PT1851250E - Anticorpo monoclonal humano para o antigénio membranar específico da próstata (psma) - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Anticorpo monoclonal humano para o antigénio membranar específico da próstata (PSMA)"

Antecedentes do Invento 0 cancro da próstata é uma das principais causas de morbidez e mortalidade entre os homens. Tratamentos para cancro de próstata incluem cirurgia, hormonas, radiação e quimioterapia. Existem poucos tratamentos eficazes para a doença metastática da próstata. Portanto, a identificação de genes e/ou produtos génicos que representem marcadores de diagnóstico e prognóstico, bem como alvos para terapia, é critica. 0 antigénio especifico da próstata (PSA) é um tal marcador de cancro que é útil no diagnóstico clínico e identificação do estádio de cancro da próstata. No entanto, o PSA não consegue diferenciar hiperplasia prostática benigna (BPH) de prostatite ou cancro da próstata no intervalo de 4- 10 ng/ml, necessitando assim de uma avaliação citológica e/ou histológica para confirmar o diagnóstico correcto (Barren, R.J. et al. (1998) Prostate 36: 181-188). O antigénio membranar específico da próstata (PSMA) é uma glicoproteína transmembranar de 750 aminoácidos, de tipo 11 de aproximadamente 110 kDa que tem 54% de homologia com o receptor da transferrina. PSMA tem 3 domínios estruturais, incluindo um domínio intracelular de 19 aminoácidos, um domínio transmembranar de 24 aminoácidos, e um domínio extracelular de 707 aminoácidos. A proteína PSMA exibe actividade de neurocarboxipeptidase e ácido fólico-hidrolase e está relatada como estando envolvida na regulação neuroendócrina do crescimento e diferenciação da próstata (Heston, W.D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 35: 400-407). PSM' é uma forma de processamento alternativo de PSMA que se localiza no citoplasma. PSMA é predominantemente expresso por células epiteliais prostáticas. A expressão de PSMA é aumentada em cancro da próstata, especialmente em carcinomas pouco diferenciados, metastáticos, e refractários a hormonas (Gregorakis, A.K. et al. (1998) Seminars in Urologic Oncology 16: 2-12; Silver, 2 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ D.A. (1997) Clinicai Câncer Research 3: 81-85). Observa-se baixo nível de expressão de PSMA em tecidos extraprostáticos tais como intestino delgado, glândula salivar, mucosa duodenal, túbulos renais proximais e cérebro (Silver, D. A. (1997) Clinicai Câncer Research 3: 81-85). PSMA é também expresso em células endoteliais dos vasos capilares em áreas peritumorais e endotumorais de certas malignidades, incluindo carcinomas de células renais, e carcinomas do cólon, mas não nos vasos sanguíneos de tecidos normais. Além disso, está relatado que PSMA está relacionado com angiogénese tumoral (Silver, D.A. (1997) Clinicai Câncer Research 3: 81-85). Recentemente, foi demonstrado que PSMA é expresso em células endoteliais da neovasculatura associada a tumores em carcinomas do cólon, da mama, da bexiga, do pâncreas, do rim, e melanoma (Chang, S.S. (2004) Curr. Opin. Investig. Drugs 5: 611-5).

Foram descritos anticorpos contra o domínio extracelular de PSMA (ver p.ex., Liu, H. et ai. (1997) Câncer Res. 57: 3629-3634; Murphy, G.P. et ai. (1998) J. Urol. 160: 2396-2401; Wang, S. et ai. (2001) Int. J. Câncer 92 : 871-876; Kato, K. et ai. (2003) Int. J. Urol. 10: 439-444; Patente U.S. No. 6150508 e Patente U.S. No. 6107090). Mais recentemente, foram descritos anticorpos humanos e humanizados que se ligam a PSMA (ver p.ex., Bander, N.H. et ai. (2003) Semin. Oncol. 30: 667-676; Publicação PCT WO 02/098897; Publicação PCT WO 01/09192; Publicação PCT WO 03/064606; Publicação PCT WO 03/034903; e Pedido de Patente U.S. No. 2004/0033229). Tais anticorpos foram utilizados para imagiologia de células de cancro da próstata (ver p.ex., Yao, D. et ai. (2002) Semin. Urol. Oncol. 20: 211-218; Bander, N.H. et ai. (2003) J. Urol. 170: 1717-1721). Foram também utilizados anticorpos anti-PSMA para intervenção terapêutica no tratamento de cancro da próstata, tipicamente como um conjugado com um agente quimioterapêutico ou isótopo radioactivo (ver, p.ex., Nanus, D.M. et ai. (2003) J. Urol. 170: S84-89; Milowsky, M.I. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22: 2522-2531; Henry, M.D. et al. (2004) Câncer Res. 64 : 7995-8001).

Consequentemente, PSMA representa um alvo valioso para o tratamento de cancro da próstata e de uma variedade de outras 3 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ doenças caracterizadas por expressão de PSMA e sao desejados agentes terapêuticos adicionais que reconheçam PSMA.

Sumário da Invenção 0 invento proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, compreendendo: (a) uma região variável da cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 10; (b) uma região variável da cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 14; (c) uma região variável da cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18; (d) uma região variável da cadeia leve CDRl compreendendo SEQ ID NO: 22; (e) uma região variável da cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 26; e (f) uma região variável da cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 30.

Outros anticorpos preferidos do invento, ou porções de ligação ao antigénio destes, compreendem: (a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (b) a região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Os anticorpos do invento podem ser, por exemplo, anticorpos inteiros, por exemplo de um isotipo IgGl ou IgG4. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpo, tais como fragmentos Fab ou Fab'2, ou anticorpos de cadeia simples. 0 invento proporciona também um imunoconjugado compreendendo um anticorpo do invento, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioactivo. 0 invento proporciona também uma molécula biespecifica compreendendo um anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, do invento, ligado a uma segunda porção funcional possuindo uma especificidade de ligação diferente da do referido anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste. 4 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Composições compreendendo um anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, ou molécula de imunoconjugado ou biespecifica do invento e um transportador farmaceuticamente aceitável são também proporcionadas.

Moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos, ou porções de ligação ao antigénio destes, do invento são também englobadas pelo invento, bem como vectores de expressão compreendendo tais ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo tais vectores de expressão. Além disso, o invento proporciona um ratinho transgénico compreendendo transgenes da cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, em que o ratinho expressa um anticorpo do invento, bem como hibridomas preparados a partir de um tal ratinho, em que o hibridoma produz o anticorpo do invento.

Ainda noutro aspecto, o invento proporciona um método de inibição do crescimento de células tumorais num sujeito, em que as células tumorais ou células endoteliais vasculares próximas das células tumorais expressam PSMA, compreendendo a administração a um sujeito de um anticorpo humano anti-PSMA do presente invento numa quantidade eficaz para inibir o crescimento das células tumorais. Numa concretização preferida, o crescimento de células tumorais da próstata é inibido.

Noutro aspecto, o invento proporciona um método de inibição ou prevenção do crescimento de um tumor (p.ex., da próstata, do cólon, renal, rectal, urotelial, da mama, da bexiga, do fígado, do pâncreas, ou melanoma) num sujeito, em que as células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor expressam PSMA. 0 método inclui a administração a um sujeito de um anticorpo anti-PSMA, ou de uma porção de ligação ao antigénio deste, em combinação com um agente anti-tumoral, ambos numa quantidade eficaz para inibir e para prevenir o crescimento do tumor.

Noutro aspecto, o invento proporciona um método de estimulação de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de um tumor num sujeito, em que células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor 5 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ expressam PSMA. Ο método inclui a administração a um sujeito de um anticorpo anti-PSMA, ou porção de ligação ao antigénio deste, em combinação com um agente anti-tumoral, ambos numa quantidade eficaz para estimular citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) do tumor.

Num outro aspecto, o invento proporciona um método de inibição de caquexia relacionada com tumor num sujeito, em que as células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor expressam PSMA. 0 método inclui a administração a um sujeito de um anticorpo anti-PSMA, ou porção de ligação ao antigénio deste, em combinação com um agente anti-tumoral, ambos numa quantidade eficaz para inibir caquexia relacionada com tumor no sujeito.

Numa concretização do invento, a administração do anticorpo anti-PSMA, ou porção de ligação ao antigénio deste, a um sujeito, em combinação com o agente anti-tumoral, conduz a um efeito sinergistico na inibição do crescimento do tumor. Noutra concretização, o agente anti-tumoral causa danos na massa tumoral, conduzindo assim a uma citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) do tumor mais eficaz.

Noutra concretização, o anticorpo anti-PSMA pode ser o anticorpo 2A10.

Numa concretização do invento, o agente anti-tumoral é um agente quimioterapêutico, tal como Taxotere® (docetaxel). Noutra concretização, o agente anti-tumoral é um agente anti-angiogénico, tal como angiostatina Kl-3, Arresten, aaAT, Canstatina, DL-a-Difluorometil-ornitina, Endostatina,

Fumagilina, Genisteina, Minociclina, Estaurosporina, Talidomida, e Tumstatina. Noutra concretização, o agente anti-tumoral é um agente imunomodulador, tal como anticorpos anti-PDl, anticorpos anti-CTLA-4, fosforotiolato oligodesoxirribonucleótido (1018 ISS), vacinas do gene de GM-CSF, interleucina-2, interleucina-7 (CYT 9907), interleucina-12 e interleucina-21.

Noutro aspecto, o invento proporciona um método de identificação de um agente anti-tumoral capaz de actuar 6 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ sinergisticamente com um anticorpo anti-PSMA na inibição ou prevenção do crescimento de um tumor, em que células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor expressam PSMA. 0 método inclui o contacto de uma composição indicadora com (a) um agente anti-tumoral de teste sozinho, (b) um anticorpo anti-PSMA sozinho, e (c) um agente anti-tumoral de teste e um anticorpo anti-PSMA; e a comparação da capacidade (a) do agente anti-tumoral de teste sozinho e (b) do anticorpo anti-PSMA sozinho para inibir ou prevenir o crescimento de um tumor com a capacidade (c) de ambos o agente anti-tumoral de teste e o anticorpo anti-PSMA para inibir ou prevenir o crescimento de um tumor, em que a inibição ou prevenção do crescimento tumoral por (c) numa quantidade superior ao efeito aditivo de (a) e (b) conduzirá à identificação de um agente anti-tumoral capaz de actuar sinergisticamente com um anticorpo anti-PSMA na inibição ou prevenção de crescimento de um tumor.

Noutro aspecto, o invento refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-PSMA (p.ex., 2A10) e um agente anti-tumoral (p.ex., Taxotere® (docetaxel), angiostatina Kl-3, Arresten, aaAT, Canstatina, DL-a-Difluorometil-ornitina, Endostatina, Fumagilina, Genisteina, Minociclina, Estaurosporina, Talidomida, Tumstatina, um anticorpo anti-PDl, em anticorpo anti-CTLA-4, fosforotiolato oligodesoxirribonucleótido (1018 ISS), uma vacina do gene de GM-CSF, interleucina-2, interleucina-7 (CYT 9907), interleucina-12 ou interleucina-21) numa quantidade eficaz para inibir ou prevenir o crescimento de um tumor e um transportador farmaceuticamente aceitável ou numa quantidade eficaz para estimular citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de um tumor e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Outras caracteristicas e vantagens do presente invento serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e dos exemplos que não devem ser considerados limitantes.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura IA mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 33) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) da região 7 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 1C3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 13) e CDR3 (SEQ ID NO: 17) são delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J estão indicadas. A Figura 1B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 3 7) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 1C3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 25) e CDR3 (SEQ ID NO: 29) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 2A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 34) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 2A10. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO: 14) e CDR3 (SEQ ID NO: 18) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas.

Figura 2B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 38) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 2A10. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 26) e CDR3 (SEQ ID NO: 30) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 3A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 35) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 2F5. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 19) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 3B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 39) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 2F5.

As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 27) e CDR3 (SEQ ID NO: 31) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 4A mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 36) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) da região 8 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 2C6. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 16) e CDR3 (SEQ ID NO: 20) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 4B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 40) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 2C6. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 28) e CDR3 (SEQ ID NO: 32) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 5 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 1C3 (SEQ ID NO: 1) com a sequência de aminoácidos de VH 3-30.3 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 41) e da linha germinativa JH6b (SEQ ID NO: 45). A Figura 6 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 2A10 (SEQ ID NO: 2), 2F5 (SEQ ID NO: 3), e 2C6 (SEQ ID NO: 4) com a sequência de aminoácidos de VH 5-51 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 42). A Figura 7 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 1C3 (SEQ ID NO: 5), 2A10 (SEQ ID NO: 6), e 2F5 (residuos 1-107 de SEQ ID NO: 7) com a sequência de aminoácidos de Vk L18 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 43) e da linha germinativa JK4 (SEQ ID NO: 46). A Figura 8 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 2C6 (SEQ ID NO: 8) com a sequência de aminoácidos de Vk L6 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 44) e a linha germinativa JK3 (SEQ ID NO: 47) . A Figura 9 mostra os resultados de experiências de citometria de fluxo demonstrando que os anticorpos monoclonais humanos 2F5, 2A10, e 2C6, dirigidos contra PSMA humana, se ligam à superfície celular de células LNCaP que expressam PSMA. 9 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ A Figura 10 mostra os resultados de experiências de ELISA demonstrando que os anticorpos monoclonais humanos contra PSMA humana se ligam especificamente a PSMA purificada a partir de células LNCaP.

As Figuras 11A-11B são os resultados de estudos de competição de ligação de anticorpos que demonstram que os anticorpos monoclonais humanos 2A10 e 7F12, dirigidos contra PSMA humana, competem pela ligação a células de cancro da próstata LNCaP que expressam PSMA. A Figura 11 mostra a competição de 12SI-2A10 com o anticorpo 7F12 frio. A Figura 11B mostra a competição de 125I-7F12 com o anticorpo 2A10 f rio.

As Figuras 12A-12B mostram os resultados de experiências de internalização demonstrando que o anticorpo monoclonal humano 2A10, dirigido contra PSMA humana, entra em células de cancro da próstata LNCaP que expressam PSMA através de um ensaio de libertação de 3H-timidina. A Figura 12A mostra os resultados para células LNCaP semeadas durante 2 horas antes da introdução do anticorpo. A Figura 12B mostra os resultados para células LNCaP semeadas de um dia para o outro antes da introdução do anticorpo.

As Figuras 13A-13B são gráficos representando as curvas da média e mediana do crescimento de xenoenxertos de tumores LNCaP para ratinhos tratados com: o anticorpo anti-PSMA 7F12, o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan, Taxotere (2 mg/kg), Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (2 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (2 mg/kg), o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (4 mg/kg) ou PBS. As Figuras 13C-13D são gráficos representando a alteração média e mediada do peso corporal de ratinhos possuindo tumores LNCaP tratados com: o anticorpo anti-PSMA 7F12, o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan, Taxotere (2 mg/kg), Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (2 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (2 10 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ mg/kg), ο anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (4 mg/kg), ou PBS.

As Figuras 14A-14B são gráficos representando curvas da média e mediana do crescimento de xenoenxertos de tumores LNCaP para ratinhos tratados com: o anticorpo anti-PSMA 7F12, o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan, ou PBS. As Figuras 14C-14D são gráficos representando a alteração média e mediana do peso corporal de ratinhos possuindo tumores LNCaP tratados com: o anticorpo anti-PSMA 7F12, o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan, ou PBS.

As Figuras 15A-15B são gráficos representando as curvas da média e mediana do crescimento de xenoenxertos de tumores LNCaP para ratinhos tratados com: Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (4 mg/kg), ou PBS. As Figuras 15C-15D são gráficos representando a alteração média e mediana do peso corporal de ratinhos possuindo tumores LNCaP tratados com: Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (4 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (4 mg/kg), ou PBS.

As Figuras 16A-16B são gráficos representando as curvas da média e mediana do crescimento de xenoenxertos de tumores LNCaP para ratinhos tratados com: Taxotere (2 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (2 mg/kg), o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (2 mg/kg), ou PBS. As Figuras 16C-16D são gráficos representando a alteração média e mediana do peso corporal de ratinhos possuindo tumores LNCaP tratados com: Taxotere (2 mg/kg), o anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere (2 mg/kg), o anticorpo de controlo do isotipo Rituxan em combinação com Taxotere (2 mg/kg), ou PBS. A Figura 17A-B mostra os resultados de um ensaio de proliferação celular demonstrando que anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA conjugados com toxina mostram citotoxicidade para células de cancro da próstata (A) com uma lavagem de três horas e (B) com uma lavagem contínua. 11 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ A FIG. 18 é um gráfico das alterações no volume tumoral ao longo do tempo para ratinhos doseados com um conjugado anticorpo de controlo do isotipo-fármaco, um conjugado anticorpo aPSMA-fármaco, ou um tampão de conjugação sozinho (veiculo). A FIG. 19 é um gráfico das alterações no volume tumoral ao longo do tempo para ratinhos doseados com várias quantidades de um conjugado anticorpo aPSMA-fármaco ou um tampão de conjugação sozinho (veiculo). A FIG. 20 é um gráfico das alterações no volume tumoral ao longo do tempo para ratinhos doseados com várias quantidades de um conjugado anticorpo de controlo do isotipo-fármaco ou um tampão de conjugação sozinho (veiculo). A FIG. 21 é um gráfico da alteração do peso corporal ao longo do tempo para ratinhos doseados com várias quantidades de um conjugado anticorpo de controlo do isotipo-fármaco ou um tampão de conjugação sozinho (veiculo). A FIG. 22 é um gráfico da alteração do peso corporal ao longo do tempo para ratinhos doseados com várias quantidades de um conjugado anticorpo de aPSMA-fármaco ou um tampão de conjugação sozinho (veiculo). A FIG. 23 é um gráfico das alterações no volume tumoral ao longo do tempo, para tumores possuindo um volume tumoral médio inicial de 240 mm3, para ratinhos doseados com um conjugado anticorpo de controlo do isotipo-fármaco, um conjugado anticorpo aPSMA-fármaco, ou um tampão de conjugação sozinho (veiculo). A FIG. 24 é um gráfico das alterações no volume tumoral ao longo do tempo, para tumores possuindo um volume tumoral médio inicial de 430 mm3, para ratinhos doseados com um conjugado anticorpo aPSMA-fármaco ou um tampão de conjugação sozinho (veiculo). 12 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Descrição Detalhada do Invento 0 presente invento refere-se a anticorpos monoclonais isolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos, que se ligam especificamente a PSMA com elevada afinidade. Em certas concretizações, os anticorpos do invento são derivados de determinadas sequências da linha germinativa da cadeia pesada e leve e/ou compreendem determinadas caracteristicas estruturais tais como regiões CDR compreendendo determinadas sequências de aminoácidos. 0 invento proporciona anticorpos isolados, métodos de produção de tais anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecificas compreendendo tais anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecificas do invento. 0 invento refere-se também a métodos de utilização dos anticorpos, tais como para tratar doenças tais como cancro.

Para que o presente invento possa ser mais facilmente compreendido, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são expostas ao longo da descrição detalhada.

Os termos "antigénio membranar especifico da próstata" e "PSMA" são aqui utilizados indiferentemente, e incluem quaisquer variantes, isoformas e homólogos de espécie do PSMA humano que sejam naturalmente expressos por células e que mantenham ligação aos anticorpos 1C3, 2A10, 2F5 ou 2C6 aqui descritos. A sequência de aminoácidos completa da proteína PSMA humana tem o número de acesso Genbank NP_004467. A sequência do ADNc completa que codifica a proteína PSMA humana tem o número de acesso Genbank NM_004476.

Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal a partir de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Tal como aqui utilizada, a frase "receptor da superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão de um tal sinal através da membrana plasmática de 13 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ uma célula. Um exemplo de um "receptor da superfície celular" do presente invento é o receptor de PSMA. 0 termo "anticorpo", tal como aqui referido inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação ao antigénio (i.e., "porção de ligação ao antigénio") ou cadeias simples destes. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas através de ligações dissulfureto, ou uma porção de ligação ao antigénio destas. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios, Chi, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipersensibilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou factores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (p.ex., células efectoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema clássico do complemento. 0 termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), tal como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade para se ligarem especificamente a um antigénio (p.ex., PSMA). Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e Chi,' (11) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente 14 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ compreendendo dois fragmentos Fab ligados através de uma ponte dissulfureto na região charneira; (iii) um fragmento Fd consistindo nos dominios VH e CHi; (iv) um fragmento Fv consistindo nos dominios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), consistindo num domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, através de um ligador sintético que lhes permite serem produzidos como uma cadeia proteica única em que as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver p.ex., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883). Também se pretende que tais anticorpos de cadeia simples estejam englobados dentro do termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são pesquisados quanto à sua utilidade do mesmo modo que os anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado", tal como aqui utilizado, pretende referir um anticorpo que é substancialmente livre de quaisquer outros anticorpos possuindo diferentes especificidades antigénicas (p.ex., um anticorpo isolado que se ligue especificamente a PSMA é substancialmente livre de anticorpos que se liguem especificamente a antigénios diferentes de PSMA). Um anticorpo isolado que se ligue especificamente a PSMA pode, no entanto, ter reactividade cruzada com outros antigénios, tais como moléculas de PSMA de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal mostra uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epitopo. 15 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ Ο termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais como as CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina humanas da linha germinativa, Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante é também derivada de sequências de imunoglobulina humana da linha germinativa. Os anticorpos humanos do invento podem incluir residuos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina humana da linha germinativa (p.ex., mutações introduzidas através de mutagénese aleatória ou especifica do local in vitro ou através de mutação somática in vivo) . No entanto, o termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamifero, tal como um ratinho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. 0 termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma única especificidade de ligação os quais possuem regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais como as CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina humana da linha germinativa. Numa concretização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos através de um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgénico não humano, p.ex., um ratinho transgénico, possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundidos com uma célula imortalizada. 0 termo "anticorpo humano recombinante", tal como aqui utilizado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (p.ex., um ratinho) que seja transgénico ou transcromossómico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir destes (descrito mais abaixo), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, p.ex., a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca combinatória recombinante de anticorpos humanos, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvam o 16 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ processamento de sequências génicas de imunoglobulina humana noutras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis em que as regiões estruturais e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina humana da linha germinativa. Em certas concretizações, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgénico para sequências de Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas com as sequências de VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de anticorpos humanos da linha germinativa in vi vo.

Tal como aqui utilizado, "isotipo" refere-se à classe de anticorpos (p.ex., IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes da região constante da cadeia pesada.

As frases "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo especifico para um antigénio" são aqui utilizadas indiferentemente com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio". 0 termo "derivados de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, p.ex., um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo. 0 termo "anticorpo humanizado" pretende referir-se a anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamífero, tal como de ratinho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. Modificações adicionais das regiões estruturais podem ser feitas dentro das sequências estruturais humanas. 0 termo "anticorpo quimérico" pretende referir-se a anticorpos em que as sequências da região variável são derivadas de uma espécie e as sequências da região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo em que as sequências da região variável são derivadas de um 17 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ anticorpo de ratinho e as sequências da região constante sao derivadas de um anticorpo humano.

Tal como aqui utilizado, um anticorpo que "se liga especificamente a PSMA humano" pretende referir-se a um anticorpo que se liga a PSMA humano com uma KD de 5xlCT8 M ou menos, de preferência lxlCT8 M ou menos, de maior preferência 5xl0“9 M ou menos, de maior preferência l,2xlCT9 M ou menos, ainda de preferência entre 1,2χ10”9 M e l,2xlCT10 M ou menos. 0 termo "Kassoc" ou "Ka", tal como aqui utilizado, pretende referir-se à velocidade de associação de uma determinada interacção anticorpo-antigénio, enquanto o termo "Kdis" ou "Kd, " tal como aqui utilizado, pretende referir-se à velocidade de dissociação de uma determinada interacção anticorpo-antigénio. 0 termo "KD", tal como aqui utilizado, pretende referir-se à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (i.e., Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M) . Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na arte. Um método preferido para a determinação da KD de um anticorpo é através da utilização de ressonância de plasmão de superfície, de preferência utilizando um sistema biossensor tal como um sistema Biacore®.

Tal como aqui utilizado, o termo "elevada afinidade" para um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo possuindo uma KD de 10”7 M ou menos, de preferência 1(Γ8 M ou menos, de maior preferência 10”9 M ou menos, e ainda de preferência 10” 10 M ou menos para um antigénio alvo. No entanto, ligação de "elevada afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "elevada afinidade" para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo possuindo uma KD de 10”7 M ou menos, de preferência 10”8 M ou menos, ainda de preferência 10”9 M ou menos. O termo "vector", tal como aqui utilizado, pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a uma volta de ADN de cadeia dupla circular na qual se podem ligar segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN adicionais podem ser 18 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ ligados no genoma virai. Certos vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (p.ex., vectores bacterianos possuindo uma origem bacteriana de replicação e vectores de mamífero epissómicos). Outros vectores (p.ex., vectores de mamífero não epissómicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e deste modo serem replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vectores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Tais vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vectores de expressão"). Em geral, vectores de expressão de utilidade em técnicas de ADN recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente fascículo, "plasmídeo" e "vector" podem ser utilizados indiferentemente uma vez que o plasmídeo é a forma mais vulgarmente utilizada de vector. No entanto, o invento pretende incluir tais outras formas de vectores de expressão, tais como vectores virais (p.ex., retrovírus de replicação deficiente, adenovírus e vírus adeno-associados), que têm funções equivalentes. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como aqui utilizado, pretende referir-se a uma célula na qual um vector de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos pretendem referir-se não só à célula sujeita particular, como à descendência de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas, quer devido a mutação quer a influências ambientais, tal descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula mãe, mas está ainda incluída dentro do âmbito do termo "célula hospedeira" tal como aqui utilizado. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, células CHO, transfectomas e células linfocíticas.

Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" inclui qualquer humano ou animal não humano. 0 termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, p.ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. 19 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Os termos "animal transgénico, não humano" referem-se a um animal não humano possuindo um genoma compreendendo um ou mais transgenes ou transcromossomas da cadeia pesada e/ou leve humana (integrados ou não integrados no ADN genómico natural do animal) e que é capaz de expressar anticorpos inteiramente humanos. Por exemplo, um ratinho transgénico pode ter um transgene de cadeia leve humana e um transgene de cadeia pesada humana ou um transcromossoma de cadeia pesada humana, de modo a que o ratinho produza anticorpos anti-PSMA humanos quando imunizado com o antigénio PSMA e/ou células expressando PSMA. 0 transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no ADN cromossómico do ratinho, tal como é o caso para ratinhos transgénicos, p.ex., ratinhos HuMAb, ou o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, tal como é o caso para ratinhos transcromossómicos (p.ex., KM) tal como descrito em WO 02/43478. Tais ratinhos transgénicos e transcromossómicos são capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para PSMA (p.ex., IgG, IgA e/ou IgE) sofrendo recombinação de V-D-J e mudança de isotipo.

Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" inclui qualquer humano ou animal não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, p.ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. Vários aspectos do invento são descritos em maior detalhe nas seguintes subsecções.

Anticorpos Anti-PSMA

Os anticorpos do invento são caracterizados por determinadas características funcionais ou propriedades dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos ligam-se especificamente a PSMA humano. De preferência, um anticorpo do invento se liga a PSMA com elevada afinidade, por exemplo, com uma KD de 5xlCT7 M ou menos. Como outro exemplo, os anticorpos ligam-se especificamente a uma linha celular LNCaP que expressa PSMA (ATCC CRL-1740). Ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos a PSMA são conhecidos na técnica, incluindo por exemplo, ELISA, Western 20 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ blots e RIA. Ensaios adequados são descritos em detalhe nos Exemplos. A cinética de ligação (p.ex., afinidade de ligação) dos anticorpos pode também ser avaliada através de ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como através de análise ELISA, Scatchard e Biacore. Outras propriedades preferidas dos anticorpos do invento incluem a capacidade para serem internalizados por células que expressam PSMA e elevada termoestabilidade. A internalização de anticorpos pode ser avaliada tal como descrito no Exemplo 6. A termoestabilidade pode ser avaliada tal como descrito no Exemplo 7. Os anticorpos preferidos do invento têm um ponto de fusão de pelo menos 65°C, de preferência, pelo menos 66°C, de maior preferência pelo menos 67°C, ainda de preferência pelo menos 68°C, ainda de maior preferência pelo menos 69°C, ainda de maior preferência pelo menos 70 °C e ainda de maior preferência pelo menos 71°C. De preferência um anticorpo do invento tem um ponto de fusão no intervalo de 67°C a 72°C, de preferência 68°C a 72°C, ou 69°C a 72°C, ou 70°C a 72°C ou 69°C a 71,43°C, ou o anticorpo tem um ponto de fusão de aproximadamente 71,43°C.

Anticorpo Monoclonal 2A10

Um anticorpo preferido do invento é o anticorpo monoclonal humano 2A10 isolado e caracterizado estruturalmente tal como descrito nos Exemplos 1 e 2. A sequência de aminoácidos de VH de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos de VL de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 6.

Noutro aspecto, o invento proporciona anticorpos que compreendem as CDR1, CDR2 e CDR3 das cadeias pesadas e cadeias leves de 2A10. A sequência de aminoácidos da CDR1 de VH de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 10. A sequência de aminoácidos da CDR2 de VH de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 14. A sequência de aminoácidos da CDR3 de VH de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 18. A sequência de aminoácidos da CDR1 de Vk de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 22. A sequência de aminoácidos da CDR2 de Vk de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 26. A sequência de aminoácidos da CDR3 de Vk de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 30. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) 21 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No . 91-3242) • Numa concretização preferida, o anticorpo compreende : (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 10; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 14; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 22; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 26; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 30 .

Moléculas de Ácido Nucleico Codificando Anticorpos do Invento

Outro aspecto do invento refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos do invento. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisado celular, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico está "isolado" ou é "tornado substancialmente puro" quando é purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, p.ex., outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, através de técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandas em CsCl, cromatografia de coluna, electroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na arte. Ver, F. Ausubel, et al., ed. (1987) "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico do invento pode ser, por exemplo, ADN ou ARN e pode ou não conter sequências intrónicas. Numa concretização preferida, o ácido nucleico é uma molécula de ADNc.

Os ácidos nucleicos do invento podem ser obtidos utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas (p.ex., hibridomas preparados a partir de ratinhos transgénicos possuindo genes de imunoglobulina humana tal como descrito mais abaixo) , 22 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ ADNcs codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de ADNc. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (p.ex., utilizando técnicas de apresentação fágica), o ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser recuperado a partir da biblioteca.

Moléculas de ácido nucleico preferidas do invento são aquelas codificando as sequências de VH e VL do anticorpo monoclonal 2A10. A sequência de ADN codificando a sequência de VH de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 34. A sequência de ADN codificando a sequência de VL de 2A10 é mostrada em SEQ ID NO: 38.

Uma vez obtidos fragmentos de ADN codificando os segmentos VH e VL, estes fragmentos de ADN podem ainda ser manipulados através de técnicas padrão de ADN recombinante, por exemplo para converter os genes da região variável em genes da cadeia inteira do anticorpo, em genes de fragmentos Fab ou num gene de scFv. Nestas manipulações, um fragmento de ADN codificando VL ou VH é operativamente ligado a outro fragmento de ADN codificando outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligador flexível. 0 termo "operativamente ligado", tal como utilizado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de ADN estão unidos de modo a que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de ADN permaneçam enquadradas. 0 ADN isolado codificando a região VH pode ser convertido num gene da cadeia pesada inteira ligando operativamente o ADN codificando VH a outra molécula de ADN codificando regiões constantes da cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3) . As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada humana são conhecidas na técnica (ver p.ex., Kabat, E. A., et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de ADN englobando estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, igM ou IgD, mas é de preferência uma região 23 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ constante de IgGl ou IgG4. Para um gene da cadeia pesada de um fragmento Fab, o ADN codificando VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de ADN codificando apenas a região constante CHI da cadeia pesada. 0 ADN isolado codificando a região VL pode ser convertido num gene inteiro da cadeia leve (bem como um gene da cadeia leve de Fab) ligando operativamente o ADN codificando VL a outra molécula de ADN codificando a região constante da cadeia leve, CL. As sequências dos genes da região constante da cadeia leve humana são conhecidas na técnica (ver p.ex., Kabat, E. A., et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de ADN englobando estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda, mas é de preferência uma região constante capa.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de ADN codificando VH e VL são operativamente ligados a outro fragmento codificando um ligador flexível, p.ex., codificando a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 48), de modo a que as sequências de VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH unidas através de um ligador flexível (ver p.ex., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554).

Produção de Anticorpos Monoclonais do Invento

Os anticorpos monoclonais (mAbs) do presente invento podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpos monoclonais convencional p.ex., a técnica de hibridação de células somáticas padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora sejam preferidos procedimentos de hibridação de células somáticas, em principio, outras técnicas para produção de anticorpos monoclonais podem ser empregues p.ex., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B. 24 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ Ο sistema animal preferido para preparação de hibridomas é um sistema de murideo. A produção de hibridoma no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (p.ex., células de mieloma de murideo) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

Os anticorpos quiméricos ou humanizados do presente invento podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de murideo preparado tal como descrito acima. ADN codificando as cadeias pesadas e leves de imunoqlobulinas pode ser obtido a partir do hibridoma de murideo de interesse e modificado para conter sequências de imunoglobulina sem ser de murideo (p.ex., humanas) utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murideo podem ser ligadas a regiões constantes humanas utilizando métodos conhecidos na técnica (ver p.ex., Patente U.S. No. 4816567 para Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR de murideo podem ser inseridas numa estrutura humana utilizando métodos conhecidos na técnica (ver p.ex., Patente U.S. No. 5225539 para Winter, e Patentes U.S. Nos. 5530101; 5585089; 5693762 e 6180370 para Queen et al.).

Numa concretização preferida, os anticorpos do invento são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra PSMA podem ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos possuindo partes do sistema imunitário humano em vez do sistema de ratinho. Estes ratinhos transgénicos e transcromossómicos incluem ratinhos aqui referidos como TM , ^ ratinhos HuMAb e ratinhos KM , respectivamente, e sao colectivamente aqui referidos como "ratinhos de Ig humana". O ratinho HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci do gene de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e leve κ humanas não rearranjadas, juntamente com mutações direccionadas que inactivam os loci endógenos das cadeias μ e κ (ver p.ex., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). 25 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Consequentemente, os ratinhos exibem uma expressão reduzida de IgM ou κ de ratinho, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humana introduzidos sofrem mudança de classe e mutação somática para gerar monoclonal IgGx humano de elevada afinidade (Lonberg, N. et ai. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei. 764: 536-546) . A preparação e utilização de ratinhos HuMab e as modificações genómicas em ratinhos de tipo selvagem são melhor descritas em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, cujos conteúdos de todos são aqui especificamente incorporados por referência na sua totalidade. Ver ainda, Patentes U.S. Nos. 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; e 5770429; todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. No. 5545807 para Surani et al.; Publicação PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT No. WO 01/14424 para Korman et al.

Noutra concretização, os anticorpos humanos do invento podem ser criados utilizando um ratinho possuindo sequências de imunoglobulina humanas em transgenes e transcromossomas, tal como um ratinho possuindo um transgene da cadeia pesada humana e um transcromossoma da cadeia leve humana. Tais ratinhos, aqui referidos como "ratinhos KM ", são descritos em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida et al.

Mais ainda, sistema animais transgénicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para criar os anticorpos anti-PSMA do invento. Por exemplo, pode ser utilizado um sistema transgénico alternativo, referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc.); tais ratinhos são descritos, por exemplo, 26 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ nas Patentes U.S. Nos. 5939598, 6075181, 6114598, 6150584 e 6162963 to Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas animais transcromossómicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para criar os anticorpos anti-PSMA do invento. Por exemplo, podem ser utilizados ratinhos possuindo tanto um transcromossoma de cadeia pesada humana como um transcromossoma de cadeia leve humana, referidos como "ratinhos TC"; tais ratinhos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 722-727. Além disso, vacas possuindo transcromossomas de cadeias pesadas e leves humanas foram descritas na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Blotechnology 20: 889-894) e podem ser utilizadas para criar os anticorpos anti-PSMA do invento.

Os anticorpos monoclonais humanos do invento podem também ser preparados utilizando métodos de apresentação fágica para pesquisar bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de apresentação fágica para isolamento de anticorpos humanos estão estabelecidos na técnica. Ver por exemplo: Patentes U.S. Nos. 5223409, 5403484, e 5571698 para Ladner et al.; Patentes U.S. Nos. 5427908 e 5580717 para Dower et al.; Patentes U.S. Nos. 5969108 e 6172197 para McCafferty et al.; e Patentes U.S. Nos. 5885793, 6521404, 6544731, 6555313, 6582915 e 6593081 para Griffiths et al.

Os anticorpos monoclonais humanos do invento podem também ser preparados utilizando ratinhos SCID nos quais células imunitárias humanas foram reconstituídas de modo a que possa ser gerada uma resposta de anticorpo humana após a imunização. Tais ratinhos são descritos, p.ex., em Patentes U.S. Nos. 5476996 e 5698767 para Wilson et al.

Imunização de Ratinhos de Ig Humana

Quando são utilizados ratinhos de Ig humana para criar os anticorpos humanos do invento, tais ratinhos podem ser imunizados com uma linha celular que expresse PSMA, tal como a linha celular LNCaP (ATCC CRL-1740), uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio PSMA e/ou PSMA 27 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ recombinante, ou uma proteína de fusão de PSMA, tal como descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. De preferência, os ratinhos terão 6-16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5-50 pg) de antigénio PSMA pode ser utilizada para imunizar os ratinhos de Ig humana intraperitonealmente.

Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais inteiramente humanos para PSMA são descritos no Exemplo 1 abaixo. A experiência cumulativa com vários antigénios mostrou que os ratinhos transgénicos respondem quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antigénio em adjuvante completo de Freund, seguido de imunizações IP semana sim semana não até um total de 6, com antigénio em adjuvante incompleto de Freund. No entanto, verifica-se que adjuvantes diferentes do de Freund são também eficazes. Além disso, verifica-se que células inteiras na ausência de adjuvante são altamente imunogénicas. A resposta imunitária pode ser monitorizada ao longo do decurso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas através de sangrias retro-orbitais. O plasma pode ser pesquisado através de ELISA (tal como descrito abaixo), e ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-PSMA podem ser utilizados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados intravenosamente com antigénio 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que possa ser necessário executar 2-3 fusões para cada imunização. São tipicamente imunizados entre 6 e 24 ratinhos para cada antigénio. Geralmente são utilizadas ambas as estirpes HCo7 e HCol2. Além disso, ambos os transgenes de HCo7 e HCol2 podem ser produzidos em conjunto num único ratinho possuindo dois transgenes diferentes de cadeia pesada humana (HCo7/HCol2). Alternativamente ou adicionalmente, pode ser utilizada a

TM estirpe de ratinho KM .

Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais Humanos do Invento

Para gerar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos do invento, esplenócitos e/ou células de 28 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ nódulos linfáticos de ratinhos imunizados podem ser isoladas e fundidas com uma linha celular imortalizada apropriada, tal como uma linha celular de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem ser pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos do antigénio. Por exemplo, suspensões de células individuais de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados podem ser fundidas com um sexto do número de células de mieloma de ratinho não secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com PEG a 50%. As células são plaqueadas a aproximadamente 2xl05 em placa de microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio selectivo contendo Soro fetal Clone a 20%, meio condicionado "653" a 18%, origen a 5% (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato de sódio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e HAT lx (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a infusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT. Poços individuais podem então ser pesquisados através de ELISA quanto a anticorpos IgM e IgG monoclonais humanos. Uma vez ocorrido um crescimento extensivo do hibridoma, o meio pode ser observado habitualmente após 10-14 dias. Os hibridomas segregadores de anticorpos podem ser replaqueados, novamente pesquisados, e se forem ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes através de diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Para purificar anticorpos monoclonais humanos, hibridomas seleccionados podem ser criados em frascos giratórios de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia de afinidade com proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada através de electroforese em gel e cromatografia líquida de alta resolução para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de DO280 utilizando 29 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Geração de Transfectomas Produtores de Anticorpos Monoclonais do Invento

Os anticorpos do invento podem também ser produzidos num transfectoma de células hospedeiras utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção de genes tal como são bem conhecidos na técnica (p.ex., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo destes, ADN codificando cadeias leves e pesadas parciais ou inteiras, podem ser obtidos através de técnicas padrão de biologia molecular (p.ex., amplificação por PCR ou clonagem de ADNc utilizando um hibridoma que expresse o anticorpo de interesse) e os ADN podem ser inseridos em vectores de expressão de modo a que os genes sejam operativamente ligados a sequências de controlo da transcrição e tradução. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo está ligado num vector de modo a que sequências de controlo da transcrição e da tradução dentro do vector desempenhem a sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do gene do anticorpo. O vector de expressão e as sequências de controlo da expressão são escolhidas para serem compatíveis com a expressão da célula hospedeira utilizada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo pode ser inserido num vector separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vector de expressão através de métodos padrão (p.ex., ligação de locais de restrição complementares no fragmento do gene do anticorpo e do vector, ou ligação de extremidades cegas se não estiverem presentes locais de restrição). As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes inteiros de anticorpo de qualquer isotipo de anticorpo através da sua inserção em vectores de expressão codificando já as regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve do isotipo desejado de modo a que o segmento VH fique 30 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ operativamente ligado ao segmento ou segmentos CH no vector e o segmento VK fique operativamente ligado ao segmento CL no vector. Adicionalmente ou alternativamente, o vector de expressão recombinante pode codificar um péptido sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vector de modo a que o péptido sinal fique ligado enquadrado com o terminal amino do gene da cadeia de anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (i.e., um péptido sinal de uma proteína que não seja imunoglobulina).

Para além dos genes da cadeia de anticorpo, os vectores de expressão recombinante do invento possuem sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpo numa célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" pretende incluir promotores, estimuladores e outros elementos de controlo da expressão (p.ex., sinais de poliadenilação) que controlem a transcrição ou tradução dos genes das cadeias de anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel ("Gene Expression Technology". Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado pelos peritos na técnica que o desenho do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências reguladoras, pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a transformar, o nível de expressão da proteína desejada, etc. Sequências reguladoras preferidas para expressão numa célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que dirigem elevados níveis de expressão proteica em células de mamífero, tais como promotores e/ou estimuladores derivados de citomegalovírus (CMVj, Virus Símio 40 (SV40), adenovírus, (p.ex., o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP) e polioma. Alternativamente, podem ser utilizadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor da ubiquitina ou o promotor da β-globina. Mais ainda, elementos reguladores compostos por sequências de fontes diferentes, tais como o sistema promotor SRoí, que contém sequências do promotor inicial de SV40 e a repetição terminal longa do virus de leucemia de células T humanas de tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) . 31 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Para além dos genes da cadeia de anticorpo e das sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinante do invento podem possuir sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vector em células hospedeiras (p.ex., origens de replicação) e genes marcadores seleccionáveis. 0 gene marcador seleccionável facilita a selecção de células hospedeiras em que o vector foi introduzido (ver, p.ex., Patente U.S. Nos. 4399216, 4634665 e 5179017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene do marcador seleccionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Genes de marcadores seleccionáveis preferidos incluem o gene da di-hidrofolato-redutase (DHFR) (para utilizar em células hospedeiras dhfr- com selecção de metotrexato/amplificação) e o gene neo (para selecção de G418).

Para expressão das cadeias pesadas e leves, o vector ou vectores de expressão codificando as cadeias pesadas e leves é transfectado numa célula hospedeira através de técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" pretendem englobar uma ampla variedade de técnicas vulgarmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, p.ex., electroporação, precipitação em fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos do invento em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e de preferência células hospedeiras de mamífero, é preferida porque é mais provável que tais células eucarióticas, e em particular células de mamífero, se juntem e segreguem um anticorpo correctamente dobrado e imunologicamente activo do que células procarióticas. A expressão procariótica dos genes de anticorpo foi relatada come sendo ineficaz para produção de elevados rendimentos de anticorpo activo (Boss, Μ. A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13). Células hospedeiras de mamifero preferidas para expressão dos anticorpos recombinantes do invento incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub and Chasin, (1980) 32 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216-4220, utilizadas com um marcador seleccionável DHFR, p.ex., tal como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para utilizar com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão génica GS divulgado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338841. Quando os vectores de expressão recombinante que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamifero, os anticorpos são produzidos através da cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, de preferência, a secreção do anticorpo para o meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos padrão de purificação de proteínas.

Caracterização da Ligação do Anticorpo ao Antigénio

Os anticorpos do invento podem ser testados quanto à ligação a PSMA, por exemplo, através de citometria de fluxo. Resumidamente, células LNCaP são colhidas frescas a partir de frascos de cultura de tecidos e é preparada uma suspensão de células individuais. As suspensões de células LNCaP são directamente coradas com anticorpo primário ou após fixação com paraformaldeído a 1% em PBS. Aproximadamente um milhão de células são ressuspensas em PBS contendo BSA a 0,5% e 50-200 pg/ml de anticorpo primário e incubadas em gelo durante 30 minutos. As células são lavadas duas vezes com PBS contendo BSA a 0,1%, NaN3 a 0,01%, ressuspensas em 100 μΐ de anti-IgG humano de cabra conjugado com FITC diluído 1:100 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), e incubadas em gelo durante mais 30 minutos. As células são novamente lavadas duas vezes, ressuspensas em 0,5 ml de tampão de lavagem e analisadas quanto à coloração de fluorescência num citómetro FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA).

Alternativamente, os anticorpos do invento podem ser testados quanto à ligação a PSMA através de ELISA padrão. Resumidamente, placas de microtitulação são revestidas com PSMA purificada a 0,25 pg/ml em PBS, e depois bloqueadas com 33 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ albumina de soro bovino a 5% em PBS. As diluições do anticorpo (p.ex., diluições de plasma de ratinhos imunizados com PSMA) são adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com reagente secundário (p.ex., para anticorpos humanos, um reagente policlonal de cabra especifico de Fc anti-IgG humana) conjugado com fosfatase alcalina durante 1 hora a 37°C. Após lavagem, as placas são reveladas com substrato pNPP (1 mg/ml) e analisadas a uma DO de 405-650. De preferência, os ratinhos que desenvolvem os títulos mais elevados serão utilizados para fusões.

Um ensaio ELISA tal como descrito acima também pode ser utilizado para pesquisar hibridomas que mostrem reactividade positiva com o imunogénio PSMA. Os hibridomas que se ligam com elevada avidez a PSMA são subclonados e melhor caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que mantém a reactividade das células-mãe (através de ELISA), pode ser escolhido para produzir um banco de células de 5-10 frascos armazenado a -140°C, e para purificação de anticorpos.

Para purificar anticorpos anti-PSMA, hibridomas seleccionados podem ser cultivados em frascos giratórios de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia de afinidade com proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). A IgG eluída pode ser verificada através de electroforese em gel e cromatografia líquida de alta resolução para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de DO280 utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-PSMA seleccionados se ligam a epitopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL) . Estudos de competição utilizando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados utilizando placas de ELISA revestidas com PSMA tal como descrito acima. A ligação do mAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda 34 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ estrep-avidina-fosfatase alcalina. Alternativamente, podem ser realizados estudos de competição utilizando anticorpo marcado radioactivamente e os anticorpos em competição não marcados podem ser detectados numa análise de Scatchard, tal como mais descrito nos Exemplos abaixo.

Para determinar o isotipo dos anticorpos purificados, podem ser realizados ELISA de isotipo utilizando reagentes específicos para anticorpos de um determinado isotipo. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, os poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 1 pg/ml de anti-imunoglobulina humana de um dia para o outro a 4°C. Após bloqueio com BSA a 1%, as placas são feitas reagir com 1 pg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou controlos do isotipo purificados, à temperatura ambiente durante uma a duas horas. Os poços podem então ser feitos reagir quer com IgGl humana quer com sondas conjugadas com fosfatase alcalina específicas de IgM humana. As placas são reveladas e analisadas tal como descrito acima.

IgG humanas anti-PSMA podem ainda ser testadas quanto a reactividade com o antigénio PSMA através de Western blotting. Resumidamente, PSMA pode ser preparado e sujeito a electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida. Após a electroforese, os antigénios separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro fetal de vitelo a 10%, e sondado com os anticorpos monoclonais a testar. A ligação da IgG humana pode ser detectada utilizando anti-IgG humana-fosfatase alcalina e revelada com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Imunoconjugados

Noutro aspecto, o presente invento apresenta um anticorpo anti-PSMA, ou um fragmento deste, conjugado com uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (p.ex., um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são aqui referidos como "imunoconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas." Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para 35 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ (p.ex., mate) as células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina, e análogos ou homólogos destes. Agentes terapêuticos incluem também, por exemplo, antimetabolitos (p.ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina), agentes alquilantes (p.ex., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cisplatina de cis-diclorodiamina-platina (II) (DDP)), antraciclinas (p.ex., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (p.ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (p.ex., vincristina e vinblastina).

Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas com um anticorpo do invento incluem duocarmicinas e caliqueamicinas e maitansinas e auristatinas, e seus derivados. Um exemplo de um conjugado de anticorpo caliqueamicina está comercialmente disponível (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).

As citotoxinas podem ser conjugadas com anticorpos do invento utilizando tecnologia de ligadores disponível na técnica. Exemplos de tipos de ligadores que têm sido utilizados para conjugar uma citotoxina com um anticorpo incluem, mas não se limitam a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfuretos e ligadores contendo péptidos. Pode ser escolhido um ligador que seja, por exemplo, susceptível a clivagem por pH baixo dentro do compartimento lisossómico ou susceptível a clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas em tecido tumoral tais como catepsinas (p.ex., catepsinas B, C, D).

Para uma discussão mais aprofundada dos tipos de citotoxinas, dos ligadores e dos métodos para conjugar agentes terapêuticos a anticorpos, ver também Saito, G. et 36 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ al. (2003) Câncer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Câncer Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Câncer 2: 750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Os anticorpos do presente invento podem também ser conjugados com um isótopo radioactivo para gerar radiofármacos citotóxicos, também referidas como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioactivos gue podem ser conjugados com anticorpos para utilização em diagnostrco ou terapia incluem, mas nao se limitam a, iodo , iodo125, índio111, ítrio90 e lutécio177. Os métodos para a preparação de radioimunoconjugados estão estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), e métodos semelhantes podem ser utilizados para preparar radioimunoconjugados utilizando os anticorpos do invento.

Os conjugados de anticorpos do invento podem ser utilizados para modificar uma resposta imunitária para modificar uma dada resposta biológica, e a porção fármaco não deve ser entendida como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa, ou um fragmento activo desta, tal como abrina, rícino A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como factor de necrose tumoral ou interferão-γ; ou, modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6") , factor estimulador de colónias de granulócitos-macróf agos ("GM-CSF")/· factor estimulador de colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros factores de crescimento.

As técnicas para conjugar tal porção terapêutica com anticorpos são bem conhecidas, ver, p.ex., Arnon et al. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, 37 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, " Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai

Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982) .

Moléculas Biespecíficas

Noutro aspecto, o presente invento apresenta moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-PSMA, ou um fragmento deste, do invento. Um anticorpo do invento, ou porções de ligação ao antigénio deste, podem ser derivados ou ligados a outra molécula funcional, p.ex., outro péptido ou proteína (p.ex., outro anticorpo ou ligando para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que ligue a pelo menos dois locais de ligação ou moléculas alvo diferentes. O anticorpo do invento pode de facto ser derivado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíf icas que se ligam a mais de dois locais de ligação e/ou moléculas alvo diferentes; também se pretende que tais moléculas multiespecíficas sejam englobadas pelo termo "molécula biespecífica" tal como aqui utilizado. Para criar uma molécula biespecífica do invento, um anticorpo do invento pode ser funcionalmente ligado (p.ex., através de ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, péptido ou mimético peptídico ou de ligação, de modo a que resulte uma molécula biespecífica.

Consequentemente, o presente invento inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para PSMA e uma segunda 38 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ especificidade de ligação para um segundo epitopo alvo. Numa concretização particular do invento, o segundo epitopo alvo é um receptor de Fc, p.ex., FcyRI humano (CD64) ou um receptor de Fca humano (CD89). Portanto, o invento inclui moléculas biespecificas capazes de se ligar a células efectoras expressando tanto FcyR como FcaR (p.ex., monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMN)), e a células alvo expressando PSMA. Estas moléculas biespecificas direccionam células que expressam PSMA para células efectoras e desencadeiam actividades de células efectoras mediadas pelo receptor de Fc, tais como fagocitose de células expressando PSMA, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), libertação de citocinas ou geração de anião superóxido.

Numa concretização do invento em que a molécula biespecifica é multiespecifica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, para além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-PSMA. Numa concretização, a terceira especificidade de ligação é uma porção anti-factor de estimulação (EF), p.ex., uma molécula que se ligue a uma proteína da superfície envolvida em actividade citotóxica e deste modo aumente a resposta imunitária contra a célula alvo. A "porção anti-factor de estimulação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que se ligue a uma dada molécula, p.ex., um antigénio ou um receptor, e resulta deste modo numa estimulação do efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou antigénio da célula alvo. A "porção anti-factor de estimulação" pode ligar-se a um receptor de Fc ou um antigénio da célula alvo. Alternativamente, a porção anti-factor de estimulação pode ligar-se a uma entidade que seja diferente da entidade a que se liga a primeira e segunda especificidades de ligação. Por exemplo, a porção anti-factor de estimulação pode ligar-se a uma célula T citotóxica (p.ex. através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imunitária que resulte numa maior resposta imunitária contra a célula alvo).

Numa concretização, as moléculas biespecificas do invento compreendem como especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo deste, incluindo, 39 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ p.ex., um Fab, Fab', F(ab')2/· Fv, ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também ser um dimero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo desta tal como um Fv ou uma construção de cadeia simples tal como descrito em Ladner et al. Patente U.S. No. 4946778, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência.

Numa concretização, a especificidade de ligação para um receptor Fcy é proporcionada por um anticorpo monoclonal, cuja ligação não seja bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG). Tal como aqui utilizado, o termo "receptor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia γ localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de receptor transmembranares ou solúveis que são agrupadas em três classes de receptores de Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD16). Numa concretização preferida, o receptor de Fcy humano é um FcyRI de elevada afinidade. 0 FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que mostra elevada afinidade para IgG monomérica (108-109 M-1). A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonais anti-FcY preferidos são descritas por Fanger et al. na Publicação PCT WO 88/00052 e na Patente U.S. No. 4954617, cujos ensinamentos são inteiramente aqui incorporados por referência. Estes anticorpos ligam-se a um epitopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num local que é distinto do local de ligação a Fcy do receptor e, assim, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos específicos anti-FcYRI úteis neste invento são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma produtor do mAb 32 está disponível em American Type Culture Collection, No. de Acesso ATCC HB9469. Noutras concretizações, o anticorpo anti-receptor de Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritas em Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002 e Publicação PCT WO 94/10332. A linha celular produtora do anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection sob a designação HA022CL1 e tem o no. de acesso CRL 11177. 40 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Ainda noutras concretizações preferidas, a especificidade de ligação para um receptor de Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humano, p.ex., um receptor de Fc-alfa (FcaRI (CD89)), cuja ligação não é, de preferência, bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA). O termo "receptor de IgA" pretende incluir o produto génico de um gene α (FcaRI) localizado no cromossoma 19. Sabe-se que este gene codifica várias isoformas transmembranares processadas alternativamente de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinófilos e neutrófilos, mas não em populações de células não-efectoras. FcaRI tem uma afinidade média (»5><107M_1) para ambas IgAl e IgA2, que é aumentada após exposição a citocinas, tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Criticai Reviews in Immunology 16: 423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcaRI fora do domínio de ligação do ligando de IgA, foram descritos (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).

FcaRI e FcyRI são os receptores de desencadeamento preferidos para utilizar nas moléculas biespecíficas do invento porque são (1) expressos principalmente em células efectoras imunitárias, p.ex., monócitos, PMN, macrófagos e células dendríticas; (2) expressos a níveis elevados (p.ex., 5000-100000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (p.ex., ADCC, fagocitose); (4) medeiam uma maior apresentação de antigénio de antigénios, incluindo auto-antigénios, direccionados a eles.

Embora os anticorpos monoclonais humanos sejam preferidos, outros anticorpos que podem ser empregues nas moléculas biespecíficas do invento são anticorpos monoclonais de murídeo, quiméricos e humanizados.

As moléculas biespecíficas do presente invento podem ser preparadas através da conjugação das especificidades de ligação constituintes, p.ex., as especificidades de ligação anti-FcR e anti-PSMA, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois 41 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, pode ser utilizada uma variedade de agentes de ligação ou reticulação para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver p.ex., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78: 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229: 81-83), e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis em Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados através de ligação sulfidrilo das regiões charneira do terminal C das duas cadeias pesadas. Numa concretização particularmente preferida, a região charneira é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrilo, de preferência um, antes da conjugação.

Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vector e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é um mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou proteína de fusão ligando χ Fab. A molécula biespecífica do invento pode ser uma molécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou um molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Os métodos para preparação de moléculas biespecíficas são descritos por exemplo na Patente u. s. Número 5260203, Patente U.S Número 5455030, Patente u. s. Número 4881175, Patente U.S Número 5132405, Patente u.s. Número 5091513, Patente U.S . Número 5476786, Patente u. s. Número 5013653, Patente U.S. Número 5258498, e Patente u.s. Número 5482858 . 42 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, através de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (p.ex., inibição do crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios detecta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse através do emprego de um reagente marcado (p.ex., um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detectados utilizando p.ex., um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado a uma enzima que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., "Principies of

Radioimmunoassays", Seventh Training Course on Radioligands Assay Techniques, The Endocrine Society, Março, 1986, que é aqui incorporado por referência). 0 isótopo radioactivo pode ser detectado através de meios tais como a utilização de um contador de γ ou um contador de cintilações ou através de autorradiografia.

Composições Farmacêuticas

Noutro aspecto, o presente invento proporciona uma composição, p.ex., uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porção ou porções de ligação ao antigénio deste, do presente invento, formulados em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de anticorpos (p.ex., dois ou mais diferentes), ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas do invento. Por exemplo, uma composição farmacêutica do invento pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a diferentes epitopos no antigénio alvo ou que possuem actividades complementares.

As composições farmacêuticas do invento podem também ser administradas em terapia de combinação, i.e., combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode 43 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ incluir um anticorpo anti-PSMA do presente invento combinado com pelo menos um outro agente anti-inflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser utilizados em terapia de combinação são descritos em maior detalhe abaixo na secção sobre utilizações dos anticorpos do invento.

Tal como aqui utilizado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, administração espinal e epidérmica (p.ex., através de injecção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto activo, i.e., anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecifica, pode ser revestido num material para proteger o composto da acção de ácidos e outras condições naturais que possam inactivar o composto.

Os compostos farmacêuticos do invento podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que mantém a actividade biológica desejada do composto original e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver, p.ex., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como a partir de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos fenil-substituídos, ácidos hidroxialcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Sais de adição básica incluem os derivados de metais de terra alcalina, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes. 44 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Uma composição farmacêutica do invento pode também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteina, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbilpalmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes metálicos, tais como ácido citrico, ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e semelhantes.

Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas do invento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e semelhantes), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e através da utilização de tensioactivos.

Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes humidificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto através de procedimentos de esterilização, supra, como através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser alcançada através da inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a 45 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes como substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto activo, a utilização destes nas composições farmacêuticas do presente invento está contemplada. Compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma elevada concentração do fármaco. 0 transportador pode ser um meio solvente ou de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (p.ex., glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrase a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através de incorporação do composto activo na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas através de incorporação do composto activo num transportador estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir dos acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem sob vácuo e secagem por congelação (liofilização) que produzem um pó do ingrediente activo mais 46 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução deste previamente esterilizada por filtração. A quantidade ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do sujeito a tratar, e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade de composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove porcento do ingrediente activo, de preferência de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, de maior preferência de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento de ingrediente activo em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (p.ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, tal como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária tal como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a tratar; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias do invento é ditada por, e directamente dependente de, (a) as caracteristicas únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes à técnica de compor um tal composto activo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0, 0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente de 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo as 47 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro do intervalo de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar implica a administração uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez cada três semanas, uma vez cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez cada 3 meses ou uma vez cada três a 6 meses. Regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-PSMA do invento incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal através de administração intravenosa, sendo o anticorpo dado através da utilização de um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) cada quatro semanas durante seis doses, depois cada três meses; (ii) cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada três semanas.

Nalguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado recai dentro dos intervalos indicados. 0 anticorpo é geralmente administrado em várias ocasiões. Os intervalos entre doses individuais podem ser, por exemplo, semanais, mensais, cada três meses ou anuais. Os intervalos podem também ser irregulares, tal como indicado através da medição dos niveis sanguíneos de anticorpo para o antigénio alvo no paciente. Nalguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 pg/ml e nalguns métodos cerca de 25-300 pg/ml.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação sustida, caso em que é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e a frequência variam dependendo da semivida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos apresentam a semivida mais longa, seguidos pelos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilácticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada a intervalos relativamente pouco frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas. Em aplicações 48 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ terapêuticas, é por vezes necessária uma dosagem relativamente elevada a intervalos relativamente curtos até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e de preferência até que o paciente mostre uma melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, pode ser administrado ao paciente um regime profiláctico.

Os niveis de dosagem reais dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas do presente invento podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente activo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, composição, e modo de administração, sem serem tóxicos para o paciente. 0 nivel de dosagem seleccionado dependerá de uma variedade de factores farmacocinéticos incluindo a actividade das composições particulares do presente invento empregues, ou o éster, sal ou amida deste, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a empregar, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, o sexo, o peso, a condição, o estado geral de saúde e a história médica anterior do paciente a tratar, e factores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-PSMA do invento resulta de preferência numa diminuição na gravidade dos sintomas da doença, num aumento na frequência e duração dos períodos sem sintomas de doença, ou numa prevenção de disfunção ou incapacidade devido à aflição da doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores PSMA+, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" inibe de preferência o crescimento celular ou o crescimento de um tumor, pelo menos, cerca de 20%, de preferência pelo menos cerca de 40%, ainda de preferência pelo menos cerca de 60%, e ainda de maior preferência pelo menos cerca de 80% relativamente a indivíduos não tratados. A capacidade de um composto para inibir o crescimento de um tumor pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada através do exame da capacidade do composto para inibir, tal inibição in vitro através de ensaios 49 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ conhecidos para ο perito executante. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho de um tumor, ou de outra formar melhorar os sintomas num sujeito. Um vulgar perito na técnica será capaz de determinar tais quantidades com base em factores tais como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição ou via de administração particular seleccionada. A composição do presente invento pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado pelo perito na técnica, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Vias de administração preferidas para os anticorpos do invento incluem as vias parentéricas de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras, por exemplo, através de injecção ou infusão. A frase "administração parentérica" tal como aqui utilizada significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente através de injecção, e inclui, sem limitação, injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraspinal, epidural e intra-esternal.

Alternativamente, um anticorpo do invento pode ser administrado através de uma via não parentérica, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, p.ex., intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente ou topicamente. 0 composto activo pode ser preparado com transportadores que irão proteger o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de etileno-vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a 50 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos dos peritos na arte. Ver, p.ex. "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa concretização preferida, uma composição terapêutica do invento pode ser administrada com um dispositivo de injecção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 ou 4596556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis no presente invento incluem: Patente U.S. No. 4487603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para distribuição de medicação a uma velocidade controlada; Patente U.S. No. 4486194, que divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. No. 4447233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuição de medicação a uma velocidade de infusão precisa; Patente U.S. No. 4447224, que divulga um aparelho de infusão de fluxo variável implantável para distribuição continua de fármacos; Patente U.S. No. 4439196, que divulga um sistema osmótico de distribuição de fármacos possuindo compartimentos com múltiplas câmaras; e Patente U.S. No. 4475196, que divulga um sistema osmótico de distribuição de fármacos. Estas patentes são aqui incorporadas por referência. Muitos outros implantes, sistemas de distribuição e módulos destes são conhecidos dos peritos na arte.

Em certas concretizações, os anticorpos monoclonais humanos do invento podem ser formulados para assegurar uma distribuição in vivo adequada. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui muitos compostos altamente hidrófilos. Para garantir que os compostos terapêuticos do invento atravessam a BHE (se desejado), estes podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, ver, p.ex., Patentes U.S. 4522811; 5374548; e 5399331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são selectivamente transportadas para células ou órgãos específicos, aumentando assim a p.ex., distribuição de fármacos direccionada (ver, p.ex., V.V. 51 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Porções direccionadoras exemplares incluem ácido fólico ou biotina (ver, p.ex., Patente U.S. 5416016 para Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor da proteína A tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

Utilizações e Métodos do Invento

Os anticorpos, composições de anticorpo e métodos do presente invento têm numerosas utilidades de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo o diagnóstico e tratamento de distúrbios envolvendo a expressão de PSMA. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, p.ex., in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, p.ex., in vivo, para tratar, prevenir e para diagnosticar uma variedade de distúrbios. Tal como aqui utilizado, o termo "sujeito" pretende incluir animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, p.ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, porcos, galinhas, aves, anfíbios e répteis. Sujeitos preferidos incluem pacientes humanos possuindo distúrbios associados a expressão de PSMA. Quando os anticorpos para PSMA são administrados em conjunto com outro agente, os dois podem ser administrados por qualquer ordem ou simultaneamente.

Vias de administração adequadas das composições de anticorpo (p.ex., anticorpo ou imunoconjugado) do invento in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser seleccionadas pelos vulgares peritos na técnica. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas através de injecção (p.ex., intravenosa ou subcutânea). As dosagens adequadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e do peso do sujeito e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpo. 52 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Numa concretização, os anticorpos do invento podem ser inicialmente testados quanto à actividade de ligação associada a utilização terapêutica ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, as composições do invento podem ser testadas utilizando ELISA e ensaios de citometria de fluxo. Além disso, a actividade destas moléculas no desencadeamento de pelo menos uma actividade de células efectoras mediada pelo efector, incluindo inibição do crescimento e/ou morte de células expressando PSMA, pode ser ensaiada. Os protocolos para ensaio de ADCC mediada por células efectoras são descritos nos Exemplos abaixo. A. Métodos de Detecção

Numa concretização, os anticorpos do invento podem ser utilizados para detectar niveis de PSMA, ou níveis de células que contenham PSMA na sua superfície membranar, níveis esses que podem então ser ligados a certos sintomas de doença.

Numa concretização particular, o invento proporciona métodos para detecção da presença de PSMA numa amostra, ou medição da quantidade de PSMA à superfície das células, compreendendo o contacto da amostra, e uma amostra de controlo, com um anticorpo, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, que se liga especificamente a PSMA, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção deste e PSMA. É então detectada a formação de um complexo, em que uma diferença na formação do complexo entre a amostra comparada com a amostra de controlo é indicativa da presença de PSMA na amostra. Por exemplo, métodos de detecção padrão, bem conhecidos na técnica, tais como ELISA e ensaios de citometria de fluxo, podem ser realizados utilizando as composições do invento.

Consequentemente, num aspecto, o invento proporciona ainda métodos para detecção da presença de PSMA (p.ex., PSMA humana) numa amostra, ou medição da quantidade de PSMA, compreendendo o contacto da amostra, e de uma amostra de controlo, com um anticorpo do invento, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, que se liga especificamente a PSMA, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção deste e PSMA. É então detectada a 53 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ formação de um complexo, em que uma diferença na formação do complexo entre a amostra comparada com a amostra de controlo é indicativa da presença de PSMA na amostra.

As composições do invento podem também ser utilizadas para direccionar células expressando PSMA, por exemplo para marcação de tais células. Para tal utilização, o agente de ligação pode ser ligado a uma molécula que possa ser detectada. Assim, o invento proporciona métodos para localização ex vivo ou in vitro de células expressando PSMA. 0 marcador detectável pode ser, p.ex., um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofactor enzimático. B. Inibição do Crescimento de Células PSMA+

Os anticorpos podem ser utilizados para inibir o crescimento de células expressando PSMA que, por sua vez, pode ser ligado à prevenção ou melhoria de certos sintomas de doença associados a expressão de PSMA. As diferenças na expressão de PSMA durante um estado de doença em comparação com um estado sem doença podem ser determinadas através do contacto de uma amostra de teste de um sujeito sofrendo da doença e de uma amostra de controlo com o anticorpo anti-PSMA sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e PSMA. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e PSMA são detectados e comparados na amostra e no controlo.

Por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados para desencadear in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes actividades biológicas: inibir o crescimento de e/ou matar uma célula expressando PSMA; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula expressando PSMA na presença de células efectoras humanas; inibir o derramamento de PSMA solúvel. Tal como aqui discutido, os anticorpos do invento exibem uma actividade de ADCC melhorada em comparação com a forma fucosilada do anticorpo.

Consequentemente, noutro aspecto, o invento proporciona um método de inibição do crescimento de células PSMA+ compreendendo o contacto das referidas células com um anticorpo anti-PSMA sob condições suficientes para induzir 54 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) das referidas células. As células podem ser, por exemplo, células tumorais. Numa concretização preferida, o anticorpo anti-PSMA é um anticorpo humano.

Numa concretização, os anticorpos, ou porções de ligação destes, do presente invento podem ser utilizados para modular os níveis de PSMA em células alvo, tal como através de bloqueio e eliminação de receptores na superfície celular. Misturas de anticorpos anti-receptores de Fc também podem ser utilizadas para este fim. Células efectoras específicas do alvo, p.ex., células efectoras associadas a composições do invento podem também ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efectoras para direccionamento podem ser leucócitos humanos, tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células possuindo receptores de IgG ou IgA. Se desejado, as células efectoras podem ser obtidas a partir do sujeito a tratar. As células efectoras específicas do alvo, podem ser administradas como uma suspensão de células numa solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas pode ser na ordem de 108-109 mas variará dependendo do fim terapêutico. Em geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, p.ex., uma célula tumoral expressando PSMA, e para efectuar a morte da célula, p.ex., através de fagocitose. As vias de administração podem também variar. A terapia com células efectoras específicas do alvo pode ser efectuada em conjunto com outras técnicas para remoção de células alvo. Por exemplo, terapia anti-tumoral utilizando as composições do invento e/ou células efectoras armadas com estas composições pode ser utilizada em conjunto com quimioterapia. Além disso, imunoterapia de combinação pode ser utilizada para dirigir duas populações efectoras citotóxicas distintas para rejeição de células tumorais. 55 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ C. Utilização de Imunoconjugados e Terapia de Combinação

Numa concretização, os imunoconjugados do invento podem ser utilizados para direccionar compostos (p.ex., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) para células que possuam moléculas de PSMA na superfície celular através da ligação de tais compostos ao anticorpo. Assim, o invento proporciona também métodos para localizar ex vivo ou in vitro células expressando PSMA (p.ex., com um marcador detectável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofactor enzimático). Alternativamente, os imunoconjugados podem ser utilizados para matar células que possuam receptores de PSMA na superfície celular direccionando citotoxinas ou radiotoxinas para PSMA, tais como células tumorais expressando PSMA, para desse modo eliminar a célula tumoral.

Noutras concretizações, o sujeito pode ser adicionalmente tratado com um agente que module, p.ex., estimule ou iniba, a expressão ou actividade de Fcy ou receptores de Fcy, por exemplo, através do tratamento do sujeito com uma citocina. Citocinas preferidas para administração durante tratamento incluem factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão-γ (IFN-γ), e factor de necrose tumoral (TNF).

Noutra concretização, pode ser adicionalmente administrado a pacientes tratados com composições de anticorpo do invento (antes, simultaneamente, ou após administração de um anticorpo do invento) outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que estimule ou aumente o efeito terapêutico dos anticorpos humanos. 0 anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou simultaneamente com o agente ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, p.ex., uma terapia anticancro, p.ex., radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como doxorrubicina (adriamicina) , sulfato de cisplatina- 56 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ bleomicina, carmustina, clorambucilo, e ciclofosfamida-hidroxiureia que, por si próprios, são eficazes apenas a niveis que são tóxicos ou subtóxicos para um paciente. A cisplatina é administrada por via intravenosa como uma dose de 100 mg/ml uma vez de quatro em quatro semanas e a adriamicina é administrada por via intravenosa como uma dose de 60-75 mg/ml cada 21 dias. A co-administração dos anticorpos anti-PSMA, ou fragmentos de ligação ao antigénio destes, do presente invento com agentes quimioterapêuticos proporciona dois agentes anticancro que operam através de diferentes mecanismos que produzem um efeito citotóxico para células tumorais humanas. Tal co-administração pode resolver problemas devidos ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou a uma mudança na antigenicidade das células tumorais que as tornaria não reactivas com o anticorpo. D. Tratamento de Cancro

Foi mostrado que PSMA é expresso em células tumorais, tais como células tumorais de carcinoma da próstata, e também foi mostrado ser expresso em células endoteliais vasculares próximas de células cancerosas, tais como células cancerosas uroteliais, células cancerosas do cólon, células cancerosas rectais, células cancerosas de pulmão, células cancerosas da mama e células cancerosas de adenocarcinoma metastático do figado (ver Patente U.S. No. 6136311). Consequentemente, os anticorpos do invento podem ser utilizados para tratar cancro através de inibição do crescimento de células tumorais expressando PSMA ou através de inibição do crescimento de células endoteliais vasculares próximas das células tumorais. Assim, noutra concretização, o presente invento proporciona um método de inibição do crescimento de um tumor num sujeito, em que células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor são PSMA+, em que um anticorpo anti-PSMA do invento é administrado ao sujeito de modo a que o crescimento do tumor seja inibido. Para sujeitos humanos, o anticorpo é de preferência um anticorpo humanizado ou humano. Numa concretização preferida, as células tumorais são células tumorais da próstata. Noutras concretizações, as células tumorais são de cancros tais como do cólon, renal, rectal, urotelial, da mama, da bexiga, do fígado, do pâncreas ou melanoma. 57 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Os métodos de tratamento do invento envolvem a administração a um sujeito de uma composição de anticorpo do presente invento numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir o distúrbio. A composição de anticorpo pode ser administrada sozinha ou com outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou um radiotóxico (conjugado ou administrado com o anticorpo), que actue em conjunto ou sinergicamente com a composição de anticorpo para tratar ou prevenir a doença associada a expressão de PSMA.

Os métodos de tratamento do invento envolvem também a administração a um sujeito de um anticorpo anti-PSMA em combinação com outro agente, tal como um agente anti-tumoral, que actue em conjunto ou sinergicamente com a composição de anticorpo para tratar ou prevenir a doença associada a expressão de PSMA. Tal como aqui mostrado, a utilização do anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere® (Docetaxel) resultou na inibição do crescimento tumoral num modelo animal e curou os animais de caquexia relacionada com o tumor (ver Exemplo 8). Sem pretender estar limitado pelo mecanismo, crê-se que a utilização de um agente anti-tumoral provoca danos na massa tumoral, permitindo, assim, uma melhor penetração do anticorpo, das células efectoras ou de um componente efector alternativo, conduzindo a uma citotoxicidade mais eficaz. Numa concretização, a utilização de um agente anti-tumoral causa danos na massa tumoral, permitindo, assim, que as células efectoras tenham acesso ao tumor, conduzindo a uma citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) das células tumorais. Noutra concretização, a utilização de um agente anti-tumoral, p.ex., um inibidor de microtúbulos, faz com que as células tumorais sejam intrinsecamente mais susceptiveis a morte mediada por anti-PSMA. Numa concretização do invento, o efeito sinergistico ou aditivo obtido através da administração de um anticorpo anti-PSMA e um agente anti-tumoral é independente de, i.e., não causado por, a inversão da polaridade apical do antigénio PSMA para a membrana plasmática basolateral.

Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo anti-PSMA" inclui qualquer anticorpo que se ligue especificamente ao antigénio membranar humano especifico da próstata. Exemplos 58 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ de tais anticorpos incluem os anticorpos aqui descritos, os anticorpos descritos em Pedido de Patente U.S. No. 10/059989 e Publicação PCT No. WO 03064606A3, ou os anticorpos descritos em Pedido Provisório U.S. No. 60/660431. Os conteúdos de cada um dos pedidos acima referidos são aqui incorporados por referência.

Tal como aqui utilizado, o termo "agente anti-tumoral" inclui qualquer agente que possa ser utilizado para destruir ou ajudar na destruição (p.ex., parcialmente ou totalmente) de um tumor. Numa concretização, o agente anti-tumoral é capaz de causar danos na massa tumoral, permitindo assim que as células efectoras acedam ao tumor mais facilmente, conduzindo a uma citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) mais eficaz das células tumorais. O termo "agente anti-tumoral" inclui agentes quimioterapêuticos, inibidores de angiogénese, agentes bloqueadores de microtúbulos, agentes imuno-moduladores, intercaladores/reticuladores de ADN, inibidores da síntese de ADN, reguladores da transcrição de ADN-ARN, inibidores enzimáticos, e reguladores de genes. O termo "agente quimioterapêutico" inclui qualquer agente que possa ser utilizado para tratar cancro, p.ex., cancro da próstata. Agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, anti-metabolitos, alcaloides vegetais, antibióticos anti-tumorais e hormonas esteróides. Exemplos específicos de agentes quimioterapêuticos incluem, mas não se limitam a, todos os trans-ácidos retinóicos, Aminoglutetimida, Azacitidina, Azatioprina, Bleomicina (Blenoxane), Bussulfano (Mielerano), Carboplatina, Carboplatino (Paraplatina), Carmustina (BCNU), Capecitabina, CCNU (Lomustina), Clorambucilo (Leukeran), 2-Colrodesoxiadenosina (2-CDA; Cladribina, Leustatina), Cis-platino (Platinol), Cisplatina (cis-DDP), Sulfato de cisplatina-bleomicina, Clorambucilo, Ciclofosfamida (Cytoxanl CTX), Ciclofosfamida-hidroxiureia, Citarabina (Ara-C; citosina-arabinósido), Daunorrubicina (Cerubidine), Dacarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazolcarboxamida), Dactinomicina (actinomicina D) , Daunorrubicina (daunomicina; rubidomicina), Dietilstilbestrol, Docetaxel (Taxotere), Doxifluridina, Doxorrubicina (Adriamicina), Epirrubicina, 59 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Etinil-estradoil, Etopósido (VP-16, VePesid), Fluorouracilo (5-Fu; Floxuridina, fluorodesoxiuridina; FUdR), Fludarabina (Fludara), Flutamida, Fluoximesterona, Gemcitabina (Gemzar) , Herceptina (Trastuzumab; anticorpo monoclonal anti-HER 2), Hidroxiureia (Hydrea), Caproato de hidroxiprogesterona, Idarrubicina, Ifosfamida (Ifex), Interferão alfa, Irinotecano (CPT-11), L-Asparaginase, Leuprolide, Mecloretamina, Acetato de medroxiprogesterona, Acetato de megestrol, Melfelano (Alkeran), Mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP),

Metotrexato (MTX; ametopterina), Mitomicina (mitomicina C) , Mitotano (ο,ρ'-DDD), Mitoxantrona (Novantrone), Oxaliplatina, Paclitaxel (Taxol), Pemetrexed, Pentostatina (2-desoxicoformicina), Plicamicina (mitramicina), Prednisona, Procarbazina (Matulane; N-metil-hidrazina, MIH), Rituxina (Rituximap), Semustina (Metil-CCNU), Estreptozocina, Taxol, Tamoxifeno, Tenipósido, Tertipósido, Propionato de testosterona, Tioguanina (6-tioguanina; TG), Tiotepa, Tomudex (Raltitrexed), Topotecano (Hycamtin; (S)-10-[(dimetilamino) metil]-4-etil-4,9-di-hidroxi-lH-pirano[3',4'], Treossulfano (Ovastat), Valrubicina, Vinblastina (VLB; Velban), Vincristina (Oncovin), Vindesina e Vinorelbina (Navelbine). O termo "agente bloqueador de microtúbulos" inclui qualquer agente que seja capaz de perturbar a organização normal e a dinâmica dos microtúbulos. Exemplos de agentes de bloqueio de microtúbulos incluem, mas não se limitam a, taxanos (Taxol® (Paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), alcaloides vinca (vinblastina, vincristina (Oncovin), Vindesina (Eldisine, Fildesin), Vinorelbina (Navelbine)), 2- metoxiestradiol (2ME2), estramustina, epotilonas, Colchicina, Dolastatina 15, Nocodazole e Podofilotoxina e Rizoxina.

Os termos "inibidor da angiogénese" e "agente anti-angiogénico" são aqui utilizados indiferentemente e incluem qualquer agente que seja capaz de impedir ou inibir a formação de vasos sanguíneos. Exemplos específicos de inibidores da angiogénese incluem, mas não se limitam a, Angiostatina Kl-3, Arresten, aaAT, Canstatina, DL-a-difluorometil-ornitina, Endostatina, Fumagilina, Genisteina, Minociclina, Estaurosporina, (±)-Talidomida e Tumstatina. 60 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ Ο termo "agente imuno-modulador" inclui qualquer agente que module, p.ex., estimule, uma resposta imunitária. Exemplos de agentes imuno-moduladores incluem anticorpos, tais como anticorpos anti-PDl e anticorpos anti-CTLA-4, sozinhos ou em combinação, descritos, inter alia, em Pedido Provisório U.S. No. 60/679466, apresentado a 05/09/2005; em Publicação PCT WO 01/14424; em Pedido Provisório U.S. 60/738434, apresentado a 11/21/2005; e em Pedido Provisório U.S.__, apresentado a 12/08/2005 (Attorney Docket

No. MEDX-0124US2 ou 04280/1203401-US1), cujos conteúdos de cada um são aqui expressamente incorporados por referência.

Agentes imuno-moduladores adicionais que podem ser utilizados nos métodos do presente invento incluem anticorpos que bloqueiam um sinal co-estimulador, (p.ex. CD28, ou ICOS), anticorpos que activam um sinal inibidor através de CTLA4 e/ou anticorpos contra outros marcadores de células imunitárias (p.ex., CD40, ligando de CD40, ou citocinas), proteínas de fusão (p.ex., CTLA4-Fc, PD-l-Fc), e fármacos imunossupressores, (p.ex., rapamicina, ciclosporina A ou FK506). Outros exemplos de agentes imuno-moduladores incluem fosforotiolato-oligodesoxirribonucleótido (1018 ISS), GVAX (uma vacina do gene de GM-CSF), interleucinas (p.ex., interleucina-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 (CYT 99 07), 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 e 30), p.ex., anticorpos de interleucinas recombinantes, p.ex., IL-2, p.ex., Aldesleukin, p.ex., interleucinas recombinantes (p.ex., interleucina-21 recombinante (rIL-21)), p.ex., IL-11, p.ex., oprelvekin, p.ex., antagonistas de receptores de interleucina, p.ex., antagonistas do receptor de IL-1, p.ex., anakinra, glucocerebrosidase, p.ex., Imiglucerase, factor activador de macrófagos, péptido de macrófagos, factor de células B, e factor de células T.

Exemplos de intercaladores/reticuladores de ADN incluem, mas não se limitam a, Bleomicina, Carboplatina, Carmustina, Clorambucilo, Ciclofosfamida, Dicloreto de cis-diaminoplatina (II) (Cisplatina), Melfalano, Mitoxantrona, e Oxaliplatina.

Exemplos de inibidores da síntese de ADN incluem, mas não se limitam a, (±)-Ametopterina (Metotrexato), 1,4-Dióxido 61 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ de 3-amino-l,2,4-benzotriazina, Aminopterina, Citosina-p-D-arabinofuranósido, 5-Fluoro-5'-desoxiuridina, 5-Fluorouracilo, Ganciclovir, Hidroxiureia e Mitomicina C.

Exemplos de reguladores da transcrição de ADN-ARN incluem, mas não se limitam a, Actinomicina D, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Homo-harringtonina e Idarrubicina.

Exemplos de inibidores de enzimas incluem, mas não se limitam a, S(+)-Camptotecina, Curcumina, (-)-Deguelina, 1-β-D-Ribofuranósido de 5,6-diclorobenz-imidazol, Etopósido, Formestano, Fostriecina, Hispidina, Ácido 2-imino-l-imidazoli-dineacético (Ciclocreatina), Mevinolina, Tricostatina A, Tirfostina AG 34 e Tirfostina AG 879.

Exemplos de reguladores de genes incluem, mas não se limitam a, 5-Aza-2'-desoxicitidina, 5-Azacitidina, Colecalciferol (Vitamina D3), 4-Hidroxitamoxifeno, Melatonina, Mifepristona, Raloxifeno, todos os trans-Retinais (aldeido de Vitamina A) , Ácido retinóico, todos os trans-(ácido de Vitamina A) , Ácido 9-cis-Retinóico, Ácido 13-cis-retinóico, Retinol (Vitamina A), Tamoxifeno e Troglitazona.

Os métodos do invento envolvem também a administração a um sujeito de um imunoconjugado (compreendendo um anticorpo anti-PSMA, ou porção de ligação ao antigénio deste, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioactivo) em combinação com um agente anti-tumoral, gue actue em conjunto ou sinergisticamente com a composição de anticorpo para tratar ou prevenir a doença associada a expressão de PSMA.

Os métodos do invento envolvem ainda a administração a um sujeito de uma molécula biespecífica (compreendendo um anticorpo anti-PSMA, ou porção de ligação ao antigénio deste, ligada a uma segunda porção funcional possuindo uma especificidade de ligação diferente da do anticorpo) em combinação com um agente anti-tumoral, que actue em conjunto ou sinergisticamente com a composição de anticorpo para tratar ou prevenir a doença associada a expressão de PSMA. 0 agente anti-tumoral pode ser administrado em qualquer dosagem 62 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ terapeuticamente eficaz conhecida na técnica ou tal como aqui descrito (ver composições farmacêuticas). 0 anticorpo anti-PSMA pode ser administrado em combinação com um único agente anti-tumoral. 0 anticorpo anti-PSMA pode também ser administrado em combinação com dois ou mais agentes anti-tumorais. 0 anticorpo anti-PSMA e o agente anti-tumoral podem ser administrados simultaneamente. Por exemplo, o anticorpo anti-PSMA e o agente anti-tumoral podem ser administrados juntos numa única formulação farmacêutica. Noutra concretização, o anticorpo anti-PSMA e o agente anti-tumoral podem ser administrados ao mesmo tempo como duas ou mais formulações farmacêuticas separadas. 0 anticorpo anti-PSMA e o agente anti-tumoral podem também ser administrados a momentos diferentes. Por exemplo, o agente ou agentes anti-tumorais podem ser administrados antes da administração do anticorpo anti-PSMA (p.ex., cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 24 ou 48 horas antes da administração do anticorpo anti-PSMA).

Alternativamente, o anticorpo anti-PSMA pode ser administrado antes da administração do agente ou agentes anti-tumorais (p.ex., cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 24 ou 48 horas antes da administração do agente ou agentes anti-tumorais. Numa concretização, o anticorpo anti-PSMA pode ser administrado em combinação com um agente anti-tumoral de acordo com o esquema de dosagem aqui delineado na Tabela 1.

Estojos

Também dentro do âmbito do invento estão estojos compreendendo um anticorpo do invento e instruções para utilização. O estojo pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imuno-estimulador, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico, ou um ou mais anticorpos adicionais do invento (p.ex., um anticorpo possuindo uma actividade complementar que se liga a um epitopo no antigénio PSMA distinto do primeiro anticorpo) . Os estojos incluem tipicamente um rótulo indicando a utilização pretendida para o conteúdo do estojo. O termo rótulo inclui 63 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ qualquer material escrito ou gravado fornecido no ou com o estojo, ou que de outro modo acompanhe o estojo. 0 presente invento é ainda ilustrado através dos seguintes exemplos que não devem se entendidos como mais limitantes.

Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra PSMA

Antigénio

Os protocolos de imunização utilizaram como antigénio células da linha celular de cancro da próstata expressando PSMA, LNCaP (ATCC CRL-1740).

Ratinhos transgénicos HuMab

Anticorpos monoclonais totalmente humanos para PSMA foram preparados utilizando a estirpe HCol2 de ratinhos transgénicos HuMab, que expressa genes de anticorpo humanos. Nestas estirpes de ratinho, o gene endógeno da cadeia leve capa de ratinho foi homozigoticamente destruído tal como descrito em Chen et ai. (1993) EMBO J. 12 : 811-820 e o gene endógeno da cadeia pesada de ratinho foi homozigoticamente destruído tal como descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Além disso, esta estirpe de ratinho possui um transgene da cadeia leve capa humana, KCo5, tal como descrito em Fishwild et ai. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, e um transgene da cadeia pesada humana, HCol2, tal como descrito no Exemplo 2 da Publicação PCT WO 01/09187.

Imunizações de HuMab:

Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para PSMA, ratinhos HuMab foram imunizados com células LNCaP expressando PSMA como antigénio. Esquemas gerais de imunização para ratinhos HuMab são descritos em Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e Publicação PCT WO 98/24884. Os ratinhos tinham 6-16 semanas de idade após a primeira infusão de antigénio. 5-10xl06 células foram 64 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ utilizadas para imunizar os ratinhos HuMab intraperitonealmente (IP), subcutaneamente (Sc) ou através de injecção na almofada da pata.

Os ratinhos transgénicos foram imunizados duas vezes com antigénio em adjuvante completo de Freund ou adjuvante de Ribi IP, seguido de 3-21 dias IP (até um total de 11 imunizações) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund ou adjuvante de Ribi. A resposta imunitária foi monitorizada através de sangrias retro-orbitais. 0 plasma foi pesquisado através de ELISA (tal como descrito abaixo), e ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-PSMA foram utilizados para fusões. Os ratinhos foram reforçados intravenosamente com antigénio 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Tipicamente, foram efectuadas 10-35 fusões para cada antigénio. Várias dezenas de ratinhos foram imunizados para cada antigénio.

Selecção de ratinhos HuMab Produtores de Anticorpos Anti-PSMA:

Para seleccionar ratinhos HuMab produtores de anticorpos que se liguem a PSMA, soros de ratinhos imunizados foram pesquisados quanto a ligação à linha celular de cancro da próstata expressando PSMA LNCaP, mas não a uma linha celular de cancro da próstata negativa através de citometria de fluxo. Resumidamente, a ligação de anticorpos anti-PSMA foi avaliada através de incubação de células LNCaP com o anticorpo anti-PSMA a uma concentração de 20 pg/ml. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um Ab anti-IgG humana marcado com FITC. Foram realizadas análises de citometria de fluxo utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinsqn, San Jose, CA) . Os anticorpos que se ligaram às células LNCaP que expressam PSMA mas não às células de cancro da próstata que não expressam PSMA foram ainda testados quanto a ligação a PSMA através de ELISA, tal como descrito por Fishwild, D. et al. (1996). Resumidamente, placas de microtitulação foram revestidas com PSMA purificada a 1-2 pg/ml em PBS, 100 μΐ/poço incubadas a 4°C de um dia para o outro, em seguida bloqueou-se com 200 μΐ/poço de soro fetal bovino a 5% em PBS/Tween (0,05%). Diluições de soros de ratinhos imunizados com PSMA foram adicionadas a cada poço e 65 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ incubou-se durante 1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com um anticorpo policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase de rábano (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram reveladas com substrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e analisadas através de espectrofotómetro a DO 415-495. Os ratinhos que desenvolveram os títulos de anticorpos anti-PSMA mais altos foram utilizados para fusões. As fusões foram realizadas como descrito abaixo e os sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto à actividade anti-PSMA através de ELISA.

Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais Humanos para PSMA:

Os esplenócitos de ratinho, isolados a partir de ratinhos HuMab, foram fundidos com PEG a uma linha celular de mieloma de ratinho com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos do antigénio. Suspensões de células individuais de esplenócitos de ratinhos imunizados foram fundidas com um quarto do número de células de mieloma de ratinho não secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com PEG a 50% (Sigma). As células foram plaqueadas a aproximadamente lxl05/poço numa placa de microtitulação de fundo plano, seguido de cerca de duas semanas de incubação em meio selectivo contendo soro fetal bovino a 10%, meio condicionado P388D1 a 10% (ATCC, CRL TIB-63), origen a 3-5% (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com concentração elevada de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina e HAT lx (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído por HT. Poços individuais foram então pesquisados através de ELISA (descrito acima) quanto a anticorpos monoclonais humanos IgG anti-PSMA. Uma vez ocorrido extenso crescimento do hibridoma, o meio foi monitorizado habitualmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpo foram novamente plaqueados, novamente pesquisados e, se fossem ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-PSMA eram subclonados pelo menos duas vezes através de diluição limitante. Subclones estáveis foram então cultivados 66 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para melhor caracterização.

Os clones de hibridoma 1C3, 2A10, 2F5, 2C6, foram seleccionados para mais análises.

Exemplo 2: Caracterização Estrutural dos Anticorpos

Monoclonais Humanos 1C3, 2A10, 2F5, e 2C6

As sequências de ADNc codificando as regiões variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais 1C3, 2A10, 2F5, e 2C6 foram obtidas a partir dos hibridomas 1C3, 2A10, 2F5, e 2C6, respectivamente, utilizando técnicas de PCR padrão e foram sequenciadas utilizando técnicas de sequenciação de ADN padrão.

As sequências nucleotidica e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 1C3 são mostradas na Figura IA e em SEQ ID NO: 33 e 1, respectivamente.

As sequências nucleotidica e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 1C3 são mostradas na Figura 1B e em SEQ ID NO: 37 e 5, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada de 1C3 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia pesada de 1C3 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 3-30.3, um segmento D indeterminado, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 6b. O alinhamento da sequência de VH de 1C3 com a sequência da linha germinativa VH 3-30.3 é mostrado na Figura 5. Outra análise da sequência de VH de 1C3 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras IA e 5, e em SEQ ID NOs: 9, 13 e 17, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve de 1C3 com as sequências conhecidas da cadeia leve da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia leve de 1C3 utiliza um segmento VL da linha 67 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ germinativa humana VK L18 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 4. 0 alinhamento da sequência de VL de 1C3 com a sequência da linha germinativa VK L18 é mostrado na Figura 7. Mais análise da sequência de VL de 1C3 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 da cadeia leve, tal como mostrado nas Figuras 1B e 7, e em SEQ ID NOs: 21, 25 e 29, respectivamente.

As sequências nucleotidica e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 2A10 são mostradas na Figura 2A e em SEQ ID NO: 34 e 2, respectivamente.

As sequências nucleotidica e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 2A10 são mostradas na Figura 2B e na SEQ ID NO: 38 e 6, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada de 2A10 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia pesada de 2A10 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 5-51, um segmento D da linha germinativa humana 7-27, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 2. 0 alinhamento da sequência de VH de 2A10 com a sequência da linha germinativa VH 5-51 é mostrado na Figura 6. Mais análise da sequência de VH de 2A10 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 da cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras 2A e 6, e em SEQ ID NOs: 10, 14 e 18, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve de 2A10 com as sequências conhecidas da cadeia leve da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia leve de 2A10 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK L18 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 4. O alinhamento da sequência de VL de 2A10 com a sequência da linha germinativa VK L18 é mostrado na Figura 7. Mais análise da sequência de VL de 2A10 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 da cadeia 68 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ leve tal como mostrado nas Figuras 2B e 7, e em SEQ ID NOs: 22, 26 e 30, respectivamente.

As sequências nucleotídica e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 2F5 são mostradas na Figura 3A e em SEQ ID NO:35 e 3, respectivamente.

As sequências nucleotídica e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 2F5 são mostradas na Figura 3B e em SEQ ID NO: 39 e 7, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada de 2F5 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia pesada de 2F5 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 5-51, um segmento D da linha germinativa humana 7-27, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 2. O alinhamento da sequência de VH de 2F5 com a sequência da linha germinativa VH 5-51 é mostrado na Figura 6. Mais análise da sequência de VH de 2F5 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras 3A e 6, e em SEQ ID NOs: 11, 15 e 19, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve de 2F5 com as sequências conhecidas da cadeia leve da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia leve de 2F5 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK L18 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 4. O alinhamento da sequência de VL de 2F5 com a sequência da linha germinativa VK L18 é mostrado na Figura 7. Mais análise da sequência de VL de 2F5 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 3B e 7, e em SEQ ID NOs: 23, 27 e 31, respectivamente.

As sequências nucleotídica e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 2C6 são mostradas na Figura 4A e em SEQ ID NO: 36 e 4, respectivamente. 69 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

As sequências nucleotídica e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 2C6 são mostradas na Figura 4B e em SEQ ID NO: 40 e 8, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia pesada de 2C6 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia pesada de 2C6 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 5-51, um segmento D da linha germinativa humana 6-13, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 4b. O alinhamento da sequência de VH de 2C6 com a sequência da linha germinativa VH 5-51 é mostrado na Figura 6. Mais análise da sequência de VH de 2C6 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras 4A e 6, e em SEQ ID NOs: 12, 16 e 20, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve de 2C6 com as sequências conhecidas da cadeia leve da imunoglobulina humana da linha germinativa demonstrou que a cadeia leve de 2C6 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK L6 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 3. O alinhamento da sequência de VL de 2C6 com a sequência da linha germinativa VK L6 é mostrado na Figura 8. Mais análise da sequência de VL de 2C6 utilizando o sistema de Kabat de determinação da região CDR conduziu à delimitação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 4B e 8, e em SEQ ID NOs: 24, 28 e 32, respectivamente.

Exemplo 3: Caracterização da Especificidade de Ligação dos Anticorpos Monoclonais Humanos Anti-PSMA

Neste exemplo, a especificidade de ligação foi examinada através de citometria de fluxo numa linha celular de cancro da próstata expressando PSMA e através de ELISA utilizando PSMA purificada. 70 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Especificidade de ligaçao através de citometria de fluxo A linha celular de cancro da próstata expressando PSMA humana LNCaP foi utilizada para determinar a especificidade dos anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA através de citometria de fluxo. A ligação dos anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA 2F5, 2A10, e 2C6 foi avaliada através da incubação das células LNCaP com os anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA a diferentes concentrações. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um Ab anti-IgG humana marcado com FITC. As análises de citometria de fluxo foram efectuadas utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA) . 0 anticorpo monoclonal anti-PSMA humano 7F12 (tal como descrito na Publicação PCT WO 03/064606) foi utilizado como controlo positivo e um anticorpo não especifico de PSMA de controlo do isotipo foi utilizado como controlo negativo. Os resultados são representados na Figura 9. Os anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA 2F5, 2A10, e 2C6 ligaram-se especificamente às células LNCaP expressando PSMA.

Especificidade da ligação através de ELISA

Uma comparação dos anticorpos anti-PSMA na ligação a PSMA imunopurifiçada foi realizada através de ELISA padrão para examinar a especificidade de ligação para PSMA. PSMA foi imunopurifiçado a partir de células LNCaP e testado quanto a ligação contra os anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA 1C3, 2A10, 2F5 e 2C6. Foram efectuados procedimentos padrão de ELISA. Os anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA foram adicionados a uma concentração de 5 pg/ml e titulados em diluições em série de 1:2. Foi utilizado anticorpo policlonal de cabra anti-IgG humana (especifico da cadeia capa) conjugado com peroxidase de rábano (HRP) como anticorpo secundário. O anticorpo monoclonal anti-PSMA humano 7F12 foi utilizado como controlo positivo e um branco foi utilizado como controlo negativo. Os resultados são mostrados na Figura 10. Os anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA 2A10 e 2F5 ligaram-se com elevada especificidade a PSMA. Os anticorpos monoclonais humanos anti-PSMA 1C3 e 2C6 exibiram um nivel detectável mas apenas baixo de ligação a PSMA num 71 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ ensaio ELISA, sugerindo que estes anticorpos se ligam a um epitopo impedido num ensaio ELISA.

Exemplo 4: Análise Scatchard de afinidade de ligação dos anticorpos monoclonais anti-PSMA A afinidade de ligação do anticorpo 2A10 à linha celular de cancro da próstata expressando PSMA LNCaP foi testada utilizando uma análise Scatchard.

As células LNCaP foram obtidas em ATCC (CRL-1740) e criadas em meio RPMI contendo soro fetal bovino (FBS) a 10%. As células foram tripsinizadas e lavadas uma vez em tampão de ligação baseado em Tris (Tris 24 mM pH 7,2, NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Glicose 2 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, BSA a 0,1%) e as células foram ajustadas a 2xl06 células/ml em tampão de ligação. Placas Millipore (MAFB NOB) foram revestidas com leite em pó magro a 1% em água e armazenadas a 4°C de um dia para o outro. As placas foram lavadas três vezes com 0,2 ml de tampão de ligação. Cinquenta microlitros de tampão sozinho foram adicionados aos poços de ligação máxima (ligação total). Vinte e cinco microlitros de tampão sozinho foram adicionados aos poços de controlo (ligação não especifica). Foram adicionadas concentrações variáveis de 125I-anticorpo anti-PSMA a todos os poços num volume de 25 μΐ. Concentrações variáveis de anticorpo não marcado num excesso de 100 vezes foram adicionadas num volume de 25 μΐ aos poços de controlo e foram adicionados 25 μΐ de células LNCaP (2xl06 células/ml) em tampão de ligação a todos os poços. As placas foram incubadas durante 2 horas a 200 rpm num agitador a 4°C. Após a conclusão da incubação as placas Millipore foram lavadas três vezes com 0,2 ml de tampão de lavagem frio (Tris 24 mM pH 7,2, NaCl 500 mM, KC1 2,7 mM, Glicose 2 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, BSA a 0,1%) . Os filtros foram removidos e contados num contador gama. A avaliação da ligação em equilíbrio foi efectuada utilizando parâmetros de ligação de um único local com o software Prism (San Diego, CA).

Utilizando o ensaio de ligação de Scatchard acima, a KD do anticorpo 2A10 para as células LNCaP foi de aproximadamente 0,8 nM. 72 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Exemplo 5: Ensaio de ligação de competição pelo epitopo 0 anticorpo monoclonal anti-PSMA 2A10 foi comparado com um anticorpo anti-PSMA conhecido, 7F12 (descrito na Publicação PCT WO 03/064606) para examinar se os dois anticorpos se ligavam à mesma região do epitopo utilizando um ensaio de competição.

As células LNCaP foram obtidas a partir de ATCC (CRL-1740) e criadas em meio RPMI contendo soro fetal bovino a 10% (FBS). As células foram tripsinizadas e lavadas uma vez em tampão de ligação baseado em Tris (Tris 24 mM pH 7,2, NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Glicose 2 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, BSA a 0,1%) e as células foram ajustadas a 2xl06 células/ml em tampão de ligação. Placas Millipore (MAFB NOB) foram revestidas com leite magro em pó a 1% em água e armazenadas a 4°C de um dia para o outro. As placas foram lavadas três vezes com 0,2 ml de tampão de ligação. Vinte e cinco microlitros de tampão sozinho foram adicionados aos poços (ligação não especifica). Foi adicionada uma concentração fixa de 125I-anticorpo anti-PSMA a todos os poços num volume de 25 μΐ. Foram adicionadas concentrações variáveis de anticorpo não marcado aos poços num volume de 25 μΐ e foram adicionados 25 μΐ de células LNCaP (2xl06 células/ml) em tampão de ligação a todos os poços. As placas foram incubadas durante 2 horas a 200 rpm num agitador a 4°C. Após a conclusão da incubação as placas Millipore foram lavadas três vezes com 0,2 ml de tampão de lavagem frio (Tris 24 mM pH 7,2, NaCl 500 mM, KC1 2,7 mM, Glicose 2 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, BSA a 0,1%). Os filtros foram removidos e contados num contador gama. A avaliação da ligação em equilíbrio foi efectuada utilizando parâmetros de ligação de um único local com o software Prism (San Diego, CA) . Um anticorpo de controlo de isotipo foi utilizado como controlo negativo. Os resultados da ligação de competição contra 125I-2A10 são mostrados na Figura 11A e da ligação de competição contra 125I-7F12 são mostrados na Figura 11B. Os resultados mostram que a adição de anticorpo 7F12 não marcado inibe a ligação do 2A10 marcado a células LNCaP e que a adição de anticorpo 2A10 não marcado inibe a ligação de 7F12 marcado a células LNCaP. Isto demonstra que os anticorpos anti-PSMA 2A10 e 7F12 se ligam ao mesmo epitopo ou a um muito semelhante em PSMA. 73 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Exemplo 6: Internalização de anticorpo monoclonal anti-PSMA

Os HuMAbs anti-PSMA foram testados quanto à capacidade de internalização em células de cancro da próstata expressando PSMA utilizando um ensaio de internalização Hum-Zap. Hum-Zap testa a internalização de um anticorpo humano primário através da ligação de um anticorpo secundário com afinidade para IgG humana conjugado com a toxina saporina. A linha celular de cancro da próstata expressando PSMA LNCaP foi semeada a 2,5xl04 células/poço em poços de 100 μΐ de um dia para o outro ou no dia seguinte durante um período de duas horas. Foi adicionado o anticorpo anti-PSMA 2A10 ou 7F12 aos poços a uma concentração inicial de 30 nM e titulado em diluições em série de 1:3. Um anticorpo de controlo do isotipo que não é específico para PSMA foi utilizado como controlo negativo. O Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, IT-22-25) foi adicionado a uma concentração de 11 nM e as placas foram deixadas a incubar durante 48 horas. As placas foram então pulsadas com 1,0 yCi de 3H-timidina durante 24 horas, colhidas e lidas num Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments). Os resultados são mostrados na Figura 12. O anticorpo anti-PSMA 2A10 mostrou uma diminuição dependente da concentração de anticorpo da incorporação de 3H-timidina em células de cancro da próstata LNCaP expressando PSMA. Estes dados demonstram que o anticorpo anti-PSMA 2A10 se internaliza na linha celular de cancro da próstata.

Exemplo 7: Termoestabilidade dos anticorpos monoclonais anti-PSMA através de calorimetria diferencial de varrimento A estabilidade térmica do anticorpo monoclonal anti-PSMA 2A10 foi comparada com a do anticorpo 7F12 utilizando análise calorimétrica da temperatura de fusão do anticorpo.

As medições calorimétricas das temperaturas de fusão Tf foram realizadas numa plataforma de microcalorímetro diferencial de varrimento VP-Capillary DSC que é combinada com um auto-amostrador (MicroCal LLC, Northampton, MA, USA). O volume da célula de amostra é de 0,144 ml. Os dados de desnaturação das formas glicosilada e desglicosilada dos 74 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ anticorpos foram obtidos através de aquecimento das amostras, a uma concentração de 2,3 μΜ, de 30 a 95°C a uma velocidade de l°C/min. As amostras de proteína estavam presentes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4. O mesmo tampão foi utilizado na célula de referência para obter a capacidade de calor molar através de comparação. Os termogramas observados foram corrigidos para o limiar e os dados normalizados analisados com base num modelo de 2 passos, utilizando o software Origin v7.0. O clone 2A10 tinha maior estabilidade térmica, com uma Tf de 71,43°C, em comparação com 63,05°C obtidos para o clone 7F12.

Exemplo 8: Tratamento de xenoenxertos tumorais in vivo com uma combinação de Taxotere® e o anticorpo 7F12 A eficácia anti-tumoral do anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com Taxotere® (docetaxel) foi testada em xenoenxertos de carcinoma da próstata humano LNCaP criados em ratinhos CB17.SCID machos. Células de cancro da próstata LNCaP expressando níveis elevados de PSMA foram obtidas em ATCC (Cat# CRL-1740) e expandidas in vitro seguindo as instruções de ATCC. Ratinhos CB17.SCID machos com 8 semanas de idade de Taconic foram implantados subcutaneamente no flanco direito com 2,5xl06 células LNCaP em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratinho. Os ratinhos foram pesados e foi medido o volume do tumor utilizando um paquímetro electrónico duas vezes por semana a partir das três semanas após a implantação. Os volumes dos tumores foram calculados como altura χ comprimento χ largura. Os ratinhos com tumores vascularizados (determinado pela aparência dos tumores) com 180 mm3 foram distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento e receberam doses segundo o peso corporal do indivíduo no Dia 0. Os ratinhos foram monitorizados quanto ao crescimento do tumor cerca de 60 dias após o fim da dosagem e sacrificados no fim do estudo. Os ratinhos foram eutanasiados quando os tumores atingiram o ponto final do tumor (1500 mm3). A informação sobre a dosagem está resumida na Tabela 1. Taxotere® foi administrado a Q3Dx3 intravenosamente (iv) através da veia da cauda. O anticorpo de controlo do isotipo Rituxan® e o 75 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ anticorpo anti-PSMA 7F12 foram administrados intraperitonealmente (ip) Q3Dx5, seguido por Q7Dx6.

Tabela 1: Informação sobre Dosagem

Tratamento N por grupo Dose iv de Taxotere® (mg/kg) Dose ip de Anticorpo (mg/kg) Esquema de Dosagem PBS 10 Dia 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 Taxotere® 2 10 2 0 Dia 0, 3, 7 Taxotere® 4 10 4 0 Dia 0, 3, 7 Ab Isotipo Rituxan® 10 0 30 Dia 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 Ab 7F12 10 0 30 Dia 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 Taxotere® 2 + Ab 7F12 10 2 30 Dia 0, 3, 7 para Taxotere Dia 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 Taxotere 2 + Isotipo Rituxan® 10 2 30 Dia 0, 3, 7 para Taxotere Dia 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 Taxotere 4 + Ab 7F12 10 4 30 Dia 0, 3, 7 para Taxotere Dia 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 Taxotere 4 + Isotipo Rituxan® 10 4 30 Dia 0, 3, 7 para Taxotere Dia 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56

Os resultados das experiências anteriores sao descritos nas Figuras 13-16. Tal como mostrado nas Figuras 13A-13B e 76 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Figuras 14Α-14Β, 30 mg/kg do anticorpo anti-PSMA 7F12 sozinho diminuíram modestamente o crescimento de tumores LNCaP. Taxotere® mostrou uma eficácia anti-crescimento tumoral dependente da dose para as duas doses testadas (i.e. 2 e 4 mg/kg). A terapia de combinação de 30 mg/kg do anticorpo anti-PSMA 7F12 e 4 mg/kg de Taxotere® mostrou uma eficácia superior à de cada tratamento sozinho e resultou em inibição quase completa do crescimento do tumor LNCaP (ver Figuras 13A-13B e Figuras 15A-15B). Tal como mostrado nas Figuras 13C-13D e Figuras 15C-15D, este regime de combinação também curou os ratinhos de caquexia relacionada com o tumor LNCaP. A terapia de combinação de 30 mg/kg do anticorpo anti-PSMA 7F12 e 2 mg/kg de Taxotere® mostrou também eficácia superior à de cada tratamento sozinho (ver Figuras 13A-13D e Figuras 16A-16D). Os dados anteriores demonstram um efeito aditivo e possivelmente sinergístico do anticorpo anti-PSMA 7F12 em combinação com quimioterapia com Taxotere® no tratamento de tumores, tais como tumores da próstata.

Exemplo 8: Avaliação da morte celular de vim anticorpo anti-PSMA conjugado com toxina em linhas celulares de cancro da próstata

Neste exemplo, anticorpos monoclonais anti-PSMA conjugados com uma toxina foram testados quanto à capacidade para matar linhas celulares de cancro da próstata PSMA+ num ensaio de proliferação celular. O anticorpo HuMAb anti-PSMA 2A10 foi conjugado com uma toxina através de um ligador, tal como um peptidilo, hidrazona ou ligador dissulfureto. Exemplos de compostos toxinas que podem ser conjugados com os anticorpos do presente invento são descritos no pedido apresentado com o Attorney Docket No. 04280/100M629US3, apresentado a 26 de Setembro de 2005. A linha celular de cancro da próstata expressando PSMA LNCaP foi semeada a 2,5xl04 células/poço em poços de 100 μΐ durante 3 horas. Um conjugado anticorpo anti-PSMA-toxina foi adicionado aos poços a uma concentração inicial de 30 nM e titulado em diluições em série de 1:3. Um anticorpo de controlo do isotipo que era não específico para PSMA foi utilizado como controlo negativo. As placas foram deixadas a incubar durante 72 horas com uma lavagem às 3 77 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ horas ou uma lavagem contínua. As placas foram então pulsadas com 1,0 pCi de 3H-timidina durante 24 horas, colhidas e lidas num Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden, CT) . Os resultados são mostrados na Figura 17A (lavagem de três horas) e 17B (lavagem contínua). O anticorpo anti-PSMA 2A10 mostrou uma diminuição na incorporação de 3H-timidina dependente da concentração de anticorpo-toxina em células de cancro da próstata LNCaP expressando PSMA. Os valores de EC50 para o anticorpo anti-PSMA 2A10 foram de 0,157 nM para o ensaio de lavagem e de 0,0643 nM para o ensaio de lavagem contínua. Estes dados demonstram que anti-PSMA é citotóxico para células de cancro da próstata quando conjugado com uma toxina. EXEMPLO 9: Estudos In Vivo

Neste exemplo, anticorpos monoclonais anti-PSMA conjugados com uma toxina foram testados quanto à capacidade para matar linhas celulares de cancro da próstata PSMA+ in vi vo. A. Tratamento de xenoenxertos de tumores in vivo utilizando um

Foi mudado o tampão ao HuMAb anti-PSMA 2A10 e a um anticorpo de controlo do isotipo para tampão fosfato 0,1 M pH 8,0 contendo NaCl 50 mM e DTPA 2 mM, e concentrado até 6 mg/ml. Ambos os anticorpos foram então tiolados através de incubação com um excesso molar de 25 vezes de 2-iminotiolano durante uma hora à temperatura ambiente, seguido de dessalga em 0,1 M tampão fosfato pH 6,0 contendo NaCl 50 mM e tampão DTPA 2 mM utilizando uma coluna Sephadex G-25. Os anticorpos tiolados foram então mantidos em gelo, enquanto o número de grupos tiol introduzidos foi determinado. Isto foi conseguido através de reacção de uma amostra de anticorpo tiolado com ditiodipiridina (DTDP) . A absorvância a 280 nm foi medida para determinar a concentração de proteína nas amostras, e, em seguida, uma alíquota de cada amostra (0,9 ml) foi incubada com 0,1 ml de DTDP (solução de reserva 5 mM em etanol) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Amostras em branco de tampão sozinho mais DTDP foram incubadas ao lado. A absorvância a 324 nm foi medida e o número de tióis presentes por anticorpo quantificado 1 '" 78 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ coeficiente de extinção para tiopiridina de 19800 ΝΓ1. No caso de anti-PSMA foram introduzidos 5,3 tióis por anticorpo, e no caso do controlo de isotipo 6,0.

Os anticorpos tiolados foram então incubados com um excesso molar de 3 vezes de Composto A sobre a concentração molar de grupos tiol.

/

Composto A

Uma solução de reserva 5 mM em DMSO de Composto A foi adicionada aos anticorpos tiolados juntamente com DMSO suficiente para levar a concentração final de DMSO até 10% (v/v). Após incubação à temperatura ambiente durante 3 horas o pH da mistura de incubação foi elevado para 7,0 utilizando trietanolamina. Os conjugados anticorpo-Composto A foram então purificados através de cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna de Sephacryl S200 pré-equilibrada com tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) contendo NaCl 50 mM e DMSO a 5% (v/v). As fracções contendo o conjugado monomérico foram recolhidas e reunidas. Os conjugados purificados resultantes foram então concentrados numa célula agitada sob azoto, utilizando uma membrana de separação de 10 kDa. As concentrações e razões de substituição (número de moléculas de fármaco ligadas por molécula de anticorpo) dos conjugados foram determinadas utilizando absorvância a 280 nm e 340 nm, por referência aos coeficientes de extinção tanto do anticorpo como do Composto A a cada comprimento de onda tal como medido anteriormente. Exemplos de outros compostos toxinas que podem ser conjugados com os anticorpos do presente invento são descritos no Pedido de Patente U.S. de 79 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ co-propriedade com Attorney Docket No. 04280/100M629US3, apresentado a 26 de Setembro de 2005. A eficácia anti-tumoral de anti-PSMA (clone 2A10) conjugado com Composto A foi testada em LNCaP, que é xenoenxertos de carcinoma da próstata humano, criados em ratinhos CB17.SCID machos (disponiveis a partir de Taconic, Germantown, NY) . As células de cancro da próstata LNCaP expressando elevados niveis de PSMA foram obtidas em ATCC (Cat# CRL-1740) e expandidas in vitro seguindo as instruções de ATCC. Ratinhos CB17.SCID machos com 8 semanas de idade de Taconic foram implantados subcutaneamente no flanco direito com 2,5xl06 células LNCaP em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratinho. Os ratinhos foram pesados e mediram-se as três dimensões do tumor utilizando um paquímetro electrónico duas vezes por semana começando três semanas após a implantação. O volume individual dos tumores foi calculado como altura χ comprimento χ largura. Os ratinhos com tumores vascularizados (determinado pela aparência dos tumores) de tamanhos apropriados foram distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento e foi-lhes administrada uma dose por peso corporal do indivíduo no Dia 0. Os ratinhos foram monitorizados quanto ao crescimento do tumor cerca de 60 dias após a dosagem e sacrificados no final do estudo. Os ratinhos foram eutanaziados quando os tumores atingiram o ponto final do tumor (1500 mm3). O desenho deste estudo de xenoenxertos está resumido na tabela 2.

Tabela 2. Resumo do Estudo de Xenoenxertos LNCaP

Tratamento Dose (pmole/kg Citotóxicos) N por grupo Via de Dosagem Volume Médio do Tumor no Dia-1 (mm3) Veiculo - 3 ip 100 Conjugado Ab do Isotipo-Comp A 0,3 3 ip 100 Conjugado 2A10-Comp A 0,3 3 ip 100

Tal como mostrado na Fig. 18, 0,3 pmole/kg (em relação às moles da Composto A citotoxina) do conjugado 2A10-Composto 80 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ A induziu regressão completa de todos os três pequenos tumores LNCaP estabelecidos. B. Estudo de Dose-Resposta

Foi mudado o tampão a anti-PSMA (2A10) para tampão fosfato 0,1 M pH 8,0 contendo NaCl 50 mM e DTPA 2 mM, e concentrou-se até 5,6 mg/ml. O anticorpo foi então tiolado através de incubação com um excesso molar de 7,5 vezes de 2-iminotiolano durante uma hora à temperatura ambiente, seguido de dessalga em tampão HEPES 50 mM pH 6,0 contendo glicina 5 mM, DTPA 2 mM e glicerol a 3% (v/v) utilizando uma coluna Sephadex G-25. 0 anticorpo tiolado foi mantido em gelo, enquanto o número de grupos tiol grupos introduzido foi determinado. Isto foi alcançado através de reacção de uma amostra de anticorpo tiolado com ditiodipiridina (DTDP). A absorvância a 280 nm foi medida para determinar a concentração de proteina nas amostras, e depois uma aliquota de cada amostra (0,9 ml) foi incubada com 0,1 ml de DTDP (solução de reserva 5 mM em etanol) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Amostras de branco de tampão sozinho mais DTDP foram incubadas juntamente. A absorvância a 324 nm foi medida e o número de tióis presentes por anticorpo quantificado utilizando um coeficiente de extinção para tiopiridina de 19800 M_1. O anticorpo tiolado foi então incubado com um excesso molar de 2 vezes de Composto A em relação à concentração molar dos grupos tiol. Composto A, solução de reserva 5 mM em DMSO a 10% (v/v)/éter dimetilico de etilenoglicol a 90% (v/v), foi adicionado ao anticorpo tiolado juntamente com suficiente éter dimetilico de etilenoglicol para levar a concentração final até 5% (v/v). Após incubação à temperatura ambiente durante 2 horas o conjugado anticorpo-Composto A foi purificado através de cromatografia de permuta iónica. A mistura reaccional foi aplicada numa coluna SP-Sepharose pré-equilibrada em tampão A (HEPES 50 mM, glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v), pH 6,0). A coluna foi lavada com tampão A, depois com tampão A a 95%, tampão B a 5% (HEPES 50 mM, NaCl 1 M, glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v), pH 7,2) e depois o conjugado anticorpo-Composto A foi eluido com tampão B a 10%, tampão A a 90%. As fracções contendo conjugado monomérico 81 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ foram recolhidas e reunidas e o pH ajustado a 7,2 através de adição de monoetanolamina. 0 conjugado purificado resultante foi então dialisado em HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v) , pH 7,2 e depois concentrou-se numa célula agitada sob azoto, utilizando uma membrana de separação de 10 kDa. As concentrações e razões de substituição (número de moléculas de fármaco ligadas por molécula de anticorpo) do conjugado foram determinadas utilizando absorvância a 280 nm e 340 nm, por referência aos coeficientes de extinção tanto do anticorpo como do Composto A a cada comprimento de onda tal como medido anteriormente. O conjugado de controlo de isotipo (anti-CD70 2H5) foi preparado utilizando o mesmo método, excepto que a eluição do conjugado a partir da coluna de permuta iónica foi conseguida com tampão B a 15%, tampão A a 85%. A eficácia e selectividade dos conjugados foram determinadas utilizando xenoenxertos de carcinoma da próstata humano LNCaP cultivados em ratinhos CB17.SCID machos tal como descrito acima. 0 desenho deste estudo de xenoenxertos está resumido na tabela 3.

Tabela 3. Resumo do Estudo de Xenoenxertos LNCaP

Tratamento Dose (pmole/kg de citotoxina) N por grupo Via de Dosagem Volume Médio do Tumor no Dia-1 (mm3) Veículo - 9 ip 160 Ab do Isotipo -Comp A 0,05, 0,15, 0,30, 0,45, 0, 60, 0, 90 9 ip 160 2A10-Comp A 0,05, 0,15, 0,30, 0,45,0, 60,0, 90 9 ip 160

Tal mostrado na Tabela 3 e nas Figs. 19-20, 0,15 pmole/kg de anti-PSMA-Composto-A (Fig. 19) tiveram melhor eficácia anti-tumoral que 0,90 pmole/kg de controlo do isotipo-Composto-A, indicando uma selectividade de pelo menos >6x (Fig. 20). 0,90 pmole/kg de anti-PSMA-Composto A mostraram apenas toxicidade transiente (Figs. 21-22) e estiveram abaixo da dose máxima tolerada. Portanto, foi indicado um indice terapêutico superior a 6 vezes para anti-PSMA-Composto A em ratinhos possuindo tumores LNCaP. 82 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ C. Eficácia em Tumores Grandes

Foi mudado o tampão a anti-PSMA (2A10) para tampão fosfato 0,1 M pH 8,0 contendo NaCl 50 mM e DTPA 2 mM, e concentrou-se até 5,6 mg/ml. 0 anticorpo foi então tiolado através de incubação com um excesso molar de 9 vezes de 2-iminotiolano durante mais de uma hora à temperatura ambiente, seguido de dessalga em tampão HEPES 50 mM pH 6,0 contendo glicina 5 mM, DTPA 2 mM e glicerol a 3% (v/v) utilizando uma coluna Sephadex G-25. O anticorpo tiolado foi mantido em gelo, enquanto o número de grupos tiol introduzidos foi determinado. Isto foi conseguido através de reacção de uma amostra de anticorpo tiolado com ditiodipiridina (DTDP). A absorvância a 280 nm foi medida para determinar a concentração de proteína nas amostras, e, em seguida, uma alíquota de cada amostra (0,9 ml) foi incubada com 0,1 ml de DTDP (solução de reserva 5 mM em etanol) durante 10 minutos à temperatura ambiente. Amostras em branco de tampão sozinho mais DTDP foram incubadas juntamente. A absorvância a 324 nm foi medida e o número de tióis presentes por anticorpo quantificado utilizando um coeficiente de extinção para tiopiridina de 19800 M_1. 0 anticorpo tiolado foi então incubado com um excesso molar de 2 vezes de Composto A em relação à concentração molar de grupos tiol. Composto A, solução de reserva 5 mM em DMSO a 10% (v/v) , éter dimetílico de etilenoglicol a 90% (v/v), foi adicionado ao anticorpo tiolado juntamente com suficiente éter dimetílico de etilenoglicol para levar a concentração final para 5% (v/v). Após incubação à temperatura ambiente durante 2 horas o conjugado anticorpo-Composto A foi purificado através de cromatografia de permuta iónica. A mistura reaccional foi aplicada a uma coluna SP-Sepharose pré-equilibrada em HEPES 50 mM, glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v), pH 6,0 (tampão A). A coluna foi lavada

com tampão A, depois com tampão A a 95%, tampão B a 5% (HEPES 50 mM, NaCl 1 M, glicina a 5 mM, glicerol a 3% (v/v), pH 7,2) e depois o conjugado anticorpo-Composto A foi eluído com tampão B a 10%, tampão A a 90%. As fracções contendo

conjugado monomérico foram colhidas e reunidas e o pH

ajustado a 7,2 através de adição de monoetanolamina. O 83 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ conjugado purificado resultante foi então dialisado para HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, glicina 5 mM, glicerol a 3% (v/v) , pH 7,2 e depois concentrado numa célula agitada sob azoto, utilizando uma membrana de separação de 10 kDa. As concentrações e razões de substituição (número de moléculas de fármaco ligadas por molécula de anticorpo) do conjugado foram determinadas utilizando absorvância a 280 nm e 340 nm, por referência aos coeficientes de extinção tanto do anticorpo como do Composto A a cada comprimento de onda tal como medido anteriormente. O conjugado de controlo do isotipo (anti-CD70 2H5) foi preparado utilizando o mesmo método excepto que a eluição do conjugado da coluna de permuta iónica foi alcançada com tampão B a 15%, tampão A a 85%. A eficácia e selectividade dos conjugados foram determinadas utilizando xenoenxertos de carcinoma da próstata humano LNCaP criados em ratinhos CB17.SCID machos tal como descrito acima. 0 desenho destes estudos de xenoenxertos está resumido nas tabelas 4 & 5.

Tabela 4. Resumo do Estudo de Xenoenxertos LNCaP

Tratamento Dose (pmole/kg de Citotoxina) N por grupo Via de Dosagem Volume Tumoral Médio no Dia-1 (mm3) Veiculo - 8 iv 240 Ab de Isotipo-Comp A 0,15 8 iv 240 2A10-Comp A 0,15 8 iv 240

Tal como mostrado na Tabela 4 e Fig. 23, uma única dose baixa de 0,15 pmole/kg de anti-PSMA-Composto A inibiu grandemente o crescimento de grandes tumores LNCaP estabelecidos de tamanhos médios de 240 mm3. Em contraste, 0,15 pmole/kg de controlo do isotipo-Composto A teve uma eficácia anti-tumoral mínima. Tal como mostrado na Tabela 5 e Fig. 24, uma única dose de 0,30 pmole/kg de anti-PSMA-Composto A induziu a regressão e inibiu o crescimento de tumores LNCaP muito grandes de tamanhos médios de 430 mm3. 84 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Tabela 5. Resumo do Estudo de Xenoenxertos LNCaP

Tratamento Dose (pmole/kg de Citotoxina) N por grupo Via de Dosagem Volume Tumoral Médio no Dia-1 (mm3) Veículo - 6 ip 430 2A10-Comp A 0,15, 0,30, 0, 45 6 ip 430

SUMARIO DA LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID No: SEQUÊNCIA SEQ ID No: SEQUÊNCIA 1 VH a.a. 1C3 21 VK CDRl a.a. IC3 2 VH a.a. 2AIO 22 VK CDRl a.a. 2A10 3 VH a.a. 2F5 23 VK CDRl a.a. 2F5 4 VH a.a. 2C6 24 VK CDRl a.a. 2C6 5 VK a.a. 1C3 25 VK CDR2 a.a. 1 C3 6 VK a.a. 2AIO 26 VK CDR2 a.a. 2A10 7 VK a.a. 2F5 27 VK CDR2 a.a. 2F5 8 VK a.a. 2C6 28 VK CDR2 a.a. 2C6 9 VH CDR1 a. a. 1C3 29 VK CDR3 a.a. 1 C3 10 VH CDR1 a. a. 2A10 30 VK CDR3 a.a. 2A10 11 VH CDR1 a. a. 2F5 31 VK CDR3 a.a. 2F5 12 VH CDRl a. a. 2C6 32 VK CDR3 a.a. 2C6 13 VH CDR2 a. a. 1C3 33 VH n.t. 1C3 14 VH CDR2 a. a. 2A10 34 VH n.t. 2AIO 15 VH CDR2 a. a. 2F5 35 VH n.t. 2F5 16 VH CDR2 a. a. 2C6 36 VH n.t. 2C6 85 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ 17 VH CDR3 a. a. 1C3 37 VK n.t. 1C3 18 VH CDR3 a. a. 2A10 38 VK n.t. 2A10 19 VH CDR3 a. a. 2F5 39 VK n.t. 2F5 20 VH CDR3 a. a. 2C6 40 VK n.t. 2C6 41 linha germinativa VH 3-30.3 a. a. 43 linha germinativa VK LI8 a.a. 42 linha germinativa VH 5-51 a.a. 44 VKL6 45 linha germinativa JH6b a.a. 47 linha germinativa JK3 a. a. 46 linha germinativa JK4 a.a. 48 (Gly4-Ser)3 a.a.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> MEDAREX, INC. <120> ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS PARA ANTIGÉNIO MEMBRANAR ESPECÍFICO DA PRÓSTATA (PSMA)

<130> MXI-334PC <140> <141> <150> 60/748417 <151> 2005-12-08 <160> 48 <170> Patent In Ver. 3.3 86 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Vai Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <400> 1

<210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 87 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly 1 5 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly 20 Trp Ile Gly Trp Vai Arg Gin Met 35 40 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser 50 55 Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala 65 70 Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala 85 Ala Arg Gin Thr Gly Phe Leu Trp 100 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115

Ala Glu 10 Vai Lys Lys Pro Gly 15 Glu Ser 25 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Ser Asn Pro Gly » Lys Gly Leu 45 Glu Trp Met Asp Thr Arg Tyr 60 Ser Pro Ser Phe Asp Lys Ser 75 Ile Ser Thr Ala Tyr 80 Ser Asp 90 Thr Ala Met Tyr Tyr 95 Cys Ser 105 Ser Asp Leu Trp Gly 110 Arg Gly

<210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 8 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly 1 5 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly 20 Trp Ile Gly Trp Vai Arg Gin Met 35 40 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser 50 55 Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala 65 70 Leu Gin Trp Asn Ser Leu Lys Ala 85 Ala Arg Gin Thr Gly Phe Leu Trp 100 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115

Ala Glu 10 Vai Lys Lys Pro Gly 15 Glu Ser 25 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Ser Asn Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Met Asp Thr Arg Tyr 60 Ser Pro Ser Phe Asp Lys Ser 75 Ile Ser Thr Ala Tyr 80 Ser Asp 90 Thr Ala Met Tyr Tyr 95 Cys Ser 105 Phe Asp Leu Trp Gly 110 Arg Gly

<210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 89 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Vai Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lye Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 90 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ile 1 Gin Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Αερ Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Αερ Ile Ser 30 Ser Ala Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Asp 50 Ala Ser Ser Leu Glu 55 Ser Gly Vai Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Tyr 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Asn Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Phe Asn Ser Tyr Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Vai Glu 105 Ile Lys

<210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 91 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Ile Lys 100 105

<210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 • 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp Ile Lys 100 105

<210> 9 <211> 5 <212> PRT 92 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 9

Ser Tyr Ala Met His 1 5

<210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Ser Asn Trp Ile Gly 1 5

<210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Ser Asn Trp Ile Gly 1 5

<210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5

<210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15

Gly ΕΡ 1 851 250/ΡΤ 93 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Ile Ile Tyr Pro 61y Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 Gly 5 10 15 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 Gly 5 10 15 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 1 Gly 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Ala Vai Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 15 94

ΕΡ 1 851 2 50/PT

<210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 18

Gin Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu 15 10

<210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Gin Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu 15 10

<210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr 15 10

<210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 15 10

<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 95 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala 15 10

<210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala 15 10

<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5

<210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5

<210> 27 <211> 7 <212> PRT 96 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 27

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5

<210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5

<210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 32 <211> 10 97 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu Phe Thr 15 10

<210> 33 <211> 372 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(372) <400> 33 cag gtg caa ctg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gin Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt age tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtc ege cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 gca gtt ata tca tat gat gga aac aat aaa tac tac gca gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gcc gtc ccc tgg gga teg agg tac tac tac tac ggt atg gac 336 Ala Arg Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 100 105 110 gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372 Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 357 98 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

<212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 34 gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg aag ate tcc tgt aag ggt tct gga tac age ttt acc agt aac 96 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn 20 25 30 tgg ate ggc tgg gtg ege cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg ate ate tat cct ggt gac tct gat acc aga tac age ccg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gte acc ate tea gee gac aag tcc ate age acc gee tac 240 Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr , 65 70 75 80 ctg cag tgg age age ctg aag gee teg gac acc gee atg tat tac tgt 288 Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agg caa act ggt ttc ctc tgg tcc tcc gat etc tgg ggc cgt ggc 336 Ala Arg Gin Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 acc ctg gtc act gtc tcc tea 357 Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 1X5 <210> 35 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D . . , (357) <400> 35 99 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg aag ate tcc tgt aag ggt tct gga tac agt ttt acc age aac 96 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn 20 25 30 tgg ate 99C tgg gtg ege cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 999 ate ate tat cct ggt gac tct gat acc aga tac age ceg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gtc acc ate tea gee gac aag tcc ate age acc gee tac 240 Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 '75 80 ctg cag tgg aac age ctg aag gee teg gac acc gee atg tat tac tgt 288 Leu Gin Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga caa act ggt ttc etc tgg tcc ttc gat etc tgg ggc cgt ggc 336 Ala Arg Gin Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 acc ctg gtc act gtc tcc tea 357 Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 363 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D .. , (363) <400> 36 100 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ gag gtg cag ctg gtg cag tct gga tea gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg aag ate tcc tgt aag ggt tct gga tac age ttt acc aac tac 96 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 tgg ate ggc tgg gtg ege cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg ate ate tat cct ggt gac tct gat acc aga tac age ccg tcc ttc 192 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Αερ Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gtc acc ate tea gee gac aag tcc ate age acc gee tat 240 Gin Gly Gin Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg age age ctg aag gee teg gac acc gee atg tat tac tgt 288 Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agt ccc ggg tat acc age agt tgg act tct ttt gac tac tgg ggc 336 Ala Ser Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tea 363 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D · · , (321) <400> 37 101 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ gcc ate cag ttg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gea tet gta gga 48 Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc cgg gea agt cag ggc att age agt gct 96 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa tea ggg aaa gct cct aag ctc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 ttt gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192 Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc ate age age ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gea act tat tac tgt caa cag ttt aac agt tat cct ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D ·. . (321) <400> 38 102 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ gcc ate cag ttg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gea tet gta gga 48 Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc cgg gea agt cag gac att age agt gct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 tta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gct cct aag ctc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 tat gga tet ggg aca gat ttc act ctc acc ate aac age ctg cag cct 240 Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gea act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 327 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (327; I <400> 39 gcc ate cag ttg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gea tet gta 99a 48 Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc cgg gea agt cag gac att age agt gct 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa ceg ggg aaa gct cct aag ctc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 103 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc ate age age ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tg.t caa cag ttt aat agt tac ceg ctc 288 Glu Àsp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa ate aaa 327 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Ile Lys 100 105

<210> 40 <211> 324 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1) .. (324) <400> 40 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gee acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gee acc ctc tcc tgc agg gee agt cag agt gtt age age tac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 tta gee tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gee act ggc ate cca gee agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt age aac tgg ccc cta 288 Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat ate aaa 324 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys val Asp Ile Lys 100 105

<210> 41 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens 104 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ <400> 41

Gin 1 Vai Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gin Pro Gly Arg 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser Gly 25 Phe 1 Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Ala Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 40 Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Val 50 Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Ser Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg <210> 42 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 Ser Leu Lys Ile 20 Ser Cys Lys Gly Ser Gly 25 Tyr Ser Phe Thr 30 Ser Tyr Trp Ile Gly Trp 35 Val Arg Gin Met Pro Gly 40 Lys Gly Leu 45 Glu Trp Met Gly Ile 50 Ile Tyr Pro Gly Asp 55 Ser Asp Thr Arg Tyr 60 Ser Pro Ser Phe Gin 65 Gly Gin Val Thr Ile 70 Ser Ala Asp Lys Ser 75 ile Ser Thr Ala Tyr 80 Leu Gin Trp Ser Ser 85 Leu Lys Ala Ser Asp 90 Thr Ala Met Tyr Tyr 95 Cys

Ala Arg <210> 43 <211> 95 105 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Ala Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 44 <211> 94

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Glu ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp 85 90

<210> 45 <211> 20 <212> PRT 106 ΕΡ 1 851 250/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 45

Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai 15 10 15

Thr Vai Ser Ser 20

<210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu ±le Lys 15 10

<210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Ly6 Vai Asp Ile Lys 15 10

<210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Ligador Gly-Ser sintético <400> 48

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Lisboa, 2012-08-21

Claims (22)

1. ΕΡ 1 851 250/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação ao antigénio deste, que se : liga especificamente ao antigénio membranar especifico compreendendo: da próstata (PSMA), SEQ uma região variável da ID NO: 10, cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ uma região variável da ID NO: 14, cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ uma região variável da ID NO: 18, cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ uma região variável da ID NO: 22, cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ uma região variável da ID NO: 26 e cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ uma região variável da ID NO: 30. cadeia leve CDR3 compreendendo
2. 2. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1, que compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
3. 3. Imunoconjugado compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2, ligado a um agente terapêutico.
4. 4. Imunoconjugado da reivindicação 3, em que o agente terapêutico é uma citotoxina ou um isótopo radioactivo.
5. 5. Molécula biespecifica compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2, ligada a uma segunda porção funcional possuindo uma especificidade de ligação diferente da do referido anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste.
6. 6. Composição compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2, o imunoconjugado da reivindicação 3 ou 4 ou a molécula ΕΡ 1 851 250/ΡΤ 2/4 biespecífica da reivindicação 5, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Molécula de ácido nucleico isolada codificando o anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2.
8. 8. Vector de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 7.
9. 9. Célula hospedeira compreendendo o vector de expressão da reivindicação 8.
10. 10. Ratinho transgénico compreendendo transgenes da cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana, em que o ratinho expressa o anticorpo da reivindicação 1 ou 2.
11. 11. Hibridoma preparado a partir do ratinho da reivindicação 10, em que o hibridoma produz o referido anticorpo.
12. 12. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2 para utilização num método de inibição do crescimento de um tumor num sujeito, em que as células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor expressam PSMA.
13. 13. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2, para utilização em combinação com um agente anti-tumoral num método de inibição ou prevenção do crescimento de um tumor num sujeito, em que células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor expressam PSMA.
14. 14. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que a administração ao referido sujeito do referido anticorpo anti-PSMA, ou porção de ligação ao antigénio deste, em combinação com o referido agente anti-tumoral, conduz a um efeito sinergistico na inibição do crescimento do referido tumor. ΕΡ 1 851 250/ΡΤ 3/4
15. 15. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o referido agente anti-tumoral causa danos na massa tumoral, conduzindo deste modo a uma citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) mais eficaz do tumor.
16. 16. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em que o tumor é de um cancro seleccionado a partir de cancro da próstata, do cólon, renal, rectal, urotelial, da mama, da bexiga, do fígado, do pâncreas e melanoma.
17. 17. Anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 13, em que o referido agente anti-tumoral é um agente quimioterapêutico, um agente anti-angiogénico ou um agente imuno-modulador.
18. 18. Anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o referido agente quimioterapêutico é Taxotere® (docetaxel), o referido agente anti-angiogénico é seleccionado a partir de angiostatina Kl-3, Arresten, aaAT, Canstatina, DL-a-Difluorometil-ornitina, Endostatina, Fumagilina, Genisteína, Minociclina, Estaurosporina, Talidomida, e Tumstatina ou o referido agente imuno-modulador é seleccionado a partir de anticorpos anti-PDl, anticorpos anti-CTLA-4, oligodesoxirribonucleótido fosforotiolato (1018 ISS), vacinas de genes de GM-CSF, interleucina-2, interleucina-7 (CYT 99 07) , interleucina-12 e interleucina-21.
19. 19. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2, para utilização em combinação com um agente anti-tumoral num método de inibição de caquexia relacionada com tumor num sujeito ou de estimulação de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de um tumor num sujeito, em que as células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor expressam PSMA.
20. 20. Composição compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2 e um agente anti-tumoral para utilização num método de inibição ou ΕΡ 1 851 250/ΡΤ 4/4 prevenção do crescimento de um tumor, ou de estimulação de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) de um tumor.
21. 21. Método in vitro de identificação de um agente anti-tumoral capaz de actuar sinergisticamente com o anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2 na inibição ou prevenção do crescimento de um tumor, em que as células do tumor ou células endoteliais vasculares próximas do tumor expressam PSMA, compreendendo: contacto de uma composição indicadora com: (a) um agente de teste anti-tumoral sozinho, (b) um anticorpo anti-PSMA das reivindicações 1 ou 2 sozinho, e (c) ambos um agente anti-tumoral de teste e um anticorpo anti-PSMA da reivindicações 1 ou 2; e comparação da capacidade de (a) o agente anti-tumoral de teste sozinho e (b) o anticorpo anti-PSMA sozinho para inibir ou prevenir o crescimento de um tumor com a capacidade de (c) ambos o agente anti-tumoral de teste e o anticorpo anti-PSMA para inibir ou prevenir o crescimento de um tumor, em que a inibição ou prevenção de crescimento do tumor através de (c) numa quantidade que é superior à do efeito aditivo de (a) e (b) conduzirá à identificação de um agente anti-tumoral capaz de actuar sinergisticamente com um anticorpo anti-PSMA na inibição ou prevenção de crescimento de um tumor.
22. 22. Método da reivindicação 21, em que a composição indicadora é um modelo animal para um tumor. Lisboa, 2012-08-21