse método pode ser conduzida quer antes ou depois da liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser armazenada em forma liofilizada ou em uma solução. Além disso, composições parente- rais são geralmente colocadas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou frasco-ampola com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.

[0192] Uma vez tenha sido formulada, a composição farmacêutica pode ser armazenada em frascos-ampolas estéreis em uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofili- zado. Tais formulações podem ser armazenadas quer em forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que requeira re- constituição antes da administração.

[0193] A invenção também abrange kits para produzir uma unidade de administração em dose única. Os kits podem conter cada um pri- meiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Além disso, estão incluídos no âmbito desta invenção kits contendo seringas preenchidas de câmara única e de múltiplas (por exemplo, seringas para líquido e lyoseringe).

[0194] A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da proteína de ligação a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. O técnico no assunto re- conhecerá que os níveis adequados de dosagem para o tratamento va- riarão, assim, dependendo, em parte, da molécula entregue, da indica- ção para a qual a proteína de ligação está sendo utilizada, a via de ad- ministração e o tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e condição (a idade e saúde em geral) do paciente. Assim, o médico pode titular a dose e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo.

[0195] A frequência da administração dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação na formulação em uso. Tipica- mente, um médico administrará a composição até que seja atingida uma dose que alcance o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada em uma dose única, em duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo ou em uma infusão contínua através de um dispositivo implan- tado ou cateter. O refinamento adicional da dose adequada é feito roti- neiramente pelos técnicos no assunto e está no âmbito das tarefas roti- neiramente realizadas por eles. Doses adequadas podem ser averigua- das através do uso de dados adequados de dose-resposta.

[0196] A via de administração da composição farmacêutica é de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, por via oral; através de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenqui- motosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intra-arte- rial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada; ou por dispositivos de implante. Quando desejado, as composições po- dem ser administradas por injeção de bolus ou continuamente por infu- são, ou por dispositivo de implante.

[0197] A composição pode também ser administrada por via oral através da implantação de uma membrana, esponja ou outro material adequado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encap- sulada. Quando um dispositivo de implante é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a liberação da molécula desejada pode ser através de difusão, bolus de liberação cro- nometrada ou administração contínua.

EXEMPLOS

[0198] Os Exemplos que se seguem são ilustrativos de modalida- des específicas da invenção e de vários usos da mesma. Eles são apre-

sentados para fins explanatórios somente, e não devem ser interpreta- dos de maneira alguma como limitação ao âmbito da invenção.

[0199] A terminologia a seguir pode ser usada alternadamente nos Exemplos e Desenhos anexos na referência a anticorpos ou domínios de ligação ao antígeno específicos anti-CD38: antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 ou CD38VH1 antiCD38_1370 ou CD38HHY1370 antiCD38_SB19 ou isatuximabe Exemplo 1: Reatividade cruzada e indução de apoptose de anticor- pos anti-CD38

[0200] Variantes humanizadas anti-CD38 foram caracterizadas quanto à ligação a polipeptídeos CD38 humanos e de cynomolgus e quanto à indução de apoptose. Materiais e métodos Afinidade de ligação a domínios extracelulares solúveis de CD38

[0201] As propriedades de ligação dos mAbs anti-CD38 foram ava- liadas usando um BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ). Resumida- mente, um chip biosensor CM5 BIAcore foi encaixado no instrumento e ativado com 250 µL de NHS/EDC 1:1 à temperatura ambiente. Uma IgG1 de camundongo anti-Fc humano (GE Healthcare no BR-1008-39) (13,5 µg/mL em tampão acetato 0,05M, pH5) foi imobilizada nos chips ativados nas células 1 do fluxo. A imobilização foi realizada a uma vazão de 5 µL/min. O chip foi então bloqueado por injeção de 55 µL de etano- lamina-HCl, pH8,5, seguido por cinco lavagens com NaOH 50 mM, NaCl 1M. Para medir a ligação de mAbs anti-CD38 mAbs à proteína CD38 humana ou proteína CD cyno, os anticorpos foram utilizados a 2 µg/mL em tampão de corrida BIAcore (HBS-EP). Antígenos (CD38 humano- histag (ID2) ou CD38 cyno-histag (ID3)) foram injetados, de 3 a 1000 nM. Depois de concluída a fase de injeção, a dissociação foi monitorada em um tampão de corrida BIAcore na mesma vazão por 360 segundos.

A superfície era regenerada entre as injeções utilizando 30 µL de NaOH 50mM-NaCl 1 M. Sensogramas individuais foram analisados usando o software BIAsimulation. Afinidade de ligação a células pré-B expressando CD38 humano

[0202] A ligação de anticorpos anti-CD38 a CD38 expresso na su- perfície de células preB::300.19 murinas recombinantes foi determinada por citometria de fluxo. A linhagem celular recombinante foi descrita por J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. Células preB::300.19 murinas expressando CD38 foram revestidas, a 40.000 células/poço, em uma placa High Bind de 96 poços (MSD L15XB-3), e 100 µL/poço de anticorpos anti-CD38 foram adicionados por 45 minutos a 4 ºC e lavados três vezes com PBS 1% BSA. 100 µL/poço de anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com Alexa488 (Jackson Immuno- Research; no 109-545-098) foram adicionados por 45 minutos a 4 ºC e lavados três vezes com PBS 1% BSA. A ligação do anticorpo foi avali- ada após centrifugação e ressuspensão das células pela adição de 200 µL/poço de PBS 1% BSA e leitura usando o sistema de citometria de fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. Os valores de KD aparente e EC50 fo- ram estimados usando o software BIOST@T-BINDING e BIOST@T- SPEED, respectivamente. Proteínas CD38 recombinantes

[0203] Várias proteínas CD38 recombinantes derivadas da isoforma A com tag (etiqueta) e mutações pontuais diferentes foram usadas (SEQ ID NOs:2, 3, 4 e 28), e uma versão com tag da isoforma E de CD38 (SEQ ID NO: 105) abrangendo o domínio celular de CD38 desde R45- P203. As proteínas foram produzidas por expressão transitória em cé- lulas de mamíferos. Sequências de codificação do DNA foram clonadas em plasmídeos de expressão em mamíferos sob o reforçador/promotor de CMV e sinais de poliA de SV40. Células HEK293 (Invitrogen; no K9000-10) foram transfectadas transitoriamente com os plasmídeos de expressão, usando o sistema de expressão ™ MAX 293 de acordo com as instruções do fabricante. Ensaio de indução de apoptose

[0204] As células foram incubadas a 2 x 105 células/mL em meio completo (RPMI-1640, FBS 10%, L-glutamina 2mM) com 1,5 μg/mL (10 nM) dos anticorpos indicados por 20 horas a 37 ºC com CO2 5%. As células foram coradas com AnnexinV-FITC de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). As amostras foram analisadas por ci- tometria de fluxo em um citômetro de fluxo BD FACSAria™ com o sof- tware BD FACSDiva para aquisição de dados controle e a análise de dados (ambos da BD Biosciences). Ensaios ELISA

[0205] Placas de 96 poços foram revestidas com CD38 a 0,5 µg/poço em PBS e 100 µL/poço de anticorpos foram adicionados à placa. A placa foi incubada a 37 ºC por 1 hora e lavada cinco vezes com PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-T). Em seguida, 100 µL de uma diluição 1:25.000 de anti-IgG humana, conjugado com peroxidase de rábano, (Jackson Ref.: 109-035-098) foram adicionados a cada poço. Após incubação a 37 ºC por 1 hora no escuro, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS-T. A ligação do anticorpo foi visualizada pela adi- ção do tampão TMB-H2O2 e leitura em um comprimento de onda de 450 nm. Os valores de EC50 foram estimados usando o software BIOST@T- SPEED. Resultados

[0206] As propriedades de ligação de anticorpos anti-CD38 humano selecionados contra CD38 solúvel humano e CD38 de macaco cynomo- lgus foram examinadas usando ensaio ELISA e por ressonância plas- mônica de superfície (SPR) usando o sistema BIAcore (Pharmacia Bi- osensor; Piscataway, NJ). Os dados de ELISA foram usados para de- terminar a EC50 de ligação do anticorpo ao CD38 humano e de macaco cynomolgus para os anticorpos humanizados anti-CD38 antiCD38_C2- CD38-1_VH1-VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2- CD38-1_VH5-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 e anticorpo hu- mano anti-CD38 antiCD38_1370.

[0207] A ligação das variantes humanizadas anti-CD38 ou do mAb humano anti-CD38 contra CD38 foi também avaliada usando ensaios por SPR. Os dados de SPR foram usados para determinar a KD e koff da ligação do anticorpo ao CD38 humano e de macaco cynomolgus para os anticorpos humanizados anti-CD38 antiCD38_C2-CD38-1_VH1- VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH5- VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 e o anticorpo humano anti-CD38 antiCD38_1370. Os dados sobre a ligação, resumidos na Tabela K, mostram que todos os mAbs anti-CD38 ligam-se a CD38 com caracte- rísticas semelhantes de ligação. Tabela K. Afinidade de ligação de mAbs anti-CD38 ao domí- nio extracelular solúvel de CD38 humano e CD38 cynomolgus, con- forme determinada por ensaio de ressonância plasmônica de superfície hCD38-his cCD38-his (SEQ ID NO:2) (SEQ ID NO:4) Kd (s-1) KD (M) Kd (s-1) KD (M) antiCD38_C2-CD38-1 2,66E-04 3,36E-10 9,85E-05 3,90E-10 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 3,90E-04 3,32E-10 7,84E-04 3,44E-09 antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 2,83E-04 4,83E-10 1,29E-04 7,10E-10 antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 5,29E-04 8,22E-10 2,01E-04 1,14E-09 antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 3,33E-04 3,12E-10 1,25E-04 5,63E-10 antiCD38_1370 2,03E-04 1,44E-09 1,90E-04 1,38E-09

[0208] A capacidade das variantes humanizadas anti-CD38 para se ligar a células expressando CD38 foi avaliada usando o ensaio baseado em FACS descrito acima. Os dados de FACS foram utilizados para de- terminar a EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano e de macaco cynomolgus para os anticorpos humanizados anti-CD38 antiCD38_C2- CD38-1_VH1-VL1, antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3, antiCD38_C2- CD38-1_VH5-VL3, antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 e o anticorpo hu- mano anti-CD38 antiCD38_1370. Os dados sobre a ligação, apresenta- dos na Tabela L, mostram que todas as variantes humanizadas anti-

CD38 exibiram afinidades de ligação semelhantes por CD38 na super- fície celular. Tabela L. Afinidade de ligação de mAbs anti-CD38 a células preB::300.19 murinas expressando CD38 KD aparente FACS (M) Células expressando hCD38 Células expressando cCD38 antiCD38_C2-CD38-1 2,80E-10 2,20E-10 antiCD38_C2-CD38-1_VH1- 3,30E-10 7,50E-10 VL1 antiCD38_C2-CD38-1_VH3- 7,80E-10 1,31E-09 VL3 antiCD38_C2-CD38-1_VH5- 5,50E-10 1,15E-09 VL3 antiCD38_C2-CD38-1_VH6- 6,80E-10 1,07E-09 VL3 antiCD38_1370 2,07E-09 1,14E-09

[0209] Os dados sobre a ligação dos ensaios ELISA, SPR e FACS acima estão resumidos na Tabela L2, junto com a identidade de sequên- cia dos domínios VH e VL a regiões V humanas. Tabela L2. Resumo de ensaios ELISA, SPR e FACS carac- terizando a ligação dos anticorpos indicados a polipeptídeos CD38 hu- mano (Hu) e de macaco cynomolgus (Cyno)

ELISA SPR FACS Identidade de região V humana EC50 nM KD nM EC50 nM Nomenclatura INN Hu Cyno Hu Cyno Hu Cyno Hu Cyno antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 -zumAb 0,11 0,10 0,33 3,44 0,33 0,76 84,7% 87,1% antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3 -zumAb 0,16 0,15 0,48 0,71 0,78 1,31 83,7% 83,9% antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3 -zumAb 0,16 0,17 0,82 1,14 0,55 1,15 80,6% 83,9% antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3 -zumAb 0,14 0,14 0,31 0,56 0,68 1,06 81,6% 83,9% antiCD38_1370 -umAb 0,05 0,09 1,44 1,38 2,00 1,14 99,0% 95,8%

[0210] A capacidade de anticorpos anti-CD38 para se ligar às iso- formas A e E de CD38 humano foi também avaliada. Para avaliar a li- gação à isoforma A e à isoforma E de CD38, um ensaio de imunoabsor- ção enzimática (ELISA) foi realizado usando as proteínas da isoforma A e isoforma E (preparadas como descrito acima) como antígeno de cap- tura. Placas de 96 poços foram revestidas com qualquer uma das iso-

formas a 0,5 µg/poço em PBS e 100 µL/poço de anticorpos foram adici- onados à placa. A placa foi incubada a 37 ºC por 1 hora e lavada cinco vezes com PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-T). Em seguida, 100 µL de uma diluição 1:25.000 de anti-IgG humana, conjugado com pero- xidase de rábano, (Jackson Ref.: 109-035-098), foram adicionados a cada poço. Após incubação a 37 ºC por 1 hora no escuro, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS-T. A ligação do anticorpo foi visu- alizada adicionando o tampão TMB-H2O2 e leitura a um comprimento de onda de 450 nm. Os valores de EC50 foram estimados com o software BIOST@T-SPEED.

[0211] A afinidade de ligação de vários anticorpos à isoforma A (SEQ ID NO:1) e à isoforma E (SEQ ID NO:105) de CD38 foi determi- nada, como mostrada na Tabela L3. A Tabela M fornece uma compara- ção entre as propriedades de ligação de vários anticorpos anti-CD38. Tabela L3. Afinidade de ligação de anticorpos anti-CD38 pe- las isoformas A e E de CD38, com base em EC50, como determinada por ELISA Anticorpo Isoforma A de CD38 EC50 (nM) Isoforma E de CD38 EC50 (nM) antiCD38_C2-CD38-1 0,11 (CV 9 %) 0,08 (CV 7%) antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 0,14 (CV 13%) 0,10 (CV 12%) antiCD38_1370 0,47 (CV 3,7%) 0,32 (CV 5%) antiCD38_SB19 0,10 (CV 7,1%) Sem ligação Tabela M. Características de ligação de vários anticorpos anti-CD38 Anti-CD38 H11 (Santa Cruz) Daratumumabe antiCD38_SB19 antiCD38_C2-CD38-1 antiCD38_1370 Ligação a huCD38 isoforma A + + + + + Ligação a huCD38 isoforma E + - - + + Ligação a CD38 cyno + - - + +

[0212] Em conclusão, somente antiCD38_C2-CD38-1 ligou-se a CD38 humano e de macaco cynomolgus com afinidade nanomolar e ligou-se às isoformas A e E de CD38. Exemplo 2: Geração de proteínas de ligação triespecíficas anti- CD38

[0213] Em seguida, as propriedades de ligação dos domínios de li- gação ao antígeno de anticorpos anti-CD38 selecionados, descritos no Exemplo 1, foram analisadas no formato triespecífico retratado na Fi- gura 1. Materiais e métodos Produção e purificação de proteínas de ligação triespecíficas

[0214] Produziram-se proteínas de ligação triespecíficas por trans- fecção transitória de 4 plasmídeos de expressão em células Expi293 usando o kit ExpiFectamine™ 293 Transfection (Thermo Fisher Scienti- fic) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 25% (p/p) de cada plasmídeo foram diluídos em Opti-MEM, misturados com o re- agente ExpiFectamine pré-diluído por 20-30 minutos à temperatura am- biente (RT), e adicionados a células Expi293 (2,5x106 células/mL). Uma otimização da transfecção para determinar a melhor razão de plasmí- deos foi frequentemente usada a fim de produzir a proteína de ligação triespecífica com bom rendimento e pureza.

[0215] 4-5 dias após a transfecção, o sobrenadante das células transfectadas foi coletado e filtrado através da unidade filtrante de 0,45 µm (Nalgene). A proteína de ligação triespecífica no sobrenadante foi purificada usando um procedimento em 3 etapas. Em primeiro lugar, usou-se purificação por afinidade à proteína A, e o Ab ligado foi eluído com o tampão de eluição “IgG Elution Buffer” (Thermo Fisher Scientific). Em segundo lugar, o produto foi dialisado contra PBS (pH7,4) durante a noite com 2 trocas do tampão PBS. Qualquer precipitado foi removido por filtração através da unidade filtrante de 0,45 µm (Nalgene) antes da etapa seguinte. Em terceiro lugar, usou-se purificação por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) (Hiload 16/600 Superdex 200 pg, ou Hiload 26/600 Superdex 200 pg, GE Healthcare) para remover agrega- dos e espécies diferentes no preparado. As frações foram analisadas em SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras para identificar as frações que continham a proteína de ligação triespecífica monomé- rica antes de combiná-las. O anticorpo purificado pode ser repartido em alíquotas e armazenado a -80 ºC por longo prazo. Ensaios ELISA

[0216] As propriedades de ligação dos anticorpos purificados foram analisadas por métodos ELISA ou SPR. Para ELISA, antígenos corres- pondentes para cada sítio de ligação na proteína de ligação triespecífica foram utilizados para revestir uma placa Immuno Plate de 96 poços (Nunc 439454, Thermo Fisher Scientific) durante a noite a 4 ºC usando 2 µg/mL de cada antígeno em PBS (pH7,4). A placa revestida foi blo- queada com leite desnatado 5% + BSA 2% em PBS por uma hora à temperatura ambiente, seguido por lavagem com PBS + Tween-20 0,25% três vezes (Aqua Max 400, Molecular Devices). Diluições em sé- rie dos anticorpos (Abs triespecífico e controle) foram preparadas e adi- cionadas às placas ELISA (100 µL/poço em duplicada), incubadas à temperatura ambiente por uma hora, seguido por lavagem 5 vezes com PBS + Tween-20 0,25%.

[0217] Depois da lavagem, o anti-Fab humano secundário, conju- gado a HRP (1:5000, Cat. No 109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc) foi adicionado a cada poço e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos. Após lavagem 5 vezes com PBS + Tween-20 0,25%, 100 µL do substrato TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Gaithers- burg, MD, EUA) foram adicionados a cada poço. A reação foi encerrada pela adição de 50 µL de H2SO4 1 M, e OD450 foi medida com SpectraMax M5 (Molecular Devices) e analisada usando o software SoftMax Pro6.3 (Molecular Devices). Os dados finais foram transferidos para o software GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, EUA) e representados como mostrado. EC50 foi calculado utilizando o mesmo software.

[0218] Usou-se ensaio ELISA para determinar a ligação de anticor-

pos triespecíficos anti-CD38xCD28xCD3 ou o anticorpo de isotipo con- trole (IgG4 humana) contra CD3 humano (Cambridge Biologics LLC Cat. no 03-01-0051), CD28 (Cambridge Biologics LLC Cat#03-01-0303), e CD38 (Cambridge Biologics LLC Cat. no 03-01-0369). Os anticorpos li- gados foram detectados utilizando um anticorpo secundário anti-Fab conjugado à peroxidase de rábano (HRP) (Jackson ImmunoResearch Inc. no 109-035-097). Resultados

[0219] Os domínios de ligação ao antígeno anti-CD38 foram testa- dos em formato triespecífico (anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3) quanto à capacidade para ligar CD38 quando outros domínios de ligação ao an- tígeno estão ligados a seus ligandos cognatos por meio de SPR. Para ligação sequencial dos três antígenos a cada Ab triespecífico, foi inje- tada concentração saturante (> 10 KD) de cada antígeno por 8 minutos, seguido por 5 minutos de dissociação. A regeneração da superfície foi conduzida injetando Glicina-HCl 10 mM, pH 2,5 por 60 segundos a 30 µL/min. Os dados foram ajustados com modelo de ligação cinética 1:1 e analisados por meio de Biacore S200 Evaluation Software v 1.0. A constante de dissociação no equilíbrio (KD) foi calculada usando a cons- tante da taxa de associação (kon) e a constante da taxa de dissociação (koff).

[0220] Esse ensaio baseado em SPR mostrou que as proteínas de ligação triespecíficas eram capazes de ligar CD38 independentemente de os domínios de ligação ao antígeno CD3 e/ou CD28 estarem igual- mente ligados ao seu antígeno cognato. Os parâmetros cinéticos, me- didos por SPR, são fornecidos na Tabela M2. Tabela M2. Ligação das proteínas de ligação triespecífica anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3 a 1, 2 ou 3 antígenos cognatos Estado da proteína de ligação antes da ligação ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (M) a CD38 Nenhum pré-ligado 9,02E+05 1,42E-03 1,57E-09 CD3 pré-ligado 8,35E+05 1,24E-03 1,48E-09 CD28 pré-ligado 7,39E+05 1,32E-03 1,79E-09

CD3 pré-ligado, depois CD28 8,18E+05 1,23E-03 1,50E-09 CD28 pré-ligado, depois CD3 8,37E+05 1,23E-03 1,47E-09

[0221] Esses resultados demonstram que todos os três alvos po- dem ligar-se às proteínas de ligação triespecíficas simultaneamente. A ligação prévia das proteínas de ligação triespecíficas a CD28, CD3, ou a ambos (em qualquer ordem) não alterou a cinética de ligação ou a afinidade de ligação a CD38.

[0222] Em seguida, cada domínio de ligação ao antígeno da prote- ína de ligação triespecífica CD38SB19xCD28supxCD3mid foi avaliado por SPR quanto à capacidade para ligar-se ao antígeno cognato com e sem os outros dois domínios de ligação ao antígeno em saturação. As Tabe- las M3 e M4 mostram os resultados desses ensaios. Tabela M3. Ligação ao alvo sem outros alvos presentes Alvo ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (M) CD38 8,04E+05 1,41E-03 1,75E-09 CD28 1,16E+05 3,14E-04 2,71E-09 CD3 2,90E+04 6,73E-04 2,32E-08 Tabela M4. Ligação ao alvo com outros alvos em saturação Alvo ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (M) CD38 5,93E+05 1,44E-03 2,42E-09 CD28 1,05E+05 3,96E-04 3,77E-09 CD3 1,27E+05 2,36E-03 1,86E-08

[0223] Como demonstrado nas Tabelas M3 e M4, a presença de dois alvos saturados por ligação prévia ao antígeno não afetou a cinética ou afinidade de ligação do terceiro alvo por CD38 ou CD28. No caso da ligação a CD3, CD38 e/ou CD28 pré-ligados resultou em cinética mais rápida (impacto de aproximadamente 4 vezes sobre os valores de kon e koff).

[0224] Os domínios de ligação ao antígeno anti-CD38 foram testa- dos em formato triespecífico com dois domínios de ligação ao antígeno anti-CD28 (super agonista, “sup”, e agonista convencional, “cvn”) e dois domínios de ligação ao antígeno anti-CD3 (“mid” e “low”). As sequências variáveis dos domínios para esses domínios de ligação ao antígeno são fornecidas como segue: anti-CD28sup: SEQ ID NO:49 (VH) e SEQ ID NO:50 (VL); anti-CD28cvn: SEQ ID NO:51 (VH) e SEQ ID NO:52 (VL);

anti-CD3mid: SEQ ID NO:53 (VH) e SEQ ID NO:54 (VL); anti-CD3low: SEQ ID NO:84 (VH) e SEQ ID NO:85 (VL). Os resultados dos ensaios de SPR examinando a ligação de proteínas de ligação triespecíficas são mostrados na Figura 2. Três domínios de ligação anti-CD38 apresenta- ram quase a mesma afinidade de ligação no formato de proteína de li- gação triespecífica que no formato de monoespecífica. Ambos os domí- nios de ligação a CD3 apresentaram aproximadamente a mesma afini- dade de ligação nos formatos mono-, bi- e triespecífico. Os domínios de ligação a CD28 mostraram afinidade de ligação ligeiramente menor (mais ainda nanomolar) no formato bi- ou triespecífico quando compa- rados com monoespecífico. Quando os outros dois domínios de ligação foram saturados, os domínios de ligação anti-CD38SB19 e anti-CD28sup apresentaram afinidades de ligação semelhantes, quando comparados com quando os outros dois domínios de ligação ao antígeno não são ligados ao antígeno. No entanto, o domínio de ligação anti-CD3mid mos- trou cinética mais rápida quando os outros dois domínios de ligação ao antígeno estavam saturados. Esses resultados demonstram que os do- mínios de ligação anti-CD38, anti-CD28 e anti-CD3 são compatíveis para uso com o formato de proteína de ligação triespecífica.

[0225] Os domínios de ligação ao antígeno anti-CD38 aqui gerados foram também comparados contra o domínio de ligação ao antígeno anti-CD38 existente de antiCD38_SB19 (ver SEQ ID NO:47 para as se- quências de VH e SEQ ID NO:48 para VL, respectivamente). A ligação de moléculas triespecíficas a CD38 expresso na superfície de células preB::300.19 murinas recombinantes foi determinada por citometria de fluxo e os anticorpos anti-CD38 monovalentes correspondentes foram analisados em paralelo. A linhagem celular recombinante foi descrita por J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. As células preB::300.19 murinas expressando CD38 foram revestidas a 40.000 cé- lulas/poço na placa High Bind de 96 poços (MSD L15XB-3) e 100 µL/poço de moléculas triespecíficas foram adicionados por 45 minutos a 4 ºC e lavados três vezes com PBS 1% BSA. 100 µL/poço de anticorpo de cabra anti-IgG humana conjugado com Alexa488 (Jackson Immuno- Research; no 109-545-098) foram adicionados por 45 minutos a 4 ºC e lavados três vezes com PBS 1% BSA. A ligação do anticorpo foi avali- ada após centrifugação e ressuspensão das células pela adição de 200 µL/poço de PBS 1% BSA e leitura por meio do sistema de citometria de fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. Os valores de KD aparente e EC50 fo- ram estimados utilizando o software BIOST@T-BINDING e BIOST@T- SPEED, respectivamente.

[0226] Citometria de fluxo foi usada como descrito acima para exa- minar a ligação do anticorpo antiCD38_SB19 ou da proteína de ligação triespecífica com o domínio de ligação ao antígeno antiCD38_SB19 anti- CD38 a células pre-B murinas expressando o polipeptídeo CD38 hu- mano ou de macaco cynomolgus na sua superfície celular. A proteína de ligação triespecífica CD38xCD28supxCD3mid com o domínio de liga- ção ao antígeno antiCD38_SB19 anti-CD38 ligou-se a células expres- sando CD38 humano com afinidade aparente 8 vezes menor (EC50 = 4 nM) do que o anticorpo monoespecífico antiCD38_SB19 (EC50 = 0,5 nM). Nem o anticorpo monoespecífico antiCD38_SB19 nem a proteína de ligação triespecífica com o domínio de ligação ao antígeno an- tiCD38_SB19 anti-CD38 ligaram-se a células expressando CD38 de cynomolgus.

[0227] O domínio de ligação do anticorpo humanizado anti-CD38 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 foi também testado em formatos tries- pecíficos quanto à ligação a células expressando polipeptídeos CD38 humano ou de cynomolgus. Diferentemente, as proteínas de ligação es- pecíficas antiCD38_SB19, CD38xCD28supxCD3mid e CD38xCD28cvn- xCD3mid com domínio de ligação ao antígeno antiCD38_C2-CD38-

1_VH1-VL1 anti-CD38, bem como o anticorpo monoespecífico an- tiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1, foram capazes de ligar polipeptídeos CD38 humano e de macaco cynomolgus. A proteína de ligação triespe- cífica CD38xCD28cvnxCD3mid com o domínio de ligação ao antígeno an- tiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 anti-CD38 ligou-se a células expres- sando CD38 humano com afinidade aparente 9 vezes menor (EC50 = 4,4 nM) que o anticorpo precursor antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 (EC50 = 0,5 nM). A proteína de ligação triespecífica CD38xCD28cvn- xCD3mid com o domínio de ligação ao antígeno antiCD38_C2-CD38- 1_VH1-VL1 anti-CD38 ligou-se a células expressando CD38 de cyno- molgus com afinidade aparente 7,5 vezes menor (EC50 = 7,5 nM) que o anticorpo precursor antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 (EC50 = 1 nM). A proteína de ligação triespecífica CD38xCD28supxCD3mid com o domí- nio de ligação ao antígeno antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1anti-CD38 ligou-se a células expressando CD38 humano com uma afinidade apa- rente 2,5 vezes menor (EC50 = 11 nM) que a proteína de ligação tries- pecífica CD38xCD28cvnxCD3mid com o domínio de ligação ao anticorpo antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 anti-CD38 (EC50 = 4,4 nM).

[0228] O domínio de ligação do anticorpo humanizado anti-CD38 antiCD38_1370 foi também comparado contra o anticorpo monoespecí- fico antiCD38_1370 quanto à ligação a células expressando polipeptí- deos CD38 humano ou de cynomolgus. Enquanto o anticorpo monoes- pecífico antiCD38_1370 ligou-se a células expressando polipeptídeos CD38 humano (EC50 = 11,2 nM) ou de macaco cynomolgus (EC50 = 6,6 nM) na faixa de nM, a proteína de ligação triespecífica CD38xCD28supxCD3mid com o domínio de ligação ao antígeno an- tiCD38_1370 anti-CD38 ligou-se a células expressando os polipeptí- deos CD38 humano ou de macaco cynomolgus sem saturação.

[0229] Em conclusão, a afinidade para ligação da proteína de liga-

ção triespecífica CD38SB19xCD28supxCD3mid proteína de ligação triespe- cífica (domínio de ligação antiCD38_SB19 anti-CD38) ao CD38 humano demonstrou estar na mesma faixa, quer examinando a ligação a CD38 humano recombinante por SPR ou a CD38 humano expresso na super- fície celular por citometria de fluxo (Figura 3). Do mesmo modo, a afini- dade das proteínas de ligação triespecíficas CD38VH1xCD28su- pxCD3mid/low (domínio de ligação antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 anti- CD38) e CD38VH1xCD28cvnxCD3mid/low (domínio de ligação an- tiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 anti-CD38) para ligação ao CD38 hu- mano também ficou na mesma faixa nos dois ensaios. Para CD38HHY1370xCD28supxCD3mid (domínio de ligação antiCD38_1370 anti- CD38), a KD para ligação ao CD38 humano foi determinada por SPR como 1 nM, enquanto nenhum valor preciso de EC50 pôde ser estimado por citometria de fluxo (Figura 3). Um resumo dos valores de KD apa- rente (obtidos por análises de FACS) de proteínas de ligação triespecí- ficas com vários domínios de ligação anti-CD38 é fornecido na Tabela M5. Tabela M5. Resumo de valores de KD aparente obtidos por ensaios de citometria de fluxo KD aparente - FACS (M) Células expressando hCD38 Células expressando cCD38 Triespecífico com domínio de ligação antiCD38_C2-CD38- 4,4 nM 7,5 nM 1_VH1-VL1 anti-CD38 Triespecífico com domínio de ligação antiCD38_1370 anti- Sem saturação Sem saturação CD38 Triespecífico com domínio de ligação antiCD38_SB19 anti- 4 nM Nenhuma ligação CD38 KD aparente - FACS (M) Células expressando hCD38 Células expressando cCD38 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 0,5 nM 1 nM antiCD38_1370 11,2 nM 6,6 nM antiCD38_SB19 0,5 nM Nenhuma ligação

[0230] Como previsto, a proteína de ligação triespecífica ΔCD38xCD28supxCD3mid desprovida do domínio de ligação anti-CD38 não se ligou a células que expressavam os polipeptídeos CD38 humano ou de macaco cynomolgus. Isso indica que a ligação observada nesse ensaio era específica para os domínios de ligação ao antígeno CD38. Exemplo 3: Ab CD38/CD3xCD28 estimula CD4 e CD8 de memória central, Th1 e respostas antígeno-específicas

[0231] Para determinar se o Ab triespecífico CD38/CD3xCD28 tri- específico poderia reforçar a função celular imune, o fenótipo de células T expandidas in vitro foi avaliado. Materiais e métodos

[0232] Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas do sangue de doadores humanos sadios, coletadas pela Research Blood Components, LLC (Boston, MA). As PBMC foram adicionadas a placas revestidas com anticorpo (350 ng/poço) (5 x 105 células/mL), como descrito antes acima, e incubadas a 37 ºC por 3 e 7 dias. As cé- lulas foram coletadas em momentos específicos e analisadas por cito- metria de fluxo para os subconjuntos de células T: virgens (CCR7+ CD45RO-), Tcm (CCR7+ CD45RO+), Tem (CCR7- CD45RO+), Tregs (CD4+ Foxp3+ CD25hi). As células foram também tratadas com monen- sina (GolgiStop) (BD Biosciences, CA) por pelo menos 6 horas antes da coloração do fluxo para determinar a expressão de citocinas intracelu- lares: Th1 (CD4+ IFN-+), Th2 (CD4+ IL-4+), e Th17 (CD4+ IL-17+). Cé- lulas T CD8+ específicas para pp65 de CMV foram detectadas usando o pentâmero conjugado fluorescente restrito ao HLA dos doadores de PBMC (A*02:01/NLVPMVATV) (ProImmune, Oxford, Reino Unido). As PBMC foram obtidas do HemaCare (Van Nuys, CA) de doadores com populações conhecidas positivas para CMV e tipos de HLA. PMBC de doadores negativos para o tipo de HLA de restrição foi usado como con- trole negativo. A coloração foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Resultados

[0233] PBMCs humanas de doadores infectados por CMV foram in- cubadas por 7 dias com o Ab triespecífico ou um anticorpo triespecífico de controle negativo com três sítios mutados de ligação ao antígeno na ausência de citocinas. A análise dos subconjuntos de CD4 revelou a maior proliferação no pool de memória central, com um aumento menor em células de memória efetora (Figura 4A). A análise do subconjunto de CD4 também revelou a maior proliferação de células Th1 (>6 vezes) em comparação a células Th2 ou Th17 (Figura 4B). No subconjunto de CD8, houve um aumento >150 vezes no subconjunto de CD8 de memó- ria central até o Dia 7, com um aumento menor em células de memória efetora (Figura 4C). De modo importante, respostas de CD8 pré-exis- tentes antígeno-específicas para CMV, direcionadas ao epítopo pp65 em doadores soropositivos para HLA-A2 utilizando coloração de tetrâ- mero (Gratama JW, van Esser JW, et al. Blood 98:1358-1364(2001)), aumentaram >44 vezes na presença do triespecífico contra CD38 em comparação ao controle negativo (Figura 4D).

[0234] Considerados em conjunto, esses dados indicam que o Ab triespecífico contra CD38 estimula a função de Th1 e as respostas pro- tetoras de células T CD8 de memória que provavelmente reforçam a imunidade antitumoral e antiviral in vivo. Exemplo 4: Anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 promovem resposta imune específica para CMV

[0235] A ativação e/ou proliferação de células T específicas para antígenos virais pode fornecer uma estratégia terapêutica contra infec- ções virais, como infecções por citomegalovírus (CMV). A capacidade de anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 para promover a ativação e expansão de células T específicas para CMV foi determinada. Materiais e Métodos Ensaios ELISA

[0236] A afinidades de ligação a cada antígeno alvo pelos engagers de células T CD38/CD28xCD3 foram medidas por ELISA. Resumida- mente, cada antígeno foi usado para revestir a placa Immuno Plate de 96 cavidades (Thermo Fisher Scientific) durante a noite a 4 ºC, utilizando 200 ng/poço em PBS (pH7,4) de cada antígeno. A placa revestida foi bloqueada com leite desnatado 5% + BSA 2% em PBS por uma hora à temperatura ambiente, seguido por lavagem com PBS + Tween-20 0,25% três vezes (Aqua Max 400, Molecular Devices). Diluições em sé- rie dos anticorpos (Abs triespecífico e controle) foram preparadas e adi- cionadas às placas de ELISA (100 µL/poço em duplicata), incubadas à temperatura ambiente por uma hora, seguido por lavagem 5 vezes com PBS + Tween-20 0,25%. Depois da lavagem, o anti-Fab humano secun- dário conjugado a HRP (1:5000, Cat. No 109-035-097, Jackson Immu- noResearch Inc) foi adicionado a cada poço e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos. Após lavagem 5 vezes com PBS + Tween-20 0,25%, 100 µL do substrato TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Gaithersburg, MD, EUA) foram adicionados a cada poço. A reação foi encerrada pela adição de 50 µL de H2SO4 1M, e OD450 foi medida com SpectraMax M5 (Molecular Devices) e analisada utilizando o software SoftMax Pro6.3 (Molecular Devices). Os dados finais foram transferidos para o software GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, EUA) e tra- çados. EC50 foi calculada usando o mesmo software. Ensaios de SPR

[0237] Os antígenos CD38-His humanos foram utilizados (Cam- bridge Biologics, Cambridge, MA) para análise cinética completa. A ca- racterização cinética de anticorpos purificados foi realizada por meio da tecnologia SPR em um BIACORE 3000 (GE Healthcare). Usou-se um ensaio de captura com o anticorpo de captura específico para IgG1 hu- mana e orientação dos anticorpos investigados. Para captura de cons- truções proteicas contendo Fc, foi usado o kit de captura de anticorpo humano (GE Healthcare). Para captura do antígeno com tag His, foi usado o kit de captura de anticorpo anti-His (GE Healthcare). O anti- corpo de captura foi imobilizado através de grupos de amina primária (11000 RU) em um chip CM5 grau de pesquisa (GE Life Sciences) em- pregando procedimentos padrão. O anticorpo analisado foi capturado a uma vazão de 10 µL/min. com um valor ajustado de RU que resultaria em sinal máximo de ligação do analito igual a tipicamente 30 RU. A ci- nética de ligação foi medida contra os anticorpos triespecíficos. Como tampão do ensaio, HBS EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e o tensoativo P20 0,005%) foi usado a uma vazão de 30 µL/min. As superfícies do chip foram regeneradas com a solução de re- generação do respectivo kit de captura. Os parâmetros cinéticos foram analisados e calculados no pacote de programa de avaliação BIA v4.1 usando uma célula do fluxo sem anticorpo capturado como referência e o modelo de ligação de Langmuir 1:1 com transferência de massa. Medição da proliferação de células T in vitro

[0238] Células T foram isoladas de doadores de células mononucle- ares do sangue periférico (PBMC) por seleção negativa, utilizando um kit de isolamento magnético Pan T Cell Isolation (Miltenyi Biotec GmbH, Alemanha). As anticorpos foram revestidos sobre placas de cultura de 96 poços, preparando os anticorpos em PBS estéril e dispensando 50 μL em cada poço (350 ng/poço). As placas foram então incubadas a 37 ºC por pelo menos 2 horas e depois lavadas com PBS estéril. Células T não tocadas foram adicionadas às placas revestidas com o anticorpo (5 x 105 células/mL) e incubadas a 37 ºC por múltiplos dias. As células foram submetidas a passagens com novo meio de cultura celular para placas frescas revestidas com anticorpo no Dia 4. Em certos experimen- tos com 7 dias de incubação, apenas meio fresco foi adicionado sem trocar para a placa fresca revestida com anticorpo. As células foram co- letadas em momentos específicos e os números das células calculados utilizando as esferas para contagem CountBright™.

Ensaio de proliferação de células T in vitro e determinação de sub- conjuntos de células T

[0239] Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas do sangue de doadores humanos sadios, coletadas pela Research Blood Components, LLC (Boston, MA). As PBMCs foram adicionadas a placas revestidas com anticorpo (350 ng/poço) (5 x 105 células/mL), como descrito antes acima, e incubadas a 37 ºC por 3 e 7 dias. As cé- lulas foram coletadas em momentos específicos e analisadas por cito- metria de fluxo para subconjuntos de células T: virgens (CCR7+ CD45RO-), Tcm (CCR7+ CD45RO+), Tem (CCR7- CD45RO+), Tregs (CD4+ Foxp3+ CD25hi). As células foram também tratadas com monen- sina (GolgiStop) (BD Biosciences, CA) por pelo menos 6 horas antes da coloração do fluxo para determinar a expressão de citocinas intracelu- lares: Th1 (CD4+ IFN-+), Th2 (CD4+ IL-4+) e Th17 (CD4+ IL-17+). Cé- lulas T CD8+ específicas para pp65 de CMV, específicas para BMLF de EBV, específicas para MP de Influenza A e específicas para Gag de HIV-1 foram detectadas usando pentâmero conjugado fluorescente res- trito ao HLA/peptídeo viral dos doadores de PBMC (A*02:01/NLV- PMVATV; SEQ ID NO:26), (A*02:01/GLCTLVAML; SEQ ID NO:27), (A*02:01/GILGFVFTL; SEQ ID NO:28) e (A*02:01/SLYNTVATL; SEQ ID NO:25) respectivamente (ProImmune, Oxford, UK). PBMC foram obti- das do HemaCare (Van Nuys, CA) para doadores com CMV, EBV ou Influenza A conhecidos, e da BioIVT (Westbury, NY) para doadores com positividade conhecida para HIV-1 e tipos de HLA. PMBC de doadores negativos para o tipo de HLA de restrição foi usado como controle ne- gativo. A coloração foi realizada de acordo com o protocolo do fabri- cante. Quantificação de células T específicas para CMV

[0240] Como descrito acima, PBMCs foram isoladas do sangue de doadores humanos sabidamente infectados por CMV e adicionadas a placas contendo o anticorpo triespecífico ou o anticorpo controle. As placas foram incubadas a 37ºC. As células foram coletadas nos momen- tos indicados e analisadas como descrito acima. Resultados

[0241] O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a proliferação de células T CD8+ de memória específica para CMV após incubação por até 10 dias com PBMCs iso- ladas do doador B humano infectado por CMV (Figuras 5A-5B) e do do- ador C humano infectado por CMV (Figuras 6A-6B). Como mostrado na Figura 5A (CMV - Doador B) e Figura 6A (CMV - Doador C), o anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid levou a aumentos em células T CD8+ de memória específicas para CMV (células/μL) em relação ao anticorpo triplo mutante controle. Além disso, o anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid aumentou a porcentagem de células CD8+ de memória efetora (Tem) e de memória central (Tcm) específicas para CMV em relação ao anticorpo triplo mutante controle (CMV - Doa- dor B, Figura 5B; CMV - Doador C, Figura 6B).

[0242] Considerados em conjunto, esses dados indicam que os an- ticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 promovem a ativação e expan- são de células T específicas para CMV, como células T CD8+ específi- cas para CMV, células T CD8+ de memória efetora (Tem) específicas para CMV e células T CD8+ de memória central (Tcm) específicas para CMV. Exemplo 5: Anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 promovem resposta imune específica para EBV

[0243] Em seguida, a capacidade de anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 para promover a ativação e expansão de células T específicas para o vírus Epstein-Barr (EBV) foi determinada. Materiais e Métodos Quantificação de células T específicas para EBV

[0244] Como descrito acima, PBMCs foram isoladas do sangue de doadores humanos sabidamente infectados por EBV e adicionadas a placas contendo o anticorpo triespecífico ou o anticorpo controle. As placas foram incubadas a 37 ºC. As células foram coletadas nos mo- mentos indicados e analisadas como descrito acima. Resultados

[0245] O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a proliferação de células T CD8+ de memória específicas para EBV após a incubação por até 11 dias com PBMCs isoladas do doador A humano infectado por EBV (Figuras 7A-7B) e o doador B humano infectado por EBV (Figuras 8A-8B). Como mostrado na Figura 7A (EBV - Doador A) e Figura 8A (EBV - Doador B), o anti- corpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid levou a aumentos em células T CD8+ de memória específicas para EBV (células/μL) em rela- ção ao anticorpo triplo mutante controle. Além disso, o anticorpo tries- pecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid aumentou a porcentagem de cé- lulas T CD8+ Tem e Tcm específicas para EBV em relação ao anticorpo triplo mutante controle (EBV - Doador A, Figura 7B; EBV - Doador B, Figura 8B, por exemplo, ver o Dia 7).

[0246] Considerados em conjunto, esses dados indicam que os an- ticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 promovem a ativação e expan- são de células T específicas para EBV, de memória efetora (Tem) espe- cíficas para EBV e células T CD8+ de memória central (Tcm) específicas para EBV. Exemplo 6: Anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 promovem resposta imune específica para HIV

[0247] Em seguida, a capacidade de anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 para promover a ativação e expansão de células T específicas para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi determi- nada.

Materiais e Métodos Quantificação de células T específicas para HIV

[0248] Como descrito acima, PBMCs foram isoladas do sangue de doadores humanos sabidamente infectados por HIV e adicionadas a placas contendo o anticorpo triespecífico ou o anticorpo controle. As placas foram incubadas a 37ºC. As células foram coletadas nos momen- tos indicados e analisadas como descrito acima. Resultados

[0249] No Dia 0 (antes da incubação com anticorpos triespecíficos), as PBMCs de doadores positivos para HIV exibem células T CD8 espe- cíficas para Gag de HIV (A*02:01 - SLYNTVATL (HIV-1 gag p17 76-84) Pentâmero conjugado a PE, ProImmune) (Figura 9). Por exemplo, três doadores de PBMC positivos para HIV tinham 0,86% (HIV - Doador A), 0,95% (HIV - Doador B) e 2,27% (HIV - Doador C) células T CD8 espe- cíficas para Gag em comparação a 0,33% em PBMCs de um doador negativo para HIV.

[0250] A incubação de PBMCs por até 10 dias com o anticorpo tri- específico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a proliferação de células T HIV-específicas. Como mostrado na Figura 10A (HIV - Doador D), Figura 11A (HIV Doador E) e Figura 12 A (HIV - Doador F), o anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid levou a aumentos em células T CD8+ de memória específicas para HIV (célu- las/μL) em relação ao anticorpo triplo mutante controle. Além disso, o anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid aumentou a por- centagem de células CD8+ de memória efetora (Tem) específicas para HIV (por exemplo, ver os Dias 7 e 10) e também, em menor grau, células CD8+ de memória central (Tcm) cells, em relação ao anticorpo triplo mu- tante controle (HIV - Doador D, Figura 10B; HIV - Doador E, Figura 11B; HIV - Doador F, Figura 12B). Exemplo 7: Anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 promovem resposta imune específica para Influenza

[0251] A capacidade de anticorpos triespecíficos CD38/CD28xCD3 para promover a ativação e expansão de células T específicas para In- fluenza foi determinada. Materiais e Métodos Quantificação de células T específicas para Influenza

[0252] Como descrito acima, PBMCs foram isoladas do sangue de doadores humanos sabidamente infectados por Influenza A e adiciona- das a placas contendo o anticorpo triespecífico ou o anticorpo controle. As placas foram incubadas a 37ºC. As células foram coletadas nos mo- mentos indicados e analisadas como descrito acima. Resultados

[0253] O anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid ativou as células T e promoveu a proliferação de células T CD8+ de memória específicas para Influenza após incubação por até 11 dias com PBMCs isoladas de um doador humano infectado pelo Influenza (Figuras 13A- 13B) (Doador A - Influenza). Como mostrado na Figura 13A, o anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28sup x CD3mid levou a aumentos nas células T CD8+ de memória específicas para Influenza (células/μL) em relação ao anticorpo triplo mutante controle. Além disso, o anticorpo triespecí- fico CD38VH1/CD28sup x CD3mid aumentou a porcentagem de células T CD8+ Tem específicas para Influenza (Flu) (por exemplo, ver os Dias 7 e 11) e células Tcm (por exemplo, ver o Dia 7) em relação ao anticorpo triplo mutante controle (Figura 13B).

[0254] Considerados em conjunto, os dados apresentados nos Exemplos 1-7 demonstram que os anticorpos triespecíficos anti- CD38/CD3/CD28 estimulam imunidade antiviral potente contra diversos vírus. Sem a intenção de estar preso à teoria, acredita-se que os anti- corpos triespecíficos CD38/CD3/CD28 podem ativar e promover a pro- liferação de células T ao envolverem todos os três ligantes nas células

T. Em particular, acredita-se que o envolvimento de CD3/CD28 nas cé- lulas T pelos anticorpos triespecíficos CD38/CD3/CD28 inicia a ativa- ção, proliferação e diferenciação de células T em células T de memória. Além disso, sem a intenção de estar preso à teoria, acredita-se que o envolvimento de CD28 proporciona um sinal coestimulatório vantajoso que reforça a duração e magnitude da resposta imune e promove a pro- liferação e sobrevida de células T.

[0255] Embora a invenção inclua várias modalidades, entende-se que variações e modificações ocorrerão aos técnicos no assunto. Por- tanto, a intenção é que as reivindicações anexadas cubram todas as tais variações equivalentes que se enquadrarem no âmbito da invenção. Além disso, os títulos das seções aqui usados são para fins de organi- zação apenas e não deverão ser interpretados como limitações à maté- ria descrita.

[0256] Cada modalidade aqui descrita pode ser combinada com qualquer outra modalidade ou modalidades a menos que claramente in- dicado o contrário. Em particular, qualquer característica ou modalidade indicada como preferida ou vantajosa pode ser combinada com qual- quer outra característica ou características ou modalidade ou modalida- des indicadas como preferidas ou vantajosas, a menos que claramente indicado o contrário.

[0257] Todas as referências citadas neste pedido de patente são expressamente aqui incorporadas por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para expansão de células T de memória vírus-es- pecíficas, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma cé- lula T de memória vírus-específica em contato com uma proteína de li- gação, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias poli- peptídicas que formam os três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina;

VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38 .

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula T de memória vírus-específica é colocada em contato com a proteína de ligação in vitro ou ex vivo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que o contato da célula T de memória vírus-específica com a proteína de ligação provoca ativação e/ou proliferação de células T de memória vírus-específicas.

4. Método para expansão de células T, caracterizado pelo fato de que compreende colocar uma célula T em contato com uma pro-

teína de ligação in vitro ou ex vivo, em que a proteína de ligação com- preende quatro cadeias polipeptídicas que formam os três sítios de liga- ção ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina;

CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3, e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T de memória ou uma célula T efetora.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracteri- zado pelo fato de que a célula T expressa um receptor de antígeno qui- mérico (CAR) na sua superfície celular ou compreende um polinucleotí- deo que codifica um CAR.

7. Método para o tratamento de infecção viral crônica, carac- terizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de li- gação, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias poli- peptídicas que formam os três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia polipeptídica compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula:

VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-hinge-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VH3-CH1-hinge-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia polipeptídica compreende uma estru- tura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VL3 é um terceiro domínio variável da cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável da cadeia pesada de imu- noglobulina; CL é um domínio constante da cadeia leve de imunoglobu- lina; CH1 é um domínio constante CH1 da cadeia pesada de imu- noglobulina; CH2 é um domínio constante CH2 da cadeia pesada de imu- noglobulina;

CH3 é um domínio constante CH3 da cadeia pesada de imu- noglobulina; hinge é uma região hinge de imunoglobulina que conecta os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes aminoácidos; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fór- mula II formam um par cruzado cadeia leve-cadeia pesada; e em que VH1 e VL1 formam um primeiro sítio de ligação ao an- tígeno que se liga a um polipeptídeo CD28, em que VH2 e VL2 formam um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD3 e em que VH3 e VL3 formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a um polipeptídeo CD38.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracteri- zado pelo fato de que a proteína de ligação é administrada ao indivíduo em uma formulação farmacêutica que compreende a proteína de liga- ção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a administração da proteína de ligação resulta na ativação e/ou proliferação de células T de memória vírus-específicas no indivíduo.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 10, caracterizado pelo fato de que as células T de memória são células T CD8+ ou CD4+ de memória.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 10 e 11, caracterizado pelo fato de que as células T de memória são células T de memória central (TCM) ou células T de memória efetora (TEM).

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CD28 é um poli- peptídeo CD28 humano, em que o polipeptídeo CD3 é um polipeptídeo CD3 humano, e em que o polipeptídeo CD38 é um polipeptídeo CD38 humano.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que: (a) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSFN (SEQ ID NO:31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IYPGNGGT (SEQ ID NO:32) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO:34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de LAS (SEQ ID NO:35) e uma sequência CDR-L3 com- preendendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); (b) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSYA (SEQ ID NO:37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IYPGQGGT (SEQ ID NO:38) e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO:33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO:39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de GAS (SEQ ID NO:40), e uma sequência CDR-L3 com- preendendo a sequência de aminoácidos de QQNKEDPWT (SEQ ID NO:36); ou (c) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GFTFSSYG (SEQ ID

NO:41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IWYDGSNK (SEQ ID NO:42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO:43), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de QGIRND (SEQ ID NO:44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AAS (SEQ ID NO:45) e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de LQDYIYYPT (SEQ ID NO:46).

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: (a) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFTSFN- MHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:5), e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGV-

PARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPWTFGGGTKL EIK (SEQ ID NO:6); (b) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVKEA- PGQRLEWIGYIYPGQGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13), e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS- QSVSSYGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRATGI-

PARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:14); (c) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEA- PGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17), e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSG- TDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18); (d) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTFTSFNMHWVKEA- PGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21), e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSG- TDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18); (e) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSFNMHWVKEA- PGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN-

QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFCARTGGLRRAYFT YWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23), e o domínio VL3 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESV- DSYGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT GIPARFSGSGSG- TDFTLTISPLEPEDFAVYYCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18); ou (f) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVR- QAPGKGLEWVAVIWYD-

GSNKYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMF

RGAFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9), e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácidos de AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS- QGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS-

RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQDYIYYPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:10).

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que: (a) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GYTFTSYY (SEQ ID NO:108), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IYPGNVNT (SEQ ID NO:109), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de TRSHYGLDWNFDV (SEQ ID NO:110), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QNIYVW (SEQ ID NO:111), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de KAS (SEQ ID NO:112), e uma sequência CDR-L3 compre- endendo a sequência de aminoácidos de QQGQTYPY (SEQ ID NO:113); ou (b) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GFSLSDYG (SEQ ID NO:114), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IWAGGGT (SEQ ID NO:115), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ARDKGYSYYYSMDY (SEQ ID NO:116), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de ESVEYYVTSL (SEQ ID NO:117), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de AAS (SEQ ID NO:118), e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQSRKVPYT (SEQ ID NO:119).

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que: (a) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVR- QAPGQGLEWIGSIYPGN-

VNTNYAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCTRSHYG LDWNFDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:49), e o domínio VL1 compre- ende a sequência de aminoácidos de DIQMTQSPSSLSAS- VGDRVTITCQASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPS-

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:50); ou (b) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSDYGVHWVR- QPPGKGLEWLGVIWAGGGTNYNPS-

LKSRKTISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARDKGYSYYYSMDY WGQGTTVTVS (SEQ ID NO:51), e o domínio VL1 compreende a se- quência de aminoácidos de DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASES- VEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGV-

PARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDVANYYCQQSRKVPYTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO:52).

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que: (a) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GFTFTKAW (SEQ ID NO:120), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:121), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de RGVYYALSPFDY (SEQ ID NO:122), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHNNANTY (SEQ ID NO:123), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de KVS (SEQ ID NO:124), e uma sequência CDR-

L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GQGTQYPFT (SEQ ID NO:125); ou (b) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 com- preendendo a sequência de aminoácidos de GFTFTKAW (SEQ ID NO:126), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de IKDKSNSYAT (SEQ ID NO:127), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GVYYALSPFDY (SEQ ID NO:128), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de QSLVHNNGNTY (SEQ ID NO:129), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequên- cia de aminoácidos de KVS (SEQ ID NO:130), e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de GQGTQYPFT (SEQ ID NO:131).

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: (a) o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVR- QAPGKQLEWVAQIKD-

KSNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRG VYYALSPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:53), e o domínio VL2 com- preende a sequência de aminoácidos de DIVMTQTPLSLSVTPGQPA- SISCKSSQSLVHNNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSN-

RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFG SGTKVEIK (SEQ ID NO:54); ou (b) o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácidos de QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTKAWMHWVR- QAPGKGLEWVAQIKD-

KSNSYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCRG VYYALSPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:84), e o domínio VL2 com-

preende a sequência de aminoácidos de DIVMTQTPLSLSVTPGQPA- SISCKSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYKVSN-

RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQGTQYPFTFG GGTKVEIK (SEQ ID NO:85).

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dentre L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácido de comprimento.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que (a) L1, L2, L3 e L4 têm cada um independentemente zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58) e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59); ou (b) L1, L2, L3 e L4 compreendem cada um independentemente uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:59).

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO:57), L3 compreende a sequência S, e L4 compreende a sequência RT.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são F234A e L235A.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são E233P, F234V, L235A e uma deleção em 236.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S228P e R409K.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são L234A, L235A e P329A.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que os domínios hinge-CH2-CH3 da segunda e da terceira cadeia polipeptídica são domínios hinge-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios hinge-CH2-CH3 compreendem cada um substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 298, 299, e 300 de IgG1 humana de acordo com o Índice

EU, em que as substituições de aminoácidos são S298N, T299A, e Y300S.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o domínio hinge-CH2-CH3 da se- gunda cadeia polipeptídica compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que o domí- nio hinge-CH2-CH3 da terceira cadeia polipeptídica compreende substi- tuições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são S354C e T366W.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o domínio hinge-CH2-CH3 da se- gunda cadeia polipeptídica compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de amino- ácidos são S354C e T366W; e em que o domínio hinge-CH2-CH3 da ter- ceira cadeia polipeptídica compreende substituições de aminoácidos em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o Índice EU, em que as substituições de aminoácidos são Y349C, T366S, L368A e Y407V.

30. Proteína de ligação de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que: (a) a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:62, e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:63;

(b) a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:65, e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:63; (c) a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:67, e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:63; (d) a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:68, e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:69; (e) a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:70, e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:69; ou (f) a primeira cadeia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:61, a segunda cadeia polipeptídica com- preende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:66, a terceira ca- deia polipeptídica compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:71, e a quarta cadeia polipeptídica compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:69.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o vírus é um vírus da imunodefi- ciência humana (HIV), vírus Influenza, citomegalovírus (CMV), vírus da hepatite B (HBV), papilomavírus humano (HPV), vírus Epstein-Barr (EBV), vírus espumoso humano (HFV), vírus herpes simples tipo 1 (HSV-1), ou vírus herpes simples tipo 1 (HSV-2).