ES2826566T3

ES2826566T3 - Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas

Info

Publication number: ES2826566T3
Application number: ES15804282T
Authority: ES
Inventors: Nils Lonberg; Alan J Korman; Mark J Selby; Bryan C Barnhart; Aaron P Yamniuk; Mohan Srinivasan; Karla A Henning; Michelle Minhua Han; Ming Lei; Liang Schweizer; Sandra V Hatcher; Arvind Rajpal
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2035-11-19
Also published as: WO2016081746A3; EA038349B1; CN107250157A; CA2968382A1; CY1123534T1; EP3221346B1; DK3221346T3; HRP20201756T8; LT3221346T; SI3221346T1; JP2020100645A; PT3221346T; EP3221346A2; US20180333502A1; MX2017006323A; EA201791127A1; PL3221346T3; CN113929770A; EP3789399A1; HRP20201756T1

Abstract

Un anticuerpo que comprende una region constante de cadena pesada modificada, en donde la region constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 en orden desde el extremo N al C, en donde: (a) la bisagra comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 21; (b) el dominio CH1 comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 7; (c) el dominio CH2 comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 4 o la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 24; y (d) el dominio CH3 comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 5 o del SEQ ID NO: 5 con las sustituciones de aminoacidos E356D y M358L; o en donde la region constante de cadena pesada que comprende el dominio CH1, la bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 como se ha definido en (a), (b), (c) y (d) carece del GK o K C-terminal.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas

Referencia a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 62/083.021, presentada el 21 de noviembre de 2014.

Antecedentes de la Invención

La terapéutica de anticuerpos es una de las áreas de crecimiento más rápido en el tratamiento de enfermedades, tales como cáncer y trastornos inmunes. Sin embargo, que un anticuerpo terapéutico sea dirigido eficazmente a un antígeno sigue siendo un reto importante en el cuidado de la salud. Por lo tanto, la ingeniería de anticuerpos se ha convertido en un foco importante en el mundo farmacéutico. A partir de este enfoque, han surgido una gran cantidad de nuevos anticuerpos modificados por ingeniería genética, tales como fragmentos de anticuerpos, conjugados de fármacos y anticuerpos (ADC, por sus siglas en inglés), anticuerpos con regiones efectoras modificadas y anticuerpos biespecíficos.

Los anticuerpos facilitan sus propiedades terapéuticas a través de muchos mecanismos diferentes. Los anticuerpos pueden inhibir o activar directamente un antígeno objetivo, regulando así la señalización celular. Los anticuerpos pueden inhibir la unión de un ligando a un receptor. Los anticuerpos también pueden inducir o inhibir una respuesta inmune, por ejemplo, potenciando el sistema inmune del sujeto para combatir la infección o el cáncer (por ejemplo, como co-estimuladores en la activación de células T).

Además, la internalización mediada por anticuerpos de un receptor/antígeno de superficie celular se reconoce como un mecanismo principal de acción para anticuerpos terapéuticos. En este caso, un anticuerpo elimina el objetivo de la superficie de la célula y evita que realice su función induciendo la internalización en la célula. De hecho, uno de los precursores de los anticuerpos terapéuticos es el trastuzumab para el tratamiento del cáncer de mama. Trastuzumab se dirige al receptor ErbB2 e induce la internalización del receptor/anticuerpo, inhibiendo así la señalización del EGFR. Sin embargo, los anticuerpos no siempre muestran cualidades eficaces de internalización, por lo que existe una necesidad continua de anticuerpos con funciones de internalización mejoradas. Por consiguiente, son altamente deseables métodos para mejorar la internalización de anticuerpos terapéuticos conocidos. El documento WO 2005/007809 describe anticuerpos y proteínas de fusión que incluyen regiones constantes obtenidas por ingeniería genética. El documento EP 2784091 describe un anticuerpo específico anti-c-Met/anti-Her2 y un método para prevenir y/o tratar el cáncer usando el mismo. El documento WO 2009/036209 describe métodos para eliminar la heterogeneidad de disulfuro en la región bisagra de proteínas de anticuerpos IgG2 recombinantes. El documento WO 2015/145360 describe anticuerpos modificados que contienen dominios de IgG2 modificados que inducen propiedades agonistas o antagonistas y uso de los mismos. El documento WO 2015/187835 describe anticuerpos contra el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides y usos de los mismos. El documento EP2206775 describe mutaciones de aminoácidos específicos en la región variable, región marco conservada y región constante de TOCILIZUMAB para reducir el riesgo de inmunogenicidad y la heterogeneidad originada de enlaces disulfuro en la región bisagra, así como mejorar la actividad de unión a antígeno, farmacocinética, estabilidad en condiciones ácidas y estabilidad en preparaciones de alta concentración.

Sumario

En un primer aspecto, la invención se refiere a anticuerpos que comprende una región constante de cadena pesada modificada, en donde la región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 en el orden del extremo N a C, en donde:

(a) la bisagra comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 21;

(b) el dominio CH1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 o la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24;

(c) el dominio CH2 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 o la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 24; y

(d) el dominio CH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 5 con las sustituciones de aminoácidos E356D y M358L;

o en donde la región constante de cadena pesada modificada que comprende el dominio CH1, la bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 como se definen en (a), (b), (c) y (d) carece de la GK o K C-terminal.

En una primera realización del primer aspecto, la invención se refiere a los anticuerpos de la invención, en donde los anticuerpos comprenden una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de los SEQ ID NO: 34, 35, 37, 81 y 84.

En una segunda realización del primer aspecto, la invención se refiere a los anticuerpos de la invención, que (i) se unen específicamente a un receptor coestimulante; (ii) se unen específicamente a una molécula de superficie celular y desencadenan internalización mediada por anticuerpo de la molécula de superficie celular; (iii) se unen específicamente a un receptor inhibidor; (iv) se unen específicamente a una molécula de superficie celular y desencadenan señalización intracelular; (v) se unen específicamente a una molécula de superficie celular y desencadenan la formación de complejos de molécula de superficie celular-anticuerpo de alto peso molecular; o (vi) se unen específicamente a una molécula de superficie celular y desencadenan el agrupamiento o la oligomerización de la molécula de superficie celular.

En una tercera realización del primer aspecto, la invención se refiere a los anticuerpos de la invención, en donde el receptor co-estimulador es GITR, OX40, 4-1BB, CD28, ICOS, CD40L, CD27 o cualquier otro miembro de la superfamilia de TNFR; la molécula de superficie celular es CD73; el receptor inhibidor es CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina 1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4; o la señalización intracelular media en la actividad agonista, actividad antagonista, internalización de la molécula de superficie celular o ADCC.

En una cuarta realización del primer aspecto, la invención se refiere a los anticuerpos de la invención, en donde los anticuerpos presentan actividad agonista mejorada o alterada en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprenden una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo posee propiedades de internalización mejoradas o alteradas en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo presenta actividad antagonista más potente o alterada o introduce una nueva actividad en relación con el mismo anticuerpo que tiene una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo desencadena señalización intracelular más potente en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo desencadena la formación de complejos de mayor peso molecular en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1; o el anticuerpo desencadena más agrupamiento u oligomerización de la molécula de superficie celular en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a moléculas biespecíficas que comprenden los anticuerpos de la invención, ligados a una molécula que tiene una segunda especificidad de unión.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden los anticuerpos de la invención, ligados a un segundo agente.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a composiciones que comprenden los anticuerpos, biespecíficos o inmunoconjugados de la invención, un vehículo y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales.

La invención proporciona regiones constantes de cadena pesada (denominadas “regiones constantes de cadena pesada modificada") o fragmentos funcionalmente equivalentes de las mismas, que potencian propiedades biológicas de anticuerpos en relación con los mismos anticuerpos de forma sin modificar. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden dichas regiones constantes modificadas presentan mayor internalización y/o actividad agonista o antagonista. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención son versiones optimizadas del anticuerpo original sin modificar. Específicamente, la región constante de cadena pesada modificada incluye una bisagra y tres dominios constantes de IgG2 (es decir, dominios CH1, CH2 y CH3), en donde uno o más de los dominios de región constante son un isotipo humano distinto de IgG2 (p. ej., IgG1, IgG3 o IgG4) o fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos. La región constante modificada puede incluir la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje correspondiente, o una variante de la misma, p. ej., una o más (p. ej., entre 1 y 10, o más) sustituciones o supresiones de aminoácidos dentro de la bisagra o los dominios CH1, CH2, CH3 en relación con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. En consecuencia, la secuencia de aminoácidos de la bisagra y/o cada dominio constante es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más (es decir, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje correspondiente.

La presente divulgación también describe las siguientes realizaciones. En una modalidad, la región constante de cadena pesada modificada incluye una bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje. La bisagra puede contener además modificaciones adicionales, por ejemplo, para reducir la formación de enlaces disulfuro. En una modalidad, la bisagra incluye la sustitución de aminoácidos C219S, con respecto a la bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje. En ciertas modalidades, la bisagra comprende la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 y 134-147 o una de estas secuencias que comprende 1-3 aminoácidos insertados entre CVE y CPP.

En ciertas modalidades, la región constante de cadena pesada modificada incluye un dominio CH1 de IgG2, por ejemplo, un dominio CH1 de IgG2 humana de tipo salvaje, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio CH1 de IgG2 humana de tipo salvaje (SEq ID NO: 7).

En ciertas modalidades, la región constante de cadena pesada modificada incluye un dominio CH2 de IgG 1, por ejemplo, un dominio CH2 de IgG 1 humana de tipo salvaje, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio CH2 de IgG1 humana de tipo salvaje. El dominio CH2 puede contener modificaciones adicionales (por ejemplo, para reducir o eliminar las funciones efectoras). En ciertas modalidades, el dominio CH2 comprende las sustituciones de aminoácido A330S y P331S, con respecto a IgG1 CH2 humana de longitud completa de tipo salvaje. En ciertas modalidades, el dominio CH2 comprende SEQ ID NO: 24.

En ciertas modalidades, la región constante de cadena pesada modificada incluye un dominio CH3 de IgG 1, por ejemplo, un dominio CH3 de IgG1 humana de tipo salvaje, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio CH3 de IgG1 humana de tipo salvaje. El dominio CH3 puede contener además modificaciones adicionales para conferir un alotipo particular. En una modalidad, el dominio CH3 contiene el residuo de aminoácido E en la posición 356 y el aminoácido M en la posición 358, con respecto a IgG 1 humana de longitud completa de tipo salvaje de un alotipo diferente. En ciertas modalidades, el dominio CH3 comprende SEQ ID NO: 5.

En una modalidad particular, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada en donde (a) el dominio CH1 es un dominio CH1 de IgG2 humana de tipo salvaje o un dominio CH1 de IgG1 de tipo salvaje, con o sin modificación adicional, (b) la bisagra es una bisagra IgG2 de tipo salvaje con o sin una sustitución C219S, (c) el dominio CH2 es un dominio CH2 de IgG1 humana de tipo salvaje o un dominio CH2 de IgG2 tipo salvaje, con o sin modificaciones adicionales, y (d) el dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG 1 humana de tipo salvaje o un dominio CH3 de IgG2 humana de tipo salvaje, con o sin el aminoácido E en la posición 356 y el aminoácido M en la posición 358. En una modalidad específica, la región constante de cadena pesada modificada comprende una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, por ejemplo, expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37 y 78-93.

Los anticuerpos de la invención (es decir, anticuerpos que tienen una región constante modificada) pueden ser anticuerpos totalmente humanos o anticuerpos humanizados, y además exhiben una o más características mejoradas o alteradas, en comparación con los mismos anticuerpos sin una región constante de cadena pesada modificada. Estas características pueden incluir una internalización aumentada o alterada por una célula, actividad agonística, formación de grandes complejos reticulados, ADCC, señalización mediada por receptores, actividad antagonista, actividad inmunomoduladora y actividad antitumoral; o introducción de una nueva propiedad, por ejemplo, actividad agonista.

También se proporcionan moléculas biespecíficas e inmunoconjugados que contienen regiones constantes modificadas de la invención, así como composiciones que contienen los anticuerpos, biespecíficos o inmunoconjugados y un vehículo farmacéutico aceptable. Tales composiciones también pueden incluir uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un agente que estimula el sistema inmune, tal como un inhibidor del punto de control, una molécula co-estimuladora, un anticuerpo anti-CD39 o un anticuerpo anti-A2AR.

También se desvelan métodos para preparar un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada. Ciertos métodos desvelados aquí incluyen métodos para aumentar la internalización de un anticuerpo por una célula, y métodos para aumentar la actividad agonista de un anticuerpo, en comparación con el mismo anticuerpo que comprende una bisagra de un isotipo no IgG2. Tales métodos comprenden las etapas de proporcionar un anticuerpo que tiene una bisagra que no es una bisagra de IgG2 y reemplazar la bisagra por una bisagra de IgG2 (tal como una bisagra que es una bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje, una bisagra que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje, o una bisagra que se modifica para reducir la formación de enlaces disulfuro, por ejemplo, una bisagra que comprende la sustitución de aminoácidos C219S). En una modalidad, la internalización del anticuerpo se incrementa o aumenta en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más, dando como resultado una reducción del T1/2 de al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más. En ciertas modalidades, la actividad agonista se incrementa o aumenta en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más según se define por una liberación aumentada de citocinas o una proliferación aumentada en células T efectoras; actividad reducida de la célula T reguladora si la interacción sobre Tregs reduce la función de Treg; o agotamiento aumentado de las Treg.

En ciertas modalidades, el método incluye además la etapa de reemplazar al menos uno de los dominios CH1, CH2 o CH3 con un dominio CH1, CH2 o CH3 de un isotipo diferente. Tales reemplazos incluyen, por ejemplo: (a) reemplazar el dominio CH1 con un dominio CH1 de IgG1 o un dominio CH1 de IgG2; (b) sustituir el dominio CH2 con un dominio CH2 de IgG 1 o un dominio CH2 de IgG2; y/o (b) reemplazar el dominio CH3 con un dominio CH3 de IgG1 o un dominio CH3 de IgG2, en donde el dominio de reemplazo tiene la secuencia de tipo salvaje o al menos 95 % de identidad de la secuencia de tipo salvaje. En ciertas modalidades, el dominio CH1 comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en el SEQ ID NO: 7. En ciertas modalidades, el dominio CH2 se modifica para reducir o eliminar funciones efectoras, por ejemplo, el dominio CH2 comprende las sustituciones de aminoácidos A330S y P331S (SEQ ID NO: 24). En ciertas modalidades, el dominio CH3 comprende el residuo de aminoácido E en la posición 356 y el aminoácido M en la posición 358 (SEQ ID NO: 5).

Los métodos desvelados aquí incluyen métodos para tratar a un sujeto mediante la administración de un anticuerpo, molécula biespecífica o inmunoconjugado que comprende una región constante de cadena pesada modificada. También se pueden coadministrar uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un agente terapéutico que estimula el sistema inmune, tal como un inhibidor de punto de control, una molécula co-estimuladora.

En la presente se desvelan anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 en orden desde el extremo N al C, y en donde (a) el dominio CH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que difiere de la misma en un máximo de 5 aminoácidos o que es al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 7, y en donde al menos uno de C131, R133, E137, S138 o R217 no se sustituyen o suprimen; (b) una bisagra que comprende una cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 o 134-147 o una secuencia que comprende 1-3 aminoácidos insertados entre CVE y CPP, o que difiere de la misma en como mucho 5 aminoácidos, en donde la bisagra no comprende una sustitución o supresión tanto en C219 como en C220; (c) el anticuerpo tiene al menos una propiedad mejorada o una nueva propiedad introducida relativa al mismo anticuerpo que comprende una bisagra de IgG1 y dominio CH1; y (d) la región constante de cadena pesada modificada no es una región constante de IgG2 tipo salvaje o una región constante de IgG2 que comprende C219S y/o C220S. La bisagra puede comprender la secuencia de aminoácidos ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 129) o ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID NO: 130), en donde X es cualquier aminoácido excepto cisteína. Por ejemplo, la bisagra puede comprender la secuencia de aminoácidos ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 131) o ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID NO: 132). En ciertas modalidades, al menos uno de, o todos los residuos de aminoácidos P233, V234, A235 y G237 se suprimen o se sustituyen con otro resto de aminoácido, por ejemplo, el aminoácido correspondiente en una bisagra de IgG1. En ciertas modalidades, ninguno de los residuos de aminoácidos R133, E137, S138 y R217 o ninguno de C131, R133, E137, S138 y R217 se sustituyen o suprimen. En ciertas modalidades, N192 y/o F193 están sustituidos con otro aminoácido. El anticuerpo puede comprender un dominio CH2 que sea al menos 95 % idéntico al de IgG1 de tipo salvaje. El anticuerpo puede comprender un dominio CH3 que sea al menos 95 % idéntico al de IgG1 tipo salvaje. En ciertas modalidades, el dominio CH2 y/o CH3 no es un dominio CH2 y/o CH3 de IgG1 tipo salvaje, y el anticuerpo tiene una función efectora que es más potente que la de IgG1 de tipo salvaje. En ciertas modalidades, el dominio CH2 y/o CH3 no es un dominio CH2 y/o CH3 de IgG1 tipo salvaje, y el anticuerpo tiene una función efectora que es menos potente que la de IgG1 tipo salvaje. En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende un dominio CH2 y/o un dominio CH1 que es al menos 95% idéntico al de IgG1 o IgG4 tipo salvaje. En ciertas modalidades, el anticuerpo tiene al menos una propiedad mejorada seleccionada de actividad agonista, internalización del receptor mediada por anticuerpos, A d CC, señalización mediada por el receptor, actividad antagonista, actividad inmunomoduladora o actividad antitumoral; o una propiedad recién introducida, que es actividad agonista.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada, en donde (a) el dominio CH1 es un dominio CH1 de IgG2 humana de tipo salvaje; (b) la bisagra comprende SEQ ID NO: cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 o 134-147 o una secuencia que comprende 1-3 aminoácidos insertados entre CVE y CPP; (c) el dominio CH2 es un dominio CH2 de IgG1 humana de tipo salvaje o un dominio CH2 modificado que confiere una función efectora potenciada o reducida al anticuerpo; y (d) el dominio CH3 es un dominio CH3 de IgG1 humana de tipo salvaje o un dominio CH3 modificado que confiere una función efectora mejorada o reducida al anticuerpo. Un dominio constante de cadena pesada modificado puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168, o una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 95 % a los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada, en donde la región constante de cadena pesada comprende un dominio CH1 y una bisagra que comprende la secuencia ASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFG TQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 133), o una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO: 133 en como máximo 10 aminoácidos o es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 133, en donde (i) al menos uno de C131, R133, E137, S138 y R217 no está sustituido con otro aminoácido o suprimido; (ii) C219 y C220 pueden estar sustituidos con otro aminoácido o suprimidos, pero C219 y C220 no pueden ser ambos sustituidos o suprimidos; (iii) se pueden insertar 1-3 aminoácidos entre CVE y CPP en la bisagra; (iv) la bisagra comprende opcionalmente un aminoácido adicional en el extremo C, por ejemplo, G; (v) uno o más de los aminoácidos P233, V234, A235 y G237 pueden estar sustituidos con otro aminoácido (por ejemplo, el correspondiente aminoácido de IgG1) o suprimidos; (vi) los dominios CH2 y CH3 pueden ser dominios c H2 y CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo salvaje o modificados; (vii) la región constante de cadena pesada modificada no es una región constante de cadena pesada de IgG2 de tipo salvaje o un dominio constante pesado de IgG2 de tipo salvaje con C219S o C220S; y (viii) el anticuerpo tiene al menos una propiedad mejorada o una nueva propiedad introducida relativa al mismo anticuerpo que comprende una bisagra de IgG1 y dominio CH1. En ciertas modalidades, el anticuerpo tiene al menos una propiedad mejorada seleccionada de actividad agonista, internalización de receptor mediada por anticuerpos, ADCC, señalización mediada por receptor, actividad antagonista, actividad inmunomoduladora o actividad antitumoral; o una propiedad recién introducida, que es actividad agonista. En ciertas modalidades, ninguno de los aminoácidos C131; R133; E137; S138; R217 se sustituyen con otro aminoácido o se suprimen. En ciertas modalidades, N192 y/o F193 no están sustituidos o son N192S y/o F193L, respectivamente. En ciertas modalidades, C219 es C219S, C220 es C220S, P233-G237 se sustituyen o suprimen; V234-G237 se sustituyen o suprimen; A235-G237 se sustituyen o se suprimen; G237 se sustituye o suprime; P233 se sustituye o suprime; P233-V234 se sustituyen o suprimen; o P233 A235 se sustituyen o suprimen. El anticuerpo puede tener una función efectora, o estar privado de la función efectora. El anticuerpo puede comprender un dominio CH2 de IgG1 tipo salvaje o modificado y/o un dominio CH3 de IgG1 modificado o de tipo salvaje.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada, en donde la región constante de cadena pesada comprende un dominio CH1 que comprende la secuencia ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE (SEQ ID NO: 7) o una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO: 7 en al menos 10 aminoácidos o es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 7, en donde (i) al menos uno de C131, R133, E137, S138 y R217 no está sustituido o suprimido; (ii) la región constante de cadena pesada modificada no es una región constante de cadena pesada de IgG2 de tipo salvaje o un dominio constante pesado de IgG2 de tipo salvaje con C219S o C220S; y (iii) el anticuerpo tiene al menos una propiedad mejorada o una nueva propiedad introducida relativa al mismo anticuerpo que comprende una bisagra de IgG1 y dominio CH1. El anticuerpo puede tener al menos una propiedad mejorada seleccionada de la actividad agonista, la internalización del receptor mediada por anticuerpos, la ADCC, la señalización mediada por el receptor, la actividad antagonista, la actividad inmunomoduladora o la actividad antitumoral; o una propiedad recién introducida, que es actividad agonista. En ciertas modalidades, ninguno de los aminoácidos C131; R133; E137 y S138 se sustituyen con otro aminoácido o se suprimen. En ciertas modalidades, N192 y/o F193 no están sustituidos o son N192S y/o F193L, respectivamente. El anticuerpo puede tener una función efectora, o estar privado de la función efectora. El anticuerpo puede comprender un dominio CH2 de IgG1 tipo salvaje o modificado y/o un dominio CH3 de IgG1 modificado o tipo salvaje.

Un anticuerpo puede comprender una región constante de cadena pesada modificada, en donde la región constante de cadena pesada comprende una bisagra que comprende la secuencia ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 8), o una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO: 8 como mucho en 5 aminoácidos, en donde (i) C219 y C220 pueden ser sustituidos con otro aminoácido o eliminados, pero C219 y C220 no pueden estar ambos sustituidos o suprimidos; (ii) uno o más de los aminoácidos P233, V234, A235 y G237 pueden estar sustituidos o eliminados; (iii) se pueden insertar 1-3 aminoácidos entre CVE y CPP en la bisagra; (iv) la bisagra comprende opcionalmente un aminoácido adicional en el extremo C, por ejemplo, G; (v) los dominios CH2 y CH3 pueden ser dominios CH2 y CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo salvaje o modificados; (vi) la región constante de cadena pesada modificada no es una región constante de cadena pesada de IgG2 tipo salvaje o un dominio constante pesado de IgG2 tipo salvaje con C219S o C220S; y (vii) el anticuerpo tiene al menos una propiedad mejorada o una nueva propiedad introducida relativa al mismo anticuerpo que comprende una bisagra de IgG1 y dominio CH1. El anticuerpo puede tener al menos una propiedad mejorada seleccionada de la actividad agonista, la internalización del receptor mediada por anticuerpos, la ADCC, la señalización mediada por el receptor, la actividad antagonista, la actividad inmunomoduladora o la actividad antitumoral; o una propiedad recién introducida, que es actividad agonista. En ciertas modalidades, C219 es C219S, C220 es C220S, P233-G237 se sustituyen o se suprimen; V234-G237 se sustituyen o suprimen; A235-G237 se sustituyen o se suprimen; G237 se sustituye o suprime; P233 se sustituye o suprime; P233-V234 se sustituyen o suprimen; o P233-A235 se sustituyen o suprimen. El anticuerpo puede tener una función efectora, o estar privado de la función efectora. El anticuerpo puede comprender un dominio CH2 de IgG1 de tipo salvaje o modificado y/o un dominio CH3 de IgG1 modificado o de tipo salvaje.

También se desvelan anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada modificada, en donde la región constante de cadena pesada comprende una bisagra IgG1 o IgG2 y en donde la bisagra carece de 1-7 aminoácidos y en donde el anticuerpo tiene al menos una propiedad mejorada o una nueva propiedad introducida en relación con el mismo anticuerpo que comprende una bisagra de IgG1 y dominio CH1. El anticuerpo puede tener al menos una propiedad mejorada seleccionada de la actividad agonista, la internalización del receptor mediada por anticuerpos, la ADCC, la señalización mediada por el receptor, la actividad antagonista, la actividad inmunomoduladora o la actividad antitumoral; o una propiedad recién introducida, que es actividad agonista. La bisagra puede ser una bisagra de IgG2 que carezca de 1-4 aminoácidos, por ejemplo, los aminoácidos C219, C220, V222 y E224. La bisagra es una bisagra IgG1 que carece de los aminoácidos S219, C220, D221, K222, T223, H224 y T225. El anticuerpo puede comprender un dominio CH1 de IgG2 que sea de tipo salvaje o modificado; un dominio CH1 de IgG1 que sea de tipo salvaje o modificado, y un dominio CH2 de IgG1, IgG2 o IgG4 y un dominio CH3 de IgG1, IgG2 o IgG4.

Los anticuerpos con regiones constantes de cadena pesada modificadas pueden ser anticuerpos humanos o humanizados, o porciones de unión a antígeno de los mismos. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une específicamente a un antígeno que está implicado en la regulación inmune. El anticuerpo puede ser un agonista de un receptor co-estimulador o un antagonista de un receptor inhibidor. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un receptor co-estimulador, por ejemplo, seleccionado del grupo de B7-1, B7-2, Cd 28, 4-1BB, GITR, OX40, ICOS, CD70, CD27, CD40, DR3 o CD28H, o el anticuerpo puede unirse a un receptor inhibidor, por ejemplo, seleccionado del grupo de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4. El antígeno puede ser un antígeno que se requiere internalizar, por ejemplo, CD73. El antígeno puede ser CD39.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada se une específicamente a un receptor co-estimulador, por ejemplo, GITR, OX40, 4-1 BB, CD28, ICOS, CD40, CD27 o cualquier otro miembro de superfamilia de TNFR, y comprende una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168. En ciertas modalidades, el anticuerpo presenta actividad agonista mejorada o alterada con respecto a un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y la cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada se une específicamente a una molécula de superficie celular, por ejemplo, CD73, y desencadena la internalización mediada por anticuerpo de la molécula de superficie celular y comprende una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de las SEQ NO ID: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168. En ciertas modalidades, el anticuerpo posee propiedades de internalización mejoradas o alteradas con respecto a un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y la cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada se une específicamente a un receptor inhibidor, por ejemplo, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina 1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4, y comprende una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168. En ciertas modalidades, el anticuerpo exhibe una actividad antagonista más potente o alterada o introduce una nueva actividad relativa al mismo anticuerpo que tiene una región constante de cadena pesada de IgG1.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada se une específicamente a una molécula de superficie celular y desencadena señalización intracelular, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de los SEQ ID NO: 26-37, 54 56, 78-125 y 152-168. En ciertas modalidades, la señalización intracelular media en la actividad agonista, la actividad antagonista, la internalización de la molécula de la superficie celular o ADCC. En ciertas modalidades, el anticuerpo desencadena señalización intracelular más potente con relación a un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y la cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada se une específicamente a una molécula de superficie celular y activa la formación de complejos de moléculas de superficie de celular-anticuerpo de alto peso molecular, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de las SEQ NO ID: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168. En ciertas modalidades, el anticuerpo desencadena la formación de complejos de mayor peso molecular con relación a un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y la cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada se une específicamente a una molécula de superficie celular y desencadena la agrupación u oligomerización de la molécula de superficie celular, donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168. En ciertas modalidades, el anticuerpo desencadena más agrupamiento u oligomerización de la molécula de superficie celular con respecto a un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y la cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.

También se proporciona aquí una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada unida a una molécula que tiene una segunda especificidad de unión. También se proporcionan en la presente invención inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada, unida a un segundo agente. También se proporciona una composición que comprende un anticuerpo, biespecífico o inmunoconjugado descrito en la presente y un vehículo. Las composiciones pueden comprender uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un agente terapéutico que estimule el sistema inmune y, por ejemplo, sea un antagonista de un inhibidor de punto de control o un receptor co-estimulador.

También se proporcionan en la presente métodos para preparar un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada, en donde el anticuerpo comprende un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 en orden desde el extremo N hasta el C, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un anticuerpo que comprende una bisagra y/o un dominio CH1 que no es una bisagra IgG2 y/o dominio CH1 de IgG2; y (b) reemplazar la bisagra y/o el dominio CH1 con una bisagra IgG2 y/o un dominio CH1 de IgG2, respectivamente. También se proporcionan en la presente métodos para aumentar la internalización de un anticuerpo por una célula, que comprenden: (a) proporcionar un anticuerpo que comprenda una bisagra y/o un dominio CH1 que no sea un dominio bisagra IgG2 y/o CH1 de IgG2; y (b) reemplazar la bisagra y/o el dominio CH1 con una bisagra IgG2 y/o un dominio CH1 de IgG2, respectivamente. La internalización del anticuerpo puede aumentarse en comparación con la internalización del mismo anticuerpo que comprende una bisagra de un isotipo no IgG2, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región constante de IgG1. También se desvelan métodos para aumentar la actividad agonista de un anticuerpo, que comprenden: (a) proporcionar un anticuerpo que comprenda una bisagra y/o un dominio CH1 que no sea una bisagra de IgG2 y/o un dominio CH1 de IgG2; y (b) reemplazar la bisagra y/o el dominio CH1 con una bisagra IgG2 y/o un dominio CH1 de IgG2, respectivamente. La actividad agonista puede aumentarse en comparación con la actividad agonista del mismo anticuerpo que comprende una bisagra de un isotipo no IgG2, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región constante de IgG1. Una bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje y puede comprender, por ejemplo, una secuencia expuesta en la Tabla 4. Un método puede comprender la etapa de sustituir al menos uno de los dominios CH1, CH2 o CH3 con un dominio CH1, CH2 o CH3 de un isotipo diferente, respectivamente. Un método puede comprender las etapas de (a) sustituir el dominio CH1 por un dominio CH1 de IgG2; (b) sustituir el dominio CH2 por un dominio CH2 de IgG1; y/o (b) reemplazar el dominio CH3 con un dominio CH3 de IgG1. Un método puede comprender las etapas de (a) sustituir el dominio CH1 por un dominio CH1 de IgG2 humana de tipo salvaje, o un dominio al menos 95 % idéntico al mismo; (b) sustituir el dominio CH2 por un dominio CH2 de IgG1 humana de tipo salvaje, o un dominio al menos 95 % idéntico al mismo; y/o (b) sustituir el dominio CH3 por un dominio CH3 de IgG 1 humana de tipo salvaje, o un dominio al menos 95% idéntico al mismo. Un método puede comprender la etapa de reemplazar la región constante de cadena pesada con una región constante de cadena pesada modificada que comprende una cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168 o una región al menos 95 % idéntica a los Se Q ID NO: 26-37, 54 56, 78-125 y 152-168. La bisagra puede modificarse para reducir o alterar la formación de enlaces disulfuro. La bisagra puede comprender la sustitución de aminoácidos C219S. La bisagra puede comprender una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21-23, 126-132 o 134-147 o una secuencia que comprende 1-3 aminoácidos insertados entre CVE y CPP. El dominio CH1 puede comprender la secuencia de aminoácidos

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 7). El dominio CH2 puede modificarse para reducir o eliminar las funciones efectoras. El dominio CH2 puede comprender sustituciones de aminoácidos A330S y P331S. El dominio CH2 puede comprender la secuencia de aminoácidos PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 4). El dominio CH2 puede comprender sustituciones de aminoácidos A330S y P331S. El dominio CH3 puede comprender la secuencia de aminoácidos GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5).

T ambién se desvelan anticuerpos, o porción de unión a antígeno de los mismos, producidos por los métodos descritos en la presente, por ejemplo, expuestos anteriormente, por ejemplo, anticuerpos humanos o humanizados. También se incluyen en la presente métodos de tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer, con cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. Los métodos pueden comprender administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, agentes terapéuticos que estimulan el sistema inmune. Por ejemplo, un agente terapéutico puede dirigirse a un inhibidor de punto de control o a una molécula co-estimuladora. Los métodos pueden incluir administrar una composición, molécula biespecífica o inmunoconjugado descritos en la presente.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A muestra la cinética de internalización mediada por anticuerpo de CD73 en células H2228 (línea celular de carcinoma de pulmón no microcítico) por los siguientes anticuerpos: anticuerpos 11F11, 4C3, 6D11, CD73.3-IgG1.1f con la cadena ligera 4C3Vk1 (“3-VH-hHC-IgG1.1f/4C3Vk1), CD73.4-IgG2CS con la cadena ligera Vk2 11F11 ("4-Vh-hHC-IgG2-C219S/11F11-Vk2"), CD73.10-IgG2CS (“CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S”), CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f) (“CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S-IgG1.1f”) y CD73.10-IgG1.1f (“CD73.10-Vh-hHC-IgG1.1f”) en células H2228. Los anticuerpos 11F11 (que es de un isotipo IgG2), CD73.4-IgG2CS, CD73.10-IgG2CS y CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f se internalizan más rápido y en mayor grado que los otros anticuerpos probados, que son de un isotipo IgG 1.

La figura 1B muestra la cinética de la internalización de CD73 mediada por anticuerpos de los mismos anticuerpos que los mostrados en la figura 1A en células HCC15 (línea celular de carcinoma de pulmón no microcítico), mostrando resultados similares a los obtenidos en células H2228.

La figura 1C muestra la cinética de la internalización de CD73 mediada por anticuerpos de los mismos anticuerpos que los mostrados en las figuras 1A y 1B, así como CD73.11-IgG2CS ("11-Vh-hVC-IgG2-C219S"), en células Calu6, mostrando resultados similares a los obtenidos en células H2228 y HCC15.

La figura 1D muestra la cinética de la internalización de CD73 mediada por anticuerpos de los mismos anticuerpos que los mostrados en la figura 1C en células NCI-2030 (línea celular de carcinoma de pulmón no microcítico), mostrando resultados similares a los obtenidos en células H2228, HCC15 y Calu6.

La figura 1E muestra la cinética de la intenalización de CD73 mediada por anticuerpos de los anticuerpos indicados en células Calu6, medida por citometría de flujo.

La figura 1F muestra la cinética de la internalización de CD73 mediada por anticuerpos de los anticuerpos indicados en células NCI-H292 (línea celular de carcinoma pulmonar mucoepidermoide), medida por citometría de flujo, pero donde los anticuerpos no se lavaron después de la primera incubación de las células con los anticuerpos.

La figura 1G muestra el porcentaje de CD73 internalizado en células Calu6 tratadas con los anticuerpos indicados, mostrando la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células Calu6 con el tiempo.

La figura 1H muestra el porcentaje de CD73 internalizado en células NCI-H292 tratadas con los anticuerpos indicados a lo largo del tiempo, mostrando la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células NCI-H292 con el tiempo.

La figura 11 muestra el porcentaje de CD73 internalizado en células SNU-C1 (línea celular de carcinoma de colon) tratadas con los anticuerpos indicados con el tiempo, mostrando la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células SNU-C1 con el tiempo.

La figura 1J muestra el porcentaje de CD73 internalizado en células NCI-H1437 (línea celular de carcinoma de pulmón no microcítico) tratadas con los anticuerpos indicados con el tiempo, mostrando la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células NCI-H1437 con el tiempo.

La figura 2 muestra la cinética de unión de los anticuerpos anti-GITR humano indicados a células T CD4 humanos anti-CD3 (recubiertas en placa) y activados por CD28 y sus correspondientes valores de CE50 derivados de la gráfica.

Las figuras 3A-3C muestran la secreción de IFN-y e IL-2 a partir de células T CD4 donantes estimuladas con anticuerpos anti-GITR humano solubles con diferentes regiones constantes de cadena pesada. La figura 3A muestra la secreción de IFN-y a partir de células T CD4 donantes estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y diversas concentraciones de anticuerpos anti-GITR humano con una región constante de IgG2-IgG1. La figura 3b muestra la secreción de IL-2 a partir de células T CD4 donadoras estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y diversas concentraciones de un dominio constante de cadena pesada de IgG1 o un dominio constante de cadena pesada híbrido de IgG2-IgG1. La Figura 3C muestra la secreción de IL-2 a partir de células T CD4 donantes estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y diversas concentraciones de versiones sin efectores (IgG1.1) de los anticuerpos en las figuras 3A y B.

La figura 4 muestra la secreción de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR cultivadas en placas revestidas con anticuerpo monoclonal anti-CD3 en presencia de cantidades crecientes de los anticuerpos anti-GITR humanos indicados: el hibridoma anti-GITR (IgG2) y derivados recombinantes como IgG1f, IgG1.1 (sin efectores), o como quimera con la bisagra de IgG2.

Las figuras 5A-5D muestran el efecto de una bisagra de IgG2 sobre el tamaño de los complejos anticuerpo/antígeno. Las figuras 5A-5C muestran datos de cromatograma SEC, datos DLS y datos MALS, para complejos de hCD73-his con el anticuerpo CD73.4 que contienen diferentes regiones constantes. La figura 5D muestra un modelo esquemático de los complejos hCD73-his/mAb derivados de las masas determinadas por MALS en la figura 5C.

La figura 6 muestra datos de SEC-MALS para complejos de CD73/mAb.

La figura 7 muestra datos de DLS para complejos de CD73/mAb.

La figura 8A muestra el porcentaje de CD73 internalizado en células Calu6 tratadas con los anticuerpos indicados a lo largo del tiempo, mostrando la internalización de CD73 mediada por anticuerpos de los anticuerpos indicados en células Calu6 con el tiempo.

La figura 8B muestra el porcentaje de CD73 internalizado en células NCI-H292 tratadas con los anticuerpos indicados a lo largo del tiempo, mostrando la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células Calu6 con el tiempo.

La figura 8C muestra el nivel de CD73 en la superficie de células Calu6 tratadas con 5 |jg/ml de los anticuerpos indicados durante 0, 5, 15 o 30 minutos.

La figura 9 muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en presencia de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas.

La figura 10 muestra el porcentaje de internalización de CD73 mediada por anticuerpos a 1, 4 o 21 horas después de la adición de cada uno de los anticuerpos mostrados. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden de 21 horas (a la izquierda), 4 horas (media) y 1 hora (derecha).

La figura 11A muestra la superposición de datos de cromatograma SEC para complejos molares 1:1 de hCD73-his con 16 anticuerpos CD73.4 diferentes que contienen diferentes secuencias de regiones constantes.

La figura 11B muestra una expansión de los datos del cromatograma de 11-19,5 min del cromatograma de la figura 10A, con 4 especies de elución distintas indicadas.

La figura 11C muestra el porcentaje del área de señal del cromatograma UV para el pico 2 de la figura 11B, trazada para los 16 complejos de anticuerpo/CD73-his diferentes. Los datos se clasifican de izquierda a derecha en orden creciente de área de pico.

La figura 12 muestra la unión del anticuerpo a proteínas FcYR-his capturadas con Fab anti-his. Las respuestas de unión se representan gráficamente como un porcentaje del Rmáx teórico asumiendo una estequiometría de enlace mAb:FcYR 1:1. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en la parte inferior de la diapositiva.

La figura 13 muestra la unión del anticuerpo a proteínas FcgR-his capturadas con Fab anti-his. Las respuestas de unión se representan gráficamente como un porcentaje del Rmáx teórico asumiendo una estequiometría de enlace mAb:FcYR 1:1. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en la parte inferior de la diapositiva.

La figura 14A muestra la unión del anticuerpo a proteínas FcYR-his capturadas con Fab anti-His. Las respuestas de unión se representan gráficamente como un porcentaje del Rmáx teórico asumiendo una estequiometría de enlace mAb:FcYR 1:1. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en la parte inferior de la diapositiva.

La figura 14B muestra la unión de anticuerpo a proteínas FcYR-his capturadas con Fab anti-his. Las respuestas de unión se representan gráficamente como un porcentaje del Rmáx teórico asumiendo una estequiometría de enlace mAb:FcYR 1:1. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en la parte inferior de la diapositiva.

La figura 15 muestra un análisis del tiempo de internalización de anticuerpos anti-GITR.

La figura 16A muestra el análisis de co-localización de GITR y el marcador de endosoma temprano EEA2 en el tiempo cero.

La figura 16B muestra el análisis de co-localización de GITR y el marcador de endosoma temprano EEA2 a los tiempos 30 y 120 minutos.

La figura 16C muestra los resultados de la cuantificación de la co-localización endosómica mostrada en las figuras 16A y 16B trazada como la relación de la intensidad de los píxeles co-localizados en relación con la tinción total. La figura 17A muestra la activación de la señalización de NFkB en células T CD8+ tratadas con los anticuerpos anti-GITR indicados.

La figura 17B muestra la activación de la señalización de NFkB en células T CD4+ tratadas con los anticuerpos anti-GITR indicados.

La figura 18 muestra la activación de P38 en células T CD4+ tratadas con los anticuerpos anti-GITR indicados. La figura 19 muestra la configuración de los enlaces disulfuro en anticuerpos IgG2 que tienen conformación A, B o A/B.

La figura 20A muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en presencia de diferentes concentraciones de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas. La figura 20B muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en presencia de 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas (el mismo experimento que en la figura 20A).

La figura 20C muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en presencia de 1,25 jg/m l de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas (el mismo experimento que en la figura 20A).

La figura 20D muestra el nivel de IL-2 secretado por células T CD4+ co-cultivadas con células CHO-OKT3 en presencia de 0,313 jg/m l de un anticuerpo anti-GITR que tiene las regiones constantes indicadas (el mismo experimento que en la figura 20A).

Descripción detallada

La invención se basa, al menos en parte, en las conclusiones de que las siguientes propiedades de anticuerpos se potencian o alteran cuando los anticuerpos comprenden una bisagra de IgG2 con respecto a los mismos anticuerpos que comprenden una bisagra no-IgG2 (o con respecto a los mismos anticuerpos que comprenden una región constante de IgG1): (i) internalización; (ii) función agonista; (iii) señalización intracelular mediada por receptor; (iv) ADCC; y (v) peso de complejos anticuerpo/antígeno. Además, estas características mejoradas o alteradas de los anticuerpos se potencian o alteran adicionalmente cuando los anticuerpos comprenden, además de una bisagra de IgG2, un dominio CH1 de IgG2. También se ha observado que los anticuerpos que tienen un dominio CH1 de IgG2, pero no una bisagra de IgG2, tienen actividades mejoradas o alteradas en comparación con los mismos anticuerpos que tienen un dominio CH1 de IgG1. Sin querer limitarse a un mecanismo de acción particular, se ha encontrado que los efectos potenciadores de una bisagra de IgG2 se correlacionan con un aumento del tamaño de complejos de anticuerpo/antígeno. El tamaño mejorado de los complejos anticuerpo/antígeno cuando el anticuerpo tiene una bisagra de IgG2 puede resultar de una mayor rigidez de las bisagras IgG2 con relación a la de otros isotipos. Además, se ha demostrado que pueden modificarse regiones específicas o residuos de aminoácido de la bisagra de IgG2 y del dominio CH1, mientras que otros preferiblemente no se modifican, para preservar las actividades mejoradas o alteradas.

Como se describe adicionalmente en la presente, estas regiones constantes de cadena pesada modificadas que confieren a anticuerpos (o regiones de unión a antígeno de los mismos) actividades mejoradas o modificadas pueden tener una función efectora. Por lo tanto, se demostró que se pueden crear anticuerpos que tienen las propiedades ventajosas conferidas por una bisagra y/o dominio CH1 de IgG2 y también tienen función efectora.

La invención se basa también al menos en parte en el hallazgo de que la supresión de ciertas porciones de una bisagra en un anticuerpo IgG1 o IgG2 da como resultado que el anticuerpo tenga propiedades mejoradas o alteradas con relación al anticuerpo con una región constante de IgG1.

En consecuencia, se desvelan en la presente (i) anticuerpos que tienen regiones constantes de cadena pesada modificadas que confieren a las regiones de unión a antígeno de los anticuerpos propiedades mejoradas o alteradas y métodos para usarlos, y (ii) métodos para mejorar o alterar ciertas propiedades biológicas de anticuerpos que comprenden una bisagra no IgG2 y/o un dominio CH1, tal como internalización, agonismo y antagonismo, en donde el método comprende reemplazar la bisagra no IgG2 y/o el dominio CH1 del anticuerpo con una bisagra IgG2 y/o un dominio CH1 de IgG2 o porción de los mismos.

En la presente se proporcionan "regiones constantes de cadena pesada modificada" que mejoran ciertas propiedades biológicas de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos que tienen una bisagra no IgG2 y/o un dominio CH1 no de IgG2, con respecto a los mismos anticuerpos que tienen diferentes regiones constantes. Las regiones constantes de cadena pesada modificada a modo de ejemplo incluyen una bisagra de IgG2, un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3, en donde al menos uno de estos dominios constantes no es del isotipo IgG2 y puede ser, por ejemplo, de una IgG1, IgG3 o IgG4. En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra IgG2 y dominios CH2 y CH3 de IgG1. En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 de IgG2 y una bisagra de IgG2. En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 de IgG2, una bisagra de IgG2, un dominio CH2 de IgG1 y un dominio CH3 de IgG1. Una región constante de cadena pesada modificada puede tener una función efectora similar a la de la IgG1 de tipo salvaje, o puede ser modificada genéticamente para tener una función efectora reducida o mejorada con relación a la de la IgG de tipo salvaje. Una región constante de cadena pesada modificada puede comprender un dominio CH1, bisagra, CH2 y/o CH3 de tipo salvaje, o una variante del mismo, por ejemplo, un dominio CH1, bisagra, CH2 y/o CH3 que tiene una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos con respecto al dominio de tipo salvaje correspondiente, y/o que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica, o más, a la secuencia tipo salvaje correspondiente.

Definiciones

Con el fin de que la presente descripción se pueda entender más fácilmente, se definen en primer lugar ciertos términos. Definiciones adicionales se exponen a lo largo de la descripción detallada.

El término “anticuerpo" tal como se usa en la presente puede incluir anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno que incluye una bisagra, un fragmento de unión a antígeno que incluye una bisagra y un dominio CH1, un fragmento de unión a antígeno que incluye una bisagra y un dominio CH2, o un fragmento de unión a antígeno que incluye una bisagra, un dominio CH2 y una porción de un dominio CH3) o cadenas simples de los mismos. En una modalidad, un "anticuerpo" se refiere a una proteína, por ejemplo, una glicoproteína, que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de la misma. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como Vh) y una región constante de cadena pesada. En ciertos anticuerpos IgG, IgD e IgA de origen natural, la región constante de cadena pesada comprende una bisagra, un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3. En ciertos anticuerpos naturales, cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores hospedadores, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico de complemento.

Una inmunoglobulina puede ser de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, incluyendo pero no limitados a IgA, IgA secretor, IgG e IgM. El isotipo IgG se divide en subclases en ciertas especies: IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 en ratones. En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente son del subtipo IgG1 o IgG2 humana. Las inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG 1 humana, existen en varios alotipos, que difieren entre sí en, como mucho, unos pocos aminoácidos. "Anticuerpo" puede incluir, a modo de ejemplo, tanto anticuerpos naturales como no naturales; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humanos y no humanos; anticuerpos completamente sintéticos; y anticuerpos de cadena sencilla.

En ciertas modalidades, una cadena pesada de un anticuerpo comprende una lisina C-terminal; una glicina C-terminal (que ha perdido la lisina C-terminal), o carece de GK o carece de K. Cuando se hace referencia a anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente, el anticuerpo puede comprender una secuencia proporcionada que tenga la GK o K C terminal, o, como alternativa, que carezca de GK o K.

La numeración de aminoácidos es según el índice de EU como en Kabat. Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, y de acuerdo con las fig. 3c-3f de la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2008/0248028.

La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Una porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser una “bisagra que contenga porción de unión a antígeno". Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión incluidos en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo descrito en la presente, incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permita fabricarse como una única cadena proteica en donde las regiones Vl y Vh se unen para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única también están destinados a estar comprendidos dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estas y otras construcciones potenciales se describen en Chan y Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10: 301. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan por su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno pueden producirse por técnicas de ADN recombinante, o por división enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

Una "CDR" de un dominio variable son residuos de aminoácidos dentro de la región hipervariable que se identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la combinación de ambas definiciones de Kabat y Chothia, AbM, contacto y/o conformacionales o cualquier método de determinación de CDR bien conocido en la técnica. Las CDR de anticuerpo pueden identificarse como las regiones hipervariables originalmente definidas por Kabat et al. Véase, por ejemplo Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington D. C. Las posiciones de las CDR también pueden ser identificadas como las estructuras de bucle estructurales descritas originalmente por Chothia y otros. Véase, por ejemplo, Chothia et al., 1989, Nature 342: 877 883. Otros enfoques para la identificación de CDR incluyen la "definición de AbM", que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se obtiene usando el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®) o la "definición de contacto" de CDR basada en contactos antigénicos observados, expuesta en MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262: 732-745. En otro enfoque, denominado en la presente como la "definición conformacional" de CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión del antígeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166. Aún otras definiciones de límites de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los enfoques anteriores, pero se superponen, no obstante, con al menos una porción de las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de predicciones o hallazgos experimentales de que residuos o grupos de residuos particulares o incluso CDR completas no afectan significativamente a la unión al antígeno. Como se usa en la presente, un CDR puede referirse a CDR definidas por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo combinaciones de enfoques. Los métodos usados en la presente pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos enfoques. Para cualquier modalidad dada que contiene más de una CDR, las CDR pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendida, AbM, de contacto y/o conformacionales.

Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo IgG 1, IgG2, IgG3, IgA1, IgA2, IgD e IgE) que está codificada por los genes del dominio constante de la cadena pesada. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de cada región constante de IgG humana de tipo salvaje (incluyendo todos los dominios, es decir, dominio CH1, bisagra, dominio CH2 y dominio CH3) está catalogada en la base de datos UniProt disponible en línea, por ejemplo, como P01857 (IgG1), P01859 (IgG2), P01860 (IgG3) y P01861 (IgG4), o diferentes alotipos de los mismos (SEQ ID NO: 1,6, 11 y 16, respectivamente). Tal como se usa en la presente, un dominio de una región constante de cadena pesada, por ejemplo, la bisagra, es de un “isotipo IgG 1 ”, “isotipo IgG2”, “isotipo IgG3” o “isotipo IgG4”, si el dominio comprende la secuencia de aminoácidos del dominio correspondiente del isotipo respectivo, o una variante del mismo (que tenga una mayor homología con el dominio correspondiente del isotipo respectivo que con el de los otros isotipos).

"Alotipo" se refiere a variantes de origen natural dentro de un grupo de isotipo específico, variantes que difieren en unos pocos aminoácidos (véase, por ejemplo, Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1) Los anticuerpos descritos aquí pueden ser de cualquier alotipo.

Una proteína de “tipo salvaje" o porción de la misma es una versión de la proteína tal como se encuentra en la naturaleza. Una secuencia de aminoácidos de una proteína de tipo salvaje, por ejemplo, una región constante de cadena pesada, es la secuencia de aminoácidos de la proteína tal como ocurre en la naturaleza. Debido a diferencias alotípicas, puede haber más de una secuencia de aminoácidos para una proteína de tipo salvaje. Por ejemplo, hay varios alotipos de regiones constantes de cadena pesada IGg 1 humanas naturales (véase, por ejemplo, Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1).

Una "región Fc" (región cristalizable de fragmento) o "dominio Fc" o "Fc" se refiere a la región C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo que media en la unión de la inmunoglobulina a tejidos hospedadores o factores, incluyendo la unión a receptores Fc situados en varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) o al primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico. De este modo, una región Fc de un anticuerpo de isotipo IgG comprende la región constante de cadena pesada del anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante (CH1). En los isotipos de anticuerpos IgG, IgA e IgD, la región Fc comprende dominios constantes Ch2 y Ch3 en cada una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; las regiones Fc IgM e IgE comprenden tres dominios constantes de cadena pesada (dominios Ch 2-4) en cada cadena polipeptídica. Para IgG, la región Fc comprende dominios de inmunoglobulina que consisten en la bisagra, CH2 y CH3. Para los propósitos de la presente, la región Fc se define como comenzando en el aminoácido 216 y terminando en el aminoácido 447, en donde la numeración es según el índice de EU como en Kabat. Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, y de acuerdo con las fig. 3c-3f de la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2008/0248028. El Fc puede ser un Fc nativo (o natural o de tipo salvaje), incluyendo cualquier variante alotípica, o un Fc variante (por ejemplo, un Fc no natural), que comprenda, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-5, 1-10 o 5-10 o más mutaciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o supresiones. Por ejemplo, un Fc variante puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a un Fc tipo salvaje. Los Fc modificados o mutados pueden tener una función efectora y/o semivida mejorada o reducida. Las regiones CH2 y CH3 son el sitio primario de las funciones efectoras y la unión a FcRn. Fc puede referirse a esta región aisladamente o en el contexto de un polipéptido de proteína que comprende Fc tal como una “proteína de unión que comprende una región Fc", también denominada “proteína de fusión Fc" (por ejemplo, un anticuerpo o inmunoadhesina).

Una "función efectora" se refiere a la interacción de una región Fc del anticuerpo con un receptor o ligando Fc, o un evento bioquímico que resulta de ello. Las "funciones efectoras" a modo de ejemplo incluyen la unión de Clq, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la unión al receptor Fc, las funciones efectoras mediadas por FcyR tales como ADCc y fagocitosis mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCP), y la regulación negativa de un receptor de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B, BCR). Tales funciones efectoras requieren generalmente que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo).

Un "receptor Fc" o "FcR" es un receptor que se une a la región Fc de una inmunoglobulina. Los FcR que se unen a un anticuerpo IgG comprenden receptores de la familia FcyR, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. La familia FcyR consiste en tres receptores activadores (FcyRI, FcyRIII y FcyRiV en ratones: FcyRIA, FcyRIIA y FcyRIIIA en seres humanos) y un inhibidor (FcyRIIB). Se resumen varias propiedades de FcyR en la tabla 1. La mayoría de los tipos de células efectoras naturales coexpresan uno o más FcyR activadores y el FcyRIIB inhibidor, mientras que las células citolíticas naturales (NK) expresan selectivamente un receptor Fc activador (FcyRIII en ratones y FcyRIIIA en seres humanos) pero no el FcyRIIB inhibidor en ratones y seres humanos. La IgG1 humana se une a la mayoría de los receptores Fc humanos y se considera equivalente a la IgG2a murina con respecto a los tipos de receptores Fc activadores a los que se une.

Tabla 1. Pro iedades de los Fc R humanos

Una "bisagra", "dominio bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra de anticuerpo" se refiere al dominio de una región constante de cadena pesada que se une al dominio CH1 con el dominio CH2 e incluye las porciones superior, media e inferior de la bisagra (Roux et al., J. Immunol.1998, 161:4083). La bisagra proporciona niveles variables de flexibilidad entre las regiones de unión y efector de un anticuerpo y también proporciona sitios para el enlace disulfuro intermolecular entre las dos regiones constantes de cadena pesada. Como se usa en la presente, una bisagra comienza en Glu216 y termina en Gly237 para todos los isotipos IgG (Roux et al., 1998, J Immunol 161: 4083). Las secuencias de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de tipo salvaje se muestran en la tabla 2.

Tabla 2.

Aminoácidos de región bisagra

Tipo de Ig Ch1 C-terminal* Bisagra superior Bisagra intermedia Bisagra inferior IgG 1 VDKRV EPKSCDKTHT (SEQ CPPCP (SEQ ID NO:64) APELLGG (SEQ ID NO:57) ID NO:59) (SEQ ID NO:70) IgG2 VDKTV ERK (SEQ ID NO:60) CCVECPPCP (SEQ ID NO:65) APPVAG (SEQ (SEQ ID NO:58) ID NO:71) IgG3 (17- VDKRV (SEQ ID ELKTPLGDTTHT CPRCP (SEQ ID NO:66) APELLGG 15-15-15) NO:57) (SEQ ID NO:61) (EPKSCDTPPPCPRCP)s (SEQ ID NO:70)

(SEQ ID NO:67)

IgG3 (17- VDKRV (SEQ ID ELKTPLGDTTHT CPRCP (SEQ ID NO:66) APELLGG

15-15) NO:57) (SEQ ID NO:61) (EPKSCDTPPPCPRCP)2 (SEQ (SEQ ID NO:70)

ID NO:67)

(continuación)

Aminoácidos de región bisagra

Tipo de Ig Ch1 C-terminal* Bisagra superior Bisagra intermedia Bisagra inferior IgG3 (17- VDKRV (SEQ ID ELKTPLGDTTHT CPRCP (SEQ ID NO:66) APELLGG 15) NO:57) (SEQ ID NO:61) (EPKSCDTPPPCPRCP)i (SEQ (SEQ ID NO:70)

ID NO:67)

IgG3 (15- VDKRV(SEQ ID EPKS (SEQ ID CDTPPPCPRCP (SEQ ID APELLGG

15-15) NO:57) NO:62) NO:68) (SEQ ID NO:70)

(EPKSCDTPPPCPRCP)2 (SEQ

ID NO:67)

I G3 15 VDKRV SEQ ID EPKS SEQ ID CDTPPPCPRCP SEQ ID APELLGG

* Secuencias de aminoácidos C-terminales de los dominios CH1.

El término "bisagra" incluye bisagras de tipo salvaje (tales como las expuestas en la tabla 3), así como variantes de las mismas (por ejemplo, bisagras no naturales o bisagras modificadas). Por ejemplo, la expresión "bisagra de IgG2" incluye bisagra de IgG2 de tipo salvaje, como se muestra en la tabla 3 y variantes que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1 -3, 1 -5, 3 5 y/o como máximo 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones. Las variantes de bisagra de IgG2 a modo de ejemplo incluyen bisagras de IgG2 en las que 1,2, 3 o las 4 cisteínas (C219, C220, C226 y C229) se cambian a otro aminoácido. En una modalidad específica, una bisagra de IgG2 comprende una sustitución C219X o C220X, en donde X es cualquier aminoácido, excepto cisteína. Una bisagra de IgG2 puede comprender una sustitución que, sola o junto con una o más sustituciones en otras regiones de la cadena pesada o ligera, hará que el anticuerpo que comprende la bisagra adopte la forma A o B (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48: 3755). En ciertas modalidades, una bisagra es una bisagra híbrida que comprende secuencias de al menos dos isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede comprender la bisagra superior, media o inferior de un isotipo y el resto de la bisagra de uno o más de otros isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede ser una bisagra IgG2/IgG1 y puede comprender, por ejemplo, las bisagras superior e intermedia de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1. Una bisagra puede tener una función efectora o estar privada de la función efectora. Por ejemplo, la bisagra inferior de la IgG1 de tipo salvaje proporciona una función efectora.

Una bisagra "no de IgG2" se refiere a una bisagra que no es del isotipo IgG2.

La expresión "dominio CH1" se refiere a la región constante de cadena pesada que liga el dominio variable a la bisagra en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en la presente, un dominio CH1 comienza en A118 y termina en V215. La expresión "dominio CH1" incluye dominios CH1 de tipo salvaje (tales como los que tienen SEQ ID NO: 2 para IgG1 y s Eq ID NO: 7 para IgG2; tabla 3), así como variantes de los mismos (por ejemplo, dominios CH1 no naturales o CH1 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH1" incluye dominios CH1 de tipo salvaje y variantes de los mismos que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como máximo 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones.

Los ejemplos de dominios CH1 incluyen dominios CH1 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. Se proporcionan aquí modificaciones al dominio CH1 que afectan a una actividad biológica de un anticuerpo.

La expresión “dominio CH2” se refiere a la región constante de cadena pesada que une la bisagra al dominio CH3 en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en la presente, un dominio CH2 comienza en P238 y termina en K340. La expresión "dominio CH2" incluye dominios CH2 de tipo salvaje (tales como los que tienen SEQ ID NO: 4 para IgG1; tabla 3), así como variantes de los mismos (por ejemplo, dominios CH2 no naturales o dominios CH2 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH2" incluye dominios CH2 de tipo salvaje y variantes de los mismos que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como máximo 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones. Los ejemplos de dominios CH2 incluyen dominios CH2 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. En ciertas modalidades, un dominio CH2 comprende las sustituciones A330S/P331S que reducen la función efectora. En la presente se proporcionan otras modificaciones al dominio CH2 que afectan a una actividad biológica de un anticuerpo.

La expresión “dominio CH3” se refiere a la región constante de cadena pesada que es C-terminal al dominio CH2 en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en la presente, un dominio CH3 comienza en G341 y termina en K447. La expresión "dominio CH3" incluye dominios CH3 de tipo salvaje (tales como que tienen SEQ ID NO: 5 para IgG1; tabla 3), así como variantes de los mismos (por ejemplo, dominios CH3 no naturales o dominios CH3 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH3" incluye dominios CH3 de tipo salvaje y sus variantes que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como máximo 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones. Los ejemplos de dominios CH3 incluyen dominios CH3 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. Se proporcionan aquí modificaciones al dominio CH3 que afectan a una actividad biológica de un anticuerpo.

Ċ

La expresión “anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que muestra una sola especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular o una composición de anticuerpos en donde todos los anticuerpos muestran una especificidad y afinidad de unión única para un epítopo particular. Normalmente, tales anticuerpos monoclonales se obtendrán de una sola célula o ácido nucleico que codifica el anticuerpo, y se propagarán sin introducir intencionalmente ninguna alteración de secuencia. Por consiguiente, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene regiones constantes variables y opcionales derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma, por ejemplo, obtenido por fusión de una célula B obtenida de un animal no humano transgénico o transcromosómico (por ejemplo, un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera), a una célula inmortalizada.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", tal como se usa aquí, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de ellos, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes comprenden regiones variables y constantes que utilizan secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana en particular, están codificadas por los genes de la línea germinal, pero incluyen reordenaciones y mutaciones posteriores que se producen, por ejemplo, durante la maduración del anticuerpo. Como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), la región variable contiene el dominio de unión a antígeno, que está codificado por varios genes que se reordenan para formar un anticuerpo específico para un antígeno extraño. Además del reordenamiento, la región variable puede modificarse adicionalmente mediante múltiples cambios de aminoácidos individuales (denominados mutación somática o hipermutación) para aumentar la afinidad del anticuerpo frente al antígeno extraño. La región constante cambiará en respuesta adicional a un antígeno (es decir, interruptor de isotipo). Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico reordenadas y somáticamente mutadas que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina de cadena ligera y de cadena pesada en respuesta a un antígeno pueden no ser idénticas a las secuencias originales de la línea germinal, sino que serán sustancialmente idénticas o similares (es decir, tienen al menos 80 % de identidad).

Un anticuerpo "humano" (HuMAb) se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables en las que tanto las regiones marco conservadas como CDR se obtienen de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se obtiene de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos descritos en la presente pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal como se usa en la presente, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, sobre secuencias marco conservadas humanas. Las expresiones anticuerpos "humanos" y anticuerpos "totalmente humanos" y se usan sinónimamente.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que algunos, la mayoría o la totalidad de los aminoácidos fuera de los dominios CDR de un anticuerpo no humano se reemplazan con aminoácidos correspondientes derivados de inmunoglobulinas humanas. En una modalidad de una forma humanizada de un anticuerpo, algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR han sido reemplazados por aminoácidos de inmunoglobulinas humanas, mientras que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR están sin cambios. Se permiten pequeñas adiciones, supresiones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos, siempre y cuando no anulen la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno particular. Un anticuerpo "humanizado" conserva una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original.

Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que las regiones variables derivan de una especie y las regiones constantes derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las regiones variables derivan de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes derivan de un anticuerpo humano.

Un “anticuerpo biespecífico” o “bifuncional” es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes, dando lugar a dos sitios de unión a antígeno con especificidad para diferentes antígenos. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante diversos métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 1448, 1547-1553 (1992).

Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en la presente con a expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al antígeno "x" está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos del antígeno "x"). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo del antígeno "x" puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otras proteínas antigénicas "x" de diferentes especies.

Como se usa en la presente, un "anticuerpo agonista" se refiere a un anticuerpo que es un agonista de un receptor co-estimulador, por ejemplo, un anticuerpo que es capaz de reforzar el sistema inmune (o una respuesta inmune) de un sujeto estimulando la actividad de una proteína que, a su vez, estimula una célula inmune, por ejemplo, una célula T, tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70 o CD27, DR3 o CD28H. En ciertas modalidades, un anticuerpo agonista es un anticuerpo que aumenta la actividad de un receptor inhibidor, por ejemplo, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, o LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM -1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 o TIM-4, y de esta manera inhibe una respuesta inmune.

Como se usa en la presente, un "anticuerpo antagonista" se refiere a un anticuerpo que es un antagonista de una señal inhibidora en una célula inmune, por ejemplo, una célula T, por ejemplo, un anticuerpo que es capaz de inhibir o bloquear una proteína que inhibe la activación de células T (por ejemplo, inhibidores del punto de control inmune), tales como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, o LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 o TIM-4 y, de este modo, estimula una respuesta inmune. En ciertas modalidades, un anticuerpo antagonista es un anticuerpo que inhibe la actividad de un receptor estimulante, por ejemplo, B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, o CD27, DR3 o CD28H, y de esta manera inhibe una respuesta inmune.

Los anticuerpos tanto agonistas como antagonistas dan como resultado la amplificación de respuestas de células T específicas de antígeno o la inhibición de respuestas de células T específicas de antígenos (reguladores de puntos de control inmunes).

La expresión “epítopo" o “determinante antigénico” se refiere a un sitio sobre un antígeno (por ejemplo, GITR) al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo. Los epítopos dentro de antígenos proteicos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos (usualmente un epítopo lineal) como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de la proteína (usualmente un epítopo conformacional). Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos son normalmente, pero no siempre, retenidos por exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden normalmente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye normalmente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar qué epítopos están unidos por un anticuerpo dado (es decir, el mapeo de epítopos) son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en los que se ensayan los péptidos solapantes o contiguos para determinar la reactividad con un anticuerpo dado. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen técnicas en este campo y las descritas en la presente, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional y HDX-MS (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, GE Morris, Ed. (1996)).

La expresión "de origen natural" tal como se usa aquí como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por el hombre en el laboratorio es natural.

Un "polipéptido" se refiere a una cadena que comprende al menos dos residuos de aminoácidos consecutivamente unidos, sin límite superior en la longitud de la cadena. Uno o más residuos de aminoácido en la proteína pueden contener una modificación tal como, pero sin limitarse a, glucosilación, fosforilación o un enlace disulfuro. Una "proteína" puede comprender uno o más polipéptidos.

La expresión "molécula de ácido nucleico", tal como se usa en la presente, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, y puede ser ADNc.

También se proporcionan "modificaciones de secuencia conservadoras" de las secuencias expuestas en la presente e incluyen, por ejemplo, sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos, así como adiciones y supresiones de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, se pueden introducir modificaciones en el SEQ ID NO: 1-74 mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Las modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones de aminoácidos conservadoras, en las que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

En una modalidad, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos a una región constante de la cadena pesada o dominio de la misma no modifican o anulan ciertas propiedades de la región constante de la cadena pesada. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, la rigidez o firmeza de la bisagra, así como la actividad agonista o antagonista del anticuerpo. En ciertas modalidades, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos a una región constante o dominio de cadena pesada modifican o anulan ciertas propiedades de la región constante de cadena pesada.

Los métodos de identificación de sustituciones conservadoras de aminoácidos que anulan o no las propiedades del anticuerpo y/o de la región constante son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe aquí en la sección de ejemplos.

Para los ácidos nucleicos, la expresión "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o sus secuencias designadas, cuando se alinean y comparan óptimamente, son idénticos, con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiados, en al menos aproximadamente 80 % de los nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 90 % a 95 %, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % a 99,5 % de los nucleótidos. Como alternativa, existe una homología sustancial cuando los segmentos se hibriden en condiciones de hibridación selectiva, con el complemento de la hebra.

Para polipéptidos, la expresión "homología sustancial" indica que dos polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan óptimamente, son idénticos, con inserciones o supresiones de aminoácidos apropiadas, en al menos aproximadamente 80 % de los aminoácidos, usualmente al menos aproximadamente 90 % a 95 %, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % a 99,5 % de los aminoácidos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias cuando las secuencias están alineadas óptimamente (es decir, % de homología = n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones x 100), con una alineación óptima determinada teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitativos que se muestran a continuación.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (44): 444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.

Las secuencias de ácido nucleico y proteínas descritas en la presente pueden usarse además como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden realizar usando los programas n BlAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína descritas en la presente. Para obtener alineaciones con huecos para efectos de comparación, Gapped BLAST puede usarse como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov.

Como se usa en la presente, el término “antígeno” se refiere a cualquier sustancia inmunogénica natural o sintética, tal como una proteína, péptido o hapteno. Un antígeno puede ser una proteína de longitud completa o madura, o un fragmento de la misma.

Una "respuesta inmune" se refiere a una respuesta biológica dentro de un vertebrado frente a agentes extraños, cuya respuesta protege al organismo contra estos agentes y enfermedades causadas por ellos. Una respuesta inmune está mediada por la acción de una célula del sistema inmune (por ejemplo, un linfocito T, un linfocito B, una célula citolítica natural (Nk), un macrófago, un eosinófilo, un mastocito, una célula dendrítica o un neutrófilo) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que da lugar a una selección selectiva de objetivo, unión, daño, destrucción y/o eliminación del cuerpo de patógenos invasores de vertebrados, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas u otras anómalas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. Una reacción inmune incluye, por ejemplo, la activación o inhibición de una célula T, por ejemplo, una célula T efectora o una célula Th, tal como una célula T CD4+ o CD8+, o la inhibición de una célula Treg.

Un "inmunomodulador" o "inmunorregulador" se refiere a un agente, por ejemplo, un componente de una vía de señalización, que puede estar implicado en la modulación, la regulación o la modificación de una respuesta inmune. "Modulación", "regulación" o "modificación" de una respuesta inmune se refiere a cualquier alteración en una célula del sistema inmune o en la actividad de tal célula (por ejemplo, una célula T efectora). Tal modulación incluye la estimulación o supresión del sistema inmune que puede manifestarse por un aumento o disminución en el número de diversos tipos celulares, un aumento o disminución en la actividad de estas células, o cualquier otro cambio que pueda ocurrir dentro del sistema inmune. Se han identificado inmunomoduladores inhibidores y estimuladores, algunos de los cuales pueden tener una función mejorada en un microambiente tumoral. En modalidades preferidas, el inmunomodulador está situado en la superficie de una célula T. Un "objetivo inmunomodulador" u "objetivo inmunorregulador" es un inmunomodulador al que se dirige la unión y cuya actividad se altera por la unión de una sustancia, agente, resto, compuesto o molécula. Los objetivos inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, receptores en la superficie de una célula ("receptores inmunomoduladores") y ligandos de receptor ("ligandos inmunomoduladores").

"Inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto afectado o en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de una enfermedad mediante un método que comprende inducir, mejorar, suprimir o modificar de otra manera una respuesta inmune.

"Terapia inmunoestimulante" o "terapia inmunoestimuladora" se refiere a una terapia que da como resultado un aumento (inducción o mejora) de una respuesta inmune en un sujeto para, por ejemplo, tratar el cáncer.

"Potenciar una respuesta inmune endógena" significa aumentar la eficacia o la potencia de una respuesta inmunitaria existente en un sujeto. Este aumento en eficacia y potencia puede lograrse, por ejemplo, mediante la superación de mecanismos que suprimen la respuesta inmune endógena del hospedador o estimulando mecanismos que aumentan la respuesta inmune endógena del hospedador.

Las células “T efectoras” (“Teff”) se refieren a células T (por ejemplo, células T CD4+ y CD8+) con actividades citolíticas así como células T ayudantes (Th), que segregan citocinas y activan y dirigen otras células inmunes, pero no incluyen células T reguladoras (células Treg).

Tal como se usa en la presente, el término "enlazado" se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El enlace puede ser covalente o no covalente. La unión también puede ser genética (es decir, fusionada recombinantemente). Tales enlaces pueden conseguirse usando una amplia variedad de técnicas reconocidas en la técnica, tales como la conjugación química y la producción de proteínas recombinantes.

Según se usa en la presente, "administrar" se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agente terapéutico para un sujeto, usando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos descritos en la presente incluyen vías de administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión “administración parenteral”, tal como se usa en la presente, significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbitaria, intradérmica, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión, así como electroporación in vivo. Como alternativa, un anticuerpo descrito en la presente puede administrarse por vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces, y/o durante uno o más periodos prolongados.

Tal como se usa en la presente, la expresión "respuesta mediada por células T" se refiere a una respuesta mediada por células T, incluyendo células T efectoras (por ejemplo, células CD8+) y células T auxiliares (por ejemplo, células CD4+). Las respuestas mediadas por células T incluyen, por ejemplo, citotoxicidad y proliferación de células T.

Como se usa en la presente, la expresión "respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL)" se refiere a una respuesta inmune inducida por células T citotóxicas. Las respuestas de CTL están mediadas principalmente por células T CD8+.

Según se usa en la presente, los términos "inhibe" o "bloquea" (por ejemplo, haciendo referencia a la inhibición/bloqueo de un ligando a su receptor o a una respuesta intracelular subsiguiente) se usan indistintamente y abarcan inhibición/bloqueo parcial y completo. En algunas modalidades, el anticuerpo inhibe la unión por al menos aproximadamente 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 %, determinado, por ejemplo, como se describe adicionalmente en la presente.

Como se usa en la presente, "cáncer" se refiere a un amplio grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento descontrolado de células anómalas en el cuerpo. La división celular no regulada puede resultar en la formación de tumores malignos o células que invaden tejidos vecinos y pueden metastatizar a partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo.

Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento", tal como se usan en la presente, se refieren a cualquier tipo de intervención o proceso realizado en, o que administra un agente activo al sujeto con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, o retardar o prevenir la progresión, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación, condición o signos bioquímicos asociados con una enfermedad. La profilaxis se refiere a la administración a un sujeto que no tiene una enfermedad, para evitar que la enfermedad se produzca o minimice sus efectos si la tiene.

Una "neoplasia maligna hematológica" incluye un linfoma, leucemia, mieloma o una neoplasia linfoide, así como un cáncer del bazo y de los ganglios linfáticos. Los ejemplos de linfomas incluyen tanto linfomas de células B como linfomas de células T. Los linfomas de células B incluyen tanto los linfomas de Hodgkin como la mayoría de los linfomas no Hodgkin. Los ejemplos no limitantes de linfomas de células B incluyen linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de tejido linfático asociado a mucosa, linfoma linfocítico de células pequeñas (solapamiento con leucemia linfocítica crónica), linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt, linfoma de células B grandes del mediastino, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B nodales de la zona marginal, linfoma de la zona marginal esplénica, linfoma de células B grandes intravasculares, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide. Los ejemplos no limitantes de linfomas de células T incluyen linfoma de células T extranodales, linfomas cutáneos de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma de células T angioinmunoblásticas. Las neoplasias malignas hematológicas también incluyen leucemia, tal como, pero sin limitarse a, leucemia secundaria, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica y leucemia linfoblástica aguda. Las neoplasias malignas hematológicas incluyen además mielomas, tales como, pero sin limitarse a, mieloma múltiple y mieloma múltiple pauciblástico. Otros cánceres hematológicos y/o asociados a células B o células T están englobados por la expresión neoplasia hematológica.

La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para conseguir o al menos parcialmente lograr un efecto deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéuticamente eficaz" de un fármaco o agente terapéutico es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se usa solo o en combinación con otro agente terapéutico, promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los periodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención de deficiencia o discapacidad debido a la afección de la enfermedad. Una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "dosificación profilácticamente eficaz" de un fármaco es una cantidad del fármaco que, cuando se administra solo o en combinación con otro agente terapéutico a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad o de padecer una recurrencia de la enfermedad, inhibe el desarrollo o recurrencia de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico o profiláctico para promover la regresión de la enfermedad o inhibir el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad puede evaluarse usando varios métodos conocidos por el experto en la técnica, como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelo animal predictivos de la eficacia en seres humanos, o mediante el ensayo de la actividad del agente en ensayos in vitro.

A modo de ejemplo, un agente anticancerígeno es un fármaco que retarda la progresión del cáncer o promueve la regresión del cáncer en un sujeto. En modalidades preferidas, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco promueve la regresión del cáncer hasta el punto de eliminar el cáncer. "Promover la regresión del cáncer" significa que la administración de una cantidad eficaz del fármaco, solo o en combinación con un agente antineoplásico, da como resultado una reducción del crecimiento o tamaño del tumor, necrosis del tumor, una disminución de la gravedad de al menos un síntoma de enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los periodos libres de síntomas de la enfermedad, una prevención de la deficiencia o discapacidad debida a la afección de la enfermedad o, de otra manera, la mejora de los síntomas de la enfermedad en el paciente. La eficacia farmacológica se refiere a la capacidad del fármaco para promover la regresión del cáncer en el paciente. Seguridad fisiológica se refiere a un nivel aceptablemente bajo de toxicidad u otros efectos fisiológicos adversos a nivel celular, de órganos y/u organismos (efectos adversos) resultantes de la administración del fármaco.

A modo de ejemplo para el tratamiento de tumores, una cantidad o dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe preferiblemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente 20 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente 60 % y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente 80 % con respecto a sujetos no tratados. En las modalidades más preferidas, una cantidad o dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe completamente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral, es decir, inhibe preferiblemente el crecimiento celular o el crecimiento del tumor en un 100 %. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento del tumor se puede evaluar usando los ensayos descritos posteriormente. Como alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibición puede medirse in vitro mediante ensayos conocidos por el experto en la materia. En otras modalidades preferidas descritas en la presente, se puede observar la regresión del tumor y puede continuar durante un periodo de al menos aproximadamente 20 días, más preferiblemente al menos aproximadamente 40 días o incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 60 días.

Los términos "paciente" y "sujeto" se refieren a cualquier animal humano o no humano que recibe tratamiento profiláctico o terapéutico. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente pueden usarse para tratar a un sujeto que tiene cáncer. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Varios aspectos descritos aquí se describen con más detalle en las subsecciones siguientes.

I. Regiones constantes de cadena pesada modificadas

En la presente se describen "regiones constantes de cadena pesada modificadas" que, cuando están presentes en anticuerpos, mejoran o alteran ciertas propiedades biológicas o características de los anticuerpos, con relación a los mismos anticuerpos que no tienen una región constante de cadena pesada modificada, tales como anticuerpos que contienen una bisagra no-IgG2, por ejemplo, anticuerpos IgG1. Las propiedades biológicas mejoradas o alteradas de los anticuerpos incluyen:

(a) internalización aumentada o alterada por una célula;

(b) actividad agonista aumentada o alterada;

(c) actividad antagonista o bloqueadora aumentada o alterada;

(d) ADCC mejorada;

(d) generación de una nueva propiedad;

(e) transducción de señal aumentada o alterada;

(f) formación de complejos reticulados de anticuerpo/antígeno más grandes;

(g) aumento del agrupamiento u oligomerización de la molécula de superficie celular objetivo;

(h) aumento de la estimulación o mejora de una respuesta inmune; y/o

(i) aumento de la inhibición de una respuesta inmune.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada media en la internalización del receptor dependiente de anticuerpo (o ligando o molécula de superficie) más eficazmente, por ejemplo, el anticuerpo internaliza una molécula objetivo o de superficie (por ejemplo, un receptor o ligando) y/o es internalizada con una velocidad y/o extensión de internalización más alta en una célula después de que el anticuerpo se uniera a su objetivo en la membrana celular, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG1. La velocidad y el grado de internalización de un anticuerpo pueden determinarse, por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos. La velocidad de internalización, tal como se mide, por ejemplo, por T1/2 de internalización, por ejemplo, como se muestra en los ejemplos, puede mejorarse o aumentarse en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más, dando como resultado una reducción del T1/2 en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más. Por ejemplo, en lugar de tener un T1/2 de 10 minutos, una región constante de cadena pesada modificada puede aumentar la velocidad de internalización y, por tanto, reducir el T1/2 a 5 minutos (es decir, un aumento de dos veces en la velocidad de internalización o una reducción de dos veces en T1/2) “T1/2" se define como el tiempo en que se alcanza la mitad de la internalización máxima, medida a partir del momento en que se añade el anticuerpo a las células. En ciertas modalidades, T1/2 se reduce en al menos 10 minutos, 30 minutos o 1 hora. El nivel máximo de internalización puede ser el nivel de internalización en la meseta de un gráfico que represente la internalización trazada contra concentraciones de anticuerpo o tiempo. Una región constante de cadena pesada modificada puede aumentar el nivel máximo de internalización de un anticuerpo en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más. Otra manera de comparar las eficacias de internalización de diferentes anticuerpos, tales como un anticuerpo con, y el mismo anticuerpo sin, una región constante de cadena pesada modificada, es comparando su nivel de internalización a una concentración de anticuerpo dada (por ejemplo, 100 nM) y/o un tiempo dado (por ejemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos o 30 minutos). La comparación de los niveles de internalización también puede hacerse comparando los niveles de CE50 de internalización. El nivel de internalización de un anticuerpo se puede definir con respecto al de un anticuerpo dado (de referencia), por ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente, por ejemplo, 11F11 o CD73.4-IgG2CS-IgG1, y puede indicarse como un porcentaje del valor obtenido con el anticuerpo dado (referencia). El grado de internalización puede ser aumentado en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más, en comparación con cualquiera de estos métodos.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad agonista más potente, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG1. En ciertas modalidades, la actividad agonista mejorada aumenta la actividad estimuladora de una molécula objetivo, por ejemplo, GITR, u otras moléculas que estimulan o co-estimulan una respuesta inmune, por ejemplo, actividad de células T. En ciertas modalidades, la actividad agonista mejorada aumenta la actividad inhibidora de una molécula objetivo que inhibe una respuesta inmune, por ejemplo, actividad de células T (por ejemplo, un inhibidor de punto de control). La actividad agonista mejorada de un anticuerpo que modula la actividad de las células T puede determinarse, por ejemplo, como se muestra en los ejemplos, por ejemplo, midiendo el nivel de secreción de IFN-y o IL-2 a partir de células T que se ponen en contacto con el anticuerpo. La actividad agonista de un anticuerpo que se une a un objetivo estimulador puede ser aumentada en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más según se define por una liberación aumentada de citocinas o una proliferación aumentada de células T efectoras; reducción de la actividad de la célula T reguladora si el compromiso sobre T regs reduce la función Treg; o aumento del agotamiento de las T reg. Por ejemplo, la cantidad de IFN-y o IL-2 secretada a partir de células T estimuladas con un anticuerpo que se une a un objetivo estimulador que comprende una región constante de cadena pesada modificada puede ser al menos 10 %, 3o %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más más alto que el de células T simuladas con el mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada. La actividad agonista de un anticuerpo que se une a un objetivo inhibidor puede ser aumentada en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más según se define por liberación reducida de citocinas o proliferación reducida de células T efectoras; aumento de la actividad de la célula T reguladora; o disminución del agotamiento de T regs. Por ejemplo, la cantidad de IFN-y o IL-2 secretada a partir de células T estimuladas con un anticuerpo que se une a un objetivo inhibidor que comprende una región constante de cadena pesada modificada puede ser al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más más baja que la de células T simuladas con el mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene actividad antagonista o bloqueante más potente, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG 1. La actividad antagonista mejorada de un anticuerpo se puede determinar, por ejemplo, midiendo la liberación y/o proliferación de citocinas en contextos que incluyen condiciones de activación de células T. La actividad antagonista puede ser aumentada en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene actividad de ADCC mejorada, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG 1. El ADCC mejorado puede determinarse según métodos conocidos en la técnica. ADCC puede ser aumentada en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 2 veces, 5 veces o más.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene la capacidad de formar mayores complejos reticulados de anticuerpo/antígeno, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG1. La capacidad para formar complejos se puede determinar como se describe, por ejemplo, en los ejemplos. Los complejos de anticuerpo/antígeno formados con un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada pueden ser al menos 50 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces más grande que los complejos formados con el mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada. En ciertas modalidades, se forman complejos de al menos 2000 kDa; 3000 kDa; 5000 kDa; 10.000 kDa, 50.000 kDa o 100.000 kDa con anticuerpos que tienen una región constante de cadena pesada modificada.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada desencadena más agrupamiento u oligomerización de la molécula objetivo sobre la superficie celular, con relación al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG 1. El grado de agrupamiento de una oligomerización puede determinarse, por ejemplo, midiendo el tamaño de los complejos anticuerpo/antígeno.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada transduce un nivel superior o tipo diferente de señalización o transducción de señal, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG1. La transducción de señales se puede supervisar determinando el nivel de activación de una o más proteínas en vías de transducción de señales. En ciertas modalidades, la transducción de señales se determina midiendo la actividad (o fosforilación) de una proteína de transducción de señales, por ejemplo, NKkB o p38, como se describe, por ejemplo, en los ejemplos. La transducción de señal desencadenada por un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada puede ser mayor o menor en al menos 10 %, 20 %, 50 %, 2 veces, 5 veces o más que la transducción de señal con el mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada. Por ejemplo, la transducción de señales desencadenada por un anticuerpo que se une a una molécula estimuladora (por ejemplo, GITR) y comprende una región constante de cadena pesada modificada puede ser aumentada en al menos un 10 % con respecto a la obtenida con el mismo anticuerpo que tiene una cadena pesada de IgG 1. Por ejemplo, CE50 de actividad NKkB o p38 (por ejemplo, fosforilación) se puede reducir en al menos 50 %, 2 veces, 5 veces o más.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene una capacidad incrementada para estimular o mejorar una respuesta inmune o el sistema inmunitario, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG 1. Una mayor capacidad para estimular una respuesta inmune o el sistema inmunitario, puede resultar de una actividad agonista mejorada de receptores co-estimuladores de células T y/o una actividad antagonista mejorada de receptores inhibidores. Una capacidad aumentada para estimular una respuesta inmune o el sistema inmunitario puede reflejarse por un aumento de la CE50 o del nivel máximo de actividad en un ensayo que mide una respuesta inmune, por ejemplo, un ensayo que mide cambios en la liberación de citocinas o quimiocinas, actividad citolítica (determinada directamente en las células objetivo o indirectamente mediante la detección de CD107a o granzimas) y la proliferación. La capacidad de estimular una respuesta inmunitaria o la actividad del sistema inmune puede aumentarse en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad antiproliferativa o antitumoral aumentada, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG1. La actividad antitumoral mejorada de un anticuerpo se puede determinar, por ejemplo, mediante el crecimiento de un tumor en un animal que ha sido tratado con el anticuerpo. La actividad antitumoral se puede mejorar en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más. La actividad antitumoral se puede medir, por ejemplo, como una disminución en la carga tumoral, por ejemplo, manifestada por una disminución de la cinética de crecimiento tumoral y regresiones completas del tumor.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene una capacidad incrementada para inhibir o suprimir una respuesta inmune o el sistema inmune, con respecto al mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, y comprende, por ejemplo, una cadena pesada de IgG1. Una mayor capacidad para inhibir o suprimir una respuesta inmune o el sistema inmunitario, puede resultar de una actividad antagonista mejorada de receptores co-estimuladores de células T y/o de una actividad agonista mejorada de receptores inhibidores. Una capacidad aumentada para estimular una respuesta inmune o el sistema inmunitario puede reflejarse por un aumento de la CE50 o del nivel máximo de actividad en un ensayo que mide una respuesta inmune, por ejemplo, un ensayo que mide cambios en la liberación de citocinas o quimiocinas, actividad citolítica (determinada directamente en las células objetivo o indirectamente mediante la detección de CD107a o granzimas) y la proliferación. La capacidad para inhibir o suprimir una respuesta inmunitaria o la actividad del sistema inmune puede aumentarse en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más.

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada o parte de la misma, por ejemplo, la bisagra, es más rígida, comparada con otras regiones constantes de cadena pesada, por ejemplo, regiones constantes de cadena pesada IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4. Por ejemplo, una región constante de cadena pesada modificada es una región constante de cadena pesada no natural que es más rígida que, o tiene una porción, por ejemplo, la bisagra, que es más rígida que una región constante constante de cadena pesada de origen natural o bisagra de la misma. La rigidez de una región constante de cadena pesada o porción de la misma, tal como la bisagra, se puede determinar, por ejemplo, mediante modelado por ordenador, microscopia electrónica, espectroscopia tal como resonancia magnética nuclear (RMN), cristalografía de rayos X (factores B) o ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación (AUC) para medir o comparar el radio de giro de los anticuerpos que comprenden la bisagra. Como alternativa, la rigidez de una región constante de cadena pesada o porción de la misma puede determinarse midiendo los tamaños de complejos anticuerpo/antígeno, por ejemplo, como se describe adicionalmente en la presente.

Se entenderá que un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada y que exhibe una propiedad funcional mejorada determinada de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica y descritas en la presente, se refiere a una diferencia estadísticamente significativa en la actividad particular con respecto a la observada en el mismo anticuerpo pero con una región constante de cadena pesada diferente.

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra del isotipo IgG2 (una "bisagra IgG2") y un dominio CH1, CH2 y CH3. En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra de IgG2 y un dominio CH1, CH2 y CH3, donde al menos uno de los dominios CH1, CH2 y CH3 no es del isotipo IgG2. En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra de IgG2 y un dominio CH1, CH2 y CH3, en donde el dominio constante de cadena pesada no es una región constante de IgG2 tipo salvaje o no es una región constante de IgG2 con una mutación en el aminoácido 219 o 220. La bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 de tipo salvaje, por ejemplo, una bisagra de IgG2 humana de tipo salvaje (por ejemplo, que tiene SEQ ID NO: 8) o una variante de la misma, con la condición de que la bisagra de IgG2 retenga la capacidad de conferir al anticuerpo una actividad mejorada con respecto a la del mismo anticuerpo que comprende una bisagra no de IgG2 o comprende una cadena pesada de IgG1. En ciertas modalidades, una variante de bisagra de IgG2 retiene similar rigidez o firmeza a la de una bisagra de IgG2 tipo salvaje. La rigidez de una bisagra puede determinarse, por ejemplo, mediante modelado por ordenador, microscopia electrónica, espectroscopia tal como resonancia magnética nuclear (RMN), cristalografía de rayos X (factores B) o ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación (AUC) para medir o comparar el radio de giro de anticuerpos que comprenden la bisagra. Una bisagra tiene una rigidez similar o superior a la de otra bisagra si un anticuerpo que comprende la bisagra tiene un valor obtenido a partir de una de las pruebas descritas en la oración anterior que difiere del valor del mismo anticuerpo con una bisagra diferente, por ejemplo, una bisagra IgG1, en menos del 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %. Una persona experta en la técnica sería capaz de determinar a partir de las pruebas si una bisagra tiene al menos una rigidez similar a la de otra bisagra interpretando los resultados de estas pruebas.

Un ejemplo de variante de bisagra de IgG2 humana es una bisagra de IgG2 que comprende una sustitución de uno o más de los cuatro residuos de cisteína (es decir, C219, C220, C226 y C229) con otro aminoácido. Una cisteína puede ser reemplazada por una serina. Una bisagra de IgG2 a modo de ejemplo es una bisagra de IgG2 humana que comprende una mutación de C219X o una mutación de C220X, en donde X es cualquier aminoácido excepto serina. En ciertas modalidades, una bisagra de IgG2 no comprende tanto una sustitución C219X como una sustitución C220X.

En ciertas modalidades, una bisagra de lgG2 comprende C219S o C220S, pero no tanto C219S como C22S. Otras variantes de bisagra de IgG2 que pueden usarse incluyen bisagras de IgG2 humana que comprenden una sustitución de C220, C226 y/o C229, por ejemplo, una mutación de C220S, C226S o C229S (que puede combinarse con una mutación de C219S). Una bisagra de IgG2 puede ser también una bisagra de IgG2 en la que una parte de la bisagra es la de otro isotipo (es decir, es una bisagra quimérica o híbrida), siempre que la rigidez de la bisagra quimérica sea al menos similar a la de una bisagra IgG2 de tipo salvaje. Por ejemplo, una bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 en la que la bisagra inferior (como se define en la tabla 2) es de un isotipo IgG1 y es, por ejemplo, una bisagra inferior de IgG1 de tipo salvaje.

Se hace referencia a una bisagra "híbrida" o "quimérica" como de un isotipo específico si más de la mitad de los aminoácidos consecutivos de la bisagra son de ese isotipo. Por ejemplo, se considera que una bisagra que tiene una bisagra superior y media de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1 es una bisagra híbrida de IgG2.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra de IgG2 que comprende una secuencia expuesta en la tabla 4, por ejemplo, una de las siguientes secuencias de aminoácidos: 8, 21,22, 23, 126-129 y 134-147. En ciertas modalidades, la bisagra comprende los SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 o 135, en donde 1, 2, 3 o los 4 aminoácidos P233, V234, A235 y G237 (correspondientes a los 4 aminoácidos C-terminales “PVAG" (SEQ ID NO: 148) son suprimidos o sustituidos con otro aminoácido, por ejemplo, los aminoácidos del extremo C de la bisagra de IgG1 (ELLG (SEQ ID NO: 150) o ELLGG (SEQ ID NO: 151). En ciertas modalidades, la bisagra comprende los SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 o 135, en donde V234, A235 y G237 se suprimen o se sustituyen con otro aminoácido. En ciertas modalidades, la bisagra comprende los SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 o 135, en donde A235 y G237 se eliminan o sustituyen con otro aminoácido. En ciertas modalidades, la bisagra comprende los SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 o 135, en donde G237 se suprime o se sustituye con otro aminoácido. En ciertas modalidades, la bisagra comprende los SEQ ID NO: 8, 21, 126, 134 o 135, en donde V234 y A235 se suprimen o se sustituyen con otro aminoácido. La sustitución de PVAG (SEQ ID NO: 143) en una IgG2 con los correspondientes aminoácidos de una bisagra de IgG1, es decir, (ELLG (SEQ ID NO: 150) o e LlGG (SEQ ID NO: 151)) para obtener una bisagra híbrida que tiene SEQ ID NO: 22 o 138 o variantes de la misma (véase, por ejemplo, la tabla 4) proporciona una bisagra que tiene las ventajas de una bisagra de IgG2 y la función efectora de bisagras de IgG1.

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra que consiste en o consiste esencialmente en una de las secuencias de la tabla 4, por ejemplo, SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 127-132 y 134-141, y, en ciertas modalidades, no comprende residuos de aminoácidos de bisagra adicionales.

continuación

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra de IgG2 expuesta en la tabla 4, en donde se inserta 1-5, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido entre los residuos de aminoácidos CVE y CPP. En ciertas modalidades, se inserta THT o GGG. En ciertas modalidades, pueden insertarse 1, 1-2 o 1-3 aminoácidos entre la bisagra y el dominio CH2. Por ejemplo, se puede insertar una glicina adicional entre la bisagra y el dominio CH2.

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada es una región constante de IgG1 o IgG2, en donde la bisagra comprende una supresión de 1-10 aminoácidos. Como se muestra en los ejemplos, un anticuerpo IgG1 que carece de los residuos de aminoácidos SCDKTHT (S219, C220, D221, K222, T223, H224 y T225; SEQ ID NO: 149) confería una internalización de CD73 mediada por anticuerpos más eficazmente que el mismo anticuerpo que tenía una región constante de IgG1 de tipo salvaje. De forma similar, en el contexto de un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG2 que carece de los residuos de aminoácido CCVE (C219, C220, V222 y E224) confería una internalización de CD73 mediada por anticuerpos más eficazmente que el mismo anticuerpo que tenía una región constante de IgG1 de tipo salvaje. En consecuencia, se proporciona aquí una región constante de cadena pesada modificada en donde la bisagra comprende una supresión de 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 residuos de aminoácido, seleccionados de los residuos S219, C220, D221, K222, T223, H224 y T225 para un anticuerpo IgG1, y los residuos C219, C220, V222 y E224 para un anticuerpo IgG2.

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 que es un dominio CH1 de tipo salvaje del isotipo IgG1 o IgG2 ("dominio CH1 de IgG1" o "dominio CH1 de IgG2", respectivamente). También pueden usarse dominios CH1 de los isotipos IgG3 e IgG4 ("dominio CH1 de IgG3” y "dominio CH1 de IgG2”, respectivamente). Un dominio CH1 también puede ser una variante de un dominio CH1 de tipo salvaje, por ejemplo, una variante de un dominio CH1 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo salvaje. Los ejemplos de variantes de dominios CH1 incluyen A114C, C131S y/o T173C. Un dominio CH1, por ejemplo, un dominio CH1 de IgG2, puede comprender la sustitución C131S, cuya sustitución confiere a un anticuerpo IgG2 o anticuerpo que tiene un CH1 IgG2 y bisagra la forma (o conformación) B.

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 que es del isotipo IgG2. En ciertas modalidades, el dominio CH1 es dominio de CH1 de IgG2 tipo salvaje, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 7). En ciertas modalidades, el dominio CH1 es una variante de SEQ ID NO: 7 y comprende 1-10, 1-5, 1-2 o 1 sustituciones o supresiones de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 7. Como se describe adicionalmente en los ejemplos, se ha demostrado en la presente que un dominio CH1 de IgG2 o sus variantes confieren propiedades mejoradas a anticuerpos con respecto a anticuerpos IgG1 y propiedades aún más potenciadas cuando los anticuerpos también comprenden una bisagra de IgG2. En ciertas modalidades, las variantes de CH1 de IgG2 no comprenden una sustitución o supresión de aminoácidos en uno o más de los siguientes residuos de aminoácido: C131, R133, E137 y S138, cuyos residuos de aminoácidos se muestran en negrita y subrayados en SEQ ID NO: 7 mostrado anteriormente. Por ejemplo, una región constante de cadena pesada modificada puede comprender un dominio CH1 de IgG2 en donde ninguno R133, E137 y S138 está sustituido con otro aminoácido o están suprimidos o en los que ninguno de C131, R133, E137 y S138 está sustituido con otro aminoácido o están suprimidos. En ciertas modalidades, C131 está sustituido con otro aminoácido, por ejemplo, C131S, cuya sustitución activa el anticuerpo para adoptar la conformación B. Tanto los anticuerpos de conformación A como de conformación B que tienen regiones constantes de cadena pesada modificadas se han demostrado en la presente invención que tienen actividades mejoradas con respecto al mismo anticuerpo con una región constante de IgG1.

En ciertas modalidades, N192 y/o F193 (mostrados como residuos en cursiva y subrayados en SEQ ID NO: 7 mostrada anteriormente) están sustituidos con otro aminoácido, por ejemplo, con los aminoácidos correspondientes en IgG1, es decir, N192S y/o F193L.

En ciertas modalidades, uno o más residuos de aminoácidos de un dominio CH1 de IgG2 están sustituidos con los correspondientes residuos de aminoácidos en IgG4. Por ejemplo, N192 puede ser N192S; F193 puede ser F193L; C131 puede ser C131K; y/o T214 pueden ser T214R.

Un anticuerpo puede comprender una región constante de cadena pesada modificada que comprenda un dominio CH1 de IgG2 o una variante de la misma y una bisagra de IgG2 o variante de la misma. La bisagra y el dominio CH1 pueden ser una combinación de cualquier bisagra IgG2 y dominio CH1 de IgG2 descrito en la presente. En ciertas modalidades, el CH1 de IgG2 y la bisagra comprenden la siguiente secuencia de aminoácidos ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSWFG TQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 133), o una secuencia de aminoácidos que difiere de la misma en un máximo de 1-10 aminoácidos. Las variantes de aminoácidos son como las descritas para los dominios bisagra y CH1 anteriores.

En ciertas modalidades, los anticuerpos comprenden al menos una bisagra de IgG2 y opcionalmente también un dominio CH1 de IgG2 o fragmento o derivado del dominio de bisagra y/o CH1 y el anticuerpo ha adoptado la forma (de conformación) A (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755). En ciertas modalidades, los anticuerpos comprenden al menos una bisagra de IgG2 y opcionalmente también un dominio CH1 de IgG2 o un fragmento o derivado del dominio de bisagra y/o CH1 y el anticuerpo ha adoptado la forma B (véase, por ejemplo, Allen et al (2009) Biochemistry, 48:3755).

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH2 que es un dominio CH2 tipo salvaje del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 ("dominio CH2 de IgG1", "dominio CH2 de IgG2", "dominio CH2 de IgG3" o "dominio CH2 de IgG4", respectivamente. Un dominio CH2 puede ser también una variante de un dominio CH2 tipo salvaje, por ejemplo, una variante de un dominio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 tipo salvaje. Los ejemplos de variantes de dominios CH2 incluyen variantes que modulan la actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CDC o modular la semivida del anticuerpo o su estabilidad. En una modalidad, el dominio CH2 es un dominio CH2 de IgG 1 humana con una mutación A330S y/o P331S, en donde el dominio CH2 tiene una función efectora reducida con relación a la misma mutación de CH2 sin las mutaciones. Un dominio CH2 puede tener una función efectora aumentada. Los dominios CH2 pueden comprender una o más de las siguientes mutaciones: SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF, GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E), y/o una o más mutaciones en los siguientes aminoácidos: E233, G237, P238, H268, P271L328 y A330. Otras mutaciones se exponen adicionalmente aquí en otra parte.

En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH3 que es un dominio CH3 de tipo salvaje del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 ("dominio CH3 de IgG1", "dominio CH3 de IgG2", "dominio CH3 de IgG3" o "dominio CH3 de IgG4", respectivamente. Un dominio CH3 puede ser también una variante de un dominio CH3 de tipo salvaje, por ejemplo, una variante de un dominio CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo salvaje. Los ejemplos de variantes de dominios CH3 incluyen variantes que modulan una actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CDC o modular la semivida del anticuerpo o su estabilidad.

Generalmente, las variantes de los dominios CH1, bisagra, CH2 o CH3 pueden comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones y/o como máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mutación, o 1-10 o 1-5 mutaciones, o comprenden una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico al del correspondiente dominio de tipo salvaje (dominio CH1, bisagra, CH2 o CH3, respectivamente), siempre que la región constante de cadena pesada que contenga la variante específica retenga la actividad biológica necesaria.

La tabla 5 expone regiones constantes de cadena pesada humanas a modo de ejemplo que comprenden un dominio humano CH1, bisagra, CH2 y/o CH3, en donde cada dominio es un dominio de tipo salvaje o una variante del mismo que proporciona la actividad biológica deseada a la región constante de cadena pesada. Una celda no rellena en la tabla 5 indica que el dominio está presente o no, y si está presente puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región constante de cadena pesada 1 de la tabla 5 es un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que comprende al menos una bisagra de IgG2 y que también puede comprender un dominio CH1, CH2 y/o CH3 y si está presente, cuyo dominio CH1, CH2 y/o CH3 es de un isotipo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4. Como otro ejemplo para comprender la tabla 5, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada 8 es un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que comprende un dominio CH1 de IgG1 y una bisagra de IgG2, un dominio CH2 de IgG1 y que puede o no comprender también un dominio CH3, que esté presente, puede ser de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Tabla 5

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En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada mostrada en la tabla 5 tiene una actividad biológica aumentada con relación al mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende esa región constante de cadena pesada específica o con respecto al mismo anticuerpo que comprende una región constante de IgG1.

En ciertas modalidades, un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo que comprende una de bisagra no de IgG2 y/o dominio CH1 no de IgG2 comprende proporcionar un anticuerpo que comprende una bisagra no de IgG2 y/o un dominio CH1 no de IgG2, y sustituyendo la bisagra no de IgG2 y el dominio CH1 no de IgG2 con una bisagra IgG2 y un dominio CH1 de IgG2, respectivamente. Un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada, puede comprender proporcionar un anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada y sustituir su región constante de cadena pesada por una región constante de cadena pesada modificada.

Se proporcionan ejemplos de regiones constantes de cadena pesada modificadas en la tabla 6, que establece la identidad de cada uno de los dominios.

Tabla 6

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En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra de IgG2 que comprende cualquiera del SEQ ID NO: 8, 21,22, 23, 126-132, 134-136 y 137 o una variante de la misma, tal como una IgG2 que comprende una secuencia de aminoácidos que (i) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 y 137 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido; (ii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21,22, 23, 126-132, 134-136 y 137 en al menos 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (iii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21,22, 23, 126-132, 134-136 y 137 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácido, y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 o 137, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en donde la región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada con relación a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no de IgG2 o relativa a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no de IgG2.

En ciertas modalidades, una bisagra comprende una secuencia que es una variante de cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 y 137, en donde R217 (segundo aminoácido en la bisagra de IgG2 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 8) no es suprimido o sustituido con otro aminoácido. En ciertas modalidades en las que una bisagra es una variante de cualquiera de los SEQ ID NO: 8, 21,22, 23, 126-132, 134-136 y 137, la bisagra tiene una rigidez que es similar a la de IgG2 de tipo salvaje.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH1 de IgG1 que comprende SEQ ID NO: 2 o un dominio CH1 de IgG2 que comprende s Eq ID NO: 7, o una variante de SEQ ID NO: 2 o 7, cuya variante (i) difiere de SEQ ID NO: 2 o 7 en 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (ii) difiere de SEQ ID NO: 2 o 7 en al menos 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (iii) difiere de SEQ ID NO: 2 o 7 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 2 o 7, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora de aminoácidos o una sustitución no conservadora de aminoácidos; y en donde la región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada con relación a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no de IgG2 o relativa a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no de IgG2.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH2 de IgG1 que comprende SEQ ID NO: 4 o 24, o una variante de SEQ ID NO: 4 o 24, cuya variante (i) difiere de SEQ ID NO: 4 o 24 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (ii) difiere de SEQ ID NO: 4 o 24 en al menos 5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (iii) difiere de SEQ ID NO: 4 o 24 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 4 o 24, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora de aminoácidos o una sustitución no conservadora de aminoácido; y en donde la región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada con relación a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no de IgG2 o relativa a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no de IgG2.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH3 de IgG1 que comprende SEQ ID NO: 5, o una variante de SEQ ID NO: 5, cuya variante (i) difiere de SEQ ID NO: 5 en 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (ii) difiere de SEQ ID NO: 5 en al menos 5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (iii) difiere de SEQ ID NO: 5 en 1-5, 1 3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 5, en donde en cualquiera de (i) a (iv) una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora de aminoácidos o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en donde la región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad biológica mejorada con relación a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no de IgG2 o relativa a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no de IgG2.

Las regiones constantes de cadena pesada modificadas también pueden comprender una combinación de los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 descritos anteriormente.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente o una variante de una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente, cuya variante (i) difiere de una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente en 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (ii) difiere de una región constante de cadena pesada modificada descrita aquí en como mucho 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (iii) difiere de una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente en 1-5, 1-3, 1 2, 2-5, 3-5, 1-10 o 5-10 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente, en donde, en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en donde la región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada con relación a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no de IgG2 o relativa a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no de IgG2.

En ciertas modalidades, un anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168 o una variante de cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168, cuya variante (i) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168 en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (ii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168 en un máximo de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos; (iii) difiere de cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168 en 1-5, 13, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 o 5-10 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de los SEQ ID NO: 26-37, 54-56, 78-125 y 152-168, donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en donde la región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada con relación a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra no de IgG2 o relativa a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra no de IgG2.

Las regiones constantes de cadena pesada modificadas pueden tener (i) función efectora similar, reducida o aumentada (por ejemplo, unión a un FcyR) con relación a una región constante de cadena pesada de tipo salvaje y (ii) semivida similar, reducida o aumentada (o unión al receptor FcRn) con respecto a una región constante de cadena pesada de tipo salvaje.

II. Anticuerpos con regiones constantes de cadena pesada modificadas y antígenos objetivo de los mismos

Las regiones modificadas de la cadena pesada pueden usarse en una amplia gama de anticuerpos, tales como anticuerpos que requieren internalización (por ejemplo, anticuerpos conjugados de fármacos (ADC) y anticuerpos anti-CD73), actividad agonista (por ejemplo, anticuerpos que son eficaces en la modulación de respuestas inmunitarias, por ejemplo, en el estímulo de la activación de células T, tales como anticuerpos agonistas anti-GITR), actividad antagonista (por ejemplo, anticuerpos que inhiben o bloquean una proteína que inhibe una respuesta inmune, por ejemplo, activación de células T, tal como un anticuerpo antagonista de PD-1), ADCC, transducción de señales o actividad antitumoral. Por ejemplo, la internalización de un receptor inhibidor de la superficie celular puede limitar su capacidad de interactuar con su(s) receptor(es) y disminuir la(s) función(es) celular(es).

En una modalidad, los anticuerpos que comprenden un dominio constante de cadena pesada modificado son anticuerpos que requieren su internalización para la actividad (por ejemplo, anticuerpos que son específicos para receptores de superficie celular), por ejemplo, induciendo endocitosis mediada por receptor cuando se unen a la superficie celular. Tales anticuerpos se pueden usar como vehículos para la administración dirigida de fármacos, toxinas, enzimas o ADN para aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, es deseable aumentar las propiedades de internalización de estos anticuerpos. Los anticuerpos a modo de ejemplo que pueden beneficiarse de la internalización eficaz son conjugados de fármacos de anticuerpo. Se conocen en la técnica y se describen aquí varios ensayos para medir las propiedades de internalización de un anticuerpo. Estos ensayos utilizan, por ejemplo, una amplia gama de colorantes para el marcaje de anticuerpos que pueden usarse en ensayos basados en lavado o inactivación para supervisar la internalización. La internalización de anticuerpos también puede supervisarse en ensayos sin lavado que se basan en marcadores fluorescentes.

En una modalidad, los anticuerpos que comprenden un dominio constante de cadena pesada modificada son anticuerpos que requieren la internalización del antígeno al que se unen, por ejemplo, una molécula de superficie celular, tal como un receptor o un ligando, para la actividad. Por lo tanto, los anticuerpos contra las proteínas de superficie celular que requieren una regulación negativa para la actividad biológica (por ejemplo, terapéutica) pueden usar una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente.

En ciertas modalidades, los anticuerpos que comprenden un dominio constante de cadena pesada modificada se unen a moléculas de superficie celular y agonizan o antagonizan la actividad biológica de la molécula de superficie celular, por ejemplo, una molécula de superficie celular en una célula inmune, por ejemplo, una célula T, célula Teff, célula Th1, célula Th2, célula T CD4+, célula T CD8+, célula Treg, célula dendrítica, macrófago, monocito, célula de Langerhans, célula NK, célula supresora derivada de mieloide, célula B o cualquier otra célula inmune. La molécula de la superficie celular puede ser una molécula estimuladora, por ejemplo co-estimuladora (por ejemplo, GITR, OX40, CD137, CD40, ICOS y otros miembros de la familia TNFR), y el anticuerpo puede estimular adicionalmente la actividad (un anticuerpo agonista) o el anticuerpo puede inhibir la actividad (un anticuerpo antagonista). La molécula de la superficie celular puede ser una molécula inhibidora (por ejemplo, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TlM-3) y el anticuerpo puede estimular adicionalmente la actividad (un anticuerpo agonista) o el anticuerpo puede inhibir la actividad (un anticuerpo antagonista).

En ciertas modalidades, los anticuerpos que comprenden un dominio constante de cadena pesada modificada son anticuerpos agonistas de moléculas estimuladoras (o co-estimuladoras) que, por ejemplo, potencian el sistema inmune de un sujeto, por ejemplo, induciendo la secreción de IL-2 y/o IFN-y A partir de células T (por ejemplo, anticuerpos anti-GITR). Se ha demostrado que otros anticuerpos agonistas activan APC, promueven respuestas de células T antitumorales y/o fomentan células mieloides citotóxicas con el potencial de controlar el cáncer en ausencia de inmunidad de células T. Los anticuerpos agonistas de las moléculas estimuladoras son diferentes de los anticuerpos antagonistas de las moléculas inhibidoras, que bloquean el punto de control inmune negativo tal como anti-CTLA-4 o anti-PD-1. La actividad agonista, tal como la proliferación de células T, se puede medir usando varios métodos conocidos en la técnica.

En ciertas modalidades, los anticuerpos que comprenden un dominio constante de cadena pesada modificada son anticuerpos antagonistas de inhibidores de punto de control que refuerzan la respuesta inmune de un sujeto bloqueando o inhibiendo un punto de control inmunológico negativo, tales como anticuerpos anti-CTLA-4 o anti-PD-1, por ejemplo, que se dirigen al receptor inhibidor expresado en células T activadas. La actividad antagonista, tal como la inhibición de la proliferación de células T, se puede medir usando varios métodos conocidos en la técnica.

En una modalidad, el anticuerpo es (i) un agonista de un receptor co-estimulador o (ii) un antagonista de una señal inhibidora sobre, por ejemplo, células T, las cuales pueden dar como resultado la amplificación de respuestas de células T específicas de antígeno (reguladores de punto de control inmune). En ciertas modalidades, un anticuerpo es (i) un antagonista de un receptor co-estimulador o (ii) un agonista de una señal inhibidora, por ejemplo, en células T. La mayoría de las moléculas co-estimuladoras y co-inhibidoras son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF), y los anticuerpos que tienen regiones constantes de cadena pesada modificadas pueden unirse a cualquiera de ellos. Una familia importante de ligandos unidos a membrana que se unen a receptores co-estimuladores o co inhibidores es la familia B7, que incluye B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2 ), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) y B7-H6, y los anticuerpos que tienen regiones constantes de cadena pesada modificadas pueden unirse a cualquiera de ellos. Otra familia de ligandos unidos a membrana que se unen a receptores co-estimuladores o co-inhibidores es la familia de moléculas de TNF que se unen a miembros de la familia del receptor TNF (TNFR), que incluyen CD40 y CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTa, LTp, LTpR, linfotoxina a1p2, FAS, FASL (CD178), DR3 (TNFRSF25), RELT, DR6, TROY, NGFR (véase, por ejemplo, Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1). Por lo tanto, los anticuerpos descritos en la presente pueden unirse a cualquiera de estas moléculas superficiales, y pueden ser, por ejemplo, (i) agonistas o antagonistas (o inhibidores o agentes bloqueantes) de proteínas de la familia IgSF o la familia B7 o la familia TNFR que inhiben activación de células T o antagonistas de citocinas que inhiben la activación de células T (por ejemplo, iL-6, IL-10, TGF-p, VEGF; “citocinas inmunosupresoras") y/o (ii) agonistas o antagonistas de receptores estimulantes de la familia IgSF, familia B7 o la familia de TNF o de citocinas que estimulan la activación de células T, para modular, por ejemplo, estimular, una respuesta inmune, por ejemplo, para tratar enfermedades proliferativas, tales como cáncer.

Por consiguiente, puede usarse un anticuerpo con un dominio constante de cadena pesada modificada como uno de los siguientes agentes:

(1) Un agonista de una proteína que estimula, por ejemplo, la activación de células T, tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 o CD28H; o

(2) Un antagonista (inhibidor o agente bloqueante) de una proteína que inhibe la activación de células T (por ejemplo, inhibidores de punto de control inmunológico), tal como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 y LAG-3, como se ha descrito anteriormente, y cualquiera de las siguientes proteínas: TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, TIM-1, TIM-4, CD39.

Otros anticuerpos incluyen antagonistas de receptores inhibidores sobre células NK y agonistas de receptores activadores en células NK, por ejemplo, KIR, TIGIT, NKG2A.

Generalmente, los anticuerpos que pueden beneficiarse de una región constante de cadena pesada modificada incluyen, por ejemplo, anticuerpos agonistas que ligan receptores coestimuladores positivos, anticuerpos de bloqueo que atenúan la señalización a través de receptores inhibidores, anticuerpos antagonistas y anticuerpos que aumentan de manera sistémica la frecuencia de células T antitumorales, anticuerpos que superan distintas vías inmunosupresoras dentro del microambiente tumoral (por ejemplo, bloquean la interacción del receptor inhibidor (por ejemplo, interacciones PD-L1/PD-1), agotan o inhiben Tregs (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-CD25, inhiben enzimas metabólicas tales como IDO, o revierten/previenen la anergia o agotamiento de las células T) y anticuerpos que desencadenan la activación inmune innata y/o la inflamación en los sitios tumorales. Una mayor internalización de los receptores inhibidores puede traducirse en un nivel inferior de un inhibidor potencial.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada es un anticuerpo que está conjugado con un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado, tal como un conjugado de fármaco y anticuerpo (ADC), cuyo inmunoconjugado requiere internalización para su actividad. En un ADC, el anticuerpo funciona como un agente de direccionamiento para dirigir el ADC a una célula objetivo que expresa su antígeno, tal como un antígeno en una célula cancerosa. En este caso, el antígeno puede ser un antígeno asociado a un tumor, es decir, uno que está expresado de forma exclusiva o sobreexpresado por la célula cancerosa. Una vez allí, el fármaco se libera, ya sea dentro de la célula objetivo o en su cercanía, para actuar como un agente terapéutico. Para una revisión sobre el mecanismo de acción y uso de ADCs en la terapia del cáncer, véase Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147.

Para el tratamiento del cáncer, el agente terapéutico o fármaco de un ADC preferiblemente es un fármaco citotóxico que causa la muerte de la célula cancerosa dirigida. Los fármacos citotóxicos que pueden usarse en ADCs incluyen los siguientes tipos de compuestos y sus análogos y derivados:

(a) enediinas tales como calicheamicina (véase, por ejemplo, Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 y 3466) y uncialamicina (véase, por ejemplo, Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007) y Chowdari et al., US 8.709.431 B2 (2012));

(b) tubulisinas (véase, por ejemplo, Domling et al., US 7.778.814 B2 (2010), Cheng et al., US 8.394.922 B2 (2013) y Cong et al., US 2014/0227295 A1;

(c) CC-1065 y duocarmicina (véase, por ejemplo, Boger, US 6.5458.530 B1 (2003), Sufi et al., US 8.461.117 B2 (2013) y Zhang et al., US 2012/0301490 A1 2012));

(d) epotilonas (véase, por ejemplo, Vite et al., US 2007/0275904 A1 (2007) y US RE42930 E (2011));

(e) auristatinas (véase, por ejemplo, Senter et al., US 6.844.869 b2 (2005) y Doronina et al., US 7.498.298 B2 (2009));

(f) dímeros de pirrolobezodiazepina (PBD) (véase, por ejemplo, Howard et al., US 2013/0059800 A1 (2013), US 2013/0028919 A1 (2013) y WO 2013/041606 A1 (2013)); y

(g) maitansinoides tales como DM1 y DM4 (véase, por ejemplo, Chari et al., US 5.208.020 (1993) y Amphlett et al., US 7.374.762 B2 (2008)).

En ADC, el anticuerpo y el agente terapéutico pueden conjugarse a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador escindible, tal como un enlazador de peptidilo, disulfuro o hidrazona. Por ejemplo, el enlazador puede ser un enlazador de peptidilo tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser o Glu. Los ADC pueden prepararse como se describe en las patentes de los Estados Unidos N.° 7.087.600; 6.989.452; y 7.129.261; Publicaciones de PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; y WO 08/103693; Publicaciones de patentes de los Estados Unidos 20060024317; 20060004081; y 20060247295.

Los ejemplos de objetivos de ADC que pueden mejorarse con una región constante de cadena pesada modificada incluyen B7H4 (Korman et al., US 2009/0074660 A1); CD19 (Rao-Naik et al., 8.097.703 B2); CD22 (King et al., US 2010/0143368 A1); CD30 (Keler et al., US 7.387.776 B2 (2008), CD70 (Terrett et al., US 8.124.738 B2), CTLA-4 (Korman et al., US 6.984.720 B1 (2006)), PD-1 (Korman et al., US 8.008.449 B2 (2011), PSMA (Huang et al., US 2009/0297438 A1 y Cardarelli et al., US 7.875.278 B2), PTK7 (Terrett et al., US 2010/0034826 A1), glipicano-3 (Terrett et al., US 2010/0209432 (A1)), RG1 (Harkins et al., US 7.335.748 B2 (2008)); mesotelina (Terrett et al., US 8.268.970 B2 (2012)); y CD44 (Xu et al., US 2010/0092484 A1).

III. Métodos para potenciar la actividad biológica de anticuerpos

Se describen aquí métodos para potenciar la actividad biológica de ciertos anticuerpos, tales como la una o más de las siguientes actividades biológicas:

(a) internalización aumentada o alterada por una célula;

(b) actividad agonista aumentada o alterada;

(c) actividad antagonista o bloqueadora aumentada o alterada;

(d) ADCC mejorada;

(d) generación de una nueva propiedad;

(e) transducción de señal aumentada o alterada;

(f) formación de complejos anticuerpo/antígeno reticulados más grandes;

(h) aumento de la estimulación o mejora de una respuesta inmune; y/o

(i) aumento de la inhibición de una respuesta inmune.

Un método para aumentar una actividad biológica de un anticuerpo puede comprender reemplazar la región constante de cadena pesada o una porción de la misma, por ejemplo, el dominio de bisagra y/o CH1, con una región constante de cadena pesada modificada o porción de la misma, por ejemplo, una bisagra de IgG2 y/o el dominio CH1 de IgG2.

En ciertas modalidades, un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo comprende (i) proporcionar un anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada como se describe en la presente; y (ii) reemplazar la región constante de la cadena pesada del anticuerpo con una región constante de cadena pesada modificada, o una porción de la misma, que mejora la actividad biológica del anticuerpo. En ciertas modalidades, un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo comprende (i) proporcionar un anticuerpo que comprende una bisagra no de IgG2 (por ejemplo, una bisagra de IgG 1, una bisagra de IgG3 o una bisagra de IgG4); y (ii) reemplazar la bisagra no de IgG2 del anticuerpo con una bisagra de IgG2. En ciertas modalidades, un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo comprende (i) proporcionar un anticuerpo que comprende una bisagra de IgG2 no potenciadora; y (ii) reemplazar la bisagra de IgG2 no potenciadora del anticuerpo con una bisagra de IgG2. Una "bisagra de IgG2 no potenciadora" es una bisagra de IgG2 variante que difiere de una bisagra de IgG2 de tal manera que ya no tiene la característica requerida para potenciar la actividad biológica de un anticuerpo, por ejemplo, una bisagra variante que ya no tiene la rigidez de una bisagra de IgG2 tipo salvaje.

Los ejemplos de métodos para aumentar la actividad biológica de un anticuerpo comprenden (i) proporcionar un anticuerpo que comprende una bisagra no de IgG2 o una bisagra de IgG2 no potenciadora, y (ii) reemplazar la bisagra por una bisagra que comprenda los SEQ ID NO: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 o 137 o sus variantes, por ejemplo, las variantes aquí descritas. Los métodos para aumentar la actividad biológica de un anticuerpo pueden comprender también (i) proporcionar un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no es una región constante de cadena pesada modificada, y (ii) reemplazar la región constante de cadena pesada por una región constante de cadena pesada modificada. El reemplazo de la región constante de cadena pesada puede comprender la sustitución del dominio CH1, bisagra, CH2 y/o CH3. Por ejemplo, puede modificarse una región constante de cadena pesada, sustituyendo la bisagra por una bisagra o variante de IgG2, y/o reemplazando el dominio CH1 por un dominio CH1 de IgG1 o IgG2 o una variante del mismo. En ciertas modalidades, la bisagra se reemplaza con una bisagra de IgG2 y el dominio CH2 se reemplaza con un dominio CH2 de IgG1. En ciertas modalidades, la bisagra se reemplaza con una bisagra de IgG2 y el dominio CH3 se reemplaza con un dominio CH3 de IgG1. En ciertas modalidades, la bisagra se reemplaza con una bisagra de IgG2, se sustituye CH1 por una bisagra de IgG2, se sustituye el dominio CH2 por un dominio CH2 de IgG1 y se sustituye el dominio CH3 por un dominio CH3 de IgG1. En ciertas modalidades, una región constante de cadena pesada se reemplaza con las regiones de cadena pesada modificadas 1-27 expuestas en la tabla 5 anterior o las regiones constantes de cadena pesada expuestas en la tabla 6 o descritas en la presente.

También se proporcionan aquí métodos para aumentar la actividad biológica de un anticuerpo IgG1 o IgG2, que comprenden suprimir 1-10 aminoácidos en la bisagra del anticuerpo IgG1 o IgG2, respectivamente. Por ejemplo, se pueden eliminar uno o más de los aminoácidos S219, C22, D221, K222, T223, H224 y T225. En una modalidad, se eliminan todos los aminoácidos S219, C22, D221, K222, T223, H224 y T225.

El reemplazo de la región constante de la cadena pesada de un anticuerpo para mejorar su actividad biológica preferiblemente no está acompañado por una reducción o una reducción significativa de su actividad de unión al antígeno objetivo. Como se describe en los ejemplos, la sustitución de la región constante de cadena pesada de anticuerpos anti-GITR y anti-CD73 no cambió significativamente su afinidad por los antígenos GITR humano y CD73 humano, respectivamente.

Se entenderá que cuando se hace referencia a la sustitución de un dominio de un isotipo específico con el mismo dominio de un isotipo diferente, no es necesario reemplazar literalmente el dominio, sino que solo puede ser necesario cambiar los aminoácidos que son diferentes entre los dos isotipos.

Se conocen en la técnica ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos frente a un antígeno de diversas especies y se describen adicionalmente en la presente e incluyen, por ejemplo, ELISAs, transferencias de Western y RIAs. Los ensayos adecuados se describen en detalle en los ejemplos. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como por análisis RPS BIACORE®. Los ensayos para evaluar las propiedades de anticuerpos que tienen regiones constantes modificadas (por ejemplo, unión al ligando, proliferación de células T, producción de citocinas) se describen con mayor detalle a continuación y en los ejemplos.

Los ejemplos de anticuerpos que pueden modificarse como se describen aquí incluyen, por ejemplo, anticuerpos para tratar el cáncer, tales como: Yervoy™ (ipilimumab) o Tremelimumab (contra CTLA-4), galiximab (contra B7.1), BMS-936558 (contra PD-1), CT-011 (contra PD-1), MK-3475 (contra PD-1), AMP224 (contra B7DC), BMS-936559 (contra B7-H1), MPDL3280A (contra B7-H1), MEDI-570 (contra ICOS), AMG557 (contra B7H2), MGA271 (contra B7H3), IMP321 (contra LAG-3), BMS-663513 (contra CD137), PF-05082566 (contra CD137), CDX-1127 (contra CD27), anti-OX40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (contra OX40L), Atacicept (contra TACI), CP-870893 (contra CD40), Lucatumumab (contra CD40), Dacetuzumab (contra CD40), Muromonab-CD3 (contra CD3), Ipilumumab (contra CTLA-4).

Otros anticuerpos que pueden modificarse como se describe en la presente incluyen anticuerpos antagonistas de PD-1 y PD-L1. Un ejemplo de anticuerpo anti-PD-1 que puede modificarse como se describe en la presente es nivolumab (BMS-936558); un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de uno de los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 y 4A11 descritos en el documento WO 2006/121168; MK-3475 (Lambrolizumab) descrito en el documento WO2012/145493; AMP-514 descrito en el documento WO 2012/145493; CT-011 (Pidilizumab, anteriormente CT-AcTibody o BAT, véase, por ejemplo, Rosenblatt et al., (2011) J. Immunotherapy 34:409); los descritos en los documentos WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, WO2013/173223, patentes de los Estados Unidos N.° 7.635.757 y 8.217.149 y la Publicación de Patente de los Estados Unidos N.° 2009/0317368.

Otros anticuerpos que pueden modificarse incluyen anticuerpos anti-PD-L1, por ejemplo, BMS-936559 (denominado 12A4 en el documento WO 2007/005874 y la patente de los Estados Unidos N.° 7.943.743); un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4, que se describen en la publicación de PCT WO 07/005874 y en la patente de los Estados Unidos N.° 7.943.743; MEDI4736 (también conocido como Anti-B7-H1); MPDL3280A (también conocido como RG7446); cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 desvelados en los documentos WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/145493, patentes de los Estados Unidos N.° 7.635.757 y 8.217.149 y la Publicación de los Estados Unidos N.° 2009/145493.

Otros anticuerpos que pueden modificarse incluyen anticuerpos anti-CTLA-4, por ejemplo, Yervoy™ (ipilimumab o anticuerpo 10D1, descrito en la publicación de PCT WO 01/14424); tremelimumab (anteriormente ticilimumab, CP-675.206); anticuerpo monoclonal o un anti-CTLA-4 descrito en cualquiera de las siguientes publicaciones: WO 98/42752; WO 00/37504; patente de los Estados Unidos N.° 6,207,156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95 (17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22 (145): Resumen N.° 2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304; y cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en el documento WO2013/173223.

Otros anticuerpos que pueden modificarse incluyen anticuerpos anti-LAG-3, por ejemplo, BMS-986016; IMP731 descrito en el documento US 2011/007023; e IMP-321.

Otros anticuerpos que pueden modificarse incluyen anticuerpos agonistas anti-GITR, por ejemplo, el anticuerpo anti-GITR 6C8 o versiones humanizadas de los mismos, descritos en el documento WO2006/105021; un anticuerpo descrito en el documento WO2011/028683; y un anticuerpo descrito en el documento JP2008278814.

También pueden modificarse los anticuerpos que se dirigen a otros antígenos, incluyendo los descritos en otra parte de la presente. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Her2 que requieren internalización, por ejemplo, trastuzumab (Herceptin), se pueden modificar como se describe en la presente.

IV. Modificaciones adicionales del dominio constante de la cadena pesada

Además de las modificaciones aquí descritas a los anticuerpos para mejorar su actividad biológica, se pueden hacer otras mutaciones, por ejemplo, en el dominio CH1, bisagra, CH2 o CH3, para efectuar, por ejemplo, la función efectora, la unión a FcyRs o la estabilidad de los anticuerpos.

Fcs y Fcs modificados

Los anticuerpos descritos en la presente pueden comprender un Fc que comprende una o más modificaciones, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como semivida del suero, fijación del complemento, unión al receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Por ejemplo, se pueden hacer modificaciones en la región Fc con el fin de generar una variante de Fc con (a) aumento o disminución de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), (b) citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) aumentada o disminuida, (c) afinidad aumentada o disminuida para C1q y/o (d) afinidad aumentada o disminuida para un receptor Fc con respecto a Fc de origen. Tales variantes de la región Fc comprenderán generalmente al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc. Se cree que la combinación de modificaciones de aminoácidos es particularmente deseable. Por ejemplo, la región Fc variante puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc sustituciones en el mismo, por ejemplo, de las posiciones específicas de la región Fc identificadas aquí. Se describen aquí ejemplos de variantes de secuencia Fc, y también se proporcionan en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; Publicaciones de patente de PCT WO 00/42072; WO 01/58957; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 y WO 06/020114.

Reducción de la función efectora

La actividad ADCC puede reducirse modificando la región Fc. En ciertas modalidades, los sitios que afectan a la unión a receptores Fc pueden ser eliminados (por ejemplo, por mutación), preferiblemente sitios distintos de los sitios de unión al receptor de recuperación. En otras modalidades, una región Fc puede modificarse para eliminar un sitio ADCC. Los sitios ADCC son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Sarmay et al., (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633 9 con respecto a los sitios ADCC en IgG1. En una modalidad, la variante G236R y L328R de IgG1 humana elimina eficazmente la unión a FcyR. Horton et al. (2011) J. Immunol. 186: 4223 y Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926. En otras modalidades, el Fc que tiene una unión reducida a FcyRs comprende las sustituciones de aminoácidos L234A, L235E y G237A. Gross et al. (2001) Immunity 15: 289.

La actividad de CDC también se puede reducir modificando la región Fc. Las mutaciones en las posiciones D270, K322, P329 y P331 de IgG1, específicamente las mutaciones de alanina D270A, K322A, P329A y P331A, reducen significativamente la capacidad del anticuerpo correspondiente para unirse a C1q y activar el complemento. Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 16:4178; WO 99/51642. Se ha demostrado que la modificación de la posición 331 de IgG 1 (por ejemplo, P331S) reduce la unión del complemento. Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 661 y Canfield y Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483. En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácidos 231 a 239 se alteran para reducir de este modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Documento WO 94/29351.

En algunas modalidades, la Fc con fijación de complemento reducida tiene las sustituciones de aminoácidos A330S y P331S. Gross et al. (2001) Immunity 15:289.

Para usos en los que se ha de evitar por completo la función efectora, por ejemplo, cuando la unión del antígeno sola sea suficiente para generar el beneficio terapéutico deseado y la función efectora solo conduzca a (o aumente el riesgo de) efectos secundarios no deseados, pueden usarse anticuerpos IgG4 o pueden contemplarse anticuerpos o fragmentos que carecen de la región Fc o una porción sustancial de la misma, o la Fc puede ser mutada para eliminar por completo la glucosilación (por ejemplo, N297A). Como alternativa, se ha generado una construcción híbrida de IgG2 humana (dominio Ch1 y región bisagra) e IgG4 humana (dominios Ch2 y Ch3) que carece de función efectora, que carece de la capacidad de unirse a los FcyRs (como IgG2) e incapaz de activar el complemento (como IgG4). Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25: 1256. Véase también Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34: 441; Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Inmunol. 20: 479 (que analiza las modificaciones de Fc para reducir la función efectora en general).

En otras modalidades, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un resto de aminoácido diferente para reducir todas las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad disminuida para un ligando efector pero retenga la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc (residuos 234, 235, 236, 237, 297) o el componente C1 del complemento (residuos 297, 318, 320, 322). Patentes de los Estados Unidos N.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.

El documento WO 88/007089 propuso modificaciones en la región Fc de IgG para disminuir la unión a FcyRI para disminuir ADCC (234A; 235E; 236A; G237A) o bloquear la unión al componente del complemento C1q para eliminar CDC (E318A o V/K320A y K322A/Q). Véase también Duncan y Winter (1988) Nature 332:563; Chappel et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 88:9036; y Sondermann et al. (2000) Nature 406:267 (que describen los efectos de estas mutaciones en la unión a FcyRIII).

Las modificaciones de Fc que reducen la función efectora también incluyen sustituciones, inserciones y supresiones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 y 328, tales como 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L y 328R. Una variante Fc puede comprender 236R/328R. Otras modificaciones para reducir las interacciones de FcyR y complemento incluyen las sustituciones 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228p, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P y 234V. Estas y otras modificaciones se revisan en Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20: 685-691. Las funciones efectoras (ADCC y activación del complemento) pueden reducirse, manteniendo la unión a FcR neonatal (manteniendo la semivida), mutando residuos de IgG en una o más de las posiciones 233-236 y 327-331, tales como E233P, L234V, L235A, opcionalmente G236A, A327G, A330S y P331S en IgG1; E233P, F234V, L235A, opcionalmente G236A en IgG4; y A330S y P331S en IgG2. Véase Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613; documento WO 99/58572. Otras mutaciones que reducen la función efectora incluyen L234A y L235A en IgG 1 (Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537); V234A y G237A en IgG2 (Cole et al., (1997) J. Immunol. 159: 3613, véase también la patente de los Estados Unidos N.° 5.834.597); y S228P y L235E para IgG4 (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925). Otra combinación de mutaciones para reducir la función efectora en una IgG1 humana incluyen L234F, L235E y P331S. Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700. Ver generalmente Labrijn et al., (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479. Las mutaciones adicionales que se ha descubierto que disminuyen la función efectora en el contexto de una proteína de fusión Fc (IgG1) (abatacept) son C226S, C229S y P238S (numeración de residuos de la UE). Davis et al. (2007) J. Immunol. 34:2204.

Otras variantes de Fc que tienen ADCC y/o CDC reducidos se describen en Glaesner et al. (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287 (F234A y L235A para disminuir ADCC y ADCP en una IgG4); Hutchins et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92:11980 (F234A, G237A y E318A en una IgG4); An et al., (2009) MAbs 1:572 y publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2007/0148167 (H268Q, V309L, A330s y P331S en una IgG2); McEarchern et al. (2007) Blood 109:1185 (C226S, C229S, E233P, L234V, L235A en una IgG1); Vafa et al. (2014) Methods 65: 114 (V234V, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S en una IgG2).

En ciertas modalidades, se elige un Fc que tiene esencialmente ninguna función efectora, es decir, que tiene unión a FcyRs reducida y unión a complemento reducida. Un ejemplo de Fc, por ejemplo, IgG1 Fc, que no tiene efector comprende las cinco mutaciones siguientes: L234A, L235E, G237A, A330s y P331S. Gross et al. (2001) Immunity 15: 289. Estas cinco sustituciones pueden combinarse con N297A para eliminar la glucosilación también.

Mejora de la función efectora

Como alternativa, la actividad ADCC puede incrementarse modificando la región Fc. Con respecto a la actividad ADCC, IgG 1 > IgG3 >> IgG4 > IgG2 humana, por lo que un dominio constante IgG 1, en lugar de una IgG2 o IgG4, podría elegirse para su uso en un fármaco en donde se desea ADCC. Como alternativa, la región Fc puede modificarse para aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad para un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 o 439. Véase documento WO 2012/142515; véase también documento WO 00/42072. Los ejemplos de sustituciones incluyen 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D y 332E. Los ejemplos de variantes incluyen 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T y 267E/268F/324T. Por ejemplo, se ha demostrado que las IgGIFcs humanas que comprenden la variante G236A, que pueden combinarse opcionalmente con I332E, aumentan la relación de afinidad de unión de FcyNA/FcyNB aproximadamente 15 veces. Richards et al. (2008) Mol. Cáncer Therap. 7: 2517; Moore et al. (2010) mAbs 2:181. Otras modificaciones para potenciar las interacciones de FcyR y complemento incluyen, pero no se limitan a, las sustituciones 298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305I y 396L. Estas y otras modificaciones se revisan en Strohl (2009) Current Opinión in Biotechnology 20:685-691. Específicamente, tanto ADCC como CDC pueden ser mejorados por cambios en la posición E333 de IgG1, por ejemplo, E333A. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591. El uso de mutaciones P247I y A339D/Q para mejorar la función efectora en una IgG1 se describe en el documento WO 2006/020114 y D280H, K290S ± S298D/V se describe en el documento WO 2004/074455. Se ha demostrado que las variantes K326A/W y E333A/S aumentan la función efectora en IgG1 humana y E333S en IgG2. Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166: 2571.

Específicamente, se han mapeado los sitios de unión en IgG 1 humana para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn, y se han descrito variantes con unión mejorada. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604. Se demostró que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcyRIII, incluyendo los mutantes de combinación T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A (que tienen una unión de FcYRIIIa y actividad ADCC mejoradas). Se han identificado otras variantes de IgG 1 con unión fuertemente reforzada a FcYRIIIa, incluyendo variantes con mutaciones S239D/I332E y S239D/I332E/A330L que mostraron el mayor incremento en afinidad por FcYRIIIa, una disminución en la unión a FcYRIIb y una fuerte actividad citotóxica en monos cynomolgus. Lazar et al., (2006) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Blood 115: 1204; Desjarlais y Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278. La introducción de las mutaciones triples en anticuerpos como alemtuzumab (específico de CD52), trastuzumab (específico de HER2/neu), rituximab (específico de CD20) y cetuximab (específico de EGFR) se tradujeron en una actividad de ADCC enormemente aumentada in vitro, y la variante S239D/I332E mostró una mayor capacidad para agotar las células B en monos. Lazar et al., (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005. Además, se han identificado mutantes de IgG1 que contienen mutaciones de L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L que exhibieron una unión mejorada a FcYRIIIa y actividad de ADCC concomitantemente aumentada en ratones transgénicos que expresan FcYRIIIa humano en modelos de tumores malignos de células B y cáncer de mama. Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67: 8882; patente de los Estados Unidos N.° 8.652.466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123.

Diferentes isotipos de IgG también presentan actividad CDC diferencial (IgG3>IgG1>>IgG2==IgG4). Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989. Para usos en los que se desea CDC mejorado, también es posible introducir mutaciones que aumentan la unión a C1q. La capacidad de reclutar complemento (CDC) puede potenciarse mediante mutaciones en K326 y/o E333 en una IgG2, como K326W (que reduce la actividad ADCC) y e 333S, para aumentar la unión a C1q, el primer componente de la cascada del complemento. Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166: 2571. La introducción de S267E/H268F/S324T (solo o en cualquier combinación) en IgG1 humana mejora la unión de C1q. Moore et al. (2010) mAbs 2:181. La región Fc del anticuerpo de isotipo híbrido IgG1/IgG3 "113F" de Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863 (figura 1 en la misma) también confiere CDC mejorado. Véase también Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70: 553 y Redpath et al. (1998) Immunology 93:595.

Se describen mutaciones adicionales que pueden aumentar o disminuir la función efectora en Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129. Véase también Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol.

20:460.

También se pueden usar variantes de Fc que aumentan la afinidad para el receptor inhibidor FcyRIIb, por ejemplo, para potenciar la actividad inductora de la apoptosis o la actividad adyuvante. Li y Ravetch (2011) Science 333:1030; ^{Li y Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci}(U^sA) ^{109: 10966; publicación de la solicitud de la patente de los Estados}Unidos 2014/0010812. Tales variantes pueden proporcionar un anticuerpo con actividades inmunomoduladoras relacionadas con las células FcyRllb+, incluyendo, por ejemplo, células B y monocitos. En una modalidad, las variantes Fc proporcionan afinidad selectivamente mejorada a FcyRllb con relación a uno o más receptores activadores. Las modificaciones para alterar la unión a FcyRllb incluyen una o más modificaciones en una posición seleccionada del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 y 332, de acuerdo con el índice de EU. Los ejemplos de sustituciones para potenciar la afinidad de FcyRllb incluyen, pero no se limitan a, 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y y 332E. Los ejemplos de sustituciones incluyen 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W y 328Y. Otras variantes de Fc para mejorar la unión a FcyRllb incluyen 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E y 267E/328F. Específicamente, las variantes S267E, G236D, S239D, L328F e I332E, incluyendo la variante doble S267E L328F, de IgG1 humana son de particular valor en mejorar específicamente la afinidad por el receptor inhibidor FcyRllb. Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; publicación de patente de los Estados Unidos 2006/024298; documento WO 2012/087928. Se puede obtener una especificidad mejorada para FcYRIIb (a diferencia de FcYRIIaR131) añadiendo la sustitución P238D. Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26: 589; documento Wo 2012/115241.

Glucosilación

La glucosilación de un anticuerpo se modifica para aumentar o disminuir la función efectora. Por ejemplo, puede hacerse un anticuerpo aglucosilado que carece de toda la función efectora mediante la mutación del residuo de asparagina conservado en la posición 297 (por ejemplo, N297A), suprimiendo así el complemento y la unión a FcyRI. Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 403. Véase también Tao y Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595 (usando N297Q en IgG1 para eliminar la glucosilación en la posición 297).

Aunque los anticuerpos aglucosilados generalmente carecen de la función efectora, pueden introducirse mutaciones para restaurar esa función. Los anticuerpos aglucosilados, por ejemplo, los que resultan de mutaciones N297A/C/D/o H o producidos en sistemas (por ejemplo, E. coli) que no glucosilan proteínas, pueden ser mutados adicionalmente para restaurar la unión a FcyR, por ejemplo, S298G y/o T299A/G/o H (documento WO 2009/079242), o E382V y M428I (Jung et al., (2010) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 107: 604).

Adicionalmente, un anticuerpo con ADCC mejorado puede hacerse alterando la glucosilación. Por ejemplo, se ha demostrado que la eliminación de fucosa de los oligosacáridos unidos a Asn297 de cadena pesada mejora ADCC, basándose en una unión mejorada a FcYRIIIa. Shields et al. (2002) JBC 277:26733; Niwa et al. (2005) J. Immunol. Methods 306:151; Cardarelli et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15:3376 (MDX-1401); Cardarelli et al. (2010) Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX-1342). Tales anticuerpos de baja fucosa pueden producirse, por ejemplo, en células de ovario de hámster chino (CHO) que carecen de fucosiltransferasa (FUT8) (Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol., Bioeng. 87: 614), o en otras células que generan anticuerpos afucosilados. Véase, por ejemplo, Zhang et al. (2011) mAbs 3:289 y Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210 (ambos describen la producción de anticuerpos en Pichia pastoris glucosilada); Mossner et al. (2010) Blood 115:4393; Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466; documento EP 1176195B1. ADCC también puede mejorarse como se describe en la publicación de PCT WO 03/035835, que describe el uso de una variante de la línea celular CHO, Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos unidos a Asn (297), dando también como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Como alternativa, se pueden añadir análogos de fucosa al medio de cultivo durante la producción de anticuerpos para inhibir la incorporación de fucosa en el carbohidrato del anticuerpo. Documento WO 2009/135181.

El aumento de las estructuras de GlcNac en bisección en los oligosacáridos unidos a anticuerpos también mejora la ADCC. La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al., describe líneas celulares modificadas genéticamente para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas genéticamente presentan estructuras aumentadas de GlcNac en bisección que da lugar a una actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

Se han desarrollado variantes de glucosilación adicionales que carecen de residuos de galactosa, ácido siálico, fucosa y xilosa (denominadas glucoformas GNGN), que exhiben ADCC y ADCP mejoradas, pero CDC disminuida, así como otros que carecen de ácido siálico, fucosa y xilosa (denominadas glucoformas G1/G2), que exhiben ADCC, ADCP y CDC mejoradas. La publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2013/0149300. Los anticuerpos que tienen estos patrones de glucosilación se producen opcionalmente en plantas de N. benthamiana modificadas genéticamente en las que se han eliminado los genes endógenos de xilosil y fucosil transferasa.

La glucoingeniería también puede usarse para modificar las propiedades antiinflamatorias de una construcción de IgG cambiando el contenido de a2,6 sialilo de las cadenas de carbohidratos unidas a Asn297 de las regiones Fc, donde una proporción aumentada de formas a2,6 sialiladas da como resultado un aumento de efectos anti-inflamatorios. Véase Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26: 513. Por el contrario, la reducción de la proporción de anticuerpos que tienen carbohidratos a2,6 sialilados puede ser útil en los casos en que no se desean propiedades anti-inflamatorias. Los métodos para modificar el contenido de a2,6 sialilación de anticuerpos, por ejemplo, por purificación selectiva de formas a2,6 sialiladas o por modificación enzimática, se proporcionan en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2008/0206246. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos de la región Fc puede modificarse para imitar el efecto de a2,6 sialilación, por ejemplo, mediante la inclusión de una modificación F241A. Documento WO 2013/095966.

Los anticuerpos descritos en la presente pueden contener uno o más sitios de glucosilación en la región variable de cadena ligera o pesada. Tales sitios de glucosilación pueden dar como resultado una inmunogenicidad aumentada del anticuerpo o una alteración del pK del anticuerpo debido a la unión alterada del antígeno (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala y Morrison (2004) J. Immunol 172: 5489-94, Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109, Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R, Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. 2000) Mol Immunol 37: 697-706). Se ha sabido que la glucosilación se produce en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T.

Semivida biológica

En ciertas modalidades, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, esto puede hacerse aumentando la afinidad de unión de la región Fc para FcRn. En una modalidad, el anticuerpo se altera dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión al receptor de recuperación tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al. Otros ejemplos de variantes Fc que aumentan la unión a FcRn y/o mejoran sus propiedades farmacocinéticas incluyen sustituciones en las posiciones 259, 308 y 434, incluyendo, por ejemplo, 259i, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y y 434M. Otras variantes que aumentan la unión de Fc a FcRn incluyen: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279 (8):6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 311A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001,276 (9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Del' Acqua et al., Journal of Immunology, 2002, 169: 5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). Véase la patente de los Estados Unidos N.° 8,367,805.

Se ha propuesto la modificación de ciertos residuos conservados en Fc de IgG (I253/H310/Q311/H433/N434), como la variante N434A (Yeung et al., (2009) J. Immunol. 182:7663) como una forma de aumentar la afinidad de FcRn, aumentando así la semivida del anticuerpo en circulación. Documento WO 98/023289. Se ha demostrado que la variante de Fc de combinación que comprende M428L y N434S aumenta la unión a FcRn y aumenta la semivida en suero hasta cinco veces. Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28: 157. La variante Fc de combinación que comprende las modificaciones de T307A, E380A y N434A también extiende la semivida de los anticuerpos IgG 1. Petkova et al. (2006) Int. Inmunol. 18:1759. Además, también se ha demostrado que las variantes de Fc de combinación que comprenden variantes M252Y/M428L, M428L/N434H, M428L/N434F, M428L/N434Y, M428L/N434A, M428L/N434M y M428L/N434S prolongan la semivida. Documento WO 2009/086320.

Además, una variante de Fc de combinación que comprende M252Y, S254T y T256E, aumenta la semivida casi 4 veces. Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514. Se ha usado una modificación de IgG 1 relacionada que proporciona una afinidad incrementada de FcRn pero una dependencia de pH reducida (M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F) para crear una construcción IgG 1 ("MST-HN Abdeg") para su uso como competidor para prevenir la unión de otros anticuerpos contra FcRn, dando como resultado una eliminación incrementada de ese otro anticuerpo, ya sea IgG endógena (por ejemplo, en una situación autoinmune) u otro mAb exógeno (terapéutico). Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283; documento WO 2006/130834.

Otras modificaciones para aumentar la unión a FcRn se describen en Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671; documentos 6.277.375; 6.821.505; WO 97/34631; WO 2002/060919.

En ciertas modalidades, pueden usarse isotipos de IgG híbridos para aumentar la unión de FcRn y potencialmente aumentar la semivida. Por ejemplo, se puede construir una variante híbrida IgG1/IgG3 sustituyendo las posiciones IgG 1 en la región CH2 y/o CH3 con los aminoácidos de IgG3 en posiciones en las que los dos isotipos difieren. Por lo tanto, se puede construir un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R y 436F. En otras modalidades descritas en la presente, puede construirse una variante híbrida IgG1/IgG2 sustituyendo las posiciones de IgG2 en la región CH2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG 1 en posiciones en las que los dos isotipos difieren. Así, puede construirse un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 233E, 234L, 235L, -236G (que se refiere a una inserción de una glicina en la posición 236) y 327A. Véase la patente de los Estados Unidos N.° 8.629.113. Se ha generado un híbrido de secuencias de IgG1/IgG2/IgG4 que supuestamente aumenta la semivida en suero y mejora la expresión. Patente de los Estados Unidos N.° 7.867.491 (número de secuencia 18 en la misma).

La semivida en suero de los anticuerpos de la presente invención también puede aumentarse por pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con un reactivo de polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Tal como se usa en la presente, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi (C1-C10) o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo a ser pegilado es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos descritos en la presente. Véase, por ejemplo, documentos EP 0154316 de Nishimura et al. y EP 0401384 de Ishikawa et al.

Como alternativa, en algunas circunstancias puede ser deseable disminuir la semivida de un anticuerpo de la presente invención, en lugar de aumentarla. Modificaciones tales como I253A (Hornick et al., (2000) J. Nucl. Med. 41:355) y H435A/R I253A o H310A (Kim et al., (2000) Eur. J. Immunol. 29: 2819) en Fc de la IgG 1 humana puede disminuir la unión a FcRn, disminuyendo así la semivida (disminuyendo el aclaramiento) para su uso en situaciones en las que se prefiere un aclaramiento rápido, tal como imagenología médica. Véase también Kenanova et al. (2005) Cancer Res.

65:622. Otros medios para mejorar el aclaramiento incluyen el formateo de los dominios de unión al antígeno de la presente invención como fragmentos de anticuerpo que carecen de la capacidad para unirse a FcRn, tales como fragmentos Fab. Tal modificación puede reducir la semivida circulante de un anticuerpo de un par de semanas a una cuestión de horas. La P E G ila c ió n selectiva de fragm entos de anticuerpo puede u sarse entonces para afinar (aumentar) la sem ivida de los fragm entos de anticuerpo si es necesario. C hapm an et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17 : 780. Los fragm entos de anticuerpo también se pueden fusionar a albúm ina de suero humano, por ejemplo, en una construcción de proteína de fusión, para aum entar la sem ivida. Y e h et al. (1992) Proc. Nat'lAcad. Sci. 89: 1904. Com o alternativa, se puede construir un anticuerpo biespecífico con un primer dominio de unión a antígeno de la presente invención y un segundo dominio de unión a antígeno que se une a albúm ina de suero hum ano (H SA). V é a s e publicación de solicitud de patente internacional W O 2009 /127691 y las referencias de patentes citadas en la m ism a. Com o alternativa, pueden añadirse se cu e n cias de polipéptidos esp ecia lizado s a fragm entos de anticuerpo para aum entar la sem ivida, por ejemplo, se cu e n cias de polipéptido "XTEN ". Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27 :1186 ; publicación de solicitud de patente internacional W O 2010 /091122.

Estabilidad

Un potencial sitio de escisión de proteasa en la bisagra de construcciones de Ig G 1 puede elim inarse mediante m odificaciones de D 221 G y K 222 S , aum entando la estabilidad del anticuerpo. Docum ento W O 2014 /043344.

En ciertas m odalidades, los anticuerpos descritos en la presente no contienen sitios isom éricos de asparag ina. La desam idación de la asparag ina puede producirse en se cu e n cias N -G o D -G y puede dar como resultado la creación de un residuo de ácido isoaspártico que puede introducir una curvatura en la cadena polipeptídica y puede dism inuir su estabilidad (efecto de ácido isoaspártico).

C a d a anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pI), que generalm ente cae en el intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pI para un anticuerpo Ig G 1 normalmente ca e dentro del intervalo de pH de 7 -9 ,5 y el pI para un anticuerpo IgG4 norm alm ente cae dentro del intervalo de pH de 6-8. S e esp ecu la que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal pueden tener cierto despliegue e inestabilidad bajo condiciones in vivo. Por lo tanto, se prefiere tener un anticuerpo que contiene un valor pI que ca e en el intervalo normal. Esto puede co nseguirse seleccio nando anticuerpos con un pI en el intervalo normal o mediante la mutación de residuos de superficie cargados.

C a d a anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, con una temperatura de fusión m ás alta indicando una m ayor estabilidad global in vivo (Krishnam urthy R y M anning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3 :361 -71) . G eneralm ente, se prefiere que la T mi (la tem peratura de despliegue inicial) se a m ayor de 60 °C , preferiblemente m ayor de 65 °C , incluso m ás preferiblemente m ayor de 70 °C . El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir usando calorim etría de exploración diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-60 , G hirlando et al (1999) Immunol Lett 68 :47-52) o dicroísm o circular (Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci. 40: 343 - 9).

En una m odalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidam ente. La degradación de un anticuerpo se puede medir usando electroforesis capilar (C E ) y M A LD I-M S (Alexander A J y Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626 -32).

C u an d o se usa un dominio constante de IgG 4, es usualm ente preferible incluir la sustitución S 228 P , que imita la se cu en cia de bisagra en IgG 1 y estabiliza de este modo las m oléculas de IgG 4, por ejemplo, reduciendo el intercambio de ram as de Fab entre el anticuerpo terapéutico y la Ig G 4 endógena en el paciente que se está tratando. Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27 :767 ; R eddy et al. (2000) J. Immunol. 16 :1925. De forma sim ilar, en los anticuerpos que contienen bisagra Ig G 2, una mutación C 219 S y/o C 220 S estabiliza el anticuerpo que com prende una bisagra de Ig G 2. Agregación

En otra m odalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación m ínim os, que pueden conducir al desencadenam iento de una respuesta inm une ind eseada y/o propiedades farm acocinéticas alteradas o desfavorables. Generalm ente, los anticuerpos son aceptables con agregación de 25 % o m enos, preferiblemente 20 % o m enos, incluso m ás preferiblemente 15 % o m enos, aún m ás preferiblemente 10 % o m enos e incluso m ás preferiblemente 5 % o m enos. La agregación puede m edirse m ediante va ria s técnicas, incluyendo la colum na de exclusión por tam año (S E C ), la crom atografía líquida de alto rendimiento (H P L C ) y la dispersión de la luz.

V. Proteínas no anticuerpo y derivados de anticuerpos

La invención descrita en la presente también puede aplicarse a m oléculas que no sean anticuerpos de longitud completa, siem pre que com prendan una bisagra. Por ejemplo, pueden prepararse proteínas de fusión de IgG con una actividad biológica m ejorada. Por consiguiente, se proporcionan en la presente proteínas de fusión que com prenden un resto activo unido, por ejemplo, unido covalentem ente, a una región constante de IgG, por ejemplo, una región Fc, que com prende una bisagra de Ig G 2 y opcionalm ente un dominio C H 2 y C H 3 o porciones de los m ism os. El F c puede se r cualquier F c de una región constante de cadena pesada m odificada descrita en la presente, tal como las porciones F c de las regiones constantes de cadena pesada m odificada expuestas en las tablas 5 y 6.

Los anticuerpos descritos en la presente también pueden u sarse para formar m oléculas b iespecíficas. Un anticuerpo, o porciones de unión a antígeno del mismo, puede derivatizarse o ligarse a otra m olécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de enlace o moléculas objetivo. Los anticuerpos descritos en la presente invención pueden derivatizarse o ligarse a más de una molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas objetivo; también se pretende que tales moléculas multiespecíficas estén englobadas por la expresión "molécula biespecífica" tal como se usa en la presente. Para crear una molécula biespecífica, un anticuerpo descrito en la presente puede estar funcionalmente unido (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de tal manera que resulta una molécula biespecífica.

VI. Composiciones

Se proporcionan además composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que contienen una o una combinación de anticuerpos, o porción(es) de unión a antígeno de las mismas, descritas aquí, formuladas junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir una o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas descritas en la presente. Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en la presente puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o bispecíficos) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias.

En ciertas modalidades, una composición comprende un anticuerpo descrito en la presente en una concentración de al menos 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml o 100-300 mg/ml.

Las composiciones farmacéuticas descritas aquí también se pueden administrar en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo descrito en la presente combinado con al menos otro agente anticanceroso y/o estimulante de células T (por ejemplo, activador). Se describen ejemplos de agentes terapéuticos que pueden usarse en terapia de combinación con mayor detalle a continuación en la sección sobre usos de los anticuerpos descritos en la presente.

En algunas modalidades, las composiciones terapéuticas descritas aquí pueden incluir otros compuestos, fármacos y/o agentes usados para el tratamiento del cáncer. Tales compuestos, fármacos y/o agentes pueden incluir, por ejemplo, fármacos de quimioterapia, fármacos de moléculas pequeñas o anticuerpos que estimulan la respuesta inmune a un cáncer dado. En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más de un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anti-OX40 (también conocido como CD134, TNFRSF4, ACT35 y/o TXGP1L), o un anticuerpo anti-LAG-3.

Como se usa en la presente, “vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, se puede recubrir en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos descritos aquí pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte efectos toxicológicos no deseados (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como los ácidos clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica descrita aquí también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas descritas aquí incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización, mencionados anteriormente, como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenólico de sodio y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por microfiltración por esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada previamente esterilizada.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material vehículo para producir una única forma de dosificación será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, de un cien por ciento, esta cantidad oscilará entre aproximadamente 0,01 por ciento y aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 por ciento y aproximadamente 70 por ciento, lo más preferiblemente entre aproximadamente 1 por ciento y aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas en el tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente adecuado formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación tal como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación descritas en la presente está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se ha de conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de componer tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Para la administración del anticuerpo, la dosificación oscila entre aproximadamente 0,0001 y 100 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a seis meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo descrito en la presente incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, administrándose el anticuerpo usando uno de los siguientes esquemas de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, después cada tres meses; ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguidos de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo se administra generalmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sanguíneos de anticuerpo contra el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración de anticuerpo plasmático de aproximadamente 1-1000 |jg/ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 |jg/ml.

Se puede administrar un anticuerpo como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más larga, seguida de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosis y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de diversos factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares descritas aquí empleadas, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, edad, sexo, peso, condición, estado general de salud y antecedentes médicos previos del paciente tratado, y factores similares bien conocido en las técnicas médicas.

Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo descrito en la presente preferentemente da como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los periodos libres de síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o discapacidad debido a la afección de la enfermedad. En el contexto del cáncer, una dosis terapéuticamente eficaz previene preferiblemente el deterioro adicional de los síntomas físicos asociados con el cáncer. Los síntomas del cáncer son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, características de lunares inusuales, un cambio en la apariencia de un lunar, incluyendo asimetría, borde, color y/o diámetro, una zona de piel nuevamente pigmentada, un lunar anómala, área oscurecida debajo de la uña, bultos en el pecho, cambios del pezón, quistes del pecho, dolor del pecho, muerte, pérdida de peso, debilidad, fatiga excesiva, dificultad para comer, pérdida del apetito, tos crónica, empeoramiento de la dificultad para respirar, tos con sangre, sangre en la orina, sangre en las heces, náuseas, vómitos, metástasis del hígado, metástasis pulmonares, metástasis óseas, plenitud abdominal, hinchazón, líquido en la cavidad peritoneal, hemorragia vaginal, estreñimiento, distensión abdominal, perforación del colon, peritonitis aguda (infección, fiebre, dolor), dolor, vómitos, sudoración abundante, fiebre, hipertensión arterial, anemia, diarrea, ictericia, mareos, escalofríos, espasmos musculares, metástasis de colon, metástasis pulmonares, metástasis de la vejiga, metástasis hepáticas, metástasis óseas, metástasis renales y metástasis pancreáticas, dificultad para tragar y similares.

Una dosis terapéuticamente eficaz puede prevenir o retardar el comienzo del cáncer, tal como se desee cuando se presentan signos tempranos o precoces de la enfermedad. Las pruebas de laboratorio utilizadas en el diagnóstico de cáncer incluyen químicas, hematología, serología y radiología. Por consiguiente, cualquier ensayo clínico o bioquímico que supervise cualquiera de los anteriores puede usarse para determinar si un tratamiento particular es una dosis terapéuticamente eficaz para tratar el cáncer. Un experto en la técnica podría determinar tales cantidades basadas en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición o vía de administración particular seleccionada.

Una composición descrita en la presente puede administrarse mediante una o más vías de administración usando uno o más de varios métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos descritos en la presente incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión “administración parenteral”, tal como se usa en la presente, significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbitaria, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

Como alternativa, un anticuerpo descrito en la presente puede administrarse por vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica descrita en la presente puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos para uso con anticuerpos descritos en la presente incluyen: patente de los Estados Unidos N.° 4.487.603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; patente de los Estados Unidos N.° 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; patente de los Estados Unidos N.° 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para suministrar medicación a una velocidad de infusión precisa; patente de los Estados Unidos N.° 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; patente de los Estados Unidos N.° 4.439.196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la patente de los Estados Unidos N.° 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármaco osmótico. Muchos otros tales implantes, sistemas de suministro y módulos son conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente pueden formularse para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos descritos aquí atraviesan la BHE (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así el suministro dirigido de fármacos (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los ejemplos de porciones de orientación incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos N.° 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140, M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor tensioactivo de la proteína A (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol, 1233:134); p120 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. ^{Laukkanen (1994) f} E^bS ^Lett. ^{346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.}

VII. Usos y métodos

Los anticuerpos, composiciones de anticuerpos y métodos descritos en la presente tienen numerosas utilidades in vitro e in vivo que implican, por ejemplo, el tratamiento de diversos trastornos, por ejemplo, cánceres. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en la presente pueden administrarse a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a seres humanos, por ejemplo, in vivo. Por consiguiente, se proporcionan aquí métodos de tratamiento de un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada, de manera que se produce el tratamiento. También se proporcionan en la presente métodos para modificar una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo de manera que se modifique la respuesta inmune en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta se mejora, se estimula o se regula. Sin embargo, en otras modalidades, se inhibe una respuesta inmune.

Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos en los que sería deseable una estimulación de una respuesta inmune. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno que puede ser tratado aumentando una respuesta inmune (por ejemplo, la respuesta inmune mediada por células T). En una modalidad particular, los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento del cáncer in vivo. En una modalidad, el sujeto es un sujeto vehículo de tumor y se estimula una respuesta inmune contra el tumor. Un tumor puede ser un tumor sólido o un tumor líquido, por ejemplo, una neoplasia maligna hematológica. En ciertas modalidades, un tumor es un tumor inmunogénico. En ciertas modalidades, un tumor es no inmunogénico. En ciertas modalidades, un tumor es PD-L1 positivo. En ciertas modalidades un tumor es PD-L1 negativo. Un sujeto también puede ser un sujeto vehículo de virus y se estimula una respuesta inmune contra el virus.

También se desvelan métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo descrito en la presente, de tal manera que el crecimiento del tumor se inhiba en el sujeto. También se desvelan métodos para tratar una infección vírica en un sujeto que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo descrito en la presente, de modo que la infección vírica se trate en el sujeto.

También se incluyen aquí métodos para el agotamiento de células Treg del microambiente tumoral de un sujeto que tiene un tumor, por ejemplo, tumor canceroso, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo descrito en la presente que comprende un Fc que estimula el agotamiento de células Treg en el microambiente tumoral. Un Fc puede, por ejemplo, ser un Fc con función efectora o función efectora mejorada, tal como unión o que tiene una unión mejorada a uno o más receptores Fc activadores.

En ciertas modalidades, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada se une a una molécula estimuladora e inhibe su actividad, es decir, es un antagonista de una molécula estimuladora, o el anticuerpo se une a una molécula inhibidora y estimula su actividad, es decir, es un agonista de una molécula inhibidora. Tales anticuerpos pueden usarse para tratar una enfermedad en la que el sistema inmunitario o una respuesta inmune debe ser regulada negativamente, por ejemplo, enfermedades autoinmunes o para prevenir rechazos de trasplantes.

Cáncer

Se desvelan aquí métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprenden administrar al anticuerpo sujeto descrito en la presente, de manera que el sujeto se trate, por ejemplo, de manera que el crecimiento de tumores cancerosos se inhiba o se reduzca y/o que los tumores remitan. Por ejemplo, la activación de GITR por anticuerpos anti-GITR puede mejorar la respuesta inmune a células cancerosas en el paciente. El anticuerpo puede usarse solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, el anticuerpo se puede usar junto con otro agente, por ejemplo, otros agentes inmunogénicos, tratamientos de cáncer convencionales u otros anticuerpos, como se describe más adelante.

Los cánceres cuyo crecimiento se puede inhibir usando los anticuerpos descritos aquí incluyen cánceres que responden normalmente a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de cánceres para tratamiento incluyen carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón no microcítico escamoso (NSCLC), no NSCLC, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñon (por ejemplo, carcinoma de células renales (RCC)), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cáncer de cuello uterino, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer (o carcinoma) de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, sarcoma pediátrico, asesino natural sinonasal, melanoma (por ejemplo, melanoma metastásico maligno, tal como melanoma maligno cutáneo o intraocular), cáncer de hueso, cáncer de piel, cáncer uterino, cáncer de la región anal, cáncer testicular, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos por el ambiente, incluyendo aquellos inducidos por amianto, cánceres relacionados con virus (por ejemplo, tumor relacionado con el virus del papiloma humano (HPV)) y neoplasias hematológicas derivadas ya sea de los dos linajes de células hemáticas principales, es decir, la línea de células mieloides (que produce granulocitos, eritrocitos, trombocitos, macrófagos y mastocitos) o una línea celular linfoide (que produce células B, T, NK y células plasmáticas), tales como todos los tipos de luekemias, linfomas y mielomas, por ejemplo, leucemias agudas, crónicas, linfocíticas y/o mielógenas, tales como leucemia aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia mielógena crónica (LMC), LMA indiferenciada (M0), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; con maduración celular), leucemia promielocítica (M3 o variante de M3 [M3V]), leucemia mielomonocítica (M4 o variante de M4 con eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico aislado y cloroma; linfomas, tales como linfoma de Hodgkin (LH), linfoma no Hodgkin (LNH), linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma linfoplasmocitoide, linfoma monocitoide de células B, tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), linfoma anaplásico, (por ejemplo, Ki 1+) de células grandes, linfoma/leucemia de células T adultas, linfoma de células del manto, linfoma de células T angioinmunoblástico, linfoma angiocéntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastínico primario, linfoma linfoblástico T precursor, linfoblástico T; y linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma de células T periférico, linfoma linfoblástico, trastorno linfoproliferativo postrasplante, linfoma histiocítico verdadero, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (LHD), linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma cutáneo de células T (LCCT) (también llamado micosis fungoide o síndrome de Sezary) y linfoma linfoplasmocitocítico (LPL) con macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tales como mieloma de IgG, mieloma de cadena ligera, mieloma no secretor, mieloma pauciblástico (también llamado mieloma indolente), plasmocitoma solitario y mielomas múltiples, leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma de células pilosas; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, schwannomas; tumores de origen mesenquimal, incluyendo fibrosarcoma, rabdomioscaroma y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de la tiroides y teratocarcinoma, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo, tumores de células T y células B, incluyendo, pero sin limitarse a, trastornos de células T tales como leucemia T-prolinfocítica (T-PLL), incluyendo el tipo de célula pequeña y cerebriforme; leucemia de linfocitos granulares grandes (LGL) preferiblemente del tipo de células T; linfoma hepatoesplénico a/d T-NHL; linfoma de células T periférico/post-tímico (subtipos pleomórfico e inmunoblástico); linfoma de células T angiocéntrico (nasal); cáncer de cabeza o cuello, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de la glándula tiroides; linfoma mieloide agudo, así como cualquier combinación de dichos cánceres. Los métodos descritos en la presente también pueden usarse para el tratamiento de cánceres metastásicos, cánceres refractarios (por ejemplo, cánceres refractarios a inmunoterapia previa, por ejemplo, con un anticuerpo bloqueante CTLA-4 o PD-1) y cánceres recurrentes.

Terapias combinadas

Además de las terapias desveladas anteriormente, los anticuerpos descritos en la presente también pueden usarse en combinación con otra terapia. Por ejemplo, para el tratamiento del cáncer, se puede administrar un anticuerpo descrito en la presente a un sujeto que también esté recibiendo otro tratamiento para el cáncer, tal como quimioterapia, radiación, cirugía o terapia génica.

Los métodos de tratamiento pueden incluir la coadministración de un anticuerpo descrito en la presente (por ejemplo, un anticuerpo antagonista, un anticuerpo agonista y ADC que tiene una región constante de cadena pesada modificada) con otra molécula, por ejemplo, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo antagonista, un anticuerpo agonista y ADC). Un anticuerpo descrito en la presente que estimula el sistema inmune puede administrarse con otra molécula que estimula el sistema inmune, por ejemplo, una molécula que es un agonista de una molécula co estimuladora o un inhibidor de una molécula inhibidora.

Un anticuerpo tal como se describe aquí solo o con uno o más anticuerpos estimulantes inmunes adicionales (por ejemplo, bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3) se puede combinar con tratamientos convencionales de cáncer. Por ejemplo, un anticuerpo descrito aquí solo o con uno o más anticuerpos adicionales puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente divulgación (Mokyr et al. (1998) Cáncer Research 58:5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es una combinación de un anticuerpo descrito en la presente, con o sin y un anticuerpo adicional, además en combinación con decarbazina o IL-2 para el tratamiento de melanoma.

Un anticuerpo descrito en la presente puede combinarse con un anticuerpo antineoplásico, tal como Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), Zevalin® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab ), Avastin® (bevacizumab) y Tarceva® (erlotinib), y similares. Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden combinar con uno o más de los siguientes agentes quimioterapéuticos: camptotecina (CPT-11), 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino, doxorrubicina, irinotecán, paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, paclitaxel, carboplatino-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5-fu, o camptotecina apo2I/TRAIL (un combo 6X)); un inhibidor de proteasoma (por ejemplo, bortezomib o MG132); un inhibidor de Bcl-2 (por ejemplo, BH3I-2' (inhibidor de bcl-xl), inhibidor de indolamina dioxigenasa-1 (IDO1) (por ejemplo, INCB24360), At -101 (derivado R-(-)-gossipol), ABT-263 (molécula pequeña), antagonistas de GX-15-070 (obatoclax) o MCL-1 (proteína 1 de diferenciación de células de leucemia mieloide), antagonistas de iAP (inhibidor de la proteína de apoptosis) (por ejemplo, smac7, smac4, mimético de molécula pequeña smac, péptidos smac sintéticos (véase Fulda et al., Nat Med 2002; 8:808-15), ISIS23722 (LY2181308) o Ae G-35156 (Ge M-640)), inhibidores de HDAC (histona desacetilasa), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), inhibidores de la angiogénesis (por ejemplo, bevacizumab), agentes antiangiogénicos dirigidos a VEGF y VEGFR (por ejemplo, Avastin), triterpenoides sintéticos (véase Hyer et al., Cancer Research 2005; 65:4799-808), moduladores de c-FLIP (proteína inhibidora de FLICE celular) (por ejemplo, ligandos naturales y sintéticos de PPARy (receptor activado por proliferador de peroxisoma y), 5809354 o 5569100), inhibidores de cinasa (por ejemplo, Sorafenib), Trastuzumab, Cetuximab, Temsirolimus, inhibidores de mTOR tales como rapamicina y temsirolimus, bortezomib, inhibidores de JAK2, inhibidores de HSP90, inhibidores de PI3K-AKT, inhibidores de la lenalildomida, GSK3p, inhibidores de IAP y/o fármacos genotóxicos.

Los anticuerpos y terapias de anticuerpos combinados descritos en la presente pueden usarse además en combinación con uno o más agentes citotóxicos antiproliferativos. Las clases de compuestos que pueden usarse como agentes citotóxicos antiproliferativos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:

Agentes alquilantes (incluyendo, sin limitación, mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (CYTOXAN™) fosfamida, melfalán, clorambucilo, pipobromán, trietilenmelamina, trietilentiofosforamina, busulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina, dacarbazina y temozolomida.

Antimetbolitos (incluyendo, sin limitación, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa): metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina.

Los agentes antiproliferativos adecuados para la combinación con anticuerpos descritos aquí, sin limitación, taxanos, paclitaxel (paclitaxel está disponible comercialmente como TAXOL™), docetaxel, discodermolida (DDM), dictiostatina (DCT), Pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona Bl, [17]-deshidrodesoxiepotilona B, [18] deshidrodesoxiepotilonas B, C12,13-ciclopropil-epotilona A, epotilona A con enlace C6-C8, trans-9,10-deshidroepotilona D, cis-9,10-deshidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discoderomólido, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (discodermólido), TZT-1027 (soblidotin), iLx -651 (clorhidrato de tasidotin), halicondrina B, mesilato de eribulina (E-7389), hemiasterlina (HTI-286), E-7974, cirptoficinas, LY-355703, inmunoconjugados maitansinoides (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobin, 17beta-acetoxi-2-etoxi-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)trien-3-ol, ciclostreptina, isolaulimalida, laulimalida, 4-epi-7-deshidroxi-14,16-didesmetil-(+)-discodermólidos y criptotilona 1, además de otros agentes estabilizadores de microtubulina conocidos en la técnica.

Los tratamientos combinados se pueden administrar simultánea o secuencialmente. En ciertos ejemplos, las combinaciones son combinaciones de dosis fijas.

En los casos en los que sea deseable hacer que las células proliferativas aberrantemente permanezcan inactivas en conjunto con o antes del tratamiento con los anticuerpos descritos en la presente, hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos), tales como 17a-etinilestradiol, dietilestilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de dromostanolona, testolactona, megestrolacetato, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesterona, leuprolida, flutamida, toremifeno, ZOLADEX™, pueden también ser administrados al paciente. Cuando se emplean los métodos o composiciones descritos en la presente, pueden administrarse también otros agentes usados en la modulación del crecimiento tumoral o metástasis en un entorno clínico, tales como antimiméticos.

Los métodos para la administración segura y eficaz de agentes quimioterapéuticos son conocidos por los expertos en la técnica. Además, su administración se describe en la bibliografía convencional. Por ejemplo, la administración de muchos de los agentes quimioterapéuticos se describe en el Physicians' Desk Reference (PDR), por ejemplo, en la edición de 1996 (Medical Economics Company, Montvale, N.J.07645-1742, Estados Unidos).

El o los agentes quimioterapéuticos y/o radioterapia pueden administrarse según protocolos terapéuticos bien conocidos en la técnica. Será evidente para los expertos en la técnica que la administración del o de los agentes quimioterapéuticos y/o terapia de radiación puede variarse dependiendo de la enfermedad que se esté tratando y de los efectos conocidos del o de los agentes quimioterapéuticos y/o radioterapia en esa enfermedad. Además, de acuerdo con los conocimientos del médico experto, los protocolos terapéuticos (por ejemplo, las cantidades de dosificación y los tiempos de administración) se pueden variar en vista de los efectos observados de los agentes terapéuticos administrados sobre el paciente y en vista de las respuestas observadas de la enfermedad a los agentes terapéuticos administrados.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitaciones adicionales. En particular, se describen en la presente las descripciones de las publicaciones de PCT WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546, WO 09/054863 y PCT/US2013/072918 y la publicación de patente de los Estados Unidos N.° 2011/0150892.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Internalización mejorada de anticuerpos anti-CD73 con una bisagra de IgG2 con respecto a los mismos anticuerpos con una bisagra no de IgG2

Se ha observado que el anticuerpo anti-CD73 11F11 derivado de hibridoma, que tiene una región constante de IgG2, es más potente en ensayos de inhibición de células CD73 que el anticuerpo 11F11 como IgG1 o IgG 1.1 (IgG1 sin efecto), y más potente que otros anticuerpos anti-CD73 que tienen regiones constantes de IgG 1. Con base al menos en esta observación, se planteó la hipótesis de que el aumento de la actividad inhibidora de los anticuerpos anti-CD73 que tienen bisagras de IgG2 con respecto a las que tienen bisagras no de IgG2, tales como bisagras de IgG1, se debió a una mayor internalización de los anticuerpos. Para probar esta hipótesis, se ensayaron anticuerpos anti-CD73 que tenían regiones constantes de IgG 1 o IgG2 o porciones de los mismos en ensayos de internalización.

Los anticuerpos que se usaron se enumeran en la tabla 7, que proporciona las identidades de cada uno de los dominios de las regiones constantes (todos humanos) de cada anticuerpo, incluyendo mutaciones específicas si están presentes.

Tabla 7

Los anticuerpos se hicieron expresando las cadenas pesadas y ligeras en células HEK293-6E, y los medios de cultivo se recogieron 5 días después de la transfección.

Se midió la unión de las construcciones a FcyRs. Los datos de unión de hCD64 y hCD32a-H131 para las moléculas IgG1.1 e IgG2 fueron consistentes con los valores esperados para los diferentes Fcs. IgG1.1f es el Fc más inerte. IgG2 e IgG2-C219S mostraron una unión a FcR típica para IgG2. Como se esperaba, los datos de IgG2-C219S-G1.1f sugieren una unión significativamente más débil que la IgG1 o IgG2 de tipo salvaje, pero unión aumentada en comparación con IgG1.1f.

La afinidad de los anticuerpos para CD73 humano se midió para determinar si el cambio de la región constante los afecta. Las afinidades se determinaron por resonancia de plasmón superficial (RPS) como sigue. La cinética de unión de CD73 y la afinidad se estudiaron mediante resonancia de plasmón superficial (RPS) usando un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25 °C. Este experimento probó la unión del dominio N-terminal de hCD73 (que consistía en los residuos 26-336 de CD73 humano, denominado N-hCD73) a anticuerpos que se capturaron en superficies de proteína A inmovilizadas. Para estos experimentos, se inmovilizó la proteína A (Pierce) a una densidad de 3000-4000 UR en las celdas de flujo 1-4 de un chip sensor CM5 (GE Healthcare) usando química convencional de etil(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS), con bloqueo de etanolamina en un tampón de ejecución de HEPe S 0,01 M a pH 7.4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tween 20 al 0,005 % v/v. Los experimentos cinéticos se realizaron capturando primero anticuerpos (5-10 ug/ml) en las superficies de la proteína A usando un tiempo de contacto de 30 s a 10 ul/min, con unión de 600, 200, 66,7, 22,2, 7,4 y 2,5 nM de N-hCD73-his, usando un tiempo de asociación de 180 s y tiempo de disociación de 360 s a un caudal de 30 |jl/min. El tampón de ejecución para los experimentos cinéticos fue fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 130 mM, tween 20 al 0,05 %, pH 7,1. Las superficies se regeneraron después de cada ciclo usando dos pulsos de 30 s de glicina 10 mM pH 1,5 a un caudal de 30 jl/min. Se hizo una doble referencia de los datos de sensograma y luego se ajustaron a un modelo Langmuir 1:1 usando el software de evaluación Biacore T 100 v2.0.4, para determinar la constante de velocidad de asociación (ka), la constante de velocidad de disociación (kd) y la constante de disociación de equilibrio (KD).

Los resultados se muestran en la tabla 8. La tabla recoge datos de diferentes experimentos. Para los anticuerpos para los cuales se muestran dos conjuntos de números, cada conjunto corresponde a los datos obtenidos en un experimento separado.

Tabla 8

continuación

Los resultados indican que la presencia de las diferentes regiones constantes en un anticuerpo, por ejemplo, CD73.10, no cambió la afinidad del anticuerpo contra CD73 humana.

La internalización de anticuerpos anti-CD73 se midió en dos ensayos diferentes.

A. Ensayo de internalización de alto contenido (ensayo de tiempo fijo de 2 horas)

Los anticuerpos anti-CD73 se usaron para analizar la internalización de CD73 dependiente de anticuerpos anti-CD73 en células Calu6 evaluando la expresión celular después de 2 horas de incubación de anticuerpos. Las células (2.000 células/pocillo) en 20 |jl de medio completo (Gibco RPMI Media 1640 con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 %) se sembraron en placas de Falcon 384 BD y se cultivaron durante una noche a 37 °C CO2 al 5 % y 95 % de humedad. Los anticuerpos anti-CD73 se diluyeron en serie con tampón PBS que contenía BSA al 0,2 %, y se añadieron 5 jl/pocillo en la placa celular. Las células se incubaron con anticuerpos durante 2 horas a 37 °C CO2 al 5 % y 95 % de humedad, seguido por lavado una vez con tampón PBS. Después se añadió formaldehído (4 % final en PBS) a la placa celular a 20 jl/pocillo, y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, se aspiró todo el líquido y se lavaron las células una vez con 30 j l de PBS. Se añadió anticuerpo de detección (2,5 |jg/pocillo de Ab anti-CD73 CD73.10.IgG2C219S) a 15 |jg/pocillo en la placa de células fijas. Las células se incubaron a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, la placa se lavó dos veces con tampón PBS, seguido por la adición de anticuerpo secundario que contenía anti-humano de cabra Alexa-488 y DAPI, teñido durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados en amortiguador PBS, se capturaron imágenes de la placa en Arrayscan Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA). Se midieron CI50 e Ymáx. Ymáx se determinó comparando con 100 nM de dosis de 11F11 como máximo interno. Todos los cálculos se determinaron como un porcentaje de internalización en comparación con este control, que se fijó en el 100 %.

Los resultados se proporcionan en la Tabla 9.

Tabla 9

Los resultados muestran que los anticuerpos anti-CD73 que tienen una bisagra de IgG2 tienen una CE50 inferior y un Ymáx más alto.

Se realizaron estudios de internalización cinética para evaluar la velocidad de internalización. Se ensayaron varias líneas celulares: células H2228, células HCC15, células Calu6 y NCI-H2030. Las células (2.000 células/pocillo) en 20 j l de medio completo (Gibco RPMI Media 1640 con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 %) se sembraron en placas de Falcon 384 BD y se cultivaron durante una noche a 37 °C con CO2 al 5 % y 95 % de humedad. Los anticuerpos CD73 se diluyeron con tampón PBS que contenía BSA al 0,2 % hasta 10 |jg/ml y se añadieron 5 |jl/pocillo en la placa celular. Las células se incubaron con anticuerpos durante 0-2 horas de tiempo a 37 °C, seguido de lavado una vez con tampón PBS. Las células se fijaron posteriormente con formaldehído (4 % final en PBS) a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se lavaron una vez con 30 j l de PBS. Se diluyó el anticuerpo de detección (2,5 jg/pocillo de Ab anti-CD73 CD73.10.IgG2C219S) con tampón Pb S que contenía Bs a al 0,2 %, y se añadieron 15 jl/pocillo en la placa de células fijas. La placa se incubó a 4 °C durante una noche. Al día siguiente, después de 3 lavados en tampón PBS, se añadió anticuerpo secundario anti-humano de cabra Alexa488 con DAPI. Las células se tiñeron durante 60 minutos a temperatura ambiente, después de 3 lavados, las imágenes se adquirieron usando Arrayscan Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA). Los resultados se proporcionan en las figuras 1A-J y las tablas 10 y 11. Los valores en la tabla 10 se obtienen de los datos mostrados en las figuras 1A-J.

Tabla 10

Los resultados indican que el 11F11 (un anticuerpo IgG2) se internalizó en cuestión de minutos, alcanzando una meseta en 30 minutos, mientras que 6E11 (un anticuerpo IgGl) se internalizó más lentamente, alcanzando una meseta a aproximadamente 1 hora (figuras 1A-1J). De forma similar, 11F11 con una región constante de IgG1 se internalizó más lentamente que 11F11 con una región constante de IgG2. Esta tendencia se observó en varias líneas celulares (tablas 10 y 11 y figuras 1A-1J).

B. Internalización medida por citometría de flujo

La internalización mediada por anticuerpo anti-CD73 de CD73 también se ensayó mediante citometría de flujo. Las células indicadas se incubaron con 10 |jg/ml del anticuerpo indicado durante 30 minutos sobre hielo, se lavaron varias veces y se transfirieron a 37 °C durante el tiempo indicado. Las células se recogieron al mismo tiempo después del tiempo de incubación indicado. Las células se tiñeron de nuevo con anticuerpo primario (el mismo anticuerpo usado para la incubación inicial) seguido por anticuerpo secundario antihumano. Las células se ensayaron después para la expresión de CD73 por citometría de flujo.

Los resultados, que se muestran en la figura 1E y en la tabla 11, son consistentes con los obtenidos en los ensayos de internalización descritos anteriormente e indican que todos los anticuerpos con bisagra de IgG2 y CH1 indujeron internalización rápida y completa. Los niveles de CD73 permanecieron bajos después de 22 horas tras el lavado, lo que indica que la internalización es duradera.

Se obtuvieron resultados similares mostrados en la figura 1F y la tabla 11 en la línea celular NCI-H292 en la que el anticuerpo se mantuvo en cultivo durante el tiempo de incubación (sin lavado). Nuevamente, estos datos indican una internalización rápida y significativa y el mantenimiento de la regulación negativa de la CD73 endógena.

También se realizaron ensayos de internalización con las células SNU-C1 humanas (línea celular de cáncer de colon) y NCI-H1437 (línea celular de carcinoma de pulmón no microcítico). Los resultados, que se muestran en las figuras 1I y 1J, también indican internalización rápida con un nivel máximo alcanzado en 5 horas y un nivel máximo de internalización de aproximadamente 50 % para CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f en SNU-C1 y 60 % para las células NCI-H1437. Las figuras 1G y H muestran cinética similar de internalización de CD73.4.IgG2-C219S-IgG1.1f en células Calu6 y NCI-H292. Para los gráficos, que muestran % de CD73 internalizado, este número se obtuvo de la siguiente manera:

IFMt=x — IFMf0nd0

% de CD73 internalizado = 100 — r „ / x— lr,„ ! x 100)

IFMt=o — IFMf ondo

en donde para cada anticuerpo, IFMt=x es la IFM en un punto temporal dado e IFMt=o es fluorescencia máxima en t=0, e IFMfondo es la IFM del Ab secundario solamente.

De este modo, los anticuerpos anti-CD73 con una bisagra de IgG2 se internalizan más rápidamente y en mayor medida en relación con los anticuerpos anti-CD73 con una bisagra de IgG1.

Ejemplo 2: Actividad agonista mejorada de anticuerpos de GITR con una bisagra de IgG2 con respecto a los mismos anticuerpos con una bisagra de IgG1

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-GITR que comprenden una bisagra de IgG2 tienen una capacidad incrementada para inducir la secreción de IL-2 e IFN-y de células T con respecto a los mismos anticuerpos que tienen una bisagra de IgG 1.

Se ha observado en los ensayos CHO-OKT3 y 3A9 descritos anteriormente que los anticuerpos derivados de hibridomas, que tienen una región constante de IgG2, son más potentes en la estimulación de la secreción de citocinas que los mismos anticuerpos en los que la región constante de cadena pesada cambió a la de IgG 1 o una IgG1 sin efectoras (IgG1.1). Por lo tanto, el efecto de una región constante o bisagra de IgG2 se ensayó adicionalmente en anticuerpos anti-GITR en estos ensayos.

La región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-GITR humano (SEQ ID NO: 75) se unió a las regiones constantes de la cadena pesada mostradas en la tabla 13. La cadena ligera de los anticuerpos anti-GITR comprendía SEQ ID NO: 77. La tabla 13 muestra la identidad de cada dominio de las regiones constantes:

Primero, las afinidades de unión de estos anticuerpos de GITR se compararon con las de los anticuerpos de GITR que tenían una bisagra IgG 1. Las afinidades de unión de los anticuerpos anti-GITR frente a GITR soluble se determinaron por Biacore como sigue. Los anticuerpos anti-GITR se capturaron en chips recubiertos de kappa humano (~5KRU, Southernbiotech cat n.° 2060-01), y GITR recombinante humano (rHGITR/Fc: R&D systems, c AT n.° 689-GR) fluyó a través del chip a concentraciones de 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62 nM y 31 nM. La concentración de captura del mAb/volumen fue de 2-40 |jg/ml (5 j l a 10 |jl/min). El tiempo de asociación del antígeno fue de 5 minutos a 15 |jl/min, el tiempo de disociación del antígeno fue de 6 minutos y la regeneración se realizó con HCl 50 mM/NaOH 50 mM (12 j l cada uno a 100 jl/min).

Los resultados que se muestran en la figura 2 indican que los tres anticuerpos de GITR que tienen una bisagra IgG2 tienen afinidades similares para las células T activadas, ya que los anticuerpos de GITR tienen una región constante IgG 1 o IgG1.1.

A continuación, se ensayó la capacidad de los anticuerpos de GITR que tienen una región constante de IgG1 o una bisagra IgG2/dominio Fc de IgG 1 para determinar su capacidad para inducir la secreción de IL-2 e IFN-y de células T donantes humanas estimuladas con células CHO que expresan anti-CD3scFv (OKT3). Las células CHO expresaron bajos niveles de OKT3 para promover una estimulación subóptima para poder observar el agonismo mediante anticuerpos anti-GITR. Células T CD4+ de un donante se estimularon con células CHO que expresan OKT3 y un anticuerpo anti-GITR, y se midió la secreción de IL-2 e IFN-y. Los experimentos se llevaron a cabo como sigue. Para experimentos con células T CD4+, se obtuvieron células T CD4+ de PBMC humanas con cóctel de enriquecimiento de células T CD4+ humanas de RosetteSep (StemCell Technology n.° 15062) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células CHO que expresan anti-CD3scFv (OKT3) (CHO-OKT3) se lavaron dos veces con medio RPMI y se sometieron a irradiación con una dosificación de 50K Rad. Las células se recogieron y resuspendieron en medio de cultivo (RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10 %, L-glutamina 2 mM, p-mercaptoetanol 55 nM, piruvato de sodio 1 mM y penicilina/estreptomicina 100 U/ml) a 2,5 x 105/ml. Se sembraron 2,5 x 104 células CHO-OKT3 y 1x105 células T por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos de calidad TC (Costar). Las células se incubaron con una titulación de 8 puntos y 4 veces del anticuerpo de GITR comenzando a 40 |jg/ml. Se añadió un hIgGI irrelevante a 40 jg/m l como control de isotipo. Se incluyó una muestra con células solamente para mostrar la actividad basal sin ningún tratamiento. El sobrenadante de cada muestra se recogió al día 2 para la medición de IL-2 (solo para ensayos con células T CD4+) (kit de ELISA de IL-2 humana BD opt EIA; BD Bioscience n.° 555190) y al día 3 para la medición de IFN-y (kit de ELlSA de IFN-g humano BD optEIA; Bioscience n.° 555142).

Como se muestra en las figuras 3A y 3B, el anticuerpo con el dominio bisagra de IgG2/Fc de IgG 1 (anti-GITR.g2.g1) indujo tanto la secreción de IL-2 como IFN-y de células T a un grado mayor que el anticuerpo con la región constante de IgG 1 (anti-GITR.g1). Se obtuvieron resultados similares con las versiones sin efectoras de estos dominios constantes (figura 3C).

Para confirmar adicionalmente la activación aumentada de células T con los anticuerpos anti-GITR que comprenden una bisagra de IgG2, se ensayó la secreción de IL-2 en un formato experimental diferente. En este experimento, se ensayó la capacidad de los anticuerpos de GITR para inducir la secreción de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR (línea celular 3A9 de hibridoma de células T de ratón que expresa ectópicamente GITR humano) como sigue. La línea celular de hibridoma 3A9 de células T de ratón que expresa ectópicamente GITR humano (3A9-hGITR) se cultivó en placas revestidas con anticuerpo monoclonal anti-CD3 en presencia de cantidades crecientes de los anticuerpos indicados. Se cultivaron 5 x 104 células 3A9-hGITR en placas recubiertas con anticuerpo anti-CD3 1 jg/m L (Clon 145-2C11, BD Biosciences), y se trataron con las concentraciones indicadas de anticuerpos durante 7 horas.

Como se muestra en la figura 4, todos los anticuerpos que tenían la bisagra IgG2 (anti-GITR.g2, anti-GITR.g2.g1f y anti-GITR.g2.g1.f) indujeron la secreción de IL-2 de células 3A9-hGITR a un mayor grado que su región constante de IgG 1 que contiene homólogos (anti-GITR.g1f y anti-GITR.g1.1f).

Estos resultados sugieren colectivamente que los anticuerpos anti-GITR que tienen una bisagra IgG2 y regiones constantes g1 o g1.1 son más potentes que los mismos anticuerpos que tienen una bisagra IgG1.

Ejemplo 3 Impacto de diferentes combinaciones bisagra/Fc sobre el tamaño de los complejos anticuerpo/antígeno

Como se muestra en los ejemplos anteriores, los anticuerpos anti-CD73 con una bisagra de IgG2 son mejores inhibidores de la actividad celular de CD73 y se internalizan mejor que los mismos anticuerpos con una bisagra de IgG 1 y los anticuerpos anti-GITR con una bisagra de IgG2 son agonistas más potentes que los mismos anticuerpos con una bisagra de IgG 1. Basándose en esta observación, y el hecho de que una bisagra de IgG2 es más rígida que una bisagra de IgG 1, se planteó la hipótesis de que se forman complejos más grandes entre un antígeno y anticuerpos que tienen una bisagra de IgG2 con respecto a anticuerpos que tienen una bisagra de IgG1. El siguiente experimento se realizó para analizar esta hipótesis.

La estructura y estado oligomérico de complejos CD73/anticuerpo en solución fueron examinados por SEC-MALS y DLS. Para estos estudios, los anticuerpos que contenían una región constante de IgG 1 o IgG2 se mezclaron en proporciones molares variables con proteínas recombinantes que comprendían el dominio extracelular de longitud completa de CD73 humano que contenía un marcador de polihistidina C-terminal (residuos de aminoácidos 26-546 de CD73 humano, denominado hCD73-his) o un fragmento correspondiente al dominio N-terminal de CD73 humano (residuos de aminoácidos 26-336, denominado N-hCD73-his).

El estado oligomérico de los complejos de CD73/anticuerpo se examinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a un detector de dispersión de luz de ángulo múltiple en línea (SEC-MALS). Las separaciones isocráticas se realizaron en una columna Shodex PROTEIN KW-803 conectada a una Prominence Shimadzu UFLC en tampón que contenía K2HPO4200 mM, NaCl 150 mM, pH 6,8, que contenía azida de Na al 0,02 % (filtrado a 0,1 jm ) corriendo a 0,5 ml/min. Se inyectaron muestras en la columna usando un muestreador automático SIL-20AC Prominence Shimadzu y se obtuvieron datos de tres detectores en línea conectados en serie: un espectrofotómetro UV/vis de matriz de diodos Prominence SPD-20AD seguido por un detector de dispersión de luz multidireccional Wyatt miniDAWN™ TREOS y después un detector de índice de refracción Wyatt Optilab T-rEX. Los datos se recogieron y analizaron usando el software Astra (Wyatt) y Labsolutions (Shimadzu).

Se realizaron estudios de dispersión dinámica de luz (DLS) en un lector de placas Wyatt DynaPro en placas de 384 pocillos a 25 °C. Los parámetros experimentales fueron 20 adquisiciones de 5 s por medición, y las mediciones se registraron en cuadruplicado, con el promedio y la desviación típica señalados. Las funciones de autocorrelación de intensidad se ajustaron usando el algoritmo de "Regularización" en el software Dynamics (Wyatt Technologies).

En las figuras 6 y 7 se proporciona un resumen de SEC-MALS y DLS. El análisis de los anticuerpos solos, muestra tiempos de retención (aproximadamente 16-17 min), masas (140-150 kDa) y radios hidrodinámicos (5,0-5,4 nm) para cada anticuerpo que son típicos para un anticuerpo monoclonal monomérico. Los datos de la proteína hCD73-his son coherentes con la proteína que adopta la estructura dimérica esperada en solución; en particular, la masa determinada a partir de los datos SEC-MALS (120 kDa) es coherente con la esperada para un dímero CD73-his (117 kDa) e incoherente con lo que se esperaría para un monómero de hCD73-his (58,5 kDa). Los datos para N-hCD73 son coherentes con la proteína del dominio N recombinante que es monomérica en solución (masa medida por SEC-MALS = 38 kDa, en comparación con la masa monomérica esperada = 35,0 kDa), lo cual se espera porque la región del dominio extracelular de CD73 de longitud completa que es responsable de la dimerización de la proteína está contenida dentro del dominio C-terminal sin la contribución de los residuos de dominio N-terminal.

Se encontró que las mezclas equimolares de un anticuerpo dado con N-hCD73-his eran eluidas como una sola especie en la SEC con un tiempo de retención más corto que el anticuerpo o N-hCD73-his solo, así como radios hidrodinámicos mayores (Rh) por DLS, que es coherente con la formación de complejos. Los datos de MALS indican masas para estos complejos de aproximadamente 210 kDa. Esto es coherente con una molécula de N-hCD73-his unida a cada uno de los dos dominios Fab de un anticuerpo dado para formar un complejo anticuerpo:N-hCD73-his 1:2.

Los datos de SEC-MALS para mezclas de anticuerpos anti-CD73 con dímero hCD73-his muestran que la mezcla se eluye antes que el hCD73-his o el anticuerpo solo, lo que sugiere que se forman complejos. La comparación de los datos de los mAbs que contienen la misma región variable pero diferentes dominios constantes, muestra que los tiempos de elución para los complejos de hCD73-his con mAbs que contienen un dominio constante de IgG2 (IgG2-C219S, IgG2-C219S-IgG1.1f) son anteriores que los de complejos de hCD73-his con mAbs que contienen un dominio constante de IgG1.1f. Además, las masas determinadas por MALS para complejos de hCD73-his con mAbs que contienen un dominio constante de IgG2 son mayores que las de complejos de hCD73-his con mAbs que contienen un dominio constante de IgG1. Los datos de DLS muestran además que el radio hidrodinámico de los complejos de hCD73-his con mAbs que contienen un dominio constante de IgG2 son mayores que los de complejos de hCD73-his con mAbs que contienen un dominio constante de IgG1. Por ejemplo, en la Figura 5 se muestran los datos de SEC-MALS y DLS para CD73.4 con tres regiones constantes diferentes (IgG2-C219S, IgG2-C219S-IgG1.1f o IgG1.1f). Aquí se puede ver que el complejo de hCD73-his con CD73.4 que contiene el dominio constante de IgG2 tienen tiempos de retención más cortos (figura 5A), radios hidrodinámicos más grandes (figura 5B) y mayores masas determinadas por MALS (figura 5C), en comparación con los complejos de hCD73-his con CD73.4-IgG1.1f. Basándose en las masas MALS, en la figura 5D se muestra un modelo esquemático para la estructura y estequiometría de los complejos entre hCD73-his y los anticuerpos, donde los complejos que contienen CD73.4-IgG1.1f predominantemente forman complejos mAb/dímero de CD73 más pequeño 2:2 (pico 1 = ~550 kDa) o 4:4 (pico 2 = ~1300 kDa), mientras que CD73.4-IgG2-C219S o CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f forman complejos mucho mayores (>3000 kDa) con hCD73-his, por lo que la estructura precisa y estequiometría no se puede modelar con seguridad.

Colectivamente los datos SEC-MALS y DLS demuestran que se forman complejos más grandes entre hCD73-his y mAbs que contienen una región bisagra IgG2 (IgG2-C219S o IgG2-C219S-IgG1.1f), en comparación con los que contienen la región bisagra IgG1 (IgG1.1f).

Ejemplo 4: CH1 del isotipo IgG2 mejora adicionalmente la intemalización de CD73 mediada por anticuerpo

Se llevaron a cabo ensayos de internalización adicionales en células Calu6 y H292 para discriminar adicionalmente el papel del isotipo en la internalización. Los ensayos de internalización se realizaron como se describe en el ejemplo 1A y 1B (protocolo de citometría de flujo sin la etapa de lavado de los anticuerpos) y los anticuerpos de variados isotipos híbridos mostrados en la tabla 14 se mantuvieron en cultivo a 10 |jg/ml durante el tiempo de incubación. Para los experimentos de citometría de flujo, se adaptó el método del ejemplo 1B a un análisis de alto rendimiento en placas de 96 pocillos (frente a placas de 48 pocillos) y con 50.000 células por pocillo.

Tabla 14: Re iones constantes ensa adas con las re iones variables de CD73.4:

continuación

Se demostró que la unión a FcyR era como se esperaba para cada construcción, es decir, la unión de FcyR es impulsada por una región bisagra/CH2 inferior.

Los resultados se muestran en las figuras 8A, B y C y en las tablas 15 y 16. Los datos mostrados en la tabla 15 se generaron usando el mismo protocolo descrito en el ejemplo 1B (sin lavado de los anticuerpos). Los datos mostrados en la tabla 16 se generaron usando el mismo protocolo descrito en el ejemplo 1A.

Ta l 1: Ym x T12 l in rn liz i n D7 m i r ni r n l l l N I-22

Tabla^ 16: Características de internalización de CD73.4 con varias re iones constantes en células^ Calu6

continuación

Las figuras 8A-C y las tablas 15 y 16 indican que los anticuerpos que tienen una bisagra y el dominio CH1 del isotipo IgG2 son más eficientes al impulsar la internalización de CD73, mientras que los anticuerpos que tienen una bisagra IgG1 y dominio CH1 corresponden a las curvas inferiores en la figura, es decir, menor grado de internalización. Además, los anticuerpos con solo la bisagra de IgG2 tienen una internalización aumentada en comparación con una bisagra de IgG1 humana. De este modo, los anticuerpos que tienen un dominio bisagra y CH1 del isotipo IgG2 tienen características de internalización superiores con respecto a los anticuerpos con un isotipo IgG1.

De este modo, el anticuerpo anti-CD73 mAb-CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (que tiene una bisagra de IgG2 con sustitución C219S y un dominio CH1 de IgG2) indujo una rápida internalización dependiendo de la línea celular probada. El T1/2 para la internalización varió de minutos a menos de una hora. La mayoría de las líneas celulares ensayadas tenían un T1/2 menor de 10 minutos. Se indujo una internalización casi completa para algunas líneas celulares y la mayoría de las probadas tuvieron al menos una reducción del 50 % en la expresión superficial de CD73 que normalmente alcanzó niveles máximos en 5 horas, mucho más corto en algunos casos.

Ejemplo 5: CH1 de IgG2 mejora la secreción de IL-2 inducida por Ab de GITR por células T CD4+

Este ejemplo muestra que un dominio CH1 del isotipo IgG2 mejora la actividad de las células T inducida por el anticuerpo anti-GITR, en relación con el anticuerpo con un dominio CH1 del isotipo IgG1.

Las mismas regiones constantes de cadenas pesadas modificadas que se usaron en el Ejemplo 4 se unieron a las regiones variables del anticuerpo anti-GITR (del ejemplo 2). Las células T CD4+ donadoras se incubaron con células CHO que expresan OKT3-scFv y se midieron los diversos anticuerpos anti-GITR, y se midió el nivel de IL-2 secretado. Esto se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 2.

Los resultados, que se muestran en la figura 9, indican que todos los anticuerpos anti-GITR que tienen un dominio CH1 del isotipo IgG2, además de una bisagra del isotipo IgG2, son más eficaces para estimular la secreción de IL-2 a partir de células T CD4+ que aquellos que tienen una bisagra IgG1 y CH1.

Por lo tanto, este ejemplo muestra que la presencia de una bisagra de IgG2 y un dominio CH1 de IgG2 en un anticuerpo anti-GITR agonista mejora adicionalmente la actividad agonista del anticuerpo con respecto al mismo anticuerpo que no tiene una bisagra y/o un dominio CH1 del isotipo IgG2. Un anticuerpo que tiene tanto una bisagra como un dominio CH1 del isotipo IgG2 tiene un efecto agonista más fuerte con respecto a un anticuerpo que tiene una bisagra, pero no CH1, del isotipo IgG2. Adicionalmente, un anticuerpo con un dominio CH1 de IgG2 tiene una actividad agonista más fuerte que un anticuerpo con un dominio CH1 del isotipo IgG 1. Un anticuerpo con una bisagra de IgG2 y un dominio CH1 de IgG 1 tiene una actividad agonista más fuerte que un anticuerpo con CH1 y bisagra de isotipo IgG 1.

Ejemplo 6: Relevancia de ciertos residuos de aminoácidos en CH1 de IgG2 y bisagra en la mejora de la internalización de CD73 mediada por anticuerpos

Se prepararon anticuerpos anti-CD73 (CD73.4) con las regiones constantes de cadena pesada mostradas en la tabla 17 y se ensayaron como se describió anteriormente en ensayos de internalización de CD73 mediados por anticuerpos.

T l 17: R i n n n n f i n r n r i n v ri l ni- D7

Los resultados, que se muestran en la figura 10, proporcionan la siguiente información en el contexto de la intemalización de CD73:

• El dominio CH2 no parece tener un impacto como se muestra por

O a) se observó muy poca diferencia en la capacidad de intemalización entre los anticuerpos que comprenden una región constante de cadena pesada modificada con formato "AY" (que tiene la bisagra IgG2 ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 8) con respecto a los de formato "KH" (ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 22) (Conjuntos 5, 6 y 7);

O b) los intercambios de CH2 son comparables a los de G1 o G2 de tipo salvaje (Conjuntos 5 y 6); y

O c) el residuo 237 no tiene impacto en la internalización: ni la adición de un residuo "G" a una bisagra IgG2 ni la supresión del "G" C terminal en una bisagra IgG 1 afectaron a la internalización (Conjunto 9).

Esto sugiere que el dominio CH2 no afecta a la internalización (es decir, el dominio CH2 puede ser de IgG 1 o IgG2);

• Intercambiar las regiones CH1 indicadas en el Conjunto 3 (KRGEGSSNLF, KRGEGS, SNLF; ITNDRTPR y SNLFPR) en IgG 1 con las de IgG2 proporciona poco beneficio, es decir, la internalización sigue siendo similar a la de IgG1; véase el Conjunto 3);

• Intercambiar las regiones CH1 indicadas en el Conjunto 4 (RKEGSGNSFL; RKEGSG; NSFL; TIDNTRRP y NSFLRP) en IgG2 con las de IgG1 tiene un impacto variable: el cambio de NSFL no tiene impacto, mientras que las otras 2 regiones (RKEGSG y RP) están involucradas (ver Conjunto 4). Basándose en los resultados de los Conjuntos 3 y 4, parece que existe una interacción entre la región CH1 y la bisagra, siendo las regiones RKEGSG y RP más importantes que la región NSFL;

• La región bisagra afecta a la internalización, es decir, la bisagra de IgG2 proporciona una mejor internalización con respecto a la bisagra de IgG1 (ver Conjuntos 7 y 8). Además, IgG 1 con una supresión (Gl-delta-bisagra) mejora la internalización sobre IgG1. IgG2 con una supresión (G2-delta-bisagra) proporciona un nivel similar de internalización con respecto a la de una bisagra de IgG2. Esto sugiere que la región bisagra afecta a la internalización, cuyo efecto es potenciado por una CH1 de IgG2 (G2-G1-G2-G2-AY es comparable a G1-G2-G1-G1-AY);

• IgG2.4 (C220S) tiene una internalización similar o reducida en comparación con IgG2.3 (C219S). IgG2.3/4 (C219S/C220S) tiene internalización muy reducida en comparación con IgG2.3 o IgG2.4 sola (ver Conjunto 10). Esto sugiere que la internalización de un anticuerpo con una bisagra de IgG2 y C219S es aproximadamente la misma que la de una bisagra de IgG2 con C220S, ambas mucho mejores que la de una bisagra de IgG2 tanto con C219S como con C220S;

• IgG2.5 (mutación C131S) tiene internalización reducida en comparación con las construcciones con C131 (ver Conjuntos 1,6 y 7).

Por lo tanto, estos resultados indican que el dominio CH1 y la bisagra son ambos relevantes en la internalización de CD73 mediada por anticuerpos y que un anticuerpo que tiene las secuencias de IgG2 de estos dominios se interioriza con una mejor eficacia con relación a un anticuerpo que tiene estas regiones de IgG1.

Ejemplo 7: Anticuerpos que tienen una bisagra de IgG2 y/o un dominio CH1 forman complejos de alto peso molecular

Los anticuerpos CD73.4 que tienen las regiones constantes de cadena pesada expuestas en la tabla 14 también se ensayaron para la formación de complejos de alto peso molecular mediante experimentos SEC-MALS y DLS, como se describe en el ejemplo 3.

Tres de los 16 anticuerpos en este estudio fueron previamente probados: CD73.4-IgG1.1f, CD73.4-IgG2-C219S (también denominado CD73.4-IgG2.3) y CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f (también denominado CD73.4-IgG2.3G1.1f-KH). Los datos de SEC-MALS y DLS de los anticuerpos solos mostraron tiempos de retención, masas y radios hidrodinámicos para cada anticuerpo que son típicos para un anticuerpo monoclonal monomérico. Los complejos equimolares de cada anticuerpo (5,5 |jM) con hCD73-his (5.5 |jM) mostraron tiempos de retención más lentos para todos los complejos en comparación con el anticuerpo o hCD73-his solo, indicando la formación de complejos. Una superposición de los datos del cromatograma SEC para cada uno de los 16 complejos se muestra en la figura 11A. Los datos del cromatograma se pueden dividir en 4 picos distintos, que se muestran en la figura 11B. El pico 1 contiene la especie más grande, con masas determinadas por MALS que sugieren complejos con un equivalente en masa mayor que los complejos 4:4 hCD73-his:mAb. El pico 2 contiene especies con masas determinadas por MALS que sugieren complejos hCD73-his:mAb de aproximadamente 2:2. El pico 3 es una especie menor con baja señal y masas determinadas por MALS que sugieren unos complejos hCD73-his:mAb de aproximadamente 1:1. El pico 4 corresponde a la elución de los mAbs solos con masas determinadas por MALS coherentes con el anticuerpo libre. Para cuantificar las cantidades relativas de cada especie, se integraron los 4 picos de cada cromatograma como pico 1 (<12,9 min), pico 2 (12,9 - 15,1 min), pico 3 (15,1 - 16,7 min), pico 4 (16,7 - 19,3 min). La integración también incluyó un rango integrado adicional denominado pico 5 (>19,3 min) para tener en cuenta cualquier especie de bajo peso molecular, que resultó ser insignificante (<3,5 % para todos los complejos). El porcentaje de cada especie de esta integración se resume en la tabla 18. Todos los complejos contenían un porcentaje pequeño similar del pico 3 (aproximadamente 6-9 %), pero cantidades variables de los otros picos. Lo más notable es que todos los complejos entre hCD73-his y anticuerpos que contienen un dominio CH1 de hIgG1 tenían un porcentaje significativamente mayor de complejos más pequeños (pico 2), mientras que aquellos que contenían el dominio CH1 de hIgG2 tenían un mayor porcentaje de complejos más grandes (pico 1) (tabla 18 y figura 11C). Esto sugiere un papel importante no solo para la región bisagra, sino también para el dominio CH1 en la formación de complejos de orden superior.

T l 1 : Ti m r n i n ni r D7 .4 n r i n n n n m ifi

continuación

Ejemplo 8: Unión de receptores Fc para anticuerpos con dominios constantes modificados

Este ejemplo demuestra que los anticuerpos que tienen regiones constantes de cadena pesada modificadas que comprenden CH1 y bisagra de IgG2 se unen a FcyR cuando contienen dominios CH2 y CH3 de IgG1.

Además de la unión al antígeno por los dominios variables, los anticuerpos pueden acoplar receptores Fc-gamma (FcgR) a través de la interacción con los dominios constantes. Estas interacciones median en funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). La actividad de la función efectora es alta para el isotipo IgG1, pero muy baja o ausente para IgG2 e IgG4 debido a estos isotipos que tienen menor afinidad para FcgRs. Además, la función efectora de IgG1 puede modificarse a través de la mutación de residuos de aminoácidos dentro de las regiones constantes para alterar la afinidad y selectividad de FcgR.

La unión de anticuerpos a los receptores Fc gamma (FcyR o FcgR) se estudió usando tecnologías de biosensor incluyendo resonancia de plasmón superficial Biacore (RPS) y Interferometría de biocapa Fortebio (BLI). Los estudios de RPS se realizaron en un instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25 °C. El fragmento Fab de un anticuerpo murino anti-6xHis se inmovilizó en un chip sensor CM5 usando EDC/NHS hasta una densidad de ~3000 UR. Se capturaron varios FcgR marcados con His (7 |jg/ml) a través de la etiqueta His C-terminal usando un tiempo de contacto de 30 s a 10 jl/m in, y se evaluó la unión de anticuerpo 1,0 jM en un tampón de ejecución de NaPO410 mM, NaCl 130 mM, p20 al 0,05 % (PBS-T) pH 7,1. Los FcgR usados para estos experimentos incluyeron CD64 (FcgRI), CD32a-H131 (FcgRIIa-H131), CD32a-R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158), CD16b-NA1 (FcgRIIIb-NA1) y CD16B-NA2 (FcgRIIlb-NA2). Se realizaron experimentos BLI en un instrumento Fortebio Octet RED (Pall, Fortebio) a 25 °C en NaPO4 10 mM, NaCl 130 mM, p20 al 0,05 % (PBS-T) pH 7,1. Los anticuerpos se capturaron de sobrenadantes de expresión no diluidos en sensores revestidos con proteína A, seguidos por la unión de los analitos hCD32a-H131 1 jM , hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158 o hCD64 1 jM .

Primero, se hicieron anticuerpos que se unieron a diversos objetivos que contenían dominios Fc de IgG1 modificados incluyendo las sustituciones S267E (SE) y S267E/L328F (SELF), así como diversas combinaciones de las mutaciones P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, E233D, denominados V4, V7, V8, V9 y V12. La unión de estos anticuerpos se estudió mediante RPS Biacore con comparación con los anticuerpos IgG1f, IgG2.3 (IgG2-C219S) e IgG4.1 (IgG4-S228P), así como un anticuerpo IgG1.1f que ha sido diseñado para reducir la unión a todos los FcgR. Los resultados, que se muestran en la figura 12, demuestran las propiedades de unión a FcgR esperadas para IgG1f, IgG2.3 e IgG4.1 y los anticuerpos IgG1 mutados, incluyendo el aumento de la unión de CD32a-H131, CD32a-R131 y CD32b para SE y SELF, así como una mayor selectividad de los mutantes V4, V7, V8, V9 y V12 para CD32b sobre CD32a-H131 y CD32a-R131, figura 12.

El siguiente conjunto de construcciones se usaron para diseñar la función efectora en el isotipo IgG2 de otro modo negativo para la función efectora. Para este estudio, las mutaciones descritas anteriormente se introdujeron en el contexto de la región constante IgG2.3, o un híbrido IgG2.3/IgG1f denominado IgG2.3G1-AY, tabla 19. Los anticuerpos se expresaron a pequeña escala como sobrenadantes y se ensayaron para unión a FcgR usando tecnología biosensora de interferometría de biocapa Fortebio Octet. Dado que los anticuerpos estaban presentes a baja concentración en los sobrenadantes, el experimento se realizó capturando anticuerpos de los sobrenadantes usando sensores recubiertos con proteína A, seguido de unión de analitos FcgR en solución. También se incluyeron IgG1f de control purificados y de sobrenadante incluyendo anticuerpos IgG1, SE, P238D, V4 y V12 de tipo salvaje y cada uno de estos anticuerpos de control mostró las propiedades de unión a FcgR esperadas, figura 13. El anticuerpo IgG2.3 también demostró el perfil de unión esperado, con unión apreciable solo a CD32a-H131. Sin embargo, todas las mutaciones para introducir las mutaciones de S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D o E233D en IgG2.3 no pudieron recapitular la afinidad de FcgR de los correspondientes mAb IgG 1 modificados, figura 13. Por el contrario, la construcción IgG2.3G1-AY fue capaz de preservar completamente las propiedades de unión a FcgR de la IgG1 tipo salvaje, manteniendo las regiones CH1 y bisagra de IgG2.3. Además, todos los mutantes de IgG2.3G1-AY que contenían S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D y E233D demostraron propiedades de unión a FcgR comparables a los mAb de versión IgG 1 que contenían las mismas mutaciones, figura 13. Esto demuestra la modificación exitosa de anticuerpos con CH1 y regiones de bisagra de IgG2 combinadas con la función efectora de IgG1 de tipo salvaje o mutante.

T l 1 : n r i n I 2 m ifi

Esta estrategia de ingeniería se exploró adicionalmente produciendo otros anticuerpos formateados con IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-S267E (IgG2.3G1-AY-V27), así como variantes de la forma IgG2-B (IgG2.5G1-AY e IgG2.5G1-AY-V27), y otros anticuerpos híbridos que contienen diferentes combinaciones de dominios constantes de IgG1 e IgG2, y ensayando la unión de estos anticuerpos a Fab anti-His capturó FcgR marcados con his usando la tecnología de RPS Biacore. De acuerdo con los datos del sobrenadante de Octet, los datos de RPS mostraron que los anticuerpos IgG2.3G1-AY e IgG2.3G1-AY-V27 tenían propiedades de unión a FcgR comparables a IgG1f e IgG1f-S267E respectivamente, a pesar de contener las regiones CH1 y bisagra de un anticuerpo IgG2 de forma A (IgG2.3) (figura 14A y B y tabla 20). También se obtuvieron datos similares usando anticuerpos IgG2.5G1-AY e IgG2.5G1-AY-V27, demostrando la ingeniería exitosa de los anticuerpos IgG2 de forma B (que contienen mutación C131S denominada IgG2.5) que tienen funciones efectoras de tipo IgG1f o IgG1f modificadas. Los datos para otros anticuerpos con regiones constantes de IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY o IgG2.5G1-AY-V27, pero regiones variables diferentes, muestran que esta estrategia de ingeniería es ampliamente aplicable a otros anticuerpos independientes de los dominios variables (figura 14A y B y tabla 20). Otras construcciones que demuestran propiedades de unión a FcgR similares a IgG1f son IgG1-G2.3G1-AY e IgG1deltaTHT, mientras que varias de las construcciones de regiones constantes modificadas no pudieron retener las propiedades de unión a FcgR de tipo IgG1f, incluyendo construcciones IgG2.3G1-KH, IgG2. 5G1-KH, IgG2.3plusTHT, IgG2.5plusTHT e IgG2.3plusGGG (figura 14A y B y tabla 20).

Tabl - ti-his

continuación

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Tomados en conjunto, estos datos muestran que la secuencia inmediatamente C-terminal al motivo conservado CPPCPAP en la región bisagra confiere función efectora mediada por FcgR, mientras que el CH1 y las porciones superiores de la bisagra del anticuerpo pueden ser reemplazados por secuencias de IgG2 o de IgG2 modificado, para combinar potencialmente las funciones efectoras de IgG1 e IgG 1 modificada con las propiedades superiores de internalización o señalización de anticuerpos que contienen CH1 y/o regiones bisagra de IgG2.

Ejemplo 9: La internalización de Ab agonista de GITR se mejora en anticuerpos que tienen una bisagra y un dominio CH1 de IgG2

Para inducir la expresión de GITR, las células se incubaron durante 72 horas a 37 °C con 20 ng/ml de CD28 de 1000 ng/mL de anti-CD3+. Como método alternativo de activación de células T, se prepararon grandes lotes de células T CD4+ activadas mediante un protocolo de cultivo en tres etapas. En resumen, las células T CD4+ se estimularon con CD3 unido a placa (1,5 |jg/ml) complementado con 1 |jg/ml de CD28 soluble durante 72 horas a 37 °C, se expandieron en cultivo durante 14 días en presencia de 20 jl/m l de IL2 y finalmente se expusieron a otra ronda de activación por adición de 10 jg/m l de PHA, 2 j/m l de IL2 y 1 jg/m l de CD28 durante 72 horas a 37 °C. Se sembraron células T estimuladas en placas de formación de imágenes de PDL de 384 pocillos durante 2 horas para adherir las células, se enfriaron durante 15 minutos a 4 °C y después se añadieron por separado anticuerpos de GITR marcados con alexa 488 durante 1 h. Finalmente, se tomaron imágenes de placas por HCS y los datos se presentaron como intensidad total por célula.

Se han evaluado tres anticuerpos de GITR diferentes usando los métodos de activación de células T anteriormente mencionados. Son anticuerpos de GITR.6 como un isotipo G1 y un isotipo inerte (IgG1.1) incapaz de unirse a receptores Fc, así como una quimera con la bisagra IgG2 en lugar de la bisagra IgG 1.

La internalización inducida por el anticuerpo de GITR se evaluó en células T CD4+ estimuladas con CD3 usando el formato de ensayo de inactivación de alexa. Las células T CD4 positivas recién obtenidas se incubaron como se ha descrito anteriormente para inducir la expresión de GITR. Después de la estimulación, las células se resuspendieron en medios frescos y se sembraron en placas para ensayos de internalización como sigue. Las células se incubaron con anticuerpo como se ha descrito anteriormente, se lavaron con medio caliente y se incubaron a 37 °C durante los tiempos indicados antes de la fijación e inactivación. El anticuerpo internalizado se midió como aumento de la fluorescencia por encima de la pequeña señal no inactivable observada en el tiempo cero y después se normalizó frente a la fluorescencia total "control no inactivado" inicialmente unido a las células. Como se muestra en la figura 15, la ligadura de GITR dio lugar a una internalización rápida que alcanzó un máximo entre 30-60 minutos para cada anticuerpo ensayado mientras que se descubrió que los anticuerpos de control mantenían la localización en la membrana plasmática. Los resultados indican que la región bisagra de IgG2 mejora la internalización inducida por la ligadura de GITR.

Para diseccionar aún más los mecanismos detallados de internalización y dinámica asociada, se analizó la endocitosis de anticuerpos y el suministro en compartimentos de endosomas tempranos. En este experimento, las células se sometieron a análisis de pulso y caza con anticuerpos no marcados. Después de la fijación, las células se permeabilizaron y tiñeron para el marcador de endosoma temprano EEA1 (tecnología de señalización celular), se lavaron y después se detectaron con anticuerpo anti-conejo conjugado alexa fluor-488 (EEA1) y anticuerpo anti humano conjugado alexa fluor-647 (GITR). Las placas se visualizaron en un sistema confocal Opera con un objetivo de inmersión en agua 60X. Los resultados indicaron una segregación clara entre la tinción del anticuerpo anti-GITR unido a la membrana y la señal intracelular de EEA1. Al calentarse los cultivos, se detectó el agrupamiento para algunos anticuerpos que parece co-localizarse con proteínas endosómicas. La cuantificación de la co-localización endosómica se llevó a cabo usando software HCS Studio y los resultados se representan como la relación de intensidad de píxeles colocalizados con relación a la tinción total (figura 16). La colocalización del anticuerpo de GITR y el endosoma temprano es más prominente a los 30 minutos. En este punto de tiempo probado, GITR.6.G2.G1f mostró una fracción más alta colocalizada que el anticuerpo GITR.6.G1f. Los resultados de colocalización se correlacionan con las observaciones realizadas usando el método de inactivación de alexa descrito anteriormente y respaldan un modelo que sugiere que la bisagra G2 tiene una ventaja potencial sobre G1 para inducir la internalización de GITR.

Ejemplo 10: La señalización de Ab agonista de GITR en células T CD4+ y CD8+ activadas por receptor de células T se mejora en anticuerpos que tienen una bisagra de IgG2 y dominio CH1

Para investigar más a fondo los mecanismos para los anticuerpos agonistas anti-GITR, se supervisaron varias vías de señalización implicadas en la activación de células T, tales como las vías de señalización de NFkB y P38.

Se activaron células T CD4+ y CD8+ de un donante sano (M6576) con anti-CD3 0,4 |jg/ml y anti-CD28 0,4 |jg/ml aplicados en placas. Después de 3 días, se recogieron células y se sembraron en placas de imagen de 384 pocillos para la activación de señalización. Después de que las células se asentaron en la placa durante 2 horas, se trataron con anticuerpos de GITR durante 15 minutos y los eventos de señalización se terminaron añadiendo formaldehído a un final de 10 % en la placa de ensayo. A continuación, las células fueron permeabilizadas y teñidas con el anticuerpo fósforo-p65 NFKB para la detección de señalización. Como se muestra en la figura 17. Los anticuerpos GITR.6.G2 y GITR.6.G2.G1f presentaron respuestas de señalización más altas en comparación con los GITR.6.G1f en células T CD4+ y CD8+. Aunque no hay evidencia directa de la vinculación de la internalización y la activación de la vía de señalización, es intrigante observar que el isotipo G2 parece mejorar ambos aspectos de las actividades funcionales de anticuerpos en comparación con la IgG1 para GITR.6.

Para cuantificar las actividades de señalización para cada anticuerpo, se calcularon tanto CE50 como Emáx para cada anticuerpo, ya que ambos parámetros son críticos para capturar toda la extensión del evento de señalización. El nivel de respuesta de GITR.6.G2.G1f se elige para ser el control al 100 %, y todos los demás anticuerpos se normalizaron contra él. Como se muestra en la tabla 21 para las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ activadas por anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, hubo una serie de actividades para los anticuerpos de GlTR en términos tanto de potencia (CE50) como de eficacia (%Emáx). Aunque GITR.6.G2, GITR.6.G2.G1f y GITR.6.G1f mostraron potencias similares (CE50) alrededor del intervalo de 10 nM, la eficacia (Emáx) fue bastante diferente para diferentes isotipos, lo que sugiere que el anticuerpo G1 no señaliza con la misma eficacia que los isotipos G2 o quiméricos.

Tabla 21. Resumen de las actividades de señalización de GITR HuMab NFKB en células T CD4+ y CD8+ activadas or TCR

Para confirmar aún más si la diferencia de señalización de GITR.6.G2 y GITR.6.G2.G1f en comparación con GITR.6.G1f está limitada a la señalización de NFkB solamente o si también es válida para otros eventos de señalización, se exploró una lectura de señalización P38MAPK. Como se muestra en la figura 18, los anticuerpos GITR.6.G2 y GITR.6.G2.G1f tenían respuestas de señalización más altas comparadas con el anticuerpo GITR.6.G1f en un ensayo de activación de p38 MApK de células CD4+. Por lo tanto, las mejores actividades de señalización para isotipo GITR.6 G2 en comparación con isotipo G1 no solo se limitan a señalización NFkB.

Además de la actividad agonista mejorada y la internalización, también se demostró que las regiones constantes de cadena pesada modificadas pueden impartir ADCC mejorada (a, por ejemplo, un agonista de un receptor estimulador), así como proporcionar una nueva actividad a un anticuerpo. Por ejemplo, se encontró que el cambio del dominio de cadena pesada constante de un anticuerpo que se une a una molécula de superficie celular inhibidora e impide la actividad inhibidora de la molécula de superficie celular (un antagonista) a una región constante de cadena pesada modificada descrita en la presente, dio como resultado que el anticuerpo perdiera su capacidad para ser un antagonista, y en su lugar estuviera dotado con actividad agonista (de la actividad inhibidora).

Ejemplo 11: Confirmación de los enlaces disulfuro de las construcciones IgG2.3 e IgG2.5

Se confirmó que las estructuras de enlace disulfuro en un anticuerpo que comprendía el dominio constante IgG2.3 (forma A), IgG2.3G1 (forma A) e IgG2.5 (forma B) eran correctas por comparación de las digestiones de Lys-C no reducidas con las no reducidas.

Las muestras de anticuerpos se digirieron con Lys-C que escinde específicamente enlaces peptídicos en el lado carboxilo-terminal de los residuos de lisina (K, Lys). Los péptidos en la digestión se separaron usando una columna Waters ACQUITY BEH C18, columna de HPLc de fase inversa de 1,7 |jm, 2,1x150 mm y se detectaron con un detector ultravioleta (UV) a 214 nm y un espectrómetro de masas Thermo LTQ.

Digestión enzimática de Lys-C y reducción de enlaces disulfuro: A un vial que contenía 100 jg de la muestra de anticuerpo, se añadieron 12o j l de tampón de desnaturalización, resultando en una solución de GuHCl 3,7 M, Tris 0,2 M, pH 7,0. La mezcla se incubó a 55 °C durante 30 minutos. La alquilación de la proteína se realizó añadiendo 1 j l de yodoacetamida 50 mM en la solución anterior, luego se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La muestra alquilada se diluyó con 80 j l de dH2O y Waco Lys-C se añadió a una relación de enzima a sustrato de 1:10. Los anticuerpos se digirieron durante una noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la digestión, se retiró una alícuota de 100 |jl de la muestra digerida con Lys-C y se añadieron 10 |jl de DTT 0,5 M. Esta muestra se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora para reducir los enlaces disulfuro.

Los resultados obtenidos son los siguientes:

Estructura disulfuro de los anticuerpos IgG2.3 e IgG2.3G1 (forma A): En la región Fab de la cadena pesada Cys22 (H) está unido a Cys98 (H) y Cys151 (H) está unido a Cys207 (H). Dentro de la región Fc de la cadena pesada Cys265 (H) está unido a Cys325 (H) y Cys371 (H) está unido a Cys429 (H). Dentro de la región Fab de la cadena ligera Cys23 (L) está unido a Cys88 (L) y Cys134 (L) está unido a Cys194 (L). El extremo C de la cadena ligera Cys214 (L) está unido a la cadena pesada en Cys138 (H). La región bisagra de la cadena pesada contiene tres residuos de cisteína Cys227 (H), Cys230 (H) y Cys233 (H), que proporcionan tres enlaces disulfuro inter-catenarios. El enlace más probable es Cys227 (H) a Cys227 (H), Cys230 (H) a Cys230 (H) y Cys233 (H) a Cys233 (H), que es la disposición de disulfuro teórica correcta de la forma A de IgG2.

Estructura disulfuro del anticuerpo IgG2.5 (forma B): En la región Fab de la cadena pesada Cys22 (H) está unido a Cys98 (H) y Cys151 (H) está unido a Cys 207 (H). Dentro de la región Fc de la cadena pesada Cys264 (H) está unido a Cys324 (H) y Cys370 (H) está unido a Cys428 (H). Dentro de la región Fab de la cadena ligera Cys23 (L) está unido a Cys88 (L) y Cys134 (L) está unido a Cys194 (L). La región bisagra de la cadena pesada contiene cuatro residuos de cisteína Cys226 (H), Cys227 (H), Cys230 (H) y Cys233 (H). El extremo C de la cadena ligera Cys214 (L) está unido a un residuo de cisteína de cadena pesada en la región bisagra, y los otros tres residuos de cisteína proporcionan tres enlaces disulfuro intercatenarios. El enlace más probable es Cys214 (L) a Cys226 (H), luego Cys227 (H) a Cys227 (H), Cys230 (H) a Cys230 (H) y Cys233 (H) a Cys233 (H), que es la correcta disposición de disulfuro teórica de la forma B de IgG2. Adicionalmente, los enlaces disulfuro en la región bisagra fueron confirmados usando la disociación de transferencia de electrones (ETD) desencadenó la espectrometría de masas en tándem usando un espectrómetro de masas de trampa de iones.

Ejemplo 12: Relevancia de ciertos residuos de aminoácidos en CH1 de IgG2 y bisagra en la mejora del agonismo de GITR en células T

Se prepararon anticuerpos anti-GITR (GITR.6) con las regiones constantes de cadena pesada mostradas en la tabla 19 y se ensayaron en ensayos de producción de IL-2 como se describe en el ejemplo 2, pero en los que los sobrenadantes se recogieron a las 40 horas en lugar de a las 48 horas.

Los resultados, que se muestran en las figuras 20A-D, estaban en gran medida de acuerdo con los resultados de internalización de CD73 (véase la figura 10) obtenidos con anticuerpos anti-CD73 que tenían las mismas regiones constantes de cadena pesada que las usadas en este ejemplo.

TABLA DE SECUENCIAS

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada, en donde la región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 en orden desde el extremo N al C, en donde:

(a) la bisagra comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 21;

(b) el dominio CH1 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7;

(d) el dominio CH3 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 5 o del SEQ ID NO: 5 con las sustituciones de aminoácidos E356D y M358L;

o en donde la región constante de cadena pesada que comprende el dominio CH1, la bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3 como se ha definido en (a), (b), (c) y (d) carece del GK o K C-terminal.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada modificada seleccionada del grupo de los SEQ ID NO: 34, 35, 37, 81 y 84.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, que (i) se une específicamente a un receptor co-estimulador; (ii) se une específicamente a una molécula de superficie celular y desencadena la internalización mediada por anticuerpo de la molécula de superficie celular; (iii) se une específicamente a un receptor inhibidor; (iv) se une específicamente a una molécula de superficie celular y desencadena señalización intracelular; (v) se une específicamente a una molécula de superficie celular y desencadena la formación de complejos anticuerpo-molécula de superficie celular de alto peso molecular; o (vi) se une específicamente a una molécula de superficie celular y desencadena la agrupación o la oligomerización de la molécula de superficie celular.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde el receptor co-estimulador es GITR, OX40, 4-1BB, CD28, ICOS, CD40L, CD27 o cualquier otro miembro de la superfamilia de TNFR; la molécula de superficie celular es CD73; el receptor inhibidor es CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4; o la señalización intracelular media en la actividad agonista, la actividad antagonista, la internalización de la molécula de superficie celular o el ADCC.

5. El anticuerpo de las reivindicaciones 3 o 4, en donde el anticuerpo presenta actividad agonista mejorada o alterada en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo posee propiedades de internalización mejoradas o alteradas en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo presenta actividad antagonista más potente o alterada o introduce una nueva actividad en relación con el mismo anticuerpo que tiene una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo desencadena señalización intracelular más potente en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1; el anticuerpo desencadena la formación de complejos de mayor peso molecular en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1; o el anticuerpo desencadena más agrupamiento u oligomerización de la molécula de superficie celular en relación con un anticuerpo que tiene las mismas regiones variables y cadena ligera, pero que comprende una región constante de cadena pesada de IgG1.

6. Una molécula biespecífica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, unido a una molécula que tiene una segunda especificidad de unión.

7. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, unido a un segundo agente.

8. Una composición que comprende el anticuerpo, biespecífico o inmunoconjugado, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, un vehículo y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales.