BR112021012338A2

BR112021012338A2 - Proteínas de ligação multiespecíficas com domínios fab mutantes

Info

Publication number: BR112021012338A2
Application number: BR112021012338-5A
Authority: BR
Inventors: Marta Amaral; Garima Tiwari; Sandra Weil; Christian Beil; Ingo Focken; Gerhard Hessler; Soraya Hoelper; Jennifer Jung; Christian Lange; Wulf-Dirk Leuschner; Ercole Rao
Original assignee: Sanofi
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-09-14
Also published as: WO2020136566A1; CO2021008995A2; KR20210108421A; CN113795508A; US20200262926A1; US11965030B2; IL284140A; EP3902823A1; JP2022515424A; SG11202106525TA; CA3124796A1; TW202104257A; AU2019412561A2; MX2021007672A; AU2019412561A1

Abstract

proteínas de ligação multiespecíficas com domínios fab mutantes. a presente invenção refere-se a proteínas de ligação compreendendo uma região vl pareada com uma região vh, e uma região ch1 pareada com uma região cl, em que a região vl e região vh compreendem mutações carregadas opostas para facilitar o pareamento, e em que a região ch1 e região cl compreendem mutações para facilitar o pareamento. proteínas de ligação compreendendo um ou mais resíduos de cisteína modificados no par vh/vl para formar uma ou mais ligações de dissulfeto são também fornecidas. proteínas de ligação multiespecíficas, ácidos nucleicos codificando proteínas de ligação e proteínas de ligação multiespecíficas, vetores de expressão, células hospedeiras, composição farmacêutica e métodos de tratamento administrando as proteínas de ligação ou proteínas de ligação multiespecíficas descritas aqui são também fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍ- NAS DE LIGAÇÃO MULTIESPECÍFICAS COM DOMÍNIOS FAB MU- TANTES".

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade para o pedido EP No.

18306843.6 depositado em 24 de dezembro de 2018 e pedido EP No.

19305812.0 depositado em 21 de julho de 2019, o teor dos quais é aqui incorporado por referência para todos os propósitos.

ANTECEDENTES

[0002] Os anticorpos clássicos são proteínas em forma de Y ou imu- noglobulinas que são heterotetrâmeros formados de dois heterodímeros, consistindo em uma porção de cadeia leve e uma porção de cadeia pe- sada. Os "braços" do anticorpo compreendem um sítio de ligação ao an- tígeno e são chamados de região Fab. Anticorpos clássicos (por exemplo, aqueles produzidos por um sistema imunológico do hospedeiro) possuem dois Fabs idênticos e podem reconhecer e se ligar a um antígeno especí- fico. A criação de assimetria em uma estrutura de anticorpo nativo é um pré-requisito para a geração de proteínas de ligação multiespecíficas com duas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) ou mais especificidades de ligação. Por exemplo, separando um ou mais Fvs em diferentes braços de ligação assimétricos ou Fabs, um anticorpo biespecífico pode ser feito com a flexibilidade de ligar dois antígenos diferentes simultaneamente. Apesar dessas vantagens, no entanto, uma grande variedade de tecnolo- gias de anticorpos multiespecíficos sofrem processo e problemas de fa- bricação devido aos pareamentos incorretos de várias cadeias pesadas e leves assimétricas. Por exemplo, muitas destas tecnologias sofrem do chamado "problema da cadeia leve", em que o pareamento aleatório de duas cadeias leves diferentes com cadeias pesadas gera várias combi-

nações de pareamentos de cadeia diferentes da combinação desejada.

Em alguns casos, o problema da cadeia leve pode ser contornado pelo uso de uma cadeia leve comum, que permite a ligação a ambos os antí- genos. No entanto, isso pode não ser possível para muitos anticorpos, uma vez que este formato requer a geração de anticorpo de novo em camundongos transgênicos ou por tecnologias de exibição. Além disso, anticorpos raros, como anticorpos anti-HIV amplamente neutralizantes derivados de pacientes humanos, não podem ser adaptados a tal forma- to. Consequentemente, permanece a necessidade de soluções alternati- vas e criativas para o problema do pareamento incorreto. As séries de mutações na interface do dímero foram cuidadosamente projetadas para permitir a heterodimerização desses anticorpos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno que podem opcionalmente compreender uma variedade de mutações ao longo de uma interface de dímero que permitem a heterodimerização efi- ciente das proteínas de ligação ao antígeno.

[0004] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno compreendendo uma região VL pareada com uma região VH para formar um sítio de liga- ção ao antígeno; e uma região CH1 pareada com uma região CL, em que a região VL e região VH compreendem mutações carregadas opostas para facilitar o pareamento, e em que uma região CH1 e região CL compreendem mutações para facilitar o pareamento.

[0005] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno também compreende uma segunda região VL pareada com uma segunda região VH para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e uma segunda região CH1 pareada com uma segunda região CL.

[0006] Em algumas modalidades, um ou ambos do primeiro par VH e VL e o segundo par VH e VL compreendem mutações carregadas opos- tas para facilitar o pareamento, e um ou ambos do primeiro par CH1 e CL e o segundo par CH1 e CL compreendem mutações para facilitar o pare- amento.

[0007] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões CH1 com- preendem uma mutação de T192E e uma ou ambas regiões CL compre- endem mutações de N137K e S114A.

[0008] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões CH1 com- preendem mutações de L143Q e S188V e uma ou ambas regiões CL compreendem mutações de V133T e S176V.

[0009] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões CH1 com- preendem mutações de T192E, L143Q e S188V e uma ou ambas regi- ões CL compreendem mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[0010] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões CH1 com- preendem uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R ou L143H e uma ou ambas regiões CL compreendem uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H, em que a mutação em CH1 é uma carga oposta da mutação em CL.

[0011] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões CH1 com- preendem uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H e uma ou ambas regiões CL compreendem uma mutação de V133E, V133D, V133K, V1I33R ou V133H, em que a mutação em CH1 é uma carga oposta da mutação em CL.

[0012] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões VH com- preendem uma mutação de 39E, 39D, 39K, 39R ou 39H, e uma ou am- bas regiões VL compreendem uma mutação de 38E, 38D, 38K, 38R, ou

Q38H, em que a mutação em VH é uma carga oposta da mutação em VL.

[0013] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões VH com- preendem uma mutação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R, ou Q39H, e uma ou ambas regiões VL compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, O038K, QO38R, ou Q38H, em que a mutação em VH é uma carga oposta da mutação em VL.

[0014] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno também compreende um ou mais resíduos de cisteína modificados em um ou ambos dos pares VH/VL para formar uma ou mais ligações de dis- sulfeto.

[0015] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões VH com- preendem uma ou ambas de mutações de 44C e 105C, e uma ou ambas regiões VL compreendem uma ou ambas de mutações de 100C e 43C.

[0016] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões VH com- preendem uma mutação de 44C e uma ou ambas regiões VL compreen- dem uma mutação de 100C.

[0017] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões VH com- preendem uma mutação de 105C e uma ou ambas regiões VL compre- endem uma mutação de 43C.

[0018] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno também compreende mutações carregadas opostas em um ou ambos os pares CH1/CL.

[0019] Em algumas modalidades, as mutações carregadas opostas em um ou ambos os pares CH1/CL são selecionadas do grupo consistin- do em: K221E na região CH1 e E123K na região CL; K228D na região CH1 e D122K na região CL; L145E na região CH1 e S176K na região CL; e L128E na região CH1 e V133K na região CL.

[0020] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo pelo menos duas regiões VL respectivamente pareadas com pelo menos duas regiões VH para formar pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno e pelo menos duas regiões CH1 respectivamente pareadas com duas regiões CL, em que pelo menos um par CH1/CL compreende mutações de CH1/CL para facilitar o pareamento selecionado de:

(1) mutação de T192E (CH1) e mutações de N137K e S114A (CL), e/ou

(2) mutações de L143Q e S188V (CH1), e mutações de V133T e S176V (CL), e/ou

(3) mutações de T192E, L143Q e S188V (CH1) e mutações de N137K, S114A, V133T e S176V (CL), e/ou

(4) mutação de K221E (CH1) e mutação de E123K (CL), e/ou

(5) mutação de T192E e K221E (CH1) e mutações de N137K, S114A e E123K (CL) e/ou

(6) mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H (CH1) e mutação de S176E, S176D, S176K, S176R, ou S176H (CL), e/ou

(7) mutação de L124E, L124D, L124K, L124R, ou L124H (CH1) e mutação de V133E, V133D, V133K, V133R, ou V133H (CL), e

(8) em que quando dois pares CH1/CL compreendem muta- ções para facilitar o pareamento para dois diferentes pares VH/VL, os dois pares CH1/CL não compreendem as mesmas mutações, e em que pelo menos um par VH/VL compreende mutações car- regadas opostas para facilitar o pareamento, referidas mutações carrega- das opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na po- sição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL.

[0021] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo pelo menos duas regiões VL respectivamente pareadas com pelo menos duas regiões VH para formar pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno e pelo menos duas regiões CH1 respectivamente pareadas com duas regiões CL, em que pelo menos um par CH1/CL compreende mutações de CH1/CL para facilitar o pareamento selecionado do grupo consistindo em um ou mais de (1) uma mutação de T192E (CH1) e mutações de N137K e S114A (CL), e (2) mutações de L143Q e S188V (CH1), e mutações de V133T e S176V (CL), e (3) mutações de T192E, L143Q e S188V (CH1) e mutações de N137K, S114A, V133T e S176V (CL), (4) uma mutação de K221E (CH1) e uma mutação de E123K (CL), (5) mutações de T192E e K221E (CH1) e mutações de N137K, S114A e E123K (CL), (6) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H (CH1) e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R, ou S176H (CL), (7) uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R, ou L124H (CH1) e uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R, ou V133H (CL), (8) uma mutação de K228D (CH1) e uma mutação de D122K (CL), e (9) mutações de K221E e K228D (CH1) e mutações de D122K e E123K (CL), em que quando dois pares CH1/CL compreendem mutações para facilitar o pareamento para dois diferentes pares VH/VL, os dois pa-

res CH1/CL não compreendem as mesmas mutações, e em que pelo menos um par VH/VL compreende mutações car- regadas opostas para facilitar o pareamento, referidas mutações carrega- das opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na po- sição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K R ouH, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL.

[0022] Em algumas modalidades, na proteína de ligação ao antígeno multiespecífica, quando pelo menos dois diferentes pares VH/VL compre- endem uma mutação definida para facilitar o pareamento, em seguida pelo menos dois diferentes pares VH/VL não compreendem o mesmo conjunto de mutação.

[0023] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação ao antíge- no multiespecífica compreende pelo menos duas regiões VL respectiva- mente pareadas com pelo menos duas regiões VH para formar pelo me- nos dois sítios de ligação ao antígeno e pelo menos duas regiões CH1 respectivamente pareadas com duas regiões CL, em que pelo menos um par CH1/CL compreende mutações de CH1/CL para facilitar o pareamento selecionado do grupo consistindo em um ou mais of: (1) mutação de T192E (CH1) e mutações de N137K e S114A (CL), e/ou (2) mutações de L143Q e S188V (CH1), e mutações de V133T e S176V (CL), e/ou (3) mutações de T192E, L143Q e S188V (CH1) e mutações de N137K, S114A, V133T e S176V (CL), e/ou (4) mutação de K221E (CH1) e mutação de E123K (CL), e/ou

(5) mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H (CH1) e mutação de S176E, S176D, S176K, S176R, ou S176H (CL), e/ou (6) mutação de L124E, L124D, L124K, L124R, ou L124H (CH1) e mutação de V133E, V133D, V133K, V133R, ou V133H (CL), e (7) quando dois pares CH1/CL compreendem mutações para facilitar o pareamento para dois diferentes pares VH/VL, os dois pares CH1/CL não compreendem as mesmas mutações, e em que pelo menos um par VH/VL compreende mutações car- regadas opostas para facilitar o pareamento selecionado de mutação de 39E, QO39D, Q39K, Q39R, ou Q39H, e mutação de 038E, Q38D, O38K, O38R, ou Q38H, e em que a mutação em VH é uma carga oposta da mu- tação em VL; e quando diversos pares VH/VL, para os quais VL ou VH não estão na mesma cadeia de polipeptídeo, compreendem mutações para faci- litar o pareamento para diferentes pares VH/VL, em seguida cada par VH/VL não compreende as mesmas mutações carregadas opostas.

[0024] Em algumas modalidades, uma ou ambas regiões CH1 são operacionalmente ligadas a um domínio de heterodimerização.

[0025] Em algumas modalidades, o domínio de heterodimerização compreende um primeiro domínio Fc.

[0026] Em algumas modalidades, o primeiro domínio Fc heterodime- riza com um segundo domínio Fc, e em que o primeiro domínio Fc com- preende uma primeira região CH3 e o segundo domínio Fc compreende uma segunda região CH3.

[0027] Em algumas modalidades, a primeira região CH3 compreende uma ou ambas de mutações de S354C e T366W, e a segunda região CH3 compreende uma ou mais de mutações de Y349C, T366S, L368A e Y407V, em que as mutações facilitam a heterodimerização de domínio Fc.

[0028] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo multiespecífico compreendendo a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1); e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2); e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que pelo menos um ou ambos de par VL1 e VH1 e de par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas para facilitar o pareamento, em que pelo menos um ou ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 para facilitar o pareamento são diferentes das mutações em CH1-2 e CL2 para facilitar o pareamento.

[0029] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo multiespecífico compreendendo:

a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que pelo menos um ou ambos de par VL1 e VH1 e de par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas para facilitar o pareamento, em que pelo menos um ou ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 para facilitar o pareamento são diferentes das mutações em CH1-2 e CL2 para facilitar o pareamento.

[0030] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo:

a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo

(1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno;

(2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e

(3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo

(4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno;

(5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2);

em que heterodimerização HD1 e HD2,

em que pelo menos um ou ambos de par VL1 e VH1 e de par VL2 e VH2 compreende mutações carregadas opostas para facilitar o pa- reamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL,

em que pelo menos um ou ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 para facilitar o pareamento são diferentes das mutações em CH1-2 e CL2 para facilitar o pareamento.

[0031] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende uma mutação de T192E e CL1 compreende mutações de N137K e S114A.

[0032] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende mutações de L143Q e S188V e CL1 compreende mutações de V133T e S176V.

[0033] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende mutações de T192E, L143Q e S188V e CL1 compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[0034] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende uma mutação de T192E e CL2 compreende mutações de N137K e S114A.

[0035] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende mutações de L143Q e S188V e CL2 compreende mutações de V133T e S176V.

[0036] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende mutações de T192E, L143Q e S188V e CL2 compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[0037] Em algumas modalidades, um de ambos de CH1-1 e CH1-2 compreende uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R ou L143H e um ou ambos de CL1 e CL2 compreende uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H, em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[0038] Em algumas modalidades, um de ambos de CH1-1 e CH1-2 compreende uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H e um ou ambos de CL1 e CL2 compreende uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R ou V133H, em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2

[0039] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de 39E, 39D, 39K, 39R ou 39H, e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de 38E, 38D, 38K, 38R, ou 38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[0040] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R, ou Q39H, e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R, ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[0041] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende um ou mais resíduos de cisteína modificados em um ou am- bos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto.

[0042] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem mutações de 44C e 105C, e um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem mutações de 100C e 43C.

[0043] Em algumas modalidades, VH1 compreende uma mutação de 44C e VL1 compreende uma mutação 100C.

[0044] Em algumas modalidades, VH1 compreende uma mutação de 105C e VL1 compreende uma mutação de 43C.

[0045] Em algumas modalidades, VH2 compreende uma mutação de 44C e VL2 compreende uma mutação de 100C.

[0046] Em algumas modalidades, VH2 compreende uma mutação de 105C e VL2 compreende uma mutação de 43C.

[0047] Em algumas modalidades, VH1 compreende mutações de 39E e 44C e VL1 compreende mutações de 38K e 100C.

[0048] Em algumas modalidades, VH1 compreende mutações de 39E e 105C e VL1 compreende mutações de 38K e 43C.

[0049] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende mutações carregadas opostas no par CH1-1/CL1.

[0050] Em algumas modalidades, as mutações carregadas opostas no par CH1-1/CL1 são selecionadas do grupo consistindo em: K221E na região CH1-1 e E123K na região CL1; K228D na região CH1-1 e D122K na região CL1; L145E na região CH1-1 e S176K na região CL1; e L128E na região CH1-1 e V133K na região CL1.

[0051] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende mutações carregadas opostas no par CH1-2/CL2.

[0052] Em algumas modalidades, as mutações carregadas opostas no par CH1-2/CL2 são selecionadas do grupo consistindo em: K221E na região CH1-2 e E123K na região CL2; K228D na região CH1-2 e D122K na região CL2; L145E na região CH1-2 e S176K na região CL2; e L128E na região CH1-2 e V133K na região CL2.

[0053] Em algumas modalidades, o primeiro e segundo domínios de heterodimerização compreendem domínios Fc.

[0054] Em algumas modalidades, o primeiro domínio de heterodime- rização compreende um primeiro domínio CH3 compreendendo uma ou ambas de mutações de S354C e T366W, e o segundo domínio de hete- rodimerização compreende um segundo domínio CH3 compreendendo uma ou ambas de mutações de Y349C, T366S, L368A e Y407V, em que as mutações facilitam a heterodimerização de domínio Fc.

[0055] Em algumas modalidades, o domínio CH1-1 é ligado a um primeiro domínio CH2 e primeiro CH3, o domínio CH1-2 é ligado a um segundo domínio CH2 e segundo CH3, e em que os primeiros domínios CH2 e CH3 e os segundos domínios CH2 e CH3 dimerizam para formar um domínio Fc .

[0056] Em algumas modalidades, o primeiro domínio CH3 compreen- de uma ou ambas de mutações de S354C e T366W, o segundo domínio CH3 compreende uma ou mais de mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V, e em que as mutações facilitam a heterodimerização de domínio Fc.

[0057] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno ou uma proteína de ligação ao antígeno multies- pecífica compreendendo pelo menos duas cadeias de polipeptídeo e for- mando pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno, em que uma ca- deia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmu- la: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e uma cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura re- presentada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [1] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido,

em que o polipeptídeo de fórmula | e o polipeptídeo de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que pelo menos um ou ambos de par VL1 e VH1 e de par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, e em que o par de domínio CH1 e CL compreende mutações que facilitam o pareamento.

[0058] Em algumas modalidades, VH1 é pareado com VL1, VH2 é pareado com VL2, e CH1 é pareado com CL.

[0059] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo pelo me- nos duas cadeias de polipeptídeo e formando pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno, em que uma cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e uma cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [1] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que VH1 é pareado com VL1, VH2 é pareado com VL2, e CH1 é pareado com CL, em que o polipeptídeo de fórmula | e o polipeptídeo de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que pelo menos um ou ambos de par VL1 e VH1 e de par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat seleciona- da de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, e em que o par de domínio CH1 e CL compreende mutações que facilitam o pareamento.

[0060] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem mutações de VH44C e VH105C.

[0061] Em algumas modalidades, um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem mutações de VL43C e VL100C.

[0062] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de VH44C e um ou ambos de VL1 e VL2 com-

preendem uma mutação de VL100C.

[0063] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de VH105C e um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem uma mutação de VL43C.

[0064] Em algumas modalidades, CH1 compreende uma mutação de T192E e CL compreende mutações de N137K e S114A.

[0065] Em algumas modalidades, CH1 compreende mutações de L143Q e S188V e CL compreende mutações de V133T e S176V.

[0066] Em algumas modalidades, CH1 compreende mutações de T192E, L143Q e S188V e CL compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[0067] Em algumas modalidades, CH1 compreende uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H, CL compreende uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H, e em que a mutação em CH1 é uma carga oposta da mutação em CL.

[0068] Em algumas modalidades, CH1 compreende uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H, CL compreende uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R ou V133H, e em que a mutação em CH1 é uma carga oposta da mutação em CL.

[0069] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de 39E, 39D, 39K, 39R, ou 39H, um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de 38E, 38D, 38K, 38R, ou 38H, e em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[0070] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, O39R ou Q39H, um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, e em que a mutação em um ou ambos de VH1 e

VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[0071] Em algumas modalidades, CH1 é operativamente ligada a um domínio de dimerização.

[0072] Em algumas modalidades, o domínio de dimerização é um domínio Fc compreendendo um domínio CH2 e um domínio CH3.

[0073] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, em que duas cadeias de polipeptídeo cada compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e duas cadeias de polipeptídeo cada compreende uma estrutura repre- sentada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fec [1] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina; Fc compreende uma região de articulação de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e

L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que VH1 é pareado com VL1 para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno, VH2 é pareado com VL2 para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno, e CH1 é pareado com CL, em que os polipeptídeos de fórmula | e os polipeptídeos de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que um ou ambos do par de VL1 e VH1 e o par de VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o parea- mento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, e em que um ou ambos do par de domínio CH1 e CL compreen- dem mutações que facilitam o pareamento, e em que quando pelo menos dois pares CH1/CL compreendem mutações para facilitar o pareamento, em seguida a mutação definida em um par CH1/CL é diferente da mutação definida no outro par CH1/CL.

[0074] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, em que duas cadeias de polipeptídeo cada compreende uma estrutura representada pela fór- mula: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e duas cadeias de polipeptídeo cada compreende uma estrutura repre-

sentada pela fórmula:

VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fec [1] em que:

VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;

CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;

CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina;

Fc compreende uma região de articulação de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e

L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que os polipeptídeos de fórmula | e os polipeptídeos de fórmula 1 formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado,

em que VH1 é pareado com VL1 para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno, VH2 é pareado com VL2 para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno, e CH1 é pareado com CL, e mais particular- mente o par VH1/VL1 compreende uma primeira especificidade de liga- ção ao antígeno e a par VH2/VL2 compreende uma segunda especifici- dade de ligação ao antígeno,

em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto,

em que um ou ambos do par de VL1 e VH1 e o par de VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o parea- mento, e em que um ou ambos do par de domínio CH1 e CL compreen- dem mutações que facilitam o pareamento, e em que quando ambos os pares CH1 e CL compreendem mu- tações para facilitar o pareamento, em seguida as mutações em um par CH1 e CL são diferentes das mutações no outro par CH1 e CL para facili- tar o pareamento.

[0075] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem mutações de VH44C e VH105C.

[0076] Em algumas modalidades, um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem mutações de VL43C e VL100C.

[0077] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de VH44C e um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem uma mutação de VL100C.

[0078] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de VH105C e um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem uma mutação de VL43C.

[0079] Em algumas modalidades, CH1 compreende uma mutação de T192E e CL compreende mutações de N137K e S114A.

[0080] Em algumas modalidades, CH1 compreende mutações de L143Q e S188V e CL compreende mutações de V133T e S176V.

[0081] Em algumas modalidades, CH1 compreende mutações de T192E, L143Q e S188V e CL compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[0082] Em algumas modalidades, CH1 compreende uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H, CL compreende mutações de

S176E, S176D, S176K, S176R, ou S176H, e em que a mutação em CH1 é uma carga oposta da mutação em CL.

[0083] Em algumas modalidades, CH1 compreende uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H, CL compreende mutações de V133E, V133D, V133K, V133R ou V133H, e em que a mutação em CH1 é uma carga oposta da mutação em CL.

[0084] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de 39E, 39D, 39K, 39R, ou 39H, um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de 38E, 38D, 38K, 38R ou 38H, e em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[0085] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, O39R ou Q39H, um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, e em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[0086] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo, que formam três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura repre- sentada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL1 [1], uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura repre- sentada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-1-articulação-CH2-CH3 [1], uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula: VH3-CH1-2-articulação-CH2-CH3 [11], e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula:

VL3-CL?2 [IV], em que:

VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;

VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

CL1 é um primeiro domínio constante de cadeia leve de imu- noglobulina;

CL2 é um segundo domínio constante de cadeia leve de imu- noglobulina;

CH1-1 é um primeiro domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;

CH1-2 é um segundo domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;

CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imu- noglobulina;

CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imu- noglobulina;

articulação é uma região de articulação de imunoglobulina co- nectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que o polipeptídeo de fórmula | e o polipeptídeo de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, e em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou mais de pares VH1/VL1, VH2/VL2 e VH3/VL3 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que um ou ambos do par de VL1 e VH1 e o par de VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o parea- mento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, em que um ou ambos do par CL1 e CH1-1 e o par CL2 e CH1- 2 compreendem mutações que facilitam o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 são diferentes do que as mutações em CH1-2 e CL2.

[0087] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem mutações de VH44C e VH105C.

[0088] Em algumas modalidades, um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem mutações de VL43C e VH100C.

[0089] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de VH44C e um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem uma mutação de VL100C.

[0090] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com-

preendem uma mutação de VH105C e um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem uma mutação de VL43C.

[0091] Em algumas modalidades, um ou ambos de CH1-1 e CL1 compreendem mutações que facilitam o pareamento e um ou ambos de CH1-2 e CL2 compreendem mutações que facilitam o pareamento.

[0092] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende uma mutação de T192E e CL1 compreende mutações de N137K e S114A.

[0093] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende mutações de L143Q e S188V e CL1 compreende mutações de V133T e S176V.

[0094] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende mutações de T192E, L143Q e S188V e CL1 compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[0095] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende uma mutação de T192E e CL2 compreende mutações de N137K e S114A.

[0096] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende mutações de L143Q e S188V e CL2 compreende mutações de V133T e S176V.

[0097] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende uma mutação de T192E, L143Q e S188V e CL2 compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[0098] Em algumas modalidades, um de ambos de CH1-1 e CH1-2 compreendem uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H, um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[0099] Em algumas modalidades, um de ambos de CH1-1 e CH1-2 compreendem uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H, um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de V133E,

V133D, V133K, V133R ou V133H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[00100] Em algumas modalidades, um ou mais de VH1, VH2, e VH3 compreendem uma mutação de 39E, 39D, 39K, 39R, ou 39H, um ou mais de VL1, VL2, e VL3 compreendem uma mutação de 38E, 38D, 38K, 38R, ou 38H, e em que a mutação em um ou mais de VH1, VH2, e VH3 é uma carga oposta da mutação em um ou mais de VL1, VL2, e VL3.

[00101] Em algumas modalidades, um ou mais de VH1, VH2, e VH3 compreendem uma mutação de Q39E, Q39D, Q39K, QA39R ou Q39H, um ou mais de VL1, VL2, e VL3 compreendem uma mutação de Q38E, O38D, Q38K, O38R ou Q38H, e em que a mutação em um ou mais de VH1, VH2, e VH3 é uma carga oposta da mutação em um ou mais de VL1, VL2, e VL3.

[00102] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo: (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1, e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo: (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-

2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2, em que o terminal C de CH1-1 é operativamente ligado ao terminal N de VH2, e em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que um ou ambos do par VL1 e VH1 e o par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, em que um ou ambos do par CL1 e CH1-1 e o par CL2 e CH1- 2 compreendem mutações que facilitam o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 são diferentes do que as mutações em CH1-2 e CL2.

[00103] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende uma mutação de T192E e CL1 compreende mutações de N137K e S114A.

[00104] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende mutações de L143Q e S188V e CL1 compreende mutações de V133T e S176V.

[00105] Em algumas modalidades, CH1-1 compreende mutações de T192E, L143Q e S188V e CL1 compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00106] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende uma mutação de T192E e CL2 compreende mutações de N137K e S114A.

[00107] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende mutações de L143Q e S188V e CL2 compreende mutações de V133T e S176V.

[00108] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende mutações de T192E, L143Q e S188V e CL2 compreende mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00109] Em algumas modalidades, um de ambos de CH1-1 e CH1-2 compreende uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H, um ou ambos de CL1 e CL2 compreende uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[00110] Em algumas modalidades, um de ambos de CH1-1 e CH1-2 compreendem uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H, um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R ou V133H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[00111] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de 39E, 39D, 39K, 39R, ou 39H, um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de 38E, 38D, 38K, 38R ou 38H, e em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[00112] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, O39R ou Q39H, um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, e em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[00113] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo: (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno;

(2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1, e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo: (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2, em que o terminal C de CH1-1 é operativamente ligado ao terminal N de VH2, e em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que um ou ambos do par VL1 e VH1 e o par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat seleciona- da de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, em que um ou ambos do par CL1 e CH1-1 e o par CL2 e CH1- 2 compreendem mutações que facilitam o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 são diferentes do que as mutações em CH1-2 e CL2.

[00114] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende um ou mais resíduos de cisteína modificados em um ou am- bos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto.

[00115] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem uma mutação de 44C e uma 105C e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de 100C e 43C.

[00116] Em algumas modalidades, VH1 compreende uma mutação de 44C e VL1 compreende uma mutação de 100C.

[00117] Em algumas modalidades, VH1 compreende uma mutação de 105C e VL1 compreende uma mutação de 43C.

[00118] Em algumas modalidades, VH2 compreende uma mutação de 44C e VL2 compreende uma mutação de 100C.

[00119] Em algumas modalidades, VH2 compreende uma mutação de 105C e VL2 compreende uma mutação de 43C.

[00120] Em algumas modalidades, VH1 compreende mutações de 39E e 44C e VL1 compreende mutações de 38K e 100C.

[00121] Em algumas modalidades, VH1 compreende mutações de 39E e 105C e VL1 compreende mutações de 38K e 43C.

[00122] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende mutações carregadas opostas no par CH1-1/CL1.

[00123] Em algumas modalidades, as mutações carregadas opostas no par CH1-1/CL1 são selecionadas do grupo consistindo em: K221E na região CH1-1 e E123K na região CL1; K228D na região CH1-1 e D122K na região CL1; L145E na região CH1-1 e S176K na região CL1; e L128E na região CH1-1 e V133K na região CL1.

[00124] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende mutações carregadas opostas no par CH1-2/CL2.

[00125] Em algumas modalidades, as mutações carregadas opostas no par CH1-2/CL2 são selecionadas do grupo consistindo em: K221E na região CH1-2 e E123K na região CL2; K228D na região CH1-2 e D122K na região CL2; L145E na região CH1-2 e S176K na região CL2; e L128E na região CH1-2 e V133K na região CL2.

[00126] Em algumas modalidades, o domínio CH1-1 é ligado a um primeiro domínio CH2 e primeiro domínio CH3, o domínio CH1-2 é ligado a um segundo domínio CH2 e um segundo domínio CH3, e em que os primeiros domínios CH2 e CH3 e os segundos domínios CH2 e CH3 di- merizam para formar um domínio Fc .

[00127] Em algumas modalidades, o primeiro domínio CH3 compreen- de uma ou ambas de mutações de S354C e T366W e o segundo domínio CH3 compreende uma ou ambas de mutações de Y349C, T366S, L368A e Y407V para facilitar heterodimerização de domínio Fc.

[00128] Em algumas modalidades, o terminal C de CH1-1 é operati- vamente ligado ao terminal N de VH2 por meio de um ligante de peptí- deo.

[00129] Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo compreende um ligante (GGGGS), (SEQ ID NO: X), em que n é qualquer número intei- rode 1a5.

[00130] Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo compreende toda ou parte da sequência de uma região de articulação de uma ou mais imunoglobulina(s) selecionada(s) de IgA, IgG, e IgD.

[00131] Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo compreende a seguinte sequência: EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: X).

[00132] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1)

compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira região VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda re- gião VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve cons- tante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreendem uma mu- tação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendemm uma mutação de QO38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2 para facilitar o pare- amento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compreendem um ou mais de uma mutação de T192E, L143Q, e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem um ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T, e S176V.

[00133] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo:

a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2); em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreen- dem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou am- bos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, O38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2 para facili- tar o pareamento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de uma mutação de T192E, L143Q e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00134]Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreen- dendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi-

ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E, K221D, K221K, K221R, ou K221H e um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123E, E123D, E123K, E123R ou E123H, em que a mutação em um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2 para facilitar o pareamento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de uma mutação de T192E, L143Q e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00135] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo

(1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2); em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E, K221D, K221K, K221R ou K221H e um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123E, E123D, E123K, E123R ou E123H, em que a mutação em um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2 para facilitar o pareamento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de uma mutação de T192E, L143Q e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00136] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons-

tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreen- dem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou am- bos de VL1 e VL2 compreendemm uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, O38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2 para facili- tar o pareamento, em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E, K221D, K221K, K221R ou K221H e um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123E, E123D, E123K, E123R ou E123H, em que a mutação em um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2 para facilitar o pareamento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de uma mutação de T192E, L143Q e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00137] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo:

a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo

(2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo

(3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e

(4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2);

em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreen- dem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou am- bos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, O38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2 para facili- tar o pareamento,

em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E, K221D, K221K, K221R ou K221H e um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123E, E123D, E123K, E123R ou E123H, em que a mutação em um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2 para facilitar o pareamento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de uma mutação de T192E, L143Q e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00138] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreen- dem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou am- bos de VL1 e VL2 compreendemm uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, O38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2 para facili- tar o pareamento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de uma mutação de T192E, L143Q e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T e S176V, e em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreen- dem uma mutação de 44C e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendemm uma mutação de 100C.

[00139] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2); em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreen- dem uma mutação de Q39E, QO39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou am- bos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, O38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2 para facili- tar o pareamento, e em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de uma mutação de T192E, L143Q e S188V e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de uma mutação de N137K, S114A, V133T e S176V, e em que pelo menos um ou ambos de VH1 e VH2 compreen- dem uma mutação de 44C e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendemm uma mutação de 100C.

[00140] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2); em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[00141] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo compreendendo: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo

(1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2); em que pelo menos um ou ambos de CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H e pelo menos um ou ambos de CL1 e CL2 compreendem uma mutação de V133E, V133D, V133K, V1S3R ou V133H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[00142] Em algumas modalidades, CH1-1 também compreende uma mutação de T192E e CL1 compreende mutações de N137K e S114A.

[00143] Em algumas modalidades, CH1-2 compreende uma mutação de T192E e CL2 compreende mutações de N137K e S114A.

[00144] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preende uma mutação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R, ou Q39H, e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R, ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2.

[00145] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende um ou mais resíduos de cisteína modificados em um ou am- bos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto.

[00146] Em algumas modalidades, um ou ambos de VH1 e VH2 com- preendem mutações de 44C e 105C, e um ou ambos de VL1 e VL2 com- preendem mutações de 100C e 43C.

[00147] Em algumas modalidades, VH1 compreende uma mutação de 44C e VL1 compreende uma mutação de 100C.

[00148] Em algumas modalidades, VH1 compreende uma mutação de 105C e VL1 compreende uma mutação de 43C.

[00149] Em algumas modalidades, VH2 compreende uma mutação de 44C e VL2 compreende uma 100C.

[00150] Em algumas modalidades, VH2 compreende uma mutação de 105C e VL2 compreende uma mutação de 43C.

[00151] Em algumas modalidades, VH1 compreende mutações de 39E e 44C e VL1 compreende mutações de 38K e 100C.

[00152] Em algumas modalidades, VH1 compreende mutações de 39E e 105C e VL1 compreende mutações de 38K e 43C.

[00153] Em algumas modalidades, o anticorpo multiespecífico também compreende mutações carregadas opostas em um ou ambos do par CH1-1/CL1 e o par CH1-2/CL2.

[00154] Em algumas modalidades, as mutações carregadas opostas em um ou ambos do par CH1-1/CL1 e o par CH1-2/CL2 compreendem K221E em um ou ambos da região CH1-1 e região CH2-2 e E123K em um ou ambos da região CL1 e região CL2.

[00155] Em algumas modalidades, o domínio CH1-1 é operativamente ligado a um primeiro domínio Fc compreendendo um primeiro CH2 e pri- meiro domínio CH3, e o domínio CH1-2 é operativamente ligado a um segundo domínio Fc compreendendo um segundo CH2 e segundo domí- nio CH3, e em que o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc dimeri-

zam.

[00156] Em algumas modalidades, o primeiro domínio CH3 compreen- de uma ou ambas de mutações de S354C e T366W, o segundo domínio CH3 compreende uma ou mais de mutações Y349C, T366S, L368A e Y407V, e em que as mutações facilitam a heterodimerização de domínio Fc.

[00157] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno compreendendo: um domínio de ligação ao antígeno e uma região CH1 de ca- deia pesada constante pareada com uma região CL de cadeia leve cons- tante, em que o domínio de ligação ao antígeno seletivamente se |i- ga a um antígeno alvo, e em que uma região CH1 e região CL compre- endem um ou ambos de: a) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R ou L143H na região CH1 e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H na região CL; e b) uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H na região CH1 e uma mutação de V133E, V133D, V133K, VI33R ou V133H na região CL, em que o resíduo mutado na região CH1 tem uma carga opos- ta do resíduo mutado na região CL.

[00158] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação compreendendo um domínio de ligação à proteína; e uma região CH1 pareada com uma região CL, em que o domínio de ligação à proteína seletivamente se liga a um antígeno alvo, e em que uma região CH1 e região CL compreen-

dem um ou ambos de: a) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R ou L143H na região CH1 e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H na região CL; e b) uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H na região CH1 e uma mutação de V133E, V133D, V133K, VI33R ou V133H na região CL, em que a mutação na região CH1 é uma carga oposta da mu- tação na região CL.

[00159] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno compreendendo uma região CH1 de cadeia pesada constante pareada com uma região CL de cadeia leve constante, em que o domínio de ligação ao antígeno seletivamente se |i- ga a um antígeno alvo, e em que uma região CH1 e região CL compre- endem um ou ambos de: a) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R ou L143H na região CH1 e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H na região CL; e b) uma mutação de K221E e K228D na região CH1 e uma mu- tação de D122K e E123K na região CL, em que o resíduo mutado na região CH1 tem uma carga opos- ta do resíduo mutado na região CL.

[00160] Em algumas modalidades, a proteína de ligação também compreende uma mutação K221E na região CH1 e uma mutação E123K na região CL.

[00161] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica compreendendo um pri-

meiro Fab, referido primeiro Fab compreendendo domínios CH1-1, VH1, CL1 e VL1, e um segundo Fab, referido segundo Fab compreendendo domínios CH1-2, VH2, CL2 e VL2, em que primeiro Fab e segundo Fab são selecionados de uma das seguintes alternativas: i.

Um primeiro Fab compreende mutação de 143R em CH1- 1, mutação de 39K em VH1, mutação de 176E em CL1, mutação de 38E em VL1 e um segundo Fab compreende mutação de 143E em CH1-2, mutação de 39E em VH2, mutação de 176R em CL2 e mutação de 38K em VL2; ii.

Um primeiro Fab compreende mutação de 143K em CH1- 1, mutação de 39K em VH1, mutação de 176E em CL1, mutação de 38E em VL1 e um segundo Fab compreende mutação de 143E em CH1-2, mutação de 39E em VH2, mutação de 176K em CL2 e mutação de 38K em VL2; iii.

Um primeiro Fab compreende mutação de 143H em CH1- 1, mutação de 39K em VH1, mutação de 176E em CL1, mutação de 38E em VL1 e um segundo Fab compreende mutação de 143E em CH1-2, mutação de 39E em VH2, mutação de 176H em CL2 e mutação de 38K em VL2; iv.

Um primeiro Fab compreende mutação de 143R em CH1- 1, mutação de 39K em VH1, mutação de 176D em CL1, mutação de 38E em VL1 e um segundo Fab compreende mutação de 143D em CH1-2, mutação de 39E em VH2, mutação de 176R em CL2 e mutação de 38K em VL2; v.

Um primeiro Fab compreende mutação de 143K em CH1- 1, mutação de 39K em VH1, mutação de 176D em CL1, mutação de 38E em VL1 e um segundo Fab compreende mutação de 143D em CH1-2, mutação de 39E em VH2, mutação de 176K em CL2 e mutação de 38K em VL2; vi. Um primeiro Fab compreende mutação de 143H em CH1- 1, mutação de 39K em VH1, mutação de 176D em CL1, mutação de 38E em VL1 e um segundo Fab compreende mutação de 143D em CH1-2, mutação de 39E em VH2, mutação de 176H em CL2 e mutação de 38K em VL2.

[00162] Em algumas modalidades, uma região CH1 é operacionalmen- te ligada a um domínio de heterodimerização.

[00163] Em algumas modalidades, o domínio de heterodimerização compreende um primeiro domínio Fc.

[00164] Em algumas modalidades, o primeiro domínio Fc heterodime- riza com um segundo domínio Fc, e em que o primeiro domínio Fc com- preende uma primeira região CH3 e o segundo domínio Fc compreende uma segunda região CH3.

[00165] Em algumas modalidades, a primeira região CH3 compreende uma ou ambas de mutações de S354C e T366W, e a segunda região CH3 compreende uma ou mais de mutações de Y349C, T366S, L368A e Y407V, em que as mutações facilitam a heterodimerização de domínio Fc.

[00166] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno também compreende pelo menos um par VH/VL compreendendo muta- ções carregadas opostas para facilitar o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL.

[00167] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação ao antíge-

no multiespecífica ou proteína de ligação ao antígeno compreende três HCDRs para cada região VH e três LCDRs para cada região VL, e tam- bém compreende especificidade de ligação a um ou mais antígenos alvos ou um ou mais epítopos alvos. Em algumas modalidades, as HCDRs, LCDRs e/ou antígeno são descritos aqui. Em algumas modalidades, a HCDRs, LCDRs e/ou antígeno são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as HCDRs, LCDRs e/ou antígeno foram recentemente iden- tificados ou descobertos.

[00168] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de ligação ao antígeno compreendendo: um domínio de ligação ao antígeno; e uma região CH1 de cadeia pesada constante pareada com uma região CL de cadeia leve constante, em que o domínio de ligação ao antígeno seletivamente se |i- ga a um antígeno alvo, e em que uma região CH1 e região CL compre- endem um ou ambos de: a) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H na região CH1 e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H na região CL; e b) uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H na região CH1 e uma mutação de V133E, V133D, V133K, VI33R ou V133H na região CL, em que o resíduo mutado na região CH1 tem uma carga opos- ta do resíduo mutado na região CL.

[00169] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno também compreende mutações de CH1/CL para facilitar o pareamento selecionado do grupo consistindo em um ou mais de: (1) uma mutação de T192E (CH1) e mutações de N137K e

S114A (CL), (2) mutações de L143Q e S188V (CH1), e mutações de V133T e S176V (CL), (3) mutações de T192E, L143Q e S188V (CH1) e mutações de N137K, S114A, V133T e S176V (CL), (4) uma mutação de K221E (CH1) e uma mutação de E123K (CL), (5) uma mutação de K228D (CH1) e uma mutação de D122K (CL), e (6) mutações de K221E e K228D (CH1) e mutações de D122K e E123K (CL), em que quando dois pares CH1/CL compreendem muta- ções para facilitar o pareamento para dois diferentes pares VH/VL, os dois pares CH1/CL não compreendem as mesmas mutações.

[00170] Em algumas modalidades, uma região CH1 é operacionalmen- te ligada a um domínio Fc.

[00171] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando o an- ticorpo multiespecífico ou proteína de ligação ao antígeno, é fornecida. Em algumas modalidades, um kit compreendendo uma ou mais molécu- las de ácido nucleico isoladas compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo codificando a proteína de ligação ao antígeno multiespecí- fica ou proteína de ligação ao antígeno, é fornecido.

[00172] Em algumas modalidades, um vetor de expressão compreen- dendo uma molécula de ácido nucleico é fornecido. Em algumas modali- dades, um Kkit compreendendo um ou mais vetores de expressão com- preendendo uma ou mais das moléculas de ácido nucleico é fornecido.

[00173] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira isolada compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico ou um ou mais vetores de expressão, é fornecida. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira isolada compreendendo o Kit de moléculas de ácido nucleico ou o Kit de vetores de expressão é fornecida.

[00174] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero ou uma célula de inseto.

[00175] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo multiespecífico ou prote- ína de ligação ao antígeno é fornecida.

[00176] Em algumas modalidades, um método de tratar um distúrbio em que atividade de antígeno é prejudicial, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno ou anticorpo multiespecifi- ca é fornecido.

[00177] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo codificando uma proteína de ligação ao antígeno ou anticorpo multiespecífica é forne- cido.

[00178] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira expressan- do uma proteína de ligação ao antígeno ou anticorpo multiespecífica é fornecida.

[00179] Em algumas modalidades, um método de produzir uma proteí- na de ligação ao antígeno ou anticorpo multiespecífica compreendendo cultura da célula hospedeira sob condições, de tal modo que, uma proteí- na de ligação ao antígeno ou anticorpo multiespecífica seja expressa, é fornecido. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação ao antíge- no ou anticorpo multiespecífica para uso como um medicamento é forne- cida.

[00180] O sumário da invenção descrito acima é não limitante e outras características e vantagens das proteínas de ligação ao antígeno e méto- dos descritos serão aparentes da seguinte breve descrição das figuras, descrição detalhada da invenção e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00181] FIG. 1A- FIG.1C esquematicamente retrata formatos de pro- teína de ligação ao antígeno de variável dupla cruzada (CODV) com di- versas diferentes mutações para realçar a heterodimerização. FIG. 1A retrata mutações DE CH1/kappa "O" sobre CODV-Fab (CH1: L1430Q, S188V; Ck: V133T, S176V) e "A" sobre Fab2 (CH1: T192E; Ck: N137K, S114A). FIG. 1B retrata mutações sobre CODV-Fab (VH39E/VL38K + O) e Fab2 (VH39K/VL38E + A). FIG. 1C retrata mutações sobre CODV-Fab ([VH39E/VL38K + O] + [VH44Cys/VL100Cys] ou [VH105Cys/VL43Cys]) e Fab2 ([VH39K/VL38E + A] + [VH44Cys/VL100Cys] ou [VH105Cys/ VL43Cys]).

[00182] FIG.2A- FIG.2G graficamente retrata os resultados para Ta- bela 5. FIG. 2A retrata resultados para o anticorpo WT CODV. FIG. 2B retrata resultados para um anticorpo CODV com somente as mutações de CH1/Ck. FIG. 2C retrata resultados para uma combinação de muta- ção de carga (CM) e CH1/Ck. FIG. 2D retrata resultados para o anticorpo CODV somente estabilizado por dissulfeto (ds). FIG. 2E retrata resulta- dos para uma combinação de mutação de CH1/Ck e ds. FIG. 2F retrata resultados para uma combinação de mutação de CM e ds. FIG. 2G retra- ta resultados para a combinação de todos os três conjuntos de mutação, CH1/Ck, CM, e ds estabilizado, em um anticorpo CODV.

[00183] FIG.3A- FIG.3D esquematicamente retrata formatos de anti- corpo Fabs tandem em configurações abertas (FIG. 3A, FIG. 3B) e fe- chadas (FIG. 3C, FIG. 3D). FIG. 3A mostra configuração aberta com mu-

tações de CH1/kappa "A" sobre Fab1 (CH1: T192E; Ck: N137K, S114A) e "O" sobre Fab2 (CH1: L143Q, S188V; Ck: V133T, S176V. FIG. 3B mostra configuração aberta com mutações sobre Fab1 (VH39K/VL38E + A) e Fab2 (VH39E/VL38K + O). FIG. 3C mostra configuração fechada com mutações de CH1/kappa A sobre Fab1 (CH1: T192E; Ck: N137K, S114A) e O sobre Fab2 (CH1: L143Q, S188V; Ck: V133T, S176V). FIG. 3D mos- tra configuração fechada com mutações sobre Fab1 (VH39K/VL38E + A) e Fab2 (VH39E/VL38K + O).

[00184] FIG. 4 retrata os resultados de SEC e análise de HIC para Fabs tandem na configuração aberta em formatos de WT, CH1/Ck, e CH1/Ck + CM.

[00185] FIG.5A-FIG.5D retrata os resultados de análise de HIC, produção, e afinidade de ligação para um anticorpo Fab tandem anti- CDA40 x anti-PD-L1 nas configurações abertas e fechadas. FIG. 5A mos- tra uma configuração fechada com mutações de CH1/Ck somente. FIG. 5B mostra uma configuração fechada com permuta de domínio Fab com mutações de CH1/Ck somente. FIG. 5C mostra uma configuração fecha- da com mutações de CH1/Ck e CM. FIG. 5D mostra uma configuração aberta com mutações de CH1/Ck e CM.

[00186] FIG.6A-FIG.6C retrata os resultados de análise de HIC, produção, e afinidade de ligação para um anticorpo Fab tandem anti-PD- 1 x anti-OX40 nas configurações abertas e fechadas. FIG. 6A mostra uma configuração fechada com mutações de CH1/Ck somente. FIG. 6B mostra uma configuração aberta com mutações de CH1/Ck somente. FIG. 6C mostra uma configuração aberta com mutações de CH1/Ck e CM.

[00187] FIG.7A- FIG.7B retrata resultados de pureza para um anti- corpo Fab tandem anti-4-1BB x anti-PD-L1 (FIG. 7A) e um anticorpo Fab tandem anti-4-1BB x anti-PD-1 (FIG. 7B). Ambos os anticorpos são na configuração aberta com mutações de CH1/Ck e CM.

[00188] FIG.8A- FIG.8B esquematicamente retrata formatos de anti- corpos biespecíficos em forma de Y com diversas diferentes mutações para realçar a heterodimerização. FIG. 8A mostra mutações de CH1/kappa "O" sobre Fab1 (CH1: L143Q, S188V; Ck: V133T, S176V) e "A" sobre Fab2 (CH1: T192E; Ck: N137K, S114A). FIG. 8B mostra muta- ções sobre Fab1 (VH39E/VL38K + O) e Fab2 (VH39K/VL38E + A).

[00189] FIG.9A- FIG. 9C retrata resultados de pureza para um anti- corpo anti-PD-1 x anti-OX40. NanoDSF (fluorimetria de varredura dife- rencial) foi usado para avaliar estabilidade térmica dos anticorpos para início T. HIC foi usado para avaliar pureza. Anticorpo de tipo selvagem é mostrado na FIG. 9A. Mutações de CH1/Ck (Fab1 = CH1: L1430Q, S188V; Ck: V133T, S176V) e (Fab2 = CH1: T192E; Ck: N137K, S114A) são mostradas na FIG. 9B. Mutações de CH1/Ck e CM(Fab1i = CH1: L143Q, S188V; Ck: V133T, S176V; VH39E/VL38K) e (Fab2 = CH1: T192E; Ck: N137K, S114A; VH39K/VL38E) são mostradas na FIG. 9C.

[00190] FIG.10A- FIG. 10L retrata perfis SEC e HIC para vários anti- corpos anti-PD-1 x anti-OX40 com diversas diferentes combinações de mutações. As mutações específicas são recitadas na Tabela 9 abaixo.

[00191] FIG.11A-FIG.11E retrata dados de pareamento incorreto de cadeia para vários anticorpos em forma de Y. FIG. 11A retrata dados de pareamento incorreto para anticorpos anti-PD-1 x anti-GITR. FIG. 11B retrata dados de pareamento incorreto para anticorpos anti-TNF x anti- GITR. FIG. 11C retrata dados de pareamento incorreto para anticorpos anti-TNF x anti-OX40. FIG. 11D retrata dados de pareamento incorreto para anticorpos anti-CD40 x anti-PD-L1. FIG. 11E retrata dados de pare- amento incorreto para anticorpos anti-CD3 x anti-CD123. As mutações específicas e dados de caracterização biofísicos são recitados na Tabela 11 abaixo.

[00192] FIG.12 retrata um ensaio citotóxico de células panT humanas contra células alvo THP-1 coincubadas com moléculas CD3xCD123- hIgG1-LALA biespecíficas. As células efetoras T e células alvo THP-1 marcadas por CFSE foram semeadas em uma relação efetora para alvo de 10:1 e coincubadas com diluições seriais de respectivas moléculas biespecíficas (10 nM — O nM) durante 20 horas a 37 ºC. As células mortas foram manchadas com 7-AAD e medidas por citometria de fluxo. A ativi- dade citotóxica foi calculada com base na porcentagem de células alvo THP-1 mortas (7-AAD/CFSE duplo positivo). Os dados mostram células alvo mortas [%] contra concentração de moléculas biespecíficas [DM] co- mo média de dois doadores saudáveis representativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO |. DEFINIÇÕES

[00192] “De modo que a invenção possa ser mais facilmente entendida, os termos selecionados são abaixo definidos.

[00193] “Números de posição de sequência usados aqui se referem à numeração Kabat (Kabat, E.A. et a/., Sequences of proteins of immuno- logical interest. 5a Edição - US Department of Health e Human Services, publicação NIH nº 91-3242, pp 662,680,689, 1991).

[00194] “Como usado aqui, o vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais; aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a-dissubstituídos, aminoácidos N-alquila, ácido lático, e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para as cadeias de polipeptídeo das proteínas de ligação descritas aqui. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, c-N,N N-trimetillisina, c-N- acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3- metilhistidina, 5-hidroxilisina, u-N-metilarginina, e outros aminoácidos sim- ilares e iminoácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina). No polipeptídeo no- tação usada aqui, a direção da mão esquerda é a direção da terminção amino e a direção da mão direita é a direção da terminação carboxila, de acordo com o uso padrão e convenção. Resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades de cadeia lateral comuns (veja a Tabela 1). Tabela 1 — Resíduos de aminoácido por classes. Propriedades de carga/ Grupo lateral Aminoácido mae o fu us hidrofóbico não polar

O REA

[00195] Substituições de aminoácido conservativas podem envolver troca de um membro de uma dessas classes com outro membro da mesma classe. Substituições de aminoácido conservativas podem abranger resíduos de aminoácido de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados pela síntese química de peptídeos ao invés da síntese em sistemas biológicos. Estes incluem os peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de resíduos de aminoácido. As sub- stituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.

[00196] “Como usado aqui, o termo "mutação" ou "mutado" refere-se a uma alteração da sequência de aminoácidos por deleção, inserção e / ou substituição de um ou mais aminoácidos. Em particular, refere-se a uma substituição. Uma mutação é introduzida em relação a uma dada se- quência, por exemplo, a sequência de aminoácido de um par VL1 e / ou VH1 que reconhece especificamente um primeiro antígeno.

[00197] “Como usado aqui, uma "Mutação T192E (CH1)" refere-se uma substituição de um resíduo de treonina (T) por um resíduo de ácido glu- tâmico (E), no domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobu- lina de uma proteína de ligação ao antígeno, na posição Kabat 192.

[00198] “Como usado aqui, um "conjunto de mutação" refere-se a um grupo de diferentes mutações presentes em uma sequência.

[00199] Como usado aqui, o termo "variante" refere-se a uma sequên- cia de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos da qual é derivada. À determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências é realizada usando o algoritmo matemático de Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877, 1993. Tal algoritmo é incorporado aos programas BLASTN e BLASTP de Altschul et a/. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Para obter alinhamentos gapped para fins comparativos, Gap- ped BLAST é utilizado conforme descrito em Altschul et a/. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. Quando utilizando os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas são utilizados. Alternativamente, uma variante também pode ser definida co-

mo tendo até 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 substituições de aminoácidos, em particular substituições conservativas de aminoácidos. As substituições conservativas são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Uma visão ge- ral das propriedades físicas e químicas dos aminoácidos é fornecida na Tabela 1 acima. Em uma modalidade particular, substituições conservati- vas são substituições feitas com aminoácidos tendo pelo menos um pro- priedade de acordo com a Tabela 1 em comum (isto é, da coluna 1 e / ou 2). O termo "variante" também inclui fragmentos. Um fragmento tem uma deleção N-terminal e / ou C-terminal de até 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 aminoácido (s) no total. Além disso ou alternativamente, a variante pode ser modificada, por exemplo, por adições de aminoácidos N-terminal e / ou C-terminal de até 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 amino ácido (s) no total.

[00200] “Como usado aqui, o termo "antígeno" ou "antígeno alvo" ou "alvo do antígeno" refere-se a um molécula ou uma porção de uma molécula (por exemplo, epítopo) que é capaz de ser especificamente lig- ado por uma proteína de ligação descrita aqui, e adicionalmente é capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de ligação específica a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno alvo pode ter um ou mais epitopes. Com respeito a cada antígeno alvo reconhecido por uma proteína de ligação, a proteína de ligação é capaz de competir com um anticorpo intacto que reconhece o antígeno alvo.

[00201] Como usado aqui, o termo "epítopo" refere-se a qualquer de- terminante, por exemplo, um determinante de polipeptídeo, capaz de es- pecificamente se ligar a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em certas modalidades, determinantes de epítopo incluem agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativas tais como aminoácidos,

cadeias laterais de açucar, grupos fosforila, ou grupos sulfonila, e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimencionais específicas e/ou características de carga especificas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligado por um anticorpo ou por um fragmen- to de ligação ao antígeno de um anticorpo ou por uma proteína de ligação. Em certas modalidades, uma proteína de ligação é referida es- pecificamente ligar-se a um antígeno quando é preferivelmente reconhe- ce seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou ma- cromoléculas. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação é refe- rida especificamente ligar-se a um antígeno quando a constante de dis- sociação de equilíbrio é < 10º M, quando a constante de dissociação de equilíbrio é < 1º M, ou quando a constante de dissociação é < 10º M.

[00202] “Como usado aqui, o termo "proteína de ligação ao antígeno" ou "proteína de ligação" ou "polipeptídeo de ligação" refere-se a um poli- peptídeo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo) que con- tém pelo menos um sítio de ligação que é responsável por seletivamente ligar-se a um antígeno alvo de interesse (por exemplo, um antígeno hu- mano). Sítios de ligação exemplares incluem, porém, não estão limitados a, um domínio variável de anticorpo, um sítio de ligação ao ligante de um receptor, ou a receptor de sítio de ligação de um ligante. Em certos as- pectos, os polipeptídeos de ligação compreendem multiple (por exemplo, dois, três, quatro, ou mais) sítios de ligação. Em certos aspectos, a proteína de ligação não é uma enzima terapêutica.

[00203] “Como usado aqui a "domínio de heterodimerização" ou "HD" refere-se a uma subuniddade de uma proteína de ligação biespecífica, triespecífica ou multiespecífica que facilita, direciona ou força a correta montagem de cadeias leves e suas cadeias pesadas cognatas para re- sultar na proteina desejada enquanto prevenindo pareamento imperfeito das respectivas cadeias leves ou pesadas.

[00204] “Como usado aqui, uma proteína de ligação "multiespecífica" é uma proteína de ligação que liga dois ou mais antígenos, e/ou dois ou mais diferentes epítopos. Uma proteína de ligação multiespecífica que liga dois antígenos, e/ou dois diferentes epígopos, é também referido aqui como uma proteína de ligação "biespecífica". A multiespecífica proteína de ligação que liga três antígênos, e/ou três diferentes epítopos, é tam- bém referido aqui como uma "proteína de ligação triespecífica".

[00205] Como usado aqui, o termo "Fc heterodimerização" ou "frag- mento funcional de heterodimerização de Fc" refere-se a uma forma mu- tante do domínio constante, por exemplo, o CH2-CH3 ou CH2-CH3-CH4, que é mutado em relação a uma parte Fc de ocorrência natural em que não forma mais homodímeros, mas forma um heterodímero com uma parte Fc mutada correspondentemente . Assim, o termo refere-se a uma parte das duas cadeias que formam um heterodímero. Vários desses pares são conhecidos na técnica e compreendem, por exemplo, variantes de botão no buraco (KIH) ou variantes EV-RWT.

[00206] [00206] Ridgeway e colegas de trabalho geraram uma inter- face CH3 favorecendo a montagem heterodimérica substituindo pe- quenas cadeias laterais em uma interface CH3 com cadeias laterais ma- iores para criar um botão e substituir grandes cadeias laterais no outro domínio CH3 com cadeias laterais menores para gerar um buraco. O teste de tais variantes demonstrou uma heterodimerização preferencial. As mutações botões em buracos originais foram posteriormente esten- didas para identificar outras combinações adequadas por exibição de fago que foram usadas para gerar anticorpos IgG biespecíficos testando substituições adicionais permitindo a formação de ligações de dissulfeto. As variantes botões em buraco são descritas adicionalmente na Patente

U.S. No. 5.732.168 e Patente U.S. No. 8.216.805, que são aqui incor- poradas por referência. Assim, em uma modalidade, o domínio CH3 de um domínio Fc ou domínio de heterodimerização contém as mutações Y349C, T366S, L368A, e Y407V, e o domínio CH3 de outro domínio Fc ou domínio de heterodimerização contém as mutações S354C e T366W (posição do aminoácido sendo indicada por referência a uma sequência 1961).

[00207] Como usado aqui, o termo "homodimerization domain" refere- se a um domínio que medeia a homodimerização de domínios semelhan- tes, por exemplo, duas cadeia pesadas. O pareamento0O da cadeia pe- sada é mediado pelo último domínio da região constante, isto é, CH3 em moléculas de IgG, que forma complexos de homodímero de alta afinidade (KD de aproximadamente 10 pM). Outras interações residem na região de articulação responsável pela ligação covalente de duas cadeias pe- sadas, que se formam após a montagem da cadeia pesada. A interação em um homodímero CH3 envolve aproximadamente 16 resíduos na inter- face CH3-CH3, como mostrado para o CH3 y1 humano com via formada por 6 resíduos (T366, L368, F405, Y407 e K409) no centro da interface contribuindo fortemente para a estabilidade. Os domínios de homodimer- ização incluem, mas não estão limitados a, regiões Fc e variantes modifi- cadas efetoras das mesmas e fragmentos de qualquer de, domínios CH2 ou fragmentos do mesmo, domínios CH3 ou fragmentos do mesmo, domínios CH4 ou fragmentos ou similares.

[00208] [00208] Anticorpos de ocorrência natural tipicamente com- preendem um tetrâmero. Cada tal tetrâmero é tipicamente composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" de tamanho natural (normalmente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" inteira (tipicamente tendo um peso molecular de cerca de 50 a 70 kDa). Os termos "cadeia pesada" e "cadeia leve", como usados aqui, referem-se a qualquer polipeptídeo de imunoglobulina com sequência de domínio variável suficiente para con- ferir especificidade para um antígeno alvo. A porção amino-terminal de cada cadeia leve e pesada inclui tipicamente um domínio variável de cer- ca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que normalmente são re- sponsáveis pelo reconhecimento do antígeno. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia normalmente define um domínio constante responsável pela função efetora. Assim, em um anticorpo de ocorrência natural, um polipeptídeo de imunoglobulina IgG de cadeia pesada de tamanho natural inclui um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2, e CH3), em que o domínio VH é no terminal amino de o polipeptídeo e o domínio CH3 está no terminal carboxila, e um polipeptídeo de imuno- globulina de cadeia leve de tamanho natural inclui um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), em que o domínio VL está no terminal amino do polipeptídeo e o domínio CL está no terminal carboxila.

[00209] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno multiespecífica da invenção compreende um ou mais domínios VH de qualquer uma das sequências de domínio VH citadas nas Tabelas 2,3, e

4. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno multies- pecífica da invenção compreende um ou mais domínios VL de qualquer uma das sequências de domínio VL citadas nas Tabelas 2, 3, e 4. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno multiespecífica da invenção compreende um ou mais domínios VH de qualquer uma das sequências de domínio VH citadas nas Tabelas 2, 3, e 4, pareadas com um ou mais domínios VL de qualquer uma das sequências de domínio VL citadas nas Tabelas 2,3, e 4.

[00210] Cadeias leve humanas são tipicamente classificadas como cadeias leves kappa e lambda, e cadeia pesadas humanas são tipica- mente classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou épsilon, e define o isótipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG tem diversas subclasses, incluindo, porém não limitado a, I9G1, I1gG2, I9G3, e I9gG4. IgM has subclasses including, mas não limitado a, IgM1 e IgM2. IgA é similarmente subdivididos em subclasses incluindo, mas não limitado a, IgA1 e IgA2. dentro de cadeias leves e pesadas de tamanho natural, os domínios variáveis e constantes tipicamente são unidos por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pe- sada também incluindo uma região "D" de cerca de mais 10 aminoácidos. Veja, por exemplo, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989), que é incorporado por referência em sua íntegra para todos os propósitos. As regiões variáveis de cadapar de cadeia leve/pesada normalmente formam um sítio de ligação ao antígeno. Os domínios variáveis de anticorpos de ocorrência natural normalmente exi- bem a mesma estrutura geral de regiões de estrutura relativamente con- servadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par tipicamente são alinhadas pelas regiões de es- trutura, que podem possibilitar ligação a um epítopo específico. Da termi- nação amino para a terminação carboxila, ambos os domínios variáveis de cadeia leve e pesada normalmente compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FRA4.

[00211] “Como usado aqui, o termo "conjuntos CDR" refere-se a um grupo de três CDRs que ocorre emu ma região variável única capaz de ligação ao antígeno. Os limites exatos destas CDRs foram definidos diferentemente de acordo com diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOG-

ICAL INTEREST (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) e (1991)) não fornece somente um sistema de numeração de resíduo não ambíguo aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas tam- bém fornece limites de resíduo precisos que definem as três CDRs. Estas CDRs podem ser referidas como CDRs Kabat. Chothia e cotrabalhadores (Chothia e Lesk, 1987, J. Affol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) descobriram que certas subporções dentro CDRs Kabat adotam conformações de cadeia principal de peptídeo quase idên- ticas, a despeito de ter grande diversidade no nível de sequência de ami- noácido. Estas subporções foram designadas como L1, L2, e L3 ou H1, H2, e H3 onde o "L" e o "H" designam as regiões de cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente. Estas regiões podem ser referidas como CDRs Chothia, que têm limites que se sobrepõem com CDRs Kabat. Outros lim- ites que definem CDRs que se sobrepõem com as CDRs Kabat foram descritos por Padlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol. 262(5): 732-45; e Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-

77. Ainda outras definições de limite de CDR não podem restritamente seguir um dos sistemas descritos aqui, mas todavia se sobrepõem com as CDRs Kabat, embora possam ser encurtados ou alongados à luz de predição ou descobertas experimentais que resíduos particulares ou grupos de resíduos ou mesmo CDRs inteiras não impactam signiífica- tivamente a ligação ao antígeno. Os métodos usados aqui podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora certas modalidades usem CDRs definidas por Kabat ou Chothia. Identifi- cação de CDRs preditas usando a sequência de aminoácido é bem conhecida no campo, tal como em Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of anticorpo variable domains," In Antibody Engineer- ing, Vol. 2. Kontermann R., Dikel S., eds. Springer-Verlag, Berlin, p. 33-51

(2010). A sequência de aminoácido do domínio variável de cadeia pesada e/ou leve pode ser also inspecionada para identificar as sequências das CDRs por outros métodos convencionais, por exemplo, por comparação a sequências de aminoácido conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade de sequência. As sequências numeradas podem ser alinhadas a olho, ou empregando um programa de alinhamento tal como um dos conjuntos de programas CLUSTAL, como descrito em Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Modelos moleculares são convencionalmente usados para corretamente delinearem estrutura e regiões de CDR e desse modo corrigem alinhamentos com base na sequência.

[00212] Em algumas modalidades, CDR/FR de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina é determinada com base emu ma definição IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; website: imgt.org).

[00213] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno multiespecífica da invenção compreende 3 CDRs cadeia pesada variá- veis (HCDRs) de qualquer uma das sequências de cadeia pesada variá- veis citadas nas Tabelas 2, 3, e 4. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno multiespecífica da invenção compreende 3 CDRs de cadeua leve variáveis (LCDRs) de qualquer uma das sequências vari- áveis de cadeia leve nas Tabelas 2, 3, e 4. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno multiespecífica da invenção compreende 3 HCDRs de qualquer uma das sequências variáveis de cadeia pesada nas Tabelas 2, 3, e 4 e 3 LCDRs de qualquer uma das sequências variá- veis de cadeia leve nas Tabelas 2, 3, e 4. As sequências de CDR das sequências variáveis de cadeia pesada e leve de Tabelas 2, 3, e 4 são facilmente determináveis por aqueles versados na técnica usando méto-

dos reconhecidos na técnica de identificação de sequências de CDR.

[00214] O termo "Fc," como usado aqui, refere-se a uma molécula compreendendo a sequência de um fragmento de não ligação ao antígeno que resulta de digestão de um anticorpo ou produzido por outros métodos, seja em forma monomérica ou multimérica, e pode conter a região de articulação. A fonte de imunoglobulina original do Fc nativo é tipicamente de origem humana e pode qualquer uma das imunoglobuli- nas, embora IgG1 e IgG2 sejam usados em modalidades exemplares. Moléculas Fc são feitas de polipeptídeos monoméricos que podem ser ligadas em formas diméricas ou multiméricas por associação covalente (isto é, ligações de dissulfeto) e associação não covalente. O número de ligações intermoleculares de dissulfeto entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas varia de 1 a 4 dependendo de classe (por exem- plo, IgG, IgA, e IgE) ou subclasse (por exemplo, I9gG1, IgG2, I19G3, IgA1, e IgGA2). Um exemplo de uma Fc é um dímero de ligação de dissulfeto resultando de digestão de papaína de uma IgG. O termo "Fc ativo," como usado aqui, é de formas genéricas à monomérica, dimérica e multimérica.

[00215] Um fragmento tipicamente inclui uma cadeia leve e os domí- nios VH e CH1 de uma cadeia pesada, em que a porção de cadeia pe- sada VH-CH1 do fragmento F(ab) não pode formar uma ligação de dissul- feto com outro polipeptídeo de cadeia pesada. Como usado aqui, um fragmento Fab pode também incluir uma cadeia leve contendo dois domínios variáveis separados por um ligante de aminoácido e um domí- nio de CL, e uma cadeia pesada contendo dois domínios variáveis sep- arados por um ligante de aminoacido e um domínio CH1.

[00216] Um fragmento F(ab') tipicamente inclui uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém mais da região constante (en- tre os domínios CH1 e CH2), tal que uma ligação de dissulfeto de inter-

cadeia possa ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2.

[00217] O termo "proteína de ligação," como usado aqui refere-se a uma molécula de ocorrência não natural (ou recombinante, modificada, ou substituída) que especificamente se liga a pelo menos um antígeno alvo.

[00218] “Como usado aqui, o termo "Tm" refere-se à temperatura de fusão de uma proteína de ligação, uma proteína de ligação ao antígeno, um anticorpo e é um parâmetro crítico para a estabilidade térmica de pro- teínas de ligação ao antígeno. A Tm comumente se refere à estabilidade térmica do fragmento Fv, isto é, uma região variável de cadeia pesada e leve (VH/VL). A Tm pode ser medida por calorimetria de varredura diferencial (DSC) ou fluorimetria de varredura diferencial (DSF).

[00219] Uma modalidade da invenção fornece proteínas de ligação tendo especificidade biológica e imunológica para entre um e quatro antí- genos alvo e/ou especificidade para entre um e quatro epítopos alvo. Ou- tra modalidade da invenção fornece moléculas de ácido nucleico com- preendendo sequências de nucleotídeo codificando cadeias de polipeptí- deo que formam tais proteínas de ligação. Outra modalidade da invenção fornece vetores de expressão compreendendo moléculas de ácido nu- cleico compreendendo sequências de nucleotídeo codificando cadeias de polipeptídeo que formam tais proteínas de ligação. Ainda outra modalida- de da invenção fornece células hospedeiras que expressam tais proteí- nas de ligação (isto é, compreendendo moléculas de ácido nucleico ou vetores codificando cadeias de polipeptídeo que formam tais proteínas de ligação).

[00220] Como usado aqui, o termo "ligante" refere-se a O a 100 resí- duos de aminoácido contíguos. Os ligantes estão, presentes ou ausentes,

e iguais ou diferentes. Ligantes compreendidos em uma proteína ou um polipeptídeo podem ter a mesma sequência de aminoácido ou podem ter diferentes sequências de aminoácido.

[00221] Em algumas modalidades, o ligante de peptídeo compreende a seguinte sequência: EPAKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO: X).

[00222] Em algumas modalidades, o termo "ligante" refere-se a 1a 15 resíduos de aminoácido contíguos. Tipicamente, um ligante fornece flexi- bilidade e separação especial entre dois aminoácidos ou entre dois domí- nios de polipeptídeo. Um ligante pode ser inserido entre domínios VH, VL, CH e/ou CL para fornecerem suficiente flexibilidade e mobilidade praos domínios das cadeias leve e pesada, dependendo do formato da molécu- la, por exemplo, para se dobrarem em imunoglobulinas de região variável dual transversais. Um ligante é tipicamente inserido na transição entre domínios variáveis entre os domínios variáveis e de nocaute, ou entre os domínios variáveis e constantes, respectivamente, no nível de sequência de amino. A transição entre os domínios pode ser identificada porque o tamanho aproximado dos domínios de imunoglobulina é bem entendido. A localização precisa de uma transição de domínio pode ser determinada localizando alongamentos de peptídeoque não formam elementos estru- turais secundários tais como folhas eta ou helices alfa como demonstrado por dados experimentais ou como pode ser determinado por técnicas de modelagem ou predição de estrutura secundária. Em certas modalidades exemplares, o ligante pode ser inserido entre os domínios Fab para criar um anticorpo Fab tandem. Em particulares modalidades, o ligante pode ser inserido entre o terminal N de um domínio VH de um primeiro Fab e o terminal C de um domínio CH1 de um segundo Fab.

[00223] A identidade e sequência de resíduos de aminoácido no ligante pode variar dependendo do tipo de elementos estruturais secundários necessários para chegar no ligante. Por exemplo, glicina, serina e alanina são adequadas para ligantes tendo flexibilidade máxima. Certas combinações de glicina, prolina, treonina e serina são úteis se um ligante mais rígido e estendido for desejado. Qualquer resíduo de ami- noácido podeser considerado como um ligante em combinação com out- ros resíduos de aminoácido para construer maiores ligantes de peptídeo como necessário, dependendo das propriedades desejadas.

[00224] Em algumas modalidades, um ligante compreende: um único resíduo de glicina (Gly); um peptídeo de diglicina (Gly-Gly); um tripep- tídeo (Gly-Gly-Gly); um peptídeo com quatro resíduos de glicina (Gly-Gly- GlIy-Gly; SEQ ID NO: x); um peptídeo com cinco resíduos de glicina (Gly- Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: x); um peptídeo com seis resíduos de glici- na (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: x); um peptídeo com sete resíduos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: x); e um peptídeo com oito resíduos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: x).

[00225] Em algumas modalidades, um ligante compreende pequenos aminoácidos, como Gly, Ala ou Ser.

[00226] Em algumas modalidades, um ligante compreende Gly (G) e Ser (S), ou GS, GGS, GGGS ou GGGGS. Em algumas modalidades, um ligante compreende (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser),s (isto é, (GGGGS);). Em al- gumas modalidades, um ligante compreende (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser);3 (isto é, (GGGGS);).

[00227] Em algumas modalidades, um ligante compreende Gly-Gly- GlIy-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), o peptídeo Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly- Gly-Ser (SEQ ID NO: x), o peptídeo Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly- Ser-Gly-Gly-Gly- Gly-Ser (SEQ ID NO: x), e o peptídeo Gly-Gly-Ser-Gly-

Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO:x).

[00228] Em algumas modalidades, um ligante compreende um único resíduo Ser; um único resíduo Val; um dipeptídeo selecionado de Arg- Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, e Ser-Leu; ou um polipeptídeo seleciona- do de Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: x), Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x), GIn-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: x), GIn-Arg- Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: x); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: x), Arg-Thr- Val-Ala- Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO: x), GIy-GIn-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO:x), His-lle-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO: x), e Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: x).

[00229] Em algumas modalidades, dois Fabs tandem são ligados atra- vés de um ligante (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser),.

[00230] Em algumas modalidades tendo porção CODV-Fab em que L1 e L2 estão sobre a cadeia leve e L3 e L4 estão sobre a cadeia pesada, L1 é 3 a 12 resíduos de aminoácido em comprimento, L2 é de 3 a 14 resí- duos de aminoácido de comprimento, L3 é de 1 a 8 resíduos de aminoá- cido de comprimento, e L4 é de 1 a 3 resíduos de aminoácido de com- primento. Em algumas modalidades, L1 é de 5 a 10 resíduos de aminoá- cido de comprimento, L2 é de 5 a 8 resíduos de aminoácido de compri- mento, L3 é de 1 a 5 resíduos de aminoácido de comprimento, e L4 é de 1 a 2 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalida- des, L1 é de 7 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 é de 5 resí- duos de aminoácido de comprimento, L3 é de 1 resíduo de aminoácido de comprimento, e L4 é de 2 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 é 10 resíduos de aminoácido de compri- mento, L2 é de 10 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 é de O resíduo de aminoácido de comprimento, e L4 é de O resíduo de aminoá- cido de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3, e L4 cada um tem um comprimento independentemente selecionado de O a 15 ami- noácidos (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 aminoácidos), em que pelo menos dois dos ligantes têm um comprimento de 1 a 15 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 aminoácidos). Em algumas modalidades, L1, L2, L3, e L4 são Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: x). Em algumas modalidades, os ligantes compreendem a sequência Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gln- Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x). Em algumas modalidades, L1 com- preende a sequência Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x), L2 compreende a sequência Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: x), L3 compreende a sequência Ser, e L4 compreende a sequência Arg-Thr. Em algumas modalidades, L3 compreende a sequência Gly-Gln-Pro-Lys- Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Ser, L2 compreende a sequência Arg-Thr, L3 compreende a sequência Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x) e L4 compreende a sequência Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: x).

[00231] Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4 cada independen- temente compreende uma sequência selecionada de (Gly-Gly-Gly-Gly- Ser), (em que n é um número inteiro entre 0 e 5; SEQ ID NO: x), Gly-Gly- GlIy-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- GlIy-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), Ser, Arg-Thr, Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: x), GIy-GIn-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x), e Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: x). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gln-Pro-Lys- Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x), L2 compreende a sequência Thr-Lys-Gly- Pro-Ser (SEQ ID NO: x), L3 compreende a sequência Ser, e L4 compre- ende a sequência Arg-Thr. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), L2 compreende a sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), L3 é de O aminoácido de comprimento, e L4 é de O aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GlIy-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: x), L2 compreende a sequência Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: x), L3 é de O aminoácido de comprimento, e L4 é de O aminoácido de compri- mento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência Gly-Gly- GlIy-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), L2 é de O aminoácido de comprimento, L3 compreende a sequência Gly-Gly- GlIy-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), e L4 é de O aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 e L2 são de zero aminoácido de comprimento, e L3 e L4 cada compreende uma sequência independentemente selecionada de (Gly-Gly-Gly-Gly- Ser), (SEQ ID NO: x) (em que n é um número inteiro entre 0 e 5; SEQ ID NO: x), GIy-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), Gly- GlIy-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), Ser, Arg-Thr, Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: x), Gly-GIn-Pro-Lys- Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x), e GIy-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: x). Em algumas modalidades, L3 e L4 são de zero aminoá- cido de comprimento, e L1 e L2 cada compreende uma sequência inde- pendentemente selecionada de (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (em que n é um número inteiro entre 0 e 5; SEQ ID NO: x), GIy-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- GlIy-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), GIy-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- GlIy-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: x), Ser, Arg-Thr, Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: x), GIy-GIn-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: x), e Gly-Gly- Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: x).

[00232] Em algumas modalidades, ligantes compreendem uma se-

quência derivada de uma sequência de ocorrência natural na junção en- tre um domínio variável de anticorpo e um domínio constante de anticor- po (por exemplo, como descrito em WO 2012/135345, incorporado por referência). Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante compreen- de uma sequência encontrada na transição entre um domínio VH e CH1 endógeno ou entre um domínio VL e CL endógeno (por exemplo, kappa ou lambda). Em algumas formas de implementação, o ligante compreen- de uma sequência encontrada na transição entre um domínio VH e CH1 humano endógeno ou entre um domínio VL e CL humano endógeno (por exemplo, kappa ou lambda humano).

[00233] Os exemplos listados acima não se destinam a limitar o esco- po da invenção de qualquer forma, e os ligantes compreendendo amino- ácidos selecionados aleatoriamente do grupo que consiste de valina, leu- cina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glu- tamato, asparagina, glutamina, glicina e prolina são adequados para uso nas proteínas de ligação aqui descritas. Para descrições adicionais de sequências de ligante, veja, por exemplo, WO 2012/135345, WO 2017/180913, incorporado por referência.

[00234] Como usado aqui, o termo "valência" refere-se ao número de sítios de ligação de uma proteína de ligação, um epítopo, uma proteína de ligação a um antígeno ou um anticorpo. Por exemplo, o termo "proteí- na de ligação monovalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem um sítio de ligação ao antígeno. O termo "proteína de ligação bivalente" refere-se a uma proteína de ligação que possui dois sítios de ligação. O termo "proteína de ligação trivalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem três sítios de ligação. O termo "proteína de ligação tetravalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem quatro sítios de ligação. Em particulares modalidades, a proteína de ligação divalente pode ligar-se a um alvo de antígeno. Em outras modalidades, a proteína de ligação diva- lente pode ligar-se a dois diferentes alvos de antígeno. Em particulares modalidades, a proteína de ligação trivalente pode ligar-se a um alvo de antígeno, isto é, é monoespecífico. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode ligar-se a dois diferentes alvos de antígenos, isto é, é biespecífico. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode ligar-se a três diferentes alvos de antígenos, isto é, é triespecífico. Em particulares modalidades, a proteína de ligação tetravalente pode |i- gar-se a um alvo de antígeno, isto é, é monoespecífico. Em outras moda- lidades, a proteína de ligação tetravalente pode ligar-se a dois diferentes alvos de antígenos, isto é, é biespecífico. Em outras modalidades, a pro- teína de ligação tetravalente pode ligar-se a três diferentes alvos de antí- genos, isto é, é triespecífico. Em outras modalidades, a proteína de liga- ção tetravalente pode ligar-se a quatro diferentes alvos de antígenos, isto é, é tetraespecífico.

[00235] Como usado aqui, o termo "especificidade" refere-se ao núme- ro de especificidades de ligação de uma proteína de ligação, um epítopo, uma proteína de ligação ao antígeno ou um anticorpo. Por exemplo, o termo "proteína de ligação monoespeciífica" refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a um alvo de antígeno. O termo "pro- teína de ligação biespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a dois diferentes alvos de antígenos. O termo "prote- ína de ligação triespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a três diferentes alvos de antígenos. O termo "prote- ína de ligação tetraespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que se liga especificamente a quatro diferentes alvos de antígenos e assim por diante.

[00236] Como usado aqui, o termo "sítio de reconhecimento seletivo"

refere-se a uma modificação na proteína de ligação que permite ser reconhecida seletivamente por uma ligação de reagente de afinidade ao sítio de reconhecimento seletivo. Exemplos de um sítio de reconhecimen- to seletivo compreendem o sítio de ligação para a proteína A na parte Fc de uma imunoglobulina.

[00237] “Como usado aqui, o termo "reagente de afinidade" refere-se a um reagente que contém um ligante que é imobilizado sobre uma matriz e se liga especificamente a agrupamentos superficiais de moléculas co- mo aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm caracte- rísticas estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga. Reagentes de afinidade são ferramentas em croma- tografia de afinidade, onde a purificação é possibilitada pela interação es- pecífica entre o ligante e o produto. "Proteína L", que é um exemplo de reagente de afinidade, refere-se a uma proteína L recombinante que é imobilizada em uma matriz para formar um ligante que possui afinidade por um subconjunto do domínio variável das cadeias leves kappa de imu- noglobulina. Essas matrizes podem ser de resina. Outro exemplo de rea- gente de afinidade é "KappaSelect", que se refere a um anticorpo de ca- deia única derivado de camelídeo de 13 kDa recombinante que é imobili- zado em uma matriz para formar um ligante que possui afinidade para o domínio constante de cadeias leves kappa de imunoglobulina humana. Outro exemplo de reagente de afinidade é a Proteína A. A proteína A é uma proteína de superfície de 42 kDa originalmente encontrada na pare- de celular da bactéria Staphylococcus aureus. Foi demonstrado por refi- namento cristalográfico que o sítio primário de ligação da proteína A está na região Fc, entre os domínios CH2 e CH3. Além disso, a proteína À mostrou se ligar a moléculas de IgG humana contendo fragmentos F(ab')2 de IgG da família de genes VH3 humanos. A proteína A pode se ligar com forte afinidade à porção Fc da imunoglobulina de certas espé- cies.

[00238] A constante de dissociação (KD) de uma proteína de ligação pode ser determinada, por exemplo, por ressonância de plasmônio de superfície. Geralmente, a análise de ressonância de plasmônio de super- fície mede as interações de ligação em tempo real entre o ligante (um an- tígeno alvo em uma matriz de biossensor) e analito (uma proteína de |li- gação em solução) por ressonância de plasmônio de superfície (SPR) usando o sistema BlAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ ). À análise de plasmônio de superfície também pode ser realizada imobili- zando o analito (proteína de ligação em uma matriz de biossensor) e apresentando o ligante (antígeno alvo). O termo "KD", como usado aqui, refere-se a uma constante de dissociação da interação entre uma deter- minada proteína de ligação e um antígeno alvo.

[00239] “Como usado aqui, o termo "liga-se especificamente" refere-se à capacidade de uma proteína de ligação ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligar a um antígeno contendo um epítopo com um Kd de pelo menos cerca de 1 x 106 M, 1x 107 M, 1x 106 M, 1 x 10º M,1 x 1070 M, 1 x 10º M, 1 x 10? M, ou mais, e/ou ligar-se a um epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afini- dade por um antígeno não específico. Afinidade de ligação de um antíge- no a uma proteína de ligação ou um anticorpo pode ser conduzida por ressonância de plasmônio de superfície (SPR) usando um instrumento BlAcore.

[00240] Como usado aqui, o termo "ácido nucléico" refere-se a ma- cromoléculas poliméricas ou oligoméricas, ou grandes moléculas biológi- cas, essenciais para todas as formas de vida conhecidas. Ácidos nuclei- cos, que incluem DNA (ácido desoxirribonucléico) e RNA (ácido ribonu-

cléico), são feitos de monômeros conhecidos como nucleotídeos. A maio- ria das moléculas de DNA de ocorrência natural consiste em duas fitas de biopolímero complementares enroladas em torno de cada outra para for- mar uma dupla hélice. A fita de DNA também é conhecida como polinu- cleotídeos consistindo em nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto de uma nucleobase contendo nitrogênio, bem como um açúcar monossaca- rídeo denominado desoxirribose ou ribose e um grupo fosfato. Nucleoba- ses de ocorrência natural compreendem guanina (G), adenina (A), timina (T), uracila (U) ou citosina (C). Os nucleotídeos são unidos uns aos ou- tros em uma cadeia por ligações covalentes entre o açúcar de um nucleo- tídeo e o fosfato do seguinte, resultando em uma estrutura alternada de açúcar-fosfato. Se o açúcar é desoxirribose, o polímero é DNA. Se o açú- car é ribose, o polímero é RNA. Normalmente, um polinucleotídeo é for- mado através de ligações fosfodiéster entre os monômeros de nucleotí- deos individuais.

[00241] Como usado aqui, o termo "polinucleotídeo" refere-se a polí- meros de ácido nucléico de fita simples ou dupla de pelo menos 10 nu- cleotídeos em comprimento. Entende-se que os nucleotídeos compreen- dendo o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucle- otídeos ou uma forma modificada de qualquer um dos tipos de nucleotí- deos. Essas modificações incluem modificações de base, como bromuri- dina, modificações de ribose, como arabinosídeo e 2',3'-didesoxirribose, e modificações de ligação internucleotídeo, tal como fosforotioato, fosforo- ditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforanilotioato, fosfora- niladato e fosoroamidato. O termo "polinucleotídeo" inclui especificamente formas de DNA de fita simples e dupla.

[00242] “Um "polinucleotídeo isolado" é um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos, que:

(1) não está associado com toda ou uma porção de um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza; (2) é ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza; ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[00243] Um "polipeptídeo isolado" é aquele que: (1) é livre de pelo menos alguns outros polipeptídeos com os quais normalmente seria en- contrado; (2) é essencialmente livre de outros polipeptídeos da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie; (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente; (4) foi separado pelo menos cerca de 50 por cento dos polinucleotídeos, lipídios, carboidratos ou outros materiais com os quais está associado na natureza; (5) não está associado (por interação covalente ou não covalente) com porções de um polipeptídeo com o qual o "polipeptídeo isolado" está associado na natureza; (6) está operacio- nalmente associado (por interação covalente ou não covalente) a um po- lipeptídeo com o qual não está associado na natureza; ou (7) não ocorre na natureza. Tal polipeptídeo isolado pode ser codificado por DNA genô- mico, CDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer com- binação dos mesmos. Em modalidades exemplares, o polipeptídeo isola- do é substancialmente isento de polipeptídeos ou outros contaminantes encontrados em seu ambiente natural que possam interferir no seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou outros).

[00244] Como usado aqui, o termo "Vetor de expressão" também refe- rido como uma construção de expressão, geralmente se refere a um plasmídeo ou vírus projetado para a expressão de proteínas em células. O termo "vetor" refere-se a uma proteína ou um polinucleotídeo ou uma mistura destes que é capaz de ser introduzida ou de introduzir proteínas e/ou ácidos nucleicos nela contidos em uma célula. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus ou cromossomos artificiais.

Em particular, um vetor é usado para trans- portar um produto gênico de interesse, tal como, por exemplo, DNA es- tranho ou heterólogo em uma célula hospedeira adequada.

Os vetores podem conter polissequências de nucleotídeo "replicon" que facilitam a replicação autônoma do vetor em uma célula hospedeira.

DNA estranho é definido como DNA heterólogo, que é DNA não naturalmente encontrado em uma célula hospedeira, que, por exemplo, replica a molécula do vetor, codifica um marcador selecionável ou rastreável, ou codifica um transge- ne.

Uma vez na célula hospedeira, o vetor pode se replicar independen- temente ou coincidentemente com o DNA cromossômico do hospedeiro, podendo ser geradas várias cópias do vetor e seu DNA inserido.

Além disso, o vetor também pode conter os elementos necessários que permi- tem a transcrição do DNA inserido em uma molécula de mRNA ou, de outra forma, causar a replicação do DNA inserido em múltiplas cópias de RNA.

Os vetores podem abranger ainda "sequências de controle de ex- pressão" que regulam a expressão do gene de interesse.

Normalmente, as sequências de controle de expressão são polipeptídeos ou polinucleo- tídeos, tais como, mas não se limitando a, promotores, intensificadores, silenciadores, isoladores ou repressores.

Em um vetor compreendendo mais de um polinucleotídeo codificando um ou mais produtos gênicos de interesse, a expressão pode ser controlada em conjunto ou separada- mente por um ou mais sequências de controle de expressão.

Mais espe- cificamente, cada polinucleotídeo compreendido no vetor pode ser contro- lado por uma sequência de controle de expressão separada ou todos os polinucleotídeos compreendidos no vetor pode ser controlado por uma única sequência de controle de expressão.

Os polinucleotídeos compre- endidos em um único vetor controlado por uma única sequência de con- trole de expressão podem formar uma estrutura de leitura aberta.

Alguns vetores de expressão contêm adicionalmente elementos de sequência adjacentes ao DNA inserido que aumentam a meia-vida do MRNA ex- presso e/ou permitem a tradução do mMRNA em uma molécula de proteí- na. Muitas moléculas de mRNA e polipeptídeo codificadas pelo DNA inse- rido podem, assim, ser sintetizadas rapidamente.

[00245] — Como usado aqui, o termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão recombinante. Uma célula hospedeira recombinante ou célula hospedeira é destinada a se referir não somente à célula em questão em particular, mas também à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas ge- rações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progê- nie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, mas tais células ainda estão incluídas no escopo do termo "célula hospedeira" como usado aqui. Uma ampla variedade de sistemas de expressão de células hospedeiras pode ser usada para expressar as proteínas de ligação, incluindo siste- mas de expressão em bactérias, leveduras, baculovirais e mamíferos (bem como sistemas de expressão de exibição em fagos). Um exemplo de um vetor de expressão bacteriana adequado é pUC19. Para expressar uma proteína de ligação de forma recombinante, uma célula hospedeira é transformada ou transfectada com um ou mais vetores de expressão re- combinante portadores de fragmentos de DNA codificando as cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação tais que as cadeias de polipeptídeo são expressas em uma célula hospedeira e, em modalidades exempla- res, secretadas no meio em que as células hospedeiras são cultivadas, a partir do qual a proteína de ligação pode ser recuperada.

[00246] “Como usado aqui, o termo "composição farmacêutica" refere- se a um composto ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado adequadamente a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano.

[00247] O termo "carreador farmaceuticamente aceitável" ou "carrea- dor fisiologicamente aceitável", como usado aqui, refere-se a um ou mais materiais de formulação adequados para realizar ou melhorar a liberação de uma proteína de ligação.

[00248] Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz", quando usados em referência a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais proteínas de ligação (por exemplo, anticor- pos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos), referem-se a uma quantidade ou dosagem suficiente para produzir um resultado tera- pêutico desejado. Mais especificamente, uma quantidade terapeutica- mente eficaz é uma quantidade de uma proteína de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) suficiente para inibir, por algum período de tempo, um ou mais dos processos pato- lógicos clinicamente definidos associados com a condição sendo tratada. A quantidade eficaz pode variar dependendo do tipo de proteína de liga- ção específico que está sendo usado, e também depende de uma varie- dade de fatores e condições relacionadas ao paciente a ser tratado e à gravidade do distúrbio. Por exemplo, se a proteína de ligação ou proteína de ligação multiespecífica é para ser administrada in vivo, fatores como idade, peso, saúde do paciente, bem como curvas de resposta à dose e dados de toxicidade obtidos em trabalhos pré-clínicos com animais esta- riam entre esses fatores considerados. A determinação de uma quantida- de eficaz ou terapeuticamente eficaz de uma determinada composição farmacêutica está dentro da capacidade dos versados na técnica.

[00249] Como usado aqui, o termo "Método de produção de proteína de ligação" refere-se a métodos recombinantes de expressão de proteí- nas usando técnicas bem conhecidas na técnica.

Il. Mutações CH1/CL para facilitar o pareamento

[00250] Em certas modalidades, mutações podem ser feitas na interfa- ce CH1 e CL para facilitar o pareamento específico e prevenir o mau pa- reamento de CH1/CL. Tais mutações são descritas abaixo e em mais de- talhes em WO2013/005194 e Golay et al. (2016) J. Immunol. Vol. 196. Pág. 3199 a 3211, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.

[00251] O primeiro conjunto de mutações pode ser feito para um par de aminoácidos de interface polar em interação no domínio CH1 e CL. Os referidos aminoácidos polares podem ser trocados por um par de amino- ácidos neutros e formadores de sal. Em uma certa modalidade, um pri- meiro conjunto de mutações pode compreender uma mutação T192E CH1 e uma mutação N137K, S114A CL kappa. A mutação T192E CH1 e a mutação N137K CL kappa formam uma ponte de sal, que pode reforçar a especificidade da associação, enquanto um pareamento indesejado de- ve ser evitado pela falta de complementaridade estérica e de carga entre os domínios CH1 e CL kappa do tipo selvagem e variante. Além disso, a mutação S114A no domínio CL kappa é feita para evitar choques estéri- cos com a maior cadeia lateral de lisina. O conjunto de mutação CH1 T192E e CL N137K/S114A pode alternativamente ser referido como o conjunto de mutação "CR3".

[00252] — Um segundo conjunto de mutações pode ser feito para um par de resíduos de aminoácido de interface hidrofóbica e polar em interação nos domínios CH1 e CL kappa. Uma mutação pode constituir uma mu- dança de uma interação hidrofóbica para polar. Em uma certa modalida- de, o segundo conjunto de mutações pode compreender uma mutação L143Q, S188V CH1 e uma mutação V133T, S176V CL kappa. A mutação L134Q CH1 e a mutação V133T CL kappa constituem uma mudança de uma interação hidrofóbica para uma interação polar. A simultânea muta- ção S188V CH1 e mutação S176V CL kappa constitui uma mudança de uma interação polar para uma interação hidrofóbica. Espera-se que a tro- ca do caráter polar/hidrofóbico das interações de interface mantenha a afinidade entre os domínios CH1 e CL kappa mutados inalterados, en- quanto diminui sua afinidade respectiva para outros domínios CH1 e CL kappa de contrapartida de tipo selvagem, evitando assim o pareamento incorreto em virtude de interações desfavoráveis que ocorrem em domí- nios incompatíveis (variante/tipo selvagem). O conjunto de mutação CH1 L143Q/S188V e CL V133T/S176V pode alternativamente ser referido co- mo o conjunto de mutação "MUTA4".

[00253] “Um terceiro e quarto conjuntos de mutações são mutações de "botão em buracos". Mais especificamente, no terceiro conjunto de muta- ções (KH1), uma mutação L124A, L143E CH1 é feita e uma mutação V133W CL kappa é feita. No quarto conjunto de mutações (KH2), uma mutação V190A CH1 é feita e uma mutação L135W, N137A CL kappa é feita. O primeiro, segundo, terceiro e quarto conjuntos de mutações são descritos em mais detalhes em WO2013/005194 A1.

[00254] Um quinto e sexto conjunto de mutações pode ser feito para trocar cargas eletrostáticas nos domínios CH1 e CL kappa. Em uma certa modalidade, o quinto conjunto de mutações pode compreender uma mu- tação K221E CH1 e uma mutação E123K CL kappa. O quinto conjunto de mutações pode ser alternativamente referido como o conjunto de mu- tação "K221E/E123K de carga oposta" ou o conjunto de mutação "NN1". Em uma certa modalidade, o sexto conjunto de mutações pode compre- ender uma mutação K228D CH1 e uma mutação D122K CL kappa. O sexto conjunto de mutações pode ser alternativamente referido como o conjunto de mutação "K228D/D122K de carga oposta" ou o conjunto de mutação "NN2". O quinto e sexto conjunto de mutações são descritos em mais detalhes em WO2007/147901 A1. Em certas modalidades, a muta- ção "K221E / E123K carga oposta" definida e a mutação "K228D / D122K carga oposta" podem ser combinadas. Assim, a combinação pode com- preender par de mutação aK221E e K228D CH1 e um par de mutação E123K e D122K CL kappa. O conjunto de mutações combinado pode ser alternativamente — referido como o conjunto de mutação "K221E:K228D/E123K:D122K carga oposta" ou o conjunto de mutação "NN3".

[00255] Um sétimo oitavo conjunto de mutações pode ser feito para trocar cargas eletrostáticas nos domínios CH1 e CL kappa. Em uma certa modalidade, o sétimo conjunto de mutações pode compreender uma mu- tação L143E, L143D, L143R, L143K, ou L143H CH1 e uma mutação S176E, S176D, S176R, S176K, ou S176H CL kappa, desde que a muta- ção CH1 seja de uma carga oposta da mutação CL kappa. O sétimo con- junto de mutações pode ser alternativamente referido como o conjunto de mutação "L143/S176 carga oposta". Em certas modalidades, uma muta- ção CH1 L143E ou L143D pode ser pareada com uma mutação CL S176R ou S176K, e pode ser referida como um conjunto de mutação "CM3". Em certas modalidades, uma mutação CH1 L143R ou L143K po- de ser pareada com uma mutação CL S176E ou S176D, e pode ser e po- de ser referida como um conjunto de mutação "CM4". Em uma certa mo- dalidade, o oitavo conjunto de mutações pode compreender uma muta- ção L124E, L124D, L124R, L124K, ou mutação L124H CH1 e uma muta- ção V133E, V133D, V133R, V133K, ou V133H CL kappa, desde que a mutação CH1 seja de uma carga oposta da mutação CL kappa. O oitavo conjunto de mutações pode ser alternativamente referido como o conjun- to de mutação de " L124/V133 carga oposta". Em certas modalidades,

uma mutação CH1 L124E ou L124D pode ser pareada com uma mutação CL V133R ou V133K, e pode ser referida como um conjunto de mutação "CMS5". Em certas modalidades, uma mutação CH1 L124R ou L124K po- de ser pareada com uma mutação CL V133E ou V133D, e pode ser refe- rida como um conjunto de mutação "CM6".

[00256] Em outras modalidades, qualquer uma ou mais das mutações acima mencionadas podem ser combinadas com cada outra e/ou com mutações descritas abaixo. Como exemplo, o domínio CH1 de um primei- ro Fab compreende uma mutação T192E, K221E e o domínio CL kappa de um primeiro Fab compreende uma mutação E123K, N137K, S114A. O domínio CH1 de um segundo Fab pode compreender ainda uma mutação L143Q, S188V e o domínio CL kappa de um segundo Fab pode compre- ender uma mutação V133T, S176V. Alternativamente, o segundo Fab pode ser de tipo selvagem.

[00257] Os números de posição de sequência usados aqui para os domínios CH1 e CL kappa referem-se à numeração de Kabat (Kabat, EA et al., Sequences of protein of immunological interest. 5º Edição - Depar- tamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, publicação NIH nº 91- 3242, pp 662, 680, 689, 1991). Ill. MUTAÇÕES DE CARGA OPOSTA DE VH / VL PARA FACILITAR O

PAREAMENTO

[00193] Em certas modalidades, as mutações podem ser preparadas na interface VH e VL para facilitar pareamento específico e prevenir pa- reamento incorreto de VH / VL. Em particulares modalidades, as muta- ções preparadas para os domínios VH e VL introduzem resíduos de ami- noácido de carga oposta para promover a heterodimerização através de interações eletroestáticas.

[00194] Em uma certa modalidade, um conjunto de mutações de carga oposta pode compreender uma mutação no domínio VH na posição 39 Kabat e uma mutação no domínio VL na posição 38 Kabat.

Qualquer re- síduo negativamente carregado ou positivamente carregado conhecido pode ser introduzido na posição Kabat VH 39, desde que, a mutação in- troduzida na posição Kabat VL 38 seja de uma carga oposta.

Por exem- plo, um possível par mutado compreende um resíduo mutado VH K39 (introduzindo uma carga positiva) e um resíduo mutado VL E38 (introdu- zindo uma carga negativa). Alternativamente, o conjunto de mutação re- versa pode ser preparado, onde um resíduo mutado VH E39 (introduzin- do uma carga negativa) e um resíduo mutado VL K38 (introduzindo uma carga positiva) são introduzidos.

Em certas modalidades, o domínio VH pode compreender na posição 39 Kabat um resíduo mutado em um E, D, K, R, ou H e o domínio VL pode compreender na posição 38 Kabat um resíduo mutado em um E, D, K, R, ou H, desde que o resíduo mutado no domínio VH seja uma carga oposta do resíduo mutado no domínio VL.

Por exemplo, quando o domínio VH compreende um resíduo mutado E ou D na posição 39 Kabat, em seguida o domínio VL compreende um re- síduo mutado K, R ou H na posição 38 Kabat.

Alternativamente, quando o domínio VH compreende um resíduo mutado K, R ou H na posição 39 Kabat, em seguida o domínio VL compreende um resíduo mutado E ou D na posição 38 Kabat.

Em uma certa modalidade, em que dois pares VH/VL não estão na mesma cadeia de polipeptídeo, se um par VH/VL compreende uma carga positiva em VH39 (por exemplo, E ou D) e uma carga negativa em VL38 (por exemplo, K, R ou H), em seguida o outro par par VH/VL pode compreender uma carga negativa em VH39 (por exemplo, K, R ou H) e uma carga positiva em VL38 (por exemplo, E ou D). Por exemplo, se um primeiro par VH/VL compreende mutações de VH39K e VL38E, em seguida um segundo par VH/VL pode compreender mutações de VH39E e VL38K. Este conjunto de mutações de carga opos- ta pode ser alternativamente referido como o conjunto de mutação de "carga oposta de VH39/VL38". Este conjunto de mutações carregadas opostas são descritos em mais detalhes em Tan et al., Biophysical Jour- nal. Vol. 75. Pg. 1473-1482. 1998.

[00195] Em uma certa modalidade, um conjunto de mutações de carga oposta pode compreender uma mutação de Q39 no domínio VH e uma mutação de Q38 no domínio VL. Qualquer resíduo negativamente carre- gado ou positivamente carregado conhecido pode ser introduzido na po- sição VH Q39, desde que a mutação introduzida na posição VL 038 seja de uma carga oposta. Por exemplo, um possível par de mutação com- preende uma mutação de VH Q39K (introduzindo uma carga positiva) e uma mutação de VL Q38E (introduzindo uma carga negativa). Alternati- vamente, o conjunto de mutação reversa pode ser preparado, onde uma mutação de VH Q39E (introduzindo uma carga negativa) e uma mutação de VL Q38K (introduzindo uma carga positiva) são introduzidas. Em cer- tas modalidades, o domínio VH pode compreender uma mutação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R, ou Q39H e o domínio VL pode compreender uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R, ou Q38H, desde que a mu- tação no domínio VH seja uma carga oposta da mutação no domínio VL.

[00196] Em outras modalidades, qualquer uma ou mais das mutações mencionadas acima pode ser combinada com cada outro e/ou com muta- ções descritas abaixo. IV. MUTAÇÕES DE ESTABILIZAÇÃO DE DISSULFETO DE VH / VL

[00197] Em certas modalidades, as mutações podem ser preparadas na interface VH e VL para melhorar a estabiliddae entre a interface VH / VL. Conjuntos específicos de mutações de aminoácido no domínio VH e os domínios VL podem melhorar a estabilidade através da introdução de resíduos de cisteína não nativos que formam pontes de dissulfeto.

[00198] “Um primeiro conjunto de mutações estabilizantes de dissulfeto pode ser preparado para resíduos de aminoácido nos domínios VH e VL. Em uma certa modalidade, o primeiro conjunto de mutações estabilizan- tes de dissulfeto pode compreender uma mutação de 44C no domínio VH e uma mutação de 100C no domínio VL. O primeiro conjunto de muta- ções estabilizantes de dissulfeto pode ser alternativamente referido como o conjunto de mutação de "VH44C/VL100C". O primeiro conjunto de mu- tações estabilizantes de dissulfeto é descrito em mais detalhes em Reiter et al. Nature Biotechnology. Vol. 14. Pg. 1239-1245. 1996, incorporado aqui por referência para todos os propósitos.

[00199] “Um segundo conjunto de mutações estabilizantes de dissulfeto pode ser preparado para resíduos de aminoácido no domínio VH e VL. Em uma certa modalidade, o segundo conjunto de mutações estabilizan- tes de dissulfeto pode compreender uma mutação de 105C no domínio VH e uma mutação de 43C no domínio VL. O segundo conjunto de mu- tações estabilizantes de dissulfeto pode ser alternativamente referido co- mo o conjunto de mutação de "VH105C/VL43C". O segundo conjunto de mutações estabilizantes de dissulfeto é descrito em mais detalhes em Pa- tente dos Estados Unidos No. 9.527.927, incorporada aqui por referência para todos os propósitos. V. COMBINAÇÕES DE MUTAÇÃO DE ANTICORPO

[00200] Em certas modalidades, conjuntos de combinações de muta- ção podem ser na interface CH1 e CL kappa e/ou na interface VH e VL para também facilitar o pareamento e melhorar a estabilidade.

[00201] Em uma modalidade particular, um primeiro domínio Fab em um anticorpo pode compreender um ou ambos do conjunto de mutação CR3 e MUT4 em combinação com um conjunto de mutação de carga oposta VH/VL. Em uma outra modalidade, um segundo domínio Fab em um anticorpo pode compreender um ou ambos do conjunto de mutação CR3 e MUT4 em combinação com um conjunto de mutação de carga oposta VH / VL.

[00202] Em particulares modalidades, um primeiro domínio Fab pode compreender um ou ambos do conjunto de mutação CR3 e MUT4 em combinação com um conjunto de mutação de carga oposta VH/VL e um conjunto de mutação estabilizante de dissulfeto. Em uma outra modali- dade, um segundo domínio Fab em um anticorpo pode compreender um ou ambos do conjunto de mutação CR3 e MUT4 em combinação com um conjunto de mutação de carga oposta VH / VL e um conjunto de mutação estabilizante de dissulfeto.

[00203] “Quaisquer das modalidades acima podem também compreen- der um conjunto de mutação de carga oposta na interface CH1 / CL. Por exemplo, um primeiro Fab pode compreender uma mutação de K221E CH1 e uma mutação de E123K CL kappa. Um segundo Fab pode com- preender uma mutação de K221E CH1 e um mutação de E123K CL kap- pa. VI. FORMATOS DE ANTICORPO E CONJUNTOS DE MUTAÇÃO NOS

MESMOS

[00204] “Quaisquer dos conjuntos de mutação recitados acima e com- binações dos mesmos podem ser aplicados à proteína de ligação ao an- tígeno multiespecífica descrita aqui. Variável Dupla Cruzada

[00205] Em uma modalidade particular, "variável dupla cruzada" ou "CODV" refere-se a um domínio de ligação ao antígeno que especifica- mente liga-se a pelo menos um antígeno alvo ou pelo menos um epítopo alvo, e compreende pelo menos duas cadeias de polipeptídeo que for-

mam pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno, em que pelo menos um cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e pelo menos um cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura re- presentada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [1] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, e em que os polipeptídeos de fórmula | e os polipeptídeos de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.

[00206] Em uma modalidade particular, um domínio de ligação ao an- tígeno CODV especificamente liga-se a pelo menos um antígeno alvo ou pelo menos um epítopo alvo, e compreende quatro cadeias de polipeptií- deo que formam quatro sítios de ligação ao antígeno, em que duas ca- deias de polipeptídeo cada compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e duas cadeias de polipeptídeo cada compreende uma estrutura repre- sentada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [1] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina; Fc é uma região de articulação de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, e em que os polipeptídeos de fórmula | e os polipeptídeos de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, em que o par VH1/VL1 compreende uma primeira especificidade de liga- ção ao antígeno e o par VH2/VL2 compreende uma segunda especifici- dade de ligação ao antígeno.

[00207] Em uma modalidade particular, uma proteína de ligação ao antígeno descrita aqui é uma proteína de ligação ao antígeno triespecífica e/ou trivalente compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que for- mam três sítios de ligação ao antígeno que especificamente liga-se a um ou mais diferentes alvos de antígeno, em que a primeira cadeia de poli- peptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:

VL2-L1-VL1-L2-CL [1] a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula:

VH1-L3-VH2-L4-CH1-articulação-CH2-CH3 [1] a terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representa- da pela fórmula:

VH3-CH1-articulação-CH2-CH3 [1] e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representa- da pela fórmula:

VL3-CL [IV], em que:

VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;

VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;

CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina;

CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imu- noglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imu- noglobulina; articulação é uma região de articulação de imunoglobulina co- nectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, e em que os polipeptídeos de fórmula | e os polipeptídeos de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado.

[00208] Em certas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeo têm uma orientação cruzada que forma dois distintos sítios de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, os VH1 e VL1 formam um par de ligação e formam o primeiro sítio de liga- ção ao antígeno. Em algumas modalidades, os VH2 e VL2 formam um par de ligação e formam o segundo sítio de ligação ao antígeno. Em al- gumas modalidades, um terceiro polipeptídeo e um quarto polipeptídeo formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno. Em algumas modalida- des, os VH3 e VL3 formam um par de ligação e formam um terceiro sítio de ligação ao antígeno.

[00209] Tal proteína de ligação ao antígeno compreende pelo menos três sítios de ligação ao antígeno. Isto é pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno trivalente. Em uma modalidade particular, isto especi- ficamente liga-se a um alvo de antígeno, isto é, é uma molécula de liga- ção ao antígeno monoespecífica. Em outra modalidade, isto especifica- mente liga-se a dois diferentes alvos de antígeno, isto é, é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em outra modalidade, isto especifi- camente liga-se a três diferentes alvos de antígeno, isto é, é uma molécu- la de ligação ao antígeno triespecífico.

[00210] Os exemplos listados acima não são destinados a limitar o es- copo da invenção de qualquer maneira, e ligantes compreendendo ami- noácidos selecionados aleatoriamente do grupo consistindo em valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina e prolina mostraram ser ade- quados nas proteínas de ligação tipo anticorpo descritas aqui.

[00211] O formato de anticorpo CODV, as várias permutações do for- mato de anticorpo CODV, e detalhes adicionais a respeito dos ligantes são também descritas em WO2012/135345A1 e WO2017/180913A2, que são incorporados aqui por referência em suas totalidades. Fabs Tandem

[00212] Em uma modalidade particular, "Fabs tandem" refere-se a uma proteína de ligação ao antígeno, em que o terminal C de uma região CH1 de um primeiro domínio Fab é operativamente ligado ao terminal N de uma região VH de um segundo domínio Fab. Em certas modalidades, o anticorpo fab tandem pode ser tetravalente e monoespeciífico (cada dos quatro Fabs ligando o mesmo antígeno). Em certas modalidades, o anti- corpo fab tandem pode ser tetravalente e biespecífico (dois dos quatro Fabs ligam um primeiro antígeno ou epítopo enquanto os outros dois fabs ligam um segundo antígeno ou epítopo).

[00213] Os fabs tandem podem ser operativamente ligados com qual- quer conhecido ligante de peptídeo na técnica usado para ligar dois ou mais domínios de ligação ao antígeno. Em uma modalidade particular, o ligante de peptídeo é um ligante Gly-Ser, isto é, um ligante compreen- dendo somente aminoácido(s) de glicina e aminoácido(s) de serina. Em uma modalidade particular, o ligante de peptídeo é um ligante (Gly-Gly- GlIy-Gly-Ser).(SEQ ID NO: x), em que n é qualquer número inteiro de 1 a

5. Em uma modalidade particular, o ligante de peptídeo é um ligante (Gly-

GlIy-Gly-Gly-Ser);(SEQ ID NO: x). Em uma modalidade particular, o ligan- te de peptídeo é um ligante (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (SEQ ID NO: x).

[00214] —Alternativamente, ou em combinação com o ligante de Gly- Serrecitado acima, o ligante de peptídeo pode compreender toda ou parte da sequência da região de articulação de uma ou mais imunoglobulinas selecionadas de IgA, IgG, e IgD. Sequências de regiões de articulação de IgG, IgA e IgD humanos são indicados abaixo: IgA1 (SEQ ID NO: X): Val-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser- Pro-Ser.

IgA2 (SEQ ID NO: X): Val-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro.

IgD (SEQ ID NO: X): Glu-Ser-Pro-Lys-Ala-Gln-Ala-Ser-Ser-Val-Pro-Thr- Ala-Gln-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Ser-Leu-Ala-Lys-Ala-Thr-Thr-Ala-Pro-Ala- Thr-Thr-Arg-Asn-Thr-Gly-Arg-Gly-Gly-Glu-Glu-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys-Glu- Lys-Glu-Glu-Gln-Glu-Glu-Arg-Glu-Thr-Lys-Thr-Pro.

I9G1 (SEQ ID NO: X): Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro.

Ig9gG2 (SEQ ID NO: X): Glu-Arg-Lys-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro.

19G3: Glu-Leu-Lys-Thr-Pro-Leu-Gly-Asp-Thr-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Arg-Cys-Pro (SEQ ID NO: X) seguido por O ou 1 a 4 repetições de Glu-Pro-Lys-Ser- Cys-Asp-Thr-Pro-Pro-Pro-Cys-Pro-Arg-Cys-Pro (SEQ ID NO: X).

I9G4: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: X).

[00215] —Referido ligante de peptídeo pode compreender toda ou parte da sequência da região de articulação de somente uma imunoglobulina. Neste caso, referida imunoglobulina pode pertencer ao mesmo isotipo e subclasses como as imunoglobulinas das quais o domínio CH1 adjacente é derivado, ou a um diferente isotipo ou subclasse.

[00216] Alternativamente, referido ligante de peptídeo pode compre- ender toda ou parte das sequências de regiões de articulação de pelo menos duas imunoglobulinas de diferentes isotipos ou subclasses. Neste caso, a porção de terminal N do ligante de peptídeo, que diretamente se- gue o domínio CH1, pode consistir em toda ou parte da região de articu- lação de uma imunoglobulina pertencendo ao mesmo isotipo e subclasse como a imunoglobulina de qual referido domínio CH1 é derivado. Opcio- nalmente, referido ligante de peptídeo pode também compreender uma sequência de 2 a 15 ou de 5 a 10 aminoácidos de terminal N do domínio CH2 de uma imunoglobulina.

[00217] Em certas modalidades, sequências de regiões de articulação nativas podem ser usadas. Em outras modalidades, mutações pontuais podem ser trazidas para essas sequências, em particular, a substituição de um ou mais resíduos de cisteína em sequências de articulação I9G1, I9gG2 ou IgG3 nativas por alanina ou serina, a fim de evitar ligações de dissulfeto intra-cadeia ou inter-cadeias indesejadas.

[00218] “Um exemplo não limitante de um ligante de peptídeo que pode ser usado nas proteínas de ligação ao antígeno da invenção é um ligante de peptídeo tendo a seguinte sequência: Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys- Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser- Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: x). Referido ligan- te de peptídeo consiste na sequência de comprimento total de articulação de IgG1 humano, seguida pelos 9 aminoácidos de terminal N de I1gG1 CH2 humano (Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser, SEQ ID NO: X), se-

guidos por uma porção da sequência de articulação de IMgA1 humano (Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser, SEQ ID NO: X), e pelo dipeptídeo GG, adicionados para fornecer flexibilidade suplementar ao ligante. Em uma modalidade particular, o ligante de peptídeo Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp- Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro- Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: x) pode ter um ou mais resíduos de cisteína substituídos para eliminar formação de ligação ao dissulfeto. Em uma modalidade particular, o ligante de peptí- deo compreende a seguinte sequência: Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys- Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser- Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: X). Os ligantes de peptídeo “derivados de articulação são também descritos em WOZ2013/005194 A2, que é incorporado aqui por referência em sua totali- dade. VII. MUTAÇÕES DE ANTICORPO EXEMPLARES E COMBINAÇÕES

DE FORMATO DE ANTICORPO

[00219] “Quaisquer das mutações de anticorpo recitadas acima podem ser combinadas com quaisquer dos formatos de anticorpo recitados aci- ma.

[00220] Em uma modalidade particular, a proteína de ligação ao antí- geno da invenção pode compreender um formato de anticorpo CODV com um ou mais dos conjuntos de mutação de CR3, o conjunto de muta- ção de MUTA, o conjunto de mutação de carga oposta de L143/S176,e o conjunto de mutação de carga oposta de L124/V133. A proteína de liga- ção ao antígeno pode também compreender um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de VH / VL. Um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de VH / VL incluem, porém, não são limitados a, o con- junto de mutação de carga oposta de VH39/VL38. A proteína de ligação ao antígeno pode também compreender um ou mais conjuntos de muta- ção de estabilização de dissulfeto de VH / VL. Um ou mais conjuntos de mutação de dissulfeto de VH / VL incluem, porém, não são limitados a, o conjunto de mutação de VH44C/VL100C e o conjunto de mutação de VH105C/VL43C. A proteína de ligação ao antígeno pode também com- preender um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de CH1 / CL. Um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de CH1 / CL po- dem incluir, porém, não são limitados a, o conjunto de mutação de carga oposta de K221E/E123K.

[00221] Em uma modalidade particular, uma proteína de ligação ao antígeno da invenção compreende duas cadeias de polipeptídeo e forma dois sítios de ligação ao antígeno, em que uma cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e uma cadeia de polipeptídeo tem uma estrutura representada pela fór- mula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [1] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu-

noglobulina; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que o polipeptídeo de fórmula | e o polipeptídeo de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, em que um ou ambos de VH1 e VH2 compreendem uma mu- tação de VH44C e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma muta- ção de VL100C para formar uma ligação de dissulfeto, em que um ou ambos de VH1 e VH2 compreendem uma mu- tação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2, e em que o domínio CH1 compreende uma ou mais de muta- ções de T192E, L143Q e S188V e o domínio CL compreende uma ou mais de mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

[00222] Em uma modalidade particular, a proteína de ligação ao antí- geno da invenção pode compreender um formato de anticorpo Fab tan- dem com um ou mais do conjunto de mutação de CR3, o conjunto de mu- tação de MUTA, o conjunto de mutação de carga oposta de L143/S176, e o conjunto de mutação de carga oposta de L124/V133. A proteína de |li- gação ao antígeno pode também compreender um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de VH / VL. Um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de VH / VL incluem, porém, não são limitados a, o con- junto de mutação de carga oposta de VH39/VL38. A proteína de ligação ao antígeno pode também compreender um ou mais conjuntos de muta- ção de estabilização de dissulfeto de VH / VL. Um ou mais conjuntos de mutação de dissulfeto de VH / VL incluem, porém, não são limitados a, o conjunto de mutação de VH44C/VL100C e o conjunto de mutação de

VH105C/VL43C. A proteína de ligação ao antígeno pode também com- preender um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de CH1 / CL. Um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de CH1 / CL po- dem incluir, porém, não são limitados a, o conjunto de mutação de carga oposta de K221E/E123K.

[00223] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo: (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo: (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2, em que o terminal C de CH1-1 é operativamente ligado ao terminal N de VH2, e em que um ou ambos de VH1 e VH2 compreendem uma mu- tação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2, e em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de mutações de T192E, L143Q e S188V e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de muta- ções de N137K, S114A, V133T e S176V, em que as mutações em CH1-1 e CL1 para facilitar o parea- mento são diferentes das mutações em CH1-2 e CL2 para facilitar o pa- reamento.

[00224] Em uma modalidade particular, a proteína de ligação ao antí- geno da invenção pode compreender um formato de anticorpo em forma de Y tradicional com um ou mais do conjunto de mutação de CR3, o con- junto de mutação de MUTA, o conjunto de mutação de carga oposta de L143/S176, e o conjunto de mutação de carga oposta de L124/V133. A proteína de ligação ao antígeno pode também compreender um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de VH / VL. Um ou mais conjun- tos de mutação de carga oposta de VH / VL incluem, porém, não são limi- tados a, o conjunto de mutação de carga oposta de VH39/VL38. A prote- ína de ligação ao antígeno pode também compreender um ou mais con- juntos de mutação de estabilização de dissulfeto de VH/ VL. Um ou mais conjuntos de mutação de estabilização de dissulfeto de VH / VL incluem, porém, não são limitados a, o conjunto de mutação de VH44C/VL100C e o conjunto de mutação de VH105C/VL43C. A proteína de ligação ao antí- geno pode também compreender um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de CH1 / CL. Um ou mais conjuntos de mutação de carga oposta de CH1 / CL podem incluir, porém, não são limitados a, o conjunto de mutação de carga oposta de K221E/E123K.

[00225] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1)

compreendendo

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2,

em que um ou ambos de VH1 e VH2 compreendem uma mu- tação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2,

em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de mutações de T192E, L143Q e S188V e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de muta- ções de N137K, S114A, V133T e S176V, e em que as mutações em CH1-1 e CL1 para facilitar o parea- mento são diferentes das mutações em CH1-2 e CL2 para facilitar o pa- reamento.

[00226] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender:

a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo

em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma ou mais de mutações de T192E, L143Q e S188V e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma ou mais de muta- ções de N137K, S114A, V133T e S176V, e em que as mutações em CH1-1 e CL1 para facilitar o parea- mento são diferentes das mutações em CH1-2 e CL2 para facilitar o pa- reamento, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 também compreendem uma mutação de K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 também compreendem uma mutação de E123K.

[00227] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que um ou ambos de VH1 e VH2 compreendem uma mu- tação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou

Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[00228] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que um ou ambos de VH1 e VH2 compreendem uma mu-

tação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R ou Q39H e um ou ambos de VL1 e VL2 compreendem uma mutação de Q38E, Q38D, Q38K, Q38R ou Q38H, em que a mutação em um ou ambos de VH1 e VH2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de VL1 e VL2, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreende uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R ou V133H, e em que a mutação em um de ambos de CH1-1 ou CH1-2 é uma carga oposta da mutação em um ou ambos de CL1 e CL2.

[00229] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2);

em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K.

[00230] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D.

[00231] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender:

a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D.

[00232] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1)

operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123K.

[00233] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123K.

[00234] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123K.

[00235] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-

2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K.

[00236] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2);

em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K.

[00237] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou

L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K.

[00238] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre-

endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K.

[00239] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K.

[00240] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K.

[00241] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1)

compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E.

[00242] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1)

operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38K.

[00243] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada

(HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E.

[00244] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno;

(5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K.

[00245] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-

2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E.

[00246] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38K.

[00247] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123K, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K.

[00248] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K.

[00249] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-

2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E.

[00250] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38K.

[00251] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K.

[00252] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K.

[00253] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-

2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E.

[00254] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143R ou LI143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38K, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compreendem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K.

[00255] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou LI43K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K.

[00256] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e

(6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que o domínio CH1-1 compreende uma mutação de L143E ou L143D e o domínio CH1-2 compreende uma mutação de L143R ou L143K e o domínio CL1 compreende uma mutação de S176R ou S176K e o domínio CL2 compreende uma mutação de S176E ou S176D, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K.

[00257] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-

2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E.

[00258] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2,

em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38K.

[00259] Em uma modalidade particular, o anticorpo multiespecífico da invenção pode compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira regi- ão VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve cons- tante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma segunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1- 2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD2, em que um ou ambos dos domínios CH1-1 e CH1-2 compre- endem uma mutação de K221E e K228D e um ou ambos dos domínios CL1 e CL2 compreendem uma mutação de D122K e E123K, em que o domínio VH1 compreende uma mutação de VH39K e o domínio VL1 compreende uma mutação de VL38E, em que o domínio VH2 compreende uma mutação de VH39E e o domínio VL2 compreende uma mutação de VL38K. VIII. FORMULAÇÕES / COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00232] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica com- preendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno descritas aqui é fornecida. Algumas modalidades incluem composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das proteínas de ligação descritas aqui, ou uma proteí- na de conjugado de ligação-fármaco, em mistura com um agente de for- mulação farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável selecionado para adequabilidade com o modo de administração.

[00233] Materiais de formulação aceitáveis são tipicamente não tóxi- Cos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas.

[00234] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter, ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsor- ção, ou penetração da composição. Materiais de formulação adequados incluem, porém, não são limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glu- tamina, asparagina, arginina, ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio, ou hidrogênio-sulfito de sódio), tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HClI, citratos, fosfa- tos, ou outros ácidos orgânicos), agentes de volume (tais como manitol ou glicina), agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamina tetra- acético (EDTA)), agentes de complexação (tais como cafeína, polivinil- pirrolidona, beta-ciclodextrina, ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas,

monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos (tais como gli- cose, manose, ou dextrinas), proteínas (tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas), agentes de coloração, aromatizantes e de diluição, agentes emulsificantes, Polímeros hidrofílicos (tais como poli- vinilpirrolidona), polipeptídeos de baixo peso molecular, contraíons for- madores de sal (tais como sódio), preservativos (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico, ou peróxido de hidrogênio), solventes (tais como glicerina, propileno glicol, ou polietileno glicol), álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol), agentes de sus- pensão, agentes tensoativos ou umectantes (tais como plurônicos; PEG; ésteres de sorbitano; polissorbatos tais como polissorbato 20 ou polissorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes de realce da estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol), agentes de realce da tonicidade (tais como haletos de metal de álcali, por exemplo, cloreto de sódio ou potássio, ou sorbitol de manitol), veículos de liberação, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (veja, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18a. Ed, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), e edições subse- quentes do mesmo, incorporadas aqui por referência para qualquer propósito).

[00235] Em algumas modalidades a composição farmacêutica ideal sera determinada por um técnico versado, dependendo de, por exemplo, a rotina de administração pretendida, formato de liberação, e dosagem desejada. Tais composições podem influenciar o estado físico, estabi- lidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de depuração in vivo de uma proteína de ligação.

[00236] Em algumas modalidades o veículo ou transportador primário em uma composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado para in- jeção pode ser água, solução de salina fisiológica, ou fluido cere- broespinhal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Salina tampon- ada neutra ou salina misturada com albumina sérica são também veícu- los exemplares. Outras composição farmacêuticas exemplares com- preendem tampão Tris de cerca de pH 7,0 a 8,5, ou tampão de acetate de cerca de pH 4,0 a 5,5, que podem também incluir sorbitol ou um sub- stitute adequado. Em uma modalidade da invenção, composições de proteína de ligação podem ser preparadas para armazenagem misturan- do a composição selecionad tendo o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcional na forma de uma massa liofilizada ou uma solução aquosa. Além disso, a proteína de ligação pode ser formu- lada como um liofiizado usando excipientes apropriados, tal como sacarose.

[00237] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção podem ser selecionadas para liberação parenteral ou subcutâ- nea. Alternativamente, a composiçãos pode ser selecionada para inal- ação ou para liberação através do trato digestivo, tal como oralmente. À preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis é dentro da experiência na técnica.

[00238] Em algumas modalidades, os componentes de formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o sítio de administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a com- posição no pH fisiológico ou em um pH ligeiramente menor, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

[00239] “Quando administração parenteral é contemplada, as com-

posições terapêuticas para uso podem ser na forma de uma solução aquosa, parenteralmente aceitável, livre de pirogênio compreendendo a proteína de ligação desejada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril em que uma proteína de ligação é formulada como solução isotônica estéril, apropriadamente preservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, com- postos poliméricos (tais como ácido polilático ou ácido poliglicólico), con- tas, ou lipossomas, que fornecem a liberação controlada ou sustentada do produto que pode em seguida ser liberado por meio de uma injeção de depósito. Ácido hialurônico pode também ser usado, e este pode ter o efeito de promoção da duração sustentada na circulação. Outros métodos adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos de liberação de fármaco implantável.

[00240] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, uma proteína de ligação pode ser formulada como um pó seco para inalação. Soluções de inalação de proteína de ligação podem também ser formuladas com um propelente para liberação aerossol. Em ainda outra modalidade, soluções podem ser nebulizadas.

[00241] É também contemplado que certas formulações possam ser administradas oralmente. Em uma modalidade da invenção, proteínas de ligação multiespecíficas que são administradas deste modo podem ser formuladas com ou se messes transportadores habitualmene usados na composição de formas de dosagem sólidas tais como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser designada para liberar a porção ativa da formulaão no ponto no trato gastrointestinal em que a bi-

odisponibilidade é maximizada e a degradação pressistêmica é minimiza- da. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da proteína de ligação. Diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimido, e aglutinantes podem também ser em- pregados.

[00242] “Outra composição farmacêutica pode envolver uma quan- tidade eficaz de proteínas de ligação multiespecíficas em uma mistura com excipientes que são adequados para a fabricação de comprimidos. Dissolvendo os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas em forma de dose unitária. Excip- ientes adequados incluem, porém, não estão limitados a, diluentes iner- tes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose, ou fosfato de calcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina, ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.

[00243] “Composições farmacêuticas adicionais da invenção serão evi- dentes para aqueles versados na técnica, incluindo formulações en- volvendo proteínas de ligação em formulações de liberação sustentada ou controlada. Técnicas para formulação de uma variedade de outros métodos de liberação sustentada ou controlada, tais como transporta- dores de lipossoma, micropartículas bioerodíveis ou contas porosas e in- jeções de depósito, são também conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos adicionais de preparações de liberação sustentada in- cluem matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos modela- dos, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Matrizes de liberação sus- tentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietil-metacrilato),

etileno vinil acetato, ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico. Composições de liberação sustentada podem também incluir lipossomas, que podem ser preparadas por quaisquer de diversos métodos versados na técnica.

[00244] Em algumas modalidades, composições farmacêuticas que devem ser usadas para administração in vivo tipicamente devem ser estéreis. Isto pode ser realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis. Onde a composição é liofilizada, esterilização usando este método podem ser conduzidas ou antes de, ou após, liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser ar- mazenada em forma liofiizada ou em uma solução. Além disso, com- posições parenterais geralmente são colocadas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasconete de solução intravenosa tendo uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00245] Uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, ela pode ser armazenada em frasconetes estéreis como uma solução, sus- pensão, gel, emulsão, sólido, ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas ou em uma forma pronto para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) requerendo reconstituição antes da administração.

[00246] A invenção também abrange kits para produção de uma uni- dade de administração de dose única. Os kits podem cada qual conter tanto um primeiro recipiente tendo uma proteína de ligação multiespeciífi- ca seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. São também incluídos no escopo desta invenção kits contendo seringas pré- carregadas de única ou múltiplas câmaras (por exemplo, seringas líquidas e lioseringas).

[00247] A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de proteína de ligação a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do context terapêutico e objetivos. Alguém versado na técnica apreciará que os níveis de dosagem apropriados para tratamento desse modo variarão dependendo, em parte, da molécula liberada, a indicação para a qual a proteína de ligação está sendo usada, a rotina de admin- istração, e o tamanho (peso corporal, superfície corporal, ou tamanho do órgão) e condição (a idade e saúde geral) do paciente. Conse- quentemente, o medico pode titurar a dosagem e modificar a rotina de administração para obter o efeito terapêutico ideal.

[00248] A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farma- cocinéticos da proteína de ligação na formulação que está sendo usada. Tipicamente, um medico administrará a composição até a dosagem ser atingida que obtém o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que po- dem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão continua por meio de um dispositivo ou cateter de implante. Outro refinamento da dosagem apropriada é rotinei- ramente feito por aqueles versdos na técnica e se inclui no âmbito das tarefas rotineiramente realizada por eles. As dosagens apropriadas po- dem ser verificadas através do uso de dados dose-resposta apropriados.

[00249] A rotina de administração da composição farmacêutica é de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, oralmente; através de in- jeção por rotinas intravenosas, intraperitoneais, intracerebrais (intra- parenquimatosas), intracerebroventriculares, intramusculares, intraocula- res, intra-arteriais, intraportais, ou intralesionais; por sistema de liberação sustentada; ou por dispositivos de implante. Onde desejado, as com- posições podem ser administradas por injeção de bolus ou continuamen- te por infusão, ou por dispositivo de implante.

[00250] Em algumas modalidades, a composição pode também ser administrada localmente por meio de implante de uma membrana, ou es- ponja, ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Onde um dispositivo de implante é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e liberação da molécula desejada pode ser por meio de difusão, bolus de liberação controlada, ou administração contínua. VIII. MÉTODOS DE TRATAMENTO / USO

[00251] — Outro aspecto da invenção é um anticorpo multiespecífico e/ou uma proteína de ligação ao antígeno como descrito aqui para uso como um medicamento.

[00252] Em uma modalidade particular, é fornecido um método de tra- tar um distúrbio em que atividade de antígeno é prejudicial, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno descrita aqui.

[00253] As proteínas de ligação podem ser empregadas em qualquer ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitivos, ensaios sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação para a de- tecção e quantificação de um ou mais antígenos alvo. As proteínas de ligação se ligarão aos referidos um ou mais antígenos alvo com uma af- inidade que é apropriada para o método de ensaio que está sendo em- pregado.

[00254] Para aplicações diagnósticas, em algumas modalidades, pro- teínas de ligação podem ser marcadas com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção de- tectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, ºC, 32P, 35S, 1251, ºTc,

ln, ou 6Ga; um composto fluorescente ou quimioluminescente, tais como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ou luciferina; ou uma en- zima, tais como fosfatase alcalina, B-galactosidase, ou rábano picante peroxidase.

[00255] As proteínas de ligação são também úteis para imageamento in vivo. Uma proteína de ligação marcada com uma porção detectável ppode ser administrada a um animal, por exemplo, na corrente san- guínea, e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro ensaiado. A proteína de ligação pode ser marcada com qualquer porção que é detectável em um animal, se por ressonância magnética nuclear, radiologia, ou outros métodos de detecção conhecidos na técnica.

[00256] Para aplicações clínicas ou de pesquisa, em algumas modali- dades, proteínas de ligação podem ser conjugadas a um agente citotóxi- co. Uma variedade de anticorpos acoplados a agentes citotóxicos (isto é, conjugados de anticorpo-fármaco) tem sido usada para alvejar cargas úteis citotóxicas para células de tumor específicas. Agentes citotóxicos e ligantes que conjugam os agentes a um anticorpo são conhecidos na téc- nica; veja, por exemplo, Parslow, A.C. et al. (2016) Biomedicines 4:14 e Kalim, M. et al. (2017) Drug Des. Devel. Ther. 11:2265-2276.

[00257] A invenção também se refere a um kit compreendendo uma proteína de ligação e outros reagentes úteis para detecção de níveis de antígeno alvo em amostras biológicas. Tais reagentes podem incluir um marcador detectável, soro de bloqueio, reagentes de amostas de controle positive e negativo, e detecção. Em algumas modalidades, o Kit compre- ende uma composição compreendendo qualquer proteína de ligação, po- linucleotídeo, vetor, sistema vetor, e/ou célula hospedeira descritos aqui. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou suplemento de embalagem sobre ou associado com o recipiente. Recipi-

entes adequados incluem, por exemplo, frascos, frasconetes, seringas, bolsas de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipient retém uma composição que é em si ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar uma condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa ou um frasconete de solução intravenosa tendo uma rolha que pode ser perfura- da por uma agulha de injeção hipodérmica). Em algumas modalidades, o rótulo ou suplemento de embalagem indica que a composição é usada para prevenir, diagnosticar, e/ou tratar a condição de escolha. Alternati- vamente, ou adicionalmente, o artigo ou kit de fabricação pode também compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tais como água para injeção bacte- riostática (BWFI), salina tamponada por fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. El epode também incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas.

[00258] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presen- te invenção é administrada a um paciente em necessidade da mesma para o tratamento ou prevenção de câncer. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a um método de prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio proliferativo (por exemplo, câncer). Em algu- mas modalidades, o método compreende administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um de uma proteína de ligação, ou composições farmacêutica relacionadas com ela, descritas aqui. Em algumas modalidades, o paciente é um humano.

[00259] Em algumas modalidades, a referida pelo menos uma proteína de ligação é administrada em combinação com uma ou mais terapias an-

ticâncer (por exemplo, qualquer terapia anticâncer conhecida na técnica, tal como um agente ou terapia quimioterápica). Em algumas modalida- des, a referida pelo menos uma proteína de ligação é administrada antes das referidas uma ou mais terapias anticâncer. Em algumas modalidades, a referida pelo menos uma proteína de ligação é administrada concomi- tantemente com as referidas uma ou mais terapias anticâncer. Em algu- mas modalidades, a referida pelo menos uma proteína de ligação é ad- ministrada após as referidas uma ou mais terapias anticâncer.

EXEMPLOS

[00260] Antes da presente invenção ser descrita em detalhes abaixo, deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos e reagentes descritos aqui visto que estes podem variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrição de modalidades particulares somente, e é não se destina a limitar o escopo da presente invenção que sera limitada somente pelas reivindicações anexas. A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mes- mos significados como comumente entendido por alguém versado na técnica. Em particulares modalidades, os termos aqui usados são definidos como descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)," Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. e Kolb, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzer- land). A menos que de outro modo definido aqui, termos científicos e téc- nicos usados aqui têm os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. No evento de qualquer anbiguidade latente, definições fornecidas aqui tomam o precedente sobre qualquer definição de dicionário ou extrínsica. A menos que de outro modo requer- ido pelo contexto, termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular. O uso de "ou" significa "e/ou" a menos que estabelecido de outro modo. O uso do termo "incluindo," bem como outras formas, tais como "inclui" e "incluído," não é limitante. Como usado aqui, a menos que de outro modo estabelecido, as formas singulares "um, uma (a)" "um, uma (an)," e "o, a" incluem a referência plural. Desse modo, por exemplo, uma referência a "uma proteina" inclui uma plurali- dade de moléculas de proteína.

[00261] Além disso, os experimentos descritos aqui, a menos que de outro modo indicado, uso molecular convencional e técnicas biológicas e imunológicas celulares dentro da experiência na técnica. Tais técnicas são bem conhecidas pelo trabalhador experiente, e são explicadas total- mente na literature. Veja, por exemplo, Ausubel, et a/., ed., Current Proto- cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008), incluindo todos os suplementos, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Quarta Edição) por MR Green e J. Sambrook e Harlow et a/l., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 2a. edição).

[00262] Diversos documentos são citados em todo o texto deste relató- rio descritivo. Cada um dos documentos aqui citados (incluindo todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações dos fabricantes, instruções etc.), seja supra ou infra, é pelo presente incorpo- rado por referência em sua íntegra. Nada aqui deve ser construído como uma admissão de que a invenção não é intitulada para antecipar tal in- venção em virtude de invenção anterior.

[00263] Nos seguintes, os elementos da presente invenção serão descritos. Estes elementos são listados com modalidades específicas; entretanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicion-

ais. Os exemplos variavelmente descritos e modalidades particulares não devem ser construídos para limitar a presente invenção as formas de re- alizaão explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para suportar e abranger modalidades que combinam as modalidades ex- plicitamente descritas com qualquer número dos elementos descritos. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os ele- mentos descritos neste pedido devem ser considerados descritos pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique de outro modo.

[00264] Geralmente, nomenclaturas usadas em conexão com cultura celular e de tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, gen- éticas e química e hibridização de proteína e ácido nucleico descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas fornecidos aqui são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e descritas em todo o presente relatório descritivo, a menos que de outro modo indicado. Reações enzimáticas e técnicas de purificação são real- izadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizadas na técnica ou como descritas aqui. As nomenclaturas usadas em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e far- macêutica descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, e liberação, e tratamento de pacientes.

[00265] “Montagem Fab é direcionada por interação de domínio VH/VL e CH1I/CL. Uma variedade de construções multiespecíficas com diferentes arquiteturas contendo diferentes mutações de interface Fab foram geradas. A capacidade de pares de mutação combinados dentro das interfaces CH1/CL e VH/VL para direcionar correto pareamento foi investigada e é descrita nos exemplos abaixo. Exemplo 1: Expressão geral e esquema de purificação Expressão de moléculas biespecíficas e triespecíficas

[00266] Células HEK 293-FS crescendo em cultura de suspensão livre de soro F17 (Invitrogen) foram transfectadas com os plasmídeos codifi- cando cadeia leve e cadeia pesada indicados usando reagente de trans- fecção de polietilenoimina. Após 7 dias de cultivo a 37ºC, células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi passado sobre um filtro de 0,22 um para remover partículas.

[00267] Para purificação, o anticorpo foi capturado na coluna MabSe- lect SuRe (Cat. No.: 11-0034-93, GE Healthcare) e eluído com tampão de citrate a 0,1M, pH 3,0 e diretamente dessalinizado usando um coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Cat.No.: 17-05087-02, GE Healthcare). Após polir a cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) usando uma Superdex200 26/60 (GE) e uma etapa de concentração de ultrafiltragem final, a proteína foi usada para outra caracterização. Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) analítica

[00268] A SEC analítica foi realizada usando um instrumento BioSEC- curity (PSS Polimer) com uma coluna TSKgel SuperSW3000 (4,6 mm x 300 mm) e coluna de guarda TSKgel SuperSW HPLC (Tosoh Bioscience) a 25ºC. Aanálise foi conduzida em uma taxa de fluxo de 0,25 ml/min usando NaCl a 250 mM, Na-fosfato a 100 mM, pH 6,7 com detecção a 280 nm e 260 nm. Dispersão de luz estática foi detectada a 436 nm. 5 ul de amostra de proteína (a 1 mg/ml) foi aplicada sobre a coluna. À avaliação de dados foi realizada usando o software WinGPC v8.1 (PSS

Polimer). Para estimative do peso molecular, a coluna de SEC foi cali- brada com padrões de proteína emu ma faixa de peso molecular de 6,5 a 670 kDa. Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) analítica

[00269] HIC analítica foi realizada usando um instrumento LC10 HPLC (Shimadzu) com uma TSKgel Ether-5SPW 10 um, 2x75mm (Tosoh Biosci- ence) a 25ºC. A análise foi conduzida em um taxa de fluxo de 0,1 mi/min com detecção a 280 nm. 5 ug de amostra de proteína não diluída foram aplicados sobre a coluna. Eluição gradiente foi de O a 30 minutos (0% a 100% de B) seguida por 10 minutos de 100% de B e 15 minutos de reequilíbrio. Tampão A foi composto de sulfato de amônio a1,5M, fosfato de sódio a 25 mM, pH 7,0. Tampão B foi composto de fosfato de sódio a mM, pH 7,0. A avaliação de dados foi realizada usando LabSolutions software v5.85 (Shimadzu). Espectrometria de Massa (MS)

[00270] Integridade de proteína foi analisada por LC-MS. Amostras de proteína foram desglicosiladas com 12,5 ug de proteína diluída para 0,5 mg/ml em tampão de D-PBS tratado com 0,5 ul de PNGaseF (NewEng- landBiolabs, livre de glicerol) a 37ºC durante 15 horas. A análise de LC- MS foi realizada usando um instrumento 6540 UHD Accurate-Mass Q- TOF LC/MS (Agilent). Cromatografia de fase reversa (RP) foi feita usando um Poroshell 300SB-C8 5 um, 75 x 0,5 mm (Agilent) com coluna de guarda Poroshell 300SB-C8, 5 um, 2,1 x 12,5 mm (Agilent) a 180 uL/min. Eluentes foram água LC, 0,1% ácido fórmico (A) e 90% de acetonitrila, 10% de água LC, 0,1% de ácido fórmico (B). 2 ug de proteína foram in- jetados sobre a coluna e eluídos usando um gradiente linear de 0% a 100% de B em 13 minutos. Análise de dados foi realizada usando o soft- ware MassHunter software B.06 (Agilent). Massas moleculares foram cal-

culadas com base nas sequências de aminoácido de uma proteína usando o software GPMAVW versão 9.13a2 (Lighthouse Data). Ressonância de Plasmônio de Superfície (SPR)

[00271] Ligação de antígenos às construções de anticorpo foi medida usando ressonância de plasmônio de superfície (SPR) com um instru- mento BlAcore 3000 (GE Healtheare) com tampão HBS-EP (GE Healthcare). O anticorpo de captura Fc anti-humano (kit de captura de anticorpo humano, GE Life Sciences) foi imobilizado por meio de grupos amina primários (11000 RU) em um chip CM5 de grau de pesquisa (GE Life Sciences) usando os procedimentos padrão. Os ligantes foram cap- turados em uma taxa de fluxo de 10 ul/min com um valor RU ajustado que resultou em ligação de analito máximo de 30 RU. As construções de anticorpo testadas foram usadas como analitos e injetadas em concen- tração a 100 nM durante 240 segundos com um tempo de dissociação de 300 segundos em uma taxa de fluxo de 30 ul/minuto. Medições de ciné- ticas de ligação foram realizadas usando os anticorpos capturados com injeções de diluições seriais de duas vezes dos analitos de 3 nM a 100 nM. Superfícies do chip foram regeneradas com injeções de 2 minutos do tampão de regeneração fornecido com o kit de captura. Sensorgramas foram referenciados duas vezes com uma superfície de chip em branco e os brancos de tampão HBS-EP. Análise de dados foi realizada usando o software BlAevaluation v4.1. Fluorimetria de varredura diferencial (DSF)

[00272] Os dados Tm do ponto de fusão foram determinados usando fluorimetria de varredura diferencial (DSF). As amostras foram diluídas em tampão de D-PBS (Invitrogen) para uma concentração final de 0,2 ug/ul incluindo uma solução concentrada 4 vezes de corante SYPRO- Orange (Invitrogen, matéria prima 5000x em DMSO) em D-PBS em plac-

as de 96 cavidades semi- white semi-saia semi-brancas (BIORAD). Todas as medicos foram feitas em duplicate usando um instrumento de PCR de tempo real MyiQ2 (BIORAD). Curvas de derivado primeiro nega- tivo (-d(RFU)/dT) das curvas de fusão foram geradas no Software iQ5 v2.1 (BIORAD). Os dados foram em seguida exportados em Excel para determinação de Tm e exibição gráfica dos dados.

[00273] Sequências para aticorpos Fab tandem seletos, anticorpos CODV triespecíficos, e anticorpos na forma de Y biespecíficos são cita- dos abaixo nas Tabelas 2,3, e 4.

Tabela 2 — Sequência de aminoácido para selecionar anticorpos Fab tandem.

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLOPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE

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TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF & OX40 NRGEC|EVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQOK DS x FRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFESVWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST o

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Sequência LC-1 — Negrito & sublinhado Nome do Construto LC-2 — Negrito & itálico 9 eee mms (CH1: T192E; CK: N137K, | FTLTISSLASEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR S114A) EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR x GEC|JQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKS OX40 RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGOQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS (CH1: L143Q, S188V; CK:|GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPS V133T, S176V) NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVASGAEVKKPGASVKVSCKASGYT

FTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVL (fechado) APRWYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV & =

HTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP RW SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL o

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GITR EIVMTOSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQKKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTE (Q38K-039E)-(CH1: — T192E; | FTLTISSLASEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR P CK: N137K, S114A) EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR x GEC|JQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIREPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKS

Sequência LC-1 — Negrito & sublinhado Nome do Construto LC-2 — Negrito & itálico 9 jeees mEmes OX40 RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGOQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS (Q038E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPS S188V; CK: V133T, S176V) NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT

FTDSYMSWVRKAPGOQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVL (fechado) APRWYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

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ISSLQPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAK

VAQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC OX40 DIQMTOASPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF (CH1: L143Q, S188V; CK:|TLTISSLAPEDFATYYCAQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE V133T, S176V) AKVOQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG T4 x EC|EVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE

GITR RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG (CH1: T192E; CK: N137K, | GTAALGCOQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN S114A) TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLST

SGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTR (fechado) RYFPFAYWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQOYNSTYRVVSVLTVLHQ

DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPG|EIVMTQS

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KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC RW OXx4o DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQEKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF o : TLTISSLAPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE (GSBE GIN (CH: 11430, AKVOQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG S188V; CIC: V133T, S176V) EC|EVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRKAPGQOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE T5 STR RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG (038K-039E)-(CH1: —T192E: GTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN . TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLST CI: N157K, 5114) SGMGVGWIREPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTR

RYFPFAYWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT (achado) FPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV

Sequência LC-1 — Negrito & sublinhado Nome do Construto LC-2 — Negrito & itálico 9 je mes

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQOYNSTYRVVSVLTVLHQ

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PATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQKKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQW

KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVMTOSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTE a

FTLTISSLASEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR NS DT

GITR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR RW (CH1: T192E; CK: N137K, | GEC/QVTLRESGPALVKPTOTLTLTCTESGFESLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKS o S114A) RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS x GGTAALGCLVKDYFPEPVYTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPS T6 OX40 NTKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT (CH1: L143Q, S188V; CK:|FETDSYMSWVROAPGOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVL V133T, S176V) APRWYFSVWGOGTLVYVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

HTFPAVLOSSGLYSLVSVVYTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP (aberto) SVFLEFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

TQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAK VAQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC EIVMTOSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQKKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTE FTLTISSLASEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR

EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR GEC|JQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIREPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKS a asa Q39E)(CH1: T192E: RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS ss & - : ; ú CK: N137K, S114A) GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPS RW ' NTKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYT o * FTDSYMSWVRKAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVL V (asse 030 (CHA: 11430, APRWYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV no HTFPAVLOSSGLYSLVSVVYTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP S188V; CIC V133T, S176V) SVFLEFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE (aberto) WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG|DIQ

MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQEKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLT ISSLQPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAK VAQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

DIQMTOASPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLAPEDFATY YCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE

AKVOQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG OXx4o EC|EVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE . . , | RWTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG (GHT: L1430, S186V, OK GTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN V1SST, S176V) TKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLST T8 STR SGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTR a = (CH1: T192E: CK: N137K, RYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT RW S114A) FPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV o

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ

DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES (aberto) NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG|EIVMTQS

PATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPRLLIYSAS YRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQW

KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC OX40 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQEKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF T9 (Q38E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | TLTISSLAPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE S188V; CK: V133T, S176V) AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRG

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado x EC|EVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRKAPGOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE

GITR RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG (Q38K-Q039E)-(CH1: — T192E; | GTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN CK: N137K, S114A) TKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLST (aberto) SGMGVGWIREPPGKALEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTR

RYFPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ Z É

DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES RW NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPG|EIVMTQS o

PATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQKKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

EIVLTAOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD Ppi FTLTISSLEPEDFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP * REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN To Oxao RGEC|DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSG

SGTDFTLTISSLAPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN (aberto) FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado SFNRGEC|IQVOLVESGGGVVAQPGRSLRLDCKASGITFESNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYA

DSVKGRFTISRDNSKNTLFLOMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVYTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSGPPGPGPGGGEVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCV LAPRWYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL Z &

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE RW WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG o OX40 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQEKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF (CH1: T192E; CK: N137K, | TLTISSLAPEDFATYYCQAQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE S114A) AKVOQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG x EC|EVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRKAPGQOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE

TH GITR RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG (CH1: L143Q, S188V; CK:|GTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN V133T, S176V) TKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTF

SSYGMHWVREAPGKGLEWVAVIWYEGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (fechado) GGSMVRGDYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS

GALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOQGNVFESCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGJAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQKKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLAQPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNF

YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC 3 =

DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTD RW PD-L1 FTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPR o (Q38K-Q039E)-(CH1: — T192E; | EAKVOWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR CK: N137K, S114A) GEC|EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFESDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVK x GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS T12 CD40 TSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK (Q038E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVOASGAEVKKPGASVKVSCKASG S188V; CK: V133T, S176V) YTETGYYMHWVRQOAPGOQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFOGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYY

CARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV (fechado) SWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP

PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

STYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVY

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOQGNVFESCSVMHEALHNHYTOK SLSLSPG|DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLAQSGVPSRFS

GSGSGTDFTLTISSLAPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LKNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP

VTKSFNRGEC DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLASGVPSRFSGSGSGTD a FTLTISSLAQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR o CD40 EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR DS (CH1: L143Q, S188V; CK:|GEC/IQVALVASGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQOAPGQOGLEWMGWINPDSGGTNYAQKF o V133T, S176V) QGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV x FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVYTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQ TI3 PD-L1 TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVOQLVESGGGLVQPGGS (CH1: T192E; CK: N137K, | LRLSCAASGFTFESDSWIHWVRQOAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLR S114A) AEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVT

VSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC (fechado) PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado KSLSLSPG|DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVT CLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQEKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTD

FTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR a CD40 GEC|EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFESDSWIHWVRKAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKG Ss = (Q38E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | RETISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST RW S188V; CK: V133T, S176V) SGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP o x SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVOASGAEVKKPGASVKVSCKASGY T1I4 PD-L1 TFTGYYMHWVREAPGQOGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFOGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYC (Q38K-Q039E)-(CH1: — T192E; | ARDOPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS CK: N137K, S114A) WNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP

CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS (fechado) TYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFESCSVMHEALHNHYTOKS LSLSPG|DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQKKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSG

SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL

KNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV o AAA

DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQEKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF TLTISSLAPEDFATY YCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE

AKVOQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG OXx4o EC|EVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRKAPGOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE . . . RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG a Saa) TI92E; OK: NISIK, GTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN % = x TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVESGGGVVAQPGRSLRLDCKASGITF RW TS PD1 SNSGMHWVREAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLOQMNSLRAEDTAVYYCAT o . . . | NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA (GHT: L1430, S186V, OK VLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLF V1SST, S176V) PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW

LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG (aberto) QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPG|EIVLTQSPA

TLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado (Q38K-039E)-(CH1: — T192E; | FTLTISSLAPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPR CK: N137K, S114A) EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR x GEC|EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVK CD40 GRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS (Q038E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | TISGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK S188V; CK: V133T, S176V) PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVOAOSGAEVKKPGASVKVSCKASG

YTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFOGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYY (aberto) CARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV Z =

SWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP RW PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN o

STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK SLSLSPG|DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLAQSGVPSRFS

VTKSFNRGEC CD40 DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLASGVPSRFSGSGSGTD TI7 (CH1: L143Q, S188V; CK:|FTLTISSLAPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR V133T, S176V) EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado x GECJQVALVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGOGLEWMGWINPDSGGTNYAQKF PD-L1 QGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDOQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV (CH1: T192E; CK: N137K, | FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTO S114A) TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVESGGGLVQPGGSL

RLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRA (aberto) EDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTV

SWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN >

DT

STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV RW KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK o SLSLSPG|DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS

GSGSGTDFTLTISSLAQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS

PVTKSFNRGEC PD-L1 DIQMTOAOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQEKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTD (Q38E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | FTLTISSLAPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPR TI8 S188V; CK: V133T, S176V) EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR x GEC|EVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRKAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKG OX40 RETISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado (Q38K-Q039E)-(CH1: — T192E; | SGEGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP CK: N137K, S114A) SNTKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGY (aberto) TFETGYYMHWVREAPGOGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFOGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYC

ARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS E ú LSLSPG|DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQKKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSG RW SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL o

KNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV

TKSFNRGEC PD1 EIVLTAOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD (CH1: T192E; CK: N137K, | FTLTISSLEPEDFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYP S114A) REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN T1I9 x RGEC|/QVAQLVESGGGVVOAPGRSLRLDCKASGITESNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSV OX40 KGRFTISRDNSKNTLFLOMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (CH1: L143Q, S188V; CK:|AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK V133T, S176V) VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTD

SYMSWVRQOAPGOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQOKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPR (fechado) WYFESVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD

WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG|DIQMTAS

PSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQAGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAKVQW 2 =

KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC RW PD1 EIVLTAOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD o : . | ETLTISSLEPEDFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYP (aBICA3IE) (CH: TI92E; REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN CI: N157K, S114A) RGEC|/QVAQLVESGGGVVAPGRSLRLDCKASGITESNSGMHWVREAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSV T20 xao KGRFTISRDNSKNTLFLOMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (038E-A39K)-(CH1: L1430, AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK no VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTD S188V; CIC V133T, S176V) SYMSWVRKAPGOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPR

WYFESVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP (achado) AVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD

WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG|DIQMTAS

PSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQEKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQAGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAKVQW

KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF a TLTISSLAPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE %

É OX40 AKVOQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG RW (CH1: L143Q, S188V; CK:|EC|EVOLVAOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE o V133T, S176V) RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG x GTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN T21 PD1 TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVESGGGVVOPGRSLRLDCKASGITFE (CH1: T192E; CK: N137K, | SNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLOMNSLRAEDTAVYYCAT S114A) NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA

VLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLE (fechado) PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW

LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPG|EIVLTQSPA

TLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC DIQMTAOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQKKPGKAPNLLIYTASTLASGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLAQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR

EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNR CD40 GEC|JQVALVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVREAPGOGLEWMGWINPDSGGTNYAQKE a (038E-A39K)-(CH1: L1430, QGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV 8 S188V: CK: V133T, S176V) FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVYTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQ RW ' ' TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVOQLVESGGGLVQPGGS o * LRLSCAASGFTFSDSWIHWVRKAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLR TP PD+1 : . | AEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVT (aBICA3IE) (CH: TI92E; VSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC CI: N157K, 5114) PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL (achado) VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPG|DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQEKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRF

SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVT CLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado ——uúLLLC SSSSSSSSSMMM

EIVLTAOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYP

REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC|JQVOLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFESNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSV PD1 . . . KGRFTISRDNSKNTLFLOMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (HT: TI92E; CIC NISTK, AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK a 7 148) VDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVOASGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTD 3 = T23 OXx4o SYMSWVRQOAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPR 5 (CH1: L1430, S188V: CK WYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP

AVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL V1SST, S176V) FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD

WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN (aberto) GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG|DIQMTAS

PSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQAGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAKVQW

KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC PD1 EIVLTAOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQKKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado CK: N137K, S114A) REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN x RGEC|/QVAQLVESGGGVVAPGRSLRLDCKASGITESNSGMHWVREAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSV OX40 KGRFTISRDNSKNTLFLOMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT (Q038E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK S188V; CK: V133T, S176V) VDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVOASGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTD (aberto) SYMSWVRKAPGQOGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPR

WYFSVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVWNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFL S

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD DS WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN o GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG|DIQMTAS

KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC OX40 DIQMTOASPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDF (CH1: L143Q, S188V; CK:|TLTISSLAPEDFATYYCAQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPRE T25 V133T, S176V) AKVOQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG x EC|EVOQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRE PD1 RVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG

Sequência LC-1 — Negrito & sublinhado Nome do Construto LC-2 — Negrito & itálico 9 je mms (CH1: T192E; CK: N137K, | GTAALGCOQVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN S114A) TKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFS

NSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLOMNSLRAEDTAVYYCATN (aberto) DDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV

LOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL

NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFESCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG|EIVLTQSPAT S =

LSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPE RW DFAVYYCQASSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWKV o

DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC CD40 DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQKKPGKAPNLLIYTASTLASGVPSRFSGSGSGTD (Q38E-Q39K)-(CH1: — L143Q, | FTLTISSLAPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPR S188V; CK: V133T, S176V) EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR x GEC|JQVALVAOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVREAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKF T26 PD-L1 QGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDOQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV (Q38K-Q039E)-(CH1: — T192E; | EPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVEVPSSSLGTO CK: N137K, S114A) TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSTPPTPSPSGGEVQLVESGGGLVQPGGSL

RLSCAASGFTFSDSWIHWVRKAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRA

Sequência Nome do Construto LC-1 — Negrito & sublinhado LC-2 — Negrito & itálico HC — sublinhado (aberto) EDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCQVKDYFPEPVTV

SWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV

KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFESCSVMHEALHNHYTOK SLSLSPG|DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQEKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFS

GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTC LLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS 3 e

PPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTOKSLSLSPG

O ese comem QDWLNGKEYKCKVSNKALPA | QGNVFSCSVMHEALHNRFTO PIEKTISKAKGQPREPQVYTL | KSLSLSPG

PPCRDELTKNQVSLWCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEA

RDELTKNQVSLWCLVKGFYP S =

SDIAVEWESNGQPENNYKTT RW PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS o

RWQQGNVFSCSVMHEALHN

SDIAVEWESNGQPENNYKTT DS PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS o

RWQQGNVFSCSVMHEALHN

RDELTKNQVSLWCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG

KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV N EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE S PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD VHNAKTKPREEQYNSTYRVVS WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN ISKAKGQPREPQVYTLPPCRDEL KALPAPIEKTISKAKGQPREPQV TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG GFYPSDIAVEWESNGQPENNY SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTQKSLSLSPGGAAHHHHH

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP SCDKTHTCPPCPAPELLGGPS KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD VHNAKTKPREEQYNSTYRVVS WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN

ISKAKGQPREPQVYTLPPCRDEL KALPAPIEKTISKAKGQPREPQV TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK =

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG GFYPSDIAVEWESNGQPENNY FZ

SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD N CSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH o

NRFTOKSLSLSPGGAAHHHHH

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP SCDKTHTCPPCPAPELLGGPS KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD VHNAKTKPREEQYNSTYRVVS WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN ISKAKGQPREPQVYTLPPCRDEL KALPAPIEKTISKAKGQPREPQV TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG GFYPSDIAVEWESNGQPENNY SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD CSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTOKSLSLSPGGAAHHHHH

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP SCDKTHTCPPCPAPELLGGPS RW KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV o

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD VHNAKTKPREEQYNSTYRVVS WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN ISKAKGQPREPQVYTLPPCRDEL KALPAPIEKTISKAKGQPREPQV TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG GFYPSDIAVEWESNGQPENNY SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD CSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTOKSLSLSPGGAAHHHHH

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP SCDKTHTCPPCPAPELLGGPS KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD VHNAKTKPREEQYNSTYRVVS

WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN ISKAKGQPREPQVYTLPPCRDEL KALPAPIEKTISKAKGQPREPQV = TKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVE CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK Ss

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG GFYPSDIAVEWESNGQPENNY DS SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD o

CSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTOKSLSLSPGGAAHHHHH

EVTHOGLSSPVTKSFNRGEC VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT | LSSPVTKSFNRGEC YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWV DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW HNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK KAKGQPREPQVYTLPPCRDELT ALPAPIEKTISKAKGQPREPQV KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS GFYPSDIAVEWESNGQPENNY FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTOKSLSLSPGGAAHHHHH

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWV DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW HNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK KAKGQPREPQVYTLPPCRDELT ALPAPIEKTISKAKGQPREPQV KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS GFYPSDIAVEWESNGQPENNY FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTQOKSLSLSPGGAAHHHHH

PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV REEQYNSTYRVVSVLTVLHODW HNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK KAKGQPREPQVYTLPPCRDELT ALPAPIEKTISKAKGQPREPQV KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS GFYPSDIAVEWESNGQPENNY FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTQOKSLSLSPGGAAHHHHH H

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWV DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV

REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW HNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK = KAKGQPREPQVYTLPPCRDELT ALPAPIEKTISKAKGQPREPQV 8

KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK N ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS GFYPSDIAVEWESNGQPENNY o

FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH NRFTOKSLSLSPGGAAHHHHH

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC | LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN | LTLSKADYEKHKVYACEVTHOG | SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOT EVTHOGLSSPVTKSFNRGEC VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT | LSSPVTKSFNRGEC YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS

HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWV DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW HNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK KAKGQPREPQVYTLPPCRDELT ALPAPIEKTISKAKGQPREPQV KNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS GFYPSDIAVEWESNGQPENNY FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC KTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVD SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG KSRWQQGNVFSCSVMHEALH

EALHNHYTQKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTOQ KSLSLSPG

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS | PSDIAVEWESNGQPENNYKTTP KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH | PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE | PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP

LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT | SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY | VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY | EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS

RVVSVLTVLHOQDWLNGKEYKCK | VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNK

VSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE | ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC

PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC | TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG

LVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN | FYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV | TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKS

DKSRWQQGNVFSCSVMHEALH | RWOQGNVFSCSVMHEALHNRF

NHYTQKSLSLSPG TQKSLSLSPG =

Y23 EIVLTOSPATLSLSPGERATLS | QVAQLVESGGGVVQPGRSLRLDC | EVQLVOSGAEVKKPGASVKVSC | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTIT 8

LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV | FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ | VOVSHEDPEVKFNWYVDGVEV

YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK | HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL

EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG | TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL

QPREPQVYTLPPCRDELTKNOQV | PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG | PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFY QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS | PSDIAVEWESNGQPENNYKTTP KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH | PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

Cc PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT | SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV | FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ | VOVSHEDPEVKFNWYVDGVEV YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK | HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG | TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL QPREPQVYTLPPCRDELTKNQV | PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG | PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFY QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS | PSDIAVEWESNGQPENNYKTTP KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH | PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH | PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

NHYTQKSLSLSPG TQKSLSLSPG

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNG | PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFY QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS | PSDIAVEWESNGQPENNYKTTP KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH | PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE | PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP

LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT | SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY | VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY | EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS

RVVSVLTVLHOQDWLNGKEYKCK | VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNK

VSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE | ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC

PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC | TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG

LVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN | FYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV | TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKS

DKSRWQQGNVFSCSVMHEALH | RWOQGNVFSCSVMHEALHNRF NM

NHYTQKSLSLSPG TQKSLSLSPG w

Y41 DIQMTOSPSSVSASVGDRVTIT | QVQLVAOSGAEVKKPGASVKVSC | EVOLVESGGGLVQPGGSLRLS | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTIT N

DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE | PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP

LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT | SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY | VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY | EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS

RVVSVLTVLHODWLNGKEYKCK | VLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNK

VSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC PQVYTLPPCRDELTKNQVSLWC | TLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG LVKGFYPSDIAVEWESNGOQPEN | FYPSDIAVEWESNGQPENNYKT NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV | TPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKS DKSRWQQGNVFSCSVMHEALH | RWOQGNVFSCSVMHEALHNRF

NHYTQKSLSLSPG TOQKSLSLSPG

EALHNHYTOKSLSLSPG KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTOKSLSLSPG KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS | LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQO KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH | PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS

EALHNHYTOKSLSLSPG KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV | KVYDEKVEPDSCDKTHTCPPCPA

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV | PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS

VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH | RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT | WYVDGVEVHNAKTKPREEQYN

VLHODWLNGKEYKCKVSNKALP | STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

APIEKTISKAKGQPREPQVYTLP | KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ

PCRDELTKNQVSLWCLVKGFYP | PREPQVCTLPPSRDELTKNQVS

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPP | LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ NM

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ | PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVS -

QGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS | KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH DS

LSLSPG EALHNRFTQKSLSLSPG o

Ya48 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTIT | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSC | QVALVESGGGVVOPGRSLRLS | AIQLTAOSPSSLSASVGDRVTITC

SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV | KVYDEKVEPDSCDKTHTCPPCPA

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV | PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS

SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV | SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV | FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCOVV

VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH | VOVSHEDPEVKFNWYVDGVEV

NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT | HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL

VLHODWLNGKEYKCKVSNKALP | TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL

APIEKTISKAKGQPREPQVYTLP | PAPIEKTISKAKGQPREPQVCTL

PCRDELTKNQVSLWCLVKGFYP | PPSRDELTKNQVSLSCAVKGFY

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPP | PSDIAVEWESNGQPENNYKTTP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ | PVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRW

QGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS | QQGNVFSCSVMHEALHNRFTOQ

LSLSPG KSLSLSPG x)

Y52 DIQMTOSPSSVSASVGDRVTIT | QVQLVAOSGAEVKKPGASVKVSC | EVOLVESGGGLVQPGGSLRLS | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTIT S

DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE | PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP

LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT | SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC

PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY | VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY | EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS

RVVSVLTVLHOQDWLNGKEYKCK | VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNK

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ | TTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKS QGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS | RWQQGNVFSCSVMHEALHNRF

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO KSLSLSPG

EALHNHYTOKSLSLSPG QQGNVFSCSVMHEALHNRFTO KSLSLSPG

Exemplo 2: Heterodimerização permitindo mutações no formato

CODV

[00258] Três mutantes diferentes do formato do anticorpo CODV foram explorados para expressão, rendimento e homogeneidade. O primeiro formato compreendia um CODV anticorpo com mutações bo- tão-em-buraco no domínio Fc com as mutações CH1/kappa MUT4 no CODV-Fab (CH1: L143Q, S188V; Ck: V133T, S176V) e as mutações CH1/kappa CR3 em Fab2 (CH1: T192E; Ck: N137K, S114A) (FIG. 14). O segundo formato compreendeu um CODV anticorpo com mutações botão-em-buraco no domínio Fc com as mutações MUT4/CR3 do primei- ro formato, em combinação com mutações eletrostáticas VH39E/VL38K em ambos CODV-Fabs e Fab2 (FIG. 1B). O terceiro formato compreen- dia um anticorpo CODV com mutações botão-em-buraco no domínio Fc com as mutações MUT4/CR3 e mutações eletrostáticas do formato segundo, em combinação com mutações estabilizantes de dissulfeto VH44C/VL100C no CODV-Fab (FIG. 1C).

[00259] Um resumo das mutações eletrostáticas e de formação de ligações dissulfeto nas regiões variáveis é mostrado na Tabela 4. Um resumo das mutações CH1/CL kappa é mostrado na Tabela 5. A des- crição detalhada dos esquemas de expressão e purificação são descri- tos em Exemplo 1. FIG. 2A a FIG. 2G retratam graficamente dados dos vários formatos de anticorpos CODV testados.

[00260] A Tabela 5 abaixo resume os resultados da caracterização de vários formatos de anticorpo CODV testados em um ([OX40 x PD1] + GITR) anticorpo CODV triespecífico. Mutações CH1/Ck : CODV-Fab (CH1: L143Q, S188V; Ck: V133T, S176V) e Fab (CH1: T192E; Ck: N137K, S114A). CM (mutações carregadas): CODV-Fab (VH39E / VL38K) e Fab2 (VH39K / VL38E). ds (mutações de estabilização da ligação dissulfeto): VH44Cys/VL100Cys. Conforme mostrado abaixo na Tabela 5, a introdução de mutações na interface CH1/CL aumentou o ponto de fusão inicial (Tm inicial), indicando um aumento na estabili- dade térmica.

A incorporação adicional de modificações VH/VL au- mentou significativamente o pareamento correto, conforme mostrado por HIC e MS (ver FIG. 2A a FIG. 2G). Uma combinação de conjuntos de mutação CH1/CL kappa (CR3 e MUT4) e mutações estabilizantes de dissulfeto apresentaram resultados promissores, demonstrando alto teor de monômero HIC e maior termoestabilidade.

A combinação de conjuntos de mutação CH1/CL kappa (CR3 e MUT4), mutações esta- bilizantes de dissulfeto e mutações de carga oposta também apresen- taram resultados promissores.

Tabela 5 — Resumo da expressão e caracterização biofísica de um ((OX40 x PD1] + GITR) anticorpo CODV tries- pecíficos contendo diferentes mutações da interface Fab. MS Tm inicial

SEC Rendimento HIC [pareado corretamente] | Tm1i médio clone Monômero Img/L] 1 [% monômero] [pareado erroneamen- | Tm2 médio ' te] re) LC2+HC1 LC2+HC2 sn Tipo Selvegem LC1+HC1 53 76 32 62 Cc1 LC2+HC2 N 68 oO LC1+HC1 o

N LC1+HC2 RB — o LC2+HC1 55 mutações CH1/Ck LC2+HC2 34 65 c2 LC1+HC1 84 LC2+HC2 CH1/Ck LC2+HC1 52 + LC2+HC2 124 81 18 58 CM LC1+HC1 79 c3 LC2+HC2

LC1I+HC1 ds LC2+HC2 22 73 81 LC1I+HC1+LC2 Cc4 LC2+HC2 CH1/Ck LC1I+HC1 + LC2+HC2 ds 32 84 Homodímero LC2+HC2 Cc5

CM LC1I+HC1 + LC2+HC2 NM Ds 23 79 88 es LC2+HC1 NS LC2+HC2 & c6 o CH1/Ck + CM 60 LC1I+HC1 + 57 63 LC2+HC2 ds 80 c7

Exemplo 3: Heterodimerização possibilitando mutações no forma- to Fab tandem

[00261] “Duas conformações de anticorpos Fab tandem foram explo- radas. Cada conformação foi posteriormente testada quanto à expres- são, purificação e homogeneidade eficientes. O primeiro formato con- sistia em uma conformação aberta do Fab tandem onde um anticorpo em forma de Y é anexado, através de ligantes flexíveis no domínio VH, a outro fragmento Fab (ver FIG.3A e FIG. 3B). O segundo Fab tandem consistia em uma conformação fechada do fab tandem, onde os ligan- tes sem domínio VH descritos acima poderiam formar uma ligação dis- sulfeto (ver FIG. 3C e FIG. 3D).

[00262] Dois mutantes, um para cada das conformações Fab tan- dem aberto e Fab tandem fechado, foram explorados para expressão eficiente, purificação e homogeneidade. O primeiro mutante consistia em uma fab aberta com somente as mutações MUT4 e CR3 (FIG. 3A). O segundo mutante consistia em uma fab aberta com as mutações MUT4 e CR3 em combinação com as mutações carregadas opostas (FIG. 3B).

[00263] Dois mutantes, cada um da conformação Fab tandem fe- chado, foram explorados para expressão eficiente, purificação e ho- mogeneidade. O primeiro mutante consistia em uma fab fechada com somente as mutações MUT4 e CR3 (FIG. 3C). O segundo mutante consistia em uma fab fechada com as mutações MUT4 e CR3 em combinação com as mutações carregadas opostas (FIG. 3D).

[00264] “Como mostrado na Tabela 6 abaixo, uma combinação de mutações de interface CH1/CL com VH/VL aumentou o perfil de HIC alvo em comparação com os exemplos onde somente as modificações de CH1/CL foram introduzidas. Assim, as mutações combinatórias di- minuíram a quantidade de espécies pareadas incorretamente e au- mentaram a quantidade de moléculas pareadas corretas (pico de HIC alvo). A força dos resultados do pareamento era dependente do ali- nhamento da sequência do anticorpo e do domínio. Tabela 6 — produção, SEC, HIC, e dados de afinidade de ligação para anticorpos Fab tandem. rendimento SEC HIC Afinidade [mg/L] Monômero[%] Pico principal [%]

GITR 0,3nNM T3 45,47 97 70 OX40 0,3nNM OX40 0,2nM TA4 49,98 45 87

GITR 0,9nM OX40 0,2nM T5 48,2 44 93

GITR 0,7nNM

GITR 0,5nM T6 15,54 100 95 OX40 n.b.

GITR 0,7nNM T7 58,7 100 93 OX40 1nM OX40 0,3nNM T8 15 100 57

GITR 0,6nM OX40 0,2nM T9 1,96 85 7658

GITR 0,6nM Fr E e tr rendimento SEC HIC Afinidade [mg/L] Monômero[%] Pico principal [%]

PD1

0,2nM TH 40,5 95

OX40

0,2nM

PD1

0,2nM T1I2 33,4 91 67

OX40

0,39NM

OX40

0,2nM T1I3 25,5

PD1

0,9nM

OX40

0,08nM T14 34,1 95 88

PD1

0,6NM

PD1

0,2nM T1I5 57,1 100

OX40

0,39NM

PD1

0,2nM T1I6 71,04 100 95

OX40

0,5nM

OX40

0,2nM TI7 63,2 100 10

PD1

1,5nM

OX40

0,09nM TI8 45,96 92

PD1

0,8NM

CD40

2,ANM T19 42,8 44 47

PD-L1

93pM rendimento SEC HIC Afinidade [mg/L] Monômero[%] Pico principal [%] CD40 1,70M T20 37,2 49 56 PD-L1 58pM Ee er e kr PD-L1 19pM T22 50,6 71 62 CD40 2,AnM CD40 3,1nM T23 55,8 PD-L1 72pM CD40 1,6nM T24 67,92 PD-L1 51pM PD-L1 21pM T25 59,64 95 CD40 4nM PD-L1 23pM T26 92 CD40 2,1nM

[00265] A configuração aberta em Fab tandem com somente as mu- tações MUT4/CR3 rendeu aproximadamente 68% de pareamento cor- reto. Porém, observou-se que a introdução das mutações carregadas opostas aumentou o rendimento e homogeneidade do polipeptídeo correto de 68% para 96%. (FIG. 4).

[00266] As configurações abertas e fechadas foram comparadas lado a lado com um anticorpo anti-CD40 x anti-PD-L1. Como pode ser visto na FIG. 5A a FIG. 5D, a configuração fechada resultou em menor rendimento e pureza, conforme medido por HIC, em comparação com a configuração aberta. A adição das mutações carregadas opostas combinadas com mutações CH1/CL kappa (CR3/MUT4) também me- lhorou a pureza. Estes efeitos foram suportados pelo anticorpo anti- PD-1 x anti-OX40, como mostrado na FIG. 6A a FIG. 6C. A configura- ção aberta resultou em maior rendimento e pureza. A inclusão das mu- tações de carga oposta melhorou ainda mais o rendimento e a pureza. Exemplo 4: mutações de anticorpos em forma de Y

[00267] O projeto de Fab ortogonal em anticorpos biespecíficos com arquitetura em forma de Y foi alcançado pela introdução de muta- ções botões-em-buracos (botão: S354C, T366W; buraco: Y349C, T366S, L368A, Y407V) no domínio CH3s das respectivas cadeias pe- sadas. Os dois braços Fab diferentes contidos como mutações descri- tas na FIG. 8A e FIG. 8B, bem como as mutações mostradas nas Ta- belas 7 a 9 abaixo. As mutações na FIG. 8A são as mutações CH1/kappa MUT4 em Fab1 (CH1: L143Q, S188V; Ck: V133T, S176V) e as mutações CH1/kappa CR3 em Fab2 (CH1: T192E; Ck: N137K, S114A). As mutações na FIG. 8B são as mutações MUT4/CR3 da FIG. 8A, em combinação com mutações eletrostáticas VH39E/VL38K em ambos Fab1 e Fab2.

[00268] “Um anticorpo anti-PD-1 x anti-cOX40 com várias mutações foi testado. A Tabela 7 abaixo oferece um resumo da expressão e ca- racterização biofísica de variantes do anticorpo biespecífico PD-1 x OX40 variando em suas mutações de interface Fab. As modificações CH1/CL-apenas ou VH/VL-apenas não foram eficazes para prevenir o pareamento incorreto. A combinação das mutações propostas de CH1/CL com mutações de interface VH39/VL38 influenciou significati- vamente o pareamento guiado, conforme determinado por HIC e MS (ver FIG. 9A - FIG. 9C).

Tabela 7- Expressão e caracterização biofísica de variantes de anticorpos anti-PD-1 x anti-OX40 em forma de Y.

[00269] Um anticorpo anti-CD40 x anti-PD-L1 com várias mutações foi testado.

A Tabela 8 abaixo oferece um re- sumo da expressão e caracterização biofísica de variantes do anticorpo CD40 x PD-L1 biespecífico variando em suas mutações de interface Fab.

As modificações CH1/CL- apenas ou VH/VL-apenas não foram eficazes para prevenir o pareamento incorreto.

A combinação de mutações de CH1/CL de mutação da interface VH39/VL38 influenciou signifi- cativamente o pareamento guiado, conforme determinado por HIC e MS.

Tabela 8 - Expressão e caracterização biofísica de variantes de anticorpos em forma de Y anti-CD40 x anti-PD- L1. Fab 1 (CD40) Fab 2 (PD-L1) Rendi- Captura — RU | Captura RU sEC HC Tm inicial Clone mento CD40/RU Fc|PDLIRU Fc Le1 Hc1 Lc2 Hc2 [% Monômero] | [% alvo] re) NM [mg/L] por SPR por SPR oO oo | R V133T L143Q o Y20 S114AN1I37K |T1I92E |81 95,8% 62,3% 57,7 63% 91% S176V S188V V133T L143Q Y29 E123K K221E |112 98,4% 65,5% 58,27 65% 92% S176V S188V SIA E123K | TI92E Y30 57 100,0% 69,5% 57,27 74% 21% N137K K221E V133T LI430 STA E123K | TIGZE Y31 88 98,5% 72,2% 58,51 58% 90% S176V S188V N137K K221E

NI37K S176V | TIGZE S188V

QE Y38 Q38E Q39K A38K E123K | [79 100% 100,0% 58,72 64% 89% Q38E Q39K Q39E Y39 Vv133T L143Q As8K E123K | 1 [78 99% 100,0% 57,74 63% 90% S176V S188V Q39E O38K S114A Y4o Q38E Q39K T1I92E |64 100% 100,0% 58,21 61% 90% E123K N137K K221E Q38E ASK Q39E O38K S114A Ya Vv133T L143Q TI92E |82 99% 100,0% 58,00 64% 90% E123K N137K NM S176V S188V K221E 8 Q39IE NW O38K SIMA RR Y42 Q38E Q39K VISIT NISTK| oo 99% 100,0% 58,55 60% 90% Dé S176V T192E

[00270] Um anticorpo anti-PD-1 x anti-OX40 com várias mutações diferentes do que o anticorpo anti-PD-1 x anti- OX40 anterior foi testado. A Tabela 9 abaixo oferece um resumo da expressão e caracterização biofísica de variantes de um anticorpo PD1 x OX40 biespecífico com mutações variadas na interface de Fab. Conforme mostrado na Tabe- la 9, mutações de CH1 CL nos pares L143/S176 ou L124/V133 em combinação com mutações de interface VH/VL nas posições VH38/VL39 aumentaram significativamente a quantidade de espécies pareadas corretas conforme observa- do pelo perfil HIC e verificado por análise MS (FIG. 9A - FIG. 9€C e FIG. 10A - FIG. 10L).

Tabela 9 - Expressão e caracterização biofísica de variantes dos anticorpos em forma de Y anti-PD-1 x anti-OX40. Clone Fab 1 (0X40) Fab 2 (PD1) Rendimento | SEC HIC [% | Tm inicial | Captura RU Ox40/RU | Captura RU PD1I/RU Img/L] [% Monômero] | alvo] rc) Fc por SPR Fc por SPR ME A o [am [eo o A 38E 39K 38K 39E 38E 39K 38K 39E 38E 39K 38K 39E e e Ss Sm 38E 39K 38K 39E Q38E Q39K Q38K Q39E Ys5 25,4 92,9% 86,3% |599 13% 18% NM ste LI4SK | S1I76K L143D [ae fon fenam ne a e 8 Q38E Q39K Q38K Q39E o o o o Q

N Y6 sieo lr143H [sim 11480 1338 92,1% 83,1% |589 12% 18% z 38E 39K 38K 39E o E E 38E 39K 38K 39E 38E 39K 38K 39E 38E 39K 38K 39E 38E 39K 38K 39E 38E 39K 38K 39E [e 5 1 E 1

[00271] Os níveis de ligação ao antígeno nos dados de SPR nas Tabelas 7 a 9 são relatados em relação ao nível de anticorpo captura- do (Captura de antígeno RU/ RU Fc) para uma melhor comparação entre as construções. Os dados de SPR nas Tabelas 7 a 9 mostram que todos as construções de anticorpos testadas ligam seus respecti- vos antígenos com níveis de ligação comparáveis. Exemplo 5: Expressão geral e esquema de purificação pelo Ex- emplo 6 e Exemplo 7 Cromatografia de exclusão por tamanho analítica (SEC)

[00272] SEC analítica foi realizada usando um instrumento Bi- oSECcurity (Polímero PSS) com uma coluna AdvanceBio 300 (4,6 mm x 300 mm) e coluna de guarda AdvanceBio 300 (Agilent Technologies) a 25 ºC. A análise foi executada a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min usando tampão D-PBS concentrado 2x (Thermo Fisher Scientific) com detecção a 280 nm. 10 ul de amostra de proteína (a 1 mg/ml) foram aplicados na coluna. A avaliação dos dados foi realizada usando o sof- tware WinGPC v8.1 (PSS Polymer). Para estimativa do peso molecu- lar, a coluna SEC foi calibrada com uma mistura padrão de calibração de proteínas (Agilent Technologies). Cromatografia de interação hidrofóbica analítica (HIC)

[00273] HIC analítica foi realizado usando um instrumento LC10 HPLC (Shimadzu) ou um instrumento Vanquish HPLC (Thermo Fisher Scientific) equipado com uma coluna TSKgel Butil-NPR (2,5 um, 4,6 x mm) (Tosoh Bioscience) a 25 ºC. A análise foi executada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min com detecção a 280 nm. 5 ug de amostra de proteína não diluída foram aplicadas na coluna. A eluição do gradiente foi de 15% de B a 85% de B em 7 min seguido por 1 min a 100% de B, em seguida 1 min a 15% de B e em seguida 3 minutos equilíbrio a 15% de B. O tampão A era composto por sulfato de amônio a 1,5 M, fosfato de sódio a 25 mM, pH 7,0. O tampão B era composto por fosfa-

to de sódio a 25 mM, pH 7,0. A avaliação dos dados foi realizada usando o software LabSolutions v5.85 (Shimadzu) ou o software Chromeleon 7 (Thermo Fisher Scientific). Espectrometria de massa (MS)

[00274] A integridade da proteína e o potencial de pareamento in- correto de construções heterodiméricas foram analisadas por LC- espectrometria de massa (LC-MS). As amostras de proteína foram desglicosiladas com 12,5 ug de proteína diluída para 0,17 mg/ml em água grau LC-MS (Thermo Scientific) tratada com 0,5 ul de PNGaseF (sem glicerol, New England Biolabs) a 37 “ºC por 16 horas. A análise LC-MS foi realizada usando um instrumento Thermo Fisher Orbitrap Lumos LC/MS. A cromatografia de fase reversa (RP) foi feita usando uma coluna MabPac RP HPLC, tamanho de partícula analítica de 4 um, 2,1 x 100 mm (Thermo Scientific) a 300 uL/min. Os eluentes foram água LC , ácido fórmico 0,1% (A) e acetonitrila 90%, água LC 10%, ácido fórmico a 0,1% (B). 2 ug de proteína foram injetados na coluna e eluídos usando um gradiente linear de 0% a 95% de B em 12 minutos. A análise dos dados foi realizada por meio do software Expressionist

13.0.3 (Genedata). As massas moleculares foram calculadas com ba- se nas sequências de aminoácidos das proteínas usando o software GPMAW versão 10.32b1 (dados Lighthouse). Ressonância de plasmônio de superfície (SPR)

[00275] A ligação de antígenos ás construções de anticorpos foi medida usando ressonância de plasmônio de superfície (SPR) com um instrumento BlAcore T200 (GE Healthcare) com tampão HBS-EP + (GE Healthcare). Para avaliação dos níveis de ligação relativa (% Rmax) dos anticorpos para seus respectivos antígenos, os anticorpos foram capturados por captura de afinidade anti-Fc para o chip de sen- sor. Neste ensaio, antígenos humanos recombinantes foram usados (PD-L1-His (9049-B7-100, R&D Systems), CD40-His (10774-H08H,

Sino Biological), TNFa (130-094-022, Miltenyi), GITR -His (produzido internamente), PD1-His (8986-PD-100, R&D Systems), CD3£5-FLAG- His (4 CTO38-H2508H, Sino Biological) e CD123 humano (% 301-R3 / CF, R&D Systems)). O anticorpo de captura de Fc anti-humano ((Kkit de captura de anticorpo humano, GE Life Sciences) foi imobilizado por meio de grupos de amina primária (11000 RU) em um chip CM5 de grau de pesquisa (GE Life Sciences) usando procedimentos padrão. Os anticorpos foram capturados a uma taxa de fluxo de 10 ul/min com um valor RU ajustado que resultou na ligação máxima do analito de 10 a 30 RU. Os antígenos foram utilizados como analitos e injetados na concentração de 400 nM e 100 nM para CD3e3-FLAG-His ou na con- centração de 100 nM para todos os outros antígenos utilizados. Os antígenos foram injetados por 240 segundos com um tempo de disso- ciação de 300 segundos a uma taxa de fluxo de 30 uL/min. As superfí- cies dos chips foram regeneradas com injeções de 2 min do tampão de regeneração fornecido com o kit de captura. Os sensorgramas fo- ram duplamente referenciados com uma superfície de chip em branco e tampões HBS-EP em branco. A análise dos dados e a determinação do nível de ligação foram realizadas usando o software Biacore 8K Evaluation v1.11.7442 (GE Healthcare). Os valores de ººRmax foram calculados usando o nível de ligação máximo dividido pelo valor Rmax teórico. Os valores de Rmax foram calculados a partir do nível de cap- tura Rcapture, a estequiometria de ligação N e o peso molecular do anticorpo Mw (Ab) e antígeno Mw (Ag) com Rma =Rcapture*N* (Mw(Ag)/Mw(Ab).

Fluorimetria de varredura nano diferencial (nanoDSF)

[00276] As temperaturas de início (T inicial) e os pontos de fusão (Tm) de desnaturação da proteína foram determinados usando fluori- metria de varredura diferencial nano (nanoDSF). As amostras foram diluídas em tampão de formulação para uma concentração final de 0,5 ug/ul e carregadas em capilares nanoDSF (Nanotemper Technologies) em duplicatas. Todas as medições foram feitas usando um dispositivo nanoDSF Prometheus NT .plex (Nanotemper Technologies). A taxa de aquecimento foi de 1 ºC por minuto de 20 ºC a 95 ºC. Os dados foram registrados usando PR.ThermControl Software v2.3.1 (Nanotemper Technologies) e analisados usando PR.Stability Analysis Software v1.0.3 (Nanotemper Technologies). Exemplo 6: adicionais mutações de anticorpos em forma de Y

[00277] — Anticorpos biespecíficos adicionais com arquitetura em for- ma de Y foram gerados e testados com diferentes conjuntos de muta- ções. Especificamente, um anticorpo anti-PD-1 x anti-OX40 foi empre- gado com as mutações citadas abaixo na Tabela 10. Os dados abaixo mostram que todos os anticorpos em forma de Y com mutações Fab reduziram o pareamento incorreto em comparação com um controle do tipo selvagem. O anticorpo com o conjunto de mutações de carga oposta VH39/VL38, o conjunto de mutação de carga oposta L143/S176,e o conjunto de mutação de carga oposta K221E: K228D/E123K:D122K combinado (Proteína ID Y61) exibiram resultados excelentes, sem pa- reamento incorreto detectado.

Tabela 10 - Expressão e caracterização biofísica de variantes dos anticorpos em forma de Y anti-PD-1 x anti-OX40. 1 qa F9R100XA0) Fab 2(PD1) Rendimento | sec mei Ms proteina LC1 He Lc2 Hc2 O [% Monômero] | [alvo] | PCT+HO1 | LOTHHO1 | LO2+HC1 . . LC1+HC2 | LC2+HC2 | LC2+HC2 FR SI EE IE asa oz Ts Q38K Q39E Q38E Q39K Y58 S176E L143R S176R L143E 25 96,7% 99,6% 0,4% E123K K221E Y59 -” Tot L14oR Q38E As 29 93,6% 98,5% 1,5% S176R L143E DO DO PO D122K K228D Q38K Q39E Q38E Q39K RN " o o Q38K Q39E 8 vei S176E L143R Q38E Q39K 57 99,6% 100% 100% E123K K221E S176R L143E D122K K228D Exemplo 7: Heterodimerização adicional permitindo mutações no formato de anticorpo em forma de Y

[00278] — Anticorpos em forma de Y adicionais com diferentes conjuntos de mutações heterodimerizantes foram tes- tados. A Tabela 11 abaixo recita os dados de caracterização biofísica de cada anticorpo em forma de Y testado. Con- forme citado na Tabela 11 e Figura 11A a Figura 11E, "CM1" se refere ao par de mutação VH39K/VL38E, "CM2" se refere ao par de mutação VH39E/VL38K, "CM3" se refere ao par de mutação CH1 L143E ou L143D/CL S176R ou S176K par de mutação, "CM4" refere-se ao par de mutação CH1 L143R ou L143K/CL S176E ou S176D, e "NN3" refe-

re-se ao par de mutação CH1 K221E e K228D/CL D122K e E123K.

Tabela 11 - Mutações de heterodimerização para anticorpos Fab tandem.

Rendimento [SEC JE [ME ID a Nome da Proteína [mg/L] par correto Mal —reparado|Mal reparado Proteína [%monômero] |[%monômero] [LC1 + HCI/LCI + HCI/LC2A + HC LC2 + HC2 LC1 + HC2 LC2 + HC2

[785 [PoTxGMTRFHS [o ss ss o

(PDT-CMI x GITR-CM2)RUIgG ANN 1908 fes o (PD1-CM1/CM3 x GITR-CM2/CM4)-|48

Y4s5 hulgG1-NN3 99,4 70,9 100

[46 [NE x GITRYFUIGOS [156 ss Ts Ao E

[var janFomIxGmTR-CMaAÇETANNS [128 fase fone fo (TNF-CM1/CM3 x GITR-CM2/CM4)-|114 Es

Ya4s hulgG1-NN3 98,9 70,0 100 S

(INF x OX40)FuIge7 [8 Ts To io AO

INFO x OXao-CMBNUIgeTANNa fo pro ssa fr (TNF-CM1/CM3 x OX40-CM2/CM4)-|52

Y51 hulgG1-NN3 75,8 63,0 100

(CDACCMTXPDLTCVAMAgeTÁNS do raso fe [o Bo (CD40-CM1/CM3 x PDL1-CM2/CM4)-

Y54 hulgG1-NN3 98,8 64,5 61 39

(CD40 x POLTTRUIGG! o bs Ta Te e

[v55 — [(CD3 x CDT25)-nulg61

(CD3-CMTxCcDI23-CMaXnueTaNS 7a asa ssa ar (CD3-CM1/CM3 x CD123-CM2/CM4)- 40

Y57 hulgG1-NN3 89,1 59,2 95 5

PR A O RR A eis | P das Tonset |Tm1 %Rmax %ARmax %Rmax %ARmax %ARmax %Rmax %ARmax %Rmax EC50

E PF ITR RR A Pe fes as e | [8 Je ap Ti O OO [e fa ar Pr ea ae a Rj a

JO RR O S e Pp º

FT TR A A [E JD O OO a

E RF TB TT II ATE AI II AA e FR E A AE AAA eee

[00279] “Como mostrado na Tabela 11 e Figuras 11A a 11E, cada uma das várias mutações de heterodimerização empregadas reduz o pareamento incorreto em comparação com um anticorpo de tipo sel- vagem. No caso do anticorpo anti-TNF x anti-OX40 (Y49), que é co- nhecido por não ter pareamento incorreto em uma configuração de tipo selvagem, a inclusão de mutações de heterodimerização não impactou negativamente o pareamento incorreto (FIG. 11C).

[00280] Além da caracterização biofísica acima, o anticorpo enga- ger de células T, CD3 x CD123, estava em um ensaio de citotoxicida- de baseado em células. Moléculas de anticorpo biespecífico foram analisadas em ensaios de citotoxicidade utilizando células T humanas primárias. Células mononucleares periféricas humanas de sangue de doadores saudáveis foram isoladas em Leucosep-Tubes (Greiner Bio- One, t 227290) usando 15ml de Histopaque (Sigma-Aldrich, % 10771) e centrifugação por 10min a 1000xg.). PBMCs isolados foram lavados duas vezes em tampão de enxágue autoMACS (Miltenyi Biotec, % 130- 091-222) suplementado com solução estoque de MACS BSA a 5% (Miltenyi Biotec, % 130-091-370). As células T humanas primárias fo- ram isoladas de PBMCs humanos com o Separador MACSpro (Mil- tenyi Biotec) e o kit de isolamento de células Pan T (Miltenyi Biotec, tt 130-096-535) usando os protocolos dos fabricantes. As células T hu- manas isoladas foram ressuspensas a 5 x 106 células/ml em meio RPMI GlutaMAX | (Gibco, *% 72400) suplementado com FCS HI a 10% (Gibco, t% 10082-147). Antes do ensaio de citotoxicidade, as células alvo THP-1 (ADCC TIB-202) foram manchadas com 1 uM de CFSE (Invitrogen, tt C1157) por 15 min a 37 ºC. As células foram lavadas duas vezes em meio RPMI + GlutaMAX | e centrifugadas a 400xg por 5min. As células alvo THP-1 foram ressuspensas a 5x 10º células/mL em meio RPMI suplementado com 10% de FCS HI. Células THP-1 marcadas com CFSE e células T humanas pan foram misturadas em um efetor de 10:1 para a relação alvo e semeadas em um volume total de 100 ul/orifício em uma placa de ensaio de 96 orifícios (Greiner Bio- One, t 650185). Moléculas de anticorpo biespecífico foram adiciona- das às células em 11 séries de diluições a partir de 10nM a OnM (dilui- ção 1: 6) em um volume de 5 uL/orifício e incubadas por 20 horas a 37 ºC e 5% de CO?2. Após a incubação, as células foram manchadas com pg/ml de 7-AAD (Invitrogen, % A1310) durante 30 min a 4 ºC. Para determinar a citotoxicidade, as células-alvo mortas foram medidas por fechamento em células CFSE/7-AAD duplo positivas THP-1 em um citômetro de fluxo LSRII (BD) e os valores de EC50 foram determina- dos com o software XIfit.

[00281] Como mostrado na FIG. 12, todos os três anticorpos bies- pecíficos CD3 x CD123 demonstraram atividade comparável e robusta. A presença de mutações de heterodimerização em Y56 e Y57 não im- pactou negativamente a atividade, reduzindo o pareamento incorreto da cadeia.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica, caracteri- zada pelo fato de compreender pelo menos duas regiões VL respectiva- mente pareadas com pelo menos duas regiões VH para formar pelo me- nos dois sítios de ligação ao antígeno e pelo menos duas regiões CH1 respectivamente pareadas com duas regiões CL, em que pelo menos um par CH1/CL compreende mutações de CH1/CL para facilitar o pareamento selecionado do grupo consistindo em um ou mais de (1) uma mutação de T192E (CH1) e mutações de N137K e S114A (CL), e (2) mutações de L143Q e S188V (CH1), e mutações de V133T e S176V (CL), e (3) mutações de T192E, L143Q e S188V (CH1) e muta- ções de N137K, S114A, V133T e S176V (CL), (4) uma mutação de K221E (CH1) e uma mutação de E123K (CL), (5) mutações de T192E e K221E (CH1) e mutações de N137K, S114A e E123K (CL), (6) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H (CH1) e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R, ou S176H (CL), (7) uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R, ou L124H (CH1) e uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R, ou V133H (CL), (8) uma mutação de K228D (CH1) e uma mutação de D122K (CL), e (9) mutações de K221E e K228D (CH1) e mutações de

D122K e E123K (CL), em que quando dois pares CH1/CL compreendem mutações para facilitar o pareamento para dois diferentes pares VH/VL, os dois pa- res CH1/CL não compreendem as mesmas mutações, e em que pelo menos um par VH/VL compreende mutações car- regadas opostas para facilitar o pareamento, referidas mutações carrega- das opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na po- sição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K R, ouH, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL.

2. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica, caracteri- zada pelo fato de compreender: a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo: (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira região VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1 (CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1) operativamente ligada a VL1; e (3) um primeiro domínio de heterodimerização (HD1); e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo: (4) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma se- gunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antí- geno; (5) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2; e (6) um segundo domínio de heterodimerização (HD2); em que heterodimerização HD1 e HD?2, em que pelo menos um ou ambos de par VL1 e VH1 e de par VL2 e VH2 compreende mutações carregadas opostas para facilitar o pa- reamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, em que pelo menos um ou ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreende mutações para facilitar o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 para facilitar o pareamento são diferentes das mutações em CH1-2 e CL?2 para facilitar o pareamento.

3. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de pelo menos uma região CH1 ser operacionalmente ligada a um domínio de heterodimerização.

4. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica, caracteri- zada pelo fato de compreender pelo menos duas cadeias de polipeptídeo e formando pelo menos dois sítios de ligação ao antígeno, em que uma cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e uma cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [Il]

em que:

VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;

CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;

CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina; e

L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que VH1 é pareado com VL1, VH2 é pareado com VL2, e CH1 é pa- reado com CL,

em que o polipeptídeo de fórmula | e o polipeptídeo de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado,

em que pelo menos um ou ambos de par VL1 e VH1 e de par VL2 e VH2 compreende mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H,

em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, e em que o par de domínio CH1 e CL compreende mutações que facilitam o pareamento.

5. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica, caracteri- zada pelo fato de compreender quatro cadeias de polipeptídeo que for- mam quatro sítios de ligação ao antígeno, em que duas cadeias de poli- peptídeo cada compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [1] e duas cadeias de polipeptídeo cada compreende uma estrutura repre- sentada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fec [1] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imu- noglobulina; Fc compreende uma região de articulação de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que VH1 é pareado com VL1 para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno, VH2 é pareado com VL2 para formar um segundo sítio de ligação ao antígeno, e CH1 é pareado com CL,

em que os polipeptídeos de fórmula | e os polipeptídeos de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que um ou ambos do par VL1 e VH1 e o par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, referida mutação carregada oposta compreendendo (1) um resíduo mu- tado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, e em que um ou ambos do par de domínio CH1 e CL compreen- de mutações que facilitam o pareamento, e em que quando pelo menos dois pares CH1/CL compreendem mutações para facilitar o pareamento, em seguida a mutação definida em um par CH1/CL é diferente da mutação definida no outro par CH1/CL.

6. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica, caracteri- zada pelo fato de compreender quatro cadeias de polipeptídeo, que for- mam três sítios de ligação ao antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutu- ra representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL1 [1], uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura repre- sentada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-1-articulação-CH2-CH3 [1], uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula:

VH3-CH1-2-articulação-CH2-CH3 [11], e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura represen- tada pela fórmula:

VL3-CL?2 [IV], em que:

VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imuno- globulina;

VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;

VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imu- noglobulina;

CL1 é um primeiro domínio constante de cadeia leve de imu- noglobulina;

CL2 é um segundo domínio constante de cadeia leve de imu- noglobulina;

CH1-1 é um primeiro domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;

CH1-2 é um segundo domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;

CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imu- noglobulina;

CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imu-

noglobulina; articulação é uma região de articulação de imunoglobulina co- nectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido, em que o polipeptídeo de fórmula | e o polipeptídeo de fórmula Il formam um par de cadeia leve-cadeia pesada cruzado, e em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou mais de pares VH1/VL1, VH2/VL2 e VH3/VL3 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que um ou ambos do par VL1 e VH1 e o par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat seleciona- da de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, em que um ou ambos do par CL1 e CH1-1 e o par CL2 e CH1- 2 compreendem mutações que facilitam o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 são diferentes do que as mutações em CH1-2 e CL2.

7.Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica, caracteriza- da pelo fato de compreender a) um primeiro par de cadeia leve (LC1)/cadeia pesada (HC1) compreendendo: (1) uma primeira região VL (VL1) pareada com primeira região VH (VH1) para formar um primeiro sítio de ligação ao antígeno; (2) uma primeira região de cadeia pesada constante 1

(CH1-1) operativamente ligada a VH1 e uma primeira região de cadeia leve constante (CL1) operativamente ligada a VL1, e b) um segundo par de cadeia leve (LC2)/cadeia pesada (HC2) compreendendo: (3) uma segunda região VL (VL2) pareada com uma se- gunda região VH (VH2) para formar um segundo sítio de ligação ao antí- geno; e (4) uma segunda região de cadeia pesada constante 1 (CH1-2) operativamente ligada a VH2 e uma segunda região de cadeia leve constante (CL2) operativamente ligada a VL2, em que o terminal C de CH1-1 é operativamente ligado ao terminal N de VH2, em que um ou mais resíduos de cisteína são modificados em um ou ambos de pares VH1/VL1 e VH2/VL2 para formar uma ou mais ligações de dissulfeto, em que um ou ambos do par VL1 e VH1 e o par VL2 e VH2 compreendem mutações carregadas opostas que facilitam o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat seleciona- da de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL, em que um ou ambos do par CL1 e CH1-1 e o par CL2 e CH1- 2 compreendem mutações que facilitam o pareamento, e em que quando ambos de par CL1 e CH1-1 e de par CL2 e CH1-2 compreendem mutações para facilitar o pareamento, as mutações em CH1-1 e CL1 são diferentes do que as mutações em CH1-2 e CL2.

8. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato de CH1 compreender uma mutação de T192E e CL compreender mutações de N137K e S114A.

9. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, caracterizada pelo fato de CH1 compreender mutações de L143Q e S188V e CL compreender mu- tações de V133T e S176V.

10. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizada pelo fato de CH1 compreender mutações de T192E, L143Q e S188V e CL compreen- der mutações de N137K, S114A, V133T e S176V.

11. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 10, caracterizada pelo fato de CH1 compreender uma mutação K221E e CL compreender uma mutação de E123K.

12. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizada pelo fato de CH1 compreender uma mutação de K228D e CL compreender uma mu- tação de D122K.

13. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 12, caracterizada pelo fato de CH1 compreender mutações de K221E e K228D e CL compreender mu- tações de D122K e E123K.

14. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 13, caracterizada pelo fato de CH1 compreender uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H, e CL compreender uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H.

15. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 14, caracterizada pelo fato de CH1 compreender uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H, e CL compreender uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R ou V133H.

16. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 15, caracterizada pelo fato de VH compreender uma mutação de Q39E, Q39D, Q39K, Q39R ou Q39H e VL compreender uma mutação de Q38E, QO38D, Q38K, Q38R ou Q38H.

17. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 16, caracterizada pelo fato de pelo menos um par CH1/CL compreender mutações de CH1/CL para facilitar o pareamento selecionado do grupo consistindo em um ou mais de: (1) uma mutação de T192E (CH1) e mutações de N137K e S114A (CL), (2) mutações de L143Q e S188V (CH1), e mutações de V133T e S176V (CL), (3) mutações de T192E, L143Q e S188V (CH1) e muta- ções de N137K, S114A, V133T e S176V (CL), (4) uma mutação de K221E (CH1) e uma mutação de E123K (CL), (5) mutações de T192E e K221E (CH1) e mutações de N137K, S114A e E123K (CL), (6) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H (CH1) e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R, ou S176H (CL),

(7) uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R, ou L124H (CH1) e uma mutação de V133E, V133D, V133K, V133R, ou V133H (CL), (8) uma mutação de K228D (CH1) e uma mutação de D122K (CL), e (9) mutações de K221E e K228D (CH1) e mutações de D122K e E123K (CL), em que quando pelo menos dois pares CH1/CL compreendem uma mutação definida para facilitar o pareamento para dois diferentes pares VH/VL, em seguida pelo menos dois pares CH1/CL não compreen- dem as mesmas mutações, e em que pelo menos um par VH/VL compreende mutações car- regadas opostas para facilitar o pareamento, referidas mutações carrega- das opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na po- sição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL.

18. Proteína de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de compreender: um domínio de ligação ao antígeno; e uma região CH1 de cadeia pesada constante pareada com uma região CL de cadeia leve constante, em que o domínio de ligação ao antígeno seletivamente se |i- ga a um antígeno alvo, e em que uma região CH1 e região CL compre- endem um ou ambos de: a) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R, ou L143H na região CH1 e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou

S176H na região CL; e b) uma mutação de L124E, L124D, L124K, L124R ou L124H na região CH1 e uma mutação de V133E, V133D, V133K, V1I33R ou V133H na região CL, em que o resíduo mutado na região CH1 tem uma carga opos- ta do resíduo mutado na região CL.

19. Proteína de ligação ao antígeno de acordo com a reivindi- cação 18, caracterizada pelo fato de ainda compreender mutações de CH1/CL para facilitar o pareamento selecionado do grupo consistindo em um ou mais de: (1) uma mutação de T192E (CH1) e mutações de N137K e S114A (CL), (2) mutações de L143Q e S188V (CH1), e mutações de V133T e S176V (CL), (3) mutações de T192E, L143Q e S188V (CH1) e muta- ções de N137K, S114A, V133T e S176V (CL), (4) uma mutação de K221E (CH1) e uma mutação de E123K (CL), (5) uma mutação de K228D (CH1) e uma mutação de D122K (CL), e (6) mutações de K221E e K228D (CH1) e mutações de D122K e E123K (CL), em que quando dois pares CH1/CL compreendem mutações para facilitar o pareamento para dois diferentes pares VH/VL, os dois pa- res CH1/CL não compreendem as mesmas mutações.

20. Proteína de ligação ao antígeno de acordo com a reivindi- cação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de ainda compreender pelo me- nos um par VH/VL compreendendo mutações carregadas opostas para facilitar o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compre- endendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat sele- cionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL.

21. Proteína de ligação ao antígeno, caracterizada pelo fato de compreender: um domínio de ligação ao antígeno; e uma região CH1 de cadeia pesada constante pareada com uma região CL de cadeia leve constante, em que o domínio de ligação ao antígeno seletivamente se |i- ga a um antígeno alvo, e em que uma região CH1 e região CL compre- endem um ou ambos de: a) uma mutação de L143E, L143D, L143K, L143R ou L143H na região CH1 e uma mutação de S176E, S176D, S176K, S176R ou S176H na região CL; e b) uma mutação de K221E e K228D na região CH1 e uma mu- tação de D122K e E123K na região CL, em que o resíduo mutado na região CH1 tem uma carga opos- ta do resíduo mutado na região CL.

22. Proteína de ligação ao antígeno de acordo com a reivindi- cação 21, caracterizada pelo fato de ainda compreender pelo menos um par VH/VL compreendendo mutações carregadas opostas para facilitar o pareamento, referidas mutações carregadas opostas compreendendo (1) um resíduo mutado na região VH na posição 39 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e (2) um resíduo mutado na região VL na posição 38 Kabat selecionada de E, D, K, R, ou H, e em que o resíduo mutado na região

VH tem uma carga oposta do resíduo mutado na região VL.

23. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de ainda compreender um ou mais resíduos de cisteína modificados em um ou diversos pares VH/VL para formar uma ou mais ligações de dissulfeto.

24. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de uma ou ambas regi- ões VH compreendem uma ou ambas de mutações de 44C e 105C, e uma ou ambas regiões VL compreendem uma ou ambas de mutações de 100C e 43C.

25. Kit, caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo uma ou mais se- quências de nucleotídeo codificando a proteína de ligação ao antígeno multiespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

24.

26. Kit, caracterizado pelo fato de compreender um ou mais vetores de expressão compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico como definidas na reivindicação 25.

27. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de com- preender uma ou mais moléculas de ácido nucleico como definidas na reivindicação 25 ou um ou mais vetores de expressão como definidos na reivindicação 26.

28. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um transportador farmaceuticamente aceitável e a proteína de ligação ao antígeno multiespecífica como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

29. Método de tratar um distúrbio, caracterizado pelo fato de a atividade de antígeno ser prejudicial, o método compreendendo adminis- trar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno multiespecífica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

30. Proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou proteí- na de ligação ao antígeno de de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 24, caracterizadas pelo fato de compreenderem três HCDRs para cada região VH e três LCDRs para cada região VL, e ainda compre- endendo especificidade de ligação a um ou mais antígenos alvo ou um ou mais epítopos alvo.