EA018396B1 - Антитела человека, которые связывают мезотелин, и применение таких антител - Google Patents

Антитела человека, которые связывают мезотелин, и применение таких антител Download PDF

Info

Publication number
EA018396B1
EA018396B1 EA201070412A EA201070412A EA018396B1 EA 018396 B1 EA018396 B1 EA 018396B1 EA 201070412 A EA201070412 A EA 201070412A EA 201070412 A EA201070412 A EA 201070412A EA 018396 B1 EA018396 B1 EA 018396B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
antibodies
mesothelin
human
variable region
Prior art date
Application number
EA201070412A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070412A1 (ru
Inventor
Джонатан А. Терретт
Сара Л. Пог
Кристофер Той
Лань Ян
Четана Рао-Найк
Бинлян Чэнь
Original Assignee
Бристоль-Мейерз Сквибб Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40526631&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA018396(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бристоль-Мейерз Сквибб Компани filed Critical Бристоль-Мейерз Сквибб Компани
Publication of EA201070412A1 publication Critical patent/EA201070412A1/ru
Publication of EA018396B1 publication Critical patent/EA018396B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/80—Immunoglobulins specific features remaining in the (producing) cell, i.e. intracellular antibodies or intrabodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Согласно изобретению предложены изолированные моноклональные антитела, которые специфично связывают мезотелин с высокой аффинностью, в частности моноклональные антитела человека. В предпочтительном варианте антитела связывают мезотелин человека. В некоторых вариантах осуществления антитела могут интернализацизоваться в клетки, экспрессирующие мезотелин, или могут выступать в качестве медиаторов антигензависимой клеточной цитотоксичности. Далее согласно изобретению предложены антитела к мезотелину, которые способы ингибировать антиген рака яичников СА125. Также предложены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела согласно изобретению, вектора экспрессии, клетки-хозяева и способы экспрессии антител согласно изобретению. Далее предложены конъюгаты антитела и молекулы-партнера, биспсцифические молекулы и фармацевтические композиции, включающие антитела согласно изобретению. Согласно изобретению также предложены способы детекции мезотелина, а также способы лечения злокачественных опухолей, такие как мезотелиомы, злокачественные опухоли поджелудочной железы и злокачественные опухоли яичников, с использованием антитела к мезотелину согласно изобретению.

Description

Мезотелин представляет собой гликопротеин, присутствующий на поверхности мезотелиальной выстилки брюшной, плевральной и перикардиальной полостей тела. Первоначально он был выделен из линии клеток раковой опухоли поджелудочной железы человека НРС-У5, было показано, что он обладает способностью потенцировать мегакариоциты и поэтому его назвали фактором потенциации мегакариоцитов (МРЕ) (УашадисЫ е1 а1. (1994) 1. ΒίοΙ. СЬет., 269:805-808). КДНК мезотелина клонировали из библиотеки, приготовленной из линии клеток НРС-У5 (Корта е1 а1. (1995) 1. Βίο1. СЬет., 270:2198421990). КДНК также клонировали с использованием моноклонального антитела К1, которое распознает мезотелиомы (СЬапд, Рак1ап (1996) Ргос. Ыа11. Асаб. 8с1. И8А, 93:136-40). В структурном смысле мезотелин экспрессируется на поверхность клетки в виде полипептида-предшественника массой 60 кДа, который в результате протеолиза превращается в разрезанный (кЬеб) компонент массой 31 кДа (соответствует МРЕ) и мембраносвязанный компонент массой 40 кДа (Наккап е1 а1. (2004) С1ш. Сапсег. Век., 10:39373942).
Помимо того, что мезотелин экспрессируется нормальными клетками мезотелия, его экспрессия повышена в некоторых опухолях человека, включая все мезотелиомы, многие злокачественные опухоли поджелудочной железы и некоторые злокачественные опухоли желудка, легкого и эндометрия. Например, мезотелин экспрессируется приблизительно в 70% всех злокачественных опухолей яичника, приблизительно 82% папиллярных серозных аденокарцином, приблизительно в 83% всех аденокарцином поджелудочной железы и приблизительно 86% всех аденокарцином протоков поджелудочной железы.
Были получены мутантные мыши, в которых ген мезотелина был разрушен путем гомологичной рекомбинации (Вега, Т.К., Рак1ап. I. (2000) Мо1. Се11. Βίο1., 20:2902-2906). При этом не наблюдали никаких аномалий в анатомии, гематологических параметрах или репродуктивной функции, что указывает на то, что функция мезотелина не является необходимой для роста и размножения, по меньшей мере, у использованных мышей.
Мезотелин специфичным образом взаимодействует с СА125 (также известным как МИС-16), муциноподобным белком, присутствующим на поверхности клеток опухолей, который ранее идентифицировали как антиген рака яичника. Кроме того, связывание СА125 с мембраносвязанным мезотелином опосредует гетеротипическую адгезию клеток, и СА125 и мезотелин одновременно экспрессируются в аденокарциномах яичника на поздних стадиях (Витр, А. е1 а1. (2004) 1. Βίο1. СЬет., 279:9190-9198). Экспрессия мезотелина в перитонеальной полости коррелирует с преимущественными участками формирования метастазов злокачественной опухоли яичников, и считают, что связывание мезотелин-СА125 способствует метастазированию опухолей яичников (СиЬЬе1к, 1.А. е1 а1. (2006) Мο1. Сапсег, 5:50).
В свете сказанного выше представляют интерес дополнительные агенты для модулирования активности мезотелина.
Краткое описание
Согласно настоящему изобретению предложены изолированные моноклональные антитела, в частности антитела человека, которые специфично связывают мезотелин и обладают желаемыми свойствами, такими как высокая аффинность связывания мезотелина человека, интернализация клетками, экспрессирующими мезотелин, ингибирование связывания мезотелина с СА125 и/или участие в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Антитела согласно настоящему изобретению можно применять, например, для детектирования (обнаружения) мезотелина или для ингибирования роста клеток, экспрессирующих мезотелин, таких как клетки опухоли, экспрессирующие мезотелин.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть такого антитела, причем указанное антитело связывает мезотелин человека и проявляет одно из следующих свойств:
(a) связывается с мезотелином человека с К 1х 10-8 М или меньше;
(b) интернализуется клетками, экспрессирующими мезотелин;
(c) ингибирует связывание мезотелина с антигеном рака яичников СА125;
(б) демонстрирует АЗКЦ в отношении клеток, экспрессирующих мезотелин; и (е) ингибирует рост клеток, экспрессирующих мезотелин ш νίνο в случае, если оно конъюгировано с цитотоксином.
В предпочтительном случае данное антитело демонстрирует по меньшей мере два свойства (а), (Ь), (с), (б) и (е). В более предпочтительном случае антитело демонстрирует по меньшей мере три из свойств (а)-(е). В более предпочтительном случае антитело демонстрирует четыре из свойств (а)-(е). В еще более предпочтительном случае антитело демонстрирует все пять свойств (а)-(е). В другом предпочтительном варианте реализации антитело связывает мезотелин Кс, равное 5х10-9 М или меньше. В еще одном пред
- 1 018396 почтительном варианте реализации антитело подавляет рост клеток, экспрессирующих мезотелии, ίη νίνο, в случае, когда указанное антитело конъюгировано с цитотоксином.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено моноклональное антитело человека или антигенсвязывающая часть такого антитела, причем указанное антитело конкурирует за связывание с эпитопом мезотелина человека, которые распознаются антителом, включающим:
(a) вариабельную область тяжелой цепи (Ун), включающую последовательность аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 19, и вариабельную область легкой цепи (Уъ), включающую последовательность аминокислот 5ЕО ΙΌ N0: 22;
(b) Ун, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 20, и Уь, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 23; или (c) Ун, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 21, и Уь, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 24.
Эталонные антитела, описанные выше, ниже в настоящем описании обозначаются как эталонные антитела (а)-(с) соответственно.
В предпочтительном варианте осуществления эталонное антитело включает Ун, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 19, и Уь, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 22. В другом предпочтительном варианте осуществления эталонное антитело включает Ун, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 20, и Уь, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 23. В еще одном предпочтительном варианте осуществления эталонное антитело включает Ун, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 21, и Уь, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 24.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело, включающее Ун, которая является продуктом или получена из гена Ун 3-33 человека или гена Ун 3-7 человека, причем указанное антитело специфично связывает мезотелин человека. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть антитела, включающее Уь, которая является продуктом или получена из гена Ук Ьб человека или гена Ук А27 человека, причем указанное антитело специфично связывает мезотелин человека. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть антитела, включающее:
(a) Ун, которая является продуктом или получена из гена Ун 3-33 человека, и Уь, которая является продуктом или получена из гена; или (b) Ун, которая является продуктом или получена из гена Ун 3-7 человека, или Уь, которая является продуктом или получена из гена Ук А27 человека, причем указанное антитело специфично связывает мезотелии человека.
Особенно предпочтительное антитело или аитигенсвязывающая часть антитела (Вариант осуществления А) включает:
(a) СЭК.1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 1;
(b) СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 4;
(c) СЭК.3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 7;
(б) СЭК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 10;
(е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 13; и (ί) СЭК.3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 1б.
Другое особенно предпочтительное антитело или аитигенсвязывающая часть антитела (Вариант осуществления В) включает:
(a) СЭК.1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 2;
(b) СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 5;
(c) СЭК.3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 8;
(б) СЭК! вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 11;
(е) СЭК.2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 14; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 17.
Другое особенно предпочтительное антитело или антигенсвязывающая часть антитела (Вариант осуществления С) включает:
(a) СЭК.1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 3;
(b) СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: б;
(c) СЭК.3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 9;
(б) СЭК.1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 12;
(е) СЭК.2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 15; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ N0: 18.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело, или антигенсвязывающая часть антитела, включающее: (а) Ун, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 19-21; и (Ь) Уь, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 22-24, причем указан
- 2 018396 ное антитело специфично связывает мезотелии человека.
Предпочтительная комбинация включает: (а) Ун, включающую последовательность аминокислот 8ЕО ГО N0: 19; и (Ь) Уь, включающую последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 22.
Другая предпочтительная комбинация включает: (а) Ун, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 20; и (Ь) Уь, включающую последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 23.
Другая предпочтительная комбинация включает: (а) Ун, включающую последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 21; и (Ь) Уь, включающая последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 24.
Антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой, например, антитела изотипа 1дС1 или 1дС4. В качестве альтернативы они могут представлять собой фрагменты антител, такие как фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ' или ЕаЬ'2 или одноцепочечные антитела.
Согласно настоящему изобретению также предложен иммуноконъюгат, включающий антитело согласно настоящему изобретению или антигенсвязывающую часть такого антигена, которые связаны с молекулой-партнером. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложен иммуноконъюгат, включающий антитело согласно настоящему изобретению или антигенсвязывающая часть такого антитела, которые связаны с соединением цитотоксином А, определение которого дано ниже, а описание можно найти в \У0 2008/083312, текст которой включен в настоящее описание посредством ссылки. Согласно настоящему изобретению предложены следующие предпочтительные иммуноконъюгаты, включающие цитотоксин А, связанный с антителом согласно настоящему изобретению, причем указанное антитело (ί) конкурирует с эталонным антителом (а), (Ь) или (с) за связывание с эпитопом мезотелина человека; (ΐΐ) соответствует варианту осуществления А; (ш) соответствует варианту осуществления В или (ίν) соответствует варианту осуществления С. Некоторые из таких конъюгатов антитела и молекулы-партнера могут интернализоваться в клетки, экспрессирующие мезотелин, и обладают способностью опосредовать АЗКЦ.
В одном варианте такие конъюгаты антитела и молекулы-партнера образованы при помощи химических линкеров. В некоторых вариантах реализации линкер представляет собой пептидильный линкер, обозначаемый в настоящем описании следующим образом: (Ь4)р-Е-(Ь1)т. Другие линкеры включают гидразинный и дисульфидный линкеры, обозначаемые (Ь4)р-Н-(Ь1)т или (Ь4)р-1-(Ь1)т соответственно. В дополнение к линкерам, присоединяемым к молекуле-партнеру, согласно настоящему изобретению также предложены расщепляемые линкерные фрагменты, которые пригодны для присоединения к, по существу, любому виду молекул.
Согласно настоящему изобретению также предложена биспецифическая молекула, включающая антитело или антигенсвязывающую часть антитела согласно настоящему изобретению, связанную со вторым функциональным фрагментом, обладающим другой специфичностью связывания, чем указанное антитело или антигенсвязывающая часть антител.
Также предложены композиции, включающие антитело или антигенсвязывающую часть антитела, или иммуноконъюгат, или биспецифичная молекула согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или антигенсвязывающие части антител согласно настоящему изобретению, а также векторы экспрессии, включающие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, включающие такие векторы экспрессии. Также предложены способы получения антител к мезотелину с использованием клеток-хозяев, включающих такие вектора экспрессии, которые могут включать следующие этапы: (ί) экспрессию антитела в клеткехозяине и (ίί) выделение антитела из клетки-хозяина.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения антитела к мезотелину. Указанный способ включает:
(a) обеспечение (ί) последовательности Ун антитела, включающей последовательность СЭК1, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 1-3, последовательность СЭК2, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 4-6, и/или последовательность СГОК3. выбранную из группы, состоящей из 5ЕС ГО N0: 7-9; и/или (ΐΐ) последовательность Уъ антитела, включающую последовательность СЭК1, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 10-12, последовательность С0К2, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 13-15, и/или последовательность СЭК3, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 16-18;
(b) изменение по меньшей мере одного остатка аминокислоты в последовательности Ун антитела и/или в последовательности Уъ антитела с получением по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и (c) экспрессию указанной измененной последовательности антитела в виде белка.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ ингибирования роста клеток опухоли, экспрессирующих мезотелин, включающий осуществление контакта клетки опухоли, экспрессирующей мезотелин, с конъюгатом антитела и молекулы-партнера согласно настоящему изобретению, что обеспечивает ингибирование роста клетки опухоли. В предпочтительном варианте клетка опухоли, экспрессирующая мезотелин, представляет собой клетку мезотелиомы, клетку опухоли поджелудочной железы, клетку опухоли яичника, клетку опухоли желудка, клетку опухоли легкого или клетку опухоли
- 3 018396 эндометрия. В других вариантах осуществления клетка опухоли, экспрессирующая мезотелии, является клеткой раковой опухоли, выбранной из группы, состоящей из мезотелиомы, папиллярной серозной аденокарциномы яичников, светлоклеточной аденокарциномы яичника, смешанной аденокарциномы мюллерова протока и яичника, эндометриоидной карциномы яичника, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы протока поджелудочной железы, серозной карциномы матки, аденокарциномы легкого, карциномы внепеченочных желчных протоков, аденокарциномы пищевода, аденокарциномы прямой и толстой кишки и аденокарциномы молочной железы.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения рака у субъекта. Способ включает введение субъекту конъюгата антитела и молекулы-партнера согласно настоящему изобретению, что обеспечивает лечение рака у субъекта. Особенно предпочтительным видами рака для лечения являются мезотелиомы, раковые опухоли поджелудочной железы, раковые опухоли яичников, раковые опухоли желудка и раковые опухоли эндометрия. В других вариантах осуществления рак, который лечат, выбирают из группы, состоящей из мезотелиом, папиллярных серозных аденокарцином яичника, светлоклеточных аденокарцином яичника, смешанных карцином мюллерова протока и яичника, аденокарцином поджелудочной железы, серозных карцином матки, аденокарцином легкого, карцином внепеченочных желчных протоков, аденокарцином желудка, аденокарцином пищевода, аденокарцином прямой и толстой кишки и аденокарцином молочной железы.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А показаны нуклеотидная (8ЕО ГО N0: 25) и аминокислотная последовательности (8Е0 ГО N0: 19) νΗ моноклонального антитела 3С10 человека. Контуром выделены участки СЭВ1 (8Е0 ГО N0: 1), ССН2 (НЕС) ГО N0: 4) и СОК.3 (НЕС) ГО N0: 7).
На фиг. 1В показаны нуклеотидная (8Е0 ГО N0: 28) и аминокислотная последовательности (8Е0 ГО N0: 22) ν2 моноклонального антитела человека 3С10. Контуром выделены участки СЭК.1 (8Е0 ГО N0: 10), С1)1Е (8Ер ГО N0: 13) и СОК.3 (НЕС) ГО N0: 16).
На фиг. 2А показаны нуклеотидная (8Е0 ГО N0: 26) и аминокислотная последовательности (8Е0 ГО N0: 20) νΗ моноклонального антитела человека 6А4. Контуром выделены участки СЭЮ (8Е0 ГО N0:
2) , С1)1Е (НЕС) ГО N0: 5) и СОК.3 (НЕС) ГО N0: 8).
На фиг. 2В показаны нуклеотидная (8Е0 ГО N0: 29) и аминокислотная последовательности (8Е0 ГО N0: 23) V,. моноклонального антитела человека 6А4. Контуром выделены участки СЭВ1 (8Е0 ГО N0:
11) , С1)1Е (НЕС) ГО N0: 14) и СЭК.3 (НЕС) ГО N0: 17).
На фиг. 3А показаны нуклеотидная (8Е0 ГО N0: 27) и аминокислотная последовательности (8Е0 ГО N0: 21) νΗ моноклонального антитела человека 7В1. Контуром выделены участки СЭВ1 (8Е0 ГО N0:
3) , С1)1Е (НЕС) ГО N0: 6) и СОК.3 (НЕС) ГО N0: 9).
На фиг. 3В показаны нуклеотидная (8Е0 ГО N0: 30) и аминокислотная последовательности (8Е0 ГО N0: 24) ν2 моноклонального антитела человека 7В1. Контуром выделены участки СЭВ1 (8Е0 ГО N0:
12) , С1)1Е (НЕС) ГО N0: 15) и СЭК.3 (НЕС) ГО N0: 18).
На фиг. 4 показано выравнивание аминокислотной последовательности νΗ8 3С10 (8Е0 ГО N0: 19) и 6А4 (8Е0 ГО N0: 20) с аминокислотной последовательностью νΗ 3-33 зародышевой линии человека (НЕ(') ГО N0: 31).
На фиг. 5 показано выравнивание аминокислотной последовательности ν95 3С10 (8Е0 ГО N0: 22) и 6А4 (8Е0 ГО N0: 23) с аминокислотной последовательностью νΗ Ь6 зародышевой линии человека (8Е0 ГО N0: 33).
На фиг. 6 показано выравнивание аминокислотной последовательности νΗ 7В1 (8Е0 ГО N0: 21) с аминокислотной последовательностью νΗ 3-7 зародышевой линии человека (8Е0 ГО N0: 32).
На фиг. 7 показано выравнивание аминокислотной последовательности ν 7В1 (8Е0 ГО N0: 24) с аминокислотной последовательностью νκ А27 зародышевой линии человека (8Е0 ГО N0: 34).
На фиг. 8 показаны результаты теста на адгезию клеток 0VСАΚ3 опухоли яичников.
На фиг. 9А и 9В показаны результаты исследования ίη νίνο с использованием модели ксенографта N0-4226 (мезотелиома легкого) на мышах.
На фиг. 10А и 10В показаны результаты исследования ίη νίνο с использованием модели ксенографта НРАС (карциномы поджелудочной железы) с использованием мышей.
Фиг. 11 представляет собой график, демонстрирующий, что иммуноконъюгат согласно настоящему изобретению обеспечивал уменьшение объемов раковой опухоли яичника в модели ксенографта с использованием мышей.
На фиг. 12 показана АЗКЦ раковых клеток яичника (клетки 0νί.ΆΒ3. фиг. 12а) и клеток Е8СБС (клетки Н226, фиг. 12В), опосредуемая нефукозилированным антителом согласно настоящему изобретению.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены моноклональные антитела, в частности антитела человека, которые связываются с мезотелином человека и обладают желаемыми свойствами. В некоторых вариантах осуществления антитела согласно настоящему изобретению получены из определенных последовательностей зародышевой линии тяжелой и легкой цепей и/или включают определенные струк
- 4 018396 турные сотрите элементы, такие как участки СЭЕ. включающие определенные последовательности аминокислот. Согласно настоящему изобретению предложены изолированные антитела, способы получения таких антител, конъюгаты антитела и молекулы-партнера и биспецифичные молекулы. Также предложены варианты или альтернативы, такие как гомологичные антитела, антитела с консервативными изменениями, сконструированные или модифицированные антитела, фрагменты антител и миметики антител, каждый из которых описан ниже. Согласно настоящему изобретению также предложены способы применения таких антител, например, для детектирования белка мезотелина, а также способы применения антител к мезотелину согласно настоящему изобретению для ингибирования роста клеток, экспрессирующих мезотелин, таких как клетки опухоли. Соответственно согласно настоящему изобретению предложены способы применения антител к мезотелину согласно настоящему изобретению для лечения различных типов рака, например рака яичников, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака легкого, рака эндометрия и мезотелиом. В предпочтительном варианте указанное антитело, конъюгат, биспецифичная молекула, вариант или модифицированная форма обладают одним или более из указанных свойств: связывание с мезотелином человека, интернализация клетками, экспрессирующими мезотелин, подавление связывания мезотелина с СА125, участие в АЗКЦ в отношении клеток, экспрессирующих мезотелин, и подавление роста клеток опухоли, экспрессирующих мезотелин, ίη νίνο. Антитела могут представлять собой антитела человека (предпочтительно), гуманизированные или химерные антитела.
Для облегчения понимания настоящего описания необходимо в начале дать определение некоторым терминам. Дополнительные определения даны в тексте подробного описания.
Термин мезотелин включает варианты, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфичные к белку мезотелину, возможно в некоторых случаях вступают в перекрестную реакцию с белком мезотелином из видов, отличных от человека. В других вариантах осуществления антитела могут быть полностью специфичны в отношении мезотелина человека и не проявлять кросс-реактивность в отношении других видов или кросс-реактивность других типов, или проявлять кросс-реактивность с некоторыми другими, но не всеми другими, видами (например, проявлять кросс-реактивность с мезотелином приматов, но не с мезотелином мыши). Термин мезотелин человека относится к последовательности мезотелина человека, такой как полная аминокислотная последовательность мезотелина человека, имеющая номер доступа в базе данных СепЬапк ΝΡ_005814. Термин мезотелин мыши относится к последовательности мезотелина мыши, такой как полная аминокислотная последовательность мезотелина мыши, имеющая номер доступа в базе данных СепЬапк ΝΡ_061345. Ν-концевая часть мезотелина также известна как фактор потенцирования мегакариоцитов (МРТ). Последовательность мезотелина человека может отличаться от мезотелина человека, имеющего номер ΝΡ_005814 в СепЬапк, например, консервативными мутациями или мутациями в неконсервативных участках, и при этом указанный мезотелин обладает, по существу, той же биологической функцией, что и мезотелий человека, хранящийся в СепЬапк под номером ΝΡ_005814, такой как связывание СА125.
Конкретная последовательность мезотелина человека обычно будет по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности мезотелина человека, хранящейся в СепЬапк под номером ΝΡ__005814, и содержит остатки аминокислот, позволяющие определить, что данная последовательность является последовательностью человека при сравнении с последовательностями мезотелина других видов (например, мыши). В некоторых случаях мезотелин человека может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичен по аминокислотной последовательности мезотелину, хранящемуся в СепЬапк под номером ΝΡ_005814. В некоторых вариантах осуществления последовательность мезотелина человека демонстрирует различие не более чем по 10 аминокислотами с последовательностью мезотелина под номером ΝΡ_005814 в СепЬапк. В некоторых вариантах осуществления мезотелин человека демонстрирует не более 5 или даже не более 4, 3, 2 и 1 отличий по аминокислотам от последовательности № СепЬапк ΝΡ_005814 в СепЬапк. Процент идентичности может быть определен согласно настоящему описанию.
Термин СА125 относится к антигену карциномы яичников или маркеру раковой опухоли яичника, также известному как МИС-16. Термин СА125 человека относится к последовательности СА125 человека, такой как полная аминокислотная последовательность СА125 человека, хранящаяся в базе СепЬапк под номером ΝΡ_078966. Последовательность СА125 человека может отличаться от последовательности СА125, имеющей номер ΝΡ_078966 в СепЬапк, например, консервативными мутациями или мутациями в неконсервативных участках. Конкретная последовательность СА125 обычно будет по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности 90% СА125, имеющему № ΝΡ_078966 в СепЬапк, и содержит остатки аминокислот, позволяющие определить, что данная последовательность является последовательностью человека при сравнении с последовательностями СА125 других видов (например, мыши) СА125. В некоторых случая СА125 человека может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичен по аминокислотной последовательности СА125 № ΝΡ_078966 в СепЬапк. В некоторых вариантах осуществления последовательность СА125 человека демонстрирует отличие не более чем по 10 аминокислотами от последовательности СА125 № ΝΡ_078966 в СепЬапк. В некоторых вариантах реализации СА125 человека демонстрирует не более 5 или даже не более 4, 3, 2 и 1 отличий по аминокислотам от последовательности СА125 № ΝΡ_078966 в СепЬапк. Про
- 5 018396 цент идентичности может быть определен согласно настоящему описанию.
Термин иммунный ответ относится к действию, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитов, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых указанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), которое обеспечивает селективное повреждение, разрушение или устранение из организма человека попавших в него патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток, или, в случае аутоиммунного ответа или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека.
Термин путь передачи сигнала относится к биохимическим отношениям между различными молекулами, участвующими в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Фраза рецептор поверхности клетки включает молекулы и комплексы, способные принимать сигнал и передавать сигнал по плазматической мембране клетки. Примером рецептора поверхности клетки является мезотелин человека.
Термин антитело относится к целым антителам и любым антигенсвязывающим фрагментам (антигенсвязывающая часть) или их одиночным цепям. Термин антитело относится к гликопротеину, включающему две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или антигенсвязывающей части гликопротеина. Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область (обозначаемую в настоящем описании сокращением νΗ) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, Сн1, Сн2 и Сн3. Каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи (обозначаемую в настоящем описании сокращением Уъ) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, Сь. νΗ и ν2 можно далее подразделить на три гипервариабельных участка, называемых участками, определяющими комплементарность (СОЯ), между которыми расположены более консервативные участки, называемые каркасными участками (ЕЯ). Каждая νΗ и ν2 состоят из трех СОЯ и четырех ТЯ, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: ЕЯ1, СЭРЕ ЕЯ2, СЦЯ2, ЕЯ3, СЪЯЗ. ЕЯ4. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей включают связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1с|) классической системы комплемента.
Термин фрагмент антитела и антигенсвязывающая часть антитела (или просто часть антитела) в настоящей заявке относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, мезотелином). Было показано, что функцию антитела связывать антиген могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающая часть антитела, включают (ί) ЕаЬ-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов Уъ, νΗ, Съ и Сн1; (ίί) Е(аЬ')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два ЕаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ш) ЕаЬ'-фрагмент, который, по существу, представляет собой фрагмент ЕаЬ с частью шарнирной области (см. ΤυΝΌΑΜΕΝΤΛΕ ΙΜΜυΝΟΕΟΟΥ (Раи1 еб., З1'1 еб. 1993); (ίν) Еб-фрагмент, состоящий из доменов νΗ и Сц1; (ν) Τν-фрагмент, состоящий из доменов У,, и νΗ одного плеча антитела, (νί) бАЬ-фрагмент (^атб е! а1., (1989) №1Ц1ге 341:544-546), который состоит из домена νΗ; (νίί) изолированный гипервариабельный участок (СОЯ) и (νίίί) нанотело, вариабельный участок тяжелой цепи, включающий один вариабельный домен и два константных домена. Далее, хотя указанные два домена фрагмента Εν, Уь и νΗ кодируются различными генами, их можно соединить с использованием рекомбинантных методов синтетическим линкером, что позволяет получать их в виде единой белковой цепи, и при этом области Уь и νΗ объединяются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Τν (δοΕν); см., например, В1гб е! а1. (1988) 8с1епсе, 242:423-426 и ΗιΐδΙοη е! а1. (1988) Ргос. №111. Асаб. 8сЕ υδΑ, 85:58795883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающая часть антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области, также проводят скрининг данных фрагментов на предмет возможности их использования таким же образом, как и интактных антител.
Изолированное антитело относится к антителу, по существу, не содержащему антител, обладающих другими антигенными специфичностями (например, изолированное антитело, которое специфично связывает мезотелин, по существу, не содержит антител, которые специфично связывают другие антигены). Изолированное антитело, которое специфично связывает мезотелин, может, однако, проявлять перекрестную реактивность в отношении других антигенов, таких как молекулы мезотелина из других видов. Более того, изолированное антитело возможно, по существу, не содержит другого клеточного материала и/или химических веществ.
Термины моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела относятся к составу, содержащему молекулы антител одной структуры. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единственный вид специфичности связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа.
Термин антитело человека относится к антителам, включающим вариабельные области, в которых и каркасные участки, и участки СОЯ получены из последовательностей зародышевой линии имму
- 6 018396 ноглобулина человека. Кроме того, в случае если антитело включает константную область, указанная константная область также получена из последовательностей зародышевой линии иммуноглобулина человека. Антитела человека согласно настоящему изобретению включают остатки аминокислот, не кодирующиеся последовательностями зародышевой линии иммуноглобулина человека (например, мутации, введенные путем случайного сайт-специфичного мутагенеза ίη νίίτο или путем соматических мутаций ίη νίνο). Однако предполагается, что антитело человека не включает антитела, в которых последовательности СЭЯ полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, привиты на каркасные последовательности человека.
Термин моноклональное антитело человека относится к антителам, проявляющим одинаковую (единственную) специфичность, которые включают вариабельные области, в которых и каркасные участки, и участки СОЯ получены из последовательностей зародышевой линии иммуноглобулина человека. В одном варианте осуществления моноклональные антитела человека продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного, не являющегося человеком, например трансгенной мыши, геном которой включает трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.
Термин рекомбинантное антитело человека в настоящем описании включает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или изолируют рекомбинантными средствами, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулина человека, или полученная из них гибридома (описана ниже), (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела человека, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной коллекции антител человека, и (б) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные другими средствами, которые включают сплайсирование последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека включают вариабельные области, в которых каркасные участки и СОЯ получены из последовательностей зародышевой линии иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека могут быть подвергнуты ίη νίίτο мутагенезу (или, в случае использования животного, которое является трансгенным по последовательностям 1д человека, ίη νίνο соматическому мутагенезу), и таким образом последовательности областей νΗ и рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностей νΗ и ν2 зародышевой линии человека и являются родственными указанным последовательностям, возможно не встречаются в природе в репертуаре зародышевой линии антитела человека ίη νίνο.
Термин изотип относится к классу антител (например, 1дМ или 1дС1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.
Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену используются равнозначно с фразой антитело, которое специфично связывается с антигеном.
Термин производные антитела человека относится к любой модифицированной форме антитела человека, например к конъюгату антитела с другим агентом или антителом.
Термин гуманизированное антитело относится к антителам, в которых последовательности СОЯ, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, привиты на каркасные последовательности человека. Также могут быть осуществлены другие модификации каркасного участка в пределах последовательностей каркасных участков человека.
Термин химерное антитело относится к антителам, в которых последовательности вариабельных областей получены из одного вида, а последовательности вариабельных областей получены из другого вида, такие как антитела, в которых последовательности вариабельных областей получены из антитела мыши, а последовательности константных областей получены из антитела человека.
Термин миметик антитела относится к молекулам, способным имитировать способность антитела связывать антиген, которые не ограничены нативными структурами антител. Примеры таких антител включают, но не ограничиваются перечисленными, антитела, белки ΌΆΡΡ, антикалины (Αηΐίοαίίη), авимеры (Ауипсг) и версатела (Vе^8аЬοбу), каждое из которых описано ниже.
Термин молекула-партнер относится к молекуле, конъюгированной с антителом в конъюгате антитела и молекулы-партнера. Примеры молекул-партнеров включают лекарственные средства, токсины, маркерные молекулы, белки и терапевтические агенты.
В настоящем описании предполагается, что антитело, которое специфично связывается с мезотелином человека, относится к антителу, которое связывается с мезотелином человека с Кс 1х 10-7 М или меньше, более предпочтительно 5х10-8 М или меньше, более предпочтительно 3х10-8 М или меньше, более предпочтительно 1х 10-8 М или меньше и еще более предпочтительно с 5х 10-9 М или меньше.
Термин по существу, не связывается с белком или клетками в настоящем описании означает, не связывается с белком или клетками с высокой аффинностью, т.е. связывается с белком или клетками с К, 1 х 10-6 М или выше, более предпочтительно 1 х 10-5 М или выше, более предпочтительно 1 х 10-4 М или выше, более предпочтительно 1х 10-3 М или выше и еще более предпочтительно 1х 10-2 М или выше.
- 7 018396
Термин Кажюс, или Ка, относится к скорости ассоциации определенного взаимодействия антитело-антиген, а термин Ка18, или Ка, в настоящем описании относится к скорости диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген. В настоящем описании термин Кс относится к константе диссоциации, которую вычисляют по отношению Ка к Ка (т.е. Ка/Ка) и выражают в виде молярной концентрации (М). Значения Кс для антител могут быть определены с использованием хорошо известных в данной области методов. Предпочтительный метод для определения Кс антитела включает использование поверхностного плазмонного резонанса предпочтительно с использованием биосенсорной системы, такой как система В1Асоге®.
Термин высокая аффинность для антитела 1дС относится к антителу, обладающему Кс в отношении целевого антигена 1х10-7 М или меньше, более предпочтительно 5х10-8 М или меньше, еще более предпочтительно 1х10-8 М или меньше, даже более предпочтительно 5х10-9 М или меньше и еще более предпочтительно 1х10-9 М или меньше. Однако высокая аффинность связывания для других изотипов антител может отличаться. Например, высокая аффинность связывания для изотипа 1дМ относится к антителу, имеющему Кс 10-6 М или меньше, более предпочтительно 10-7 М или меньше, еще более предпочтительно 10-8 М или меньше.
Термин субъект включает любое животное, являющееся или не являющееся человеком. Термин животное, не являющееся человеком включает всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, не относящихся к виду человека, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д.
Термин алкил, сам по себе или в качестве части другого заместителя, обозначает, если не указано другое, углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью или циклический, либо комбинацию указанных радикалов, причем указанные радикалы могут быть полностью насыщенными, моно- или полиненасыщенными и могут включать одно- или двухвалентные радикалы, включающие указанное число атомов углерода (т.е. С1-С10 означает от одного до десяти атомов углерода). Примеры насыщенных угле водородных радикалов включают, но не ограничиваются перечисленными, такие группы, как метил, этил, η-пропил, изопропил, η-бутил, 1-бутил. изобутил, сек-бутил, циклогексил, (циклогексил)метил, циклопропилметил, гомологи или изомеры, например, η-пентила, η-гексила, η-гептила, η-октила и т.п. Ненасыщенная углеводородная группа представляет собой группу, включающую одну или более двойных или тройных связей. Примеры ненасыщенных алкильных групп включают, но не ограничиваются перечисленными, винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4пентидиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил, а также высшие гомологи и изомеры. Предполагается, что термин алкил, если не указано другое, включает производные алкила, которые подробно определены ниже, такие как гетероалкил. Алкильные группы, ограниченные углеводородными группами, называются гомоалкил.
Термин алкилен сам по себе или как часть другого заместителя обозначает двухвалентный радикал, полученный из алкана. Примеры включают, но не ограничиваются, -СН2СН2СН2СН2- и дополнительно включают группы, относящиеся к гетероалкиленам, описанным ниже. Обычно группа алкила (или алкилена) включает от 1 до 24 атомов углерода, причем предпочтительными согласно настоящему изобретению являются группы, включающие 10 атомов углерода или меньше. Низший алкил или низший алкилен представляет собой группу алкила или алкилена с короткой цепью, обычно включающей восемь атомов углерода или меньше.
Термин гетероалкил, сам по себе или в комбинации с другим термином, обозначает, если не указано другое, стабильный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью или циклический радикал, либо комбинацию указанных радикалов, которые состоят из указанного количества атомов углерода и по меньшей мере одного гетероатома, выбранного из О, Ν, 81 и 8, причем атомы азота, углерода и серы возможно окислены, а гетероатом азота возможно кватернизован. Гетероатом(ы) О, Ν, 8 и 81 могут располагаться в любом внутреннем положении гетероарильной группы или в положении, в котором алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленными, -СН2СН2ОСН3, -СН2СН^СН3, -СН2СН^(СН3)2, -СН28СН2СН3, -СН2СН28 (О)СН3, -СН2СН28(О)2СН3, -СН=СНОСН3, -81(СНэ)э, -С1ЕСН ΝΌ(Ί 1; и -СН=СН^СНэ)2. До двух гетероатомов могут быть расположены последовательно, как, например, в -Ο^ΝΉΟΩ^ и -СН2О81(СН3)3. Аналогично, термин гетероалкилен сам по себе или как часть другого заместителя обозначает двухвалентный радикал, являющийся производным гетероалкила. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленными: -СН2СН28СН2СН2- и -СН28СН2СН2NНСН2-. В группах гетероалкиленов гетероатомы также могут располагаться на одном или обоих концах цепи (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и т.д.). Термины гетероалкил и гетероалкилен охватывают поли(этиленгликоль) и его производные (см., например, каталог 811еаг\\а1ег Ро1ушег8, 2001). Далее, для связывающих групп, представляющих собой алкилен или гетероалкилен, порядок, в котором записана форма связующей группы, не предполагает определенной ориентации данной связующей группы. Например, формула -С(О)2К.'- обозначает как -С(О)2К.'-, так и -К.'С(О)2-.
Термин низший в комбинации с терминами алкил илигетероалкил относится к фрагменту,
- 8 018396 включающему от 1 до 6 атомов углерода.
Термины алкокси, алкиламино, алкилсульфонил и алкилтио (или тиоалкокси) используются в своем обычном смысле и относятся к алкильным группам, присоединенным к оставшейся части молекулы через атом кислорода, аминогруппу, группу 8О2 или атом серы соответственно. Термин арилсульфонил относится к арильной группе, присоединенной к остальной части молекулы через группу 8О2, а термин сульфгидрильная относится к группе 8Н.
В целом заместитель ацила также выбирают из группы, определенной выше. В настоящем описании заместитель ацила относится к группам, присоединенным к и заполняющим валентность углерода карбонильной группы, который либо напрямую, либо опосредованно присоединен к полициклическому ядру соединения согласно настоящему изобретению.
Термины циклоалкил и гетероциклоалкил, сами по себе или в комбинации с другими терминами, обозначают, если не указано другое, циклические варианты замещенного или незамещенного алкила и замещенного или незамещенного гетероалкила соответственно. Дополнительно в случае гетероциклоалкила гетероатом занимает положение, в котором гетероцикл присоединен к остальной части молекулы. Примеры циклоалкила включают, но не ограничиваются перечисленными: циклопентил, циклогексил, 1-циклогексенил, 3-циклогексенил, циклогептил и т.п. Примеры гетероциклоалкилов включают, но не ограничиваются перечисленными: 1-(1,2,5,6-тетрагидропиридил), 1-пиперидинил, 2-пиперидинил,
3- пиперидинил, 4-морфолинил, 3-морфолинил, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил, тетрагидротиен-2-ил, тетрагидротиен-3-ил, 1-пиперазинил, 2-пиперазинил и т.п. Гетероатомы и атомы углерода возможно окислены.
Термины гало или галоген, самостоятельно или в качестве части другого заместителя, означают, если не указано другое, атом фтора, хлора, брома или йода. Дополнительно предполагается, что такие термины, как галоалкил, включают моногалоалкил и полигалоалкил. Например, термин гало(С1С4)алкил включает, но не ограничивается перечисленными, трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4хлорбутил, 3-бромпропил и т.д.
Термин арил означает, если не указано другое, замещенный или незамещенный полиненасыщенный углеводородный заместитель, которые может представлять собой единственное кольцо или множество колец (предпочтительно от 1 до 3 колец), которые сопряжены или связаны ковалентно друг с другом. Термин гетероарил относится к группам арилов (или кольцам), которые содержат от одного до трех гетероатомов, выбранных из Ν, О и 8, причем атомы азота, углерода и серы могут быть окислены, а атом(ы) азота возможно кватернизован. Группа гетероарила может быть соединена с остальной частью молекулы через гетероатом. Неограничивающие примеры арильных и гетероарильных групп включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, 4-бифенил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 3-пиразолил, 2-имидазолил,
4- имидазолил, пиразинил, 2-оксазолил, 4-оксазолил, 2-фенил-4-оксазолил, 5-оксазолил, 3-изооксазолил, 4-изооксазолил, 5-изооксазолил, 2-тиазолил, 4-тиазолил, 5-тиазолил, 2-фурил, 3-фурил, 2-тиенил, 3тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидил, 4-пиримидил, 5-бензотиазолил, пуринил, 2бензимидазолил, 5-индолил, 1-изохинолил, 5-изохинолил, 2-хиноксалинил, 5-хиноксалинил, 3-хинолил и 6-хинолил. Заместители для каждой из указанной выше арильной и гетероарильной системы колец выбирают из группы приемлемых заместителей, описанных ниже. Арил и гетероарил также охватывают систему колец, в которых одна или более систем неароматических колец сопряжены или связаны другим образованием арильной или гетероарильной системы колец.
Для краткости, термин арил в случае использования в комбинации с другими терминами (например, арилокси, аритиокси, арилалкил) включает и арильные и гетероарильные кольца, определенные выше. Таким образом, термин арилалкил включает радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенэтил, пиридилметил и т.д.), включая алкильные группы, в которых атом углерода (например, группа метилена) заменен, например, на атом кислорода (например, феноксиметил, 2-пиридилоксиметил, 3-(1-нафтилокси)пропил и т.д.).
Каждый из приведенных выше терминов (например, алкил, гетероалкил, арил и гетероарил) включает и замещенные, и незамещенные формы указанного радикала. Предпочтительные заместители для каждого типа радикала приведены ниже.
Заместители для алкильных и гетероалкильных радикалов (включая группы, часто называемые алкиленом, алкенилом, гетероалкиленом, гетероалкенилом, алкинилом, циклоалкилом, гетероциклоалкилом, циклоалкенилом и гетероциклоалкенилом) в целом называются заместителями алкила и заместителями гетероалкиласоответственно и могут представлять собой одну или более из групп, выбранных из, но не ограниченных: -ОК', =О, =ΝΚ', =ΝΟΚ', -ΝΚ'Κ, -8К', -галоген, -81К'КК', -ОС( О)1С -С(=О)К', -СО2К', -СОХН'., -ОС(=О)ХК'К, -ХКС(=О)К', -ХК'С(=О)ХКК', -ХКС(=О)2К',
-ХКС(ХК'КК')=ХК, -ΝΚΤ(ΝΚ'Κ)=ΝΚ', -8(О)К', -8(О)2К', -8(О)2ХК'К, -1ХК8О2К', -СХ и -ХО.·, в количестве, лежащем в диапазоне от нуля до (2т'+1), где т' представляет собой общее число атомов углевода в данном радикале. Каждый из К', К, К' и К предпочтительно независимо относится к водороду, замещенному или незамещенному гетероарилу, замещенному или незамещенному арилу, например к арилу, замещенному 1-3 галогенами, группам алкокси и тиоалкокси или арилалкильным группам. В случае, когда соединение согласно настоящему изобретению включает более одной группы К, например,
- 9 018396 каждая из групп В выбрана независимо так же, как и каждая из групп В', В, В' и В в случае, когда присутствует более одной такой группы. В случае, когда В' и В присоединены к атому азота, они возможно объединены с указанным атомом азота с образованием 5-, 6- или 7-членного кольца. Например, предполагается что -ИВ'В включает, но не ограничивается перечисленными, 1-пирролидинил и 4морфолинил. Из приведенного выше обсуждения заместителей специалист в данной области поймет, что термин алкил включает группы, включающие атомы углерода, связанные с группами, отличными от групп водорода, такими как галоалкил (например, -СР3 и -СН2СР3) и ацил (например, -С(=О)СН3, -С(=О)СР3, -С(=О)СН2ОСН3 и т.п.).
Аналогично заместителям, описанным для алкильного радикала, заместители для арильного и гетероарильного радикалов, в общем, называются заместителями арила и заместителями гетероарила соответственно, они могут быть различными и выбраны из, например: галогена, -ОВ', =О, =ИВ', =И-ОВ', -ИВ'В, -8В', -галогена, -81В'ВВ', -ОС(=О)В', -С(=О)В', -СО2В', -С(=О)ИВ'В, -ОС(=О)ИВ'В, -ИВС(=О)В', -ИВ'С(=О)ИВВ', -ИВСО2В', -ИВС(ИВ'В)=ИВ', -8(=О)В', -8(=О)2В', -8(=О)2ИВ'В, -ИВ8О2В', -СИ и -ИО2, -В', -Ν3, -СН(Рй)2, фтор(С1-С4)алкокси и фтор(С1-С4)алкил, в количестве, лежащем в диапазоне от нуля до общего числа доступных валентностей в ароматической системе колец, и при этом В', В, В' и В предпочтительно независимо выбраны из углевода, (С1-С8)алкила и гетероалкила, незамещенного арила и гетероарила, (незамещенный арил)-(С1-С4)алкила и (замещенный арил)окси-(С1С4)алкила. В случае, если соединение согласно настоящему изобретению включает более одной группы В, например, каждая из групп В независимо выбрана так же, как каждая группа В', В, В' и В в случае, если присутствует более одной такой группы.
Два заместителя арила на соседних атомах возможно заменены заместителем формулы -Т-С(О)(СВВ'Ц-ϋ-, где Т и и независимо представляют собой -ΝΚ-. -О-, -СВВ'- или одинарную связь и с.| представляет собой целое число от 0 до 3. В качестве альтернативы два заместителя на соседних атомах кольца арила или гетероарила могут быть возможно заменены заместителем формулы -А-(СН2)Г-В-, где А и В независимо представляют собой -СВВ'-, -О-, -ΝΚ-, -8-, -8(О)-, -8(О)2-, -8(О)2ИВ'- или одинарную связь, и г представляет собой целое число от 1 до 4. Одна из однократных связей образованного таким образом нового кольца возможно может быть заменена двойной связью. В качестве альтернативы два заместителя на соседних атомах кольца арила или гетероарила могут быть возможно заменены заместителем формулы -(СВВ')8 Х(СВВ')а-, где 8 и ά независимо представляют собой целое число от 0 до 3 и X представляет собой -О-, -ИВ'-, -8-, -8(=О)-, -8(=О)2- или-8 (=О)2ИВ'-. Заместители В, В', В и В' предпочтительно независимо выбраны из углевода или замещенного или незамещенного (С1-С6)алкила.
В настоящей заявке термин дифосфат включает, без ограничения, сложный эфир фосфорной кислоты, содержащий две фосфатные группы. Термин трифосфат включает, без ограничения, сложный эфир фосфорной кислоты, включающий три фосфатные группы.
В настоящей заявке термин гетероатом включает кислород (О), азот (Ν), серу (8) и кремний (81).
Символ В представляет собой сокращение, которое обозначает группу заместителя, которая выбрана из замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклила, если из контекста не следует другое.
В приведенных ниже подразделах различные аспекты изобретения описаны более подробно.
Антитела к мезотелину, обладающие особыми функциональными свойствами.
Антитела согласно настоящему изобретению характеризуются особыми функциональными признаками или свойствами. Например, они специфично связываются с мезотелином человека, таким как мезотелин человека, экспрессируемый на поверхности клетки. В предпочтительном варианте антитело согласно настоящему изобретению связывается с мезотелином человека с Кс 1х 10-7 М или меньше, более предпочтительно с Кс 5х10-8 М или меньше и даже более предпочтительно с Кс 1х 10-8 М или меньше. Антитела к мезотелину согласно настоящему изобретению связываются с мезотелином человека и предпочтительно проявляют одно из следующих свойств:
(a) связываются с мезотелином человека с Кс 1х 10-8 М или меньше;
(b) интернализуются клетками, экспрессирующими мезотелин;
(c) ингибируют связывание мезотелина с антигеном рака яичников СА125;
(ά) демонстрируют антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) в отношении клеток, экспрессирующих мезотелин; и (е) ингибируют рост клеток, экспрессирующих мезотелин, ίη νίνο, в случае, когда антитело конъюгировано с цитотоксином.
В предпочтительном случае антитело согласно настоящему изобретению связывается с белком мезотелином с Кс 5х 10-8 М или меньше, связывается с белком мезотелином с Кс 3х 10-8 М или меньше, связывается с белком мезотелином с Кс 1х10-8 М или меньше, связывается с белком мезотелином с Кс 7х10-9 М или меньше, связывается с белком мезотелином с Кс 6х10-9 М или меньше или связывается с белком мезотелином с Кс 5х10-9 М или меньше. Аффинность связывания антитела в отношении мезотелина может быть определена, например, при помощи стандартного теста (см., например, пример 3В).
- 10 018396
Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению представляют собой антитела человека. Дополнительно или в качестве альтернативы антитела могут представлять собой, например, химерные или гуманизированные антитела.
Моноклональные антитела 3С10, 6А4 и 7В1.
Предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению представляют собой антитела человека 3С10, 6А4 и 7В1, изолированные и охарактеризованные с точки зрения структуры, как описано в примерах 1 и 2. Аминокислотные последовательности νΗ 3С10, 6А4 и 7В1 приведены в 8ЕО Ш N0: 19, 20 и 21 соответственно. Аминокислотные последовательности V 3С10, 6А4 и 7В1 показаны в 8Е0 Ш N0: 22, 23 и 24 соответственно.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антитела, которые включают гипервариабельные участки легкой и тяжелой цепей 0ΌΒ15 СОК2 и 0ΌΒ3 антител 3С10, 6А4 или 7В1 или их комбинацию. Последовательности аминокислот участков СЭВ1 тяжелой цепи 3С10, 6А4 и 7В1 показаны в 8Е0 Ш N0: 1-3 соответственно. Последовательности аминокислот участков 0ΌΒ2 тяжелой цепи 3С10, 6А4 и 7В1 показаны в 8Е0 Ш N0: 4-6 соответственно. Последовательности аминокислот участков 0ΌΒ3 тяжелой цепи 3С10, 6А4 и 7В1 показаны в 8Е0 Ш N0: 7-9 соответственно. Последовательности аминокислот участков СОК! легкой цепи 3С10, 6А4 и 7В1 показаны в 8Е0 Ш N0: 10-12 соответственно. Последовательности аминокислот участков 0ΌΒ2 легкой цепи 3С10, 6А4 и 7В1 показаны в 8Е0 Ш N0: 13-15. Последовательности аминокислот участков СЭК3 легкой цепи 3С10, 6А4 и 7В1 показаны в 8Е0 Ш N0: 16-18 соответственно. Участки СОК выделены с использованием системы КаЬа! (КаЬа!, Е.А., е! а1. (1991) 8ес.|иепсе5 оГ Рто!еш8 оГ 1ттиио1одса1 [Шегек!. ΕίΠΙι ΕάίΙίοπ. публикация Департамента здоровья и социального обеспечения США №. 91-3242, здесь и далее Кабат '242).
С учетом того, что каждое из описанных антител обладает способностью связывать мезотелин человека, а специфичность связывания антигена обеспечивают в первую очередь участками СЭК1, СЭК2 и СЭВ3, можно смешивать и сочетать последовательности СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 тяжелой цепи и последовательности СЭК1, СЭК2 и СЭК3 легкой цепи (т.е. можно смешивать и сочетать участки СОК из разных антител, однако каждое антитело должно содержать СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 тяжелой цепи и СЭКЕ ί.ΌΒ2 и СЭК3 легкой цепи), с получением молекул, связывающих мезотелин, согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно в случае, когда комбинируют и сочетают СОК тяжелой цепи, последовательность СЭК.1, СЭК2 и/или СЭК3 конкретной νΗ заменяют на структурно близкую последовательность(и) СОК. Аналогично, в случае когда комбинируют и сочетают последовательности СОК легкой цепи, последовательности СЭК.1, СЭК2 и/или СЭК3 определенной последовательности ν£ заменяют на структурно близкую последовательность(и) СОК. Для специалиста в данной области очевидно, что новые последовательности νΗ и ν£ можно получить путем замены одной или более последовательностей участков СОК тяжелой цепи и/или легкой цепи на структурно близкие последовательности из последовательностей СОК, раскрытых в настоящем описании для моноклональных антител 3С10, 6А4 и 7В1.
Соответственно согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено изолированное антитело или антигенсвязывающая часть такого антигена, включающие:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК1, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 1-3;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СОК2, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 4-6;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.3, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 7-9;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭКЕ включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 10-12;
(е) вариабельный участок легкой цепи СОК2, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 13-15; и (Γ) вариабельный участок легкой цепи 0ΟΒ3, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 16-18;
причем указанное антитело специфично связывает мезотелин человека.
В предпочтительном варианте осуществления антитело соответствует варианту осуществления А. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело соответствует варианту осуществления В. В еще одном предпочтительном варианте осуществления антитело соответствует варианту осуществления С.
Хорошо известно, что домен СЭК.3, вне зависимости от домена (доменов) СЭК1 и/или СЭВ.2, один может определять специфичность связывания антитела к когнатному антигену, и на основе общей последовательности СОК можно предсказуемым образом получить множество антител, обладающих одинаковой специфичностью.
Соответственно согласно настоящему изобретению предложены моноклональные антитела, включающие один или более участков СЭК3 тяжелой и/или легкой цепи из антитела, полученного из животного, являющегося человеком или относящегося к другому виду, причем указанное моноклональное ан
- 11 018396 титело обладает способностью специфично связывать мезотелии человека. В некоторых аспектах настоящего изобретения предложены моноклональные антитела, включающие один или более участков СЭНЗ тяжелой и/или легкой цепи из антитела, не являющегося антителом человека, причем указанное моноклональное антитело обладает способностью специфично связывать мезотелин человека. В некоторых вариантах осуществления антитела согласно настоящему изобретению, включающие один или более участков СЭНЗ тяжелой и/или легкой цепи антитела, не являющегося антителом человека, (а) обладают способностью конкурировать за связывание с; (Ь) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом, что и; и/или (й) обладают аффиностью связывания, близкой к таковой соответствующего исходного антитела, не являющегося антителом человека.
В других аспектах настоящего изобретения предложены антитела, включающие один или более участков СЭНЗ тяжелой и/или легкой цепи из антитела человека, такого как, например, антитело человека, полученное из животных, не являющихся человеком, причем указанное моноклональное антитело обладает способностью специфично связывать мезотелин человека. В других аспектах настоящего изобретения предложены антитела, включающие один или более участков СЭНЗ тяжелой и/или легкой цепи из первого антитела человека, такого как, например, антитело человека, полученное из животных, не являющихся человеком, причем указанное первое моноклональное антитело обладает способностью специфично связывать мезотелин человека, и при этом указанный участок СЭНЗ из первого антитела человека замещает участок СЭНЗ в антителе человека, у которого отсутствует специфичность к мезотелину, в результате чего получают второе антитело человека, которое обладает способностью специфично связывать мезотелин человека. В некоторых вариантах осуществления антитела согласно настоящему изобретению, включающие один или более участков СЭНЗ из первого антитела человека, (а) обладают способностью конкурировать за связывание с; (Ь) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом, что и; и/или (й) обладают аффиностью связывания близкой к таковой соответствующего первого исходного антитела человека.
Антитела, включающие определенные последовательности зародышевой линии.
В некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящему изобретению включают νΗ из определенного гена тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии и/или ν3 определенного гена легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии.
Например, согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения предложено моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть такого антигена, включающая νΗ, которая является продуктом или производной νΗ З-ЗЗ человека или гена νΗ З-7 человека, причем указанное антитело специфично связывает мезотелин человека. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть такого антигена, включающая Уь, которая является продуктом или производным νκ Ь6 человека или гена νκ А27 человека, причем указанное антитело специфично связывает мезотелин человека. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть такого антигена, причем указанное антитело включает νΗ, которая является продуктом или производным гена νΗ З-ЗЗ человека, и включает Уъ, которая является продуктом или производным гена νκ Ь6 человека, причем указанное антитело специфично связывает мезотелин человека. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело, или антигенсвязывающая часть такого антигена, причем указанное антитело включает νΗ, которая является продуктом или производным гена νΗ З-7 человека, и включает Уь, которая является продуктом или производным гена νκ А27 человека, причем указанное антитело специфично связывает мезотелин человека.
Такие антитела могут обладать одной или более из функциональных характеристик, подробно описанных выше, таких как высокая аффинность связывания с мезотелином человека, интернализация клетками, экспрессирующими мезотелин, ингибирование связывания мезотелина с СА125, и способность к участию в АЗКЦ в отношении клеток, экспрессирующих мезотелин, и/или способность ингибировать рост клеток опухоли, включающей клетки, экспрессирующие мезотелин, ίη νίνο в случае, когда указанное антитело конъюгировано с цитотоксином.
Примерами антител, включающих νΗ и Уъ гена νΗ З-ЗЗ и νκ Ь6, соответственно являются антитела ЗС10 и 6А4. Примером антитела, включающего νΗ и генов νΗ З-7 и νκ А27, соответственно является антитело 7В1.
В настоящем описании антитело содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепей, которые являются продуктом или получены из определенной последовательности зародышевой линии в случае, если вариабельные области антитела получены из системы, в которой использованы гены иммуноглобулина зародышевой линии человека. Такие системы включают иммунизацию трансгенной мыши, несущей гены иммуноглобулина человека, представляющим интерес антигеном или скрининг библиотеки генов иммуноглобулинов человека в виде фагового дисплея, представляющим интерес антигеном. Антитело можно идентифицировать как антитело человека, которое является продуктом или получено из последовательности зародышевой линии иммуноглобулина человека путем сравнения последовательностей аминокислот иммуноглобулинов зародышевой линии человека и отбора последовательности
- 12 018396 иммуноглобулина зародышевой линии человека, последовательность которой является наиболее близкой (т.е. обладает максимальным % идентичности) к последовательности антитела человека. Антитело человека, которое является продуктом или получено из определенной последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, возможно включает отличия по аминокислотам от последовательности зародышевой линии, которые являются результатом, например, естественных соматических мутаций или намеренного введения сайт-направленных мутаций. Однако выбранное антитело обычно имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90% идентичную по последовательности аминокислот, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека, и содержит остатки аминокислот, которые указывают на то, что данное антитело является антителом человека, при сравнении с последовательностями аминокислот иммуноглобулинов зародышевой линии других видов (например, последовательности зародышевой линии мыши). В некоторых случаях последовательность аминокислот антитела может быть по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности аминокислот гена иммуноглобулина зародышевой линии. Обычно антитело человека, полученное из конкретной последовательности зародышевой линии человека, демонстрирует не более 10 отличий по аминокислотам от последовательности аминокислот, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека. В некоторых случаях антитело человека возможно демонстрирует не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 отличий по аминокислотам от последовательности аминокислот, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.
Г омологичные антитела.
В еще одном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей, включающие последовательности аминокислот, гомологичные последовательностям аминокислот согласно настоящему описанию, и при этом антитела сохраняют желаемые функциональные свойства антител к мезотелину согласно настоящему изобретению.
Например, согласно настоящему изобретению предложено изолированное моноклональное антитело, или антигенсвязывающая часть такого антигена, включающее УН и Уь, причем (а) УН включает последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 19-21; (Ь) Уъ включает последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 22-24; и (с) антитело специфично связывает мезотелин человека.
В других вариантах осуществления последовательности аминокислот УН и/или Уъ возможно на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична представленным выше последовательностям. Антитела, включающие области УН и Уъ, обладающие высокой (т.е. 80% или выше) гомологией с областями УН и Уь, имеющими представленные выше последовательности, можно получить путем мутагенеза (например, сайт-направленного мутагенеза или мутагенеза, опосредуемого ПЦР) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих 8Е0 ΙΌ N0: 25-27 или 28-30, с последующим тестированием кодируемого измененного антитела на сохранение функции (т.е. функций, описанных выше) с использованием описанных в настоящем описании функциональных тестов.
Процент гомологии между двумя последовательностями аминокислот является эквивалентом процента идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, которыми обладают последовательности (т.е. % гомологии = число идентичных положений/общее число положенийх100), с учетом числа пробелов, которое необходимо ввести для того, чтобы оптимальным образом выровнять две последовательности. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма, описанного в неограничивающих примерах ниже.
Процент идентичности двух последовательностей аминокислот может быть определен с использованием алгоритма, предложенного Е. Меуегк и МШет (Сοтриΐ. Арр1. Βίο^ί.. 4:11-17 (1988)), который реализован в программе ΛΕΙΟΝ (версия 2.0), с использованием матрицы остатков весов РАМ120, штрафа за длину пробела 12 и штрафа за пробел 4. Кроме того, процент идентичности последовательностей аминокислот может быть определен с использованием алгоритма №еб1етап и \Уипкс11 (I. Мο1. Βίο1., 48:444453 (1970)), реализованного в программе ОАР программного пакета ОСО (доступен на йΐίр://^^^.дсд.сοт), с использованием либо матрицы Βίοκκιιιη 62, либо матрицы РАМ250, и веса пробела, равного 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и веса длины, равного 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Последовательности белков согласно настоящему изобретению могут также быть использованы в качестве запрашиваемых последовательностей (диету кедиепсе) для поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такие поиски можно выполнять с использованием программы XΒ^А§Т (версия 2.0), описанной в А1!ксйи1, е! а1. (1990) I. Мο1. Βίο1., 215: 403-10. Можно осуществлять поиски белков по алгоритму Β^А§Т при помощи программы XΒ^А§Т, балл = 50, длина слова = 3 для получения последовательностей аминокислот, гомологичных молекулам антител согласно настоящему изобретению. Для получения выравниваний с пробелами для целей сравнения можно использовать программу Оарреб Β^А§Т, как описано в А1!ксйи1 е! а1. (1997) Νυ
- 13 018396 с1е1с Лс1Й8 Кек., 25(17): 3389-3402. При использовании программ ВЬА8Т и Саррей ВЬА8Т полезны заданные по умолчанию параметры данных программ (например, ХВЬА8Т и ΝΒΕΑ8Τ); см. \\л\л\\псЫ.п1т.ш11доу.
Антитела с консервативными модификациями.
В некоторых вариантах реализации антитело согласно настоящему изобретению включает νΗ, включающую последовательности СЭКЕ СЭВ2 и СОК3, и ν^ включающую последовательности СОК1, ί.ΌΒ2 и СОК3, причем одна или более указанных последовательностей СОК включает указанные последовательности аминокислот на основе известных антител к мезотелину, или консервативные модификации таких последовательностей, и при этом антитела сохраняют желаемые функциональные свойства антител к мезотелину согласно настоящему изобретению. Очевидно, что могут быть сделаны такие консервативные модификации последовательностей, которые не приводят к потери способности связывать антиген. Соответственно согласно настоящему изобретению предложено изолированное моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть такого антигена, включающая νΗ, включающую последовательности СЭКЕ СЭВ2 и СОК3, и ν^ включающую последовательности СОК1, СЭВ2 и СОК3, причем (а) последовательность ί.ΌΒ3 вариабельной области тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 7-9, и консервативно модифицированных вариантов указанных последовательностей; (Ь) последовательность ί.ΌΒ3 вариабельной области легкой цепи включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 16-18, и консервативно модифицированных вариантов указанных последовательностей; и (с) указанное антитело специфично связывает мезотелин человека.
В предпочтительном варианте осуществления последовательность СЭВ2 вариабельной области тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 4-6, и консервативно модифицированных вариантов указанных последовательностей; и последовательность ί.ΌΒ2 вариабельной области легкой цепи включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 13-15, и консервативно модифицированных вариантов указанных последовательностей. В другом предпочтительном варианте осуществления последовательность ί.ΌΒ1 вариабельной области тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 1-3, и консервативно модифицированных вариантов указанных последовательностей; и последовательность СЭВ1 вариабельной области легкой цепи включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 10-12, и консервативно модифицированных вариантов указанных последовательностей.
Термин консервативные модификации последовательности относится к изменениям аминокислот, которые не нарушают или не снижают существенно характеристики связывания антитела, содержащего указанные аминокислоты. Такие консервативные модификации включают замены, добавления и делеции аминокислот. Модификации могут быть введены в антитело с использованием стандартных методик, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез, или мутагенез с помощью ПЦР. Консервативными являются такие замены аминокислот, при которых остаток аминокислоты заменяется на остаток аминокислоты с аналогичной боковой цепью. В данной области определены семейства остатков аминокислот, обладающих аналогичными боковыми цепями. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота), полярными незаряженными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более остатков аминокислот в участках СОК антитела согласно настоящему изобретению можно заменить на другие остатки аминокислот с боковыми цепями из того же семейства и протестировать измененное антитело на сохранение функции с использованием описанных в настоящем описании функциональных тестов.
Антитела, которые связывают тот же эпитоп, что и антитела к мезотелину.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложены антитела, которые связывают эпитоп, распознаваемый каким-либо из моноклональных антител к мезотелину согласно настоящему изобретению (т.е. антитела, которые обладают способностью перекрестно конкурировать за связывание с мезотелином человека с каким-либо из моноклональных антител согласно настоящему изобретению). В предпочтительных вариантах осуществления эталонное антитело для исследования перекрестной реактивности может представлять собой моноклональное антитело 3С10 (включающее последовательности νΗ и ν^ показанные в 8Е0 ΙΌ N0: 19 и 22 соответственно), или моноклональное антитело 6А4 (включающее последовательности νΗ и показанные в 8Е0 ΙΌ N0: 20 и 23 соответственно), или моноклональное антитело 7В1 (включающее последовательности νΗ и ν^ показанные в 8Е0 ΙΌ N0: 21 и 24 соответственно).
- 14 018396
Такие перекрестно конкурирующие антитела могут быть идентифицированы по способности к перекрестной конкуренции с 3С10, 6А4 или 7В1 в стандартных тестах на связывание мезотелина, таких как средства для анализа ЕЬ18А (М0А) или В1Асоге. В предпочтительном варианте осуществления антитело, которое связывается с тем же эпитопом, который распознается 3С10, 6А4 или 7В1, представляет собой моноклональное антитело человека. Такие моноклональные антитела могут быть получены и изолированы (выделены), как описано в примерах.
Искусственно сконструированные и модифицированные антитела.
Кроме того, антитело согласно настоящему изобретению можно получить путем использования антитела, содержащего одну или более последовательностей Ун и/или Уъ известных антител к мезотелину в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела, обладающего свойствами, отличающимися от свойств исходного антитела. Можно модифицировать одну или более аминокислот в одной из или обеих Ун и Уь, в одном или более участках СИЯ и/или в одном или более каркасных участках. В качестве дополнения или альтернативы могут быть модифицированы остатки в константной области (областях), что приведет к изменению эффекторной функции (функций) антитела.
В некоторых вариантах осуществления можно использовать прививку СИЯ для конструирования вариабельных областей антител. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном за счет остатков аминокислот в участках СИЯ. По этой причине последовательности аминокислот в участках СИЯ в большей степени различаются в различных антителах, чем последовательности за пределами СИЯ. Поскольку последовательности СИЯ отвечают за большую часть взаимодействий антителоантиген, возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфичных природных антител путем конструирования векторов экспрессии, которые включают последовательности СИЯ из природных специфичных антител, привитых на каркасные последовательности из другого антитела, обладающего другими свойствами (см., например, Шесйтаии, Ь. е( а1. (1998) УИнге, 332:323-327; Юпек, Р. е( а1. (1986) Ханне, 321:522-525; Сиееп, С. е( а1. (1989) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ее. И8А, 86:10029-10033; патент США 5225539, выданный №т(ег, и патенты США № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Снееп е( а1.).
Соответственно в другом варианте осуществления настоящего изобретения предложено изолированное моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть такого антигена, включающее Ун, включающую последовательности СЭЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 1-3, 8ЕС ГО N0: 4-6 и 8ЕС ГО N0: 7-9 соответственно, и Уъ, включающую последовательности СГОЯ1, СИЯ2 и СИЯ3, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из 8ЕС ГО N0: 10-12, 8ЕС ГО N0: 13-15 и 8ЕС ГО N0: 16-18 соответственно. Соответственно такие антитела содержат последовательности СИЯ Ун и Уъ моноклональных антител 3С10, 6А4 или 7В1, но, возможно, содержат каркасные последовательности, отличающиеся от указанных антител.
Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных источников, которые содержат последовательности генов антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для генов Ун и Уъ человека можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека УВаке (доступна в сети Интернет по адресу \у\у\у.тгс-сре.сат.ас.икЛ'Ьаке), а также в источниках КаЬа( '242; ТошКпкоп, 1.М., е( а1. (1992) 1. Мо1. Вю1., 227: 776-798 и Сох, РР.Ь. е( а1. (1994) Еиг. 1. 1ттипо1., 24:827-836; каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. В качестве другого примера последовательности ДНК зародышевой лини для генов Ун и Уъ человека можно найти в базе данных СепЬапк. Например, следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, входящие в состав гуманизированного моноклонального антитела НСо7 мыши, доступны в базе СепЬапк под следующими номерами доступа: 1-69 (N0 0010109, №Г_024637 и ВС070333), 3-33 (N0^010109 и ЭТ_024637) и 3-7 (N0^010109 и №Г__024637). В качестве другого примера следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, входящие, обнаруживаемые в мышах НСо12 (гуманизированные мышиные моноклональные антитела) доступны в базе данных СепЬапк под номерами 1-69 (N0-0010109, №Г_024637 и ВС070333), 5-51 (N0 0010109 и №Г_024637), 4-34 (N0 0010109 и ЭТ_024637), 3-30.3 (СА1556644) и (А1406678). Еще один источник последовательностей тяжелой и легкой цепей зародышевой линии представляет собой база данных иммуноглобулинов человека 1МСТ ПШрХ/ппдОстек.Гг).
Последовательности белков антител сравнивают с составленной базой данных последовательностей с использованием одного из методов поиска сходства под названием Сарреб ВЬА8Т (Л1(8сйи1 е( а1. (1997) Кис1е1с Ас1бк Яекеагсй, 25:3389-3402), который хорошо известен специалистам в данной области. ВЬА8Т представляет собой эвристический алгоритм, предполагающий, что статистически значимое выравнивание между последовательностью антитела и последовательностью в базе данных должно содержать пары сегментов выровненных слов с высокими баллами (н8Р). Пары сегментов, баллы для которых нельзя увеличить путем увеличения или уменьшения размера, называют 116 (попадание). Вкратце, последовательности нуклеотидов, полученные из УВаке (Ир:/УЬаке.тгс-сре.сат.ас.икУЬаке1/11к(2.рйр), транслируют и сохраняют участок, расположенный между и включающий каркасные участки с ЕЯ1 по ЕЯ3. Средняя длина последовательностей в базе данных составляет 98 остатков. Повторяющиеся последова
- 15 018396 тельности, которые полностью совпадают по всей длине, удаляют. Поиск белков по алгоритму ВБА8Т с использованием программы с установленными по умолчанию стандартными параметрами, за исключением фильтра низкой сложности, который отключают, и матрицей замен ВЬ08иМ62, позволяет отобрать 5 попаданий, которые имеют совпадения последовательностей. Последовательности нуклеотидов транслируют во всех шести рамках, при этом стоп-кодоны в совпадающем сегменте последовательности из базы данных не рассматривают как потенциальные попадания. Затем снова проводят проверку с использованием программы 1Ь1ак1х, в которой реализован алгоритм ВБА8Т, которая транслирует последовательность антитела во всех шести рамках и осуществляет сравнение полученных продуктов трансляции с продуктами трансляции последовательностей нуклеотидов из базы данных УВаке. Поиск в других базах данных, таких как базы 1МОТ (НЦр://|шд1.с1пе5.Гг). можно осуществлять аналогично базе УВаке, как описано выше.
Идентичные положения представляют собой точные совпадения аминокислот между последовательностью антитела и белком базы данных по полной длине последовательности. Положительные положения (идентичные + совпадения с учетом замен) представляют собой положения, которые не являются идентичными, но представляют собой замены аминокислот в соответствии с матрицей замен ВЬО8ИМ62. Если последовательность антитела совпадает с двумя последовательностями из базы данных с одинаковыми значениями идентичности, попаданием, совпадающим с последовательностью, считают попадание с максимальным числом положительных положений.
Предпочтительные каркасные последовательности для использования в антителах согласно настоящему изобретению представляют собой последовательности, структурно близкие каркасным последовательностям, используемым в предпочтительных антителах согласно настоящему изобретению, например близкими каркасным последовательностям Ун 3-33 (8ЕО ГО N0: 31) или Ун 3-7 (8Е0 ГО N0: 32) и/или каркасным последовательностям Ук Ь6 (8Е0 ГО N0: 33) или Ук А27 (8Е0 ГО N0: 34). Последовательности СИКЗ, СГОВ2 и СГОВ3 Ун и последовательности Ук СГОКЕ СГОК2 и СГОВ3 можно привить на каркасные участки, имеющие последовательность, идентичную обнаруживаемой в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого получена данная каркасная последовательность, либо последовательности СИВ могут быть привиты на каркасные участки, которые содержат более одной мутации по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в некоторых примерах полезно осуществлять мутирование остатков в каркасных участках для сохранения или усиления способности к связыванию антигена (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Оиееп е! а1.).
Другой тип модификации вариабельной области представляет собой мутацию остатков аминокислот в участках СЭВ1, СЭВ2 и/или СЭВ3 Ун и/или Ук, которая позволяет улучшить одну или более характеристик связывания (например, аффинность). Введение мутации(й) и изменение связывания антитела или других представляющих интерес свойств можно осуществить с использованием сайтнаправленного мутагенеза или мутагенеза путем ПЦР. Оценку можно осуществлять при помощи ίη νίΐτο или ίη νίνο анализов, как описано в настоящем документе. В предпочтительном случае вводят консервативные модификации. Мутации могут представлять собой замены, добавления или делеции аминокислот, но предпочтительно являются заменами. Более того, обычно не изменяют больше одного, двух, трех, четырех или пяти остатков аминокислот в участке СЭВ.
Соответственно в другом варианте осуществления настоящего изобретения предложены изолированные моноклональные антитела к мезотелину или антигенсвязывающая часть такого антитела, включающие (а) участок СЭВ1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 1-3, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ГО N0: 1-3; (Ь) участок СЭВ2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 4-6, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ГО N0: 4-6; (с) участок СЭВ3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 7-9, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ГО N0: 7-9; (б) участок СЭВ1 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 10-12, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ГО N0: 10-12; (е) участок СЭВ2 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 13-15, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ГО N0: 13-15; и (Г) СЭВ3 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 16-18, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ГО N0: 16-18.
Искусственно сконструированные антитела согласно настоящему изобретению включают антитела,
- 16 018396 в которых были сделаны модификации в каркасных остатках области νΗ и/или νΕ, которые обеспечивают, например, улучшение свойств антитела. Обычно такие модификации каркасного участка осуществляют для того, чтобы снизить иммуногенность антитела. Один из подходов заключается в осуществлении обратной мутации одного или более остатков каркасного участка, которая приводит к переводу в последовательность зародышевой линии, из которой получено данное антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых получено данное антитело.
В качестве примера в табл. А показаны участки, в которых какое-либо положение аминокислоты в каркасном участке (по системе нумерации КаЬа!) отличается от зародышевой линии, и как можно осуществить обратную мутацию данного положения к зародышевой линии путем указанных замен:
Таблица А - Примеры обратных мутаций
Участок Положение каркасного аминокислоты участка Обратная мутация
зсю νΗ 3 Υ30
зсю νΗ 27 Ι27Ρ
зсю νΗ 82 Ь82<2
6А4 νΗ 3 изо
6А4 νΗ 23 У2 3А
6Α4 νΗ 27 Ι27Ε
6Α4 νΗ 30 К.305
6Α4 νΗ 93 Ι93ν
7Β1 νΗ 3 Н3<2
7Β1 νΗ 41 <241Р
7Β1 νΗ 80 580Υ
Другой тип модификаций каркасного участка включает осуществление мутаций одного или более остатков в пределах каркасного участка или даже в пределах одного или более участков СБЯ, которые приводят к удалению эпитопов Т-клеток и соответственно к снижению иммуногенности антитела. Такой подход также называется деиммунизацией и описан более подробно в заявке на патент США 2003/0153043 Сагг е! а1.
В качестве дополнения или альтернативы модификациям в каркасных участках или участках СБЯ в антитела согласно настоящему изобретению можно ввести модификации в области Ре, обычно приводящие к изменению одного или более функциональных свойств, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание рецептора Рс и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело согласно настоящему изобретению может быть подвергнуто химической модификации (например, к антителу можно присоединить одну или более химических групп) или модификации, которая приводит к изменению гликозилирования, что опять же приводит к изменению одного или более функциональных свойств. Каждый из вариантов ниже описан более подробно. Нумерация остатков в участке Рс соответствует индексу Еи по КаЬа!.
В одном варианте осуществления осуществляют модификацию шарнирной области СН1, заключающуюся в изменении числа остатков цистеина в шарнирной области (т.е. уменьшении или увеличении согласно патенту США 5677425; Βοάте^ е! а1.). Такие изменения могут способствовать объединению тяжелой и легкой цепей или повышению или приводить к снижению стабильности антитела.
В другом варианте осуществления шарнирную область Рс подвергают мутированию, в результате чего снижается биологическое время полужизни антитела. Более конкретно, в домен на границе СН2СН3 шарнирной области Рс вводят одну или более мутаций аминокислот, в результате чего ухудшается связывание антитела с белком А стафилококка (8рА) относительно связывания нативной шарнирной области Рс с 8рА, как описано в патенте США 6165745 (Шагб е! а1.).
В другом варианте осуществления антитело модифицируют таким образом, чтобы увеличить их время биологической полужизни. Например, могут быть введены одна или более из следующих мутаций: Т252Ь, Т2548, Т256Р, как описано в патенте США 6277375, выданном Шагб. В качестве альтернативы антитела могут быть изменены в участке СН1 или Сь таким образом, чтобы ввести в них эпитоп связывания рецептора реутилизации, образованный двумя петлями домена СН2 участка Рс 1§С, как описано в патентах США № 5869046 и 6121022 (Рге§!а е! а1.).
В других вариантах осуществления участок Рс изменяют путем замены по меньшей мере одного остатка аминокислоты, которая приводит к изменению эффекторной функции (функций). Например, один или более остатков аминокислот 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 могут быть заменены на другие остатки аминокислот с получением антитела, обладающего измененной аффинностью в отношении эффекторного лиганда, например рецептора Рс или компонента С1 комплемента, но сохраняющего способность к связыванию антигена родительского антитела, как описано в патенте США 5624821 и 5648260 (оба выданы Шш!ег е! а1.).
- 17 018396
В другом примере один или более остатков аминокислот из 329, 331 и 322 можно заменить таким образом, чтобы получить антитело с измененным связыванием С1с| и/или сниженной комплементзависимой цитотоксичностью (КЗЦ) или не обладающее комплементзависимой цитотоксичностью, как описано в патенте США 6194551 Ибиюще е! а1.).
В другом примере один или более остатков аминокислот в положениях 231 и 239 можно изменить таким образом, чтобы это привело к изменению способности антитела фиксировать комплемент. Такой подход более подробно описан в \УО 94/29351 (Вобтег е! а1.).
В еще одном примере участок Ес модифицируют с повышением способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) и/или с повышением аффинности антитела в отношении рецептора Есу путем модификации одной или более аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Данный подход более подробно описан в \УО 00/42072 (Ртейа). Более того, были картированы сайты связывания на 1дС1 для ЕсуЯ1, ЕсуЯ11, ЕсуЯШ и ЕсЯп и описаны варианты с повышенным связыванием (см. §Ые1б§, Я.Ь. е! а1. (2001) 1. Вю1. СЬет., 276:6591-6604). Было показано, что определенные мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с ЕсуЯШ. Кроме того, было показано, что следующие комбинированные мутации обеспечивают улучшение связывания ЕсуЯШ: Τ256Α/8298Α, 8298Α/Ε333Α, 8298Α/Κ224Α и 8298А/Е333А/К334А.
В еще одном варианте осуществления С-конец антител согласно настоящему изобретению модифицируют путем введения остатка цистеина, как описано в РСТ/υδ 2008/073569, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. Такие модификации включают, но не ограничены перечисленными: замену существующего остатка аминокислоты на С-конце полноразмерной последовательности тяжелой цепи или вблизи него, а также введение дополнительного участка, содержащего цистеин, в С-концевой участок полноразмерной последовательности тяжелой цепи. В предпочтительных вариантах осуществления указанный дополнительный участок, содержащий цистеин, включает последовательность цистеин-аланин-аланин (от Ν-конца к С-концу).
В предпочтительных вариантах осуществления присутствие таких модификаций С-конца с использованием цистеина обеспечивает участок для конъюгирования с молекулой-партнером, такой как терапевтический агент или маркерная молекула. В частности, присутствие реактивной тиольной группы, обеспеченное модификацией С-конца с использованием цистеина, можно использовать для конъюгирования молекулы-партнера, включающей сульфгидрил-реактивную группу малеимида. Такое конъюгирование антитела с молекулой-партнером обеспечивает улучшенный контроль специфичного сайта присоединения. Более того, благодаря введению сайта присоединения на С-конце или вблизи него, конъюгирование может быть оптимизировано таким образом, чтобы снизить или исключить его влияние на функциональные свойства антитела и обеспечить упрощение исследования и контроль качества композиций, содержащих конъюгаты.
В еще одном варианте осуществления изменяют гликозилирование антитела путем исключения гликозилирования (агликозилирование) или изменяют сайт (сайты) гликозилирования, что приводит к повышению аффинности антитела. Например, может быть сделана одна или более замен аминокислот, которые обеспечат устранение одного или более сайтов гликозилирования в каркасном участке вариабельной области. Такое агликозилирование может обеспечить увеличение аффинности антитела в отношении антигена; см. патенты США 5714350 и 6350861 (Со е! а1.). Дополнительные подходы к изменению гликозилирования описаны в патентах США 7214775 (Ηηηηί е! а1.), 6737056 (Ртейа); заявке США 20070020260 (Ртейа); международной публикации \УО 2007/084926 (Эюкеу е! а1.); \УО 2006/089294 (ΖΙπ.ι е! а1.) и \УО 2007/055916 (Яауе1с11 е! а1.); каждый из источников полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
В качестве дополнения или альтернативы антитело может быть получено таким образом, чтобы оно имело измененный тип гликозилирования, например гипофукозилированное антитело, содержащее сниженное количество остатков фукозы, или антитело, содержащее повышенное количество двухантенных структур С1с№1с. Было показано, что такие измененные профили гликозилирования увеличивают способность антител к АЗКЦ. Такие модификации углеводородов можно осуществить, например, путем экспрессии антител в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Например, в клетках линий Μ§704, Μ§705 и Μ§709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, ЕИТ8 (альфа(1,6)фукозилтрансфераза), благодаря чему антитела, экспрессирующиеся в данных линиях клеток, не содержат фукозу в составе углеводов; см. заявку на патент США 2004/0110704 (Аатапе е! а1.) и ΥатаηеОЬпцкг е! а1. (2004) В1о!есЬпо1 Вюепд, 87: 614-22. В качестве другого примера в ЕР 1176195 (Чаши е! а1.) описана линия клеток с нарушенной функцией гена ΕυΤ8, который кодирует фукозилтрансферазу, в результате чего антитела, экспрессируемые в такой линии клеток, являются гипофукозилированными. Йапа! е! а1. также описывают линии клеток с низкой активностью ферментов, присоединяющих фукозу к Νацетилглюкозамину, который связывается с участком Ес антитела. В публикации \УО 03/035835 (Ртейа)
- 18 018396 описан вариант линии клеток СНО, клетки Ьес13, со сниженной способностью присоединять фукозу к Акп (297)-связанным углеводам (см. также 8Ые1бк, К.Ь. е! а1. (2002) I. ΒίοΙ. СЬет., 277:26733-26740). В публикации \У0 99/54342 (Итапа е! а1.) описаны линии клеток, модифицированные таким образом, что они экспрессируют гликозилтрансферазы, модифицирующие гликопротеины, в результате чего антитела, экспрессируемые такими клетками, содержат повышенное количество двухантенных структур С1сИас и обладают повышенной активностью АЗКЦ (см. также Итапа е! а1. (1999) №11. Вю!есЬ., 17: 176-180). В качестве альтернативы остатки фукозы антитела могут быть отщеплены под действием фермента фукозидазы (ТагепБпо, А.Ь. е! а1. (1975) ВюсЬет., 14:5516-23).
В качестве дополнения или альтернативы могут быть получены антитела с измененным типом гликозилирования, причем указанные изменения касаются уровня сиалирования. Такие изменения описаны в публикациях \У0 2007/084926 (Июкеу е! а1.) и \У0 2007/055916 (КахеЮк е! а1.), каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки. Например, можно использовать ферментативную реакцию с сиалидазой, как описано в патенте США И8 5831077, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Другие примеры подходящих ферментов включают нейраминидазу и N гликозидазу Р, как описано у 8сЬ1оетег е! а1., I. У1го1оду, 15(4), 882-893 (1975) и у Ье1Ь1§ег е! а1., ВюсЬет I., 338, 529-538 (1999) соответственно. В качестве альтернативы можно использовать способы повышения уровня сиалирования, такие как применение сиалилтрансфераз, котрое описано у Вакке! е! а1., 8сапбтаг1ап 1оита1 οί [ттипойду, 51 (3), 307-311 (2000).
Другим вариантом модификации антител согласно настоящему изобретению является пегилирование. Пегилирование антитела обеспечивает, например, увеличение его биологической полужизни (например, в сыворотке). Для получения пегилированного антитела обычно осуществляют реакцию антитела или фрагмента антитела с производным полиэтиленгликоля (РЕС), таким как реактивный сложный эфир или альдегид РЕС. Либо пегилирование можно осуществить путем проведения реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой РЕС (или аналогичным водорастворимым полимером). В настоящем описании термин полиэтиленгликоль охватывает любую форму РЕС, которая используется для получения производного других белков, такую как моно (С1-С10) алкокси- или арилокси полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. Антитело, которое необходимо пегилировать, может представлять собой агликозилированное антитело. Методы пегилирования белков известны в данной области и могут быть применены к антителам согласно настоящему изобретению; см., например, ЕР 0154316 (ИйМтига е! а1.) и ЕР 0401384 ОкЫкахта е! а1.).
Фрагменты антител и миметики антител.
Настоящее изобретение не ограничено традиционными антителами и может быть осуществлено с использованием фрагментов антитела и миметиков антитела. В настоящее время разработаны и широко известны в данной области различные технологии фрагментов антител и миметиков антител.
Доменные антитела (бАЬк) представляют собой минимальные функциональные связывающие блоки антител, соответствующие вариабельным областям либо тяжелой (Ун) либо легкой (Уь) цепи антител человека. Доменные антитела имеют молекулярную массу около 13 кДа. Из доменов был получен ряд обширных и очень полезных библиотек полностью человеческих бАЬк на основе Ун и Уъ (каждая библиотека содержит более миллиарда различных последовательностей). Указанные библиотеки применяют для выбора бАЬк, специфичных к терапевтическим мишеням. В отличие от многих обычных антител, доменные антитела хорошо экспрессируются в системах на основе клеток бактерий, дрожжей и млекопитающих. Дополнительные подробности относительно доменных антител и способов их получения можно найти, обратившись к патентам США 6291158; 6582915; 6593081; 6172197 и 6696245; заявке на патент США 2004/0110941; европейским патентам ЕР 1433846, 0368684 и 0616640; публикациям \У0 2005/035572, 2004/101790, 2004/081026, 2004/058821, 2004/003019 и 2003/002609, каждый их которых полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
Нанотела представляют собой полученные из антител уникальные терапевтические белки, которые обладают уникальным структурными и функциональными свойствами природных антител, состоящих из тяжелой цепи. Указанные антитела, состоящие из тяжелой цепи, включают единственный вариабельный домен (УНН) и два константных домена (СН2 и СН3). Важно, что клонированный и изолированный домен УНН представляет собой обладающий прекрасной стабильностью полипептид, сохраняющий емкость связывания антигена, присущую исходному антителу, состоящему из тяжелой цепи. Нанотела обладают высокой степенью гомологии с доменами Ун антител человека и могут быть дополнительно гуманизированы без какой-либо потери активности. Важно, что нанотела имеют низкий иммуногенный потенциал, что было подтверждено в исследованиях лидерных соединений класса нанотел на приматах.
Нанотела сочетают преимущества обычных антител с важными свойствами небольших лекарственных молекул подобно обычным антителам, нанотела демонстрируют высокую специфичность нацеливания и аффинность, а также исходно низкую токсичность. В то же время, подобно небольшим лекарственным молекулам они способны ингибировать ферменты и легко проникают в карманы рецепторов. Более того, нанотела исключительно стабильны и их можно вводить не только путем инъекции (см., например, публикацию \¥0 2004/041867, полностью включенную в настоящее описание путем ссылки). К другим преимуществам нанотел относится то, что благодаря малым размерам они способны распозна
- 19 018396 вать необычные или скрытые эпитопы, способность к связыванию в полостях или активных сайтах белков-мишеней с высокой аффинностью и селективностью, обусловленными гибкой 3-мерной структурой, возможность варьирования времени полужизни и быстроту обнаружения лекарственных средств.
Нанотело(а) кодируется единственным геном и эффективно продуцируется в большинстве прокариотических и эукариотических хозяев, например Е. со11 (см., например, патент США 6765087, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки), плесневыми грибами (например, АкретдШик или Тпсйобегта) и дрожжами (например, Зассйатотусек, К1иууеготусе5. Нап§епи1а или РюЫа) (см., например, патент США 6838254, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки).
Метод наноклонов (см., например, публикацию \УО 06/079372, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки) позволяет получить нанотела к желаемой мишени на основе автоматизированного высокоэффективного отбора В-клеток и может быть использован в контексте настоящего изобретения.
Унитела (ЦшВоФек) представляют собой еще одну технологию фрагментов антител, основанную на удалении шарнирной области из антител класса 1дС4. Удаление шарнирной области дает молекулу, которая имеет размер, составляющий, по существу, половину размера обычного антитела класса 1дС4, и содержит одновалентный участок связывания в отличие от двухвалентного участка связывания антитела класса 1дС4. Подобно антителам 1дС4, унитела инертны и не взаимодействуют с иммунной системой, что может быть полезно в лечении заболеваний, при которых иммунный ответ является нежелательным. Функция унител может заключаться в ингибировании или подавлении, но не уничтожении, клеток, с которыми они связываются. Кроме того, связывание унител с раковыми клетками не приводит к стимуляции пролиферации последних. Кроме того, поскольку размер антител несколько меньше, они демонстрируют лучшее распределение в большем количестве солидных опухолей при потенциально полезной эффективности. Унитела выводятся из организма со скоростью, близкой к антителам 1дС4, и способны связывать антигены антител 1дС4 с близкой аффинностью. Более подробное описание унител можно найти в публикации \УО 2007/059782, которая полностью включена в настоящее описание путем ссылки.
Молекулы аффител представляют собой аффинные белки на основе домена белка, состоящего из 58 остатков аминокислот, полученных из трехспирального домена стафилококкового белка А, который связывает 1дС. Данный домен используют в качестве каркаса для конструирования комбинаторных фагмидных библиотек, из которых можно отобрать варианты аффител к желаемым молекулам с использованием технологии фагового дисплея (Ыотб е! а1., ΝηΙ. Вю1есйпо1, 1997; 15:772-7; Роптагк е! а1., Еиг 1. Вюсйет, 2002; 269:2647-55). Простая устойчивая структура и низкая молекулярная масса (6 кДа) молекул аффител обуславливают возможность их применения в разнообразных приложениях, например, в качестве детектирующих реагентов и ингибиторов рецепторных взаимодействий. Более подробно аффитела и их получение описаны в патенте США 5831012, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Также меченые аффитела можно использовать для получения изображений с целью определения распространенности изоформ.
Белки ΌΑΚΡ (Эемдпеб Апкупп Ререа! РгоЮпъ) представляют собой воплощение технологии миметиков антител ΌΚΡ (Эемдпеб Ререа! РгоЮпе искусственные белки с повторами), использующей способность к связыванию полипептидов, не являющихся антителами. Содержащие повторы белки, такие как белки, богатые лейцином и акрилином, представляют собой универсальные связывающие молекулы, которые, в отличие от антител, встречаются как внутри, так и снаружи клетки. Их уникальное модульное строение характеризуется повторяющимися структурными единицами (повторами), которые вместе образуют более длинные области повторов, создающие вариабельные и различающиеся между собой поверхности связывания мишеней. С учетом модульного строения можно получить комбинаторные библиотеки полипептидов, обладающих крайне разнообразными специфичностями связывания. Указанная стратегия включает согласованную разработку совместимых повторов, имеющих различные остатки на поверхности, и случайное объединение таких доменов.
Белки ΌΑΚΡ могут быть получены в бактериальных системах экспрессии с очень высоким выходом. Они относятся к наиболее стабильным из известных белков. Были получены высокоспецифичные, высокоаффинные белки ΌΑΚΡ, связывающие разнообразные белки-мишени, включая рецепторы, киназы и цитокины человека, протеазы человека, белки вирусов и мембран, некоторые из которых обладают аффинностью в диапазоне от единиц наномолей до пикомолей.
Белки ΌΑΚΡ используются в разнообразных приложениях, включая твердофазный ИФА, сэндвичИФА, анализ методом поточной цитометрии (ЕАС8), методы иммуногистохимии (1НС), использование чипов, аффинную очистку и анализ методом вестерн-блот. Белки ΌΑΚΡ не только идеально блокируют белок-белковые взаимодействия, но и ингибируют ферменты. Очень быстрое проникновение в опухоль и очень благоприятное соотношение кровь/опухоль обуславливают применимость белков ΌΑΚΡ для применения в 1п у1уо диагностике и лечении. Дополнительную информацию относительно ΌΑΚΡ и других технологий ΌΚΡ можно найти в патенте США 2004/0132028 и публикации \УО 02/20565, каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки.
Антикалины представляют собой еще одну технологию миметиков антител, однако в этом случае
- 20 018396 источником специфичности связывания являются липокалины - семейство низкомолекулярных белков, экспрессирующихся естественным путем в тканях и жидкостях тела человека в больших количествах. Липокалины выполняют ряд функций ίη νίνο, связанных с транспортировкой и запасанием химически чувствительных или нестабильных соединений. Липокалинам присуща устойчивая структура, включающая высококонсервативный β-участок, являющийся основой для четырех петель на одном из концов белка. Указанные петли образуют вход в карман связывания, конформационные различия в этой части молекулы обуславливают различия в специфичности связывания между отдельными липокалинами.
Хотя общая структура из гипервариабельных петель, поддерживаемых консервативным β-листом, напоминает иммуноглобулины, липокалины значительно отличаются от антител по размеру, а также тем, что они состоят из единственной цепи из 160-180 аминокислот, что существенно превышает размер одного антитела иммуноглобулина.
Липокалины можно клонировать, а их петли - модифицировать, и таким образом получать антикалины. Были получены библиотеки антикалинов разнообразной структуры. Дисплей антикалинов обеспечивает возможность отбора и скрининга функции связывания с последующей экспрессией и получением растворимого белка для дальнейшего анализа в клетках эукариот и прокариот. Проведенные исследования продемонстрировали, что возможно получить антикалины, специфичные к, по существу, любому белку-мишени человека, и при этом получить аффинность связывания в наномолярном диапазоне или выше.
Антикалины также можно получить в формате белков двойной направленности (дуокалины). Дуокалины объединяют два различных терапевтических фрагмента в одном белке, легко получаемом с использованием стандартных методов получения, и при этом сохраняют специфичность к мишени и аффинность вне зависимости от структурной ориентации двух связывающих доменов.
Влияние на множество мишеней при помощи одной молекулы особенно полезно при заболеваниях, о которых известно, что они вызваны более чем одним фактором, более того, двух- или мультивалентные форматы связывания, такие как дуокалины, обладают значительным потенциалом нацеливания на поверхность клетки при заболевании и оказывают агонистическое действие на пути передачи сигнала или вызывают усиленную интернализацию посредством связывания и кластеризации рецепторов клеточной поверхности. Более того, высокая стабильность, присущая дуоклинам, сравнима со стабильностью мономерных антикалинов.
Дополнительную информацию относительно антикалинов можно найти в патенте США 7250297 и публикации \νϋ 99/1687З, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.
Авимеры представляют собой еще один тип технологии миметиков антител, применимый в контексте настоящего изобретения. Авимеры получены из обширного семейства внеклеточных рецепторных доменов человека путем ίη νίΐτο перемешивания экзонов и применения фагового дисплея, обеспечивших получение мультидоменных белков, обладающих свойствами связывания и ингибирования. Было показано, что объединение независимых связывающих доменов приводит к возникновению авидности, улучшению аффинности и специфичности по сравнению с обычными связывающими белками, связывающими единственный эпитоп. Другие потенциальные преимущества включают простоту и эффективность получения таких мультспецифичных молекул в ЕзсНепсЫа со11, улучшенную термостабильность и устойчивость к действию протеаз. Были получены авимеры к различным мишеням, обладающие субнаномолярными значениями аффинности. Дополнительную информацию относительно авимеров можно найти в документах 2006/028660З, 2006/02З4299, 2006/022З114, 2006/01778З1, 2006/0008844, 2005/0221З84, 2005/0164З01, 2005/00899З2, 2005/005З97З, 2005/0048512, 2004/0175756, каждый из которых полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
Версатела представляют собой еще одну технологию миметиков антител, которую можно использовать в контексте настоящего изобретения. Версатела представляют собой небольшие белки массой З-5 кДа, содержащие >15% цистеинов, которые образуют каркас с высокой плотностью дисульфидных связей, вместо гидрофобной основы, которой обычно обладают белки. Такая замена обеспечивает белок, имеющий более маленький размер и являющийся более гидрофильным (т.е. менее склонный к агрегации и неспецифичному связыванию) и более устойчивым к действию тепла и протеаз, который обладает меньшей плотностью эпитопов Т-клеток, поскольку остатки, которые вносят наибольший вклад в презентацию ГКГС являются гидрофобными. Хорошо известно, что каждое из четырех указанных свойств влияет на иммуногенность и поэтому ожидается, что вместе они обеспечат значительное снижение иммуногенности.
Структура версател обеспечивает формат миметиков антител, который включает множественную валентность, множественную специфичность, разнообразные механизмы регулирования полужизни, модули тканевого нацеливания и отсутствие участка Ес-антитела. Кроме того, версатела получают в Е. со11 с высоким выходом, а благодаря гидрофильности и небольшому размеру версатела хорошо растворимы, что обеспечивает возможность их получения в форме с высокой концентрацией. Версатела исключительно устойчивы к воздействию температуры и имеют увеличенное время полужизни. Дополнительную информацию относительно антител можно найти в заявке на патент США 2007/0191272, которая полно
- 21 018396 стью включена в настоящее описание посредством ссылки.
Приведенное выше описание технологий фрагментов и миметиков антител не является полным. В контексте настоящего изобретения могут использоваться разнообразные дополнительные технологии, включая альтернативные технологии, основанные на полипептидах, например объединение гипервариабельных участков, описанное Οιιί е! а1., №11иге В1о!ескпо1оду, 25(8) 921-929 (2007), а также технологии, основанные на нуклеиновых кислотах, такие как технологии РНК-аптамеров, описанные в патентах США 5789157; 5864026; 5712375; 5763566; 6013443; 6376474; 6613526; 6114120; 6261774 и 6387620; каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки.
Физические свойства антител.
Антитела согласно настоящему изобретению можно описывать через различные физические свойства, что позволяет определять и/или различать различные классы.
Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельной области тяжелой или легкой цепи. Такие сайты гликозилирования могут обеспечивать повышенную иммуногенность антитела или изменение рК антитела вследствие изменения связывание антигена (Магкка11 е! а1. (1972) Аппи Кем. Вюскет, 41: 673-702; Са1а апа Мотком (2004) 1. 1ттипо1, 172: 5489-94; №аШск е! а1. (1988) 1. Ехр. Мед., 168:1099-109; 8р1го (2002) С1усоЫо1оду, 12:43К-56К; Рагекк е! а1. (1985) №11иге 316:452-7; М1тига е! а1. (2000) Мо1. 1ттипо1., 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность И-Х-8/Т. В некоторых случаях предпочтительно получить антитело к мезотелину, которое не гликозилировано в вариабельной области. Этого можно достичь либо путем отбора антител, которые не содержат мотивов гликозилирования в вариабельной области, либо путем осуществления мутаций в участке гликозилирования.
В предпочтительном варианте осуществления антитела согласно настоящему изобретению не содержат сайтов изомеризации аспарагина. Деамидирование аспарагина может возникать в последовательностях N-0 или Э-С и приводить к образованию остатка изоаспарагиновой кислоты, который вызывает перекручивание полипептидной цепи или снижение ее стабильности (эффект изаспарагиновой кислоты).
Каждое антитело обладает уникальной изоэлектрической точкой (р1), которая обычно лежит в диапазоне рН от 6 до 9,5. р1 для антитела 1дС1 обычно лежит в диапазоне рН 7-9,5, а р1 для антитела 1дС4 обычно лежит в диапазоне рН 6-8. Существует предположение, что антитела, р1 которых находится за пределами нормального диапазона, возможно обладают некоторой неустойчивостью и склонности к нарушению пространственной укладки ш νί\Ό. Таким образом, предпочтительно получать антитела, значение р1 которых попадает в нормальный диапазон. Этого можно достичь либо путем отбора антитела с р1 в нормальном диапазоне, либо путем осуществления мутаций заряженных остатков.
Каждое антитело будет обладать характерной температурой плавления, причем более высокая температура плавления указывает на более высокую общую стабильность ш νίνυ (Кпккпатийку К. апа Мапшпд М.С. (2002) Сигг Ркагт Вю!ескпо1, 3:361-71). В целом предпочтительно, чтобы ТМ1 (температура начала разворачивания молекулы) была выше 60°С, предпочтительно выше 65°С, еще более предпочтительно выше 70°С. Точка плавления антитела может быть определена при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (Скеп е! а1. (2003) Ркагт Кек., 20:1952-60; Ск1г1апйо е! а1. (1999) 1ттипо1 Ье!!, 68:47-52) или методом кругового дихроизма (Миггау е! а1. (2002) 1. Скгота!одг δα, 40:343-9).
В предпочтительном варианте осуществления отбирают антитела, которые не подвержены быстрому разрушению. Разрешение антител можно определить методом капиллярного электрофореза (СЕ) и МАЕЭ1-М8 (Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация-масс-спектрометрия, А1ехапйег АД. апа ИмдИек ϋ,Ε. (1995) Апа1 Скет, 67: 3626-32).
В другом предпочтительном варианте осуществления отбирают антитела, которые обладают минимальным эффектом агрегации, который может привести к нежелательному иммунному ответу и/или измененным или неблагоприятным фармакокинетическим свойствам. В целом, приемлемыми являются антитела с агрегацией 25% или меньше, предпочтительно 20% или меньше, еще более предпочтительно 15% или меньше, еще более предпочтительно 10% или меньше и еще более предпочтительно 5% или меньше. Агрегация может быть измерена с использованием нескольких методик, включая колоночную гель-хроматографию (8ЕС), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и рассеяние света.
Способы конструирования антител.
Как описано выше, антитела к мезотелину, включающие известные последовательности νΗ и ν^ можно использовать для получения новых антител к мезотелину путем модификации их самих или константных областей (области), к которым они присоединены. Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения структурные элементы известного антитела к мезотелину, например 3С10, 6А4 или 7В1, используют для получения структурно близких антител к мезотелину, которые сохраняют по меньшей мере одно из функциональных свойств антител согласно настоящему изобретению, таких как связывание мезотелина человека. Например, один или более участков СЭК известных антител к мезотелину или мутантов таких антител можно рекомбинантными методами объединить с каркасными участками и/или другими участками СЭК с получением дополнительных рекомбинантных антител к мезотелину согласно настоящему изобретению, как обсуждалось выше. Другие типы модификации включают модификации,
- 22 018396 описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для такого метода конструирования являются одна или более последовательностей УН и/или Уь, приведенных в настоящем описании, или один или более участков СИЯ указанных областей. Для получения сконструированного антитела необязательно фактически получать (т.е. экспрессировать в виде белка) антитело, включающее одну или более последовательностей УН и/или Уъ, приведенных в настоящем описании, или один или более участков СИЯ указанных областей. Вместо этого информацию, содержащуюся в такой последовательности (последовательностях), используют для получения последовательности (последовательностей) второго поколения, полученной из исходной последовательности (последовательностей), а затем указанную последовательность второго поколения получают и экспрессируют в виде белка.
Соответственно согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения предложен способ получения антител к мезотелину, включающий:
(a) обеспечение (ί) последовательности УН антитела, включающей последовательность СИЯ1, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 1И NΟ: 1-3, включающей последовательность СИЯ2, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 1И NΟ: 4-6, и/или включающей последовательность СИЯ3, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 1И NΟ: 7-9; и/или (ίί) последовательности Уъ антитела, включающей последовательность СИЯ1, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 1И NΟ: 10-12, последовательность СИЯ2, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО 1И NΟ: 13-15, и/или последовательность СИЯ3, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО 1И NΟ: 16-18;
(b) изменение по меньшей мере одного остатка аминокислоты в последовательности вариабельной области УН антитела и/или последовательности Уъ антитела с получением по меньшей мере одной измененной последовательности антитела и (c) экспрессию указанной измененной последовательности антитела в виде белка.
Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно использовать стандартные методики молекулярной биологии.
В некоторых вариантах осуществления возможно вводят мутации (случайным или селективным образом) во всей последовательности, кодирующей антитело к мезотелину или в ее части, полученное в результате модифицированное антитело к мезотелину можно подвергнуть скринингу на активность связывания и/или другие функциональные свойства согласно настоящему изобретению. Способы осуществления мутаций описаны в данной области. Например, в АО 02/092780 (81юг1) описаны способы получения и скрининга мутированных антител с использованием насыщающего мутагенез, сборки путем синтетического лигирования или комбинаций указанных методов. В качестве альтернативы в АО 03/074679 (Ьа/аг е! а1.) описаны способы использования методов компьютерного скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитела согласно настоящему изобретению. Такие нуклеиновые кислоты могут существовать в цельных клетках, в лизатах клеток или в частично очищенной или по существу очищенной форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или по существу очищенной, если она очищена от других компонентов клетки и других примесей, например других нуклеиновых кислот или белков клетки, стандартными способами, включая обработку смесью щелочь/8И8, разделение с использованием С5С1, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие способы, известные в данной области (см., Е. Аи8иЬе1, е! а1., еб. (1987) Сиггей РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Стене РиЫЫннд аиб А11еу Йеттеме, Νον Уогк). Нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может представлять собой, например, ДНК, РНК и может содержать или не содержать интронные последовательности. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК.
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть получены при помощи стандартных методик молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными с использованием трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулина человека, как описано ниже), молекулы кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител, продуцируемые гибридомами, можно получить путем стандартной амплификации методом ПЦР или методами клонирования кДНК. В случае антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с использованием методики фагового дисплея), кодирующую такие антитела нуклеиновую кислоту можно получить из библиотеки генов.
Предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы, кодирующие последовательности УН и Уъ моноклональных антител 3С10, 6А4 или 7В1. Последовательности ДНК, кодирующие УН 3С10, 6А4 и 7В1, показаны в 8ЕО 1И NΟ: 25-27 соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие У|, 3С10, 6А4 и 7В1, показаны в 8ЕО 1И NΟ: 28-30 соответственно.
После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты УН и Уь, указанные фрагменты ДНК можно подвергнуть дальнейшим манипуляциям с применение стандартных технологий рекомбинантной ДНК, например, чтобы превратить гены вариабельных областей в гены полноразмерных антител, в гены фрагментов РаЬ или в гены 5сЕу. В указанных манипуляциях фрагменты ДНК, кодирующие Уъ или УН, функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как констант
- 23 018396 ная область или гибкий линкер. Термин функционально связанный в настоящем описании означает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что кодируемые ими последовательности аминокислот остаются в рамке.
Изолированную ДНК, кодирующую область УН, можно превратить в ген полноразмерной цепи антитела путем обеспечения функциональной связи ДНК, кодирующей УН, с молекулой ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константных областей тяжелой цепи человека известны в данной области (см., например, КаЬа! '242), а фрагменты ДНК, включающие такие участки, могут быть получены путем стандартной амплификации методом ПЦР. Константные области тяжелой цепи могут представлять собой константные области 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА, 1дЕ, 1дМ или 1§ϋ, но в наиболее предпочтительном случае представляют собой константную область 1дС1 или 1дС4. Для гена тяжелой цепи фрагмента ЕаЬ ДНК, кодирующая УН, может быть функционально связана с молекулой ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи.
Изолированную ДНК, кодирующую область Уь, можно превратить в ген полноразмерной цепи антитела (а также в ген легкой цепи ЕаЬ) путем обеспечения функциональной связи ДНК, кодирующей Уь, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область, СЬ. Последовательности генов константных областей легкой цепи человека известны в данной области (см., например, КаЬа! '242), а фрагменты ДНК, включающие такие участки, могут быть получены путем стандартной амплификации методом ПЦР. В предпочтительных вариантах осуществления константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа или лямбда.
Чтобы получить ген ксЕу, фрагменты ДНК, кодирующие УН и Уъ, функционально соединяют с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующий последовательность аминокислот (61у4-8ег)3, таким образом, чтобы последовательности УН и Уь экспрессировались в виде непрерывной цепи белка, и при этом У|, и УН были соединены гибким ликером (см., например, В1гб е! а1. (1988) 8с1епсе, 242:423-426; НикЮп е! а1. (1988) Ргос. Ха!1. Асаб. 8с1. И8А, 85:5879-5883; МсСайейу е! а1., (1990) Ха!иге, 348:552-554).
Получение моноклональных антител согласно настоящему изобретению.
Моноклональные антитела (тАЬк) согласно настоящему изобретению можно получать с использованием разнообразных методик, включая методику гибридизации соматических клеток, предложенную КоЫег и М11к!ет (1975) Хайне, 256: 495. Хотя предпочтительными являются процедуры гибридизации соматических клеток, в принципе, можно использовать и другие методики, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов.
Предпочтительные животные с использованием клеток животных для получения гибридом представляют собой системы с использование мышей. Получение гибридом в мышах - очень хорошо разработанная процедура. Протоколы иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области. Партнеры для слияния (например, клетки миеломы мыши) и процедуры слияния также известны.
Химерные или гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены на основе последовательностей, не являющихся антителами человека антител, полученных, как описано выше. ДНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, может быть получена из представляющих интерес гибридом, полученных не из клеток человека, и подвергнута модификации для включения не-мышиных последовательностей иммуноглобулинов (например, последовательностей человека) с применением стандартных методик молекулярной биологии. Например, для получения химерного антитела вариабельные области мыши можно объединить с константными областями человека (см., например, И8 4816567 (СаЬШу е! а1.)). Чтобы получить гуманизированное антитело, участки СИК мыши можно встроить в каркас человека (см., например, И8 5225539 (^1п!ег) и И8 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 (Цнееп е! а1.)).
В предпочтительном случае антитела представляют собой антитела человека. Такие антитела могут быть получены с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, в которых часть иммунной системы мыши заменена на часть иммунной системы человека. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают типы НиМАЬ Мойке® и КМ Мойке® соответственно. В настоящем описании таких мышей называют общим термином мыши, несущие 1д человека.
Мыши типа НиМАЬ Мойке® (Мебагех®, 1пс.) несут минилокусы гена иммуноглобулина человека, которые кодируют неперемешанные последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой к цепи иммуноглобулина человека, а также содержат направленные мутации, инактивирующие эндогенные локусы цепи μ и к (см., например, ЬопЬегд е! а1. (1994) Хайне, 368 (6474): 856-859). Соответственно такие мыши демонстрируют пониженную экспрессию 1дМ или к мыши, и в ответ на иммунизацию происходит переключение класса введенных трансгенов тяжелой и легкой цепей человека и соматическая мутация, что приводит к выработке высокоаффинных антител 1дСк человека (ЬопЬегд е! а1. (1994), кирга; обзор в ЬопЬегд (1994) НапбЬоок οί Е.хрептеп1а1 Рйагтасо1оду, 113:49-101; ЬопЬегд апб Ннкхаг (1995) 1п!ет. Кеу. 1ттипо1., 13:65-93 и Нагбтд апб ЬопЬегд (1995) Апп. Ν.Υ. Асаб. 8сЦ 764:536-546). Получение и использование мышей типа НиМАЬ Мойке® и модификаций генома таких мышей описано в источниках Тау1ог е! а1.
- 24 018396 (1992) Иис1ею Аайк ВекеагсЬ, 20:6287-6295; СЬеп е! а1. (1993) 1п!етпайопа1 1ттипо1оду, 5: 647-656; Тиай1оп е! а1. (1993) Ргос. ИаЙ. Асай. 8ск И8Л, 90: 3720-3724; СЬо1 е! а1. (1993) Иа!иге Сепейск, 4:117-123; СЬеп е! а1. (1993) ЕМВО I., 12: 821-830; ТиаШоп е! а1. (1994) I. 1ттипо1., 1 52:2912-2920; Тау1ог е! а1. (1994) 1п!етпайопа1 1ттипо1оду, 6: 579-591 и РЫю'Пй е! а1. (1996) Иа!иге В1о!есЬпо1оду, 14: 845-851, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание путем иммунизации; см. также патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429 (все ЬопЬетд и Кау); 5545807 (8иташ е! а1.); публикации АО 92/03918, АО 93/12227, АО 94/25585, АО 97/13852, АО 98/24884, АО 99/45962 (все ЬопЬетд апй Кау) и АО 01/14424 (Когтап е! а1.). Также можно использовать трансгенных мышей, несущих гены легкой цепи лямбда человека, например, описанные в АО 00/26373 (Вгиддетапп). Например, можно скрестить мышь, несущую трансген легкой цепи лямбда человека, с мышью, несущей трансген тяжелой цепи человека (например, НСо7) и возможно также несущей трансген легкой цепи каппа человека (например, КСо5), с получением мыши, несущей трансгены как легкой, так и тяжелой цепей (см., например, пример 1).
В другом варианте осуществления моноклональные антитела человека согласно настоящему изобретению можно получать с использованием мыши, несущей последовательности иммуноглобулинов человека в виде трансгенов или трансхромосом, например мыши, несущей трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. В настоящем описании такая мышь обозначается как штамм или тип КМ Мойке®, такие мыши описаны в АО 02/43478 (Ыпйа е! а1.).
Кроме того, можно использовать другие доступные альтернативные системы экспрессии генов иммуноглобулинов человека на основе трансгенных животных для получения антител к мезотелину согласно настоящему изобретению. Например, можно использовать одну из таких альтернативных трансгенных систем, обозначаемую Хепотоике (АЬдешх, 1пс.), которая описана, например, в И8 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 (КисЬейарай е! а1.).
Кроме того, в данной области доступны альтернативные системы экспрессии генов иммуноглобулинов человека на основе трансхромосомных животных, которые можно использовать для получения антител к мезотелину согласно настоящему изобретению. Например, можно использовать трансгенных мышей, несущих и трансхромосому тяжелой цепи человека, и трансхромосому легкой цепи человека, обозначаемых ТС мыши; такие мыши описаны в Топи/ика е! а1. (2000) Ргос. №11. Асай. 8ск И8А, 97: 722-727. Помимо этого, описаны коровы, несущие трансхромосомы тяжелой и легкой цепей, например Китова е! а1. (2002) Иа!иге Вю!есйпо1оду, 20: 889-894 и АО 2002/092812.
Антитела человека согласно настоящему изобретению можно также получать с использованием методов фагового дисплея для скрининга библиотек иммуноглобулинов человека; см., например, патенты США 5223409; 5403484 и 5571698 (Ьайпет е! а1.); патенты 5427908 и 5580717 (Эо^ег е! а1.); патенты 5969108 и 6172197 (МсСаШейу е! а1.) и патенты 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 (СпГГййк е! а1.).
Антитела человека согласно настоящему изобретению можно также получать с использованием мышей 8СГО, в которых воссозданы иммунные клетки человека, благодаря чему после иммунизации может развиться ответ антител человека. Такие мыши описаны в патентах США 5476996 и 5698767 (А11коп е! а1.).
В другом варианте осуществления антитела человека к мезотелину получают с использованием комбинации мыши, несущей 1д человека, и методик фагового дисплея, как описано в И8 6794132 (ВиесЫег е! а1.). Более конкретно, данный способ включает, во-первых, индукцию ответа антител к мезотелину у мышей, несущих ген 1д человека (например, мыши НиМаЬ Мойке® или КМ Мойке®), путем иммунизации антител одним или более антигенов мезотелина, с последующим выделением нуклеиновых кислот, кодирующих цепи антител человека, из лимфоцитов мыши и введением указанных нуклеиновых кислот в вектор дисплея (например, фаговый) с получением набора векторов для библиотеки. Таким образом, каждый член библиотеки содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую цепь антитела человека, а каждая цепь антитела представлена в дисплее. Затем осуществляют скрининг библиотеки с белком мезотелином, что позволяет выделить члены библиотеки, специфично связывающие мезотелин. Затем вставки нуклеиновых кислот отобранных членов библиотеки выделяют и секвенируют стандартными методами, чтобы определить вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепей. Вариабельные области можно превратить в полноразмерные цепи антител с использованием стандартных методик рекомбинантной ДНК, таких как клонирование в вектор экспрессии, который несет константные области тяжелой и легкой цепей, таким образом, чтобы область УН была функционально связана с областью СН, а область Уь была функционально связана с областью Сь.
Иммунизация мышей, вырабатывающих 1д человека.
Если для получения антител человека согласно настоящему изобретению используют мышей, несущих ген 1д человека, таких мышей можно иммунизировать очищенной или обогащенной композиции антигена мезотелина и/или рекомбинантного белка мезотелина, клеток, экспрессирующих белок мезотелин, или белком слияния, включающем мезотелин, как описано в ЬопЬетд, Ν. е! а1. (1994) Иа!иге, 368(6474): 856-859; Р1кЬ^йй, Ό. е! а1. (1996) Иа!иге Вю!есйп., 14: 845-851 и АО 98/24884 и АО 01/14424.
- 25 018396
В предпочтительном случае используют мышей в возрасте 6-16 после первой инфузии. Например, очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена мезотелина используют для интраперитонеальной и/или подкожной иммунизации мышей, несущих ген 1д человека. В наиболее предпочтительном случае иммуноген, используемый для стимуляции выработки антител согласно настоящему изобретению, представляет собой белок слияния на основе мезотелина, содержащий внеклеточный домен белка мезотелина, слитый с ^полипептида, не являющегося мезотелином (например, меткой Шк) (см., например, пример 1).
Процедуры получения полностью человеческих моноклональных антител, которые связывают мезотелин человека, подробно описаны в примере 1. Экспериментальные данные, полученные с различными антигенами, показывают, что у трансгенных мышей типа ΗυΜΑϋ Мойке получали ответ путем первичной внутрибрюшинной иммунизации (1Р) антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующими еженедельными 1Р иммунизациями (до 6) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда (например, адъювант К1В1). Кроме того, обнаружили, что цельные клетки без адъюванта также высокоиммуногенны. Можно осуществлять мониторинг иммунного ответа на протяжении курса иммунизации по образцам крови, полученным из заглазничных областей. Скрининг плазмы можно осуществлять методом ИФА. Мышей с достаточным уровнем иммуноглобулинов к мезотелину можно использовать для получения слитых конструктов. Можно провести поддерживающую иммунизацию мышей антигенов, например, за 3 дня до умерщвления и извлечения селезенки. Ожидается, что для каждой иммунизации может потребоваться 2-3 слияния. Каждым антигеном обычно иммунизируют от 6 до 24 мышей. Обычно используют оба типа: НСо7 и НСо12. Кроме того, оба трансгена, НСо7 и НСо12, можно культивировать в одной мыши, несущей два разных трансгена тяжелой цепи человека (НСо7/НСо12). В качестве альтернативы или в дополнение можно использовать мышей КМ Мойке®.
Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела человека согласно настоящему изобретению.
Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела человека согласно настоящему изобретению, выделяют спленоциты и/или лимфоциты иммунизированных мышей и осуществляют их слияние с клетками иммортализованной линии, таким как линия клеток миеломы мыши. Полученные гибридомы проверяют на предмет продуцирования антигенспецифичных антител. Например, осуществляют слияние клеточных суспензий (содержащие одну клетку) лимфоцитов селезенки из иммунизированных мышей с отношении один к шести с несекреторными клетками миеломы мыши линии Р3Х63Ад8. 653 (АТСС, СКЬ 1580) с 50% РЕО. В качестве альтернативы можно осуществить слияние суспензий лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей методом электрослияния с использованием электропорятора для слияния клеток с большой камерой Су!оРи1ке (Су!оРи1ке 8с1еисек, 1пс., О1еи Вигше, Магу1аиб). Клетки наносят на плоскодонные микротитрационные планшеты в концентрации 2х105, после чего инкубируют в течение двух недель в селективной среде, содержащей 20% фетальной сыворотки С1опе кегит, 18% кондиционированной среды 653, 5% оригена (1СЕ№), 4 мМ Ь-глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 5 мМ ИЕРЕ8, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина и 1Х ΗΑΤ (81дта; ΗΑΤ добавляют через 24 ч после слияния). Затем приблизительно в течение двух недель клетки культивируют в среде, в которой ΗΑΤ заменен на НТ. Методом ИФА проводят скрининг отдельных клеток на моноклональные антитела 1дМ и 1дС человека. После начала интенсивного роста гибридом культивирование продолжают обычно в течение 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, пересевают, снова подвергают скринингу и, если они все еще положительны по [дС человека, по меньшей мере дважды субклонируют моноклональные антитела путем ограничивающего разбавления. Затем стабильные субклоны культивируют ίη νίίΐΌ для получения небольших количеств антитела в среде для культивирования тканей для исследования.
Для очистки моноклональных антител человека отобранные гибридомы культивируют в двухлитровых вращающихся флаконах. Супернатанты фильтруют и концентрируют, а затем подвергают аффинной хроматографии с белком А на сефарозе (Рйагташа, Р1кса!а^ау, Нью-Джерси). Элюированные фракции 1дС проверяют методом гель-электрофореза и ВЭЖХ, чтобы гарантировать чистоту. Буферный раствор заменяют на ФБР и определяют концентрацию по ОП280 при коэффициенте экстинктции 1.43. Моноклональные антитела аликвотируют и хранят при -80°С.
Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела согласно настоящему изобретению.
Антитела согласно настоящему изобретению также можно продуцировать, используя в качестве клеток-хозяев трансфектомы, с применением, например, комбинации технологии рекомбинантной ДНК и методов трансфекции генов, хорошо известных в данной области (например, Моткои, 8. (1985) 8с1еисе, 229:1202).
Например, для экспрессии антител или фрагментов антител при помощи стандартных методик молекулярной биологии получают молекулы ДНК, кодирующие часть или полноразмерные тяжелые и легкие цепи (например, амплификация путем ПЦР или клонирование ДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует представляющее интерес антитело), после чего полученные молекулы ДНК мож
- 26 018396 но встраивать в векторы экспрессии с обеспечением функциональной связи генов с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В настоящем описании термин функционально связан означает, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что последовательности контроля транскрипции и трансляции данного вектора осуществляют регуляции транскрипции и трансляции указанного гена антитела. Вектор экспрессии и контрольные последовательности выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с используемой клеткой-хозяином. Г ен легкой цепи антигена и ген тяжелой цепи антигена встраивают в разные векторы или, что более типично, оба гена встраивают в один вектор экспрессии. Встраивание генов антитела в вектор экспрессии осуществляют стандартными методами (например, лигирование комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе, или лигирование тупых концов при отсутствии сайта рестрикции). Вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител согласно настоящему изобретению используют для получения полноразмерных генов антитела определенного изотипа путем встраивания их в векторы, которые уже кодируют константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи желаемого изотипа, таким образом, чтобы сегмент νΗ был функционально связан с сегментом(ами) Сн в векторе, а сегмент ν2 был функционально связан с сегментом Съ в векторе. В качестве дополнения или альтернативы рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, чтобы указанный сигнальный пептид был связан в пределах рамки с аминоконцом гена антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из белка, отличного от иммуноглобулина).
В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии согласно настоящему изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию указанных генов цепей антитела в клетке-хозяине. Термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, у ^еббе1 (Семе Ε.χρίΌδδίοη ТесНгю^ду. Мебюбб ίη Еηζутο1οβу. 185, Асабеиис Рге§8, 8аη Эхе^, СА (1990)). Для специалиста в данной области очевидно, что конструкция вектора экспрессии, включая секреторные и регуляторные последовательности, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, желаемый уровень экспрессии и т.д., предпочтительные регуляторные последовательности для клеток-хозяев млекопитающих включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, например, полученные из цитомегаловируса Юму), вируса обезьян 40 (8ν40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (АбМЬР) и полиомы). В качестве альтернативы можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как убикфитиновый промотор или промотор βглобина. Кроме того, можно использовать регуляторные элементы, состоящие из последовательностей, полученных из разных источников, такие как промоторная система 8Яа, которая содержит последовательности из раннего промотора 8ν40 и длинный концевой повтор из вируса Т-клеточной лейкемии человека типа 1 (ТакеЬе, Υ. е! а1. (1988) Μοί. Се11. Βίο1., 8:466-472).
В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные векторы экспрессии согласно настоящему изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетке-хозяине (например, ориджины репликации) и гены маркеров отбора. Гены маркеров отбора облегчают отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017, авторы Ахе1 е! а1.). Например, типичный ген маркера селекции сообщает устойчивость к какому-либо лекарственному средству, такому как С418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую введен данный вектор. Предпочтительные гены маркеров селекции включают ген дигидрофолетредуктазы (ОНРЯ) (для использования бЫг-клеток-хозяев в селекции/амплицикации с метотрексатом) и ген ικο (для селекции с С418).
Для обеспечения экспрессии тяжелой и легкой цепей, кодирующий вектор(ы) экспрессии вводят путем трансфекции в клетку-хозяина. Предполагается, что термин трансфекция включает разнообразные технологии, обычно применяемые для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотичекую клетку, например электропорацию, преципитацию кальций-фосфатом, трансфекцию с использованием ЭЕАЕ-декстрана и т.п. Хотя теоретически возможно осуществлять экспрессию антител согласно настоящему изобретению либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно в клетках млекопитающих, будет обеспечивать сборку и секрецию правильно свернутого иммунологически активного антитела скорее, чем экспрессия в прокариотических клетках.
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител согласно настоящему изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая бЫг клетка СНО, описанные Иг1аиЬ и СРакт, (1980) Ргас. №111. Асаб. 8с! И8А, 77:4216-4220, используемые с маркером селекции ОНРЯ, например, как описано в ЯЛ. КаиРшап аиб Р.А. 8Нагр (1982) ί. Μο1. Βίο1., 159:601-621), клетки миеломы N80, клетки СО8 и клетки 8Р2. В частности, для использования с
- 27 018396 клетками миеломы N80 предпочтительной является другая система экспрессии с геном С8, описанная в \У0 87/04462 (\V^1кοη). \У0 89/01036 (ΒеЬЬ^пдιοп) и ЕР 338841 (ΒеЬЬ^пдΐοп). В случае если рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, указанные антитела получают путем культивирования клеток-хозяев на протяжении периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антител в клетках-хозяевах или более предпочтительно секреции антител в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева, антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием обычных методов очистки белков.
Исследование связывания антитела с антигеном.
Антитела согласно настоящему изобретению можно тестировать на связывание мезотелином при помощи, например, стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Вкратце, микротитрационные планшеты покрывают очищенным и/или рекомбинантным белком мезотелином (см., например, пример 1) в концентрации 1 мкг/мл в ФБР, а затем блокируют 5% бычьим сывороточным альбумином в ФБР. В каждую лунку добавляют разбавления антитела (например, разбавления плазмы мышей, иммунизированных мезотелином) и инкубируют в течение 1-2 ч при 37°С. Планшеты промывают смесью ФБР/Тгееп и инкубируют с вторичным реагентом (например, для антител человека, поликлональный реагент, специфичный к Ес 1дО человека, выделенный из организма козы), конъюгированным со щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°С. После промывки стимулируют развитие цветной реакции в планшетах путем добавления субстрата р№Р (1 мг/мл) и определяют ОП на длине волны 405-650. В предпочтительном случае для получения продуктов слияния.
Описанные выше средства твердофазного иммуноферментного анализа также можно использовать для скрининга на гибридомы, которые демонстрируют положительную реактивность с белком мезотелином. Из каждой гибридомы можно отобрать по одному клону, который сохраняет реактивность родительской клетки (при помощи ЕБ18А), для получения банка клеток объемом 5-10 сосудов, хранящихся при -140°С, и для очистки антитела.
Для очистки антител к мезотелину выбранные гибридомы выращивают в двухлитровых переворачиваемых сосудах для очистки моноклональных антител. Супернатанты фильтруют и концентрируют, а затем подвергают аффинной хроматографии с белком А на сефарозе (РЬагтас1а, Р1кса!атау, НьюДжерси). Элюированные фракции 1дО проверяют методом гель-электрофореза и ВЭЖХ, чтобы гарантировать чистоту. Буферный раствор заменяют на ФБР и определяют концентрацию по ОП280 при коэффициенте экстинктции 1.43. Моноклональные антитела аликвотируют и хранят при -80°С.
Чтобы определить, связываются ли отобранные антитела к мезотелину с уникальными эпитопами, каждое антитело биотинилируют с использованием коммерчески доступных реагентов (Р1егсе, ВοскΓο^б. ГБ, США). Исследования конкуренции с использованием немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноколональных антител осуществляют с использованием немеченых моноклональных антител и планшетов для ИФА, покрытых белком мезотелином. Связывание биотинилированного тАЬ можно детектировать при помощи зонда стрептавидин-щелочная фосфатаза.
Для того чтобы определить изотип очищенных антител, можно осуществить ИФА на изотип с использованием реагентов, специфичных к определенному изотипу. Например, чтобы определить изотип моноклонального антитела человека, можно покрыть лунки микротитрационного планшета 1 мкг/мл антител к иммуноглобулину человека в течение ночи при 4°С. После блокирования 1% БСА осуществляют реакцию планшетов с 1 мкг/мл или меньше тестируемых моноклональных антител или очищенных контролей изотипов при комнатной температуре в течение от одного до двух. Затем проводят в лунках реакцию либо с конъюгированными со щелочной фосфатазой зондами, специфичными либо к 1дС1 человека, либо к 1дМ человека. Затем инициируют цветную реакцию и проводят анализ, как описано выше.
1дС человека к мезотелину также можно исследовать на реактивность с антигеном - мезотелином методом вестерн-блот анализа. Вкратце, готовят антиген - мезотелин и подвергают гель-электрофорезу на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Разделенные антигены переносят на целлюлозные мембраны, блокируют 10% фетальной бычьей сывороткой, осуществляют тесты с исследуемыми моноклональными антителам. Связывание 1дО человека детектируют с использованием щелочной фосфатазы к 1дО и проводят цветную реакцию с использованием таблетированного субстрата ΒСIР/NΒТ (81дта СЬет. Сс., 8ΐ. Εοω^ Миссури, США).
Специфичность связывания антител согласно настоящему изобретению можно также определять путем мониторинга связывания с клетками, экспрессирующими белок мезотелин, например, путем поточной цитометрии. Можно использовать клетки или линии клеток, которые в природе экспрессируют белок мезотелин, такие как клетки 0УСАКЗ, N0-4226, СЕРАС-1 или ΚΒ, или линии клеток, такие как клетки СНО, которые можно трансфецировать вектором экспрессии, кодирующим мезотелин, что обеспечит экспрессию мезотелина на поверхность клетки. Тренсфецированный белок может содержать метку, такую как метка тус или метка Ык, предпочтительно на №конце, для детектирования с использованием антитела к данной метке. Связывание антитела согласно настоящему изобретению с белком мезотелином может быть определено путем инкубирования трансфецированных клеток с антителом и детектирования связанного антитела. Связывание антитела с меткой на трансфецированном белке можно использовать в качестве положительного контроля.
- 28 018396
Биспецифичные молекулы.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены биспецифичные молекулы, включающие антитело к мезотелину или фрагмент такого антитела согласно настоящему изобретению, соединенное с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком, таким как другое антитело, миметик связывания или лиганд к рецептору, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или целевыми молекулами. Антитела согласно настоящему изобретению фактически могут быть связаны с более чем одной другими функциональными молекулами, в результате чего получают мультиспецифичные молекулы, которые связываются с больше чем двумя сайтами связывания и/или целевыми молекулами. Предполагается, что такие мультиспецифичные молекулы охватывает термин биспецифичные молекулы, используемый в настоящем описании. Связывание может быть осуществлено посредством химической связи, генетического слияния, нековалентной ассоциации или другими средствами.
Соответственно настоящее изобретение охватывает биспецифичные молекулы, имеющее по меньшей мере одну первую специфичность связывания к мезотелину и вторую специфичность связывания ко второму целевому эпитопу. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй целевой эпитоп представляет собой Ес-рецептор, например ЕсуЕ1 человека (СО64) или рецептор Еса человека (СО89). Соответственно настоящее изобретение включает биспецифичные молекулы, способные связываться с эффекторными клетками, экспрессирующими ЕсуЕ или ЕсаЕ (например, моноцитами, макрофагами или полиморфноядерными клетками (ПЯК, ΡΜΝ)), и обеспечивать нацеливание на клетки, экспрессирующие мезотелин. Такие биспецифичные молекулы нацеливают клетки, экспрессирующие мезотелин, на эффекторные клетки и запускают опосредуемую рецептором Ес активность эффекторных клеток, такую как фагоцитоз клеток, экспрессирующих мезотелин, АЗКЦ, высвобождение цитокинов или выработку супероксид-аниона.
В случае, когда биспецифичная молекула является мультиспецифичной, указанная молекула может дополнительно обладать третьей специфичностью (т.е. включать третий элемент, определяющий специфичность), в дополнение к специфичности связывания в отношении Ес и специфичности связывания в отношении мезотелина. В одном варианте реализации третья специфичность связывания направлена против фактора активации (ЕЕ), часть, например, молекулы, которая связывается с белком поверхности, участвующим в цитотоксической активности, что обеспечивает усиление иммунного ответа в отношении клетки-мишени. Направленная к фактору активации часть может представлять собой антитело, функциональный фрагмент антитела или лиганд, который связывается с определенной молекулой, например антигеном или рецептором, что приводит к усилению эффекта детерминант связывания рецептора Ес или антигена клетки-мишени. Направленная к фактору активации часть обладает способностью связывать рецептор Ес или какой-либо антиген клетки-мишени. В качестве альтернативы направленная к фактору активации часть возможно обладает способностью связывать молекулу, которая отличается от молекулы, к которой направлены первая и вторая специфичности связывания. Например, направленная к фактору активации часть возможно связывается с цитотоксической Т-клеткой (например, через СЭ2, СЭ3. СЭ8, СО28, СЭ4, СЭ40, 1САМ-1) или другой клеткой иммунной системы, что обеспечивает усиление иммунного ответа в отношении клетки-мишени).
В одном варианте осуществления биспецифичные молекулы согласно настоящему изобретению включают в качестве части, отвечающей за специфичность, по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, включая, например, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Еу, Еб, бАЬ или одноцепочечный Еу. Антитело также может представлять собой димер легкой или тяжелой цепи или любой минимальный фрагмент антитела, такой как Еу или одноцепочечный конструкт, описанный в патенте США 4946778 (Ьабиег с! а1.), содержание которого прямо включено в настоящее описание посредством ссылки.
В одном варианте осуществления специфичность связывания в отношении рецептора Есу обеспечивает моноклональное антитело, связывание которого не блокирует иммуноглобулин С (1дС) человека. В настоящем описании термин рецептор 1дС относится к любому из восьми генов у-цепи, расположенному в хромосоме 1. Указанные гены вместе кодируют двенадцать изоформ трансмембранного или растворимого рецептора, которые делятся на три класса рецепторов Есу: ЕсуЕ1 (СЭ64), ЕсуЕН (СЭ32) и ЕсуЕШ (СЭ16). В одном предпочтительном варианте осуществления рецептор Есу представляет собой высокоаффинный рецептор ЕсуЕ1 человека. ЕсуЕ1 человека представляет собой молекулу массой 72 кДа, которая демонстрирует высокую аффинность в отношении мономерного 1дС (108-109 М-1).
Получение и исследование некоторых предпочтительных анти-Есу моноклональных антител описаны в публикации КО 88/00052 и патенте США 4954617 (Еаидег е! а1.), которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Указанные антитела связываются с некоторым эпитопом ЕсуЕ1, ЕсуЕ11 или ЕсуЕШ в сайте, который отличается от сайта связывания Есу рецептора, и, таким образом, их связывание, по существу, не блокируется физиологическими уровнями 1дС. Специфичные антиЕсуЕ1 антитела, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой тАЬ 22, тАЬ 32, тАЬ 44, тАЬ 62 и тАЬ 197. Гибридома, продуцирующая тАЬ 32, доступна в Американской коллекции типовых культур, АТСС, № доступа НВ9469. В других вариантах осуществления
- 29 018396 антитело к рецептору Есу получают путем гуманизации из моноклонального антитела 22 (Н22). Получение и исследование антитела Н22 описано в Сп-Шапо, К.Е. е! а1. (1995) 1. Iттиηο1, 155 (10): 4996-5002 и А0 94/10332 (ТетреЧ е! а1.). Линия клеток, продуцирующих Н22, депонирована в Американской коллекции типовых культур, обозначена ΗΑ022ί.Έ1 и имеет номер доступа СКЬ 11177.
В других предпочтительных вариантах осуществления специфичность связывания в отношении рецептора Ес обеспечена антителом, которое связывает рецептор ΙβΑ человека, например рецептор Есальфа (ЕсаК (СЭ89)), связывание с которым в предпочтительном случае не блокируется иммуноглобулином Α (Ι§Α). Предполагается, что термин рецептор Ι§Α включает продукт одного α-гена (ЕсаШ), расположенного в хромосоме 19. Известно, что данный ген кодирует несколько образующихся в результате альтернативного сплайсинга изформ, имеющих массу от 55 до 110 кДа. ЕсаШ (СЭ89) конститутивно экспрессируется в моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не в популяциях клеток, не являющихся эффекторами. ЕсаК! обладает средней аффинностью (« 5х107 М-1) в отношении как Ι§Α1 так и Ι§Α2, причем аффинность повышается после воздействия цитокинов, таких как С-С8Е или СМ-С8Е (Мойоп, Н.С. е! а1. (1996) Сгйюа1 Кет1е\\ъ ш Iттиηο1οду, 16:423-440).
Были описаны четыре ЕсаШ-специфичных моноклональных антитела, обозначенных Α3, А59, А62 и А77, которые связывают ЕсаК! за пределами области связывания лиганда ΙβΑ (Мойе1го, К.С. е! а1. (1992) I. ^типок, 148:1764).
ЕсаК! и ЕсуК представляют собой предпочтительные триггерные рецепторы для использования в биспецифичных молекулах согласно настоящему изобретению, поскольку они:
(1) экспрессируются в основном эффекторными иммунными клетками, например моноцитами, ПЯК, макрофагами и дендритными клетками;
(2) уровни их экспрессии высоки (например, 5000-100000 на клетку);
(3) являются медиаторами цитотоксической активности (например, АЗКЦ, фагоцитоза) и (4) участвуют в активизации презентации антигенов, включая собственные антигены, к которым они направлены.
Хотя предпочтительными являются антитела человека, в биспецифичных молекулах согласно настоящему изобретению можно также применять другие антитела, такие как антитела мыши, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.
Биспецифичные молекулы согласно настоящему изобретению могут быть получены путем конъюгирования элементов, определяющих специфичность связывания, например специфичность связывания в отношении ЕсК и мезотелина, с использованием известных в данной области методов. Например, каждый определяющий специфичность элемент биспецифичной молекулы может быть получен отдельно, а затем осуществляют их конъюгирование друг с другом. В случае, когда элементы, определяющие специфичность, представляют собой белки или пептиды, для ковалентного конъюгирования можно использовать разнообразные поперечно сшивающие агенты. Примеры поперечно сшивающих агентов включают белок А, карбодиимид, №сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (8ΑΤΑ), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту) (^ΤNВ), о-фенилендималеимид (οΡ^М), №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ) и сульфосукцинимидил 4-(№малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-8МСС) (см., например, Κ^^νδ^ е! а1. (1984) I. Ехр. Мей., 160:1686; Ьш, МА е! а1. (1985) ΡΐΌα №111. Αсай. 8сг υδΑ, 82:8648). Другие методы включают методы, описанные у Ριιι1ιι5 (1985) Вейппд Ιπδ. МШ., №. 78, 118-132; Вгеппап е! а1. (1985) 8с1епсе 229:81-83 и С1епте е! а1. (1987) I. Iттиηο1., 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются 8ΑΤΑ и сульфо-8МСС, каждый из которых можно приобрести в Ρ^е^се Сйетка1 Со. (КоскГогй, Иллинойс, США).
В случае, когда элементы, обуславливающие специфичность, представляют собой антитела, их можно конъюгировать посредством образования сульфогидрильных связей на С-конце шарнирной области двух тяжелых цепей. В особенно предпочтительном варианте осуществления шарнирную область перед конъюгированием модифицируют таким образом, чтобы она содержала нечетное число сульфгидрильных остатков.
В качестве альтернативы оба элемента, обуславливающих специфичность, могут быть закодированы в одном векторе и экспрессированы и объединены в одной клетке-хозяине. Этот способ особенно полезен в случае, когда биспецифичная молекула представляет собой слитый белок тΑЬхтΑЬ, тΑЬxЕаЬ, ЕаЬхЕ(аЬ')2 или лигандхЕаЬ. Биспецифичная молекула согласно настоящему изобретению может представлять собой одноцепочечную молекулу, включающую одно одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечную молекулу, включающую две детерминанты связывания. Биспецифичные молекулы могут включать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифичных молекул описаны, например, в патентах США 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.
Связывание биспецифичных молекул со своими специфичными мишенями может быть подтверждено, например, методом ИФА (ΕΕΙ8Α), радиоиммуноанализа (ΜΑ), анализа методом ЕΑС8 (сортировка клеток по индуцированной флюоресценции), или в биоанализе (например, ингибирование роста),
- 30 018396 или анализа методом вестерн-блот. Каждый из указанных способов анализа позволяет детектировать присутствие представляющих интерес комплексов белок-антитело с применением меченого реагента (например, антитела), специфичного к указанному представляющему интерес комплексу. Например, комплексы ЕсН-антитело можно детектировать с использованием, например, связанного с ферментом антитела или антитела, которое распознает комплексы антитело-ЕсН и специфично связывается с ними. В качестве альтернативы комплексы можно детектировать с использованием других разнообразных иммуноанализов. Например, антитело можно снабдить радиоактивной меткой и использовать в радиоиммуноанализе (Н1А) (см., например, УетЧгаиЬ, В., Рппс1р1е5 оГ Найюиптипоаззауз. Седьмой обучающий курс по методикам анализа с применением радиолигандов// Общество Эндокринологов, март 1986, который включен в настоящее описание посредством ссылки). Радиоактивный изотоп можно детектировать такими средствами, как, например, с использованием γ-счетчика или счетчика сцинцилляции или путем ауторадиографии.
Конъюгаты.
В другом аспекте предложены конъюгаты антитела и молекулы-партнера, в которых молекулапартнер присоединена к антителу согласно настоящему изобретению химическим линкером (который в настоящем описании иногда называется просто линкер). Молекула-пертнер может представлять собой терапевтический агент или маркер. Терапевтический агент может представлять собой, например, цитотоксин, нецитотоксическое лекарственное средство (например, иммунодепрессант), радиоактивный агент, другое антитело или фермент. В предпочтительном случае молекула-партнер представляет собой цитотоксин. Маркер может представлять собой любую метку, которая порождает детектируемый сигнал, такую как радиометка, флюоресцентная метка или фермент, который катализирует детектируемое изменение субстрата. Антитело выполняет функцию нацеливания путем связывания целевой ткани или клетки, содержащей соответствующий антиген, антитело направляет конъюгат к целевой ткани или клетке. Там линкер расщепляется, что приводит к высвобождению молекулы-партнера и обеспечивает реализацию ее желаемой биологической функции. В некоторых примерах конъюгат интернализуется внутрь целевой клетки и расщепление происходит внутри.
Линкеры.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкер является пептидильным линкером, обозначенным в настоящей заявке как (Ь4)р-Е-(Ь1)т. Другие линкеры включают гидразиновые и дисульфидные линкеры, обозначенные в настоящей заявке как (Ε Ι)Ρ,-Η-(ΕΙ)Μ и (Ь4)р-Ч-(Ь1)т соответственно. Е, Н, и Ч обозначают пептидильную, гидразиновую и дисульфидную группы соответственно, которую можно разрезать с высвобождением молекулы-партнера из конъюгата с антителом, а Ь1 и Ь4 представляют собой линкерные группы. Е, Η, Ч, Ь1 и Ь4 более полно определены в настоящей заявке далее, вместе с переменными р и т. Получение и использование этих и других линкеров описано в патенте УО 2005/112919, содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Использование пептидильных и других линкеров для конъюгатов типа антитело-партнер описано в патентах США 2006/0004081; 2006/0024З17; 2006/0247295; 6989452; 7087600 и 7129261; УО 2007/051081; 2007/0З8658; 2007/059404 и 2007/089100; содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Дополнительные линкеры описаны в патентах И8 6214З45; 200З/009674З, 200З/01З0189 и статьях йе ОгооЧ еЧ а1., Ч. Мей. СЬет., 42, 5277 (1999); йе ОгооЧ еЧ а1. Ч. Огд. СЬет., 4З, З09З (2000); йе ОгооЧ еЧ а1., Ч. Мей. СЬет., 66, 8815, (2001); УО 02/08З180; Саг1 еЧ а1., Ч. Мей. СЬет. ЬеЧЧ., 24, 479, (1981); ЭиЬомсЧик еЧ а1., Вюогд & Мей. СЬет. ЬеЧЧ., 8, ЗЗ47 (1998), содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В дополнение к соединению антитела и молекулы-партнера линкер может придавать стабильность молекуле партнера, уменьшать ее токсичность ίη νί\Ό или иным способом благотворно влиять на фармакокинетику, биологическую доступность и/или фармакодинамику. Обычно предпочтительным является, чтобы линкер расщеплялся, высвобождая молекулу-партнера, после доставки конъюгата к месту его действия. Также предпочтительно линкеры не оставляют следов, т.е. после удаления из молекулы-партнера (например, в течение активации) не остается никаких следов присутствия линкера.
В другом варианте осуществления линкеры характеризуются способностью расщепляться на месте или около клетки-мишени, например, в месте терапевтического действия или маркерной активности молекулы-партнера. Такое расщепление по своей природе может быть ферментативным. Эта особенность полезна для снижения системной активации молекулы-партнера, снижения токсичности и системных побочных эффектов. Предпочтительные расщепляемые группы для ферментативного расщепления включают пептидные связи, сложноэфирные связи и дисульфидные связи, такие как вышеупомянутые группы Е, Н, и Ч. В других вариантах осуществления линкеры чувствительны к рН и расщепляются вследствие изменения рН.
Важным аспектом является способность контролировать скорость, с которой расщепляются линкеры. Часто желательным является быстро расщепляемый линкер. Однако в некоторых вариантах осуществления может быть предпочтительным линкер, который расщепляется более медленно. Например, в форме замедленного высвобождения или в форме как для быстрого высвобождения, так и для замедлен
- З1 018396 ного высвобождения компонента, может оказаться полезным линкер, который расщепляется более медленно. В указанной выше публикации ЭД0 2005/112919 раскрыты гидразиновые линкеры, которые можно создать для расщепления в диапазоне скоростей, от очень быстрой до очень медленной.
Линкеры могут также служить для защиты молекулы-партнера от разрушения при циркуляции конъюгата в кровотоке, то есть до достижения им ткани или клетки-мишени. Эта особенность обеспечивает значимую пользу, поскольку увеличивает период полураспада молекулы-партнера в кровотоке. Линкер служит для подавления активности молекулы-партнера, таким образом, что конъюгат сравнительно безопасен в кровотоке, но молекула-партнер оказывает желаемое действие, например цитотоксическое, после активации в желаемом месте действия. В случае конъюгата с терапевтическим агентом эта особенность линкера служит для улучшения терапевтического индекса агента.
В дополнение к расщепляемым пептидным, гидразиновым или дисульфидным группам Е, Н или 1 соответственно между молекулой-партнером и Е, Н или 1 можно вводить одну или более линкерную группу Ь1. Эта линкерная часть Ь1 может также быть названа спейсером, она содержит по меньшей мере две функциональные группы. В зависимости от величины коэффициента т (т.е. числа присутствующих Ь1 групп) и положения конкретной группы Ь1, химическая функциональная группа спейсера Ь1 может связываться с химической функциональной группой молекулы-партнера, Е, Н или 1, в зависимости от обстоятельств, или группой другого линкера Ь1 (если присутствует более одного Ь1. Примеры пригодных химических функциональных групп для спейсеров Ь1 включают гидрокси-, меркапто-, карбонил-, карбокси-, амино-, кето- и альдегидные группы.
Линкеры Ь1 могут представлять собой алкил с заместителями или без заместителей, арил с заместителями или без заместителей, гетероарил с заместителями или без заместителей или гетероалкил с заместителями или без заместителей. В одном варианте осуществления алкильная или арильная группы могут включать от 1 до 20 атомов углерода. Они могут также включать фрагмент полиэтиленгликоля.
Примеры групп Ь1 включают, например, 6-аминогексанол, 6-меркаптогексанол, 10гидроксидекановую кислоту, глицин и другие аминокислоты, 1,6-гександиол, β-аланин, 2-аминоэтанол, цистамин (2-аминоэтантиол), 5-аминорепентановую кислоту, 6-аминогексановую кислоту, 3малеимидобензойную кислоту, фталид, α-замещенные фталиды, карбонильную группу, аминоэфиры, нуклеиновые кислоты, пептиды и т.п.
Одна из функций группы Ь1 состоит в обеспечении пространственного разделения между Е, Н или 1 в зависимости от обстоятельств, и молекулы-партнера, если последний создает помехи (например, за счет стерических или электронных эффектов) для химического отщепления Е, Н или 1. Группа Ь1 также может служить для введения в конъюгат дополнительной молекулярной массы и химической функциональности. Обычно дополнительная масса и функциональность влияют на период полураспада в сыворотке и другие свойства конъюгата. Таким образом, при аккуратном выборе спейсерных групп можно получать конъюгаты с диапазоном периода полураспада в сыворотке. Один или более линкер Ь1 возможно может быть саморазрушающейся группой, которая описана далее в настоящей заявке.
Коэффициент т является целым числом, выбранным из 0-6. Когда присутствуют многочисленные группы Ь1, они могут быть одинаковыми или разными.
Ь4 представляет собой линкер, который обеспечивает пространственное разделение между Е, Н или 1, в зависимости от обстоятельств, и антителом, если Е, Н или 1 препятствуют связыванию антитела с антигеном, или антитело препятствует химическому расщеплению Е, Н или 1. Предпочтительно Ь4 придает повышенную растворимость или уменьшает свойства агрегации у конъюгатов, использующих линкер, который содержит эту субъединицу, или модифицирует скорость гидролиза конъюгата. Как и в случае Ь1, Ь4 возможно может быть саморазрушающейся группой. В одном варианте осуществления линкер Ь4 представляет собой алкил с заместителями, алкил без заместителей, арил с заместителями, арил без заместителей, гетероалкил с заместителями или гетероалкил без заместителей, любой из которых может быть линейным, разветвленным или циклическим. Заместителем может быть, например, низший алкил (С1-С6), алкокси, тиоалкил, алкиламин или диалкиламин. В определенных вариантах осуществления Ь4 включает не циклическую группу. В другом варианте осуществления Ь4 включает положительно или 4 отрицательно заряженный полимер из аминокислот, такой как полилизин или полиаргинин. Ь может включать в себя полимер, такой как полиэтиленгликоль. В дополнение линкер Ь4 может включать в себя, например, как компонент полимера, так и небольшую его молекулу.
В предпочтительном варианте осуществления Ь4 включает субъединицу полиэтиленгликоля (ПЭГ). Полиэтиленгликолевая часть линкера Ь4 может иметь в длину от 1 до 50 единиц. Предпочтительно ПЭГ будет иметь 1-12 повторяющихся единиц, более предпочтительно 3-12 повторяющихся единиц, более предпочтительно 2-6 повторяющихся единиц или еще более предпочтительно 3-5 повторяющихся единиц и наиболее предпочтительно 4 повторяющиеся единицы. Линкер Ь4 может состоять исключительно из ПЭГ или он может также содержать дополнительный алкил или гетероалкил с заместителями или без заместителей. Применение ПЭГ в виде части линкера Ь4 полезно для повышения растворимости комплекса в воде. Кроме того, ПЭГ уменьшает степень агрегации, которая может произойти в процессе соединения лекарственной молекулы и антитела.
- 32 018396
Коэффициент р равен 0 или 1; т.е. присутствие Ь4 является возможным, но не обязательным. В случае присутствия Ь4 имеет по меньшей мере две функциональные группы; с одной функциональной группой связывается функциональная группа компонента Е, Н, или I в зависимости от обстоятельств и другая функциональная группа связывается с антителом. Примеры пригодных химических функциональных групп Ь4 включают гидрокси-, карбонил-, карбокси-, амино-, кето-, альдегидо- и меркаптогруппы. Так, антитела обычно присоединяют при помощи сульфгидрильной группы (например, из неокисленных остатков цистеина, добавленных с помощью иминотиолана на остатки лизина радикалов, содержащих сульфогидрильную группу, или восстановленных дисульфидных мостиков), аминогруппы (например, из остатков лизина), альдегидной группы (например, из окисленных боковых цепей гликозидов), или гидроксильной группы (например, из остатков серина). Предпочтительные химические функциональные группы для присоединения к антителу реакционноспособны с предыдущими группами, примерами которых являются малеимидные, сульфгидрильные, альдегидные, гидразиновые, семикарбазидные и карбоксильные группы. Предпочтительной является комбинация сульфгидрильной группы в антителе и малеимидной группы на Ь4.
В некоторых вариантах осуществления Ь4 включает
Н, алкила с заместителями или без заместителей, гетероалкила с заместителями или без заместителей и ацила. Каждый радикал Я25, Я25, Я26 и Я26 независимо выбирают из Н, алкила с заместителями или без заместителей, гетероалкила с заместителями или без заместителей, арила с заместителями или без заместителей, гетероарила с заместителями или без заместителей и гетероциклоалкила с заместителями или без заместителей; 8 и ! представляют собой независимые целые числа от 1 до 6. Предпочтительно Я20, Я25, Я25, Я26 и Я26 являются гидрофобными. В некоторых вариантах осуществления Я20 представляет собой Н или алкил (предпочтительно низший алкил без заместителей). В некоторых вариантах осуществления Я , Я , Я и Я представляют собой независимо Н или алкил (предпочтительно С1-С4-алкил без заместителей). В некоторых вариантах осуществления Я25, Я25, Я26 и Я26 все представляют собой Н. В некоторых вариантах осуществления ! равно 1 и 8 равно 1 или 2.
Пептидные линкеры (Е).
Как обсуждалось ранее, пептидильные линкеры согласно настоящему изобретению могут быть представлены общей формулой (Ь4)р-Е- (Ь1)т, в которой Е представляет часть, включающую пептидильный фрагмент. В одном варианте осуществления часть Е, возможно, включает дополнительный саморазрушающийся линкер Ь2 и карбонильную группу, соответствующую конъюгату формулы (а) хМ14НЛЛ'^^1,Ь
В данном варианте осуществления Ь1, Ь4, р и т имеют определенные ранее значения. X4 представляет собой антитело и I) представляет собой молекулу партнер. Коэффициент о равен 0 или 1, Ь2, если он присутствует, представляет собой саморазрушающийся линкер. АА1 представляет собой одну или более природную аминокислоту и/или неприродную α-аминокислоту; с - целое число от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления с находится в диапазоне от 2 до 5 или с равно 2 или 3.
В формуле (а) АА1 связана своей концевой аминогруппой непосредственно с Ь4 либо, если Ь4 отсутствует, непосредственно с X4. В некоторых вариантах осуществления, если Ь4 присутствует, Ь4 не включает карбоксильную группу, непосредственно соединенную с Ν-концом (АА1)с.
В другом варианте осуществления часть Е включает аминогруппу и, возможно, спейсерные группы Ь3 и Ь1 отсутствуют (т.е. т равно 0), соответствуя конъюгату формулы (Ь)
X4—^-^АА1^—Ν—
В этом варианте осуществления X4, 1)_ Ь4, АА1, с и р имеют определенные ранее значения. Коэффициент о равен 0 или 1. Спейсер Ь3, если он присутствует, содержит первичный или вторичный амин или функциональную карбоксильную группу, либо амин Ь3 образует амидную связь со свободной функциональной карбоксильной группой I) или карбоксил Ь3 образует амидную связь со свободной функциональной аминогруппой Ώ.
- 33 018396
Саморазрушающиеся линкеры.
Саморазрушающийся линкер является бифункциональным химическим соединением, которое способно ковалентно связывать вместе два раздельных химических фрагмента в стабильную в обычных условиях молекулу из трех частей, высвобождающую один из указанных химических фрагментов посредством ферментативного расщепления. После ферментативного расщепления такой линкер спонтанно отщепляется от оставшейся молекулы с высвобождением других отдельных фрагментов. В соответствии с настоящим изобретением саморазрушающийся спейсер ковалентно связан одним концом с пептидным фрагментом, а другим концом ковалентно связан с химически реакционноспособным участком лекарственного фрагмента, дериватизация которого подавляет фармакологическую активность. При этом разделенные, но ковалентно связанные пептидный и лекарственный фрагменты образуют молекулу из трех частей. Такая молекула является стабильной и фармакологически неактивной в отсутствие ферментамишени, однако под действием такого фермента происходит расщепление указанной молекулы по связи, ковалентно соединяющей спейсер и пептидный фрагмент, тем самым вызывая высвобождение пептидного фрагмента из состоявшей из трех частей молекулы. Такое ферментативное расщепление, в свою очередь, приводит к активации саморазрушения спейсера и запускает спонтанное расщепление связи, ковалентно соединяющей спейсер и лекарственный фрагмент, тем самым вызывая высвобождение лекарственного фрагмента субъединицы в фармакологически активной форме; см., например, Саг1 е! а1., 1. Меб. СЬет., 24 (3), 479-480 (1981); Саг1 е! а1., \0 81/01145 (1981); Ток1 е! а1., I. 0гд. СЬет., 67, 1866-1872 (2002); Воуб е! а1., \0 2005/112919 и Воуб е! а1., публикацию \0 2007/038658, содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Один конкретный предпочтительный саморазрушающийся спейсер может быть представлен формулой (с)
к24
Ароматическое кольцо аминобензильной группы можно заменить на одну или более групп К. Группа К является заместителем в ароматическом кольце, который заменяет водород, то есть связан с одним из четырех не имеющих заместителей атомов углерода, которые являются частью структуры кольца. Группа К может быть одиночным атомом, например галогеном, или может быть группой из многих атомов, такой как алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галогеналкил и цианогруппа. Каждый радикал К независимо выбирают из группы, состоящей из алкила с заместителями, алкила без заместителей, гетероалкила с заместителями, гетероалкила без заместителей, арила с заместителями, арила без заместителей, гетероарила с заместителями, гетероарила без заместителей, гетероциклоалкила с заместителями, гетероциклоалкила без заместителей, галогена, N0^ NК К , NК С0К , 21 22 21 21 21 22
0С0NК К , 0С0К и 0К , где К и К независимо выбирают из группы, состоящей из Н, алкила с заместителями, алкила без заместителей, гетероалкила с заместителями, гетероалкила без заместителей, арила с заместителями, арила без заместителей, гетероарила с заместителями, гетероарила без заместителей, гетероциклоалкила с заместителями и гетероциклоалкила без заместителей. Примеры заместителей К включают, но не ограничиваются: Р, С1, Вг, Ι, N0^ ОН, ОСН3, N11С0С1 Г, ^СН3)2, NНС0СР3 и метил. Для КД ΐ является целым числом: 0, 1, 2, 3 или 4. В одном предпочтительном варианте осуществления ΐ равно 0.
Эфирный атом кислорода в показанной выше структуре связан с карбонильной группой. Линия от функциональной группы NК24 к ароматическому кольцу показывает, что функциональная аминогруппа может быть связана с любым из пяти атомов углерода, которые образуют кольцо и не имеют заместителя -СН2-0- группы. Предпочтительно функциональная группа X NК24 ковалентно связана с ароматическим кольцом в пара-положении относительно группы -СН2-0-. Радикал К24 выбирают из группы, состоящей из Н, алкила с заместителями, алкила без заместителей, гетероалкила с заместителями и гетероалкила без заместителей. В специфическом варианте осуществления К24 представляет собой водород.
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает пептидный линкер формулы (а), в котором Р включает структуру
где К24, АА1, К, Ι и с имеют определенные ранее значения.
В другом варианте осуществления пептидный линкер формулы (а) включает фрагмент -Р-(Р1)т-, который включает структуру
- 34 018396
где Я24, АА1, К, ι и с имеют определенные ранее значения.
В некоторых вариантах осуществления включен саморазрушающийся спейсер Ь1 или Ь2
где каждый Я17, Я18 и Я19 независимо выбирают из Н, алкила с заместителями или без заместителей, гетероалкила с заместителями или без заместителей и арила с заместителями или без заместителей, и \ν представляет собой целое число от 0 до 4. В некоторых вариантах осуществления Я17 и Я18 независимо представляют собой Н или алкил (предпочтительно С1-С4-алкил с заместителями или без заместителей). Предпочтительно Я17 и Я18 представляют собой С1-4 алкилы, такие как метил или этил. В некоторых вариантах осуществления \ν равно 0. Экспериментально обнаружено, что этот конкретный саморазрушающийся спейсер циклизуется сравнительно быстро.
В некоторых вариантах осуществления включаются Ь1 или Ь2
1*7 ί о ίη Л где Я , Я , Я , Я и К имеют определенные ранее значения.
Спейсерные группы.
Спейсерная группа Ь3 характеризуется тем, что она включает первичный или вторичный амин или функциональную карбоксильную группу либо аминогруппа Ь3 образует амидную связь со свободной карбоксильной функциональной группой Ό или карбоксильная группа Ь3 образует амидную связь со свободной функциональной аминогруппой Ό. Спейсер Ь3 можно выбрать из группы, состоящей из алкила с заместителями или без заместителей, гетероалкила с заместителями или без заместителей, арила с заместителями или без заместителей, гетероарила с заместителями или без заместителей или гетероциклоалкила с заместителями или без заместителей. В предпочтительном варианте осуществления Ь3 включает ароматическую группу. Более предпочтительно Ь3 включает группу бензойной кислоты, анилина или индола. Не ограничивающие примеры структур, которые могут служить в качестве -^3-NН-спейсера, включают следующие структуры:
ΗΝ^ нк
О где Ζ представляет собой элемент, выбранный из О, 8 и NЯ23, и где Я23 представляет собой элемент, выбранный из Н, алкила с заместителями или без заместителей, гетероалкила с заместителями или без заместителей и ацила.
После расщепления линкера в варианте осуществления настоящего изобретения, содержащего Ь3, группа Ь3 остается присоединенной к лекарственному соединению Ό. Соответственно группу Ь3 выбирают так, что присоединение ее к Ό не изменяет активность Ό значимым образом. В другом варианте осуществления часть самого функционального лекарственного соединения Ό служит спейсером Ь3. Например, в одном варианте осуществления лекарственное соединение Ό представляет собой производное дуокармицина, в котором часть лекарственного соединения функционирует в качестве спейсера Ь3. Не ограничивающие примеры таких воплощений включают такие, где Κ^-φ^-ϋ имеет структуру, выбран- 35 018396
без заместителей, гетероалкил с заместителями или без заместителей или ацил; группа ИН2 в каждой структуре реагирует с (АА1)с, образуя -(АА^-ИН-.
Последовательность пептида (АА1)с.
Группа АА1 представляет собой одиночную аминокислоту или несколько аминокислот, которые соединены вместе амидными связями. Аминокислоты могут быть природными аминокислотами и/или не природными α-аминокислотами. Они могут быть в Б- или Ό-конфигурации. В одном варианте осуществления используют по меньшей мере три разные аминокислоты. В другом варианте осуществления используют только две аминокислоты.
Термин аминокислоты относится к аминокислотам природного и синтетического происхождения, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют подобно аминокислотам природного происхождения. Аминокислотами природного происхождения являются те, что закодированы в генетическом коде, а также те аминокислоты, которые позднее подвергаются модификации, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, цитрулин и О-фософосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют ту же базовую химическую структуру, как и аминокислоты природного происхождения, т.е. α атом углерода, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой Я, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоновая кислота. Такие аналоги имеют модифицированные Я группы (например, норлейцин) или модифицированный пептидный остов, но сохраняют ту же базовую химическую структуру, что и аминокислоты природного происхождения. Одной аминокислотой, которую можно таким образом использовать, является цитруллин, который служит предшественником аргинина и участвует в образовании мочевины в печени. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислот, но по функции подобны аминокислотам природного происхождения. Термин неприродные аминокислоты включает стереохимические Ό формы двадцати аминокислот природного происхождения, описанных ранее. Понятно, что термин неприродная аминокислота включает гомологи природных аминокислот и искусственно модифицированные формы природных аминокислот. Искусственно модифицированные формы включают, но не ограничиваются, аминокислоты, имеющие алкильные цепи, укороченные или удлиненные вплоть до двух атомов углерода, аминокислоты, включающие дополнительные заместители арильные группы, и аминокислоты, включающие галогенсодержащие группы, предпочтительно галогенизированные алкильные и арильные группы. Будучи связаны с линкером или конъюгатом согласно настоящему изобретению аминокислота находится в форме боковой цепи аминокислоты, где карбоксильная группа аминокислоты заменена на кетогруппу (С(О)). Таким образом, например, боковая цепь аланина представляет собой -С(О)-СН(ИН2) -СН3 и т.д.
Последовательность пептида (АА1)с представляет собой переведенный в функционально амидную форму остаток одной аминокислоты (когда с=1) или множество аминокислот, соединенных вместе амидными связями. Последовательность пептида (АА1)с предпочтительно выбирают для катализируемого ферментом расщепления в интересующем положении в биологической системе. Например, для конъюгатов, которые нацелены на клетки, но не интернализуются внутри них, выбирают пептид, который будет расщепляться протеазами внеклеточного матрикса, например протеазами, вышедшими из соседних уми
- 36 018396 рающих клеток или связанными с опухолями протеазами, таким образом, что пептид расщепляется вне клетки. Для конъюгатов, предназначенных для попадания внутрь клетки, последовательность (АА1)с предпочтительно выбирают для расщепления протеазами эндосом или лизосом. Количество аминокислот в пептиде может колебаться от 1 до 20; но более предпочтительно (АА1)с включает 1-8 аминокислот, 1-6 аминокислот или 1-3 или 4 аминокислоты.
Последовательности пептида, которые подвергаются расщеплению специфическими ферментами или классами ферментов, хорошо известны в данной области техники.
Предпочтительно (ΑΑ1)0 содержит последовательность аминокислот (последовательность узнавания для расщепления), которая представляет собой сайт расщепления для протеаз. В данной области техники известны многие расщепляемые протеазами последовательности; см., например, Ма!ауозЫ е! а1. 8с1епсе, 247: 954 (1990); 1)ипп е! а1. Ме!й. Еп/уто1., 241: 254 (1994); 8е1бай е! а1. Ме!й. Еп/уто1., 244: 175 (1994); ТйогпЬеггу, Ме!й. Еп/уто1., 244: 615 (1994); ^еЬег е! а1. Ме!й. Еп/уто1., 244: 595 (1994); 8тйй е! а1. Ме!й. Еп/уто1., 244: 412 (1994); Воиу1ег е! а1. Ме!й. Еп/уто1., 248: 614 (1995), Нагбу е! а1., в Αту1о^б Ρ^о!е^п Ρι^υτδΘΓ т Эеуе1ортеп!, Αβΐ^, апб Α1ζйе^те^'8 Эхзеазе, еб. Маз!егз е! а1., р. 190-198 (1994).
В последовательность пептида (АА1)с выбирают на основании его способности расщепляться протеазами лизосом, не ограничивающие примеры которых включают катепсины В, С, Ό, Н, 1, и 8. Предпочтительно последовательность пептида (АА1)с способна к расщеплению при помощи катепсина В т уйго.
В другом варианте осуществления последовательность пептида (АА1)с выбирают на основании ее способности расщепляться протеазами, связанными с опухолями, такими как обнаруживаемые вне клеток вокруг клеток опухоли протеазы, примеры которых включают олигопептидазу тимет (ТОР) и СЭ10. В других вариантах осуществления последовательность (АА1)с разрабатывают для избирательного расщепления урокиназой или триптазой.
Пригодные, но не ограничивающие примеры последовательностей пептидов, подходящих для использования в конъюгатах настоящего изобретения, включают Вал-Цит, Цит-Цит, Вал-Лиз, Фен-Лиз, Лиз-Лиз, Ала-Лиз, Фен-Цит, Лей-Цит, Иле-Цит, Трп, Цит, Фен-Ала, Фен-^-тозил-Арг, Фен-^-нитроАрг, Фен-Фен-Лиз, Ό-Фен-Фен-Лиз, Гли-Фен-Лиз, Лей-Ала-Лей, Иле-Ала-Лей, Вал-Ала-Вал, Ала-ЛейАла-Лей (8Е0 ΙΌ N0: 40), β-Ала-Лей-Ала-Лей (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 41) и Гли-Фен-Лей-Гли (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 42) Вал-Ала, Лей-Лей-Гли-Лей (8Е^ ΙΌ N0: 43), Лей-Асн-Ала и Лиз-Лей-Вал. Предпочтительные последовательности пептидов представляют собой Вал-Цит и Вал-Лиз.
В другом варианте осуществления расположенную ближе всего к лекарственной субъединице аминокислоту выбирают из группы, состоящей из Ала, Асн, Асп, Цит, Цис, Глн, Глу, Гли, Иле, Лей, Лиз, Мет, Фен, Про, Сер, Тре, Трп, Тир и Вал. В еще одном варианте осуществления расположенную ближе всего к лекарственной субъединице аминокислоту выбирают из группы, состоящей из Ала, Асн, Асп, Цис, Глн, Глу, Гли, Иле, Лей, Мет, Фен, Про, Сер, Тре, Трп, Тир и Вал.
Специалист в данной области легко может оценить массив последовательностей пептидов и определить их применимость в настоящем изобретении без перехода к непосредственному экспериментированию; см., например, /пптегтат М., е! а1., (1977) Αпа1у!^са1 Вюсйетй!гу, 78:47-51; Ьее, Ό., е! а1., (1999) Вюогдатс апб Меб1ста1 СЬепйкХгу Ье!!егз, 9:1667-72 и Иапо, Τ.Α., е! а1. (1997) СЪепйкХгу апб Вю1о§у, 4:149-55. Конъюгаты согласно настоящему изобретению возможно содержат два или более линкеров. Указанные линкеры могут быть одинаковыми или разными. Например, пептидильный линкер можно использовать для присоединения лекарственного средства к лиганду, а второй пептидильный линкер может присоединять к комплексу диагностический агент. Другие варианты использования дополнительных линкеров включают связывание с комплексом антитело-партнер аналитических агентов, биомоле кул, нацеливающих агентов и детектируемых меток.
Гидразиновые линкеры (Н).
В другом варианте осуществления конъюгат согласно настоящему изобретению включает гидразиновый саморазрушающийся линкер, причем конъюгат имеет структуру
X4----(1.4)р-н-(1_1)т—ϋ где О, Ь1, Ь4, р, т, и X4 такие, как определено ранее и описано далее, и Н представляет собой лин кер, включающий структуру
С(К24)3
где щ представляет собой целое чисто от 1 до 10, 0, 1 п2 или 2; каждый Κ24 является членом, независимо выбранным из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила, и Ι является либо связью (например, связью между атомом углерода главной цепи и соседним атомом азота) или
- 37 018396
где п3 - это 0 или 1, при условии, что когда п3 равно 0, п3 не равно 0; а п4 равно 1, 2 или 3.
В одном варианте осуществления замещение в фениловом кольце является п-замещением. В предпочтительных вариантах осуществления щ равно 2, 3 или 4 или щ равно 3. В предпочтительных вариантах осуществления п2 равно 1. В предпочтительных вариантах осуществления I является связью (например, связью между атомом углерода главной цепи и соседним атомом азота). В одном аспекте гирдазиновый линкер Н после расщепления может образовывать 6-члеииый саморазрушающийся линкер, например, когда п3 равно 0 и п4 равно 2. В другом аспекте гирдазиновый линкер Н после расщепления может образовывать 5-членный саморазрушающийся линкер. И уже в других аспектах Н образует 5членный саморазрушающийся линкер, Н образует 7-членный саморазрушающийся линкер или Н образует 5-члеииый саморазрушающийся линкер и 6-члеииый саморазрушающийся линкер после расщепления. От скорости расщепления зависит размер кольца, сформированного после расщепления. Таким образом, в зависимости от нужной скорости расщепления можно выбрать кольцо подходящего размера для формирования после расщепления.
стоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила. Эта гидразиновая структура может также формировать пяти-, шести- или семичленные кольца, и дополнительные компоненты могут быть добавлены с получением множественных колец.
Приготовление, химия расщепления и кинетика циклизации различных гидразиновых линкеров раскрыты в документе Ж) 2005/112919, описание которых включено в настоящий документ путем ссылки.
Дисульфидные линкеры (I).
В еще одном варианте осуществления линкер содержит ферментативно расщепляемую дисульфидную группу. В одном варианте изобретения изобретение предоставляет соединение цитотоксичного антитела-партнера, имеющее структуру согласно формуле (ά) где Ό, Ь1, Ь4, р, т, и X4 такие, как определено ранее и описано далее, и
I - дисульфидный линкер, включающий группу структуры
каждый К24 является элементом, независимо выбранным из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила, каждый К является элементом, независимо выбранным из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незаме щенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила, галогена, N0^ КК21К22, ЫК21С0К22, 0С0КК21К22, 0С0К21 и 0К21, где К21 и К22 независимо выбраны из группы, состоящей из Н, замещенного алкила, незамещенного алкила, замещенного гетероалкила и незамещенного гетероалкила, замещенного арила, незамещенного арила, замещенного гетероарила, незамещенного гетероарила, замещенного гетероциклоалкила, незамещенного гетероциклоалкила; ΐ - целое число, равное 0-3 или 4; и ά целое число, равное 0-5 или 6.
Ароматическое кольцо дисульфидного линкера может быть замещено одной или несколькими группами К. Группа К является заместителем в ароматическом кольце, который заменяет атом водорода, иначе присоединенный к одному из четырех атомов углерода, являющихся частью кольца. Группа К может представлять собой единственный атом, такой как галоген, или быть многоатомной группой, такой как алкил, гетероалкил, амино, нитро, гидрокси, алкокси, галоалкил и циано. Типичные заместите
ли К независимо включают, но не ограничиваются перечисленными, Е, С1, Вг, I, ХО2, ОН, ОСН3, ХНСОСН3, Х(СН3)2, ХНСОСЕ3 и метил. Для К/' ΐ является целым числом, равным 1-3 или 4. В одном из вариантов осуществления ΐ равно 0.
В предпочтительном варианте осуществления линкер содержит ферментивно расщепляемую дисульфидную группу следующей формулы:
К где Е4, X4, р и К24 описаны выше, а б равно 0-5 или 6. В определенном варианте осуществления б равно 1 или 2.
Более конкретный пример дисульфидного линкера показан в следующей формуле:
Предпочтительно б равно 1 или 2, а каждая К представляет собой Н.
Другой пример дисульфидного линкера показан в следующей формуле:
Предпочтительно б равно 1 или 2, а каждая К представляет собой Н.
В различных вариантах осуществления дисульфиды являются орто к амину. В другом специфичном варианте осуществления а равно 0. В предпочтительных вариантах осуществления К24 независимо выбран из Н и СН3.
Приготовление и химия дисульфидных линкеров, таких как описаны выше, раскрыты в документе ШО 2005/112919, описание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Для дальнейшего обсуждения типов цитотоксинов, линкеров и других методов конъюгирования терапевтических агентов см. также И8 7087600; И8 6989452; И8 7129261; И8 2006/0004081; И8 2006/0247295; ШО 02/096910; ШО 2007/051081; ШО 2005/112919; ШО 2007/059404; ШО 2008/083312; заявку РСТ. РСТ/И82008/054362, 8аИо и др. (2003) Абу. Огид Пе11У. Кеу., 55:199-215; Тгай е! а1. (2003) Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!Еег., 52:328-337; Раупе. (2003) Сапсег Се11, 3:207-212; А11еп (2002) Ха!. Кеу. Сапсег 2:750-763; Рак!ап апб КгеЦтап (2002) Сигг. Орт. 1пуекбд. Эгидк, 3:1089-1091; 8еп!ег апб 8ргтдег (2001) Абу. Эгид ОеЕу. Кеу., 53:247-2 64. Каждый из перечисленных источников включен в настоящее описание посредством ссылки.
Цитотоксины в качестве молекулы-партнера.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено антитело, конъюгированное и молекулойпартнером, такой как цитотокин, лекарственное средство (например, иммунодепрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты также называются иммунотоксинами. Понятие цитотоксин или цитотоксичный агент включает любой агент, повреждающий (например, убивающий) клетки.
Примеры молекул-партнеров согласно настоящему изобретению включают таксон, цитохалазин В, грамицидин Ώ, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидрокси антрацин дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ώ, 1-дигидротестостерон, глюкокотрикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, их аналоги и гомологи. Примеры молекулы-партнера также включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-флюорорацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиопеа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В8ХИ) и ломустин (ССХИ), циклофосфамид, бусульфан, тубулизин, дибромоманнитол, стрептозотоцин, митомицин С, цисплатин, антрациклины (например, даунорубуцин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и противомитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Другие предпочтительные примеры молекул-партнеров, которые могут быть конъюгированы с антителами согласно настоящему изобретению, включают калихеамицин, майтанзины и ауристатины, и их производные.
Предпочтительные примеры молекул-партнеров являются аналогами и производными СС-165 и
- 39 018396 структурно родственных дуокармицинов, несмотря на его значительную и эффективную противоопухолевую активность. СС-1065 не может применяться для лечения людей, так как вызывает отложенную смерть подопытных животных, что обуславливает необходимость поиска аналогов или производных с лучшим терапевтическим индексом.
Многие аналоги и производные СС-1065 и дуокармицины известны в этой области. Было рассмотрено изучение структуры, синтез и свойства многих соединений; см., например, Водег и др., Ануем. Сйет. Ιηΐ. Еб. Еид1., 35: 1438 (1996) и Водег и др., Сйет. Кем, 97: 787 (1997). Другие сведения касательно аналогов или производных СС-1065 включают И8 5101038; И8 5641780; И8 5187186; И8 5070092; И8 5703080; И8 5070092; И8 5641780; И8 5101038; И8 5084468; И8 5739350; И8 4978757; И8 5332837 и И8 4912227; ΑΌ 96/10405 и ЕР 0537575 А1.
В одном предпочтительном аспекте молекулой-партнером является аналог СС-1065/дуокармицина, имеющий структуру (е)
в которой кольцевая структура А является элементом, выбранным из замещенной или незамещенной арильной, замещенной или незамещенной гетероарильной и замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной группы. Типичные кольцевые системы А включают фенил и пиррол.
Символы Е и С независимо выбраны из Н, замещенного или незамещенного алкила или незамещенного гетероалкила, гетероатома, отдельной связи или Е и С опционально соединены, формируя кольцевую систему, выбранную из замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила и замещенного или незамещенного гетероциклоалкила.
Символ X представляет собой член, выбранный из О, 8 и МК23. К23 представляет собой член, выбранный из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила или ацила.
К3 представляет собой член, выбранный из 8К11, ИИК.11 и 0К11, где К11 это Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, монофосфаты, дифосфаты, трифосфаты, сульфонаты, ацил, С(0)К12К13, С(0)0К12, С(0)КК12К13, Р(0)(0К12)2, ^0^ΗΕ12Ε13, 8К12 или 81К12К13К14. К12, К13 и К14 независимо представляют Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и замещенный или незамещенный арил, где К12 и К13 вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, опционально соединены, формируя замещенное или незамещенное гетероциклоалкиловое кольцо, имеющее от 4 до 6 членов, опционально содержащее два или более гетероатомов.
К4, К4, К5 и К5 являются членами, независимо выбранными из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, N0^ NК15К16, NС(Ο)К15, 00(0^^5^6 ОС(0)0К15, С(0)К15, 8К15, 0К15, СК15=NК16 и где и - целое число от 1 до 20, или любая смежная пара К4, К4, К5 и К5, вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединяются, формируя замещенный или незамещенный циклоалкиловую или гетероциклалкиловую кольцевую систему, включающую от 4 до 6 членов. К15 и К16 независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный пептидил, где К15 и К16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, опционально присоединяются, образуя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, имеющую от 4 до 6 членов, опционально содержащих два или более гетероатомов. Одной показательной структурой является анилин.
Один из К3, К4, К4, К5, и К5 соединяет цитотоксин с линкером или ферментативно расщепляемым субстратом данного изобретения, как описано здесь, например с й1 или й3, если такие присутствуют, или с Ε, Н или I.
К6 является одинарной связью, которая либо присутствует, либо отсутствует. Когда К6 присутствует, К6 и К7 соединяются с образованием кольца циклопропила. К7 представляет собой СН2-Х2 или -СН2-. Когда К7 является -СН2- - это компонент циклопропанового кольца. X1 представляет собой 1еа^ид группу, такую как галоген, например С1, Вг или Ε. Комбинации К6 и К7 интерпретируются таким образом, чтобы не противоречить принципам химической валентности.
X1 может быть любой уходящей группой. Список полезных уходящих групп включает, но не огра- 40 018396 ничивается перечисленными: галогены, азиды, сульфоновые эфиры (например, аклилсульфонил, арилсульфонил), ионы оксония, перхлораты алкила, аммониоалканесульфонатные эфиры, алкилфторсульфонаты и фторированные соединения (например, трифлаты, нонафлаты, тресилаты) и т.п. В качестве уходящих групп особенно полезны галогены Е, С1 и Βγ.
Волнистая линия в шестичленном кольце означает, что кольцо может включать одну или более ненасыщенных связей и может быть ароматическим. Таким образом, кольцевые структуры, такие как набор далее, и родственные структуры включаются в формулу (ί)
В одном из вариантов осуществления В11 включает компонент X5, не подверженный внутренней циклизации, и соединяет лекарственное средство с Ь1 или Ь3, если они присутствуют, или с Е, Н, или I. Компонент Х5 предпочтительно расщепляется ферментом и при расщеплении дает активное лекарственное средство. В качестве примера В11 может иметь следующую структуру (с правой стороны присоединение к оставшейся части лекарственного средства):
о о
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из В4, В4, В5 и В5 присоединяет указанное лекарственное средство к Ь1, если он присутствует, или к Е, Н, I, или X2, и В3 выбрано из 8В11, N11^ и 0В11. В11 выбран из -80(0Н)2, -РО(ОН)2, -ААп, -81 (СН3)2С(СН3)3, -С(0)0РШН(АА)т,
и их фармацевтически приемлемые соли, где п целое число от 1 до 10, т любое целое от 1 до 4, р любое целое от 1 до 6, а АА является любой природной или неприродной аминокислотой. В настоящем описании соединение формулы (е), конъюгированное с помощью В4, В4, В5 или В6, В3 содержит расщепляемую блокирующую группу, присутствие которой блокирует цитотоксическое действие соединения, но расщепляется в условиях предполагаемого места действия по механизму, отличному от расщепления линкера, связывающего цитотоксин с антителом. Таким образом, в случае непредусмотренного расщепления конъюгата в плазме блокирующая группа снижает цитотоксичность высвобождаемого цитотоксина. Например, если конъюгат содержит гидразинный или дисульфидный линкер, блокирующая группа может быть ферментативно расщепляемым амидом. Или, если линкером является пептидил, расщепляемый протеазой, блокирующей группой может быть эфир или карбамат, расщепляемый карбоксиэстеразой.
Например, в предпочтительном варианте осуществления □ является цитотоксином структуры (])
элементом, выбранным из О, 8 и NВ23, где В23 является элементом, выбранным из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.
- 41 018396
Я1 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил, С(О)Я8 или СО2Я8, где Я8 является элементом, выбранным из NЯ9Я10 и ОЯ9, в котором Я9 и Я10 являются членами, независимо выбранными из Н, замещенного или незамещенного алкила или замещенного или незамещенного гетероал кила.
Я1 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил, или С(О)Я8, где Я8 является элементом, выбранным из NЯ9Я10 и ОЯ9, в котором Я9 и Я10 являются членами, независимо выбранными из Н, замещенного или незамещенного алкила или замещенного или незамещенного гетероалкила.
Я2 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил или незамещенный гетероалкил либо циано или алкокси, и Я2 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил или незамещенный гетероалкил.
Один из Я3, Я4, Я4, Я5 или Я5 соединяет цитотоксин с Ь1 или.
Ь3, если они присутствуют, или с Р, Н, или
Следующий вариант осуществления имеет формулу:
, , к5
В этой структуре А, Я6, Я7, X, Я4, Я5 и Я5 такие, как описано выше в формуле (е). Ζ является элементом, выбранным из О, 8 и NЯ23, где Я23 является элементом, выбранным из Н, замещенного или неза мещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила.
Я34 представляет собой С(=О)Я33 или С1-С6-алкил, где Я33 выбран из Н, замещенного или незаме щенного алкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, NО2, NЯ15Я16, NС(О)Я15, ОС(О^Я15Я16, ОС(О)ОЯ15, С(О)Я15, 8Я15, ОЯ15, СЯ15=т16 и О (СН2)^ (СН3)2, где η целое число от 1 до 20. Я15 и Я16 независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарила, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный пептидил, где Я15 и Я16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, опционально соединяются, формируя замещенную или незамещенную гетероциклоалкильную кольцевую систему, имеющую от 4 до 6 членов, опционально содержащих два или более гетероатома.
Предпочтительно А представляет собой замещенный или незамещенный фенил или замещенный или незамещенной пиррол. Более того, любой выбор заместителей, описанный здесь для Я11, также применим к Я33.
Маркеры в качестве молекул-партнеров.
В случае, когда молекула-партнер представляет собой маркер, она может представлять собой любой элемент, обладающий или порождающий детектируемое химическое или физическое свойство, указывающее на присутствие маркера в ткани или клетке. Маркеры (которые иногда также называются репортерными группами) используются в области иммуноанализов, биомедицинских исследований и медицинской диагностики. Детекцию маркеров можно осуществлять спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими или химическими методами. Примеры включают магнитные гранулы (например, ^ΥNΑΒЕΑ^8™), флюоресцентные красители (например, флюоресцин изотионат, красный краситель Техаз, родамин и т.д.), радиометки (например, 3Н, 1251, 358, 14С или 32Р), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие обычно применяемые в ИФА) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветные стеклянные или пластиковые гранулы (например, из полистирола, полипроилена, латекса и т.д.).
Маркер предпочтительно представляет собой элемент группы, состоящей из радиоактивных изотопов, предшественников флюоресцентных агентов, хромофоров, ферментов и их комбинаций. Примерами подходящих ферментов являются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза и оксидаза глюкозы.
Флюоресцентные агенты включают флюоресцин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон и т.д. Хемилюминесцентные соединения включают люцеферин и 2,3дигидрофталазиндионы, например люминол. Обзор различных способов мечения или систем получения сигналов, которые можно использовать, можно найти, например, в патенте США # 4391904.
Маркеры могут быть присоединены непрямым образом: через молекулу лиганда (например, биотин), ковалентно связанную с антителом. Затем лиганд связывается с другой молекулой (например, стрептавидином), которой либо присущи детектируемые свойства, либо она ковалентно связана с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флюоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение.
Примеры конъюгатов.
Примерами комбинаций молекула-партнер - линкер, подходящих для конъюгирования с антителом
- 42 018396 согласно настоящему изобретению, являются следующие комбинации:
- 43 018396
- 44 018396
- 45 018396
- 46 018396
- 47 018396
В описанных выше соединениях, если в формуле присутствует подстрочный индекс, он представляет собой целое число от 0 до 24. К, везде, где он встречается, представляет собой оо н, ,9 /7®9 ,,Л|1 γΝ·.^-'Λ4 о о го
Каждое из приведенных выше соединений включает малеимидную группу и его легко можно конъюгировать с антителом через сульфгидрильную группу на антителе.
Конъюгирование антител согласно настоящему изобретению также можно осуществить с использованием других типов химических функциональных групп, как описано выше для биспецифичных молекул.
Фармацевтические композиции.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая одно из или комбинацию перечисленных: моноклональные антитела или антигенсвязывающая часть(и) согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению также можно вводить в комби
- 48 018396 нированной терапии, например, в комбинации с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать антитело к мезотелину согласно настоящему изобретению в сочетании по крайней мере с одним другим противораковым агентом. Примеры лекарственных средств, которые можно использовать в комбинированной терапии более подробно, описываются ниже.
В настоящем описании термин фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, диспергенты, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и подобные физиологически совместимые агенты. В предпочтительном случае носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального и эпидермального применения (например, посредством впрыскивания или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединение, например антитело, иммуноконъюгат или биспецифическая молекула, может быть покрыто материалом для защиты соединения от действия кислот и других естественных условий, которые могут привести к его инактивации.
Фармацевтические соединения согласно настоящему изобретению могут содержать одну или более фармацевтически приемлемую соль. Термин фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не привносит никаких нежелательных токсикологических эффектов. Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная, азотная, фосфорная, серная, бромоводородная, йодоводородная, фосфорная и им подобные, так же, как и нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и им подобные. Соли присоединения оснований включают соли щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., так же, как и нетоксичных органических аминов, таких как ^Удибензилэтиленедиамин, N-метилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) растворимые в воде антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеин гидрохлорид, натрия бисульфат, натрия метабисульфит, натрия сульфит и т.п., (2) растворимые в масле антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуин (ВНТ), лецитин, пропил галлат, альфа-токоферол и им подобные, и (3) металлохелиты, такие как лимонная кислота, этилендиаминовая тетрауксусная кислота (ЕОТА), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и им подобные.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические эфиры, подходящие для инъекций, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, используя покрытие из материалов, таких как лецитин, путем поддержания необходимого размера молекулы в случае дисперсии, а также при помощи поверхностно-активных веществ.
Композиция может также содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажнители, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечивать как с помощью процедур стерилизации, см. выше, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлоробутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может возникнуть потребность включения изотонических агентов, таких как сахар, хлорид натрия и т.п. В дополнение, пролонгированная абсорбция впрыскиваемых лекарственных форм может быть достигнута включением агентов, которые пролонгируют всасывание, таких как алюминия моностеарат и желатин.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного приготовления стерильных впрыскиваемых растворов или дисперсий. Использование таких наполнителей и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением случаев, когда какой-либо обычно употребляемый наполнитель или агент несовместим с активным соединением, использование такового в фармацевтических композициях согласно изобретению предусмотрено. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильны и стабильны в условиях производства и хранения. Композиции могут быть изготовлены в форме раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носителем может быть растворитель или диспергент, содержащий, например, воду, этанол, полиол (например, глицерол, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, используя покрытие из материалов, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера молекулы в случае дисперсии, а также при помощи поверхностноактивных веществ. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонического агента, на
- 49 018396 пример сахара, полиспиртов, таких как маннитол, сорбитол или хлорид натрия.
Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем микрофильтрации. В общем, дисперсии приготовляют путем добавления активного соединения в стерильный механизм, который содержит базовый диспергент и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных впрыскиваемых растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация для получения порошка активного ингредиента с любыми требуемыми дополнительными ингредиентами из их предварительно стерильно очищенных растворов.
Количество активных ингредиентов, которые можно объединять с материалом носителя для получения дозированной лекарственной формы, меняется в зависимости от пациента и конкретной формы введения. Количество активных ингредиентов, которые можно объединять с материалом носителя для получения дозированной лекарственной формы, в общем случае будет представлять собой такое количество композиции, которое оказывает терапевтическое действие. В общем случае из 100% это количество будет составлять от примерно 0,01 до примерно 99% активного ингредиента, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 70%, наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Режимы дозирования подбирают так, чтобы обеспечить оптимальный желаемый отклик (например, реакция на терапию). Например, может быть введен один болюс или можно ввести несколько разделенных доз через интервал времени или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать в зависимости от терапевтических показаний. Особенно предпочтительно изготовление композиций для парентерального введения в дозированных лекарственных формах для облегчения введения и равномерного дозирования. Под единицей дозирования лекарственной формы здесь понимают физически отдельную единицу, которую можно применять в качестве единичной дозы для пациента, причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, чтобы обеспечить желаемое терапевтическое действие, вместе с необходимым фармацевтическим носителем. Требования к дозированной лекарственной форме согласно настоящему изобретению определяются и непосредственно зависят от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного желаемого терапевтического действия и (Ь) ограничений, присущих изготовлению таких активных соединений для лечения чувствительности у субъектов.
Для введения антитела согласно настоящему изобретению доза лежит в интервале от 0,0001 до 100 мг/кг, а более обычно от 0,01 до 5 мг/кг в расчете на 1 кг веса пациента. Например, доза может составлять 0,3, 1, 3, 0,3, 5 или 10 мг/кг веса или в интервале 1-10 мг/кг. Типичный режим лечения предполагает введение один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в три или шесть месяцев. Предпочтительные режимы дозирования включают 1 или 3 мг/кг тела внутривенно, причем антитело дается согласно одному из следующих расписаний: (ί) каждые четыре недели первые шесть доз, далее каждые три месяца; (ίί) каждые три недели; (ш) 3 мг/кг тела однократно и затем 1 мг/кг тела каждые три недели.
В некоторых методах два или более моноклональных антитела с различными специфичностями связывания вводят одновременно, причем в этом случае дозировка каждого вводимого антитела попадает в обозначенные интервалы. Антитело обычно вводят несколько раз. Интервалы между введениями могут составлять, например, неделю, месяц, три месяца или год. Интервалы могут быть также нерегулярными и зависеть от измеренного уровня антитела к целевому антигену в крови у пациента. В некоторых способах дозировку регулируют таким образом, чтобы достичь концентрации антитела в плазме около 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах - около 25-300 мкг/мл.
В качестве альтернативы антитело можно вводить в форме препарата с отложенным высвобождением. Дозировка и частота изменяются в зависимости от периода полураспада антитела в организме пациента. В общем, человеческие антитела демонстрируют самый длинный период полураспада, затем идут гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела. Дозировка и частота введения может изменяться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении относительно малые дозы вводят через относительно редкие интервалы в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца жизни. При терапевтическом применении иногда требуются относительно крупные дозы в относительно короткие интервалы, пока у пациента не зарегистрируют частичное или полное уменьшение симптомов заболевания. С этого времени пациенту может быть назначен профилактический режим.
При применении в профилактике и/или лечении заболеваний, связанных с анормальным ростом клеток, предпочтительной является концентрация вводимого соединения в циркулирующей крови, равная примерно от 0,001 до 20 мкМ, и более предпочтительной является концентрация от 0,01 до 5 мкМ.
Дозы соединения согласно настоящему изобретению для перорального введения пациенту обычно составляют от примерно 1 до примерно 10,000 мг в день, более типично от примерно 10 до примерно 1,000 мг в день и наиболее типично от примерно 50 до примерно 500 мг в день. Установленные в терминах массы тела пациента типичные дозы находятся в интервале от примерно 0,01 до примерно 150 мг/кг
- 50 018396 в день, более типично от примерно 0,1 до примерно 15 мг/кг в день и наиболее типично от примерно 1 до примерно 10 мг/кг в день, например 5 или 3 мг/кг в день.
По крайней мере, в некоторых вариантах осуществления дозы, замедляющие или останавливающие рост опухоли у пациента, могут быть равны 1 мкмоль/кг в день или менее. Например, дозы могут быть равны 0,9, 0,6, 0,5, 0,45, 0,3, 0,2, 0,15, или 0,1 мкмоль/кг в день или менее (в терминах молей лекарственного средства). Предпочтительно конъюгат антитело-лекарственное средство останавливает рост опухоли при введении ежедневной дозы в течение по крайней мере пяти дней.
Фактический уровень дозировки активного ингредиента в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению можно варьировать до получения количества активного ингредиента, обеспечивающего требуемый терапевтический ответ для данного пациента, композиции и режима введения без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, включающего активность данных композиций, или их эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с данным применяемым соединением, возраста, пола, массы тела, заболевания, общего состояния здоровья и предыдущего анамнеза пациента, и других факторов, хорошо известных в медицинской практике.
Терапевтически эффективная дозировка антитела к мезотелину согласно настоящему изобретению предпочтительно приводит к уменьшению интенсивности симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов, или предотвращению ухудшения состояния или потери жизнеспособности в результате болезни. Например, для лечения субъектов, страдающих от опухоли, терапевтически эффективная дозировка предпочтительно замедляет рост опухоли по крайней мере на 20%, более предпочтительно по крайней мере на 40%, еще более предпочтительно по крайней мере на 60% и наиболее предпочтительно по крайней мере на 80% относительно субъекта в отсутствие лечения. Способность соединения замедлять рост опухоли может быть оценена на животной модельной системе предсказания эффективности при опухолях человека. Альтернативно, это средство композиции может быть оценено посредством проверки способности соединения замедлять рост клеток, такое замедление может быть измерено ίη νίΐΐΌ по случаям, известным высококвалифицированному практику. Терапевтически эффективное количество лекарственного соединения может уменьшать размер опухоли или иначе облегчать симптомы у пациента. Определить это количество при наличии рядовых навыков в области можно на основе таких факторов, как размеры субъекта, интенсивность симптомов субъекта и выбранного вида композиции или способа введения.
Композицию согласно настоящему изобретению можно вводить несколькими путями с использованием одного или набора способов, известных в данной области. Для специалиста очевидно, что способ и/или режим введения зависит от желаемого результата. Предпочтительные пути введения для антител согласно настоящему изобретению включают внутривенный, интрадермальный, внутрибрюшной, подкожный, спинальный или другие парентеральные способы, например инъекция или инфузия. Фраза парентеральное введение обозначает режимы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включает, но не ограничивается перечисленными, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрисуставную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитональную, транстрахеальную, подкожную, интраартикулярную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и надчревную инъекцию и инфузию.
В качестве альтернативы антитело согласно настоящему изобретению может быть введено непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный или мышечный способ введения, например интраназально, орально, вагинально, ректально, сублингвально или местно.
Активные соединения можно изготавливать с носителями, которые защищают соединение от быстрого высвобождения, например средствами контролируемого высвобождения, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы саморассасывающиеся биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевые кислоты, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких рецептов запатентованы или широко известны специалистам в данной области; см., например, 8ийатеб ааб СойгоНеб Яе1еа§е Эгид Ое1й'егу 8у51ет5, !Я. ЯоЬткоп, еб., Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, 1978.
Терапевтические композиции можно вводить с использованием медицинских приспособлений, известных в данной области. Например, терапевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена при помощи гиподермического безыгольного инжектора, такого как описан в И8 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры имплантатов и модулей, применимых в данном изобретении, включают И8 4487603 (имплантируемый насос для микроинфузий для распределения препарата с контролируемой скоростью); И8 4486194 (терапевтический прибор для введения медикаментов через кожу); И8 4447233 (инфузионный насос для доставки препарата с точной скоростью инфузии); И8 4447224 (имплантируемый аппарат для инфузий регулируемого потока для безостановочной доставки препарата); И8 4439196 (осмотическая система доставки лекарственного средст
- 51 018396 ва с многокамерной емкостью) и υδ 4475196 (осмотическая система доставки лекарственного средства). Ссылки на эти патенты приводятся здесь. Многие другие имплантаты, системы доставки и модуля известны квалифицированным в данной области специалистам.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть включены в состав для обеспечения должного распределения ш νί\Ό. Например, гематоэнцефалитический барьер (ВВВ) не пропускает многие высоко гидрофильные соединения. Чтобы обеспечить прохождение терапевтических соединений согласно настоящему изобретению через ВВВ (если это необходимо), их можно изготовить, например, в форме липосом. Для получения информации о производстве липосом см., например, υδ 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или более добавок, которые селективно доставляются к определенным клеткам или органам, таким образом способствуя целевой доставке лекарственного средства (см., например, Яапабе (1989) 1. С1т. РЬагтасо1., 29:685). Типичные нацеливающие добавки включают фолат и биотин (см., например, υδ 5416016 Ьоте е! а1.), маннозиды (Бтеха^а е! а1., (1988) Вюсйет. ВюрЬу8. Яе8. Соттип., 153:1038), антитела (В1оетап е! а1.) (1995) ΕΕВδ Ье!!., 357:140; О\\Ю8 е! а1. (1995) ΑπΙίιηχίΌό. Α^πΐ8 СЬето!йег., 39:180); поверхностный белок рецептора Α (Вп8сое е! а1. (1995) Αт. 1. РЬ.у8ю1., 1233:134); с. 120 ^сйге1ег е! а1. (1994) 1. Вю1. СЬет., 269:9090); см. также Кетапеп апб Ьаиккапеп (1994) ΕΕВδ Ье!!.; К111юп апб Е1б1ег (1994) 1ттипоте!Ьоб8, 4:273.
Применения и способы согласно изобретению
Антитела, в частности антитела человека, композиции антител, композиции конъюгатов антитела и молекулы-партнера и способы согласно настоящему изобретению имеют множество применений в диагностике и терапии ш νί\Ό и ш νίϋΌ, включая диагностику и терапию нарушений, опосредуемых мезотелином. Например, такими молекулами можно обрабатывать клетки в культуре ш νίΙΐΌ или ех νί\Ό или вводить человеку для лечения, предотвращения и диагностики ряда нарушений. В настоящем описании термин субъект относится к животным, являющимся или не являющимся человеком. К животным, не являющимся человеком, относятся все позвоночные, например млекопитающие и немлекопитающие, такие как нечеловекообразные приматы, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, амфибии и рептилии. Предпочтительные субъекты включают пациентов-людей, страдающих нарушениями, опосредуемыми активностью мезотелина, в частности пациентов-людей, страдающих нарушениями, ассоциированными с аберрантной экспрессией мезотелина. Когда конъюгат молекулы-партнера антитела с мезотелином вводится вместе с другим агентом, их можно вводить в любой последовательности или одновременно.
С учетом того, что антитела согласно данному изобретению специфично связываются с мезотелином, антитела согласно данному изобретению могут быть использованы для детектирования экспрессии мезотелина и, более того, могут быть использованы для очистки мезотелина методом иммунной очистки.
В одном из вариантов осуществления композиции согласно настоящему изобретению могут быть использованы для определения уровней мезотелина, которые могут быть связаны с симптомами определенного заболевания. В качестве альтернативы композиции могут быть использованы для ингибирования или блокирования функций мезотелина, которые, в свою очередь, могут быть связаны с предотвращением или облегчением симптомов определенного заболевания, тем самым указывая на то, что мезотелин является медиатором заболевания. Это может быть достигнуто приведением в контакт образца и контрольного образца с антителом к мезотелину в условиях, которые допускают образование комплекса между антителом и мезотелином. После этого осуществляют детектирование комплексов, образованных между антителом и мезотелином, и сравнивают с контрольным образцом.
В другом варианте осуществления композиции согласно данному изобретению возможно вначале тестируют на активность связывания, ассоциированную с терапевтическим или диагностическим использованием т νίΙΐΌ. Например, композиции согласно данному изобретению могут быть протестированы методом поточной цитометрии, известным в данной области.
Композиции согласно данному изобретению имеют дополнительное приложение в терапии и диагностике связанных с мезотелином заболеваний. Например, иммуноконъюгаты могут быть использованы для стимулирования ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ одной или более или из следующих видов биологической активности: ингибирования роста и/или уничтожения клеток, экспрессирующих мезотелин, участия в фагоцитозе, или АЗКЦ клетки, экспрессирующей мезотелин в присутствии эффекторных клеток человека, или для блокирования лиганда мезотелина, связывающегося с мезотелином.
В одном из вариантов осуществления композиции используются ш νί\Ό для лечения, предотвращения или диагностирования ряда заболеваний, связанных с мезотелином. Примеры заболеваний, связанных с мезотелином, включают, среди прочих, рак яичников, поджелудочной железы, желудка, легкого, матки, эндометрия, желчного протока, пищевода/желудка, прямой и толстой кишки и молочной железы.
Композиции согласно настоящему изобретению могут содержать агенты, включая, среди прочих, противоопухолевые агенты, такие как доксорубицин (адриамицин), цисплатин, блеомицин сульфат, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид и гидроксимочевину, которые сами по себе эффективны только в дозах, токсичных или субтоксичных для пациента. Цисплатин вводят внутривенно в дозе 100 мг/кг каждые четыре недели, а адриамицин вводят внутривенно в дозе 60-75 мг/мл через 21 день. Совместное введение антитела человека к мезотелину или антигенсвязывающего фрагмента такого антитела согласно
- 52 018396 данному изобретению с химеотерапевтическими агентами обеспечивает два противораковых агента, которые действуют по различным механизмам и обеспечивают цитотоксичный эффект по отношению к клеткам опухоли человека. Такое совместное введение может обеспечить решение проблем, возникающих из-за развития резистентности к препарату или из-за изменения антигенности клеток опухоли, которое приводит к отсутствию реакции с антителами.
Биспецифичные и мультиспецифичные молекулы согласно настоящему изобретению могут также быть использованы для модулирования уровней ЕсуВ или ЕсуВ на эффекторных клетках, например кэпирования и устранения рецепторов на поверхности клетки. Смесь рецепторов в Ес также может быть использована для этой цели.
Композиции согласно данному изобретению, содержащие сайты связывания комплемента, такие как части 1дС1, -2, или -3 или 1дМ, которые связывают комплемент, могут также быть использованы в присутствии комплемента. В одном из вариантов осуществления обработка ех νίνο популяции клеток, содержащих клетки-мишени со связывающим агентом согласно данному изобретению и подходящие эффекторные клетки, может быть дополнена комплеменом или сывороткой, содержащей комплемент. Фагоцитоз клеток-мишений, покрытых связывающим агентом согласно данному изобретению, может быть усилен путем связывания белков комплемента. В другом варианте осуществления клетки-мишени, покрытые композициями (например, антитела человека, мультиспецифичные и биспецифичные молекулы) согласно настоящему изобретению, могут также быть лизированы комплементом. В еще одном варианте осуществления композиции согласно настоящему изобретению не активируют комплемент.
Композиции согласно настоящему изобретению также можно вводить совместно с комплементом. Таким образом, согласно данному изобретению предложены композиции, содержащие антитела человека, мультиспецифичные или биспецифичные молекулы и сыворотку или комплемент. Такие композиции могут быть полезны в случае, когда комплемент располагается вблизи антитела человека, мультиспецифичных или биспецифичных молекул. В качестве альтернативы антитела человека мультиспецифичные или биспецифичные молекулы согласно данному изобретению и комплемент или сыворотка можно вводить по отдельности.
Также настоящее изобретение включает наборы, содержащие композиции антител согласно данному изобретению и инструкцию по использованию. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммуноподавляющий агент, цитотоксичный агент или радиотоксичный агент, или одно или более дополнительных антител человека согласно данному изобретению (например, антитело человека, обладающее способностью к комплементарному связыванию с эпитопом в антигене мезотелина, отличный от того эпитопа, с которым связывается первое антитело человека).
Соответственно пациентам, к которым применяют лечение композициями антител согласно данному изобретению, можно дополнительно вводить (до, одновременно с или после введения композиции согласно настоящему изобретению) другой дополнительный терапевтический агент, такой как цитотоксичный или радиотоксичный агент, который усиливает или улучшает терапевтический эффект композиции.
В других вариантах осуществления субъект может получать дополнительное лечение агентом, который модулирует, например усиливает или ингибирует, экспрессию или активность Есу или Есу рецепторов посредством, например, лечения субъекта цитокином. Предпочтительные цитокины для введения во время лечения мультиспецифичной молекулой включают колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (6-С8Е), колонистимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (6М-С8Е), интерферон-у (ШЫ-у), фактор некроза опухоли (Т№).
В одном из вариантов в изобретении предложены способы детектирования присутствия антигена мезотелина в образце, или измерения количества антигена мезотелина, включающие приведение в контакт образца и контрольного образца с моноклональным антителом человека или его антигенсвязывающей частью, которая специфично связывается с мезотелином в условиях, допускающих образование комплекса между антителом и его частью и мезотелином. Затем образование комплекса детектируется, причем различие в образовании комплекса в образце по сравнению с контрольным образцом указывает на присутствие антигена мезотелина в образце.
В других вариантах осуществления в изобретении предложены способы лечения опосредуемых мезотелином нарушений у субъекта, например рак яичников, поджелудочной железы, желудка, легкого, матки, эндометрия, желчного протока, пищевода/желудка, прямой и толстой кишки и молочной железы.
В еще одном варианте осуществления иммуноконъюгаты согласно данному изобретению используют для связывания молекул-партнеров с клетками, которые экспрессируют мезотелин, путем связывания такой молекулы-партнера с антителом. Например, антитело к мезотелину может быть конъюгировано с любым из токсичных соединений, описанных в И8 6281354; 6548530; 2003/0050331; 2003/0064984; 2003/0073852 и 2004/0087497 или ЭД0 03/022806. Таким образом, в изобретении также предложены способы локализации ех νίνο или ίη νίνο клеток, экспрессирующих мезотелин (например, с использованием детектируемой метки, такой как радиоизотоп, флюоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента). В качестве альтернативы иммуноконъюгаты могут быть использованы для уничтожения клеток,
- 53 018396 которые имеют на своей поверхности рецепторы к мезотелину, путем нацеливания конъюгатов цитотоксина или радиотоксина при помощи связывающегося с мезотелином антителом.
Поскольку мезотелин ассоциирован с определенными опухолями, согласно настоящему изобретению предложен способ ингибирования роста клеток опухоли, экспрессирующих мезотелин, включающий проведение в контакт клетки опухоли с антителом к мезотелину согласно настоящему изобретению, что обеспечивает ингибирование роста клеток опухоли. В предпочтительном варианте осуществления антитело конъюгируют с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин. В особенно предпочтительных вариантах осуществления экспрессирующая мезотелин клетка опухоли является клеткой мезотелиомы, или клеткой опухоли, ассоциированной с раком яичников, поджелудочной железы, желудка, легкого, матки, эндометрия, желчного протока, пищевода/желудка, прямой и толстой кишки и молочной железы. В других предпочтительных вариантах осуществления экспрессирующая мезотелин клетка опухоли является клеткой мезотелиомы, клеткой опухоли поджелудочной железы, клеткой опухоли яичника, клеткой опухоли желудка, клеткой опухоли легкого или клеткой опухоли эндометрия. В еще одном варианте осуществления клетка опухоли является клеткой раковой опухоли, выбранной из группы, состоящей из мезотелиом, папиллярных серозных аденокарцином яичника, светлоклеточных карцином яичника, смешанных карцином Мюллерова протока и яичника, эндометриоидных муцинозных карцином яичника, аденокарцином поджелудочной железы, аденокарцином протоков поджелудочной железы, серозных карцином матки, аденокарцином легкого, карцином внепеченочных желчных протоков, аденокарцином желудка, аденокарцином пищевода, аденокарцином прямой и толстой кишки и аденокарцином молочной железы.
Далее, в другом аспекте антитела к мезотелину и их конъюгаты с лекарственными средствами могут быть использованы для лечения рака у субъекта. Соответственно согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту антитела согласно настоящему изобретению, что обеспечивает лечение рака у субъекта. Например, в особенно предпочтительном варианте осуществления антитела могут быть использованы в лечении мезотелиом, раковых опухолей яичника и поджелудочной железы. В других предпочтительных вариантах осуществления антитела используются в лечении мезотелиом, раковых опухолей поджелудочной железы, раковых опухолей яичников, раковых опухолей желудка, раковых опухолей легкого или раковых опухолей эндометрия. В других вариантах осуществления антитела используются в лечении рака, выбранного из группы, состоящей из мезотелиом, папиллярных серозных аденокарцином яичника, светлоклеточных карцином яичника, смешанных карцином Мюллерова протока и яичника, эндометриоидных муцинозных карцином яичника, аденокарцином поджелудочной железы, аденокарцином протоков поджелудочной железы, серозных карцином матки, аденокарцином легкого, карцином внепеченочных желчных протоков, аденокарцином желудка, аденокарцином пищевода, аденокарцином прямой и толстой кишки и аденокарцином молочной железы.
Антитело может быть использовано самостоятельно или в комбинации с другими методами лечения рака, такими как хирургическое вмешательство и/или радиотерапия, и/или с другими противораковыми агентами, такими как противораковые агенты, обсуждавшиеся и описанные выше, включая препараты химиотерапии и другие противоопухолевые антитела, такие как антитела, связывающие СЭ20, Нег2, Р8МА, Сатра!к-1, ЕСЕЕ и т.п.
Антитела к мезотелину можно (но не обязательно) комбинировать с иммуногенным агентом, таким как вакцина, содержащая раковые клетки, очищенные антигены опухоли (включая рекомбинантные белки, пептиды и молекулы углевода), клетки, клетки, трансфецированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины (Не е! а1. (2004) I. 1ттипо1., 173:4919-28). Были разработаны многие экспериментальные стратегии противоопухолевого вакцинирования (ЕокепЬегд, 8., 2000, Оеуе1ортеп1 о£ Сапсег Уассшек, А8СО Ебиса!юпа1 Воок 8ргшд: 60-62; Ьодо!кеЙ8, С., 2000, А8СО Ебисайопа1 Воок 8ргтд: 300-302; Ккауа!, Ό. 2000, А8СО Ебисайопа1 Воок 8ргтд: 414-428; Еооп, К. 2000, А8СО Ебисайопа1 Воок 8ргтд: 730-738; см. также ЕекШо, Ν. апб 8хпо1, М., Сапсег Уасстек, Ск. 61, р. 3023-3043 в ЭеУйа, V. е! а1. (ебк.), 1997, Сапсег: Ргтс1р1ек апб Ргасйсе о£ Опсо1оду, 5-е изд.). В одной из этих стратегий вакцина готовится с использованием аутологичных или аллогенных клеток опухоли. Было показано, что такие клеточные вакцины наиболее эффективны, когда опухолевые клетки в результате трансдуцикции обеспечивают экспрессию СМ-С8Е. Было показано, что СМ-С8Е является мощным активатором презентации антигенов для вакцинации опухоли (ЭгапоГГ е! а1. (1993) Ргос. Асаб. 8с1 И8А, 90: 3539-43).
Другой вид противоопухолевых вакцин включает белки вирусов, связанные с раковыми заболеваниями человека, такими как вирус папилломы человека (НРУ), вирусы гепатита (НВУ и НСУ) и вирус герпеса, связанный с саркомой Капоши (КН8У). Другим видом специфичного антигена опухоли, который может использоваться в опухолевых вакцинах, являются белки теплового шока (Н8Р), изолированные от самой ткани опухоли. Эти белки теплового шока содержат фрагменты белков из клеток опухоли и такие Н8Р обладают высокой эффективностью в доставке к антигенпрезентирующим клеткам для того, чтобы вызвать иммунный ответ в отношении опухоли (8ио!, Е. & 8пуак1ауа, Р. (1995) 8с1епсе, 269:15851588; Татига, Υ. е! а1. (1997) 8с1епсе, 278:117-120).
Дендритные клетки (ЭС) являются эффективными антигенпрезентирующими клетками, которые
- 54 018396 могут быть использованы для того, чтобы инициировать антигенспецифичный ответ. ОС могут быть получены ех νί\Ό и снабжены различными антигенами белков и пептидов так же, как и экстракты опухолевых клеток (№8Йе, Е. е! а1. (1998) №ииге Мейюте, 4: 328-332). ОС могут также быть подвергнуты генетической трансдукции для экспрессии опухолевых антигенов. ОС также сливали непосредственно с опухолевыми клетками с целью иммунизации (Кид1ег, Α. е! а1. (2000) №ииге Мейюте, 6:332-336). Как метод вакцинации, иммунизацию ОС можно комбинировать с лечением антителами к мезотелину, чтобы активировать противоопухолевый ответ.
Использование антимезотелиновых антител можно также комбинировать со стандартными методами лечения рака. Лечение антителами к мезотелину может быть эффективно комбинировано с режимами химиотерапии. В этих случаях возможно уменьшать дозу вводимого химиотерапевтического реагента (Мокуг, М. е! а1. (1998) Сапсег Кекеагсй, 58: 5301-5304). Другими видами комбинированной терапии, которые могут приводить к синергетическому действию с лечением антителами к мезотелину, являются радиотерапия, хирургическое вмешательство и гормональная депривация. Ингибиторы ангиогенеза также можно комбинировать с лечением антителами к мезотелину.
Лечение антителами к мезотелину может быть также использовано в комбинации с биспецифичными антителами, направленными к Ес-альфа или Ес-гамма экспрессирующим рецептор клеткам - эффекторам на клетки опухоли (см., например, υδ 5922845 и 5837243). Например, рецептор Ес/биспецифичные антитела противоопухолевого антигена (например, Иег-З/пеи) были использованы для нацеливания макрофагов на сайты опухоли. Это нацеливание может более эффективно активировать специфичный ответ на опухоль. В качестве альтернативы антиген может доставляться непосредственно к ОС при помощи использования биспецифичных антител, которые связываются с антигеном опухоли и поверхностным маркером специфичной клетки дендритной клетки.
Опухоли избегают действия иммунной системы хозяина с помощью большого числа механизмов. Многие из этих механизмов могут быть преодолены инактивацией иммуноподавляющих белков, экспрессируемых опухолью. Эти белки включают ТСЕ-Ье!а (Кейг1, I. е! а1. (1986) I. Ехр. Мей., 163: 10371050), ЕЪ-10 (Мо^арй, М. & 0'Сагга, Α. (1992) Iттиηο1οду Тойау, 13: 198-200) и лиганд Еак тайпе, М. е! а1. (1996) 8с1епсе, 274: 1363-1365). Антитела к каждому из них могут быть использованы в комбинации с антителами к мезотелину, чтобы противостоять эффектам иммуноподавляющих агентов и способствовать развитию иммунного ответа на опухоль в организме хозяина.
Другие антитела, которые могут быть использованы для активации способности к иммунному ответу хозяина, могут быть использованы в комбинации с антимезотелином. Они включают молекулы на поверхности дендритных клеток, которые активируют функции ОС и презентацию антигена. Анти-СО40 антитела способны эффективно замещать активность клетки хелпера Т (К1йде, 1. е! а1. (1998) №!иге, 393: 474-478) и могут быть использованы в комбинации с антителами к мезотелину (Йо, N. е! а1. (2000) ΙιηтипоЬю1о§у, 201 (5) 527-40). Антитела к молекулам, стимулирующим Т-клетки, такие как ΟΤΕ-ΑΠ (например, патент США № 5811097 и 6984720), ОХ-40 (АешЬегд, Α. е! а1. (2000) ]ттипо1, 164: 2160-2169), 4-1ВВ (Ме1его, Ι. е! а1. (1997) ХаИие Мейюте, 3: 682-685 (1997), ГО08 (Η^Μ, Α. е! а1. (1999) №!иге, 397: 262-266), ΡΌ-1 и/или ΡΌ-Ы могут также обеспечивать повышение уровня активации Т-клетки и, таким образом, такие активирующие Т-клетки антитела могут быть использованы в комбинации с антителами к мезотелину согласно настоящему изобретению.
Трансплантация костного мозга в настоящее время используется в лечении ряда опухолей гематопоэтического происхождения. В то время как реакция отторжения трансплантата является следствием такого лечения, благоприятное терапевтическое воздействие может быть достигнуто за счет реакции трансплантат против опухоли. Таким образом, лечение антителами к мезотелину может быть использовано в комбинации с трансплантацией костного мозга как часть режима лечения опухоли.
Данное описание далее проиллюстрировано следующими не ограничивающими примерами. Содержание всех чертежей и ссылок, последовательность из базы данных СепЬапк, патентов и заявок на патент, ссылки на которые содержатся в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание путем ссылки.
Пример 1. Получение моноклональных антител человека к белку мезотелину.
Моноклоальные антитела (МАт) человека к мезотелину получали с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих гены антитела человека, следующим образом. Антиген В качестве антигена для иммунизации использовали растворимый белок слияния, включающий мезотелин. Данный растворимый белок слияния состоял из части мезотелина массой 40 кДа (который связан с мембраной посредством связи с гликофосфатидилинозитолом в природном мезотелине, который благодаря фосфатидилинозитолу является мембраносвязанным), связанной на С-конце с гистидиновой меткой (Ηίδ). В настоящем описании этот белок слияния называется слитый белок мезотелин человека-йк. Белок слияния получали с помощью стандартных технологий рекомбинантной ДНК и экспрессировали в трансфецированных клетках СНО, которые выделяли растворимый белок слияния в культуральный супернатант. Использованные для трансфекции хозяйские клетки СНО получали от Iην^!^οдеη (кат. № 11619-012). Выделенный растворимый белок слияния очищали для использования в качестве иммуногена. Кроме того, супернатант из трансфецированных клеток СНО, выделяющих белок слияния мезотелин человека-й18,
- 55 018396 использовали в тестах с помощью твердофазного ИФА для скрининга моноклональных антител человека (описанных далее в настоящей заявке).
Трансгенные мыши.
Моноклональные антитела человека к мезотелину человека получали с использованием мышей НСо7хЬи Ьатйа, принадлежащих к линии трансгенных мышей ΗиМаЬ типа Мойке™ (Нсо7хЬи топке). В этой линии эндогенный ген легкой каппа-цепи мыши гомозиготно разрушен, как описано в СНеи еЧ а1. (199З) ЕМВО 1- 12:811-820, а эндогенный ген тяжелой цепи мыши гомозиготно разрушен, как описано в примере 1 УО 2001/09187. Кроме того, это линия мышей несет трансген легкой каппа-цепи человека, КСо5, описанный в Е1к11\\г1й еЧ а1. (1996) ЫаЧиге Вютс^-кЛоду, 14:845-851, дрожжевую искусственную хромосому (УАС), несущую большую часть локуса легкой лямбда-цепи человека, описанную в публикации УО 2000/026З7З, и трансген тяжелой цепи человека НСо7, описанный в патентах США 5545806; 5625825 и 5545807.
Иммунизация мышей.
Для получения трансгенных моноклональных антител человека к мезотелину человека мышей НСо7хЬи иммунизировали очищенным белком слияния мезотелин человека-Ык. Общие схемы иммунизации описаны в Еог1Ьегд, N. еЧ а1. (1994) ЫаЧиге, З68(6414): 856-859; ЕЧкЬ^йй, Ό. еЧ а1. (1996) ЫаЧиге В1оЧес^о^ду, 14: 845-851 и патенте УО 98/24884. К моменту первого введения антигена мыши имели возраст З-4 месяца. Для внутрибрюшинной и подкожной иммунизации мышей использовали очищенный препарат антигена, рекомбинантный мезотелин человека-Ык (10 мкг белка, очищенного из трансфецированных клеток млекопитающего, экспрессирующих белок слияния). Антиген смешивали 1:1 с адъювантом Н[В[ (81дта кат. № М65З6).
Мышей иммунизировали 9 раз с интервалом в одну неделю. Иммунный ответ проверяли при помощи забора крови из ретроорбитального синуса. Плазму изучали с помощью анализа непрямым твердофазным ИФА (как описано в настоящей заявке), для слияний использовали мышей с максимальными титрами 1дО человека к мезотелину человека. Мыши получали конечное бустирование с помощью внутривенной и внутрибрюшинной инъекции растворимого антигена за 2 и З дня перед умерщвлением и удалением селезенки.
Селекция мышей, продуцирующих моноклональные антитела человека к мезотелину человека.
Для селекции мышей Нсо7хЬи, продуцирующих высокие титры антител к мезотелину, проводили проверку титров антител в сыворотке, используя непрямой ИФА-анализ следующим образом. Меченые гистидином антитела осаждали на планшет для микротитрования (Nονадеη кат. № 71184), промывали и блокировали З00 мкл/лунку 1% ВБЛ/ЭРВБ в течение 10-15 мин. После нескольких отмывок супернатант из клеток СНО, секретирующих белок слияния мезотелин человека-Ык, титровали до максимального сигнала, добавляли в количестве 50 мкл/лунку и инкубировали в течение 1 ч. После отмывки планшетов с помощью ОРВБ/Тгуеег! в каждую лунку добавляли разбавленную плазму от иммунизированных мезотелином мышей (начиная с разбавления 1:50, и затем серия из 11 разбавлений 1:2) и инкубировали в течение 1 ч. Планшеты промывали ^РВ§/Т^ееη и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами козы к антителам 1дО человека, связанными с пероксидазой хрена (Часкком [тпишоНекеагс!! ЬаЬк кат. № 115-0З6-098). Затем добавляли субстрат АВТ8 (2,2'-азино-бис[З-этилбентиозолин-6-сульфоновую кислоту]) (81дта кат. № 9941) и планшеты анализировали спектрфотометрически, определяя оптическую плотность при 415 нм. Титр определяли как разбавление сыворотки, которое обеспечивает оптическую плотность в два раза выше фоновой. Титр вычисляли с использованием шаблона Ехсе1. Для слияний использовали мышей, которые развивали наивысшие титры антител к мезотелину человека. Слияния проводили так, как описано в настоящей заявке, супернатанты гибридом тестировали на активность к мезотелину человека с использованием двух различных форматов твердофазного ИФА ЕЬ18А, также описанных в настоящей заявке.
Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела человека к мезотелину.
У мышей НСо7хЬи с высоким титром антител выделяли спленоциты, их слияние с миеломой мыши вызывали в электрическом поле при помощи электрослияния, с использованием электропоратора СуЧо Ри1ке с большой камерой для слияния клеток (СуЧо Ри1ке Бае^ек, 1пс., С1ег1 Вигше, МО). Суспензию одиночных клеток лимфоцитов селезенки из иммунизированных мышей сливали с равным числом РЗХ6З Ад8.6.5З (АТСС СНЬ 1580) несекретирующих клеток миеломы мыши. Полученные клетки помещали в количестве 2,0х104 клеток/лунку в плоскодонный планшет для микротитрования в селективной среде ЭМЕМ, содержащей высокую концентрацию глюкозы (Се11дго № 10-01З-СМ) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Иус^е № НЗ0071.0З) с добавлением бета-меркаптоэтанола (1000Х, ОЧЬсо № 2198502З), 7 мМ ЖРЕ8 (Се11дго 25-060-С1), 2 мМ Ь-глютамина (Се11дго 25-005-С1), ΗАТ (50Х, 8Чдта № Η0262), 5% фактора для клонирования гибридом (ВюХепк № 210001), 10% кондиционирующей среды РЗ88Э[ (АТСС № СНБ Т1В-6З) и пенициллином-стрептомицином (100Х, Се11дго № З0-002-С1). Спустя примерно 7 дней некоторое количество среды, содержащей ΗАТ, заменяли на среду, содержащую НТ (Се11дго № 25-047-С1).
Спустя 10-12 дней отдельные лунки проверяли с помощью анализа методом прямого твердофазного
- 56 018396
ИФА для поиска лунок, содержащих антитела человека с легкой каппа-цепью человека или легкой лямбда-цепью 1дС человека. В формате прямого твердофазного ИФА планшеты для микротитрования покрывали антителами козы, специфичными к фрагментам Е(аЬ')2 и Ес 1дС человека (1асккоп 1ттипоКекеагск ЬаЬк, кат. № 109-006-098), 2,5 г/мл, 50 мкл/лунку, инкубировали в течение 1 ч и затем блокировали 300 мкл/лунку 1% В§А/ОРВ§ в течение 15 мин. Блокирующий буфер удаляли, добавляли супернатант из планшета для слияния (50 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 ч. Планшеты промывали ОРВБ/Тгееп и затем инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами козы к легким каппа-цепям человека, конъюгированными с пероксидазой хрена (Ве!ку1, кат. № А80-115Р), или поликлональными антителами козы к легким лямбда-цепям человека, конъюгированными с пероксидазой хрена (Вюкоигсе, кат. № 10904). После промывки в планшеты добавляли субстрат АВТ8 и методом спектрофотометрического анализа определяли оптическую плотность при 415 нм. Лунки с оптической полностью 0Ό>0,75 выбирали для дальнейшего анализа.
Клетки гибридом из лунок с положительными результатами на 1дС/легкую каппа-цепь человека или на 1дС/легкую лямбда-цепь человека переносили в 24-луночные культуральные планшеты. Через несколько дней супернатант из отдельных лунок повторно проверяли на специфичность с использованием непрямого твердофазного ИФА для идентификации антител 1дС человека, продуцируемых гибридомами, специфическими к мезотелину человека. Протокол для непрямого твердофазного ИФА, использованного для повторного скрининга гибридом, был тем же протоколом, который описан ранее для анализа титров антител сыворотки мышей Нсо7хки, за исключением образцов супернатанта из ки 1дС/ки каппа или ки 1дС/ки лямбда положительных культур.
Гибридомы клонировали с помощью последовательных разведений и подвергали двукратному скринингу. Проводили многочисленные анализы (описанные в следующих примерах) с использованием супернатантов от клеток, выращиваемых в 24-луночных культуральных планшетах до клонирования. Было выбрано десять антител, их характеристики подтверждали с использованием клонирования ш νίΙΐΌ и очистки антител. Три антитела: 3С10 (оригинальное имя клона: 1382.210.3С10.1.6), 6А4 (оригинальное имя клона: 1382.210.6А4.1.6) и 7В1 (оригинальное имя клона: 1382.210.7В1.2.18) были выбраны для секвенирования и дальнейшего анализа.
Пример 2. Исследование структуры антител 3С10, 6А4 и 7В1.
Последовательности кДНК, кодирующие вариабельные участки тяжелых и легких цепей МАт, экспрессируемых клонами 3С10, 6А4 и 7В1, описанными в примере 1, секвенировали с использованием стандартных методов секвенирования ДНК и экспрессируемые белки характеризовали с помощью стандартного химического анализа белка. Оказалось, что все три клона экспрессируют антитело, включающее тяжелую цепь 1дС1 и легкую каппа-цепь.
Последовательности нуклеотидов и аминокислот νΗ клона 3С10 показаны на фиг. 1А и в 8ЕО ГО N0: 25 и 19 соответственно. Последовательности нуклеотидов и аминокислот Уь клона 3С10 показаны на фиг. 1В и в 8ЕО ГО N0: 28 и 22 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина клона 3С10 с известными последовательностями иммуноглобулинов тяжелых цепей в зародышевой линии человека показало, что тяжелая цепь 3С10 использует сегмент νΗ зародышевой линии человека νΗ3-33, сегмент Ό зародышевой линии человека Ό3-10 и сегмент 1Η зародышевой линии человека 1ц4В. Дальнейший анализ последовательности клона 3С10 νΗ с использованием системы определения области гипервариабельных участков (СОК) по КаЬа! приводил к определению участков СЭЕВ СЭК2 и СЭ3 тяжелой цепи, как показано на фиг. 1А и в 8Е0 ГО N0: 1, 4 и 7 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина клона 3С10 с известными последовательностями иммуноглобулинов тяжелых цепей в зародышевой линии человека показало, что легкая каппа-цепь 3С10 содержит сегмент Ук зародышевой линии человека УкЬ6 и сегмент 1К зародышевой линии человека 1К4. Дальнейший анализ последовательности клона 3С10 Ук с использованием системы определения гипервариабельных участков по КаЬа! позволил определить участки СОК1, СЭК2 и СЭ3 легкой цепи, как показано на фиг. 1В и в 8Е0 ГО N0: 10, 13 и 16 соответственно.
Последовательности нуклеотидов и аминокислот νΗ клона 6А4 показаны на фиг. 2А и в 8Е0 ГО N0: 26 и 20 соответственно. Последовательности нуклеотидов и аминокислот клона 6А4 показаны на фиг. 2В и в 8Е0 ГО N0: 29 и 23 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина клона 6А4 с известными последовательностями иммуноглобулинов тяжелых цепей в зародышевой линии человека показало, что тяжелая цепь 6А4 содержит сегмент νΗ зародышевой линии человека νΗ3-33, сегмент Ό зародышевой линии человека Ό3-10 и сегмент 1Η зародышевой линии человека 1ц4В. Дальнейший анализ последовательности клона 6А4 νΗ с использованием системы определения области гипервариабельных участков по КаЬа! приводил к определению участков СОК1, СЭК2 и СЭ3 тяжелой цепи, как показано на фиг. 2А и в 8Е0 ГО N0: 2, 5 и 8 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина клона 6А4 с известными последовательностями иммуноглобулинов тяжелых цепей в зародышевой линии человека показало, что легкая каппа-цепь 6А4 содержит сегмент Ук зародышевой линии человека УкЬ6 и сегмент 1к зародышевой ли
- 57 018396 нии человека 1К4. Дальнейший анализ последовательности клона 6А4 УК с использованием системы определения области гипервариабельных участков по КаЬа! приводил к определению участков СОВ1, СЭВ2 и СЭ3 легкой цепи, как показано на фиг. 2В и в 8Е0 ΙΌ N0: 11, 14 и 17 соответственно.
Последовательности нуклеотидов и аминокислот УН клона 7В1 показаны на фиг. 3А и в 8Е0 ΙΌ N0: 27 и 21 соответственно. Последовательности нуклеотидов и аминокислот Уъ клона 7В1 показаны на фиг. 3В и в 8Е0 ΙΌ N0: 30 и 24 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина клона 7В1 с известными последовательностями иммуноглобулинов тяжелых цепей в зародышевой линии человека показало, что тяжелая цепь 7В1 содержит сегмент УН зародышевой линии человека УН3-7, сегмент Ό зародышевой линии человека Ό3-10 и сегмент 1Н зародышевой линии человека Ι||6Β. Дальнейший анализ последовательности клона 7В1 УН с использованием системы определения области гипервариабельных участков по КаЬа! позволил определить участки СОВ1, СЭВ2 и СЭ3 тяжелой цепи, как показано на фиг. 3А и в 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6 и 9 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина клона 7В1 с известными последовательностями иммуноглобулинов тяжелых цепей в зародышевой линии человека показало, что легкая каппа-цепь 7В1 содержит сегмент УК зародышевой линии человека УКА27 и сегмент 1К зародышевой линии человека 1К2. Дальнейший анализ последовательности клона 3С10 УК с использованием системы определения области гипервариабельных участков по КаЬа! позволил определить участки СОВ1, СЭВ2 и ί.Ό3 легкой цепи, как показано на фиг. 3В и в 8Е0 ΙΌ N0: 12, 15 и 18 соответственно.
Последовательности нуклеотидов и аминокислот УН клона 3С10 показаны на фиг. 1А и в 8Е0 ΙΌ N0: 25 и 19 соответственно. Последовательности нуклеотидов и аминокислот Уъ клона 3С10 показаны на фиг. 1В и в 8Е0 ΙΌ N0: 28 и 22 соответственно. Последовательности нуклеотидов и аминокислот УН клона 3С10 показаны на фиг. 1А и в 8Е0 ΙΌ N0: 25 и 19 соответственно. Последовательности нуклеотидов и аминокислот Уъ клона 3С10 показаны на фиг. 1В и в 8Е0 ΙΌ N0: 28 и 22 соответственно.
Фиг. 4 показывает выравнивание вариабельной последовательностей аминокислот тяжелой цепи клонов 3С10 и 6А4 (8Е0 ΙΌ N0: 19 и 20 соответственно) с последовательностью аминокислот, кодируемой в зародышевой линии сегментом УН 3-33 (8Е0 ΙΌ N0: 31). Показаны участки СОВ1, СЭВ2 и СЭВ3.
Фиг. 5 показывает выравнивание вариабельной последовательностей аминокислот легкой каппацепи клонов 3С10 и 6А4 (8Е0 ΙΌ N0: 22 и 23 соответственно) с последовательностью аминокислот, кодируемой в зародышевой линии сегментом УКЬ6 (8Е0 ΙΌ N0: 33). Показаны участки СОВ1, СЭВ2 и СЭВ3.
Фиг. 6 показывает выравнивание вариабельной последовательностей аминокислот тяжелой цепи клона 7В1 (8Е0 ΙΌ N0: 21) с последовательностью аминокислот, кодируемой в зародышевой линии сегментом УН3-7 (8Е0 ΙΌ N0: 32). Показаны участки СОВ1, СЭВ2 и СЭВ3.
Фиг. 7 показывает выравнивание вариабельной последовательностей аминокислот легкой каппацепи клона 7В1 (8Е0 ΙΌ N0: 24) с последовательностью аминокислот, кодируемой в зародышевой линии сегментом УКА27 (8Е0 ΙΌ N0: 34). Показаны участки СОВ1, СЭВ2 и СЭВ3.
Вариабельные участки 3С10, 6А4 и 7В1 можно преобразовать в полноразмерные антитела любого желаемого изотипа с использованием стандартных методов работы с рекомбинантной ДНК. Например, ДНК, кодирующую участки УН и Уъ, можно клонировать в вектор экспрессии, который несет константные участки тяжелой и легкой цепей таким образом, что вариабельные участки будут функционально связаны с константными участками. Кроме того, для экспрессии полноразмерных тяжелой цепи и легкой цепи можно использовать отдельные векторы. Не ограничивающие примеры векторов для экспрессии, пригодные для использования при создании полноразмерных антител, включают векторы рЬЕ, описанные ΒΜ в патенте США № 2005/0153394.
Пример 3. Исследование свойств связывания моноклональных антител к мезотелину.
В этом примере связывание МАт 3С10, 6А4 и 7В1 с мезотелином на поверхности клетки исследовали с помощью проточной цитометрии. Кроме того, исследовали кинетику связывая с мезотелином путем анализа методом Β^^ΚΕ.
А. Исследования с помощью проточной цитометрии.
Для проверки способности антител связываться с белком мезотелином на поверхности клетки антитела инкубировали с четырьмя разными экспрессирующими мезотелин клетками: 0УСАВ3 (обозначение в коллекции АТСС НТВ-161, линия клеток рака яичника человека), NСI-Н226 (обозначение в коллекции АТСС СВЬ-5826, производное мезотелиомы легкого человека), СЕРАС-1 (обозначение в коллекции АТСС СВЬ-1918, линия клеток рака поджелудочной железы человека) и КВ (обозначение в коллекции АТСС ССЬ-17, линия клеток карциномы ротовой полости человека). Для исследования с помощью проточной цитометрии моноклональные антитела 3С10, 6А4 и 7В1 разводили в холодном 1х фосфатносолевым буфером (ФСБ) + 0,1% Β8А до 40 мкг/мл. Для реакции связывания 50 мкл разбавленного раствора антитела добавляли к 50 мкл суспензии клеток, содержащей 4х 105 клеток, смесь помещали в лед на 30-60 мин. Клетки затем троекратно отмывали 1х ФСБ + 0,1% Β8А. Добавляли разбавленные 1:50 меченые В-фикоэритрином антитела козы к фрагменту ΙβΟ человека ЕуЕ(аЬ)2 IттиηοВекеа^сЬ ЬаЬк,
- 58 018396 кат. №109-116-098), смесь помещали в лед на 1 ч, после чего ее дважды промывали холодным 1х ФСБ + 0,1% В8А. После последней промывки к каждому раствору добавляли 200 мкл холодного 1х ФСБ + 0,1% В8А, анализ связывания антитела проводили с помощью флюоресцентного клеточного сортинга.
Результаты анализа с помощью проточной цитометрии суммированы ниже в табл. 1, которые показывают ЕС50 для связывания с четырьмя различными линиями клеток. Результаты демонстрируют, что все три моноклональных антитела эффективно связываются с мезотелином человека на поверхности клеток.
Таблица 1: Связывание антител к мезотелину з клетками,
экспрессирующими мезотелин человека
Антитело Клетки ОУСАВЗ ЕС50 (нМ) Клетки N01- Н226 ЕС50 (нМ) Клетки СЕРАС-1 ЕС50 (нМ) Клетки КВ ЕС50 (нМ)
зсю 0.2126 0.1968 0.1933 0.1441
6А4 0.1697 0.1556 0.1932 0.1815
7В1 0.1103 0.6642 0.0643 0.06793
В. ВТАсоге анализ.
Связывание антител 3С10, 6А4 и 7В1 с рекомбинантным растворимым белком слияния, мезотелином человека-Ь1к, исследовали с помощью ВГАсоге™, используя метод захвата. Антитела 3С10, 6А4 и 7В1 каждое отдельно захватывали на белок С (Р1егсе, КоскГогб, Ш), покрывающий чип СМ5 при высокой плотности (4000 Ед.). Покрытие проводили на основании стандартной процедуры иммобилизации, рекомендованной изготовителем. Затем очищенное антитело 3С10, 6А4 или 7В1 захватывали на белок С, серию концентраций рекомбинантного белка слияния мезотелин человека-Ь1к (450, 225, 112,5, 56, и 28 нМ) проводили над захваченным антителом в течение 2 мин при скорости течения 25 мкл/мл. Антиген оставляли диссоциировать в течение 8 мин. На чип помещали контрольные изотипы, данные использовали для вычитания неспецифического связывания. Весь анализ проводили на приборе для поверхностного плазмонного резонанса ВРАсоге 2000 или 3000 с использованием программного обеспечения ВРАсоге Соп!го1 ν4.01. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Β^аЕνа1иа!^οη ν4.01.
Результаты показаны в табл. 2 ниже. Результаты теста В^соге для 3С10, 6А4 и 7В1 подтверждали результаты проточной цитометрии о том, что все три антитела способны связываться с высокой аффинностью с мезотелином человека.
Таблица 2: Аффинность связывания с рекомбинантным мезотелином человека и кинетики антител к мезотелину
Антитело Ко х 10~у (М) коп (1/Мз) х Ю4 ко££ (1/з) х 10-4
ЗСЮ 5.8 6.30 3 . 62
6А4 5.9 6.39 3.77
7В1 2.4 7.15 1.71
Для исследования эпитопов, связываемых моноклональными антителами 3С10, 6А4 и 7В1, провели анализ связываемых эпитопов с помощью метода ВРАсоге. Моноклональные антитела 3С10 и 7В1 ковалентно пришивали на чип СМ5 (чип, покрытый карбоксиметилдекстраном) через первичную аминогруппу, используя стандартные способы химического связывания аминогрупп и набор ВРАсоге. Смеси комплексов антиген-антитело изменяли с использованием серии разбавлений в два раза, начиная с концентрации между 50 и 500 нМ. Концентрация мезотелина была между 22 и 44 нМ. Антитела и мезотелин предварительно инкубировали по меньшей мере 1 ч до инъекции. Смеси антиген-антитело (15 мкл) вводили со скоростью течения 6 мкл/минуту. Антитела, которые имеют перекрывающиеся эпитопы, конкурируют (уменьшение ответа с возрастанием концентрации антитела), в то время как антитела с различающимися эпитопами одновременно связываются с антигеном (возрастание ответа с возрастанием концентрации антитела). Результаты показали, что тАЬ 3С10 связывает тот же (или очень похожий эпитоп), что и описанное ранее моноклональное антитело мыши к мезотелину К1. Антитело 7В1 имеет эпитоп связывания, отличный от эпитопа 3С10 и К1. Моноклональное антитело 6А4 способно блокировать связывание с рекомбинантным мезотелином как 3С10, так и 6А4.
Пример 4. Характеристика стабильности моноклональных антител к мезотелину.
В этом примере изучали стабильность тАЬ 3С10, 6А4 и 7В1 с помощью химической денатурации и анализа температурной стабильности следующим образом.
Стабильность моноклональных антител к мезотелину сравнивали путем измерения средней точки химической денатурации с помощью флюоресцентной спектроскопии. Измерение флюоресценции от химической денатурации проводили на приборе 8РЕХ Р1иого1од 3.22, оснащенном планшетным считывателем М1сготах (8РЕХ, Еб1коп, N1). Измерения проводили на образцах антитела, которые оставались в равновесии в течение 20 ч при 16 различных концентрациях гидрохлорида гуанидина (СбНСЬ) в буфере ФСБ, с ионной силой от 0 до 6 моль. Измерения проводили в черных 384-луночных планшетах малого
- 59 018396 объема, с не связывающей поверхностью (Согшпд, Ас!оп, МА), требовался 1 мкМ антитела в объеме лунки 12 мкл. Флюоресценцию возбуждали при 280 нм, спектры эмиссии измеряли между 320 и 400 нм. Скорость сканирования была 1 с на 1 нм, щели были установлены на ширину полосы 5 нм. Из данных автоматически вычитали измерения для чистого буфера, сделанные с использованием ФСБ. Данные помещали в модель денатурации с двумя состояниями с использованием программного обеспечения ОгарЪРаб Рпкт. Результаты, выраженные в виде молярной концентрации ОбНС1, которая соответствовала средней точке денатурации, показаны ниже в табл. 3.
Температурную стабильность моноклональных антител к мезотелину определяли с помощью калориметрического анализа температуры плавления антител.
Калориметрические изменения температур плавления (Тпл) проводили с помощью микрокалориметрической платформы для дифференциального сканирования УР-СарШагу Э8С, которая соединена с автоматическим семплером (М1сгоСа1 ЬЬС, ХогФатр^оп, МА, и8А). Данные о денатурации антител получали путем нагревания образцов в концентрации 0,25 мг/мл, от 30 до 95°С со скоростью 1°С/минута. Образцы антител находились в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,4. Такой же буфер использовали в контрольной ячейке для получения для сравнения молярной теплоемкости. Наблюдаемые термограммы корректировали относительно исходного уровня, нормализованные данные анализировали, основываясь на модели не двух состояний с использованием программного обеспечения Опдш ν7.0. Результаты, выраженные в виде температуры (в С°), при которой наблюдали пики, указывающие на плавление антитела, показаны в табл. 4 ниже.
Результаты выше показывают, что антитела 3С10, 6А4 и 7В1 имеют желаемые свойства химической и температурной стабильности.
Пример 5. Интернализация антител к мезотелину.
В этом примере была изучена способность антител 3С10, 6А4 и 7В1 к интернализации мезотелинвырабатывающими клетками.
В первой серии анализов интернализация антител была изучена с помощью метода Нит-ΖΛΡ. В процедуре метода Нит-ΖΛΡ (наборы для которого можно приобрести в Абνаηсеб Тагдейпд 8ук!етк, 8ап О1едо, СА) антитела к мезотелину прореагировали с мезотелин-вырабатывающими клетками и с антителами козла к человеческим антителам 1дО, связанными с токсином сапорином (инактивирующий рибосомы белок). Во время интернализации первичных антител к мезотелину вторичные антитела, связанные с сапорином, также проникают в клетку, в результате чего ингибируется синтез белка и клетка погибает в течение 2-4 дней.
А именно, клетки были разведены до концентрации 5х104 клеток/мл в среде клеточной культуры. В каждую ячейку 96-ячеечной пластинки тканевой культуры добавили 50 мкл разведенных клеток и оставили на ночь при температуре 37°С, 5% СО2. Антитела развели в среде культуры до концентрации 4 и 0,4 мкг/мл. 25 мкл разведенных антител добавили в клеточную культуру таким образом, что конечная концентрация антител стала 1 и 0,1 мкг/мл. Клетки и антитела инкубировали 10 мин, после чего добавили 25 мкл реагента Нит-ΖΛΡ в концентрации 8 мкг/мл. Затем полученную смесь инкубировали 72 ч при температуре 37°С, 5% СО2. 100 мкл СеШйег-Θίο (краситель, определяющий жизнеспособность) добавили в каждую ячейку и осторожно поболтали 2 мин. Через 10 мин пластинки проанализировали с помощью прибора Рготеда Уегйак М1сгор1а!е Ьитша!ог при комнатной температуре.
Тест Нит-ΖΛΡ проводился с использованием мезотелин-вырабатывающих клеточных линий ХС1Н226, СЕРАС-1 и КВ (как описано в примере 3) в качестве клеток-мишеней, а также клеток СНО, модифицированных таким образом, что они выделяют мезотелин на клеточную поверхность через связь с ΘΡΙ (гликозил-фосфатидил-инозитолом) (СНО-мезотелин). Качественные результаты можно увидеть в табл. 5 ниже.
- 60 018396
Таблица 5: Интернализация антител к мезотелину, исследованная с помощью метода Нит-ΖΑΡ
Антитело СНОмезотелин ΝΟΙ-Η226 СЕРАС-1 КВ
ЗСЮ + Не Не +
определена определена
6А4 + + + +
7В1 + Не Не + /-
определена определена
Результаты Ниш^АР показали, что антитела 6А4 интернализовались всеми четырьмя клеточными линиями. Антитела 3С10 и 7В1 также интернализовались клетками СНО-мезотелин. Кроме того, антитела 3С10 интернализовались клетками КВ, в то время как антитела 7В1 интернализовались клетками КВ хуже, чем остальные 2 типа антител.
На второй стадии анализов изучалась интернализация антител 6А4 клетками N0-11226 с помощью иммунофлуоресценции. В этой процедуре клетки ΝΟ-Η226 вырастили до 80% непрерывности слоя. Связываемые клетки собрали с помощью диссоциирующего клеточного буфера (Се11 8!г1ррег), затем 1,35х106 клеток перенесли в 15-миллилитровую коническую пробирку и один раз промыли буфером РАС8 (фосфатно-солевой буфер + 2% фетальная коровья сыворотка). Клетки инкубировали с антителами 6А4 в концентрации 20 мкг/мл, в 450 мкл буфера РАС8 (фосфатно-солевой буфер + 2% фетальная коровья сыворотка) при 4°С в течение 30 мин, затем промыли холодным буфером РАС8. Затем клетки окрасили выявляющими антителами - антителами козы к человеческому иммуноглубулину 1дС, связанными с родамином в концентрации 20 мкг/мл в буфере РАС8 при 4°С в течение 30 мин, после чего промыли холодным буфером РАС8. Данный комплекс рецептора и антитела затем опять поместили в 450 мкл буфера РАС8 и инкубировали вместе с клетками при 37°С/5% СО2 определенные промежутки времени (0, 5, 10, 15, 30, 60, 120 мин и в течение ночи) для завершения интернализации. В указанные временные точки 50микролитровые образцы, соответствующие 150000 клеткам, поместили на 96-ячеечные пластинки и окрасили с помощью конъюгата эмбрионального агглютинина пшеницы и А1еха Ейюг 488 (Ιηνί!Γο^η, Са!. #Ш11261), окрашивающего клеточную поверхность. Клеточные образцы инкубировали в ледяной бане 30 мин с 10 мкг/мл эмбрионального агглютинина пшеницы в буфере РАС8, после чего промыли буфером РАС8. В завершение, клетки промыли буфером РАС8, зафиксировали, добавив 2% параформальдегид и проанализировали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии на предмет наличия ассоциированной иммунофлуоресценции, используя длины волн возбуждения/эмиссии, равные 495/519 и 554/570 для А1еха488 и родамина соответственно. Результаты подтвердили, что антитела 6А4 эффективно интернализовались клетками ΝΟ-Η226.
Пример 6. Ингибирование связывания мезотелина с СА125 антителами к мезотелину.
Для определения способности антител к мезотелину к ингибированию связывания мезотелина с СА125 выполнили ίη νί!Γο процедуру гетеротипической адгезии клеток. В этом тесте исследовали способность антител к ингибированию адгезии клеток ОУСАЯ3 (линия раковых яйцеклеток, вырабатывающих СА125) к клеткам СНО, модифицированных таким образом, что они выделяют мезотелин на клеточной поверхности (СНО-мезотелин). Адгезия клеток ОУСАЯ3 (описанная далее в примере 3) к СНОмезотелиновым клеткам опосредована взаимодействием мезотелина с СА125.
Для исследования взаимодействия мезотелин/СА125 клетки ОУСАЯ посеяли на 96-ячеечные пластинки с плотностью 4х104 клеток/200 мкл на ячейку на 24 ч перед экспериментом, чтобы получить единую клеточную культуру. Через 24 ч среду удалили и в ячейки добавили свежую среду, содержащую 1% коровий сывороточный альбумин (В8А) плюс 10 мкг/мл антител (3С10, 7В1, 6А4, изотипичный контроль или без антител). Клетки инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 30 мин. СΗО-8 (родительские клетки) и СНО-мезотелиновые клетки инкубировали 30 мин с кальцеин-ацетоксиметилом (Са1сеш АМ, 5 мкМ для 6х106 клеток/мл), промыли средой и добавили в культуры ОУСАЯ, после чего инкубировали 60 мин при 37°С.
После инкубации образцы промыли фосфатно-солевым буфером 4 раза, чтобы удалить несвязанные клетки. Количество связавшихся клеток определили путем добавления 100 мкл/ячейка фосфатносолевого буфера 8упе^ду-ΗТ флуоресцентным измерителем с длиной волны 494/517 нм.
Результаты показаны на фиг. 8. Они показали, что клетки ОУСАЯ3 адгезировались к СНОмезотелиновым клеткам в отсутствие антител, однако не связались с контрольными клетками СΗО-8, не несущими мезотелин на поверхности. Далее, присутствие антител 3С10 или 6А4 вызвало ингибирование клеточной адгезии на уровне приблизительно 68,7 и 84,8% соответственно в сравнении с контрольными антителами (ЭТ). Антитела 7В1, напротив, не выказали ингибиторной активности по отношению к взаимодействию мезотелина и СА125. Это означает, что эпитоп мезотелина, с которым связывался 7В1 (который отличается от эпитопов 3С10 и 6А4), не блокирует регион взаимодействия мезотелина и СА125.
Пример 7. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность.
Для определения способности антител 6А4 убивать клетки, продуцирующие мезотелин в присутст
- 61 018396 вии эффекторных клеток путем антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС), использовали метод флуоресцентной цитотоксичности. Клетки СНО, модифицированные для экспрессии ассоциирующегося с мембраной 40 кДа фрагмента мезотелина на клеточной поверхности (СНО-мезотелиновые клетки), использовались как клетки-мишени.
Эффекторные клетки человека были взяты из цельной крови, как описано ниже. Мононуклеарные клетки (моноциты) периферической крови человека были выделены из гепаринизированной цельной крови с помощью стандартной сепарации, используя фиколл (ЕюоП-рацие). Клетки внесли в среду КРМ11640, содержащую 10% фосфатно-солевой буфер (инактивировав нагреванием) и 200 ед./мл интерлейкина-2 человека, и оставили на ночь при 37°С. На следующий день клетки собрали, промыли 4 раза в среде культуры и посеяли в концентрации 2х107 клеток/мл. СНО-мезотелиновые клетки-мишени получили, инкубируя с реактивом ВАТЭА (бис(ацетоксиметил) 2,2':6',2-терпиридина-6,6-дикарбоксилат, Регкш Е1тег, ^е11ек1еу, МА) в концентрации 2,5 мкл ВАТЭА на 1х106 клеток-мишеней/мл при 37°С 20 мин. Клетки-мишени промыли 4 раза, центрифугировали и оставили конечный объем таким, чтобы концентрация стала 1 х105 клеток/мл.
СНО-мезотелиновые клетки были исследованы на антитело-специфичную АЭСС (антителозависимую клеточную цитотоксичность) с моноклональными антителами к мезотелину человека 6А4 с использованием флуоресцентного иммуноанализа ЭЕЬЕ1А, как описано ниже. СНО-мезотелиновые клетки (100 мкл меченых клеток-мишеней, 10 клеток/ячейка) были инкубированы с 50 мкл эффекторных клеток (10 клеток/ячейка) и 50 мкл антител (конечная концентрация 10 мкг/мл). Во время анализа поддерживалось соотношение мишеней к эффекторам, равное 1:100. Во всех исследованиях отрицательным контролем служил изотип 1дС1 иммуноглобулина человека. Клетки центрифугировали на скорости 2000 об/мин и инкубировали 1 ч при 37°С. Взяли верхнюю (не осажденную) фракцию, центрифугировали и поместили 20 мкл верхней (не осажденной) фракции на плоскую пластинку, куда добавили 180 мкл раствора Ей (Регкш Е1тег, ^е11ек1еу, МА), затем проанализировали с помощью прибора КиЬу8!аг геабег (ВМС ЬаЬ!есй). Процент лизиса был вычислен так: (выход образца - спонтанный выходх100)/(максимальный выход - спонтанный выход), где спонтанный выход - это флуоресценция образцов из ячеек, содержащих клетки-мишени плюс клетки-эффекторы, а максимальный выход - это флуоресценция образцов из ячеек, содержащих клетки-мишени, обработанные 2% буфером Тп!ои-Х.
Результаты приведены в табл. 6 ниже, где указаны значения ЕС50 в нМ.
Таблица 6: Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность, вызванная антителами 6А4
Антитело ЕС50 (нМ)
6А4 63.10
Изотипичный контроль 682.7
Из результатов видно, что моноклональные антитела 6А4 проявляют эффект АЭСС (антителозависимой клеточной цитотоксичности) к клеточным линиям, вырабатывающим мезотелин на поверхность клетки.
Пример 8. Ингибирование роста опухолей ш νινί) антителами к мезотелину 6А4.
В этом примере была исследована способность моноклональных антител (тАЬ) 6А4 ингибировать рост опухолей у мышей ш νΐνΌ как в форме голых антител, так и в форме конъюгатов с цитотоксином. Здесь, конъюгат 6А4 с цитотоксином относится к 6А4-цитотоксину А (6А4-Су!о!охш А), состоящему из антитела 6А4, связанного с цитотоксином А. Цитотоксин А и его синтез описаны ниже в 2008/083312, полное содержание которого включено в ссылку. Конъюгат 6А4-цитотоксин А (6А4Су!о!охш А) был получен, как описано ниже.
Антитело 6А4 взяли в концентрации около 5 мг/мл, буфер поменяли на 100 мМ фосфатный буфер, 50 мМ №С1, 2 мМ ЭТРА (диэтилентриаминопентаацетат) рН 8,0 и тиолировали, добавив на 60 мин 2иминотиолан, молярность которого в 8-10 раз выше, при комнатной температуре. После тиолирования буфер поменяли на 50 мМ ΗЕРЕ8 (4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновая кислота), содержащий 5 мМ глицин, 2 мМ ЭТРА (диэтилентриаминопентаацетат) и 0,5% повидон (10 К) рН 5,5. Степень тиолирования определили с помощью 4,4-дитиодипиридина, измерив выход тиопиридина при 324 нМ. Конъюгация была достигнута добавлением малеимида, содержащего препарат цитотоксин А, причем молярное соотношение препарата к тиолам было равно 3:1. Смесь инкубировали при комнатной температуре 60 мин, затем добавили ^этилмалеимид (КЕМ) в молярной пропорции 10:1 ^этилмалеимида к тиолам. После инкубации с ^этилмалеимидом полученные конъюгаты отделили с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке 8ерйасгу1-200 в 50 мМ 11ЕРЕ8- 5 мМ глицина, 100 мМ №С1, рН 6,0. Фракции, содержащие мономерные конъюгаты антител, отделили и концентрировали ультрафильтрацией. Соотношение концентрации и замены конъюгатов антител определили, измерив спектральную поглощательную способность (оптическую плотность) при 280-340 нм.
- 62 018396
Цитотоксин А имеет следующую структуру:
Специалисты в данной области оценят то, что хотя применился термин цитотоксин, указанная формула, в сущности, включает как специфическую цитотоксичную (молекула-партнер), так и связывающую группу для присоединения цитотоксина к антителу. Кроме того, после расщепления конъюгата токсин выделяется в форме про-препарата, которая затем гидролизуется с получением собственно токсина. Таким образом, строго говоря, молекула-партнер конъюгата согласно настоящему изобретению может рассматриваться либо как про-препарат, либо как собственно цитотоксин.
В первой серии экспериментов исследовали эффект 6А4 и 6А4-цитотоксин А на рост клеток ΝίΊН226 (мезотелиома легких; обозначение АТСС (американской коллекции типовых культур) СΚ^-5826) в модели ксенотрансплантанта мышей. В данной модели ксенотрансплантанта иммунодефицитным мышам 8С1Б (СВ17, Тасошс, Сегтап!о^п, ΝΥ) имплантировали 9х106 клеток NСI-Н226/мышь и растили клетки Ν^Ή226 36 дней. На 40-й день, когда средний объем опухоли составлял 87 мм3, мышам в случайном порядке интраперитонеально ввели 6А4 (10 мг/кг или 30 мг/кг) или конъюгат 6А4-цитотоксин (0,1 мкмоль/кг) одновременно с контролем: пустой переносчик (фосфатно-солевой буфер, ^3^х4), подобранные по изотипу антитела человека Ι§Θ1 (4Α3) или подобранные по изотипу антитела человека Ι§Θ1, связанные с цитотоксином А (изо-цитотоксин А).
Антитела 6А4 и их контроль ввели на 40, 43, 47 и 51-й день. Конъюгат 6А4-цитотоксин А ввели на 40 и 64-й день. Размер опухоли измерялся с регулярными интервалами до 105-го дня. На фиг. 9А и 9В показаны средний и срединный размеры опухоли соответственно у мышей, которым ввели пустой переносчик, 6А4-цитотоксин А (0,1 мкмоль/кг), изо-цитотоксин А (0,1 мкмоль/кг), неконъюгированный 6А4 и неконъюгированный изотипичный контроль (4А3). Как и предполагалось, притом, что ксенотрансплантированная модель мыши, использованная в настоящем исследовании, иммунодефицитна и поэтому не должна испытать выраженное влияние антителозависимой клеточной цитотоксичности (Αϋ^), введение пустых 6А4 не оказало никакого влияния на размер опухоли клеток N0-^26 (т.е. не ингибировало рост опухоли). В отличие от этого, введение конъюгата 6А4-цитотоксин А существенно ингибировало рост опухоли, как показано на чертежах фиг. 9А и 9В.
Во второй серии экспериментов исследовали эффект 6А4 и 6А4-цитотоксин А на рост клеток НРАС (аденокарцинома поджелудочной железы человека; обозначение АТСС (американской коллекции типовых культур) ΟΚΡ-2119) в модели ксенотрансплантанта мышей. Клетки НРАС (5х106 клеток/мышь) имплантировали иммунодефицитным мышам СВ17 8СГ0 и растили 8 дней. На 8-й день, когда средний объем опухоли составлял 96 мм3, мышам в случайном порядке интраперитонеально ввели 6А4 (10 или 30 мг/кг) или конъюгат 6А4-цитотоксин (0,15 мкмоль/кг) одновременно с контролем: пустой переносчик (фосфатно-солевой буфер, ^3^х4), подобранные по изотипу антитела человека ΙβΘ1 (4Α3; 30 мг/кг) или подобранные по изотипу антитела человека Ι§Θ1, связанные с цитотоксином А (2А10-цитотоксин А; 0,15 мкмоль/кг) и неконъюгированные 6А4 (8 мг/кг) или неконъюгированный изотипичный контроль (2А10; 8,7 мг/кг, 8Ό) в эквивалентных дозах белка. Антитела 6А4 и их контроль вводили в режиме дозировки ^3^х4 (по четыре дозы каждые три дня). Конъюгат 6А4-цитотоксин А и его контроль вводили в режиме дозировки одной дозой (8Ό). Размер опухоли измерялся с регулярными интервалами до 57-го дня.
Результаты показаны на фиг. 10А и 10В. На фиг. 10А и 10В показаны средний и срединный разме
- 63 018396 ры опухоли соответственно у мышей, которым вводили пустой переносчик, 6А4-цитотоксин А (0,15 мкмоль/кг), подобранный по изотипу конъюгат (2А10-цитотоксин А; 0,15 мкмоль/кг), соответственно массе неконъюгированные 6А4 (8 мг/кг), неконъюгированный изотипичный контроль (2А10; 8,7 мг/кг) в эквивалентной дозе белка, пустые 6А4 (10 или 30 мг/кг) или подобранные по изотипу пустые моноклональные антитела 1д01 (4А3; 30 мг/кг). По полученным данным пустые антитела 6А4 вызвали подавление роста опухолевых клеток НРАС, хотя ожидалось, что в ксенотрансплантированной модели мыши не возникнет выраженного эффекта АЭСС. Опять же, как и в предыдущем примере, введение конъюгата 6А4-цитотоксин А оказалось весьма эффективным в подавлении роста опухолевых клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека (НРАС).
В третьей серии экспериментов исследовали эффект 6А4-цитотоксин А на рост клеток рака яичника 0УСАЯ3 (обозначение АТСС (американской коллекции типовых культур) НТВ-161). В этой модели иммунодефицитным мышам СВ17 8СГО имплантировали 5х106 клеток 0УСАК3/мышь и растили 42 дня. На 42-й день размер опухоли в среднем составлял 100 мм3. Мышам интраперитонеально ввели конъюгат 6А4-цитотоксин А дозами 0,1 или 0,3 мкмоль/кг. В качестве контроля мышам вводили пустой переносчик (фосфатно-солевой буфер, по 4 дозы каждые 3 дня) либо 0,1 или 0,3 мкмоль/кг подобранные по изотипу антитела человека 1дС1, связанные с цитотоксином А.
Конъюгат 6А4-цитотоксин А и его контроль вводили на 42, 96, 132 и 176-й день. Как показано на фиг. 11, введение конъюгата 6А4-цитотоксин А существенно подавило опухолевый рост. В данном примере рост опухоли постоянно контролировался, включая 176-й день, когда ввели последнюю дозу 0,3 мкмоль/кг 6А4-цитотоксина А. Рост опухоли контролировался до 150-го дня для дозы 0,1 мкмоль/кг 6А4цитотоксина А. Изотипичный контроль оказался неэффективным в контролировании опухолевого роста (данные опущены).
Подводя итог, цитотоксичный конъюгат антител 6А4 (в дозах 0,1-0,15 мкмоль/кг) существенно ингибировал рост опухолей ш νί\Ό в трех разных ксенотрансплантированных моделях мышей.
Пример 9. Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЭСС), опосредованная нефукозилированными 6А4.
В этом примере показано, что нефукозилированные антитела 6А4 (6А4пГ) являются эффективными медиаторами АЭСС при раке легких и яичника. Флуоресцентный иммуноанализ ПЕЬНА показал, что нефукозилированные 6А4 уничтожают клетки, продуцирующие мезотелин Н226 (N8040) и 0УСАЯ3 (рак яичника) в присутствии клеток-эффекторов путем антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС). Сначала из цельной крови приготовили эффекторные клетки человека, как описано ниже. Мононуклеарные клетки (моноциты) периферической крови человека были выделены из гепаринизированной цельной крови с помощью стандартной сепарации, используя фиколл (НсоИ-расще). Клетки внесли в среду ЯРМ11640, содержащую 10% фосфатно-солевой буфер (инактивировав нагреванием) и 200 ед/мл интерлейкина-2 человека, оставили на ночь при 37°С. На следующий день клетки собрали, промыли 4 раза в среде культуры и посеяли в концентрации 2х 107 клеток/мл.
Затем меченые клетки Н226 или 0УСАЯ3 приготовили, инкубируя их с реактивом ВАТОА (бис(ацетоксиметил) 2,2':6',2-терпиридина-6,6-дикарбоксилат, Реткт Е1тег, ^е11ек1еу, МА). После этого клетки-мишени смешали с эффекторами и антителами. 100 мкл меченых клеток-мишеней (104 клеток/ячейка) инкубировали с 50 мкл эффекторных клеток (106 клеток/ячейка) и 50 мкл антител (с получением конечной концентрации, равной 10 мкг/мл). Во время эксперимента отношение мишеней к эффекторам поддерживалось равным 1:100. Контрольный изотип 1д01 (ни1д01) человека использовался как отрицательный контроль. Затем определили степень лизиса. Клетки центрифугировали при 2000 об/мин и инкубировали при 37°С 1 ч. Верхние (не осажденные) фракции собрали, центрифугировали, после чего 20 мкл верхней фракции перенесли на плоскую пластинку. Добавили 180 мкл раствора Ей (Реткт Е1тег, ^е11ек1еу, МА) и исследовали с помощью прибора ЯиЬу8(ат геабег (ВМС ЬаЫеск). Процент лизиса рассчитывался, как описано ниже: ((выход образца - спонтанный выход)х100)/(максимальный выход - спонтанный выход), где спонтанный выход - это флуоресценция из ячеек, содержащих клетки-мишени и эффекторные клетки, и максимальный выход - это флуоресценция из ячеек, содержащих клетки-мишени, обработанных 2% буфером ТтЬоп-Х. При использовании нефукозилированных 6А4 в клетках 0УСАК3 (фиг. 12а) Н226 (фиг. 12Ь) выявлена существенная антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЭСС).
Пример 10. Нефукозилированные 6А4 подавляли опухолевый рост 1п νί\Ό.
В другом эксперименте, 6А4пГ, в комбинации с гемцитабином существенно замедлили рост клеток Н226 в модели ксенотрансплантированной мыши. Иммунодефицитным мышам СВ17 8СГО имплантировали 9х 106 клеток Н226/мышь и позволили клеткам расти. На 23-й день средний размер опухоли равнялся 100 мм3. Мышам в случайном порядке интраперитонеально ввели 6А4пГ, 80 мг/кг гемцитабина, комбинацию 6А4пГ и гемцитабина, контрольный переносчик или изотипичный контроль 1дС1. 6А4пГ вводили в дозах 10 или 30 мг/кг. Рост Н226 ингибировался всеми комбинациями 6А4пГ и гемцитабина. Максимальное подавление было достигнуто, когда 6А4пГ вводили в дозах 30 мг/кг в комбинации с гемцитабином, что указывает на зависимость эффекта от дозы.
- 64 018396
Пример 11. Экспрессия мезотелина опухолевыми клетками.
Иммуногистохимический анализ с использованием антител 6А4 выявил их способность связываться с опухолями человека и определять степень экспрессии мезотелина опухолевыми клетками.
6А4 предварительно связали с фрагментами РаЬ козла, специфичными к человеку Цасккоп # 109097-003), меченными Р1ТС (флуоресцеина изотиоцианатом) таким образом, что конечная концентрация 6А4 равнялась 6 мкг/мл. Затем полученные комплексы использовали в стандартных иммуногистохимических процедурах для определения связывания. Показано, что 6А4 связывались с раком яичника, раком поджелудочной железы, раком легких, мезотелиомой, а также злокачественными опухолями головы и шеи. Дополнительные примеры связывания 6А4 со злокачественными опухолями головы и шеи включают рак надгортанника, гортани, слюнных желез, языка и тканей миндалин.
Пример 12. 6А4-цитотоксин А нетоксичен для Масаса ГакасЫапк (яванского макака).
Показано, что 6А4-цитотоксин А нетоксичен для яванского макака. Модель экспрессии мезотелина у этих животных сходна с таковой у людей. Также антитела 6А4 связываются с мезотелином яванских макак с таким же сродством, как и с мезотелином человека. Таким образом, яванские макаки оказались подходящими для исследования токсичного влияния 6А4-цитотоксина А.
6А4-цитотоксин А внутривенно ввели двум самкам и двум самцам яванских макак. Две дозы по 0,4 мкмоль/кг ввели в первый и 15-й день. За животными наблюдали, отмечая поведенческие изменения, знаки токсичности и проводя анализы крови. У животных не было выявлено проявления токсического эффекта.
В 3, 2, 7, 14, 21 и 28 день была взята кровь и исследованы многие параметры. Существенных изменений в лейкоцитах, эритроцитах, тромбоцитах, ретикулоцитах, процентном количестве нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, неокрашенных клеток, гемоглобине, гематокрите, среднем объеме эритроцита, среднем содержании гемоглобина в эритроците, средней концентрации гемоглобина в эритроците, свертываемости, тесте Эпта, альбумине, общем белке, глобулине, билирубине, азоте в моче, креатинине, щелочной фосфатазе, аланин-трансферазе, аспартат-трансферазе, глутамилтрансферазе, глюкозе, холестерине, кальции, хлориде, фосфоре, калии, натрии и триглицеридах обнаружено не было.
После проведения вскрытия на 28-й день не было обнаружено изменений, связанных с препаратом, в следующих органах: надпочечники, аорта, грудина, головной мозг, слепая кишка, двенадцатиперстная кишка, толстая кишка, пищевод, глаза, зрительный нерв, бедро, желчный пузырь, сердце, подвздошная кишка, тощая кишка, почки, лимфатические узлы, печень, легкие, молочные железы, тек, седалищный нерв, яичники, поджелудочная железа, гипофиз, паращитовидные железы, анус, слюнные железы, кожа, скелетные мышцы, селезенка, желудок, щитовидная железа, тимус, спинной мозг, трахея, мочевой пузырь, матка, влагалище, копчик, место введения, маточные трубы, мочеточник и пейеровы бляшки.
- 65 018396
ОБЗОР СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
5Εζ) 10 N0: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОС ТЬ 2Е<2 Ιϋ N0: ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОС ТЬ
1 νΗ СОВ1 а.а. ЗС10 25 νΗ п.Ь. ЗС10
2 Ун С0Е1 а.а. 6А4 26 νΗ η.С. 6А4
3 νΗ ΟϋΚΐ а.а. 7В1 27 νΗ η.С. 7В1
4 С0К.2 вариабельной области тяжелой цепи а.а. ЗС10 28 νκ η.С. ЗС10
5 СОК2 вариабельной области тяжелой цепи а.а. 6А4 29 νκ η.С. 6Ά4
б С0К2 вариабельной области тяжелой цепи а.а. 7В1 30 νκ η.С. 7Β1
7 СОВЗ вариабельной области тяжелой цепи а.а. ЗС10 31 а.а. зародышевой линии νΗ 3-33
8 СОКЗ вариабельной области тяжелой цепи а.а. 6А4 32 а.а. зародышевой линии νΗ 3-7
9 СБКЗ вариабельной области тяжелой цепи а.а. 7В1 33 а.а. зародышевой линии Ук Ьб
10 Ук С0К1 а.а. ЗС10 34 а.а. зародышевой линии А2 7
- 66 018396
11 νκ СОК1 а.а. 6А4 35 фрагмент ЗС10 УН, представленный на Фиг. 4
12 νκ СОК1 а.а. 7В1 36 6А4 УН ГгадтепЕ ргезепкеЦ ίη Е1д. 4
13 νκ СОК2 а.а. ЗС10 37 фрагмент ИК4, представленный на Фиг.4.5
14 νκ ΟϋΚ2 а.а. 6А4 38 фрагмент ИН6Ь, представленный на Фиг. 4 6
15 νκ СОК2 а.а. 7В1 39 фрагмент СГК2, представленный на Фиг. 4 7
16 νκ СОКЗ а.а. ЗС10 40 Последовательное т пептидного конъюгата
17 Ук СОВЗ а.а. 6А4 41 Последовательное т пептидного конъюгата
18 νκ СОКЗ а.а. 7В1 42 Последовательное т пептидного конъюгата
19 νΗ а.а. ЗС10 43 Последовательное т пептидного конъюгата
20 νΗ а.а. 6А4
21 νΗ а.а. 7В1
22 νκ а.а. ЗС10
23 νκ а.а. 6А4
24 Ук а.а. 7В1
- 67 018396
Список последовательностей <110> Мебагех 1пс.
ТеггеЬР, ЛопаТНап А.
Родие, ЗагаН Ь.
Тоу, КгазЕорЪег
Уапд, Ьап
Као-баЬк, СЬекапа
СНеп, ВапдНапд <120> АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА К МЕЗОТЕЛИНУ И ПРИМЕНЕНИЕ ТАКИХ АНТИТЕЛ <130> 0192РС <140> ИО 00/000000 <141> 2008-10-01 <150> из 60/976626 <151> 2007-10-01 <150> из 60/991,692 <151> 2007-11-30 <150> 03 61/077,397 <151> 2008-07-01 <160>43 <170> РакепЫп уегзюп 3.5 <210> 1 <211>5 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <400>1
Не Туг С1у Мек Н13 <210> 2 <211>5 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <400>2
11е Туг О1у МеЕ Н15 <210>3 <211>5 <212> РЕТ <213> Ното заргепз <400>3
Агд Туг Тгр МеЕ Зег <210>4 <211>17
- 68 018396 <212>
<213>
РКТ
Ното зарЬепз <400>
17а1 11е Тгр
Туг Азр
С1у
Зег
ΗΪ3 <31и
Туг
Туг
А1а
Азр
Зег
Уа1
Ьуз
С1у <210> <211>
<212>
<213>
РКТ
Ното зарЬепз <4 0 0>
Уа1 Ьеи Тгр
Туг Азр
СНу
Зег
ΗΪ3
С1и
Туг
Туг
А1а
Азр
Зег
Уа1
Ьуз
С1у <210> <211>
<212>
<213>
б
РКТ
Ното зарЬепз <400>
Зег Не Ьуз
31п А1а
СНу
Зег
С1и
Ьуз
ТЬг
Туг
Уа1
Азр
Зег
Уа1
Ьуз
СНу <210> <211>
<212>
<213>
РКТ
Ното зарЬепз <4 О 0>
Азр С1у Азр
Туг Туг
Азр
Зег
С1у
Зег
Рго
Ьеи
Азр
Туг <210>
<211>
<212>
<213>
РКТ
Ното зарЬепз <400>
Азр С1у Азр
Туг Туг
Азр
Зег
С1у
Зег
Рго
Ьеи
Азр
Туг
- 69 018396
<210> 9
<211> 22
<212> РКТ
<213> Ното зариепз
<4 00 > 9
31и С1у А1а Туг Туг Туг Азр Зег
1 5
Туг Туг Зег МеЕ Азр 20 Уа1
<210> 10
<211> 11
<212> РКТ
<2 13> Ното зарЬепз
<400> 10
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<4 0 0> 11
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 12
Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<400> 13
Азр А1а . Зег Азп Агд А1а ТЬг
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зариепз
Туг Ьеи А1а
Туг Ьеи А1а
Зег Туг Ьеи А1а
А1а Зег Туг Туг Рго Туг Туг Туг
15
- 70 018396 <400> 14
Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зариепз
<4 0 0> 15
01у А1 а Зег Зег Агд А1а ТЬг
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зарЬепз
<4 0 0> 16
С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Ьеи
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<400> 17
С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Ьеи
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<4 00> 18
С1п С1п ι Туг С1у Зег Зег С1п Туг
1 5
<210> 19
<211> 122
<212> РКТ
<213> Ното зариепз
<400> 19
С1п Уа1 . Туг Ьеи Уа1 С1и Зег С1у
1 5
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а
20
ТЬг
ТЬг
ТЬг
С1у С1у \7а1 Уа1 С1п Рго С1у Агд
15
Зег С1у Не ТЬг РЬе Зег 11е Туг
30
- 71 018396
С1у МеЕ Н13 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
А1а Уа1 Не Тгр Туг Азр С1у Зег Н13 С1и Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз <31 у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи Ьеи МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр С1у Азр Туг Туг Азр Зег С1у Зег Рго Ьеи Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 20
<211> 122
<212> РРТ
<213> Ното зарРепз
<400> 20
С1п Уа1 Н13 Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 С1п Рго С1у Агд
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз Уа1 А1а Зег С1у 11е ТЬг РЬе Агд 11е Туг
20 25 30
(31 у МеЕ Н13 Тгр \7а1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Уа1 Ьеи Тгр Туг Азр С1у Зег Н13 С1и Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а 11е Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр С1у Азр Туг Туг Азр Зег С1у Зег Рго Ьеи Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 21
- 72 018396 <211>131 <212> РРТ <213> Ното зар1епз <400>21
С1и 1 Уа1 Н13 Ьеи Уа1 5 С1и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго СИу 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Агд Туг
20 25 30
Тгр Мек Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а С1п С1у Ьуз С1у Ьеи (Ии Тгр Уа1
35 40 45
А1а Зег Не Ьуз С1п А1а С1у Зег С1и Ьуз ТЬг Туг Уа1 Азр Зег \7а1
50 55 60
Ьуз С1у Агд Рке ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Зег
65 70 75 80
Ьеи С1п Мек Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и С1у А1а Туг Туг Туг Азр Зег А1а Зег Туг Туг Рго Туг
100 105 110
Туг Туг Туг Туг Зег МеЬ Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг
115 120 125
Уа1 Зег Зег
130
<210> 22 <211>107 <212> ΡΚΤ <213> Ното зарЬепз <400>22
СИи 1 11е Уа1 Ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго А1а ТЬг 10 Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 15 СИу
СИи Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег СИп Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у 21п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у Не Рго А1а Агд РЬе Зег СИу
50 55 60
- 73 018396
Зег 65 С1у Зег С1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не 75 Зег Зег Ьеи С1и Рго 80
С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> РРТ
<213> Ното зархепз
<400> 23
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго <31у
1 5 10 15
61и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105
<210> 24
<211> 108
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<4 0 0> 24
С1и 11е Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго С1у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
- 74 018396
Не Туг 50 С1у А1а Зег Зег Агд 55 А1а ТЬг С1у Пе Рго 60 Азр Агд РЬе Зег
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг С1у Зег Зег С1п
85 90 95
Туг ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз
100 105
<210>25 <211>366 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 25
саддЬдЬасс ЬддЕддадЬс Едддддаддс дЬддЕссадс ссдддаддкс ссЪдадасЬс 60
ЬссЕдЬдсад сдЬсЬддааЕ сассЬЬсадЬ аЕсЕаЬддса ЬдсасЬдддЬ ссдссаддсЕ 120
ссаддсаадд ддсЕддадЬд ддЬддсадЕЬ аЬаЬддЬаЕд аЬддаадЬса ЪдааЕасЬаЬ 180
дсадаскссд Едаадддссд аЬЬсассабс Ьссададаса аЬЬссаадаа сасдсЬдЪаЕ 240
сЕдсЕааЕда асадссЕдад адссдаддас асддсЕдЕдЬ аЬЬасЕдЬдс дададакддс 300
даЬЬаЕЬаЬд аЬЕсддддад ЬссЬсЬЕдас ЕасЕддддсс адддаасссЕ ддЬсассдЬс 360
ЬссЕса 366 <210> 26 <211>366 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 26
саддЕдсасс ЬддЕддадЕс Ьдддддаддс дЬддЬссадс скдддаддЬс ссЬдадасЕс 60
ЕссЕдЬдЬад сдйсЬддааЕ сассЬЕсадд аЬскаЬддса ЬдсасЬдддЕ ссдссаддск 120
ссаддсаадд ддсЕддадЬд ддЬддсадЬЬ ЕЕаЬддЬаЬд аЪддаадкса ЬдааЕасЕаЕ 180
дсадасЕссд Ьдаадддссд аЬЬсассаЬс Ьссададаса аЬЬссаадаа сасдсЕаЕаЬ 240
сЬдсааакда асадсскдад адссдаддас асддсЬаЬаЬ аЕЬасЬдЬдс дададакддс 300
даЬЬасЬаЬд аЬЬсддддад ЬссЬсЬЬдас ЬасЬддддсс адддаасссЬ ддЬсассдЬс 360
ЬссЕса 366
<210> <211> <212> <213> 27 393 ДНК Ното зариепз
<400> 27
- 75 018396
даддООсасс ОддОддадОс Одддддаддс ООддОссадс сОддддддОс ссОдадасОс 60
ОссОдОдсад ссОсОддаОО сассОООадО адаОасОдда ОдадсОдддО ссдссаддсО 120
саадддааад ддсОддадОд ддОддссадс аОааадсаад сОддаадОда даааассОаО 180
дОддасОсОд Одаадддссд аООсассаОс Оссададаса асдссаадаа сОсасОдОсО 240
сОдсаааОда асадссОдад адссдаддас асддсОдООО аООасОдОдс дадддадддд 300
дсаОаООасО аОдаООсддс дадООаООас ссООасОасО асОасОасад ОаОддасдОс 360
Оддддссаад ддассасддО сассдОсОсс Оса 393
<210> 28 <211>321 <212> ДНК <213> Ното зархепз <400> 28
даааООдОдО ОдасасадОс Оссадссасс сОдОсОООдО сОссадддда аададссасс 60
сОсОссОдса дддссадОса дадОдООадс адсОасООад ссОддОасса асадааассО 120
ддссаддсОс ссаддсОссО саОсОаОдаО дсаОссааса дддссасОдд саОсссадсс 180
аддООсадОд дсадОдддОс Одддасадас ООсасОсОса ссаОсадсад ссОададссО 240
даадаООООд садОООаООа сОдОсадсад сдОадсаасО ддссдсОсас ОООсддсдда 300
дддассаадд ОддадаОсаа а 321
<210>29 <211>321 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 29
даааООдОдО ОдасасадОс Оссадссасс сОдОсОООдО сОссадддда аададссасс 60
сОсОссОдса дддссадОса дадОдООадс адсОасООад ссОддОасса асадааассО 120
ддссаддсОс ссаддсОссО саОсОаОдаО дсаОссааса дддссасОдд саОсссадсс 180
аддООсадОд дсадОдддОс Одддасадас ООсасОсОса ссаОсадсад ссОададссО 240
даадаООООд садОООаООа сОдОсадсад сдОадсаасО ддссдсОсас ОООсддсдда 300
дддассаадд ОддадаОсаа а 321
<210>30 <211>318 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 30
дОдООдасдс адОсОссадд сасссОдОсО ООдОсОссад дддааададс сасссОсОсс 60
Одсадддсса дОсададОдО Оадсадсадс ОасООадссО ддОассадса дааассОддс 120
саддсОссса ддсОссОсаО сОаОддОдса Оссадсаддд ссасОддсаО сссадасадд 180
- 76 018396
ЬЬсадкддса дЬдддксЬдд дасадасЬЬс асксксасса ВсадсадасЕ ддадсскдаа 240
даккЬЕдсад Ьдкаккаскд ЬсадсадкаЬ ддкадсксас адкасасЬЬЬ Еддссадддд 300
ассаадскдд адаксааа 318
<210>31 <211>98 <212> ΡΚΤ <213> Ното зарЬепз <400>31
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 С1и Зег С1у С1у С1у 10 Уа1 Уа1 С1п Рго С1у 15 Агд
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у Рке Ткг Рке Зег Зег Туг
20 25 30
С1у Мек Юз Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Уа1 Не Тгр Туг Азр С1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд Рке Ткг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп Ткг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мек Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр Ткг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд <210>32 <211>98 <212> ΡΚΤ <213> Ното зарЬепз <400>32
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Уа1 5 С1и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у Рке Ткг Рке Зег Зег Туг
20 25 30
Тгр Мек Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Азп Не Ьуз С1п Азр С1у Зег С1и Ьуз Туг Туг Уа1 Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд 65 РЬе Азп ТЬг Зег 85 11е 70 Ьеи Зег Агд Агд А1а Азр С1и Азп Азр 90 А1а 75 ТЬг Ьуз А1а Азп Уа1 Зег Туг Ьеи Туг 95 Туг 80 Суз
Ьеи С1п А1а Агд Мек
<210> 33
<211> 95
<212> РРТ
<213> Ното зартепз
<4 0 0> 33
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Азр А1а Зег Азп Агд А1а ТЬг С1у 11е Рго А1а Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго
85 90 95
<210> 34
<211> 95
<212> РКТ
<213> Ното 5ар1епз
<4 0 0> 34
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго С1у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Зег Зег Зег
20 25 30
Туг Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи
35 40 45
11е Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг С1у 11е Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
- 78 018396
- 79 018396 <211> 4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность конъюгата пептида <400>40
А1а Ьеи А1а Ьеи <210>41 <211>4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность конъюгата пептида <220>
<221> М13С__ЕЕАТиКЕ <222> (1) . . (1) <223> X = Бета-аланин <400>41
Хаа Ьеи А1а Ьеи <210>42 <211>4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность конъюгата пептида <400>42
С1у РЬе Ьеи С1у <210>43 <211>4 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность конъюгата пептида <400> 43
Ьеи Ьеи СНу Ьеи

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное моноклональное антитело человека или его антигенсвязывающая часть, где антитело связывает мезотелин человека и проявляет по меньшей мере одно из следующих свойств:
    (a) связывается с мезотелином человека с Ко 1 х 10-8 М или меньше;
    (b) интернализуется клетками, экспрессирующими мезотелин;
    (c) ингибирует связывание мезотелина с антигеном рака яичников СА125;
    (б) проявляет антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) в отношении клеток, экспрессирующих мезотелин; или (е) ингибирует рост клеток, экспрессирующих мезотелин, ίπ νίνο в случае, если данное антитело
    - 80 018396 конъюгировано с цитотоксином;
    где антитело содержит:
    (a) СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 2;
    (b) С1Ж2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 5;
    (c) СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 8;
    (б) СЭК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 11;
    (е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 14; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 17;
    или (a) СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 1;
    (b) С1Ж2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 4;
    (c) СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 7;
    (б) СЭК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 10;
    (е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 13; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 16;
    или (a) СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 3;
    (b) С1Ж2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 6;
    (c) СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 9;
    (б) СЭК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 12;
    (е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 15; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 18.
  2. 2. Антитело по п.1, которое содержит:
    (a) СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 2;
    (b) С1Ж2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 5;
    (c) СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 8;
    (б) СЭК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 11;
    (е) СЭК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 14; и (ί) СЭК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Ер П) ХО: 17.
  3. 3. Антитело по п.1, где указанное антитело не содержит остатков фукозы.
  4. 4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, содержащее:
    (a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей 8Ер П) ХО: 19-21; и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей 8Ер П) ХО: 22-24;
    где антитело специфически связывается с белком мезотелина человека.
  5. 5. Конъюгат антитела с молекулой-партнером, содержащий антитело или его антигенсвязывающую часть по п.1 и молекулу-партнер, где молекула-партнер представляет собой терапевтическое средство.
  6. 6. Конъюгат антитела с молекулой-партнером по п.5, где терапевтическое средство представляет собой цитотоксин со структурой (ΐ) где X представляет собой элемент, выбранный из О, 8 и ХК23; где К23 является элементом, выбранным из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного гетероалкила и ацила;
    К1 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил, С(О)К8 или СО2К8; где К8 является элементом, выбранным из ХК9К10 и ОК9, в котором К9 и К10 являются элементами, независимо выбранными из Н, замещенного или незамещенного алкила или замещенного или незамещенного гетероалкила;
    К1 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил или С(О)К8;
    К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил или незамещенный гетероалкил или циано либо алкокси;
    К2 представляет собой Н, замещенный или незамещенной низший алкил или незамещенный гетероалкил;
    К3 представляет собой элемент, выбранный из 8К11, ХНК11 и ОК11, где К11 это Н, замещенный или
    - 81 018396 незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, монофосфаты, дифосфаты, трифосфаты, сульфонаты, ацил, С(О)В12В13, С(О)ОВ12, С(О)ИВ12В13, Р(О)(ОВ12)2, С(О)СНВ12В13, 8В12 или 81В12В13В14; и В12, В13 и В14 независимо представляют Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил и замещенный или незамещенный арил, где В12 и В13 вместе с атомом азота или углерода, к которому они присоединены, необязательно объединены с формированием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, имеющей от 4 до 6 элементов, необязательно содержащих два или более гетероатомов;
    В4, В4, В5 и В5 являются элементами, независимо выбранными из Н, замещенного или незамещенного алкила, замещенного или незамещенного арила, замещенного или незамещенного гетероарила, замещенного или незамещенного гетероциклоалкила, галогена, ИО2, ИК15В16, ИС(О)В15, ОС(О)ИК15В16, ОС(О)ОВ15, С(О)В15, 8В15, ОВ15, СВ15=ИВ16 и О(СН2)пИ(СН3)2, где п целое число от 1 до 20, или любая смежная пара В4, В4, В5 и В5 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, соединяются, формируя замещенную или незамещенную циклоалкиловую или гетероциклалкиловую кольцевую систему, имеющую от 4 до 6 элементов; где В15 и В16 независимо представляют собой Н, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил и замещенный или незамещенный пептидил, где В15 и В16 вместе с атомом азота, к которому они присоединены, необязательно, объединяются с образованием замещенной или незамещенной гетероциклоалкильной кольцевой системы, имеющей от 4 до 6 элементов, необязательно, содержащих два или более гетероатомов; и один из В3, В4, В4, В5 и В5 присоединяет цитотоксин к антителу или его антигенсвязывающей части через линкер.
  7. 7. Конъюгат антитела с молекулой-партнером по п.6, где антитело содержит:
    (a) СЭВ1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8ЕЦ ΙΌ ИО: 2;
    (b) СЭВ2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8ЕЦ ΙΌ ИО: 5;
    (c) СЭВ3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8ЕЦ ΙΌ ИО: 8;
    (ά) СЭВ1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8ЕЦ ΙΌ ИО: 11;
    (е) СЭВ2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8ЕЦ ΙΌ ИО: 14; и (Г) СЭВ3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8ЕЦ ΙΌ ИО: 17.
  8. 8. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата по п.5, и фармацевтически приемлемый носитель.
  9. 9. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающую часть по п.1.
  10. 10. Способ лечения рака у индивида, предусматривающий введение индивиду терапевтически эффективного количества антитела по п.1.
  11. 11. Способ по п.10, где рак представляет собой мезотелиому, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак желудка, рак легкого или рак эндометрия.
  12. 12. Способ по п.10, где рак выбран из группы, состоящей из папиллярной серозной аденокарциномы яичника, светлоклеточной карциномы яичника, смешанной карциномы мюллерова протока и яичника, эндометриоидной муцинозной карциномы яичника, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, серозной карциномы матки, аденокарциномы легкого, карциномы внепеченочного желчного протока, аденокарциномы желудка, аденокарциномы пищевода, аденокарциномы прямой и толстой кишки и аденокарциномы молочной железы.
  13. 13. Способ лечения рака у индивида, предусматривающий введение указанному индивиду терапевтически эффективного количества конъюгата по п.5.
  14. 14. Способ по п.13, где рак представляет собой мезотелиому, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак желудка, рак легкого или рак эндометрия.
  15. 15. Способ по п.13, где рак выбран из группы, состоящей из папиллярной серозной аденокарциномы яичника, светлоклеточной карциномы яичника, смешанной карциномы мюллерова протока и яичника, эндометриоидной муцинозной карциномы яичника, аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, серозной карциномы матки, аденокарциномы легкого, карциномы внепеченочного желчного протока, аденокарциномы желудка, аденокарциномы пищевода, аденокарциномы прямой и толстой кишки и аденокарциномы молочной железы.
EA201070412A 2007-10-01 2008-09-29 Антитела человека, которые связывают мезотелин, и применение таких антител EA018396B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US97662607P 2007-10-01 2007-10-01
US99169207P 2007-11-30 2007-11-30
US7739708P 2008-07-01 2008-07-01
PCT/US2008/078123 WO2009045957A1 (en) 2007-10-01 2008-09-29 Human antibodies that bind mesothelin, and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070412A1 EA201070412A1 (ru) 2010-10-29
EA018396B1 true EA018396B1 (ru) 2013-07-30

Family

ID=40526631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070412A EA018396B1 (ru) 2007-10-01 2008-09-29 Антитела человека, которые связывают мезотелин, и применение таких антител

Country Status (27)

Country Link
US (5) US8268970B2 (ru)
EP (1) EP2195017B1 (ru)
JP (1) JP5535074B2 (ru)
KR (2) KR101554848B1 (ru)
CN (1) CN101951946B (ru)
AR (1) AR068590A1 (ru)
AU (1) AU2008308956B2 (ru)
BR (1) BRPI0816014A8 (ru)
CA (1) CA2700860C (ru)
CL (1) CL2008002923A1 (ru)
CO (1) CO6300960A2 (ru)
CY (1) CY1116036T1 (ru)
DK (1) DK2195017T3 (ru)
EA (1) EA018396B1 (ru)
ES (1) ES2526355T3 (ru)
HK (1) HK1140943A1 (ru)
HR (1) HRP20150074T1 (ru)
IL (2) IL204615A (ru)
MX (1) MX2010003581A (ru)
NZ (1) NZ584633A (ru)
PL (1) PL2195017T3 (ru)
PT (1) PT2195017E (ru)
RS (1) RS53760B1 (ru)
SI (1) SI2195017T1 (ru)
TW (1) TWI446922B (ru)
WO (1) WO2009045957A1 (ru)
ZA (1) ZA201002313B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2714902C2 (ru) * 2013-12-19 2020-02-20 Новартис Аг Химерные рецепторы антигена против мезотелина человека и их применение
RU2748281C2 (ru) * 2015-08-21 2021-05-21 Кафа Терапьютикс Лимитед Полностью человеческие антитела к мезотелину и иммунные эффекторные клетки, нацеленные на мезотелин

Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
PL2195017T3 (pl) * 2007-10-01 2015-03-31 Bristol Myers Squibb Co Ludzkie antyciała, które wiążą mezotelinę i ich zastosowania
SI2215121T1 (sl) * 2007-11-26 2016-06-30 Bayer Intellectual Property Gmbh Protitelesa anti-mezotelin in njihova uporaba
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
UY32560A (es) * 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
BR112013014527A2 (pt) 2010-12-20 2017-03-07 Genentech Inc anticorpo isolado, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, uso do imunoconjugado, método para tratamento de um indivíduo que tem um câncer positivo para mesotelina, para inibição de proliferação de uma célula positiva para mesotelina, para detecção de mesotelina humana em uma amostra biológica e para detectar um câncer positivo para mesotelina
CN103826661B (zh) 2011-04-21 2019-03-05 西雅图基因公司 新的结合剂-药物缀合物(adc)及其用途
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
EA027925B1 (ru) 2012-02-13 2017-09-29 Бристол-Майерс Сквибб Компани Ендиины, их конъюгаты и способы их получения и применения
WO2014004549A2 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
AU2013306076B2 (en) 2012-08-21 2018-01-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
AU2013324049B2 (en) * 2012-09-27 2017-09-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin antibodies and methods for eliciting potent antitumor activity
ES2628156T3 (es) 2013-02-14 2017-08-01 Bristol-Myers Squibb Company Compuestos de tubulisina, métodos para su fabricación y su uso
WO2014146575A1 (en) 2013-03-19 2014-09-25 Beijing Shenogen Pharma Group Ltd. Antibodies and methods for treating estrogen receptor-associated diseases
CA2921401A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 William Marsh Rice University Derivatives of uncialamycin, methods of synthesis and their use as antitumor agents
CN103819559B (zh) * 2013-12-10 2016-02-24 中国科学院武汉病毒研究所 一种抗间皮素纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途
KR101923326B1 (ko) 2014-06-06 2018-11-29 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 글루코코르티코이드-유도 종양 괴사 인자 수용체 (gitr)에 대한 항체 및 그의 용도
JP2017518053A (ja) * 2014-06-06 2017-07-06 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター メソセリン標的化キメラ抗原受容体およびその使用
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
CA2968382A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
UY36404A (es) 2014-11-21 2016-06-01 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware ANTICUERPOS MONOCLONALES (Ab) COMO DETECTORES DE CD73 E INHIBIDORES DE SU ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN
EP4249066A3 (en) 2014-12-23 2023-11-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to tigit
CA2973355A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Heteroarylene-bridged benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
CA2973354A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
JP2018510864A (ja) 2015-03-10 2018-04-19 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ トランスグルタミナーゼによって結合可能な抗体およびそれによって製造される結合体
RS60753B1 (sr) 2015-04-17 2020-10-30 Bristol Myers Squibb Co Kompozicije koje sadrže kombinaciju ipilimumaba i nivolumaba
KR101782487B1 (ko) * 2015-09-24 2017-09-27 재단법인 목암생명과학연구소 신규 항-메소텔린 항체 및 이를 포함하는 조성물
EP3377532B1 (en) 2015-11-19 2022-07-27 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
BR112018012524A2 (pt) 2015-12-21 2018-12-11 Bristol Myers Squibb Co anticorpos variantes para conjugação sítio-específica
CN109069597A (zh) 2015-12-22 2018-12-21 诺华股份有限公司 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗
AU2016382512A1 (en) 2015-12-30 2018-07-12 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
BR112018067679A2 (pt) 2016-03-04 2019-01-15 Novartis Ag células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso
KR20230038311A (ko) 2016-03-04 2023-03-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-cd73 항체와의 조합 요법
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
CN109715808A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
JP7160683B2 (ja) * 2016-04-29 2022-10-25 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 術後癒着の予防及び治療のための方法及び組成物
JP2019518013A (ja) 2016-05-10 2019-06-27 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 安定性が向上したツブリシン類似体の抗体薬物結合体
ES2905823T3 (es) 2016-05-20 2022-04-12 Biohaven Therapeutics Ltd Uso de riluzol, profármacos de riluzol o análogos de riluzol con inmunoterapias para tratar cánceres
WO2017210335A1 (en) 2016-06-01 2017-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18f-radiolabeled biologics
CA3032581A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
US10287291B2 (en) 2016-08-19 2019-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
US20190218294A1 (en) * 2016-09-09 2019-07-18 Bristol-Myers Squibb Company Use of an anti-pd-1 antibody in combination with an anti-mesothelin antibody in cancer treatment
US10398783B2 (en) 2016-10-20 2019-09-03 Bristol-Myers Squibb Company Antiproliferative compounds and conjugates made therefrom
EP3541423A4 (en) * 2016-11-18 2020-10-07 The Regents of The University of California MODIFIED ANTIBODIES AND THEIR USES
AU2017367734A1 (en) 2016-12-01 2019-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-PD-l1 antibodies for immuno-PET imaging
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
KR102153642B1 (ko) 2017-02-08 2020-09-09 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트
CN110506057B (zh) 2017-02-17 2023-09-29 百时美施贵宝公司 Alpha突触核蛋白抗体及其应用
EP3601355A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
KR20200006115A (ko) 2017-05-16 2020-01-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-gitr 효능제 항체에 의한 암의 치료
KR20200013241A (ko) 2017-05-25 2020-02-06 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
JP2020536894A (ja) 2017-10-15 2020-12-17 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 腫瘍処置法
KR101966362B1 (ko) 2017-10-20 2019-04-05 주식회사 녹십자 항-msln 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
WO2019133639A2 (en) * 2017-12-26 2019-07-04 The Regents Of The University Of California Human antibodies that bind and are internalized by mesothelioma and other cancer cells
US11242393B2 (en) 2018-03-23 2022-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
JP2021519771A (ja) 2018-03-30 2021-08-12 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 腫瘍を処置する方法
US20210147570A1 (en) 2018-04-12 2021-05-20 Bristol-Myers Squibb Company Anticancer combination therapy with cd73 antagonist antibody and pd-1/pd-l1 axis antagonist antibody
US11485741B2 (en) 2018-04-24 2022-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (TLR7) agonists
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2019213282A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
SG11202011739SA (en) 2018-05-29 2020-12-30 Bristol Myers Squibb Co Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
CN113166266A (zh) * 2018-06-18 2021-07-23 安维塔生物科学股份有限公司 抗间皮素构建体及其用途
US11020490B2 (en) 2018-06-22 2021-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate with a tubulysin analog warhead having a stabilized acetate group in the TUV subunit
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
CN110746508B (zh) * 2018-07-23 2023-04-14 上海细胞治疗集团有限公司 特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
US20220106400A1 (en) 2018-11-28 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
HRP20230500T1 (hr) 2018-11-30 2023-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Antitijelo koje sadrži c-terminalnu ekstenziju lakog lanca koja sadrži glutamin, njegovi konjugati, i postupci i primjene
EP3894443A2 (en) 2018-12-12 2021-10-20 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
WO2020128972A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
CN109705219B (zh) * 2019-01-08 2020-11-13 上海霖科生物科技有限公司 与间皮素结合的单克隆抗体及其制备方法
WO2020165834A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CA3124935A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
CN110698562B (zh) * 2019-10-31 2022-10-25 浙江蓝盾药业有限公司 抗人msln单克隆抗体
CA3164129A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Amgen Inc. Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
US20230056470A1 (en) 2019-12-20 2023-02-23 Novartis Ag Uses of anti-tgf-beta antibodies and checkpoint inhibitors for the treatment of proliferative diseases
CN113698492B (zh) * 2020-05-22 2024-04-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
CA3185455A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
CN116134027A (zh) 2020-08-03 2023-05-16 诺华股份有限公司 杂芳基取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
AU2021416156A1 (en) 2020-12-28 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumors
US20220233693A1 (en) 2020-12-28 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibody Compositions and Methods of Use Thereof
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
KR20230005001A (ko) * 2021-06-30 2023-01-09 (주)이노베이션바이오 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
WO2023108114A2 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Merck Sharp & Dohme Llc Human mesothelin binders
CN114423789B (zh) * 2021-12-24 2022-09-30 浙江时迈药业有限公司 针对间皮素的抗体及其用途
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030040044A1 (en) * 2000-08-07 2003-02-27 George Heavner Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US20060204506A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-14 Wolfgang Ebel Anti-mesothelin antibodies

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4978757A (en) 1984-02-21 1990-12-18 The Upjohn Company 1,2,8,8a-tetrahydrocyclopropa (C) pyrrolo [3,2-e)]-indol-4(5H)-ones and related compounds
US4912227A (en) 1984-02-21 1990-03-27 The Upjohn Company 1,2,8,8A-tetrahydrocyclopropa(c)pyrrolo(3,2-e)-indol-4-(5H)-ones and related compounds
US5332837A (en) 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
US5084468A (en) 1988-08-11 1992-01-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-88a derivatives
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
JPH05508394A (ja) 1990-04-25 1993-11-25 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー 新規なｃｃ―１０６５アナログ
CA2093928C (en) 1990-10-12 2000-02-29 Mark C. Willingham Monoclonal antibodies for detection and treatment of cancer
JPH0597853A (ja) 1991-10-07 1993-04-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｄｃ−８９誘導体の臭化水素酸塩
JP3328341B2 (ja) 1991-12-27 2002-09-24 中外製薬株式会社 新規な巨核球増幅因子
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
DE69533277T2 (de) 1994-04-22 2005-07-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-89 derivat
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
EP0786252A4 (en) 1994-09-30 1998-01-07 Kyowa Hakko Kogyo Kk ANTI-TUMOR AGENT
CA2230759C (en) * 1995-08-29 2012-02-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for producing the same
EP0871492B1 (en) 1996-01-05 2003-11-26 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Mesothelium antigen and methods and kits for targeting it
US7375183B1 (en) 1996-01-05 2008-05-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mesothelin, immunogenic peptides derived therefrom, and compositions comprising mesothelin, or immunogenic peptides thereof
ATE317437T1 (de) * 1997-12-01 2006-02-15 Us Gov Health & Human Serv Antikörper, sowie fv moleküle, und immunkonjugate mit hoher bindungsaffinität für mesothelin und methoden für deren verwendung
US6809184B1 (en) 1997-12-01 2004-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies, including FV molecules, and immunoconjugates having high binding affinity for mesothelin and methods for their use
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
DE60028361T2 (de) 1999-02-26 2007-05-10 Pacific Northwest Research Institute, Seattle Verfahren und zusammensetzungen zur karzinomdiagnose
MXPA01011950A (es) 1999-05-27 2002-05-06 Gov Health & Human Serv Inmunoconjugados que tienen alta afinidad de enlace.
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
WO2002101075A2 (en) 2001-06-13 2002-12-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
WO2002102235A2 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003035835A2 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
CN1761746B (zh) * 2003-01-22 2016-03-23 罗氏格黎卡特股份公司 融合构建体及其用来生产Fc受体结合亲和性和效应子功能提高的抗体的用途
PL224786B1 (pl) 2003-01-22 2017-01-31 Glycart Biotechnology Ag Wyizolowany kwas nukleinowy, ssaczy wektor ekspresyjny, komórki gospodarza, fuzja polipeptydowa i sposób jej wytwarzania, sposoby in vitro i ex vivo modyfikowania profilu glikozylacji polipeptydu wytwarzanego przez komórki gospodarza
HN2004000285A (es) * 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
AU2004263514A1 (en) 2003-08-05 2005-02-17 Morphotek, Inc. A variant cell surface molecule associated with cancer
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
DK1691837T3 (da) * 2003-12-10 2012-10-01 Medarex Inc IP-10-antistoffer og anvendelse heraf
US20050266008A1 (en) * 2004-03-29 2005-12-01 Medarex, Inc. Human anti-IRTA-5 antibodies
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
CA2564076C (en) 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
US20090047211A1 (en) * 2005-05-12 2009-02-19 The Govt. Of The U.S. As Represented By The Sec. Of The Dept. Of Health And Human Services Anti-mesothelin antibodies useful for immunological assays
WO2007038658A2 (en) 2005-09-26 2007-04-05 Medarex, Inc. Antibody-drug conjugates and methods of use
JP5116686B2 (ja) 2005-10-26 2013-01-09 メダレックス インコーポレイテッド Ｃｃ−１０６５類似体の調製方法及び調製用化合物
WO2007100385A2 (en) 2005-10-31 2007-09-07 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
EP1994000B1 (en) 2006-02-02 2017-08-23 Syntarga B.V. Water-soluble cc-1065 analogs and their conjugates
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
CN101012280A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 吴小华 抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备方法
JP2010519310A (ja) 2007-02-21 2010-06-03 メダレックス インコーポレイテッド 単一のアミノ酸を有する化学リンカーおよびその複合体
PL2195017T3 (pl) * 2007-10-01 2015-03-31 Bristol Myers Squibb Co Ludzkie antyciała, które wiążą mezotelinę i ich zastosowania
SI2215121T1 (sl) * 2007-11-26 2016-06-30 Bayer Intellectual Property Gmbh Protitelesa anti-mezotelin in njihova uporaba

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030040044A1 (en) * 2000-08-07 2003-02-27 George Heavner Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US20060204506A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-14 Wolfgang Ebel Anti-mesothelin antibodies

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2714902C2 (ru) * 2013-12-19 2020-02-20 Новартис Аг Химерные рецепторы антигена против мезотелина человека и их применение
RU2748281C2 (ru) * 2015-08-21 2021-05-21 Кафа Терапьютикс Лимитед Полностью человеческие антитела к мезотелину и иммунные эффекторные клетки, нацеленные на мезотелин

Also Published As

Publication number Publication date
CA2700860C (en) 2016-07-19
US8425904B2 (en) 2013-04-23
MX2010003581A (es) 2010-08-02
KR20100093033A (ko) 2010-08-24
JP2010539981A (ja) 2010-12-24
EP2195017A1 (en) 2010-06-16
SI2195017T1 (sl) 2015-01-30
JP5535074B2 (ja) 2014-07-02
RS53760B1 (en) 2015-06-30
CL2008002923A1 (es) 2009-10-23
US20130190481A1 (en) 2013-07-25
KR101554753B1 (ko) 2015-09-22
AU2008308956B2 (en) 2013-03-14
DK2195017T3 (en) 2015-01-19
CN101951946B (zh) 2014-12-10
CN101951946A (zh) 2011-01-19
KR20150043550A (ko) 2015-04-22
PT2195017E (pt) 2014-12-31
WO2009045957A1 (en) 2009-04-09
US8268970B2 (en) 2012-09-18
US20130028905A1 (en) 2013-01-31
NZ584633A (en) 2011-11-25
ZA201002313B (en) 2011-06-29
US8399623B2 (en) 2013-03-19
AU2008308956A1 (en) 2009-04-09
BRPI0816014A8 (pt) 2018-06-19
US20130028906A1 (en) 2013-01-31
TWI446922B (zh) 2014-08-01
US20110262448A1 (en) 2011-10-27
ES2526355T3 (es) 2015-01-09
HK1140943A1 (en) 2010-10-29
EP2195017B1 (en) 2014-10-22
PL2195017T3 (pl) 2015-03-31
CY1116036T1 (el) 2017-01-25
IL243375B (en) 2018-08-30
HRP20150074T1 (hr) 2015-03-13
US8383779B2 (en) 2013-02-26
EA201070412A1 (ru) 2010-10-29
EP2195017A4 (en) 2012-05-30
CA2700860A1 (en) 2009-04-09
US20130028904A1 (en) 2013-01-31
IL204615A (en) 2016-02-29
TW200922620A (en) 2009-06-01
CO6300960A2 (es) 2011-07-21
KR101554848B1 (ko) 2015-09-21
AR068590A1 (es) 2009-11-18
IL204615A0 (en) 2010-11-30
BRPI0816014A2 (pt) 2015-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018396B1 (ru) Антитела человека, которые связывают мезотелин, и применение таких антител
EA019344B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
EA017086B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение
JP5816558B2 (ja) Ｃａｄｍ１に特異的な完全ヒト抗体
WO2017043613A1 (ja) 抗ｃｄ２６抗体と他の抗癌剤とを組み合わせた癌治療用組成物
EP3971208A1 (en) Antibody against claudin 18a2 and use thereof
EA017812B1 (ru) Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение
EA017491B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела к фукозил-gm1 и способы применения антифукозил-gm1 антител
PT1851250E (pt) Anticorpo monoclonal humano para o antigénio membranar específico da próstata (psma)
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
TW202039007A (zh) 荷伯希二烯(herboxidiene)剪接調節抗體-藥物結合物及其使用方法
RU2638457C2 (ru) Антитела, специфически связывающие рецептор 1 типа фактора роста фибробластов, применение антител для лечения онкологического заболевания, способ получения антител
JP2024509099A (ja) 抗ｈｅｒ２抗体‐薬物コンジュゲートおよびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU