BR112014010823B1 - anticorpos que se ligam a gp41 e neutralizam o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (hiv-1), seus usos, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, composição, kit, bem como métodos de detecção de infecção pelo hiv-1 e de teste de imunógeno potencial - Google Patents

anticorpos que se ligam a gp41 e neutralizam o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (hiv-1), seus usos, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, composição, kit, bem como métodos de detecção de infecção pelo hiv-1 e de teste de imunógeno potencial Download PDF

Info

Publication number
BR112014010823B1
BR112014010823B1 BR112014010823-4A BR112014010823A BR112014010823B1 BR 112014010823 B1 BR112014010823 B1 BR 112014010823B1 BR 112014010823 A BR112014010823 A BR 112014010823A BR 112014010823 B1 BR112014010823 B1 BR 112014010823B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
seq
hiv
amino acid
antibodies
Prior art date
Application number
BR112014010823-4A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112014010823A2 (pt
Inventor
Mark Connors
Jinghe Huang
Leo B. Laub
Peter Kwong
Gary Nabel
John R. Mascola
Baoshan Zhang
Rebecca S. Rudicell
Ivelin Georgiev
YongPing Yang
Jiang Zhu
Gilad Ofek
Original Assignee
The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services filed Critical The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services
Publication of BR112014010823A2 publication Critical patent/BR112014010823A2/pt
Publication of BR112014010823B1 publication Critical patent/BR112014010823B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/161—HIV-1, HIV-2 gag-pol, e.g. p55, p24/25, p17/18, p.7, p6, p66/68, p51/52, p31/34, p32, p40

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

ANTICORPOS QUE SE LIGAM A GP41 E NEUTRALIZAM O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA TIPO 1 (HIV-1), SEUS USOS NA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE INFECÇÃO POR HIV-1, PROTEÍNA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO, KIT, BEM COMO MÉTODOS DE DETECÇÃO DE INFECÇÃO PELO HIV-1 E DE TESTE DE IMUNÓGENO POTENCIAL. A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao gp41 e neutraliza vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) e seu uso na prevenção ou tratamento de infecção pelo HIV-1. Ainda, a presente invenção refere-se a proteína arca bouço, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, kit, bem como a métodos de detecção de uma infecção pelo HIV-1 e de teste de imunógeno potencial.

Description

ANTICORPOS QUE SE LIGAM A GP41 E NEUTRALIZAM O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA TIPO 1 (HIV-1), SEUS USOS, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, COMPOSIÇÃO, KIT, BEM COMO MÉTODOS DE DETECÇÃO DE INFECÇÃO PELO HIV-1 E DE TESTE DE IMUNÓGENO POTENCIAL REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este Pedido Reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.nº 61/702.703, depositado em 18 de setembro de 2012; Pedido Provisório U.S.nº 61/698.480, depositado em 7 de setembro de 2012; Pedido Provisório U.S.nº 61/672.708, depositado em 17 de julho 2012; e Pedido Provisório U.S.nº 61/556.660, depositado em 7 de novembro de 2011. Cada um destes Pedidos anteriores é incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] Este se refere à identificação de anticorpos neutralizantes monoclonais, tais como, porém não limitados aos anticorpos que se ligam à região próxima à membrana de gp41 de HIV-1.
ANTECEDENTES
[003] Uma vacina contra o Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-l) eficaz, provavelmente necessitará induzir anticorpos neutralizantes (NAbs) que bloqueiam a entrada de HIV-l nas células humanas. Para serem eficazes, os anticorpos induzidos por vacina deverão ser ativos contra a maioria das linhagens circulantes de HIV-l. Infelizmente, as vacinas atuais contra HIV-l são incapazes de induzir NAbs amplamente reativos. Um maior obstáculo para o planejamento de melhores vacinas é o entendimento limitado de qual região das glicoproteínas envelope de HIV-1, tais como gp120 e gp41, é reconhecida por NAbs. Alguns anticorpos monoclonais neutralizantes (mAbs) foram isolados de indivíduos infectados por HIV-1 e estes mAbs definem regiões específicas (epitopos) no vírus que são vulneráveis aos NAbs.
[004] Embora as glicoproteínas envelope sejam imunogênicas e induzam uma variedade de anticorpos, os anticorpos neutralizantes que são induzidos são específicos de linhagem, e a maioria das respostas imunes é desviada para determinantes não neutralizantes (Weiss, R.A., et al., Nature, 1985. 316 (6023): p. 69-72; Wyatt, R. e J. Sodroski, Science, 1998. 280 (5371): p. 1884-8). Anticorpos amplamente neutralizantes foram isolados apenas raramente de infecção por HIV natural. Três exemplos de anticorpos amplamente neutralizantes que ligam gp41 são 2F5, 4E10 e Z13E1. Estes anticorpos neutralizantes de gp41 reconhecem a região próxima à membrana (MPER) da glicoproteína de gp41 de HIV-1. Infelizmente, estes anticorpos são limitados em sua reatividade cruzada de linhagem ou sua potência e, portanto, não fornecem uma escolha viável para intervenção terapêutica. Desse modo, a necessidade existe de métodos para preparar os anticorpos monoclonais amplamente neutralizantes que podem fornecer proteção de um agente infeccioso, tal como HIV.
SUMÁRIO
[005] Anticorpos neutralizantes monoclonais humanos isolados que especificamente ligam gp41 são fornecidos aqui. Em certos exemplos, a capacidade de ligação e/ou neutralização destes anticorpos foi otimizada. São também descritas aqui composições incluindo os anticorpos descritos que especificamente ligam gp41, ácidos nucleicos codificando estes anticorpos, vetores de expressão incluindo os ácidos nucleicos, e células hospedeiras isoladas que expressam os ácidos nucleicos. Fragmentos de ligação de antígeno dos anticorpos isolados são também fornecidos.
[006] Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, inclui uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 1. Em diversas tais modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, especificamente se liga a gp41 e contata L, WF, LW e R na sequência de aminoácido estabelecida como LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, resíduos 14 a 28), e é neutralizante. Em modalidades adicionais, o anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, especificamente se liga a gp41 e contata NWF, T, e R na sequência de aminoácido estabelecida como NWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13, resíduos 7 a 19), e é neutralizante. Em modalidades adicionais, um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação de antígeno é fornecido que inclui uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada inclui os aminoácidos 26 a 33 (região 1 determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1)), 51 a 60 (HCDR2), ou 99 a 120 (HCDR3) de SEQ ID NO: 11, em que X1 é Q ou R, X2 é V ou A, X3 é S ou Y, e X4 é T ou I. O anticorpo ou o fragmento de ligação de antígeno especificamente liga gp41 de HIV-1, e é neutralizante. Em algumas tais modalidades, o anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno inclui uma cadeia pesada incluindo um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (HCDR1), 51 a 60 (HCDR2), e 99 a 120 (HCDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 147-149, 189 a 192, ou 200 a 204. Em algumas tais modalidades, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano isolado inclui uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 147-149, 189-192, ou 200-204. Em outras modalidades, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, inclui a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 147-149, 189-192, ou 200-204.
[007] Em modalidades adicionais, o anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inclui uma cadeia leve pelo menos cerca de 80% idêntica à sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, a cadeia leve inclui os aminoácidos 26 a 31 (região 1 determinante de complementaridade de cadeia leve (LCDR1)), 49-51 (LCDR2), e 87-98 (LCDR3) de SEQ ID NO: 12, onde X4 é E ou D, X5 é Y ou H, X6 é K ou I, X7 é V ou I, X8 é S ou T, X9 é D ou E, X10 é E ou D, e X11 é T ou I. Em modalidades adicionais, a cadeia leve inclui os aminoácidos 26 a 31 (LCDR1), 49 a 51 (LCDR2), ou 87-98 (LCDR3) de uma das SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150 a 152, ou 164 a 186. Em algumas modalidades, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno inclui uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150 a 152, ou 164 a 186. Em uma modalidade, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno inclui a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150 a 152, ou 164 a 186.
[008] Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é fornecido, em que a cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 1 e a cadeia leve inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 2. O anticorpo especificamente liga gp41 de HIV-1 e é neutralizante. Em outras modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é fornecido, em que a cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 154 e a cadeia leve inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 152. O anticorpo especificamente liga gp41 de HIV-1 e é neutralizante. Em outras modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo é fornecido, em que a cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 192 e a cadeia leve inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 152. O anticorpo especificamente liga gp41 de HIV-1 e é neutralizante.
[009] Os anticorpos e composições descritas aqui podem ser usados para uma variedade de propósitos, tal como para detectar a presença de HIV-1 em uma amostra biológica ou diagnosticar AIDS. Estes métodos podem incluir uma amostra de um indivíduo com um anticorpo monoclonal que especificamente liga gp41, e detectar a ligação do anticorpo à amostra. Um aumento na ligação do anticorpo à amostra, com relação à ligação do anticorpo, para uma amostra de controle identificar o indivíduo como um indivíduo com infecção por HIV-1 e/ou AIDS. Em alguns exemplos não limitantes, um aumento na ligação do anticorpo para a amostra relativa para uma amostra de controle detectar a presença de HIV-1.
[0010] São descritos também, métodos para o tratamento de um indivíduo com infecção por HIV, tal como, porém não limitado a um indivíduo com AIDS. Os métodos incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal como acima descrito a um indivíduo.
[0011] As anteriores e outras características e vantagens desta invenção, tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de diversas modalidades que prosseguem com referência às figuras acompanhantes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0012] As figuras 1A a 1C são um grupo de tabelas e um diagrama ilustrando análises de neutralização e sequência de anticorpo 10E8. (A) Genes de linhagem germinativa inferidos codificando as regiões variáveis de 10E8, 7H6 e 7N16. (B) A atividade de neutralização de anticorpos contra um painel de pseudovírus de proteína envelope (Env) de HIV-1 de isolado 181. Dendrogramas indicam a distância de proteína gp160 de isolado primário de HIV-1 Envs. (C) Os dados abaixo do dendrograma mostram o número de vírus testados, a porcentagem de vírus neutralizados, e a média geométrica IC50 para vírus neutralizados com um IC50<50 μg/ml. Títulos médios são baseados em todos os vírus testados, incluindo aqueles com IC50 >50ug/ml, aos quais foi designado um valor de 100.
[0013] As figuras 2A e 2B ilustram a especificidade de ligação de 10E8. (A) Ligação de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) de mAb 10E8 ou 4E10 ao peptídeo gp140, gp120, gp41, ou 4E10. As barras de erro indicam um erro padrão da média (SEM). (B) Inibição de neutralização de mAbs 10E8 ou 4E10 de vírus de C1 HIV2/HIV-1 MPER por 4E10 peptídeos de varredura de alanina. O peptídeo foi incubado com mAb 4E10 ou 10E8 durante uma hora antes da infecção de células TZM-bl. O eixo Y mostra o percentual de neutralização para cada condição. Os resíduos W672, F673, T676 e R683 foram as posições para que o peptídeo mutante de alanina não bloqueasse a neutralização (R683 apenas para o anticorpo 10E8). Os resíduos 16 a 28 de SEQ ID NO: 26 são mostrados.
[0014] As figuras 3A e 3B são um grupo de gráficos e um grupo de imagens digitais ilustrando a análise de autorreatividade de 10E8. (A) Análise de Ressonância de Plasmônio de Superfície (SPR) de ligação de 10E8 aos fosfolipídeos aniônicos. 10E8 foi injetado sobre lipossomas de PC-CLP ou lipossoma de PC-PS imobilizado no chip de sensor BIACORE® L1. 4E10 e 2F5 foram usados como controle positivos e 13H1, 17b, e a proteína anti-RSV F como controles negativos. (B) Reatividade de 10E8 com células epiteliais HEP-2. Os controles são como acima com VRC01 adicionado como um controle negativo adicional. A concentração de anticorpo foi de 25 μg/ml. Todas as imagens são mostradas em ampliação de 400x.
[0015] As figuras 4A-4H são um grupo de diagramas em fita ilustrando a estrutura cristalina de anticorpo 10E8 em complexo com seu epitopo de MPER de gp41. (A) 10E8 reconhece uma hélice de gp41 altamente conservada para neutralizar HIV-1. 10E8 de Fab é mostrado em representação em fitas (tons de cinza escuro para cadeia pesada e de cinza claro para cadeia leve) em complexo com um peptídeo de gp41 (cinza escuro) que abrange o MPER (Asn656-Arg683; NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26)). (B) Interface entre 10E8 e gp41 com cadeias laterais de 10E8 seletas e cadeias laterais de gp41 em representação em bastão. Em analogia por um lado, a articulação pode ser vista como sendo presa por um polegar (representdo por CDR H2), a hélice de terminal C como sendo suspensa ao longo de um indicador estendido correspondente (representado pelo CDR H3), e resíduos que iniciam a hélice de terminal C como sendo capturados na fenda entre o polegar e o indicador (representado pela junção das alças de CDR). (C-D) Superfícies de contato embotado e conservação de epitopo. Um exame da superfície de contato embotado no gp41 (cinza; C) revela que os resíduos de epitopo (rotulados, D) que são diretamente contatados por 10E8 são altamente conservados através 2870 linhagens examinadas (porcentagens de conservação fornecidas em parênteses; veja também figuras 26 a 28). E-H, mutagênese de alanina de parátopo e epitopo. Os resíduos na esxtremidade do CDR H3 de 10E8 e dentro da fenda hidrofóbica são cruciais para o reconhecimento de gp41 e para a neutralização do vírus (figuras 31 a 32), como mapeado na superfície de contato de 10E8 embotada (E, G). Estes resultados refletem os efeitos de mutações de varredura de alanina do epitopo 10E8 (figuras 18-19), como mapeado na superfície de gp41-b embotada (F, H). Uma comparação dos efeitos da mutagênese de alanina do parátopo e epitopo revela que os resíduos do epitopo que são mais cruciais para a neutralização e reconhecimento de 10E8, são também os mais altamente conservados (D).
[0016] As figuras 5A e 5B são uma tabela, um grupo de gráficos e um diagrama esquemático ilustrando um sítio de vulnerabilidade de gp41. (A) Impacto de variação de sequência sob a neutralização de 10E8. Sequências de aminoácidos preditas dentro do epitopo de ligação de 10E8 para três vírus resistentes a 10E8 e do vírus do paciente são mostradas. A região de ligação de 10E8 e diferenças na sequência em comparação com o vírus de JR2 são rotuladas em cinza claro. Valores IC50 e IC80 que são >20 vezes do que são pseudovírus do tipo selvagem de JR2, são destacados em cinza claro. Barras de erro denotam um SEM. (B) Definição estrutural de uma região altamente conservada de gp41 reconhecida por anticorpos neutralizantes. Átomos de resíduos altamente conservados que fazem contato direto com 10E8 são em tom de cinza médio e mostrados em representação em bastão, átomos embotados por 10E8 são em tom de cinza escuro, e átomos de contato de cadeia principal são em tom de cinza claro. Superfícies semitransparentes do MPER de gp41 são sombreadas de acordo com os átomos fundamentais. Vistas de 90º são mostradas, com ligação de anticorpo 10E8 no painel direito. O CDR H3 de 10E8 interage com resíduos hidrofóbicos altamente conservados, enquanto o CDR H2 contata átomos de cadeia principal na junção entre as hélices de terminal N e C. A maioria dos resíduos não ligados do MPER (cinza) são hidrofóbicos, especialmente aqueles na hélice de terminal C. Na estrutura de um intermediário de fusão tardio (Figura 16), estes resíduos opõem-se ao lado externo de um rolo em espiral helicoidal; na conformação de pré-fusão do espigão viral, estes podem interagir com a membrana viral ou com outras regiões hidrofóbicas de Env.
[0017] As figuras 6A e 6B descreve um alinhamento de sequência das cadeias pesadas e leves de anticorpos 10EB de gp41 (SEQ ID NO: 1 e 2), 7H6 (SEQ ID NO: 3 e 4), 7N16 (SEQ ID NO: 5 e 6), IGHV3- 15*05 (SEQ ID NO: 7) e a sequência de linhagem germinativa de IGLV3-19*01 (SEQ ID NO: 8). Os resíduos em cinza claro representam as substituições da sequência de linhagem germinativa. O símbolo ponto significa a deleção de resíduo. A numeração de Kabat e IMGT é mostrada e é usada para identificar resíduos específicos de identidade nas cadeias pesadas e leves de 10E8.
[0018] A figura 7 é um gráfico ilustrando a correlação de potências de neutralização entre soro de doador N152 e anticorpo 10E8. É mostrada uma plotagem dos ID50s de neutralização de soro de doador N152 em comparação com IC50s de neutralização de 10E8, ensaiada em comparação com um painel de 20 pseudovírus. Uma correlação de Spearman não paramétrica foi usada para avaliar a correlação entre IC50s de 10E8 e ID50s de N152.
[0019] As figuras 8A-8C são um gráfico e um grupo de tabelas ilustrando a especificidade de ligação de 10E8. (A) Ligação ELISA de mAbs indicados aos peptídeos MPER, 2F5, Z13e1, 4E10 e 4E10.19. Sequências de aminoácido de peptídeos são também mostradas (descedente, SEQ ID NO: 26 com triplicatas de lisina de terminal N- e C-, resíduos 1 a 16 de SEQ ID NO: 26, resíduos 11 a 21 de SEQ ID NO: 26 com uma triplicata de lisina de terminal C, resíduos 16-24 de SEQ ID NO: 26 com uma triplicata de lisina de terminal C e resíduos 16-28 de SEQ ID NO: 26 com uma cisteína de terminal N e uma triplicata de lisina de terminal C). (B-C) Inibição de neutralização de mAb de vírus quimérico de MPER de C1 HIV-2/HIV-1 por adição de peptídeos MPER, 2F5, Z13e1, 4E10 e 4E10.19. O efeito de duplicação foi calculado como a relação de IC50 de neutralização com peptídeo de simulação/IC50 (B), ou a relação de IC80 de neutralização com peptídeo de simulação/IC80 (C), para o peptpideo indicado. Valores >5 são sombreados de cinza claro.
[0020] As figuras 9A e 9B ilustram análise de ressonância de plasmônio de superfície de ligação de anticorpos de 10E8, 2F5 e 4E10 a um peptídeo MPER de gp41. (A) Um peptídeo de MPER biotinilado compreendido de resíduos 656 a 683 de gp41 foi imobilizado em um chip de estreptavidina SA (GE Healthcare) e Fabs de anticorpo fluidos sobre os analisados em concentrações crescentes de 2 vezes variando de 3,9 a 125 nM (10E8), 0,49-31,25 nM (2F5), e 0,25 nM a 62,5 nM (4E10). Fases de associação e dissociação de três minutos e cinco minutos, respectivamente, foram usadas, em uma taxa de fluxo de 30 μl/minuto, e cada concentração de analisado foi realizada em triplicata. (B) Constantes de ligação, listadas, foram obtidas ajustandose sensogramas com um modelo Langmuir de 1:1. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 é mostrada.
[0021] A figura 10 é um gráfico de pizza ilustrando a frequência de soros de HIV-1+ com uma determinada especificidade. Os soros de 78 doadores saudáveis infectados com HIV-1 foram usados neste ensaio. Frequência medida pela capacidade dos soros do paciente neutralizar as quimeras de HIV-2/HIV-1 contendo porções do MPER e confirmada com bloqueio de peptídeo. A neutralização de ID50s de soros é reportada na figura 21. Mudanças de duplicação de ID50 após o bloqueio de peptídeo são reportadas na figura 22. Os seis pacientes com soros contendo anticorpos semelhantes a 10E8 não foram diferentes dos 72 pacientes restantes com respeito à carga viral (6748 cópias por ml com 10E8 vs 5446 sem; p>0,05), contagem de CD4 (437 células/μl vs. 557; p>0,05), anos desde o diagnóstico (20 anos vs. 13; p>0,05), ou título de neutralização médio (302 vs. 156; p>0,05).
[0022] As figuras 11A-11C ilustram a acessibilidade de 10E8 ao MPER. (A) Ligação de 10E8, 4E10 e 2F5 uma espiga envelopes de HIVJR-FL de tamanho natural, 4E10 mutante (Phe673Ser) ou 2F5 mutante (Lys665Glu) expressa na superfície de célula 293T quando medida por citometria de fluxo. Anticorpo serialmente diluído foi incubado com células durante uma hora. Anticorpos 2G12 e b12 foram usados como controles positivos e F105 foi usado como um controle negativo. VRC01 é usado como um controle adicional em células transfectadas por JR-FL. Porcentual de ligação relativo é calculado como a intensidade de fluorescência média (MFI) dividida pela MFI média do controle positivo 2G12 X 100. (B) Acessibilidade de MPER foi determinada lavando-se a mistura de anticorpo-vírion antes da infecção de células TZM-bl. Pseudovírus foram incubados com anticorpos a 37 ºC durante 30 minutos, e a mistura de anticorpo-vírion foi lavada ou não antes da infecção de células alvo. (C) O impacto da lavagem sobre a neutralização de anticorpo foi medido pela área sob a curva (AUC) ou no IC80. Para BaL e JRFl o IC80 não foi obtido na condição sem lavagem e a concentração inibitória elevada (IC60 e IC75, respectivamente) foi usada.
[0023] As figuras 12A e 12B são diagramas esquemáticos ilustrando comparação de duas cópias do MPER de gp41 na unidade assimétrica cristalina. (A) peptídeos de gp41 dos dois complexos de 10E8-gp41 na unidade assimétrica cristalina são mostrados em representação em bastão (complexo 1, cinza escuro; complexo 2, cinza médio), circundada por sua densidade de elétron 2fo-fc contornada a 1σ (cinza escuro). Imagens mostradas são giradas a 180 com relação uma a outra, e estão na mesma orientação como nas figuras 4C e 4D. (B) Um alinhamento dos peptídeos nos dois complexos cristalinos. Mostrada, em visões de 90º, é a superposição dos dois peptídeos na unidade assimétrica com base no alinhamento de todos os átomos de resíduos 671-683. A hélice de terminal N no complexo 2 é desviada em 45° com relação àquela no complexo 1 neste alinhamento. Ao mesmo tempo em que as orientações diferentes da hélice de terminal N nos dois complexos sugerem um grau de plasticidade estrutural, resíduos da articulação e hélice de terminal C nos dois complexos são altamente conservados e estão envolvidos nas interações mais críticas com o anticorpo.
[0024] As figuras 13A-13C são um grupo de gráficos ilustrando a análise de ressonância de plasmônio de superfície de variantes de alanina de parátopo 10E8. São mostradas sensogramas de ligação de peptídeo MPER a 25 variantes de parátopo de 10E8, bem como ao 10E8 do tipo selvagem (peso). IgGs variantes foram capturadas em um chip bissensor acoplado à IgG anti-humano à densidades de superfície de 1000 a 2000 unidades de resposta e peptídeo MPER (listado) fluido sobre o analisado em diluições de duas vezes seriais iniciando em 500 nM (com a exceção de HC D30A, W100bA, S100cA, P100fA, que iniciou em 250 nM). Fases de associação e dissociação de três minutos e cinco minutos, respectivamente, foram usadas, em taxas de fluxo de 30 μl/minutos. Sensogramas foram ajustados com um modelo Langmuir de 1:1 usando software BIACORE® BIAEVALUATION® (GE Healthcare). Constantes de ligação são reportadas na figura 31. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 é mostrada na figura 13C.
[0025] A figura 14 mostra um gráfico ilustrando a correlação de ligação e neutralização de variante de 10E8. KD’s de ligação das variantes de parátopo de alanina de 10E8 plotados com relação aos seus IC50s e IC80s de neutralização média. Uma correlação de Spearman não paramétrica foi usada para avaliar a relação entre a ligação e neutralização. KD’s e IC50s e IC80s de neutralização são reportados nas figuras 31 a 32.
[0026] As figuras 15A-15H ilustram o reconhecimento de uma hélice de MPER de terminal C estruturalmente conservada por 10E8 e 4E10. 10E8 e 4E10 usam substancialmente modos diferentes de reconhecimento para ligar uma hélice estruturalmente conservada no terminal C do MPER de gp41. (A) Conformação de MPER e superfície embotada para anticorpos neutralizantes 10E8, 2F5 (Protein DataBank (PDB) ID No. 1TJI, incorporado por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012), Z13e1 (PDB ID No. 3FN0, incorporado por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012), e 4E10 (PDB ID No. 2FX7, incorporado por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). Representações de fita de Cα do MPER de gp41 ligado por qualquer anticorpo são mostradas, com gráficos em barra exibindo a quantidade de superfície embotada por resíduo. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 é mostrada abaixo em cada gráfico em barra. A sequência de o epitopo cristalizado é mostrada em letras maiúsculas. (B) Superposição da hélice de terminal C de MPER, nas conformações ligadas a 10E8 (cinza escuro) e 4E10 (cinza claro), exibida em orientações de 90°. Representações de fita de Cα são mostradas, com cadeias laterais exibidas como bastões. (CF) Comparação de reconhecimento de 10E8 e 4E10 da hélice de MPER de terminal C, com moléculas exibidas em representações de fita de Cα. (C) Domínios variáveis de 10E8 em complexo com o MPER, sombreados de acordo com à figura 4A. (D) Domínios variáveis de 4E10 em complexo com o MPER (PDB ID No. 2FX7, incorporado por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012), em uma orientação com base no alinhamento de hélices de terminal C de gp41 descritas no (B; painel esquerdo). gp41 é sombreado de não totalmente branco, Cadeia pesada de 4E10, cinza escuro, e cadeia leve de 4E10, cinza médio. (E-F) vistas de 90° de (C) e (D), observando do terminal C ao terminal N da hélice de terminal C de MPER conservado. (G,H) Representações de aço helicais das hélices de terminal C de MPER ligado a 10E8- e 4E10, refletindo a orientação exibida em (B; painel direito). Faces de contato de anticorpo realçadas sçao com base no contato direto observado entre os anticorpos e gp41, como descrito na figura 35.
[0027] A figura 16 mostra um diagrama de fitas ilustrando o sítio de gp41 de vulnerabilidade mapeado em uma conformação de "intermediário tardio" de gp41. O sítio de gp41 de vulnerabilidade como definido pela pegada de contato de anticorpo 10E8 no gp41 é mostrado, mapeado na estrutura de peptídeo de MPER ligado a 10E8 (esquerda, orientação similar como a figura 6B) e uma conformação de feixe de seis hélices de intermediário tardio de gp41 (PDB ID No. 2XR7 (direita), incorporado por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). Os átomos reconhecidos pelo anticorpo 10E8 são sombreados de cinza escuro e mostrados em representação em bastão. O contato de átomo ou resíduo exclusivo aos anticorpos 2F5, Z13e1, e 4E10, é mostrado como bastões, sombreado de cinza claro ou médio. O sítio definido de 10E8 de faces externas de vulnerabilidade, fora do eixo núcleo do feixe, e parece ser amplamente acessível nesta conformação. Um sítio de glicosilação ligado por N potencial na posição 674 não poderia ser compatível com a conformação de intermediário tardio, visto que a cadeia lateral do resíduo 674 faz face externamente do feixe de seis hélices.
[0028] As figuras 17A-17F são um grupo de tabelas ilustrando as propriedades neutralizantes de 10E8. (A) Neutralização de 10E8 e 7H6 em comparação com um mini-painel de pseudovírus Env isolado 5. Valores IC50 menores do que 1 μg/ml são realçados em cinza. (B) Perfil de neutralização de soro de N152 do paciente e anticorpos monoclonais. aOs dados para N152 mostram o ID50 (dose de vírus requerida para 50% de infecção) de soro em comparação a cada vírus. ID50>1000 é realçado em cinza escuro, 500<ID50<1000 está em cinza médio, e 100< ID50<500 está em cinza claro. Os dados para os anticorpos monoclonais mostram o IC50. IC50 < 1 μg/ml é realçado em cinza médio; IC50 de 1-10 μg/ml é realçado em cinza claro; e IC50 de 10-50 μg/ml é realçado em cinza escuro. (C-F) Os dados de neutralização de anticorpo em comparação com 181 pseudovírus Env de HIV-1. IC50 < 1 μg/ml é realçado em cinza médio; IC50 de 1-10 μg/ml é realçado em cinza claro; e IC50 of 10-50 μg/ml é realçado em cinza escuro.
[0029] A figura 18 é uma tabela ilustrando ligação de 10E8 e 4E10 a peptídeos analisados por analina de MPER de gp41, por ELISA. A mudança de duplicação foi calculada como IC50 de peptídeo/IC50 de peptídeo de simulação. Os valores de mudança de duplicação >10 são realçados em cinza claro.
[0030] A figura 19 é uma tabela listando os dados de neutralização quanto ao 10E8 em comparação aos mutantes de alanina de MPER de HIV-1JR2 pseudotipado. A concentração é de μg/ml. Valores de IC50 e IC90 >20 vezes em comparação com JR2 do tipo selvagem para 10E8 ou >100 vezes para 4E10 são realçados em cinza claro.
[0031] A figura 20 é uma tabela listando sequências das quimeras de HIV-2HIV-1 usadas para ensaios de neutralização. As sequências de 7312A, C1, C1C, C3, C7, C6, C4, C4GW e C8 são mostradas (SEQ ID Nºs: 15 a 22, respectivamente). Fragmentos da sequência de MPER que correspondem à sequência do MPER de HIV-1 são sublinhados.
[0032] A figura 21 é uma tabela ilustrando o mapeamento de soros/anticorpos neutralizantes anti-MPER com quimeras de HIV-2/HIV-1. a IC50 (μg/ml) é mostrado. b valores ID50 são mostrados. Os números estão em negrito e realçados em cinza claro, se o ID50 das quimeras de HIV-2/HIV-1 foi tanto 3 vezes maior do que o controle de HIV-2 do tipo selvagem quanto >100. "-" indica sem neutralização. "ND" indica que a classificação de soro não pode ser determinada.
[0033] A figura 22 é uma tabela ilustrando o bloqueio de neutralização mediada por mAb- e soro das quimeras C1 de HIV-2/HIV-1 usando peptídeos de MPER mutantes. A sequência dos peptídeos de bloqueio é mostrada na figura 8A. bA mudança de duplicação de IC50 se refere a (IC50 de peptídeo)/(IC50 de peptídeo de simulação). cA mudança de duplicação de ID50 se refere a (ID50 de peptídeo de simulação)/( ID50 de peptídeo). O realce em cinza claro indica uma mudança de 3 vezes no IC50/ID50 com relação ao peptídeo de controle.
[0034] A figura 23 é uma tabela ilustrando a reatividade de 10E8 com autoantígenos. A reatividade de 10E8 com autoantígenos foi detectada pelo ensaio de Luminex. Um anticorpo monoclonal antiRSV, Synagis (MedImmune, Gaithersburg, MD), foi usado como um controle negativo. Os anticorpos 4E10, 2F5, VRC01 e 17b foram também testados para comparação. SSA refere-se ao antígeno A da síndrome de Sjogren; SSB se refere ao antígeno B da síndrome de Sjogren; Sm refere-se ao antígeno de Smith; RNP refere-se à ribonucleoproteína; Scl 70 refere-se ao escleroderma 70; Jo1 refere-se ao antígeno; CentrB refere-se ao centrômero B.
[0035] A figura 24 é uma tabela listando a coleta de dados e estatísticas de refinamento para os estudos de estrutura cristalina de 10E8. O invócrulo de resolução elevada é mostrado em parênteses. O conjunto de dados mostrado foi coletado de um cristal.
[0036] A figura 25 é uma tabela listando os ângulos Phi-Psi de peptídeos de gp41 ligados a anticorpo. aPara o complexo de 4E10:gp41, a estrutura de PDB ID No. 2FX7 foi usada (incorporada por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). b Para o complexo de Z13e1:gp41, a estrutura de PDB ID No. 3FN0 foi usada (incorporada por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012).
[0037] A figura 26 é uma tabela listando a área de superfície embotada total em 10E8 e gp41. Todas as interações foram realizadas usando PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). §BSA referese à Área de Superfície Embotada, Å2.
[0038] A figura 27 é uma tabela listando as áreas de superfície embotada na interface entre a cadeia pesada de 10E8 e gp41, por resíduo. Todas as interações foram realizadas usando PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). £Percentual de identidade deste resíduo em uma análise de 2870 linhagens de HIV depositadas no banco de dados de sequência de HIV Los Alamos (como de 12/2011). ‡ASA refere-se à Área de Superfície Acessível, Å2. §BSA refere-se à Área de Superfície Embotada, Å2. §§Barras representam a porcentagem de área embotada, uma barra por 10%. ΔiG refere-se ao efeito de enregia de solvação, kcal/mol.
[0039] A figura 28 é uma tabela listando Áreas de Superfícies Embotadas na interface entre a cadeia leve de 10E8 e gp41, por resíduo. Todas as interações foram realizadas com PISA (ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver). £Percentual de identidade deste resíduo em uma análise de 2870 linhagens de HIV depositadas no banco de dados de sequência de HIV Los Alamos (como de 12/2011). ASA refere-se à Área de Superfície Acessível, Å2. BSA refere-se à Área de Superfície Embotada, Å2. Barras representam a porcentagem de área embotada, uma barra por 10%. ΔiG refere-se ao efeito de enregia de solvação, kcal/mol.
[0040] A figura 29 é uma tabela listando as ligações de hidrogênio e pontes de sal entre 10E8 e gp41. As ligações de hidrogênio foram determinadas com o uso do programa Ligplot (McDonald et al., J Mol Biol 238, 777-793, 1994). Cadeia H refere-se ao complexo 1 de cadeia pesada; Cadeia B refere-se ao complexo 2 de cadeia pesada; Cadeia P refere-se ao complexo 1 de peptídeo de gp41; Cadeia F refere-se ao complexo 2 de peptídeo de gp41.
[0041] A figura 30 é uma tabela listando contato Van der Waals entre 10E8 e gp41. Os contatos Van der Waals foram determinados com o uso do programa Ligplot (McDonald et al., J Mol Biol 238, 777- 793, 1994). Cadeia H e cadeia L referem-se às cadeias pesada e leve de complexo 1, respectivamente; Cadeia P refere-se ao peptídeo de gp41 de complexo 1. Cadeia B e cadeia D referem-se às cadeias pesada e leve de complexo 2, respectivamente; Cadeia F refere-se ao peptídeo de gp41 de complexo 2.
[0042] A figura 31 é uma tabela ilustrando afinidades de ligação de variantes de alanina de 10E8 a um peptídeo de MPER solúvel. SE se refere ao erro padrão; nb refere-se à ligação fraca à indetectável na faixa de concentração usada. ^Duplicação é definida como mudança de duplicação com relação aos ciclos de 10E8 do tipo selvagem realizados em paralelo com as variantes. $Média dos três ciclos de 10E8 do tipo selvagem individual. #Apenas aquelas mutações que produzem efeitos maiores do que 10 vezes foram mapeadas na superfície embotada de 10E8 b na figura 4E (cinza médio, >100x; cinza claro, 50x < 100x; cinza escuro, 10x < 50x). Resíduos de cadeia pesada Y99AHC e G100hAHC mostraram quase nenhuma ligação ao peptídeo solúvel, ao mesmo tempo em que as mutações de resíduos adicionais do CDR H3 (F100aAHC, G100dAHC, P100fAHC, P100gAHC, E100iAHC, e E100jAHC) diminuíram a afinidade 50 a 120 vezes (a numeração de Kabat é usada para identificar os resíduos específicos nas cadeias pesada e leve de 10E8). Mutações de alça de CDR H1 e região 2 de estrutura W33AHC e R50AHC, respectivamente, que estão presentes na fenda hidrofóbica, também ligação de nocaute ao peptídeo de MPER, e a mutação de CDR H2 E53AHC na fenda diminuiu a afinidade quanto ao peptídeo MPER em 60 vezes. Resíduo de cadeia leve R91LC, que está localizado na base da fenda hidrofóbica e forma interações diretas com resíduos do CDR H3, ligação de nocaute quando mutado em alanina possivelmente desestabilizando a própria fenda.
[0043] A figura 32 é uma tabela listando os IC50s e IC80s de neutralização de variantes de varredura de alanina 10E8. Nos casos onde IC50 ou IC80 de neutralização não foram obtidos na concentração mais elevada de anticorpo, a concentração mais elevada foi usada no cálculo da média. ^Média do efeito de duplicação é definida como a média dos efeitos de duplicação individuais observados em comparação com cada linhagem viral. &Mutações Y99AHC, F100aAHC, W100bAHC, e G100hAHC, todas tiveram efeitos nocivos sob a neutralização, diminuindo a potência em mais de 1000 vezes. Outras mutações também tiveram fortes efeitos sob a neutralização, incluindo P100gAHC e E100iAHC do CDR H3, e W33AHC e R50AHC na fenda hidrofóbica. A mutação de cadeia leve R91ALC, similarmente a seus efitos na ligação ao peptídeo, diminuiu a potência de neutralização em mais de 1000 vezes.
[0044] A figura 33 é uma tabela ilustrando desvios de raiz quadrada média (RMSD) de estruturas de gp41 ligadas ao anticorpo. Alinhamentos foram realizados com o uso do programa LSQKAB (Winn, M. D. et al. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 67, 235-242, 2011). Para o complexo de 4E10:gp41, a estrutura de PDB ID No. 2FX7 foi usada (incorporado por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). Para o complexo de Z13e1:gp41, a estrutura de PDB ID No. 3FN0 foi usada (incorporado por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). Para o complexo de 2F5:gp41, a estrutura de PDB ID No. 1TJI foi usada).
[0045] A figura 34 é uma tabela mostrando comparação de superfícies embotadas de anticorpo específico de MPER em gp41. Os estudos de interação foram realizados com PISA (ebi.ac.uk/msdsrv/prot_int/cgi-bin/piserver). Os valores nos parênteses são para o complexo 2. Para o complexo de 4E10:gp41, a estrutura de PDB ID No. 2FX7 foi usada (incorporada por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). Para o complexo de Z13e1:gp41, a estrutura de PDB ID No. 3FN0 foi usada (incorporada por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). Para o complexo de 2F5:gp41, a estrutura de PDB ID No. 1TJI foi usada (incorporada por referência aqui como apresentado no banco de dados em 22 de Outubro de 2012). A respeito do reconhecimento de uma faixa de resíduos mais extensiva, 10E8 tem uma pegada de gp41 menor do que 4E10. Se a comparação é limitada à faixa de peptídeo de sobreposição, resíduos 671 a 683, a diferença nas pegadas será ainda mais pronunciada, com 10E8 encobrindo aproximadamente 25% menos da área de superfície em gp41 do que 4E10.
[0046] A figura 35 é uma tabela mostrando comparação de contato direto de anticorpos 10E8 e 4E10 com gp41. Contatos diretos foram determinados com o uso do programa Ligplot (McDonald et al., J Mol Biol 238, 777-793, 1994). H refere-se à ligação de hidrogênio; N refere-se ao contato van der Waals.
[0047] A figura 36 é um grupo de tabelas ilustrando resultados da neutralização de mutantes de MPER de envelope COT6.15 (clado C) pseudotipados com anticorpos 10E8 e 4E10.
[0048] A figura 37 é uma tabela ilustrando resultados de ensaios de neutralização usando a complementação cruzada das cadeias pesada e leve de 10E8, 7H6 e 7N16.
[0049] A figura 38 é um diagrama esquemático da estrutura cristalina do anticorpo 10E8 em complexo com um peptídeo de gp41, mostrando a carga de superfície eletrostática do anticorpo.
[0050] A figura 39 é um diagrama esquemático da estrutura cristalina do anticorpo 10E8 em complexo com um peptídeo de gp41, mostrando a carga de superfície eletrostática do peptídeo.
[0051] A figura 40 é um diagrama esquemático da estrutura cristalina do anticorpo 10E8 em complexo com um peptídeo de gp41, mostrando as posições das mudanças de resíduo nos anticorpos de variante de 10E8 7H6 e 7N16.
[0052] A figura 41 é imagens digitais das estruturas cristalinas dos anticorpos 2F5, 4E10 e Z13E1 em complexo com peptídeos de gp41 e um esquemático de gp41 ilustrando os sítios de ligação relativos dos anticorpos 2F5, 4E10, Z13E1 e 10E8. A sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 é mostrada.
[0053] As figuras 42A e 42B são plotagens de scattergram mostrando os resultados de isolamento de FACS de células CD19+ IgAIgDIgM- B de uma amostra de PBMC.
[0054] A figura 43 é uma tabela e um grupo de diagramas de fita ilustrando uma varredura de alanina dos resíduos de 10E8 indicados (posições de Kabat) como descritos nos exemplos 1 e 8.
[0055] As figuras 44A e 44B são uma série de diagramas de fita ilustrando a mutagênese com base na estrutura de 10E8 para realçar as interações hidrofóbicas com gp41.
[0056] A figura 45 é uma tabela ilustrando os resultados de ensaios de neutralização em um painel de vírus de HIV-1 usando os mutantes de 10E8 com base na estrutura descrita nas figuras 44A e 44B e Exemplo 8 (com referência à numeração Kabat).
[0057] A figura 46 é um diagrama esquemático ilustrando o projeto de variantes de anticorpo parcialmente revertidos.
[0058] A figura 47 é um alinhamento de sequência e um diagrama em fitas ilustrando inversor parcial de linhas germinativas da cadeia pesada e leve 10E8. As sequências mostradas são SEQ ID NO: 7 (10E8_germ_H), SEQ ID NO: 147 (10E8gH01), SEQ ID NO: 148 (10E8gH02), SEQ ID NO: 149 (10E8gH03), SEQ ID NO: 1 (10E8_HEAVY), SEQ ID NO: 8 (10E8_germ_L), SEQ ID NO: 150 (10E8gL01), SEQ ID NO: 151 (10E8gL02), SEQ ID NO: 152 (10E8gL03), SEQ ID NO: 2 (10E8_LIGHT).
[0059] A figura 48 é um grupo de tabelas ilustrando resultados de ensaios de neutralização em um painel de vírus de HIV-1 usando o inversor parcial de linhas germinativas do anticorpo 10E8 como descrito na figura 47 e Exemplo 8. "10E8-R1" refere-se à cadeia pesada de 10E8gH01 (SEQ ID NO: 147) pareada com cadeia leve de 10E8gL01 (SEQ ID NO: 150). "10E8-R3" refere-se à cadeia pesada de 10E8gH03 (SEQ ID NO: 149) pareada com cadeia leve de 10E8gL03 (SEQ ID NO: 152).
[0060] A figura 49 é um grupo de tabelas ilustrando os resultados de ensaios de neutralização em um painel de vírus de HIV-1 usando uma série de mutantes de 10E8 na cadeia pesada de base de 10E8gH03 (SEQ ID NO: 149) ou base de 10E8gL03 (SEQ ID NO: 152) como mostrado na figura 47 e descrito no exemplo 8.
[0061] As figuras 50A a 50F são uma série de gráficos ilustrando a identificação de variantes somáticas de anticorpo 10E8 por sequenciamento e amostragem de grade. (A) Plotagens de identidade/divergência de 10E8 de antibodyome de cadeia leve N152 de doador (esquerda), com amostragem de grade (direita). Identidade ao 10E8 é mostrada no eixo vertical, e divergência da origem de gene V de linhagem germinativa é plotada no eixo horizontal, com frequência de anticorpos mostrada como um mapa de calor.
Amostragem de grade é mostrada, com anticorpos selecionados que não expressam ou se ligam ao MPER em círculos vazios e com anticorpos selecionados que não se ligam a círculos sólidos, sombreados de acordo com sua distância filogenética de 10E8 em (C). (B) Plotagens de identidade/divergência de 10E8 de antibodyome de cadeia leve N152 de doador (esquerda), com amostragem de grade (direita). Eixos e sombreados são iguais como em (A). (C/D) Árvore filogenética de variante identificada por grade para cadeia pesada (C) e cadeia leve (D). (E-F) Neutralização de variantes de 10E8 e 10E8, avaliada em duplicata em 6 isolados de HIV-1 para variantes de cadeia pesada (E) e variantes de cadeia leve (F). Os IC50s médios de gVRCH1dN152:10E8L e gVRC-H11dN152:10E8L foram melhorados aproximadamente 6 vezes mais do que o modelo original 10E8. Variantes são dispostas e nomeadas por sua distância genética de 10E8, e sombreadas com relação a sua distância filogenética.
[0062] As figuras 51A-51D são uma série de alinhamentos de sequência e diagramas de fita ilustrando sequências e estruturas modeladas de variantes de 10E8 que neutralizam o HIV-1. (A) Sequências de cadeia pesada (SEQ ID Nºs: 1, e 153-163, descendente; gVRC-H1dN152 (SEQ ID NO: 153); gVRC-H2dN152 (SEQ ID NO: 154); gVRC-H3dN152 (SEQ ID NO: 155); gVRC-H4dN152 (SEQ ID NO: 156); gVRC-H5dN152 (SEQ ID NO: 157); gVRC-H6dN152 (SEQ ID NO: 158); gVRC-H7dN152 (SEQ ID NO: 159); gVRC-H8dN152 (SEQ ID NO: 160); gVRC-H9dN152 (SEQ ID NO: 161); gVRC-H10dN152 (SEQ ID NO: 162) gVRC-H11dN152 (SEQ ID NO: 163)). As sequências são dispostas por distância genética de 10E8, com mudanças de sequência de 10E8 sublinhadas. Estrutura e resíduos de CDR são realçados, visto que são resíduos que interagem com o epitopo de MPER de gp41 (círculo aberto, interação de cadeia principal; círculo aberto com raios, interações de cadeia lateral; círculo sólido, tanto interações de cadeia principal quanto cadeia lateral). (B) Estruturas modeladas de variantes de cadeia pesada em complexo com epitopo de gp41. Variantes de 10E8 com reconhecimento realçado (com cadeias pesadas sombreadas de acordo com a distância filogenética como em 1B) foram modeladas na estrutura de 10E8 com a região de MPER completa de gp41 de HIV-1 (não totalmente branco). As estruturas são exibidas como fitas Cα, com cadeias laterais de aminoácido que variam de 10E8 realçado em representação em bastão, cinza escuro. (C) Sequências de cadeia leve (SEQ ID Nºs: 2 e 164-186, descendente; gVRC-L1dN152 (SEQ ID NO: 164); gVRC-L2dN152 (SEQ ID NO: 165); gVRC-L3dN152 (SEQ ID NO: 166); gVRC-L4dN152 (SEQ ID NO: 167); gVRC-L5dN152 (SEQ ID NO: 168); gVRC-L6dN152 (SEQ ID NO: 169); gVRC-L7dN152 (SEQ ID NO: 170); gVRC-L8dN152 (SEQ ID NO: 171); gVRC-L9dN152 (SEQ ID NO: 172); gVRC-L10dN152 (SEQ ID NO: 173); gVRC-L11dN152 (SEQ ID NO: 174); gVRC-L12dN152 (SEQ ID NO: 175); gVRC-L13dN152 (SEQ ID NO: 176); gVRC-L14dN152 (SEQ ID NO: 177); gVRC-L15dN152 (SEQ ID NO: 178); gVRC-L16dN152 (SEQ ID NO: 179); gVRC-L17dN152 (SEQ ID NO: 180); gVRC-L18dN152 (SEQ ID NO: 181); gVRC-L19dN152 (SEQ ID NO: 182); gVRC-L20dN152 (SEQ ID NO: 183); gVRC-L21dN152 (SEQ ID NO: 184); gVRC-L22dN152 (SEQ ID NO: 185); gVRC-L23dN152 (SEQ ID NO: 186)). As sequências são dispostas por distância genética de 10E8, com mudanças de sequências de 10E8 sublinhadas. Estrutura e resíduos de CDR são realçados, visto que são resíduos que interagem com o epitopo de MPER de gp41 (como descrito em (A). (D) Estruturas modeladas de variantes de cadeia leve em complexo com epitopo de gp41. Variantes de 10E8 com reconhecimento realçado (com cadeias leves sombreadas de acordo com a distância filogenética como em 1C) foram modeladas na estrutura de 10E8 com região de MPER inteira de HIV-1 gp41 (não totalmente branco). Estruturas são exibidas como fitas de Cα, com cadeias laterais de aminoácido que variam de 10E8 realçado em representação em bastão, cinza escuro.
[0063] As figuras 52A a 52D são uma tabela e um grupo de gráficos ilustrando pareamento de ramificação filogenética de variantes de cadeia pesada e leve de 10E8. (A) Pareamento de ramificação filogenética. A partir da árvore filogenética de anticorpos identificados por grade (Figura 1 C,D), as ramificações foram nomeadas com base na distância de 10E8, b1-H para pesada e b1-L para leve para a ramificação contendo 10E8, e em ordem descendente, b2-H (b2-L), b3-H (b3-L), e b4-H para a ramificação mais distante. A variante de cada ramificação que exibiu a neutralização mais potente com um parceiro do tipo selvagem de 10E8 foi escolhida, e uma matriz total de 12 anticorpos reconstituída. (B) Neutralização de HIV-1. A neutralização foi avaliada em 5 isolados, para as variantes de 10E8 de pareamentos de ramificação pareada e pareada incorretamente. (C) Manchamento de Hep2. A autorreatividade foi acessada com manchamento de célula Hep2, para variantes de 10E8 de pareamentos de ramificação pareada e pareada incorretamente.
[0064] A figura 53 é uma tabela ilustrando anticorpos monoclonais de 10E8 compostos das variantes de cadeia pesada e leve, indicadas com base na potência de neutralização das variantes indicadas quando complementadas com a cadeia complementar do tipo selvagem de 10E8.
[0065] A figura 54 é uma tabela ilustrando 10E8 anticorpos compostos das variantes de cadeia pesada e leve indicadas filogeneticamente pareadas.
[0066] As figuras 55A a 55C mostram um grupo de tabelas ilustrando resultados de ensaios de neutralização em um painel de vírus de HIV-1 usando a série de variantes de 10E8 pareadas por potência de neutralização ou filogeneticamente pareadas como mostrado nas figuras 53 e 54 e descrito no exemplo 8.
[0067] A figura 56 é um grupo de tabelas ilustrando resultados de ensaios de autorreatividade em um painel de vírus de HIV-1 usando a série de variantes de 10E8 pareadas por potência de neutralização ou filogeneticamente pareadas como mostrado nas figuras 53 e 54 e descrito no exemplo 8.
[0068] A figura 57 é um grupo de tabelas ilustrando resultados de ensaios de neutralização em um painel de vírus de HIV-1 usando a série de variantes de 10E8 pareadas por potência de neutralização ou filogeneticamente pareadas como mostrado nas figuras 53 e 54 e descrito no exemplo 8.
[0069] As figuras 58A e 58B são um grupo de gráficos ilustrando os resultados de ensaios de neutralização testando as propriedades de neutralização das séries indicadas de anticorpos, contendo cadeias leves e pesadas de 10E8, ou variantes de cadeias leves e pesada de 10E8, em um painel de 20 vírus de HIV.
[0070] A figura 59 é uma tabela ilustrando a nomenclatura e SEQ ID Nºs para as cadeias pesadas e leves de certas variantes de anticorpo 10E8.
[0071] As figuras 60A e 60B são um grupo de tabelas ilustrando um sumário de variantes de cadeia pesada de 10E8. Mutantes "Inversores de linha germinativa," "454," "Varredura de alanina," "Com base na estrutura," e "adicionais" referem-se às substituições de cadeia pesada de 10E8 ilustradas no exemplo 8.
[0072] As figuras 61A e 61B são um grupo de tabelas ilustrando um sumário das variantes de cadeia leve de 10E8. Mutantes "Inversores de linha germinativa" e "454" referem-se às substituições de cadeia leve de 10E8 ilustradas no exemplo 8.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0073] As sequências de ácido nucleico e aminoácido listadas na listagem de sequência acompanhante são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, e três códigos de letra para aminoácidos, como definido em 37 C.F.R. 1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, porém o filamento complementar é entendido como inluído por qualquer referência ao filamento exibido. A listagem de sequência é submetida como um arquivo de texto de ASCII na forma de arquivo nomeado "Sequência.txt" (~160 kb), que foi criado em 7 de Novembro de 2012, que é incorporado por referência aqui. Na listagem de sequência acompanhante:
SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo específico de gp41 10E8.
SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácido da cadeia leve do anticorpo específico de gp41 10E8.
SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo específico de gp41 7H6.
SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácido da cadeia leve do anticorpo específico de gp41 7H6.
SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácido da cadeia pesada do anticorpo específico de gp41 7N16.
SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácido da cadeia leve do anticorpo específico de gp41 7N16.
SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácido da cadeia pesada de IGHV3-15*05.
SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácido da cadeia leve de IGLV3-19*01.
SEQ ID Nºs: 9 e 10 são epitopos no MPER de gp41.
SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácido da cadeia pesada de um anticorpo específico de gp41.
SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácido da cadeia leve de um anticorpo específico de gp41.
SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácido de um epitopo de gp41 que especificamente liga 10E8 e anticorpos semelhantes a 10E8.
SEQ ID Nºs: 14-25 são a sequência de aminoácidos de sequências de MPER de gp41 mutante.
SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácido de uma região da MPER de gp41.
SEQ ID Nºs: 27-34 são as sequências de ácido nucleico de iniciadores de sequenciamento.
SEQ ID Nºs: 35-115 são as sequências de ácido nucleico de cadeias pesadas de anticorpo semelhante a 10E8 exemplar.
SEQ ID Nºs: 116-145 são as sequências de ácido nucleico de cadeias leves de anticorpo semelhante a 10E8 exemplar.
SEQ ID NO: 146 é a sequência de aminoácido de consenso da cadeia pesada de um anticorpo específico de gp41.
SEQ ID Nºs: 147-149 são a sequência de aminoácidos das cadeias pesadas de inversores de linha germinativa do anticorpo monoclonal 10E8.
SEQ ID Nºs: 150-152 são a sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve de inversores de linha germinativa do anticorpo monoclonal 10E8.
SEQ ID Nºs: 153-163 são a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesadas de anticorpos específicos de gp41.
SEQ ID Nºs: 164-186 são a sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos específicos de gp41.
SEQ ID NO: 187 é a sequência de aminoácido de consenso da região variável de cadeia pesada de um anticorpo específico de gp41.
SEQ ID NO: 188 é a sequência de aminoácido de consenso da região variável de cadeia pesada de um anticorpo específico de gp41.
SEQ ID Nºs: 189-192 são a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesadas de anticorpos específicos de gp41.
SEQ ID Nºs: 193-196 são as sequências de ácido nucleico de iniciadores.
.SEQ ID Nºs: 197-199 são a sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos específicos de gp41.
SEQ ID Nºs: 200-205 são a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesadas de anticorpos específicos de gp41.
SEQ ID Nºs: 205-209 são a sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve de anticorpos específicos de gp41.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. Sumário de Termos
[0074] A menos que de outro modo observado, termos técnicos são usados de acordo com uso convencional. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 1999; Kendrew e outro, (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994; e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995; e outras referência particulares.
[0075] Como usado aqui, as formas singulares "um/uma (a)", "um/uma (an)", e "o/a" referem-se tanto ao singular quanto ao plural, a menos que o contexto, claramente, indique de outra forma. Por exemplo, o termo "um antígeno" inclui antígenos singulares ou plurais e pode ser considerado equivalente à frase "pelo menos um antígeno".
[0076] Como usado aqui, o termo "compreende" significa "inclui". Desse modo, "que compreende um antígeno" significa "incluindo um antígeno" sem excluir outros elementos.
[0077] Deve-se também entender que qualquer e tosos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de massa molecular ou peso molecular, fornecidos para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos com propósitos, a menos que de outra forma indicada. Embora muitos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados, métodos e materiais particulares ao descritos abaixo. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo explicações de termos, controlar. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos apenas e não destinados a ser limitantes.
[0078] Para facilitar a revisão das modalidades, as seguintes explicações de termos fornecidos:
[0079] Administração: A introdução de uma composição em um indivíduo por uma rotina escolhida. A administração pode ser local ou sistêmica. Por exemplo, se a rotina escolhida for intravenosa, a composição será administrada introduzindo-se uma composição em uma veia o indivíduo. Em alguns exemplos, um anticorpo descrito, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, específico para um HIV gp41 polipeptídeo é administrado a um indivíduo.
[0080] Agente: qualquer substância ou qualquer combinação de substâncias que seja útil para obter uma finalidade ou resultado; por exemplo, uma substância ou combinação de substâncias úteis para inibir infecção de HIV em um indivíduo. Os agentes incluem proteínas, moléculas de ácido nucleico, compostos, moléculas pequenas, compostos orgânicos, compostos inorgânicos, ou outras moléculas de interesse. Um agente pode incluir um agente terapêutico (tal como agente antirretroviral), um agente diagnóstico ou um agente farmacêutico. Em algumas modalidades, o agente é um agente polipeptídeo (tal como um anticorpo de neutralização de HIV), ou um agente antiviral. O técnico versado entenderá que agentes particulares que podem ser úteis para obter mais do que um resultado.
[0081] Substituição de aminoácido: A substituição de um aminoácido no polipeptídeo com por aminoácido diferente.
[0082] Amplificação: uma técnica que aumenta o número de cópias de uma molécula ácido nucleico (tal como um RNA ou DNA). Um exemplo de amplificação é a reação em cadeia de polimerase, em que uma amostra biológica é conectada com um par de iniciadores oligonucleotídeo, sob condições que permitem a hibridização dos iniciadores para um modelo de ácido nucleico na amostra. Os iniciadores são estendidos sob condições adequadas, isolados o modelo, e, em seguida, reanelada, estendida, e dissociados para amplificar o número de cópias do ácido nucleico. O produto de amplificação pode ser caracterizado por eletroforese, padrões e clivagem endonuclease de restrição, hibridização de oligonucleotídeo ou ligação, e/ou sequenciamento de ácido nucleico usando técnicas padrões. Outros exemplos de amplificação incluem amplificação por deslocamento padrão, como descrito na Patente U.S.nº 5.744.311; amplificação isotérmica livre de transcrição, como descrito na Patente U.S.nº 6.033.881; amplificação de reação de cadeia de reparo, como descrito no WO 90/01069; em amplificação de reação em cadeia de ligase, como descrito no EP-A-320 308; amplificação de reação de cadeia de ligase de enchimento de lacuna, como descrito na Patente U.S.nº 5.427.930; e amplificação livre de transcrição de NASBA™ RNA, como descrito na Patente U.S.nº 6.025.134.
[0083] Animal: organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui, por exemplo, mamíferos e aves. O termo mamífero inclui tanto humano e não humanos. Similarmente, o termo "indivíduo" inclui tanto pacientes humano quanto veterinários.
[0084] Anticorpo: Um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina, ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos, que especificamente ligam e reconhecem um analito (antígeno) tal como gp41 ou um fragmento imunogênico de gp41, por exemplo, a região próxima à membrana de gp41. Os genes de imunoglobulina os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como os genes de região variável de imunoglobulina miríade.
[0085] Os anticorpos existem, por exemplo, como imunoglobulinas intactas e como um número de fragmentos de ligação de antígeno bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases. Por exemplo, Fabs, Fvs, scFvs que especificamente se ligam a gp41 ou fragmentos de gp41 seriam agentes de ligação específicos de gp41. Uma proteína de scFv é uma proteína de fusão em que uma região variável de cadeia leve de uma imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de uma imunoglobulina são encontradas por um ligador, o mesmo tempo em que em dsFvs, as cadeias têm sido mudadas para produzir uma ligação de dissulfeto para estabilizar a associação das cadeias. O termo também inclui formas geneticamente planejadas tais como anticorpos quiméricos e anticorpos heteroconjugados tais como anticorpos biespecíficos. Veja também, Pierce Catalog e Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, Immunology, 3a Edição, W.H. Freeman & Co., Nova iorque, 1997.
[0086] Os fragmentos de anticorpo incluem, porém não limitados a, o seguinte: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo produzida por digestão de anticorpo integral com a enzima papaína para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo obtida tratando-se anticorpo integral com pepsina, seguido por redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos de Fab’ são obtidos por molécula de anticorpo; (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo obtido tratando-se anticorpo integral com a pepsina de enzima sem redução subsequente; (4) F(ab')2, um dímero de dois fragmentos de Fab' mantido junto por duas ligações de dissulfeto; (5) Fv, um fragmento geneticamente projetado contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressa como duas cadeias; e (6) anticorpo de cadeia única ("SCA"), uma molécula geneticamente projetada contendo a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligada por um ligador de polipeptídeo adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida.
[0087] O termo "anticorpo", como usado aqui, também inclui fragmentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos integrais ou aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinantes. Em alguns exemplos, o termo anticorpo inclui a sequência de aminoácidos de uma ou mais das CDRs do anticorpo enxertado sobre um andaime.
[0088] Tipicamente, uma imunoglobulina de ocorrência natural tem cadeias pesadas (H) e cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Existem dois tipos de cadeia leve, lambda λ) e kappa (κ). Existem cinco principais classes de cadeia pesada (ou isótopos) que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Os anticorpos descritos podem ser mudados de classe.
[0089] Cada cadeia leve e pesada contém uma região constante e uma região variável, (as regiões são também conhecidas como "domínios"). Em várias modalidades, os domínios variáveis de cadeia leve e pesada se combinam para, especificamente se ligarem ao antígeno. Em modalidades adicionais, apenas o domínio variável de cadeia pesada é requerido. Por exemplo, anticorpos de camelídeo de ocorrência natural que consistem de uma cadeia pesada apenas são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve (veja, por exemplo, Hamers-Casterman, e outro, Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff, e outro, Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996). Os domínios variáveis de cadeia leve e pesada contêm uma região de "estrutura" interrompida por três regiões intervariáveis, também chamadas "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs" (veja, por exemplo, Kabat, e outro, Sequences of proteínas of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências das regiões de estrutura de cadeias pesadas ou leves diferentes são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de estrutura de um anticorpo, que são as regiões de estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDRs no espaço tridimensional.
[0090] As CDRs são primeiramente responsáveis pela ligação a um epitopo de um antígeno. Os limites da sequência de aminoácido de uma determinada CDR podem ser facilmente determinados usando qualquer de um número de esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat, e outro, ("Sequences of proteínas of Immunological Interest," 5ª Edição Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; "Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani, e outro, (JMB 273,927-948, 1997; "Chothia" numbering scheme), e Lefranc, e outro, ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; "IMGT" numbering scheme).
[0091] As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2, e CDR3 (do terminal de N ao terminal de C), e são também tipicamente identificadas pela cadeia na qual a CDR particular é localizada. Desse modo, uma CDR3 VH é localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo em que ela é encontrada, enquanto que uma CDR1 VL é a CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo em que ela é encontrada. As CDRs de cadeia leve são, às vezes, referidas como CDR L1, CDR L2, e CDR L3. As CDRs de cadeia pesada são, às vezes, referidas como CDR H1, CDR H2, e CDR H3.
[0092] As referências a "VH" ou "VH" referem-se à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo aquela de um fragmento de anticorpo, tal como Fv, scFv, dsFv ou Fab. As referências a "VL" ou "VL" referem-se à região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina, incluindo aquela de um Fv, scFv, dsFv ou Fab.
[0093] Um "anticorpo monoclonal" é um anticorpo produzido por uma classe simples de B-linfócitos ou por uma célula em que os genes de cadeia leve e pesada de um anticorpo de cadeia única foram transferidos. Os anticorpos monoclonais são produzidos por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, preparando-se células de formação de anticorpo híbridas a partir de uma fusão de células de mieloma com células do baço imunes. Estas células fundidas e sua progênie são chamadas "hibridomas". Os anticorpos monoclonais incluem anticorpos monoclonais humanizados. Em alguns exemplos, os anticorpos monoclonais são isolados de um indivíduo. A sequência de aminoácidos de tais anticorpos monoclonais isolados pode ser determinada.
[0094] Uma imunoglobulina "humanizada" é uma imunoglobulina incluindo uma região de estrutura humana e uma ou mais CDRs de uma imunoglobulina não humana (tal como um camundongo, rato, ou sintético). A imunoglobulina não humana que fornece as CDRs é chamada de um "doador", e a imunoglobulina humana que fornece a estrutura é chamada de um "aceptor". Em uma modalidade, todas as CDRs são da imunoglobulina doadora em uma imunoglobulina humanizada. As regiões constantes não precisam estar presentes, porém se estiverem, elas devem ser, substancialmente, idênticas às regiões constantes de imunoglobulina humana, tal como pelo menos cerca de 85 a 90 %, tal como cerca de 95 % ou mais idênticas. Em consequência, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, exceto, possivelmente, as CDRs, são, substancialmente, idênticas às partes correspondentes de sequências humanas naturais. Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo incluindo uma cadeia leve humanizada e uma imunoglobulina de cadeia pesada humanizada. Um anticorpo humanizado se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo doador que fornecer as CDRs. A estrutura receptora de uma imunoglobulina humanizada ou anticorpo pode ter um número limitado de substituições por aminoácidos tiradas da estrutura do doador. Os anticorpos monoclonais humanizados ou outros anticorpos monoclonais podem ter substituições de aminoácido conservadoras adicionais que não têm, substancialmente, nenhum efeito sobre a ligação de antígeno ou outras funções de imunoglobulina. As imunoglobulinas humanizadas podem ser construídas por meio de engenharia genética (por exemplo, veja Patente U.S.nº 5.585.089).
[0095] Autorreatividade de anticorpo: uma propriedade de um anticorpo, segundo a qual o anticorpo reage com autoepitopos, isto é, epitopos de proteínas e/ou lipídeos que são produzidos pelo indivíduo. Por exemplo, um anticorpo, tal como 10E8 que não tem autorreatividade, não se ligam aos lipídeos presentes na membrana de uma célula de um indivíduo, tal como uma célula infectada com HIV e/ou expressando gp41 sobre sua superfície. Os métodos de determinar se um anticorpo reage com autoepitopos são conhecidos pela pessoa versada na técnica e descritos aqui (por exemplo, nos exemplos 1 e 8). Em um exemplo, a autorreatividade de anticorpo é avaliada usando um ensaio de anticardiolipina ou um ensaio de antígeno antinuclear (ANA).
[0096] Andaime de anticorpo: refere-e a uma proteína que é enxertada com uma ou mais CDRs de um anticorpo de interesse sobre sua superfície. O transplante das CDRs pode ser realizado computacionalmente de uma maneira que preserve sua conformação e estrutura relevante. As mutações dentro do andaime receptor são feitas para acomodar o enxerto de CDR.
[0097] Anticorpoome: O repertório inteiro da sequência de cadeia leve e pesada de anticorpo expressa em um individual. O indivíduo pode ser um indivíduo infectado com um patógeno, por exemplo, HIV.
[0098] Antígeno: Um polipeptídeo que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T em um animal, incluindo polipeptídeos que são injetados ou absorvidos em um animal. Um animal reage com os produtos de imunidade celular ou humoral específica, incluindo aqueles induzidos por antígenos heterólogos, tais como os antígenos descritos. "Epitopo" ou "determinante antigênico" refere-se à região de um antígeno à qual as células B e/ou T respondem. Em uma modalidade, as células T respondem ao epitopo, quando o epitopo é apresentado juntamente com uma molécula de MHC. Os epitopos podem ser formados tanto de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por duplicação terciária de uma proteína. Os epitopo formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição aos solventes de desnaturação enquanto que os epitopos formados por duplicação terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epitopos tipicamente inclui pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5, cerca de 9, ou cerca de 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos de determinar a conformação espacial de epitopo incluem, por exemplo, cristalografia de raio x e ressonância magnética nuclear.
[0099] Os polipeptídeos imunogênicos e propriedades imunogênicas são exemplos não limitantes de antígenos. Em alguns exemplos, os antígenos incluem polipeptídeos derivados de um patógeno de interesse, tal como um vírus. Um antígeno que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T em um indivíduo a um polipeptídeo expresso por um vírus é um antígeno viral. Um "antígeno de HIV" pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T em um indivíduo a um polipeptídeo expresso por HIV. Em algumas modalidades, um antígeno de HIV é um polipeptídeo expresso por HIV, tal como gp160, ou um fragmento do mesmo, tal como gp145, gp140, gp120 ou gp41.
[00100] Um "epitopo alvo" é um epitopo específico em um antígeno que especificamente liga um anticorpo de interesse, tal como um anticorpo monoclonal. Em alguns exemplos, um epitopo alvo inclui os resíduos de aminoácido que contatam o anticorpo e interesse, de tal forma que o epitopo alvo possa ser selecionado pelos resíduos de aminoácido determinados estarem m contato com o anticorpo e interesse.
[00101] Agente antirretroviral: Um agente que, especialmente, inibe um retrovírus a partir da duplicação ou infecção de células. Os exemplos não limitantes de fármacos antirretrovirais incluem inibidores de entrada (por exemplo, enfuvirtida), antagonistas receptores de CCR5 (por exemplo, aplaviroc, vicriviroc, maraviroc), inibidores de transcriptase reversa (por exemplo, lamivudina, zidovudina, abacavir, tenofovir, entricitabina, efavirenz), inibidores de protease (por exemplo, lopivar, ritonavir, raltegravir, darunavir, atazanavir), inibidores de maturação (por exemplo, interferon alfa, bevirimat e vivecon).
[00102] Terapia antirretroviral (ART): Um tratamento terapêutico para infecção de HIV que envolve a administração de pelo menos um agente antirretroviral (por exemplo, um, dois, três ou quatro agentes antirretrovirais) a um indivíduo infectado por HIV durante um período de tratamento. Os exemplos não limitantes de agentes antirretrovirais incluem inibidores de entrada (por exemplo, enfuvirtida), antagonistas receptores de CCR5 (por exemplo, aplaviroc, vicriviroc, maraviroc), inibidores de transcriptase reversa (por exemplo, lamivudina, zidovudina, abacavir, tenofovir, entricitabine, efavirenz), inibidores de protease (por exemplo, lopivar, ritonavir, raltegravir, darunavir, atazanavir), inibidores de maturação (por exemplo, interferon alfa, bevirimat e vivecon). Um exemplo de um regime de ART inclui tratamento com uma combinação de tenofovir, entricitabina e efavirenz. Em alguns exemplos, ART inclui Terapia Antirretroviral Altamente Ativa (HAART).
[00103] Coordenadas atômicas ou coordenadas de estrutura: as coordenadas matemáticas derivadas de equações matemáticas relacionadas aos padrões obtidos em difração de um feixe monocromático de raio X pelos átomos (centros de dispersão) tal como um antígeno, ou um antígeno em complexo com um anticorpo. Em alguns exemplos aquele antígeno pode ser gp41, um complexo de gp41:anticorpo, ou combinações dos mesmos em um cristal. Os dados de difração são usados para calcular um mapa de densidade de elétron da unidade de repetição do cristal. Os mapas de densidade de elétron são usados para estabilizar as posições os átomos individuais dentro da célula unitária do cristal. Em um exemplo, o termo "coordenadas de estrutura" refere-se às coordenadas cartesianas derivadas de equações matemáticas relacionadas aos padrões obtidos na difração de um feixe monocromático de raios X, tal como pelos átomos de um gp41 em forma de cristal.
[00104] Aqueles versados na técnica entendem que um conjunto de coordenadas de estrutura determinadas por cristalografia de raio X não é sem erro padrão. Para o propósito desta descrição, qualquer conjunto de coordenadas de estrutura que tem uma raiz significa desvio quadrado de átomos de esqueleto de proteína (N, Cα, C e 0) menor do que cerca de 1,0 ângstrons quando sobrepostos, tal como cerca de 0,75, ou cerca de 0,5, ou cerca de 0,25 ângstrons, usando átomos de esqueleto, (na ausência de uma especificação explícita ao contrário) será considerado idêntico.
[00105] Célula B e Célula B de memória: as células B são um subconjunto de linfócitos, isto é, glóbulos brancos (leucócitos). As células B maduras diferenciam-se em células plasmáticas, que produzem anticorpos, e células B de memória. Um "progenitor de célula B" é uma célula que pode desenvolver-se em um uma célula B madura. Os progenitores de célula B incluem células-tronco, células pró-B iniciais, células pró-B finais, células pré-B grandes, células pró-B pequenas, e células B imaturas e células B de transição. Geralmente, as células pró-B iniciais (que expressam, por exemplo, CD43 ou B220) submetem-se à redisposição de cadeia de pesada de imunoglobulina para se tornar células pré B e pró B, e também se submetem à redisposição de cadeia leve de imunoglobulina pata se tornar uma célula B imatura. Em seres humanos, as células B imaturas (por exemplo, células B de transição periférica imaturas) incluem células CD38hi, IgD+ , CD10+ , CD24hi, CD44lo, CD23lo e CD1lo . Desse modo, as células B imaturas incluem células de expressão de B220 (CD45R) em que os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e pesada são redispostos. Em uma modalidade, as células B imaturas expressam CD45R, classe II, IgM, CD19 e CD40. As células B imaturas podem se desenvolver em células B maduras, que podem produzir imunoglobulinas (por exemplo, IgA, IgG ou IgM). As células B maduras têm superfície adquirida IgM e IgD, são capazes de responder o antígeno, e expressam marcadores característicos tais como células CD21 e CD23 (CD23hiCD21hi). As células plasmáticas são células B terminalmente diferenciadas Plasma que são as células secretoras de anticorpo predominantes.
[00106] Após um progenitor de célula B (por exemplo, um linfócito pequeno pré-comprometido) ser estimulado por um antígeno, ele diferencia-se em uma célula de explosão, que se diferencia em uma célula plasmática imatura que pode se diferenciar em uma célula plasmática madura ou uma célula B de memória. Uma "célula plasmática madura" secreta as imunoglobulinas em resposta a um antígeno específico.
[00107] As células B podem ser ativadas por agentes tal como lipopolissacarídeo (LPS) ou IL-4 e anticorpos para IgM. As fontes biológicas comuns de células B e progenitores de célula B incluem medula óssea, sangue periférico, baço e linfonódos.
[00108] Uma "célula B de memória" é uma célula B que suporta comutação de isótipo e hipermutação somática que são geralmente encontradas durante uma resposta imune secundária (uma exposição de antígeno subsequente após uma exposição primária), porém põem também ser detectadas durante uma resposta de antígeno primária. A geração de células B de memória requer células T auxiliares. O desenvolvimento de células B de memória ocorre em centros germinais (GC) de folículos linfoides onde linfócitos regulados por antígeno sofrem hipermutação somática e seleção de afinidade, presumivelmente sob a influência de células T auxiliares. Tipicamente, as células B de memória expressam imunoglobulina específica de antígeno de alta afinidade (receptor de célula B) em sua superfície celular. Em uma modalidade, as células B de memória incluem células que expressam CD19, porém não expressam IgA, IgD ou IgM (células CD19+IgA-IgD-IgM-).
[00109] Anticorpo biespecífico: uma molécula recombinante de dois domínios de ligação de antígeno diferentes que, consequentemente, se ligam a dois epitopos antigênicos diferentes epitopos antigênicos. Os anticorpos biespecíficos incluem moléculas quimicamente ou geneticamente ligadas de dois domínios de ligação de antígeno. Os domínios de ligação de antígeno podem ser ligados usando um ligador. Os domínios de ligação de antígeno podem ser anticorpos monoclonais, fragmentos de ligação de antígeno (por exemplo, Fab, scFv), eAds, anticorpos de cadeia única biespecíficos ou combinação dos mesmos. Um anticorpo biespecífico pode incluir um ou mais domínios constantes, porém não necessariamente incluem um domínio constante. Um exemplo de um anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico de cadeia única incluindo um scFv que especificamente se liga ao gp41 ligado (por meio de um ligador de peptídeo) a um scFv que especificamente se liga a uma antígeno diferente de gp41. Outro exemplos é um anticorpo biespecífico incluindo um Fab que especificamente se liga ao gp41 ligado a um scFv que especificamente se liga a uma antígeno diferente de gp41.
[00110] Repertório de célula B: As células B em uma mostra ou em um indivíduo específico para antígeno de interesse.
[00111] CD40: uma proteína coestimuladora encontrou um antígeno que apresenta células que são requeridas para sua ativação. A ligação de ligante de CD40 (CD40L), também conhecido como CD154, a CD40 ativa as células apresentadoras de antígeno. Este receptor foi descoberto ser essencial em mediar uma ampla variedade de respostas imunes e inflamatórias incluindo mudança e classe de imunoglobulina dependente de célula T, desenvolvimento de célula B de memória, e formação do centro germinal. Uma sequência de aminoácido exemplar para CD40, e uma sequência de mRNA exemplar que codifica CD40 pode ser encontrada em GENBANK® acessão nº NM_001250, (Junho 10, 2012), que é incorporado aqui por referência.
[00112] Ligante CD40 (CD40L): Um ligante que é também chamado CD154, que é expresso em células T ativadas e é um membro da superfamília de necrose de tumor de moléculas. Ele liga-se ao CD40 em células apresentadoras de antígeno, que leva a muitos efeitos que dependem do tipo de célula alvo. Em geral, o CD40L desempenha o papel de uma molécula coestimuladora e induz à ativação em células apresentadoras de antígeno em associação com T estimulação de receptor de célula por moléculas de MHC nas células apresentadoras de antígeno. Em CD40L total tem três padrões de ligação: CD40, integrina α5β1 e αIIbβ3. CD154 é expresso na superfície de células de T. Ele regula a função de célula B engajandose CD40 na superfície de célula B. Uma sequência de aminoácido exemplar para CD40, e uma sequência de mRNA exemplar codificando CD40 pode ser encontrada no GENBANK® acessão nº NM_000074.2, (Junho 10, 2012), que é incorporado aqui por referência.
[00113] Anticorpo quimérico: Um anticorpo que inclui sequências derivadas de dois anticorpos diferentes, que tipicamente são de espécies diferentes. Em alguns exemplos, um anticorpo quimérico inclui uma ou mais CDRs e/ou regiões de estrutura de um anticorpo humano e CDRs e/ou regiões de estrutura de outro anticorpo humano. Em alguns exemplos, um anticorpo quimérico é produzido enxertandose uma ou mais CDRs em um andaime de anticorpo.
[00114] Variante clonal: qualquer sequência, que difira por um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, na presença de região V com mutações idênticas em comparação com o uso de gene de VJ ou VDJ idêntico, germinativo, e comprimento de D e J idêntico. A sequência "germinativa" é destinada a ser a sequência que codifica o anticorpo/imunoglobulina (ou de qualquer fragmento do mesmo) privações de mutações, por exemplo, mutações somáticas. A porcentagem de homologia representa uma indicação dos eventos mutacionais que qualquer tipo de porção de cadeia pesada sofre após o contato com um antígeno.
[00115] Meios de Armazenagem Legíveis por Computador: qualquer meio ou meios, que podem ser lidos e acessados diretamente por um computador, de modo que os meios sejam adequados para uso em um sistema de computador. Tais meios incluem, porém não são limitados a: meios de armazenamento magnético tais como disquetes, meio de armazenamento em disco rígido e fita magnética; meios de armazenamento ópticos tais como discos ópticos ou CD-ROM; meios de armazenamento elétrico tais como RAM e ROM; e híbridos destas categorias tais como meios de armazenamento óticos/magnéticos.
[00116] Sistema de computador: O hardware que pode ser usado para analisar os dados de coordenada atômica e/ou planejar um antígeno que usa dados de coordenada atômica ou para analisar uma sequência de aminoácido ou ácido nucleico, por exemplo, para comparar duas ou mais sequências a uma divergência e/ou similaridade de sequência calculada. O hardware mínimo de um sistema baseado em computador, tipicamente, inclui uma unidade de processamento central (CPU), um dispositivo de entrada, por exemplo, um mouse, teclado, e similares, um dispositivo de saída, e um dispositivo de armazenamento de dados. Desejavelmente, um monitor é fornecido para visualizar os dados de estrutura. O dispositivo de armazenamento de dados pode ser RAM ou outros meios legíveis de acessar o computador. Os exemplos de tais sistemas são estações de trabalho de microcomputador disponíveis pelos sistemas operacionais Silicon Graphics Incorporated and Sun Microsystems running Unix based Windows NT ou IBM OS/2.
[00117] Conjugado: Um complexo de duas moléculas ligadas uma a outra, por exemplo, ligadas uma à outra por uma ligação covalente. Em uma modalidade, um anticorpo é ligado a uma molécula efetora; por exemplo, um anticorpo que especificamente se liga ao gp41 covalentemente ligado a uma molécula efetora ou a uma toxina. Uma ligação pode ser por meios químicos ou recombinantes. Em uma modalidade, a ligação é química, em que uma reação entre a porção de anticorpo e a molécula efetora produziu uma ligação covalente formada entre as duas moléculas para formar uma molécula. Um ligador de peptídeo (sequência de peptídeo curta) pode opcionalmente ser incluído entre o anticorpo e a molécula efetora. Porque os conjugados podem ser preparados de duas moléculas com funcionalidades separadas, tais como um anticorpo e uma molécula efetora, eles são também, às vezes, referidos como "moléculas quiméricas". Em uma modalidade, um anticorpo ligado a uma molécula efetora é também ligado a um lipídeo ou outra molécula a uma proteína ou peptídeo para aumentar sua meia vida no corpo.
[00118] Contato: colocação em associação física direta; inclui tanto em forma sólida quanto líquida, que pode ocorrer a vácuo ou in vitro. O contato inclui contato entre uma molécula e outra molécula, por exemplo, o aminoácido sobre a superfície de um polipeptídeo, tal como um antígeno, que contata outro polipeptídeo, tal como um anticorpo. O contato entre polipeptídeos pode incluir contato direto entre aminoácidos de dois ou mais polipeptídeos (por exemplo, ligação de hidrogênio ou interações de força Van der Waals entre polipeptídeos), bem como outras interações entre polipeptídeos que produzem uma interface entre os polipeptídeos com acessibilidade de solvente reduzida (sem todos os aminoácidos da interface necessariamente formando ligações diretas). Em algumas modalidades, um contato direto refere-se à formação de uma ligação de hidrogênio ou interação de Van der Waals com, particularmente, um resíduo idêntico ou resíduos em uma sequência, porém não com o outros resíduos na sequência. A pessoa versada na técnica é familiar com métodos de determinar o contato entre polipeptídeos (veja, por exemplo, Exemplo 1). A contactação pode também incluir contatar uma célula, por exemplo, colocando-se um anticorpo em associação física direta com uma célula. Em algumas modalidades, um anticorpo (por exemplo, 10E8) apenas contata resíduos particulares de um epitopo sobre um antígeno, tal como o epitopo de 10E8 sobre gp41 como descrito aqui.
[00119] Controle: um padrão de referência. Em algumas modalidades, o controle é uma amostra obtida de um paciente saudável. Em outras modalidades, o controle é uma amostra de tecido obtido de um paciente diagnosticado com infecção por HIV. Em ainda outras modalidades, o controle é um controle histórico ou valor de referência padrão ou faixa de valores (tal como uma amostra de controle previamente testada, tal como um grupo de pacientes de HIV com prognóstico ou resultado conhecido, ou grupo de amostras que representa linha de base ou valores normais).
[00120] Uma diferença entre uma amostra de teste e um controle pode ser um aumento ou contrariamente um decréscimo. A diferença pode ser uma diferença qualitativa ou uma diferença quantitativa, por exemplo, uma diferença estatisticamente significante. Em alguns exemplos, uma diferença é um aumento ou decréscimo, em relação a um controle, de pelo menos cerca de 5 %, tal como pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 100 %, pelo menos cerca de 150 %, pelo menos cerca de 200 %, pelo menos cerca de 250 %, pelo menos cerca de 300 %, pelo menos cerca de 350 %, pelo menos cerca de 400 %, pelo menos cerca de 500 %, ou mais do que 500 %.
[00121] Citocina/Interleucina (IL): Um nome genérico para um grupo diverso de peptídeos e proteínas solúveis que agem como reguladores humorais em concentrações nano- a picomolares e que, sob condições normais ou patológicas, modulam as atividades funcionais de células e tecidos individuais. Estas proteínas também mediam as interações entre células diretamente e regulam os processos que ocorrem no ambiente extracelular. Muitos fatores de crescimento e citocinas agem como fatores de sobrevivência celular prevenindo-se morte celular programada. As citocinas e interleucinas incluem tanto peptídeos de ocorrência natural quanto variantes que retêm a atividade biológica total parcial. Embora as citocinas/interleucinas específicas sejam descritas na especificação, elas não são limitadas aos peptídeos especificamente descritos.
[00122] Citotoxicidade: a toxicidade de uma molécula, tal como uma imunotoxina, para as células destinadas a serem alvejadas, quando opostas às células do resto de um organismo. Em uma modalidade, em contraste, o termo "toxicidade" refere-se à toxicidade de uma imunotoxina para células diferentes daquelas que são as células destinadas a serem alvejadas pela porção alvejante da imunotoxina, e o termo "toxicidade animal" refere-se à toxicidade da imunotoxina para um animal por toxicidade da imunotoxina para células alvejadas pela imunotoxina.
[00123] Marcador detectável: Uma molécula detectável (também conhecida como um rótulo) que é conjugada diretamente ou indiretamente a uma segunda molécula, tal como um anticorpo, pra facilitar a detecção da segunda molécula. Por exemplo, o marcador detectável pode ser capaz de detecção por ELISA, espectrofotometria, citometria de fluxo, microscopia ou técnicas de diagnóstico por imagem (tal como varreduras de CT, MRIs, ultrassom, exame de fibra óptica, e exame laparoscópico). Os exemplos não limitantes, específicos de marcadores detectáveis incluem fluoróforos, proteínas fluorescentes, agentes quimioluminescentes, ligações enzimáticas, isótopos radioativos e metais pesados ou compostos (for exemplo, nanocristais de óxido de ferro superparamagnético para detecção por MRI). Em um exemplo, um "anticorpo rotulado" refere-se à incorporação de outra molécula no anticorpo. Por exemplo, o rótulo é um marcador detectável, tal como a incorporação de um aminoácido radiorrotulado ou ligação a um polipeptídeo de porções de biotinila que pode ser detectada por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Vários métodos de rotular polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Os exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, porém não são limitados a, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (tal como 35S ou 131I), rótulos fluorescentes (tais como isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, fósforos lantanídeos), rótulos enzimáticos (tai como rábano picante peroxidase, betagalactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, grupos biotinilados, epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (tal como uma sequência de par de zíper de leucina, ligando sítios para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulo de epitopo), ou agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio. Em algumas modalidades, os rótulos são ligados por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial. Os métodos de usar marcadores detectáveis e guias na escolha de marcadores detectáveis apropriados para os vários propósitos são discutidos, por exemplo, em Sambrook, e outro, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) e Ausubel, e outro, (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1998).
[00124] Detecção: para identificar a existência, presença, ou fato de alguma coisa. Os métodos gerais de detecção são conhecidos pelo técnico versado e podem ser suplementados com os protocolos e reagentes descritos aqui. Por exemplo, incluídos aqui são os métodos de detectar uma célula que expressa gp41 em um indivíduo.
[00125] Sequenciamento de DNA: O processo de determinar a ordem do nucleotídeo de uma determinada molécula de DNA. As características gerais de "sequenciamento profundo" são que o material genético é amplificado, tal como por reação em cadeia de polimerase, e, em seguida, os produtos amplificados são ligados a uma superfície sólida. A sequência do material genético alvo amplificado é, em seguida, realizada em paralelo a informação da sequência é capturada por um computador. Geralmente, o sequenciamento pode ser realizado usando sequenciamento de Sanger automatizado (analisador de genoma AB13730xl), pirosequenciamento em um suporte sólido (sequenciamento 454, Roche), sequenciamento por síntese com terminações reversíveis (ILLUMINA® Genome Analyzer), sequenciamento por ligação (ABI SOLiD®) ou sequenciamento por síntese com terminadores virtuais (HELISCOPE®). Em algumas modalidades, o sequenciamento de DNA é realizado usando um método de terminação de cadeia desenvolvido por Frederick Sanger, e, desse modo, chamado "sequenciamento baseado em Sanger" ou "SBS." Esta técnica usa terminação específica de sequência de uma reação de síntese de DNA usando substratos de nucleotídeo modificado. A extensão é iniciada em um sítio específico no DNA padrão usando-se uma complementaridade de iniciador de oligonucleotídeo curta para o padrão naquela região. O iniciador de oligonucleotídeo é estendido usando DNA polimerase na presença das quatro bases desoxinucleotídeo (bloqueios de construção de DNA), juntamente com uma baixa concentração de um nucleotídeo de terminação de cadeia (mais comumente um di-desoxinucleotíeo). A incorporação limitada do nucleotídeo de terminação de cadeia pelos resultados de DNA polimerase em uma série de fragmentos de DNA relacionados que são terminados apenas em posições onde aquele nucleotídeo particular está presente. Os fragmentos são, em seguida, separados por tamanho por eletroforese, um gel de poliacrilamida, ou um tubo de vidro estreito (capilar) depositado com um polímero viscoso. Uma alternativa para usar um iniciador rotulado é usar terminadores rotulados em vez disso; este método é geralmente chamado "sequenciamento de terminador de tintura".
[00126] "Pirossequenciamento" é um método baseado na disposição, que tem sido comercializado por 454 Life Sciences (Branford, CT). Em algumas modalidades dos métodos baseados na disposição, o DNA de filamento único é anelado e amplificado por meio de EmPCR®. Estas contas ligadas ao DNA são, em seguida, colocadas em cavidades em um chip de fibra ótica juntamente com enzimas que produzem luz na presença de ATP. Quando nucleotídeos livres são lavados sobre este chip, a luz é produzida, visto que a amplificação de PCR ocorre e o ATP é gerado quando os nucleotídeos se ligam com seus pares de base complementares. A adição de um (ou mais) nucleotídeo(s) resulta em uma reação que gera um sinal de luz que é registrado, tal como pela câmera de dispositivo acoplado de carga (CCD), dentro do instrumento. A intensidade de sinal é proporcional ao número de nucleotídeos, por exemplo, trecho homopolímeros, incorporados em um fluxo de nucleotídeo único.
[00127] Quantidade eficaz: a quantidade de um agente (tal como CD40L, IL-21 ou IL-2) que sozinho, ou juntamente com um ou mis agentes adicionais, induz a resposta desejada.
[00128] Molécula efetora: a porção de uma molécula quimérica que é entendida ter um efeito desejado sobre uma célula à qual a molécula quimérica é alvejada. A molécula efetora é também conhecida como uma porção efetora, agente terapêutico, ou agente diagnóstico, ou termo similares.
[00129] Epitopo: um determinante antigênico. Estes são grupos químicos particulares ou sequências de peptídeo em uma molécula que são antigênicas, de tal forma que elas obtenham uma resposta imune específica, por exemplo, um epitopo é a região de um antígeno à qual as respostas B e/ou T respondem. Em alguns exemplos, um anticorpo especificamente descrito se liga a um epitopo na superfície de gp41 de HIV.
[00130] Os epitopos podem ser formados tanto de aminoácidos contíguos quanto aminoácidos não contíguos justapostos por duplicação terciária de uma proteína. Os epitopo formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição aos solventes de desnaturação enquanto os epitopos formados por duplicação terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais geralmente, pelo menos 5, cerca de 9, ou cerca de 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos de determinar a conformação espacial de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia de raio x e ressonância magnética nuclear.
[00131] Polipeptídeo de Fc: O polipeptídeo que inclui a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante. A região de Fc geralmente referese aos dois últimos domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD, e IgG, e os últimos três domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM. Uma região de Fc pode também incluir parte ou todo o terminal de N de dobradiça flexível a estes domínios. Para IgA e IgM, uma região de Fc pode ou não pode incluir o arremate, e pode ou não pode ser ligada pela cadeia de J. Para o IgG, a região de Fc inclui domínios de imunoglobulina Cgamma2 e Cgamma3 (Cγ2 e Cγ3) e a parte inferior da dobradiça entre Cgamma1 (Cγ1) e Cγ2. Através dos limites da região de Fc podem variar, a região de Fc de cadeia pesada de IgH humana é geralmente definida por incluir resíduos C226 ou P230 a seus terminal de carboxila, em que a numeração é de acordo com o índice de EU como em Kabat. Para IgA, a região de Fc inclui domínios de imunoglobulina Calfa2 e Calfa3 (Cα2 e Cα3) e a parte inferior da dobradiça entre Calpha1 (Cα1) e Cα2. Abrangidos dentro da definição da região de Fc são análogos e variantes de funcionalmente equivalentes da região de Fc. Um análogo funcionalmente equivalente da região de Fc pode ser uma região de Fc variante, incluindo uma ou mais modificação de aminoácido em relação à região de Fc de existência natural ou do tipo selvagem. As regiões de Fc variantes possuirão pelo menos 50 % homologia com uma região de Fc de existência natural, tal como cerca de 80 %, e cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 % de homologia. Os análogos funcionalmente equipados da região de Fc podem incluir um ou mais resíduos de aminoácido adicionados a ou deletados do terminal de N ou C da proteína, tal como não mais do que 30 ou não mais do que 10 adições e/ou deleções. Os análogos funcionalmente equivalentes da região de Fc incluem as regiões de Fc operavelmente ligadas a um parceiro de fusão. Os análogos funcionalmente equivalentes da região de Fc devem incluir a maioria de todos os domínios de Ig que compõem a região de Fc como definido acima; por exemplo, as regiões de Fc de IgG e IgA como definido aqui devem incluir a maioria das sequência codificando o CH2 e a maioria da sequência codificando o CH3. Desse modo, o domínio de CH2 por si próprio, ou o domínio de CH3 por si próprio, não são considerados a região de Fc. A região de Fc pode se referir a esta região em isolamento, ou esta região em relação a um polipeptídeo de fusão de Fc (imunoadesina, veja abaixo).
[00132] Região de estrutura: as sequências de aminoácido interpostas entre as CDRs. Incluem regiões de estrutura pesadas variáveis e leves variáveis. As regiões de estrutura servem para manter as CDRs em uma orientação apropriada par ligação de antígeno.
[00133] gp41: uma proteína de HIV específica. A proteína envelope de HIV-1 é inicialmente sintetizada como uma proteína precursora mais longa de 845 a 870 aminoácidos em tamanho, designada gp160. A gp160 forma um homotrímeros e sofre glicosilação dentro do aparato de Golgi. In vivo, é, em seguida, clivada por uma protease celular em gp120 e gp41. A sequência de aminoácido de um exemplo de gp41 é estabelecida no GENBANK® acessão nº CAD20975 (como disponível em 16 de outubro de 2009) que é incorporado por referência aqui. Entende-se que a sequência de gp41 pode variar daquela fornecida no GENBANK® acessão nº CAD20975. A gp41 contém um domínio de transmembrana e, tipicamente, permanece em uma configuração trimérica; ela interage com gp120 de uma maneira não covalente.
[00134] Proteína envelope de HIV (Env): a proteína envelope de HIV é inicialmente sintetizada como uma proteína precursora mais longa de 845 a 870 aminoácidos em tamanho, designada gp160. A gp160 forma um homotrímeros e sofre glicosilação dentro do aparato de Golgi. In vivo, é, em seguida, clivada por uma protease celular em gp120 e gp41. A gp120 contém a maioria dos domínios externos, expostos em superfícies, do complexo de glicoproteína envelope de HIV, e é a gp120 que se liga tanto aos receptores de CD4 celulares quanto aos receptores de quimiocina celulares (tal como CCR5). A gp41 contém um domínio de transmembrana e permanece em uma configuração trimétrica; ela interage com gp120 de uma maneira não covalente.
[00135] Células hospedeiras: Células em que um vetor pode ser propagado e seu DNA expresso, por exemplo, um anticorpo descrito pode ser expresso em uma célula hospedeira. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo também inclui qualquer progênie da célula hospedeira do indivíduo. Entende-se que toda progênie não pode ser idêntica à célula parental, visto que existem mutações que ocorrer durante a replicação. Entretanto, tais progênies são incluídas quando o termo "célula hospedeira" é usado.
[00136] Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV): Um retrovírus que causa imunossupressão em humanos (doença de HIV), e induz a um complexo de doença conhecido como a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). "Doença de HIV" refere-se a uma constelação bem reconhecida de sinais e sintomas (incluindo o desenvolvimento de infecções oportunísticas) em pessoas que são infectadas por um vírus de HIV, como determinados por estudos de anticorpo ou western blot. Descobertas de laboratório associadas com esta doença incluem um declínio progressivo nas células T. HIV inclui HIV tipo 1 (HIV-1) e HIV tipo 2 (HIV-2). Vírus relacionados que são usados como modelos de animal incluem o vírus da imunodeficiência de símio (SIV), e vírus da imunodeficiência felina (FIV). O tratamento de HIV-1 com HAART foi eficaz na redução da carga viral e melhora dos efeitos da infecção por HIV-1 em indivíduos infectados.
[00137] Sistema de numeração de HXB2: Um sistema de numeração de referência para proteína de HIV e sequências de ácido nucleico, usando sequências de linhagem de HXB2 de HIV-1 como uma referência para todas as outras sequências de linhagem de HIV. A pessoa versada na técnica é familiar com o sistema de numeração de HXB2, e este sistema é mencionado em "Numbering Positions in HIV Relative to HXB2CG," Bette Korber, et al, Human Retroviruses and AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber B, Kuiken CL, Foley B, Hahn B, McCutchan F, Mellors JW, and Sodroski J, Eds. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM, que são incorporados aqui por referência aqui em sua totalidade. HXB2 é também conhecida como: HXBc2, para clone 2 de HXB 2; HXB2R, no banco de dados de Los Alamos HIV, com o R para revisado, quando ele foi ligeiramente revisado com relação à sequência de HXB2 original; e HXB2CG em GENBANK™, para genoma completo de HXB2. A numeração usada nos polipeptídeos de gp41descritos aqui, é relativa ao esquema de numeração de HXB2.
[00138] IgA: Um polipeptídeo pertencente à classe de anticorpos que são substancialmente codificados por um gene de imunoglobulina alfa. Em seres humanos, esta classe ou isótipo inclui IgA1 e IgA2. Anticorpos IgAn podem existir como monômeros, polímeros (referidos como pIgA) de forma predominantemente dimérica, e IgA secretória. A cadeia constante de IgA do tipo selvagem contém uma extensão de 18 aminoácidos em seu terminal C chamada porção cauda (tp). IgA polimérica é secretada por células plasmáticas com um peptídeo de 15-kDa chamado a cadeia J ligando os dois monômeros de IgA através do resíduo de cisteína conservado na porção cauda.
[00139] IgG: Um polipeptídeo pertencente à classe ou isótipo de anticorpos que são substancialmente codificados por um gene de imunoglobulina gama reconhecido. Em seres humanos, esta classe inclui IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4.
[00140] Complexo imune: A ligação de anticorpo a um antígeno solúvel forma um complexo imune. A formação de um complexo imune pode ser detectada através de métodos convencionais conhecidos pelo técnico versado, por exemplo, imunoistoquímica, imunoprecipitação, citometria de fluxo, microscopia de imunofluorescência, ELISA, imunomanchamento (por exemplo, Western blot), imageamento de ressonância magnética, varreduras de CT, raio X e cromatografia de afinidade. Propriedades de ligação imunológica de anticorpos selecionados podem ser quantificadas usando métodos bem conhecidos na técnica.
[00141] Imunoadesina: Uma fusão molecular de uma proteína com a região Fc de uma imunoglobulina, em que a imunoglobulina mantém propriedades específicas, tal como ligação de receptor de Fc e meia vida aumentada. Uma fusão de Fc combina a região Fc de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão, que em geral pode ser qualquer proteína, polipeptídeo, peptídeo, ou molécula pequena. Em um exemplo, uma imunoadesina inclui a articulação, domínios de CH2, e CH3 da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina gama 1. Em outro exemplo, a imunoadesina inclui os domínios de CH2, e CH3 de um IgG.
[00142] Imunógeno: Um composto, composição, ou substância (por exemplo, uma proteína ou uma porção da mesma) que é capaz de induzir uma resposta imune em um mamífero, tal como um mamífero infectado ou em risco de infecção com um patógeno. Administração de um imunógeno pode induzir à imunidade protetiva e/ou imunidade proativa contra um patógeno de interesse. Em alguns exemplos, um imunógeno é um antígeno de HIV. Exemplos de imunógenos incluem, porém não estão limitados a peptídeos, lipídios, polissacarídeos, combinações dos mesmos, e ácidos nucleicos contendo determinantes antigênicos, tais como aqueles reconhecidos por uma célula imune. Em alguns exemplos, imunógenos incluem peptídeos derivados de um patógeno de interesse. Patógenos exemplares incluem bactérias, fungos, vírus e parasitas. Em exemplos específicos, um imunógeno é derivado de HIV, tal como um peptídeo de gp41 derivado de HIV ou fragmento antigênico do mesmo.
[00143] Sonda imunológica: Uma molécula que pode ser usada para seleção de anticorpos de soros que são direcionados contra um epitopo específico, incluindo de soros de paciente humano. Os andaimes de epitopo, junto com mutantes de ponto relacionado, podem ser usados como sondas imunológicas tanto em seleção positiva quanto negativa de anticorpos contra o enxerto de epitopo. Em alguns exemplos, sondas imunológicas são variantes planejadas de gp120.
[00144] Condições imunologicamente reativas: Incluem referência às condições que permitem um anticorpo elevado contra um epitopo particular ligar-se àquele epitopo em um grau detectavelmente maior do que, e/ou para a exclusão substancial de, ligação a substancialmente todos os outros epitopos. Condições imunologicamente reativas são dependentes do formato da reação de ligação de anticorpo e tipicamente são aquelas utilizadas em protocolos de imunoensaio ou aquelas condições encontradas in vivo. Veja, Harlow & Lane, infra, para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio. As condições imunologicamente reativas empregadas nos métodos são "condições fisiológicas" que incluem referência às condições (por exemplo, temperatura, osmolaridade e pH) que são típicas no interior de um mamífero vivente ou uma célula mamífera. Ao mesmo tempo em que é reconhecido que alguns órgãos são submetidos às condições extremas, o ambiente intraorganismal e intracelular normalmente situa em torno de pH 7 (por exemplo, de pH 6,0 a pH 8,0, mais tipicamente pH 6,5 a 7,5), contêm água como o solvente predominante, e existe em uma temperatura acima de 0°C e abaixo de 50°C. Osmolaridade está na faixa que é sustentadora de viabilidade e proliferação celular.
[00145] Inibição ou tratamento de uma doença: A inibição do desenvolvimento completo de uma doença ou condição, por exemplo, em um indivíduo que está em risco de uma doença tal como síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). "Tratamento" refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após ela ter começado a se desenvolver. O termo "melhora," com referência a uma doença ou condição patológica, refere-se a qualquer efeito benéfico observável do tratamento. O efeito benéfico pode ser evidenciado, por exemplo, por um início retardado de sintomas clínicos das doenças em um indivíduo suscetível, uma redução na gravidade de algum ou todos os sintomas clínico da doença, uma progressão mais lenta da doença, uma redução na carga viral, uma melhora na saúde total, ou bem-estar do indivíduo, ou por outros parâmetros bem conhecidos na técnica que são específicos para a doença particular. Um tratamento "profilático" é um tratamento administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença ou exibe apenas sinais precoces para os propósitos de diminuir o risco de desenvolver a patologia.
[00146] Interleucina-2 (IL-2): IL-2 é uma citocina que é necessária para o crescimento e função de células T. A ligação de antígeno ao receptor de célula T (TCR) estimula a secreção de IL-2, e a expressão de IL-2R receptores de IL-2. A interação de IL-2/IL-2R então estimula o crescimento, diferenciação e sobrevivência de células T citotóxicas selecionadas de antígeno por meio da ativação de genes específicos. Como tal IL-2 é necessária para o desenvolvimento de memória imunológica da célula T, que depende da expansão do número e função de clones de célula T selecionados de antígeno. IL-2 é também necessária durante o desenvolvimento de célula T no timo para a maturação de um subgrupo de células T que são denominadas células T regulatórias. Uma sequência de aminoácido exemplar de IL-2 humana é fornecida em GENBANK® Acesso nº NM_000586 (10 de Junho de 2012), que é incorporado aqui por referência.
[00147] Interleucina-21 (IL-21): A citocina clonada de uma biblioteca de cDNA derivada de células T de CD3+ ativadas (ParrishNovak, e outro, Nature 408:57-63, 2000). O cDNA de IL-21 codifica uma proteína secretada de proteína de 131 aminoácidos mais intimamente relacionada à IL-2 e IL-15. O gene de IL-21 foi mapeado para um cromossoma humano 4q26-q27 próximo ao gene de IL-2.
[00148] mRNA de IL-21 demonstrou ser expresso em células CD4+ ativadas, porém não em outras células T, células B, ou monócitos (Parrish-Novak, e outro, Nature 408:57-63, 2000). Entretanto, demonstrou-se que IL-21 estimula a proliferação de células B que são estimuladas por reticulação do antígeno CD40 e proliferação de células B estimuladas por IL-4 em adição ao anti-IgM. IL-21 também mostrou estimular a proliferação de células que não receberam tratamento (CD45RA (+)), mediada por comprometimento de CD3. IL21 também mostrou estimular a proliferação de medula óssea progenitora para células e realçar a expressão do marcador de célula CD56 na presença de IL-15. (Para revisão, veja Horst Ibelgaufts' COPE: Citocinas Online Pathfinder Encyclopedia, disponível na internet). A sequência de aminoácido de uma IL-21 humana exemplar é mostrada como SEQ ID NO: 1 no Pedido de Patente Publicada U.S.nº 2003/0003545, que é incorporado aqui, por referência. Um clone representativo contendo toda ou a maior parte da sequência para IL-21 (designado HTGED19) foi depositado com a Coleta de Cultura do Tipo Americano ("ATCC") em 5 de Março de 1998, e foi fornecido o número de depósito de ATCC 209666 (veja, por exemplo, Pedido de Patente Publicada U.S.nº 2003/0003545).
[00149] O receptor de IL-21 foi isolado e foi constatado ser expresso por células B CD23+, linhagens de célula B, uma linhagem de leucemia de célula T, e linhagens de célula NK. O gene receptor foi mapeado para o cromossoma humano 16p12 (veja, Parrish-Novak, e outro, Nature 408:57-63, 2000; Ozaki, e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11439-11444, 2000).
[00150] Interleucina 15 (IL-15): A citocina com similaridade estrutural à IL-2. IL-15 liga a e sinaliza através da cadeia IL-2/IL-15 beta (CD122) e a cadeia gama comum (gama-C, CD132). IL-15 é secretada por fagócitos mononucleares (e algumas outras células) seguindo a infecção por vírus. Esta citocina induz à proliferação celular de células exterminadoras naturais; células do sistema imune inato cujo principal papel é matar células viralmente infectadas.
[00151] Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um anticorpo, por exemplo, um anticorpo que especificamente liga gp41, um ácido nucleico, peptídeo, proteína ou anticorpo) foi substancialmente separado, produzido à parte de, ou purificado longe de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente naturalmente ocorre, tal como, outro DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos, e proteínas. Ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas que foram "isolados" desse modo incluem ácidos nucleicos e proteínas purificados por métodos de purificação padrões. O termo também abrange ácidos nucleicos, peptídeos, e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira bem como ácidos nucleicos ou polipeptídeos quimicamente sintetizados. Em alguns exemplos, um anticorpo, tal como um anticorpo específico quanto o gp41, pode ser isolado, por exemplo, isolado de um indivíduo infectado com HIV.
[00152] Uma célula "isolada" é uma célula que foi purificada de outros componentes celulares de um tecido. As células podem ser isoladas por métodos mecânicos (tal como por uso de FACS) e/ou enzimáticos. Em diversas modalidades, uma população isolada de células (tal como um repertório de célula B) inclui mais do que cerca de 80 %, cerca de 85%, cerca de 90 %, cerca de 95%, ou mais do que cerca de 99% das células de interesse. Em outra modalidade, uma população isolada de células é uma em que nenhuma outra célula de um fenótipo diferente pode ser detectada. Em uma outra modalidade, uma população isolada de células é uma população de células que inclui menos do que cerca de 20 %, cerca de 15%, cerca de 10 %, cerca de 5%, ou menos do que cerca de 1% de uma célula de um diferente fenótipo do que as células de interesse.
[00153] KD: A constante de dissociação para uma determinada interação, tal como uma interação de ligante de polipeptídeo ou uma interação de antígeno-anticorpo. Por exemplo, para a interação bimolecular de um anticorpo (tal como aquele descrito aqui) e um antígeno (tal como gp41) ela é a concentração dos componentes individuais da interação bimolecular dividida pela concentração do complexo.
[00154] Ligador: Uma molécula bifuncional que pode ser usada para ligar duas moléculas em uma molécula contígua, por exemplo, para ligar uma molécula efetora a um anticorpo. Em algumas modalidades, um conjugado inclui um ligador entre a molécula efetora ou marcador detectável e um anticorpo. Em algumas modalidades, o ligador é clivável sob condições intracelulares, de modo que a clivagem do ligador libere releases a molécula efetora ou marcador detectável do anticorpo no ambiente intracelular. Ainda em outras modalidades, o ligador não é clivável e a molécula efetora ou marcador detectável pode ser liberado, por exemplo, por degradação de anticorpo. Em alguns casos, um ligador é um peptídeo dentro de um fragmento de ligação de anticorpo (tal como um fragmento de Fv) que serve pata indiretamente ligar a cadeia pesada variável à cadeia leve variável.
[00155] Os termos "conjugar," "unir," "ligar" ou "conectar" referemse a produção de dois polipeptídeos em uma molécula de polipeptídeo contígua, para covalentemente ligar um radionucleotídeo ou outra molécula a um polipeptídeo, tal como um anticorpo que especificamente liga gp41, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo. No contexto específico, os termos incluem referência à ligação de um ligante, tal como um a porção anticorpo, a uma molécula efetora. A ligação pode ser por métodos químicos ou recombinantes. "Métodos químicos" refere-se a uma reação entre a porção de anticorpo e a molécula efetora de modo que exista uma ligação covalente formada entre as duas moléculas para formar uma molécula.
[00156] Região Externa Próxima à Membrana (MPER) de gp41: Uma região que é imediatamente de terminal N da região de transmembrana de gp41. A MPER é altamente hidrofóbica (50% de resíduos são hidrofóbicos) e é altamente conservada através de muitos clados de HIV (Zwick, M.B., e outro, J Virol, 75 (22): p. 10892- 905, 2001). A MPER conservada de gp41 de HIV-1 é um alvo de dois anticorpos monoclonais humanos neutralizantes, 2F5 e 4E10. O núcleo do epitopo 2F5 foi mostrado ser ELDKWAS (SEQ ID NO: 9). Com este epitopo, os resíduos D, K, e W foram constatados ser mais críticos para reconhecimento por 2F5. O núcleo do epitopo 4E10, NWFDIT (SEQ ID NO: 10), mapeia apenas o terminal C para o epitopo 2F5 no ectodomínio gp41.
[00157] Anticorpo neutralizante: um anticorpo que reduz a titulação infecciosa de um agente infeccioso por ligação a um antígeno específico no agente infeccioso. Em alguns exemplos, o agente infeccioso é um vírus. Em alguns exemplos, um anticorpo que é específico quanto ao gp41, neutraliza a titulação infecciosa de HIV. Um "anticorpo amplamente neutralizante" é um anticorpo que se liga a e inibe a função de antígenos relacionados, tal como antígenos que compartilham pelo menos 85%, 90 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de superfície de identidade antigênica de antígeno. Com respeito a um antígeno de um patógeno, tal como um vírus, o anticorpo pode ligar-se a e inibir a função de um antígeno de mais do que uma classe e/ou subclasse do patógeno. Por exemplo, com respeito a um vírus da imunodeficiência humana, o anticorpo pode ligar-se a e inibir a função de um antígeno, tal como gp41 de mais do que um clado. Em uma modalidade, anticorpos amplamente neutralizantes para HIV são distintos de outros anticorpos para HIV pelo fato de que eles neutralizam um porcentual elevado da maioria dos tipos de HIV em circulação.
[00158] Ácido nucleico: Um polímero composto de unidades de nucleotídeo (ribonucleotídeos, deoxirribonucleotídeos, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e análogos de ocorrência não natural sintéticos dos mesmos) ligado por meio de ligações de fosfodiéster, variantes estruturais de ocorrência natural relacionadas, e análogos de ocorrência não natural sintéticos dos mesmos. Desse modo, o termo inclui polímeros de nucleotídeos em que os nucleotídeos e as ligações entre eles incluem análogos de ocorrência não natural sintéticos, tal como, por exemplo, e sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirais, ribonucleotídeos de 2-O-metila, ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs), e similares. Tais polinucleotídeos podem ser sintetizados, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado. O termo "oligonucleotídeo" tipicamente refere-se aos polinucleotídeos mais curtos, geralmente não maior do que cerca de 50 nucleotídeos. Será entendido que quando uma sequência de nucleotídeo é representada por uma sequência de DNA (isto é, A, T, G, C), esta também inclui uma sequência de RNA (isto é, A, U, G, C) em que "U" substitui "T. "
[00159] Notação convencional é usada aqui para descrever sequências de nucleotídeo: a extremidade à esquerda de uma sequência de nucleotídeo de filamento simples é a extremidade 5'; a direção à esquerda de uma sequência de nucleotídeo de filamento duplo é referida como a direção 5'. A adição de direção de 5' a 3' de nucleotídeos às transcrições de RNA nascente é referida como a direção de transcrição. O filamento de DNA tendo a mesma sequência como um mRNA é referido como "filamento de codificação;" sequências no filamento de DNA tendo a mesma sequência como um mRNA transcrito daquele DNA e que estão localizadas as extremidades 5' à 5' da transcrição de RNA são referidas como "sequências a montante;" sequências no filamento de DNA tendo a mesma sequência como o RNA e que são de extremidade 3' à 3' da transcrição de RNA de codificação são referidas como "sequências a jusantes."
[00160] "cDNA" refere-se a um DNA que é complementar ou idêntico a um mRNA, em forma de filamento simples ou filamento duplo.
[00161] "Codificando" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA, ou um mRNA, para server como um padrão para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes a partir destes. Desse modo, um gene codifica uma proteína se a transcrição ou translação de mRNA produzido por aquele gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto o filamento de codificação, a sequência de nucleotídeo do qual é idêntica à sequência de mRNA e é geralmente fornecida em listagens de sequência, quanto o filamento de não codificação, usado como padrão para transcrição, de um gene ou cDNA podem ser referidos como codificando a proteína ou outros produto daquele gene ou cDNA. A menos que de outro modo especificado, uma "sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido" inclui todas as sequências de nucleotídeo que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácido. Sequências de nucleotídeo que codificam proteínas e RNA podem incluir íntrons.
[00162] "Ácido nucleico recombinante" refere-se a um ácido nucleico tendo sequências de nucleotídeo que não são naturalmente ligadas juntas. Isto inclui vetores de ácido nucleico incluindo um ácido nucleico amplificado ou montado que pode ser usado para transformar uma célula hospedeira adequada. Uma célula hospedeira que inclui o ácido nucleico recombinante é referida como uma "célula hospedeira recombinante." O gene é então expresso na célula hospedeira recombinante para produzir, por exemplo, um "polipeptídeo recombinante." Um ácido nucleico recombinante pode servir também como uma função de não codificação (por exemplo, promotor, origem de replicação, sítio de ligação de ribossoma, etc.).
[00163] Uma primeira sequência é um "antissentido" com respeito a uma segunda sequência se um polinucleotídeo cuja sequência é a primeira sequência, especificamente hibridiza-se com um polinucleotídeo cuja sequência é a segunda sequência.
[00164] Operacionalmente ligado: Uma primeira sequência de ácido nucleico é operacionalmente ligada com uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor, tal como o promotor de CMV, é operacionalmente ligada a uma sequência de codificação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Geralmente, sequências de DNA operacionalmente ligadas são contíguas e, onde necessário para ligar duas regiões de codificação de proteína, na mesma estrutura de leitura.
[00165] Agente farmacêutico: Um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêutico ou profilático desejado, quando apropriadamente administrada a um indivíduo ou uma célula. Em alguns exemplos um agente farmacêutico inclui um ou mais dos anticorpos descritos aqui.
[00166] Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Os veículos farmaceuticamente aceitáveis de uso são convencionais. Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a Edição, 1995, descreve composições e formulações adequadas para liberação farmacêutica dos anticorpos descritos aqui.
[00167] Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo particular de administração que está sendo empregada. Por exemplo, formulações parenterais geralmente incluem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis tais como água, salina fisiológica, soluções de sal equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou similares como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas de pó, pílula, comprimido, ou cápsula), veículos sólidos não tóxicos convencionais incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, ou estearato de magnésio. Além dos veículos biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes de umectação ou emulsificação, conservantes, e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.
[00168] Polipeptídeo: Qualquer cadeia de aminoácidos, independente de comprimento ou modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação). Em uma modalidade, o polipeptídeo é polipeptídeo de gp41. Em uma modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo descrito ou um fragmento do mesmo. Um "resíduo" refere-se a um aminoácido ou mimético de aminoácido incorporado em um polipeptídeo por uma ligação de amida ou mimético de ligação de amida. Um polipeptídeo tem uma extremidade de terminal amino (terminal N) e uma extremidade de terminal carbóxi (terminal C).
[00169] Promotor: Um promotor é um arranjo de sequências de controle de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Um promotor inclui sequências de ácido nucleico necessárias próximas ao sítio de início de transcrição, por exemplo, no caso de um promotor do tipo polimerase II tipo, um elemento TATA. Um promotor também opcionalmente inclui elementos repressores ou realçadores distais que podem ser localizados tanto como diversos milhares de pares de base do sítio de pinico de transcrição. Tanto promotores constitutivos quanto induzíveis são incluídos (veja, por exemplo, Bitter, e outro, Methods in Enzymology 153:516-544, 1987).
[00170] Exemplos não limitantes, específicos de promotores incluem promotores derivados do genoma de células mamíferas (tal como o promotor de metalotioneína) ou de vírus mamíferos (tal como a repetição terminal longa de retrovírus; o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7,5K do vírus da vaccínia) podem ser usados. Promotores produzidos por DNA recombinante ou técnicas sintéticas podem também ser usados. Um polinucleotídeo pode ser inserido em um vetor de expressão que contém uma sequência de promotor que facilita a transcrição eficiente da sequência genética inserida d hospedeiro. O vetor de expressão tipicamente contém uma origem de replicação, um promotor, bem como sequências específicas de ácido nucleico que permitem seleção fenotípica das células transformadas.
[00171] Purificado: O termo purificado não requer pureza absoluta; de preferência, é entendido como um termo relativo. Desse modo, por exemplo, uma preparação de peptídeo purificada é aquela em que o peptídeo ou proteína (tal como um anticorpo) é mais enriquecido do que o peptídeo ou proteína e está em seu ambiente natural dentro da célula. Em uma modalidade, uma preparação é purificada de modo que a proteína ou peptídeo represente pelo menos 50% do teor de peptídeo ou proteína total da preparação.
[00172] Recombinante: Um ácido nucleico recombinante é aquele que tem uma sequência não é de ocorrência natural ou tem uma sequência que é feita por uma combinação artificial de dois segmentos de outro modo separados de sequência. Esta combinação artificial é frequentemente realizada por síntese química ou, mais comumente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética.
[00173] Identidade de Sequência: A similaridade entre as sequências de aminoácido é expressa em termos da similaridade entre as sequências, de outro modo referida como a identidade de sequência. Identidade de sequência é frequentemente medida em termos de porcentagem de identidade (ou similaridade ou homologia); quanto mais alta a porcentagem, mais similares as duas sequências são. Homólogos ou variantes de um polipeptídeo possuirão um grau relativamente elevado de identidade de sequência quando alinhados usando métodos padrões.
[00174] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Váriso programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins e Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins e Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., ácidos nucleicos Research 16:10881, 1988; e Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994, apresentam uma consideração de métods de alinhamento de seuência e cálculos de homologia.
[00175] A Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básica NCBI (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990) é disponível de diversas fontes, incluindo a National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) e na internet, para uso em conexão com os programas de análise de sequência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa é disponível no website NCBI na internet.
[00176] Homólogos e variantes de um VL ou um VH de um anticorpo que especificamente liga um polipetídeo são tipicamente caracterizados por possessão de pelo menos cerca de 75%, por exemplo, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência contada sobre o alinhamento de tamanho natural com a sequência de aminoácido de interesse. Proteínas com similaridade ainda maior às sequências de referência mostrarão porcentagem de identidades crescente quando avaliadas por este método, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência. Quando menos do que a sequência inteira está sendo comparada com a identidade de sequência, homólogos e variantes tipicamente possuirão pelo menos 80% de identidade de sequência sobre curtas janelas de 10 a 20 aminoácidos, e poderão possuir identidades de sequência de pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou 95% dependendo de sua similaridade à sequência de referência. Métodos para determinação da identidade de sequência sobre tais curtas janelas estão disponíveis no website NCBI na internet. Alguém versado na técnica apreciará que estas faixas de identidade de sequência são fornecidas para orientação apenas; é inteiramente possível que homólogos fortemente significantes podem ser obtidos, que se incluem fora das faixas fornecidas.
[00177] Especificamente ligado: quando se referindo a um anticorpo, refere-se a uma reação de ligação que determina a presença de uma proteína alvo, peptídeo, ou polissacarídeo alvo na presença de uma população heterogênea de proteínas e outros biológicos. Desse modo, sob condições designadas, um anticorpo ligase preferencialmente a uma proteína alvo particular, peptídeo ou polissacarídeo (tal como um presente antígeno na superfície de um patógeno, por exemplo, gp41) e não se liga em uma quantidade significante a outras proteínas ou polissacarídeos presentes na amostra ou indivíduo. Ligação específica pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, tal como avaliando-se a afinidade do anticorpo quanto a um antígeno. Em uma modalidade, a afinidade é calculada por uma modificação do método Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979. Em outra modalidade, afinidade de ligação é medida por uma taxa de dissociação de antígeno/anticorpo. Ainda em outra modalidade, uma afinidade de ligação elevada é medida por um radioimunoensaio de competição. Com referência a um comlexo de anticorpo-antígeno, ligação específica do antígeno e anticorpo tem um Kd menor do que cerca de 10-6 Molar, tal como menor do que cerca de 10-6 Molar, 10-7 Molar, 10-8 Molar, 10-9, ou ainda menos do que cerca de 10-10 Molar.
[00178] Substancialmente purificado: O termo substancialmente purificado indica que o indivíduo está substancialmente livre de outros constituintes moleculares ou celulares com os quais ele está naturalmente associado. Desse modo, uma população substancialmente purificada de células (tais como células B, progenitores de célula B, células B maduras, células B de memória, células de plasma, etc.) é substancialmente livre de outros componentes celulares do tecido no qual outros componentes celulares do tecido nos quais ele é naturalmente encontrado, tal como medula óssea, sangue periférico, baço, linfonodo, etc. Por exemplo, uma população substancialmente pura de células B (por exemplo, um progenitor de célula B, uma célula B imatura, uma célula B madura, uma célula B de memória, uma célula plasmática, etc.) é pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos cerca de 80% ou alternativamente pelo menos cerca de 90% livre de outros componentes celulares. Em uma modalidade, a população de células B é de pelo menos cerca de 95% livre de outras células. Por exemplo, uma população de células B purificadas, obtidas de um tecido tal como sangue periférico, é substancialmente livre de glóbulos vermelhos, células T, plaquetas, e outras células tipicamente encontradas no sangue periférico.
[00179] Célula T: Um globule branco crítico para a resposta imune. Células T incluem, porém não estão limitadas às células T CD4+ e células T CD8+ . Um linfócito T de CD4+ é uma célula imune que transporta um marcador em sua superfície conhecido como "cluster de diferenciação 4" (CD4). Estas células, também conhecidas como células T auxiliadoras, ajudam a orquestrar a resposta imune, incluindo resposta do anticorpo bem como respostas da célula T exterminadora. As células T CD8+ transportam o marcador de "cluster de diferenciação 8" (CD8). Em uma modalidade, uma célula T CD8 é um linfócito T citotóxico. Em outra modalidade, uma célula CD8 é uma célula T supressora.
[00180] Agente Terapêutico: usado em um sentido genérico, ele inclui agentes de tratamento, agentes profiláticos, e agentes de substituição. Um agente terapêutico é usado para melhorar um grupo específico de condições em um indivíduo com uma doença ou um distúrbio.
[00181] Quantidade terapeuticamente eficaz ou quantidade eficaz: Uma quantidade de uma substância específica, tal como um anticorpo descrito, suficiente para obter um efeito desejado em um indivíduo sendo tratado. Por exemplo, esta pode ser a quantidade necessária para inibir a replicação de HIV ou tratar AIDS. Em diversas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade necessária para reduzir um sinal ou sintoma de AIDS, e/ou para diminuir a titulação viral em um indivíduo. Quando administrada a um indivíduo, uma dosagem geralmente será usada que obterá concentrações de tecido alvo que foram mostradas para obter um efeito in vitro desejado.
[00182] Toxina: Uma molécula efetora que induz citoxicidade quando ela contata uma célula. Exemplos não limitantes, específicos de toxinas incluem, porém não são limitadas à abrina, ricina, auristatinas (tal como monometil auristatin E (MMAE; veja, por exemplo, Francisco et al., Blood, 102: 1458-1465, 2003)) e monometil auristatina F (MMAF; veja, por exemplo, Doronina et al., BioConjugate Chem., 17: 114-124, 2006), maitansinoides (tal como DM1; veja, por exemplo, Phillips et al., Cancer Res., 68:9280-9290, 2008), Pseudomonas exotoxina (PE, tal como PE35, PE37, PE38, e PE40), toxina diftérica (DT), toxina botulínica, saporina, restrictocina ou gelonina, ou toxinas modificadas faz mesmas, ou outros agentes tóxicos que inibem direta ou indiretamente o crescimento celular ou matam as células. Por exemplo, PE e DT são compostos altamente tóxicos que tipicamente causam a morte através da toxicidade do fígado. PE e DT, entretanto, podem ser modificados em uma forma para uso como imunotoxina removendo-se o componente de alvejamento nativa da toxina (tal como o domínio Ia de PE e a cadeia B de DT) e substuindo-o com uma porção de alvejamento diferente, tal como um anticorpo.
[00183] Sob condições suficientes para: a frase que é usada para descrever qualquer ambiente que permite uma atividade desejada. Em um exemplo, a atividade desejada é a formação de um complexo imune. Em exemplos particulares, a atividade desejada é o tratamento de um tumor.
[00184] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico quando introduzida em uma célula hospedeira, desse modo produzindo uma célula hospedeira transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que o permite replicar em uma célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Um vetor pode também incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica.
[00185] Vírus: Organismo infeccioso microscópico que reproduz células vivas interiores. Um vírus consiste essencialmente em um núcelo de um ácido nucleico simples circundado por um revestimento de proteína, e tem a capacidade de replicar-se apenas dentro da célula viva. "Replicação viral" é a produção de vírus adicionais pela ocorrência de pelo menos um ciclo de vida viral. Um vírus pode destruir as funções normais da célula hospedeira, fazendo a célula comportar-se de uma maneira determinada pelo vírus. Por exemplo, uma infecção viral pode resultar em uma célula produzindo uma citocina, ou respondendo a uma citocina, quando a célula não infectada normalmente não faz.
[00186] "Retrovírus" são vírus de RNA em que o genoma viral é RNA. Quando uma célula hospedeira é infectada com um retrovírus, o RNA genômico é transcrito reverso em um intermediário de DNA que é integrado muito eficientemente no DNA cromossômico das células infectadas. O intermediário de DNA integrado é referido como provírus. O termo "lentivírus" é usado em seu sentido convencional para descrever um gênero de vírus contendo transcriptase reversa. O lentivírus inclui o "vírus da imunodeficiência" que inclui o vírus da imunodeficiência humana (HIV) tipo 1 e tipo 2 (HIV-I e HIV-II), vírus da imunodeficiência símio (SIV), e vírus da imunodeficiência felina (FIV).
[00187] Métodos e materiais adequados para a prática ou teste desta invenção são descritos abaixo. Tais métodos e materiais são ilustrativos apenas e não se destinam a ser limitantes. Outros métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados. Por exemplo, métodos convencionais bem conhecidos na técnica à qual esta invenção descrita pertence, são descritos em várias referências gerais e mais específicas, incluindo, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (e suplementos a 2012); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4a edição, Wiley & Sons, 1999; Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; e Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
II. Descrição de Diversas Modalidades A. Anticorpos Monoclonais Neutralizantes
[00188] Anticorpos monoclonais humanos isolados que especificamente ligam gp41 são descritos aqui. Os anticorpos descritos especificamente ligam a região extracelular próxima à membrana (MPER) de gp41. São também descritas aqui, as composições incluindo estes anticorpos monoclonais humanos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Ácidos nucleicos codificando estes anticorpos, vetores de expressão incluindo estes ácidos nucleicos, e células hospedeiras isoladas que expressam os ácidos nucleicos são também fornecidos.
[00189] Composições incluindo os anticorpos monoclonais humanos específicos quanto ao gp41 podem ser usadas para propósitos de pesquisas, diagnósticos e terapêuticos. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos descritos aqui podem ser usados para detectar HIV-1 em uma amostra biológica ou interferir com a atividade de HIV-1, por exemplo, para diagnosticar ou tratar um indivíduo tendo uma infecção por HIV-1 e/ou AIDS. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados determinar a titulação de HIV-1 em um indivíduo. Os anticorpos descritos aqui também podem ser usados para estudar a biologia do vírus da imunodeficiência humana.
[00190] Os anticorpos descritos que especificamente ligam gp41, ligam a região extracelular próxima à membrana (MPER) de gp41 em um epitopo anteriormente não caracterização, que designado aqui como o epitopo 10E8, para o primeiro membro desta classe de anticorpos descoberta (anticorpos semelhantes a 10E8). A estrutura cristalina do anticorpo 10E8 foi resolvida em complexo com um peptídeo de gp41 (veja, exemplo 1), que permitiu análise detalhada da ligação desta classe do anticorpo 10E8 e gp41, e descreve no nível atômico a ligação de anticorpos semelhantes a 10E8 (tal como 10E8) ao epitopo de 10E8. Este epitopo, e desse modo, os anticorpos desta classe (anticorpos semelhantes a 10E8), podem ser distinguidos de outros anticorpos que ligam gp41 em virtude de sua ligação ao epitopo 10E8. Em diversas modalidades, o epitopo 10E8, por exemplo, KWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13), extende o terminal C ao epitopo 2F5 (embora exista alguma sobreposição) no ectodomínio de gp41 e é distinguido do epitopo de 4E10 e Z13E1 expandindo-se a ligação aos resíduos de terminal C, anteriormente acreditados ser inacessíveis (por exemplo, acreditava-se que estes resíduos fossem embotados na bicamada de lipídio). A pessoa versada na técnica entenderá que os anticorpos de 10E8 podem especificamente se ligar aos resíduos de MPER de gp41 extendendo o terminal N à sequência acima. Em algumas modalidades, os anticorpos semelhantes a 10E8 descritos especificamente se ligam a um polipetídeo incluindo uma sequência de aminoácido estabelecida como resíduos 1-28, 2-28, 3- 28, 4-28, 5-28, 6-28, 7-28, 8-28, 9-28, 10-28, 11-28, 12-28, 13-28 ou 14-28 de SEQ ID NO: 26, que correspondem aos resíduos de gp41 656-683, 657-683, 658-683, 659-683, 660-683, 661-683, 662-683, 663- 683, 664-683, 665-683, 666-683, 667-683, 668-683, ou 669-683, respectivamente (sistema de numeração de HXB2).
[00191] Em algumas modalidades, resíduos acreditados fazer contato com o anticorpo 10E8 incluem o K, SLWNWF, TN, LW, e IR mostrado em negrito acima. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo semelhante a 10E8 especificamente se liga a um ou mais dos K, SLWNWF, TN, LW, e IR de SEQ ID NO: 13, tal como pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12 ou ainda todos os 13 destes resíduos. Em alguns exemplos, um anticorpo semelhante a 10E8 ligase aos resíduos NWF, T e R mostrados em negrito na seguinte sequência NWFDITNWLWYIR (resíduos 7 a 19 de SEQ ID NO: 13).
[00192] Em modalidades adicionais, o fragmento de ligação de anticorpo ou antígeno contata L, WF, LW e R mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, resíduos 14 a 28). Em modalidades adicionais, o anticorpo descrito contata LW, WF, LW e R mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como LWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, resíduos 14 a 28). Em modalidades adicionais, o anticorpo descrito contata SLW, WF, LW e R mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como SLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, resíduos 13 a 28). Em modalidades adicionais, o anticorpo descrito contata L, DK, SLWNWF, TN, LW e IR mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como LELDKWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 26, resíduos 6-28). Em modalidades adicionais, o anticorpo descrito contata NWF, T, e R mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como NWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13, resíduos 7 a 19). Em modalidades adicionais, o anticorpo descrito contata K, SLNWF, T, e IR mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como KWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13). Em modalidades adicionais, o anticorpo descrito o anticorpo especificamente se liga aos resíduos NWF, T, e R mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como NWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13, resíduos 7 a 19). Em modalidades adicionais, o anticorpo descrito especificamente se liga aos resíduos K, SLNWF, T, e IR mostrados em negrito na sequência de aminoácido estabelecida como KWASLWNWFDITNWLWYIR (SEQ ID NO: 13). Em diversas tais modalidades, o anticorpo diretamente contata a MPER de gp41 nos resíduos indicados quando especificamente ligado a gp41, por exemplo, através de contato por ligação de hidrogênio e/ou contatos de Van der Waals. Em modalidades adicionais, o anticorpo contata a MPER de gp41 nos resíduos indicados quando especificamente ligado a gp41, por exemplo, através de contatos por ligação de hidrogênio, contatos Van der Waals, e/ou interações que causam acesso de solvente reduzido entre o anticorpo e gp41 (isto é, área de superfície embotada). Como mostrado nas figuras 27 e 28, resíduos nos anticorpos de 10E8 e semelhantes a 10E8 que são importantes para a ligação ao epitopo de 10E8 incluem os resíduos de Kabat 28, 31, 33, 50, 52, 52B, 52C, 53, 56, 58, e 97-100J da cadeia pesada e resíduos de Kabat 91 e 95B da cadeia leve. Estes resíduos correspondem aos resíduos 28, 31, 33, 50, 52, 54, 55, 56, 59, 61, 103-116 da cadeia pesada (os números do resíduo são fornecidos com relação à SEQ ID NO: 1), e 91 e 97 da cadeia leve (os números de resíduo são fornecidos com relação à SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, um anticorpo semelhante a 10E8 especificamente se liga a gp41, e um ou mais dos resíduos 28, 31, 33, 50, 52, 54, 55, 56, 59, 61, e/ou 103-116 da cadeia pesada (com relação à SEQ ID NO: 1), tal como pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, ou ainda todos os 27 destes resíduos contatam gp41. Em algumas modalidades, um anticorpo semelhante a 10E8 especificamente se liga a gp41 e pelo menos um dos resíduos 91 e 97 da cadeia leve (com relação à SEQ ID NO: 2) contata gp41.
[00193] Em algumas modalidades, a classe de anticorpos semelhantes ao 10E8 não exibe autorreatividade, isto é, eles não ligam autoantígenos, tal como proteína humana. Sem ser ligado à teoria, o exame da estrutura cristalina de 10E8 em complexo com um peptídeo de gp41 de MPER mostra que 10E8 se liga à MPER de uma maneira que pode não requerer qualquer interação hidrofóbica com a membrana. Outros anticorpos neutralizantes conhecidos que ligam à MPER de gp41, tal como 2F5 e 4E10, incluem resíduos hidrofóbicos no CDR H3 que não contatam o epitopo e são acreditados fazser contato específico com a membrana lipídica em que gp41 é situada.
[00194] Ao mesmo tempo em que não sendo ligado à teoria, acredita-se que a amplitude de neutralização dos anticorpos semelhantes ao 10E8 pode tolerar mudanças conservativas ao epitopo ao mesmo tempo em que ainda mantendo a ligação. Por exemplo, ao mesmo tempo em que o resíduo de terminal C é mostrado como uma arginina, anticorpos desta classe podem tolerar uma substituição de lisina neste sítio, e ainda manter afinidade elevada de ligação. Além disso, alguém versado na técnica pode formular uma sequência de consenso para o epitopo de 10E8 usando as sequências de todas as variações de gp41 de HIV para os isolados de HIV listados na figura 17B ou nas figuras 17C-17F. Em algumas modalidades, os anticorpos nesta classe (anticorpos semelhantes a 10E8) podem também ser distinguidos por amplitude de neutralização. Em algumas modalidades, um anticorpo semelhante a 10E8 pode neutralizar pelo menos 95% (tal como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) dos isolados de HIV-1 listados na figura 17B ou nas figuras 17C-17F com um IC50 menor do que 50 µg/ml. Em algumas modalidades, um anticorpo semelhante a 10E8 pode neutralizar pelo menos 65% (tal como pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, ou pelo menos 80%) dos isolados de HIV-1 listados na figura 17B ou nas figuras 17C-17F com um IC50 menor do que 1 µg/ml. Em modalidades específicas, um anticorpo semelhante a 10E8 não é o anticopor Z13E1, 4E10 ou 2F5.
[00195] A descrição de anticorpos monoclonais abaixo se refere aos anticorpos monoclonais isolados que incluem domínio variável de cadeia pesada e leve incluindo um CDR1, CDR2 e CDR3. A pessoa versada na técnica entenderá que vários esquemas de numeração de CDR (tal como os esquemas de numeração Kabat, Chothia ou IMGT) podem ser usados para determinar as posições de CDR. As posições de CDR de cadeia pesada do anticorpo monoclonal 10E8 de acordo com o esquema de numeração Kabat e IMGT são mostradas na figura 6A (Kabat) e na figura 6B (IMGT). Em diversas modalidades, referência às substituições de aminoácido particulares nas cadeias pesadas e leves dos anticorpos descritos é feita de acordo com os esquemas de numeração Kabat ou IMGT. Por exemplo, a substituição de aminoácido S74W em 10E8 referenciada aqui se refere ao esquema de numeração de Kabat. Usando o esquema de numeração IMGT, esta substituição pode ser referida como S82W. Em ambos os casos, esta substituição se refere à substituição do resíduo de serina na posição 77 de SEQ ID NO: 1. A pessoa versada na técnica facilmente entenderá o uso de vários esquemas de numeração CDR quando referenciando os aminoácidos dos anticorpos particulares descritos aqui.
[00196] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (região 1 determinante de complementaridade (CDR1)), aminoácidos 51 a 60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 11: EVX1LX2ESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFDFDNAWMTWVRQPPGKG LEWVGRITGPGEGWSVDYAAPVEGRFTISRLNX3INFLYLEMNNLRM EDSGLYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGRGTLVX4VSS (SEQ ID NO: 11), onde X1 é Q ou R, X2 é V ou A, X3 é S ou Y, e X4 é T ou I. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 11. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 11.
[00197] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (região 1 determinante de complementaridade (CDR1)), aminoácidos 51-60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 146:
EVX1LX2ESGGGLVKPGGSLRLSCSASGFX3FX4X5AWMTWVRQPPGKGLEWVGRITGPGEX6WSVDYAAPVEGRFTISRLNSINFLYLEMNNLRMEDSGLYFCARTGKYYDFWSGYPPGEEYFQDWGRGTLVX7VSS (SEQ ID NO: 146), onde X1 é Q ou R, X2 é V ou A, X3 é D ou W, X4 é D ou W, X5 é N ou W, X6 é G ou W e X7 é T ou I). Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 146. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 146.
[00198] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (região 1 determinante de complementaridade (CDR1)), aminoácidos 51 a 60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 187. SEQ ID NO: 187 é estabelecida como
EX1X2LX3ESGGX4LVX5PGGSLRLSCX6ASGFX7FX8X9X10WMTWVRQX 11PGKGLEWVGRIX12GX13GX14X15WX16X17X18YAX19X20VX21GRFX22ISRX23X24X25X26X27X28X29YLX30MNX31X32X33X34X35DX36X37X38YX39CX40X41TX42KX43YX44FWX45GX46PPGEEYX47X48X49WGX50GTX51VX52VX53S, em que X1 é V ou I; X2 é Q ou R; X3 é V ou A; X4 é G, R, ou D; X5 é K ou R; X6 é S ou A; X7 é D, N, S, A, ou W; X8 é D, K, W ou A; X9 é N, S, D, A, W, F, ou Y; X10 é A, T, ou Q; X11 é P, ou A; X12 é T, S, ou A; X13 é P ou W; X14 é E, A, F, L, M, V, ou W; X15 é G ou W; X16 é S, T, A, ou H; X17 é V ou S; X18 é D, G, ou A; X19 é A ou E; X20 é P, S, ou T; X21 é E, K ou Q; X22 é T ou I; X23 é L, D, M, I, ou N; X24 é N ou D; X25 é S, M, W, F, L, ou M; X26 é I ou K; X27 é N ou D; X28 é F, T. ou M; X29 é L ou F; X30 é E ou Q; X31 é N, S, ou R; X32 é L ou V; X33 é R, ou K; X34 é M, T, I, ou P; X35 é E ou D; X36 é S, T ou W; X37 é G, A, ou W; X38 é L, V, S ou Y; X39 é F, ou Y; X40 é A, T ou V; X41 é R, T, ou H; X42 é G ou E; X43 é Y ou H; X44 é D, A, ou N; X45 é S, G, ou R; X46 é Y ou A; X47 é F ou L; X48 é Q ou E; X49 é D ou H; X50 é R ou Q; X51 é L ou Q; X52 é T ou I; e X53 é S ou P.) Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 187. Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 187.
[00199] Em diversas modalidades, o anticorpo isolado que especificamente liga gp41, é neutralizante, e inclui uma cadeia pesada incluindo uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada de uma das sequências de região variável de cadeia pesada estabelecidas como SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, de acordo com os sistemas de numeração de Kabat, IMGT, ou Clothia. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41 e é neutralizante, inclui uma cadeia pesada incluindo a CDR1, CDR2, e CDR3 de uma das regiões variáveis de sequências de cadeia pesada estabelecidas como SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189- 192, ou 200-204, de acordo com os sistemas de numeração Kabat, IMGT, ou Clothia.
[00200] Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), aminoácidos 51 a 60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204.
[00201] Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada de anticorpo 10E8 de gp41, 7H6 e/ou 7N16. A cadeia pesada de anticorpo 10E8 de gp41 é estabelecida como SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26-33 (27-38 na figura 6B) (CDR1), aminoácidos 51-60 (56-65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 99-120 (105-126 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 1. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 1. A cadeia pesada de anticorpo 7H6 de gp41 é estabelecida como SEQ ID NO: 3. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 3. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 3. A cadeia pesada de anticorpo 7N16 de gp41 é estabelecida como SEQ ID NO: 5. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 5. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 5.
[00202] Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácido de qualquer uma das cadeias pesadas semelhantes a 10E8 descritas aqui e, também incluindo uma substituição de aminoácido na posição 77 (posição 74 de acordo com uma numeração Kabat), tal como uma substituição de S77Y (S74Y de acordo com uma numeração Kabat). Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada de qualquer uma das cadeias pesadas semelhantes a 10E8 descritas aqui e, também incluindo uma substituição de aminoácido na posição 77 (posição 74 de acordo com uma numeração Kabat), tal como uma substituição de S77Y (S74Y de acordo com uma numeração Kabat). Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada de um dos anticorpos gVRC-H2dN152 ou gVRC-H2dN152 de gp41 com uma substituição de aminoácido na posição 77 (posição 74 de acordo com uma numeração Kabat). Em alguns exemplos a substituição de aminoácido é uma substituição de serina por tirosina. A cadeia pesada de anticorpo gVCR-H2dN152 de gp41 é estabelecida como SEQ ID NO: 154. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 154. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 154. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 154. A cadeia pesada de anticorpo gVCR-H2dN152 de gp41 com substituição de serina em tirosina na posição 77 (posição 74 usando numeração Kabat) é estabelecida como SEQ ID NO: 192. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e/ou 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 192. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 192. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 192.
[00203] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve de aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e/ou 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 12:
SYELTQX1TGVSVALGRTVVTITCRGDSLRSHX2ASWYQKKPGQAPX3LLFYGKNNRPSGX4PDRFSGSASGNRASLTIX5GAQAEDX6AX7YYCSSRDKSGSRLSVFGGGTKLX8VL (SEQ ID NO: 12), onde X1 é E ou D, X2 é Y ou H, X3 é V ou I, X4 é V ou I, X5 é S ou T, X6 é D ou E, X7 é E ou D, e X8 é T ou I. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia leve com aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 12. Em exemplos específicos, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 12.
[00204] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve de aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e/ou 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 188:
X1X2X3LTQX4X5X6VSVAX7X8X9TVX10ITCX11GDSLRX12X13YX14X15WYQX16X17X18X19QAPX20LX21X22YX23X24X25X26RPSX27X28X29DRFSX30X31X32SGNX33ASLTIX34GAX35X36X37DX38AX39YYCSSRDKSGSRLX40X41FGX42GTX43X44X45X46X4 7, em que X1 é S ou A; X2 é Y ou S; X3 é E ou D; X4 é E ou D; X5 é T ou P; X6 é G, A, ou T; X7 é L ou F; X8 é G, K, ou E; X9 é R, Q, ou K; X10 é T ou R; X11 é R ou Q; X12 é S, R, ou N; X13 é H ou Y; X14 é A, V, ou T; X15 é S ou G; X16 é K, E, ou Q; X17 é K ou R; X18 é P ou T; X19 é G ou R; X20 é I, V, ou K; X21 é L ou V; X22 é F, V, ou I; X23 é G ou P; X24 é K ou R; X25 é N, D, ou H; X26 é N ou I; X27 é G, ou P; X28 é V ou I; X29 é P, H, ou S; X30 é G ou A; X31 é S ou F; X32 é A, T, ou S; X33 é R ou T; X34 é S, A, ou T; X35 é Q ou E; X36 é A ou G; X37 é E ou D; X38 é D, E, ou I; X39 é E ou D; X40 é S, V; X41 é V, T; X42 é G, R; X43 é K ou E; X44 é L, V, ou R; X45 é T, S, ou A; X46 é V, T, ou G; e X47 é L, V, ou P. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia leve com aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 188. Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 188.
[00205] Diversas modalidades incluem um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, é neutralizante, e inclui uma cadeia leve incluindo uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve de uma das sequências de cadeia leve de região variável estabelecidas como SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199, de acordo com os sistemas de numeração Kabat, IMGT, ou Clothia. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41 e é neutralizante, inclui uma cadeia leve incluindo a CDR1, CDR2, e CDR3 de uma das sequências de cadeia leve de região variável estabelecidas como SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199, de acordo com os sistemas de numeração Kabat, IMGT, ou Clothia. Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26-31 (27-38 na figura 6B) (CDR1), 49- 51 (56-65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 87-98 (105-116 na figura 6B) (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199. Em outras modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia leve com aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199. Em exemplos específicos, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano inclui uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199.
[00206] Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve de anticorpo 10E8 de gp41, 7H6 e/ou 7N16. A cadeia leve de anticorpo 10E8 de gp41 é estabelecida como SEQ ID NO: 2. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 31 (27-38 na figura 6B) (CDR1), 49 a 51 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 87 a 98 (105 a 116 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia leve com aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 2. Em exemplos específicos, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 2. A cadeia leve de anticorpo 7H6 de gp41 é estabelecida como SEQ ID NO: 4. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e/ou 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia leve com aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 4. Em exemplos específicos, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 4. A cadeia leve de anticorpo 7N16 de gp41 é estabelecida como SEQ ID NO: 6. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2), e/ou 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 6. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 6.
[00207] Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada de anticorpo 10E8 de gp41gL03. A cadeia leve de anticorpo 10E8 de gp41gH03 é estabelecida como SEQ ID NO: 152. Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui um ou mais dos aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49-51 (CDR2), e/ou 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 152. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com aminoácidos 26-31 (CDR1), 49-51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 152. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui SEQ ID NO: 152.
[00208] Modalidades adicionais incluem um anticorpo isolado que especificamente liga gp41 e é neutralizante, e inclui uma cadeia pesada incluindo uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada de uma das regiões variáveis de sequências de cadeia pesada estabelecidas como SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, de acordo com os sistemas de numeração Kabat, IMGT, ou Clothia, e uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve de uma das sequências de cadeia leve de região variável estabelecidas como SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199, de acordo com os sistemas de numeração Kabat, IMGT, ou Clothia, respectivamente. Modalidades adicionais incluem um anticorpo isolado que especificamente liga gp41 e é neutralizante, e inclui uma cadeia pesada incluindo a região 1 determinante de complementaridade de cadeia pesada (HCRD1), HCRD2, e HCDR3 de uma das regiões variáveis de sequências de cadeia pesada estabelecidas como SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189- 192, e 200-204, de acordo com os sistemas de numeração Kabat, IMGT, ou Clothia, e a região 1 determinante de complementaridade de cadeia leve (HCRD1), HCRD2, e HCDR3 de uma das sequências de cadeia leve de região variável estabelecidas como SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199, de acordo com os sistemas de numeração Kabat, IMGT, ou Clothia, respectivamente.
[00209] Desse modo, em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo aminoácidos 26 a 33 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), aminoácidos 51 a 60 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 99 a 120 (105 a 126 na figura 6B) (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, e uma cadeia leve incluindo aminoácidos 26 a 31 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), 49 a 51 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 87-98 (105-116 na figura 6B) (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199. Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo aminoácidos 26 a 33 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), aminoácidos 51 a 60 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e 99 a 120 (105 a 126 na figura 6B) (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, e uma cadeia leve incluindo aminoácidos 26-31 (27-38 na figura 6B) (CDR1), 49-51 (56-65 na figura 6B) (CDR2), e 87-98 (105-116 na figura 6B) (CDR3) de uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199.
[00210] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo aminoácidos 26 a 33 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), aminoácidos 51- 60 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 99 a 120 (105 a 126 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 1, e uma cadeia leve incluindo aminoácidos 26 a 31 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), 49 a 51 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 87 a 98 (105 a 116 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo aminoácidos 26 a 33 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), aminoácidos 51 a 60 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 99 a 120 (105 a 126 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 154, e uma cadeia leve incluindo aminoácidos 26 a 31 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), 49 a 51 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 87 a 98 (105 a 116 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 152. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo aminoácidos 26 a 33 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), aminoácidos 51 a 60 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 99 a 120 (105 a 126 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 192, e uma cadeia leve incluindo aminoácidos 26 a 31 (27 a 38 na figura 6B) (CDR1), 49 a 51 (56 a 65 na figura 6B) (CDR2), e/ou 87 a 98 (105 a 116 na figura 6B) (CDR3) de SEQ ID NO: 152.
[00211] Em exemplos adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41 e é neutralizante, inclui uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, ou 200-204, e a região variável de cadeia leve inclui a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199. Em um exemplo, a região variável de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 1, e a região variável de cadeia leve inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 2. Em outro exemplo, a região variável de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 192, e a região variável de cadeia leve inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 152. Em um outro exemplo, a região variável de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 154, e a região variável de cadeia leve inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 152.
[00212] Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204. Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199. Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199.
[00213] Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 2.
[00214] Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 187, em que a sequência de aminoácido inclui não mais do que 25 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou não mais do que 24) substituições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 1. Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 188, em que a sequência de aminoácido inclui não mais do que 33 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 35, 36, 37, 38, 39, 30, 31, 32 ou não mais do que 33) substituições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 187, em que a sequência de aminoácido inclui não mais do que 25 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou não mais do que 24) substituições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 1, e uma cadeia leve incluindo a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 188, em que a sequência de aminoácido inclui não mais do que 33 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 35, 36, 37, 38, 39, 30, 31, 32 ou não mais do que 33) substituições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 2.
[00215] Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido tendo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, e em que as substituições são selecionadas da substituição de aminoácidos listados nas figuras 60A e 60B. Em modalidades adicionais, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199, em que as substituições são selecionadas das substituições de aminoácidos mostradas nas figuras 61A e 61B. Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido tendo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, em que as substituições são selecionadas das substituições de aminoácidos mostradas nas figuras 60A e 60B, e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido incluindo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com uma das a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199, e em que as substituições são selecionadas da substituição de aminoácidos listados nas figuras 61A e 61B. Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácido tendo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 1, em que as substituições são selecionadas da substituição de aminoácidos listados nas figuras 60A e 60B, e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácido tendo não mais do que 10 (tal como mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou não mais do que 9) substituições de aminoácido em comparação com SEQ ID NO: 2, e em que as substituições são selecionadas da substituição de aminoácidos listados nas figuras 61A e 61B.
[00216] Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três ou no máximo quatro substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 11, e uma cadeia leve. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três, no máximo quatro ou no máximo cinco substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 1.
[00217] Em algumas modalidades, o anticorpo pode incluir uma cadeia pesada com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três, no máximo quatro ou no máximo cinco substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o anticorpo pode incluir uma cadeia pesada com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três, no máximo quatro ou no máximo cinco substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o anticorpo pode incluir uma cadeia pesada com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três, no máximo quatro ou no máximo cinco substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 33 (CDR1), 51 a 60 (CDR2), e 99 a 120 (CDR3) de SEQ ID NO: 154.
[00218] Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, e inclui uma cadeia leve com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três ou no máximo quatro substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, e inclui uma cadeia leve com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três ou no máximo quatro substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o anticorpo pode incluir uma cadeia leve com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três ou no máximo quatro substituições de aminoácido nos aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49-51 (CDR2), e 87-98 (CDR3) de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o anticorpo pode incluir uma cadeia leve com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três ou no máximo quatro substituições de aminoácido aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o anticorpo pode incluir uma cadeia leve com no máximo uma, no máximo duas, no máximo três ou no máximo quatro substituições de aminoácido aminoácidos 26 a 31 (CDR1), 49 a 51 (CDR2), e 87 a 98 (CDR3) de SEQ ID NO: 152.
[00219] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41 como descrito aqui inclui até 10 substituições de aminoácido (tal como até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou até 9 substituições de aminoácido) nas regiões de estrutura (por exemplo, de acordo com os sistemas de numeração Kabt, Clothia ou IMGT) da cadeia pesada do anticorpo, da cadeia leve do anticorpo, ou as cadeias pesadas e leves do anticorpo.
[00220] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204. Regiões de estrutura de SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204 incluem aminoácidos 1-25 (FR1), 34-50 (FR2), 61-66 (FR3) e 121-131 (FR4) de SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, e 200-204, respectivamente (de acordo com uma numeração Kabat). Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia leve incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150- 152, 164-186, 188, ou 197-199, respectivamente. Regiões de estrutura de SEQ ID NO: 2 incluem aminoácidos 1-25 (LFR2), 32-48 (LFR2), 52- 86 (LFR3) e 99-108 (OFR4) de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164- 186, 188, ou 197-199, respectivamente (de acordo com uma numeração Kabat).
[00221] Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de SEQ ID Nºs: 2. Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de SEQ ID NO: 154 e uma região variável de cadeia leve incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de SEQ ID NO: 152. Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de SEQ ID NO: 192 e uma região variável de cadeia leve incluindo não mais do que 10 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) substituições de aminoácido nas regiões de estrutura de SEQ ID NO: 152.
[00222] Em algumas modalidades, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% (tal como pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, ou 200-204. Em exemplos adicionais, a cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, ou 200-204. Em alguns exemplos, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano inclui a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% (tal como pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197- 199. Em outras modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada inclui a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% (tal como pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146, 147-149, 187, 189-192, ou 200-204, e a região variável de cadeia leve inclui a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% (tal como pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%) de identidade de sequência com a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199.
[00223] Como descrito aqui, sequenciamento de profundidade foi usado para identificar anticorpos adicionais que se ligam a epitopos substancialmente similares na superfície de gp41 na orientação substancialmente igual que 10E8, 7H6, e/ou 7N16 liga. Sequências de ácido nucleico exemplares codificando cadeias pesadas de anticorpo são estabelecidas como SEQ ID Nºs: 35-115 na listagem de sequência acompanhante. Estas codificam regiões variáveis de cadeia pesada, pelo menos cerca de 80% idênticas à região variável de cadeia pesada de anticorpo 10E8 (SEQ ID NO: 1). Desse modo, descritos aqui são moléculas de aminoácido codificando regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo que são pelo menos cerca de 80% idênticas à região variável de cadeia pesada estabelecida como SEQ Id NO: 1, tal como pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85% pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, ou ainda pelo menos cerca de 89% pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95% pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou ainda pelo menos cerca de 99% idênticas à SEQ ID NO: 1. Sequências de ácido nucleico exemplares codificando cadeias leves de anticorpo semelhante a 10E8 são estabelecidas como SEQ ID Nºs: 116-145 na listagem de sequência acompanhante. Sequências de ácido nucleico exemplares codificando cadeias leves de anticorpo são estabelecidas como SEQ ID Nºs: 116-145 na listagem de sequência acompanhante. Estas codificam regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo pelo menos cerca de 80% idênticas à região variável de cadeia leve de anticorpo 10E8 (SEQ ID NO: 2). Desse modo, descritas aqui são moléculas de aminoácido codificando regiões variáveis de cadeia leve de anticorpo que são pelo menos cerca de 80% idênticas à região variável de cadeia pesada estabelecida como SEQ ID NO: 2, tal como pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85% pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, ou ainda pelo menos cerca de 89% pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95% pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou ainda pelo menos cerca de 99% idênticas à SEQ ID NO: 2.
[00224] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada codificadas pela sequência de ácido nucleico estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 35-115. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia pesada com todas as CDRs codificadas pela sequência de ácido nucleico, estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 35-115. Em exemplos específicos, a cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano inclui a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácido nucleico, estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 35-115.
[00225] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve codificadas pela sequência de ácido nucleico, estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 116-145. Em algumas modalidades, um anticorpo monoclonal humano isolado que especificamente liga gp41, inclui uma cadeia leve com todas as CDRs de anticorpo, codificadas pela sequência de ácido nucleico, estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 116-145. Em exemplos específicos, a cadeia leve do anticorpo monoclonal humano inclui a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácido nucleico, estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 116-145.
[00226] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia pesada codificada por um ácido nucleico derivado da origem alélica de linhagem germinativa IGHV3-15, por exemplo, a origem alélica de linhagem germinativa IGHV3-15*01, IGHV3-15*02, IGHV3-15*03, IGHV3-15*04, IGHV3-15*05, IGHV3-15*06, IGHV3-15*07, IGHV3- 15*08, IGHV3-15*09, IGHV3-15*10, IGHV3-15*11, IGHV3-15*12, IGHV3-15*13, IGHV3-15*14, ou IGHV3-15*15. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada é codificada por um ácido nucleico derivado da origem alélica de linhagem germinativa IGHV3-15, por exemplo, origem alélica de linhagem germinativa IGHV3-15*01, IGHV3-15*02, IGHV3-15*03, IGHV3-15*04, IGHV3- 15*05, IGHV3-15*06, IGHV3-15*07, IGHV3-15*08, IGHV3-15*09, IGHV3-15*10, IGHV3-15*11, IGHV3-15*12, IGHV3-15*13, IGHV3- 15*14, ou IGHV3-15*15, e é cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40%, tal como cerca de 15% a 40% divergente da respectiva sequência de linhagem germinativa de cadeia pesada.
[00227] Em algumas modalidades, um anticorpo isolado que especificamente liga gp41, inclui uma região variável de cadeia leve codificada por um ácido nucleico derivado da origem alélica de linhagem germinativa IGLV3-19, tal como uma origem alélica de linhagem germinativa IGLV3-19*01. Em algumas modalidades, a cadeia leve é codificada por um ácido nucleico derivado da origem alélica de linhagem germinativa IGLV3-19, tal como uma origem alélica de linhagem germinativa IGLV3-19*01, e é cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40%, tal como cerca de 15% a 40% respectiva sequência de linhagem germinativa de cadeia leve.
[00228] Em alguns exemplos, o domínio variável de cadeia pesada é uma variante clonal do doador N152, com uma cadeia pesada codificada por gene VH3-15 e genes VJ-1J. Em outros exemplos, o domínio variável de cadeia leve é uma variante clonal do doador N152, com uma cadeia leve codificada por um gene LV3-19 V e um gene LJ-3 J. O anticorpo monoclonal isolado pode incluir uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada é uma variante clonal do doador N152 com uma região variável de cadeia pesada sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID NO: 1. A cadeia pesada é derivada de um gene VH3-15 e LJ-3 J genes. O domínio variável de cadeia leve é uma variante clonal do doador N152 com uma região variável de sequência de aminoácido de cadeia leve estabelecida como SEQ ID NO: 2. A cadeia leve é derivada de um gene LV3-19 V e um gene LJ-3 J, o anticorpo monoclonal especificamente liga gp41, compete com 10E8 quanto à ligação a gp41, e é neutralizante.
[00229] Em algumas modalidades, a cadeia pesada de um anticorpo semelhante a 10E8 pode ser complementada pela cadeia leve do anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 e ainda mantém a ligação quanto a gp41, por exemplo, mantém a ligação específica para o epitopo de 10E8. Em algumas modalidades, a cadeia leve de um anticorpo semelhante a 10E8 pode ser complementada pela cadeia pesada do anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 e ainda mantém a ligação quanto à gp41, por exemplo, mantém a ligação específica para o epitopo de 10E8. Desse modo, são descritos aqui anticorpos semelhantes ao 10E8, que podem ser identificados pela complementação das cadeias pesadas ou leves de 10E8, 7H6, e/ou 7N16.
[00230] Visto que um domínio variável de cadeia pesada ou leve de interesse é identificado, a ligação ao gp41 ou um epitopo de interesse (tal como o epitopo de 10E8) pode ser determinada usando uma análise de complementação cruzada. Resumidamente, se o domínio variável de interesse é um domínio variável de cadeia pesada, a sequência de aminoácido deste domínio variável de cadeia pesada é produzida. O domínio variável de cadeia pesada é em seguida pareado com um domínio variável de cadeia leve de sequência de referência, tal como 10E8 (SEQ ID NO: 2), 7H6 (SEQ ID NO: 4), e/ou 7N16 (SEQ ID NO: 6), domínio variável de cadeia leve, e é determinado se o anticorpo especificamente liga o antígeno (o epitopo) com uma afinidade específica, tal como um KD de 10-8 , 10-9 ou 10-10 . Similarmente, se o domínio variável de interesse é um domínio variável de cadeia leve, esta sequência de aminoácido é produzida. O domínio variável de cadeia leve variável é em seguida pareado com um domínio variável de cadeia pesada de sequência de referência, tal como domínio variável é em seguida pareado com um domínio variável de cadeia leve de sequência de referência, tal como domínio variável de cadeia pesada de 10E8 (SEQ ID NO: 1), 7H6 (SEQ ID NO: 3), e/ou 7N16 (SEQ Id NO: 5), e é determinado se o anticorpo especificamente liga o antígeno (o epitopo) com uma afinidade específica, tal como um KD de 10-8, 10-9 ou 10-10.
[00231] Anticorpos monoclonais totalmente humanos incluem regiões de estrutura humana. Desse modo, qualquer um dos anticorpos que especificamente liga gp41 aqui, pode incluir a região de estrutura humana e pode incluir as regiões de estrutura da sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID NO; 1-6, 11, 12, e/ou 146-192 ou codificadas por uma das SEQ ID Nºs: 35-145. Entretanto, as regiões de estrutura podem ser de outra fonte. Exemplos adicionais de sequências de estrutura que podem ser usadas incluem as sequências de aminoácido de estrutura das cadeias pesadas e leves descritas na Publicação de PCT nº WO 2006/074071 (veja, por exemplo, SEQ ID Nºs: 1-16), que é incorporada aqui por referência.
[00232] Em algumas modalidades, uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e/ou leve de anticorpo gp41 estabelecidas como uma das 1-6, 11, 12, e/ou 146-192 ou codificadas por SEQ ID Nºs: 35-145 são expressas na superfície de outra proteína, tal como uma proteína de sustentação. A expressão de domínios de anticorpos na superfície de uma proteína de sustentação é conhecida na técnica (veja, por exemplo, Liu et al., J. Virology 85(17): 8467-8476, 2011). Tal expressão cria uma proteína quimérica que mantém a ligação ao gp41, tal como ligação específica ao epitopo de 10E8. Como descrito no exemplo 1, a classe de 10E8 de anticorpos faz a maioria dos seus contatos através das CDRs de cadeia pesada (veja, por exemplo, as tabelas fornecidas nas figuras 27-30, e os modelos moleculares mostrados nas figuras 4, 5, 12, 15, 16 e 39-41A). Desse modo, em algumas modalidades específicas, uma ou mais das CDRs de cadeia pesada são enxertadas em uma proteína de sustentação, tal como uma ou mais das CDR1, CDR2, e/ou CDR3 de cadeia pesada estabelecidas como uma das SEQ ID NO; 1,3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187, 189-192, ou 200-204 ou codificadas por uma das SEQ ID Nºs: 35-115.
[00233] O anticorpo monoclonal pode ser de qualquer isotipo. O anticorpo monoclonal pode ser, por exemplo, um anticorpo IgM ou IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. A classe de um anticorpo que especificamente liga gp41 pode ser comutada com outra. Em um aspecto, uma molécula de ácido nucleico codificando VL ou VH é isolada usando métodos bem conhecidos na técnica, de modo que ela não inclua quaisquer sequências de ácido nucleico codificando a região constante da cadeia leve ou pesada, respectivamente.
[00234] Em exemplos particulares, a sequência de aminoácido VH é estabelecida como uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153- 163, 187, 189-192, ou 200-204 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 35-115. Em outros exemplos, a sequência de aminoácido VL é estabelecida como uma das SEQ ID NO: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164- 186, 188, ou 197-199 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 116-145. A molécula de ácido nucleico codificando VL ou VH é em seguida operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico codificando a CL ou CH de uma classe diferente de molécula de imunoglobulina. Esta pode ser obtida usando um vetor ou molécula de ácido nucleico que inclui uma cadeia de CL ou CH, como conhecido na técnica. Por exemplo, um anticorpo que especificamente liga gp41, que era originalmente IgM pode ser uma classe mudada para um IgG. A mudança de classe pode ser usada para converter uma subclasse IgG em outra, tal como de IgG1 em IgG2, IgG3, ou IgG4.
[00235] Em alguns exemplos, os anticorpos descritos são oligômeros de anticorpos, tais como dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, hexâmetros, septâmeros, octômeros e assim por diante. Em alguns exemplos, os anticorpos são pentâmeros.
[00236] Em alguns exemplos, os anticorpos, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos são modificados, de modo que sejam diretamente citóxicos para células infectadas, ou usem defesas naturais tais como complemento, citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), ou fagocitose por macrófago.
[00237] Fragmentos de anticorpo são abrangidos pela presente invenção, tal como Fab, F(ab')2, e Fv que incluem uma região variável de cadeia pesada e cadeia leve e especificamente ligam gp41. Estes fragmentos de anticorpo mantêm a capacidade se seletivamente ligarse com o antígeno e são fragmentos de "ligação de antígeno". Estes fragmentos:
  • (1) Fab, o fragmento que contém um fragemento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão de anticorpo inteiro com nezima papaína para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada;
  • (2) Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo pode ser obtido por tratamento de anticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos de Fab' são obtidos por molécula de anticorpo;
  • (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido por tratamento de anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem redução subsequente; F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos de Fab' mantidos juntamente por duas ligações de dissulfeto;
  • (4) Fv, um fragmento geneticamente projetado contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressa como duas cadeias; e
  • (5) Anticorpo de cadeia simples (tal como scFv), definido como uma molécula geneticamente projetada contendo a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligada por um ligador de polipeptídeo adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida.
  • (6) Um dímero de um anticorpo de cadeia simples (scFV2), definido como um dímero de um scFV. Este foi também denominado um "minianticorpo."
[00238] Métodos de preparação destes fragmentos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1988).
[00239] Em um outro grupo de modalidades, os anticorpos são Fv anticorpos, que são tipicamente cerca de 25 kDa e contêm um sítio de ligação de antígeno completo com três CDRs por cada cadeia pesada e cada cadeia leve. Para produzir estes anticorpos, a VH e a VL podem ser expressas de duas contruções de ácido nucleico individuais em uma célula hospedeira. Em exemplos particulares, a sequência de aminoácido de VH inclui as CDRs de uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187 ou 189-192 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 35-115. Em outros exemplos, a sequência de aminoácido de VL inclui as CDRs de SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 116-145. Em exemplos adicionais, a sequência de aminoácido de VH inclui a sequência de aminoácido estabelecida como uma das SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187 ou 189-192 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 35-115. Em outros exemplos, a sequência de aminoácido de VL inclui a sequência de aminoácido estabelecida como SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 116-145.
[00240] Se a VH e a VL são expressas não contiguamente, as cadeias do anticorpo de Fv são tipicamente mantidas juntamente por interações não covalentes. Entretanto, estas cadeias tendem a dissociar-se sob diluição, assim métodos foram desenvolvidos para reticular as cadeias através de glutaraldeído, dissulfetos intermoleculares, ou um ligador de peptídeo. Desse modo, em um exemplo, o Fv pode ser Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são quimicamente ligadas por ligações de dissulfeto.
[00241] Em um exemplo adicional, os fragmentos de Fv incluem cadeias VH e VL conectadas por um ligador de peptídeo. Estas proteínas de ligação de antigen de cadeia simples (scFv) são preparadas construindo-se um gene estrutural incluindo sequências de DNA codificando os domínios VH e VL conectados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido em um vetor de expressão, que é subsequentemente introduzido em uma célula hospedeira tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia de polipeptídeo simples com um peptídeo ligador ligando em ponte os dois domínios V. Métodos para a produção de scFvs são conhecidos na técnica (veja, Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Volume 2, página 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; Patente U.S.nº 4.946.778; Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993; e Sandhu, supra). Dimers of a anticorpo de cadeia simples (scFV2), são também contemplados.
[00242] Fragmentos de anticorpo podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão de E. coli de DNA codificando o fragmento. Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão de pepsina ou papaína de anticorpos inteiros por métodos convencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento pode ser também clivado usando um agente de redução de tiol, e opcionalmente um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrila resultantes da clivagem de ligações de dissulfeto, para produzir fragmentos monovalentes de Fab' de 3.5S . Alternativamente, uma clivagem enzimática usando pepsina produz dois fragmentos de Fab' monovalentes e um fragmento de Fc diretamente (veja, Patente U.S.nº 4.036.945 e Patente U.S.nº 4.331.647, e referências contidas a esse respeito; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzymology, Volume 1, página 422, Academic Press, 1967; e Coligan et al. nas seções 2.8.1-2.8.10 e 2.10.1-2.10.4).
[00243] Outros métodos de anticorpos de clivagem, tal como separação de cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve-pesada, outra clivagem de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas, ou genéticas podem também ser usados, contanto que os fragmentos se liguem ao antígeno, que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
[00244] Alguém versado perceberá que variantes conservativas dos anticorpos podem ser produzidas. Tais variantes conservativas empregadas nos fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos dsFv ou em fragmentos scFv, manterá os resíduos de aminoácido críticos necessários para a duplicação correta e estabilização entre as regiões VH e VL, e manterá as características de carga dos resíduos a fim de preservar o pI baixo e baixa toxicidade das moléculas. Substituições de aminoácido (tal como no máximo uma, no máximo duas, no máximo três, no máximo quatro, ou no máximo cinco substituições de aminoácido) podem ser feitas nas regiões VH e VL para aumentar a produção. Em exemplos particulares, a sequência de VH é SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 11, 146-149, 153-163, 187 ou 189-192 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 35-115. Em outros exemplos, a sequência VL é SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 116-145. Tabelas de substituição de aminoácido conservativas fornecendo aminoácidos funcionalmente similares, são bem conhecidas por alguém versado na técnica. Os seis seguintes grupos são exemplos de aminoácidos que são considerados ser substituições conservativas por uma outra:
  • 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
  • 2) Ácido aspártico (D), Ácido Glutâmico (E);
  • 3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
  • 4) Arginina (R), Lisina (K);
  • 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e
  • 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W).
[00245] Os anticorpos descritos aqui podem ser isolados usando antígenos mascarados, como descrito na Publicação de PCT nº WO 2009/100376. Resumidamente, os antígenos são mascarados para antigenicidade alvo do antígeno para um epitopo específico que especificamente liga-se ao anticorpo de interesse, tal como um anticorpo neutralizante.
[00246] Anticorpos neutralizantes humanos recombinantes adicionais que especificamente ligam o mesmo epitopo de gp41 ligado pelos anticorpos descritos aqui, que especificamente ligam gp41, podem ser isolados por análise de uma biblioteca de anticorpo combinatória recombinante, tal como uma biblioteca de exibição de fago de Fab (veja, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S.nº 2005/0123900). Em alguns casos, as bibliotecas de exibição de fago são preparadas usando cDNAs das regiões variáveis de cadeias pesadas e leves preparadas de mRNA derivado de linfócitos humanos. Metodologias para preparação e análise de tais bibliotecas são bem conhecidas na técnica. Existem kits comercialmente disponíveis para a geração de bibliotecas de exibição de fago (por exemplo, o Sistema de Anticorpo de Fago Recombinante de Farmácia, Catálogo nº 27-9400- 01; e o kit de exibição de fago Stratagene SurfZAP™, catálogo nº 240612). Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e análise de bibliotecas de exibição de anticorpo (veja, por exemplo, Patente U.S.5.223.409; Publicação de PCT nº WO 92/18619; Publicação de PCT nº WO 91/17271; Publicação de PCT nº WO 92/20791; Publicação de PCT nº WO 92/15679; Publicação de PCT nº WO 93/01288; Publicação de PCT nº WO 92/01047; Publicação de PCT nº WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372, 1991; Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85, 1992; Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; McCafferty et al., Nature 348:552-554,1990; Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734, 1993)
[00247] Em uma modalidade, para isolar anticorpos humanos adicionais que especificamente ligam gp41, um anticorpo neutralizante que especificamente liga gp41, como descrito aqui, é primeiro usado para selecionar sequências de cadeia pesada e leve humanas tendo atividade de ligação similar a gp41, tal como usando os métodos de impressão de epitopo descritos na Publicação de PCT nº WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpo usadas neste método são as bibliotecas de scFv preparadas e analisadas, usando métodos tais como àqueles descritos na Publicação de PCT nº WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; e/ou Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734, 1993 usando gp120.
[00248] Visto que segmentos de cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) humana são selecionados, experimentos de "mistura e pareamento", em que pares diferentes dos segmentos de VL e VH inicialmente selecionados são analisados quanto à ligação de gp41, são realizados para selecionar combinações de par de VL/VH de interesse. Adiconalmente, para aumentar a afinidade de ligação do anticorpo, os segmentos de VL e VH podem ser aleatoriamente mutados, tal como dentro da região H-CDR3 ou da região L-CDR3, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação de afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Desse modo, a maturação de afinidade in vitro pode ser realizada ampliando as regiões de VH e VL usando iniciadores de PCR complementares para H-CDR3 ou L-CDR3, respectivamente. Neste processo, os iniciadores foram "reforçados" com uma mistura randômica das quatro bases de nucleotídeo em certas posições, de modo que os produtos de PCR resultantes codifiquem os segmentos de VH e VL nos quais mutações randômicas foram introduzidas nas regiões de CDR3 de VH e/ou VL. Estes segmentos de VH e VL randomicamente mutados podem ser testados para determinar a afinidade de ligação quanto ao gp41. Em exemplos particulares, a sequência de aminoácido de VH é SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, ou 11, 146-149, 153-163, 187, 189-192, ou 200-204 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 35-115. Em outros exemplos, a sequência de aminoácido de VL é SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 12, 150-152, 164-186, 188, ou 197-199 ou codificada por uma das SEQ ID Nºs: 116-145.
[00249] Seguindo análise e isolamento de um anticorpo que liga gp41 de uma biblioteca de exibição de imunoglobulina recombinante, ácido nucleico codificando o anticorpo selecionado pode ser recuperado do pacote de exibição (por exemplo, do genoma de fago) e subclonado em outros vetores de expressão por técnicas de DNA recombinante padrões, como descrito aqui. Se desejado, o ácido nucleico pode ser também manipulado para criar outros fragmentos de anticorpo, também como descrito aqui. Para expressar um anticorpo recombinante isolado por análise de uma biblioteca combinatória, o DNA codificando o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em uma célula hospedeira mamífera, como descrito aqui.
[00250] Moléculas efetoras, tais como porções terapêuticas, diagnósticas, ou de detecção podem ser ligadas a um anticorpo de interesse, usando quaisquer números de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Tanto métodos de ligação covalente quanto não covalente podem usados. O procedimento para ligação de uma molécula efetora a um anticorpo varia de acordo com a estrutura química da efetora. Polipeptídeos tipicamente contêm uma variedade de grupos funcionais; tal como grupos ácido carboxílico (COOH), amina livre (-NH2) ou sulfidrila (-SH), que são disponíveis com um grupo funcional adequado para resultar na ligação da molécula efetora. Alternativamente, o anticorpo é derivado para expôr ou ligar grupos funcionais reativos adicionais. A derivação pode envolver a ligação de qualquer número de moléculas ligadoras tais como aquelas disponíveis de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. O ligador pode ser qualquer molécula usada para unir o anticorpo à molécula efetora. O ligador é capaz de formar ligações covalentes tanto ao anticorpo quanto à molécula efetora. Ligadores adequados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, porém não são limitados aos ligadores de carbono de cadeia linear ou ramificada, ligadores de carbono heterocíclicos, ou ligadores de peptídeo. Onde o anticorpo e a molécula efetora são polipeptídeos, os ligadores podem ser ligados aos aminoácidos constituintes através de seus grupos laterais (tal como através de uma ligação de dissulfeto à cisteína) ou aos grupos alfa amino carbono e carboxila dos aminoácidos terminais.
[00251] Em algumas circunstâncias, é desejável libertar a molécula efetora do anticorpo quando o imunoconjugado tiver alcançado seu sítio alvo. Portanto, nestas circunstâncias, os imunoconjugados incluirão ligações que são cliváveis na vizinhaça do sítio alvo. A clivagem do ligador para liberar a molécula efetora do anticorpo pode ser induzida por atividade enzimática ou condições às quais o imunoconjugado é individualizado dentro da célula alvo ou na vizinhaça do sítio alvo.
[00252] Em vista do grande número de métodos que foram reportados para ligação de uma variedade de compostos radiodiagnósticos, compostos radioterapêuticos, fármacos de rótulo (tais como enzimas ou moléculas fluorescentes), toxinas, e outros agentes aos anticorpos alguém versado na técnica será capaz de determinar um método adequado para ligação de um determinado agente a um anticorpo ou outro polipeptídeo.
[00253] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo descritos aqui podem ser derivados ou ligados a outra molécula (tal como outro peptídeo ou proteína). Em geral, o anticorpo ou porção do mesmo é derivado de modo que a ligação ao gp41 não seja adversamente afetada pela derivação ou rotulagem. Por exemplo, o anticorpo pode ser funcionalmente ligado (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais entidades moleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo ou porção anticorpo com outra molécula (tal como uma região núcleo de estreptavidina ou um rótulo de polihistidina).
[00254] Um tipo de anticorpo derivado é produzido reticulando-se dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, tal como para criar anticorpos biespecíficos). Reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriado (tal como m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida éster) ou homobifuncionais (tal como suberato de dissuccinimidila). Tais ligadores são disponíveis de Pierce Chemical Company (Rockford, IL).
[00255] Um anticorpo que especificamente liga gp41 pode ser rotulado com uma porção detectável. Agentes de detecção úteis incluem compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1- naftalenossulfonila, ficoeritrina, fósforos de lantanida e similares. Marcadores bioluminescentes são também de uso, tais como luciferase, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente amarelo. Um anticorpo pode também ser rotulado com enzimas que são úteis para detecção, tal como rábano picante peroxidase, β- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e similares. Quando um anticorpo é rotulado com uma enzima detectável, ele pode ser detectado adicionando reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação que pode ser discernido. Por exemplo, quando o agente rábado picante peroxidase está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina induz a um produto de reação colorido, que é visualmente detectável. Um anticorpo pode também ser rotulado com biotina, e detectado através de avaliação indireta de ligação de avidina ou estreptavidina. Deve-se observar que a própria avidina pode ser rotulada com uma enzima ou um rótulo fluorescente.
[00256] Um anticorpo pode ser rotulado com um agente magnético, tal como gadolínio. Anticorpos podem também ser rotulados com lantanídeos (tal como európio e disprósio), e manganês. Partículas paramagnéticas tal como óxido de ferro superparamagnético são também de uso como rótulos. Um anticorpo pode também ser rotulado com um epitopo de polipeptídeo predeterminado reconhecido por um repórter secundário (tal como sequências de par de zíper da leucina, sítios de ligação para anticorpo secundário, domínios de ligação de metal, rótulos de epitopo). Em algumas modalidades, rótulos são ligados por ramificações espaçadoras de vários comprimentos para reduzir um impedimento potencial estérico.
[00257] Um anticorpo pode também ser be rotulado com um aminoácido radiorrotulado. O radiorrótulo pode ser usado tanto para propósitos diagnósticos quanto terapêuticos. Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, porém não são limitados aos seguintes radioisótopos ou radionucleotídeos: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
[00258] Um anticorpo pode também ser derivado com um grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila, ou um grupo carboidrato. Estes grupos podem ser úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, tal como para aumentar a meia vida do soro ou para aumentar a ligação de tecido.
[00259] Métodos para detectar tais rótulos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Desse modo, por exemplo, radiorrótulos podem ser detectados usando película fotográfica ou contadores de cintilação, marcadores fluorescentes podem ser detectados usando um fotodetector para detectar iluminação emitida. Rótulos enzimáticos são tipicamente detectados fornecendo a enzima com um substrato e detectando o produto de reação produzido pela ação da enzima no subtrato, e rótulos colorimétricos são detectados simplesmente visualizando o rótulo colorido.
[00260] A presente invenção também se refere aos cristais obtidos do anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16, ou porções do mesmo em complexo com gp41 (ou peptídeos de gp41), as estruturas cristalinas do anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 ou porções dos mesmos em complexo com gp41 (ou peptídeos de gp41), as coordenadas tridimensionais do anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 ou porções do mesmo em complexo com gp41 (ou peptídeos de gp41) e estruturas tridimensionais de modelos do anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 ou porções do mesmo em complexo com gp41 (ou peptídeos de gp41).
[00261] Aqueles versados na técnica entederão que um grupo de coordenadas de estrutura para o anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 ou porções do mesmo em complexo com gp41 ou uma porção do mesmo, é um grupo relativo de pontos que define a forma em três dimensões. Desse modo, é possível que um grupo inteiramente diferente de coordenadas possa definer uma forma similar ou idêntica. Entretanto, ligeiras variações nas coordenadas individuais terão pouco efeito sobre a forma total. As variações nas coordenações descritas acima podem ser geradas por causa de manipulações matemáticas das coordenadas de estrutura.
[00262] A invenção também fornece sistemas, tal como sistemas de computador, destinadas a gerar estruturas e/ou realizar planejamento de composto ou fármaco racional para um composto antigênico capaz de eliciar uma resposta imune em um indivíduo. O sistema pode conter um ou mais ou todos de: dados de coordenadas atômicas de acordo com um complexo de anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 ou um subgrupo do mesmo, e as figuras derivadas a partir deste por modelagem de homologia, os dados definindo a estrutura tridimensional de um complexo de anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 ou pelo menos um subdompinio do mesmo, ou dados de fator estrutural quanto o gp41, os dados de fator estrutural sendo deriváveis dos dados de coordenada atômica de complexo de anticorpo 10E8, 7H6, e/ou 7N16 ou um subgrupo do mesmo e das figuras.
B. Polinucleotídeos e Expressão
[00263] Moléculas de aminoácido (também referidas como polinucleotídeos) codificando os polipeptídeos fornecidos aqui (incluindo, porém não limitados aos anticorpos) podem facilmente ser produzidas por alguém versado na técnica. Por exemplo, estes ácidos nucleicos podem ser produzidos usando a sequência de aminoácidos fornecida aqui (tal como as sequências de CDR, sequências de cadeia pesada e cadeia leve).
[00264] Alguém versado na técnica pode facilmente usar o código genético para construir uma variedade de ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tal como ácidos nucleicos que diferem em sequência, porém que codifica a mesma sequência de anticorpo, ou codifica uma proteína de conjugado ou fusão incluindo a sequência de ácido nucleico VL e/ou VH.
[00265] Sequências de ácido nucleico codificando os anticorpos que especificamente ligam gp41 podem ser preparadas por qualquer método adequado incluindo, por exemplo, clonagem de sequências apropriadas ou por síntese química direta por métodos tais como o método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; o método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981; o método de fosforamidita triéster de fase sólida por Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862, 1981, por exemplo, usando um sintetizador automatizado como descrito em, por exemplo, Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; e, o método de suporte sólido de Patente U.S.nº 4.458.066. Síntese química produz um oligonucleotídeo de filamento simples. Este pode ser convertido em DNA de filamento duplo por hibridização com uma sequência complementar ou por polimerização com um DNA polimerase usando o filamento simples como um padrão. Alguém versado pode reconhecer que, ao mesmo tempo em que a síntese química de DNA está geralmente limitada às sequências de cerca de 100 bases, sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas.
[00266] Ácidos nucleicos exemplares podem ser preparados por técnicas de clonagem. Exemplos de técnicas de clonagem e sequenciamento apropriadas, e instruções suficientes para direcionar as pessoas versadas através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Sambrook et al., supra, Berger e Kimmel (eds.), supra, e Ausubel, supra. A informação de produto de fabricantes de reagentes biológicos e equipamento experimental também fornece informação útil. Tais fabricantes incluem o SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suíça), Invitrogen (Carlsbad, CA), e Applied Biosystems (Foster City, CA), bem como muitas outras fontes comerciais conhecidas por alguém versado.
[00267] Os ácidos nucleicos podem também ser preparados por métodos de amplificação. Métodos de amplificação incluem a reação de cadeia polimerase (PCR), a reação de cadeia ligase (LCR), o sistema de amplificação com base em transcrição (TAS), o sistema de replicação de sequência autossustentada (3SR). Uma ampla variedade de métodos de clonagem, células hospedeiras, e metodologias de amplificação in vitro são bem conhecidas por pessoas versadas.
[00268] Qualquer um dos ácidos nucleicos codificando qualquer um dos anticorpos, VH e/ou VL, descritos aqui (ou fragmento dos mesmos) pode ser expresso em uma célula recombinantemente planejada tais como células mamíderas, bactérias, planta, levedura, e inseto. Estes anticorpos podem ser expressos como cadeia VH e/ou VL individual, ou podem ser expressos como uma proteína de fusão. Uma imunoadesina pode também ser expressa. Desse modo, em alguns exemplos, os ácidos nucleicos codificando a VH e VL, e imunoadesina são fornecidos. As sequências de ácido nucleico podem opcionalmente codificar uma sequência líder.
[00269] Para criar um anticorpo de cadeia simples, (scFv) os fragmentos de DNA codificando VH- e VL são operacionalmente ligados a outro fragmento codificando um ligador flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácido (Gly4-Ser)3, de modo que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com os domínios de VL e VH ligado pelo ligador flexível (veja, por exemplo, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). Opcionalmente, um sítio de clivagem pode ser incluído em um ligador, tal como um sítio de clivagem de furina.
[00270] O ácido nucleico codificando o VH e/ou o VL opcionalmente pode codificar um domínio de Fc (imunoadesina). O domínio de Fc pode ser um domínio de IgA, IgM ou IgG Fc. O domínio de Fc pode ser um dompinio de Fc otimizado, como descrito no Pedido de Patente Publicado U.S.nº 20100/093979, incorporado aqui por referência. Em um exemplo, a imunoadesina é um Fc de IgG1. Em um exemplo, a imunoadesina é um Fc de IgG3.
[00271] O anticorpo de cadeia simples pode ser monovalente, se apenas um VH e VL simples for usado, bivalente, se dois VH e VL forem usados, ou polivalente, se mais do que dois VH e VL forem usados. Anticorpos biespecíficos ou polivalentes podem ser gerados que se ligam especificamente a gp120 e a outra molécula, tal como gp41. O VH e VL codificados opcionalmente podem incluir um sítio de clivagem de purina entre os domínios de VH e VL.
[00272] Espera-se que aqueles versados na técnica sejam entendidos nos numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de proteínas incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, levedura, e várias células eucarióticas superiores tais como as linhagens celulares COS, CHO, HeLa e mieloma.
[00273] A célula hospedeira pode ser uma bactérica gram positiva incluindo, porém não são limitadas à Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, e Oceanobacillus. Métodos para expressão de proteína em bactérias gram positiva, tal como Lactobaccillus são bem conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Pedido de Patente Publicado U.S.nº 20100/080774. Vetores de expressão para lactobacilo são descritos, por exemplo, na Patente U.S.6.100.388, e Patente U.S.nº 5.728.571. Sequências líder podem ser incluídas para expressão em Lactobacillus. Bactérias gram positivas incluem, porém não estão limitadas à E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, e Ureaplasma.
[00274] Uma ou mais sequências de DNA codificando o anticorpo ou fragmento do mesmo podem ser expressas in vitro por transferência de DNA em uma célula hospedeira adequada. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo também inclui qualquer progênie da célula hospedeira do indivíduo. Entende-se que toda a progênie pode não ser idêntica à célula parental, visto que podem existir mutações que ocorrem durante a replicação. Métodos de transferência adequada, significando que o DNA estranho é continuamente mantido no hospedeiro, são conhecidos na técnica. Hibridomas expressando os anticorpos de interesse são também abrangidos por esta invenção.
[00275] A expressão de ácidos nucleicos codificando as proteínas isoladas descritas aqui pode ser obtida ligando-se operacionalmente o DNA ou cDNA a um promotor (que é constitutivo ou induzível), seguido por incorporação em um cassete de expressão. O promotor pode ser qualquer promotor de interesse, incluindo um promotor de citomegalovírus e um promotor de vírus linfotrófico de célula T humana (HTLV)-1. Opcionalmente, um realçador, tal como um realçador de citomegalovírus, é incluído na construção. Os cassetes podem ser adequados para replicação e integração em procariotas ou eucariotas. Cassetes de expressão típicos contêm sequências específicas úteis para a regulação da expressão do DNA codificando a proteína. Por exemplo, os cassetes de expressão podem incluir promotores, realçadores, terminadores de transcrição e translação apropriados, sequências de iniciação, um códon de partida (isto é, ATG) na frente de um gene codificando proteína, sinal de entrelaçamento para íntrons, sequências para a manutenção da estrutura de leitura correta daquele gene para permitir a translação apropriada de mRNA, e códons de interrupção. O vetor pode codificar um marcador selecionável, tal como um marcador codificando a resistência ao fármaco (por exemplo, resistência à ampicilina ou tetraciclina).
[00276] Para obter expressão de nível elevado de um gene clonado, é desejável construir cassetes de expressão que contêm, no mínimo, um forte promotor para direcionar a transcrição, um sítio de ligação de ribossoma para iniciação translacional (sequências de ligação ribossômica interna), e um terminador de transcrição/translação. Para E. coli, isto inclui um promotor tal como os promotores T7, trp, lac, ou lambda, um sítio de ligação de ribossoma, e preferivelmente um sinal de terminação de transcrição. Para células eucarióticas, as sequências de controle podem incluir um promotor e/ou um realçador derivado de, por exemplo, um gene de imunoglobulina, HTLV, SV40 ou citomegalovírus, e uma sequência de poliadenilação, e podem também incluir sequências doadoras e/ou receptoras de ligação (por exemplo, sequências receptoras e doadoras de ligação de CMV e/ou HTLV). Os cassetes podem ser transferidos na célula hospedeira escolhida por métodos bem conhecidos tais como transformação e eletroporação para E. coli e tratamento com cálcio de fosfato, eletroporação ou lipofecção para células mamíferas. Células transformadas pelos cassetes podem ser selecionadas por resistência a antibióticos conferida por genes contidos nos cassetes, tais como os genes amp, gpt, neo e hyg.
[00277] Quando o hospedeiro é um eucariota, tais métodos de transfecção de DNA como coprecipitados de fosfato de cálcio, procedimentos mecânicos convencionais tais como microinjeção, electroporação, inserção de um plasmídeo envolto e, lipossomas, ou vetores de vírus podem ser usados. Células eucarióticas podem também ser cotransformadas com sequências de polinucleotídeo codificando o anticorpo, anticorpo rotulado, ou fragmento de ligação de anticorpo do mesmo, e uma segunda molécula de DNA estranho codificando um fenótipo selecionável, tal como o gene de timidina cinase de herpes simples. Outro método é usar um vetor viral eucariótico, tal como vírus símio 40 (SV40) ou vírus do papiloma bovino, para transitoriamente infectar ou transformar células eucarióticas e expressar a proteína (veja, por exemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Alguém versado na técnica pode facilmente usar um sistema de expressão tal como plasmídeos e vetores de uso na produção de proteínas em células incluindo células eucarióticas superiores tais como as linhagens de célula COS, CHO, HeLa e mieloma.
[00278] Modificações podem ser feitas ao ácido nucleico codificando um polipetídeo descrito aqui sem diminuir sua atividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão, ou incorporação da molécula alvo em uma proteína de fusão. Tais modificações são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, códons de terminação, uma metionina adicionada mo terminal amino para fornecer uma iniciação, sítio, aminoácidos adicionais colocados no terminal para criar sítios de restrição convenientemente localizados, ou aminoácidos adicionais (tal como poli His) para auxiliar as etapas de purificação. Além dos métodos recombinantes, os imunoconjugados, porções efetoras, e anticorpos da presente invenção podem também ser construídos no total ou em parte usando síntese de peptídeo padrão bem conhecida na técnica.
[00279] Uma vez expressos, os imunoconjugados recombinantes, anticorpos, e/ou moléculas efetoras podem ser purificados de acordo com procedimentos padrões da técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, e similares (veja, geralmente, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Os anticorpos, imunoconjugados e moléculas efetoras não necessitam ser 100% puros. Uma vez purificados, parcialmente ou até homogeneidade como desejado, se a serem usados terapeuticamente, os polipeptídeos devem ser substancialmente livres de endotoxina.
[00280] Métodos para expressão de anticorpos e/ou reduplicação para uma forma ativa apropriada, incluindo anticorpos de cadeia simples, de bactérias tal como E. coli foram descritos e são bem conhecidos e são aplicáveis aos anticorpos descritos aqui. Veja, Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse et al., Science 246:1275, 1989 e Ward et al., Nature 341:544, 1989.
[00281] Frequentemente, proteínas heterólogas funcionais de E. coli ou outras bactérias são isoladas de corpos de inclusão e requerem a solubilização usando desnaturantes fortes, e reduplicação subsequente. Durante a etapa de solubilização, como é bem conhecido na técnica, um agente de redução deve estar presente para separar as ligações de dissulfeto. Um tampão exemplar com um agente de redução é: Tris a 0,1 M, pH 8, guanidina a 6 M, EDTA a 2 mM, DTE a 0,3 M (ditioeritritol). Reoxidação das ligações de dissulfeto pode ocorrer na presença de reagentes de tiol de baixo peso molecular em forma reduzida e oxidada, como descrito em Saxena et al., Biochemistry 9: 5015-5021, 1970, e especialmente como descrito por Buchner et al., supra.
[00282] A renaturação é tipicamente realizada por diluição (por exemplo, 100 vezes) da proteína desnaturada e reduzida em tampão de reduplicação. Um tampão exemplar é Tris a 0,1 M, pH 8,0, Larginina a 0,5 M, glutationa oxidada a 8 mM (GSSG), e EDTA a 2 mM.
[00283] Como uma modificação ao protocolo de purificação de anticorpo de duas cadeias, as regiões de cadeia pesada e leve são separadamente solubilizadas e reduzidas e, em seguida combinadas na solução de reduplicação. Uma produção exemplar é obtida quando estas duas proteínas são misturadas em uma relação molar, de modo que um excesso molar de 5 vezes de uma proteína sobre a outra não seja excedido. Excesso de glutationa oxidada ou outros compostos de baixo peso molecular oxidantes podem ser adicionados à solução de reduplicação após o embaralhamento de redox ser concluído.
[00284] Além dos métodos recombinantes, os anticorpos, anticorpos rotulados e fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos que são descritos aqui podem também ser construídos no total ou em parte, usando síntese de peptídeo padrão. Síntese de fase sólida dos polipeptídeos menor do que cerca de 50 aminoácidos no comprimento pode ser realizada ligando o aminoácido de terminal C da sequência a um suporte insolúvel seguido por adição sequencial dos aminoácidos restantes na sequência. Técnicas para síntese de fase sólida são descritas por Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Volume 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. páginas 3 a 284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, e Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a edição., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984. Proteínas de comprimento maior podem ser sintetizadas por condensação dos terminais amino e carboxila de fragmentos mais curtos. Métodos de formação de ligações de peptídeo por ativação de uma extremidade de terminal carboxila (tal como pelo uso do reagente de acoplamento N, N'-diciloexilcarbodimida) são bem conhecidos na técnica.
C. Composições e Métodos Terapêuticos
[00285] Métodos são descritos aqui para a prevenção ou tratamento de uma infecção por HIV, tal como uma infecção por HIV-1. A prevenção pode incluir inibição de infecção com HIV-1. Os métodos incluem contatar uma célula com uma quantidade eficaz dos anticorpos monoclonais humanos descritos aqui que especificamente ligam gp41, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos. O método pode também incluir administrar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz dos anticorpos monoclonais humanos a um indivíduo, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos, por exemplo, o fragmento de ligação de anticorpo pode ser uma ou mais das CDRs enxertadas em uma proteína de sustentação. Em alguns exemplos, os anticorpos, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos, podem ser usados em profilaxia pós-exposição. Em alguns exemplos, anticorpos, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, podem ser usados para eliminar o repertório viral. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz dos anticorpos, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo pode ser administrada a um indivíduo que está sendo tratado com terapia antiviral. Em alguns exemplos, os anticorpos, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos são modificados, de modo que sejam diretamente citotóxicos às células infectadas, ou usem defesas naturais tais como complemento, citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), ou fagocitose por macrófago.
[00286] Métodos para ensaio da atividade de neutralização incluem, porém não são limitados a um ensaio de infecção de único ciclo como descrito em Martin et al. (2003) Nature Biotechnology 21:71-76. Neste ensaio, o nível de atividade viral é medido por meio de um marcador selecionável cuja atividade é refletiva da quantidade de vírus viável na amostra, e o IC50 é determinado. Em outros ensaios, infecção aguda pode ser monitorada em linhagem celular PM1 ou em células primárias (PBMC normal). Neste ensaio, o nível de atividade viral pode ser monitorado determinando-se as p24 concentrações usando ELISA. Veja, por exemplo, Martin et al. (2003) Nature Biotechnology 21:71-76.
[00287] A infecção por HIV não necessita ser completamente eliminada para a composição ser eficaz. Por exemplo, uma composição pode diminuir infecção por HIV por uma quantidade desejada, por exemplo, em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou ainda pelo menos 100% (eliminação de células infectadas por HIV detectáveis), quando em comparação com infecção por HIV na ausência da composição. Em exemplo, a célula é também contactada com uma quantidade eficaz de um agente adicional, tal como agente antiviral. A célula pode ser in vivo ou in vitro. Os métodos podem incluir administração de um ou mais agentes adicionais conhecidos na técnica. Em exemplos adicionais, a replicação de HIV pode ser reduzida ou inibida por métodos similares. A replicação de HIV não necessita ser completamente eliminada para a composição ser eficaz. Por exemplo, uma composição pode diminuir a replicação de HIV por uma quantidade desejada, por exemplo, em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou ainda pelo menos 100% (eliminação de HIV detectável), quando em comparação com replicação de HIV na ausência da composição. Em um exemplo, a célula é também contactada com uma quantidade eficaz de um agente adicional, tal como agente antiviral. A célula pode ser in vivo ou in vitro.
[00288] São fornecidas composições que incluem um ou mais dos anticorpos que especificamente ligam gp41, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos, que são descritos aqui em um veículo. As composições podem ser preparadas em formas de dosagem unitária para administração a um indivíduo. A quantidade e o tempo de administração estão na discrição do médico do tratamento para obter os propósitos desejados. O anticorpo pode ser formulado para administração sistêmica ou local. Em um exemplo, o anticorpo que especificamente liga gp41, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, é formulado para administração parenteral, tal como administração intravenosa.
[00289] As composições para administração podem incluir uma solução do anticorpo que especificamente liga gp41, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos, dissolvida em um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma variedade aquosa. Uma variedade de veículos aquosos pode ser usada, por exemplo, salina tamponada e similares. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de substância indesejada. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis quando requeridas para aproximar condições fisiológicas tal como agentes de tamponamento e ajuste de pH, agentes de ajuste de toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, clorto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e similares. A concentração de anticorpo nestas formulações pode variar amplamente, e será selecionada primeiramente com base nos volumes fluidos, peso corporal e similares de acordo com o modo particular de administração selecionada e das necessidades do indivíduo.
[00290] Uma composição farmacêutica típica para administração intravenosa inclui cerca de 0,1 a 10 mg de anticorpo por indivíduo por dia. Dosagens de 0,1 até cerca de 100 mg por indivíduo por dia podem ser usadas, particularmente se o agente for administrado a um sítio isolado e não no sistema circulatório ou linfático, tal como em uma cavidade corporal ou em um lúmem de um órgão. Métodos atuais para a preparação de composições administráveis serão conhecidos ou evidentes para aqueles versados na técnica e são descritos em maiores detalhes em tais publicações como Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995).
[00291] Anticorpos, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos, podem ser fornecidos em forma liofilizada e reidratados com água estéril antes da administração, embora eles sejam também fornecidos em soluções estéreis de concentração conhecida. A solução de anticorpo, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, é em seguida adicionada a uma bolsa de infusão contendo cloreto de sódio a 0,9%, USP, e tipicamente administrada em uma dosagem de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal. Experiência considerável está disponível na técnica na administração de fármacos de anticorpo, que foram comercializados nos Estados Unidos desde a aprovação de RITUXAN® em 1997. Anticorpos, ou um fragmento de ligação de anticorpo dos mesmos ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos dos mesmos, podem ser administrados por infusão lenta, em vez de em um impulso ou bolo intravenoso. Em um exemplo, uma dose de carga elevada é administrada, com doses de manutenção subsequentes sendo administradas em um nível inferior. Por exemplo, uma dose de carga inicial de 4 mg/kg pode ser infudida durante um período de 90 minutos, seguida por doses de manutenção semanais durante 4 a 8 semenas de 2 mg/kg infudidos durante um período de 30 minutos se a dose anterior foi bem tolerada.
[00292] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humano específico de gp41, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, dependerá da gravidade da doença e/ou infecção e do estado geral da saúde do paciente. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo é aquela que fornece alívio subjetivo de um sintoma(s) ou uma melhora objetivamente identificável como observado pelo médico ou outro observador qualificado. Estas composições podem ser administradas em conjunção com outro agente terapêutico, ou simultanemanete ou sequencialmente.
[00293] Em uma modalidade, a administração do anticorpo, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, resulta na redução no estebelecimento de infecção por HIV e/ou redução de progressão de doença de HIV subsequente em um indivíduo. Uma redução no estabelecimento de infecção por HIV e/ou uma redução na progressão de doença subsequente HIV abrange qualquer redução estatisticamente significante na atividade de HIV. Em algumas modalidades, métodos são descritos para o tratamento de um indivíduo com uma infecção por HIV-1. Estes métodos incluem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, ou um ácido nucleico codificando o anticorpo, desse modo impedindo ou tratando a infecção pelo HIV-1.
[00294] Estudos mostraram que a taxa de transmissão de HIV de mãe para filhos é significantemente reduzida quando zidovudina é administrada às mulheres infectadas por HIV durante a gravidez o parto e ao filho após o nascimento (Connor et al., 1994 Pediatr Infect Dis J 14: 536-541). Diversos estudos de transmissão de mãe para filho de HIV demonstraram uma correlação entre a carga viral maternal na liberação e risco de transmissão por HIV para a criança. A presente invenção fornece anticorpos monoclonais humanos isolados que são de uso na diminuição de transmissão pelo HIV de mãe para filho. Desse modo, em alguns exemplos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humano específico de gp41, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, é administrada a fim de impedir a transmissão de HIV, ou diminuir o risco de transmissão de HIV, de uma mãe para um filho. Em alguns exemplos, uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, é administrada a mãe e/ou à criança durante o parto. Em outros exemplos, uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo é administrada à mãe e/ou bebê antes da amamentação a fim de impedir a transmissão viral ao bebê ou diminuir o risco de transmissão viral ao bebê. Em algumas modalidades, tanto uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo quanto uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente, tal como zidovudina, são administradas à mãe e/ou bebê.
[00295] Para qualquer aplicação, o anticorpo, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo ou um ácido nucleico codificando tais anticorpos ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, pode ser combinado com terapia antirretroviral. Fármacos antirretrovirais são amplamente classificados pela fase do ciclo de vida do retrovírus que o fármaco inibe. Os anticorpos descritos podem ser administrados em conjunção com inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeo (tais como zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudine, lamivudina, abacavir, emtricitabina, entecavir, e apricitabina), inibidores de transcriptase reversa de nucleotídeo (tal como tenofovir e adefovir), inibidores de transcriptase reversa de não nucleotídeo (tal como efavirenz, nevirapina, delavirdina, etravirina, e rilpivirina), inibidores de protease (tais como saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, fosamprenavir, atazanavir, tipranavir, e darunavir), inibidores de entrada ou fusão (tais como maraviroc e enfuvirtida), inibidores de maturação, (tal como bevirimat e vivecon), ou inibidores de amplo espectro, tais como antivirais naturais. Em alguns exemplos, um anticorpo descrito ou fragmento ativo do mesmo ou ácidos nucleicos codificando tais, é administrado em conjunção com IL-15, ou conjugado a IL-15.
[00296] Em alguns exemplos, a um indivíduo é também administrado um ou mais anticorpos adicionais que ligam glicoproteínas de HIV, tais como gp120 e gp41. Exemplos de anticorpos neutralizantes que podem ser administrados em conjunção com os anticorpos descritos podem ser encontrados na Publicação de Patente Internacional nº WO 2011/038290, publicada em 31 de Março de 2011, que é especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[00297] Administrações simples ou múltiplas das composições incluindo os anticorpos descritos aqui são administradas dependendo da dosagem e frequência como requerido e tolerado pelo paciente. Em qualquer evento, a composição deve fornecer uma quantidade suficiente de pelo menos um dos anticorpos descritos aqui para eficazmente tratar o paciente. A dosagem pode ser administrada uma vez, porém pode ser aplicada periodicamente até um resultado terapêutico ser obtido ou até os efeitos colaterais justificarem a descontinuação da terapia. Em um exemplo, a dose do anticorpo é infudida durante trinta minutos a cada dois dias. Neste exemplo, cerca de uma a cerca de dez doses podem ser administradas, tal como três ou seis doses podem ser administradas a cada dois dias. Em um outro exemplo, uma infusão contínua é administrada durante cerca de cinco a dez dias. O indivíduo pode ser tratado em intervalos regulares, tal como mensalmente, até um resultado terapêutico desejado ser obtido. Geralmente, a dose é suficiente para tratar ou melhorar os sintomas ou sinais de doença, sem produzir toxicidade inaceitável ao paciente.
[00298] Formulações parenterais de liberação controlada podem ser feitas como implantes, injeções oleosas, ou como sistemas de particulado. Para uma ampla visão de sistemas de liberação de proteína veja, Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995). Sistemas de particulado incluem microsperas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas, e nanopartículas. As microcápsulas contêm a proteína terapêutica, tal como uma citotoxina ou um fármaco, como um núcleo central. Em microesferas o terapêutico é disperso por toda a partícula. Partículas, microesferas, e microcápsulas menores do que cerca de 1 µm são geralmente referidas como nanopartículas, nanoesferas, e nanocápsulas, respectivamente. Capilares têm um diâmetro de aproximadamente 5 µm, de modo que apenas nanopartículas sejam administradas intravenosamente. Micropartículas são tipicamente em torno de 100 µm em diâmetro e são administradas subcutaneamente ou intramuscularmente. Veja, por exemplo, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, NY, pp. 219-342 (1994); e Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. Nova Iorque, NY, páginas 315 a 339, (1992).
[00299] Polímeros podem ser usados para libaração controlada por íon das composições de anticorpo descritas aqui. Várias matrizes poliméricas degradáveis e não degradáveis para uso na liberação de fármaco controlada são conhecidas na técnica (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993). Por exemplo, o copolímero de bloqueio, polaxâmero 407, existe como um líquido viscoso, porém móvel em baixas temperaturas, porém forma um gel semissólido em temperatura corporal. Ele foi mostrado ser um veículo eficaz para formulação e liberação prolongada de interleucin-2 recombinante e urease (Johnston et al., Pharm. Res. 9:425-434, 1992; e Pec et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990). Alternativamente, hidroxiapatita foi usada como um microveículo para liberação controlada de proteína (Ijntema et al., Int. J. Pharm.112:215-224, 1994). Ainda em outro aspecto, lipossomas são usados para liberação controlada bem como alvejamneto de fármaco do fármaco capsulado de lipídio (Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Numerosos sistemas adicionais para liberação controlada de proteínas terapêuticas são conhecidos (veja, Patente U.S.nº 5.055.303; Patente U.S.nº 5.188.837; Patente U.S.nº 4.235.871; Patente U.S.nº 4.501.728; Patente U.S.nº 4.837.028; Patente U.S.nº 4.957.735; Patente U.S.nº 5,019,369; Patente U.S.nº 5.055.303; Patente U.S.nº 5,514,670; Patente U.S.nº 5.413.797; Patente U.S.nº 5.268.164; Patente U.S.nº 5.004.697; Patente U.S.nº 4.902.505; Patente U.S.nº 5.506.206; Patente U.S.nº 5.271.961; Patente U.S.nº 5.254.342 e Patente U.S.nº 5.534.496).
[00300] Em alguns exemplos, ao indivíduo é administrado o DNA codificando o anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, por exemplo, o fragmento de ligação de anticorpo pode ser uma ou mais das CDRs enxertadas em uma proteína de sustentação, para fornecer produção de anticorpo in vivo, por exemplo, usando a maquinaria celular do indivíduo. Imunização por construções de ácido nucleico é bem conhecida na técnica e ensinada, por exemplo, na Patente U.S.nº 5.643.578, e Patente U.S.nº 5.593.972 e Patente U.S.nº 5.817.637. Patente U.S.nº 5.880.103 descreve diversos métodos de liberação de ácidos nucleicos codificando a um organismo. Os métodos incluem liberação lipossômica dos ácidos nucleicos. Tais métodos podem ser aplicados à produção de um anticorpo, ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, por alguém versado na técnica.
[00301] Um método de administração de ácidos nucleicos é administração direta com DNA de plasmídeo, tal como com um plasmídeo de expressão mamífera. A sequência de nucleotídeo codificando o anticorpo descrito, ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, pode ser colocada sob o controle de um promotor para aumentar a expressão.
[00302] Em outro método para usar ácidos nucleicos, um anticorpo descrito, ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo pode também ser expresso por vetores virais atenuados ou vetores bacterianos. Vírus da vacínia recombinante, vírus adeno-associado (AAV), vírus herpes, retrovírus, citomegalovírus ou outros vetores virais podem ser usados para expressar o anticorpo. Por exemplo, vetores de vacínia e protocolos úteis de métodos são descritos na Patente U.S.nº 4.722.848. BCG (Bacillus Calmette Guerin) fornece outro vetor para expressão dos anticorpos descritos (veja, Stover, Nature 351:456-460, 1991).
[00303] Em uma modalidade, um ácido nucleico codificando um anticorpo descrito, ou fragmento de ligação de anticorpos do mesmo, é introduzido diretamente em células. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser carregado em microesferas de ouro por métodos padrões e introduzido na pele por um dispositivo tal como Bio-Rad’s HELIOS Gene Gun. Os ácidos nucleicos podem ser "nus," que consistem em plasmídeos sob controle de um forte promotor.
[00304] Tipicamente, o DNA é injetado no músculo, embora ele possa também ser injetado diretamente em outros sítios. Dosagens para injeção são geralmente em torno de 0,5 µg/kg a cerca de 50 mg/kg, e tipicamente são cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 5 mg/kg (veja, por exemplo, Patente U.S.nº 5.589.466).
D. Métodos Diagnósticos e Kits
[00305] Um método é fornecido aqui para a detecção da expressão de gp41 in vitro ou in vivo. Em um exemplo, a expressão de gp41 é detectada em uma amostra biológica, e pode ser usado para detectar infecção por HIV-1 como a presença de HIV-1 em uma amostra. A amostra pode ser qualquer amostra, incluindo, porém não limitada a tecido de biópsias, autópsias e espécimes de patologia. Amostras biológicas também incluem seções de tecidos, por exemplo, seções congeladas tiradas para propósitos histológicos. Amostras biológicas também incluem fluidos corporais, tais como sangue, soro, plasma, esputo, fluido espinhal ou urina.
[00306] Em diversas modalidades, um método é fornecido para detecção de AIDS e/ou uma infecção por HIV-1 em um indivíduo. A invenção fornece um método para detecção HIV-1 em uma amostra biológica, em que o método inclui contatar uma amostra biológica com o anticorpo sob condições conducentes para a formação de um complexo imune, e detecção do complexo imune, para detectar o gp41 na amostra biológica. Em um exemplo, a detecção de gp41 na amostra indica que o indivíduo tem uma infecção por HIV. Em outro exemplo, a detecção de gp41 na amostra indica que o indivíduo tem AIDS. Em outro exemplo, de detecção de gp41 na amostra confirma um diagnóstico de AIDS e/ou uma infecção por HIV-1 em um indivíduo.
[00307] Em algumas modalidades, os anticorpos descritos são usados para testar as vacinas. Por exemplo, para testar se uma composição de vacina assume a mesma confirmação como um peptídeo de gp41. Desse modo, é fornecido um método para testar uma vacina, em que o método inclui contactar uma amostra contendo a vacina, tal como um imunógeno de gp41, com o anticorpo sob condições conducentes para a formação de um complexo imune, e detectar um complexo imune, para detectar a vacina na amostra. Em um exemplo, a detecção do complexo imune na amostra indica que o componente da vacina, tal como um imunógeno de gp41 assume uma conformação capaz de ligar o anticorpo.
[00308] Em uma modalidade, o anticorpo é diretamente rotulado com um rótulo detectável. Em outra modalidade, o anticorpo que liga gp41 (o primeiro anticorpo) é não rotulado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode ligar o anticorpo que liga o gp41 é utilizado. Como é bem conhecido por alguém versado na técnica, um segundo anticorpo é escolhido que é capaz de especificamente ligar as espécies específicas e classe do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o primeiro anticorpo é um IgG humano, então o anticorpo secundário pode ser uman anti-humano-IgG. Outras moléculas que podem ligar aos anticorpos incluem, sem limitação, Proteína A e Proteína G, ambas das quais são comercialmente disponíveis.
[00309] Rótulos adequados para o anticorpo ou anticorpos secundários são descritos acima, e incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, agentes magnéticos e materiais radioativos. Exemplos não limitantes de enzimas adequadas incluem rábano picante peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase. Exemplos não limitantes de complexos de grupo prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina. Exemplos não limitantes de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina. Um material luminescente exemplar não limitante é luminol; um agente magnético exemplar não limitante é gadolínio, e rótulos radioativos exemplares não limitantes incluem 125I, 131I, 35S ou 3H.
[00310] Os imunoensaios e métodos descritos aqui podem ser usados para diversos propósitos. Kits para detecção de um polipetídeo tipicamente incluirá um anticorpo que liga gp41, tal como qualquer um dos anticorpos descritos aqui. Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento de Fv ou um Fab é incluído no kit. Em uma outra modalidade, o anticorpo é rotulado (por exemplo, com um rótulo fluorescente, radioativo, ou enzimático).
[00311] Em uma modalidade, um kit inclui materiais instrucionais descrevendo métodos de uso. Os materiais instrucionais podem ser escritos, em uma forma eletrônica (tal como um disquete de computador ou disco compacto) ou podem ser visuais (tal como arquivos de vídeo). Os kits podem também incluir components adicionais para facilitar a aplicação particular para o qual o kit é designado. Desse modo, por exemplo, o kit pode adiconalmente conter métodos de detecção de um rótulo (tal como substratos de enzima para rótulos enzimáticos, conjuntos de filtro para detectar rótulos fluorescentes, rótulos secundários apropriados tal como anticorpos secundários, ou similares). Os kits podem adiconalmente incluir tampões e outros reagentes rotineiramente usados para a prática de um método particular. Tais kits e teores apropriados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00312] Em uma modalidade, o kit diagnóstico inclui um imunoensaio. Embora os detalhes dos imunoensaios possam variar com o formato particular empregado, o método detecção de gp41 em uma amostra biológica geralmente inclui as etapas de contato da amostra biológica com um anticorpo que especificamente reage, sob condições imunologicamente reativas, ao gp41. O anticorpo é deixado especificamente ligar-se sob condições imunologicmente reativas para formar um complexo imune, e a presença do complexo imune (anticorpo ligado) é detectada direta ou indiretamente.
E. Métodos de Identificação de Anticorpos de Interesse
[00313] São fornecidos métodos para produção de um anticorpo monoclonal que especificamente se liga a um antígeno alvo. Estes métodos incluem o isolamento de uma população de células B de memória de um indivíduo que foi exposto ao antígeno alvo, em que as células B de memória são células CD19+IgA-IgD-IgM-B. A população das células B de memória isoladas é contactada com uma quantidade eficaz de IL-21, IL-2 e ligante de CD40 (CD40L), e mRNA é isolada da população de células B de memória isoladas. Ácidos nucleicos codificando as cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis de anticorpos, são isolados das células, e as cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis são expressas. Um anticorpo monoclonal incluindo uma cadeia pesada variável e uma cadeia varável leve que especificamente se liga ao antígeno alvo é em seguida selecionado de combinações das cadeias pesadas variáveis e das cadeias leves variáveis.
[00314] Em algumas modalidades, uma população de células B de memória é isolada de uma amostra biológica de um indivíduo que foi anteriormente exposta ao antígeno de interesse. A população de células B de memória é dividida em subpopulações que são contactadas com uma quantidade eficaz de CD40L, IL-2 e IL-21 durante uma quantidade suficiente de tempo para as células B de memória sofrerem a divisão celular e produzir anticorpos. A presença ou ausência de anticorpos que especificamente se ligam ao antígeno de interesse é determinada para as subpopulações de células B de memória. É determinado que a subpopulação de células B de memória produzu anticorpos que especificamente se ligam ao antígeno de interesse, em seguida que a subpopulação é selecionada. A sequência de ácido nucleico codificando o domínio variável de cadeia pesada e leve dos anticorpos produzidos por células B de memória da subpopulação selecionada pode ser determinada, e anticorpos monoclonais contendo as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos produzidos pela subpopulação selecionada de células B de memória produzidas. Os anticorpos monoclonais são ensaiados quanto à ligação específica ao antígeno em interesse, e anticorpos que especificamente se ligam ao antígeno de interesse são selecionados, desse modo identificando um anticorpo que especificamente se liga ao antígeno de interesse.
[00315] São também fornecidos métodos para isolamento do repertório de células B específicas para um antígeno alvo de um indivíduo. Estes métodos incluem isolamento de uma população de células B de memória de um indivíduo que foi exposto ao antígeno alvo, em que as células B de memória são células CD19+IgA-IgD-IgMB. A população das células B de memória isoladas é contactada com uma quantidade eficaz de IL-21, IL-2 e CD40, e células B são selecionadas da população que expressa anticorpos que especificamente ligam o antígeno alvo. Estes métodos podem também incluir isolamento da biblioteca de ácidos nucleicos codificando as cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis de imunoglobulinas são isoladas de ácidos nucleicos. A biblioteca de cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis é em seguida expressa para isolar o repertório de células B específicas ao antígeno alvo do indivíduo.
[00316] Um repertório humoral incluindo, porém não limitado ao repertório humoral completo, para uma entidade, tal como um patógeno ou vacina, pode fornecer informação multi-dimensional (por exemplo, especificidade, afinidades, estabilidades, preferências de sequência de segmento de gene, etc) que pode ser considerada um "perfil" de uma resposta humoral do indivíduo. A quantificação destes parâmetros (Story et al., 2008 PNAS 105(46):17902-17907) pode ser usada para correlacionar com proteção de um patógeno ou falha ao proteger. Esta informação pode então informar um planejamento de vacina em um modelo iterativo, fornecer a base para um ensaio diagnóstico de múltiplos parâmetros para antígenos específicos, ou ser diretamente usada para identificar anticorpos neutralizantes simples ou múltiplos contraum determinado patógeno.
[00317] Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser caracterizados. Por exemplo, grupos de dados multiparamétricos podem ser coletados que descrevem as características, por exemplo, especificidades, afinidades, estabilidades, isótipos, preferências de sequência de segmento de gene, etc. (Story et al., 2008 PNAS 105(46):17902-17907. Em algumas modalidades representativas, não limitantes, o perfil ou conjunto de dados multiparamétrico podem ser usados para informar o planejamento de vacina em um modelo iterativo, fornecem a base para um ensaio diagnóstico de múltiplos parâmetros para antígenos específicos, ou ser diretamente usados para identificar anticorpos neutralizantes simples ou múltiplos contra um determinado patógeno.
[00318] Desse modo, os métodos descritos aqui podem ser usados para isolar um ou mais anticorpos monoclonais que especificamente ligam um antígeno alvo, e/ou podem ser usados para isolar o repertório de célula B que liga o antígeno alvo em uma amostra ou em um indivíduo. O antígeno alvo pode ser de um patógeno, incluindo vírus, parasitas, fungos e bactérias. Em algumas modalidades, patógeno é um vírus, tal como, porém não limitado a um vírus de uma das seguintes famílias: Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana (HIV); vírus de leucemia de célula T (HTLV); Picornaviridae (por exemplo, vírus da pólio, vírus da hepatite A; vírus da hepatite C; enterovírus, vírus coxsackie humano, rinovírus, ecovírus; vírus da doença pé-boca); Calciviridae (tal como linhagens que causam gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalite equina, vírus da rubéola); Flaviridae (por exemplo, vírus da dengue; vírus da febre amarela; vírus do Nilo Ocidental; vírus da encefalite St. Louis; vírus da encefalite japonesa; e outros vírus da encefalite); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus; vírus da síndrome respiratória aguda severa (SARS); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus da ébola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da parainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório (RSV)); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza); Bunyaviridae (por exemplo, vírus Hantaan; vírus Sin Nombre, vírus da febre Rift Valley; vírus bunya, flebovírus e vírus Nairo); Arena viridae (vírus da febre hemorrágica; vírus Machupo; vírus Junin); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus da hepatite B); Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (vírus da papiloma, vírus do polioma; vírus BK); Adenoviridae (mais adenovíruses); Herpesviridae (vírus da herpes simples (HSV)-1 e HSV-2; citomegalovírus (CMV); vírus Epstein-Barr (EBV); vírus varicela zoster (VZV); e outros vírus da herpes, incluindo HSV-6); Poxviridae (vírus da varíola, vírus da vacínia, vírus da sífilis); e Iridoviridae (tal como vírus da febre suína africana); Filoviridae (por exemplo, vírus da ébola; vírus Marburg); Caliciviridae (por exemplo, vírus Norwalk) e vírus não classificados (por exemplo, os agentes etiológicos de encefalopatia espongiforme, o agente de hepatite delta (pensado ser um satélite defeituoso do vírus da hepatite B); e astrovírus).
[00319] Em outras modalidades, o antígeno alvo é um antígeno de uma bactéria, tal como, porém não limitada à Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (tais como M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Streptococcus de grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, ou Actinomyces israelli.
[00320] Em outras modalidades, o antígeno é de um fungo, tal como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, ou Candida albicans. Em outras modalidades, o antígeno é de um parasita, tal como, porém não limitado a Plasmodium falciparum ou Toxoplasma gondii.
[00321] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno de câncer. O câncer pode ser um tumor sólido ou um câncer hematogênico. Em exemplos particulares, o tumor sólido é um sarcoma ou um carcinoma, tal como fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, ou outro sarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, malignidade linfoide, câncer pancreático, câncer de mama, cânceres de pulmão, câncer ovariano, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma celular escamoso, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma do ducto de bílis, coriocarcinoma, tumoe de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma de bexiga, ou um tumor de CNS (tal como um glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma ou retinoblastoma).
[00322] Em alguns exemplos, o câncer hematogênico é uma leucemia, tal como uma leucemia aguda (tal como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielogenosa aguda e mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia); uma leucemia crônica (tal como leucemia crônica mielocítica (granulocítica), leucemia crônica mielogenosa, e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin (formas de grau elevado e indolentes), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, síndroem mielodisplásica, leucemia de célula capilar ou mielodisplasia.
[00323] Antígenos de tumor são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, antígeno carcinoembriônico (CEA), gonadotropina coriônica humana (HCG), alfa-fetoproteína (AFP), AFP reativa de lectina, (AFP-L3), tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), RU1, RU2 (AS), carboxila esterase intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, antígeno específico de próstata (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, Her2/neu, survivina e telomerase, antígeno 1 de tumor de carcinoma de próstata (PCTA-1), antígeno associado ao melanoma (MAGE), ELF2M, neutrofil elastase, efrinB2 e CD22. As moléculas de domínio CH2 ou CH3 podem também ligar quaisquer proteínas relacionadas com câncer, tal IGF-I, IGF-II, IGR-IR ou mesotelina. Antígenos associados com tumor adicional são fornecidos na tabela abaixo:
Tumores exemplares e seus antígenos de tumor
Figure img0001
[00324] Em algumas modalidades, o antígeno é autoantígeno. O antígeno pode ser aum antígeno associado com uma doença autoimune, tal como artrite reumatoide, oligoartrite juvnil, artrite induzida por colágeno, artrite induzida por adjuvante, síndrome de Sjögren, esclerose múltipla, encefalomielite autoimune experimental, doença do intestino inflamatória (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa), atrofia gástrica autoimune, pênfigo vulgar, psoríase, vitiligo, diabetes do tipo 1, diabetes não obesa, miastenia grave, doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, colangite esclerosante, sialodenite esclerosante, lúpus eritematoso sistêmico, trombocitopenia púrpura autoimune, síndrome de Goodpasture, doença de Addison, esclerose sistêmica, polimiosite, dermatomiosite, anemia hemolítica autoimmune ou anemia perniciosa.
Isolamento de células B
[00325] Em diversas modalidades, uma população de células incluindo células B de memória é obtida de um indivíduo. Tipicamente, uma população substancialmente pura de células B de memória (tal como células CD19+ IgA-, IgD-, IgM- B) é isolada. Tipicamente, a população isolada de células é enriquecida por células B de memória.
[00326] A população de células incluindo células B de memória pode ser isolada de uma amostra biológica obtida de um indivíduo de interesse. Amostras biológicas exemplares para uso com os presentes métodos incluem medula óssea, baço, linfonodo, sangue, por exemplo, sangue periférico. Entretanto, a amostra biológica pode também incluir qualquer outra fonte da qual as células B de memória podem ser isoladas, incluindo: tecido, biópsia, espécimes cirúrgicos, aspirados de agulha fina, material de autópsia, e similares. Em diversas modalidades, a amostra biológica é obtida de um indivíduo que foi exposto a um antígeno de interesse. O indivíduo pode ser qualquer animal, preferivelmente um mamífero ou um humano. O indivíduo pode ter uma doença ou uma condição incluindo um tumor, uma doença infecciosa, ou uma doença autoimune, ou foram imunizados. Em certos aspectos, o indivíduo pode recuperar-se ou sobreviver de uma doença ou uma condição tal como um tumor, uma doença infecciosa, ou uma doença imune. Em outros aspectos, o indivíduo pode estar sob ou após prevenção e tratamento para uma doença ou uma condição, tal como terapia ou terapia de doença por infecção, ou vacinação. Por exemplo, o indivíduo tem ou foi exposto a um antígeno que é um agente infeccioso, um antígeno de tumor, uma célula de tumor, um alérgeno ou um autoantígeno. Tal agente infeccioso pode ser quaisquer vírus patogênicos, bactéricas patogênicas, fungos, protozoários, parasitas multicelulares, e proteínas aberrantes tais como príons, bem como ácidos nucleicos ou antígenos derivados a partir destes. Um alérgeno pode ser qualquer antígeno não parasítico capaz de estimular uma reação de hipersensibilidade do tipo I em indivíduos, tal como muitos antígenos ambientais comuns.
[00327] Classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) pode ser usada para classificar (isolar) células, tal como populações de células B de memória, contatando as células com um anticorpo apropriadamente rotulado e classificando as células com base na ligação do anticorpo rotulado à célula. Em uma modalidade, diversosanticorpos (tal como anticorpos que ligam CD19, IgA, IgD, e/ou IgM) e classificação de FACS pode ser usada para produzir populações substancialmente purificadas de células B de memória. Estes métodos são conhecidos na técnica, e protocolos exemplares são descritos aqui.
[00328] FACS emprega uma pluralidade de canais de cor, e canais de detecção de dispersão de luz de baixo ângulo e obtusa, e canais de impedância, entre outros níveis mais sofisticados de detecção, para separar ou classificar células rotuladas ou não rotuladas com um marcador detectável. Qualquer técnica de FACS pode ser empregada contanto que não seja prejudicial à viabilidade das células desejadas. (Para métodos exemplares de FACS, veja a Patente U.S.nº 5.061.620). Em um exemplo, um classificador celular FACSARIA III® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) é usado. Anticorpos podem ser conjugados à biotina, que em seguida pode ser removida com avidina ou estreptavidina ligada a um suporte, ou fluorocromos, que podem ser usados com um FACS, para possibilitar a separação celular. Entretanto, outras técnicas de diferenciação de eficácia podem ser empregadas para purificar e isolar populações desejadas de células. As técnicas de separação devem maximizar a retenção de viabilidade da fração das células a serem coletadas. A técnica particular empregada, de fato, dependerá da eficiência de separação, citotoxicidade do método, a facilidade e velocidade de separação, e qual o equipamento e/ou experiência técnica é requerida.
[00329] Os procedimentos de separação incluem separação magnética, usando contas magnéticas revestidas com anticorpo, cromatografia de afinidade, agentes citotóxicos, ou unidos a um anticorpo monoclonal ou usados em conjunção com complemento, e "paniculação," que utiliza um anticorpo monoclonal ligado a uma matriz sólida, ou outra técnica conveniente. Anticorpos ligados a contas magnéticas e outras matrizes sólidas, tal como contas de agarose, contas de poliestireno, membranas de fibra ocas e placas de Petri plásticas, provêem separação direta. Células que são ligadas pelo anticorpo podem ser removidas de uma suspensão celular simplesmente por separação física do suporte sólido de uma suspensão celular. As condições exatas e duração de incubação das células com os anticorpos ligados à fase sólida dependerão de diversos fatores específicos para o sistema empregado. A seleção de condições apropriadas, entretanto, inclui-se bem na experiência na técnica.
[00330] As células soltas em seguida podem ser coletadas (quando seleção negativa quanto à ligação às imunocontas está sendo usada) ou removidas com tampão fisiológico (quando seleção positiva é benigna usada quanto à ligação às imunocontas) após suficiente tempo ter sido permitido para as células expressando um marcador de interesse (por exemplo, CD19) para ligarem-se aos anticorpos ligados à fase sólida. As células ligadas são em seguida separadas da fase sólida por qualquer método apropriado, dependendo principalmente da natureza da fase sólida e do anticorpo empregado. Após um primeiro ciclo de seleção usando contas de magneto, um segundo ciclo (e ciclos adicionais) pode ser usado para também isolar uma população celular de interesse.
[00331] Em algumas modalidades, células expressando CD19 são separadas das outras células por seleção positiva para a expressão de CD19 de superfície celular. Em um exemplo, não limitante, específico, células CD19+ são positivamente selecionadas usando FACS por rotulagem de células CD19+ com um anticorpo específico de CD19 conjugado a um marcador detectável, e em seguida usando FACS para selecionar células rotuladas com o anticorpo conjugado ao marcador detectável. Anticorpos específicos de CD19 conjugados a marcadores detectáveis são conhecidos e são comercialmente disponíveis, por exemplo, de BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ. Em outro exemplo não limitante, específico, células CD19+ são positivamente selecionadas por separação de conta magnética, em que contas magnéticas são revestidas com anticorpos monoclonais reativos de CD19, e células que são capturadas pelas imunocontas reativas de CD19 são coletadas. As células CD19+ são em seguida removidas das contas magnéticas.
[00332] Em outras modalidades, células que não expressam IgA sobre a superfície celular são separadas de outras células pela ausência de expressão de IgA de superfície celular. Em um exemplo não limitante, específico, células IgA- são negativamente selecionadas usando FACS por rotulagem de células de IgA+ com um anticorpo específico de IgA conjugado a um marcador detectável, e em seguida usando FACS para selecionar células que não são rotuladas com o anticorpo específico de IgA conjugado ao marcador detectável. Anticorpos específicos de IgA conjugados a marcadores detectáveis são conhecidos e são comercialmente disponíveis, por exemplo, de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA. Em outro exemplo não limitante específico, células de IgA- são negativamente selecionadas por separação de conta magnética, em que as contas magnéticas são revestidas com anticorpo monoclonal reativo a IgA e células que não são capturadas pelas imunocontas são coletadas.
[00333] Em outras modalidades, células que não expressam IgD sobre a superfície celular são separadas de outras células pela ausência de expressão de superfície celular de IgD. Em um exemplo não limitante, específico, células IgD- são negativamente selecionadas usando FACS por rotulagem de células de IgD+ com um anticorpo específico de IgD conjugado a um marcador detectável, e em seguida usando FACS para selecionar células que não são rotuladas com o anticorpo específico de IgD conjugado ao marcador detectável. Anticorpos específicos de IgD conjugado a marcadores detectáveis são conhecidos e são comercialmente disponíveis, por exemplo, de BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ. Em outro exemplo não limitante específico, células IgD- são negativamente selecionadas por separação de conta magnética, em que as contas magnéticas são revestidas com anticorpo monoclonal reativo a IgD e células que não são capturadas pelas imunocontas são coletadas.
[00334] Em outras modalidades, células que não expressam IgM sobre a superfície celular são separadas de outras células pela ausência de expressão de superfície celular de IgM. Em um exemplo não limitante, específico, células IgM- são negativamente selecionadas usando FACS por rotulagem de células de IgM+ com um anticorpo específico de IgM conjugado a um marcador detectável, e em seguida usando FACS para selecionar células que não são rotuladas com o anticorpo específico de IgM conjugado ao marcador detectável. Anticorpos específicos de IgM conjugados a marcadores detectáveis são conhecidos e são comercialmente disponíveis, por exemplo, de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA. Em outro exemplo não limitante específico, células IgM- são negativamente selecionadas por separação de conta magnética, em que as contas magnéticas são revestidas com anticorpo monoclonal reativo a IgM e as células que não são capturadas pelas imunocontas são coletadas.
[00335] Em outras modalidades, células que expressam CD19, porém não expressam IgA, IgD ou IgM sobre a superfície celular são separadas de outras células por seleção positiva quanto à expressão de superfície de célula CD19 e seleção negativa quanto à expressão de IgA, IgD e IgM sobre a superfície celular. Usando tais métodos, células CD19+IgA-IgD-IgM- podem ser coletadas. Em um exemplo não limitante, específico, células CD19+IgA-IgD-IgM- são selecionadas usando FACS por rotulagem de células com quatro anticorpos específicos para CD19, IgA, IgD, e IgM, cada dos quais é conjugado a um marcador detectável que pode ser diferencialmente detectado usando análise de FACS. FACS é em seguida usado para classificar células CD19+IgA-IgD-IgM- . Alguém versado na técnica pode facilmente usar FACS e estabelecer portas apropriadas para isolar células CD19+IgA-IgD-IgM-.
Contatar células B com CD40L, IL-2 e IL-21
[00336] Em diversas modalidades, células B de memória isoladas são contatas com CD40L, IL-2 e IL-21 durante um período suficiente de tempo para as células B de memória sofrerem divisão celular e produzirem anticorpos. Em alguma população célula B de memória isolada é contatada com CD40L, IL-2 e IL-21 por incubação da população isolada de células B de memória com CD40L, IL-2 e IL-21 durante cerca de 10 a cerca de 15 dias. Em modalidades adicionais, a população isolada de células B de memória é incubada com CD40L, IL-2 e IL-21 durante cerca de 13 dias. Em diversas modalidades, as células B são contatadas com a CD40L, IL-2 e IL-21 durante um período suficiente de tempo para as células B de memória sofrerem divisão celular e produzirem anticorpos. Neste contexto, um período suficiente de tempo pode ser de pelo menos 5 dias, tal como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 dias, por exemplo, de 5-22, 5-21, 10-20, 10-15, 11-16, ou 13-15 dias. As células B podem ser contatadas com a CD40L, IL-2 e IL-21 na presença de meio de crescimento, tal como Meio de Dulbecco Modificado de Iscove, (IMDM) com 10% de Soro Bovino Fetal, ou outro meio de crescimento de cultura de tecido para uso em cultura de células B. A pessoa versada na técnica é familiar com tal meio.
[00337] CD40L (também conhecido como ligante de CD40 ou CD154) é uma proteína que é primariamente expressa, por exemplo, sobre células T ativadas, porém é também encontrada em forma solúvel. CD40L liga-se a CD40 sobre a superfície celular de células B, um evento de ligação que pode resultar na ativação de células B, diferenciação de células B maduras em células plasmáticas e células de memória, e produção de anticorpos. A pessoa versada na técnica é familiar com CD40L, e CD40L é comercialmente disponível (veja, por exemplo, Life Technologies Cat. No. PHP0024). Em algumas modalidades, células B são contatadas com CD40L por cultura das células B com uma linhagem celular que expressa CD40L, tal como uma linhagem de célula alimentadora CD40L. As linhagens de célula alimentadora CD40L são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kershaw et al., Cancer Res., 61: 7920-7924, 2001). As concentrações exemplares de CD40L para uso nos métodos descritos incluem 1-2000 unidades internacionais por mililitro, tal como 100 unidades internacionais por mililitro. Sequências de ácido nucleico e polipeptídeo exemplares para CD40L humana estão disponíveis no NCBI website como o Número de Acessão GENBANK® NM_000074.2 e Número de Acessão GENBANK® NP_000065.1, respectivamente, (como disponíveis em 13 de junho de 2012) que são incorporados aqui por referência.
[00338] IL-2 é comercialmente disponível (veja, por exemplo, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. No. PHP0021). Sequências de ácido nucleico e polipeptídeo exemplares para IL-2 humana estão disponíveis no NCBI website como o Número de Acessão GENBANK® NM_000586.3 e Número de Acessão GENBANK® NP_000577.2, respectivamente (como disponíveis em 13 de junho de 2012) que são incorporados aqui por referência. As concentrações exemplares de IL-2 para uso nos métodos descritos incluem 10-200 unidades internacionais por mililitro, tal como 100 unidades internacionais por mililitro.
[00339] IL-21 é também comercialmente disponível (veja, por exemplo, Life Technologies, Grand Island, NY, Cat. No. PHC0211). Sequências de ácido nucleico e polipeptídeo exemplares para IL-21 humana são disponíveis no website NCBI como GENBANK® Acesso No. NM021803 e GENBANK® Acesso nº AF254069, respectivamente. Estas entradas de GENBANK® são incorporadas por referência aqui. Em diversas modalidades, as células B isoladas são contactadas com cerca de 10 a 100 ng/ml de IL-21, tal como cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 ng/ml IL-21, por exemplo, as células B de memória podem ser contactadas com 10-100, 20-90, 30-80, 40-70, 40- 60 ou 45-55 ng/ml de IL-21. Concentrações exemplares de IL-2 para uso nos métodos descritos incluem 5 a 500 ng/ml de IL-21, tal como 50 ng/ml de IL-21.
[00340] Em diversas modalidades, contatar as células B de memória com a combinação de CD40L, IL-2 e IL21 fornece sinergia, isto é, a quantidade de divisão celular e produção de anticorpo pelas células B de memória contactadas com estas três moléculas é maior em combinação do que a soma do efeito daquele resultado de uso das moléculas separadamente.
Seleção de Células B que produzem o Anticorpo de interesse
[00341] Em algumas modalidades, as subpopulações de células B que foram contactadas com CD40L, IL-2 e IL-21 durante um período de tempo suficiente para as células B de memória sofrerem divisão celular e produzir anticorpos são ensaiadas quanto à expressão de anticorpos que especificamente se ligam ao antígeno de interesse. Métodos para determinação se um anticorpo liga a um antígeno de interesse são familiares para a pessoa versada na técnica, e incluem ELISA e ensaios de neutralização.
[00342] Três classes gerais representativas de métodos de análise que podem ser empregadas (a) ensaios de captura de anticorpo; (b) ensaios de captura de antígeno; e (c) análises funcionais. Combinações podem também ser empregadas. Em ensaios de captura de anticorpo, o antígeno pode ser ligado a uma fase sólida, anticorpos monoclonais a ser testados são deixados ligar ao antígeno, anticorpos não ligados são removidos por lavagem, e em seguida os anticorpos ligados são detectados, por exemplo, por um reagente secundário tal como um anticorpo rotulado que especificamente reconhece o anticorpo. Para um ensaio de captura de antígeno, o antígeno pode ser diretamente rotulado. Em uma modalidade, anticorpos monoclonais a serem testados podem ser ligados a uma fase sólida e em seguida reagidos com o antígeno rotulado opcionalmente. Alternativamente, o complex de anticorpo-antígeno pode ser deixado formar por imunoprecipitação antes da ligação do anticorpo monoclonal a ser testado quanto a uma fase sólida. Visto que os complexos de anticorpo-antígeno são ligados à fase sólida, antígeno não ligado pode ser removido por lavagem e positivos podem ser identificados por detecção de antígeno.
[00343] Várias análises funcionais existem para identificação de anticorpos monoclonais com atividades desejadas. Exemplos incluem um ensaio de neutralização de vírus; o ensaio de atividade agonística e ensaio de bloqueio; ensaio de adesão de monocamada de ceratinócito e o ensaio de resposta de linfócito misto (MLR) (Werther et al. J. Immunol. 157:4986-4995 (1996)); ensaios de inibição de crescimento de célula de tumor (como descrito na Publicação de PCT nº WO 89/06692, por exemplo); celular-1-citoxicidade dependente de anticorpo (ADCC) e ensaios de citoxicidade mediada por complemento (CDC) (Patente U.S.5.500.362); e ensaios de hematopoiese (veja, WO 95/27062). A classe/subclasse dos anticorpos pode ser determinada, por exemplo, por ensaios de difusão dupla; captura de anticorpo em placas revestidas por antígeno; e/ou captura de anticorpo em anticorpos anti-IgG.
[00344] Para analisar os anticorpos que se ligam a um epitopo particular no antígeno de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado. Alternativamente, mapeamento de epitopo, por exemplo, como descrito em Champe et al. (J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)) pode ser realizado para determinar se o anticorpo liga um epitopo de interesse.
[00345] Se for determinado que a subpopulação de células B de memória produz anticorpos que especificamente se ligam ao antígeno de interesse, então etapas adicionais podem ser consideradas para isolar um anticorpo monoclonal que especificamente se liga ao antígeno de interesse da subpopulação. Por exemplo, a região variável da cadeia pesada e a cadeia leve dos genes de imunoglobulina das células B na subpopulação são isoladas, anticorpos monoclonais contendo a região variável da cadeia pesada edas cadeias leves são gerados, e a acidez de ligação específica dos anticorpos monoclonais quanto ao antígeno de interesse é ensaiada (por exemplo, por ELISA ou ensaio de neutralização).
[00346] Em certos aspectos, informação de sequências de ácido nucleico pode ser obtida. A obtenção da informação de sequência de ácido nucleico pode incluir a determinação da sequência de ácido nucleico. Para determinação das sequências de ácido nucleico, quaisquer métodos de sequenciamento de ácido nucleico conhecidos na técnica podem ser usados, incluindo sequenciamento de DNA de produtividade elevada. Exemplos não limitantes de métodos de sequenciamento de produtividade elevada incluem sequenciamentopor-síntese (por exemplo, sequenciamento 454), sequenciamento-porligação, sequenciamento-por-hibridização, sequenciamento de DNA de molécula simples, sequenciamento de polony múltiplo, sequenciamento de nanoporo, ou uma combinação dos mesmos.
[00347] Em uma outra modalidade o método pode incluir (a) isolamento de RNA de uma subpopulação de células B; (b) transcrição do referido RNA em cDNA; (c) amplificação do referido cDNA referido primeiro lago de moléculas de DNA usando uma primeira mistura de oligonucleotídeos incluindo pelo menos dois oligonucleotídeos capazes de amplificar regiões de codificação de domínio variável de cadeia pesada; (d) amplificação do referido cDNA segundo referido lago de moléculas de DNA usando uma segunda mistura de oligonucleotídeos incluindo pelo menos dois oligonucleotídeos capazes de amplificar as regiões de codificação de domínio variável de cadeia leve; e opcionalmente (e) ligação de espécimes do primeiro e segundo lado de moléculas de DNA um ou outro por um DNA codificando a referida região ligadora (LR).
[00348] A clonagem de regiões variáveis é um procedimento padrão geralmente conhecido na técnica e foi descrita para várias espécies, incluindo humanos, não humanos, primatas, camundongo, coelho, e galinha. Para revisão, veja Barbas III et al. (eds.), Phage Display--A Laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, 2001, em particular, o capítulo Andris-Widhopf et al., Generation of Antibody Libraries: PCR Amplification and Assembly of Light- and Heavy-chain Coding Sequences, a esse respeito. Andris-Widhopf et al. descrevem sequências de oligonucleotídeos capazes de amplificar regiões de codificação de região variável (regiões de codificação de VR), preferivelmente têm regiões de codificação de domínio variável de cadeia pesada ou regiões de codificação de domínio variável de cadeia leve. Além disso, oligonucleotídeos capazes de amplificar regiões de codificação de domínio variável de cadeia pesada ou regiões de codificação de domínio variável de cadeia leve, preferivelmente human regiões de codificação de domínio variável de cadeia pesada ou regiões de codificação de domínio variável de cadeia leve, podem ser designados pelo técnico comparando-se sequências conhecidas de regiões de codificação de anticorpo que são disponíveis de banco de dados tais como, por exemplo, Immunogenetics (imgt.cines.fr/), Kabat (Kabatdatabase.com), e Vbase (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), e identificando as squências de consenso adequadas para planejamento de iniciador. Oligonucleotídeos capazes de amplificar regiões de codificação de domínio variável de cadeia pesada ou regiões de codificação de domínio variável de cadeia leve, em que os iniciadores podem incluir sítios de restrição adequados para a clonagem dos produtos amplificados e em que os oligonucleotídeos também codificam uma região ligadora são conhecidos na técnica. Estratégias adicionais para amplificar e clonar domínios variáveis são descritas em Sblattero e Bradbury (1998) Immunotechnology 3:271- 278 e Weitkamp et al. (2003), J. Immunol. Meth. 275:223-237.
[00349] Em alguns exemplos, a região variável da cadeia pesada e a cadeia leve dos genes imunoglobulina podem ser amplificadas por RT-PCR usando métodos conhecidos (veja, por exemplo, Tiller et al., J. Immunological Methods, 329:112-124, 2008). O produto de PCR incluindo o DNA de região de VH ou VL pode ser clonado nos vetores de expressão de Igγ1, Igκ e Igλ correspondentes, que podem ser usados para cotransfectar em uma linhagem celular permissiva (tal como células 293T) para expressão e produção de anticorpo monoclonal. Em alguns exemplos, IgG1 de tamanho natural pode ser purificado usando procedimentos padrões, e em seguida testada quanto à ligação ao antígeno de interesse (por exemplo, usando ELISA ou ensaio de neutralização). A pessoa versada na técnica entenderá que os vetores de expressão podem ser expressos em qualquer linhagem celular permissiva ou indivíduo para teste (por exemplo, em uma linhagem celular mamífera, uma linhagem celular de planta, ou usar um vetor de expressão viral para expressão em uma linhagem celular ou organismo. Além disso, as proteínas incluindo a sequência codificada pelo DNA de região de VH ou VL podem ser produzidas sinteticamente para teste.
Diversas Modalidades Envolvendo Métodos de Identificação de Anticorpos de Interesse
[00350] Diversas modalidades incluem um método para produção de um anticorpo monoclonal que especificamente se liga a um antígeno alvo, em que o método inclui: (a) isolamento de uma população de células B de memória de um indivíduo que foi exposto ao antígeno alvo, em que as células B de memória são células CD19+IgA-IgD-IgM-B; (b) contato da população isolada de células B de memória com uma quantidade eficaz de IL-21, IL-2 e CD40; (c) isolamento de moléculas de aminoácido da população isolada de células B de memória; (d) amplificação dos ácidos nucleicos codificando as cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis dos ácidos nucleicos; (e) expressão das cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis dos ácidos nucleicos para produzir moléculas de anticorpo das cadeias pesadas variáveis e as cadeias leves variáveis; e (f) seleção do anticorpo monoclonal que especificamente se liga ao antígeno alvo.
[00351] Algumas modalidades incluem um método para isolamento do repertório de células B específicas quanto ao um antígeno alvo de um indivíduo, incluindo: (a) isolamento de uma população de células B de memória de um indivíduo que foi exposto ao antígeno alvo, em que as células B de memória são células CD19+IgA-IgD-IgM-B; (b) contato da população isolada de células B de memória com uma quantidade eficaz de IL-21, IL-2 e CD40; e (c) seleção de células B da população que expressa anticorpos que especificamente ligam o antígeno alvo, desse modo isolamento do repertório de células B específicas para o antígeno alvo do indivíduo.
[00352] Em diversas modalidades, o antígeno alvo é um antígeno de um patógeno, tal como um vírus, um fungo, um parasita, ou uma bactéria. O antígeno pode ser de um vírus, por exemplo, vírus da imunodeficiência humana (HIV), tal como HIV-1. Em algumas modalidades, o antígeno pode ser HIV-1 gp41. Em algumas modalidades em que o antígeno alvo é um antígeno de HIV, o indivíduo é aquele indivíduo infectado com um HIV, tal como HIV-1. Em outras modalidades, o antígeno alvo é um antígeno de câncer. Em algumas tais modalidades, o indivíduo é um indivíduo com câncer. Ainda em outras modalidades, o antígeno alvo é um autoantígeno. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno alvo é uma toxina, tal como uma toxina bacteriana, por exemplo, toxina de antrax. Em modalidades adicionais, o antígeno alvo é um antígeno incluído em uma vacina. A pessoa versada na técnica apreciará que o antígeno alvo pode ser qualquer antígeno ao qual um indivíduo é capaz de produzir uma resposta de célula B que resulta na produção de células B de memória que produzem anticorpo que especificamente se liga ao antígeno alvo.
[00353] Em algumas modalidades, a população isolada de células B de memória é representativa do repertório de células B no indivíduo que é específica para o antígeno alvo.
[00354] Em algumas modalidades dos métodos descritos, o contato da população isolada de células B de memória com CD40L inclui incubar as células B de memória isoladas com uma célula alimentadora que expressa o CD40L.
[00355] Em modalidades adicionais dos métodos descritos, contactar a população isolada de células B de memória isoladas com CD40L, IL-2 e IL-21 inclui incubação da população isolada de células B de memória com CD40L, IL-2 e IL-21 durante cerca de 10 a cerca de 15 dias, tal como cerca de 13 dias.
EXEMPLOS
[00356] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar as características particulares de certas modalidades, porém o escopo das reivindicações não deve ser limitado por aqueles aspectos exemplificados.
Exemplo 1 Isolamento e Caracterização de Anticorpos Monoclonais Específicos de MPER Amplamente Neutralizantes
[00357] Este exemplo ilustra o isolamento de caracterização de anticorpos de ligação específica a gp41 de HIV-1 de um indivíduo infectado com HIV-1.
[00358] Resumo. Caracterização de anticorpos monoclonais humanos forneceu discernimento considerável em mecanismos de ampla neutralização de HIV-1. Este exemplo descreveu o isolamento de um anticorpo específico de (MPER) de região externa proximal da membrana de gp41 de HIV-1, denominado 10E8, que neutraliza ~98% das viroses testadas. Uma análise de soros de 78 doadores infectados por HIV-1 saudáveis demonstrou que 27% continham de anticorpos específicos de MPER e 8% continham especificidades semelhantes a 10E8. Ao contrário de outros anticorpos de MPER neutralizantes, 10E8 não se ligou a fosfolipídeos, não foi autorreativo, e ligou-se a Env de superfície celular. A estrutura de 10E8 em complexo com o MPER completo revelou um sítio de vulnerabilidade incluindo uma extensão estreita de resíduos hidrofóbicos de gp41 altamente conservados e um Arg/Lys crítico exatamente antes da região de transmembrana. Análise de variantes de HIV-1 resistentes confirmou a importância destes resíduos para neutralização. O MPER altamente conservado é um alvo de anticorpos neutralizantes não autorreativos, potentes, que sugerem que vacinas de HIV-1 devem ter em vista induzir os anticorpos para esta região de Env de HIV-1.
[00359] Introdução. Indução de uma resposta ao anticorpo capaz de neutralizar diversos isolados de HIV-1 é um objetivo crítico para vacinas que protegem contra infecção de HIV-1. Potencialmente o maior obstáculo para a obtenção deste objetivo é a extraordinária diversidade que se desenvolve no alvo de neutralização de anticorpos, a glicoproteína de envelope (Env). Embora as vacinas tenham desse modo, deixado de induzir respostas de anticorpo amplamente neutralizantes, existem exemplos de pacientes cronicamente infectados com soros que neutralizam isolados de HIV-1 altamente diversos. Estes indivíduos fornecem evidência de que é possível para a resposta de anticorpo humano neutralizar linhagens altamente diversas de HIV-1, embora os mecanismos pelos quais tais respostas são induzidas ou mediadas permaneçam incompletamente entendidos (Haynes et al., Nat Biotechnol 30, 423-433, 2012; Walker et al., Curr Opin Immunol 22, 358-366, 2010).
[00360] Recentemente, isolamento e caracterização de anticorpos monoclonais humanos de células de pacientes cronicamente infectados forneceram avanços consideráveis no entendimento das especificidades e mecanismos subjacentes às respostas amplamente neutralizantes ao HIV-1. Env existe no vírion e superfície de célula infectada como um trímero de heterodímeros preparados de subunidades de gp120 e gp41s. Durante algum tempo, apenas um pequeno número de anticorpos monoclonais amplamente neutralizantes (mAbs) foi isolado, consistindo em um anticorpo que se liga ao sítio de ligação de CD4 em gp120 (b12), aquele que liga uma configuração de glicano sobre o domínio externo de gp120 (2G12) e três que ligam a região externa proximal à membrana (MPER) em gp41 (2F5, Z13e1, e 4E10; Zwick et al., J Virol 75, 10892-10905, 2001; Burton et al., Science 266, 1024-1027, 1994; Muster et al,. J Virol 67, 6642-6647, 1993). Mais recentemente, anticorpos consideravelmente mais amplos e potentes foram descobertos, os quais têm em vista o sítio de ligação de CD4 da proteína envelope (para a qual VRC01 é um protótipo; Bonsignori et al,. J Virol 86, 4688-4692, 2012; Wu et al, Science 333, 1593-1602, 2011; Scheid et al., Science 333, 1633-1637, 2011; Wu et al., Science 329, 856-861, 2010) e glicano contendo regiões das regiões V1/V2 e V3 de gp120 (para o qual PG9 e PGT128 são protótipos; Walker et al., PLoS Pathog 6, e1001028, 2010; Walker et al., Nature 477, 466-470, 2011; Bonsignori et al., J Virol 85, 9998- 10009, 2011; Walker et al,. Science 326, 285-289, 2009). As especificidades destes novos anticorpos são o fornecimento de importante informação com respeito aos alvos de antígeno no Env ao qual a resposta imune humoral pode ser direcionada para mediar ampla e potente neutralização. Entretanto, evidência para estas especificidades em muitos pacientes cronicamente infectados dentro do coorte é deficiente, sugerindo que ampla e potente neutralização pode ser mediada por outras especificidades.
[00361] Este exemplo descreve o isolamento de um MPER amplo e potente de mAb humano específico de gp41, 10E8, de um indivíduo infectado por HIV-1 com títulos de neutralização elevados. 10E8 é entre os anticorpos mais amplos e potentes, desse modo, bastante descritos, e carece de muitas das características anteriormente pensadas limitar a utilidade de anticorpos específicos de MPER em vacinas ou terapias passivas, incluindo ligação de lipídeo e autorreatividade. Além disso, a estrutura cristalina de 10E8, juntamente com estudos de ligação bioquímica, demonstram que a amplitude de 10E8 é mediada por seu modo único do reconhecimento de um sítio de vulnerabilidade estruturalmente conservado dentro do MPER de gp41.
[00362] Isolamento e propriedades de neutralização de 10E8. Para entender as especificidades e características de ligação que são subjacentes a uma resposta de anticorpo amplamente neutralizante foram desenvolvidas técnicas que permitiram o isolamento de anticorpos monoclonais humanos sem conhecimento anterior de especificidade (Walker et al,. Science 326, 285-289, 2009). Soro de um doador, N152, exibiu amplitude e potência neutralizantes no topo de 1% do coorte contra um painel de 20 pseudovírus de clado híbrido (FIG. 17; Doria-Rose et al., J Virol 84, 1631-1636, 2010). Células B de memória CD19+IgM-IgD-IgA de sangue periférico deste paciente foram classificadas e expandidas durante 13 dias com IL-2, IL-21, e células alimentadoras expressando ligante de CD40. Os sobrenadantes de ~16,500 culturas de células B foram avalisados e os genes de IgG de cavidades com atividade de neutralização foram clonados e reexpressos (Tiller et al., Journal of immunological methods 329, 112-124, 2008 ) e dois novos anticorpos (10E8 e 7H6) foram isolados.
[00363] Análise de sequência de nucleotídeo de DNA codificando 10E8 e 7H6 revelou que ambos eram anticorpos de IgG3 e eram variantes somáticas do mesmo clone de IgG. Estes anticorpos foram derivados de genes de linha germinativa de IGHV3-15*05 e IGLV3- 19*01, e foram altamente somaticamente mutados em genes variáveis de ambas cadeia pesada (21%) e cadeia leve de lambda (14%) em comparação com a linha germinativa. Estes anticorpos também possuíam uma alça de região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (CDR H3) composta de 22 aminoácidos (FIG. 1A). As cadeias pesadas de 10E8 e 7H6 foram idênticas e existiam apenas duas diferenças de resíduo na cadeia leve (FIG. 6).
[00364] Para avaliar a atividade de neutralização das variantes clonal, elas foram inicialmente testadas em comparação a 5 pseudoviroses Env (FIG. 17A), e 10E8 de mAb foi selecionado para outro estudo. Para determinar se a atividade de neutralização de 10E8 foi representativa da especificidade de neutralização total presente em soro de doador de N152 de paciente, o painel de neutralização foi expandido para 20 pseudoviroses Env, e 10E8 foi testado em paralelo com soro de doador de N152. Embora existam algumas similaridades no padrão de neutralização de variantes altamente resistentes, uma correlação da IC50 de neutralização de 10E8 de mAb e ID50 de soro de N152 não obteve significância estatística (p=0,11; as figuras 7 e 17B). Esta descoberta sugere que embora 10E8 possa desempenhar um importante papel, a amplitude total de neutralização por soro de N152 é provavelmente mediada por um amálgama de anticorpos semelhantes a 10E8 ou outros.
[00365] Para comparar a potência e amplitude de neutralização de 10E8 com outros anticorpos anti-HIV-1 amplamente neutralizantes, 10E8 foi em seguida testado em um painel de 181 pseudovírus de Env de isolado em paralelo com 4E10, 2F5, VRC01, NIH45-46, 3BNC117, PG9, e PG16 (As figuras 1B e as figuras 17C-17F). Em um IC50 abaixo de 50 µg/ml, 10E8 neutralizou 98% das pseudoviroses testadas em comparação com 98% para 4E10 e 89% para VRC01. Entretanto, em uma IC50 abaixo de 1 µg/ml, 10E8 neutralizou 72% das viroses testadas em comparação com 37% para 4E10. Os valores IC50 da média e média geométrica para 10E8 foram abaixo de 1 ug/ml. Desse modo, 10E8 media ampla e potente neutralização contra uma grande faixa de viroses e a potência é comparável a alguns dos melhores anticorpos monoclonais disponíveis.
[00366] Especificidade e ligação de epitopo de 10E8. Para mapear o epitopo do anticorpo 10E8, ligação a diferentes sub-regiões de Env por ensaio de imunoabsorvente ligado à enzima foi testada (ELISA). 10E8 ligado fortemente a gp140, gp41, e ao peptídeo de MPER específico de 4E10, porém não a gp120 (FIG. 2A). Para também mapear o epitopo de 10E8 dentro do MPER, a ligação de 10E8 a peptídeos em sobreposição que correspondem às especificidades de 2F5 (656-671), Z13e1 (666-677), e 4E10 (671-683) foi examinada. 10E8 ligado ao MPER total e aos peptídeos específicos de 4E10, porém não peptídeos específicos de 2F5 ou Z13e1. Dentro do epitopo de 4E10, quando um peptídeo com uma terminação C truncada foi testado, 4E10.19 (671-680), ligação de 10E8 foi enfraquecida consideravelmente, sugerindo que os três aminoácidos terminais do MPER, Tyr681, Ile682, e Arg683, foram cruciais para a ligação de 10E8 (FIG. 8A). Consistente com estes resultados, apenas o MPER total e peptídeos específicos de 4E10 bloquearam a neutralização mediada por 10E8 do vírus C1 quimérico, que contém o Env de HIV-2 com o MPER de HIV-1 (FIG. 8B). Empregados juntos, estes dados sugerem que o epitopo de 10E8 mínimo é localizado dentro dos resíduos 671-683 do MPER, embora contato adicional à terminação amino do MPER não possa ser excluído.
[00367] Para mais precisamente mapear o epitopo de 10E8, um painel de peptídeos mutantes de alanina examinando os resíduos de MPER 671-683 foi usado para bloquear a neutralização de 10E8 do vírus C1 quimérico em um ensaio de TZM-bl (FIG. 2B; Brunel et al., J Virol 80, 1680-1687, 2006). Para estes ensaios, o peptídeo de base foi o peptídeo de MPER de 4E10.22 (CNWFDITNWLWYIRKKK; SEQ ID NO: 14) com as substituições de alanina indicadas. Os peptídeos de MPER com substituições de alanina a Trp672, Phe673 ou Thr676 não bloqueou a neutralização de 4E10 ou 10E8, sugerindo que estes resíduos são críticos para ligação a ambos 4E10 e 10E8. Resíduo Asn671 e resíduo Arg683, ambos os quais não são requeridos para a ligação a 4E10, foram constatados serem críticos para a ligação e neutralização de 10E8 (As figuras 2B e 18). A capacidade de 10E8 para neutralizar pseudoviroses de HIV-1JR2 com substituições de alanina em resíduos de MPER 660-683 foi também testada (FIG. 19). Consistente com os efeitos de substituições de alanina na ligação de peptídeo, resíduos Asn671 e Arg683 foram críticos para neutralização de 10E8, porém não 4E10. Substituições de alanina individuais nos resíduos 671-673, 680 e 683 resultaram em sensibilidade de neutralização reduzida a 10E8 mais evidente no nível IC90 em vez do nível de IC50. Embora o mecanismo para este fenômeno não seja claro, um efeito similar foi observado anteriormente quando mutações de MPER causam resistência parcial a 4E10 (Zwick et al., J Virol 79, 1252-1261, 2005). Empregados juntos, estes resultados sugeriram que 10E8 reconheceu um novo epitopo, que se sobrepõe aos conhecidos epitopos de 4E10 e Z13e1, porém difere em uma dependência crítica sobre a ligação a Asn671 e Arg683, o último resíduo do MPER.
[00368] Se a potência de neutralização maior de 10E8 em comparação com outros anticorpos de MPER foi um resultado de maior afinidade de ligação ao MPER, foi em seguida investigado. Captura de um peptídeo biotinilado que abrange o MPER total (656- 683) para um chip de ressonância de plasmônio de superfície, permitiu os cinéticos de ligação de Fabs 10E8, 2F5 e 4E10 serem examinados. Ao contrário de sua potência de maior neutralização, o KD de 10E8 para este peptídeo de MPER foi mais fraco do que aquele de 2F5 e 4E10; 17 nM para 10E8 versus 3,8 nM para 2F5 e 0,74 nM para 4E10 (FIG. 9). Portanto, a afinidade de 10E8 para o MPER em um formato de peptídeo solúvel não explicou sua maior potência de neutralização em comparação com outros anticorpos específicos de MPER.
[00369] Prevalência de anticorpos semelhantes ao 10E8. A prevalência de anticorpos de neutralização específicos de MPER e semelhantes a 10E8 no coorte de doadores infectados por HIV-1 foi em seguida investigada. A seguir, 78 soros dos coortes com uma neutralização ID50>100 contra pelo menos um pseudovírus em um minipainel de 5 vírus foram selecionados (Doria-Rose et al., J Virol 84, 1631-1636, 2010). O tempo médio desde o diagnóstico destes doadores foi de 13,5 anos, a contagem de CD4 mediana foi de 557 células/l, RNA de HIV plasmático mediano - 5573 cópias/ml, e eles não estavam recebendo antirretrovirais. Neutralização contra a quimera C1 de HIV-2/HIV-1 foi testada (FIG. 20). De 78 soros, 21 exibiram atividade de neutralização contra o vírus C1 de HIV-2/HIV-1 (FIG. 21). Para mapear a região que foi alvejada por estes soros, a neutralização foi medida usando 7 quimeras de HIV-2/HIV-1 contendo subdomínios do MPER (FIG. 20; Gray et al,. J Virol 81, 6187-6196, 2007). Dos 21 soros com atividade de neutralização contra o MPER inteiro, 8 exibiram um padrão de neutralização similar àquele observado para 10E8, que vinculou a neutralização de apenas aquelas viroses quiméricas de HIV-2/HIV-1 que continham o resíduo terminal do MPER Arg683 (C4, C4GW e C8; FIG. 21). Para também confirmar estes resultados, peptídeos correspondentes às diferentes porções do MPER para bloquear a neutralização de soros da quimera C1 de HIV2/HIV-1 foram usados (FIG. 22). Dos 8 soros constatados terem um padrão semelhante a 10E8 com base na neutralização das quimeras, 3 foram bloqueados por peptídeos consistentes com a atividade semelhante a 10E8. Um adicional de 3 dos 8 soros semelhantes a 10E8 foram bloqueados por peptídeos em um padrão consistente com uma combinação de anticorpos semelhantes a 10E8 e Z13e1. Os 6 pacientes cujos soros tiveram atividade semelhante a 10E8 não diferiram dos restantes 72 pacientes com respeito ao curso clínico ou neutralização de HIV (legenda; FIG. 10, legenda). Em geral, 27% dos soros de paciente testado exibiram atividade de neutralização antiMPER. Esta prevalência é consideravelmente maior do que a observada em trabalho anterior, possivelmente relacionada com a seleção de doadores com atividade de neutralização conhecida (Gray et al., J Virol 83, 8925-8937, 2009; Tomaras et al,. J Virol 85, 11502- 11519, 2011; Morris et al., PLoS ONE 6, e23532, 2011; Gray et al,. J Virol 83, 11265-11274, 2009). Além disso, 8% dos soros testados tiveram anticorpos semelhantes ao 10E8 (FIG. 10), sugerindo que os anticorpos semelhantes ao 10E8 não são raros.
[00370] Análise de autorreatividade de 10E8. Uma propriedade comum aos mAbs de MPER anteriormente caracterizados 2F5 e 4E10 é que eles interagem com autoantígenos (Haynes et al., Science 308, 1906-1908, 2005). Além disso, ligação a ambos, a membrana celular e o trímero Env é acreditada ser importante para a neutralização ideal por estes anticorpos e esta autorreatividade pode ser um obstáculo à eliciação de similares anticorpos por uma vacina (Haynes et al., Science 308, 1906-1908, 2005; Alam et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 20234-20239, 2009). Análise de ressonância de plasmônio de superfície mostrou que 10E8 não se liga a fosfolipídeos aniônicos, tais como lipossomas de fosfatidil colina-cardiolipina (PC-CLP) e fosfatidil colina-fosfatidil serina (PC-PS) (FIG. 3A). 10E8 também não se ligou a células epiteliais HEP-2, ao contrário de 2F5 e 4E10 que se ligou em um padrão citoplásmico e nuclear (FIG. 3B). Adicionalmente, 10E8 não se ligou a autoantígenos, tal como antígenos de síndrome de Sjogren A e B, antígeno de Smith, ribonucleoproteína, antígeno de esclerodermia 70, antígeno Jo1, centrômero B e histona (FIG. 23). Empregados juntos, estes resultados sugerem que 10E8, ao contrário de outros anticorpos de MPER, não é autorreativo.
[00371] Acessibilidade de vírion de 10E8. Os anticorpos de 2F5 e 4E10 mostraram ligar-se relativamente mal ao pico de HIV-1 Env na superfície de células infectadas ou a vírions livres de célula, e reagem mais eficientemente após comprometimento de Env do receptor de CD4 (Chakrabarti et al., J Virol 85, 8217-8226, 2011). Ligação aos picos de Env de tamanho natural, clivados em células transfectadas por HIVJRFL foi medida (FIG. 11A). Embora 10E8 ligue-se menos eficientemente do que outros anticorpos tal como VRC01 ou F105, onde a acessibilidade não é um resultado, ele ligou-se mais eficientemente do que 2F5 ou 4E10. Ao contrário dos resultados de substituição de alanina, uma mutação na região de 4E10 (F673S) em picos de Env de HIVJRFL de tamanho natural realçou a ligação de 10E8 embora o mecanismo permaneça não claro. Uma mutação na região de 2F5 (K665E) não teve nenhuma influência sobre a ligação de 10E8. Estes dados sugerem que 10E8 tem acesso modestamente maior ao epitopo de MPER sobre a superfície celular do que 2F5 ou 4E10.
[00372] Para avaliar a ligação a vírus livre de célula, os vírions foram incubados com anticorpo, removido o anticorpo solto, e a neutralização testada (Chakrabarti et al., J Virol 85, 8217-8226, 2011; Frey et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 3739-3744, 2008; Rathinakumar et al., J Virol 86, 1820-1831, 2012). Durante a lavagem, anticorpos que não podem acessar seu alvo de Env sobre vírions livres serão amplamente removidos e, portanto, a neutralização será diminuída. Como um controle, a neutralização do isolado de HXBc2 não foi diminuída por lavagem, por que a região de MPER é acessível neste isolado adaptado em laboratório (Chakrabarti et al., J Virol 85, 8217-8226, 2011). A lavagem também teve pequeno impacto sobre a neutralização de JRFL por VRC01. Consistente com trabalho anterior, neutralização de 2F5 e 4E10 da maioria dos isolados de vírus testados foi substancialmente diminuída após a lavagem (FIG. 11B). Ao contrário de 2F5 e 4E10, a lavagem teve um menor efeito sobre a neutralização de 10E8 da maioria de viroses testadas, como medido pela área sob a curva ou análise da quantidade de mudança em neutralização em uma concentração inibitória fixada (FIG. 11C). Embora 10E8 não seja totalmente capaz de acessar seu epitopo no pico viral nativo similarmente a VRC01, sob as condições mais experimentais testadas foi mais capaz de acessar seu epitopo do que 2F5 ou 4E10.
[00373] Estrutura de complexo de 10E8-gp41. Para fornecer um entendimento de nível atômico da interação de 10E8 com HIV-1, o fragmento de ligação de antígeno (Fab) de 10E8 em complexo com a peptídeo abrangendo o MPER de gp41 de 28 resíduos inteiro (resíduos 656-683) foi cristalizado. Cristais monocíclicos difratados para resolução de 2.1 Å, e solução de estrutura e refinamento para Rcryst = 18,01% (Rfree = 21.76%) revelaram dois complexos na unidade assimétrica (até agora referidos como complexos 1 e 2) (FIG. 24). Em geral, 10E8 ligado a uma face do peptídeo de MPER, que formou duas hélices, cada 15-20 Å de comprimento e orientadas 100⁰ com relação uma à outra (FIG. 4A). Densidade eletrônica foi observada para o MPER inteiro, variando de Asn656-Arg683 (Leu660-Arg683 para o complexo 2), com o mais alto grau de densidade ordenada observado do resíduo Trp666 dentro de uma hélice de terminal N através de Arg683 da hélice de terminal C (FIG. 12). A análise de ângulos diédricos de cadeia principal (FIG. 25) indicou que a α-hélice de terminal N estende-se do resíduo Asn657 a Ala667, retesa-se em uma hélice 310 entre os resíduos Ser668 e Leu669, antes de retornar aos resíduos Trp670 e Asn671. A α-hélice de terminal C, tamponada por Asn671, inicia no resíduo Trp672 e estende-se ao resíduo Arg683, o resíduo final do MPER (FIG. 4A,B).
[00374] O anticorpo 10E8 contata o MPER de gp41 primariamente através de sua cadeia pesada, embora os contatos cruciais sejam também mediados pela CDR L3 de cadeia leve (As figuras 4C e 26- 28). Três locos predominantes de interação são observados entre o anticorpo e gp41 (As figuras 29-30): Um entre os resíduos da ponta da alça de CDR H3 e a ponta de uma hélice de terminal C do peptídeo, um segundo entre resíduos da alça de CDR H2 e resíduos da região de articulação do peptídeo, e um terceiro na conexão das três alças de CDR de cadeia pesada e a CDR L3 de cadeia leve, que formam uma fenda hidrofóbica que retém resíduos do início da hélice de terminal C do MPER (FIG. 4B).
[00375] Interface de 10E8-gp41. Para complementar os resultados observados para a mutagênese do epitopo de 10E8 altamente conservado (As figuras 4D e 18), cada resíduo do parátopo de 10E8, como determinado da estrutura de cristal, foi individualmente mutado à alanina e as resultantes 25 variantes de 10E8 avaliadas quanto à afinidade para um peptídeo de MPER solúvel. Em geral, os efeitos mais pronunciados das mutações de alanina na afinidade de ligação de 10E8 para um peptídeo de MPER solúvel ocorreram dentro dos resíduos da alça de CDR H3, embora mutações dentro da fenda hidrofóbica também tenham mostrado efeito substancial (As figuras 4E, 13 e 31). Resíduos de 10E8 identificados por varredura de alanina como crítica para a interação com gp41 estendido da fenda todo o caminho para a ponta da CDR H3 (FIG. 4E) e foram refletidos por um estiramento correspondente de resíduos de gp41 que substancialmente afetou a ligação de 10E8 quando mutado à alanina (FIG. 4F).
[00376] O mesmo painel de mutações de alanina de 10E8 foi testado quanto à potência de neutralização contra um painel de cinco pseudoviroses-Env que incluíram bambas as viroses Tier 1 e Tier 2 (FIG. 32). Similares aos dados de ligação, resíduos da CDR H3 de 10E8 tiveram efeitos dramáticos sobre a neutralização, como fizeram resíduos da fenda hidrofóbica (FIG. 4g). Geralmente, KDs de mutantes de parátopo correlacionados com neutralização (FIG. 14). Interações de cadeia principal (sobre ambos 10E8 e gp41) também contribuem para a interface, especialmente entre a CDR H2 de 10E8 e a região de articulação do MPER, embora estes sejam silenciosos em análises de varredura de alanina. Em geral, 10E8 utiliza uma faixa estreita de resíduos (~20 x 5 Å) que estende-se da CDR H1 e H2 e estende-se ao longo da maior parte da CDR H3 para reconhecer uma série de resíduos gp41 hidrofóbicos altamente conservados, e um resíduo carregado crítico, Arg/Lys683, que ocorre exatamente antes da região de transmembrana (FIG. 4F,H).
[00377] Um determinante de neutralização de gp41 conservada. Diversas estruturas de anticorpos de neutralização em complexo com o MPER de gp41 foram reportadas anteriormente, incluindo aquelas para anticorpos 2F5, Z13e1 e 4E10 (FIG. 15A; Julien et al., J Mol Biol 384, 377-392, 2008; Cardoso et al., J Mol Biol 365, 1533-1544, 2007; Cardoso et al., Immunity 22, 163-173, 2005; Ofek et al., J Virol 78, 10724-10737, 2004; Pejchal et al., J Virol 83, 8451-8462, 2009). O MPER adota conformações de alça divergentes, quando ligado por 2F5 e Z13e1 e uma α-hélice quando ligada por 4E10. Comparação de epitopos 2F5, Z13e1, e 4E10 com gp41 ligado a 10E8 revelou que apenas o epitopo de 4E10 tem estrutura secundária similar, com sobreposição produzindo um RMSD de 2,49 Å para todos os átomos de resíduos 671-683 e 0,98 Å para os átomos de cadeia principal (As figuras 15B e 33).
[00378] Para comparar o reconhecimento de 10E8 e 4E10, seus ângulos de epitopo métodos foram examinados. Como mostrado nas figuras 15C-15F, o alinhamento da hélice de MPER reconhecida coloca 10E8 e 4E10 em posições espaciais gerais similares. As orientações relativas da hélice reconhecida e as cadeias pesadas e leves dos dois anticorpos, entretanto, diferem dramaticamente. Com 10E8, a hélice de terminal C é perpendicular ao plano seccionando cadeias pesadas e leves (As figuras 15C,E); com 4E10, a hélice reconhecida é na interface entre cadeias pesadas e leves (FIG. 15D,F). Talvez relevante a isto, 10E8 utiliza alças de CDR quase exclusivamente em seu reconhecimento de gp41, ao mesmo tempo em que 4E10 incorpora substanciais interações de β-filamento com gp41 na interface entre as cadeias pesadas e leves.
[00379] Os modos divergentes de reconhecimento de 10E8 e 4E10 da hélice de MPER de terminal C conservada resultam em uma diferença substancial na proporção da face helicoidal reconhecida: 10E8 contata ligeiramente um terço da face helicoidal, ao mesmo tempo em que 4E10 contata acima da metade (FIG. 15G, 15H e 34- 35). A menor superfície de contato de 10E8 pode fornecer uma explicação para o reconhecimento reduzido de superfícies de lipídio por 10E8 versus 4E10 – fornecendo uma explicação com base na estrutura potencial para autorreatividade reduzida de 10E8.
[00380] Variação de Sequência e neutralização de 10E8. Para colocar os dados de especificidade e estruturais no contexto de variação conhecido do MPER, sequências virais com resistência à neutralização por 10E8 foram analisadas (FIG. 5A). Das 183 viroses testadas, apenas três foram altamente resistentes a 10E8 com IC50 >50 μg/ml. Cada destas viroses teve substituições nas posições encontradas para realizar a neutralização por varredura de alanina (Asn671, Trp672, Phe673, e Trp680). Vírus plasmático do paciente N152, de quem 10E8 foi clonado, é também provavelmente resistente à neutralização mediada por 10E8 (Wu et al., J Virol 86, 5844-5856, 2012). Análise de sequência de RNA viral plasmático revelou raras substituições nas posições Trp680 e Lys/Arg683 (FIG. 5A). Estes resíduos são tipicamente altamente conservados com variação apenas ocorrendo em 1,17% de 3,730 sequências Env de HIV na Los Alamos Database (hiv.lanl.gov). Quando as substituições para as 3 viroses resistentes e as viroses de paciente foram colocadas na base do vírus JR2 sensível, substituições em Asn671Thr, Trp672Leu, e Phe673Leu tiveram um efeito modesto sobre a IC50 porém elevaram a IC80 acima de 20 g/ml. Na análise estrutural, contatos diretos com 10E8 não foram observados na posição 671 sugerindo que os efeitos sobre a neutralização de substituições Thr ou Ala nesta posição são mediados por efeitos conformacionais ou outros dentro de gp41. A combinação de Trp672Leu e Phe673Leu conferiu resistência de alto nível nos níveis IC50 e IC80. Mudanças que correspondem ao vírus circulante dominante do paciente tiveram um efeito similar. Embora Lys/Arg683Gln sozinhos tenham conferido resistência no nível IC80, juntos Trp680Arg e Lys/Arg683Gln resultaram em maior resistência a 10E8 (FIG. 5A). Quando empregados junto com a análise do parátopo de 10E8, estes dados sugerem que além de Trp672, Phe673, e Trp680 encontrados no epitopo de 4E10, o resíduo ligado a 10E8 adicional Lys/Arg683 é crítico para neutralização. Além de outras diferenças em ligação com base nas análises estruturais mencionadas acima, é possível que a potência adicional de 10E8 em comparação com 4E10 junto a variantes virais de ocorrência natural possa ser mediada por meio de ligação de resíduos altamente conservados Trp680 e Lys/Arg683 que interagem diretamente com a CDRH3 de 10E8.
[00381] Discussão. 10E8 é um amplo e potente anticorpo de neutralização com importantes implicações para esforços para estimular tais anticorpos com vacinas. Anticorpos de MPER anteriores foram um pouco limitados em potência, e tiveram uma capacidade mais limitada para acessar MPER em Env de isolados primários. Além disso, ligação de lipídeo e autorreatividade foram acreditadas serem características de anticorpos de MPER e importantes obstáculos para sua eliciação por vacinas. Entretanto, 10E8 carece de cada destas características. Além disso, anticorpos com uma especificidade similar não foram raros no coorte cronicamente infectados. Isto sugere que anticorpos semelhantes ao 10E8 não foram deletados do repertório por causa da autorreatividade. Estes resultados também sugerem que anticorpos semelhantes ao 10E8 podem ser elevados em uma maior fração de pessoas não infectadas por HIV recebendo uma vacina designada para eliciar estes anticorpos sem os defeitos de célula B de infecção de HIV crônica. Planejamento de tal vacina provavelmente requerirá não apenas apresentação de um epitopo de 10E8 intacto, porém também uso de uma plataforma suficientemente imunogênica para controlar a evolução de anticorpos semelhantes ao 10E8.
[00382] As extraordinárias amplitude e potência de 10E8 parecem ser mediadas por sua capacidade de se ligar a resíduos altamente conservados dentro de MPER. Embora o epitopo de 10E8 sobreponha-se àqueles de mAbs conhecidos, tal como 4E10, ele difere em reconhecimento de superfície, ângulo de aproximação, ligação de lipídeo, e autorreatividade. Varredura de alanina, análise estrutural, e análise de parátopo, cada qual indica que 10E8 faz contato crucial com resíduos altamente conservados Trp672, Phe673, Trp676 e Lys/Arg683. A amplitude extraordinária de alguns mAbs potentes, por exemplo, que se ligam ao sítio de ligação de CD4, é acreditada ser conferida pelo bloqueio de um sítio funcionalmente importante que é crítico para entrada viral. Se 10E8 prejudica a função de Env ou simplesmente age por ligação de resíduos altamente conservados, permanece a ser determinado. Todavia, a amplitude e potência de 10E8 demonstra um sítio conservado de vulnerabilidade de gp41 (FIG. 5B) que é um importante antígeno alvo para neutralização de HIV e que provavelmente reanima o interesse em planejamento de vacina de HIV com base em MPER.
Métodos Sumário de Métodos.
[00383] Células CD19+IgM-IgD-IgA- B de sangue periférico foram classificadas por citometria de fluxo, semeadas em 4 células por cavidade, e expandidas com citocinas e células alimentadoras. Sobrenadantes de cultura de célula B foram selecionados por microneutralização contra pseudovírus HIVMN.03 e HIVBal.26. Genes IgG de cavidades com atividade de neutralização foram clonados e novamente expressos em células 293T. Amplitude de atividade de neutralização foi confirmada contra um painel de pseudovírus Env de isolado 181. A especificidade foi determinada por peptídeos de varredura de alanina e pseudovírus Env mutante. Ligação de lipídio e autorreatividade de 10E8 foram medidos por ressonância de plasmônio de superfície, imunofluorescência indireta de células HEp-2 e disposições de conta. Ligação de envelopes de HIV em 293 células transfectadas foi detectada por citometria de fluxo. Seguindo préincubação com anticorpo, o impacto de lavagem de vírions antes de infectar células TZM-bl foi usado para medir acesso ao MPER viral. A frequência de soros de HIV-1 + com uma dada especificidade foi medida pela habilidade para neutralizar quimeras de HIV-2/HIV-1 contendo porções do MPER. Cocristalização bem sucedida de 10E8 com gp41 foi obtida quando um peptídeo abrangeu o MPER gp41 de resíduo 28 inteiro (resíduos 656-683). A determinação de estrutura revelou dois complexos na unidade assimétrica de cristal. Análises de diferenças entre os dois complexos possibilitaram interações essenciais serem discernidas. O parátopo, como definido por resíduos no anticorpo que mostrou acessibilidade de solvente reduzida quando complexados por gp41, foi submetido à varredura de alanina compreensiva, com cada dos 25 mutantes de alaninas 10E8 avaliado por SPR para reconhecimento de gp41 e por neutralização em um painel de 5 viroses pseudotipadas. A sequência do RNA viral plasmática de paciente foi derivada usando RT-PCR de diluição limitante.
[00384] Pacientes de estudo. Células mononucleares de sangue periférico e plasma (PBMC) foram selecionadas dos pacientes infectados por HIV-1 inscritos no Instituto Nacional de Saúde sob um protocolo clínico aprovado pela Junta Examinadora de Inspeção Investigacional no Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID-IRB). Todos os participantes assinados informaram consentimento aprovado pelo NIAID-IRB. Os critérios para inscrição foram como segue: tendo uma carga viral detectável, uma contagem de célula T CD4 estável acima de 400 células/μl, sendo diagnosticada com infecção por HIV durante pelo menos 4 anos, e tratamento de off ARV durante pelo menos 5 dias. Com base nas localizações de corrente e residências anteriores, todos os pacientes foram presumidos ser infectados com vírus de clado B. N152 doador foi selecionado para classificação de célula B e geração de anticorpo porque sua atividade de neutralização de soro está entre a mais potente e ampla no grupo. Ele é um progressor lento com base nos critérios descritos anteriormente (Migueles e outro, Immunity 29, 1009- 1021, 2008). No momento de leucaferese, ele foi infectado com HIV-1 durante 20 anos, com contagens de célula T CD4 de 325 células/μl, valores de RNA de HIV-1 plasmático de 3.811 cópias/ml e não estava em tratamento antirretroviral.
[00385] Manchamento de célula B de memória, classificação e clonagem de anticorpo. Manchamento e classificação de célula simples de células B de memória foram realizados como segue. PBMCs de N152 doador infectado por HIV-1 foram manchados com coquetel de anticorpo consistindo em anti-CD19-PE-Cy7 (BD Bioscience), IgA-APC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), IgD-FITC (BD Pharmingen), e IgM-PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) a 4ºC no escuro durante 30 min. As células foram em seguida lavadas com 10 ml de tampão de PBS-BSA e novamente suspensas em 500 μl de PBS-BSA. Células B de memória de 66.000 CD19+IgA-IgD-IgM foram classificadas usando um classificador de célula FACSAria III (Becton Dickinson) e novamente suspensas em meio IMDM com 10 % de FBS contendo 100 U/ml de IL-2, 50 ng/ml de IL-21 e 1x105 /ml de células alimentadoras 3T3-msCD40L irradiadas (Kershaw e outro, Cancer Res 61, 7920-7924, 2001). Células B foram semeadas em placas de microtitulação de 384 cavidades em uma densidade de 4 células/cavidade em um volume final de 50 μl. Após 13 dias de incubação, 40 μl de sobrenadantes de cultura de cada cavidade foram coletados e selecionados para atividade de neutralização usando um ensaio de microneutralização de rendimento elevado contra HIV-1MN.03 e HIV-1Bal.26. Células B em cada cavidade foram lisadas com 20 μl de tampão de lise contendo 0,25 μl de inibidor de RNase (New England Biolabs Inc.), 0,3 μl de Tris a 1 M, pH8 (Quality Biological Inc.) e 19,45 µl de H2O tratados por DEPC. As placas com células B foram armazenadas a -80 °C.
[00386] A região variável da cadeia pesada e a cadeia leve do gene imunoglobulina foram amplificadas por RT-PCR das cavidades que resultaram positivas em ambos os ensaios de neutralização HIV-1MN.03 e HIV-1Bal.26. O produto de cDNA foi usado como molde na reação de PCR. A fim de amplificar a imunoglobulina de gene elevadamente somaticamente mutado, dois conjuntos de iniciadores como descrito anteriormente (Tiller e outro, Journal of immunological methods 329, 112-124, 2008) foram usados em dois PCRs independentes. Um conjunto de iniciadores consistiu nos iniciadores dianteiros e os iniciadores reversos específicos para a região líder e região constante de IgH, Igκ ou Igλ, respectivamente. O outro conjunto de iniciadores consistiu nas misturas de iniciador dianteiro específicas para FWR1 e respectivos iniciadores reversos específicas para os genes IgH, Igκ e Igλ J. Todos os PCRs foram realizados em placas de PCR de 96 cavidades em um volume total de 50 μl contendo 20 nM cada iniciador ou mistura de iniciador, 10 nM cada de dNTP (Invitrogen), 10 µl de 5x solução Q (Qiagen) e 1,2 U de HotStar Taq DNA polimerase (Qiagen). Da reação positiva de PCRs, lagos do DNA de região VH ou VL foram ligados a um vetor pCR2.1-Topo-TA (Invitrogen) para sequenciamento antes da clonagem no correspondente vetor de expressão Igγ1, Igκ e Igλ. 10 µg de plasmídeos de cadeia leve e pesada, clonados da mesma cavidade e combinados em todos os pares de cadeia leve e pesada possíveis, foram misturados com 40 µl de FuGENE 6 (Roche) em 1500 µl de DMEM (Gibco) e cotransfectados em 293 células T. O IgG de tamanho natural foi purificado usando uma coluna A de proteína recombinante (GE Healthcare).
[00387] Ensaios de neutralização. Neutralização dos anticorpos monoclonais foi medida usando infecção por pseudovírus Env de HIV1 de único ciclo de células TZM-bl (Li e outro, J Virol 79, 10108-10125, 2005). Pseudovírus Env de HIV-1 foram gerados por cotransfecção de células 293T com esqueleto de pSG3ΔEnv contendo um gene repórter de luciferase e um segundo plasmídeo que expressaram Env de HIV1. Em 72 horas de pós-transfecção, os sobrenadantes contendo pseudovírus foram colhidos e congelados a -80°C até outro uso. No ensaio de neutralização, 10 µl de soro de paciente 5 vezes serialmente diluído ou mAb foram incubados com 40 µl de pseudovírus em uma placa de 96 cavidades a 37 °C durante 30 minutos antes da adição de células TZM-bl. Após 2 dias de incubação, as células foram lisadas e a infectividade viral foi quantificada medindo a atividade de luciferase com um luminômetro Victor Light (Perkin Elmer). A concentração inibitória a 50 % (IC50) foi calculada como a concentração de anticorpo que reduziu a infecção por 50 %. Epitopos de anticorpo foram mapeados usando pseudovírus mutante de alanina JR2 MPER de HIV-1 em um ensaio de TZM-bl.
[00388] Neutralização de quimera de HIV-2/HIV-1. Quimera C1 de HIV-2/HIV-1 (vírus de HIV-2 7312A com MPER de gp41 de HIV-1; Gray e outro, J Virol 81, 6187-6196, 2007 ) foi usado no ensaio de competição. Uma concentração fixa de peptídeo de MPER foi incubada com anticorpo 2F5, 4E10, Z13e1 ou 10E8 serialmente diluído a 37 °C durante 30 minutos antes de incubação com quimera C1 de HIV-2/HIV-1. Vírus 7312A de HIV-2 de tipo selvagem foi usado como um controle. Mapeamento de epitopo de anticorpo foi completado adicionando 10 µl de mAb de 10E8 a 5 µl de diluições seriais de peptídeo 4E10 ou seus mutantes de alanina a 37 °C durante 30 minutos antes da adição de quimera C1 de HIV-2/HIV-1. O grau ao qual neutralização mediada por anticorpo bloqueado por peptídeos foi calculada como a quantidade de mudança no valor de IC50 do anticorpo na presença de mutantes de alanina de 4E10 comparado ao peptídeo de tipo selvagem. A região de ligação precisa no MPER alvejado por anticorpos ou soro de paciente foi determinada usando as quimeras de HIV-2/HIV-1 contendo diferentes porções de MPER de HIV-1, tais como C1 (Env de HIV-2 com MPER de HIV-1), C1C (Env de HIV-2 com MPER de clado C), C3 (Env de HIV-2 com epitopo de 2F5), C4 (Env de HIV-2 com epitopo de 4E10), C6 (Env de HIV-2 com NWFDIT de epitopo de 4E10 curto), C7 (Env de HIV-2 com ALDKWA de epitopo de 2F5 curto) e C8 (Env de HIV-2 com ambos epitopos de Z13 e 4E10). Soro de paciente diluído 5 vezes ou mAb foi incubado com quimera em uma placa de 96 cavidades a 37 °C durante 30 minutos antes da adição de células TZM-bl. As especificidades nos soros de paciente foram confirmadas bloqueando a neutralização da quimera C1 com 25 g/ml de 2F5, 4E10, MPER, Bal.V3, peptídeo de controle, ou 50 g/ml de peptídeo de Z13.
[00389] Ensaios ELISA. Cada antígeno a 2 μg/ml foi revestido em placas de 96 cavidades durante a noite a 4°C. Placas foram bloqueadas com tampão de BLOTTO (PBS, 1 % de FBS, 5 % de leite sem gordura) durante uma hora em temperatura ambiente (RT), seguidas por incubação com anticorpo serialmente diluído em tampão de rompimento (PBS, 5 % de FBS, 2 % de BSA, 1 % de Tween-20) durante uma hora em temperatura ambiente. Diluição a 1:10.000 de anticorpo IgG antihumano de cabra conjugado à rábano picante peroxidase (HRP) foi adicionada durante uma hora em temperatura ambiente. Placas foram lavadas entre cada etapa com 0,2 % de Tween 20 em PBS. Placas foram desenvolvidas usando 3,3´,5,5´- tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) e lidas a 450 nm.
[00390] Ensaios de autorreatividade. Ligação de 10E8 ao fosfolipídeo foi medida por SPR conduzido em um instrumento BIACORE® 3000 e análises de dados foram realizadas usando o software BIAevaluation® 4.1 (BIACORE®) como descrito anteriormente (Alam e outro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 20234- 20239, 2009). Lipossomas contendo fosfolipídeo foram capturados em um chip sensor BIACORE® L1, que usa um ligador de alquila para lipídeos de ancoramento. Antes de capturar os lipídeos, a superfície do chip L1 foi limpa com uma injeção de 60-s de octil-β-Dglucopiranosídeo a 40 mM, a 100 µl/minuto, e o chip e fluídicos foram lavados com excesso de tampão para remover quaisquer traços de detergente. mAbs foram em seguida injetados a 100 µg/ml em uma taxa de fluxo de 30 µl/min. Após cada injeção de Ab, a superfície foi novamente limpa com octil β-D-glucopiranosídeo, e injeções de 5-s de cada HCl a 5 mM, em seguida NaOH a 5 mM, para limpar qualquer proteína aderente do chip.
[00391] Reatividade às células epiteliais humanas negativas de HIV-1 (HEp-2) foi determinada por imunofluorescência indireta em slides usando Evans Blue como uma contra mancha e OgG antihumano de cabra conjugado a FITC (Zeus Scientific, Raritan N.J.; Haynes e outro, Science 308, 1906-1908, 2005). Slides foram fotografados em um microscópio de fluorescência Nikon Optiphot. Em relação à FIG. 3B, slides de codacromo foram tomados de cada ligação de MAb a células Hep-2 em uma exposição de 32 segundos, e os slides analisados em formato digital. O teste Luminex AtheNA MultiLyte ANA (Wampole Laboratories, Princeton, NJ) foi usado para testar para reatividade de MAb ao SSA/Ro, SS-B/La, Sm, ribonucleoproteína (RNP), Jo-1, DNA de filamento duplo (dsDNA), centrômero B, e histona e foi realizado pelas especificações do fabricante e como anteriormente descrito (Haynes e outro, Science 308, 1906-1908, 2005). Concentrações de MAb ensaiadas foram 50, 25, 12,5 e 6,25 µg/ml. 10 µl de cada concentração foram incubados com as contas fluorescentes de Luminex e o teste realizado por especificações do fabricante.
[00392] Manchamento de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de Env de HIV-1 de superfície celular. Manchamento de FACS foi realizado como anteriormente descrito (Chakrabarti e outro, J Virol 85, 8217-8226, 2011; Koch e outro, Virology 313, 387-400, 2003). 48 horas depois da transfecção, as células foram colhidas e lavadas em tampão de FACS (PBS, 5 % de HIFBS, 0,02 % de azida) e manchadas com anticorpos monoclonais. As células transfectadas foram suspensas em tampão de FACS e foram incubadas com os anticorpos durante uma hora em temperatura ambiente. A mistura de célula de anticorpo monoclonal foi lavada extensivamente em tampão de FACS e anticorpo secundário antihumano de cabra conjugado à ficoeritrina (PE) (Sigma) foi adicionado durante uma hora em uma diluição a 1:200, seguido por lavagem extensiva para remover anticorpo secundário não ligado. As células manchadas com o anticorpo PE foram adquiridas em um instrumento BD LSRII e analisadas por FlowJo.
[00393] Experimentos de remoção de anticorpo-vírus. De uma concentração inicial de 2 mg/ml, 12,5 μl de anticorpos serialmente diluídos 5 vezes em PBS foram adicionados a 487,5 μl de DMEM contendo 10 % de HIFCS e 15 μl de pseudovírus de tal modo que as concentrações finais de anticorpos sejam 50 μg/ml a 0,08 μg/ml em um volume total de 500 μl. No controle de "nenhum inibidor", o mesmo volume de PBS foi adicionado em vez de anticorpo. A mistura reacional foi incubada durante 30 minutos a 37 °C. A mistura reacional de 250 μl foi diluída para 10 ml com DMEM completo, centrifugada a 25.000 rpm em um rotor SW41 rotor, durante 2 horas a 4 °C. A pélete de vírus foi em seguida lavada mais duas vezes com 10 ml de PBS. Durante as etapas de lavagem, o complexo de vírus-anticorpo foi centrifugado a 40.000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. Após a lavagem final, 250 μl de DMEM foram adicionados à pélete de vírus lavada e ela foi novamente suspensa por suave agitação a 4 °C durante 30 min. 100 μl dos vírus suspensos foram usados para infectar 100 μl de células TZM-bl (0,2 milhões/ml), em duplicata. Dos restantes 250 μl de mistura reacional, um volume igual da mistura anticorpo-vírus foi usado como um controle de "nenhuma eliminação". Placas foram incubadas a 37 °C em um incubador de CO2 durante 2 dias. Após 2 dias, o ensaio de luciferase foi feito como descrito anteriormente (Mascola e outro J Virol 76, 4810-4821, 2002). Os dados foram em seguida plotados para determinar a neutralização mediada pelos anticorpos em condições de "lavagem" ou "nenhuma lavagem".
[00394] Análise e determinação de estrutura. O fragmento de ligação de antígeno de 10E8 (Fab) foi preparado usando digestão de LysC, como anteriormente descrito (Ofek e outro, Proc. Natl. Aca. Sci. .U.S.A., 107, 17880-17887, 2010). O IgG foi primeiro reduzido com DTT a 100 mM durante uma hora a 37 °C, seguido por uma hora de diálise em Hepes, pH 7,6, para reduzir a concentração de DTT para 1 mM. Anticorpos foram em seguida dialisados contra iodoacetamida a 2 mM durante 48 horas a 4 °C, e submetidos a uma diálise final contra Hepes, pH 7,6, durante 2 h. Após redução e alquilação, os anticorpos foram clivados com Lys-C (Roche), executados sobre uma coluna de Proteína A para segregar o fragmento de Fc, e em seguida submetidos à permuta de íon (Mono S) e cromatografia por exclusão de tamanho (S200). Fab de 10E8 purificado foi incubado com peptídeo em excesso de 10 vezes RRR-NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO: 26)-RRR (American Peptídeo, CA) e o complexo em seguida estabelecido para cristalizações de gota de assentamento de difusão de vapor a 20°C no robô Honeybee 963. 576 condições iniciais adaptadas do Hampton comercialmente disponível (Hampton Research), Precipitant Synergy (Emerald Biosystems), e avaliações de cristalização Wizard (Emerald Biosystems) foram estabelecidas e trabalhadas usando o Rockimager (Formulatrix), seguido por otimização manual de hits de cristal. Os cristais foram desenvolvidos em 40 % de PEG 400, Citrato de Na a 0,1 M, Tris a 0,1 M, pH 7,5 difratado para resolução 2.1 Å em um composto crioprotetor de líquido mãe suplementado com 15 % de 2R-3R-butanodiol e peptídeo em excesso. Após montar os cristais em uma alça, eles foram resfriados instantaneamente e os dados foram coletados em comprimento de 1.00 Å em beamlines SER CAT ID-22 ou BM-22 (APS) e processados usando HKL-2000 (Otwinowski e outro, Macromolecular Crystallography, Pt A 276, 307-326, 1997). As estruturas foram resolvidas através de substituição molecular com Phaser (McCoy e outro, J Appl Crystallogr 40, 658-674, 2007; Winn e outro, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 235-242, 2011), usando uma estrutura livre anteriormente obtida de 10E8 como um modelo de pesquisa. Requinte da estrutura foi empreendido com Phenix (Adams e outro, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 1948-1954, 2002), com construção de modelo iterativo usando Coot (Emsley, P. & Cowtan, K. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-2132 (2004). A estrutura foi validada com MolProbity (Davis e outro, Nucleic Acids Res 35, W375-383, 2007), produzindo 97 % e 99,8 % de resíduos abrangendo regiões de Ramachandran mais favorecidas e regiões de Ramachandran permitidas, respectivamente. A estrutura foi analisada com APBS (Baker e outro, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 10037-10041, 2001) para eletrostáticas (Ligplot; McDonald e outro, J Mol Biol 238, 777-793, 1994), para contatos diretos, PISA (Krissinel e outro, J Mol Biol 372, 774-797, 2007), para áreas de superfície escondidas, e LSQKAB (ccp4 Package; Winn, M. D. e outro Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 67, 235-242, 2011) para alinhamentos de RMSD. Rodas helicoidais foram geradas usando o programa Pepwheel (150.185.138.86/cgibin/emboss/pepwheel). Todos os gráficos foram preparados com Pymol (PyMOL Molecular Graphics System).
[00395] Avaliação de afinidades de ligação de variantes 10E8 e 10E8 ao gp41 MPER. Ressonância de plasmônio de superfície (SPR) (BIACORE® T200, GE Healthcare) foi usada para avaliar afinidade de ligação de 10E8 de tipo selvagem a um peptídeo gp41 MPER. Um peptídeo biotinilado composto de resíduos 656-683 do gp41 MPER (RRR-NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO: 26)- RRK-biotina; American Peptídeo, CA) foi acoplado a um chip BIACORE® SA em uma densidade de superfície de 20-50 Unidades de Resposta (RU). O fragmento de 10E8 de ligação de antígeno (Fab) foi em seguida fluído sobre como analisado em concentrações variando de 0,25 nM a 125 nM, em diluições seriais 2 vezes, com fases de associação ou dissociação de até cinco minutos, em uma taxa de fluxo de 30 ml∕min. A ligação dos controles de Fab de 2F5 e 4E10 ao mesmo peptídeo foi examinada sob condições idênticas.
[00396] Afinidades de ligação dos mutantes de alanina de parátopo de 10E8 ao MPER foram também avaliadas com SPR, porém usando um método de captura de anticorpo. Um chip BIACORE® CM5 foi acoplado por amina com anticorpo de Fc anti-humano às densidades de superfície elevadas de ~10.000 RU. Os IgGs de variante de parátopo de 10E8 foram em seguida capturados para entre 1500-2500 RU e um peptídeo composto de resíduos 656-683 do gp41 MPER (RRR-NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIR(SEQ ID NO: 26)- RRR) fluído sobre como analisado em diluições seriais 2 vezes iniciando a 500 nM (com a exceção de HC D30A, W100bA, S100cA, P100fA, que iniciaram a 250 nM). Fases de associação ou dissociação duraram três minutos e cinco minutos, respectivamente, em uma taxa de fluxo de EEEEE 30 µl ∕min. Sensogramas de ligação estavam aptos com modelos 1∶ 1 Langmuir usando Software BIACORE® BiaEvaluation® (GE Healthcare). Em todos os casos, tampão de BIACORE® HBSEP+ foi usado (Hepes a 10 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM, 0,1 % de P-20).
[00397] Sequenciamento e amplificação de PCR. Extração de RNA viral de síntese de plasma e cDNA foi realizada como anteriormente descrito (Imamichi e outro, J Infect Dis 183, 36-50, 2001). Moléculas simples de um fragmento de 588bp, abrangendo a região de MPER do gene envelope de HIV-1, obtidas através de diluição limitante, foram amplificadas por PCR com o Expand High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) usando os seguintes conjuntos de iniciador: +7789 (senso) 5’- TCTTAGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGG-3’ (SEQI ID NO: 193) e - 8524 (antissentido) 5’-GTAAGTCTCTCAAGCGGTGGTAGC-3’ (SEQI ID NO: 194) em uma primeira reação em série; +7850 (senso) 5’- ACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAACAGCA-3’(SEQI ID NO: 195) e - 8413 (antissentido) 5’-CCACCTTCTTCTTCGATTCCTTCGG-3’ (SEQI ID NO: 196) em uma segunda reação em série. Cada série de PCR consistiu em 25 ciclos, com the desnaturação inicial a 94 °C durante dois minutos, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 15 segundos, recozimento a 50 °C durante 30 segundos, e extensão a 72 °C durante 1 minuto, com a extensão final a 72 °C durante 7 min. Os produtos de PCR foram purificados com o kit de purificação de PCR rápida de QIA (QIAGEN, Valencia, CA), e em seguida clonados em vetor de pCR2.1-TOPO (TOPO TA Cloning it, Invitrogen, Carlsbad, CA) para análises de sequência de clones moleculares individuais. Os DNAs de 18 clones independentes foram sequenciados com o ABI BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) e analisados com o analisador genético ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA).
[00398] Análises estatísticas. A relação entre a potência de soro de paciente de N152 e 10E8, e a relação entre ligação de variante de 10E8 e neutralização foram avaliadas pelo método Spearman rank.
[00399] Depósitos. A sequência de nucleotídeo de cadeias leves e pesadas de 10E8 foi submetida ao GenBank sob números de adesão JX645769 e JX645770, cada dos quais é incorporado por referência aqui como apresentado em GenBank em 18 de Setembro de 2012. Fatores de estrutura e coordenados para Fab de 10E8 em complexo com o gp41 MPER foram depositados com o Banco de Dados de Proteína sob o código de adesão 4G6F que é incorporado por referência aqui como apresentado em GenBank em 18 de Setembro de 2012.
Exemplo 2 Ensaios de neutralização
[00400] Este exemplo descreve um método para teste da amplitude de neutralização e potência dos anticorpos descritos aqui.
[00401] Neutralização dos anticorpos monoclonais foi medida usando uma infecção de único ciclo por Pseudovírus Env de HIV-1 e células alvo TZM-bl. Pseudovírus Env de HIV-1 foram gerados por cotransfecção de células 293T com esqueleto de pSG3ΔEnv contendo um gene repórter de luciferase e um segundo plasmídeo que expressaram Env de HIV-1. Em 72 horas após a transfecção, o sobrenadante contendo pseudovírus foi colhido e congelado a -80 °C até outro uso. Atividade específica de região externa proximal de membrana anti-gp41 (MPER) de soro de paciente e anticorpos foi medida usando as quimeras de MPER de HIV-2/HIV-1. 7312A de HIV2 de tipo selvagem foi usado como um controle. A concentração inibitória a 50 % (IC50) foi calculada como as concentrações de anticorpo/inibidor causando uma redução de 50 % de infecção. Para o ensaio de competição, a concentração fixa de peptídeo foi incubada com Ab de 2F5, 4E10, Z13E1 ou 10E8 serialmente diluído a 37 °C durante 30 minutos antes de incubação de quimera de 7312A-C1. Ensaio de mapeamento de epitopo foi avaliado adicionando 0,5 μg/ml de Ab de 10E8 às diluições seriais de peptídeo 4E10 ou seus mutantes de alanina a 37 °C durante 30 minutos antes da adição de quimera de 7312A-C1. O efeito de bloqueio de neutralização dos peptídeos foi calculado como uma quantidade de mudança no valor de IC50 do anticorpo na presença de mutantes de alanina de 4E10 comparados ao peptídeo 4E10 de tipo selvagem. Neutralização de 10E8 contra pseudovírus mutantes de alanina de COT6.15 de HIV-1 foi também medida usando um ensaio de TZM-bl (figura 36). Outra neutralização de diversas linhagens de HIV-1 foi testada com anticorpo de 10E8 bem como anticorpos contendo cadeias leves e pesadas de 10E8, 7H6, e 7N16 intercomplementadas (figura 37).
Exemplo 3 Ensaios ELISA
[00402] Cada antígeno a 2 μg/ml foi usado para revestir placas de 96 cavidades durante a noite a 4°C. As placas revestidas foram bloqueadas com tampão de BLOTTO (PBS, 1 % de FBS, 5 % de leite sem gordura) durante uma hora em temperatura ambiente, seguidas por incubação com anticorpo serialmente diluído em tampão de rompimento (PBS, 5% de FBS, 2% de BSA, 1% de Tween-20) durante uma hora em temperatura ambiente. Anticorpo IgG anti-humano de cabra conjugado à rábano picante peroxidase (HRP) a 1:10.000 foi adicionado durante uma hora em temperatura ambiente. Placas foram lavadas entre cada etapa com 0,2 % de Tween 20 em PBS. Placas foram desenvolvidas usando 3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) e lidas a 450 nm.
Exemplo 4 Anticorpos neutralizantes monoclonais de HIV-1 específicos para gp41 para detectar HIV-1 em uma amostra ou um paciente
[00403] Este exemplo descreve o uso de anticorpos neutralizantes monoclonais de HIV-1 específicos para gp41 para a detecção de HIV-1 em ema amostra ou um paciente. Este exemplo também descreve o uso destes anticorpos para confirmar o diagnóstico de HIV-1 em um paciente.
[00404] Uma amostra biológica, tal como uma amostra de sangue, é obtida do paciente diagnosticado com, submetido à triagem para, ou suspeito de ter uma infecção por HIV-1. Uma amostra de sangue tirada de um paciente que não é infectado é usada como um controle, apesar de um resultado padrão poder também ser usado como um controle. Um ELISA é realizado para detectar a presença de HIV-1 na amostra de sangue. Proteínas presentes nas amostras de sangue (a amostra de paciente e amostra de controle) são imobilizadas sobre um suporte sólido, tal como uma placa de 96 cavidades, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Robinson e outro, Lancet 362:1612-1616, 2003, incorporado aqui por referência). Seguindo a imobilização, anticorpos neutralizantes monoclonais de HIV-1 específicos para gp41 que são diretamente rotulados com um marcador fluorescente são aplicados à placa imobilizada de proteína. A placa é lavada em um tampão apropriado, tal como PBS, para remover qualquer anticorpo não ligado e para minimizar ligação de anticorpo não específica. Fluorescência pode ser detectada usando uma leitora de placa fluorométrica de acordo com métodos padrão. Um aumento em intensidade de fluorescência da amostra de paciente, relativa à amostra de controle, indica as proteínas ligadas especificamente por anticorpo gp41 da amostra de sangue, desse modo detecta a presença de proteína de HIV-1 na amostra. Detecção de proteína de HIV-1 na amostra de paciente indica que o paciente tem HIV-1, ou confirma diagnóstico de HIV-1 no paciente.
Exemplo 5 Anticorpos neutralizantes monoclonais de HIV-1 específicos para gp41 para o tratamento de HIV-1
[00405] Este exemplo descreve um método particular que pode ser usado para tratar HIV em um paciente humano por administração de um ou mais mAbs neutralizantes humanos específicos de gp41. Apesar de métodos particulares, dosagens, e modos de administrações serem fornecidos, alguém versado na técnica apreciará que as variações podem ser feitas sem substancialmente afetar o tratamento.
[00406] Com base nos ensinamentos descritos aqui, HIV-1 pode ser tratado administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos mAbs neutralizantes descritos aqui, desse modo reduzindo ou eliminando infecção de HIV.
[00407] Avaliação de Pacientes. Em exemplos particulares, o paciente é primeiro selecionado para determinar se eles têm uma infecção de HIV. Exemplos de métodos que podem ser usados para avaliar para infecção de HIV incluem uma combinação de avaliar uma contagem de célula T CD4+ do paciente e o nível de HIV em níveis de sangue de soro. Mais métodos usando os mAbs específicos de gp41 descritos aqui podem também ser usados para avaliar quanto ao HIV.
[00408] Em alguns exemplos, teste de HIV consiste em avaliação inicial com um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) para detectar anticorpos para HIV, tais como para HIV-1. Espécimens com um resultado não reativo do ELISA inicial são consideradas HIVnegativo a menos que nova exposição a um parceiro infectado ou parceiro de estado de HIV desconhecido tenha ocorrido. Espécimens com um resultado de ELISA reativo são novamente testadas em duplicata. Se o resultado de qualquer teste duplicado é reativo, a espécimen é relatada como repetidamente reativa e sofre teste confirmatório com um teste suplementar mais específico (Poe exemplo, Western blot ou um ensaio de imunofluorescência (IFA)). Espécimens que são repetidamente reativas por ELISA e positivas por IFA ou reativas por Western blot são consideradas HIV-positivo e indicativas de infecção de HIV. Espécimens que são repetidamente reativas por ELISA ocasionalmente fornecem um resultado de Western blot indeterminado, que pode ser uma resposta de anticorpo incompleta ao HIV em uma pessoa infectada, ou reações não específicas em uma pessoa não infectada. IFA pode ser usado para confirmar infecção nestes casos ambíguos. Em alguns exemplos, uma segunda espécimen será coletada mais do que um mês depois e novamente testada para pacientes com resultados de Western blot indeterminados. Em mais exemplos, teste de ácido nucleico (por exemplo, método de amplificação de DNA proviral ou RNA viral) pode também auxiliar diagnósticos em certas situações.
[00409] A detecção de HIV em um sangue do paciente é indicativa que o paciente é infectado com HIV e é um candidato para receber as composições terapêuticas descritas aqui. Além disso, detecção de contagem de célula T CD4+ abaixo de 350 por microlitro, tais como 200 células por microlitro, é também indicativa que o paciente é provável ter uma infecção de HIV.
[00410] A pré-avaliação não é requerida antes da administração das composições terapêuticas descritas aqui.
[00411] Pré-tratamento de pacientes. Em exemplos particulares, o paciente é tratado antes da administração de um agente terapêutico que inclui uma ou mais terapias antirretrovirais conhecidas por aqueles versados na técnica. Entretanto, tal pré-tratamento não é sempre requerido, e pode ser determinado por um clínico versado.
[00412] Administração de composições terapêuticas. Seguindo a seleção de paciente, uma dose terapeuticamente eficaz de um mAb neutralizante específico de gp41 descrita aqui é administrada ao paciente (tal como um humano adulto ou uma recém-nascida em risco de contrair HIV ou conhecido ser infectado com HIV). Mais agentes, tais como agentes antivirais, podem também ser administrados ao paciente simultaneamente, ou antes de, ou após a administração dos agentes descritos. Administração pode ser ativada por qualquer método conhecido na técnica, tais como administração oral, inalação, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea.
[00413] A quantidade da composição administrada para prevenir, reduzir, inibir, e/ou tratar HIV ou uma condição associada com ele depende do paciente que está sendo tratado, a severidade do distúrbio, e a maneira de administração da composição terapêutica. Idealmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente é a quantidade suficiente para prevenir, reduzir, e/ou inibir, e/ou tratar a condição (por exemplo, HIV) em um paciente sem causar um efeito citotóxico substancial no paciente. Uma quantidade eficaz pode ser prontamente determinada por alguém versado na técnica, por exemplo, usando curvas de resposta de dose estabilizante de experiências de rotina. Como tal, estas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00414] Em um exemplo específico, os anticorpos são administrados a 5 mg por kg a cada duas semanas ou 10 mg por kg a cada duas semanas dependendo do estágio particular de HIV. Em um exemplo, os anticorpos são administrados continuamente. Em outro exemplo, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo são administrados a 50 µg por kg dados duas vezes por semana durante 2 a 3 semanas.
[00415] Administração das composições terapêuticas pode ser tomada a longo prazo (por exemplo durante um período de meses ou anos).
[00416] Avaliação. Seguindo a administração de uma ou mais terapias, os pacientes com HIV podem ser monitorados para reduções em níveis de HIV, aumentos em uma contagem de célula T CD4+ do paciente, ou reduções em um ou mais sintomas clínicos associados com HIV. Em exemplos particulares, os pacientes são analisados uma ou mais vezes, iniciando 7 dias seguintes ao tratamento. Os pacientes podem ser monitorados usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, amostras biológicas do paciente, incluindo sangue, podem ser obtidas e alterações em níveis de célula T CD4+ ou HIV avaliadas.
[00417] Tratamentos adicionais. Em exemplos particulares, se os pacientes são estáveis ou têm uma menor, misturada ou parcial resposta ao tratamento, eles podem ser novamente tratados após reavaliação com o mesmo planejamento e preparação de agentes que eles anteriormente receberam para o período desejado de tempo, incluindo a duração de um tempo de vida do paciente. Uma resposta parcial é uma redução, tais como pelo menos a 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50%, ou pelo menos 70% em infecção de HIV, replicação de HIV ou combinação destas. Uma resposta parcial pode também ser um aumento em contagem de célula T CD4+ tal como pelo menos 350 células T por microlitro.
Exemplo 6 PCR para Sequenciamento de 454 de células N152 de paciente
[00418] Este exemplo descreve um ensaio de PCR para amplificar DNA de amostra para seqüenciamento profundo. O processo incluiu geração de cDNA de células de paciente usando RT PCR seguido por amplificação de genes de VH3 e VL3 do cDNA gerado.
[00419] Amostra de paciente N152 tinha 33-36 milhões de PBMCs/ml.
[00420] mRNA foi preparado usando Kit Qiagen Oligotex (como descrito em instruções do fabricante).
[00421] RT PCR foi realizado em mRNA usando reagentes de Invitrogen (que incluíram oligo dT como iniciador, e Superscript II RT).
[00422] Após reação de RT de PCRs, cDNA foi em seguida submetido à amplificação usando iniciadores específicos de gene VH3 e VL3 destinados a amplificar das sequências líder dos alelos IGHV-3- 15*05 e IGLV3-19*01, que são os precursores putativos de 10E8.
[00423] Os iniciadores usados foram como segue:
5’ Cadeia pesada
>XLR-A_5L-VH3
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG (SEQ ID NO: 28)
>XLR-A_VH3-L1-MP
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAATGT (SEQ ID NO: 29)
>XLR-A_VH3/4_L1_MP
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTC (SEQ ID NO: 30)
>XLR-A_VH3/4_L3_MP
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGTTGCAGTTTTAAAAGGTGTCCAGTG (SEQ ID NO: 31)
5’ Cadeia Leve
>XLR-A_5L-
VL3CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG (SEQ ID NO: 32)
>XLR-A_5MP-VL3-1
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGCTTACTGCACAGGATCCGTGGCC (SEQ ID NO: 33)
>XLR-A_5MP-VL3-19
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGACTCTTTGCATAGGTTCTGTGGTT (SEQ ID NO: 34)
>XLR-A_5MP-VL3-21
CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTCACTGCACAGGCTCTGTGACC (SEQ ID NO: 35)
[00424] As amostras foram extraídas por gel e purificadas por fenolclorofórmio.
[00425] Produção Final: 1,15 µg de cadeia pesada; 0,9 µl de cadeia leve
[00426] 0,5 µg de cada cadeia foi enviado para seqüenciamento de 454.
[00427] O número total de sequências obtido de um chip de 454 total para cada cadeia: Cadeia pesada: 843084 sequências brutas, 37669 sequências pertencentes à família de IGHV3-15; Cadeia Leve: 1219214 sequências brutas, 91951 sequências pertencentes à família IGKV3-15.
Exemplo 7 Método para isolar e produzir anticorpos monoclonais sem conhecimento anterior de especificidade de antígeno.
[00428] Este exemplo ilustra um método para isolar e produzir todos os anticorpos que um organismo produz contra um antígeno alvo, tal como virions, cânceres, ou toxinas. Métodos atuais para o isolamento e produção de anticorpos monoclonais contam com epitopos conhecidos, específicos, para isolar e produzir novos anticorpos monoclonais. Usando estes métodos, células B são classificadas e genes de imunoglobulina são isolados com base na especificidade do epitopo. Estas metodologias, entretanto, podem ser polarizadas por que elas contam com especificidades de anticorpo ou epitopos anteriormente conhecidas. Adicionalmente, por que estas metodologias contam com especificidades de anticorpo anteriormente conhecidas ou epitopos, estas metodologias não permitem a descoberta de novos anticorpos monoclonais com especificidades de epitopo desconhecidas. Ao contrário das metodologias atuais, esta metodologia começa com uma população de células B de um organismo que é representativo de todas as células B produzidas pelo organismo. Esta população é expandida e selecionada quanto à atividade contra uma funcionalidade ou antígeno de interesse, tal como um virion, toxina, proteína ou câncer. Isto permite o isolamento de um repertório completo de células B de memória que um organismo produz específicas para um antígeno sem conhecimento anterior de especificidade ou características de ligação. Por exemplo, células B de memória neste repertório podem ser selecionadas para uma atividade funcional (tal como atividade de neutralização) e usadas para produzir anticorpos monoclonais específicos para o antígeno.
Métodos
[00429] Manchamento e classificação de célula simples de células B de memória são realizados como segue.
Isolamento de células B
[00430] PBMCs de um paciente anteriormente exposto ao antígeno alvo (tal como um paciente com infecção de HIV-1, se o antígeno alvo for um antígeno de HIV-1) são manchados com o coquetel de anticorpo que consiste em anti-CD19-PE-Cy7 (BD Bioscience), IgA-APC (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), IgD-FITC (BD Pharmingen), e IgM-PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) a 4ºC no escuro durante 30 minutos. As células são em seguida lavadas com 10 ml de tampão de PBS-BSA e novamente suspensas em 500 μl de PBS-BSA. Células B de memória de CD19+IgA-IgD-IgM são classificadas usando um classificador celular FACSAria III (Becton Dickinson). A FIG. 42 ilustra resultados de isolamento de FACS de células B de CD19+ IgAIgDIgM de uma amostra de PBMC.
Descrição Adicional de Isolamento de Células B
1. Preparar um classificador celular FACSARIA III® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ):
  • a. Ligar, esquentar, e conduzir CST; conduzir Auto Drop delay (seguir as etapas no manual);
  • b. Preparar um frasco de PBS-BSA estéril (ou refiltrar o frasco existente)
  • c. Esterilizar o tubo: (1) carregar a amostra de 15% de contrad e conduzir durante cinco minutes na taxa de fluxo 8; (2) carregar uma amostra de 10% de branqueamento e conduzir durante cinco minutos em taxa de fluxo 8; (3) carregar uma amostra de PBSBSA estéril (em tubo estéril) e conduzir durante minutos em taxa de fluxo 8; (4) retornar para a taxa de fluxo 1
  • d. Auxiliar a corrente de classificação: (1) colocar um tubo guava vazio em bloco de classificação e ligar o bloco; (2) abrir a porta da corrente; (3) Diva: na janela de corrente lateral (chamada "70 mícron"), abrir a gaveta de resíduo; verifique se os escorregadores 1,3,4 estão estabelecidos em zero, escorregador 2 deve estar em torno de 48; (4) clique em Voltagem em seguida Classificação de Teste; (5) olhe na porta de corrente – é a corrente de classificação que atinge o centro do tubo?; (6) uso escorregadores na janela de corrente lateral para ajustar a corrente então em seu centro; (7) clique Voltagem para desligar; feche a gaveta de resíduos
  • e. DIVA (software Aria): copiar um padrão antigo escolhendo uma classificação anterior, em seguida "Duplicar sem dados" ou estabelecer novo experimento com fechamento como mostrado abaixo
  • f. Ligar tubo resfriador ao bloco de classificação; ligar o resfriador
2. Preparar as células:
  • a. cuidadosamente limpar o capuz e pipetas com etanol antes de iniciar
  • b. preparar pelo menos 400 ml de IMDM (com glutamax)/10% de FBS/micozap
  • c. aquecer dois tubos cônicos de 15 ml de 7,5 ml de IMDM / 10% de FBS com 15 µl de benzonase
  • d. preparar a mistura mestre de manchamento em tubo eppindorf:
Centrifugar os anticorpos IgM e IgA 1 minuto antes da aliquotagem.
Preparar mistura mestre: 50 µl por 50 milhões de células de anticorpo
Figure img0002
[00431] girar 20 minutos a 4ºC em microfuge; Pigmentos FACS (PE: Ficoeritrina; Cy7: um pigmento de cianina; APC: Aloficocianina; FITC: isotiocianato de fluoresceína; CD19-PE-Cy7 (mAb anti-CD19 conjugado com Pigmentos específicos para células B (exceto células b plasmáticas); IgA: mAb anti-IgA; IgD: mAb anti-IgD; IgM: mAb anti-IgM
e. descongelar 2 frasconetes de células do paciente: (1) aquecer o frasconetes em banho de água até o gelo flutuante ficar visível; (2) adicionar 1 ml de meio/benzonase preaquecido ao frasconete, deixar assentar 15 segundos; (3) mover todo o conteúdo do frasconete para tubo cônico de 15 ml de meio de aquecimento; (4) peletizar 1200 rpm 10 minutos; (5) ressuspender cada em 1 ml de PBS-BSA, combinar, mover 50 µl para cada de 5 tubos cônicos; (6) peletizar todos os 6 tubos cônicos; (7) NOTA – se apenas um frasconete for necessário, você pode pular as etapas v. e vi.
f. Ressuspender as péletes celulares: (1) amostra principal: em 100 µl de mistura mestre; (2) comps. em 50 µl de PBS-BSA, adicionar corantes simples (0,5 µl deCD19-PE-Cy7 etc)
g. 30 min 4ºC cobertos em folha delgada de metal
h. lavagem: adicionar 1000 µl de PBS-BSA com P1000, misturar bem, adicionar mais 2 ml de PBS-BSA
i. peletizar, enquanto isso, abrir nova bolsa de tubos de tampa filtrante em capuz e rotulá-los
j. ressuspender em 500 µl de PBS-BSA e transferir para tubos de tampa filtrante estéreis injetando células através da tampa (tocar a ponta na tampa ao mesmo tempo em que injetando)
k. manter frio até ficarem prontas para fluir
3. Classificar as células: (1) carregar em Aria, fechar como mostrado no exemplo; usar compensação antiga se as voltagens parecerem OK, de outro modo, ajustar as voltagens e conduzir a compensação; (2) ajustar a taxa de fluxo entre 1-2 de modo que a taxa de evento seja tão alta quanto possível, porém não mais do que 13,000 evt/segundo. Monitorar isto durante as classificações; (3) estabelecer a classificação (Clique em Classificação > Novo layout de classificação; Pureza 1.5; Classificação: contínua; Escolher a porta P6 para classificação à Esquerda); (4) Colocar 250 µl de meio dentro de tubo de anel-o de 2 ml, carregar dentro do bloco de classificação e. Classificar por Teste 500 células; (5) Descarregar a amostra, retornar para frio; (6) Conduzir o refluxo da linha de amostra durante 1 a 2 minutos, em seguida carregar o tubo fresco de PBS-BSA no fluxo; (7) Avaliar 8 durante dois minutes e esvaziar a amostra principal; (8) Remove o tubo de classificação do bloco de classificação, usar P1000 para suavemente lavar os lados usando meio em tubo; (9) Mover tudo para um tubo de fluxo; (10) Fluir e registrar a pureza pós-classificação; (12) Carregar a amostra principal em Aria e classificar 20000 a 30000 células B; (13) Repetir as etapas 5-7; (14) Tomar 10 µl, adicionar a 100 µl de PBSBSA em tubo de fluxo, fluir e registrar a pureza pós-classificação; (15) Colocar 270 µl de Guava ViaCount em um tubo guava, adicionar 30 µl de células classificadas, dois minutos, em seguida contar em Guava (registrar a concentração apenas; não será aceito 0,25 ml como volume); (16) Calcular a quantidade de células necessárias para semear na densidade desejada.
[00432] Tratar as células com fatores de crescimento para induzir a divisão celular
[00433] Células B de memória CD19+IgA-IgD-IgM são novamente suspensas em Meio de Dulbecco Modificado de Iscove IMDM com 10% de FBS contendo 100 U/ml de IL-2, 50 ng/ml de IL-21 e 1x105 /ml de células alimentadoras 3T3-msCD40L irradiadas produzidas como anteriormente descrito (Kershaw e outro, Cancer Res., 61: 7920-7924, 2001). Células B são semeadas em placas de microtitulação de 384 cavidades em uma densidade de 4 células/cavidade em um volume final de 50 μl.
Descrição Adicional de tratamento de células com fatores de crescimento
1. Preparar as condições de semeadura: (1) Descongelar 1 frasconete de 35x106 de células 3T3-msCD40L irradiadas (método benzonase), novamente suspensas em 10 ml de IMDM/10% de FBS; (2) Calcular as quantidades de reagente.
  • a. Concentrações (Mistura Alimentadora): 3T3-msCD40L: 5000 células/ 50 ul / cavidade = 105 células/ml; IL2 100 u/ml; IL21 50 u/ml; Em meio de cultua de célula IMDM /10% de FBS (veja acima); Para 20 placas = 350 ml: 336 ml IMDM/10%FBS; 3.5 ml IL2 (10000 u/ml); 175 µl IL21; 10 ml 3T3msCD40L
  • b. Preparar a mistura alimentadora como calculado; Para 10 placas: pôr de parte 12,5 ml para nenhum controle de célula B.
2. Semear células: (1) Usar placas brancas de 384 cavidades; rotulá-las sobre a tampa e sobre o lado da placa; (2) Usar pipetas de 12 canais; (3) Portadores de placa angulada podem ser úteis; (4) Colocar 100 µl de dI-H2O estéril com gent em cavidades externas (necessários 7,7 ml/placa); (5) Antes adicionar células b para misturar, semear 50 µl/cavidade de mistura de alimentadores na série D de todas as placas (isto é; (6) controle de nenhum anticorpo); (7) Adicionar a quantidade apropriada de células B à mistura de alimentadores restante (Para 10 placas, 2,5 células B/cavidade = 50 células/ml, necessárias 8125 células B); (8) Mover a mistura celular para bacias estéreis grandes, e semear 50 µl/cavidade em 308 cavidades internas (exceto a série D); (9) Tenha certeza de misturar as células na bacia frequentemente; (10) Semear um quarto de placa extra para ELISA posteriormente; (11) Mover novamente da incubadora, deixar não incomodada durante 13 dias
3. Fornecedores: IL2 – Roche- 11147528001 (50 ml); IL21 – Invitrogen – PHC0215 (25ug); IMDM + Glutamax – Invitrogen – 31980-097 (1x10btls) Incubação e Avaliação de Neutralização de Sobrenadante
[00434] Após 13 dias de incubação, 40 μl de sobrenadantes de cultura de cada cavidade são coletados e selecionados para a atividade de neutralização usando um alvo funcional do antígeno de interesse (por exemplo, se um antígeno HIV-1 for o antígeno alvo, o ensaio de neutralização pode ser um ensaio de microneutralização de rendimento elevado contra HIV-1MN.03 e HIV-1Bal.26).
Descrição adicional de coleção de sobrenadante para ensaio de neutralização
1. Coleção de sobrenadante para ensaio de neutralização
  • a. Preparar uma placa ELISA antecipadamente (revestir uma placa Maxisorp™ com anti-IgG); Limpar o capuz e pipetas com etanol e em seguida RNaseAway™; rotular tantas placas brancas de 384 cavidades quantas você tiver no dia 11 de placas.
  • b. Mover 40 µl de cada cavidade da placa no dia 11 para a correspondente cavidade de placa fresca: (1) usar uma pipeta de 12 canais; (2) Pegar a ponta mais distante para baixo em cavidade quanto possível – Ok para tocar a base ligeiramente, mover a ponta para cima ligeiramente, em seguida puxar para cima; (3) dispensar para a nova placa; (4) cobrir sup. das placas com adesivo de folha delgada de metal e colocar a tampa sobre; a quarta parte da placa vai para 4ºC; (5) armazenar as sup. das placas a -80 e usar como necessário para ensaio de neutralização.
  • c. Fazer tampão de captura de lise – suficiente para 308 cavidades * 1,15 * número de placas: para 1 cavidade (0,3 µl de Tris, pH 8, 1M; 0,25 µl de Inibidor de RNase; 19,45 µl de H2O tratada com depc); colocar 20 µl de tampão de captura de lise sobre todas as cavidades de célula B (dispensar com pipeta de múltiplos canais; cobrir com adesivo de folha delgada de metal e colocar a tampa sobre; armazenar a -80°C); realizar ELISA usando 10 µl de sup da quarta parte da placa para medir a concentração de IgG e avaliar o impacto.
Produção de anticorpos monoclonais
[00435] As células B em cada cavidade são lisadas com 20 μl tampão de lise contendo 0,25 μl de inibidor de RNase (New England Biolabs Inc.), 0,3 μl de Tris a 1M, pH8 (Quality Biological Inc.) e 19,45 μl de H2O tratada com DEPC. As placas com células B são armazenadas a -80°C. A região variável da cadeia pesada e da cadeia leve do gene imunoglobulina são amplificadas por RT-PCR das cavidades que se classificaram positivas no ensaio de neutralização. O produto de cDNA é usado como molde na reação de PCR. A fim de amplificar a imunoglobulina de gene altamente somaticamente mutado, dois conjuntos de iniciadores como descrito anteriormente (Tiller e outro, J. Immunological Methods, 329:112-124, 2008) são usados em dois independentes PCRs. Um conjunto de iniciadores inclui os iniciadores dianteiros e os iniciadores reversos específicos para a região líder e região constante de IgH, Igκ ou Igλ, respectivamente. O outro conjunto de iniciadores inclui as misturas de iniciador dianteiro específicas para FWR1 e respectivos iniciadores reversos específicos para os genes J IgH, Igκ e Igλ. Todos os PCRs são realizados em placas de PCR de 96 cavidades em um volume total de 50 μl contendo 20 nM de cada iniciador ou mistura de iniciador, 10 nM de cada dNTP (Invitrogen), 10 μl de 5x solução-Q (Qiagen) e 1,2 U HotStar Taq DNA polimerase (Qiagen). A partir da reação positiva de PCRs, lagos do DNA de região VH ou VL são ligados a um vetor pCR2.1-Topo-TA (Invitrogen) para seqüenciamento antes da clonagem no correspondente vetor de expressão Igγ1, Igκ e Igλ. 10 μg de plasmídeos de cadeia leve e pesada, clonados da mesma cavidade e combinados em todos os pares de cadeia leve e pesada possíveis, é misturados com 40 μl de FUGENE® 6 (Roche) em 1500 μl de DMEM (Gibco) e cotransfectados em células 293T. O IgG de tamanho natural é purificado usando uma coluna de proteína A recombinante (GE Healthcare).
Ensaios de Neutralização para anticorpos monoclonais
[00436] Seguindo a purificação de IgG de tamanho natural, os anticorpos produzidos são testados quanto à atividade de neutralização.
[00437] Por exemplo, se o antígeno de interesse for um antígeno HIV-1, a atividade de neutralização dos anticorpos monoclonais pode ser medida usando uma infecção por pseudoviroses Env. de HIV-1 de único ciclo de células TZM-bl. As pseudoviroses Env. de HIV-1 podem ser geradas por cotransfecção de células 293T com esqueleto de Env de pSG3 e um segundo plasmídeo que expressou Env. de HIV-1 em 72 horas após transfecção, os sobrenadantes contendo pseudovírus são colhidos e congelados a -80°C até outro uso. No ensaio de neutralização, 10 μl de soro de paciente diluído serialmente 5 vezes ou mAb são incubados com 40 μl de pseudovírus em uma placa de 96 cavidades a 37°C durante 30 minutos antes da adição de células TZMbl. Após 2 dias de incubação, as células são lisadas e a infectividade viral quantificada medindo a atividade de luciferase com um luminômetro VICTOR® Light (Perkin Elmer). A concentração inibitória de 50% (IC50) é calculada como a concentração de anticorpo que reduz a infecção por 50%.
Exemplo 8 Modificações de 10E8
[00438] Este exemplo ilustra modificações do anticorpo 10E8 para aumentar a afinidade para gp120, sem aumentar a autorreatividade. Como descrito abaixo, diversos métodos foram empreendidos para identificar e planejar desenvolvimentos para o 10E8 anticorpo, incluindo mutagênese de varredura de alanina com base na estrutura de parátopo 10E8; Mutagênese com base na estrutura para realçar interações hidrofóbicas; Reversão de linha germinativa parcial; combinação destes métodos, e pirossequenciamento profundo de 454 para identificar variantes filogenéticas de 10E8 com potência melhorada. Além disso, combinações destes quarto métodos foram também empreendidas, combinando-se os melhores elementos e os resultados de cada um. Abaixo está um sumário de cada dos quatro métodos com o racional atrás de cada.
(1) Mutagênese de varredura de alanina com base na estrutura de parátopo de 10E8
[00439] Com base na estrutura cristal de Fab de 10E8 com o MPER de gp41 (descrito acima), resíduos de cadeia pesada do parátopo de 10E8 foram mutados para alanina. As construções de anticorpo mutantes foram geradas usando técnicas padrões, e os anticorpos foram expressos e purificados como descrito no Exemplo 1. Todos os resíduos do parátopo de 10E8 foram mutados para alanina (veja FIG. 43), e diversas posições de resíduo levaram à neutralização de vírus mediada por 10E8 realçada (veja as figuras. 32 e 49). Estes incluem os resíduos de 10E8 D28, D30, N31, T52, E53, S56, D58, e Y100e (numeração Kabat). Ensaios de neutralização foram realizados como descrito no exemplo 2.
(2) Mutagênese com base na estrutura para realçar interações hidrofóbicas
[00440] Com base na estrutura de cristal de Fab de 10E8 com o MPER de gp41, resíduos que foram supostos serem coplanares com o epitopo de 10E8e foram mutados para resíduos hidrofóbicos (veja FIGs 44A e 44B). As construções de anticorpo mutante foram geradas usando técnicas padrões, e os anticorpos foram expressos e purificados como descrito no exemplo 1. Como mostrado na FIG. 45, diversas posições de resíduo, ambas singularmente e em combinação, resultaram em potência de neutralização aumentada de 10E8. Dos mutantes listados na FIG. 45, mutação do resíduo S74 para triptofano gerou o maior aumento em neutralização, seguida pelo mutante duplo D30-N31 e o mutante simples D28. Ensaios de neutralização foram realizados como descrito no exemplo 2.
(3) Reversão de linha germinativa parcial
[00441] Enxerto de CDR foi usado para reverter uma fração das mudanças de maturação de 10E8 novamente para a sequência de linha germinativa. Enxerto de CDR é um procedimento que é tipicamente usado para humanização de anticorpos de uma fonte não humana (por exemplo, mouse): o procedimento usa um alinhamento de sequência do anticorpo não humano com contraparte humano (tipicamente um gene de linha germinativa humana) e retém as CDR’s de anticorpo original, porém, muta resíduos de estrutura selecionados para as respectivas entidades humanas. Resíduos de estrutura são selecionados para mutação com base em análise estrutural e de sequência. Em certos casos, nem todas as mudanças de maturação observadas em um anticorpo podem ser benéficas, e reversão parcial para linha germinativa pode ajudar a melhorar certas propriedades de anticorpo, tal como meia-vida aumentada, imunogenicidade diminuída, ou potência melhorada. Aplicando enxerto de CDR a 10E8, três diferentes inversores de cadeia pesada e três diferentes cadeias parcialmente revertidas leves foram designadas (veja FIG. 47). No nível de aminoácido, as taxas de mutação foram diminuídas de 28% a 12-20% para a cadeia pesada e de 21% a 7-14% para a cadeia leve. Os anticorpos mutados foram construídos e produzidos usando métodos padrões, descrito no exemplo 1. Diferentes combinações de inversores de cadeia pesada e leve foram testadas para ligação a MPER e para neutralização (veja FIG. 48). A maior melhora em neutralização (<2-vezes) foi observada para o inversor que incluiu as reversões de cadeia pesada e leve mais próximas do anticorpo maduro ("10E8-R3," que inclui a cadeia pesada de 10E8gH03 (SEQ ID NO: 149) e a cadeia leve 10E8gL03 (SEQ ID NO: 152)). Melhoras adicionais foram observadas Quando os inversores foram pareados com cadeias pesadas/leves de outras fontes (tal como sequenciamento profundo, descrito abaixo).
(4) Mutações Adicionais
[00442] Com base em dados de neutralização, análise de inversor, análise de alanina de parátopo, e planejamentos de hidrofobicidade realçada descritos acima, as seguintes mutações adicionais foram introduzidas na variante de cadeia pesada de 10E8gH03 de 10E8 e a variante de cadeia leve de 10E8gL03 de 10E8, anticorpos foram construídos e produzidos de acordo com métodos padrões, como descrito no exemplo 1, e testados quanto à atividade de neutralização de acordo com métodos descritos no exemplo 2 (figura 49)
Figure img0003
(5) pirossequenciamento profundo de 454 para identificar variantes filogenéticas de 10E8 com potência melhorada
[00443] Este exemplo ilustra a identificação e pareamento funcional de sequências de cadeias pesadas e leves semelhantes a 10E8 determinada em reações de pirossequenciamento de 454 separadas. Iniciando da sequência tipo selvagem de anticorpo neutralizante de 10E8, variantes clonais para cadeia pesada e leve foram identificadas e avaliadas quanto a função por pareamento com a cadeia complementar de 10E8 tipo selvagem. As árvores filogenéticas das cadeias leves e pesadas revelaram topologias de ramificação similares em torno das sequências de 10E8 tipo selvagem, permitindo ramificações das árvores filogenéticas de cadeia pesada e leve serem comparadas com base em suas distâncias relativas de 10E8. Avaliando uma matriz de anticorpos reconstituída de ramificações comparadas e erroneamente comparadas para neutralização de HIV-1 e reatividade com auto-antígenos, o impacto de pareamento filogenético sobre a função foi quantificado.
[00444] O anticorpo amplamente neutralizante 10E8 foi identificado no doador de N152 infectado por HIV-1, e reconhece uma hélice na região externa proximal da membrana (MPER) exatamente antes da região de união de transmembrana da glicoproteína de gp41 de HIV-1, e neutraliza 98% de isolados de HIV-1 diversos em uma concentração inibitória de 50% (IC50) de 0,32 ug/ml. A cadeia pesada de anticorpo 10E8 deriva de IgHV3-15 e IgHJ1, tem uma terceira região determinante de complementaridade (CDR H3) de 22 aminoácidos, e apresenta uma taxa de mutação somática de 21%. A cadeia leve de anticorpo 10E8 deriva-se de IgVL3-19 e IgLJ3, tem uma CDR L3 de 12 aminoácidos, e apresenta uma taxa de mutação somática de 14%. Sequenciamento profundo de transcrições de célula B doadora usando reação de cadeia de polimerase (PCR) para amplificar sequências de cadeia pesada de IgG da família IgHV3 e para amplificar sequências de cadeia leve IgG da família IgVL3 foi realizado como descrito no exemplo 6. mRNA de um estimado de 5 milhões de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foi usado para transcrição reversa para produzir cDNA padrão, e, em ambos os casos, iniciadores que estavam a montante do início das sequências líder de gene V e a jusante da extremidade de cadeia J foram usados.
[00445] Pirossequenciamento de 454 Roche forneceu 843.084 leituras de cadeia pesada e 1.219.214 leituras de cadeia leve para N152 doador (veja FIG. 50). Após análise primária usando um canal de informação de bioinformáticas 36.318 sequências de cadeia pesada foram designadas para a família alélica de IgHV1-3 e 54.583 sequências de cadeia leve foram designadas para as famílias alélicas de IgVL3-IgJ3 (veja, por exemplo, Wu e outro, Science, 333, 1593- 1602, 2011, e Zhu e outro, Frontiers in microbiology, 3, 315-315, 2012). Leituras foram analisadas quanto à identidade para 10E8 e divergência dos genes V não mutados, e suas freqüências plotadas sobre grades de identidade/divergência (figuras 50A e 50B, painéis esquerdos). Notavelmente com a cadeia pesada diversas ilhas bem separadas de alta identidade e cerca de 25% de divergência foram observados, e com a cadeia leve, uma ilha bem separada simples de alta identidade e cerca de 15% de divergência foram observados. Amostragem com base na grade da região de divergência de alta identidade, selecionadas 61 sequências de cadeia pesada e 48 sequências de cadeia leve. A ligação filogenética destas sequências a 10E8 foi analisada (figuras 50C e 50D) e também sintetizada, reconstituída com a cadeia de 10E8 tipo selvagem complementar, e expressa por transfecção transitória em um formato de 96 cavidades. Ensaios imunoabsorventes ligados por enzima (ELISAs) das variantes de 10E8 expressas identificaram 11 cadeias pesadas e 24 cadeias leves (a nomenclatura e sequências destas cadeias leves e pesadas é mostrada na FIG. 51 e FIG. 59) que quando pareadas com as cadeias de 10E8 parceiras ligadas a um peptídeo correspondendo ao MPER inteiro de gp41 de HIV-1 (figura 50A e 50B, painéis direitos). Em um painel de isolado de 6-HIV-1, aumentos de até ~5 vezes em potência de neutralização foram observados (figuras 50E e 50F).
[00446] As cadeias pesadas de 10E8 funcionais derivadas de três ilhas distintas nos plotes de identidade/divergência (figura 50A), e sequências exibidas e padrões mutacionais consistentes com uma origem clonal comum (figura 51A). Mutações agrupadas em CDR H1 e H3, e também na primeira, terceira e quarta regiões de estrutura (FR1, FR3 e FR4). A sequência mais divergente, gVRC-H11dN152, teve 25 mudanças de aminoácido, correspondentes à 19,1% de diferença da cadeia pesada de 10E8 tipo selvagem. As cadeias leves de 10E8 funcionais derivadas de diversas regiões dos plotes de identidade/divergência, incluindo uma única ilha distinta e diversas regiões sobrepondo-se à população de cadeia leve primária (figura 50B). Como a cadeia pesada, as cadeias leves funcionais exibiram padrões mutacionais consistentes com uma origem clonal comum (figura 51C). As mutações agrupadas nas regiões CDR L1 e CDR L2, e todas as regiões de estrutura. A sequência mais divergente, gVRCL23dN152, teve 33 mudanças de aminoácido, correspondentes a 30,3% de diferença da cadeia leve de 10E8 tipo selvagem.
[00447] Embora funcionais, as variantes de 10E8 reconstituídas com cadeias de complementaridade tipo selvagem de 10E8 não representam pares naturais. Uma desvantagem conhecida do método de sequenciamento profundo para caracterização do anticorpo é que as regiões de sequenciamento separadas são requeridas para cadeias leves e pesadas, e a informação crítica relacionada com a ontogenia natural e fenótipo funcional é perdida. Portanto, uma análise com base na evolução foi realizada para fornecer suficiente informação para recapitular pareamentos naturais aproximados. A maturação/evolução de cadeias leves e pesadas deve ser ligada por causa de sua associação física como proteínas, a presença de seus genes em evolução nas mesmas células objeto para os mesmos processos de mutação enzimática, e o requisito para mudança estrutural cooperativa em resposta ao mesmo imunógeno. Além disso, a amostragem de cadeias leves e pesadas pareadas em uma única biblioteca de cDNA de população de mRNA de transcrições de anticorpo que devem ser altamente correlacionadas por que elas se originam das mesmas células. Em princípio, esta similaridade em amostragem deve levar a correlações em frequências de correspondentes ramificações de cadeia pesada e leve de árvores filogenéticas.
[00448] Análises filogenéticas das cadeias pesadas e leves de 10E8 experimentalmente testadas selecionadas da grade encontradas na maioria dos anticorpos neutralizantes para popular três ramificações, próximas a e incluindo o 10E8 padrão (figuras 50C e 50D). A ramificação b1-H para a cadeia pesada (ou b1-L para a cadeia leve) continha 10E8, a ramificação b2-H (b2-L) foi a mais próxima ramificação a b1-H, e a ramificação b3-H (b3-L) foi a seguinte ramificação mais próxima. Uma única sequência neutralizante (gVRCH11dN152) ocupou uma ramificação mais distante (b4-H). Por que o pirossequenciamento de 454 produz em média cerca de 5 erros por domínio de anticorpo variável, o anticorpo mais potente de cada ramificação foi selecionado como representativo, quando o anticorpo mais funcional é provável de ter por pouco que seja função não pareada-erro de 454. Doze anticorpos foram reconstituídos, incluindo uma completa matriz de pareamento de cadeia pesada/leve das 4 ramificações de cadeia pesada e as 3 ramificações de cadeia leve (FIG 52A). 11 dos 12 anticorpos reconstituídos expressaram níveis suficientes de IgG para avaliar a neutralização, que foi feita em um painel de cinco isolados de HIV-1. Todos os 11 anticorpos expressos foram neutralizantes. Pareamentos de cadeia pesada e leve que compararam a distância filogenética de 10E8 (por exemplo, b1-H a b1- L, b2-H a b2-L, e b3-H a b3-L), foram ligeiramente mais potentes em média do que os pareamentos mal comparados, porém o diferente não foi estatisticamente significante (figura 52B).
[00449] A reatividade de pareamento comparado e mal comparado com auto-antígenos foi também testada. Notavelmente, o pareamento comparado mostrou significantemente menor manchamento de Hep2 (p=0.049) (figura 52C).
[00450] Os resultados mostram com 10E8 e N152 doador (i) como a amostragem de grade de identidade/divergência pode ser usada para identificar variantes somáticas, (ii) como a arquitetura da árvore filogenética pode ser usada para aproximar os pareamentos naturais, e (iii) que os anticorpos pareados por comparação filogenética mostram menos autorreatividade. Tal autorreatividade reduzida está provavelmente relacionada com a seleção in vivo que os anticorpos naturais sofrem. Com um anticorpo como 10E8, que pode mecanicamente ser mais propenso à autorreatividade do que outros anticorpos, tal recapitulação de pareamento natural pode ser útil. Embora pareamentos naturais sejam perdidos com sequenciamento profundo, o acima mencionado sugere que é possível aproximá-los usando similaridades topológicas entre as árvores filogenéticas de cadeia pesada e leve. Desse modo, pode ser possível usar similaridade filogenética ou análise de linhagem como métodos de peneiração, visto que estes fornecem um método exclusivamente computacional para identificar variantes somáticas.
(5) Variantes e combinações adicionais
[00451] Combinações adicionais das cadeias leves e pesadas identificadas, bem como as variantes de cadeia pesada e leve identificadas foram geradas para testar quanto à neutralização e autorreatividade. Combinações de certas cadeias leves e pesadas são indicadas nas FIGs. 53-54, incluindo combinações com base na neutralização no contexto da cadeia de complemento de 10E8 tipo selvagem, bem como combinações com base no pareamento filogenético. A nomenclatura e informação de sequência para estes pareamentos é mostrada na FIG. 59, exceto para "rL3" que corresponde ao inversor de linha germinativa de cadeia leve de 10E8gL03 mostrado na FIG. 47 e listado como SEQ ID NO: 149. Os valores de neutralização (IC50 em µg/ml) contra um painel de seis vírus são apresentados nas FIGs. 55A-55C, e os valores de autorreatividade são apresentados na FIG. 56. Os valores de neutralização (IC50 em µg/ml) contra um painel de vinte vírus são apresentados na FIG. 57. Os resultados indicam diversos pareamentos de cadeia pesada e leve que mostram atividade de neutralização aumentada em comparação ao 10E8 tipo selvagem, porém não têm autoatividade aumentada, incluindo o pareamento de cadeia pesada HC6 (gVRC-H2dn152; SEQ ID NO: 154) e cadeia leve 10E8gL03 (rL3; SEQ ID NO: 152).
[00452] Outras variantes de cadeia pesada foram desenvolvidas e complementadas com cadeia leve de 10E8 ou variantes de cadeia leve de 10E8 e testadas quanto à atividade de neutralização (veja FIGs. 58A e 58B). O resíduo de serina na posição 74 (numeração Kabat) do HC6 de cadeia pesada da variante de 10E8 (gVRC-H2dn152; SEQ ID NO: 154) foi adicionalmente mutado para alanina, arginina, valina ou tirosina. As sequências destas variantes são fornecidas como SEQ ID NO: 189 (HC6 S74A), SEQ ID NO: 190 (HC6 S74R), SEQ ID NO: 191 (HC6 S74V), SEQ ID NO: 192 (HC6 S74Y). Estas cadeias pesadas de variante de 10E8 foram complementadas com a variante de cadeia leve de 10E8 "rL3" (10E8gL03; SEQ ID NO: 149) e o resultante anticorpo foi testado quanto à atividade de neutralização contra um painel de 20 viroses de HIV, incluindo 6, 8, 4, 1 e 1 viroses de clados A, B, C, AG, e G, respeitosamente. Ensaios de neutralização foram realizados como descrito no exemplo 1, e um gráfico resumindo os resultados destes ensaios é apresentado na FIG. 58A (mostrando os valores IC50) e FIG. 58B (mostrando os valores IC80).
[00453] Mutantes de cadeia pesada e cadeia leve adicionais foram desenvolvidos para produzir os anticorpos de ligação de gp41 com solubilidade aumentada, reduzindo o número de resíduos hidrofóbicos expostos a solvente. Resíduos que não são requeridos para reconhecimento de epítope (com base em dados de sequenciamento profundo de 454, bem como replanejamento de proteína com base na estrutura) foram selecionados para substituição com resíduos polares ou carregados. As seguintes cadeias leves e pesadas semelhantes a 10E8 foram construídas (substituições de aminoácido Kabat com referência às cadeias leves e pesadas de HC6 (SEQ ID NO: 154) e rL3 (SEQ ID NO: 152), respectivamente)
Cadeia leve:
10E8gL03_hp_L01 (SEQ ID NO: 197; I44K)
10E8gL03_hp_L02 (SEQ ID NO: 198; S2Y, V10T, L14A, I44V, L106P)
10E8gL03_hp_L03 (SEQ ID NO: 199; V10T, L14A, I44K, L106P)
Cadeia pesada:
HC6_S77Y_hp_H01 (SEQ ID NO: 200; L18Q, S74Y)
HC6_S77Y_hp_H02 (SEQ ID NO: 201; L72D, S74Y, I75K, F77T, M84T)
HC6_S77Y_hp_H03 (SEQ ID NO: 202; L18Q, W55K, S74Y, M84T)
HC6_S77Y_hp_H04 (SEQ ID NO: 203; L18Q, W55K, L72D, S74Y, I75K, F77T, M84T)
[00454] Uma construção inversora de linha germinativa parcial de HC6 foi também construída:
HC6rH03S77Y (SEQ ID NO: 204; S23A, N73D, S74Y, E81Q, N82bS, R83K, M84T, S87T, L89V, F91Y, R105Q)
[00455] Variantes de cadeia leve de 10E8 adicionais foram construídas. Estas variantes incluem variantes da cadeia leve do tipo selvagem 10E8, o inversor rL3 de linha germinativa parcial de cadeia leve de 10E8, e os três mutantes de solubilidade de cadeia leve acima citados. Estas construções contêm um R23Q de única mutação que remove um sítio de ligação de integrina potencial. Q é a identidade de linha germinativa na posição 23 na cadeia leve de 10E8. Os mutantes adicionais são mencionados como: 10E8_L_R23Q (SEQ ID NO: 205); 10E8gL03_R23Q (SEQ ID NO: 206); 10E8gL03_hp_L01_R23Q (SEQ ID NO: 207); 10E8gL03_hp_L02_R23Q (SEQ ID NO: 208); 10E8gL03_hp_L03_R23Q (SEQ ID NO: 209). A pessoa versada na técnica apreciará que o 10E8 ou qualquer das regiões variáveis de cadeia leve variante de 10E8 descritas aqui podem opcionalmente incluir a substituição de R23Q.
(6) Sumário de mutações de 10E8.
[00456] As substituições de 10E8 descritas acima são sumariadas nas tabelas dadas como FIGs. 60A e 60B (substituições de cadeia pesada) e FIG.s 61A e 61B (substituições de cadeia leve).
[00457] Será evidente que os detalhes precisos dos métodos ou composições descritos podem ser variados ou modificados sem afastar-se do espírito das modalidades descritas. Foram reivindicadas todas as modificações e variações que se incluem no escopo e espírito das reivindicações abaixo.

Claims (27)

  1. Anticorpo monoclonal isolado, caracterizado pelo fato de que compreende:
    uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões determinantes de complementariedade de cadeia pesada (HCDR)1, (HCDR)2 e (HCDR)3 compreendendo os aminoácidos 26 a 33, 51 a 60 e 99 a 120, respectivamente, da SEQ ID NO: 154; e
    uma região variável de cadeia leve compreendendo regiões determinantes de complementariedade de cadeia leve (LCDR)1, (LCDR)2 e (LCDR)3 compreendendo os aminoácidos 26 a 31, 49 a 51 e 88 a 99, respectivamente, da SEQ ID NO: 152, uma estrutura (FR)2 e uma (FR)3 compreendendo os aminoácidos 32 a 48 e 52 a 86, respectivamente, da SEQ ID NO: 152;
    em que o anticorpo se liga especificamente ao gp41 e neutraliza HIV-1.
  2. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácido determinada como uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 149, 189 a 192, 200 a 201 ou 204.
  3. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:
    a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido determinada na SEQ ID NO: 154, e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido determinada na SEQ ID NO: 152.
  4. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 192, e a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 152.
  5. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 152.
  6. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 154.
  7. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO: 192.
  8. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de IgG, IgM ou IgA.
  9. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1.
  10. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região Fc variante.
  11. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo neutraliza pelo menos 98% dos isolados de HIV-1 listados nas figuras 17C-17F com uma concentração inibitória (IC50) menor do que 50 µg/mL.
  12. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo neutraliza pelo menos 72% dos isolados de HIV-1 listados nas figuras 17C-17F com uma concentração inibitória (IC50) menor do que 1 µg/mL.
  13. Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende anticorpo monoclonal humano isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
  14. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que está ligado a uma porção efetora.
  15. Anticorpo monoclonal humano isolado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a porção efetora é uma toxina ou uma marcação detectável.
  16. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
  17. Molécula de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que é operacionalmente ligada a um promotor heterólogo.
  18. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolado, como definida na reivindicação 16 ou 17.
  19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:
    • (a) o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 16 ou 17, o vetor de expressão, como definido na reivindicação 18, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos; e
    • (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
  20. Método de detecção de uma infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    contatar, in vitro, uma amostra biológica do indivíduo com o anticorpo monoclonal humano isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, sob condições suficientes para formar um complexo imune; e
    detectar a presença do complexo imune na amostra do indivíduo, em que a presença do complexo imune na amostra do indivíduo indica que o indivíduo tem uma infecção por HIV-1; e
    opcionalmente, em que o anticorpo monoclonal humano isolado é diretamente marcado.
  21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:
    contatar, in vitro, a amostra com um segundo anticorpo que especificamente liga o anticorpo monoclonal humano isolado; e
    detectar a ligação do segundo anticorpo à amostra;
    em que um aumento na ligação do segundo anticorpo à amostra em comparação com a ligação do segundo anticorpo a uma amostra de controle, detecta a presença de uma infecção por HIV-1 no indivíduo.
  22. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 16 ou 17, do vetor de expressão como definido na reivindicação 18, ou de uma combinação de dois ou mais dos mesmos, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para prevenção ou tratamento de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)-1 em um indivíduo.
  23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que é um uso para o tratamento de uma infecção por HIV1, e em que o indivíduo tem síndrome de deficiência imune adquirida (AIDS).
  24. Uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um agente antiviral adicional, opcionalmente em que o agente antiviral adicional compreende um inibidor de transcriptase reversa de análogo de nucleosídeo, um inibidor de transcriptase reversa de nucleotídeo, um inibidor de transcriptase reversa de não nucleosídeo, um inibidor de protease, um inibidor de entrada ou fusão, um inibidor de maturação, ou um inibidor de espectro amplo ou uma combinação dos mesmos.
  25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais anticorpos adicionais, ou ácidos nucleicos codificando tais anticorpos, em que os anticorpos adicionais especificamente ligam gp120 e/ou gp41; e/ou
    compreende ainda uma quantidade eficaz de IL-15.
  26. Método para testar um imunógeno potencial, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o imunógeno potencial com um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15; e detectar a ligação do anticorpo ao imunógeno, desse modo determinando que o imunógeno como sendo de uso para produzir uma resposta imune a um vírus da imunodeficiência humana.
  27. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:
    • (a) o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 16 ou 17, o vetor de expressão, como definido na reivindicação 18, a composição, como definida na reivindicação 19, uma combinação de dois ou mais dos mesmos; e
    • (b) instruções para usar o kit.
BR112014010823-4A 2011-11-07 2012-11-07 anticorpos que se ligam a gp41 e neutralizam o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (hiv-1), seus usos, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, composição, kit, bem como métodos de detecção de infecção pelo hiv-1 e de teste de imunógeno potencial BR112014010823B1 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161556660P 2011-11-07 2011-11-07
US61/556,660 2011-11-07
US201261672708P 2012-07-17 2012-07-17
US61/672,708 2012-07-17
US201261698480P 2012-09-07 2012-09-07
US61/698,480 2012-09-07
US201261702703P 2012-09-18 2012-09-18
US61/702,703 2012-09-18
PCT/US2012/063958 WO2013070776A1 (en) 2011-11-07 2012-11-07 Neutralizing gp41 antibodies and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112014010823A2 BR112014010823A2 (pt) 2017-09-12
BR112014010823B1 true BR112014010823B1 (pt) 2021-02-17

Family

ID=48290514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112014010823-4A BR112014010823B1 (pt) 2011-11-07 2012-11-07 anticorpos que se ligam a gp41 e neutralizam o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (hiv-1), seus usos, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, composição, kit, bem como métodos de detecção de infecção pelo hiv-1 e de teste de imunógeno potencial

Country Status (7)

Country Link
US (4) US9475862B2 (pt)
EP (1) EP2776463B1 (pt)
CN (1) CN104080805B (pt)
BR (1) BR112014010823B1 (pt)
RU (1) RU2624046C2 (pt)
WO (1) WO2013070776A1 (pt)
ZA (1) ZA201403264B (pt)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11357866B2 (en) * 2013-04-03 2022-06-14 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Expression of HIV inhibitors by mesenchymal stem cells
WO2015017755A1 (en) * 2013-08-02 2015-02-05 The Regents Of The University Of California Engineering antiviral t cell immunity through stem cells and chimeric antigen receptors
US20180265885A1 (en) * 2015-01-29 2018-09-20 Plantvax, Inc. Highly expressed protective plant-derived broadly neutralizing hiv monoclonal antibodies for use in passive immunotherapy
EP3271022A4 (en) * 2015-03-19 2018-10-31 Duke University Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof
US11071783B2 (en) 2015-03-19 2021-07-27 Duke University HIV-1 neutralizing antibodies and uses thereof
AU2016249404B2 (en) 2015-04-17 2021-01-21 Igm Biosciences, Inc. Multi-valent human immunodeficiency virus antigen binding molecules and uses thereof
CN104830908B (zh) * 2015-06-02 2018-04-10 中国食品药品检定研究院 假病毒包装系统及其用途
AU2016347058B2 (en) 2015-10-25 2023-11-09 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins for prevention or treatment of HIV infection
CN108884149B (zh) * 2015-11-03 2022-07-01 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1 gp41中和抗体及其用途
US10730933B2 (en) 2015-12-05 2020-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois HIV binding agents
KR101873815B1 (ko) * 2016-03-04 2018-07-03 (주)진매트릭스 재조합 단백질의 가용화를 위한 조성물, 그 방법 및 이를 이용한 재조합 항원의 생산 방법
DK3443006T5 (da) 2016-04-13 2023-11-06 Sanofi Sa Trispecifikke og/eller trivalente bindingsproteiner
SG11201808911SA (en) 2016-04-13 2018-11-29 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
CN105801694A (zh) * 2016-05-03 2016-07-27 上海科新生物技术股份有限公司 一种抗心磷脂/β2糖蛋白I复合物的嵌合抗体
TW201811376A (zh) 2016-07-01 2018-04-01 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產權有限公司 抗體-藥物結合物及使用其之治療方法
WO2018053328A1 (en) * 2016-09-16 2018-03-22 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
CN107383190B (zh) * 2017-08-03 2020-09-25 深圳市慢性病防治中心 人源抗HIV gp41特异性抗体及其应用
CN111788225A (zh) 2017-10-10 2020-10-16 赛诺菲 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
EP3817819A1 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Gilead Sciences, Inc. Antibodies that target hiv gp120 and methods of use
SG11202103478RA (en) 2018-10-09 2021-05-28 Sanofi Sa Trispecific anti-cd38, anti-cd28, and anti-cd3 binding proteins and methods of use for treating viral infection
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
TW202104274A (zh) 2019-04-09 2021-02-01 法商賽諾菲公司 用於治療ｈｉｖ感染之三特異性及／或三價結合蛋白
US20220233542A1 (en) * 2019-06-05 2022-07-28 University Of Georgia Research Foundation Compositions and methods for preventing or treating human immunodeficiency virus associated pulmonary arterial hypertension
CA3145791A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Gilead Sciences, Inc. Hiv vaccines and methods of making and using
WO2021016529A1 (en) * 2019-07-25 2021-01-28 The Johns Hopkins University Methods and compositions for hepatitis c virus (hcv)
US20220332780A1 (en) 2019-09-10 2022-10-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2-il15 fusion proteins for tunable regulation
EP4045532A4 (en) * 2019-10-14 2024-02-28 Scripps Research Inst LARGELY NEUTRALIZING HUMAN ANTIBODIES AGAINST HIV ENV PROXIMAL-EXTERNAL MEMBRANE REGION FOR VACCINE DESIGN AND INTERVENTION
CN111253493B (zh) * 2020-03-05 2021-03-23 武汉科技大学 一种靶向hiv病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用
AU2021333577A1 (en) 2020-08-25 2023-03-30 Gilead Sciences, Inc. Multi-specific antigen binding molecules targeting HIV and methods of use
EP4217386A1 (en) * 2020-09-24 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Cell-free antibody engineering platform and neutralizing antibodies for sars-cov-2
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
WO2023114951A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Viiv Healthcare Company Combination therapies for hiv infections and uses thereof
WO2024015741A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2422845B (en) 2003-11-19 2007-08-01 Us Gov Health & Human Serv Method of inducing memory B cell development and terminal differentiation
WO2005111079A2 (en) 2004-05-14 2005-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Hiv vaccine immunogens and immunization strategies to elicit broadly-neutralizing anti-hiv-1 antibodies against the membrane proximal domain of hiv gp41
JP5020941B2 (ja) 2005-05-02 2012-09-05 マイメティクス コーポレーション Ｈｉｖに対して中和活性を有するがｉｌ２には中和活性を有さない抗体又はその断片
RU2393873C2 (ru) * 2005-05-02 2010-07-10 Майметикс Корпорейшн Антитело или его фрагмент, имеющие нейтрализующую активность в отношении вич, но не в отношении il2
EP2343363A1 (en) * 2005-07-01 2011-07-13 John Schrader Methods of isolating cells and generating monoclonal antibodies involving single epitope multiple staining
EP1997830A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
CA2738176C (en) * 2008-09-23 2012-01-10 Hema-Quebec Method for polyclonal immunoglobulin g production by human b cells
AU2010210073B2 (en) * 2009-02-06 2016-06-09 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Splitting gp41
US20110064760A1 (en) * 2009-08-14 2011-03-17 Cho Michael W Polypeptides comprising epitopes of hiv gp41 and methods of use
CN103403026B (zh) 2009-09-25 2016-05-11 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1中和抗体及其用途
WO2011046623A2 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Duke University Hiv-1 antibodies
EP2316920A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-04 BioNTech AG Clonal expansion of B cells
JP5873807B2 (ja) * 2010-01-08 2016-03-01 イミュソフト コーポレーション Ｂ細胞を形質導入するためのベクターおよび方法
WO2011092593A2 (en) * 2010-01-20 2011-08-04 Institute For Research In Biomedicine Hiv-1 neutralizing antibodies and uses thereof
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection

Also Published As

Publication number Publication date
CN104080805A (zh) 2014-10-01
US20180002406A1 (en) 2018-01-04
US20140342407A1 (en) 2014-11-20
US9783595B2 (en) 2017-10-10
US20140348785A1 (en) 2014-11-27
ZA201403264B (en) 2017-08-30
EP2776463A4 (en) 2015-03-25
RU2014118462A (ru) 2015-12-20
US9475862B2 (en) 2016-10-25
RU2624046C2 (ru) 2017-06-30
EP2776463B1 (en) 2017-09-20
US20160333076A1 (en) 2016-11-17
BR112014010823A2 (pt) 2017-09-12
WO2013070776A1 (en) 2013-05-16
US10047148B2 (en) 2018-08-14
EP2776463A1 (en) 2014-09-17
CN104080805B (zh) 2017-02-22
US10047147B2 (en) 2018-08-14
WO2013070776A8 (en) 2014-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10047148B2 (en) Neutralizing GP41 antibodies and their use
US10815295B2 (en) Broadly neutralizing HIV-1 antibodies that bind to the CD4-binding site of the envelope protein
US20230060304A1 (en) Neutralizing antibodies to gp120 and their use
US10035845B2 (en) Neutralizing antibodies to HIV-1 and their use
US20150044137A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
WO2015103549A1 (en) Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2012106578A1 (en) HIV NEUTRALIZING ANTIBODIES HAVING MUTATIONS IN CONSTANT DOMAIN (Fc)

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according art. 34 industrial property law
B07E Notice of approval relating to section 229 industrial property law

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: suspension of the patent application procedure
B07A Technical examination (opinion): publication of technical examination (opinion)
B09A Decision: intention to grant
B16A Patent or certificate of addition of invention granted

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/11/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.