JP6668345B2 - 修飾された重鎖定常領域を含む抗体 - Google Patents

修飾された重鎖定常領域を含む抗体 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６２／０８３，０２１号に基づく優先権の利益を主張する。本明細書を通して引用される特許、特許出願および引用文献の内容は、その全体を引用により本明細書中に包含させる。
背景
抗体療法は、癌および免疫障害などの疾患の処置において最も開発が進んでいる領域の１つである。それにもかかわらず、治療用抗体による抗原の効率的なターゲティングは、ヘルスケアにおいて依然として大きな課題である。それ故、抗体エンジニアリングが、製薬業界で大きな注目を集めている。この点から、抗体断片、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、修飾されたエフェクター領域を有する抗体、および二重特異性抗体などの、新たな改変抗体が数多く出現している。
抗体は、多くの異なる機序を通してその治療特性を促進する。抗体は、標的抗原を直接阻害または活性化することにより、細胞シグナル伝達を制御し得る。抗体は、リガンドの受容体への結合を阻害し得る。抗体はまた、例えば、対象の免疫系を強化して感染症または癌と闘うことにより（例えば、Ｔ細胞の活性化における共刺激因子として）、免疫応答を誘導または阻害し得る。
さらに、抗体介在性の細胞表面受容体／抗原の内在化は、治療用抗体の主要な作用機序として認識されている。この場合、抗体は、細胞表面から標的を取り除き、細胞内への内在化を誘導することによりその機能をなくす。実際、抗体療法の先駆的なものの１つが、乳癌の処置用のトラスツズマブである。トラスツズマブは、ＥｒｂＢ２受容体を標的とし、受容体／抗体の内在化を誘導して、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する。しかしながら、抗体は、常に効率的な内在化特性を示す訳ではないため、改善された内在化機能を有する抗体が未だ必要とされている。従って、既知の治療用抗体の内在化を改善する方法が高く望まれている。
概要
本発明は、修飾されていない形態の同じ抗体と比べて抗体の生物学的特性を増強する、重鎖定常領域（“修飾された重鎖定常領域”とも言う）またはその機能的に等価な断片を提供する。例えば、かかる修飾された定常領域を含む抗体は、内在化および／またはアゴニスト活性もしくはアンタゴニスト活性の増大を示す。従って、本発明の抗体は、元の修飾されていない抗体の最適化バージョンである。具体的には、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジおよび３つの定常ドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含み、ここで、該定常領域ドメインの１以上は、非ＩｇＧ２ヒトアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）またはその機能的に等価な断片である。修飾された定常領域は、対応する野生型アミノ酸配列、または例えば、ヒンジまたはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン内に野生型アミノ酸配列と比較して１つもしくは複数の（例えば、１から１０個、もしくはそれ以上の）アミノ酸置換または欠失を有する、その変異体、を含み得る。従って、ヒンジおよび／または各定常ドメインのアミノ酸配列は、対応する野生型アミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上（すなわち、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である。
一態様において、修飾された重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、または野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ヒンジは、例えば、ジスルフィド結合の形成を減少させる、さらなる修飾をさらに含み得る。一態様において、ヒンジは、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジと比較して、アミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを含む。ある態様において、ヒンジは、配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２および１３４〜１４７のいずれかに記載のアミノ酸配列またはＣＶＥとＣＰＰの間に１〜３個のアミノ酸挿入を含むこれらの配列の１つを含む。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、または野生型ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号７）と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、または野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＣＨ２ドメインは、（例えば、エフェクター機能を低下または排除する）さらなる修飾を含み得る。ある態様において、ＣＨ２ドメインは、野生型完全長ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２と比較して、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。ある態様において、ＣＨ２ドメインは配列番号２４を含む。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、または野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ＣＨ３ドメインは、特定のアロタイプを付与するためのさらなる修飾をさらに含み得る。一態様において、ＣＨ３ドメインは、異なるアロタイプの野生型完全長ヒトＩｇＧ１と比較して、位置３５６にアミノ酸残基Ｅおよび位置３５８にアミノ酸Ｍを含む。ある態様において、ＣＨ３ドメインは配列番号５を含む。
特定の態様において、抗体は、修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、（ａ）ＣＨ１ドメインは、さらなる修飾を含むか、もしくは含まない、野生型ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたは野生型ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインであり、（ｂ）ヒンジは、Ｃ２１９Ｓ置換を含むか、もしくは含まない野生型ＩｇＧ２ヒンジであり、（ｃ）ＣＨ２ドメインは、さらなる修飾を含むか、もしくは含まない、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインまたは野生型ＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインであり、そして（ｄ）ＣＨ３ドメインは、位置３５６にアミノ酸Ｅおよび位置３５８にアミノ酸Ｍを含むか、もしくは含まない、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインまたは野生型ヒトＩｇＧ２ ＣＨ３ドメインである。特定の態様において、修飾された重鎖定常領域は、例えば、配列番号２６〜３７および７８〜９３のいすれか１つに記載された、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。
本発明の抗体（すなわち、修飾された定常領域を有する抗体）は、完全ヒト抗体またはヒト化抗体であってもよく、さらに修飾された重鎖定常領域を有さない同じ抗体と比較して、１つまたはそれ以上の増強されたまたは改変された特性を示し得る。これらの特性は、増加または改変された細胞による内在化、アゴニスト活性、大きな架橋複合体の形成、ＡＤＣＣ、受容体介在性シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性および抗腫瘍活性；または、例えば、アゴニスト活性である新たな特性の付与を含み得る。
本発明の修飾された定常領域を含む二重特異性分子および免疫複合体、ならびに抗体、二重特異性抗体、または免疫複合体および許容される医薬担体を含む組成物もまた提供される。かかる組成物はまた、１つまたは複数のさらなる治療剤、例えば、チェックポイント阻害剤、共刺激分子、抗ＣＤ３９抗体、または抗Ａ２ＡＲ抗体などの免疫系を刺激する薬剤を含み得る。
修飾された重鎖定常領域を含む抗体を作製するための方法もまた、提供される。本明細書で提供されるすべての方法には、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体と比較して、細胞による抗体の内在化を増加させる方法、および抗体のアゴニスト活性を増加させる方法が含まれる。そのような方法は、ＩｇＧ２ヒンジではないヒンジを有する抗体を提供する工程、および該ヒンジをＩｇＧ２ヒンジ（例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒンジ、またはジスルフィド結合の形成を減少させる修飾を有するヒンジ、例えば、アミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを有するヒンジ）で置換する工程を含む。一態様において、抗体の内在化は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強または増加され、結果として、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上のＴ１／２の減少がもたらされる。ある態様において、アゴニスト活性は、エフェクターＴ細胞における増加したサイトカイン放出または増加した増殖；Ｔｒｅｇの関与がＴｒｅｇの機能を低下させる場合、低下したＴ調節細胞活性；または、増加したＴｒｅｇの枯渇、により定義されるように、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増加または増大される。
ある態様において、この方法は、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの少なくとも１つを、異なるアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインで置換する工程をさらに含む。そのような置換には、例えば、（ａ）ＣＨ１ドメインの、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインでの置換；（ｂ）ＣＨ２ドメインの、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインまたはＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインでの置換；および／または、（ｂ）ＣＨ３ドメインの、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインまたはＩｇＧ２ ＣＨ３ドメインでの置換（ここで、置換ドメインは、野生型配列、または野生型配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する）が含まれる。ある態様において、ＣＨ１ドメインは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減または排除するために改変され、例えば、ＣＨ２ドメインは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（配列番号２４）を含む。ある態様において、ＣＨ３ドメインは、位置３５６にアミノ酸残基Ｅおよび位置３５８にアミノ酸Ｍを含む（配列番号５）。
本明細書に記載の方法は、修飾された重鎖定常領域を含む抗体、二重特異性分子または免疫複合体を投与することにより対象を処置する方法を含む。１つまたは複数のさらなる治療剤、例えば、チェックポイント阻害剤などの免疫系を刺激する治療剤、共刺激分子もまた、同時に投与されてよい。
本発明は、Ｎ末端からＣ末端の順にＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む修飾された重鎖定常領域を含む抗体であって、（ａ）該ＣＨ１ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号７と最大５個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８またはＲ２１７のうち少なくとも１個が置換または欠失されておらず；（ｂ）ヒンジが、配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７のいずれか１つのアミノ酸配列、これらの配列のＣＶＥとＣＰＰの間に１〜３個のアミノ酸挿入を含む配列、またはこれらの配列と最大５個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含み、ここで、該ヒンジは、Ｃ２１９およびＣ２２０の両方共の置換または欠失を含まない；（ｃ）該抗体は、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体と比べて、少なくとも１つの増強された特性または新たに付与された特性を有する；そして、（ｄ）該修飾された重鎖定常領域は、野生型ＩｇＧ２定常領域またはＣ２１９Ｓおよび／もしくはＣ２２０Ｓを含むＩｇＧ２定常領域ではない、抗体を提供する。ヒンジは、アミノ酸配列ＥＲＫＸＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰ（配列番号１２９）またはＥＲＫＣＸＶＥＣＰＰＣＰＡＰ（配列番号１３０）を含んでいてよく、ここで、Ｘは、システインを除く任意のアミノ酸である。例えば、ヒンジは、アミノ酸配列ＥＲＫＳＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰ（配列番号１３１）またはＥＲＫＣＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰ（配列番号１３２）を含んでいてよい。特定の態様において、アミノ酸残基Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の少なくとも１つ、または全ては、欠失されているか、または別のアミノ酸残基、例えば、ＩｇＧ１ヒンジにおける対応するアミノ酸で置換されている。ある態様において、アミノ酸残基Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７のいずれも、またはＣ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７のいずれも、置換または欠失されていない。ある態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３は、別のアミノ酸で置換されている。抗体は、野生型ＩｇＧ１のそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＨ２ドメインを含んでいてよい。抗体は、野生型ＩｇＧ１のそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＨ３ドメインを含んでいてよい。ある態様において、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインではなく、抗体は、野生型ＩｇＧ１よりも強力なエフェクター機能を有する。ある態様において、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、野生型ＩｇＧ１ ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインではなく、抗体は、野生型ＩｇＧ１よりも効力の低いエフェクター機能を有する。ある態様において、抗体は、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ１ドメインを含む。ある態様において、抗体は、アゴニスト活性、抗体介在性の受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在性シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも1つの増強された特性；または、アゴニスト活性である、新たに付与された特性を有する。
ある態様において、抗体は、修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、（ａ）ＣＨ１ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインであり；（ｂ）ヒンジは、配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７のいずれか１つのアミノ酸配列、またはこれらの配列のＣＶＥとＣＰＰの間に１〜３個のアミノ酸挿入を含む配列を含み；（ｃ）ＣＨ２ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであるか、または該抗体に増強されたか、もしくは低減されたエフェクター機能を付与する、修飾されたＣＨ２ドメインであり；そして、（ｄ）ＣＨ３ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインであるか、または該抗体に増強されたか、もしくは低減されたエフェクター機能を付与する、修飾されたＣＨ３ドメインである。修飾された重鎖定常ドメインは、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、または配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
ある態様において、抗体は、修飾された重鎖定常領域を含み、ここで該重鎖定常領域は、配列

配列番号１３３と最大１０個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、または配列番号１３３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨ１ドメインおよびヒンジを含み、ここで、（ｉ）Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の少なくとも１つが、別のアミノ酸で置換されていないか、または欠失されておらず；（ｉｉ）Ｃ２１９およびＣ２２０が、別のアミノ酸で置換されているか、または欠失されていてよいが、Ｃ２１９およびＣ２２０の両方共が置換または欠失されておらず；（ｉｉｉ）１〜３個のアミノ酸が、ヒンジにおけるＣＶＥとＣＰＰの間に挿入されていてよく；（ｉｖ）ヒンジは、要すれば、Ｃ末端に付加アミノ酸、例えばＧを含んでよく；（ｖ）アミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の１個またはそれ以上が、別のアミノ酸（例えば、ＩｇＧ１由来の対応するアミノ酸）で置換されていてよいか、または欠失されていてよく；（ｖｉ）ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、野生型であるか、または修飾されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであってよく；（ｖｉｉ）修飾された重鎖定常領域は、野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳもしくはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重鎖定常ドメインではなく；そして、（ｖｉｉｉ）抗体は、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体と比べて、少なくとも１つの増強された特性または新たに付与された特性を有する。ある態様において、抗体は、アゴニスト活性、抗体介在性の受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在性シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも1つの増強された特性；または、アゴニスト活性である、新たに付与された特性を有する。ある態様において、アミノ酸Ｃ１３１；Ｒ１３３；Ｅ１３７；Ｓ１３８；Ｒ２１７のいずれも、別のアミノ酸で置換されていないか、または欠失されていない。ある態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３は、置換されていないか、またはそれぞれＮ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｌである。ある態様において、Ｃ２１９はＣ２１９Ｓであり、Ｃ２２０はＣ２２０Ｓであり、Ｐ２３３−Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ｖ２３４−Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ａ２３５−Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ｐ２３３は、置換または欠失されている；Ｐ２３３−Ｖ２３４は、置換または欠失されている；または、Ｐ２３３−Ａ２３５は、置換または欠失されている。抗体は、エフェクター機能を有していてもよいか、またはエフェクター機能を欠いていてもよい。抗体は、野生型または修飾されたＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインおよび／または野生型または修飾されたＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含み得る。
ある態様において、抗体は、修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、該重鎖定常領域は、配列

配列番号７と最大１０個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＣＨ１ドメインを含み、ここで、（ｉ）Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の少なくとも１つが置換または欠失されておらず；（ｉｉ）修飾された重鎖定常領域が、野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域、またはＣ２１９ＳもしくはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重鎖定常ドメインではない；そして、（ｉｉｉ）該抗体が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体と比べて、少なくとも１つの増強された特性または新たに付与された特性を有する。抗体は、アゴニスト活性、抗体介在性の受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在性シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも1つの増強された特性；または、アゴニスト活性である、新たに付与された特性を有する。ある態様において、アミノ酸Ｃ１３１；Ｒ１３３；Ｅ１３７およびＳ１３８はいずれも、別のアミノ酸で置換されていないか、または欠失されていない。ある態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３は、置換されていないか、またはそれぞれＮ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｌである。抗体は、エフェクター機能を有していてもよいか、またはエフェクター機能を欠いていてもよい。抗体は、野生型または修飾されたＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインおよび／または野生型または修飾されたＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含み得る。
抗体は、修飾された重鎖定常領域を含んでいてよく、ここで、重鎖定常領域は、配列

または配列番号８と最大５個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列、を含むヒンジを含み、ここで、（ｉ）Ｃ２１９およびＣ２２０は、別のアミノ酸で置換されていてよいか、または欠失されていてよいが、Ｃ２１９およびＣ２２０の両方共が置換または欠失されておらず；（ｉｉ）アミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の１個またはそれ以上が、置換または欠失されていてよく；（ｉｉｉ）１〜３個のアミノ酸が、ヒンジにおけるＣＶＥとＣＰＰの間に挿入されていてよく；（ｉｖ）ヒンジは、要すれば、Ｃ末端に付加アミノ酸、例えばＧを含んでよく；（ｖ）ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、野生型であるか、または修飾されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであってよく；（ｖｉ）修飾された重鎖定常領域は、野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳもしくはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重鎖定常ドメインではなく；そして、（ｖｉｉ）抗体は、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体と比べて、少なくとも１つの増強された特性または新たに付与された特性を有する。抗体は、アゴニスト活性、抗体介在性の受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在性シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも1つの増強された特性；または、アゴニスト活性である、新たに付与された特性を有する。ある態様において、Ｃ２１９はＣ２１９Ｓであり、Ｃ２２０はＣ２２０Ｓであり、Ｐ２３３−Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ｖ２３４−Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ａ２３５−Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ｇ２３７は、置換または欠失されている；Ｐ２３３は、置換または欠失されている；Ｐ２３３−Ｖ２３４は、置換または欠失されている；または、Ｐ２３３−Ａ２３５は、置換または欠失されている。抗体は、エフェクター機能を有していてもよいか、またはエフェクター機能を欠いていてもよい。抗体は、野生型または修飾されたＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインおよび／または野生型または修飾されたＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含み得る。
修飾された重鎖定常領域を有する抗体であって、該重鎖定常領域が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ヒンジを含み、ヒンジが１〜７個のアミノ酸を欠き、そして抗体が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体と比べて、少なくとも1つの増強された特性または新たに付与された特性を有する、抗体もまた提供される。抗体は、アゴニスト活性、抗体介在性の受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在性シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも1つの増強された特性；または、アゴニスト活性である、新たに付与された特性を有し得る。ヒンジは、１〜４個のアミノ酸、例えば、アミノ酸Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４を欠くＩｇＧ２ヒンジであり得る。ヒンジは、アミノ酸Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５を欠くＩｇＧ１ヒンジである。抗体は、野生型または修飾されたＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン；野生型または修飾されたＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインを含み得る。
修飾された重鎖定常領域を有する抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体、またはその抗原結合部分であり得る。ある態様において、抗体は、免疫調節に関与する抗原に特異的に結合する。抗体は、共刺激受容体のアゴニストまたは阻害受容体のアンタゴニストであり得る。例えば、抗体は、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８Ｈからなる群より選択される共刺激受容体に結合してよいか、または抗体は、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４からなる群より選択される阻害受容体に結合してよい。抗原は、内在化が必要とされる抗原、例えば、ＣＤ７３であり得る。抗原はＣＤ３９であり得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、共刺激受容体、例えば、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ２７またはすべての他のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに特異的に結合し、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８からなる群より選択される修飾された重鎖定常領域を含む。ある態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含まない抗体と比べて、増強または改変されたアゴニスト活性を示す。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、細胞表面分子、例えば、ＣＤ７３に特異的に結合し、抗体介在性の細胞表面分子の内在化を誘発し、そして配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８からなる群より選択される修飾された重鎖定常領域を含む。ある態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、増強または改変された内在化特性を有する。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、阻害受容体、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４に特異的に結合し、そして、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８からなる群より選択される修飾された重鎖定常領域を含む。ある態様において、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する同じ抗体と比べて、より強力な、または改変されたアンタゴニスト活性を示すか、または新たな活性を付与する。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、細胞表面分子に特異的に結合し、細胞内シグナル伝達を誘発し、ここで、該抗体は、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８からなる群より選択される修飾された重鎖定常領域を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達は、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、細胞表面分子の内在化、またはＡＤＣＣを仲介する。ある態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、より強力な細胞内シグナル伝達を誘発する。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、細胞表面分子に特異的に結合し、高分子量の抗体−細胞表面分子複合体の形成を誘発し、ここで、該抗体は、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８からなる群より選択される修飾された重鎖定常領域を含む。ある態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、より高分子量複合体の形成を誘発する。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、細胞表面分子に特異的に結合し、細胞表面分子のクラスター化またはオリゴマー化を誘発し、ここで、該抗体は、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８からなる群より選択される修飾された重鎖定常領域を含む。ある態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、細胞表面分子のクラスター化またはオリゴマー化をより誘発する。
本発明は、第２の結合特異性を有する分子に連結された修飾された重鎖定常領域を含む抗体を含む二重特異性分子もまた提供する。本発明は、第２の薬物に連結された、修飾された重鎖定常領域を含む抗体を含む免疫複合体もまた提供する。本明細書に記載の抗体、二重特異性または免疫複合体ならびに担体を含む組成物もまた、提供される。組成物は、１つまたは複数のさらなる治療剤を含んでいてよく、例えば、治療剤が免疫系を刺激し、例えば、チェックポイント阻害剤または共刺激受容体のアンタゴニストである。
本発明はまた、Ｎ末端からＣ末端の順にＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む、修飾された重鎖定常領域を含む抗体の製造方法であって、（ａ）ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；および、（ｂ）該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程、を含む方法を提供する。本発明はさらに、細胞による抗体の内在化を増大させる方法であって、（ａ）ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；および、（ｂ）該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程、を含む方法を提供する。抗体の内在化は、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えばＩｇＧ１定常領域を含む抗体の内在化と比べて増大され得る。また、抗体のアゴニスト活性を増大させる方法であって、（ａ）ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；および、（ｂ）該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程、を含む方法を提供する。アゴニスト活性は、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えばＩｇＧ１定常領域を含む抗体のアゴニスト活性と比べて増強され得る。ＩｇＧ２ヒンジは、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるか、または野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてよく、例えば、表４に記載の配列であってよい。方法は、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの少なくとも１つを、それぞれ異なるアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインで置換する工程を含み得る。方法は、（ａ）ＣＨ１ドメインをＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程；（ｂ）ＣＨ２ドメインをＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインで置換する工程；および／または（ｃ）ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインで置換する工程、を含み得る。方法は、（ａ）ＣＨ１ドメインを、野生型ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するドメインで置換する工程；（ｂ）ＣＨ２ドメインを、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するドメインで置換する工程；および／または（ｃ）ＣＨ３ドメインを、野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン、またはそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するドメインで置換する工程、を含み得る。方法は、重鎖定常領域を、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか１つを含む修飾された重鎖定常領域、または配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８と少なくとも９５％の配列同一性を有する領域で置換する工程を含み得る。ヒンジは、ジスルフィド結合の形成を低減または改変させる修飾を含み得る。ヒンジは、アミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを含み得る。ヒンジは、配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、またはこれらの配列のＣＶＥとＣＰＰの間に１〜３個のアミノ酸挿入を含む配列を含み得る。ＣＨ１ドメインは、アミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶ（配列番号７）
を含み得る。ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減または除くように修飾され得る。ＣＨ２ドメインは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含み得る。ＣＨ２ドメインは、アミノ酸配列
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号４）
を含み得る。ＣＨ２ドメインは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含み得る。ＣＨ３ドメインは、アミノ酸配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５）
を含み得る。
本明細書に記載の、例えば、上記の方法により産生される抗体、またはその抗原結合部分、例えば、ヒトまたはヒト化抗体もまた提供される。対象、例えば、癌を有する対象を、本明細書に記載の抗体のいずれかで処置する方法もまた、本明細書中に包含される。該方法は、１以上のさらなる治療剤、例えば、免疫系を刺激する治療剤を投与する工程をさらに含む。例えば、治療剤は、チェックポイント阻害剤または共刺激分子を標的とし得る。方法は、本明細書に記載の組成物、二重特異性分子、または免疫複合体を投与することを含み得る。
図１Ａは、Ｈ２２２８細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）における以下の抗体によるＣＤ７３の抗体介在性の内在化の動態を示す：１１Ｆ１１、４Ｃ３、６Ｄ１１、４Ｃ３Ｖｋ１軽鎖を有するＣＤ７３．３−ＩｇＧ１．１ｆ（“３−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１．１ｆ／４Ｃ３Ｖｋ１”）、１１Ｆ１１ Ｖｋ２軽鎖を有するＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ（“４−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ／１１Ｆ１１−Ｖｋ２”）、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ（“ＣＤ７３．１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ”）、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（“ＣＤ７３．１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ”）、およびＨ２２２８細胞におけるＣＤ７３．１０−ＩｇＧ１．１ｆ（“ＣＤ７３．１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１．１ｆ”）抗体。１１Ｆ１１（ＩｇＧ２アイソタイプである）、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳおよびＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ抗体は、他の試験抗体（ＩｇＧ１アイソタイプである）よりも速くかつより高度に内在化される。図１Ｂは、Ｈ２２２８細胞で得られたものと同様の結果を示す、ＨＣＣ１５細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）における、図１Ａに示されるものと同じ抗体の抗体介在性のＣＤ７３内在化の動態を示す。図１Ｃは、Ｈ２２２８およびＨＣＣ１５細胞で得られたものと同様の結果を示す、Ｃａｌｕ６細胞における、図１Ａおよび１Ｂに示されるものと同じ抗体、ならびにＣＤ７３．１１−ＩｇＧ２ＣＳ（“１１−Ｖｈ−ｈＶＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ”）の抗体介在性のＣＤ７３内在化の動態を示す。図１Ｄは、Ｈ２２２８、ＨＣＣ１５、およびＣａｌｕ６細胞で得られたものと同様の結果を示す、ＮＣＩ−２０３０細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）における、図１Ｃに示されるものと同じ抗体の抗体介在性のＣＤ７３内在化の動態を示す。図１Ｅは、フローサイトメトリーによって測定される、Ｃａｌｕ６細胞における示された抗体の抗体介在性のＣＤ７３内在化の動態を示す。図１Ｆは、フローサイトメトリーによって測定される、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（肺粘膜類表皮癌細胞株）における示された抗体の抗体介在性のＣＤ７３内在化であって、該抗体を用いた細胞の最初のインキュベーション後に抗体を洗浄しなかった場合の動態を示す。図１Ｇは、Ｃａｌｕ６細胞における示された抗体の抗体介在性の経時的ＣＤ７３内在化を示す、示された抗体で処理したＣａｌｕ６細胞におけるＣＤ７３内在化の割合を示す。図１Ｈは、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における示された抗体の抗体介在性の経時的ＣＤ７３内在化を示す、示された抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における経時的ＣＤ７３内在化の割合を示す。図１Ｉは、ＳＮＵ−Ｃ１細胞における示された抗体の抗体介在性の経時的ＣＤ７３内在化を示す、示された抗体で処理したＳＮＵ−Ｃ１細胞（結腸癌細胞株）における経時的ＣＤ７３内在化の割合を示す。図１Ｊは、ＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞における示された抗体の抗体介在性の経時的ＣＤ７３内在化を示す、示された抗体で処理したＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）における経時的ＣＤ７３内在化の割合を示す。
図２は、抗ＣＤ３（プレートをコーティングした）およびＣＤ２８−活性化ヒトＣＤ４Ｔ細胞に対する示された抗ヒトＧＩＴＲ抗体の結合動態およびグラフからの対応するＥＣ５０値を示す。 図３Ａ−Ｃは、異なる重鎖定常領域を有する可溶性抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激したドナーＣＤ４Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌を示す。図３Ａは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度のＩｇＧ２−ＩｇＧ１定常領域を有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激したドナーＣＤ４Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を示す。図３Ｂは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度のＩｇＧ１重鎖定常ドメインまたはＩｇＧ２−ＩｇＧ１ハイブリッド重鎖定常ドメインで刺激したドナーＣＤ４Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。図３Ｃは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度の図３ＡおよびＢにおける抗体のエフェクターを欠く（effectorless）バージョン（ＩｇＧ１．１）で刺激したドナーＣＤ４Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。 図４は、示された抗ヒトＧＩＴＲ抗体：ハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ（ＩｇＧ２）およびＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ１．１（エフェクター機能を欠く）、またはＩｇＧ２ヒンジを有するキメラのような組換え誘導体の増加量の存在下での、抗ＣＤ３モノクローナル抗体でコーティングしたプレート上で培養した３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。 図５Ａ−Ｄは、抗体／抗原複合体のサイズに対するＩｇＧ２ヒンジの効果を示す。図５Ａ−Ｃは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと異なる定常領域を含む抗体ＣＤ７３．４の複合体について、ＳＥＣクロマトグラムデータ、ＤＬＳデータおよびＭＡＬＳデータを示す。図５Ｄは、図５ＣにおけるＭＡＬＳにより決定された質量に由来するｈＣＤ７３−ｈｉｓ／ｍＡｂ複合体の図式モデルを示す。
図６は、ＣＤ７３／ｍＡｂ複合体についてのＳＥＣ−ＭＡＬＳデータを示す。 図７は、ＣＤ７３／ｍＡｂ複合体についてのＤＬＳデータを示す。 図８Ａは、Ｃａｌｕ６細胞における示された抗体の抗体介在性の経時的ＣＤ７３内在化を示す、示された抗体で処理されたＣａｌｕ６細胞におけるＣＤ７３内在化の経時的割合を示す。図８Ｂは、Ｃａｌｕ６細胞における示された抗体の抗体介在性の経時的ＣＤ７３内在化を示す、示された抗体で処理されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＣＤ７３内在化の経時的割合を示す。図８Ｃは、０、５、１５または３０分間、５μｇ／ｍｌの示された抗体で処理されたＣａｌｕ６細胞表面上のＣＤ７３レベルを示す。 図９は、示された定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下での、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２レベルを示す。 図１０は、示された抗体のそれぞれの添加の１、４または２１時間後の、抗体介在性のＣＤ７３内在化の割合を示す。各抗体の棒グラフは、２１時間（左）、４時間（中央）および１時間（右）の順に示されている。
図１１Ａは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと、異なる定常領域配列を含む１６個の異なるＣＤ７３．４抗体の１：１モル複合体の、ＳＥＣクロマトグラムデータのオーバーレイを示す。図１１Ｂは、示される４つの異なる溶出種を含む、図１０Ａのクロマトグラムの１１〜１９．５分のクロマトグラムデータの拡大を示す。図１１Ｃは、１６個の異なる抗体／ＣＤ７３−ｈｉｓ複合体についてプロットした、図１１Ｂのピーク２に対するＵＶクロマトグラムシグナル領域の割合を示す。データは、ピーク面積が大きい順に左から右に並べられている。 図１２は、抗ｈｉｓ Ｆａｂ捕捉ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質に結合する抗体を示す。結合応答は、１：１のｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論と仮定すると、理論的Ｒｍａｘの割合としてプロットされる。各抗体の棒グラフは、スライド下部に提供される色の凡例により示される。 図１３は、抗ｈｉｓ Ｆａｂ捕捉ＦｃｇＲ−ｈｉｓタンパク質に結合する抗体を示す。結合応答は、１：１のｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論と仮定すると、理論的Ｒｍａｘの割合としてプロットされる。各抗体の棒グラフは、スライド下部に提供される色の凡例により示される。 図１４Ａは、抗ｈｉｓ Ｆａｂ捕捉ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質に結合する抗体を示す。結合応答は、１：１のｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論と仮定すると、理論的Ｒｍａｘの割合としてプロットされる。各抗体の棒グラフは、スライド下部に提供される色の凡例により示される。図１４Ｂは、抗ｈｉｓ Ｆａｂ捕捉ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質に結合する抗体を示す。結合応答は、１：１のｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論と仮定すると、理論的Ｒｍａｘの割合としてプロットされる。各抗体の棒グラフは、スライド下部に提供される色の凡例により示される。 図１５は、抗ＧＩＴＲ抗体の内在化の時間経過分析を示す。
図１６Ａは、０時間での、ＧＩＴＲおよび早期エンドソームマーカーＥＥＡ２の共局在分析を示す。図１６Ｂは、時間３０および１２０分での、ＧＩＴＲおよび早期エンドソームマーカーＥＥＡ２の共局在分析を示す。図１６Ｃは、全染色と比べて共局在ピクセル強度の割合としてプロットされる、図１６ＡおよびＢに示されるエンドソーム共局在の定量の結果を示す。 図１７Ａは、示される抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＮＦｋＢシグナル伝達の活性化を示す。図１７Ｂは、示される抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＮＦｋＢシグナル伝達の活性化を示す。 図１８は、示される抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰ３８活性化を示す。 図１９は、立体構造Ａ、ＢまたはＡ／Ｂを有するＩｇＧ２抗体におけるジスルフィド結合の形状を示す。 図２０Ａは、異なる濃度の示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下での、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２レベルを示す。図２０Ｂは、５μｇ／ｍｌの示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下での、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２レベルを示す（図２０Ａと同じ実験）。図２０Ｃは、１．２５μｇ／ｍｌの示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下での、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２レベルを示す（図２０Ａと同じ実験）。図２０Ｄは、０．３１３μｇ／ｍｌの示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下での、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２レベルを示す（図２０Ａと同じ実験）。
詳細な説明
本発明は、抗体がＩｇＧ２ヒンジを含むとき、非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ抗体と比べて（または、ＩｇＧ１定常領域を含む同じ抗体と比べて）、抗体の以下の特性：（ｉ）内在化；（ｉｉ）アゴニスト機能；（ｉｉｉ）受容体介在性の細胞内シグナル伝達；（ｉｖ）ＡＤＣＣ；および、（ｖ）抗体／抗原複合体の重量が、増加または改変されるという発見に、少なくとも部分的に基づく。加えて、抗体のこれらの増強または改変された特性は、該抗体が、ＩｇＧ２ヒンジに加えて、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含むときに、さらに増強または改変される。ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有するが、ＩｇＧ２ヒンジを有さない抗体が、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを有する同じ抗体と比べて増強または改変された活性を有することも観察されている。特定の作用機序に限定されることなく、ＩｇＧ２ヒンジの増強された効果は、抗体／抗原複合体のサイズの増加と相関することが見いだされている。抗体がＩｇＧ２ヒンジを有するとき、抗体／抗原複合体のサイズの増加は、他のアイソタイプのものと比べてＩｇＧ２ヒンジの高剛性に起因し得る。さらに、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの特定の領域またはアミノ酸残基が修飾されて、一方で、他のものは好ましくは修飾されずに、増強または改変された活性を維持することができることが示されている。
本明細書にさらに記載するとおり、増強または修飾された活性を抗体（またはその抗原結合領域）に与えるこれらの修飾された重鎖定常領域は、エフェクター機能を有し得る。従って、抗体はＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインによって付与される有利な特性を有し、また、エフェクター機能を有するように作製され得ることが示された。
本発明はまた、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体中のヒンジの特定の部分の欠失が、ＩｇＧ１定常領域を有する抗体と比べて、増強または改変された特性を有する抗体をもたらすという発見に少なくとも一部基づいている。
従って、本発明は、（ｉ）抗体の抗原結合領域に増強または改変された特性を付与する修飾された重鎖定常領域を有する抗体およびそれらの使用法、ならびに（ｉｉ）非ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体のある生物学的特性、例えば内在化、アゴニズムおよびアンタゴニズムを増強または改変する方法であって、抗体の非ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインもしくはその部分で置換することを含む方法を提供する。
本発明は、異なる定常領域を有する同じ抗体と比べて、抗体、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する抗体の特定の生物学的特性を増強する“修飾された重鎖定常領域”を提供する。修飾された重鎖定常領域の例としては、ＩｇＧ２ヒンジ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが挙げられ、ここで、これらの定常ドメインの少なくとも１つは、ＩｇＧ２アイソタイプのものではなく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであり得る。ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジならびにＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ２ヒンジを含む。ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む。修飾された重鎖定常領域は、野生型ＩｇＧ１と同様のエフェクター機能を有し得るか、または野生型ＩｇＧと比べて、低減または増強されたエフェクター機能を有するように作製され得る。修飾された重鎖定常領域は、野生型ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、あるいはそれらの変異体、例えば、対応する野生型ドメインと比較して１個以上のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有する、および／または対応する野生型配列と少なくとも９０％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含んでいてよい。
定義
本明細書の記載をより容易に理解し得るようにするため、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
本明細書で用いる用語“抗体”は、全長抗体およびそのすべての抗原結合断片（例えば、ヒンジを含む抗原結合断片、ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む抗原結合断片、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む抗原結合断片、またはヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの一部を含む抗原結合断片）またはその単鎖抗体を含み得る。一態様において、“抗体”は、タンパク質、例えば、ジスルフィド結合により内部で連結された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中、ＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。特定の天然ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体において、重鎖定常領域は、ヒンジ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる。特定の天然抗体において、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中、ＶＬと略す）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される変異性の高い領域に細分され、その間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存性の高い領域が存在している。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。該重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が含まれる、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介することができる。
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、それらに限定されない、周知のアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種のサブタイプに分けられ、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、マウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３に分けられる。ある態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１には、せいぜい数個のアミノ酸が互いに異なる幾つかのアロタイプが存在する。“抗体”には、一例として、天然抗体および非天然抗体の両方；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体；完全合成抗体；および単鎖抗体が含まれ得る。
ある態様において、抗体の重鎖は、Ｃ末端リシン；Ｃ末端グリシン（Ｃ末端リシンを欠く）を含むか、またはＧＫを欠くか、もしくはＫを欠く。本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域を含む抗体に言及するとき、抗体は、Ｃ末端ＧＫまたはＫを有するか、あるいは、ＧＫまたはＫを欠く、提供された配列を含み得る。
アミノ酸の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD）に従い、および米国特許出願第２００８／０２４８０２８号の図３ｃ−３ｆに従っている。
本明細書で用いる用語、抗体の“抗原結合部分”は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を意味する。抗体の抗原結合部分は、“ヒンジ含有抗原結合部分”であり得る。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行可能であることが示されている。用語、本明細書に記載の抗体の“抗原結合部分”に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544−546）；および、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または必要に応じて合成リンカーによって連結され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせ、が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え法を用いて、一本のタンパク質鎖として作製できる合成リンカーにより連結でき、ここで、ＶＬおよびＶＨ領域は対となって、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価の分子を形成する；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423−426;および、 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883を参照のこと。このような一本鎖抗体もまた、抗体の“抗原結合部分”に包含されることが意図される。これらの、および他の可能性のある構築物は、Chan ＆ Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の常套法を用いて入手可能であり、該断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の免疫グロブリンの酵素的切断または化学的切断により、産生され得る。
可変ドメインの“ＣＤＲ”は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の組み合わせ、ＡｂＭ定義、接触定義(contact definition)、および／もしくはコンフォメーション定義(conformational definition)、または当技術分野で周知の任意のＣＤＲ決定法に従って同定される、超可変領域内のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって最初に定義された超可変領域として同定され得る。例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.Cを参照のこと。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらによって最初に記載された構造的ループ構造としても同定され得る。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａらの、1989, Nature 342:877−883を参照のこと。ＣＤＲ同定のための他の手法には、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して誘導される“ＡｂＭ定義”、または、ＭａｃＣａｌｌｕｍらの、1996, J. Mol. Biol., 262:732−745に記載の、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの“接触定義”が含まれる。本明細書中でＣＤＲの“コンフォメーション定義”と言う別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対してエンタルピー的寄与を行う残基として同定され得る。例えば、Makabe et al., 2008, Journal of Bio;ogical Chemistry, 283:1156−1166を参照のこと。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法のうちの１つに厳密には従わない場合があるが、それにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部分と重複する。ただし、これらは、特定の残基や残基の群、またはＣＤＲ全体さえもが、抗原結合に顕著な影響を与えないという予測または実験的発見に鑑みて、短縮または伸長されている場合がある。本明細書で用いるＣＤＲとは、手法の組合せを含めた、当技術分野で公知の任意の手法によって定義されたＣＤＲを意味し得る。本明細書で用いる方法は、これらの手法のうちの任意のものに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。２以上のＣＤＲを含有する任意の所定の態様において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、その拡張、ＡｂＭ定義、接触定義、および／またはコンフォメーション定義のうちの任意のものに従って定義され得る。
本明細書で用いる“アイソタイプ”は、重鎖定常ドメイン遺伝子によってコードされている抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体）を意味する。各野生型ヒトＩｇＧ定常領域（全てのドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む）の完全長アミノ酸配列は、オンラインで利用可能なＵｎｉＰｒｏｔデータベース内に登録されており、例えば、Ｐ０１８５７（ＩｇＧ１）、Ｐ０１８５９（ＩｇＧ２）、Ｐ０１８６０（ＩｇＧ３）、およびＰ０１８６１（ＩｇＧ４）、またはそれらの異なるアロタイプ（それぞれ、配列番号１、６、１１および１６）である。本明細書で用いる、重鎖定常領域の１つのドメイン、例えば、ヒンジは、該ドメインが、それぞれのアイソタイプの対応するドメインのアミノ酸配列、またはその変異体を有する（他のアイソタイプのものとよりも、それぞれのアイソタイプの対応するドメインにより高い相同性を有する）場合、“ＩｇＧ１アイソタイプ”、“ＩｇＧ２アイソタイプ”、“ＩｇＧ３アイソタイプ”または“ＩｇＧ４アイソタイプ”のものである。
“アロタイプ”は、特定のアイソタイプ群内の天然変異体であって、数個のアミノ酸のみが異なる変異体（例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）を意味する。本明細書に記載の抗体は、すべてのアロタイプのものであり得る。
“野生型”タンパク質またはその部分は、天然に見いだされるタンパク質の１つのバージョンである。野生型タンパク質、例えば、重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それが天然ような、タンパク質のアミノ酸配列である。アロタイプの違いによって、野生型タンパク質に対して２以上のアミノ酸配列が存在し得る。例えば、天然ヒトＩＧｇ１重鎖定常領域のいくつかのアロタイプが存在する（例えば、Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。
“Ｆｃ領域”（結晶性断片領域）または“Ｆｃドメイン”または“Ｆｃ”は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置するＦｃ受容体または古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介する、抗体の重鎖のＣ末端領域を意味する。従って、アイソタイプＩｇＧの抗体のＦｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１）を欠く、抗体の重鎖定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖のぞれぞれにＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む；ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、それぞれのポリペプチド鎖内に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２−４）を含む。ＩｇＧに関して、Ｆｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３からなる免疫グロブリンドメインを含む。本発明の目的に関して、Ｆｃ領域は、アミノ酸２１６で開始し、アミノ酸４４７で終わるように定義され、ここで番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD）に従い、および米国特許出願第２００８／０２４８０２８号の図３ｃ−３ｆに従っている。Ｆｃは、アロタイプ変異体を含む、天然（または、天然か、または野生型）Ｆｃ、または例えば、１、２、３、４、５、１−５、１−１０または５−１０またはそれ以上のアミノ酸変異、例えば、置換、付加または欠失を含む、変異型Ｆｃ（例えば、非天然Ｆｃ）を含む。例えば、変異多がＦｃは、野生型Ｆｃと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。修飾された、または変異されたＦｃは、増強(増大)または低減されたエフェクター機能および／または半減期を有し得る。ＣＨ２およびＣＨ３領域は、エフェクター機能およびＦｃＲｎ結合の主要部位である。Ｆｃは、分離して、またはＦｃ含有タンパク質ポリペプチド、例えば、“Ｆｃ融合タンパク質”とも言う“Ｆｃ領域を含む結合タンパク質”（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）の文脈でも、この領域を意味し得る。
“エフェクター機能”とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用、またはそれから生じる生化学的事象を意味する。“エフェクター機能”の例には、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ介在性エフェクター機能、例えばＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御が含まれる。そのようなエフェクター機能は、一般的に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と連結されるＦｃ領域を必要とする。
“Ｆｃ受容体”または“ＦｃＲ”は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシング型を含む、ＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３種の活性型（マウスでは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶ；ヒトでは、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１つの阻害型（ＦｃγＲＩＩＢ）受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の特性を表１にまとめる。天然の（innate）エフェクター細胞タイプの大部分は、１以上の活性型ＦｃγＲおよび阻害型ＦｃγＲＩＩＢを共発現しており、一方で、マウスおよびヒトにおいて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１つの活性型Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩおよびヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するが、阻害型ＦｃγＲＩＩＢは発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性型Ｆｃ受容体のタイプに関してマウスＩｇＧ２ａと同等と考えられる。
“ヒンジ”、“ヒンジドメイン”または“ヒンジ領域”または“抗体ヒンジ領域”は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合し、ヒンジの上部、中央、および下部を含む、重鎖定常領域のドメインを意味する（Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083）。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域との間の柔軟性の様々なレベルを提供し、また２つの重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合のための部位を提供する。本明細書で用いるヒンジは、全てのＩｇＧアイソタイプについて、Ｇｌｕ２１６から開始し、Ｇｌｙ２３７で終わる（Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083）。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジの配列を表２に示す。
用語“ヒンジ”は、野生型ヒンジ（例えば、表３に記載のもの）、ならびにその変異体（例えば、非天然ヒンジまたは修飾されたヒンジ）を含む。例えば、用語“ＩｇＧ２ヒンジ”は、表３に示すような野生型ＩｇＧ２ヒンジ、ならびに１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５個および／または多くとも５、４、３、２または１個の変異、例えば、置換、欠失または付加を有する変異体を含む。ＩｇＧ２ヒンジ変異体の例には、ＩｇＧ２ヒンジが含まれ、それは、１、２、３個または４個全てのシステイン（Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９）が別のアミノ酸に置換されている。特定の態様において、ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９ＸまたはＣ２２０Ｘ置換を含み、ここで、Ｘは、システインを除くすべてのアミノ酸である。IｇＧ２ヒンジは、置換を含んでいてよく、それは、単独で、または重鎖もしくは軽鎖の他の領域における１つ以上の置換と共に、該ヒンジを含む抗体を形態ＡまたはＢにすることができる（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755）。ある態様において、ヒンジは、少なくとも２つのアイソタイプからの配列を含むハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、１つのアイソタイプ由来の上部、中央または下部のヒンジ、および１以上の他のアイソタイプ由来の残りの部分のヒンジを含んでいてよい。例えば、ヒンジは、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってもよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中央ヒンジならびにＩｇＧ１の下部ヒンジを含んでいてもよい。ヒンジは、エフェクター機能を有し得るか、またはエフェクター機能を失い得る。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジは、エフェクター機能を提供する。
“非ＩｇＧ２”ヒンジは、ＩｇＧ２アイソタイプ由来ではないヒンジを意味する。
用語“ＣＨ１ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおいて可変ドメインをヒンジに連結する重鎖定常領域を意味する。本明細書で用いる、ＣＨ１ドメインは、Ａ１１８から開始し、Ｖ２１５で終わる。用語“ＣＨ１ドメイン”には、野生型ＣＨ１ドメイン（例えば、配列番号２のＩｇＧ１および配列番号７のＩｇＧ２を有する；表３）、ならびにその変異体（例えば、非天然ＣＨ１ドメインまたは修飾されたＣＨ１ドメイン）が含まれる。例えば、用語“ＣＨ１ドメイン”には、野生型ＣＨ１ドメイン、および１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５個および／または多くとも５、４、３、２または１個の変異、例えば、置換、欠失または付加を含むその変異体が含まれる。ＣＨ１ドメインの例には、抗体の生物学的活性、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などを修飾する変異を有するＣＨ１ドメインが含まれる。抗体の生物学的活性に影響を与えるＣＨ１ドメインに対する修飾は、本明細書に記載される。
用語“ＣＨ２ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおいてヒンジをＣＨ３ドメインに連結する重鎖定常領域を意味する。本明細書で用いる、ＣＨ２ドメインは、Ｐ２３８から開始し、Ｋ３４０で終わる。本明細書で用いる用語“ＣＨ２ドメイン”には、野生型ＣＨ２ドメイン（例えば、配列番号４のＩｇＧ１を有する；表３）、ならびにその変異体（例えば、非天然ＣＨ２ドメインまたは修飾されたＣＨ２ドメイン）が含まれる。例えば、用語“ＣＨ２ドメイン”には、野生型ＣＨ２ドメイン、および１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５個および／または多くとも５、４、３、２または１個の変異、例えば、置換、欠失または付加を含むその変異体が含まれる。ＣＨ２ドメインの例には、抗体の生物学的活性、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などを修飾する変異を有するＣＨ２ドメインが含まれる。ある態様において、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減する、置換Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含む。抗体の生物学的活性に影響を与えるＣＨ２ドメインに対する他の修飾は、本明細書に記載される。
用語“ＣＨ３ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおいてＣＨ２ドメインのＣ末端に位置する重鎖定常領域を意味する。本明細書で用いる、ＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１から開始し、Ｋ４４で終わる。用語“ＣＨ３ドメイン”には、野生型ＣＨ３ドメイン（例えば、配列番号５のＩｇＧ１を有する；表３）、ならびにその変異体（例えば、非天然ＣＨ３ドメインまたは修飾されたＣＨ３ドメイン）が含まれる。例えば、用語“ＣＨ３ドメイン”には、野生型ＣＨ３ドメイン、および１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５個および／または多くとも５、４、３、２または１個の変異、例えば、置換、欠失または付加を含むその変異体が含まれる。ＣＨ３ドメインの例には、抗体の生物学的活性、例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などを修飾する変異を有するＣＨ３ドメインが含まれる。抗体の生物学的活性に影響を与えるＣＨ３ドメインに対する他の修飾は、本明細書に記載される。
本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体、または全ての抗体が特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す複数の抗体組成物を意味する。一般的に、かかるモノクローナル抗体は、単一の細胞または抗体をコードする核酸から誘導され、意図的に配列変化を導入することなく伝播され得る。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変および任意の定常領域を有するモノクローナル抗体を意味する。一態様において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは染色体導入（transchromosomal）非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を、不死化細胞と融合させて得られる、ハイブリドーマにより産生される。
本明細書で用いる用語“組換えヒト抗体”は、組換え手段によって製造、発現、作製または単離される全てのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子によるトランスジェニックもしくは染色体導入である動物（例えば、マウス）、またはそれから作製されたハイブリドーマより単離される抗体、（ｂ）抗体を発現させるために形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）などから単離される抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、ならびに（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む、その他のいかなる手段によっても、製造、発現、作製または単離される抗体である。そのような組換えヒト抗体は、特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を利用し、該生殖細胞遺伝子によりコードされる可変および定常領域を含むが、例えば、抗体の成熟中に起こる、その後の再構成および変異も含む。当技術分野で公知の通り（例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117−1125を参照のこと）、可変領域は、抗原結合ドメインを含み、それは、外来抗原に対する抗体の特異性を形成するために再構成される種々の遺伝子によってコードされている。再構成に加えて、可変領域は、外来抗原に対する抗体の親和性を増加するために複数の単一アミノ酸を変化（体細胞性変異または超突然変異（hypermutation）と称される）させることによりさらに修飾され得る。定常領域は、抗原に対するさらなる応答において変化し得る（すなわち、アイソタイプスイッチ）。従って、抗原に対する応答として軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする、再構成および体細胞性変異した核酸配列は、元の生殖細胞系配列と同一ではないが、その代わりに、実質的に同一または類似であり得る（すなわち、少なくとも８０％の同一性を有する）。
“ヒト”抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する、可変領域を有する抗体を意味する。さらに、抗体が定常領域を含むとき、該定常領域もまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載の抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含む（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異による変異）。しかしながら、本明細書で用いる用語“ヒト抗体”は、別の哺乳動物種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語“ヒト”抗体および“完全ヒト”抗体は、同義的に使用されている。
“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸のいくつか、大部分または全てが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている、抗体を意味する。抗体のヒト化形態の一態様において、ＣＤＲドメイン外の幾つか、大部分または全てのアミノ酸は、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置換されており、一方、１以上のＣＤＲ領域内の幾つか、大部分または全てのアミノ酸は変化していない。アミノ酸の少しの付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それらが特定の抗原に結合する該抗体の能力を無効にしない限り、許容される。“ヒト化”抗体は、元の抗体と同程度の抗原特異性を保持する。
“キメラ抗体”は、可変領域がある種に由来し、そして定常領域が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域がマウス抗体に由来し、そして定常領域がヒト抗体に由来する抗体を意味する。
“二重特異性”または“二機能性（bifunctional）”抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対を有する人工ハイブリッド抗体であって、それは、異なる抗原に対する特異性を有する２つの抗原結合部位を生じる。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む種々の方法によって製造することができる。例えば、Songsivilai ＆ Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315−321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547−1553 (1992)を参照のこと。
語句“抗原を認識する抗体”および“抗原に対して特異的な抗体”は、本明細書中、用語“抗原に対して特異的に結合する抗体”と互換的に使用される。
本明細書で用いる、“単離された抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することが意図される（例えば、抗原“ｘ”に特異的に結合する単離された抗体は、抗原“ｘ”以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、抗原“ｘ”のエピトープに特異的に結合する単離された抗体は、異なる種に由来する他の抗原“ｘ”タンパク質に対する交差反応性を有していてもよい。
本明細書で用いる、“アゴニスト抗体”は、共刺激受容体のアゴニストである抗体、例えば、タンパク質の活性を刺激することにより、対象の免疫系（または免疫応答）を増強することができる抗体を意味し、すなわち、免疫細胞、例えばＴ細胞を刺激する抗体、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、またはＣＤ２７、ＤＲ３、またはＣＤ２８Ｈタンパク質である。ある態様において、アゴニスト抗体は、阻害受容体の活性を増強する抗体、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、またはＴＩＭ−４であって、それにより免疫応答を阻害する。
本明細書で用いる、“アンタゴニスト抗体”は、免疫細胞、例えばＴ細胞上の阻害シグナルのアンタゴニストである抗体、例えば、Ｔ細胞活性化を阻害するたんぱく質を阻害または遮断することができる抗体（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）を意味し、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、またはＴＩＭ−４であり、それにより免疫応答を刺激する。特定の態様において、アンタゴニスト抗体は、刺激性受容体の活性を阻害する抗体、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、またはＣＤ２７、ＤＲ３、またはＣＤ２８Ｈであり、それにより免疫応答を阻害する。
アゴニストおよびアンタゴニスト抗体の両方は、抗原特異的Ｔ細胞応答の増幅、または抗原特異的Ｔ細胞応答の阻害（免疫チェックポイント調節因子）をもたらし得る。
用語“エピトープ”または“抗原決定基”は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＧＩＴＲ）上の部位を意味する。タンパク質抗原内のエピトープは、連続するアミノ酸（通常、線形エピトープ）またはタンパク質の三次元折り畳みによって形成される連続しないアミノ酸（通常、立体構造エピトープ）の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは一般的に、常にではないが、変性溶媒への暴露により保持されるが、一方、三次元の折り畳みで形成されるエピトープは一般的に、変性溶媒での処理により失われる。エピトープは一般的に、独特の空間的立体構造中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。どのエピトープが所定の抗体に結合されるかを決定する方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当技術分野でよく知られており、例えば、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイが含まれ、ここで、重複または連続するペプチドの所定の抗体との反応性を試験する。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、当技術分野の、および本明細書に記載の技術が含まれ、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳ（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと）である。
ある物に対して本明細書で用いる用語“天然”は、当該物が天然に見いだされ得るという事実を意味する。例えば、天然の供給源から単離することができ、実験室内でヒトにより意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
“ポリペプチド”は、少なくとも２つの連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖であって、鎖の長さに上限はない鎖を意味する。タンパク質中の１以上のアミノ酸残基は、例えば、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの、これらに限定されない、修飾を含み得る。“タンパク質”は、１以上のポリペプチドを含み得る。
本明細書で用いる用語“核酸分子”は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであってもよい。
例えば、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、ならびに、ヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失を含む、本明細書に記載の配列の“保存的配列修飾”もまた提供される。例えば、修飾は、配列番号１〜７４中に当技術分野で公知の標準的技術によって、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発によって、導入され得る。保存的配列修飾には、保存的アミノ酸置換が含まれ、ここで、該アミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
一態様において、重鎖定常領域またはそのドメインのアミノ酸配列修飾は、重鎖定常領域の特定の特性を改変したり、無効にしたりしない。これらの特性には、例えば、ヒンジの剛性（rigidity or stiffness）、ならびに抗体のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性が含まれる。ある態様において、重鎖定常領域またはそのドメインのアミノ酸配列修飾は、重鎖定常領域の特定の特性を変更し、または無効にする。
抗体および／または定常領域の特性を無効にする、および無効にしない、アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、実施例部分に記載の通りに実施する。
核酸について、用語“実質的に相同”は、最適に整列させて比較した場合に、２つの核酸またはその中の指定した配列が、適当なヌクレオチドの挿入または欠失を伴っても、少なくとも約８０％のヌクレオチド、通常少なくとも約９０％から９５％、およびより好ましくは少なくとも約９８％から９９．５％のヌクレオチドが同一であることを意味する。あるいは、実質的な相同性は、セグメントが鎖の相補体に、選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするときに存在する。
ポリペプチドについて、用語“実質的に相同”は、最適に整列させて比較した場合に、２つのポリペプチドまたはその指定した配列が、適当なアミノ酸挿入または欠失を伴っても、少なくとも約８０％のアミノ酸、通常少なくとも約９０％から９５％、およびより好ましくは少なくとも約９８％から９９．５％のアミノ酸が同一であることを意味する。
２つの配列間の同一性パーセントは、配列が最適に整列されるとき、該配列によって共有される同一な位置の数の関数であり（すなわち、同一性％＝同一である位置の数／位置の総数×１００）、ここで、最適アライメントは、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して決定されており、それらは２つの配列の最適アライメントのために導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間の同一性％の決定は、限定されないが、以下に例示するような数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。
２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用い（http://www.gcg.comで利用可能）、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いて決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性％はまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11−17 (1989)）のアルゴリズムを用い、残基重み表（weight residue table）ＰＡＭ１２０、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http://www.gcg.comで利用可能）に組み込まれたNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48:444−453 (1970)）アルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いて決定することができる。
本明細書に記載の核酸およびタンパク質配列は、“クエリー配列”としてさらに使用することができ、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対する検索を実行する。かかる検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403−10に記載のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、本明細書に記載の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２として実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、本明細書に記載のタンパク質分子に等価なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３として実行することができる。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389−3402に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
本明細書で用いる、用語“抗原”は、タンパク質、ペプチド、またはハプテンなどの、すべての天然または合成の免疫原性物質を意味する。抗原は、完全長または成熟タンパク質、またはその断片であってもよい。
“免疫応答”は、外来物に対する脊椎動物における生物学的応答であって、これらの物に対して、およびそれらにより引き起こされる疾患から生物を保護する応答を意味する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）およびこれらの細胞により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用、または病原体が侵入している脊椎動物体、病原体に感染した細胞または組織、癌または他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常なヒト細胞または組織の、選択的標的化、それへの結合、その損傷、その破壊、および／またはそれからの排除をもたらす肝臓の作用により仲介される。免疫反応には、例えばＴ細胞、例えばエフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞、例えばＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化または阻害、またはＴｒｅｇ細胞の阻害が含まれる。
“免疫モジュレーター”または“免疫調節剤”は、薬物、例えば、シグナル伝達経路の成分を意味し、それは免疫応答の変調、制御または調節に関与し得る。免疫応答の“変調”、“制御”または“調節”とは、免疫系の細胞またはかかる細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）の活性におけるすべての変化を意味する。そのような変調には、種々の細胞タイプの数の増減、これらの細胞の活性の増減、または免疫系内で発生し得るすべての他の変化によって顕在化し得る免疫系の刺激または抑制が含まれる。阻害性および刺激性の免疫モジュレーターの両方が同定されており、それらの幾つかは、腫瘍微小環境中で増強された機能を有し得る。好ましい態様において、免疫モジュレーターは、Ｔ細胞表面に配置されている。“免疫モジュレーター標的”または“免疫調節標的”は、物質、薬物、部分、化合物または分子により結合の標的とされる免疫モジュレーターであり、そしてそれらの結合によりその活性が変化する免疫モジュレーターである。免疫モジュレーター標的には、例えば、細胞表面の受容体（“免疫モジュレーター受容体”）および受容体リガンド（“免疫モジュレーターリガンド”）が含まれる。
“免疫療法”は、免疫応答を誘導する、抑制する、または他の変調することを含む方法による、疾患に罹患している、罹患するリスクのある、または再発するリスクのある対象の処置を意味する。
“免疫刺激療法”または“免疫賦活療法”は、例えば、癌の処置のために、対象において免疫応答の増加(誘導または増強)をもたらす治療を意味する。
“内因性の免疫応答を増強する”は、対象における既存の免疫応答の有効性および効力を増加することを意味する。この有効性および効力の増加は、例えば、内因性の宿主免疫応答を抑制する機序を克服すること、または内因性の宿主免疫応答を増強する機序を刺激することによって、達成され得る。
“Ｔエフェクター”（“Ｔｅｆｆ”）細胞は、細胞溶解活性を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）ならびにサイトカインを分泌し、直接他の免疫細胞を活性化するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞を意味するが、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は含まれない。
本明細書で用いる、用語“連結”は、２以上の分子の結合を意味する。連結は、共有結合または非共有結合であり得る。連結はまた、遺伝子的（すなわち、組換え融合）であり得る。かかる連結は、化学的結合および組換えタンパク質産生などの当技術分野で認識されている多様な技術を用いて達成することができる。
本明細書で用いる、“投与”は、当業者に公知の種々の方法および送達方法を用いる、対象への治療薬を含む組成物の物理的導入を意味する。本明細書に記載の抗体の好ましい投与経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路、例えば注射または点滴が含まれる。本明細書で用いる用語“非経腸投与”は、通常は注射による、限定されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、ならびにインビボでのエレクトロポレーションを含む、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味する。あるいは、本明細書に記載の抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所投与などの、非経張経路を介して投与され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または長期間に１回以上の回数で行われ得る。
本明細書で用いる、用語“Ｔ細胞介在性応答”は、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）およびヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）を含む、Ｔ細胞によって媒介される応答を意味する。Ｔ細胞介在性応答には、例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性および増殖が含まれる。
本明細書で用いる、用語“細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答”とは、細胞傷害性Ｔ細胞により誘導される免疫応答を意味する。ＣＴＬ応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって主に媒介される。
本明細書で用いる用語“阻害する”または“阻止する”（例えば、その受容体またはその後の細胞内応答に対するリガンドの阻害／阻止を意味する）は、互換的に用いられ、部分的および完全な阻害／阻止の両方を包含している。いくつかの態様において、抗体は、例えば本明細書にさらに記載の通りに決定される、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％、結合を阻害する。
本明細書で用いる“癌”は、身体における異常細胞の制御不能な増殖によって特徴付けられる疾患の広範な群を意味する。無制御の細胞分裂は、悪性腫瘍または隣接組織に浸潤する細胞の形成をもたらす可能性があり、リンパ系または血流を介して身体の離れた部分に転移をもたらし得る。
本明細書で用いる用語“処置する(treat)”、“処置(treating)”および“処置(treatment)”は、症状、合併症、病状または疾患に関係する生化学的徴候の進行、進展、重症度または再発を逆転、緩和、改善、阻害もしくは遅延または防止する目的で、対象に実行される介入またはプロセスのすべての形態、または対照への活性剤の投与を意味する。予防は、疾患を有しない対象への投与、疾患の発生の防止、または疾患が発生した場合にはその影響を最小限にすることを意味する。
“血液学的悪性腫瘍”には、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍、ならびに脾臓およびリンパ節の癌が含まれる。リンパ腫の例としては、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の両方が挙げられる。Ｂ細胞リンパ腫には、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方が含まれる。Ｂ細胞リンパ腫の限定しない例には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ球性白血病と重複）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、大縦隔Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症（Waldenstroem macroglobulinemia）、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症が含まれる。Ｔ細胞リンパ腫の限定しない例としては、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、および血管免疫芽Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。血液悪性腫瘍はまた、例えば限定されないが、二次性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病などの白血病が含まれる。血液悪性腫瘍はさらに、例えば限定されないが、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの骨髄腫を含む。他の血液学的および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連癌は用語“血液悪性腫瘍”に包含される。
用語“有効用量”または“有効投与量”は、所望の効果が達成されるか、または少なくとも部分的に達成されるのに十分な量として定義される。薬剤または治療剤の“治療的有効量”または“治療的有効投与量”は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用される場合、疾患症状の重症度の低下によって明らかになる疾患の緩解、疾患の症状のない期間の頻度と持続時間の増加、または疾患の苦痛による障害もしくは身体障害の防止、を促進する薬剤の任意の量である。薬物の“予防的有効量”または“予防的有効投与量”は、疾患の発症または疾患の再発のリスクのある対象に単独で、または別の治療薬と組み合わせて投与されるとき、該疾患の発症または再発を阻害する薬剤の量である。疾患の緩解を促進するか、または疾患の発症もしくは再発を阻害する治療剤または予防剤の能力を、当業者に公知の種々の方法を用いて、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、またはインビトロアッセイで薬剤の活性をアッセイすることによって、評価することができる。
一例として、抗癌剤は、対象において癌の進行を遅延させるか、または癌の緩解を促進する薬剤である。好ましい態様において、治療的有効量の薬剤は、癌を除去するところまで癌の緩解を促進する。“癌の緩解を促進する”とは、の薬剤を、単独で、または抗腫瘍剤と併用して投与することにより、腫瘍増殖またはサイズの減少、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、疾患の苦痛による障害もしくは身体障害の予防、または患者における疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。薬理効果は、患者において癌の緩解を促進する薬剤の能力を意味する。生理的安全性は、薬剤の投与によってもたらされる、毒性、または細胞、臓器および／または生物レベルでの他の有害な生理的作用（有害作用）が許容できるくらい低レベルであることを意味する。
腫瘍の処置のための一例として、薬剤の治療的有効量または投与量は、好ましくは未処置対象と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％、細胞増殖または腫瘍増殖を阻害する。最も好ましい態様において、薬剤の治療的有効量または投与量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害し、すなわち、好ましくは、細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、以下に記載のアッセイを用いて評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、細胞増殖を阻害する化合物の能力を調べることによって評価することができ、かかる阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定することができる。本明細書に記載の他の好ましい態様において、腫瘍緩解が観察され得て、少なくとも約２０日、より好ましくは少なくとも約４０日、またはさらにより好ましくは少なくとも約６０日継続されてよい。
用語“患者”および“対象”は、予防的処置または治療的処置のいずれかを受けるヒトまたは非ヒト動物を意味する。例えば、本明細書に記載の方法および組成物は、癌を有する対象に使用され得る。用語“非ヒト動物”には、例えば、哺乳動物および非哺乳動物の全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。
本明細書に記載の種々の面は、以下の小節にさらに詳しく記載される。
Ｉ．修飾された重鎖定常領域
本明細書に記載の“修飾された重鎖定常領域”は、抗体中に存在するとき、非ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体、例えばＩｇＧ１抗体のような、修飾された重鎖定常領域を有さない同じ抗体と比べて、抗体のすべての生物学的特性または特徴を増強または改変するものである。抗体の生物学的特性の増加または改変には、
（ａ）細胞による内在化の増加または改変；
（ｂ）アゴニスト活性の増加または改変；
（ｃ）アンタゴニスト活性またはブロッキング活性の増加または改変；
（ｄ）ＡＤＣＣの増強；
（ｄ）新たな特性の付与；
（ｅ）シグナル伝達の増加または改変；
（ｆ）より大きな抗体／抗原架橋複合体の形成；
（ｇ）標的細胞表面分子のクラスター化またはオリゴマー化の増加；
（ｈ）免疫応答の刺激の増加または増強；および／または
（ｉ）免疫応答の阻害の増加
が含まれる。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、かつ例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、抗体依存性受容体（またはリガンドもしくは表面分子）の内在化をより効率的に仲介し、例えば、該抗体は、標的または表面分子（例えば、受容体またはリガンド）を内在化し、および／または抗体が細胞膜上のその標的と結合した後、それ自体を細胞内へより迅速に、および／または高い程度の内在化させる。抗体の内在化の速度および程度は、例えば実施例に示すように決定され得る。例えば実施例に示される通り、例えば、内在化のＴ１／２により測定されるような内在化の速度は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強または増加され得て、結果として、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上のＴ１／２の減少となる。例えば、１０分のＴ１／２を有するにも関わらず、修飾された重鎖定常領域は、内在化の速度を増加させることができ、それによりＴ１／２を５分に低下させる（すなわち、内在化の速度を２倍に増加する、またはＴ１／２を半分に減少させる）。“Ｔ１／２”は、抗体を細胞に添加した時点から測定される、最大内在化の半分が達成されるまでの時間として定義される。ある態様において、Ｔ１／２は、少なくとも１０分、３０分または１時間低減される。内在化の最大レベルは、抗体濃度または時間に対してプロットされる内在化を示すグラフの水平化（プラトー）時点での内在化のレベルであり得る。修飾された重鎖定常領域は、抗体の内在化の最大レベルを少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増加させ得る。抗体、修飾された重鎖定常領域を含む抗体およびそれを含まない同じ抗体などの異なる抗体の内在化効率を比較する別の方法は、それらの所定の抗体濃度（例えば、１００ｎＭ）および／または所定の時間（例えば、２分、５分、１０分または３０分）での内在化のレベルを比較することである。内在化レベルの比較はまた、内在化のＥＣ５０レベルを比較することによっても行われる。抗体の内在化のレベルは、所定の（対照）抗体、例えば、本明細書に記載の抗体、例えば、１１Ｆ１１またはＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１の内在化レベルに対する比較と定義され得て、かつ所定の（対照）抗体で得られた値の割合として示され得る。これらの方法のいずれか１つにより比較されるとき、内在化の程度は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増大され得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まないで、かつ例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、より強力なアゴニスト活性を有する。ある態様において、増強されたアゴニスト活性は、標的分子、例えばＧＩＴＲ、または免疫応答、例えばＴ細胞活性を刺激もしくは共刺激する他の分子の刺激活性を増強する。ある態様において、増強されたアゴニスト活性は、免疫応答、例えばＴ細胞活性を阻害する標的分子（例えば、チェックポイント阻害剤）の阻害活性を増強する。Ｔ細胞活性を調節する抗体の増強されたアゴニスト活性は、例えば実施例に記載の通りに、例えば、抗体と接触されたＴ細胞からのＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌のレベルを測定することにより、決定することができる。刺激性標的へ結合する抗体のアゴニスト活性は、増加したサイトカイン放出またはエフェクターＴ細胞の増加した増殖；Ｔｒｅｇ上の係合がＴｒｅｇ機能を低下させる場合、減少したＴ調節細胞活性；または、Ｔｒｅｇの増加した枯渇によって定義されるように、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。例えば、修飾された重鎖定常領域を含む刺激性標的に結合する抗体で刺激された細胞からのＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌の量は、修飾された重鎖定常領域を含まない同じ抗体で刺激されたＴ細胞のそれよりも、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上高い。阻害性標的に結合する抗体のアゴニスト活性は、低下したサイトカイン放出またはエフェクターＴ細胞の低下した増殖；増加したＴ調節細胞；または、Ｔｒｅｇの減少した枯渇により定義されるように、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。例えば、修飾された重鎖定常領域を含む阻害性標的に結合する抗体で刺激されたＴ細胞からのＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌の量は、修飾された重鎖定常領域を含まない同じ抗体で刺激されたＴ細胞のそれよりも、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上低い。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、より強力なアンタゴニスト活性または遮断活性を有する。抗体の増強されたアンタゴニスト活性は、例えば、Ｔ細胞活性化の条件を含む状況において、サイトカイン放出および／または増殖を測定することにより、決定することができる。アンタゴニスト活性は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、増強したＡＤＣＣ活性を有する。増強されたＡＤＣＣは、当技術分野で公知の方法に従って決定され得る。ＡＤＣＣは、少なくとも１０％、３０％、５０％、２倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、より大きな抗体／抗原架橋複合体を形成する能力を有する。複合体を形成する能力は、例えば実施例に記載の通りに、決定され得る。修飾された重鎖定常領域を含む抗体を用いて形成される抗体／抗原複合体は、修飾された重鎖定常領域を含まない同じ抗体を用いて形成される複合体よりも、少なくとも５０％、２倍、３倍、５倍または１０倍大きい。ある態様において、少なくとも２，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ；５０００ｋＤａ；１０，０００ｋＤａ、５０，０００ｋＤａまたは１００，０００ｋＤａの複合体が、修飾された重鎖定常領域を有する抗体を用いて形成される。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、細胞表面上の標的分子のより多くのクラスター化またはオリゴマー化を誘導する。クラスター化およびオリゴマー化の程度は、例えば、抗体／抗原複合体のサイズを測定することにより、決定することができる。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、より高いレベルまたは異なるタイプのシグナルまたはシグナル伝達を誘導する。シグナル伝達は、シグナル伝達経路における１以上のタンパク質の活性化レベルを決定することによりモニタリングされ得る。ある態様において、シグナル伝達は、例えば実施例に記載の通り、シグナル伝達タンパク質、例えば、ＮＫｋＢまたはｐ３８の活性（またはリン酸化）を測定することにより決定される。修飾された重鎖定常領域を含む抗体によって誘発されるシグナル伝達は、修飾された重鎖定常領域を含まない同じ抗体によるシグナル伝達よりも、少なくとも１０％、２０％、５０％、２倍、５倍またはそれ以上高いか、または低い。例えば、刺激分子（例えば、ＧＩＴＲ）に結合し、かつ修飾された重鎖定常領域を含む抗体により誘発されるシグナル伝達は、ＩｇＧ１重鎖を有する同じ抗体により得られるシグナル伝達よりも、少なくとも１０％増強され得る。例えば、ＮＫｋＢまたはｐ３８活性（例えば、リン酸化）のＥＣ５０は、少なくとも５０％、２倍、５倍またはそれ以上低減され得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、免疫応答または免疫系を刺激または増強する増大した能力を有する。免疫応答または免疫系を刺激する増大した能力は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアゴニスト活性および／または阻害性受容体の増強されたアンタゴニスト活性をもたらし得る。免疫応答または免疫系を刺激する増大された能力は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性（標的細胞上で直接またはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムを介して間接的に決定される）および増殖の変化を測定するアッセイにおいて、活性のＥＣ５０または最大レベルの増加倍に反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増大され得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、増大した抗増殖活性または抗腫瘍活性を有する。抗体の増強した抗腫瘍活性は、該抗体で処理された動物において、例えば腫瘍の増殖により決定され得る。抗腫瘍活性は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。抗腫瘍活性は、例えば、低下した腫瘍の増殖速度および完全な腫瘍の緩解により明らかになる、例えば腫瘍量の減少により、測定することができる。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、修飾された重鎖定常領域を含まず、例えばＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体と比べて、免疫応答または免疫系を阻害または抑制する増加した能力を有する。免疫応答または免疫系を阻害または抑制する増加した能力は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアンタゴニスト活性および／または阻害性受容体の増強されたアゴニスト活性をもたらし得る。免疫応答または免疫系を刺激する増加した能力は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性（標的細胞上で直接的に、またはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムの検出を介して間接的に決定される）および増殖の変化を測定するアッセイにおいて、ＥＣ５０または活性の最大レベルの増加倍に反映され得る。免疫応答または免疫系活性の阻害または抑制能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域またはその部分、例えばヒンジは、他の重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４重鎖定常領域と比べて、より剛性である。例えば、修飾された重鎖定常領域は、天然重鎖定常領域またはそのヒンジよりも剛性であるか、または天然重鎖定常領域またはそのヒンジよりも剛性である部分、例えばヒンジを有する非天然重鎖定常領域である。重鎖定常領域またはその部分、例えばヒンジの剛性(rigidity)は、例えば、コンピュータモデリング、電子顕微鏡法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）のような分光法、Ｘ線結晶学（Ｂ−因子）、または沈降速度分析超遠心分離（ＡＵＣ）により、ヒンジを含む抗体の回転半径を測定または比較することにより、決定することができる。あるいは、重鎖定常領域またはその部分の剛性は、例えば本明細書にさらに記載する通り、抗体／抗原複合体のサイズを測定することにより決定することができる。
修飾された重鎖定常領域を含み、かつ当技術分野で公知の方法および本明細書に記載の方法に従って決定される増強された機能特性を示す抗体は、同じ抗体であるが、異なる重鎖定常領域を有する抗体で見られる活性と比較して、特定の活性に対して統計的に有意な差異に関係することが理解され得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ（“ＩｇＧ２ヒンジ”）ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも１つは、ＩｇＧ２アイソタイプではない）を含む。ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（ここで、重鎖定常ドメインは、野生型ＩｇＧ２定常領域ではないか、またはアミノ酸２１９もしくは２２０に変異を有するＩｇＧ２定常領域ではない）を含む。ＩｇＧ２ヒンジは、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ（例えば、配列番号８のもの）またはその変異体であってよい。ただし、該ＩｇＧ２ヒンジは、非ＩｇＧ２ヒンジを含むか、またはＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体の活性と比較して、増強した活性を該抗体に付与する能力を保持する。ある態様において、ＩｇＧ２ヒンジ変異体は、野生型ＩｇＧ２ヒンジと同様の剛性（rigidity or stiffness）を保持する。ヒンジの剛性は、例えば、コンピュータモデリング、電子顕微鏡法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）のような分光法、Ｘ線結晶学（Ｂ−因子）、または沈降速度分析超遠心分離（ＡＵＣ）により、ヒンジを含む抗体の回転半径を測定または比較することにより、決定することができる。ヒンジは、ヒンジを含む抗体が、異なるヒンジ、例えばＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体の値とは、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％未満異なる、上記の試験の１つから得られた値を有する場合、別のヒンジの剛性と比較して同様の、またはそれより高い剛性を有する。当業者は、これらの試験結果を解釈することにより、ヒンジが、別のヒンジの剛性と少なくとも同様の剛性を有するかどうかを、該試験から決定することができる。
ヒトＩｇＧ２ヒンジ変異体の一例は、４つのシステイン残基（すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９）の１つまたは複数の別のアミノ酸での置換を含むＩｇＧ２ヒンジである。システインはセリンで置換され得る。ＩｇＧ２ヒンジの一例は、Ｃ２１９Ｘ変異またはＣ２２０Ｘ変異（ここで、Ｘは、セリン以外の任意のアミノ酸である。）を含むヒトＩｇＧ２ヒンジである。任意の態様において、ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９ＸおよびＣ２２０Ｘ置換の両方を含まない。任意の態様において、ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを含むが、Ｃ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓの両方ともを同時には含まない。使用可能な他のＩｇＧ２ヒンジ変異体には、Ｃ２２０、Ｃ２２６および／またはＣ２２９置換、例えばＣ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ変異（Ｃ２１９Ｓ変異と組み合わされ得る）を含むヒトＩｇＧ２ヒンジが含まれる。ＩｇＧ２ヒンジは、ヒンジの部分が、別のアイソタイプのものである（すなわち、それは、キメラまたはハイブリットヒンジである）ＩｇＧ２ヒンジであってもよい。ただし、キメラヒンジの剛性は、野生型ＩｇＧ２ヒンジと少なくとも同様の剛性である。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、下部ヒンジ（表２に定義の通り）がＩｇＧ１アイソタイプのもの、例えば、野生型ＩｇＧ１下部ヒンジであるＩｇＧ２ヒンジであってよい。
“ハイブリッド”または“キメラ”ヒンジは、ヒンジの連続するアミノ酸の半分以上が特定のアイソタイプ由来である場合、そのアイソタイプであると称される。例えば、ＩｇＧ２の上部および中央ヒンジならびにＩｇＧ１の下部ヒンジを有するヒンジは、ＩｇＧ２ハイブリッドヒンジであると考えられる。
ある態様において、抗体は、表４に記載の配列、例えば、以下のアミノ酸配列：８、２１、２２、２３、１２６−１２９および１３４〜１４７のうち１つを含むＩｇＧ２ヒンジを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。ある態様において、ヒンジは、配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、４つのアミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７（Ｃ末端の４つのアミノ酸“ＰＶＡＧ”（配列番号１４８）に対応する）の１、２、３個または全てのアミノ酸が、欠失されるか、または別のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１ヒンジのＣ末端のアミノ酸（ＥＬＬＧ（配列番号１５０）またはＥＬＬＧＧ（配列番号１５１）で置換されている。ある態様において、ヒンジは、配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７は、欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。ある態様において、ヒンジは、配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ａ２３５およびＧ２３７は、欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。ある態様において、ヒンジは、配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ｇ２３７は、欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。ある態様において、ヒンジは、配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ｖ２３４およびＡ２３５は、欠失されているか、または別のアミノ酸で置換されている。ＩｇＧ２中のＰＶＡＧ（配列番号１４３）のＩｇＧ１ヒンジの対応するアミノ酸での置換、すなわち（ＥＬＬＧ（配列番号１５０）またはＥＬＬＧＧ（配列番号１５１）での置換）により得られる配列番号２２または１３８を有するハイブリッドヒンジまたはその変異体（例えば、表４参照）は、ＩｇＧ２ヒンジの利点およびＩｇＧ１ヒンジのエフェクターを有するヒンジを提供する。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、表４の配列の１つ、例えば、配列番号８、２１、２２、２３、１２７−１３２および１３４−１４１からなるか、または本質的にそれからなるヒンジを含み、ある態様において、さらなるヒンジアミノ酸残基を含まない。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、表４に記載のＩｇＧ２ヒンジを含み、ここで、１〜５、１〜３、１〜２または１個のアミノ酸が、アミノ酸残基ＣＶＥとＣＰＰの間に挿入されている。ある態様において、ＴＨＴまたはＧＧＧが挿入されている。ある態様において、１、１〜２または１〜３個のアミノ酸が、ヒンジとＣＨ２ドメインの間に挿入されていてよい。例えば、追加のグリシンが、ヒンジとＣＨ２ドメインの間に挿入されていてよい。
任意の態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域であり、ここで、ヒンジは、１〜１０個のアミノ酸の欠失を含む。実施例に記載の通り、アミノ酸残基ＳＣＤＫＴＨＴ（Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５；配列番号１４９）を欠くＩｇＧ１抗体は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体よりも効率のよい抗体介在性のＣＤ７３の内在化を付与した。同様に、ＩｇＧ２抗体の文脈において、アミノ酸残基ＣＣＶＥ（Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４；配列番号１７０）を欠くＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体よりも効率のよい抗体介在性のＣＤ７３内在化を付与した。従って、本発明は、修飾された重鎖定常領域を提供し、ここで、ヒンジは、ＩｇＧ１抗体について残基Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５、およびＩｇＧ２抗体について残基Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４から選択される１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸残基の欠失を含む。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの野生型ＣＨ１ドメイン（それぞれ“ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン”または“ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン”）であるＣＨ１ドメインを含む。アイソタイプＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン（それぞれ“ＩｇＧ３ ＣＨ１ドメイン”および“ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン”）もまた使用可能である。ＣＨ１ドメインはまた、野生型ＣＨ１ドメインの変異体、例えば野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ１ドメインの変異体であり得る。ＣＨ１ドメインの変異体の例としては、Ａ１１４Ｃ、Ｃ１３１Ｓおよび／またはＴ１７３Ｃが挙げられる。ＣＨ１ドメイン、例えばＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインは、置換Ｃ１３１Ｓを含んでいてよく、該置換は、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２ ＣＨ１およびヒンジを有する抗体にＢ型（またはコンフォメーションＢ）をもたらす。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１ドメインを含む。ある態様において、ＣＨ１ドメインは、野生型ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインであり、例えばアミノ酸配列：

を有する。ある態様において、ＣＨ１ドメインは、配列番号７の変異体であり、配列番号７と比べて１〜１０、１〜５、１〜２または１個のアミノ酸置換または欠失を含む。実施例にさらに記載する通り、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはその変異体は、ＩｇＧ１抗体と比べて抗体に増強された特性を付与し、該抗体がＩｇＧ２ヒンジも含むとき、さらにより増強された特性を付与することが本明細書に記載されている。ある態様において、ＩｇＧ２ ＣＨ１変異体は、以下のアミノ酸残基：Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の1つまたは複数でのアミノ酸置換または欠失を含まず、ここで、アミノ酸残基は、上記の配列番号７に太字および下線を付して示されている。例えば、修飾された重鎖定常領域は、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８のいずれも、別のアミノ酸で置換されていないか、または欠失されておらず、またはＣ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８のいずれも別のアミノ酸で置換されていないか、または欠失されていない、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含み得る。ある態様において、Ｃ１３１は別のアミノ酸で置換されており、例えば、Ｃ１３１Ｓであり、置換は、抗体がコンフォメーションＢを採る要因となる。修飾された重鎖定常領域を有するコンフォメーションＡおよびコンフォメーションＢの抗体の両方は、ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体と比較して、増強された活性を有することが本明細書に記載されている。
ある態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３（上記の配列番号７において斜体および下線を付した残基として示す）は、ＩｇＧ１中の別のアミノ酸、例えば、対応するアミノ酸で置換されており、すなわち、Ｎ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｌである。
ある態様において、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインの１または複数のアミノ酸残基は、ＩｇＧ４中の対応するアミノ酸残基で置換されている。例えば、Ｎ１９２はＮ１９２Ｓであり得る；Ｆ１９３はＦ１９３Ｌであり得る；Ｃ１３１はＣ１３１Ｋであり得る；および／またはＴ２１４はＴ２１４Ｒであり得る。
抗体は、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインまたはその変異体およびＩｇＧ２ヒンジまたはその変異体を含む修飾された重鎖定常領域であり得る。ヒンジおよびＣＨ１ドメインは、本明細書に記載のＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインの組合せであり得る。ある態様において、ＩｇＧ２ ＣＨ１およびヒンジは、以下のアミノ酸配列

、または多くとも１〜１０個のアミノ酸がそれとは異なるアミノ酸配列を含む。アミノ酸変異体は、上記のヒンジおよびＣＨ１ドメインに記載の通りである。
ある態様において、抗体は、少なくとも１つのＩｇＧ２ヒンジ、および要すれば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインもしくはその断片または該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインの誘導体を含み、該抗体は、フォーム（またはコンフォメーション）Ａを採る（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと）。ある態様において、抗体は、少なくとも１つのＩｇＧ２ヒンジ、および要すれば、ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインもしくは断片または該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインの誘導体を含み、該抗体が、フォームＢを採る（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと）。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ２ドメイン（それぞれ、“ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ２ ＣＨ２ドメイン”、“ＩｇＧ３ ＣＨ２ドメイン”または“ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン”）であるＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインはまた、野生型ＣＨ２ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインの変異体であり得る。ＣＨ２ドメインの変異体の例には、抗体のＦｃ領域の生物学的活性、例えばＡＤＣＣまたはＣＤＣを改変するか、または抗体の半減期もしくはその安定性を改変する変異体が含まれる。一態様において、ＣＨ２ドメインは、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインであり、ここで、ＣＨ２ドメインは、変異を含まない同じＣＨ２変異体と比較して、低下したエフェクター機能を有する。ＣＨ２ドメインは、増強されたエフェクター機能を有し得る。ＣＨ２ドメインは、以下の変異：ＳＥ（Ｓ２６７Ｅ）、ＳＥＬＦ（Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）、ＳＤＩＥ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）、ＳＥＦＦ、ＧＡＳＤＡＬＩＥ（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）の１つ以上、および／または以下のアミノ酸：Ｅ２３３、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ｐ２７１Ｌ３２８およびＡ３３０における１つ以上の変異を含み得る。他の変異は、本明細書の他の箇所にさらに記載されている。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ３ドメイン（それぞれ、“ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ２ ＣＨ３ドメイン”、“ＩｇＧ３ ＣＨ３ドメイン”または“ＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン”）であるＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインはまた、野生型ＣＨ３ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの変異体であり得る。ＣＨ３ドメインの変異体の例には、抗体のＦｃ領域の生物学的活性、例えばＡＤＣＣまたはＣＤＣを改変するか、または抗体の半減期もしくはその安定性を改変する変異体が含まれる。
一般的に、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異、および／または多くとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の変異、または１〜１０または１〜５個の変異を含んでよいか、または対応する野生型ドメイン（それぞれ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。ただし、重鎖定常領域は、必要な生物学的活性を保持する特定の変異体を含む。
表５は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むヒト重鎖定常領域を記載しており、ここで各ドメインが、野生型ドメインまたは重鎖定常領域に所望の生物学的活性を提供するその変異体のいずれかである。表５の何も記載されていないセルは、ドメインが存在するか、または存在しないことを示し、存在するとき、何れかのアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであり得る。例えば、表５における重鎖定常領域１を含む抗体は、少なくとも１つのＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域を含む抗体であり、それは、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含んでもよく、存在するとき、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。表５から理解される別の例として、重鎖定常領域８を含む抗体は、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ３ドメインを含むか、または含まなくてよく、存在するとき、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプであり得る、重鎖定常領域を含む抗体である。
ある態様において、表５に示す重鎖定常領域を含む抗体は、特定の重鎖定常領域を含まない、重鎖定常領域を含む同じ抗体またはＩｇＧ１定常領域を含む同じ抗体と比較して、増強された生物学的活性を有する。
ある態様において、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む抗体の生物学的活性を改善する方法は、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程、および非ＩｇＧ２ヒンジおよび非ＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程を含む。修飾された重鎖定常領域を含まない抗体の生物学的活性を改善する方法は、修飾された重鎖定常領域を含まない抗体を提供する工程、およびその重鎖定常領域を修飾された重鎖定常領域で置換する工程を含み得る。
修飾された重鎖定常領域の例を表６に提供し、それは、ドメインのそれぞれの識別情報を記載する。
ある態様において、抗体は、配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７のいずれか１つを含むＩｇＧ２ヒンジまたはその変異体、例えば、（ｉ）配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７のいずれか１つと、１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる、アミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７のいずれか１つと、多くとも５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる、アミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７のいずれか１つと、１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる、アミノ酸配列、および／または（ｉｖ）配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６または１３７のいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列であって、ここで、（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾された重鎖定常領域と比較して、増強された生物学的活性を有する、アミノ酸配列を含むＩｇＧ２ヒンジを含む修飾された重鎖定常領域を含む。
ある態様において、ヒンジは、配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７のいずれか１つの変異体である配列（ここで、Ｒ２１７（野生型ＩｇＧ２ヒンジ（配列番号８）の第二のアミノ酸は欠失されていないか、または別のアミノ酸で置換されていない）を含む。ヒンジが、配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７のいずれか１つの変異体である任意の態様において、該ヒンジは、野生型ＩｇＧ２の剛性と同様の剛性を有する。
ある態様において、抗体は、配列番号２を含むＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインもしくは配列番号７を含むＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン、または配列番号２もしくは７の変異体（ここで、変異体は、（ｉ）配列番号２もしくは７と１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる；（ｉｉ）配列番号２もしくは７と、多くとも５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる；（ｉｉｉ）配列番号２もしくは７と、１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる、および／または（ｉｖ）配列番号２もしくは７と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾された重鎖定常領域と比較して、増強された生物学的活性を有する）を含む修飾された重鎖定常領域を含む。
ある態様において、抗体は、配列番号４もしくは２４、または配列番号４もしくは２４の変異体（ここで、変異体は、（ｉ）配列番号４もしくは２４と１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる；（ｉｉ）配列番号４もしくは２４と、多くとも５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる；（ｉｉｉ）配列番号４もしくは２４と、１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる、および／または（ｉｖ）配列番号４もしくは２４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾された重鎖定常領域と比較して、増強された生物学的活性を有する）を含むＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインを含む修飾された重鎖定常領域を含む。
ある態様において、抗体は、配列番号５、または配列番号５の変異体（ここで、変異体は、（ｉ）配列番号５と、１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり；（ｉｉ）配列番号５と、多くとも５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり；（ｉｉｉ）配列番号５と、１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり、および／または（ｉｖ）配列番号５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾された重鎖定常領域と比較して、増強された生物学的活性を有する）を含むＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを含む修飾された重鎖定常領域を含む。
修飾された重鎖定常領域はまた、上記のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組合せを含む。
ある態様において、抗体は、本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域または本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域の変異体を含み、ここで、変異体は、（ｉ）本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり；（ｉｉ）本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域と、多くとも１０、９、８、７、６，５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり；（ｉｉｉ）本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域と、１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり、および／または（ｉｖ）本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾された重鎖定常領域と比較して、増強された生物学的活性を有する。
ある態様において、抗体は、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか１つまたは配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか1つの変異体を含む修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、変異体は、（ｉ）配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか１つと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり；（ｉｉ）配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか１つと、多くとも１０、９、８、７、６，５、４、３、２または１個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり；（ｉｉｉ）配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか１つと、１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０個のアミノ酸置換、付加または欠失により異なり、および／または（ｉｖ）配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜１６８のいずれか１つと、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）−（ｉｖ）のいずれかにおいて、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾された重鎖定常領域と比較して、増強された生物学的活性を有する。
修飾された重鎖定常領域は、（ｉ）野生型重鎖定常領域と比較して、類似の、減少した、または増加したエフェクター機能（例えば、ＦｃγＲへの結合）を有するか、または（ｉｉ）野生型重鎖定常領域と比較して、類似の、低下した、または増加した半減期（またはＦｃＲｎ受容体への結合）を有し得る。
ＩＩ．修飾された重鎖定常領域を有する抗体およびその標的抗原
修飾された重鎖定常領域は、広範な抗体、例えば内在化を必要とする抗体（例えば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、および抗ＣＤ７３抗体）、アゴニスト活性を必要とする抗体（例えば、免疫応答を調整する、例えば、Ｔ細胞活性を刺激するのに有効な抗体、例えばアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体）、アンタゴニスト活性を必要とする抗体（例えば、免疫応答、例えば、Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質を阻害または阻止する抗体、例えばアンタゴニストＰＤ−１抗体）、ＡＤＣＣを必要とする抗体、シグナル伝達を必要とする抗体、または抗腫瘍活性を必要とする抗体に使用可能である。例えば、細胞表面阻害受容体の内在化は、その受容体（複数可）と相互作用するその能力を制限し、細胞機能（複数可）を低下させ得る。
一態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、例えば、それらが細胞表面に結合するとき、受容体介在性のエンドサイトーシスを誘導することにより、活性のためにその内在化を必要とする抗体（例えば、細胞表面受容体に特異的な抗体）である。そのような抗体は、塗料摘要のための薬剤、毒物、酵素またはＤＮＡの標的化送達のためのビークルとして使用可能である。従って、これらの抗体の内在化特性の増加は、望ましい。有効な内在化から利益を得ることができる抗体の例は、抗体薬物複合体である。抗体の内在化特性を測定するための種々のアッセイが、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。これらのアッセイは、内在化をモニターするために、洗浄アッセイまたはクエンチベースのアッセイに使用することができる抗体標識のための広範な色素を利用する。抗体内在化はまた、蛍光ラベルによる無洗浄アッセイでモニターすることもできる。
一態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、活性のために、それらが結合する抗原例えば、受容体またはリガンドなどの細胞表面分子の内在化を必要とする、抗体である。従って、生物学的（例えば、治療的）活性の下方制御を必要とする細胞表面タンパク質に対する抗体は、本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域を使用することができる。
ある態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、細胞表面分子に結合し、細胞表面分子、例えば、免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、ランゲルハンス細胞、ＮＫ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、Ｂ細胞または任意の他の免疫細胞上の細胞表面分子の生物学的活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする。細胞表面分子は、阻害性分子、例えば、共刺激性分子（例えば、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＩＣＯＳおよび他のＴＮＦＲファミリーメンバー）であってよく、抗体は、活性をさらに刺激し得る（アゴニスト抗体）か、または抗体は、活性を阻害し得る（アンタゴニスト抗体）。細胞表面分子は、阻害分子（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３）であってよく、抗体は、活性をさらに刺激する（アゴニスト抗体）か、または抗体は、活性を阻害してよい（アンタゴニスト抗体）。
ある態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、例えばＴ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ分泌を誘導することにより、例えば、対象の免疫系を高める刺激性（または共刺激性）分子のアゴニスト抗体（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）である。他のアゴニスト抗体は、ＡＰＣを活性化し、抗腫瘍Ｔ細胞応答を促進し、および／またはＴ細胞免疫のない状態で癌を制御する可能性を有する細胞傷害性骨髄細胞を促進することが示されている。刺激性分子のアゴニスト抗体は、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１などの負の免疫チェックポイントを阻止する阻害性分子のアンタゴニスト抗体とは異なる。Ｔ細胞増殖などのアゴニスト活性は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて測定することができる。
ある態様において、修飾された重鎖定常ドメインを含む抗体は、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１抗体などの負の免疫チェックポイントを阻止または阻害することにより、例えば、活性化Ｔ細胞上に発現する阻害性受容体を標的とすることにより、対象の免疫応答を増強する、チェックポイント阻害剤のアンタゴニスト抗体である。Ｔ細胞増殖の阻害などのアンタゴニスト活性は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて測定することができる。
一態様において、抗体は、（ｉ）共刺激受容体のアゴニスト、または（ｉｉ）例えば、Ｔ細胞に対する阻害シグナルのアンタゴニストであり、両方とも、抗原特異的Ｔ細胞応答（免疫チェックポイント調節因子）の増強をもたらし得る。ある態様において、抗体は、（ｉ）共刺激受容体のアンタゴニスト、または（ｉｉ）例えばＴ細胞に対する阻害シグナルのアゴニストである。ほとんどの共刺激分子および共阻害分子は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであり、修飾された重鎖定常領域を有する抗体は、それらのいずれかに結合し得る。共刺激受容体または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの１つの重要なファミリーは、Ｂ７ファミリーであり、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）、およびＢ７−Ｈ６が含まれ、そして修飾された重鎖定常領域を有する抗体は、それらの何れかに結合し得る。共刺激受容体または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの別のファミリーは、同族のＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーであり、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴβ、ＬＴβＲ、リンホトキシンα １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ（ＣＤ１７８）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲ（例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1を参照のこと）が含まれる。従って、本明細書に記載の抗体は、これらの表面分子のいずれかに結合することができ、それらは、例えば、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＮＦＲファミリーのタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト（または、阻害剤もしくは阻止剤）、またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ；“免疫抑制サイトカイン”）のアンタゴニスト、および／または（ｉｉ）例えば癌などの増殖性疾患を処置するための、免疫応答を調節する、例えば刺激するための、Ｔ細胞活性化を刺激する、ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの刺激性受容体、またはサイトカインの刺激性受容体の、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
従って、改変された重鎖定常ドメインを有する抗体は、以下の薬剤の１つとして使用され得る：
（１）Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３またはＣＤ２８Ｈなどの、例えば、Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト；または、
（２）上記の通り、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３などのＴ細胞活性化を阻害するタンパク質（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）、および以下のタンパク質のいずれか：ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＣＤ３９、のアンタゴニスト（阻害剤または阻止剤）。
他の抗体には、ＮＫ細胞上の阻害受容体のアンタゴニストおよびＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニスト、例えば、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａが含まれる。
一般的に、修飾された重鎖定常領域からの利点を有し得る抗体には、例えば、正の共刺激受容体を連結するアゴニスト抗体、阻害性受容体を介してシグナル伝達を遮断するブロッキング抗体、アンタゴニスト抗体、および抗体抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増加させる抗体、腫瘍微小環境内の異なる免疫抑制経路を克服する（例えば、阻害剤性受容体の関与を遮断する（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用）、Ｔｒｅｇを枯渇または阻害する（例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体、ＩＤＯ等の代謝酵素を阻害する、またはＴ細胞アネルギー（anergy）または疲弊（exhaustion）を逆行／阻止する）抗体、および腫瘍部位での自然免疫の活性化および／または炎症を誘発する抗体が含まれる。阻害性受容体の増加した内在化は、可能性のある阻害剤をより低レベルに変換することができる。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、治療剤と複合体形成して、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）などの免疫複合体を形成する抗体であり、ここで、免疫複合体は、その活性のために内在化を必要とする。ＡＤＣにおいて、抗体は、ＡＤＣを癌細胞上の抗原などのその抗原を発現する標的細胞に指向するための標的化薬剤として機能する。この場合において、抗原は、腫瘍関連抗原であってよく、すなわち、癌細胞により独自に発現されるか、または過剰に発現される抗原であり得る。一旦、薬剤が放出されると、標的細胞内またはその周辺のいずれかで、治療剤として作用する。癌治療におけるＡＤＣの作用機序および使用に関する文献としては、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147を参照のこと。
癌治療のために、ＡＤＣの治療剤または薬物は、好ましくは、標的癌細胞の細胞死を引き起こす細胞傷害性薬物である。ＡＤＣに使用可能な細胞傷害性薬物には、以下のタイプの化合物ならびにそれらの類縁体および誘導体が含まれる：
（ａ）カリケアマイシン（例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464および3466を参照のこと）およびウンシアラマイシン（例えば、Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007) および Chowdari et al., US 8,709,431 B2 (2012) を参照のこと）などのエンジイン類；
（ｂ）チューブリシン（例えば、Domling et al., US 7,778,814 B2 (2010); Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013); および、Cong et al., US 2014/0227295 A1を参照のこと）；
（ｃ）ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン（例えば、Boger, US 6,5458,530 B1 (2003); Sufi et al., US 8,461,117 B2 (2013); および、Zhang et al., US 2012/0301490 A1 (2012) を参照のこと）；
（ｄ）エポチロン（例えば、Vite et al., US 2007/0275904 A1 (2007) および US RE42930 E (2011) を参照のこと）；
（ｅ）アウリスタチン（例えば、Senter et al., US 6,844,869 B2 (2005) および Doronina et al., US 7,498,298 B2 (2009) を参照のこと）；
（ｆ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体（例えば、Howard et al., US 2013/0059800 A1(2013); US 2013/0028919 A1 (2013); および、WO 2013/041606 A1 (2013) を参照のこと）；および
（ｇ）ＤＭ１およびＤＭ４などのメイタンシノイド類（例えば、Chari et al., US 5,208,020 (1993) および Amphlett et al., US 7,374,762 B2 (2008) を参照のこと）。
ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、リンカー、例えば切断可能なリンカーにより連結されていてよく、例えば、ペプチジルリンカー、ジスルフィドリンカー、またはヒドラゾンリンカーである。例えば、該リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号１６９）、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕなどのペプチジルリンカーであり得る。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号；同第６，９８９，４５２号；および、同第７，１２９，２６１号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０９６９１０；ＷＯ０７／０３８６５８；ＷＯ０７／０５１０８１；ＷＯ０７／０５９４０４；ＷＯ０８／０８３３１２；および、ＷＯ０８／１０３６９３；米国特許出願公開第２００６００２４３１７号；同第２００６０００４０８１号；および、同第２００６０２４７２９５号（引用によりそれらの開示内容を本明細書中に包含させる）に記載の通りに調製することができる。
修飾された重鎖定常領域で増強され得るＡＤＣの標的の例には、Ｂ７Ｈ４（Korman et al., ＵＳ２００９／００７４６６０Ａ１）；ＣＤ１９（Rao−Naik et al.、８，０９７，７０３Ｂ２）；ＣＤ２２（King et al., ＵＳ２０１０／０１４３３６８Ａ１）；ＣＤ３０（Keler et al., ＵＳ７，３８７，７７６Ｂ２（２００８）；ＣＤ７０（Terrett et al., ＵＳ８，１２４，７３８Ｂ２）；ＣＴＬＡ−４（Korman et al., ＵＳ６，９８４，７２０Ｂ１（２００６））；ＰＤ−１（Korman et al., ＵＳ８，００８，４４９Ｂ２（２０１１）；ＰＳＭＡ（Huang et al., ＵＳ２００９／０２９７４３８Ａ１およびCardarelli et al., ＵＳ７，８７５，２７８Ｂ２）；ＰＴＫ７（Terrett et al., ＵＳ２０１０／００３４８２６Ａ１）；グリピカン−３（Terrett et al., ＵＳ２０１０／０２０９４３２（Ａ１））；ＲＧ１（Harkins et al., ＵＳ７，３３５，７４８Ｂ２（２００８））；メソテリン（Terrett et al., ＵＳ８，２６８，９７０Ｂ２（２０１２））；ならびに、ＣＤ４４（Xu et al., ＵＳ２０１０／００９２４８４Ａ１）が含まれる。
ＩＩＩ．抗体の生物学的活性を増強する方法
本発明は、以下の生物学的の活性の１以上などの、特定の抗体の生物学的活性を増強するための方法を提供する：
（ａ）細胞による内在化の増加または改変；
（ｂ）アゴニスト活性の増加または改変；
（ｃ）アンタゴニスト活性またはブロッキング活性の増加または改変；
（ｄ）ＡＤＣＣの増強；
（ｄ）新たな特性の付与；
（ｅ）シグナル伝達の増加または改変；
（ｆ）より大きな抗体／抗原架橋複合体の形成；
（ｇ）標的細胞表面分子のクラスター化またはオリゴマー化の増加；
（ｈ）免疫応答の刺激の増加または増強；および／または
（ｉ）免疫応答の阻害の増加。
抗体の生物学的活性を増強するための方法は、重鎖定常領域またはその部分、例えば、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、修飾された重鎖定常領域またはその部分、例えば、ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換することを含み得る。
ある態様において、抗体の生物学的活性を改善するための方法は、（ｉ）本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域を含まない抗体を提供すること；および、（ｉｉ）該抗体の重鎖定常領域を、抗体の生物学的活性を増強する修飾された重鎖定常領域またはその部分で置換することを含む。ある態様において、抗体の生物学的活性を改善するための方法は、（ｉ）非ＩｇＧ２ヒンジ（例えば、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジ）を含む抗体を提供すること；および、（ｉｉ）抗体の非ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置換することを含む。ある態様において、抗体の生物学的活性を改善するための方法は、（ｉ）非増強性(non-enhancing)ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体を提供すること；および、（ｉｉ）該抗体の非増強性ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置換することを含む。“非増強性ＩｇＧ２ヒンジ”とは、それが抗体の生物学的活性を増強するために必要な特性をもはや有しないようにとは異なるＩｇＧ２ヒンジ変異体ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ＩｇＧ２ヒンジの剛性をもはや有していない変異体ヒンジである。
抗体の生物学的活性を増強するための例示的方法は、（ｉ）非ＩｇＧ２ヒンジまたは非増強性ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体を提供すること、および（ｉｉ）該ヒンジを、配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６もしくは１３７またはそれらの変異体、例えば本明細書に記載の変異体を含むヒンジで置換することを含む。抗体の生物学的活性を増強するための方法はまた、（ｉ）修飾された重鎖定常領域ではない重鎖定常領域を含む抗体を提供すること、および（ｉｉ）該重鎖定常領域を修飾された重鎖定常領域で置換することを含み得る。重鎖定常領域の置換は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの置換を含み得る。例えば、重鎖定常領域は、ヒンジをＩｇＧ２ヒンジまたはその変異体で置換することにより、および／またはＣＨ１ドメインをＩｇＧ１またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインもしくはそれらの変異体で置換することにより、修飾され得る。ある態様において、ヒンジは、ＩｇＧ２ヒンジで置換され、そしてＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインで置換される。ある態様において、ヒンジは、ＩｇＧ２ヒンジで置換され、そしてＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインで置換される。ある態様において、ヒンジは、ＩｇＧ２ヒンジで置換され、ＣＨ１は、ＩｇＧ２ヒンジで置換され、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインで置換され、そしてＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインで置換される。ある態様において、重鎖定常領域は、上記の表５に記載の修飾された重鎖領域１−２７または表６もしくは本明細書に記載の重鎖定常領域で置換される。
本発明はまた、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体の生物学的活性を増強するための方法であって、それぞれＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体のヒンジにおいて１〜１０個のアミノ酸を欠失させることを含む方法を提供する。例えば、アミノ酸Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５の１以上が、欠失されていてよい。一態様において、アミノ酸Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５の全てが欠失されている。
抗体の生物学的活性を増強するためのその重鎖定常領域の置換は、好ましくは、標的抗原に対するその結合活性の低減または顕著な低減を伴わない。実施例に記載の通り、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＣＤ７３抗体の重鎖定常領域の置換は、それぞれヒトＧＩＴＲ抗原およびヒトＣＤ７３抗原に対するそれらの親和性を顕著に変えなかった。
特定のアイソタイプのあるドメインの異なるアイソタイプの同じドメインでの置換に言及するとき、文字通りドメインを置換する必要はなく、むしろ、２つのアイソタイプ間で異なるアミノ酸を変更することのみが必要とされ得ることが理解され得る。
種々の抗原に対する抗体の結合能力を評価するための標準アッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書にさらに記載されており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、およびＲＩＡが含まれる。好適なアッセイは、実施例に詳細に記載されている。抗体の結合動態（例えば、結合親和性）はまた、当技術分野で公知標準アッセイ、例えばＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)ＳＰＲ分析により評価することができる。修飾された定常領域を有する抗体の特性（例えば、リガンド結合、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生）を評価するためのアッセイは、以下および実施例にさらに詳細に記載されている。
本明細書に記載の修飾され得る抗体の例には、例えば、癌を処置するための抗体が含まれ、例えば：Ｙｅｒｖｏｙ(商標)（イピリムマブ）またはトレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４に対する）、ガリキシマブ（Ｂ７．１に対する）、ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１に対する）、ＣＴ−０１１（ＰＤ−１に対する）、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１に対する）、ＡＭＰ２２４（Ｂ７ＤＣに対する）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＥＤＩ−５７０（ＩＣＯＳに対する）、ＡＭＧ５５７（Ｂ７Ｈ２に対する）、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３に対する）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ−３に対する）、ＢＭＳ−６６３５１３（ＣＤ１３７に対する）、ＰＦ−０５０８２５６６（ＣＤ１３７に対する）、ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７に対する）、抗ＯＸ４０（Providence Health Services）、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０Ｌに対する）、アタシセプト（ＴＡＣＩに対する）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０に対する）、ルカツムマブ（Lucatumumab）（ＣＤ４０に対する）、ダセツズマブ（ＣＤ４０に対する）、ムロモナブ−ＣＤ３（ＣＤ３に対する）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ−４に対する）である。
本明細書に記載の修飾され得る他の抗体の例には、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体が含まれる。本明細書に記載の修飾され得る抗ＰＤ−１抗体の例は、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）；ＷＯ２００６／１２１１６８に記載の抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１つのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載のＭＫ−３４７５（ランブロリズマブ）；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載のＡＭＰ−５１４；ＣＴ−０１１（ピディリズマブ；以前はＣＴ−ＡｃＴｉｂｏｄｙまたはＢＡＴ；例えば、Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409を参照）；ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１３／１７３２２３、米国特許第７，６３５，７５７号および同第８，２１７，１４９号、ならびに米国特許出願第２００９／０３１７３６８号に記載のものである。
修飾され得るさらなる抗体には、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、ＢＭＳ−９３６５５９（ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７，９４３，７４３号において、１２Ａ４と言われる）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７，９４３，７４３号に記載の、３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体；ＭＥＤＩ４７３６（抗Ｂ７−Ｈ１としても公知）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６としても公知）；ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７，６３５，７５７号および同第８，２１７，１４９号および米国特許出願公開第２００９／１４５４９３号に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の何れかが含まれる。
修飾され得る他の抗体には、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、Ｙｅｒｖｏｙ(商標)（ＰＣＴ出願公開ＷＯ０１／１４４２４に記載の、イピリムマブまたは抗体１０Ｄ１）；トレメリムマブ（以前は、チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）；以下の文献：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６，２０７，１５６号； Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067−10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP−675206); および、Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301−5304、のいずれかに記載のモノクローナル抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体；ＷＯ２０１３／１７３２２３に記載の抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれかが含まれる。
修飾され得る他の抗体には、抗ＬＡＧ−３抗体、例えば、ＢＭＳ−９８６０１６；ＵＳ２０１１／００７０２３に記載のＩＭＰ７３１；および、ＩＭＰ−３２１が含まれる。
修飾され得る他の抗体には、ＷＯ２００６／１０５０２１に記載の、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、例えば、抗ＧＩＴＲ抗体６Ｃ８もしくはそのヒト化抗体；ＷＯ２０１１／０２８６８３に記載の抗体；および、ＪＰ２００８２７８８１４に記載の抗体が含まれる。
本明細書の他の箇所に記載のものを含む、他の抗原を標的とする抗体もまた、修飾され得る。例えば、内在化を必要とする抗Ｈｅｒ２抗体、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）は、本明細書に記載の通りに修飾され得る。
ＩＶ．さらなる重鎖定常ドメイン修飾
抗体の生物学的活性を増強するための該抗体に対する本明細書に記載の修飾に加えて、さらなる変異が、例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインに対して行われて、例えば、エフェクター機能、ＦｃγＲに対する結合、または抗体の安定性に影響を与え得る。
Ｆｃおよび修飾されたＦｃ
本明細書に記載の抗体は、一般的に、抗体の１以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合反応、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害を改変するために、１以上の修飾を含むＦｃを含み得る。例えば、親Ｆｃと比較して、（ａ）増加または減少した抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、（ｂ）増加または減少した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、（ｃ）増加または減少したＣ１ｑに対する親和性、および／または（ｄ）増加または減少したＦｃ受容体に対する親和性を有するＦｃ変異体を作製するためにＦｃ領域中に修飾を行ってよい。かかるＦｃ領域変異体は、一般的に、Ｆｃ領域中に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み得る。アミノ酸修飾の組合せは、特に望ましいと考えられる。例えば、変異体Ｆｃ領域には、例えば本明細書で同定された特定のＦｃ領域の位置の、その中に２つ、３つ、４つ、５つ等の置換を含み得る。Ｆｃ配列変異体の例は、本明細書に記載されており、また米国特許第５，６２４，８２１号；同第６，２７７，３７５号；同第６，７３７，０５６号；同第６，１９４，５５１号；同第７，３１７，０９１号；同第８，１０１，７２０号；ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０１／５８９５７；ＷＯ０４／０１６７５０；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０３５７５２；ＷＯ０４／０７４４５５；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１；ＷＯ０５／０７０９６３；ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４にも記載されている。
エフェクター機能の低減
ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域を修飾することにより低減することができる。ある態様において、Ｆｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位は、（例えば、変異により）除去することができる。他の態様において、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するように修飾され得る。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野で知られている；ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関して、例えば、Sarmay et al. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633−9を参照のこと。一態様において、ヒトＩｇＧ１のＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ変異体は、ＦｃγＲ結合を効果的に排除する。Horton et al. (2011) J. Immunol. 186:4223 and Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926。他の態様において、ＦｃγＲへの減少した結合を有するＦｃは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含んだ。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
ＣＤＣ活性はまた、Ｆｃ領域を修飾することによって低減することができる。ＩｇＧ１の位置Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１での変異、特にアラニン変異Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ａは、Ｃ１ｑと結合し、補体を活性化する、対応する抗体の能力を顕著に低減させる。Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178；ＷＯ９９／５１６４２。ＩｇＧ１の位置３３１（例えば、Ｐ３３１Ｓ）の修飾は、補体結合を低減することが示されている。Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661 and Canfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483。別の例において、アミノ酸位置２３１から２３９内の１以上のアミノ酸残基が改変され、補体を結合する抗体の能力が減少する。ＷＯ９４／２９３５１。
ある態様において、減少した補体結合を有するＦｃは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有する。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
エフェクター機能が完全に回避される用途では、例えば抗原結合のみが所望の治療効果を得るのに十分であり、エフェクター機能のみが望ましくない副作用をもたらす（またはそのリスクを増大させる）場合、ＩｇＧ４抗体を使用してよいか、あるいは抗体またはＦｃ領域もしくはその実質的な部分を欠く断片を考慮し得るか、あるいはＦｃをグリコシル化を完全に排除するように変異させることができる（例えば、Ｎ２９７Ａ）。あるいは、エフェクター機能を欠き、ＦｃγＲに結合する能力を欠き（ＩｇＧ２のような）、そして補体を活性化することができない（ＩｇＧ４のような）、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域）およびヒトＩｇＧ４（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）のハイブリッド構築物が、作製されている。Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256。Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34:441; Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479も参照のこと（一般に、エフェクター機能を低下させるＦｃ修飾を議論する）。
他の態様において、Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって改変され、抗体の全てのエフェクター機能を低減させる。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸は、エフェクターリガンドに対する減少した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体（残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７）または補体のＣ１成分（残基２９７、３１８、３２０、３２２）であり得る。両方ともＷｉｎｔｅｒらの、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号。
ＷＯ８８／００７０８９は、ＡＤＣＣを減少させるためにＦｃγＲＩへの結合を減少させるＩｇＧ Ｆｃ領域における修飾（２３４Ａ；２３５Ｅ；２３６Ａ；Ｇ２３７Ａ）、またはＣＤＣを排除するために補体成分Ｃ１ｑへの結合を阻止するＩｇＧ Ｆｃ領域における修飾（Ｅ３１８ＡまたはＶ／Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ／Ｑ）を提案した。Duncan ＆ Winter (1988) Nature 332:563; Chappel et al. (1991) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 88:9036; and Sondermann et al. (2000) Nature 406:267 （ＦｃγＲＩＩＩ結合に対するこれらの変異の影響を議論する）も参照のこと。
エフェクター機能を低下させるＦｃ修飾はまた、位置２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５および３２８での、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒなどの、置換、挿入、および欠失も含む。Ｆｃ変異体は、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減させる他の修飾には、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖが含まれる。これらおよび他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685−691に記載されている。エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび補体活性化の両方）は、新生児型ＦｃＲ結合を維持しながら（半減期の維持）、位置２３３〜２３６および３２７〜３３１の１以上でのＩｇＧ残基の変異により、例えば、ＩｇＧ１においてＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、要すればＧ２３６Δ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ；ＩｇＧ４においてＥ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、要すればＧ２３６Δ；および、ＩｇＧ２においてＡ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓにより、低減され得る。Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613; WO 99/58572を参照のこと。エフェクター機能を減少させる他の変異には、ＩｇＧ１におけるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（Alegre et al. (1994) 移植 57:1537）；ＩｇＧ２におけるＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ（Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613;米国特許第5,834,597号も参照のこと）；および、ＩｇＧ４についてＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ（Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925）、が含まれる。エフェクター機能を低下させるための、ヒトＩｇＧ１における別の変異の組合せには、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓが含まれる。Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700。一般的に、Labrijn et gal. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479を参照。Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質（アバタセプト）との関連でエフェクター機能を低下させることが見いだされたさらなる変異は、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓである（ＥＵ残基番号付け）。Davis et al. (2007) J. Immunol. 34:2204。
減少したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有する他のＦｃ変異体は、Glaesner et al. (2010) Diabates Metab. Res. Rev. 26:287（ＩｇＧ４における、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを減少させるＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）；Hutchins et al. (1995) Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 92:11980（ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＥ３１８Ａ）；An et al. (2009) MAbs 1:572および米国特許出願公開第２００７／０１４８１６７号（ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）；McEarchern et al. (2007) Blood 109:1185（ＩｇＧ１におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ）；Vafa et al. (2014) Methods 65:114（ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ｖ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ）。
ある態様において、Ｆｃは、本質的にエフェクター機能を有しないものが選択され、すなわち、それは、減少されたＦｃγＲへの結合および減少された補体結合を有する。エフェクター機能を欠くＦｃの一例、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃは、以下の５つの変異：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。これらの５つの置換は、Ｎ２９７Ａと組み合わされて、同様にグリコシル化を排除する。
エフェクター機能の増強
あるいは、ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域を修飾することにより増強され得る。ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３≫ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であるので、ＩｇＧ１定常ドメインは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４よりも、ＡＤＣＣが望ましい薬物に使用するために選択される可能性がある。あるいは、Ｆｃ領域は修飾されて、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加させ、および／または以下の位置：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９で１以上のアミノ酸を修飾することにより、Ｆｃγ受容体に対する親和性を増加させることができる。ＷＯ２０１２／１４２５１５を参照のこと；ＷＯ００／４２０７２も参照のこと。置換の例には、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅが含まれる。変異の例には、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、および２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが含まれる。例えば、必要に応じてＩ３３２Ｅと組み合わせることができる、Ｇ２３６Ａ変異を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＦｃγＩＩＡ／ＦｃγＩＩＢ結合親和性比を約１５倍増加させることが示されている。Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. ( 2010) mAbs 2:181。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増加させる他の修飾には、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉ、および３９６Ｌが含まれるが、これに限定されない。これらおよび他の修飾が、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685−691に記載されている。具体的には、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方は、ＩｇＧ１の位置Ｅ３３３での変異、例えばＥ３３３Ａにより、増強され得る。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591。エフェクター機能を増強するためのＩｇＧ１におけるＰ２４７ＩおよびＡ３３９Ｄ／Ｑ変異の使用は、ＷＯ２００６／０２０１１４に記載されており、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ±Ｓ２９８Ｄ／Ｖは、ＷＯ２００４／０７４４５５に記載されている。ヒトＩｇＧ１におけるＫ３２６Ａ／ＷおよびＥ３３３Ａ／Ｓ変異、およびＩｇＧ２におけるＥ３３３Ｓは、エフェクター機能を増加させることが示された。 Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。
具体的には、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位は、マッピングされており、改善された結合を有する変異体が記載されている。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591−6604。変異の組合せＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合およびＡＤＣＣ活性を有する）を含む、位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９における特定の変異は、ＦｃγＲＩＩＩへの改善された結合が示されている。ＦｃγＲＩＩＩａに対する強く増強された結合を有する他のＩｇＧ１変異体が同定されており、それらには、カニクイザルにおけるＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の最大の増加、ＦｃγＲＩＩｂ結合の減少、および強力な細胞毒性活性を示す、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有する変異体が含まれる。Lazar et al.(2006) Proc. Nat’l Acad Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278。アレムツズマブ（ＣＤ５２特異的）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的）、リツキシマブ（ＣＤ２０特異的）、およびセツキシマブ（ＥＧＦＲ特異的）等の抗体への三重変異の導入は、インビトロで大幅に増強されたＡＤＣＣ活性をもたらし、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体は、サルにおいてＢ細胞を枯渇させる能力の増強が示されている。Lazar et al. (2006) Proc. Nat’l Acad Sci. (USA) 103:4005。加えて、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルであるヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａへの増強された結合および付随的に増強されたＡＤＣＣ活性を示す、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が、同定されている。Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882; U.S. Pat. No. 8,652,466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123。
異なるＩｇＧアイソタイプはまた、異なるＣＤＣ活性を示す（ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４）。Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989。増強されたＣＤＣが望まれる用途のために、Ｃ１ｑへの結合を増加する変異を導入することも可能である。補体（ＣＤＣ）を動員する能力は、ＩｇＧ２におけるＫ３２６および／またはＥ３３３での変異、例えばＫ３２６Ｗ（ＡＤＣＣ活性を減少させる）およびＥ３３３Ｓにより増強されて、補体カスケードの第一成分であるＣ１ｑへの結合お増加させ得る。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。ヒトＩｇＧ１へのＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ（単独または任意の組合せで）の導入は、Ｃ１ｑ結合を増強させる。Moore et al. (2010) mAbs 2:181。Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863 （そこに記載の図１）に記載のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドアイソタイプ抗体“１１３Ｆ”のＦｃ領域もまた、増強されたＣＤＣを付与する。Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553 および Redpath et al. (1998) Immunology 93:595も参照のこと。
エフェクター機能を増加または減少させるさらなる変異は、Dall’Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129に記載されている。Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460も参照のこと。
阻害性受容体ＦｃｙＲＩＩｂに対する親和性を増強するＦｃ変異体もまた、例えばアポトーシス誘導またはアジュバント活性を増強するために使用可能である。 Li ＆ Ravetch (2011) Science 333:1030; Li ＆ Ravetch (2012) Proc. Nat’l Acad. Sci (USA) 109:10966；米国特許出願公開２０１４／００１０８１２。かかる変異体は、例えばＢ細胞および単球を含むＦｃｙＲｌｌｂ＋細胞に関連する免疫モジュレーター活性を有する抗体を提供することができる。一態様において、Ｆｃ変異体は、１以上の活性化受容体に関連するＦｃｙＲｌｌｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃｙＲｌｌｂに対する結合を変更するための変異には、ＥＵインデックスに従い、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、および３３２からなる群より選択される位置での１以上の修飾を含む。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性を増強するための置換の例には、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅが含まれるが、これに限定されない。置換の例には、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、および３２８Ｙが含まれる。ＦｃｙＲｌｌｂに対する結合を増強するための他のＦｃ変異には、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆが含まれる。具体的には、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ＋Ｌ３２８Ｆ二重変異体を含むＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅ変異は、阻害性ＦｃｙＲｌｌｂ受容体に対する親和性を増強するのに特に重要である。Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開２００６／０２４２９８；ＷＯ２０１２／０８７９２８。増強されたＦｃγＲＩＩｂに対する特異性（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１とは区別される）は、Ｐ２３８Ｄ置換を加えることにより得られる。Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. ＆ Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１。
グリコシル化
抗体のグリコシル化は、エフェクター機能を増加または減少するために修飾される。例えば、非グリコシル化抗体は、位置２９７でのアスパラギン残基の保存的変異（例えば、Ｎ２９７Ａ）により全てのエフェクター機能を欠き、従って補体およびＦｃγＲＩ結合をなくした抗体を作製することができる。Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao ＆ Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595も参照のこと（ＩｇＧ１におけるＮ２９７Ｑを用いて、位置２９７でのグリコシル化を排除する）。
非グリコシル化抗体は、一般的に、エフェクター機能を欠くが、変異は、機能を回復するために導入することができる。非グリコシル化抗体、例えばＮ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／もしくはＨ変異により生じる抗体またはタンパク質をグリコシル化しない系（例えば大腸菌）で産生される抗体は、ＦｃγＲ結合を回復させるためにさらに変異されてよく、例えばＳ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／またはＨ（ＷＯ２００９／０７９２４２）、またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ（Jung et al. (2010) Proc. Nat’l Acad. Sci (USA) 107:604)である。
さらに、増強されたＡＤＣＣを有する抗体は、グリコシル化を変更することにより作製できる。例えば、重鎖のＡｓｎ２９７結合型オリゴ糖からのフコースの除去は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する改善された結合に基づいて、ＡＤＣＣを増強することが示されている。Shields et al. (2002) JBC 277:26733; Niwa et al. (2005) J. Immunol. Methods 306: 151; Cardarelli et al. (2009) Clin. Cancer Res.15:3376 (MDX−1401)； Cardarelli et al. (2010) Canver Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX−1342)。このような低不コース抗体は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を欠くノックアウトチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Yamane−Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614）、または非フコシル化抗体を産生する他の細胞において、製造可能である。例えば、Zhang et al. (2011) mAbs 3:289 および、Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210 （両方とも、糖鎖工学性（glycoengineered）ピキア酵母における抗体産生を記載）； Mossner et al. (2010) Blood 115:4393; Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466；ＥＰ１１７６１９５Ｂ１。ＡＤＣＣはまた、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合させる能力が低下し、また宿主細胞中に発現される抗体の低フコシル化をもたらす、変異ＣＨＯ細胞株の使用を開示する、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５に記載の通りに増強され得る（Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733−26740も参照のこと）。あるいは、フコース類縁体は、抗体上の炭水化物へのフコースの取り込みを阻害する抗体の産生中に培地に添加されてよい。ＷＯ２００９／１３５１８１。
抗体結合オリゴ糖にバイセクティング(bisecting)ＧｌｃＮａｃ構造を増やすこともまた、ＡＤＣＣを増強させる。ＵｍａｎａらのＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／５４３４２は、操作された細胞株において発現された抗体が、増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示し、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株を記載する（Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176−180も参照のこと）。
さらなるグリコシル化変異体は、ガラクトース、シアル酸、フコースおよびキシロース残基（所謂、ＧＮＧＮグリコフォーム）を欠くものが開発されており、それは、増強されたＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを示すが、ＣＤＣは減少されており、ならびにシアル酸、フコースおよびキシロース（所謂、Ｇ１／Ｇ２グリコフォーム）を欠く他のものが開発されており、それは、増強されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣを示す。米国特許出願公開番号２０１３／０１４９３００。これらのグリコシル化パターンを有する抗体は、要すれば、内在性キシロシルおよびフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされた遺伝的に改変されたタバコ属野生種（N.benthamiana）植物で産生される。
糖鎖エンジニアリング(glycoengineering)はまた、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に結合した炭水化物鎖のα２，６シアリル含量を変化させることによって、ＩｇＧ構築物の抗炎症特性を変更するために使用することができ、ここで、α２，６シアリル化形態の増加した割合は、増強された抗炎症作用をもたらす。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513を参照のこと。逆に、α２，６シアリル化炭水化物を有する抗体の割合の減少は、抗炎症特性が望まれない場合に有用であり得る。抗体のα２，６シアリル化含量を、例えばα２，６シアリル化形態の選択的精製または酵素的修飾により改変する方法は、米国特許出願公開番号２００８／０２０６２４６に記載されている。他の態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、例えばＦ２４１Ａ修飾の包含によって、α２，６シアリル化の効果を模倣するように修飾することができる。ＷＯ２０１３／０９５９６６。
本明細書に記載の抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のいずれかに１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、変化した抗原結合に起因する抗体の免疫原性の増加または抗体のｐＫの変化をもたらし得る（Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673−702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489−94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099−109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R−56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452−7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697−706）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。
生物学的半減期
ある態様において、抗体は、その生物学的半減期を増加するために修飾されている。種々のアプローチが可能である。例えば、このことは、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることにより可能である。一態様において、抗体は、Ｐｒｅｓｔａらの米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載の通り、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループに由来するサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変される。ＦｃＲｎへの結合を増加させ、および／または薬物動態特性を改善するＦｃ変異の他の例は、位置２５９、３０８および４３４での置換を含み、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加させる他の変異には、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213−6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346−356）、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591−6604）、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ（Del’ Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171−5180, Dall’Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514−23524）が含まれる。米国特許第８，３６７，８０５号を参照のこと。
Ｎ４３４Ａ変異体（Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663）などのＩｇＧ Ｆｃ内の特定の保存された残基の修飾（Ｉ２５３／Ｈ３１０／Ｑ３１１／Ｈ４３３／Ｎ４３４）は、ＦｃＲｎ親和性を増加させ、それにより循環における抗体の半減期を増加させることができる方法として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含むＦｃ変異の組合せは、ＦｃＲｎ結合を増加させ、血清半減期を５倍増加させることが示されている。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含むＦｃ変異の組合せも、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長させる。Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759。加えて、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｍ、およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異を含むＦｃ変異の組合せもまた、半減期を延長させることが示されている。ＷＯ２００９／０８６３２０。
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含むＦｃ変異の組合せは、半減期をほぼ４倍に増加させる。Dall’Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。増加したＦｃＲｎ親和性を提供するが、低下したｐＨ依存性を提供する関連するＩｇＧ１修飾（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）を、ＦｃＲｎへの、内因性ＩｇＧ（例えば、自己免疫セッティングの場合）または別の外因性（治療用）ｍＡｂのいずれかの他の抗体の結合を阻止し、その結果その他の抗体の増加したクリアランスをもたらするための競合物質として使用するためのＩｇＧ１構築物（“ＭＳＴ−ＨＮ Ａｂｄｅｇ”）を作製するために用いられている。Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４。
ＦｃＲｎ結合を増加させるための他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663−7671；６，２７７，３７５；６，８２１，５０５；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。
ある態様において、ハイブリッドＩｇＧアイソタイプは、ＦｃＲｎ結合を増加させるため、可能であれば半減期を増加させるために使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体は、２つのアイソタイプが異なる位置での、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ１位置を、ＩｇＧ３由来のアミノ酸で置換することにより構築され得る。従って、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体は、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むように構築され得る。本明細書に記載の他の態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体は、２つのアイソタイプが異なる位置での、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ２位置を、ＩｇＧ１由来のアミノ酸で置換することにより構築され得る。従って、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体は、１以上の置換、例えば以下のアミノ酸置換の１以上：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６でのグリシンの挿入を意味する）、および３２７Ａを含むように構築され得る。米国特許第８，６２９，１１３号を参照のこと。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドは、血清半減期を増加させ、発現を改善することを意図して作製されている。米国特許第７，８６７，４９１号（そこに記載される配列番号１８）。
本発明の抗体の血清半減期はまた、ペグ化により増加することができる。抗体は、例えば、該抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加するために、ペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体またはその断片を、一般的に、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）反応材と、抗体または抗体断片に結合するような条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いる用語“ポリエチレングリコール”は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導するために使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することが意図される。ある態様において、ペグ化される抗体は、アグリコシル化（aglycosylated）抗体である。タンパク質をペグ化する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載の抗体に適用することができる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらのＥＰ０１５４３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらのＥＰ０４０１３８４を参照のこと。
あるいは、いくつかの状況下で、本発明の抗体の半減期を増加させるのではなく、それ減少させることが望ましい場合がある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおける、Ｉ２５３Ａ（Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355）およびＨ４３５Ａ／Ｒ Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ（Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819）などの修飾は、医療用画像取得のような迅速なクリアランスが好ましい状況下での使用のために、ＦｃＲｎ結合を減少させて、半減期を低減させる（クリアランスを増加させる）ことができる。Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照のこと。クリアランスを強化するための他の手段には、Ｆａｂ断片などのＦｃＲｎと結合する能力を欠く抗体断片として本発明の抗原結合ドメインをフォーマットすることが含まれる。このような修飾は、数週間から数時間に抗体の循環半減期を低減し得る。その後、抗体断片の選択的ＰＥＧ化は、必要に応じて、抗体断片の半減期を微調整（増加）するために使用することができる。Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。抗体断片は、例えば融合タンパク質構築物において、ヒト血清アルブミンと結合させて半減期を増加させ得る。Yeh et al. (1992) Proc. Nat’l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、二重特異性抗体は、本発明の第一の抗原結合ドメインおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する第二の抗原結合ドメインで構成されてもよい。国際特許公報ＷＯ２００９／１２７６９１およびそこに引用される特許文献を参照のこと。あるいは、特定のポリペプチド配列、例えば“ＸＴＥＮ”ポリペプチド配列が、半減期を増加させるために抗体断片に追加され得る。Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186；国際特許公報ＷＯ２０１０／０９１１２２。
安定性
ＩｇＧ１構築物のヒンジにおける潜在的なプロテアーゼ切断部位は、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾によって除去することができ、抗体の安定性を高めることができる。ＷＯ２０１４／０４３３４４。
ある態様において、本明細書に記載の抗体は、アスパラギン異性部位を含んでいない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で生じてよく、その結果、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を減少させることができる、イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る（イソアスパラギン酸効果）。
各抗体は、一般的に、６から９．５の範囲のｐＨにある、固有の等電点（ｐＩ）を有し得る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、一般的に、７〜９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、一般的に、６〜８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下で折り畳まれず、不安定であり得るという推測がある。従って、正常範囲内にあるｐＩ値を含む抗体を得ることが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体を選択すること、または荷電表面残基に変異を導入することのいずれかにより、達成することができる。
各抗体は、安定性インビボでより高い全体的なを示す、より高い融解温度を有する特徴的な融解温度を有し得る（Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361−71）。一般的に、ＴＭ１（初期のアンフォールディング(unfolding)の温度）は、６０℃以上、好ましくは６５℃以上、さらにより好ましくは７０℃以上であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952−60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47−52）または円二色性分散計（Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343−9）を用いて測定することができる。
好ましい態様において、抗体は、急速に分解されないように選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626−32）を用いて測定することができる。
ＩｇＧ４定常ドメインを用いるとき、通常、ＩｇＧ１のヒンジ配列を模倣し、それによってＩｇＧ４分子を安定化する、例えば治療される患者において、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間のＦａｂアームの交換を減少させる、置換Ｓ２２８Ｐを含むことが好ましい。Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925。同様に、ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体において、Ｃ２１９Ｓおよび／またはＣ２２０Ｓ変異は、ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体を安定化させる。
凝集
別の好ましい態様において、望ましくない免疫応答の誘発および／または変化したもしくは好ましくない薬物動態学的特性をもたらし得る、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下の凝集を有することが許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱法を含むいくつかの技術によって測定することができる。
Ｖ．非抗体タンパク質および抗体誘導体
本明細書に記載の発明はまた、全長抗体ではない分子にも適用され得る。ただし、それらはヒンジを含む。例えば、増強された生物学的活性を有するＩｇＧ融合タンパク質を作製することができる。従って、本発明は、ＩｇＧ２ヒンジおよび要すれば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその部分を含む、ＩｇＧ定常領域、例えばＦｃ領域に結合された、例えば共有結合された活性部分を含む融合タンパク質を提供する。Ｆｃは、表５および６に示される修飾された重鎖定常領域のＦｃ部分のような、本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域の任意のＦｃであり得る。
本明細書に記載の抗体はまた、二重特異性分子を形成するためにも使用され得る。抗体またはその抗原結合部分は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成し得る。本明細書に記載の抗体は、２以上の他の機能的分子に誘導体化または連結されて、２以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成してもよい；かかる多重特異性分子はまた、本明細書で用いる用語“二重特異性分子”に包含されることが意図される。二重特異性分子を作製するために、本明細書に記載の抗体は、二重特異性分子が得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１つまたは複数の他の結合分子に、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方法によって）機能的に連結され得る。
ＶＩ．組成物
薬学的に許容される担体とともに製剤された、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分（複数可）の１つまたは組合せを含む、組成物、例えば医薬組成物がさらに提供される。かかる組成物は、本明細書に記載の（例えば、２以上の異なる）抗体、または免疫複合体または二重特異性分子の１つまたは組合せを含み得る。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する抗体または相補的な活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性）の組み合わせを含み得る。
ある態様において、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、１−３００ｍｇ／ｍｌ、または１００−３００ｍｇ／ｍｌの濃度で本明細書に記載の抗体を含む。
本明細書に記載の医薬組成物はまた、併用療法で、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激剤（例えば、活性化剤）と組み合わせた本明細書に記載の抗体を含み得る。併用用量で使用され得る治療剤の例は、本明細書に記載の抗体の使用に関する節で以下により詳細に記載される。
ある態様において、本明細書に記載の治療用組成物は、癌の処置に使用される他の化合物、薬剤、および／または薬物を含んでいてよい。かかる化合物、薬剤、および／または薬物には、例えば、化学療法薬、小分子薬剤、または所与の癌に対する免疫応答を刺激する抗体が含まれ得る。いくつかの例では、治療用組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても公知）抗体、または抗ＬＡＧ−３抗体を含み得る。
本明細書で用いる、“薬学的に許容される担体”には、生理学的に適合する、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与に適している。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から該化合物を保護する物質でコーティングされ得る。
本明細書に記載の医薬化合物は、１または複数の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性作用を与えない、塩を意味する（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1−19を参照のこと）。かかる塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの非毒性無機酸、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来する塩が含まれる。塩基付加塩には、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来する塩が含まれる。
本明細書に記載の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでいてよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および、（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
本明細書に記載の医薬組成物に使用することができる好適な水性または非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適当な流動性は、例えば、分散液の場合には必要とされる粒子径を維持することにより、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでいてよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌法および例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの種々の抗菌剤および抗真菌剤の包含の両方によって確実にされ得る。組成物に、例えば糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることもまた望ましい。加えて、注射用医薬形態の吸収の遅延は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤の包含によってもたらされ得る。
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。任意の常套の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記載の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を、組成物に組み込むことも可能である。
治療用組成物は、一般的に、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適する他の規則構造(ordered structure)として製剤され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子径を維持することにより、および界面活性剤を使用することにより、適切な流動性が維持され得る。多くの場合、例えば、組成物中に、糖類、マンニトールおよびソルビトールのようなポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張化剤を含んでいることが好ましい。注射可能な組成物の吸収の遅延は、組成物中に、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンのような吸収を遅延する試薬を包含させることにより可能となる。
滅菌注射溶液は、活性化合物を必要量で適当な溶媒中に、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組合せと共に包含させ、次いで、精密ろ過により滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分に任意の追加の所望の成分を加えたものの粉末が生成される、真空乾燥法および凍結乾燥（凍結乾燥）法である。
単一投与量形態を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象、および特定の投与方法によって変わり得る。単一投与量形態を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に、治療効果を生じる組成物の量であり得る。一般的に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた、約０．０１％〜約９９％の活性成分、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の活性成分の範囲であり得る。
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラス投与が可能であり、いくつかの分割用量は長期間投与され得るか、または該用量は、急迫した治療状況で示されるように比例的に減少または増加され得る。それは、とりわけ投与の容易性および投与量の均一性のため単位投与量形態に非経腸組成物を剤形化するのに有利である。本発明で用いる単位投与量形態は、処置されるべき対象に対して単一投与量として適する物理的に不連続な単位を意味する；各単位は、必要な薬学的担体と共に所望の治療的効果を生じることが計算された、予め決定した量の活性化合物を含む。本明細書に記載の単位投与量形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独特な特性および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療用にそのような活性化合物を配合する技術に固有の制限、に支配され、そして直接的に依存する。
抗体の投与に関して、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり、約０．０００１〜１００ｍｇ、より通常は、０．０１〜５ｍｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。例示的な処置レジメンは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与である。本明細書に記載の抗体の好ましい投薬レジメンには、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、抗体は、（ｉ）４週間毎に６回の投薬、その後に３カ月毎；（ｉｉ）３週間毎；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次いで１ｍｇ／ｋｇ体重を３週間毎、の投薬スケジュールのうちの１つを用いて提供される。
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、その場合、投与するそれぞれの抗体の投与量は示した範囲内にある。抗体は、通常、複数回で投与される。単回投薬間の間隔は、例えば、週に１回、月に１回、３カ月毎または年に１回とすることができる。また、間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって示されるように、不規則であり得る。一部の方法では、投与量を、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度が達成されるように、ある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度が達成されるように、調整する。
抗体は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、より低頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体である。投与の投与量および頻度は、処置が予防的または治療的であるかに応じて変わり得る。予防適用では、比較的低い投与量を比較的低頻度の間隔で長期的に投与する。一部の患者は、その残りの寿命の間、処置を受け続ける。治療的適用では、比較的短い間隔の比較的高い投与量が、疾患の進行が低下または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで、必要な場合がある。その後、患者に予防的レジメンを投与することができる。
本明細書に記載の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を得るために、変動させ得る。選択される投与量レベルは、用いる本明細書に記載の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置すべき患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康および病歴、ならびに医学分野で周知の同様の要因を含めた、種々の薬物動態学要因に依存して変わり得る。
本明細書に記載の抗体の“治療的有効投与量”は、好ましくは、疾患の症状の重篤度の低下、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の罹患が原因の機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。癌において、治療的に有効な用量は、好ましくは、癌と関連する身体的症状のさらなる悪化を防止する。癌の症状は、当該技術分野において周知であり、例えば、異常なモル特徴（mole feature）、非対称性、境界性（border）、色および／または直径の外観の変化、新たに色素沈着した皮膚領域、異常なほくろ、爪の下の黒変、乳房腫瘤、乳首の変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、衰弱、過度の疲労、食事困難、食欲不振、慢性の咳、悪化する息切れ、吐血、尿血、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、満腹感、腫脹(bloating)、腹腔内液、膣出血、便秘、腹部膨満、結腸穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、痛み）、疼痛、激しい発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝転移、骨転移、腎転移および膵臓転移、嚥下困難などを引き起こす。
治療的有効用量は、早期または予備的な疾患の徴候が存在するとき、所望され得るような癌の発症を予防または遅延させ得る。癌の診断に利用される実験室検査には、化学、血液学、血清学および放射線学が含まれる。従って、上記のいずれかをモニターする臨床的または生化学的アッセイを、特定の処置が癌を処置するのに治療的に有効な用量であるかどうかを決定するのに用いることができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの要因に基づいて、かかる量を決定することができる。
本明細書に記載の組成物は、１つまたは複数の投与経路を介して、当分野で知られている種々の方法のうちの１つまたは複数を用いて投与することができる。当業者によって理解されるように、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記載の抗体のための好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路、例えば注射または注入によるものが含まれる。本明細書で用いる語句“非経腸投与”とは、経腸および局所投与以外の投与様式、通常は注射によるものを意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれるが、これに限定されない。
あるいは、本明細書に記載の抗体は、局所、上皮または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの、非経腸ではない経路を介して投与することができる。
活性化合物は、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル封入送達系を含めた徐放性製剤など、化合物を迅速な放出に対して保護し得る担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法が、特許取得されているか、または当業者に一般に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療機器で投与することができる。例えば、好ましい態様において、本明細書に記載の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；または、同第４，５９６，５５６号に記載の装置のような無針皮下注射装置で投与することができる。本明細書に記載の抗体と共に使用するための周知のインプラントおよびモジュールの例には、制御された速度で薬物を投与するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して薬剤を投与するための治療装置を開示している米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；連続的な薬物送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバ区画を有する浸透圧ドラッグデリバリーシステムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号；および、浸透圧ドラッグデリバリーシステムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。これらの特許文献は、引用により本明細書中に包含させる。多くのそのような他のインプラント、送達システム、およびモジュールが、当業者に知られている。
ある態様において、本明細書に記載の抗体は、インビボでの適切な分配を保証するように製剤され得る。例えば、血液−脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本明細書に記載の治療用化合物がＢＢＢを通過するのを確実にするために（所望の場合）、それらは、例えば、リポソーム中に製剤され得る。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１つまたは複数の物質を含むことができ、従って、標的薬物送達を増強することができる（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。標的化物質の例には、葉酸塩またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの、米国特許第５，４１６，０１６号を参照）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと）が含まれる。
ＶＩＩ．使用および方法
本明細書に記載の抗体、抗体組成物および方法は、例えば、種々の障害、例えば癌の処置を含む、多数のインビトロおよびインビボでの有用性を有する。例えば、本明細書に記載の抗体は、培養下、インビトロまたはエクスビボで細胞に、あるいは例えば、インビボでヒト対象に投与され得る。従って、処置が進行するように、修飾された重鎖定常領域を含む抗体を対象に投与することを含む、該対照の処置法を提供する。また、対象における免疫応答を改変するように、抗体を対象に投与することを含む該対象における免疫応答を改変する方法もまた提供される。好ましくは、応答は、増強され、刺激され、または上方制御される。しかしながら、他の態様において、免疫応答は阻害される。
好ましい対象には、免疫応答の増強が望ましいヒト患者が含まれる。この方法は、特に、免疫応答（例えば、Ｔ細胞介在性免疫応答）を増強することにより処置され得る障害を有するヒト患者の処置に好適である。特定の態様において、本方法は、インビボでの癌の処置に特に適している。一態様において、対象は、腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は、固形腫瘍または液性腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍であり得る。ある態様において、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。ある態様において、腫瘍は、非免疫原性である。ある態様において、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陽性である。特定の態様において、腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はまた、ウイルス保有対象でもよく、該ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
さらに、腫瘍の増殖が対象において阻害されるように、本明細書に記載の抗体を該対象に投与することを含む、該対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。また、ウイルス感染が対象において処置されるように、本明細書に記載の抗体を該対象に投与することを含む、該対象におけるウイルス感染の処置法も提供する。
また、本明細書中、腫瘍、例えば、癌性腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境からＴｒｅｇ細胞を枯渇させる方法であって、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞の枯渇を刺激するＦｃを含む本明細書に記載の抗体の治療的有効量を該対象に投与することを含む方法も包含される。Ｆｃは、例えば、１以上の活性化Ｆｃ受容体への結合または増強された結合を有するような、エフェクター機能または増強されたエフェクター機能を有するＦｃであり得る。
ある態様において、修飾された重鎖定常領域を含む抗体は、刺激性分子に結合し、その活性を阻害する、すなわち、刺激性分子のアンタゴニストであるか、または抗体は、阻害性分子に結合し、その活性を刺激する、すなわち、阻害性分子のアゴニストである。かかる抗体は、免疫系または免疫応答が下方制御されるべき疾患、例えば、自己免疫疾患を処置するため、または移植片拒絶を予防するために使用され得る。
癌
本発明は、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻害または低減されるように、および／または腫瘍が退行するように、癌を有する対象を処置する方法であって、本明細書に記載の抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲの活性化は、患者の癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。抗体は、癌性腫瘍の増殖を阻害するために単独で使用可能である。あるいは、抗体は、以下に記載の通り、別の薬剤、例えば、他の免疫原性薬剤、標準的な癌処置剤、または他の抗体と組み合わせて使用されてよい。
本明細書に記載の抗体を用いて増殖が阻害され得る癌には、一般的に、免疫療法に応答する癌が含まれる。処置のための癌の非限定的な例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮癌細胞腫（ＮＳＣＬＣ）、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎臓癌（例えば、淡明細胞癌腫）、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（例えば、腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺）、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫）、頚部癌、胃癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌癌腫、および頭頸部癌（または癌腫）、胃癌、胚細胞腫瘍、小児肉腫、鼻腔内ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、悪性腫瘍皮膚癌または眼内悪性黒色腫などの転移性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、副甲状腺の癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腫瘍、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性の癌（アスベストによって誘導される癌を含む）、ウイルス関連癌（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）、ならびに２つの主要な血液系細胞株、すなわち、骨髄系細胞株（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよびマスト細胞を産生する）またはリンパ系細胞株（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および血漿細胞を産生する）のいずれかに由来する血液系腫瘍、例えば全タイプの白血病、リンパ腫、および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ球性および／または骨髄性白血病、例えば急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（Ｍ０）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；成熟細胞を含む）、急性骨髄性白血病（Ｍ３またはＭ３変異体［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加を伴うＭ４変異体［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、単球性白血病肉腫、およびクロロマ；リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞様リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球リンパ腫、Ｔリンパ芽球；およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症またはセザリー症候群とも言う）、およびリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）／ワルデンストレームマクログロブリン血症；骨髄腫、例えばＩｇＧ型骨髄腫、軽鎖型骨髄腫(light chain myeloma)、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（無症候性骨髄腫とも言う）、孤立性形質細胞腫、および多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性リンパ腫；骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；精上皮腫、奇形癌腫、星状細胞腫を含む中枢および末梢神経の腫瘍、シュワン腫；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；および、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺乳頭癌および奇形癌腫、リンパ系造血性腫瘍、例えば、小細胞および脳回状核の細胞型を含む、Ｔ細胞およびＢ細胞腫瘍(Ｔ細胞性の前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を含むを含むが、これに限定されない)を含む、他の腫瘍；好ましくはＴ細胞型の、大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ 肝脾Ｔ細胞性リンパ腫；末梢性／成熟Ｔ細胞リンパ腫（多形性サブタイプおよび免疫芽球性サブタイプ）；血管中心性（鼻型）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄性リンパ腫、ならびに該癌の何れかの組合せが含まれる。本明細書に記載の方法はまた、転移癌、難治性癌（例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体を遮断することを含む、例えば、以前の免疫療法に反応しない癌）、および再発癌の処置にも使用可能である。
併用療法
上記の治療法に加えて、本明細書に記載の抗体はまた、別の治療法と組み合わせて使用することもできる。例えば、癌治療のために、本明細書に記載の抗体は、化学療法、放射線療法、外科手術または遺伝子治療のような別の癌治療も受けている対象に投与することができる。
処置法には、本明細書に記載の抗体（例えば、アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体、および修飾された重鎖定常領域を有するＡＤＣ）を、別の分子、例えば、抗体（例えば、アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体、およびＡＤＣ）と共に投与することが含まれ得る。免疫系を刺激する本明細書に記載の抗体は、免疫系を刺激する別の分子、例えば、共刺激分子のアゴニストまたは阻害性分子の阻害剤である分子と共に投与され得る。
本明細書に記載の抗体単独、またはそれと１もしくは複数のさらなる免疫刺激抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断薬）の組合せは、標準的な癌治療と組み合わせることができる。例えば、本明細書に記載の抗体単独またはそれと１もしくは複数のさらなる抗体の組合せは、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。これらの例では、本明細書に記載の組み合わせと共に投与される他の化学療法剤の用量を減少させることが可能であり得る（Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301−5304）。そのような組み合わせの一例は、黒色腫の処置のためのデカルバジンまたはＩＬ−２とさらに組み合わせた、本明細書に記載の抗体と追加抗体を併用または併用しない組み合わせである。
本明細書に記載の抗体は、抗新生物抗体、例えばリツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、べクサー（登録商標）（トシツモマブ）、ゼヴァリン（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、リンフォシド（登録商標）（エフルツズマブ）、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、およびタルセバ（登録商標）（エルロチニブ）などと併用することができる。本明細書に記載の抗体はまた、以下の化学療法剤の１以上と併用することもできる：カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル（タキソール）、ドキソルビシン、５−ｆｕ、またはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ（６Ｘコンボ））；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２）；Ｂｃｌ−２阻害剤（例えば、ＢＨ３Ｉ−２’（ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤）、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ１）阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ２４３６０）、ＡＴ−１０１（Ｒ−（−）−ゴシポール誘導体）、ＡＢＴ−２６３（小分子）、ＧＸ−１５−０７０（オバトクラックス）、またはＭＣＬ−１（骨髄性白血病細胞分化誘導タンパク質−１）アンタゴニスト）、ｉＡＰ（アポトーシスタンパク質の阻害剤）アンタゴニスト（例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃ模倣体、合成ｓｍａｃペプチド（Fulda et al., Nat Med 2002;8:808−15を参照のこと）、ＩＳＩＳ２３７２２（ＬＹ２１８１３０８）、またはＡＥＧ−３５１５６（ＧＥＭ−６４０））、ＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチラーゼ）阻害剤、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、血管形成阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ（例えば、アバスチン）を標的とする抗血管形成剤、合成トリテルペノイド（Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799−808を参照のこと）、ｃ−ＦＬＩＰ（細胞性ＦＬＩＣＥ−阻害性タンパク質）モジュレーター（例えば、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ）、５８０９３５４または５５６９１００の天然および合成リガンド）、キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンおよびテムシロリムス、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド（Lenalildomide）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物。
本明細書に記載の抗体および併用抗体療法はさらに、１以上の抗増殖性細胞傷害剤と組み合わせて使用することができる。抗増殖性細胞傷害剤として使用可能な化合物のクラスには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
アルキル化剤（窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼンを含むが、これに限定されない）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））、ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピペロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミド。
代謝拮抗剤（葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類縁体、プリン類縁体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これに限定されない）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン。
本明細書に記載の抗体との併用に適する抗増殖剤、当該分野で公知の他の微小管安定化剤に加えて、タキサン類、パクリタキセル（パクリタキセルは、タキソール（商標）として市販されている）、ドセタキセル、ディスコデルモライド（ＤＤＭ）、ジクチョスタチン（ＤＣＴ）、ペロルシドＡ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２，１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ−９，１０−デヒドロエポチロンＤ、シス−９，１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(Patupilone)（ＥＰＯ−９０６）、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ（ディスコデルモライド）、ＴＺＴ−１０２７（ソブリドチン）、ＩＬＸ−６５１（塩酸タシドチン）、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩（Ｅ−７３８９）、ヘミアスタリン（ＨＴＩ−２８６）、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、メイタンシノイド免疫複合体（ＤＭ−１）、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２（イスピネシブ）、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７ベータ−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−オール、シクロステレプチン、イソラウリマリド、ラウリリマイド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４，１６−ジデメチル−（＋）−ディスコデルモライド、およびクリプトチロン１（これらに限定されない）。
併用療法剤は、同時にまたは逐次投与することができる。任意の例において、組合せは、固定用量の組合せである。
本明細書に記載の抗体との併用時またはその処置前に、異常増殖細胞を休止状態にすることが望ましい場合、ホルモンおよびステロイド（合成類縁体を含む）、例えば１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロｔｒｉａｎｉｓｅｎｅ、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ＺＯＬＡＤＥＸ（商標）もまた、患者に投与することができる。本明細書に記載の方法または組成物を使用するとき、抗菌薬などの臨床状況における腫瘍増殖または転移の調節に使用される他の薬剤もまた、所望の通りに投与することができる。
化学療法剤の安全かつ有効な投与のための方法は、当業者に公知である。加えて、それらの投与は、標準的な文献に記載されている。例えば、多くの化学療法剤の投与は、Physicians’ Desk Reference （ＰＤＲ）、例えば、１９９６年版（Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645−1742、ＵＳＡ）に記載されている；その開示内容は、引用により本明細書中に包含させる。
化学療法剤（複数可）および／または放射線療法は当技術分野で周知の治療プロトコルに従って投与できる。化学療法剤（複数可）および／または放射線療法の投与は、処置されている疾患とその疾患での化学療法剤（複数可）および／または放射線療法の既知の効果に依存して変化できることは当業者には明白なことである。また、治療プロトコール（例えば、投与量および投与回数）は、専門医師の知識によって、投与された治療剤の患者で観察される効果および投与された治療剤に対するその疾患の観察される反応を考慮して変えることができる。
本明細書の開示は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これはさらに限定するものと解釈されるべきではない。本願中で引用される全ての図および全ての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、引用により本明細書中に明示的に包含させる。特に、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０９／０４５９５７、ＷＯ０９／０７３５３３、ＷＯ０９／０７３５４６、ＷＯ０９／０５４８６３およびＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７２９１８、および米国特許出願第２０１１／０１５０８９２の開示は、引用により本明細書中に明示的に包含させる。
実施例
実施例１：非ＩｇＧ２ヒンジを有する同じ抗体と比較して、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体の増強された内在化
ＩｇＧ２定常領域を有するハイブリドーマ由来抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１．１（エフェクターを欠くＩｇＧ１）としての１１Ｆ１１抗体よりも細胞性ＣＤ７３阻害アッセイにおいてより強力であり、ＩｇＧ１定常領域を有する他の抗ＣＤ７３抗体よりも強力であることが観察された。少なくともこの観察に基づいて、ＩｇＧ１ヒンジなどの非ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体と比較して、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体の増加した阻害活性が、抗体の増加した内在化によるものであるという仮説が立てられた。この仮説を試験するために、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域またはその一部を有する抗ＣＤ７３抗体を、内在化アッセイで試験した。
使用した抗体は、表７に列挙されており、存在する場合には、特定の変異を含む各抗体の定常領域（全てのヒト）の各ドメインの同一性を提供する。
抗体は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞内での鎖および軽鎖を発現することによって作製し、培養培地を、トランスフェクションの５日後に回収した。
ＦｃγＲに対する構築物の結合を測定した。ＩｇＧ１．１およびＩｇＧ２分子に対するｈＣＤ６４およびｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１結合データは、異なるＦｃについての期待値と一致した。ＩｇＧ１．１ｆは、最も不活性なＦｃである。ＩｇＧ２およびＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓは、ＩｇＧ２に対する一般的なＦｃＲ結合を示した。予想されるように、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１．１ｆについてのデータは、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２よりも顕著に弱い結合を示唆するが、ＩｇＧ１．１ｆに比べて結合を増加させた。
ヒトＣＤ７３に対する抗体の親和性を、定常領域の変化がそれらに影響を与えるかどうかを決定するために測定した。親和性は、以下のように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。ＣＤ７３結合速度論および親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（GE Healthcare）を２５℃で用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって調べた。この試験は、ｈＣＤ７３のＮ末端ドメイン（ヒトＣＤ７３の残基２６−３３６からなる；Ｎ−ｈＣＤ７３と称される）の固定化プロテインＡ表面上に捕捉された抗体への結合を試験した。これらの試験のために、プロテインＡ（Pierce）を、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖトゥイーン２０のランニング緩衝液中、エタノールアミンブロッキングと共に、標準エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学を用いて、ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare）のフローセル１−４上で３０００−４０００ＲＵの密度に固定した。動力学的試験を、初めに、１０ｕｌ／分で３０秒間の接触時間を用いてプロテインＡ表面上に抗体（５−１０ｕｇ／ｍｌ）を捕捉させ、３０ｕｌ／分の流速で、１８０の会合時間および３６０秒の解離時間を用いて、６００、２００、６６．７、２２．２、７．４、および２．５ｎＭのＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓを結合させて行った。動力学的試験のための泳動バッファーは、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１３０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０５％トゥイーン２０、ｐＨ７．１であった。３０μｌ／分の流速で、１０ｍＭグリシン ｐＨ１．５の２つの３０秒パルスを使用して、各サイクル後に表面を再生した。センソグラムデータを二重参照し、次いで、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアｖ２．０．４を用いて、１：１ラングミュアモデルにフィッティングさせて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。
結果を表８に示す。この表は、異なる試験からのデータを合わせている。２組の数字が示されている抗体について、各セットは、別々の試験で得られたデータに対応する。
結果は、抗体中の異なる定常領域、例えば、ＣＤ７３．１０の存在が、ヒトＣＤ７３に対する抗体の親和性を変えなかったことを示している。
抗ＣＤ７３抗体の内在化を、２つの異なるアッセイで測定した。
Ａ．高含量内在化アッセイ（２時間の一定時間アッセイ）
抗ＣＤ７３抗体を、抗体インキュベーションの２時間後に、細胞発現を評価することによりＣａｌｕ６細胞における抗ＣＤ７３抗体依存性ＣＤ７３内在化を試験するために使用した。２０μｌの完全培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含むＧｉｂｃｏ ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０）中、細胞（２，０００細胞／ウェル）を、３８４ ＢＤ Ｆａｌｃｏｎプレートに播種し、一晩、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で増殖させた。抗ＣＤ７３抗体を０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で連続希釈し、該細胞プレートに５μｌ／ウェル添加した。細胞を抗体と共に２時間、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度下でインキュベートし、その後、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで、ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、最終４％）を該細胞プレートに２０ｕｌ／ウェル添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。その後、全ての液体を吸引し、細胞を３０ｕｌのＰＢＳで１回洗浄した。検出抗体（２．５μｇ／ウェルの抗ＣＤ７３Ａｂ ＣＤ７３．１０．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ）を、１５μｇ／ウェルで固定細胞プレートに添加した。細胞を４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ−４８８ヤギ抗ヒトを含む二次抗体およびＤＡＰＩを添加し、室温で１時間染色させた。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、プレートを、Ａｒｒａｙｓｃａｎ Ｖｔｉ（Cellomics, Pittsburgh, PA）上でイメージングした。ＩＣ５０およびＹｍａｘを測定した。Ｙｍａｘを、内部最大値として１００ｎＭ用量の１１Ｆ１１と比較することによって決定した。すべての計算は、１００％に設定されたこの対照と比較して内在化の割合として決定した。
結果を表９に示す。
結果は、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体が、より低いＥＣ５０およびより高いＹｍａｘを有することを示す。
動力学的内在化試験を、内在化の割合を評価するために実行した。いくつかの細胞を試験した：Ｈ２２２８細胞、ＨＣＣ１５細胞、Ｃａｌｕ６細胞、およびＮＣＩ−Ｈ２０３０。２０μｌの完全培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含むＧｉｂｃｏ ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０）中の細胞（２，０００細胞／ウェル）を、３８４ ＢＤ Ｆａｌｃｏｎプレートに播種し、一晩、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度下で増殖させた。ＣＤ７３抗体を、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍｌまで希釈し、細胞プレートに５μｌ／ウェル添加した。細胞を抗体と共に０−２時間、３７℃にてインキュベートし、次いでＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。その後、細胞を、ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、最終４％）を用いて室温で１０分間固定し、次いで３０ｕｌのＰＢＳで１回洗浄した。検出抗体（２．５μｇ／ウェルの抗ＣＤ７３Ａｂ ＣＤ７３．１０．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ）を０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で希釈し、１５μｇ／ウェルで固定細胞プレートに添加した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後に、二次抗体Ａｌｅｘａ−４８８ヤギ抗ヒトとＤＡＰＩを添加した。細胞を室温で６０分間染色させ、３回洗浄後、Ａｒｒａｙｓｃａｎ Ｖｔｉ（Cellomics, Pittsburgh, PA）を用いて画像を得た。結果を、図１Ａ−Ｊならびに表１０および１１示す。表１０の値は、図１Ａ−Ｊに示されたデータから導出される。

結果は、１１Ｆ１１（ＩｇＧ２抗体）が、数分以内に内在化し、３０分でプラトーに達し、一方、６Ｅ１１（ＩｇＧ１抗体）が、よりゆっくり内在化し、約１時間でプラトーに達したことを示す（図１Ａ−Ｊ）。同様に、ＩｇＧ１定常領域を有する１１Ｆ１１は、ＩｇＧ２定常領域を有する１１Ｆ１１よりもゆっくり内在化した。この傾向は、いくつかの細胞株で観察された（表１０および１１ならびに図１Ａ−Ｊ）。
Ｂ．フローサイトメトリーにより測定される内在化
ＣＤ７３の抗ＣＤ７３抗体介在性の内在化をまた、フローサイトメトリーにより試験した。示された細胞を、１０μｇ／ｍＬの示された抗体と共に、氷上で３０分間インキュベートし、数回洗浄し、示された時間で３７℃にてトランスファーした。示されたインキュベーション時間後の同じ時間に細胞を回収した。細胞を、再び一次抗体（最初のインキュベーションに用いたのと同じ抗体）で染色し、次いで、抗ヒト二次抗体で染色した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ７３の発現についてアッセイした。
図１Ｅおよび表１１に示す結果は、上記の内在化アッセイで得られた結果と一致しており、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を有する全ての抗体が、迅速かつ完全な内在化を誘導したことを示している。ＣＤ７３レベルは、２２時間後のウォッシュアウト後に低いままであり、内在化が永続的であることを示している。
図１Ｆおよび表１１に示される同様の結果は、抗体が、インキュベーション時間（ウォッシュアウトなし）中に培養物中に維持されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株で得られた。ここでも、これらのデータは、急速かつ顕著な内在化および内因性ＣＤ７３の下方制御の維持を示している。
内在化アッセイはまた、ヒトＳＮＵ−Ｃ１（結腸癌細胞株）およびＮＣＩ−Ｈ１４３７（非小細胞肺癌腫細胞株）細胞を用いて行われた。図１ＩおよびＪに示される結果はまた、急速な内在化で、５時間以内に最大レベルに達したことを示し、ＳＮＵ−Ｃ１においてＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆについて約５０％およびＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞について６０％の内在化の最大レベルを示す。図１ＧおよびＨは、Ｃａｌｕ６およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆの内在化の同様の動態を示す。ＣＤ７３内在化の％を示すグラフについて、この数値は、以下のように得られた：

ここで、各抗体について、ＭＦＩｔ＝ｘは、所与の時点でのＭＦＩであり、ＭＦＩｔ＝０は、ｔ＝０での最大蛍光であり、そしてＭＦＩバックグラウンドは、二次ＡｂのみのＭＦＩである。
従って、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ１ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体と比べて、より迅速かつより高度に内在化する。
実施例２：ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体と比較した、ＩｇＧ２ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体の増強されたアゴニスト活性
本実施例は、ＩｇＧ２ヒンジを含む抗ＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体と比較して、Ｔ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘導する増加した能力を有することを実証する。
上記のアッセイでＣＨＯ−ＯＫＴ３および３Ａ９において、ＩｇＧ２定常領域を有するハイブリドーマ由来抗体が、重鎖定常領域をＩｇＧ１またはエフェクターを欠くＩｇＧ１（ＩｇＧ１．１）ものに交換した同じ抗体よりも、サイトカイン分泌をより強力に刺激することが観察された。従って、ＩｇＧ２定常領域またはヒンジの効果は、これらのアッセイにおいて抗ＧＩＴＲ抗体でさらに試験された。
抗ヒトＧＩＴＲ抗体の重鎖可変領域（配列番号７５）を、表１３に示される重鎖定常領域に連結した。抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖は、配列番号７７からなる。表１３は、定常領域の各ドメインの同一性を示す：
まず、これらのＧＩＴＲ抗体の結合親和性を、ＩｇＧ１ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体のそれと比較した。可溶性ＧＩＴＲに対する抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性は、以下のようにＢｉａｃｏｒｅにより決定された。抗ＧＩＴＲ抗体を、ヒトκコーティングされたチップ（〜５ＫＲＵｓ； Southernbiotech カタログ番号２０６０−０１）上に捕捉し、組み換えヒトＧＩＴＲ（ｒＨＧＩＴＲ／Ｆｃ：Ｒ＆Ｄ systems、カタログ番号６８９−ＧＲ）を該チップ上に５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２ｎＭおよび３１ｎＭ濃度で流した。ｍＡｂ／容量の捕捉濃度は、２−４０μｇ／ｍＬ（１０μＬ／分で５μＬ）であった。抗原結合時間は、１５μＬ／分で５分であり、抗原解離時間は６分であって、再生を、５０ｍＭ ＨＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨ（１００μＬ／分で、それぞれ１２μＬ）を用いて行った。
図２に示される結果は、ａＩｇＧ２ヒンジを有する３つすべてのＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１．１定常領域を有するＧＩＴＲ抗体と同様の、活性化Ｔ細胞に対する親和性を有することを示す。
次に、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有するＧＩＴＲ抗体の能力を、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（ＯＫＴ３）を発現するＣＨＯ細胞で刺激したヒトドナーＴ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を刺激するそれらの能力について試験した。ＣＨＯ細胞は、抗ＧＩＴＲ抗体によるアゴニズムを観察できるように、準最適刺激を促進するために低レベルのＯＫＴ３を発現した。ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および抗ＧＩＴＲ抗体で刺激し、そしてＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を測定した。試験を以下のように行った。ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いる試験について、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に富むカクテル（StemCell Technology＃１５０６２）を製造業者のプロトコルに従って用いて、ヒトＰＢＭＣから得た。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（ＯＫＴ３）を発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＯＫＴ３）を、ＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、５０Ｋ Ｒａｄの投与量で照射した。細胞を採取し、培養培地（１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５５ｎＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、および１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した、ＲＰＭＩ−１６４０）に、２．５ｘ１０５／ｍＬで再懸濁した。９６ウェル ＴＣグレードの平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１ウェル当たり２．５ｘ１０４ ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞および１ｘ１０５ Ｔ細胞を、播種した。細胞を、４０μｇ／ｍＬで開始するＧＩＴＲ抗体の８点、４倍滴定でインキュベートした。無関係のｈＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として４０μｇ／ｍＬで添加した。細胞のみを含むサンプルを、何ら処理を行わないベースライン活性を示すものに含めた。各サンプルからの上清を、ＩＬ−２測定（ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いるアッセイについてのみ）（ＢＤ ｏｐｔ ＥＩＡ ヒトＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５５１９０）について２日目に、およびＩＦＮ−γ測定（ＢＤ ｏｐｔＥＩＡ ヒト ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＡキット；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５５１４２）について３日目に採取した。
図３ＡおよびＢに示す通り、ＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（抗ＧＩＴＲ．ｇ２．ｇ１）を有する抗体は、ＩｇＧ１定常領域（抗ＧＩＴＲ．ｇ１）を有する抗体よりも高度に、Ｔ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γの両方の分泌を誘導した。同様の結果が、これらの定常ドメインのエフェクターを欠くバージョンでも得られた（図３Ｃ）。
ＩｇＧ２ヒンジを含む抗ＧＩＴＲ抗体を用いるＴ細胞の増加した活性化をさらに確認するために、異なる試験形式でＩＬ−２分泌を試験した。この試験において、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞（ヒトＧＩＴＲを異所的に発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株）からのＩＬ−２分泌を誘導するＧＩＴＲ抗体の能力を、以下のように試験した。ヒトＧＩＴＲ（３Ａ９−ｈＧＩＴＲ）を異所的に発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株を、漸増量の示された抗体の存在下で、抗ＣＤ３モノクローナル抗体でコーティングしたプレート上で培養した。５ｘ１０４ ３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１；BD Biosciences）でコーティングしたプレート上で培養し、示された濃度の抗体で７時間処理した。
図４に示す通り、ＩｇＧ２ヒンジ（抗ＧＩＴＲ．ｇ２、抗ＧＩＴＲ．ｇ２．ｇ１ｆ、および抗ＧＩＴＲ．ｇ２．ｇ１．ｆ）を有する全ての抗体が、対応物を含むＩｇＧ１定常領域（抗ＧＩＴＲ．ｇ１ｆおよび抗ＧＩＴＲ．ｇ１．１ｆ）よりも高程度に、３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を誘導した。
これらの結果をまとめると、ＩｇＧ２ヒンジおよびｇ１またはｇ１．１定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体は、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体よりも強力であることが示唆される。
実施例３：抗体／抗原複合体のサイズに対する異なるヒンジ／Ｆｃの組合せの影響
上記実施例に示す通り、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３細胞活性のよりよい阻害剤であり、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体よりも内在化し、そしてＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＧＩＴＲ抗体は、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体よいｒも強力なアゴニストである。この観察、およびＩｇＧ２ヒンジがＩｇＧ１ヒンジよりも剛性であるという事実に基づき、ＩｇＧ１ヒンジを有する抗体と比べて、より大きな複合体が、抗原とＩｇＧ２ヒンジを有する抗体の間に形成されていると仮定された。以下の試験は、この過程を分析するために行った。
溶液中のＣＤ７３／抗体複合体の構造およびオリゴマー状態を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳにより調べた。これらの試験のために、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域のいずれかを含む抗体を、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを含むヒト−ＣＤ７３の全長細胞外ドメイン（ヒト−ＣＤ７３のアミノ酸残基２６−５４６、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと称される）またはヒト−ＣＤ７３のＮ末端ドメインに対応する断片（アミノ酸残基２６−３３６、Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓと称される）のいずれかを含む組み換えタンパク質と可変モル比で混合した。
ＣＤ７３／抗体複合体のオリゴマー状態を、インラインのマルチアングル光散乱検出器に連結したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって試験した。イソクラティックな分離を、０．０２％ アジ化Ｎａ（０．１μｍフィルター濾過）を含む、２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８を含む緩衝液中、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＦＬＣに接続したＳｈｏｄｅｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＫＷ−８０３ カラムを用いて、０．５ｍＬ／分で泳動して、行った。サンプルを、ＳＩＬ−２０ＡＣ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ Ｓｈｉｍａｄｚｕ オートサンプラーを用いてカラムに注入し、データを、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＳＰＤ−２０ＡＤダイオードアレイＵＶ／ｖｉｓ分光光度計、次いでＷｙａｔｔ ｍｉｎｉＤＡＷＮ(商標) ＴＲＥＯＳ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎｇｌｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ検出器、次いでＷｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ−ｒＥＸ屈折率検出器の３つのオンライン検出器を連続接続した装置で得た。データを集め、Ａｓｔｒａ（Ｗｙａｔｔ）およびＬａｂ溶液（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ソフトウェアを用いて分析した。
動的光散乱（ＤＬＳ）試験を、３８４ウェルプレート中、２５℃で、Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーで行った。試験パラメーターは、１回の測定につき５秒ずつ２０回の測定を行い、測定値を４回繰り返して、平均および標準偏差を記録した。強度自己相関関数は、Ｄｙｎａｍｉｃｓソフトウェア（Wyatt Technologies）を用いて、“Ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ”アルゴリズムを使用して適合させた。
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳの概要を、図６および図７に示す。抗体単独の分析は、一般的に単量体モノクローナル抗体である各抗体について保持時間（約１６〜１７分）、質量（１４０〜１５０ｋＤａ）、および流体力学的半径（５．０〜５．４ｎｍ）を示す。ｈＣＤ７３−ｈｉｓタンパク質のデータは、溶液中で予期される二量体構造を採用するタンパク質と一致している；特に、ＳＥＣ−ＭＡＬＳデータから決定された質量（１２０ｋＤａ）は、ＣＤ７３−ｈｉｓ二量体について予期される質量（１１７ｋＤａ）と一致し、ｈＣＤ７３−ｈｉｓ単量体について予期され得る質量（５８．５ｋＤａ）と不一致であった。Ｎ−ｈＣＤ７３についてのデータは、溶液中で単量体である組み換えＮ−ドメインタンパク質と一致し（予期される単量体質量＝３５．０ｋＤａと比較して、ＳＥＣ−ＭＡＬＳで測定された質量＝３８ｋＤａ）、このことは、タンパク質の二量化に関与する全長ＣＤ７３細胞外ドメインの領域が、Ｎ−ドメイン残基の寄与なしにＣ末端ドメイン内に含まれるため、予期された。
所定の抗体とＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓとの等モル混合物は、抗体またはＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独よりも短い保持時間、ならびにＤＬＳにより、より大きな流体力学的半径（Ｒｈ）を有する、ＳＥＣにおいて単一種として溶出することが見出され、複合体の形成と一致する。ＭＡＬＳデータは、約２１０ｋＤａのこれらの複合体の質量を示す。これは、１つのＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ分子が所与の抗体の２つのＦａｂドメインのそれぞれに結合して、１：２の抗体：Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ複合体を形成することと一致する。
抗ＣＤ７３抗体とｈＣＤ７３−ｈｉｓ二量体との混合物についてのＳＥＣ−ＭＡＬＳデータは、該混合物がｈＣＤ７３−ｈｉｓまたは抗体単独のいずれよりも早く溶出することを示し、複合体が形成されることが示唆される。同一の可変領域であるが異なる定常ドメインを含む複数のｍＡｂのデータの比較は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメイン（ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ）を含むｍＡｂとの複合体の溶出時間は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１．１ｆ定常ドメインを含むｍＡｂとの複合体よりも早いことを示す。加えて、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂとの複合体のＭＡＬＳ測定質量は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むｍＡｂの複合体の質量よりも大きい。ＤＬＳデータはさらに、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂの複合体の流体力学的半径が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むｍＡｂの複合体の流体力学的半径よりも大きいことを示す。例えば、３つの異なる定常領域（ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ、またはＩｇＧ１．１ｆ）を有するＣＤ７３．４についてのＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータを、図５に示す。本明細書中、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むＣＤ７３．４の複合体は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＣＤ７３．４−ＩｇＧ１．１ｆの複合体と比較して、より短い保持時間を有し（図５Ａ）、より大きい流体力学的半径を有し（図５Ｂ）、そしてより大きいＭＡＬＳにより決定される質量を有する（図５Ｃ）ことが明らかであり得る。ＭＡＬＳ質量に基づいて、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと各抗体との複合体の構造および化学量論の模式図を図５Ｄに示し、ここで、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ１．１ｆを含む抗体との複合体は、主に、より小さい２：２（ピーク１＝〜５５０ｋＤａ）または４：４ ｍＡｂ／ＣＤ７３二量体複合体（ピーク２＝〜１３００ｋＤａ）を形成するが、一方で、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆを含む抗体は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと共により大きな複合体（＞３０００ｋＤａ）を形成し、そのため、正確な構造および化学量論は明確に形成することができない。
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータをまとめると、ＩｇＧ１ヒンジ領域（ＩｇＧ１．１ｆ）を含むｍＡｂとの複合体と比較して、より大きな複合体が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２ヒンジ領域（ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ）を含むｍＡｂとの間で形成されることが実証されている。
実施例４：ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１は、抗体介在性のＣＤ７３内在化をさらに改善する
さらなる内在化アッセイを、Ｃａｌｕ６およびＨ２９２細胞で行い、内在化に対するアイソタイプの役割をさらに識別した。内在化アッセイを、実施例１Ａおよび１Ｂ（抗体のウォッシュアウト工程なしの、フローサイトメトリープロトコル）に記載の通りに行い、表１４に示される種々のハイブリッドアイソタイプの抗体を、インキュベーション時間中、１０μｇ／ｍＬで培養液中に維持した。フローサイトメトリー実験のために、実施例１Ｂに記載の方法を、９６ウェルプレート（４８ウェルプレートではなく）にて、１ウェル当たり５０，０００細胞を用いて、ハイスループット分析に適合させた。
ＦｃγＲ結合は、各構築物について予期される通りであること、すなわち、ＦｃγＲ結合は下部ヒンジ／ＣＨ２領域によって駆動されることが示された。
結果を図８Ａ、ＢおよびＣならびに表１５および１６に示す。表１５に示されるデータは、実施例１Ｂに記載の同様のプロトコル（抗体をウォッシュアウトすることなく）を用いて作成した。表１６に示されるデータは、実施例１Ａに記載の同様のプロトコルを用いて作成された。

図８Ａ−Ｃならびに表１５および１６は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体が、最も効率的にＣＤ７３の内在化をもたらし、一方で、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は、図中下側の曲線に対応する、すなわち、内在化の程度がより低いことを示す。加えて、ＩｇＧ２からのヒンジのみを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１ヒンジと比べて、増加した内在化を有する。従って、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体と比べて、より優れた内在化特性を有する。
従って、抗ＣＤ７３抗体ｍＡｂ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（Ｃ２１９Ｓ置換を有するＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインを有する）は、試験した細胞株によって迅速な内在化を誘導した。内在化のＴ１／２は、数分から１時間の範囲である。試験したほとんどの細胞株は、１０分以下のＴ１／２を有した。ほぼ完全な内在化が、いくつかの細胞株で誘導され、ほとんどの試験では、表面でのＣＤ７３発現が少なくとも５０％低下し、これは一般的には５時間までに最大レベルに達し、いくつかの場合にははるかに短かった。
実施例５：ＩｇＧ２ ＣＨ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＩＴＲ Ａｂ誘導性のＩＬ−２分泌を増強する
本実施例は、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ１ドメインを有する抗体と比較して、抗ＧＩＴＲ抗体誘導性のＴ細胞活性を増強することを示す。
実施例４で用いたおと同じ修飾された重鎖定常領域を、（実施例２の）抗ＧＩＴＲ抗体の可変領域に連結させた。ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＫＴ３−ｓｃＦｖ発現ＣＨＯ細胞および種々の抗ＧＩＴＲ抗体と共にインキュベートし、そしてＩＬ−２分泌のレベルを測定した。これを、実施例２に記載の通りに行った。
図９に示される結果は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジに加えて、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１ドメインを有する全ての抗ＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１を有する抗体よりも、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌をより効果的に刺激することを示す。
従って、本実施例は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体におけるＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインの存在が、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを有しない同じ抗体と比較して、該抗体のアゴニスト活性をさらに増強することを示す。ＩｇＧ２アイソタイプヒンジおよびＣＨ１ドメインの両方を有する抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを有するが、ＣＨ１を有しない抗体と比べて、より強力なアゴニスト作用を有する。さらに、ＩｇＧ２由来のＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ由来のＣＨ１ドメインを有する抗体よりも強力なアゴニスト活性を有する。ＩｇＧ２由来のヒンジおよびＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ由来のＣＨ１およびヒンジを有する抗体よりも強力なアゴニスト活性を有する。
実施例６：抗体介在性のＣＤ７３内在化の改善における、ＩｇＧ２ ＣＨ１およびヒンジにおける特定のアミノ酸残基の関連性
表１７に示される重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体（ＣＤ７３．４）を調製し、抗体介在性のＣＤ７３内在化アッセイにおいて上記のように試験した。
図１０に示される結果は、ＣＤ７３内在化に関する以下の情報を提供する：
・ＣＨ２ドメインは、以下に示される通り、影響を与えていないようである。
○ａ）フォーマット“ＡＹ”（ＩｇＧ２ヒンジ ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号８））を有する修飾された重鎖定常領域を含む抗体と、フォーマット“ＫＨ”（ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号２２））を有する修飾された重鎖定常領域を含む抗体との間で、内在化能力の差はほとんど認められなかった（セット５、６および７）；
○ｂ）ＣＨ２の交換は、野生型Ｇ１またはＧ２に匹敵する（セット５および６）；および
○ｃ）残基２３７は、内在化に影響を与えない：ＩｇＧ２ヒンジへの“Ｇ”残基の付加も、ＩｇＧ１ヒンジにおけるＣ末端“Ｇ”の欠失も、内在化に影響を与えなかった（セット９）。
このことは、ＣＨ２ドメインが内在化に影響を与えないことを示唆する（すなわち、該ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２由来であり得る）；
・ＩｇＧ１におけるセット３に示されるＣＨ１領域（ＫＲＧＥＧＳＳＮＬＦ；ＫＲＧＥＧＳ；ＳＮＬＦ；ＩＴＮＤＲＴＰＲおよびＳＮＬＦＰＲ）をＩｇＧ２のものと交換することは、ほとんど利益をもたらさず、すなわち、内在化は、ＩｇＧ１と同程度のままである（セット３参照）；
・ＩｇＧ２におけるセット４に示されるＣＨ１領域（ＲＫＥＧＳＧＮＳＦＬ；ＲＫＥＧＳＧ；ＮＳＦＬ；ＴＩＤＮＴＲＲＰおよびＮＳＦＬＲＰ）をＩｇＧ１のものと交換することは、影響を与え得る：ＮＳＦＬの変更は、影響を与えないが、一方で、他の２領域（ＲＫＥＧＳＧ＆ＲＰ）は、影響を与える（セット４参照）。セット３および４の結果に基づき、ＣＨ１領域とヒンジとの間に相互作用が存在し、そしてＲＫＥＧＳＧ領域およびＲＰ領域がＮＳＦＬ領域よりも重要であると考えられる；
・ヒンジ領域は、内在化に影響を与え、すなわち、ＩｇＧ２のヒンジは、ＩｇＧ１のヒンジと比べて、より良好な内在化を提供する（セット７および８参照）。加えて、ヒンジを欠失したＩｇＧ１（Ｇ１−Δ−ヒンジ）は、ＩｇＧ１よりも内在化を改善する。ヒンジ欠失したＩｇＧ２（Ｇ２−Δ−ヒンジ）は、ＩｇＧ２ヒンジのそれと比べて、同様のレベルの内在化を提供する。このことは、ヒンジ領域が内在化に影響を与え、その作用が、ＩｇＧ２ ＣＨ１によって増強される（Ｇ２−Ｇ１−Ｇ２−Ｇ２−ＡＹはＧ１−Ｇ２−Ｇ１−Ｇ１−ＡＹに匹敵する）ことを示唆する；
・ＩｇＧ２．４（Ｃ２２０Ｓ）は、ＩｇＧ２．３（Ｃ２１９Ｓ）と比べて、同様の、または減少した内在化を有する。ＩｇＧ２．３／４（Ｃ２１９Ｓ／Ｃ２２０Ｓ）は、ＩｇＧ２．３またはＩｇＧ２．４単独と比べて、大幅に減少した内在化を有する（セット１０参照）。このことは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣ２１９Ｓを有する抗体の内在化が、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣ２２０Ｓを有する抗体とほぼ同じであり、両者が、ＩｇＧ２ヒンジとＣ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓの両方を有する抗体よりもはるかに優れていることを示唆する；
・ＩｇＧ２．５（Ｃ１３１Ｓ変異）は、Ｃ１３１を有する構築物と比べて、減少した内在化を有する（セット１、６および７参照）。
従って、これらの結果は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジが両方とも、抗体介在性のＣＤ７３内在化に関連すること、およびこれらのドメイン由来のＩｇＧ２配列を有する抗体が、ＩｇＧ１由来のこれらの領域を有する抗体と比べてより効果的に内在化されることを示す。
実施例７：ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを有する抗体は、高分子量複合体を形成する
表１４に記載の重鎖定常領域を有するＣＤ７３．４抗体を、実施例３に記載の通り、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳ実験により、高分子量複合体の形成についても試験した。
この試験における１６抗体のうち３つは、以前に試験した：ＣＤ７３．４−ＩｇＧ１．１ｆ、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ（ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２．３とも言う）、およびＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ（ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２．３Ｇ１．１ｆ−ＫＨとも言う）である。抗体単独のＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータは、単量体モノクローナル抗体について一般的な、各抗体についての保持時間、質量、およびヒ流体力学的半径を示した。各抗体（５．５ｕＭ）とｈＣＤ７３−ｈｉｓ（５．５ｕＭ）との等モル量の複合体は、抗体単独またはｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独と比較して、全ての複合体の保持時間がより遅く、複合体の形成が示された。１６複合体の各々についてのＳＥＣクロマトグラムデータの重複を図１１Ａに示す。クロマトグラムデータは、図１１Ｂに示される、４つの異なるピークに分けることができる。ピーク１は、ＭＡＬＳで決定された質量を有する最大種を含み、４：４以上のｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体の質量相当量を含む複合体を示唆する。ピーク２は、ＭＡＬＳで決定された質量を有する種を含み、約２：２ ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体の形成を示唆する。ピーク３は、低いシグナルおよびＭＡＬＳで決定された質量を有する少量の種であり、約１：１ ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体を示唆する。ピーク４は、遊離抗体と一致する、ＭＡＬＳで決定された質量を有するｍＡｂ単独の溶出に相当する。各種の相対量を定量するために、各クロマトグラムの４つのピークを、ピーク１（＜１２．９分）、ピーク２（１２．９−１５．１分）、ピーク３（１５．１−１６．７分）、ピーク４（１６．７−１９．３分）として統合した。この統合はまた、無視できる程度である（全ての複合体で、＜３．５％）、低分子量種を意味するピーク５（＞１９．３分）と呼ばれる追加の統合範囲を含んだ。この統合からの各種の割合を表１８にまとめる。すべての複合体は、同様の僅かな割合のピーク３（約６−９％）を含むが、可変量の他のピークを含んでいた。最も注目すべきは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとｈＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを含む抗体との全ての複合体が、有意に高い割合のより小さい複合体（ピーク２）を有するが、一方で、ＩｇＧ２由来のＣＨ１ドメインを含む抗体との複合体は、より高い割合でより大きな複合体（ピーク１）を含んだことである（表１８および図１１Ｃ）。このことは、ヒンジ領域のみならず、ＣＨ１ドメインもまた、高次複合体形成において重要な役割を果たすことを示唆している。
実施例８：遺伝子操作された定常ドメインを有する抗体のＦｃ受容体結合
本実施例は、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗体は、それらがＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する場合、ＦｃγＲに結合することを実証する。
可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用を介してＦｃ−γ受容体（ＦｃｇＲ）に結合し得る。これらの相互作用は、抗体依存性の細胞性細胞傷害性抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性の細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのエフェクター機能を仲介する。エフェクター機能活性は、ＩｇＧ１アイソタイプでは高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では、これらのアイソタイプがＦｃｇＲに対してより低い親和性を有するため、非常に低いかまたは存在しない。加えて、ＩｇＧ１のエフェクター機能は、ＦｃｇＲ親和性および選択性を変化させるために、定常領域内のアミノ酸残基の変異によって改変され得る。
Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ）に対する抗体の結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＦｏｒｔｅｂｉｏ社のバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）法を含むバイオセンサー技術を用いて、試験した。ＳＰＲ試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（GE Healthcare）にて、２５℃で行った。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体由来のＦａｂ断片を、〜３０００ＲＵの密度まで、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いてＣＭ５センサーチップ上に固定化した。種々のｈｉｓタグを付したＦｃｇＲ（７ｕｇ／ｍｌ）を、１０ｕｌ／分で３０秒間の接触時間を用いてＣ末端ｈｉｓタグを介して捕捉し、１．０ｕＭの抗体の結合を、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｐ２０（ＰＢＳ−Ｔ） ｐＨ７．１の泳動緩衝液で評価した。これらの試験に用いたＦｃｇＲには、ＣＤ６４（ＦｃｇＲＩ）、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｈ１３１）、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｒ１３１）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃｇＲＩＩｂ）、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８（ＦｃｇＲＩＩＩａ−Ｖ１５８）、ＣＤ１６ｂ−ＮＡ１（ＦｃｇＲＩＩＩｂ−ＮＡ１）、およびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２（ＦｃｇＲＩＩＩｂ−ＮＡ２）が含まれた。ＢＬＩ実験を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ装置（Ｐａｌｌ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）にて、２５℃で、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｐ２０（ＰＢＳ−Ｔ） ｐＨ７．１中で行った。プロテインＡでコーティングしたセンサー上に、希釈されていない発現上清から抗体を捕捉し、次いで、１ｕＭ ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、または０．１ｕＭ ｈＣＤ６４分析物を結合させた。
初めに、種々の標的に結合する抗体を、置換Ｓ２６７Ｅ（ＳＥ）およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＳＥＬＦ）、ならびに変異Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、Ｅ２３３Ｄの種々の組合せを含む修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含んで作製し、それらをＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２と称した。これらの抗体の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲによって、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２．３（ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ）およびＩｇＧ４．１（ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ）抗体、ならびに全てのＦｃｇＲに対して結合を減少させるように遺伝子操作されたＩｇＧ１．１ｆ抗体と比較して、試験した。図１２に示される結果は、ＳＥおよびＳＥＬＦに対する増加したＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂ結合、ならびにＣＤ３２ａ−Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ−Ｒ１３１よりもＣＤ３２ｂに対してＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２変異体の増加した選択性（図１２）を含む、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２．３およびＩｇＧ４．１ならびに変異型ＩｇＧ１抗体に対して予期されるＦｃｇＲ結合特性を示す。
構築物の次のセットを、エフェクター機能を他のエフェクター機能が陰性のＩｇＧ２アイソタイプ中に操作するために使用した。この試験のために、上記の変異を、ＩｇＧ２．３定常領域、またはＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹと称するＩｇＧ２．３／ＩｇＧ１ｆハイブリッドに導入した（表１９）。抗体を上清として小スケールで発現させ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法バイオセンサー技術を用いてＦｃｇＲに対する結合を試験した。抗体は上清中に低濃度で存在しているため、プロテインＡでコーティングしたセンサーを用いて上清から抗体を捕捉し、ついで溶液中でＦｃｇＲ分析物に結合させることにより、実験を行った。精製され、かつ上清の、野生型ＩｇＧ１、ＳＥ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４およびＶ１２抗体を含む対照ＩｇＧ１ｆもまた比較のために含められ、これらの対照抗体のそれぞれは予期されるＦｃｇＲ結合特性を示した（図１３）。ＩｇＧ２．３抗体はまた、予期される結合プロファイルを示し、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１のみに対してかなりの結合が見られた。しかしながら、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤまたはＥ２３３Ｄ変異をＩｇＧ２．３に導入する全ての変異は、対応する操作されたＩｇＧ１ ｍＡｂのＦｃｇＲ親和性を再現できなかった（図１３）。対照的に、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ構築物は、ＩｇＧ２．３のＣＨ１およびヒンジ領域を保持しながら、野生型ＩｇＧ１のＦｃｇＲ結合特性を完全に保存することができた。加えて、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤおよびＥ２３３Ｄを含む全てのＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ変異体は、同じ変異を含むＩｇＧ１バージョンｍＡｂに匹敵するＦｃｇＲ結合特性を示した（図１３）。このことは、野生型または変異型ＩｇＧ１のエフェクター機能と組み合わされたＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジ領域を有する抗体の成功裏の産生を実証する。
このエンジニアリング戦略は、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｓ２６７Ｅ（ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７）、ならびにＩｇＧ２−Ｂ型変異体（ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７）、およびＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常ドメインの異なる組合せを含む他のハイブリッド抗体を用いてフォーマットされた他の抗体を産生し、そしてＳＰＲ技術を用いて、抗ｈｉｓ Ｆａｂにより捕捉されたｈｉｓタグを付したＦｃｇＲに対するこれらの抗体の結合を試験することにより、さらに調査された。Ｏｃｔｅｔの上清データと一致して、ＳＰＲデータは、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体が、ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ−Ｓ２６７Ｅ Ａ型ＩｇＧ２抗体（ＩｇＧ２．３）のＣＨ１およびヒンジ領域を含むにもかかわらず、それぞれＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ−Ｓ２６７Ｅに匹敵するＦｃｇＲ結合特性を有することを示した（図１４ＡおよびＢならびに表２０）。同様のデータはまた、ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体を用いても得られ、ＩｇＧ１ｆまたは修飾されたＩｇＧ１ｆ様エフェクター機能を有するＢ型ＩｇＧ２抗体（ＩｇＧ２．５と呼ばれるＣ１３１Ｓ変異を含む）の成功裏の産生を実証している。ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７、ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹまたはＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７定常領域を有するが、異なる可変領域を有するいくつかの他の抗体のデータは、エンジニアリング戦略が、可変ドメインとは無関係の他の抗体に広く適用可能であることを示す（図１４ＡおよびＢならびに表２０）。ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合特性を示す他の構築物は、ＩｇＧ１−Ｇ２．３Ｇ１−ＡＹ、およびＩｇＧ１ΔＴＨＴであるが、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２．３プラスＴＨＴ、ＩｇＧ２．５プラスＴＨＴおよびＩｇＧ２．３プラスＧＧＧ構築物を含む、修飾された定常領域構築物のいくつかは、ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合特性を保持できなかった（図１４ＡおよびＢならびに表２０）。


まとめると、これらのデータは、ヒンジ領域中の保存されたＣＰＰＣＰＡＰモチーフへのＣ末端直後の配列がＦｃｇＲ介在性エフェクター機能を付与し、一方で、抗体のＣＨ１およびヒンジの上部部分は、ＩｇＧ２または修飾されたＩｇＧ２配列で置換されて、ＩｇＧ１および修飾されたＩｇＧ１のエフェクター機能を、ＩｇＧ２ ＣＨ１および／またはヒンジ領域を含む抗体の優れた内在化またはシグナル伝達特性と共に組み合わせて有する可能性を示す。
実施例９：ＧＩＴＲアゴニストＡｂ内在化は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体において増強される
ＧＩＴＲ発現を誘導するために、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ 抗ＣＤ３＋１０００ｎｇ／ｍｌ ＣＤ２８と共に、３７℃で７２時間、インキュベートした。Ｔ細胞活性化の別の方法として、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞の大きなバッチを、３段階培養プロトコルで調製した。要するに、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、１ｕｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ２８を添加したプレートに結合させたＣＤ３（１．５ｕｇ／ｍｌ）で、３７℃で７２時間刺激し、２０ｕ／ｍｌのＩＬ２の存在下で１４日間培養して増殖させ、最後に、１０ｕｇ／ｍｌ ＰＨＡ、２ｕ／ｍｌ ＩＬ２および１ｕｇ／ｍｌ ＣＤ２８を、３７℃で７２時間添加することにより再度の活性化に暴露した。刺激したＴ細胞を３８４ウェルのＰＤＬイメージングプレートに播種し、２時間、細胞を付着させ、４℃で１５分間冷却し、その後、ａｌｅｘａ ４８８標識したＧＩＴＲ抗体を別々に１時間添加した。最後に、プレートをＨＣＳにより画像化し、データを細胞当たりの全強度として報告した。
３つの異なるＧＩＴＲ抗体は、上記のＴ細胞活性化法を用いて評価された。それらは、Ｆｃ受容体に結合できないＧ１アイソタイプおよび不活性（ＩｇＧ１．１）アイソタイプ、ならびにＩｇＧ１ヒンジの代わりにＩｇＧ２ヒンジを有するキメラとしてのＧＩＴＲ．６抗体である。
ＧＩＴＲ抗体誘導性の内在化を、ａｌｅｘａクエンチアッセイ形式を用いてＣＤ３刺激したＣＤ４＋ Ｔ細胞において評価した。新たに得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞を上記のようにインキュベートして、ＧＩＴＲ発現を誘導した。刺激後、細胞を新鮮な培地に再懸濁し、以下のように内在化アッセイのためにプレートに播種した。細胞を上記のように抗体と共にインキュベートし、温かい培地で洗浄し、３７℃で示された時間インキュベートしてから固定し、そしてクエンチした。内在化された抗体は、０時間で観察された僅かなクエンチされないシグナルよりも高い蛍光として測定され、次いで、最初に細胞に結合した全蛍光“クエンチしない対照”に対して正規化した。図１５に示す通り、ＧＩＴＲライゲーションは、試験した各抗体について３０−６０分の間の迅速な内在化ピークを示し、一方で、対照抗体は原形質膜への局在を維持することが分かった。この結果は、ＩｇＧ２ヒンジ領域が、ＧＩＴＲライゲーションにより誘導される内在化を増強することを示唆する。
内在化および関連する動態の詳細な機構をさらに解明するために、、抗体エンドサイトーシスおよび早期エンドソームコンパートメントへの送達を分析した。この実験において、細胞を、非標識抗体を用いたパルスチェイス分析に供した。固定化後、細胞を透過性にし、早期エンドソームマーカーＥＥＡ１（cell signaling technology）で染色し、洗浄し、その後、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ−４８８と複合させた抗ウサギ二次抗体（ＥＥＡ１）およびａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ−６４７と複合させた抗ヒト抗体（ＧＩＴＲ）を用いて検出した。６０×水浸対物レンズを備えたＯｐｅｒａ共焦点システムでプレートを画像化した。この結果は、膜結合抗ＧＩＴＲ抗体染色と細胞内ＥＥＡ１シグナルとの間の明確な分離を示した。培養物を加温すると、いくつかの抗体のクラスター化が検出され、これはエンドソームタンパク質と共局在すると思われる。エンドソーム共局在化の定量は、ＨＣＳスタジオソフトウェアを用いて行い、結果は、全染色に対する共局在ピクセル強度の比としてプロットした（図１６）。ＧＩＴＲ抗体と初期エンドソームとの共局在は、３０分で最も顕著である。この試験した時点で、ＧＩＴＲ．６．Ｇ２．Ｇ１ｆは、ＧＩＴＲ．６．Ｇ１ｆ抗体よりもより高い分画を共局在させることを示した。共局在結果は、上記のａｌｅｘａクエンチング法を用いて観察されたものと相関し、Ｇ２ヒンジがＧＩＴＲ内在化を誘導するためのＧ１よりも潜在的利点を有することを示唆するモデルを支持する。
実施例１０：Ｔ細胞受容体活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧＩＴＲアゴニストＡｂシグナル伝達は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体において増強される
抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体の機序をさらに調べるために、ＮＦｋＢおよびＰ３８シグナル伝達経路などのＴ細胞活性化に関与するいくつかのシグナル伝達経路をモニタリングした。
健常ドナー（Ｍ６５７６）由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレートをコーティングした０．４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および０．４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８で活性化した。３日後、細胞を集め、シグナル伝達活性化のために３８４ウェル画像プレートに播種した。細胞を２時間プレートに沈降させた後、それらをＧＩＴＲ抗体で１５分間処理し、シグナル伝達事象を、アッセイプレートにホルムアルデヒドを最終１０％濃度まで添加することにより終了させた。その後、細胞を透過処理し、シグナル伝達検出のためにphosphor−ｐ６５ＮＦＫＢ抗体で染色した。図１７に示す通り、ＧＩＴＲ．６．Ｇ２およびＧＩＴＲ．６．Ｇ２．Ｇ１ｆ抗体は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方におけるＧＩＴＲ．６．Ｇ１ｆと比較して、より高いシグナル伝達応答を有した。内在化およびシグナル伝達経路の活性化を直接的に示す証拠はないが、Ｇ２アイソタイプが、ＧＩＴＲ．６に対するＩｇＧ１と比較して、抗体機能活性の両方の面を改善するようであることに注目することは興味深い。
各抗体のシグナル伝達活性を定量するために、各抗体についてＥＣ５０およびＥｍａｘの両方を、それら両パラメーターがシグナル伝達事象の全範囲を捕捉するのに重要であるため、計算した。ＧＩＴＲ．６．Ｇ２．Ｇ１ｆの応答レベルは、１００％対照であるように選択され、全ての他の抗体はそれに対して正規化された。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方について表２１に示されるように、効力（ＥＣ５０）および有効性（Ｅｍａｘ％）の両方に関して、ＧＩＴＲ抗体に関するある範囲の活性化があった。ＧＩＴＲ．６．Ｇ２、ＧＩＴＲ．６．Ｇ２．Ｇ１ｆおよびＧＩＴＲ．６．Ｇ１ｆは、約１０ｎＭの範囲で同様の効力（ＥＣ５０）を示したが、有効性（Ｅｍａｘ）は、異なるアイソタイプで全く異なっており、これは、Ｇ１抗体が、Ｇ２またはキメラアイソタイプと同様に効果的にシグナルを伝達しないことを示唆している。
ＧＩＴＲ．６．Ｇ１ｆと比べてＧＩＴＲ．６．Ｇ２およびＧＩＴＲ．６．Ｇ２．Ｇ１ｆのシグナル伝達差異が、ＮＦｋＢシグナル伝達のみに限定されるか、または他のシグナル伝達事象についても同様であるかどうかをさらに確認するために、Ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達の読み取りが検討された。図１８に示す通り、ＧＩＴＲ．６．Ｇ２およびＧＩＴＲ．６．Ｇ２．Ｇ１ｆ抗体は、ＣＤ４＋細胞ｐ３８ ＭＡＰＫ活性化アッセイにおいて、ＧＩＴＲ．６．Ｇ１ｆ抗体と比較してより高いシグナル伝達応答を有した。従って、Ｇ１アイソタイプと比較して、ＧＩＴＲ．６ Ｇ２アイソタイプのより良好なシグナル伝達活性は、ＮＦｋＢシグナル伝達のみに限定されない。
増強されたアゴニスト活性および内在化に加えて、修飾された重鎖定常領域が、（例えば、刺激受容体のアゴニストに対する）増強されたＡＤＣＣを付与し、ならびに抗体に新たな活性を提供し得ることも示された。例えば、阻害性細胞表面分子に結合し、細胞表面分子（アンタゴニスト）の阻害活性を阻止する抗体の定常重鎖ドメインを、本明細書に記載の修飾された重鎖定常領域に置換することは、結果として、該抗体がそのアンタゴニストである能力を失い、その代わりに（阻害活性の）アゴニスト活性を付与したことが見出された。
実施例１１：ＩｇＧ２．３およびＩｇＧ２．５構築物のジスルフィド結合の確認
定常ドメインＩｇＧ２．３（Ａ型）、ＩｇＧ２．３Ｇ１（Ａ型）およびＩｇＧ２．５（Ｂ型）を含む抗体のジスルフィド結合構造は、非還元型Ｌｙｓ−Ｃ消化物と還元型Ｌｙｓ−Ｃ消化物とを比較することにより正確であることが確認された。
抗体サンプルを、リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）残基のカルボキシル末端側のペプチド結合を特異的に切断するＬｙｓ−Ｃで消化した。消化物中のペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８ カラム、１．７μｍ、２．１ｘ１５０ｍｍ、逆相ＨＰＬＣカラムを用いて分離し、紫外線（ＵＶ）検出器で２１４ｎｍにて、およびＴｈｅｒｍｏ ＬＴＱ質量分光計で検出した。
Ｌｙｓ−Ｃ酵素消化およびジスルフィド結合の還元：１００μｇの抗体サンプルを含むバイアルに、１２０μＬの変性緩衝液を添加して、３．７Ｍ ＧｕＨＣｌ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０溶液とした。混合物を、５５℃で３０分間インキュベートした。タンパク質のアルキル化を、１μｌの５０ｍＭ ヨードアセトアミドを上記の溶液に添加し、次いで、室温で３０分間、暗室にて、インキュベーションして行った。アルキル化サンプルを８０μＬのｄＨ２Ｏで希釈し、Ｗａｃｏ Ｌｙｓ−Ｃを、１：１０の酵素：基質比で添加した。抗体を、室温にて、暗室で一晩、消化した。消化後、１００μＬのアリコートを、Ｌｙｓ−Ｃ消化したサンプルから取り出し、１０μＬの０．５Ｍ ＤＴＴをそこに添加した。このサンプルを、室温にて１時間、インキュベートし、ジスルフィド結合を減少させた。
得られた結果は以下の通りである：
ＩｇＧ２．３およびＩｇＧ２．３Ｇ１抗体（Ａ型）のジスルフィド構造：重鎖のＦａｂ領域内で、Ｃｙｓ２２（Ｈ）はＣｙｓ９８（Ｈ）に連結され、Ｃｙｓ１５１（Ｈ）はＣｙｓ２０７（Ｈ）に連結されている。重鎖のＦｃ領域内で、Ｃｙｓ２６５（Ｈ）はＣｙｓ３２５（Ｈ）に連結され、そしてＣｙｓ３７１（Ｈ）はＣｙｓ４２９（Ｈ）に連結されている。軽鎖のＦａｂ領域内で、Ｃｙｓ２３（Ｌ）はＣｙｓ８８（Ｌ）に連結され、そしてＣｙｓ１３４（Ｌ）はＣｙｓ１９４（Ｌ）に連結されている。軽鎖のＣ末端のＣｙｓ２１４（Ｌ）は、Ｃｙｓ１３８（Ｈ）で重鎖に連結されている。重鎖のヒンジ領域は、３つのシステイン残基Ｃｙｓ２２７（Ｈ）、Ｃｙｓ２３０（Ｈ）およびＣｙｓ２３３（Ｈ）を含み、それらは、３つの鎖間ジスルフィド結合を提供する。最も可能性の高い結合は、Ｃｙｓ２２７（Ｈ）とＣｙｓ２２７（Ｈ）、Ｃｙｓ２３０（Ｈ）とＣｙｓ２３０（Ｈ）およびＣｙｓ２３３（Ｈ）とＣｙｓ２３３（Ｈ）であり、それは、ＩｇＧ２ Ａ型の正しい理論的ジスルフィド配列である。
ＩｇＧ２．５抗体（Ｂ型）のジスルフィド構造：重鎖のＦａｂ領域内で、Ｃｙｓ２２（Ｈ）はＣｙｓ９８（Ｈ）に連結され、そしてＣｙｓ１５１（Ｈ）はＣｙｓ２０７（Ｈ）に連結されている。重鎖のＦｃ領域内で、Ｃｙｓ２６４（Ｈ）はＣｙｓ３２４（Ｈ）に連結され、そしてＣｙｓ３７０（Ｈ）はＣｙｓ４２８（Ｈ）に連結されている。軽鎖のＦａｂ領域内で、Ｃｙｓ２３（Ｌ）はＣｙｓ８８（Ｌ）に連結され、そしてＣｙｓ１３４（Ｌ）はＣｙｓ１９４（Ｌ）に連結されている。重鎖のヒンジ領域は、４つのシステイン残基Ｃｙｓ２２６（Ｈ）、Ｃｙｓ２２７（Ｈ）、Ｃｙｓ２３０（Ｈ）およびＣｙｓ２３３（Ｈ）を含む。軽鎖のＣ末端Ｃｙｓ２１４（Ｌ）は、ヒンジ領域において重鎖のシステイン残基に連結され、残りの３つのシステイン残基は、３つの鎖間ジスルフィド結合を提供する。最も可能性の高い結合は、Ｃｙｓ２１４（Ｌ）とＣｙｓ２２６（Ｈ）、そしてＣｙｓ２２７（Ｈ）とＣｙｓ２２７（Ｈ）、Ｃｙｓ２３０（Ｈ）とＣｙｓ２３０（Ｈ）およびＣｙｓ２３３（Ｈ）とＣｙｓ２３３（Ｈ）であり、それは、ＩｇＧ２ Ｂ型正しい理論的ジスルフィド配列である。さらに、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を、イオントラップ質量分光計を用いた電子移動解離（ＥＴＤ）依存性タンデム質量分析を用いて確認した。
実施例１２：Ｔ細胞に対するＧＩＴＲアゴニズムの改善におけるＩｇＧ２ ＣＨ１およびヒンジにおける特定のアミノ酸残基の関連
表１７に示す重鎖定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体（ＧＩＴＲ．６）を調製し、４８時間ではなく４０時間で回収したこと以外、実施例２に記載の通りにＩＬ−２産生アッセイで試験した。
図２０Ａ−Ｄに示される結果は、本実施例で使用したものと同じ重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体で得られたＣＤ７３内在化結果（図１０参照）と大部分一致した。





























当業者は、本明細書に記載の特定の態様の多くの均等態様について、常套の試験を超えない試験を用いて、認識または確認することができる。そのような均等態様は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (13)

  1. 修飾された重鎖定常領域を含む抗体であって、該修飾された重鎖定常領域が、Ｎ末端からＣ末端の順にＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ここで
    （ａ）該ヒンジが配列番号１２９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号１３０、または配列番号１２７のアミノ酸配列を含み；
    （ｂ）該ＣＨ１ドメインが配列番号７のアミノ酸配列を含み；
    （ｃ）該ＣＨ２が配列番号４のアミノ酸配列または配列番号２４のアミノ酸配列を含み；かつ
    （ｄ）該ＣＨ３ドメインが配列番号５またはアミノ酸置換Ｅ３５６ＤおよびＭ３５８Ｌを有する配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または
    ここで、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）で規定されるＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む、修飾された重鎖定常域が、Ｃ末端ＧＫまたはＫを欠く、
    抗体。
  2. 抗体が、配列番号２８、３４、３５、３７、５５、８０、８１、８４、および１５９からなる群より選択される修飾された重鎖定常域を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. （ｉ）共刺激受容体に特異的に結合する；（ｉｉ）細胞表面分子に特異的に結合し、細胞表面分子の抗体介在性内在化を誘発する；（ｉｉｉ）阻害受容体に特異的に結合する；（ｉｖ）細胞表面分子に特異的に結合し、細胞内シグナル伝達を誘発する；（ｖ）細胞表面分子に特異的に結合し、高分子量の抗体−細胞表面分子複合体の形成を誘発する；または（ｖｉ）細胞表面分子に特異的に結合し、細胞表面分子のクラスター化またはオリゴマー化を誘発する、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 共刺激受容体が、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７、または任意の他のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり；細胞表面分子がＣＤ７３であり；阻害受容体が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４であり；または細胞内シグナル伝達がアゴニスト活性、アンタゴニスト活性、細胞表面分子の内在化、またはＡＤＣＣを仲介する、請求項３に記載の抗体。
  5. 同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、増強されたか、または改変されたアゴニスト活性を示す；
    同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、増強されたか、または改変された内在化特性を有する；
    ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する同じ抗体と比べて、より強力な、または改変されたアンタゴニスト活性を示すか、または新たな活性を付与する；
    同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、より強力な細胞内シグナル伝達を誘発する；
    同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、高分子量複合体の形成を誘発する；または
    同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と比べて、細胞表面分子のよりクラスター化またはオリゴマー化を誘発する、
    請求項１−４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 第二の結合特異性を有する分子に連結された、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体を含む二重特異性分子。
  7. 第二の薬剤に連結された、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体を含む免疫複合体。
  8. 請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体もしくは免疫複合体および担体を含む、組成物。
  9. １つ以上のさらなる治療剤をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体、二重特異性抗体もしくは免疫複合体を含む、対象を治療するための医薬組成物。
  11. 請求項１に記載の抗体の製造方法であって、以下の工程：
    （ａ）ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；
    （ｂ）該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程
    を含む、方法。
  12. 細胞による抗体の内在化を増大させる方法であって、
    （ａ）ＩｇＧ２ヒンジまたはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；
    （ｂ）該ヒンジおよびＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程
    を含む、方法。
  13. 抗体のアゴニスト活性を増大させる方法であって、
    （ａ）ＩｇＧ２ヒンジまたはＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインではない、ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む抗体を提供する工程；
    （ｂ）該ヒンジおよびＣＨ１ドメインを、それぞれＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ ＣＨ１ドメインで置換する工程
    を含む、方法。
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