ES2559002T3 - Anticuerpos contra PSMA - Google Patents

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ES2559002T3
ES2559002T3 ES10184957.8T ES10184957T ES2559002T3 ES 2559002 T3 ES2559002 T3 ES 2559002T3 ES 10184957 T ES10184957 T ES 10184957T ES 2559002 T3 ES2559002 T3 ES 2559002T3
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Paul Maddon
Gerald Donovan
William Olson
Norbert Schulke
Jason Gardner
Dangshe Ma
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PSMA Development Co LLC
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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a formas diméricas de PSMA, pero no a formas monoméricas de PSMA, y tiene la capacidad de unir células vivas que expresan PSMA.

Description

Anticuerpos contra PSMA
Campo de la invención
Esta invención se refiere, en general, al campo de polipéptidos asociados al cáncer y anticuerpos que reconocen epitopos nativos en los polipéptidos. En particular, la invención se refiere, en parte, a anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a epítopos confonnacionales en el dominio extracelular de PSMA, a fonnas multiméricas de proteínas de PSMA, a anticuerpos que se unen selectivamente a los multimeros y a composiciones que cootienen tales anticuerpos o multimeros.
Antecedentes de la invención
El cáncer de próstata es el tipo más predominante de cáncer y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres americanos, con 179.000 casos estimados y 37.000 muertes en 1999, (landis, S.H. et al. CA J. Caneer G/in. 48:6-29 (1998». El número de hombres a quienes se ha diagnosticado cáncer de próstata está aumentando constantemente como resultado de la creciente población de hombres de edad avanzada, asi como un mayor conocimiento de la enfermedad que conduce a su diagnóstico precoz (Parker et al., 1997, GA Cáncer J. Clin. 47 :5280). El riesgo de por vida para los hombres de desarrollar cáncer de próstata es de 1 en 5 para los caucásicos, de 1 en 6 de los afroamericanos. los grupos de alto riesgo están representados por aquellos con un historial familiar positivo de cáncer de próstata o afroamericanos.
A lo largo de la vida, más de 213 de los hombres diagnosticados con cáncer de próstata mueren de la enfermedad (Wingo et al., 1996, CA Caneer J. C/in. 46: 113-25). Además de ello, muchos pacientes que no sucumben al cáncer de próstata requieren tratamiento continuo para mejorar los sintomas tales como dolor, sangrado y obstrucción urinaria. Por lo tanto, el cáncer de próstata también representa una causa importante de sufrimiento y un aumento de los gastos de atención de salud.
Dónde se localiza el cáncer de próstata y la esperanza de vida del paciente es de 10 años o más, la prostatectomia radical ofrece la mejor oportunidad para la erradicación de la enfennedad. Históricamente, el inconveniente de este proceso es que la mayoría de los cánceres se hablan extendido más allá de los limites de la operación en el momento en que se detectaron. los pacientes con tumores voluminosos. de alto grado son menos propensos a ser tratados oon éxito mediante prostatectomía radical.
la radioterapia también ha sido ampliamente utilizada como una alternativa a la prostatectomia radical. Pacientes tratados generalmente mediante radioterapia son aquellos que son mayores y menos sanos y aquellos con tumores de mayor grado, más dinicamente avanzados. Procedimientos particularmente preferidos son la terapia de haz externo que implica una radioterapia tridimensional, confocal, en donde el campo de la radiación está diseñado para adaptarse al volumen de tejido tratado; radioterapia intersticial, en donde semillas de compuestos radiactivos se implantan utilizando una guia ecográfica; y una combinación de la terapia de haz externo y la radioterapia intersticial.
Para el tratamiento de los pacientes con enfermedad localmente avanzada, se ha utilizado la terapia hormonal antes
o después de la prostatectomia radical o radioterapia. la terapia hormonal es la principal forma de tratar a los hombl'"es con cáncer de próstata diseminado. la orquiectomla reduce las concentraciones de testosterona en suero, mientras que el tratamiento con estrógenos es igualmente beneficioso. Dielilestilbestrol de estrógenos es otra terapia hormonal útil que tiene la desventaja de provocar toxicidad cardiovascular. Cuando se administran agonistas de la hormona liberadora de gonadotropina se reducen en última instancia las concentraciones de testosterona. Flutamida y otros agentes anti-andrógenos, no esteroides, bloquean la unión de teslosterona a sus receptores intracelulares. Como resultado, bloquea el efecto de la testosterona, aumentando las concentraciones de testosterona sérica, y permite a los pacientes pennanecer siendo potentes -un problema importante después de la prostatectomia radical y tratamientos de radiación
la quimioterapia citotóxica es en gran medida ineficaz en el tratamiento de cáncer de próstata. Su toxicidad hace que este tipo de tratamiento sea inadecuado para pacientes de edad avanzada. Además, el cáncer de próstata es relativamente resistente a agentes cilotóxicos.
Una recalda o enfermedad más avanzada también se trata con terapia anti-andr6genos. Desafortunadamente, casi todos los tumores se vuelven resistentes a la honnona y progresa rápidamente en ausencia de cualquier terapia eficaz.
Por consiguiente, existe una necesidad de agentes terapéuticos eficaces para el cáncer de próstata que no son abrumadoramente tóxicos para los tejidos normales de un paciente, y que son eficaces en eliminar selectivamente las células de cáncer de próstata.
Sumario de la invención
la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado o a un fragmento de unión a antrgeno del mismo que se une especfficamente a formas diméricas de PSMA, pero no a formas monoméricas de PSMA, y tiene la capacidad de unir células vivas que expresan PSMA.
En realizaciones de la invención, fragmentos de anticuerpos de unión a antrgeno aislados pueden incluir una CDR de los fragmentos de unión a antlgeno anteriores. Preferiblemente, la CDR es CDR3.
Se describen vectores de expresión que incluyen una molécula de ácido nudeico aislada que codifica los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antlgeno anteriores. También se describen células huéspedes transformadas o transfectadas por estos vectores de expresión.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona por su capacidad para unirse a células vivas tales como una célula tumoral o una célula de próstata. preferiblemente células lNCaP. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antrgeno del mismo media en la citolisis de células que expresan PSMA. Preferiblemente, la citolisis de células que expresan PSMA está mediada por células efectoras o está mediada por el complemento en presencia de células efectoras.
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de uni6n a antígeno del mismo inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de uni6n a antlgeno del mismo no requiere la lisis celular para unirse al dominio extracelular de PSMA.
En realizaciones adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE o tiene un dominio de inmunoglobulina constante y/o variable de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o multiespecífico.
Todavía en otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico, o una mezcla de estos. En realizaciones particularmente preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo humano, p. ej ., un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal o una mezcla de anticuerpos monoclonales y policlonales. Todavla en otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecffico o multiespecifico.
Fragmentos de unión a antígenos preferidos incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab'b y un fragmento Fv de CDR3.
En determinadas otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo confonnacional y/o se internaliza en una célula junto con el antígeno de membrana específico para la próstata. En otras realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un marcador, preferiblemente uno seleccionado del grupo que consiste en un marcador fluorescente, un marcador enzimático, un marcador radiactivo, un marcador activo de resonancia magnética nuclear, un marcador luminiscente y un marcador cromóforo.
En aun otras realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antrgeno del mismo está unido a al menos un resto terapéutico tal oomo un fármaco, preferiblemente un fármaco citotóxico, un virus selectivo para la replicación, una toxina o un fragmento de la misma, o una enzima o un fragmento de la misma. Un fármaco citotóxico preferido incluye: caliqueamicina, esperamicina, metotrexato, doxorubicina, melfalán, dorambucilo, ARAC, vindesina, mitomicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina, S-fluorouracilo, estramustina, vincristina, etopósido, doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, dalastatina 10, auristalina E y auristatina PHE. En otras realizaciones, el resto terapéutico es un agente inmunoestimulante o inmunomodulador, preferiblemente uno seleccionado del grupo constituido por: una citoquina, quimioquina y adyuvante.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a anUgeno de la invención se unen específicamente a PSMA de la superficie celular y/o rsPSMA con una afinidad de unión de aproximadamente 1 X l O'
10.10
g M o menos. Preferiblemente, la afinidad de unión es de aproximadamente 1 X M o menos, más preferiblemente la afinidad de unión es de aproximadamente 1 X 10.11 M o menos. En otras realizaciones, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 5 X 10.10 M.
En real ízaciones adicionales, los anticuerpos o fragmentos de unión a anligeno de la invención median en la muerte celular específica de células que expresan PSMA con una CI~ de menos de aproximadamente 1 X 10.10 M. Preferiblemente, la Clso es menor que aproximadamente 1 X 10' M. Más preferiblemente, la Clsos es menor que
aproximadamente 1 X 10.12 M. En otras realizaciones, la Clso es menor que aproximadamente 1,5 X 10. M.
En aún otras realizaciones, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a anUgeno del mismo está unido a un radioisótopo. El radioisótopo puede emitir radiaciones 0'2 radiaciones 13 o radiaciones y. Preferiblemente el radioisótooo se selecciona del aru~ que consiste en 22SAc, llAt, 2128i, 2138i, 186Rh 188Rh, 177Lu, 9Oy, 13\ 67CU, 12\ 1231, 77Br, lS3Sm, 166Ho, 64CU, 21t'Pb, 224 Ra y 223Ra.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporcionan composiciones que incluyen los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y un soporte, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. Otras composiciones incluyen una combinación de dos o más de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y un soporte, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, las composiciones también incluyen un agente antitumoral, un agente inmunoestimulante, un inmunomodulador o una combinación de los mismos. Agentes antitumorales preferidos incluyen un agente citotóxico, un agente que actúa sobre la neovasculatura del tumor, o una combinación de los mismos. Inmunomoduladores preferidos incluyen interferón o, interferón y, factor de necrosis tumoral a o una combinación de los mismos. Agentes inmunoeslimulantes preferidos incluyen interleucina-2, oligonucleótidos inmunoestimulantes o una combinación de los mismos.
Kits para la detección de cáncer de próstata para el diagnóstico, pronóstico o monitorización pueden incluir el anticuerpo marcado aislado anterior o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y uno o más compuestos para la detección del marcador. Preferiblemente, el marcador se selecciona del grupo que consiste en un marcador fluorescente, un marcador enzimático, un marcador radiactivo, un marcador activo de resonancia magnética nuclear, un marcador luminiscente y un marcador cromóforo.
Uno o más de los anteriores anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antigeno de los mismos se pueden envasar en forma liofilizada, o envasar en un medio acuoso.
Métodos para detectar la presencia de PSMA, o una célula que expresa PSMA, pueden incluir poner en contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a anUgeno de los mismos que se unen específicamente a un dominio exlracelular de PSMA, durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo entre el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y PSMA, y detectar el complejo PSMA-anticuerpo o el complejo PSMA-fragmento de unión a antrgeno. La presencia de un complejo en la muestra es indicativa de la presencia en la muestra de PSMA o una célula que expresa PSMA.
Métodos para diagnosticar una enfermedad mediada por PSMA en un sujeto pueden incluir administrar a un sujeto, sospechoso de tener o previamente diagnosticado con la enfermedad mediada por PSMA, una cantidad de cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que se unen específicamente a un dominio exlracelular del anUgeno de membrana específico de la próstata. El método también incluye permitir la formación de un complejo entre el anticuerpo o fragmento de unión a antrgeno del mismo y PSMA, y detectar la formación del complejo PSMA-anticuerpo o complejo PSMA-fragmento de unión a antígeno al epitopo diana. la presencia de un complejo en el sujeto sospechoso de tener o previamente diagnosticado con cáncer de próstata es indicativa de la presencia de una enfermedad mediada por PSMA.
La enfermedad mediada por PSMA puede ser cáncer de próstata. En otras realizaciones, la enfermedad mediada por PSMA es un cáncer no prostático tales como los seleccionados del grupo que consiste en cáncer de vejiga, incluyendo carcinoma de células de transición; cáncer pancreático, incluyendo carcinoma del conducto pancreático; cáncer de pulmón, incluyendo carcinoma de pulmón de células no pequeñas; cáncer de riñón, incluyendo carcinoma de células renales convencional; sarcoma, incluyendo sarooma de tejidos blandos; cáncer de mama, incluyendo carcinoma de mama; cáncer de cerebro, incluyendo glioblastoma multiforme; carcinoma neuroendocrino; cáncer de colon, incluyendo carcinoma de colon; cáncer testicular, incluyendo carcinoma embrionario testicular; y melanoma, incluyendo melanoma maligno.
En realizaciones preferidas de los métodos anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado. En otras realizaciones de los métodos anteriores, se administra un segundo anticuerpo para detectar el primer anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo.
Métodos para evaluar el pronóstico de un sujeto con una enfermedad mediada por PSMA pueden induir administrar a un sujeto, sospechoso de tener o previamente diagnosticado con la enfemledad mediada por PSMA, una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento del mismo, pennitir la formación de un complejo entre el anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo y PSMA, y detectar la formación del complejo con el epítopo diana. La cantidad del complejo en el sujeto sospechoso de tener o previamente diagnosticado con la enfennedad mediada por PSMA es indicativa del pronóstico.
Métodos para evaluar la eficacia de un tratamiento de un sujeto con una enfennedad mediada por PSMA pueden induir administrar a un sujeto tratado para una enfermedad mediada por PSMA una cantidad eficaz de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antrgeno de los mismos, permitir la formación de un complejo entre el anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo y PSMA, y detectar la formación del complejo con el epítopo diana. La cantidad del complejo en el sujeto sospechoso de tener o previamente diagnosticado con la enfermedad mediada por PSMA es indicativa de la eficacia del tratamiento.
En determinadas realizaciones de los dos métodos anteriores, la enfermedad mediada por PSMA puede ser cáncer de próstata. En otras realizaciones, la enfermedad mediada por PSMA es un cáncer no prostático. En esas realizaciones, el cáncer no prostático se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cáncer de vejiga, induyendo carcinoma de células de transición; cáncer pancreático, induyendo carcinoma de conducto pancreático; cáncer de pulmón, incluyendo carcinoma de pulmón de células no pequeñas; cáncer de riñón, induyendo carcinoma de células renales convencional; sarcoma, induyendo sarooma de tejidos blandos; cáncer de mama, incluyendo carcinoma de mama; cancer de cerebro, induyendo glioblastoma multiforme; carcinoma neuroendocrino; cáncer de colon, induyendo carcinoma de colon; cáncer testicular, induyendo carcinoma embrionario testicular; y melanoma, induyendo melanoma maligno_ En todavía otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está marcado. En realizaciones adicionales, se administra un segundo anticuerpo para detectar el primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Métodos para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA pueden incluir poner en contacto una célula que expresa PSMA con una cantidad de al menos uno de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antrgeno de los mismos que se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA eficaz para inhibir el crecimiento de la célula que expresa PSMA.
Métodos para inducir la citolisis de una célula que expresa PSMA pueden incluir poner en contacto una célula que expresa PSMA con una cantidad de al menos uno de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA, eficaz para inducir la citolisis de la célula que expresa PSMA. En determinadas realizaciones, la citolisis se produce en la presencia de una célula efectora. En otras realizaciones, la citolisis es mediada por el complemento.
Métodos para tratar o prevenir una enfennedad mediada por PSMA pueden incluir administrar a un sujeto que tiene una enfermedad mediada por PSMA una cantidad eficaz de al menos uno de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para tratar o prevenir la enfennedad mediada por PSMA. En algunas realizaciones, la enfermedad mediada por PSMA es un cáncer tal como cáncer de próstata o un cáncer no prostático (induyendo los cánceres no prostáticos descritos en esta memoria en otra parte).
Métodos para tratar o prevenir una enfennedad mediada por PSMA pueden incluir administrar a un sujeto que tiene una enfermedad mediada por PSMA o en riesgo de tener una enfermedad mediada por PSMA una cantidad de al menos uno de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antrgeno de los mismos, eficaz para tratar o prevenir la enfennedad mediada por PSMA.
En algunas realizaciones, la enfermedad mediada por PSMA es un cáncer tal como cáncer de próstata o un cáncer no prostático (induyendo los cánceres no prostáticos descritos en esta memoria en otra parte).
En otras realizaciones, el método también incluye la administración de otro agente terapéutioo para tratar o prevenir la enfermedad mediada por PSMA en cualquier momento antes, durante o después de la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo. En algunas de estas realizaciones, el agente terapéutico es una vacuna, y preferiblemente la vacuna inmuniza al sujeto oontra PSMA.
En aún otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está unido a al menos un resto terapéutico, preferiblemente un fármaco citotóxico, un fármaco que actúa sobre la neovasculatura tumoral y combinaciones de los mismos. Fármacos citotóxicos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en: caliqueamicina, esperamicina, metotrexato, doxorubicina, melfalán, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitornicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina, 5-fluorouracilo, estramustina, vincristina, etopósido. doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, dolastatina 10, auristatina E y auristatina PHE.
En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo está unido a un radioisótopo, y las radiaciones emitidas por el radioisótopo se seleccionan del grupo ~ue consiste en radiaciones a, p 1, y. Preferiblemente... el radioisótoDO se selecciona del grURQ que consiste en 2 sAc, 211At, 2128i, 2138i, 186Rh, 18BRh, 1 Lu,
9Oy, 13\ 67 CU, 1~\ 12\ 77Br, I~Sm, 166Ho, 64CU, 212pb, 224 Ra y 223Ra.
Los anticuerpos y fragmentos de uniÓn a antígeno de la presente invenciÓn se pueden utilizar en métodos para modular al menos una actividad enzimálica de PSMA. Tal como se utiliza en realizaciones preferidas de los métodos, "modular" una actividad enzimática de PSMA significa potenciar o inhibir la actividad enzimática. Los términos "potenciar" e "inhibir" en este contexto indican que la actividad enzimática de PSMA es potenciada o inhibida en presencia de un anticuerpo que se une especificamente a PSMA, o fragmento de unión a antígeno del mismo, con relaciÓn al nivel de actividad en ausencia de un anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo de este tipo. las actividades enzimáticas de PSMA incluyen la actividad felato hidrolasa, la actividad dipeptidasa ácida N-acetilada a-enlazada (NAALADasa), la actividad dipeptidil dipeptidasa IV y la actividad y-glutamil hidrolasa.
Métodos para modular la actividad de felato hidrolasa pueden incluir poner en contacto un poIipépl ido felato hidrolasa con una cantidad del anticuerpo aislado anterior o fragmento de unión a anligeno del mismo, en condiciones en las que el anticuerpo aislado o fragmento de uniÓn a antlgeno del mismo modula la actividad felato hidrolasa. El poIipéptido folalo hidrolasa puede ser aislado, puede estar contenido en una muestra tal como una célula, un homogeneizado celular, un tejido, o un homogeneizado de tejido, o puede estar contenido en un organismo_El organismo es preferiblemente un animal, de manera particularmente preferida un mamífero
Métodos para modular la actividad dipeptidasa ácida N-acetilada a-enlazada (NAALADasa) pueden incluir poner en contacto un poIipéplido de NAALADasa con una cantidad del anticuerpo aislado anlariO( o fragmento de unión a antigeno del mismo bajo condiciones en las que el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo modula la actividad de NAALADasa. El poIipéptido de NAALADasa puede ser aislado, puede estar contenido en una muestra tal como una célula, un homogeneizado celular, un tejido, o un homogeneizado de tejido, o puede estar contenido en un organismo. El organismo es preferiblemente un animal, de manera particularmente preferida un mamífero.
Métodos para modular la actividad de dipeptidil dipeptidasa IV pueden incluir poner en contacto un polipéptido dipeptidil dipeptidasa IV con una cantidad del anticuerpo aislado anterior o fragmento de unión a anligeno del mismo bajo condiciones en las que el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo modula la actividad de la dipeptidil dipeptidasa IV. El polipéptido IV dipeptidil dipeptidasa puede ser aislado, puede estar contenido en una muestra tal como una célula , un homogeneizado celular, un tejido, o un homogeneizado de tejido, o puede estar contenido en un organismo. El organismo es preferiblemente un animal, de manera particularmente preferida un mamífero.
Métodos para modular la actividad de y-glutamil hidrolasa pueden incluir poner en contacto un polipéptido y-glutamil hidrolasa con una cantidad del anticuerpo aislado anterior o fragmento de unión a anligeno del mismo bajo condiciones en las que el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo modula la actividad de yglutamil hidrolasa. El poIipéptido y-glutamil hidrelasa puede ser aislado, puede estar contenido en una mueslra lal como una célula, un homogeneizado celular, un tejido, o un homogeneizado de tejido, o puede estar contenido en un organismo. El organismo es preferiblemente un animal, de manera particularmente preferida un mamífero.
Los anticuerpos y fragmentos de uniÓn a antígeno de la presente invención se pueden utilizar en métodos de suministro especifico de al menos un agente terapéutico a células que expresan PSMA. los métodos incluyen administrar una cantidad eficaz de al menos uno de los anticuerpos anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos conjugados con al menos un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es una melécula de ácido nucleico, un fármaco antitumoral, una toxina o un fragmento de la misma, una enzima o un fragmento de la misma, un virus de replicación selectiva o un agente inmunoeslimulante o inmunomodulador. Fannacos antitumorales preferidos incluyen fannaoos citotóxioos, fannaoos que actúan sobre la neovasculalura tumoral y combinaciones de los mismos. Fannacos citotóx.icos preferidos incluyen caliqueamicina, esperamicina, metotrexato, doxorubicina, melfalán, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitornicina C, cis-platino, etopósido,
bleomicina, 5-fluorouracilo, estramustina, vincristina, etop6sido, doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, dolastatina 10, auristatina E '1 auristatina PHE. Un agente inmunoestimulante o inmunomodulador preferido incluye citoquinas, quimioquinas '1 adyuvantes.
De acuerdo con la invención, se proporcionan anticuerpos aislados que se unen específicamente a un dímero de proteína PSMA. En realizaciones preferidas, al menos una de las proteínas que fonnan el multímero de PSMA es un polipéptido PSMA recombinante, soluble (rsPSMA). Preferiblemente, el polipéptido rsPSMA consiste esencialmente en los aminoácidos 44-750 de la SEO ID NO: 1.
En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan anticuerpos aislados que se unen específicamente a un dímero de proteína PSMA '1 modulan una o más actividades enzimáticas del dímero de proteína PSMA. Tal como se utiliza en realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, ~modular~ una actividad enzimática de un dímero de PSMA significa inhibir la actividad enzimática. Por lo tanto, en determinados aspectos de la invención, se proporcionan anticuerpos que inhiben una actividad enzimática de un dímero de PSMA. El término ~inhibir~ en este contexto indica que la actividad enzimática de un multímero de PSMA es inhibida en presencia de un anticuerpo que se une específicamente al dímero de PSMA, o al fragmento de unión a anUgeno del mismo, con relación al nivel de actividad en ausencia de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, la actividad enzimática se selecciona del grupo que consiste en la actividad de folato hidro lasa, la actividad de NAALAOasa, la actividad de dipeptidil dipeptidasa IV yla actividad de y-glutamil hidrolasa. En otras realizaciones, la actividad enzimática está en el dominio extracelular de la molécula de PSMA. En todavía otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un dominio extra celular de PSMA.
Todavía en otro aspecto de la invención. se proporcionan composiciones que incluyen uno o más de los anticuerpos aislados anteriores y una molécula inmunoestimulante tal como un adyuvante '110 una citoquina. Preferiblemente, la molécula inmunoestimulante es Il-2 o un oligonudeótido inmunoestimulante. En determinadas realizaciones, las composiciones anteriores también incluyen un soporte farmacéuticamente aceptable.
Métodos para inducir una respuesta inmune pueden incluir administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad eficaz de los anticuerpos aislados anteriores o composiciones.
la invención proporciona, en otro aspecto, anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a un dímero de proteína PSMA y modulan al menos una actividad enzimática de PSMA. Tal como se utiliza en realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, ·modular~ una actividad enzimatica de un PSMA significa inhibir la actividad enzimática. Por lo tanto, en determinados aspectos de la invención, se proporcionan anticuerpos que inhiben una actividad enzimática de PSMA. El término ~inhibir· en este contexto indica que la actividad enzimática de PSMA es inhibida en presencia de un anticuerpo que se une específicamente a PSMA, o fragmento de unión a anUgeno del mismo, con relación al nivel de actividad en ausencia de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de este tipo. la enzima, en determinadas realizaciones, se selecciona del grupo que consiste en hidrolasas y peptidasas. Hidrolasas preferidas induyen folato hidrolasa y y-glutamil hidrolasa. En una realización particularmente preferida de inhibición de PSMA, la hidrolasa es folato hidrolasa y el anticuerpo es mAb (anticuerpo monoclonal) 5.4 o mAb 3.9. Peptidasas preferidas incluyen NAALADasa y dipeptidil dipeptidasa IV. En algunas realizaciones, la enzima es activa en células cancerosas y tiene menor actividad en células normales que en células cancerosas o, preferiblemente, ninguna actividad en células normales. En realizaciones preferidas, las células cancerosas en las que la enzima es activa son células de cáncer de próstata. También se proporcionan por parte de la invención composiciones que incluyen los anticuerpos aislados anteriores o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y un soporte farmacéuticamente aceptable.
Todavía en otras realizaciones, las composiciones anteriores también induyen un adyuvante '1/0 una citoquina u otra molécula inmunoestimulante. Citoquinas preferidas induyen Il-2, Il-12, Il-18 Y GM-CSF. En realizaciones adicionales, las composiciones anteriores también induyen un soporte farmacéuticamente aceptable.
Métodos para inducir una respuesta inmune pueden incluir administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad eficaz de una o más de las composiciones anteriores.
También se proporciona el uso de las anteriores cornjXIsiciones, moléculas y agentes en la preparación de medicamentos. En realizaciones preferidas, los medicamentos son útiles en el tratamiento de afecciones relacionadas con enfermedades hiperproliferativas, incluyendo el cáncer, y enfermedades de actividad inapropiada de NAALADasa, actividad de felato hidrolasa, actividad de dipeptidil dipeptidasa IV ylo actividad de y-glutamil hidrolasa.
[0070] Estos y otros aspectos de la invención se describirán con más detalle en relación con la descripción detallada de la invención.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 representa la reactividad de PSMA de mAbs segun se determina por citometria de flujo. Los mAbs (3.7, 3.9, 3.11, 3.12, 5.4 Y 10.3) anti-PSMA incubados con células 3T3 parentales (indicados por líneas negras) o células 3T3 modificadas para expresar PSMA de la superficie celular (3T3-PSMA; Ifneas grises).
La Figura 2 muestra una imagen digitalizada de la inmunoprecipitación de PSMA por parte de mAbs. Usados de células 3T3-PSMA o células 3T3 parentales fueron incubadas con cada uno de los mAbs y luego fueron precipitados utilizando pertas de agarosa de Proteína AlG. Después del lavado, las protefnas se resolvieron en un gel de poliacrilamida, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se visualizaron utilizando el mAb anti-PSMA MAB544.
La Figura 3 muestra el reconocimiento de PSMA no desnaturalizado por parte de varios anticuerpos de PSMA que reconocen la conformadón de PSMA.
La Figura 4 es una imagen digitalizada de una transferencia Western que muestra el reconocimiento de PSMA desnaturalizado por parte de dos anticuerpos PSMA y muestra que los anticuerpos que reconocen la conformación de PSMA no reconocen PSMA desnaturalizado.
La Figura 5 es una imagen digitalizada de un gel de poliacrilamida que muestra un análisis de PSMA purificado recombinante, soluble (rsPSMA) y de PSMA de longitud completa de células 3T3 (3T3 PSMA) o células lNCaP (lNCap PSMA) mediante SDS-PAGE reducida y no reducida.
La Figura 6 es una imagen digitalizada de un gel de poliacrilamida que representa un análisis PAGE Nativa Azul de PSMA purificado recombinante, soluble (rsPSMA purificado) y de PSMA de longitud completa de células 3T3 (3T3 PSMA) o células LNCaP (LNCaP PSMA).
La Figura 7 muestra el efecto de cuatro anticuerpos (mAb 3.9. mAb 5.4. mAb 7.3 y mAb J591) sobre la actividad enzimática de falato hidrolasa a través de la medición de la velocidad de escisión del glutamato a partir de di-gamma glutamato de metotrexato mediante falato hidralasa presente en 0,0002 I-Ig de rsPSMA nO 7.
La Figura 8 muestra el efecto de cuatro anticuerpos (mAb 3.9, mAb 5.4, mAb 7.3 y mAb J591) sobre la actividad enzimática de falato hidrolasa a través de la medición de la velocidad de escisión del glutamato a partir de di-gamma glutamato de metotrexato mediante falato hidralasa presente en 0,0002 I-Ig de rsPSMA nO 8.
La Figura 9 muestra el efecto de cuatro anticuerpos (mAb 3.9, mAb 5.4, mAb 7.3 y mAb J591) sobre la actividad enzimática de folato hidralasa a través de la medición de la velocidad de escisión de glutamato a partir de di-gamma glutamato de metotrexato mediante falato hidralasa presente en lisados de células C4-2.
La Figura 10 representa el protocolo de donación para la donación del anticuerpo IgGl en pcADN.
La Figura 11 proporciona el mapa de plásmido de una molécula de ácido nudeico que codifica la cadena pesada del anticuerpo AB-PG1-XG1-006.
La Figura 12 proporciona el mapa de plasmido de una molécula de ácido nudeico que codifica la cadena pesada del anticuerpo AB-PG1-XG1-026.
La Figura 13 proporciona el mapa de plásmido de una molécula de ácido nudeico que codifica la cadena pesada del anticuerpo AB-PG1-XG1-051 .
La Figura 14 proporciona el mapa de plásmido de una molécula de ácido nudeico que codifica la cadena pesada del anticuerpo AB-PG1-XG1-069.
La Figura 15 proporciona el mapa de plásmido de una molécula de ácido nudeico que codifica la cadena pesada del anticuerpo AB-PG1-XG1-077.
La Figura 16 proporciona el mapa de plásmido de una molécula de ácido nudeico que codifica la cadena pesada del anticuerpo PSMA 10.3.
La Figura 17 proporciona el mapa de plásmido de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo AB-PG1-XG1-006.
La Figura 18 proporciona el mapa de plásmido de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo AB-PG1-XG1-026.
La Figura 19 proporciona el mapa de plasmido de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo AB-PG1-XG1-051.
La Figura 20 proporciona el mapa de plasmido de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo AB-PG1-XG1-069.
La Figura 21 proporciona el mapa de plasmido de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo AB-PG1-XG1-077.
La Figura 22 proporciona el mapa de plasmido de una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo PSMA 10.3.
La Figura 23 representa la citotoxicidad de 225Ac_3.9 sobre células diana LNCaP.
La Figura 24 ilustra la reactividad de anticuerpos monoclonales XG-006, XG-051, 4.40.1. 4.49.1, 4.292.1 Y 4.304.1 anti-PSMA incubados con células 3T3 parentales (histograma negro) o células 3T3 modificadas para expresar PSMA humano de la superficie celular (histograma gris) y se analizaron mediante citometria de flujo.
La Figura 25 ilustra la unión de los Abs (anticuerpos) anti-PSMA. La Figura 25A muestra que los mAbs anti-PSMA se unen a células 3T3-PSMA y no a células 3T3. Se muestra un experimento representativo de al menos diez determinaciones. la Figura 258 ilustra que se producla la unión a PSMA de la superficie celular utilizando diluciones en serie de sobrenadantes de cultivo que contienen mAb anti-PSMA. Se muestra un experimento representativo de cinco. La Figura 25C muestra la unión a PSMA de la superficie celular utilizando diluciones en serie de mAbs antiPSMA purificados, XG-006 y 10.3. Se muestra un experimento representativo.
la Figura 26 ilustra la citotoxicidad inmunotoxina de anticuerpos murines anti-PSMA sobre las células de cáncer de próstata C4-2. SJ25C-l como un anticuerpo control es una IgG anti-CD19 murina. Los anticuerpos LD 50s (M) para 5,4,3,9 Y mJ591 eran 2,27 x 10.11, 2,29 X 10.11 Y 8.82 X 10.11, respectivamente.
la Figura 27 ilustra la citotoxicidad inmunotoxina de anticuerpos murinos anti-PSMA sobre células 3T3-PSMA. SJ25C-l como un anticuerpo de control es una I~G murina anti-CD19. Los anticuerpos lD 50s (M) para 5,4, 3,9 Y mJ591 eran 1,64 x 10.11 , 1,96 X 10.11 Y 8,90 X 10.1 , respectivamente.
la Figura 28 proporciona la citotoxicidad de 4.304 anticuerpos humanos conjugados directos anti-PSMA con saporina sobre PSMA-3T3. la DlSO era 1,48 x 10.11 M para 4.304 anticuerpos anti-PSMA con saporina.
La Figura 29 ilustra los resultados del ensayo de competencia de anticuerpos 4.304, 4.40, mJ591 anti-PSMA no modificados utilizados ¡:.ara competir con anticuerpos 4.40 y 4.304 anti-PSMA radiomarcados con In-l11 .
La Figura 30 ilustra los resultados del ensayo de competencia de anticuerpos 4.304, mJ591 anti-PSMA utilizados para competir con anticuerpos mJ591 anti-PSMA radiomarcados con 1n-111 .
la Figura 31 muestra un análisis del anticuerpo PRGX1-XG-006 en fase de asociación y fase de disociación a diferentes concentraciones de rsPSMA de 100 nM a 6,25 nM.
La Figura 32 muestra los resultados de la comparación de los anticuerpos 4.40.1, 4.49.1, 051 Y 006 anti-PSMA completamente humanos y el anticuerpo 3.9 anti-PSMA murino, realizada utilizando el análisis de 8iacOfe.
La Figura 33 proporciona resultados del análisis de Scatchard utilizando el anticuerpo 3.9 anti-PSMA marcado con In-111 de las líneas celulares PSMA-3T3, lNCaP y C4-2.
La Figura 34 muestra la citotoxicidad in vitre del anticuerpo 4.40 marcado anti-PSMA humano marcado con Ac-225 en células de cancer de próstata.
La Figura 35 muestra los resultados de la radioinmunoterapia in vivo con anticuerpos anti-PSMA humanos marcados con Lu-177.
La Figura 36 es una sene de gráficos que muestran los datos de citometria de flujo para la unión de antisueros antiPSMA a células 3T3-PSMA. Los antisueros de ratones inmunizados con una preparación de dimeros de rsPSMA (A8IM151, A81M152, A81M153, A8IMl54 Y A81M155) exhibieron una fuerte unión a células que expresan PSMA. Los antisueros de ratones inmunizados con una preparación de monómeros de rsPSMA (A8IM156, A81M157, A81M158, A81M159 YA81M160) exhibieron poca o ninguna unión a células que expresan PSMA.
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno de los mismos que se unen específicamente a epítopos confOllTlacionales sobre el dominio extracelular de PSMA, composiciones que contienen uno o una combinación de anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno de los mismos de este tipo, lineas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos y métodos de utilizar los anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno de los mismos para el diagnóstico y tratamiento del cancer.
La invención y sus aspectos preferidos se describen en las reivindicaciones adjuntas.
El antígeno prostático especifico de membrana (PSMA) es una glicoproleína de la membrana de 100 kD de Tipo 11 expresada en tejidos de la próstata y se identificó originalmente mediante reactividad con un anticuerpo monoclonal denominado 7E11-C5 (HOfoszewicz et al., 1987, Anticaneer Res. 7:927-935; patente de EE.UU. N". 5.162.504). PSMA se obtuvo en forma purificada (Wright el al, 1990, Anlibody Immunoconjugates and Radio Pharmaceuticals 3: Abstract 193) y se caracterizó como una proteina de la transmembrana de tipo 11 que tiene una identidad de secuencia con el receptor de transferrina (Israeli et al., 1994, Caneer Res. 54:1807-1811) y con actividad de NAALAoasa (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. u.s.A. 93:749-753). De manera más importante, PSMA se expresa en cantidades incrementadas en el cáncer de próstata, y los niveles elevados de PSMA también son detectables en los sueros de estos padentes (HOfoszewicz et al., 1987; Rochon et al., 1994, Prestate 25:219-223; Murphy et al., 1995, ProsIate 26:164-168; y Murphy et al., 1995, Anticancer Res. 15:1473-1479). La expresión de PSMA aumenta con el progreso de la enfermedad, convirtiéndose en la más alta en enfermedad metastásica, refractaria a las hormonas, para la cual no existe actualmente terapia. oalos recientes provocativos indican que PSMA se expresa también abundantemente en la neovasculalura de una diversidad de otros tumores importantes, induyendo células tumorales de vejiga, páncreas, sarcoma, melanoma, pulmón y riñón, pero no en la vasculatura normal.
Hibridomas se depositaron ante la ATCC como Autoridad de Depósito Internacional y se les dio las siguientes Designaciones de Depósito de Patente (Tabla 1): Tabla 1
Anticuerpo
HibridomalPlásmido Designación de Depósito de Patente Fecha de Depósito
PSMA3.7
PSMA3.7
PTA-3257 5 de abril,2001
PSMA3.9
PSMA3.9
PTA-3258 5 de abril , 2001
PSMA3.11
PSMA3.11
PTA-3269 10 de abril , 2001
PSMA 5.4
PSMA 5.4
PTA-3268 10 de abril , 2001
PSMA 7.1
PSMA 7.1
PTA-3292 18 de abril , 2001
PSMA 7.3
PSMA 7.3
PTA-3293 18 de abril , 2001
PSMA 10.3
PSMA 10.3 PSMA 10.3 HC en pcAoN (SEO ID NO: 7) PSMA 10.3 Kappa en pcAoN (SEO ID NO: 13) PTA-3347 PTA-4413 PTA-4414 1 de mayo, 2001 29 de mayo, 2002 29 de mayo, 2002
PSMA 1.8.3
PSMA 1.8.3
PTA-3906 5 de dic., 2001
Anticuerpo HibridomalPlasmido
Designación de Depósito de Patente Fecha de Depósito
PSMAA3.1.3
PSMA A3.1.3 PTA-3904 5 de dic., 2001
PSMAA3.3.1
PSMA A3.3.1 PTA-3905 5 de dic., 2001
Abgenix 4.248.2
Abgenix 4.248.2
PTA-4427 4 de junio, 2002
Abgenix 4.360.3
Abgenix 4.360.3
PTA-4428 4 de junio, 2002
Abgenix 4.7.1
Abgenix 4.7.1
PTA-4429 4 de junio, 2002
Abgenix 4.4.1
Abgenix 4.4.1
PTA-4556 18 de julio, 2002
Abgenix 4.177.3
Abgenix 4.177.3
PTA-4557 18 de julio, 2002
Abgenix 4.16.1
Abgenix 4.16.1
PTA-4357 16 de mayo, 2002
Abgenix 4.22.3
Abgenix 4.22.3
PTA-4358 16 de mayo, 2002
Abgenix 4.28.3
Abgenix 4.28.3
PTA-4359 16 de mayo, 2002
Abgenix 4.40.2
Abgenix 4.40.2
PTA-4360 16 de mayo, 2002
Abgenix 4.48.3
Abgenix 4.48.3
PTA-4361 16 de mayo, 2002
Abgenix 4.49.1
Abgenix 4.49.1
PTA-4362 16 de mayo, 2002
Abgenix 4.209.3
Abgenix 4.209.3
PTA-4365 16 de mayo,2002
Abgenix4.219.3
Abgenix 4.219.3 PTA-4366 16 de mayo,2002
Abgenix 4.288.1
Abgenix 4.288.1
PTA-4367 16 de mayo,2002
Abgenix 4.333.1
Abgenix 4.333.1
PTA-4368 16 de mayo,2002
Abgenix 4.54.1
Abgenix 4.54.1
PTA-4363 16 de mayo, 2002
Abgenix4.153.1
Abgenix4.153.1
PTA-4388 23 de mayo, 2002
Abgenix 4.232.3
Abgenix 4.232.3
PTA-4389 23 de mayo, 2002
Abgenix 4.292.3
Abgenix 4.292.3
PTA-4390 23 de mayo, 2002
Abgenix4.304.1
Abgenix 4.304.1 PTA-4391 23 de mayo, 2002
AB-PG1 -XG1 -006
AB-PG1-XG1-006 Cadena Pesada (SEO ID NO, 2) AB-PG1-XG1-006 Cadena Ligera (SEO ID NO, 8) PTA-4403 PTA-4404 29 de mayo , 2002
AB-PG1-XG1026
AB-PG1-XG1-026 Cadena Pesada (SEO ID NO, 3) AB-PG1-XG1-026 Cadena Ligera (SEO ID NO: 9) PTA-4405 PTA-4406 29 de mayo, 2002
AB-PG1-XG1051
AB-PG1-XG1-051 Cadena Pesada (SEO ID NO: 4) AB-PG1-XG1-051 Cadena Ligera (SEO ID NO: 10) PTA-4407 PTA-4408 29 de mayo, 2002
AB-PG1-XG1069
AB-PG1-XG1-069 Cadena Pesada (SEO ID NO: S) AB-PG1-XG1-069 Cadena ligera (SEO ID NO: 11) PTA-4409 PTA-441O 29 de mayo, 2002
Anticuerpo
HibridomalPlasmido Designación de Depósito de Patente Fecha de Depósito
AB-PG1-XG1077
AB-PG1-XG1-077 Cadena Pesada (SEO ID NO: 6) AB-PG1-XG1-077 Cadena ligera (SEO ID NO 12) PTA-4411 PTA-4412 29 de mayo, 2002
Se describen anticuerpos que tienen secuencias particulares y se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos que comprenden: una cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucieico que comprende la región o regiones de la cadena pesada codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEO ID NOs: 2-7, y una cadena ligera codificada poi'" una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de la cadena ligera de una secuencia de nucle6tidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucleótidos recogidas como SEO ID NOs: 8-13. También se proporcionan fragmentos de unión a antigeno de los anticuerpos anteriores.
Los plásmidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos PSMA 10.3, AB-PG1-XG1-006 , AB-PG1 XG1-026, AB-PG1-XG1-051 , AB-PG1-XG1-069, AB-PG1-XG1-077 también fueron depositados en la ATCC y se muestran en la Tabla 1 anterior. Tal como se utiliza en esta memoria, los nombres de los hibridomas o plásmidos depositados se pueden utilizar de fonna indistinta con los nombres de los anticuerpos. SerIa evidente para un experto en la técnica cuando el nombre pretende referirse al anticuerpo o cuando se refiere a los plásmidos o hibridomas que codifican o producen los anticuerpos, respectivamente. Adicionalmente, los nombres de anticuerpos pueden ser una forma abreviada del nombre mostrado en la Tabla 1. Por ejemplo, al anticuerpo AB-PG1-XG1-006 se puede aludir como AB-PG1-XG1-006, PG1-XG1-006, XG1-006, 006, etc. En olro ejemplo, al nombre del anticuerpo PSMA 4.232.3 se puede aludir como PSMA 4.232.1, 4.232.3, 4.232.1, 4.232, elc. Se pretende que todas las variaciones en el nombre del anticuerpo se refieran al mismo anticuerpo y no uno diferente.
Los anticuerpos también se describen que están codificados por conjuntos particulares de secuencias de cadena pesada y ligera. El anticuerpo (AB-PG1-XG1-006) es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de las secuencias de ácido nucleico recogidas como: SEO ID NOs: 2 y 8, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-026) es codificado poi'" las moléculas de ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificadoras de las secuencias de nucJeótidos recogidas como: SEO ID NOs: 3 y 9, el anticuerpo (ABPG1-XG1-051) es codificado por las moléculas de ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificadoras de las secuencias de nucleótidos recogidas como: SEO ID NOs: 4 y 10, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-069) es codificado por las moléculas de ácido nucleioo que comprenden la región o regiones codificadoras de las secuencias de nucJe6tidos recogidas como: SEO ID NOs: 5 y 11, el anticuerpo (AB-PG1-XG1-077) es codificado poi'" las moléculas de ácido nudeico que comprenden la región o regiones codificadoras de las secuencias de nucleótidos recogidas como: SEO ID NOs: 6 y 12, Yel anticuerpo (PSMA 10.3) es codificado por las moléculas de ácido nucleico que comprenden la región o regiones codificadoras de las secuencias de nucle6lidos recogidas como: SEO ID NOs: 7 y 13.
También se describen anticuerpos que incluyen una región variable de cadena pesada codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucle6tidos recogidas como: SEO ID NOs: 14, 18, 22, 26 Y 30, Y una región variable de cadena ligera codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la región o regiones codificadoras de una secuencia de nucle6tidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de nucle6tidos recogidas como: SEO ID NOs: 16,20, 24,28 Y 32. Tal como se utiliza en esta memoria, una "región codificadora" se refiere a una región de una secuencia de nucle6tidos que codifica una secuencia de polipéplidos; la región codificadora puede incluir una región que codifica una porción de una proteína que luego se escinde tal como un péptido señal.
El anticuerpo (AB-PG1-XG1-006) incluye una secuencia variable de la inmunoglobulina codificada por moléculas de ácido nucleico que incluyen la región o regiones codificadoras de las secuencias de ácidos nucleicos recogidas como SEO ID NOs: 14 y 16, o incluye una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoacidos recogidas como SEO ID NOs: 15 y 17. El anticuerpo (AB-PG1-XG1-026) incluye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por moléculas de ácido nudeico Que comprenden la región o regiones codificadoras de secuencias de nucle6tidos recogidas como: SEO ID NOs: 18 y 20, o incluye una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEO ID NOs: 19 y 21 . El
anticuerpo (AB-PG1-XG1-051) induye una secuerJcia variable de inmunoglobulina codificada por las moléculas de ácido nudeico que comprenden la región o regiones codificadoras de secuencias de nude6tidos recogidas como: SEO ID NOs: 22 y 24, o incluye una secuerJcia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEO ID NOs: 23 y 25. El anticuerpo (AB-PG1-XG1-069) induye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por las moléculas de ácido nudeico que comprenderJ la región o regiones codificadoras de secuencias de nucle6tidos establecidas como: SEO ID NOs: 26 y 28, o induye una secuencia variable de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos recogidas como SEO ID NOs: 27 y 29. El anticuerpo (AB-PG1-XG1-077) induye una secuencia variable de inmunoglobulina codificada por las moléculas de ácido nudeico que comprenden la región o regiones codificadoras de secuencias de nudeótidos recogidas como: SEO ID NOs: 30 y 32 o incluye una secuerJcia variable de inmunoglobulina que comprerJde las secuerJcias de aminoacidos recogidas como SEO ID NOs: 31 y 33.
Tal como se utiliza erJ esta memona, el ténnino ·anticuerpo· se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cac:lerJas pesadas (H) y dos caderJas ligeras (l) inter-conectadas por enlaces disulfuro. Cada una de las caderJas pesadas esta compuesta de una región variable de cadena pesada (abreviada erJ esta memOl'ia como HCVR o VH) y una región constante de caderJa pesada. la región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada una de las caderJas ligeras está compuesta por una región variable de caderJa ligera (abreviada erJ esta memoria como lCVR o Vd y una región constante de cadena ligera. la región constante de caderJa ligera está compuesta por un dominio, Cl. las regiones VH y VL pUederJ subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominados regiones detem\inantes de la complementariedad (CoR), intercaladas con regiones que son regiones más conservadas, derJominadas regiones marco (FR). Cada una de VH y VL se compone de tres CoRs y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguierJte orden: FR1, COR1, FR2, CoR2, FR3, CoR3, FR4. las regiones variables de las caderJas pesada y ligera contienerJ un dominio de unión que interactúa con un anligeno. las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar erJ la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmune (p. ej. , células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.
la expresión "fragmento de unión a antígerJo· de un anticuerpo, tal como se utiliza erJ esta memoria, se refiere a una
o mas porciones de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antrgeno (p. ej. , PSMA). Se ha demostrado que la función de unión al antígerJo de un anticuerpo puede ser realizada por fragmerJtos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmerJtos de unión abarcados por la expresión "fragmerJto de unión a antigerJo· de un anticuerpo incluyerJ (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, Ct. y CH1; (ii) un F(ab'l2. un fragmento bivalente que comprende dos fragmerJtos Fab erJlazados por un puente disulfuro erJ la región de bisagra; (iii) un fragmerJto Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VHde un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546) que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (COR) aislada. Además de ello, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V y VH, son codificados por genes separados, puederJ unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite ser hechos como una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VHse aparean para formar moléculas monovalentes (oonocidas como Fv de cadena serJcilla (scFv); véase, p. ej ., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proe. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de caderJa sencilla también están destinados a estar comprendidos dentro de la expresión ·porción de unión a antígeno· de un anticuerpo. Estos fragmerJtos de anticuerpo se obtienerJ utilizando procedimientos convencionales tales como proeedimierJtos de fragmerJtación proteolítica tal como se describerJ en J. Goding, Monooonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 98-118 (N.Y. Academic Press 1983), asi como por otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica . los fragmerJtos se rastrean en cuanto a la utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.
Un ·anticuerpo aislado", tal como se utiliza erJ esta memoria, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmerJte libre de otros anticuerpos que tierJen especificidades antigénicas diferentes (p. ej ., un anticuerpo aislado que se une específicamente a PSMA está sustancialmente libre de anticuerpos que espeeíficamerJte se unerJ a antígenos distintos de PSMA). Un anticuerpo aislado que se une espeeificamerJte a un epítopo, isoferma o variante de PSMA puede, sin embargo, tiene reactividad cruzada con otros antigenos relacionados, p. ej ., de otras especies
(p. ej., homólogos de especies de PSMA). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos quimicos. Tal como se utiliza en esta memoria, "unión especifica" se refiere a la unión del anticuerpo a un antlgerJo predeterminado. Tipicamente, el anticuerpo se une con una afinidad que es al merJOS dos veees mayor que su afinidad por la unión a un antigeno no específico (p. ej ., BSA, caseína) distinto del antigeno predeterminado o de un antígeno estrechamente relacionado.
los anticuerpos aislados de la invención abarcan diversos isotipos de anticuerpos tales como IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsee, Igo, IgE. Tal como se utiliza erJ esta memoria, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (p. ej ., IgM o IgG1) que es codificado por genes de la región constante de la cadena pesada. los
anticuerpos pueden ser de longitud completa o pueden incluir sólo un fragmento de unión a antígeno tal como el anticuerpo de dominio constante y/o variable de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 'gAsec, IgD o IgE, o podrla consistir en un fragmento Fab, un fragmento F(ab'h y un fragmento Fv.
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales, monodonales, o una mezcla de anticuerpos polidonales y monodonales. Los anticuerpos pueden ser producidos por una diversidad de técnicas bien conocidas en la técnica. l os procedimientos para producir anticuerpos polidonales son bien conocidos. Por ejemplo, anticuerpos policlonales anti-PSMA son producidos por la administración de la proteína PSMA por vla subcutánea a conejos blancos New Zealand, que primero han sido sangrados para obtener suero pre-inmune. El PSMA se puede inyectar en un volumen total de 100 ¡JI por sitio en seis sitios diferentes, típicamente con uno o más ajustes. los conejos se sangraron luego dos semanas después de la primera inyección y se refOfZaron periódicamente con el mismo antígeno tres veces cada seis semanas. Una muestra de suero se recoge 10 días después de cada refuerzo. Los anticuerpos policlonales se recuperan del suero, preferiblemente por cromatografia de afinidad utilizando PSMA para capturar el anticuerpo. Este y otros procedimientos para producir anticuerpos ~iclonales se describen en Harlow E., et al., compiladores, AntibOOies: A Laboratory Manual (1988).
la producción de anticuerpos monodonales puede realizarse mediante técnicas que son bien conocidos en la técnica. la expresión -anticuerpo monoclonal-, tal como se utiliza aqul, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monocJonal exhibe una sola especificidad de unión y afinidad para un epltopo particular. El proceso de produccioo de anticuerpos monodonales implica obtener células somáticas inmunes con el potencial para producir anticuerpos, en particular, los linfocilos S, que han sido inmunizados previamente con el antigeno de interés in VNO o in vitro y que son adecuados para la fusión con una linea de mieloma de células S.
Linfocitos de mamífero típicamente se inmunizan mediante inmunización in VNO del animal (p. ej ., un ralón) con la proteína o el ~ipéptido deseado, p. ej ., con PSMA en la presente invención. Tales inmunizaciones se repiten según sea necesario a intervalos de hasta varias semanas para obtener un título suficiente de anticuerpos. Una vez inmunizados, los animales pueden ser utilizados como una fuente de linfocitos productores de anticuerpos. Tras el último refuerzo de antígenos, los animales se sacrifican y se separan las células del bazo. los linfocitos de ratoo dan un mayor porcentaje de fusiones estables con las líneas de mieloma de ratoo descritas en esta memoria. De estos, se prefiere el ratón BAlS/c. Sin embargo, también se pueden utilizar otras cepas de ralón, conejo, hámster, oveja y rana como huéspedes para preparar cél ulas productoras de anticuerpos. Véase; Goding (en Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2' ed., págs. 60-61, Orlando, Fla., Academic Press, 1986). En particular, se prefieren cepas de ratón que tengan genes de inmunoglobulina humanos insertados en el genoma (y que no pUeden producir inmunoglobulinas de ratón). Ejemplos incluyen las cepas de ratón HuMAb producidas por MedarexJGenPharm International, y las cepas XenoMouse producidas por Abgenix. Ratones de este tipo producen moléculas de inmunoglobulina totalmente humanas en respuesta a la inmunización.
Las células productoras de anticuerpos que están en la fase de plasmablasto se fusionan preferiblemente. l as células somáticas se pueden obtener de los ganglios linfátioos, bazos y sangre periférica de animales cebados con antrgeno, y las células linfáticas de elección dependen en gran medida de su utilidad emplrica en el sistema de fusión particular. Los linfocitos que secretan anticuerpos se fusionan entonces con células de mieloma de células B (ratón) o células transfonnadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciendo de este modo una linea inmortal de células secretoras de inmunoglobulina. las células fusionadas resultantes, o hibridomas, se cultivan y las colonias resultantes se rastrean en cuanto a la producción de los anticuerpos monodonales deseados. Colonias que producen este tipo de anticuerpos se clonan, y se cultivan in VNO o in vitre para producir grandes cantidades de anticuerpo. Una descripción de la base teórica y la metodologla práctica de fusionar estas células se recoge en Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975).
Alternativamente, células somáticas humanas capaces de producir anticuerpos, específicamente linfocitos S, son adecuadas para la fusión con líneas celulares de mieloma. Mientras que se pueden utilizar los linfocitos S de bazos, amígdalas o ganglios linfáticos de una biopsia de un individuo, se prefieren los linfocitos de sangre periférica S más fácilmente accesibles. l os linfocitos pueden derivarse de paCientes con carcinomas de próstata diagnosticados u otro cáncer que expresa PSMA Además, las células B humanas se puedoo inmortalizar directamoote por el virus Epstein-Barr (CoIe et aL, 1995, Monodonal Antibodies and Cancer Therapy, A1an R. liss, Inc., págs. 77-96). Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monodonales tales como la transfonnación viral u oncogénica de linfocitos B.
lineas celulares de mieloma, adecuadas para su uso en procedimientos de fusión productoras de hibridoma, son preferiblemente no productoras de anticuerpos, tienen alta eficacia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en determinados medios selectivos que soportan el crecimiento de los hibridomas
E1 0184957
deseados. Ejemplos de tales líneas celulares de mieloma que pueden utilizarse para la producción de líneas de células fusionadas induyen P3-X631Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1. Ag4.1, Sp2l0-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11X45-GTG 1.7, S194/5XXO Bul, todas derivadas de ratones; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F Y 48210 derivadas de ratas y U-266, GM1500-GRG2, lICR-lON-HMy2, UC729-6, todas derivadas de seres humanos (Goding, en Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 28 ed., págs. 65-66, Orlando, Florida, Academic Press., 1986; Campbett, en Monoclonal Antibody Technotogy, laboratory Techniques in Biochemistry and Motecular Biology Vol. 13, Burden y Van Knippenberg, comps. págs. 75-S3, Amsterdam, Elseview, 1984).
la fusión con células de mieloma de mamífero u otros participantes en la fusión capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular se efectúa mediante técnicas estándares y bien conocidas, por ejemplo, mediante el uso de polietilenglicol (-PEG-) u otros agentes de fusión (véase Milstein y Kohler, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976» .
En otras realizaciones, los anticuerpos pueden ser anticuerpos recombinantes. la expresión -anticuerpo recombinante-, tal como se utiliza en esta memoria, pretende incluir anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina de otras especies, anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de un banco de anticuerpos recombinante, combinatorio, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina a otras secuencias de AON.
Todavía en otras realizaciooes, los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos o humanizados. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión -anticuerpo quiméfico-se refiere a un anticuerpo que combina las regiones variables o hipervariables murinas con la región constante humana o regiones de entramado constante y variable. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión -anticuerpo humanizado-se refiere a un anticuerpo que conserva solamente las CORs de unión al antigeno del anticuerpo parental en asociación con regiones de entramado humanas (véase, Waldmann, 1991, Science 252:1657). Se espera que anticuerpos quiméricos o humanizados de este tipo, que conservan la especificidad de unión del anticuerpo murino, tengan una inmunogenicidad reducida cuando se administran in vivo para aplicaciones de diagnóstico, profilácticas o terapéuticas de acuerdo oon la invención.
De acuerdo con una realización alternativa, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden modificarse para estar en forma de un anticuerpo biespecifico, o un anticuerpo multiespecifico. la expresión -anticuerpo biespecifico-pretende incluir cualquier agente, p. ej., una proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tiene dos especificidades de unión diferentes que se unen a, o interactúan con (a) un antígeno de la superficie celular y (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora. la expresión -anticuerpo multiespecífico-pretende incluir cualquier agente, p. ej ., una protelna, péptido o complejo de de protelna o péptido, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes que se unen a, o interactúan con (a) un antlgeno de la superficie celular, (b) un receptor Fc sobre la superficie de una célula efectora y (e) al menos otro componente. Por consiguiente, la invención incluye, pero no se limita a anticuerpos bi-específicos, tri-específicos, tetra-específioos, y otros anticuerpos multi-específicos que se dirigen contra antlgenos de la superficie celular tales como PSMA, y a receptores Fe en las células efectoras. la expresión -anticuerpos biespecificos-induye, además, diacuerpos. los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecificos, en los que los dominios Vf', y VL se expresan en una única cadena polipeptídico, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para pemlitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando con ello a emparejarse a los dominios con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antlgeno (véase, p. ej., HoIliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-644S; Poijak, R J., st al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Un anticuerpo bi-específico puede formarse de una región de unión a antigeno específica para el dominio extracelular de PSMA y una regiÓfl de unión a antígeno específica para una célula efectora que tiene actividad tumoricida o inhibidora de tumores. las dos regiones de unión a antrgeno del anticuerpo bi-especifico están químicamente enlazadas o pueden ser expresadas por una célula modificada por ingeniería genética para producir el anticuerpo bi-específico. (Véase, en general, Fanger el al., 1995 Drug News & Psrspec. 8(3): 133-137). Células efectoras adecuadas que tienen actividad tumoricida incluyen, pero no se limitan a células T citotóxicas (principalmente células COS'), células asesinas naturales, etc. Una cantidad eficaz de un anticuerpo bi-especifico de acuerdo con la invención se administra a un paciente con cáncer de próstata y el anticuerpo bi-específioo mata y/o inhibe la proliferación de las células malignas tras la localización en los sitios de tumores primarios o metastásicos que portan PSMA.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanos. la expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en esta memoria, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. los anticuerpos humanos de la invención pueden
induir residuos aminoácidos no codificados por secuerJcias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej ., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión ·anticuerpo humano·, tal como se utiliza erJ esta memoria, no pretende incluir anticuerpos erJ los que secuerJcias de la CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamíferos tal como un ratón han sido injertadas erJ secuencias de erJtramado humano (a los que se alude en esta memoria como -anticuerpos humanizados·). Anticuerpos humanos dirigidos contra PSMA se gerJeran utilizando ratones transgénicos portadores de partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema de ratón .
Anticuerpos monoclonales completamente humanos también se pueden preparar mediante la inmunización de ratones transgénicos para graneles porciones de loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Véase,
p. ej ., las paterJtes de EE.UU. 5.591.669, 5.598.369, 5.545.806, 5.545.807, 6.150.584, Y refererJcias citadas en las mismas. Estos animales se han modificado gerJéticamente de fonna que existe una deleción funcional erJ la producción de anticuerpos erJdógerJos (p. ej ., murinos). l os animales se modifican adicionalmente para que conterJgan toda o una parte del locus del gerJ de inmunoglobulina de la línea gemlinal humana, de manera que la inmunización de estos animales resulta en la producción de anticuerpos completamente humanos contra el antígeno de interés. Después de la inmunización de estos ratones (p. ej., XenoMouse (AbgerJix), ratones HuMAb (MedarexJGerJPhann» , los anticuerpos monocJonales se preparan de acuerdo con la tecnologla de hibridoma estándar. Estos anticuerpos monocJonales tienerJ secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina humana y, por lo tanto, no provocará respuestas de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) cuando se administra a seres humanos.
Preferiblemente, los ratones son de 6-16 semanas de edad tras la primera inmunización. Por ejemplo, una preparación purificada o erJriquecida de antlgeno PSMA (p. ej ., PSMA recombinante o células que expresan PSMA) se utiliza para inmunizar a los ratones por vía intraperitoneal (IP), aunque también son posibles otras vías de inmunización conocidas para un experto nonnal erJ la técnica. AntigerJo PSMA es inyectado en combinación con un adyuvante, tal como adyuvante completo de Freund, y preferiblemente la inyección inicial es seguida por inmunizaciones de refuerzo con antlgeno en un adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund. l a respuesta inmune se vigila durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas por, por ejemplo, mediante sangrados retro-orbitales. El plasma se tamiza mediante ElISA (tal como se describe a continuación), y para las fusiones se utilizan los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana antiPSMA. los ratones se estimulan por via intravenosa con anUgeno 3 dlas antes del sacrificio y la extirpación del bazo.
El anticuerpo aislado o fragmerJto de unión a antígeno del mismo se selecciona por su capacidad para unirse a células vivas que expresan PSMA. Con el fin de demostrar la unión de anticuerpos monocJonales a células vivas que expresan el PSMA, se puede utilizar la citometría de flujo. Por ejemplo, Hneas celulares que expresan PSMA (cultivadas bajo condiciones de crecimiento estándares) o células de cáncer de próstata que expresan PSMA se mezclan con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene Tween 80 al 0,1% y suero de ratón al 20%, y se incuban a 3rC durante 1 hora. Después del lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo secundario anti-lgG humana marcado con fluoresceína (si se utilizaron anticuerpos anti-PSMA humanos) bajo las mismas condiciones que la tinción de anticuerpos primarios. l as muestras pueden ser analizadas mediante un instrumento dasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), utilizando luz y propiedades de dispersión lateral para sincronizar células individuales. Se puede utilizar un ensayo alternativo de microscopia de fiuorescencia (además de o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. las células se pueden teñir exactamente como se describió anterionnente y se pueden examinar mediante microscopia de fluorescerJcia. Este método pemlite la visualización de células individuales, pero puede haber disminuido la sensibilidad dependierJdo de la densidad del antrgeno.
la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a las células vivas que expresan PSMA puede inhibir el crecimierJto de las células o mediar erJ la citolisis de las células. la citolisis puede ser mediada por el complemento o puede ser mediada por células efectoras. En una realización preferida, la citolisis se lleva a cabo erJ un organismo vivo, preferiblemente un mamífero, y la célula viva es una célula tumoral. Ejemplos de tumores que pueden ser objetivo de los anticuerpos de la invención induyen cualquier tumor que expresa PSMA tal como, por ejemplo, próstata, vejiga, páncreas, pulmón, colon, riñón, melanomas y sarcomas. En una realización preferida, la célula tumoral es una célula de cancer de próstata.
El erJsayo de actividad citolítica de anticuerpos in vitro mediante el erJsayo de liberación de cromo puede proporcionar un rastreo inicial antes del erJsayo en modelos in vivo. Este ensayo puede llevarse a cabo utilizando ensayos de liberación de cromo estándares. En síntesis, células polimorfonucleares (PMN) u otras células efectoras, procedentes de donantes sanos pueden ser purificadas mediante cerJtrifugaciÓll por gradiente de densidad Ficoll Hypaque, seguida de la lisis de los eritrocitos contaminantes. PMNs lavadas pueden ser suspendidas erJ RPMI suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% y se mezclan con células marcadas con s' Cr que
E101849S7
expresan PSMA, a diversas relaciones de células efectoras a células tumorales (células efectoras:células tumorales). IgGs anti-PSMA purificadas se pueden añadir entonces a diversas concentraciones. Una IgG irrelevante se puede utilizar como control negativo. los ensayos pueden llevarse a cabo durante 0-120 minutos a 3rc. las muestras pueden ensayarse para la citelisis midiendo la liberación de SI Cr en el sobrenadante del cultivo.
5 Anticuerpos monoclonales anti-PSMA también se pueden someter a ensayo en combinaciones entre sí para determinar si la citelisis se ha potenciado con múltiples anticuerpos monodonales.
los anticuerpos que se unen a PSMA también pueden ser sometidos a ensayo en un modelo in vivo (p. ej., en ratones) para detem\inar su eficacia en la mediación de la citolisis y el exterminio de células que expresan PSMA, p. ej ., células tumorales. Estos anticuerpos se pueden seleccionar, por ejemplo, en base a los siguientes criterios, que
10 no pretenden ser exclusivos: 1) la unión a las células vivas que expresan PSMA; 2) alta afinidad de unión a PSMA; 3) unión a un epítopo únioo en PSMA (para eliminar la posibilidad de que los anticuerpos con actividades complementarias, cuando se utilizan en combinación, compitan poi'" la unión al mismo epítopo);
15 4) la opsonización de células que expresan PSMA; 5) la mediación de la inhibición del crecimiento, fagocitosis ylo el exterminio de células que expresan PSMA en presencia de células efectoras; 6) modulación (inhibición o mejora) de las actividades de NAALADasa, felato hidrelasa, dipeptidil peptidasa IV ylo y-glutamil hidrolasa;
20 7) inhibición del crecimiento, detención ylo citotoxicidad del ciclo celular en ausencia de células efectoras; 8) internalización de PSMA; 9) unión a un epítopo oonfonnacional en PSMA; 10) reactividad cruzada mínima con células o tejidos que no expresan PSMA; y 11) unión preferencial a las formas diméficas de PSMA en lugar de formas monoméficas de PSMA.
25 Anticuerpos preferidos de la invención cumplen uno o mas, y preferiblemente todos estos criterios. En una realización particular, los anticuerpos se utilizan en combinación, p. ej., como una composición farmacéutica que comprende dos o mas diferentes anticuerpos anti-PSMA o fragmentos de unión de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PSMA que tienen diferentes actividades, pero complementarias, se pueden combinar en una única terapia para conseguir un efecto terapéutico o de diagnóstico deseado. Una ilustración de esto seria una
30 composición que contuviera un anticuerpo anti-PSMA que media en el exterminio altamente eficaz de células diana en presencia de células efectoras, en combinación con otro anticuerpo anti-PSMA que inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA.
El anticuerpo o fragmento de unión a antigeno del mismo se puede unir a un epítopo conformacional dentro del dominio extracelular de la molécula de PSMA. Para detem\inar si los anticuerpos anti-PSMA humanos se unen a 35 epítopos conformacionales, cada uno de los anticuerpos se puede testar en ensayos que utilizan proteína nativa (p. ej ., inmunoprecipitación no desnaturalizante, analisis citométrico de flujo de unión a la superficie celular) y la proteina desnaturalizada (p. ej., transferencia Western, inmunoprecipitación de proteínas desnaturalizadas). Una comparación de los resultados indicará si los anticuerpos se unen a epítopos conformacionales. los anticuerpos que se unen a proteínas nativas pero no a proteínas desnaturalizadas son aquellos anticuerpos que se unen a epitopos
40 oonfonnacionales.
Para detem\inar si los anticuerpos anti-PSMA humanos seleccionados se unen preferentemente (es decir, de forma selectiva ylo específica) a un dímero de PSMA, cada uno de los anticuerpos se puede testar en ensayos (p. ej., inmunoprecipitaciÓll seguida de transferencia Western) utilizando proteina PSMA dimérica nativa y proteína PSMA monoméfica disociada. Una comparación de los resultados indicará si los anticuerpos se unen preferentemente al
45 dímero o al monómero. la invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente al dímero de PSMA, pero no a las proteínas PSMA monoméricas.
Anticuerpos preferidos induyen anticuerpos que inhiben competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su epitopo diana en PSMA. Para determinar la inhibición competitiva, se puede emplear una diversidad de ensayos conocidos para un experto normal en la técnica. Por ejemplo, los ensayos de competencia cruzada 50 recogidos en los Ejemplos 4 y 21 se pueden utilizar para determinar si un anticuerpo inhibe competitivamente la unión a PSMA por parte de otro anticuerpo. Estos ejemplos proporcionan métodos basados en células que emplean citometria de flujo o análisis de unión en fase sólida. También se pueden utilizar otros ensayos que evalúan la capacidad de los anticuerpos de competir de forma cruzada por moléculas de PSMA que no se expresan en la superficie de las células, en fase sólida o en fase de disolución. Estos ensayos utilizan preferiblemente los
55 multímeros de PSMA descritos en esta memoria.
Determinados anticuerpos preferidos inhiben competitivamente la unión específica de un segundo anticuerpo a su eprtopo diana en PSMA en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 95% o 99%. la inhibición se puede evaluar a varias relaciones molares o relaciones de masa; por ejemplo, pueden llevarse a cabo experimentos de unión competitiva con un exceso molar 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 7 veces, 10 veces o más mayor del primer anticuerpo frente al segundo anticuerpo.
Otros anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos que especrficamente (es decir, selectivamente) se unen a un epltopo en PSMA definida por un segundo anticuerpo. Para determinar el epítopo se pueden utilizar métodos estándares de mapeo de epítopos conocidos en la técnica. Por ejemplo, fragmentos (péptidos) de antígeno PSMA (preferiblemente péptidos sintéticos) que se unen el segundo anticuerpo se pueden utilizar para detenninar si un anticuerpo candidato se une al mismo epítopo. Para epítopos lineales, se sintetizan péptidos de solapamiento de una longitud definida (p. ej., 8 o más aminoácidos). Los péptidos preferiblemente se compensan con 1 aminoácido, de manera que se prepara una serie de péptidos que cubren cada 8 fragmentos de aminoácidos de la secuencia de proteínas PSMA. Menos péptidos se pueden preparar utilizando compensaciones más grandes, p. ej ., de 2 ó 3 aminoacidos. Además, se pueden sintetizar péplidos más largos (p. ej., 9-, 10-u 11-meros). La unión de péplidos a anticuerpos se puede detenninar utilizando metodologras estandares, incluyendo resonancia de plasmón de superficie (BIACORE; véase el Ejemplo 22) y los ensayos ElISA. Para el examen de epítopos conformacionales, se pueden utilizar fragmentos de PSMA mayores. Se han descrito y se pueden utilizar otros métodos que utilizan la espectrometrra de masas para definir los epilopos confonnacionales (véase, p. ej ., Baerga-Ortiz et al, Protein Science 11 :1300-1308, 2002 y referencias allJ citadas). Todavia otros métodos para la determinación de epítopos se proporcionan en las obras de referencia de laboratorio estándares tales como la Unidad 6.8 (-Phage Display Seleclion and Analysis of B-cell Epitopes") y la Unidad 9.8 ("Identification of Antigenic Detenninanls Using Synthetic Peptide Combinatorial libraries-) de Cummt Protoco/s in Immunology, Coligan et al., comps., John Wiley & Sonso Los epitopos se pueden confirmar mediante la introducción de mutaciones o deleciones puntuales en un epítopo conocido, y luego el ensayo de la unión con uno o mas anticuerpos para detenninar qué mutaciones reducen la unión de los anticuerpos.
En una realización de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a anUgeno del mismo se une y se internaliza con PSMA expresado en células. El mecanismo por el cual el anticuerpo o fragmento de unión a antrgeno del mismo se interioriza con el anUgeno de membrana prostático específico no es crítico para la práctica de la presente invención. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo puede inducir la internalización de PSMA. Alternativamente, la internalización del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede ser el resultado de una internalización rutinaria de PSMA. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede utilizar en una forma no modificada, solo o en combinación con otras composiciones. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo puede unirse a una sustancia eficaz para exterminar las células tras la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo a antlgeno de membrana específico de la próstata y tras la internalización del agente biológico con el antigeno de membrana prostático específico.
Los anticuerpos PSMA humanos de la presente invención se unen específicamente a PSMA de la superficie celular y/o rsPSMA con afinidad nanomolar. los anticuerpos PSMA humanos de la presente invención tienen afinidades de unión de aproximadamente 1 X 10--9 M o menos, preferiblemente de aproximadamente 1 X 10.10 M o menos, más preferiblemente 1 X 10.11 M o menos. En una realización particular, la afinidad de unión es menor que aproximadamente 5 X 10.10 M.
Un anticuerpo puede estar enlazado a un marcador detectable, un agente antitumoral o un inmunornodulador. Agentes antitumorales pueden incluir agentes citotóxicos y agentes que actúan sobre la neovasculatura tumoral. Marcadores detectables incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos o fluOl'"escentes. Los agentes citotóxicos incluyen radionucleidos citotóxicos, toxinas qurmicas y toxinas proteicas.
El radionucleido citotóxico o isótopo radioterapéutico preferiblemente es un isótopo emisOl" alfa tal como 22sAc, 211 A, 212 8i, 213 8i, 212pb, 224Ra o Z!3Ra. Alternativamente, el radionucleido citotóxico puede ser un isótopo emisor beta tal como 166Rh , 166Rh, 177lu, 9Oy, 13 \ 67CU, l\4Cu, lS3Sm o 16t1 Ho. Además, el radionúclido citotóxico puede emitir Auger y electrones de baja energra y puede incluir los isótopos 1251, 1231o 17Br.
Toxinas qurmicas o agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen miembros de la familia enediina de moléculas tales como caliqueamicina y esperamicina. Toxinas químicas también se pueden tomar del grupo que consiste en melotrexato, doxorubicina, melfalán, cJorambucilo, ARA-C, vindesina, mitomicina e , cis-platino, etopósido, bleomicina y 5-fluorouracilo. Otros agentes antineoplásicos que se pueden conjugar a los anticuerpos anti-PSMA de la presente invención incluyen dolastatinas (Patentes de EE.UU. N°s. 6.034.065 Y 6.239.104) Y derivados de las mismas. De interés particular es dolastatina 10 (éster metílico de dolavalina-valina-dolaisoleuina-dolaproínadolafenina) y los derivados de auristatina PHE (éster metílico de dolaisoieuina-dolaproína-fenilalanina) (Pettit, G.R.
et al., Anticancer Drug Des. 13(4):243-277, 1998; Woyke, T. et al. , Antimicrob. Agents Ghemother. 45(12):35803584, 2001), Y aurastatina E y similares. Las toxinas que son menos preferidas en las composiciones y métodos de la invención induyen lectinas venenosas, toxinas de plantas tales como las toxinas ricina, abrina, modecina, botulina y difteria. Por supuesto, combinaciones de las diversas toxinas también se podrian acoplar a una moiécula de anticuerpo, admitiendo con ello una citotoxicidad variable. Otros agentes quimioterapéuticos son conocidos por los expertos en la técnica.
Formas conjugados a toxina de los anticuerpos PSMA de la presente invención median en el exterminio celular específico de células que expresan PSMA a concentraciones picomolares. l os anticuerpos PSMA conjugados a toxina de la presente invención exhiben una Glso a concentraciones de menos de aproximadamente 1 X 10.10 M preferiblemente menos de aproximadamente 1 X 10.11 M. más preferiblemente menos de aproximadamente 1 X 10·Ji
M. En una realización particular una Glso se alcanza a una concentración de menos de aproximadamente 1,5 X 10.11
M.
Agentes que actúan sobre la vasculatura del tumor puede incluir agentes de unión a tubulina, tales como combrestatina A4 (Griggs et al. , Lancet Onca/. 2:82, 2(01), angiostatina y endostatina (revisado en Rosen, Oncologist 5:20, 2(00) y la proterna inducible por interteron 10 (patente de EE.UU. nO 5.994.292). También se contempla un cierto número de agentes antiangiogérJicos actualmente en ensayos clínicos. Agentes actualmente en ensayos clínicos incluyen: 2ME2, angiostatina, angiozima, Anti-VEGF RhuMAb, Apra (CT-2584), avicina, benefin, BMS275291 , carboxiamidotriazol, CC4047, CC5013, CC7085, COC801, CGP-41251 (PKC 412), CM101, profármaco Combretastatina A-4, EMO 121974, endostatina, navopiridol, genisteína (GCP), extracto de té verde, IM-862, ImmTher, interferón alfa, interleucina-12, Iressa (Z01839), marimastat, metastat (CoI-3), neovastat, octreotida, paclita)(el, penicilamina, Photofrin, Photopoint, PI-88, Prinomastat (AG-3340), PTK787 (ZK22584), R0317453, Solimastat, escualamina, SU 101 , SU 5416, SU-6668, Suradista (FCE 26644), Suramin (Metaret), tetratiomolibdato, talidomida, TNP-470 y Vitaxin. Agentes antiangiogénioos adicionales se describen por Kerbel, J. Glin. Oncol. 19(18s):455-51s, 2001. Inmunomoduladores adecuados para la conjugación con anticuerpos anti-PSMA incluyen interferón 0, inteñerón V y factor de necrosis tumoral alfa (TNFo).
Está previsto que el acoplamiento de una o más moléculas de toxina al anticuerpo anti-PSMA incluya muchos mecanismos químicos, por ejemplo de unión oovalente, unión por afinidad, intercalación, unión de coordenadas y complejación. Los compuestos tóxicos utilizados para preparar las inmunotoxinas anti-PSMA se unen a los anticuerpos o fragmentos de unión a PSMA de los mismos mediante protocolos estándares oonocidos en la técnica.
La unión covalente se puede lograr ya sea por condensación directa de cadenas laterales existentes o por la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas de protelnas a otras proternas, péptidos o funciones amina, etc. Por ejemplo, la bibliografía está repleta de agentes de acoplamiento tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilen-diaminas. Esta lista no pretende ser exhaustiva de los diversos agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino, más bien, es ilustrativa de los agentes de aooplamiento más comunes.
En realizaciones preferidas, se contempla que se puede desear derivatizar primero el anticuerpo, y luego fijar el componente toxina al producto derivatizado. Agentes de reticulación adecuados para su uso de esta manera incluyen, por ejemplo, SPOP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato) y SMPT, 4-succinimidil-oxicarbonil-metil-(2piridilditio)tolueno.
Además, toxinas proteicas pueden fusionarse con el anticuerpo anti-PSMA o fragmento de unión a PSMA por métodos genéticos para fonnar una protelna de fusión inmunotoxina hlbrida. Para hacer una proteína de fusión inmunotoxina de acuerdo con la invención, se genera una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-PSMA, un fragmento de un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-PSMA de cadena sencilla o una 5ubunidad de un anticuerpo anti-PSMA enlazado a una toxina proteica. Proteínas de fusión de este tipo contienen al menos un agente de fijación de objetivo (p. ej., subunidad de anticuerpo anti-PSMA) y una toxina de la invención, operativamente unida. Las proternas de fusión también pueden incluir secuencias adicionales de péptidos tales como espaciadores de péptidos que se fijan operativamente al agente de fijación de objetivo y al compuesto toxina, siempre y cuando estas secuencias adicionales no afecten sensiblemente a las actividades de fijación de objetivo o de toxina de la proterna de fusión . Las dos proternas se pueden fijar mediante un enlazador o espaciador de péptidos tales como un espaciador de péptido glicina-seTina, o una bisagra de péptido como es bien conocido en la técnica. Asr, por ejemplo, el extremo e de un anticuerpo anti-PSMA o fragmento del mismo puede fusionarse al extremo N-tem1 inal de la molécula de toxina proteica para formar una inmunotoxina que conserva las propiedades de uniOn del anticuerpo anti-PSMA. otras disposiciones de fusión serén conocidas por un experto normal en la técnica.
Para expresar la inmunotoxina de fusión, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se inserta erJ un vector de expresión de acuerdo con métodos estándares, para la expresión estable de la protefna de fusión, preferiblemente erJ células de mamífero tales como células CHO. la proteína de fusión puede ser aislada y purificada a partir de las células o sobrerJadante de cultivo utilizando metodología estándar, tal como una columna de afinidad de PSMA.
los radionucleidos estén acoplados tipicamerJte a un anticuerpo mediante queladón. Por ejemplo, erJ el caso de radionucleidos metálicos, se utiliza comúnmerJte un quelante bifuncional para erJlazar el isótopo al anticuerpo u otra proteína de interés. Trpicamente, el agerJte quelante se fija primero al anticuerpo, y el conjugado agerJte quelanteanticuerpo se pone erJ contacto con el radioisótopo metálico. Se ha desarrollado para este fin un cierto número de quelantes bifuncionales, induYerJdo la serie del ácido dietilerJtriamina-perJtaacético (DTPA) de los aminoácidos descritos en las paterJtes de EE.UU. 5.124.471, 5.286.850 Y 5.434.287. Como otro ejemplo, agentes quelantes bifundonales basados en áddos hidroxámicos se describen erJ la patente de EE.UU. 5.756.825. Otro ejemplo es el agerJte quelante derJominado p-SCN-Bz-HEHA (ácido 1,4,7,10,13, 16-hexaazacicJo-octadecano-N,N',N" ,N'" ,N-,N"'"hexaacélico) (Deal et al., J. Med. Chem. 42: 2988, 1999), que es un agente quelanle eficaz de radiometales lal como 225Ac. Todavia otro ejemplo es DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano N,N',N",N'"-tetraacético), que es un agerJte quelante bifuncional (véase McDevitt et al, ScierJce 294: 1537-1540, 2001) que se puede utilizar erJ un método de dos etapas para el marcaje, seguido de conjugación.
En otro aspecto, la invención propol'"ciona composiciones que comprenderJ un anticuerpo aislado, un anticuerpo derivatizado o erJlazado a otros restos funcionales, o un fragmento de unión a antigeno del mismo o una combinación de uno o más de los anticuerpos mencionados anteriormerJl e o fragmerJtos de unión a antlgeno de los mismos. las composiciones incluyen un soporte, excipierJte o estabilizador fisiológicamente o farmacéuticamente aceptable, mezclado con el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigerJo del mismo. En una realización preferida, las composiciones incluyen una combinación de múltiples (por ejemplo, dos o más) anticuerpos aislados o porciones de unión a antlgeno de los mismos de la inverJción. Preferiblemente, cacla uno de los anticuerpos o porciones de unión a antigerJO de los mismos de la composición se une a un epftopo conformacional distinto de PSMA. En una realización, se utilizan anticuerpos anti-PSMA que tierJen actividades complementarias erJ combinación, p. ej., como una composición farmacéutica, que comprende dos o más anticuerpos anti-PSMA. Por ejemplo, un anticuerpo que media erJ la citolisis altamerJte eficaz de células diana en presencia de células efectoras puede combinarse con otro anticuerpo que inhibe el crecimierJto de células que expresan PSMA. Tal como se utiliza en esta memoria, "célula diana" ha de dar a entender cualquier célula indeseable en un sujeto (p. ej., un ser humano
o animal) que puede ser el blanco de una composición de la invención. En realizaciones preferidas, la célula diana es una célula que expresa o sobre-expresa PSMA. Células que expresan PSMA típicamente incluyen células tumorales tales como células tumorales de próstata, vejiga, páncreas, pulmón, riñón, colon, melanornas y sarcomas.
Composiciones farmacéuticas de la inverJción también puederJ administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la preserJte invención con al menos un agente anti-tumor, inmunomodulador, agente inmunoestimulador u otra terapia convencional. El agente puede estar unido o conjugado a o puede formarse como una molécula de fusión recombinante con los anticuerpos PSMA de la preserJte inverJción para la fijación como objetivo dirigida del agerJte a las células que expresan PSMA.
los anticuerpos PSMA de la presente invención se pueden utilizar como un resto de fijación como objetivo para el suministro de virus selectivo para la replicación a células que expresan PSMA para la terapia tumoral. Virus competerJtes para la replicación, tales como el mutante dl1520 del adenovirus que fija como objetivo la via p53, ONYX-015, exterminan selectivamente células tumorales (Biederer, C. et al., J. Mol. Med. 80(3):163-175, 2002).
Tal como se utiliza en esta memoria, "soporte farmacéulicamente aceptable" o "soporte fisiológicamente aceptable" incluye cualquiera y todas las sales, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibaclerianos y antifúngicos, agerJtes retardantes isotónicos y de absorción, y similares que son fisiológicamerJte compatibles. Preferiblemente, el soporte es adecuado para administración inlraverJosa, inlramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la via de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, puede estar revestido en un material para proteger al compuesto frerJte a la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puederJ inactivar el compuesto.
Cuando se administran, las preparaciones farmacéuticas de la invención se aplican en cantidades farmacéuticamerJte aceptables y en composiciones farmacéuticamerJte aceptables. la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Preparaciones de este tipo pueden contener rutinariamente sales, agentes tampón, conservantes, soportes compatibles y, opcionalmerJte, otros agentes terapéuticos tales como agerJtes
potenciadores inmunes suplementarios, incluyendo adyuvantes, quimioquinas y citoquinas. Cuando se utilizan en medicina, las sales deberian ser fannacéuticamente aceptables, pero sales no farmacéuticamente aceptables pueden utilizarse convenientemente para preparar sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y no están excluidas del alcance de la invención.
Una sal conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, p. ej., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de sales de este tipo incluyen sales por adición de ácidos y sales por adición de bases. Sales por adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánioos no tóxicos tales como clorhldrioo, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhldrico, fosforoso y similares, asi como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono-y di-carboxilioos, ácidos alcanoioos sustituidos coo fenilo, ácidos hidroxi-alcanoioos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifátioos y aromáticos, y similares. Sales por adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas tales como N,N'dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, coiina, dietanolamina, etilendiamina, procaína, y similares.
Una composición de anticuerpo anti-PSMA se puede combinar, si se desea, con un soporte farmacéuticamente aceptable. La expresión ~soporte farmacéuticamente aceptable~, según se utiliza en esta memoria, significa una o más cargas sólidas o líquidas, diluyentes o sustancias encapsulantes compatibles que son adecuadas para la administración a un ser humano. El término ·soporte~ designa un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. los componentes de las composiciooes farmacéuticas también son capaces de ser co-mezclados con las moléculas de la presente invención, y entre si, de manera que no haya interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Las composiciones fannacéuticas pueden contener agentes tampón adecuados, incluyendo: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfÓfico en una sal.
Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos y timerosal.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de poner el agente activo en asociación con un soporte que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e intimamente el compuesto activo en asociación con un soporte líquido, un soporte sólido finamente dividido, o ambos, y luego. si es necesario, conformando el producto.
Composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa o no acuosa estéril de anticuerpos anti-PSMA, que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación puede fonnularse de acuerdo con métodos conocidos utilizando agentes dispersantes o humedanles adecuados y agentes de suspensión. la preparación inyectable estéril puede ser también una disoiución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico. por ejemplo. como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los soportes y disoiventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un disoivente o medio de suspenSión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono-o di-glicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tales como ácido oIeico se pueden utilizar en la preparación de inyectables. Formulaciooes adecuadas de soporte para administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc. se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing ca., Easton, PA.
Los compuestos activos pueden prepararse con soportes que protegerán el compuesto frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro miaoencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biooompatibles tales como etilenoacetato de vinilo, polianhidridos, ácido poIiglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poIiláctico. Muchos métodos para la preparación de formulaciones de este tipo están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sustained and Controlled ReJease Drug Del;very Systems, J.R. Robinsoo , comp., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Los agentes terapéuticos de la invención pueden administrarse mediante cualquier vía convencional, induyendo inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. La administración puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, intralumoral o transdérmica. Cuando se utilizan anticuerpos
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terapéuticamente, vlas preferidas de administración incluyen intravenosa y por aerosol pulmonar. Técnicas para preparar sistemas de suministro de aerosol que contienen anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Generalmente, estos sistemas deberlan utilizar oomponentes que no deterioren significativamente las propiedades biológicas de los anticuerpos, tales como la capacidad de unión al paratopo (véase, por ejemplo, Sciarra y Cutie, ~Aerosols~, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 1Ba edición, 1990, págs. 1694-1712). los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los diversos parámetros y condiciones para producir aerosoles de anticuerpos, sin recurrir a una experimentación excesiva.
las composiciones de la invención se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" es aquella cantidad de una composición de anticuerpo anti-PSMA que sola o junto con dosis adicionales, produce la respuesta deseada,
p. ej ., trata un tumor maligno en un sujeto. Esto puede implicar sólo ralentizar temporalmente el progreso de la enfermedad, aunque más preferiblemente, implica la detención del progreso de la enfennedad de forma permanente. Esto puede ser vigilado por métodos rutinarios. la respuesta deseada al tralamiento de la enfermedad
o afección también puede ser retrasar el brote o incluso prevenir el brote de la enfemledad o afección.
Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la afección particular que esté siendo tratada, la gravedad de la afección, los parámetros individuales del paciente, induyendo edad, condición físíca, tamaño y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), la via específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y experiencia del profesional de la salud. Estos factores son bien conocidos por los expertos nonnales en la técnica y pueden ser abordados con no más de una experimentación rutinaria . Se prefiere generalmente utilizar una dosis máxima de los componentes individuales de los mismos o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con el juicio médioo. Se entenderá por los expertos en la técnica, sin embargo, que un paciente puede insistir en una dosis más baja o una dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o virtualmente por cualesquiera otras razones.
las composiciones farmacéuticas utilizadas en los métodos precedentes son preferiblemente estériles y contienen una cantidad eficaz de anticuerpos anti-PSMA para producir la respuesta deseada en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente. la respuesta puede medirse, por ejemplo, detenninando los efectos fisiológicos de la composición de anticuerpo anti-PSMA tal como la regresión de un tumor o la disminución de los síntomas de la enfemledad. otros ensayos serán conocidos por un experto normal en la técnica y pueden emplearse para medir el nivel de la respuesta .
las dosis de anticuerpos anti-PSMA administradas a un sujeto pueden elegirse de acuerdo con diferentes parámetros, en particular de acuerdo con el modo de administración utilizado y el estado del sujeto. otros factores induyen el periodo de tratamiento deseado. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a las dosis iniciales aplicadas, se pueden emplear dosis más altas (o dosis efectivamente mayores mediante una via de suministro diferente, más localizada) en la medida que permita la tolerancia del paciente.
En general, las dosis pueden oscilar entre aproximadamente 10 ~g1kg Y aproximadamente 100.000 ~g1kg. Sobre la base de la compoSición, la dosis se puede suministrar de forma continua tal como mediante una bomba continua, o a intervalos periódioos. Intervalos de tiempo deseados de dosis múltiples de una composición particular pueden determinarse sin una experimentación excesiva por un experto en la técnica. otros protocolos para la administración de composiciones de anticuerpos anti-PSMA serán conocidos por un experto normal en la técnica, en donde la cantidad de dosis, el programa de administración, los sitios de administración, el modo de administración y similares varían de lo anterior.
En general, dosis de radionucleidos suministradas por los anticuerpos anti-PSMA de la invención pueden oscilar entre aproximadamente 0,01 mCilkg y aproximadamente 10 mCilkg. Preferiblemente, la dosis de radionucleidos oscila entre aproximadamente 0,1 mCiJkg y aproximadamente 1,0 mCilkg. la dosis óptima de un isólopo dado puede determinarse empíricamente por experimentos de titulación rutinarios simples bien conocidos por un experto ordinario en la técnica.
la administración de composiciones de anticuerpos anti-PSMA de mamíferos distintos de seres humanos, p. ej., para fines de ensayo o fines terapéuticos veterinarios, se lleva a cabo sustancialmente bajo las mismas condiciones que se describen anteriormente.
las composiciones (anticuerpos contra PSMA y derivados/conjugados de los mismos) de la presente invención tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, p. ej., in vitro o ex VNO , o en un sujeto, p. ej., in VNO, para tratar, prevenir o diagnosticar una diversidad de trastornos. Tal como se utiliza en esta memoria, el término ~sujeto" pretende incluir seres humanos y
animales no humanos. Sujetos preferidos incluyen un paciente humano que tiene un trastorno caracterizado por la expresión, tipicamente expresión aberrante (p. ej., sobre-expresión) de PSMA.
Un método para detectar células cancerosas o porciones de las mismas en una muestra biológica (p. ej., muestras histológicas o citológicas, biopsias y similares), en particular para distinguir tumores malignos de tejidos normales y tumores no malignos, implica proporcionar un anticuerpo o un fragmento de unión de unión a anUgeno del mismo, sonda, o ligando, que se une a un dominio extracelular de PSMA de tales células, p. ej., un anticuerpo anti-PSMA. El anticuerpo anti-PSMA se une a un marcador que permite la detección de las células o poi'"ciones de las mismas (p. ej., PSMA o fragmentos del mismo liberados de tales células cancerosas) tras la unión del anticuerpo anti-PSMA a las células o porciones de las mismas. La muestra biológica se pone en contacto con el anticuerpo anti-PSMA marcado en condiciooes eficaces para pemlitir la unión del anticuerpo anti-PSMA al dominio extracelular de PSMA de cualquiera de las células o porciooes de las mismas en la muestra biológica. La presencia de cualesquiera células o porciooes de las mismas en la muestra biológica se detecta mediante la detección del marcador. En una forma preferida, el contacto entre el anticuerpo anti-PSMA y la muestra biológica se lleva a cabo en un mamífero vivo e implica administrar el anticuerpo anti-PSMA al mamífero en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-PSMA a PSMA de cualquiera de las células o porciones de los mismos en la muestra biológica. Una vez más, una administración de este tipo puede llevarse a cabo por cualquier método adecuado conocido por un experto normal en la técnica.
Además, los anticuerpos anti-PSMA de la presente invención se pueden utilizar en técnicas de inmunofluorescencia para examinar muestras de tejido humano, células y de fluido corporal. En un protocolo típico, cortes que contienen secciones de criostato de muestras de biopsia de tejido congeladas, no fijadas o frotis citológicos se secan al aire, se fijan con formalina o acetona y se incuban con la preparación de anticuerpo monodonal en una cámara humidificada a temperatura ambiente. los cortes se lavan después y se incuban adicionalmente con una preparación de un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo monodooal, habitualmente algún tipo de inmunoglobulina antiratón si los anticuerpos monodonales utilizados se derivan de la fusión de un linfocito de bazo de ratón y una línea celular de mieloma de ratón. Este anticuerpo secundario se marca con un compuesto, por ejemplo rodamina o isotiocianato de fluoresceína, que emite fluorescencia a una loogitud de onda particular. El patrón de tinción y las intensidades dentro de la muestra se detemlinan luego mediante microscopía de luz fluorescente y opcionalmente se registran fotográficamente.
Como aún otra alternativa, se puede utilizar el análisis de imágenes de fluorescencia pot9flciado por ordenador o la citometria de flujo para examinar muestras de tejido o células exfoliadas, es decir, preparaciooes de células individuales a partir de biopsias de aspiración de tumores utilizando los anticuerpos anti-PSMA de esta invención. Los anticuerpos anti-PSMA de la invención son particularmente útiles en la cuantificación de células tumorales vivas, es decir, preparaciones de células individuales a partir de biopsias de aspiración de tumores de próstata mediante un analizador de imágenes de fluorescencia potenciada por ordenador o con un cit6metro de flujo. Los anticuerpos de la invención son particularmente útiles en ensayos de este tipo para diferenciar entre tumores de próstata benignos y malignos ya que la protefna PSMA a la que se unen los anticuerpos anti-PSMA se expresa en cantidades incrementadas por tumores malignos en comparación con tumores de próstata benignos. El porcentaje de población de células PSMA-positivas, solas o en unión con la determinación de otros atributos de las células (p. ej., la ploidia de ADN de estas células) puede, adicionalmente, proporcionar información de pronóstico muy útil, proporcionando un indicador temprano del progreso de la enfermedad.
Todavía en otra forma de realización alternativa, los anticuerpos de la presente invención se puede utilizar en combinación con otros anticuerpos conocidos para proporcionar infonnación adicional con respecto al fenotipo maligno de un cáncer.
Alternativamente, la etapa de contacto puede llevarse a cabo en una muestra de suero u orina u otros fluidos corporales, incluyendo, pero no limitados a fluido seminal, fluido prostático, eyaculado, y similares, tal como para detectar la presencia de PSMA en el fluido corporal. Cuando el contacto se lleva a cabo en una muestra de suero u orina, se prefiere que el agente biológico sustancialmente no reconozca antigenos circulantes en la sangre que no sean PSMA. Dado que las células intactas no excretan o secretan PSMA en el entrono exlracelular, la detección de PSMA en suero, orina u otros fluidos corporales en general, indica que las células están siendo lisadas o cubiertas. Por lo tanto, los agentes biológicos y métodos de la presente invención pueden utilizarse para detemlinar la efectividad de un protocolo de tratamiento del cáncer mediante la vigilancia del nivel de PSMA en suero, orina u otros fluidos corporales.
En un método de detectar células cancerosas, el anticuerpo anti-PSMA o un fragmento de unión a antigeno del mismo, se puede unir a e internalizar con el antígeno prostático especifico de membrana de tales células. Una vez más, el agente biológico se une a un marcador eficaz para permitir la detección de las células o porciones de las
mismas tras la unión del agente biológico a y la internalización del agente biológico con el antlgeno de membrana prostático especifico.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a anligeno de los mismos también se pueden utilizar en la terapia in vivo del cáncer. Los anticuerpos se pueden utilizar solos o unidos covalentemente, ya sea directamente o por medio de enlazador, a un compuesto que extermina y/o inhibe la proliferación de las células malignas o tejidos después de la administración y localización de los conjugados. Cuando el anticuerpo se utiliza por si mismo, puede mediar en la destrucción del tumor mediante fijación del complemento o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse en combinación con un fármaco quimioterapéutico para dar como resultado efectos terapéuticos sinérgicos (Baslya y Mendelsohn, 1994 Breast Caneer Res. and Treatment 29:127-138). Una diversidad de diferentes tipos de sustancias puede conjugarse directamente al anticuerpo para usos terapéuticos, induyendo el metal radiactivo e isótopos no metálicos, fármacos quimioterapéuticos, toxinas, etc. tal como se describe anteriormente y es conocido en la técnica (véase. p. ej., Vitetla y Uhr de 1985, Annu. Rev.
Immunol. 3:197 ).
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden también administrarse junto con el complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de la invención se encuentran composiciones que comprenden anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas debido a que el complemento se encuentra en estrecha proximidad a los anticuerpos humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Alternativamente, los anticuerpos o fragmentos de unión a anligeno de los mismos de la invención y el complemento o suero se pueden administrar por separado.
Los anticuerpos pueden ser administrados con uno o más agentes inmunoestimulantes para inducir o potenciar una respuesta inmune tales como IL-2 y oIigonucleótidos inmunoestimulantes (p. ej., aquellos que contienen motivos CpG). Agentes inmunoestimulantes preferidos estimulan bl'"azos especificas del sistema inmune tales como células asesinas naturales (NK) que median en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
También pueden administrarse al sujeto otros agentes que estimulan la respuesta inmune del sujeto a antigenos multímeros PSMA. Por ejemplo, las citoquinas también son útiles en protocolos de vacunación como resultado de sus propiedades reguladoras de linfocitos. Muchas citoquinas útiles para dichos fines serán conocidos por un experto normal en la técnica, incluyendo la interleucina-2 (IL-2); IL-4; IL-5; IL-12, que se ha demostrado que mejoran los efectos protectores de las vacunas (véase, p. ej. , Science 268:1432-1434, 1995); GM-CSF; IL-15; IL-18; combinaciones de los mismos, y similares. Por lo tanto, se pueden administrar citoquinas en unión con anticuerpos, antlgenos, quimioquinas y/o adyuvantes para aumentar una respuesta inmune.
Quimioquinas útiles en el aumento de la respuesta inmune incluyen, pero no se limitan a SLC, ELC, MIP3a, MIP3¡3, IP-10, MIG, y combinaciones de las mismas.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se pueden utilizar en unión con otras modalidades de tratamiento terapéutico. Estos otros tratamientos incluyen cirugla, radiación, criocirugia. termoterapia. tratamiento hormonal. quimioterapia. vacunas y otras inmunoterapias.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se pUeden utilizar para la profilaxis. Por ejemplo, estos materiales pueden ser utilizados para prevenir o retrasar el desarrollo o progreso del cáncer.
El uso de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención en la terapia del cáncer tiene una serie de beneficios. Dado que los anticuerpos anti-PSMA o fragmentos de unión a antrgeno de los mismos de acuerdo con la presente invención fijan preferiblemente como objetivo células de cáncer de próstata, está a salvo otro tejido. Como resultado, el tratamiento con tales agentes biológicos es más seguro, particularmente para pacientes de edad avanzada. Se espera que un tratamiento de este tipo sea particularmente eficaz, ya que dirige altos niveles de anticuerpos anti-PSMA o fragmentos de uniÓfl a antígeno de los mismos a la médula ósea y nódulos linfáticos en donde predominan metástasis de cáncer de próstata. Además de ello, los sitios del tumor para el cáncer de próstata tienden a ser de un tamaño pequeño y, por lo tanto, son fácilmente destruidos por agentes citotóxicos. Un tratamiento de este tipo se puede vigilar eficazmente con parámetros clínicos tales como el antlgeno prostático especifico sérico y/o rasgos patológicos de cáncer de un paciente, induyendo la fase, la puntuación de Gleason, la invasión extracapsular, seminal, vesicular o perineural, márgenes positivos, nódulos linfático implicados, etc. Alternativamente, estos parámetros pueden utilizarse para indicar cuándo se debe emplear dicho tratamiento.
Debido a que los anticuerpos o fragmentos de unión a antigeno de los mismos de la presente invención se unen a células vivas, los métodos terapéuticos que utilizan estos agentes biológicos son mucho más eficaces que los que
se fijan como objetivo células lisadas. Por las mismas razones, los métodos de diagnóstico y de fOlTTlación de imágenes que determinan la ubicación de células vivas nonnales, de hiperplasia benigna o cancerosas han mejorado mucho mediante el empleo de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Además, la capacidad de diferenciar entre células vivas y muertas puede ser ventajosa, especialmente para vigilar la eficacia de un régimen de tratamiento particular.
También dentro del alcance de la invención se encuentran kits que comprenden las composiciones de la invención e instrocciones de uso. Los kits pueden contener, además, al menos un reactivo adicional tal como complemento, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (p. ej ., un anticuerpo que tiene una actividad complementaria que se une a un epltopo en el antigeno PSMA distinto del primer anticuerpo). Otros kits pueden incluir los multlmeros PSMA descritos más adelante.
Los kits que contienen los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención se pueden preparar para el diagnóstico in 'litro, el pronóstico y/o la vigilancia del cáncer mediante métodos inmunohistológicos, inmunocitol6gicos e inmunoserol6gicos descritos anterionnente. Los componentes de los kits pueden envasarse en medio acuoso o en fonna liofilizada. Cuando los anticuerpos o fragmentos de unión a antígerJo de los mismos se utilizan en los kits en forma de conjugados en los que está unido un resto de marcadOl", tal como una enzima o un ion metálico radiactivo, los componerJtes de conjugados de este tipo pueden suministrarse en fonna completamente conjugada, en fonna de compuestos intennedios o como restos separados a conjugar por e! usuario o e! kit.
Un kit puede comprerJder un soporte que está dividido en compartimierJtos para recibir, erJ estrecho confinamiento en e! mismo, uno o más medios de recipiente o series de medios de recipiente tales como tubos de ensayo, viales, matraces, botellas, jeringas o similares. Un primero de dichos medios de recipiente o series de medios de recipiente pueden contener uno o más anticuerpos anti-PSMA o fragmentos de unión a antlgeno de los mismos. Un segundo medio de recipierJte o serie de medios de recipierJle puede conterJer un marcadOl" o oompuesto intennedio de enlazador-marcador, capaz de unirse a los anticuerpos anti-PSMA primarios (o fragmento de los mismos).
Se pueden preparar kits para uso en la localización de! tumOl" in vivo y método de terapia que contienen los anticuerpos anti-PSMA o fragmentos de unión a antlgeno de los mismos conjugados coo otros compuestos o sustancias. los componentes de los kits pUeden envasarse en medio acuoso o en forma liofilizada. Cuando los anticuerpos o fragmentos de unión a antígerJo de los mismos se utilizan erJ los kits erJ forma de conjugados erJ los que se fija un marcador o un resto de fármaco terapéutico, lal como un ion de metal radiactivo o un resto de fármaco terapéutico, los componentes de este tipo de conjugados pueden suministrarse ya sea de fonna completamente conjugada, en fonna de compuestos intennedios o como restos separados a conjugar por el usuario del kit.
Se describe un método para modular al merJos una actividad erJzimática de PSMA, estando la actividad seleccionada del grupo constituido por la actividad dipeptidasa ácida N-acetilada a-erJlazada (NAALADasa), folato hidrolasa, dipeptidil dipeptidasa IV y y-glutamil hidrolasa o una combinación de los mismos in vitro o in vivo. la modulación puede ser una potenciación o una inhibición de al menos una actividad enzimática de PSMA.
En los métodos para inhibir al menos una actividad enzimática de PSMA. la actividad puede seleccionarse del grupo constituido por la actividad dipeptidasa ácida N-acetilada o-enlazada (NAALADasa), falato hidrolasa, dipeptidil dipeptidasa IV y y-glutamil hidralasa o una combinación de los mismos in vitro o in vivo. El método comprende poner en contacto una NAALADasa, una falato hidrolasa, una dipeptidil dipeptidasa IV y/o una y-glutamil hidralasa con una cantidad de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antlgeno del mismo de la invención erJ condiciones bajo las cuales el anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la actividad NAALADasa, falato hidralasa, dipeptidil dipeptidasa IV o y-glutamil hidralasa.
Los niveles tisulares de NAALADasa se pueden determinar solubilizando erJ detergente tejidos homogeneizantes, sedimentando el material insoluble mediante centrifugación y midiendo la actividad de NAALADasa en el sobrerJadante restante. Del mismo modo, la actividad de NAALADasa en los fluidos corporales también se puede medir sedimentando primero el material celular mediante cerJtrifugación y realizando un ensayo erJzimático típico para la actividad de NAALADasa en e! sobrenadante. Ensayos enzimáticos de NAALADasa han sido descritos por Frieden, 1959, J. BiD/, Chem., 234:2891. En este ensayo, el producto de reacción de la enzima NAALADasa es ácido glutámico. Este se deriva de la escisión, catalizada por enzima, de N-acetilaspartilglutamato para producir ácido Nacetilaspártico y ácido glutámico. El ácido glutámico, en una etapa que requiere NAD(P)', proporciona de 2oxoglutarato más NAD(P)H en una reacción catalizada por glutamato deshidrogenasa. El progreso de la reacción puede medirse facil y coovenienlemenle midiendo el cambio en la absorbancia a 340 nm debido a la oonversión de NAD(pf para NAD(P)H.
La actividad folato hidrolasa de PSMA se puede medir realizando erJsayos enzimáticos según se describe por Heston y otros (p. ej. , Clin. Caneer Res. 2(9):1445-1451, 1996; Urology 49 (3A Supl.):104-12,1997). FoIato hidrolasas tales como PSMA separan los glutamatos gamma-erJlazados de folatos poliglutamatos. Actividad folato hidrolasa se puede medir utilizando sustratos tales como tri-gamma glutamato de metotrexato (MTXGlu3), di-gamma glutamato de metotrexato (MTXGlu2) y pteroilpentaglutamato (PleGlu5), por ejemplo utilizando electroforesis capilar (véase Clin. Caneer Res. 2(9):1445-1451, 1996). Las incubaciones temporizadas de PSMA con sustratos poliglutamados son seguidas de separación y detección de productos de hidrólisis.
El anticuerpo aislado o fragmerJto de unión que se une selectivamente a un dímero de proteína PSMA puede modular la actividad enzimática del dímero de proteína PSMA. En una realización de este tipo, el anticuerpo inhibe al menos una actividad enzimática tal como la actividad de NAALAoasa, la actividad folato hidrolasa, la actividad dipeptidil dipeptidasa IV, la actividad y-glutamil hidrolasa o combinaciones de las mismas. En otra realización, el anticuerpo poterJcia al merJOS una actividad enzimática tal como la actividad NAALAoasa, la actividad folato hidrolasa, la actividad dipeptidil dipeptidasa IV, la actividad y-glutamil hidrolasa, o combinaciones de las mismas.
Un multfmero de proteína PSMA, tal corno se utiliza en esta memoria, es un complejo proteico de al merJos dos proteinas PSMA o fragmerJtos de las mismas. Los multimeros de proteina PSMA pueden estar compuestos de diversas combinaciones de proteínas PSMA de longitud completa (p. ej., SEO ID NO: 1), PSMA recombinante soluble (rsPSMA, p. ej. , aminoácidos 44-750 de SEO ID NO: 1) y fragmentos de la anterior que forman multimeros (es decir, que conservan el dominio pfOteina requerido para la formación de dímeros y/o multímeros de PSMA de orden superior). En realizaciones preferidas, al menos una de las proteínas PSMA que forman el multímero es un polipéptido de PSMA recombinante, soluble (rsPSMA). Multímeros de proteínas PSMA preferidos son dímeros, particularmente los formados a partir de proteína PSMA recombinante soluble. Una realización particularmente preferida es un homodímero de rsPSMA.
Se cree que los multímeros de proteina PSMA a los que se alude en esta memoria asumen una conformación nativa y preferiblemente tienen una conformaciÓll de este tipo. Las proteínas PSMA en detenninadas realizaciones están covalentemente unidas erJtre si para formar el multímero de proteína PSMA. Por ejemplo, se ha descubierto que la proteína PSMA se asocia de forma no covalente para formar dímeros erJ condiciones no desnaturalizantes, tal como se describe en los Ejemplos que figuran mas adelante.
Los multímeros de proteinas PSMA pueden, y preferiblemente lo hacen, conservar las actividades de PSMA. la actividad de PSMA puede ser una actividad enzimatica tal como la actividad felato hidrelasa, la actividad NAALAoasa, la actividad dipeptidil peptidasa IV y la actividad y-glutamil hidrolasa. Métodos para ensayar la actividad de PSMA de multímeros son bien conocidos en la técnica (revisados por O'Keefe et al en: Prostate Cancer: Biolooy Genetics and Itle New Therapeulics, LWK Chung, W.B. Isaacs y JW. Simons (comps.) Humana Press, Totowa, NJ, 2000, págs. 307-326), algunos de los cuales se describen en los Ejemplos que figuran más adelante.
Tal como se utiliza en esta memoria con respecto a poiipéptidos, proteinas o fragmentos de los mismos, ~aislado~ significa separado de su entorno nativo y presente en cantidad suficiente para permitir su identificación o uso. Aislado, cuando se hace referencia a una proteína o poIipéptido, significa, por ejemplo: (i) producido selectivamente por donación de expresión o (ii) purificado tal como por cromatografía o electroforesis. Proteínas o poIipéptidos aislados pueden ser, pero no tienen por qué ser, sustancialmente puros. la expresión "sustancialmente puros~ significa que las proteínas o polipéptidos están esencialmente libres de otras sustancias con las que se pueden encontrar en la naturaleza o en sistemas in vivo en una medida práctica y adecuada para el uso previsto. Polipéptidos sustancialmente puros se pueden producir mediante técnicas bierJ conocidas erJ la técnica. Debido a que una proteína aislada se puede mezclar con un soporte farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, la proteína puede comprender sólo un pequeño porcerJtaje erJ peso de la preparación. la proteína se aisla, no obstante, debido a que se ha separado de las sustancias con las que puede estar asociada en los sistemas vivos, es decir, se ha aislado de otras proteinas.
los fragmentos de una proteína PSMA son preferiblemente aquellos fragmentos que conservan una capacidad funcional distinta de la proteína PSMA. Capacidades funcionales que puederJ ser conservadas erJ un fragmento induyen la unión de otras moléculas de PSMA para formar dímeros y multrmeros de orden superior, la interacción con anticuerpos, la interacción con otros poIipéplidos o fragmentos de los mismos y la actividad enzimática. Otros fragmentos de proteínas PSMA, p. ej ., otros fragmentos solubles recombinantes de SEO ID NO: t , se pueden seleccionar de acuerdo con sus propiedades funcionales. Por ejemplo, un experto ordinario en la técnica puede preparar de forma recombinante fragmentos de PSMA y someter a ensayo esos fragmentos de acuerdo con los métodos ejemplificados más adelante.
Las modificaciones de un polipéptido de PSMA se hacen típicamente con el ácido nudeico que codifica el polipéptido PSMA, y pueden incluir dele<:iones, mutaciones puntuales, truncamientos, sustituciones de aminoácidos y adiciones de aminoácidos o restos que no son aminoácidos. Alternativamente, se pueden hacer modificaciones directamente al polipéptido, tal como por escisión, adición de un ácido graso, y similares. las modificaciones también abarcan proteinas de fusión que comprenden toda o parte de la secuencia de ami noácidos de PSMA.
En general, los polipéptidos PSMA modificados induyen poIipéptidos que se modifican específicamente para alterar un rasgo del polipéptido no relacionado con su actividad fisiológica. Por ejemplo, residuos cisterna pueden ser sustituidos o eliminados para evitar enlaces disulfuro no deseados. De manera similar, determinados aminoácidos se pueden modificar para potenciar la expresión de un polipéptido de PSMA mediante la eliminación de la proteolisis por parte de proteasas en un sistema de expresión (p. ej., residuos de aminoácidos di básicos en sistemas de expresión de levaduras en los que está presente la actividad proteasa KEX2).
Las moclificaciones se preparan convenientemente alterando una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de PSMA. Las mutaciones de un ácido nucleico que codifica un poiipéptido de PSMA preferiblemente conservan el marco de lectura de aminoácidos de la secuencia codificadora, y preferiblemente no crean regiones en el ácido nudeico que puedan hibridarse para formar estructuras secundarias tales como horquillas o bucles, que pueden ser perjudiciales para la expresión del poiipéptido moclificado.
Las modificaciones se pueden hacer mediante la selección de una sustitución de aminoácido, o por mutagénesis aleatoria de un sitio seleccionado en un ácido nucJeico que codifica el poiipéptido de PSMA. Polipéptidos modificados de PSMA pueden luego ser expresados y sometidos a ensayo para una o más actividades (p. ej., la unión de anticuerpos, la actividad enzimática, la estabilidad multimérica) para determinar qué mutación proporciona un polipéptido modificado con las propiedades deseadas. Mutaciones adicionales se pueden hacer a polipéptidos modificados de PSMA (o a polipéptidos no modificados de PSMA) que son silenciosas en cuanto a la secuencia de aminoacidos del polipéptido, pero que proporcionan codones preferidos para la traducción en un huésped particular. Los codones preferidos para la traducción de un ácido nucleico, p. ej ., en E coIi, son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Aún otras mutaciones se pueden hacer a las secuencias no codificadoras de una secuencia codificadora de PSMA o don de AoNc para potenciar la expresión del poJipéptido. l a actividad de poiipéptidos de PSMA modificados se puede someter a ensayo clonando el gen que codifica el polipéptido de PSMA modificado en un vector de expresión bacteriano o de mamíferos, introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, expresando el polipéptido de PSMA modificado y sometiendo a ensayo una capacidad funcional de los polipéptidos de PSMA tal como se describe en esta memoria. Los procedimientos anteriores son bien conocidos para un experto ordinario en la técnica.
El experto en la materia también reconocerá que se pueden hacer sustituciones conservativas de aminoácidos en polipéptidos PSMA para proporcionar poiipéptidos de PSMA funcionalmente equivalentes, es decir, poiipéptidos de PSMA modificados que conservan las capacidades funcionales de los polipéptidos de PSMA. Tal como se utiliza en esta memoria, una -sustitución de aminoácidos conservativa-se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera las características de carga o de tamaño relativas de la proteína en la que se realiza la sustitución de aminoacidos. PoIipéptidos de PSMA modificados pueden prepararse de acuerdo con métodos para alterar la secuencia de polipéptidos conocida para un experto ordinario en la técnica tales como se encuentran en referencias que recopilan tales métodos, p. ej ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., comps., Segunda Edición, Cold Spring Harbar Laboratory Press, CoId Spring Harbar, Nueva York, 1989, o Current Proloco/s in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., comps., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. PoIipéptidos de PSMA funcionalmente equivalentes a modo de ejemplo induyen sustituciones conservadoras de aminoácidos de SEO ID NO: 1, o fragmentos de los mismos tales como el poiipéplido de PSMA soluble recombinante (aminoácidos 44-750 de SEO ID NO: 1). Sustituciones conservativas de aminoácidos induyen sustituciones hechas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, 1, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) a, N; y (g) E, O.
Las sustituciones de aminoácidos oonservativas en poJipéptidos de PSMA se hacen típicamente mediante la alteración de un ácido nudeico que codifica un poiipéptido de PSMA. Sustituciones de este tipo se pueden hacer mediante una diversidad de métodos conocidos para un experto ordinario en la técnica. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer por mutación dirigida por PCR, mutagénesis dirigida al sitio o por síntesis química de un gen que codifica un poiipéptido de PSMA. Den los casos en los que las sustituciones de aminoácidos se hacen a un pequeño fragmento de un poiipéptido de PSMA, las sustituciones se pueden hacer sintetizando directamente el péptido. La actividad de fragmentos funcionalmente equivalentes de polipéptidos de PSMA se puede someter a ensayo donando el gen que codifica el polipéptido de PSMA alterado en un vector de expresión bacteriano o de mamíferos, introduciendo el vector en una célula huésped apropiada, que expresa el polipéptido de PSMA alterado, y sometiendo a ensayo una capacidad funcional del poiipéptido de PSMA tal como se describe en esta memoria.
3S
4S
Los multímeros de proteína PSMA tal como se describen en esta memoria, tienen un cierto número de usos, algunos de los cuales se describen en esta memOl"ia en otra parte. los multímeros son útiles para someter a ensayo compuestos que modulan la actividad enzimática de PSMA o la multimenzación de PSMA Los multímeros se pueden utilizar para aislar anticuerpos que se unen selectivamente a PSMA, incluidos los selectivos para epítopos confonnacionales, losselectivos para la unión de multímeros de PSMA y mon6meros no PSMA, y los que modulan selectivamente una actividad enzimática de PSMA. los mullímeros, en particular PSMA dimérico, también se pueden utilizar para inducir o aumentar las respuestas inmunes a PSMA, como composiciones de vacuna.
Agentes que modulan selectivamente una actividad enzimática de PSMA incluyen agentes que inhiben o potencian al menos una actividad enzimática de PSMA tal como la actividad de NAALADasa, la actividad folato hidrolasa, la actividad IV dipeptidasa dipeptidil, la actividad y-glutamil hidrolasa, o combinaciones de los mismos.
Ejemplos
Materiales y Métodos
Construcciones de ADM. Todas las construcciones de PSMA secretadas se derivaron del clon P55A de PSMA humano OI"iginal proporcionado por el Dr. W.DW. Heston (Israeli et al., Caneer Res. 53: 227-230, 1993). las construcciones se subdonaron en el vectOl" de expresión PPI4 (Trkola et al., Natura 384:184-187,1996) para la expresión de allo nivel y la secreción en células de mamífero. PSMA recombinanle soluble (rsPSMA) corresponde a todo el dominio eJdracelular de PSMA (aminoácidos 44-750 de SEO ID NO: 1 (GenBank número de Acceso a Proteínas AAA60209».
Construcciones de p/ásmido pcDNA: Moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-PSMA 10.3, 006, 026, 051 , 069 Y 077 fueron clonados en el plásmido pcDNA. El protocolo de clonación se proporciona en la Figura 10. También se muestran los cebadores (SEO ID NOs 33-36, sentido y anti-sentido) utilizados para las amplificaciones de la región variable: los plásmidos construidos para anticuerpos anti-PSMA 006, 026, 051, 069, 077 Y 10.3 contienen secuencias de nucleótidos que codifican la cadena pesada de los anticuerpos (SEO 10 NOS: 27; PTA-4403, PTA-4405, PTA-4407, PTA-4409, PTA-4411 , PTA-4413, respectivamente) o contienen secuencias de nucle6tidos que codifican la cadena ligera de los anticuerpos (SEO ID NO: 8-13; PTA-4404, PTA-4406, PTA-4408, PTA-441 O, PT A-4412 Y PT A-4414, respectivamente). Mapas de plásmidos se proporcionan en las Figuras 11-22.
Transferencias Westem. las células se lisaron en PBS que contenfa EDTA 1 mM, NP-40 al 1%, Triton X-lOO al 1% y 5 mglml de aprotinina y los desechos celulares se separaron mediante centrifugación a 3000g durante 30 min a 4°C. Los lisados se separaron en un gel de gradiente de 5-20% antes de la transferencia a membranas de nitrocelulosa. las transferencias resultantes se bloquearon en PBS que contenfa 5% de leche, SDS al 0,02% y Triton X-100 al 0,1% antes de la incubación con el anticuerpo primario MAB544 (Maine Biotechnologies) a una concentración de 2 mg/ml. Después de tres lavados, los borrones se incubaron con un anticuerpo secundario antiratón de cabra, conjugado a HRP, a una concentración de 0,2 mglml. Los boI"rones se visualizan utilizando el sistema de quimioluminiscencia Renaissance (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA).
ELlSA. Las células se lisaron en PBS que contenía EDTA 1 mM, NP-40 al 1%, Triton X-100 al 1% y S mgJml de aprotinina. las membranas de las células resultantes se sembraron en placas de 96 pocillos y se secaron en una campana estéril durante la noche. las placas se bloquearon después con PBS que contenía caseína y Tween-20 antes de la adición de suero de ratón o sobrenadantes de hibridoma, utilizando MABS44 purificado (Maine Biotechnologies) o 7E11 (Cytogen) como patrón. Después de lavar en PBS, un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (específico para la subclase) se incubó y subsiguientemente se lavó en PBS. A continuación, se añadió el sustrato pNPP para la detección colorimétrica a una longitud de onda de 40S nm.
Citometría de flujo . Células 3T3 de tipo salvaje o células 3T3 que expresan PSMA (106 células por condición) se lavaron en PBS que contenfa NaN3 al 0,1%. A continuación, se añadieron anticuerpos o sueros (dilución 1: 100 en PBS) y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Después de lavar en PBS + NaN3 al 0,1%, las células se incubaron con IgG + IgM anti-ralón (Calbiotech) durante 30 minutos en hielo. las células se lavaron de nuevo en PBS + NaN3 al 0,1% Y se analizaron mediante citometria de flujo.
Ejemplo 1: Generación de un panel de anticuerpos monodonales (mAbs) para epftopos confonnacionales sobre PSMA
Se creó un panel de mAbs anti-PSMA que representan candidatos prometedores para la terapia En sfntesis, los mAbs se generaron como sigue: ratones BAlB/c fueron inmunizados por via subcutánea con PSMA recombinanle a
intervalos de aproximadamente tres semanas. Después de un total de 4 inyecciones, los ratones fueron sacrificados y sus esplenocitos se fusionaron con una Ifnea celular de mieloma utilizando técnicas estándares con el fin de crear hibridomas. Sobrenadantes de hibridoma individuales se seleccionaron mediante ElISA en cuanto a la reactividad con PSMA derivado de células tumorales de próstata humanas LNCaP o de células 3T3 modificadas mediante ingeniería para expresar PSMA humano de longitud completa (células 3T3-PSMA). Los clones positivos se rastrearon secundariamente mediante citometria de flujo en cuanto a la reactividad específica con células 3T3PSMA y LNCaP intactas con el fin de seleccionar anticuerpos que reconocen PSMA nativo de la superficie celular y, por lo lanlo, tienen el mayor potencial terapéutico.
Ratones que tienen la capacidad de producir anticuerpos humanos (XenoMouse, Abgenix; Mendez et ala Nature Genetics 15:. 146, 1997) se inmunizaron por vía subcutánea una vez o dos veces por semana con 5 X 10 células LNCaP con adyuvante con alumbre o Titennax GoId (Sigma Chemical Co., St. louis, MO). Animales se reforzaron dos veces con 10 IJg de protelna de inmunoafinidad PSMA recombinanle capturados en microperlas magnéticas de proteína G (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). El mAb 3.11 de PSMA se utilizó para la captura. Los esplenocitos se fusionaron con células de mieloma NSO y los hibridomas que resultaron fueron seleccionados como anterionnente mediante citometría de flujo para detectar clones que producen anlicuerpos reaclivos con la porción extracelular de PSMA. Un clan, 10.3 (PTA-3347), producia anticuerpos de este tipo.
Estos métodos han proporcionadO una alta proporción de mAbs que reaccionan exclusívamente con los epilopos especlficos para la conformación de PSMA de la superficie celular. Tal como se muestra en la Fig. 1, varios mAbs (mAb 3.7, 3.9, 3.11, 5.4 Y 10.3), pero no todos (mAb 3.12) se unen específicamente a células que expresan PSMA viables . Utilizando protelnas PSMA recombinantes solubles expresadas en lineas celulares de ovario de hámster chino (CHO), se demostró adicionalmente que los mAbs unen epítopos en la región extracelular de PSMA. los mAbs también fueron sometidos a ensayo en cuanto a su capacidad de inmunoprecipitar PSMA nativa de lisados de células 3T3-PSMA. Los mAbs positivos en la citametría de flujo (Fig. 1) también fueron eficaces en la inmunoprecipitación (Fig. 2), mientras que el mAb 3.12 era no reactivo. La Fig. 3 muestra el reconocimiento de PSMA de longitud completa no desnaturalizado y PSMA soluble recombinante por varios anticuerpos de PSMA que reconocen la conformación de PSMA. Esto oonfirma, además, que estos métodos proporcionan una preponderancia de mAbs que reconocen de manera eficiente PSMA nativo.
los mAbs se sometieron a ensayo en cuanto a la reaclividad con PSMA desnaturalizado mediante transferencia Westem (Fig. 4). lisados de las células indicadas y muestras (controles: células 3T3, Ifneas celulares de próstata humana PC-3 y DU145 PSMA negativas, sobrenadante simulado; muestras PSMA-positivas: células 3T3 que expresan PSMA, lineas celulares de próstata humano PSMA positivas lNCaP, sobrenadante rsPSMA-positivo) se resolvieron mediante SDS-PAGE, electrotransferencia y se sondaron con los mAbs 3.1 y 3.12 anti-PSMA (Designaciones del Depósito de Patentes de ATCC PTA-3639 y PTA-3640, respectivamente). Cuatro mAbs sometidos a ensayo en paralelo (3.7, 3.8, 3.9, 3.11) no mostraron reactividad a proteínas rsPSMA de longitud completa o secretadas. El mAb 7E11 inmunoprecipitaba rsPSMA de longitud completa, pero no secretada.
Los mAbs reactivos en la citometrla de flujo y la inmunoprecipitación (mAbs 3.7, 3.9, 3.11, 5,4 Y 10.3) eran todos no reactivos en análisis de transferencia Western, indicando que los mAbs no reconocen epltopos lineales. Tomado en conjunto, los datos sugieren fuertemente que estos 5 mAbs reconocen epítopos específicos para la conformación situados en el dominio extracelular de PSMA. Dado que los mAbs a epítopos confonnacionales tipicamente poseen la mayor afinidad y especificidad para el antígeno, representan candidatos preferidos para la terapia.
Las reactividades de determinados anticuerpos anti-PSMA se describen en la Tabla 2:
Tabla 2· Propiedades de anticuerpos anti PSMA
-
mAb
Reaclividad Epítopo
ELISA
Citometria de Flujo IP Western
3.1
+ + + + lineal. Extracelular. expuesto sobre PSMA nativa
3.7
+ + + - Conformacional, extracelular
3.8
+ + + - Confonnacional, extracelular
3.9
+ + + - Conformaciooal, extracelular
3.11
+ + + - Conformacional, extracelular
3S
mAb
Reactividad Eprtopo
ELISA
Citometría de Flujo IP Westem
3.12
+ - - + lineal, Extracelular, no expuesta a PSMA nativa
5.4
+ + + - Confonnacional, extracelular
7.1
+ - - + lineal, Extracelular, no expuesta a PSMA nativa
7.3
+ + + - Confonnacional, extracelular
10.3
+ + + - Confonnacional, extracelular
1.8.3
+ + - Extracelular
A3.1.3
+ + - Extracelular
A3.3.1
+ + - Extracelular
Mediante ElISA se determinó que los mAbs eran principalmente de los isotipos IgG2a de ratón , IgG2b de ratón y TgG1 humanos, que median en funciones efectoras potentes. Aunque se ha descrito a lo largo de los años y se ha evaluado para el potencial terapéutico un cierto número de mAbs anti-PSMA (véase, por ejemplo, liu, H. st al., Caneer Res. 57:3629-3634, 1997; Chang, S.S. et al. Caneer Res. 59: 3192-3198, 1999; Murphy, G.P. et al. J Urology
160: 2396-2401 , 1998), ninguno inhibe la actividad enzimática de PSMA y unos pocos reconocen determinantes confonnacionales en PSMA.
Ejemplo 2: Producción de mAbs anti-PSMA
Para evaluar con precisión y cuantitativamente el potencial terapéutico de estos mAbs, los mAbs se producen en una cantidad y calidad adecuadas para una extensa caracterización in vitro e in vivo. Brevemente, los hibridomas que secretan mAbs se cultivan en frascos rotatorios en medio DMEMlF12 suplementado con FBS al 10% que ha sido agolado en IgG bovina (life Technologies). Duranle la fase de producción del cultivo, las células se mantienen a-S x106 células/ml a través de intercambios dos veces por semana de los medios. los medios recogidos se clarifican medianle filtración a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a -95"C antes de la purificación. Teniendo en cuenta niveles de expresión de anticuerpos medios de -25 mgJL, se requieren aproximadamente 3L de sobrenadantes de frascos rotatorios para cada uno de los anticuerpos para pemlitir pérdidas de purificación.
Los sobrenadantes del cultivo de un hibridorna dado se reúnen y se cargan en una columna de afinidad de Sepharose Proteina A. Anticuerpos IgG2a de ralón, IgG2b de ralón e IgG 1 humana se cargan directamente, pero los sobrenadantes que contenian anticuerpos IgG1 de ralón se ajustan a pH 8,5 Y NaCI1 M antes de la carga con el fin de fomentar la unión. Después de lavar la columna, el mAb se eluye con tampón de pH bajo en fracciones utilizando Tris 1 M, pH 8,0. Fracciones de pico de elución se agrupan, se dializan frente a tampón PBS, se concentran hasta 5 mg/ml y se almacenan en partes alícuotas estériles a -95"C. Todos los procedimientos de purificación se llevan a cabo utilizando tampones libres de endotoxina y columnas de cromatografía desinfectados. los mAbs purificados se someten a ensayo en cuanto a la pureza mediante SDS-PAGE reductora y no reductora , para la afinidad de unión de PSMA medianle ElISA y para los niveles de endoloxina por el ensayo de lisado de amebocilos de limulus. Eslos procedimientos producen rutinariamente anticuerpo de -calidad animal-a > 95% de pureza y < 0,5 unidades de endotoxina por miligramo de proteína.
Ejemplo 3: Evaluación del potencial terapéutico de los mAbs no marcados in vitro
mAbs purificados se someten a ensayo en una batería de ensayos en cuanto a las propiedades terapéuticamente relevantes, induyendo la afinidad, la especificidad, la actividad inhibidora de las enzimas y las funciones efectoras. El candidalo de producto ideal se une e inhibe la actividad de PSMA en concentraciones subnanomolares y media en el polente exterminio celular a través de funciones efectoras relacionadas con el Fc.
En primer lugar, la afinidad de los mAbs para la superficie celular y formas secretadas de PSMA se mide mediante citometria de flujo y ELlSA, respectivamente. En el ensayo de citometrla de flujo, cantidades variables de mAbs se incuban con Sx105 células 3T3-PSMA en tampón FACS (PBS que contiene FBS al 1% y NaN3 al 0,1%) durante 2 h para pemlilir la unión de saturación. Las células se lavan y se incuban con un anticuerpo de cabra acoplado a
ficoeritrina contra IgG de ratón (ICN/Cappel) para la detecdón de mAb unido mediante citometria de flujo . la unión especifica se calcula restando la intensidad de la nu()(escencia observada con células 3T3 parentales.
Para ElISA, la proteina PSMA soluble recombinante derivada de células CHO (rsPSMA, Progenies, Tarrytown, NY) se diluye a razón de 1 IJglml en tampón carbonato 50 mM, pH 9,4, Y se reviste durante la noche a 4°C en placas de microtitulación de 96 pocillos Immulon 11 a razón de 100 ¡JI/pocillo. las placas se bloquean a continuación durante 2 h con tampón PBS que contiene BSA al 5%. Se añaden mAbs en un intervalo de concentraciones en tampón ElISA (tampón PBS que contiene BSA al 2%, FBS al 1% y Tween 20 al 0,5%) durante 2 horas a temperatura ambiente. las placas se lavan, y se añade durante 1 h a temperatura ambiente anticuerpo de cabra peroxidasa conjugado con rábano picante contra IgG de ratón. las placas se lavan de nuevo y se añade sustrato de dihidrocloruro de 3,3',5,5'tetrametilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, Il) para la lectura calorimétrica a 450 nm utilizando un lector de placas ElISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Ejemplo 4: Ensayo de unión de competición cruzada de mAb
Para identificar si un grupo dado de mAbs reconoce epilopos distintos o sOlapantes sobre PSMA, se realizan ensayos de unión de competencia cruzada (liu, H. et al. Caneer Res. 57: 3629-3634, 1997). En este ensayo de citometria de flujo, un mAb biolinilado de ensayo se incuba con células 3T3-PSMA en presencia o ausencia de concentraciones variables de mAbs competidores no marcados tal como se describe arriba. Después del lavado, se añade estreptavidina conjugada con ficoeritrina para determinar la cantidad de mAb biotinilado unido. El porcentaje de inhibición se define con relación al observado en presencia de un mAb emparejado en el isotipo de especificidad irrelevante (0% de inhibición) y al observado utilizando mAb de ensayo no marcado en exceso (100% de inhibición).
Ejemplo 5: Efectos de mAbs sobre la actividad enzimálica de PSMA.
PSMA ha demostrado poseer actividades enzimáticas tanto folato hidrolasa como dipeptidasa acida N-acetilada 0enlazada (NAALADasa), que pueden influir en la proliferación y tumores malignos de la célula tum()(al (Heston, W .DW. Prestate: Basic and Clinical Aspects (R.K. Naz, comp.). CRC Press, Nueva Y()(k: 219-243, 1997). Varios de los mAbs arriba descritos (mAb 3.9, mAb 5.4 y mAb 7.3) y mAb J591 (ATCC nO HB-12126) se sometieron a ensayo para determinar la actividad moduladora de falato hidrolasa utilizando ensayos descritos previamente para medir la actividad enzimática de PSMA (Pinto, J.T. et al. Clinical Caneer Res 2:1445-1451 , 1996).
En sfntesis, la actividad folato hidrolasa se midió como sigue. Cincuenta ¡JM de di-gamma glutamato de metotrexato y 10 ¡JgJml de rsPSMA (premezclado con anti-PSMA o mAb irrelevante) se incubó en tampón acetato pH 4,5 en un volumen de 100 ¡JI durante 2 h a 37°C. las reacciones se terminaron por ebullición durante 5 minutos antes de la separaCión de las formas libre, mono-y di-gamma glulamato de metolrexato por electrof()(esis capilar en una Spectra Foresis 1000 (Thenno Separation, San Jose, CA). los diversos derivados de metotrexato se cuantificaron en base a sus tiempos de retención y a la abs()(bancia a 300 nm .
los datos demuestran que mAb 5.4 bloquea potentemente la actividad enzimática de la proteína rsPSMA purificada yen lisados de céluli;lls C4-2. C4-2 es un derivado independiente de i;IIndrógenos de la línea celular lNi;IICP (línea de cáncer de próstata humano) que expresa PSMA endógeno. Más detalles con respecto a la línea celular C4-2 se pueden encontrar en O'Keefe D.S. et al. Prostate 45: 149-157, 2000). las Figuras 7 y 8 proporcionan los resultados para dos lotes de producción de rsPSMA (rsPSMA nO 7 y rsPSMA nO 8). los resultados para los lisados celulares C4-2 se muestran en la Figura 9. las figuras ilustran el efecto de cuatro anticuerpos (mAb 3.9, mAb 5.4, mAb 7.3 y mAb J591 ) sobre la actividad enzimática de la folato hidrolasa por medio de la velocidad de escisión de glutamato a partir de di-gamma glutamato de metotrexato (MTXGlu2) por parte de folato hidralasa presente en los dos lotes de producción de rsPSMA y en los lisados celulares C4-2. Además de los efectos inhibidores de mAb 5.4, también se encontró que mAb 3.9 inhibe la actividad de folato hidrolasa.
Para los ensayos de actividad de NAALADasa, la proteína rsPSMA se incuba con cantidades variables de antiPSMA o mAb control en Tris 50 mM pH 7,4, COCI2 1 mM durante 10 minutos a 3r C antes de añadir 50 ¡JI de Nacetilaspartil-(3H)glutamato 0,6 ¡JM. Después de 15 minutos, la reacción se detiene mediante la adición de 1 mi de NaP04 100 mM. Glutamato escindido se separa del sustrato mediante cromatografía de intercambio iónico y se detecta por recuento de centelleo. Cada una de las mediciones se realiza por triplicado.
Ejemplo 6: Reactividad con los tejidos humanos normales y malignos mediante inmunohistoaufmica
mAbs anti-PSMA se someten a ensayo mediante técnicas de inmunohistoqufmica en cuanto a la reactividad con tejidos humanos tanto normales como malignos utilizando un método de peroxidasa de avidina-biotina (Silver, DA
et al. Clin Caneer Res. 3:81-85,1997). Se pueden utilizar tejidos congeladas o induidos en parafina. Secciones de tejido embebido en parafina se desparafinan y la actividad de peroxidasa endógena se bloquea mediante incubación con H2<h a11 % durante 15 minutos. Las Sec{;iones se bloquean en una dilución 1:10 de suero de caballo en PBSBSA al 2% (Sigma Chemical, St Louis, MO) durante 30 minutos antes de la incubación durante la noche con 2 IJgJml de mAb anti-PSMA en PBS-BSA al 2%. Después del lavado, las secciones se incuban con anticuerpo secundario biotinilado, se lavan y se incuban con complejos de avidina:biotina peroxidasa (Vector Laboratories, Burtingame, CA) diluidos en la relación 1:25 en PBS durante 30 minutos. Después del lavado, las secciones se visualizan mediante inmersión en PBS que contiene tetracloruro de diaminobenzidina al 0,05%, H20 2 al 0,01 % y Triton X-100 al 0,5%. Secciones de control negativo se incuban con mAbs emparejados en isotipo de especificidad irrelevante. Como control positivo, se utiliza 7E1 1 (Cytogen, Princeton, NJ), un mAb anti-PSMA bien caracterizado.
Ejemplo 7: Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos IADCe>
En el ensayo de ADCC, mAbs se diluyen en serie y se combinan con células 3T3-PSMA marcadas con 51 Cr o células PC-3 de próstata humana que han sido diseñadas para expresar PSMA humano (células PC-3-PSMA). Células efectoras NK se purifican a partir de nódulos linfáticos o bazos utilizando micropef1as anti-NK (Miltenyi Biotec). Sueros, células efectoras NK y células diana cargadas con 51 Cr_se co-incuban a relaciones de efector:células diana de 10:1, 20:1 y 40:1, realizándose cada una de las condiciones por triplicado. Las células se incuban durante 4-5 horas a 37"C antes de que se recojan los sobrenadantes para la medición de la liberación de 51 Cr mediante recuento gamma. El porcentaje de lisis especifica se determina con relación a la observada en la presencia de mAb no especifico emparejado en isotipo (0% de lisis) a la obtenida utilizando dodecil-sulfato sódico al 10% (100% de lisis).
Ejemplo 8: Lisis mediada por el complemento ICMU
Para CML, células 3T3-PSMA o PC-3-PSMA cargadas con 51 Cr sirven como células diana. Diluciones en serie de mAbs se co-incuban con complemento de conejo y células diana durante 4-5 horas a 3rC, realizándose cada una de las condiciones por triplicado. los sobrenadantes se recogen después y se recuentan con un contador gamma. La lisis específica se calcula como se hizo anteriormente con los datos del ensayo de ADCC.
Ejemplo 9: Efectos anti-proliferativos
Para someter a ensayo los efectos anti-proliferativos de estos anticuerpos, mAbs anti-PSMA se diluyen en serie y se incuban con células LNCaP, PC-3-PSMA y PC-3 parentales en crecimiento en fase logarltmica. A intervalos de 4 h, 24 h Y 72 h, las células se retiran y se analizan en cuanto a la densidad y la viabilidad mediante tinción con azul de tripano y ensayo WST-1 (Roche Biochemicals).
Ejemplo 10: Optimización de los procedimientos de guelación y radiomarcaje
Los mAbs más prometedores, identificados utilizando los ¡xocedimientos descritos en los ejemplos anteriores, se optimizarán para la estabilidad y actividad bioqulmicas y biológicas después del marcaje antes de la evaluación en animales. El éxito en experimentos in vi(ro se define como la identificación de un mAb radiomarcado que extermina específicamente células tumorales que expresan PSMA a concentraciones > 10 veces más bajas que el mAb de control de isotijXI no marcado o marcado de manera similar.
Debido a que los isótopos emisores a y f3 preferidos son todos radiometales, cada uno de los mAbs se conjuga primero con un agente quelante de metales adecuado. Basándose en los datos favorables de estabilidad in vivo y su uso demostrado en ensayos cl fnicos humanos, el agente quelante bifuncional ácido transcidohexildietilentriaminapentaacético (p-SCN-CHX-A~-DTPA) C-funcionalizado es el agente preferido para la fijación de 90y o 213Bi al anticuerpo (Brechbiel, MW. et al., J. Chem. Soco Chem. Commun. 1169-1170, 1991). Una forma de este quelato ya ha sido testada en más de 70 dosis en seres humanos en los ensayos en curso en el MemorialSloan Kettering Cancer Genter (McDevitt, M.R. et al., J. Nucl. Med. 40: 1722-1727, 1999). Para 225Ac, los estudios iniciales de los autores de la invención examinarán un nuevo agente quelante bifuncional denominado p-SGN-Bz-HEHA (ácido 1,4,7,10,13,16-hexaazacicJooctadecano-N,N',W,N .. ,N-,N· ...-hexaacético) (Oeal, KA et al. J. Med. Chem. 42:2988-2992,1999). El objetivo es optimizar la conjugación de anticuerpos y las relaciones de quelación para maximizar el rendimiento y la actividad de marcaje, manteniendo la estabilidad adecuada para la utilización in vivo. Agentes quelantes adicionales también se utilizan, ya que estarán disponibles del N.J.H. Y otras fuentes.
Inicialmente, se hace que el anticuerpo esté libre de metal mediante incubación con un gran exceso molar de EDTA a pH = 5. El EDTA Y cualesquiera metales rescatados de la pl"eparación de anticuerpos se separan a través de
intercambio continuo de tampón/diálisis con el fin de reemplazar el tampón de pH = 5 con el tampón de conjugación (Nikula, T.K. et al. Nuel. Med. Siol. 22:387-390, 1995). Las condiciones que proporcionan una relación de quelante a anticuerpo óptima, pero todavla permanecen siendo inmunorreactivas se identifican mediante la variación sistemática de la relación quelante:anticuerpo, tiempo de reacción, temperatura y/o sistemas tampón acerca de las condiciones iniciales que emplean un exceso molar de 40 veces de quelante a anticuerpo en tampón HEPES, pH 8,5. El nOmero de quelatos unidos por anticuerpo se detennina utilizando un método espectrofotométrico establecido (Pippin, C.G. st al. Bioconjugats Chsmistry 3:342-345, 1992).
Para oonstrucciones de 90y y 225Ac, la eficiencia del marcaje se mide directamente. Para 213s¡, construcx:iones iniciales de anticuerpos se someten a ensayo en cuanto a la eficiencia de quelación utilizando 111 1n, que tiene una química de quelación similar a 213Bi, pero que posee las ventajas de una semivida más larga (1112 = 3 días), disponibilidad lista y emisiones V trazables. Una vez optimizado utilizando l11 ln, el marcaje de la eficiencia se
determina para 213Bi.
mAb radiomarcado se purifica sobre una columna de desalación BioRad 10DG utilizando HSA al 1% como la fase móvil y se evalOa mediante cromatografía liquida en capa fina instantánea (ITLC) y/o cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) para determinar el porcentaje de incorporación del radionucleido (Zamora, P.O. et al. Biotschniques 16:306-311 , 1994). ITLC y HPLC proporcionan medios para establecer la pureza e identificar el porcentaje de impurezas radioquímicas de bajo peso molecular (es decir, quelatos de metales, coloides y metales libres). Se desarrollan tiras de ITLC por duplicado para cada una de las fases móviles, se secan y cortan en el R, de marca 0,5 y se cuentan en un contador gamma. El sistema de HPLC está equipado con un detector de absorción UV en línea y un detector de radiactividad. El perfil de elución de HPLC correlaciona directamente la radiactividad con proteína y especies de bajo peso molecular como una función del tiempo de elución. Se utiliza una columna TSK SW3000xL (TosoHaas, Montgomeryville, PA) y se calibra utilizando una gama de patrones de peso molecular de proteínas.
Ejemplo 11 ' Afinidad e inmunorreactividad de mAbs radiomarcados
Una vez que se obtienen construcciones radiomarcadas, se purifican y se evalOan en cuanto a su pureza radioqulmica y bioqulmica, se determina la actividad biológica. La actividad de unión de la radioconstrucción se realiza mediante análisis de Scatchard de datos de unión obtenidos utilizando células LNCaP y 3T3-PSMA enteras y/o fracciones de membrana tal como se ha descrito pl'"eviamente (Scheinberg, D.A. st al. Leukemia 3:440-445 (1991).
La inmunorreactividad de las construcciones sintéticas se evalOa con el fin de correlacionar la relación molar quelato:anticuerpo con la actividad biológica. En síntesis, 2 ng de mAb marcado se incuban con un exceso de -25 veces de PSMA tal como se expresa en células 3T3-PSMA. Después de una incubación durante 30 min a O°C, las células se recogen por centrifugación y el sobrenadante que contiene mAb no unido se añade a células 3T3-PSMA recientes durante 30 min adicionales a O°C. Ambos conjuntos de células se centrifugan y se lavan dos veces con PBS frio. Los sedimentos celulares, fracciones de sobrenadante y de lavado se recuentan para la radiactividad. La inmunorreactividad se define como la cantidad de radiactividad en los sedimentos celulares dividida por la radiactividad total en los sedimentos celulares, sobrenadante y fracciones de lavado.
Ejemplo 12: Internalización de mAb
La actividad de mAbs radiomarcados puede ser modulada de manera significativa por sus tasas de internalización. La internalización del complejo anticuerpo-antlgeno de la superficie celular se mide utilizando construcciones de anticuerpos radiomarcadas con ll1 1n (Caron, P.C. et al. Ganeer Res. 52:6761-6767, 1992). En srntesis, 5 x105 células 3T3-PSMA se incuban a 37"C con anticuerpo radiomarcado con m ln durante periodos variables de tiempo. Las cél ulas se lavan con PBS y las construcciones radiomarcadas unidas en la superficie celular son raspadas con 1 mi de glicina 50 mM/NaCl 150 mM, pH = 2,8. La radiactividad total asociada a las células y la radiactividad resistente a ácidos (interiDfizada) se detenninan mediante recuento V para detenninar la tasa de internalización. Células 3T3 parentales que no expresan PSMA se utilizan como un control para detenninar la unión no específica. Sobre la base de los resultados previos por parte de otros grupos (Smilh-Jones P.M. et al. Caneer Res. 60: 5237-5243, 2000), se espera una internalización significativa de PSMA después de la unión con una o más de las construcciones de mAbs.
Ejemplo 13: Estudios de citotoxicidad in vitro
Se llevó a cabo una evaluación de la citotoxicidad in vitro de mAbs a-marcados una vez que se estableció la inmunorreactividad del radioinmunoconjugado. Aproximadamente 50.000 células diana (ya sean células 3T3-PSMA
o lNCaP) fueron tratadas en placas de 96 pocillos y fueron analizadas 24-96 horas más tarde. la cuantificación de la muerte celular debido a construcciones marcadas con 225Ac (o 213Bi ) se llevó a cabo mediante la detenninación de la absOf"ción de 3H_timidina por las células supervivientes (Nikula, TK et al. J. Nuel. Med. 40:166-176, 1999). la especificidad se delenninó mediante el uso de células control (lineas celulares PC-3 y DU-145 de próstata humana PSMA-negativas, asl como células 3T3 control), bloqueo con un exceso de anticuerpo no marcados y radioconjugados control.
Se evaluaron los efectos citotóxioos de la concentración de anticuerpo conjugado, la actividad específica y el tiempo de exposición. la citotoxicidad se expresó con relación a la observada con Ha 1M (muerte celular 100%) y medios (muerte celular de fondoJ. los valores Dlso se calcularon representando la viabilidad celular como una función del numero de átomos de 22 Ac unidos sobre las células (McDevitt, M.R. et al. (1998) Eur. J. Nuc!. Med. 25:1341-1351 (1998).
Se habran establecido esferoides multicelulares de células lNCaP-FGC y se utilizaron para investigar el potencial de radioinmunoterapia (RIT) para erradicar la enfermedad mlnima in vitro. Estos esferoides tridimensionales imitan las estructuras de tejido con más precisión que los cultivos en monocapa y, por lo tanto, proporcionan un modelo más relevante de tumores sólidos (O'Connor, KC. Pharm. Res. 16: 486-493, 1999). lNCaP-FGC es un clan de rápido crecimiento de la linea celular lNCaP original, y las células se cultivaron utilizando una técnica de superposición de líquido a un tamaño de 200-600 IJm (Ballangrud, A.M. et al. Clin. Caneer Res. 5: 3171s-3176s, 1999). En esferoides mayores, la masa interna de células se vuelve necrótica, mientras que el borde exterior consiste en células tumorales proliferantes. la penetración de anticuerpos se midió por microscopra oonfocal, y los resultados anteriores sugirieron que un anticuerpo anti-PSMA debe penetrar a una profundidad de 40-50 IJm (Ballangrud, A.M. et al. 7· Conferencia sobre Radioinmunodetecdón y Radioinmunoterapia de Cáncer, Princeton NJ, 1998). la citotoxicidad in vitro de 225Ac_3.9 en células diana lNCaP se muestra en la Figura 23. El porcentaje de células lNCaP PSMA+ viables se representó gráficamente como una función de la actividad del radioconjugado. la adición de un exceso de 100 veces de anticuerpo no marcado se utilizó como oontrol para la especificidad.
Ejemplo 14: Evaluación de la eficacia in VNO de mAbs no marcados v radiomarcados en modelos de xenoinjerto de ratón de cáncer de !)!óstata humano
Anticuerpos que tienen éxito en los ensayos anteriores demuestran una especificidad significativa y propiedades funcionales que sugieren que serán útiles para un uso terapéutico. las más prometedoras de estas construcciones de mAb radiomarcadas y "desnudas" se evalúan en los mejores modelos de ratón disponibles de cáncer de próstata. los estudios emplean un modelo de xenoinjerto establecido, en el cual se inyecta la linea celular de tumor de próstata humana lNCaP en ratones inmunológicamente deficientes inmunocomprometidos y se deja que forme tumores sólidos (Ellis, W.J. et al. Clin Caneer Res. 2: 1039-1048 (1996), que luego son tratados con construcciones de mAb tanto radiomarcadas como no marcadas. Estudios ulteriores también utilizan un modelo de xenoinjerto de ratón, CWR22, que reproduce muchos de los rasgos biológioos clave de cáncer de próstata humano.
Modelo de xenoinjerto de células tumorales LNCaP
Una construcción que muestra una alta afinidad y alta especificidad se toma en el modelo in vivo de xenoinjerto de células tumorales lNCaP para la biodistribución y el análisis farmacocinético. Anticuerpo anti-PSMA marcado con lllln se utiliza para estos estudios debido a su qurmica de quelación favorable'2 semivida radiactiva v_emisión gamma trazable. los instantes se evalúan según corresponda a las semividas de 13Si, '225Ac, 177lu y WV, que son los nucleidos de interés terapéutico. Construcciones radiomarcadas (1-5 IJg) se inyectan i.v. en ratones inmunológicamente deficientes (normales y portadores de tumores) y los ratones se sacrifican a los 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 2 h, 4 h, 18 h Y 24 h post-inyección. la sangre y los órganos principales se toman de los animales, se pesan y se determina el porcentaje de radiactividad inyectada por gramo de tejido (Nikula, TK et al. J. Nucl. Med. 40: 166-176, 1999). la especificidad se dirige mediante la pre-inyección con construcción no marcada en exceso. El volumen del tumor macroscópico y las tasas de supervivencia de animales se registran a lo largo de los experimentos.
También se lleva a cabo un estudio de intervalo de dosis para determinar la toxicidad de las construcciones cuando se administran a través de inyección i.v. o i.p. a ratones normales y portadores de tumor. Estos animales se examinan rutinariamente en cuanto a los efectos secundarios tóxioos durante el curso de los estudios mediante la quimica de la sangre y el examen fisico. los animales se sacrifican durante y al final de la investigación con el fin de
recolectar sangre y los tejidos del cuerpo para su posterior evaluación. Datos previos han demostrado una dosis tolerada máxima aproximada de 250 IJCilratón, por lo que las dosis totales se mantienen por debajo de ese nivel.
Una vez que se documenta la biodistribución i.v. y la toxicidad, se evalúa la radioterapia de los tumores. A grupos de cinco ratones se les inyecta < 11-'9 de construcx:iÓll de mAb anti-PSMA radiomarcada tanto antes como después del enfrentamiento al tumor para evaluar la actividad anti-tumoral. También se utilizan como control tumores xenoinjertados antrgeno-negativos (RAJI o RAMOS). Otros controles incluyen (1) el tratamiento con mAb anti-PSMA no marcado solo y.(2) pretratamiento con mAb anti-PSMA no marcado en exceso ante anti-PSMA marcado con 213Bi, 225Ac, 177lu y/o Wy para bloquear la fijación específica como objetivo.
A grupos de ratones portadores de tumores se les inyectan mAbs anti-PSMA no marcados (en concentraciones equimolares) y varios niveles de dosis de anti-PSMA radiomarcado o un anticuerpo control de isotipo marcado de manera similar. El efecto sobre el crecimiento del tumor se evalúa a lo largo del tiempo. Las diferencias estadisticas entre los grupos de tratamiento se determinan mediante un análisis de un método de varianza (ANOVA) y la supervivencia de los animales se ilustra utilizando gráficos de Kaplan-Meier. la eficacia de las construcciones antiPSMA marcadas con 213s¡, 225Ac, 177lu y/o 90y se correlaciona con los datos obtenidos in vitro. El éxito en estos experimentos se define como la capacidad de aumentar de forma significativa (p < 0,05) la vida 001 y/o disminuir el volumen del tumor en comparación con un mAb control de isotipo radiomarcado.
Ademas de ello, se utilizan modelos de tumores para testar si la predosificación con anticuerpo no marcado antes de la inyección de anticuerpo radiomarcado mejora el suministro del anticuerpo radiomarcado al tumor. A los ratones portadores de tumores se les inyecta < 1 J-lg de anticuerpo anti-PSMA radiomarcado con o sin una inyección única antes de 5-100 1-'9 de anticuerpo no marcado. Después de varios días, se sacrifican los animales para la evaluación de la distribución de la radiactividad en el tumor, el tejido nOl1llal y la sangre. Si la predosificación con anticuerpo no marcado mejora el suministro y la fijación como objetivo de anticuerpo radiomarcado a los tumores, se aplica este enfoque y se optimiza en estudios de toxicidad y terapéuticos.
Ademas de la supervivencia 9lobal, el papel de la sincronización de la inyección después del trasplante dellumor (día 1 frente a 3 frente a 7), se examinan el papel de la dosificación (curvas dosis-respuesta con 3-4 niveles de dosis), el papel del programa (inyecciones diarias únicas frente a divididas múltiples) y la especificidad del tratamiento (pre-tratamiento con anti-PSMA no marcado para bloquear la fijación como objetivo).
Estos estudios in vivo han sido diseñados para hacer frente a la dosis máxima tolerada de anticuerpo radiomarcado, la actividad del anticuerpo, el programa de dosificación óptimo (inyecciones únicas o múltiples), y el efecto sobre el tamaño del tumor. La conclusión con éxito de este trabajo permite la detenninación de la viabilidad de la radioinmunotera~a con gartículas alfa dirigidas a PSMA (RIT) de cáncer de próstata e identifica las construcx:iones marcadas con 21 Bi y/o 2 SAc óptimas para entrar en desarrollo clínico.
Modeb de xenoinjerto de ratón CWR22
Los mAbs anti-P$MA más prometedores en formi;ll no marcadi;ll, marcada con tOJQni;ll y/o radiomarcada se someten i;II ensayo en el modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de próstata humana CWR22, (Wainstein, M.A. et al. Caneer Res. 54:6049-6052 (1994); Ni;IIgi;llbhushan, M. et al Caneer Res 56: 3042-3046 (1996); Pretlow, T.G. et al. J Natl Caneer Inst 85: 394-398 (1993». Este modelo tiene muchos rasgos de la condición humana, incluyendo una dependencia de andrógenos, una correlación entre los niveles medidos de PSA en suero y el tamaño del tumor y el alto nivel de expresión de PSMA. Tras la retirada de andrógenos, los niveles de PSA disminuyen a niveles casi indetectables y disminuye el volumen del tumor. Más tarde, el tumor vuelve a crecer como una neoplasia independiente de andrógenos, que se manifiesta inicialmente por un aumento de PSA y. más tarde, el crecimiento medible del tumor. Después de la retirada de andrógenos, los tumores vuelven a crecer en periodos de tiempo variables.
Ratones machos BAlBJc alimicos inmunológicamente deficientes, de cuatro a seis semanas de edad, se obtienen del Cancer Institute-Frederick Caneer Center y se mantienen en jaulas ventiladas presurizadas. Aunque inmunodeficientes en muchos aspectos, estos ratones median en los niveles de tipo salvaje de ADCC y CMl. La Hnea tumoral CWR22 se propaga en los animales mediante la inyección de tejido tumoral picado de un tum()( establecido en el tejido subcutáneo de los costados de ratones atímicos inmunológicamente deficientes junto con membrana basal reconstituida (Matrigel, CoIlaborative Research, Bedford, MA). Para mantener los niveles séricos de andrógenos, a los ratones se administran 12,5 mg de gránulos de testosterona de liberación sostenida (Innovative Research of America , Sarasota, FL) por via subcutánea antes de recibir los tumores. Tres a cuatro semanas después de la inoculación, se miden los tumores de aproximadamente 1,5 x 1,0 x 1,0 cm. los andrógenos son
retirados mediante castración quirúrgica bajo anestesia con pentobarbital y separación de los gránulos de testosterona de liberación sostenida. El tamaño del tumor se determina mediante mediciones de calibre de altura, anchura y profundidad. los valores de PSA se realizan en el suero de los ratones después de sangrado de la cola utilizando un ensayo inmuno-radiométrico Tandem-R de PSA (Hybritech, San Diego, CA).
A grupos de cinco ratones se les inyecta mAb anti-PSMA o mAb de control de isotipo similar en dosificaciones de 5100!Jg para evaluar la actividad anti-tumor. También se examina el efecto de programar dosis individuales frente a múltiples inyecciones diarias divididas. las tasas de volumen tumoral macroscópico y de supervivencia de los animales se registran a lo largo de los experimentos. Las diferencias estadlsticas entre los grupos de terapia se determinan utilizando un método de análisis de varianza (ANOVA) y la supervivencia de los animales se ilustra utilizando gráficos de Kaplan-Meier, con éxito definida como una diferencia de p < 0,05. De manera similar, se comoara la eficacia de mAbs "inmunodeficientes· con la observada con construcciones anti-PSMA marcadas con
9Oy, ' 77 lu, 213Bi y/o m Aco
Estos estudios in VNO han sido diseñados para hacer frente a la dosis máxima tolerada de mAb, la actividad del anticuerpo, la dosis ópt ima y el programa de dosificación (inyecciones únicas o múltiples divididas), y el efecto del tratamiento sobre el tamaño del tumor. la condusión con éxito de este trabajo pennitirá la detenninación de la viabilidad de la inmunoterapia fijada como objetivo con PSMA del cáncer de próstata y la identificación de construcciones óptimas para que entren en desarrollo cJinico.
Ejemplo 15: Investigación de la Conformación de Proteína PSMA Nativa
Extracción de PSMA de la superficie celular de células LNCaP y 3T3
Células lNCaP o 3T3 se cultivaron hasta la confluencia en un matraz de cultivo celular T150, se separaron utilizando una disolución de disociación celular (Mediatech, Herndon, VA) y se transfirieron a un tubo cónico de 15 mI. las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron con 2 mi de Reactivo de Extracción de Proteína de Mamíferos M_Per™ (Pierce, Rockford, Il). Después de la incubación durante 10 min a 4"C, los desechos celulares y los agregados insolubles se separaron mediante centrifugación a 15.000 rpm durante 30 min a 4"C. El sobrenadante se transfirió a un vial criogénico y se almacenó a -80"C hasta su uso posterior.
Producción y Purificación de PSMA Recombinante, Soluble (rsPSMA)
El dominio eldracelular de PSMA (aminoácidos 44-750 de la proteína de loogitud completa, SEO ID NO: 1) se obtuvo como una proteína secretada a partir de la ¡¡nea celular de ovario de hámster chino (CHO) DXB1 1 y se transfectó de forma estable con un vector de expresión de rsPSMA. Las células se cultivaron en un Biorreactor de Lecho Empaquetado CelJigen Plus 2.2l (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) en medio libre de proteínas. El Biorreactor se hizo funcionar en modo de perfusión, y el sobrenadante se recogió asépticamente en bolsas de recogida mantenidas a 4"C. El inhibidor de proteasa aprotinina se añadió al sobrenadante recolectado, que se concentró 25 veces antes de su almacenamiento a -9O"C. Para la purificación, el concentrado se descongeló y se purificó utilizam:lo li;IIs etapas subsiguientes de cromi;lltografía de afinidad con lectini;ll CoOCi;llni;llv8ilini;ll A y cromatografíi;ll de interacx:ión hidrofóbica Butil-Sepharose. la proteína purificada se dializó contra fosfato de potasio 10 mM, pH 7,0. La proteína rsPSMA purificadi;ll es dimériCél, y posee i;IIctividad enzimátiCél folato hidroli;llsa CUi;llndo se ensi;llyi;ll de i;IIcuerdo con los procedimientos publicados (Pinto et al, Clinical Cancer Research 2:1445, 1996) y reacdona con cada uno de un panel de anticuerpos monocJonales específicos para la confonnaci6n, lo que indica que rsPSMA adopta una confonnación nativa.
Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y Transferencia Westem de las diferentes proteínas PSMA
Para cada uno de los análisis individuales PAGE se utilizaron 15 !JI de cada uno de los lisados celulares y 5 !JI del rsPSMA purificado.
SDS-PAGE se realizó utilizando procedimientos estándares. Li;IIs mueslri;lls se prepararon hirviendo durante 5 minutos en presencia de tampón de muestra laemmli (con o sin el agente reductor ditiotreitol IDT1]). Las muestras se aplicaron después a un gel de Tris-glicina al 4-15% (BioRad, Hercules, CA). Después de la electroforesis durante 1 ha 200 V, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa (BioRad) y se analizaron mediante transferencia Western.
Se analizó la naturaleza oligomérica de las diferentes proteínas PSMA utilizando azul nativo PAGE (BN-PAGE). Cada una de las muestras se diluyó con un volumen igual de 2x tampón de muestra BN-PAGE (MOPS 0,1 M / Tris 0,1 M I glicerol al 40% I Coomassie G-250 al 0,1%) antes de la carga en el gel. BN-PAGE se realizó utilizando geles
BisTris al 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y MOPS 50 mM I Tris 50 mM, pH 7,7 como tampón de desarrollo. Azul de Coomassie fue omitido en el tampón de cátodo para evitar la interferencia con la unión de proternas durante la transferencia de las proteínas a nitrocelulosa. Después de la electroforesis durante 2,5 h a 125 V, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (BioRad) y se analizaron mediante transferencia Western.
La transferencia Westem se realizó como sigue: Después de la transferencia, la membrana de nitrocelulosa se bloqueó con leche al 5% en PBS I Triton X-100 al 0,1% ISDS al 0,02%, que también se utilizó para las subsiguientes etapas de lavado y de incubación del anticuerpo. Proteínas PSMA se detectaron utilizando los mAbs 3.1 03.9 antiPSMA (Progenies Pharmaceuticals) como anticuerpo primario e IgG anti-ratón marcada con HRP como anticuerpo secundario e incubando durante 1 h a temperatura ambiente. las membranas fueron desarrolladas colorimétricamente utilizando quimioluminiscencia (NEN Plus, Perkin Elmer Life Sciences, Bostan, MA).
Resultados
Tanto PSMA de longitud completa como PSMA recombinante, soluble (rsPSMA) migran en la SDS-PAGE reductora y no reductora con un peso molecular 01-100 kDa (Fig. 5). El resultado para la PSMA de longitud completa está de acuerdo con observaciones previas (Israeli et al, Patente de EE.UU. 5.538.866; Murphy et al, Patente de EE.UU. 6.158.508; Israeli, et al. , caneer Research 54:1807, 1994; Troyer et al. Int. J. Caneer62:552, 1995; Troyer et al., The Prostate 30:233, 1997; Grauer et al., Caneer Research 58:4787, 1998). En cada uno de estos informes, PSMA de longitud completa migró como una banda principal de 100-120 kDa, con una banda secundaria (típicamente < 5% de la proteína total PSMA) de 180-200 kDa, observada en un subconjunto de informes (Patente de EE.UU. 6.158.508; Troyer et al., 1995; Troyer et al, 1997). Troyer et al. (1995) describen las especies de 180-200 kDa como un PSMA dímero asociado de forma no covalente que puede ser interrumpido con concentraciones crecientes de detergente sos.
rsPSMA contiene 94% (707 de 750) de los aminoácidos presentes en PSMA de longitud completa, y las dos proteínas no se resuelven con claridad en este análisis, tal como se esperaba.
SDS-PAGE permite el análisis de sólo proteínas desnaturalizadas. Con el fin de examinar las proteínas nativas en su estado nativo, se han de emplear otras técnicas tales como PAGE Azul Nativo (BN-PAGE). BN-PAGE se utiliza para detenninar el peso molecular nativo de las proternas y sus complejos no covalentes (Schágger y v. Jagow, Anal. 8iochem. 199:223-231 , 1991 ; ScMgger et al. , Anal. 8iochem. 217:220-230,1994). El colorante azul de Coomassie G-250 se une a los dominios hidrofóbicos en la superficie de la mayoria de las proteínas, mejora la solubilidad e introduce un desplazamiento de carga en las proteínas nativas que resulta en la migración hacia el ánodo a pH 7,5 con independencia del punto isoeléctrico de la proterna. Aunque la velocidad de migración de las proteínas en BN-PAGE varia un poco, la masa molecular de las proteínas se puede determinar por sus respectivos puntos extremos de la migración debido al tamaño de poro decreciente del gradiente de acrilamida presente en los geles.
Cuando se analiza mediante BN-PAGB, PSMA de longitud completa (extra ido de células LNCaP o 3T3), asi como rsPSMA purificado migra con un peso molecular de -190 kDa (Fig. 6). Esta sorprendente observación de PSMA de longitud completa indica que la forma predominante de PSMA de la superficie celular es un dímero asociado de forma no covalente. Este resultado inesperado puede ser contrastado con el de los informes previos (Patente de EE.UU. 6.158.508; Troyer et al 1995; Troyer et al, 1997), donde el PSMA dímero representa una especie menor en los análisis de SDS-PAGE. Presumiblemente, el PSMA dímero no covalente se disocia en gran medida por ebullición en presencia de SOS detergente desnaturalizante.
Además de ello, el resultado para la proterna rsPSMA purificada indica que el dímero se estabiliza a través de interacciones entre los aminoácidos extracelulares, además de o de forma exclusiva de aminoacidos en los segmentos de transmembrana o intracelulares, que no están presentes en rsPSMA.
Ejemplo 16: Disociación de multimeros de PSMA
PSMA es una metaloproteasa de zinc putativa, y la mutagénesis dirigida al sitio de los aminoacidos implicados en la unión al zinc resulta en una profunda pérdida de la actividad enzimática (Speno et al., Molecular Pharmacology 55:179, 1999). Estos aminoácidos incluyen His-377, Asp-387 Glu-425, Asp-453 y Su-553. Ácido etilendiaminotetraacélico (EDTA~ es un fuerte agente quelante para Zni• y otros cationes divalentes y, por lo tanto, tiene el potencial de separar Zn • u otros cationes divalentes coordenados de PSMA. los autores de la invención han determinado que el tratamiento con EDTA hace que el homodímero de PSMA se disocie en subunidades
3S
4S
monoméricas. Resultados similares se puederJ esperar para otros agentes que poseen propiedades quelantes similares tales como etilenglicol-bis(beta-aminoetil-éter) (EGTA).
La proterna rsPSMA purificada se incubó con o sin EDTA 10 mM durante 16 h a 4"C y después se analizó mediante BN-PAGE. Bajo estas condiciones, la proteína tratada oon EDTA era monomérica, mientras que rsPSMA se mantuvo dimérico erJ auserJcia de EDTA. Aunque la disociación del dímero de PSMA en monómero era esencialmerJte completa, cualquier proteína dimérica residual puede separarse si se desea mediante filtración erJ gel, ultracerJtrifugación u otros métodos de separación basados erJ el tamaño que son bierJ conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplo 17: Métodos para la iderJtificación de !?!omotores de la disociación de PSMA
Los compuestos son rastreados en cuanto a la capacidad de fomerJtar la disociación de drmeros de PSMA utilizando un método que induye:
(a)
poner erJ contacto un dímero de PSMA con un compuesto en condiciones que no fomerJterJ la disociación del dímero de PSMA en ausencia del compuesto;
(b) medir la cantidad de monÓlnero de PSMA; y
(e)
comparar la cantidad de mOllÓlTlero de PSMA medida en presencia del compuesto con la observada en ausencia del compuesto.
Un aumento en la cantidad de monómero de PSMA medida en presencia del compuesto indica que el compuesto es capaz de fomentar la disociación del dímero de PSMA.
En una realización adicional, los compuestos son rastreados erJ cuanto a la capacidad de fomentar la disociación de dímeros de PSMA utilizando un método que induye:
(a)
poner en contacto un dímero de PSMA con un compuesto en condiciones que no fomenten la disociación del dímero de PSMA en ausencia del compuesto;
(b) medir la cantidad de dímero de PSMA; y
(e)
comparar la cantidad de dímero de PSMA medida en presencia del compuesto con la observada en ausencia del compuesto.
Una disminución en la cantidad de dímero de PSMA medida erJ presencia del compuesto indica que el compuesto es capaz de fomentar la disociación del dímero de PSMA.
En una realización adicional, los compuestos son rastreados en cuanto a la capacidad de fomentar la disociación de dímeros de PSMA utilizando un método que induye:
(a) poner erJ contacto un dímero de PSMA con un compuesto en condiciones que no fomerJterJ la disociación del dímero de PSMA en ausencia del compuesto;
(b)
medir la cantidad de monÓlnero de PSMA y dímero de PSMA;
(e)
calcular una relación de mOllÓlTlero de PSMA a dímero de PSMA; y
(d)
comparar 11;1 relación obtenida en (c) oon la obtenida en ausencia del compuesto.
Un incremerJto en la relación medida en presencia del compuesto indica que el compuesto es capaz de fomentar la disociación del dímero de PSMA.
Ejemplo 18: Estudios de unión de PSMA a la superficie celular
Citometría de flujo
Células 3T3 parentales o 3T3 que expresan PSMA (2 x 105 células por condición) se lavaron en PBS y se incubaron con PBS que contenía suero de cabra (10% v/v) durante 20 minutos en hielo para bloquear sitios de unión no especifica. Anticuerpos monoclonales anti-PSMA (forma no purificada en sobrenadantes o mAbs purificados) se añadieron en diluciones en serie a células en 100 ¡JI de PBS y se incubaron en hielo durante 30 minutos. IgG antihumana de control (Callag, Bur1ingame, CA) se utilizó para establecer la unión de fondo. Después de dos lavados en PBS, las células se incubaron con IgG anti-humana (BD Phaffi1ingen. San Diego. CA) durante 30 minutos erJ hielo. Las células se lavaron dos veces en PBS, se resusperJdieron erJ 2S0 ¡JI de PBS y se analizaron mediante citometria de flujo utilizando una maquina FACScan (Beclon Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y el software CellQuest. las células viables fueron sincronizadas mediante parámetros de dispersión anterior y de dispersión lateral, y la unión se cuantificó utilizando gráficos de histogramas de los niveles de intensidad de fluorescerJcia media (MFI).
Se encontró que los mAbs anti-PSMA XG-006 (PTA-4403 y PTA-4404, plásmidos de cadena pesada y ligera), XG051 (PTA-4407 Y PTA-4408), 4.40.1 (PTA-4360, 4.40, 4.40 0.1 Y 4.40.2 son el mismo anticuerpo que representan diferentes etapas de subclonación del hibridoma), 4.49.1, 4.292.1 (PTA-4390) y 4.304.1 se unen ávidamente a PSMA de la superficie celular (Figura 24).
Unión Máxima
Los datos de citometrla de flujo (intensidad de fluorescencia media frente a concentración de anticuerpos) se traspusieron y trazaron utilizando el software Excel (Microsoft, Redmond, WA). los resultados de experimentos representativos de al menos tres determinaciones se representan en las Figuras 25A-25C. La unión se comparó mediante el cálculo de la concentración efectiva al 50% (CESO) utilizando la función Forecast en Excel. El valor CESO representa la concentración de anticuerpos requerida para la unión semi-máxima.
Se encontró que los mAbs anti-PSMA 10.3 (PSMA 10.3) y XG-006 se unian a células 3T3-PSMA y no a células 3T3 (Figura 25A). Se añadió anticuerpo (26 nM) a las células, que fueron analizadas mediante citometria de flujo. También se demostró la unión a PSMA de la superficie celular utilizando diluciones en serie de sobrenadantes de cultivo que contienen mAbs anti-PSMA de XG-006, 4.304.1, XG-026 (PTA-4405 y PTA-4406) Y 4.49.1 (Figura 258). la unión a PSMA de la superficie celular utilizando diluciones en serie de mAbs anti-PSMA purificados XG-006 y
10.3 se representa en la Figura 25C.
Ejemplo 19: Citotoxicidad de anticuerpo marcado con toxina
Células PSMA-3T3, lNCaP y/o C4-2 (y lineas celulares de control 3T3 y PC3 que no expresan PSMA) se sembraron a razón de 2500 células/100 J.lUpocillo en miaoplacas de 96 pocillos (Falcon) y se incubaron durante la noche a 37"C en presencia de 5% de CO2• Los medios utilizados para PSMA-3T3 (y 3T3) Y LNCaP (y C4-2 Y PC3) eran DMEM o RPMI 1640, respectivamente, que contiene l-glutamina 2 mM, FBS al 10% y 1% de penicilinaestreptomicina. 50 ng (en 50 J.ll) de Mab-Zap o Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) en medio se añadieron a cada uno de los pocillos. Mab-Zap y Hum-Zap son anticuerpo IgG anti-ratón de cabra o anticuerpo IgG anti-humano de cabra enlazado covalentemente a saporina, la más potente de las proternas inactivadoras de ribosomas vegetales (RIP) de las semillas de la planta SaJX)naria officinafis. la sapoTina induce la muerte celular mediante apoptosis (Bergamasdli, G., Pertetti, V., Tonon, L , Novella, A. , lucotti, C., Oanova, M., Glennie, M.J., Merlini, G., Cazzola, M. Saporina, una proterna inactivadora de ribosomas, utilizada para preparar inmunotoxinas, induce la muerte celular a través de apoptosis. Br J Haematol 93, 789-94. (1996». El Mab-Zap no se unia ni internalizaba en las células en ausencia de un anticuerpo primario apropiado.
Anticuerpos anti-PSMA murino 3.9, 5.4, mJ591 (ATCC nI> HB-12126) y humano 006, 4.40, 4.304 (y anticuerpos IgG control) se añadieron en placas a diferentes concentraciones para llevar el volumen total a 200 I.ll por triplicado. las placas se mantuvieron frias en hielo durante al menos 30 min para maximizar la unión de Map-Zap o Hum-Zap a anticuerpos PSMA antes de la intemalización. Las placas se incubaron durante 2 dias y luego se cambió el medio y se incubaron durante otros 2 días. Después de 4 días de incubación, el medio fue retirado y medio fresco que contiene 10% de Alamar Blue (20 J.ll. Bioscience. Camarillo. CA) se añadió a cada uno de los pocillos y se incubaron durante 2 h. Un lector de placas CytoFlour se utilizó para medir la fluorescencia en placas de 96 pocillos a longitudes de onda de 530 nm de excitación y 590 nm de emisión. La internalización de la toxina estaba mediada por anticuerpos anti-PSMA. la muerte celular se ilustra en la Figura 26 en las células C4-2 y en la Figura 27 en las células PSMA-3T3.
Anticuerpo anti-PSMA 4.304 humano se conjugó directamente con saporina (Wrenn et al, Brain Res. 740:175-184, 1996), y su citotoxicidad se demostró utilizando un protocolo similar al descrito anterionnente (véase la Figura 28).
Ejemplo 20: Inmunorreactividad
PSMA-3T3, lNCaP y C4-2 se utilizaron como líneas celulares que expresan PSMA y 3T3 se utilizó como una linea celular control que no expresa PSMA. las células se bloquearon con suero de cabra al 10% en hielo para reducir la unión no especifica en este ensayo.
Se añadió una pequeña cantidad (1-5 ng) de mAb marcado a un sedimento celular de 10 millones de células y se incubó a O°C (en hielo) con mezcladura suave. Después de incubación durante 1 hora, las células se recogieron mediante centrifugación y el sobrenadante que contenía mAb no unido se transfirió a un sedimento celular reciente durante 1 hora de incubación adicional a O°C. Ambos conjuntos de células se centrifugaron y lavaron dos veces con PBS frio. l os sedimentos celulares, fracciones de sobrenadante y de lavado se contaron para la radiactividad. la
inmunorreactividad se define como la cantidad de radiactividad en los sedimerJtos celulares, dividida por la radiactividad total en las fracciones de sedimentos celulares, sobrenadante y de lavado. Estos datos se muestran a continuación erJ la Tabla 3.
Tabla 3 Inmunorreactividad de anticuerpo radiomarcado con lllln en células que expresan PSMA radiomarcadas 5
mAb radiomarcado
Inmunorreactividad (%) linea celular
In-11 1 4.304
92,6 (1,4) PSMA-3T3 (3T3)
92,6
PSMA-3T3
91,4(1,7)
PSMA-3T3 (3T3)
89,1
LNCaP
92,4
C4-2
Media =
91,6± 1,5
In-1114.40
87,7 (0,5) PSMA-3T3 (3T3)
86,8
PSMA-3T3
89,4 (1,5)
PSMA-3T3 (3T3)
Media=
88,O± 1,3
In-111 mJ591
58,5 PSMA-3T3
54,9(1,1)
PSMA-3T3 (3T3)
Media =
56,7 ± 2,5
In-11 1 3.9
88 LNCaP
87
C4-2
89 (2)
PSMA-3T3 (3T3)
95,3 (0,5)
PSMA-3T3 (3T3)
88,6
PSMA-3T3
84,8
C4-2
89,3
PSMA-3T3
mAb radiomarcado
Inmunorreactividad (%) Unea celular
Media =
88,6 ± 3,2
Los anticuerpos 4.40, 4.304 Y mJ591 se conjugaron con el quelato bifuncional CHX-A"-DTPA y el anticuerpo 3.9 se conjugó oon C-DOTA.
Ejemplo 21 : Ensayo de unión competitiva para identificar epítooos de unión
Para identificar si un grupo dado de mAbs reconoce epitopos distintos o solapantes en PSMA, se realizaron ensayos de unión competitiva con anticuerpos radiomarcados con In-111 . 2 x 105 células (100 IJL) de PSMA-3T3 se sembraron en microplacas de 96 pocillos, y se añadieron los anticuerpos 4.40, 4.304 Y mJ591 (100 IJl) a diferentes concentraciones (dilución en serie). Las células se incubaron a O"C durante 30 mino 20 IJl de construcciones de anticuerpos CHX-N-DTPA radiomarcados con In-lll se añadieron a cada uno de los pocillos. Después de 2 horas de incubación en hielo durante la unión de competencia, las células se lavaron 5 veces con PBS fria. Las células que contenlan anticuerpos In-lll unidos se recuperaron de mia""oplacas en tubos de ensayo y se contaron en un contador gamma.
Los resultados detallados en las Figuras 29 demuestran que mJ591 bloqueaba la unión de In-ll1 4.40 a células PSMA-3T3 y no bloqueaban In-111 4.304. Además, 4.40 y 4.304 no se bloqueaban entre sr. Anticuerpos 4.304 y mJ591 no modificados también se utilizaron para competir con mJ591 radiomarcado con In-l11 . 4.304 humano no compitió COf1 In-lll mJS91 por la unión a PSMA-3T3 (Figura 30).
Ejemplo 22: Afinidad de unión utilizando Biacore 3000
Para determinar la cinética y la afinidad de los anticuerpos, los anticuerpos en sobrenadantes brutos, en forma purificada y en formas modificadas de quelatos bifuncionales se analizaroo utilizando un instrumento Biacore 3000 (Biacore Inc., Piscataway, NJ). Biacore 3000 es un sistema biosensQ( basado en resonancia de plasmón de superficie (SPR) totalmente automatizado (SPR) que está diseñado para proporcionar datos cinéticos en tiempo real de formatos de ensayo que no requieren etiquetas ni el marcaje de compuestos para las interacciones biomoleculares. Es ideal para el rastreo de sobrenadantes brutos.
Los chips sensores recubiertos con estreptavidina (chips SA, Biacore) se utilizaron para capturar el anticuerpo antiIgG humana biotinilado (Sigma, St. Louis, MO). La superficie entera del chip sensor se acoodiciooó coo cinco inyecciones de disolución de acondicionamiento (NaCI 1 M, NaOH 50 mM) y se equilibró con tampón PBS que conten fa poIisorbato 20 al 0,005%. Dos a tres mil unidades de resonancia (RU) de anticuerpo IgG anti-humano biotinilado (Sigma) se inmovilizaron sobre el chip SA, seguido por una inyecdón de tampón de regeneración (glicinaHCI, pH 2,2). los anticuerpos en los sobrenadantes se diluyeron hasta 2 IJgJml en tampón PBS y se capturaron en una sola celda de flujo IgG anti-humana, mientras que el anticuerpo humano control emparejado en el isotipo (Sigma) fue capturado de manera similar en una segunda celda de flujo. rsPSMA a diferentes concentraciones en tampón PBS se hizo fluir sobre las células a razón de 30 IJUmin durante 3 min en una "fase de asociación" seguida de una "fase de disociación" durante 10 mino La SPR se vigiló y se muestra como una función del tiempo. Para cada uno de los anticuerpos a una concentración, el chip se regeneró y se equilibró. Un ejemplo del análisis de anticuerpo PRGX1-XG-006 en fase de asociación y fase de disociación a diferentes concentraciones de rsPSMA de 100 nM a 6,25 nM se muestra en la Figura 31 . Constantes de velocidad tennodinámica y cinética de la unión se calcularon utilizando el software Biacore Evaluation. Por ejemplo, se determinó que la afinidad de anticuerJ?Os XG-006 en un sobrenadante a rsPSMA era 4,92x10·'O M con una ~de 1,3x105 M·I S·I y una K.:! de 6,4 x10-5 s· . Datos selectivos para varios anticuerpos PSMA humanos en sobrenadante bruto, forma purificada y modificada con quelato bifuncional se listan en la Tabla 4 para la comparación.
La actividad de unión de anticuerpos radiomarcados con In-111 se determinó mediante análisis de Scatchard de datos de unión obtenidos utilizando células que expresan PSMA (LNCaP, C4.2, PSMA-3T3 y 3T3 parental como control). Se han descrito previamente los procedimientos y métodos experimentales de análisis de datos (Scheinberg, DA sr al. Leukemia 3:440-445 (1991 ).
Tabla 4: Constantes de velocidad cinética de anticuerpos en formas de sobrenadante bruto, purificada, de quelatos bifuncionales modificado junto con KD determinadas utilizando el análisis de Scatchard radiomarcado con In-111 .
E101849S7
Anticuerpos
Ka (M" ,s" ) Kd (s" ) KD (M " ) KD media
Sobrenadante 006
1,30E+OS 6,40E-OS 4,92E-10 4,92E-10
006-1 purificado
2,94E+OS 1,37E-04 4,66E-10
006-2 purificado
2,26E+OS 1,27E-04 S,62E-10 S,14E-10
Sobrenadante 4.40
2,10E+OS 1,2SE-04 S,9SE-10 S,9SE-10
4.40-1 purificado
2,54E+OS 1,S2E-04 S,98E-10
4.40-2 purificado
2,43E+OS 2,37E-04 9,7SE-10 7,87E-10
CHX-4.40-1
2,S7E+OS 1,60E-04 6,23E-10
CHX-4.40-2
2,47E+OS 1,SSE-04 6,28E-10 6,2SE-10
IN-111 CHX-4.40-1
4,44E-09
IN-1 11 CHX-4.40-2
4,9SE-09 4,70E-09
Sobrenadante 4.304
1,40E+OS 1,2SE-04 8,93E-l 0 8,93E-10
4.304-1 purificado
8,31E+04 1,20E-04 1,44E-09
4.304-2 purificado
1,06E+OS 6,33E-OS S,97E-l 0 1,02E-09
CHX-4.304-1
6, 19E+04 1,21 E-04 1,9SE-09
CHX-4.304-2
6,79E+04 1,49E-04 2,19E-09 2,07E-09
IN-1 11 CHX-4.304-1
9,63E-09
IN-1 11 CHX-4.304-2
S,97E-09 7,80E-09
Sobrenadante 10.3
1,90E+OS 3,63E-04 1,91E-09 1,91E-09
10.3-1 purificado
3,28E+OS 6,32E-OS 1,93E-l 0
10.3-2 purificado
2,96E+OS 6,43E-OS 2,17E-l 0 2,OSE-10
Una comparación de los anticuerpos totalmerJte humanos 4.40.1, 4.49.1, 051 Y 006 Y el anticuerpo murino 3.9 se realizó mediante Biacore. Para cada uno de los anticuerpos para la comparación, la respuesta se normalizó a 100 RU. La gráfica de tiempo frente a la diferencia de respuesta para estos anticuerpos se da erJ la Figura 32. Se 5 determinó que las afinidades de unión para estos anticuerpos eran 6,1, 6,7, 5,8, 4,8 Y 13,7x10' 1O M, respectivamente.
Ejemplo 23: Caracterización de líneas celulares para estudios in vitre e in vivo
Los resultados de un análisis de Scatchard utilizando anticuerpo anti-PSMA 3.9 marcado con ln-l11 se representan en la Figura 33. Células murinas 3T3 transfectadas expresan> 1 millón de copias de PSMA por célula, células LNCaP (l ínea celular de cáncer de próstata humano dependiente de andrógerJos) expresan 0,64 millones de copias,
10 mientras que las células C4-2 (andrógeno-indeperJdiente) expresan 0,25 millones de copias por célula. La afinidad de 3.9 para PSMA de la superficie de la célula es 6,4 nM para PSMA-3T3, 4,0 nM para LNCaP y 3,3 nM para C4-2 (4,6 nM es la media de estos datos).
Un resumerJ de los análisis de los sobrenadantes brutos para los anticuerpos anti-PSMA humanos se da en la Tabla 5 que figura a continuación.
15 Tabla 5: Caracterización de anticuerpos monodonales anti-PSMA
Cone de Ab (~g1ml)
Unión a 3T3-PSMA (FACS) Estudios Biaeore
Sobrenadante
PGNX Usado EIA PGNX FACS Unión Máx. Media CESO Media C4.2 FACS Anti-PSMA Western KD, M-l (x 10.1°) Ka, Mls-l (x 10' ) Kd, s-l (x 10-5)
PRGX1-XG1026
4,7 NO' NO 148 2 ,4 NO Conf. ~ 2 ,0 1,5 2,9
4.4 .1
4,7 0,08 7 8 NO 5,2 Conf. 4 ,2 2,3 9,7
PRGX1-XG1006
1,8 0,39 114 183 3 ,4 9,5 Conf. 4 .8 1,3 6,4
PRGX1-XG1051
3,5 0,48 83 202 2 ,0 9,9 Conf. 5 ,8 1,4 8,2
4.40.1
4,3 0,33 53 163 2 ,3 10,8 Conf. 6 ,1 2,1 12,5
4.49.1
2,6 0,36 362 162 0 ,9 16,2 Conf. 6 ,7 3,1 20,7
4.292.1
2,7 0,18 75 195 6 ,0 9,2 Conf. 6 ,8 1,2 8,5
4.304.1
4,1 0,39 92 184 9 ,1 8,4 Conf. 8 ,7 1,4 12,5
4.232.1
2,4 0,49 .7 138 2.7 6,0 lineal" 9 ,4 1,5 13,8
4.153.1
5,. 0,2. 279 182 5 ,3 14,8 Conf. 9 ,5 1,2 11 ,8
4.333.1
2,9 0,18 82 168 3 ,1 6,6 Conf. 11 0,7 8,5
PRGX1-XG1077
3,9 0,45 392 227 6 ,0 12,4 Conf. 16 0,6 10,4
10.3
8,5 1,06 NO NO NO NO NO 19 1,9 36,4
10.3 puro
0,44 130 181 7 ,5 NO Conf. NO
4,7
4.22.1
2,8 0,08 7 NO NO 4,7 NO 20 1,7 33
4.248.1
3,5 0,37 7 NO NO 4,1 Conf. 27 1,0 28
4.54.1
10 0,14 267 162 3 ,9 13,6 NO 30 1,9 56
4.7.1
5 0,23 156 141 1,6 10,2 Conf. 32 1,7 56
4.78.1
5,3 0,00 205 118 1,0 7,9 Conf. 53 2,4 125
4.48.1
4,9 0,06 14 NO NO 7,7 NO 62 O,. 59
4.209.1
3,5 0,22 60 NO NO 6,7 NO 142 0,9 125
4.177.1
1,1 0,15 236 174 2 ,4 10,6 NO 155 0,6 93
4.152.1
3,4 0,38 81 85 4 ,0 7,5 NO 163 0,8 126
4.28.1
4,2 0,04 112 155 4 ,2 11 ,3 NO 167 1,2 192
4.16.1
5,3 0,00 8 NO NO 7,8 NO 177 1,8 313
4.360.1
1,5 0,02 112 130 2 ,2 7,9 NO 197 1,0 201
4.288.1
15,4 0,02 67 141 4 ,1 6,5 NO 198 1,3 257
4.219.2
0,5 0,34 69 NO NO 5,9 NO NO
PRGX1-XG1069
6,5 NO NO 71 7 ,9 NO NO Sin unión
3.9 murino
13,7 I 0,7 9,7
Cone de Ab
Unión a 3T3-PSMA Estudios Biaeore
(~g1ml)
(FACS)
Sobrenadante
PGNX Usado PGNX Unión CESO C4.2 Anti-PSMA KD, M-l Ka, M- Kd, s-l
EIA
FACS Máx. Media FACS Western (x 10.1°) ls-l (x (x 10-5)
Media
10' )
Control
6 ,34 2,24 14,2
1 NO =no delenninado 2 conf. = epilopo confOlTTlacional 3 lineal = epítopo lineal
Ejemplo 24: Citotoxicidad de anticuerpo radiomarcado
La citotoxicidad in vitro de anticuerpo anti-PSMA marcado con Ac-225 se determinó utilizando una metodología similar a la utilizada en el Ejemplo 19. Células de cáncer de próstata (100 tJL de células C4-2, lNCaP y PC3 a una concentración de 2 x 104 célulaslmL) se colocaron en pocillo separado de una microplaca de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con anticuerpo anti-PSMA 4.40 humano marcado con Ac225 a diferentes concentraciones durante más de 4 dlas. la citotoxicidad celular se cuantificó utilizando Alamar Blue (Biosource International, Camarillo, CA).
la Figura 34 muestra un gráfico de la supervivencia celular frente a la concentración de actividad de Ac-225. la CE50 para células que expresan PSMA (C4-2 y LNCaP) era < 2 nCi/mL. Sin embargo, la CE50 era 420 nCi/ml para células PC3, que no expresan PSMA en la superficie celular. Por lo tanto, el anticuerpo anti-PSMA 4.40 humano marcado con Ac-225 muestra una selectividad> 200 veces en exterminar células de cáncer de próstata que expresan PSMA (C4-2 y LNCaP) frente a células control (PC3).
Ejemplo 25: Radioinmunoterapia in vivo con Anticuerpos Marcados con lU-l77
Ratones atímicos inmunológicamente deficientes del National Cancer Institute se implantaron por vía subcutánea con 2 x 106 células PSMA-3T3. Después de que aparecieran tumores medibles el dla 7 después de la implantación, los ratones fueron tratados mediante inyección, ya sea con una sola dosis de 250 tJCi de anticuerpo anti-PSMA 4.40 ó 4.304 humano marcado con lu-177 (University of Missouri Research Reactor), o se inyectaron sólo como control. El tamaño del tumor de animales individuales se midió utilizando un calibrador electrónico. la Figura 35 muestra un gráfico del tamaño mediano del tumor en cada uno de los grupos con el tiempo. los crecimientos del tumor se redujeron sustancialmente en grupos tratados con anticuerpo Lu-177 en comparación con el grupo control.
Ejemplo 26: Inmunización con preparaciones de dímero de rsPSMA
Inmunización
Ratones BAlBJc se inmunizaron mediante inyección subcutánea los dlas O, 7, 14 Y 42 , ya sea con 5 tJg del lote de rsPSMA dlnico nO 4019-COOl (75% de dlmerol25% de monómero) o 5 lJ9 de lote de rsPSMA nO T0045-003 operación l /pico 2 (100% de monómero) y adyuvante con 50 tJg de Alhydrogel por dosis. El suero se extrajo 10 dlas después de la cuarta inmunización y se analizó mediante inmunoensayo ligado a enzimas (EIA) y citometrla de flujo.
E/A
lote de rsPSMA nO 4019-COOl o el lote de rsPSMA nO T0045-003 operación l /pico 2 se adsorbió pasivamente a placas de microtitulación de 96 pocillos. El resto de los sitios de unión en la placa se bloquearon con un tampón de PBSJcaselnafTween 20. Se añadieron suero de ratón diluido en serie o controles y el anticuerpo unido se detectó utilizando un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. El EIA se desarrolló con el sustrato pNPP que produce un cambio de color que es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo antiPSMA unido. Se leyó la absorbancia a 405 nm con una corrección de 620 nm. El título de anticuerpos se definió como la dilución más alta de suero de ratón que produce una absorbancia en blanco corregida de 0,1. Suero inmune de ratón con un título anti-PSMA conocido o suero de ratón normal sin reactividad anti-PSMA se utilizó como controles.
Análisis de Citometría de Flujo
Células 3T3-PSMA se incubaron con 200 IJL de suero inmune a una dilución de 1/50 en PBS con 0,1% de azida sódica en hielo durante 30 minutos. Suero inmune de ratón con titulo anti-PSMA conocido o suero de ratón nonnal sin reactividad anti-PSMA se utilizó como controles. Las células se lavaron dos veces con PBS con azida sódica al 0.1% y se incubaron durante 30 minutos en hielo con IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC. las células se
5 lavaron una vez, se resuspendieron en PBS con azida sódica al 0,1% Y se sometieron a análisis de citometría de flujo en FACSCaliber (Becton Oickinson).
Resultados
515 ratones inmunizados con lote de rsPSMA nO 4019-CCI01 mostraron una respuesta de anticuerpo anti-PSMA mediante EIA. El titulo de anticuerpos era similar para placas de ensayo revestidas con el lote de rsPSMA nO 4019
10 C001 (75% de dímerol25% de mon6mero) y placas de ensayo recubiertas con el lote de rsPSMA nO T0045-003 operación 1/pico 2 (100% de mon6mero). la mediana de la respuesta para el grupo era 1/6400.
4/5 ratones inmunizados con el lote de rsPSMA nO TD045-003 operación l /pico 2 mostraron una respuesta de anticuerpos anti-PSMA mediante EIA. Un ratón era negativo. El titulo de anticuerpos era similar para placas de ensayo recubiertas con el lote de rsPSMA nO 4019-COOl (75% de dímerol25% de monómero) y placas de ensayo
15 recubiertas con el lote de rsPSMA nO T0045-003 operación 1/pico 2 (100% de monómero). la mediana de la respuesta para el grupo era 1/6400.
Los resultados del análisis de la EIA se proporcionan en la Tabla 6.
Tabla 6: Especificidad de la respuesta de anticuerpos anti-PSMA en ratones vacunados 4 veces con rsPSMA 5 IJgldosis y 50 IJgldosis de Alhydrogel
Ratón ID n'
Inmunogen Titulo por EIA frenle al lote 4019-C001 Titulo por EIA frente al Lote TOO45-003 operación l /pico 2 RFI mediana frente a células PSMA-3T3
ABIM151
4019-COOl Dímero 1/3200 1/3200 84
ABIM152
4019-COOl Dímero 1/3200 1/3200 41
ABIM153
4019-COOl Dímero 1/25600 1/25600 76
ABIMl54
4019-COOl Dímero 1/12800 1/12800 63
ABIM155
40l9-COOl Dímero 1/6400 1/6400 74
ABIM156
Mon6mero 1/1600 1/1600 5
ABIM157
Mon6mero 1/6400 1/12800 8
ABIM158
Mon6mero O O 6
ABIM159
Mon6mero 1/6400 1/6400 6
ABIM160
Mon6mero 1/6400 1/6400 12
Tal como se muestra en la Fig. 36, el anticuerpo anti-PSMA en el suero de ratones inmunizados con una
preparación de dlmeros de rsPSMA (lote n° 40l9-COO1) mostró una fuerte unión a células 3T3-PSMA. El anticuerpo
anti-PSMA en el suero de ratones inmunizados con una preparación de 100% de mon6meros de rsPSMA (lote nO
T0045-003 operación l/pico 2) no mostró unión alguna a células 3T3-PSMA
lS
3S

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antrgeno del mismo que se une especlficamente a fonnas diméricas de PSMA, pero no a fonnas monoméricas de PSMA, y tiene la capacidad de unir células vivas que expresan PSMA.
  2. 2.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo segun la reivindicación 1, en donde el PSMA es un polipéptido de PSMA recombinante, soluble (rsPSMA) que consiste esencialmente en los aminoácidos 44-750 de SEQ ID NO: 1, Y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un homoclímem de dicho rsPSMA.
  3. 3.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno del mismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que inhibe al menos una actividad enzimática del dímero de protelna PSMA.
  4. 4.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a anllgeno del mismo según la reivindicación 3, en donde la actividad enzimática se selecciona del grupo que consiste en actividad folato hidrolasa, actividad NAALADasa, actividad dipeptidil dipeptidasa IV, actividad y-glutamil hidrolasa y combinaciones de las mismas.
  5. 5.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 3, en donde la actividad enzimática se encuentra en el dominio extracelular de la molécula de PSMA.
  6. 6.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un dominio extracelular de PSMA.
  7. 7.
    Una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y un oligonucle6tido inmunoestimulante.
  8. 8.
    Una compoSición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y una citoquina. en donde la citoquina se selecciona, opcionalmente, del grupo que consiste en IL-2, IL-12, IL-18 Y GM-CSF.
  9. 9.
    Una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y un agente antitumoral, agente inmunoestimulante o inmunomodulador.
  10. 10.
    Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que comprende, además, un soporte fannacéuticamente aceptable.
  11. 11 . Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7· 10, para uso en un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento.
  12. 12.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, unido a un resto o agente terapéutico, o a un marcador.
  13. 13.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 11 Y 12, para uso en un método de tratar, prevenir o diagnosticar cáncer, opcionalmente cáncer de próstata.
  14. 14.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antigeno según la reivindicación 3, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antlgeno del mismo inhibe al menos una actividad enzimática del dímero de proteína PSMA, y la enzima es activa en células cancerígenas y tiene menos actividad en células nonnales que en células cancerlgenas o no tiene actividad alguna en células normales.
  15. 15.
    Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 14, en donde las células cancerigenas son células de cáncer de próstata.
  16. 16.
    Una composición que oomprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 11-15, Y un soporte farmacéuticamente aceptable.
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