CN101124249A - 抗前列腺特异性膜抗原（psma）的人单克隆抗体 - Google Patents

抗前列腺特异性膜抗原（psma）的人单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明提供与PSMA高亲和力特异性结合的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本发明抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞和表达本发明抗体的方法。还提供了包含本发明抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物。本发明还提供了治疗癌症的方法。

Description

抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人单克隆抗体
发明背景
前列腺病是男性发病率和死亡率的主要原因。对于前列腺癌的治疗包括手术、激素、放射疗法和化学疗法。对于转移性前列腺疾病几乎没有有效治疗。因此，代表诊断和预后标记的基因和/或基因产物以及治疗靶标的鉴定是关键的。前列腺特异性抗原(PSA)是一种在前列腺癌的临床诊断和分期中有用的这样的癌标记。但是，在4-10ng/ml范围内PSA不能区别良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎或者前列腺癌，因此，需要细胞学和/或组织学评价来证实正确的诊断(Barren，R.J.等人(1998)Prostate 36：181-188)。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是与转铁蛋白受体具有54％同源性的大约110kD的II型跨膜糖蛋白，具有750个氨基酸。PSMA具有三个结构域，包括一个19个氨基酸的胞内结构域，一个24个氨基酸的跨膜结构域，和一个707个氨基酸的胞外结构域。PSMA蛋白质显示神经羧肽酶和叶酸水解酶活性，据报道参与前列腺生长和分化的神经内分泌调节(Heston，W.D.(1996)Urologe-Ausgabe A.35：400-407)。PSM’是位于细胞质中的PSMA的一种可变剪接形式。
PSMA主要由前列腺上皮细胞表达。在前列腺癌中，特别是在低分化的、转移的和激素难以治疗的癌中，PSMA的表达增加(Gregorakis，A.K.等人(1998)Seminars in Urologic Oncology 16：2-12；Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：85-515)。在前列腺外组织例知小肠、唾液腺、十二指肠粘膜、近端肾小管和脑中发现低水平PSMA表达(Silver，D.A.(1997)Clinical CancerResearch 3：85-515)。在一些恶性肿瘤(包括肾细胞癌和结肠癌)的肿瘤外周和肿瘤内区域中的毛细血管的内皮细胞中也表达PSMA，但是在正常组织的血管中不表达。另外，据报道PSMA与肿瘤血管生成相关(Silver，D.A.(1997)Clinical Cancer Research 3：81-85)。最近，已经证明PSMA在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌和黑素瘤中的肿瘤相关新血管系统的内皮细胞中表达(Chang，S.S.(2004)Curr Opin Investig Drugs 5：611-5)。
抗PSMA胞外域抗体已经描述(参见，例如，Liu，H.等人(1997)Cancer Res.57：3629-3634；Murphy，G.P.等人(1998)J.Urol.160：2396-2401；Wang，S.等人(2001)Int.J.Cancer92：871-876；Kato，K.等人(2003)Int.J.Urol.10：439-444；美国专利No.6,150,508和美国专利No.6,107,090)。最近，与PSMA结合的人和人源化抗体已经描述(参见，例如，Bander，N.H.等人(2003)Semin.Oncol.30：667-676；PCT公布WO 02/098897；PCT公布WO 01/09192；PCT公布WO 03/064606；PCT公布WO03/034903；和美国申请No.2004/0033229)。这些抗体已经用于对前列腺癌细胞成像(参见，例如，Yao，D.等人(2002)Semin.Urol.Oncol.20：211-218；Bander，N.H.等人(2003)J.Urol.170：1717-1721)。抗-PSMA抗体也已经在前列腺癌治疗中用于治疗性干预，一般与化疗剂或放射性同位素联合使用(参见，例如，Nanus，D.M.等人(2003)J.Urol.170：S84-89；Milowsky，M.I.等人(2004)J.Clin.Oncol.22：2522-2531；Henry，M.D.等人(2004)Cancer Res.64：7995-8001)。
因此，PSMA是一种用于治疗前列腺癌和以PSMA表达为特征的多种其他疾病的有价值的靶标。
发明内容
本发明提供与PSMA结合的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。本发明的抗体具有所需的特性，例如对PSMA的高亲和力，被表达PSMA的细胞内化的能力，和高熔解温度(meltingtemperature)。优选地本发明的抗体具有至少67℃，或者至少69℃，或者至少71℃的熔解温度。
在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或来源于人VH3-30.3基因的重链可变区，其中该抗体与PSMA特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或来源于人VKL18基因的轻链可变区，其中该抗体与PSMA特异性结合。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)人VH3-30.3基因的重链可变区；和
(b)人VKL18基因的轻链可变区；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
在另一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)人VH5-51基因的重链可变区；和
(b)人VKL18基因的轻链可变区；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
在优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO：13、14、15和16的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO：25、26、27和28的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
一种优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：9的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：21的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：25的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDR3。
另一优选组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：10的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：22的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDR3。
另一优选组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR3。
另一优选组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：12的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR3。
本发明的其他优选抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自SEQ ID NO：5、6、7和8的氨基酸序列的轻链可变区；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
一种优选的组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区。
另一优选组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区。
另一优选组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链可变区。
另一优选组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明的抗体可以是，例如，如IgG1或IgG4同种型的全长抗体。或者，这些抗体可以是抗体片段，如Fab或Fab’2片段，或单链抗体。
本发明还提供一种免疫偶联物，其包含与诸如细胞毒素或放射性同位素等治疗剂连接的本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明还提供一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的本发明的抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
还提供包含本发明的抗体或其抗原结合部分或免疫偶联物或双特异性分子和药学上可接受的载体的组合物。
本发明也包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含这些核酸的表达载体，和包含这些表达载体的宿主细胞。而且，本发明提供一种含有人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本发明的抗体，以及由这种小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生本发明的抗体。
另一方面，本发明提供一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其中该肿瘤细胞或靠近该肿瘤细胞的血管内皮细胞表达PSMA，该方法包括给该受试者施用有效抑制肿瘤细胞生长的量的本发明的抗PSMA人抗体。在一个优选实施方案中，抑制前列腺肿瘤细胞的生长。
本发明还提供基于本文提供的抗-PSMA抗体的序列制备“第二代”抗-PSMA抗体的方法。例如，本发明提供制备抗-PSMA抗体的方法，该方法包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的CDR1序列、选自SEQ ID NO：13、14、15和16的CDR2序列、和选自SEQ ID NO：17、18、19和20的CDR3序列；或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24的CDR1序列、选自SEQ ID NO：25、26、27和28的CDR2序列、和选自SEQ ID NO：29、30、31和32的CDR3序列；
(b)改变至少一个可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，所述序列选自重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，从而产生至少一个改变的抗体序列；和
(c)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
在另一方面，本发明提供一种抑制或阻止受试者中肿瘤(例如前列腺癌、结肠癌、肾癌、直肠癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤)生长的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA。该方法包括给受试者联合施用均为有效抑制或阻止肿瘤生长的量的抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和抗肿瘤剂。
在另一方面，本发明提供一种刺激受试者中肿瘤的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA。该方法包括给受试者联合施用抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和抗肿瘤剂，其量均为有效刺激肿瘤的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的量。
另一方面，本发明提供一种抑制受试者中与肿瘤相关的恶病质的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA。该方法包括给受试者联合施用抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和抗肿瘤剂，其量均为有效抑制受试者中与肿瘤相关的恶病质的量。
在本发明的一个实施方案中，给受试者联合施用抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和抗肿瘤剂导致对肿瘤生长抑制的协同效应。在另一实施方案中，抗肿瘤剂导致对肿瘤块的损害，由此导致肿瘤的更有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在另一实施方案中，抗-PSMA抗体可以是7F12、1C3、2A10、2F5或2C6抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述抗肿瘤剂是化疗剂，例如泰索帝(Taxotere)(多西紫杉醇)。在另一实施方案中，所述抗肿瘤剂是抗血管发生剂，例如制管张素K1-3、Arresten、aaAT、血管能抑素(Canstatin)、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑制素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、沙利度胺和肿瘤抑素(Tumstatin)。在另一实施方案中，所述抗肿瘤剂是免疫调节剂，如抗-PD1抗体、抗-CTLA-4抗体、硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸(1018 ISS)、GM-CSF基因疫苗、白介素-2、白介素-7(CYT 9907)、白介素-12和白介素-21。
在另一方面，本发明提供鉴定能够与抗-PSMA抗体在抑制或阻止肿瘤生长中协同作用的抗肿瘤剂的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA。该方法包括使指示成分接触(a)单独的待测抗肿瘤剂，(b)单独的抗-PSMA抗体，和(c)待测抗肿瘤剂和抗-PSMA抗体，并且将(a)单独的待测抗肿瘤剂和(b)单独的抗-PSMA抗体抑制或阻止肿瘤生长的能力与(c)待测抗肿瘤剂和抗-PSMA抗体抑制或阻止肿瘤生长的能力进行比较，其中(c)抑制或阻止肿瘤生长的程度大于(a)和(b)的加合效应将导致鉴定出能够与抗-PSMA抗体在抑制或阻止肿瘤生长中协同作用的抗肿瘤剂。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其含有有效抑制或阻止肿瘤生长的量的抗-PSMA抗体(例如7F12、1C3、2A10、2F5或2C6)和抗肿瘤剂(例如泰索帝(多西紫杉醇)、制管张素K1-3、Arresten、aaAT、血管能抑素、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑制素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、沙利度胺、肿瘤抑素、抗-PD1抗体、抗-CTLA-4抗体、硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸(1018 ISS)、GM-CSF基因疫苗、白介素-2、白介素-7(CYT 9907)、白介素-12或白介素-21)，和药学上可接受的载体，或含有有效刺激肿瘤的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的量的上述抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂以及药学上可接受的载体。
本发明的其他特征和优点通过下面的详述和实施例将是显而易见的，该详述和实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、Genbank项、专利和公布的专利申请的内容均在此处特别引入作为参考。
附图说明
图1A显示1C3人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：33)和氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：9)、CDR2(SEQ ID NO：13)和CDR 3(SEQ ID NO：17)区，并指出了V、D和J的种系来源。
图1B显示1C3人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：37)和氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：21)、CDR2(SEQ ID NO：25)和CDR 3(SEQ ID NO：29)区，并指出了V和J的种系来源。
图2A显示2A10人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：34)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：14)和CDR3(SEQ ID NO：18)区，并指出了V和J的种系来源。
图2B显示2A10人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：38)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：22)、CDR2(SEQ ID NO：26)和CDR3(SEQ ID NO：30)区，并指出了V和J的种系来源。
图3A显示2F5人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：35)和氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：11)、CDR2(SEQ ID NO：15)和CDR3(SEQ ID NO：19)区，并指出了V和J的种系来源。
图3B显示2F5人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：39)和氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：23)、CDR2(SEQ ID NO：27)和CDR3(SEQ ID NO：31)区，并指出了V和J的种系来源。
图4A显示2C6人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：36)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：12)、CDR2(SEQ ID NO：16)和CDR 3(SEQ ID NO：20)区，并指出了V和J的种系来源。
图4B显示2C6人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：40)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：24)、CDR2(SEQ ID NO：28)和CDR3(SEQ ID NO：32)区，并指出了V和J的种系来源。
图5显示1C3的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：1)与人种系VH3-30.3氨基酸序列(SEQ ID NO：41)和JH 6b种系(SEQ ID NO：45)的比对。
图6显示2A10(SEQ ID NO：2)、2F5(SEQ ID NO：3)和2C6(SEQ ID NO：4)的重链可变区氨基酸序列与人种系VH5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：42)的比对。
图7显示1C3(SEQ ID NO：5)、2A10(SEQ ID NO：6)和2F5(SEQ ID NO：7的残基1-107)的轻链可变区氨基酸序列与人种系VkL18氨基酸序列(SEQ ID NO：43)和JK4种系(SEQ ID NO：46)的比对。
图8显示2C6的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：8)与人种系VkL6氨基酸序列(SEQ ID NO：44)和JK3种系(SEQ ID NO：47)的比对。
图9显示流式细胞实验结果，该结果证明抗人PSMA的人单克隆抗体2F5、2A10和2C6与表达PSMA的LNCaP细胞的细胞表面结合。
图10显示ELISA实验结果，该结果证明抗人PSMA的人单克隆抗体与从LNCaP细胞中纯化的PSMA特异性结合。
图11A-11B是抗体结合竞争研究的结果，该结果证明抗人PSMA的人单克隆抗体2A10和7F12竞争结合表达PSMA的LNCaP前列腺癌细胞。图11A显示125I-7F12与冷7F12抗体的竞争。图11B显示125I-2A10与冷2A10抗体的竞争。
图12A-12B显示通过3H-胸苷释放试验进行的内化实验的结果，证明抗PSMA的人单克隆抗体2A10进入表达PSMA的LNCaP前列腺癌细胞中。图12A显示在导入抗体之前接种2小时的LNCaP细胞的结果。图12B显示在导入抗体之前接种过夜的LNCaP细胞的结果。
图13A-13B显示用以下任一种治疗的小鼠的平均值和中值LNCaP肿瘤异种移植物生长曲线：抗-PSMA 7F12抗体、同种型对照抗体利妥昔单抗(Rituxan)、泰索帝(2mg/kg)、泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA7F12抗体联合泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(4mg/fg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(2mg/kg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(4mg/kg)或PBS。图13C-13D显示用以下任一种治疗的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值体重变化：抗-PSMA 7F12抗体、同种型对照抗体利妥昔单抗、泰索帝(2mg/kg)、泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(4mg/kg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(2mg/kg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(4mg/kg)或PBS。
图14A-14B显示用以下任一种治疗的小鼠的平均值和中值LNCaP肿瘤异种移植物生长曲线：抗-PSMA 7F12抗体、同种型对照抗体利妥昔单抗或PBS。图14C-14D显示用以下任一种治疗的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值体重变化：抗-PSMA 7F12抗体、同种型对照抗体利妥昔单抗或PBS。
图15A-15B显示用以下任一种治疗的小鼠的平均值和中值LNCaP肿瘤异种移植物生长曲线：泰索帝(4mg/kg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(4mg/kg)或PBS。图15C-15D显示用以下任一种治疗的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值体重变化：泰索帝(4mg/kg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(4mg/kg)、抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(4mg/kg)或PBS。
图16A-16B显示用以下任一种治疗的小鼠的平均值和中值LNCaP肿瘤异种移植物生长曲线：泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(2mg/kg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(2mg/kg)或PBS。图16C-16D显示用以下任一种治疗的LNCaP荷瘤小鼠的平均值和中值体重变化：泰索帝(2mg/kg)、抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(2mg/kg)、同种型对照抗体利妥昔单抗联合泰索帝(2mg/kg)或PBS。
图17A-B显示细胞增殖试验的结果，证明毒素偶联的人单克隆抗-PSMA抗体经(A)3小时洗涤和(B)连续洗涤表现出对前列腺癌细胞的细胞毒性。
图18是给予同种型对照抗体-药物偶联物、αPSMA抗体-药物偶联物或单独的偶联缓冲液(载体)的小鼠肿瘤体积随时间的变化图。
图19是给予各种含量的αPSMA抗体-药物偶联物或单独的偶联缓冲液(载体)的小鼠肿瘤体积随时间的变化图。
图20是给予各种含量的同种型对照抗体-药物偶联物或单独的偶联缓冲液(载体)的小鼠肿瘤体积随时间的变化图。
图21是给予各种含量的同种型对照抗体-药物偶联物或单独的偶联缓冲液(载体)的小鼠随时间的体重变化图。
图22是给予各种含量的αPSMA抗体-药物偶联物或单独的偶联缓冲液(载体)的小鼠随时间的体重变化图。
图23是对于初始平均肿瘤体积为240mm3的肿瘤，给予同种型对照抗体-药物偶联物、αPSMA抗体-药物偶联物或单独的偶联缓冲液(载体)的小鼠肿瘤体积随时间的变化图。
图24是对于初始平均肿瘤体积为430mm3的肿瘤，给予αPSMA抗体-药物偶联物或单独的偶联缓冲液(载体)的小鼠肿瘤体积随时间的变化图。
发明详述
本发明涉及与PSMA高亲和力特异性结合的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体来源于特定重链和轻链种系序列，和/或包含特定结构特征，如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备该抗体的方法、含有该抗体的免疫偶联物和双特异性分子、和含有本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用该抗体的方法，例如用于治疗疾病如癌症。
为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其他的定义在发明详述内容中说明。
术语“前列腺特异性膜抗原”和“PSMA”在本文中可以互换使用，包括细胞天然表达的并且保持与本文所述抗体1C3、2A10、2F5或2C6结合的人PSMA的任何变体、同种型和物种同源物。人PSMA蛋白的完整的氨基酸序列的Genbank登录号为NP_004467。编码人PSMA蛋白的完整的cDNA序列的Genbank登录号为NM_004476。
“信号转导途径”是指在信号从一个细胞的一部分向一个细胞的另一部分传送中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。本文使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接收信号和跨过细胞质膜传播这种信号的分子和分子复合物。本发明的“细胞表面受体”的一个例子是PSMA受体。
本文提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如PSMA)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够制成一条蛋白质链，其中VL和VH区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。
本文使用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与PSMA特异性结合的分离的抗体基本不含与除PSMA以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与PSMA特异性结合的分离的抗体与诸如来自其他物种的PSMA分子等其他抗原可以具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。
本文使用的术语“人抗体”包括具有其中构架区和CDR区都来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”不包括其中来源于另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指表现为单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)中获得。
本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有其中构架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这些重组人抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列尽管是来源于人种系VH和VL序列并与之相关的序列，但可能不是在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分(repertoire)中。
本文使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和其它试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。
本文使用的术语“与人PSMA特异性结合”的抗体是指以5×10-8M或更低、更优选1×10-8M或更低、更优选5×10-9M或更低、更优选1.2×10-9M或更低、甚至更优选1.2×10-9M至1.2×10-10M之间或更低的KD与人PSMA结合的抗体。
本文使用的术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文使用的术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文使用的术语“KD”是指解离常数，它是由Kd与Ka的比值获得的(即Kd/Ka)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可能用本领域建立的方法测定。测定抗体KD的一种优选方法是使用表面等离振子共振法，优选使用生物传感器系统，如Biacore系统。
本文使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的KD为10-7M或更低、更优选10-8M或更低、更优选10-9M或更低、更优选-10M或更低。但是对于其他抗体同种型来说，“高亲和力”结合可能不同。例如，对于IgM同种型来说，“高亲和力”结合是指抗体具有10-7M或更低、更优选10-8M或更低、甚至更优选10-9M或更低的KD。
本文使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，它是指环形双链DNA环，其中可以连接另外的DNA片段。另一种载体类型是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后可以整合到宿主细胞的基因组中，由此随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够引导与它们有效连接的基因的表达。这些载体在本文中被称为“重组表达载体”(或者简称为“表达载体”)。通常在重组DNA技术中使用的表达载体常常为质粒形式。在本说明书中，
“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们起等同的功能。
本文使用的术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)是指已经导入了重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅指特定受试者的细胞，而且指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍然包含在本文使用的术语“宿主细胞”中。重组宿主细胞包括，例如，CHO细胞、转染瘤和淋巴细胞。
本文使用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。
术语“转基因非人类动物”是指具有含有一种或多种人类重链和/或轻链转基因或转染色体(整合或者非整合到动物的天然基因组DNA内)的基因组并且能够表达完全人类抗体的非人类动物。例如，转基因小鼠可能具有人轻链转基因和人重链转基因或人重链转染色体，使得该小鼠在用PSMA抗原和/或表达PSMA的细胞免疫时产生人抗-PSMA抗体。人重链转基因可以整合到小鼠的染色体DNA内，例如转基因(例如HuMAb)小鼠，或者人重链转基因可以保持在染色体外，如WO02/43478所述的转染色体(例如KM)小鼠。这些转基因和转染色体小鼠通过经历V-D-J重组和同种型转换能够产生抗PSMA人单克隆抗体的多种同种型(例如IgG、IgA和/或IgE)。
本文使用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。
本发明的各个方面在下面的部分中进一步详细描述。
抗-PSMA抗体
本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，这些抗体与人PSMA特异性结合。优选地，本发明的抗体与PSMA高亲和力结合，例如KD为5×10-7M或更低。作为另一个例子，抗体与表达PSMA的LNCaP(ATCC CRL-1740)细胞系特异性结合。评价抗体与PSMA结合能力的标准测定在本领域中公知，包括，例如ELISA、Western blots和RIA。合适的测定在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域公知的标准测定法来评价，例如ELISA、Scatchard和Biacore分析。本发明抗体的其他优选性质包括被表达PSMA的细胞内化的能力和高热稳定性。抗体的内化可以如实施例6所述评价。热稳定性可以如实施例7所述评价。本发明优选的抗体的熔点至少为65℃，更优选至少66℃，更优选至少67℃，更优选至少68℃，更优选至少69℃，更优选至少70℃，更优选至少71℃。本发明的抗体优选具有67℃至72℃，更优选68℃至72℃，或69℃至72℃，或70℃至72℃，或69℃至71.43℃的熔点，或者抗体的熔点大约为71.43℃。
单克隆抗体1C3、2A10、2F5和2C6
本发明优选的抗体是如实施例1和2所述分离并进行结构表征的人单克隆抗体1C3、2A10、2F5和2C6。1C3、2A10、2F5和2C6的VH氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：1、2、3、4中。1C3、2A10、2F5和2C6的VL氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：5、6、7、8中。
假定这些抗体中的每一个都能够与PSMA结合，则VH和VL序列可以“混合并匹配”，从而产生本发明的其他的抗-PSMA结合分子。PSMA与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如FACS或ELISA)检测。优选地，当VH和VL链混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被替换为结构上相似的VH序列。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被替换为结构上相似的VL序列。
因此，在一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自SEQ ID NO：5、6、7、8的氨基酸序列的轻链可变区；
其中该抗体与PSMA、优选与人PSMA特异性结合。
优选的重链和轻链组合包括：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链可变区；或
(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面，本发明提供包含1C3、2A10、2F5和2C6的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。1C3、2A10、2F5和2C6的VH CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：9、10、11和12中。1C3、2A10、2F5和2C6的VH CDR2的氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：13、14、15和16中。1C3、2A10、2F5和2C6的VH CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：17、18、19和20中。1C3、2A10、2F5和2C6的VK CDR1的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：21、22、23和24中。1C3、2A10、2F5和2C6的VK CDR2的氨基酸序列分别示于SEQID NO：25、26、27和28中。1C3、2A10、2F5和2C6的VK CDR3的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：29、30、31和32中。CDR区用Kabat系统(Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH出版号91-3242)勾画出。
假如这些抗体均能与PSMA结合，并且抗原结合特异性主要是由CDR1、2和3区提供的，则VH CDR1、CDR2和CDR3序列与VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有VH CDR1、CDR2和CDR3和VK CDR1、CDR2和CDR3)，从而产生本发明的其他的抗-PSMA结合分子。PSMA与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如FACS、ELISA，Biacore分析)来检测。优选地，当VH CDR序列混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当VK CDR序列混合并匹配时，来自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域技术人员而言显而易见的是，通过将一个或多个VH和/或VLCDR区序列替换为来自本文公开的单克隆抗体1C3、2A10、2F5和2C6的CDR序列的结构上相似的序列，可以产生新的VH和VL序列。
因此，在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO：13、14、15和16的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO：25、26、27和28的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中该抗体与PSMA、优选与人PSMA特异性结合。
在一个优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：9的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：21的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：25的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：10的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：22的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR3。
在另一个优选实施方案中，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：12的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR3。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
例如，在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或来源于人VH3-30.3基因的重链可变区，其中该抗体与PSMA特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或来源于人VKL18基因的轻链可变区，其中该抗体与PSMA特异性结合。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：
(a)包含产自或来源于人VH3-30.3基因(SEQ ID NO：41)的重链可变区；
(b)包含产自或来源于人VKL18基因(SEQ ID NO：43)的轻链可变区；且
其中该抗体与PSMA、优选与人PSMA特异性结合。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：
(a)包含产自或来源于人VH5-51基因(SEQ ID NO：42)的重链可变区；
(b)包含产自或来源于人VKL18基因(SEQ ID NO：44)的轻链可变区；且
其中该抗体与PSMA、优选与人PSMA特异性结合。
分别具有VH3-30.3和VkL18的VH和VK的抗体的一个例子是1C3。分别具有VH5-51和VkL18的VH和VK的抗体的例子是2A10和2F5。
在本文中，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中获得的，则该人抗体包含“产自”或“来源于”特定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。“产自”或“来源于”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以这样鉴定：将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，选择在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。“产自”或“来源于”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的有意引入而导致的氨基酸差异。但是，选择的人抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比较时确认该人抗体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一般来说，来源于特定人种系序列的人抗体显示与该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，该人抗体可能显示与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明的抗体包含的重链和轻链可变区含有与本文所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗-PSMA抗体的所需功能特性。
例如，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；
(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：5、6、7和8的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；且
(c)该抗体与表达PSMA的LNCaP细胞系特异性结合。
在另外一些实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的VH和VL区高度(即80％或更高)同源的VH和VL区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)对应于SEQ ID NO：33、34、35、36、37、38、39和40的核酸分子，然后用本文所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能(即以5×10-8M或更低的KD与人PSMA结合)。
本文使用的两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序列之间的百分同一性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数(即％同源性＝相同位点的数目/位点的总数×100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。
两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法来确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。
另外，或者可替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行检索，例如用来鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如1C3、2A10、2F5或2C6)的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗一PSMA抗体的所需功能特性。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；
(b)轻链可变区CDR 3序列包含选自SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且
(c)该抗体与表达PSMA的LNCaP细胞系特异性结合。
在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNO：13、14、15和16的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR 2序列包含选自SEQ ID NO：25、26、27和28的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQID NO：21、22、23和24的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。
本文使用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基酸置换是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括：具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以用本文所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能(即(c)所述的功能)。
与本发明的抗-PSMA抗体结合相同表位的抗体
在另一实施方案中，本发明提供与本发明的任意PSMA单克隆抗体结合相同表位的抗体(即能够与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合PSMA的抗体)。在优选实施方案中，用于交叉竞争研究的参比抗体可以是单克隆抗体1C3(具有分别如SEQ ID NO：1和5所示的VH和VL序列)或单克隆抗体2A10(具有分别如SEQ ID NO：2和6所示的VH和VL序列)或单克隆抗体2F5(具有分别如SEQ ID NO：3和7所示的VH和VL序列)或单克隆抗体2C6(具有分别如SEQ ID NO：4和8所示的VH和VL序列)。这些交叉竞争抗体可以根据它们在标准PSMA结合测定中与1C3、2A10、2F5或2C6交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA测定或流式细胞分析来证明与本发明抗体的交叉竞争。被试抗体抑制例如1C3、2A10、2F5或2C6与人PSMA结合的能力证明，该被试抗体可以与1C3、2A10、2F5或2C6竞争结合人PSMA，因此与1C3、2A10、2F 5或2C6结合人PSMA上相同的表位。在一个优选实施方案中，与1C3、2A10、2F5或2C6结合人PSMA上相同表位的抗体是人单克隆抗体。这些人单克隆抗体可以如实施例所述制备和分离。
工程化抗体和修饰的抗体
本发明的抗体还可以如下制备：用具有本文所公开的一种或多种VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，改造一种修饰的抗体，该修饰的抗体可具有与起始抗体相比改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来构建改造抗体。另外或者可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来改造抗体，例如改变该抗体的效应功能。
可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体：该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利5,225,539，和Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12、SEQ ID NO：13、14、15和16和SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24、SEQ ID NO：25、26、27和28和SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列。因此，这些抗体含有单克隆抗体1C3、2A10、2F5或2C6的VH和VLCDR序列，但是可能含有与这些抗体不同的构架序列。
这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现：“VBase”人种系序列数据库(可从因特网上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire ofHuman Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VHSegments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of HumanGerm-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；其内容均在此引用作为参考。
用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于所选择的本发明抗体使用的构架序列，例如，类似于本发明优选的单克隆抗体使用的VH3-30.3构架序列(SEQ ID NO：41)和/或VH5-51构架序列(SEQ IDNO：42)和/或VKL18构架序列(SEQ ID NO：43)和/或VKL6构架序列(SEQ ID NO：44)。VH CDR1、CDR2和CDR3序列和VK CDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到与该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者CDR序列可以被移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况中，将构架区内的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如，Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VK CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，对抗体结合的影响或者其他目标功能特性可以用此处所述和实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选引入(如上文所述的)保守修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选置换。而且，一般改变CDR区内不超过1、2、3、4或5个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗-PSMA单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区含有：(a)VH CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：9、10、11和12相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，其包含选自SEQ IDNO：13、14、15和16的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13、14、15和16相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17、18、19和20相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VK CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21、22、23和24相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VK CDR2区，其包含选自SEQ IDNO：25、26、27和28的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：25、26、27和28相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VK CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：29、30、31和32相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体包括例如为了改善抗体特性而对其VH和/或VK内的构架残基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。这种“回复突变”的抗体也包括在本发明中。例如，对于2C6，VH的氨基酸残基#9(FR1内)是丝氨酸，而在相应的VH5-51种系序列中该残基为丙氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，可以通过(例如)定点诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变“回复突变”为种系序列(例如，2C6的VH的FR1的残基9可以从丝氨酸“回复突变”为丙氨酸)。
另一个例子是，对于2F5，VH的氨基酸残基#84(FR3内)是天冬酰胺，而在相应的VH5-51种系序列中该残基为丝氨酸。为了使构架区序列恢复为其种系构型，例如，可以将2F5的VH的FR3的残基#18从天冬酰胺“回复突变”为丝氨酸。
另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、乃至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，由此降低该抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，在Carr等人的公布号为20030153043的美国专利中详细记载。
除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方案，也可以将本发明的抗体改造为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以将本发明的抗体化学修饰(例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上)，或者修饰以改变其糖基化，由此改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利No.5,677,425号中详细记载。改变CH1铰链区中半胱氨酸的数目是为了(例如)促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半衰期。更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合比天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱。该方法在Ward等人的美国专利No.6,165,745号中详细记载。
在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。可以使用各种方法。例如，如Ward的美国专利No.6,277,375所述，可以引入一个或多个如下突变：T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人的美国专利No.5,869,046和6,121,022所述，为了提高生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区内进行改变，使之含有来自IgG Fc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。
在其他一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力被改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260中更详细地描述。
在另外一个实例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体的C1q结合改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。该方法在Idusogie等人的美国专利No.6,194,551中更详细地描述。
在另外一个实例中，改变氨基酸位点239、10、11和1239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。
在另外一个实例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，通过在下列位点处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区：238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。该方法在Presta的PCT公布WO 00/42072中进一步描述。而且，人IgG1上对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。位点256、290、298、333、334和339处的特定突变显示改善了与FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了与FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在另一实施方案中，改变抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。例如，为了提高抗体对抗原的亲和力，可以改变糖基化。这样的碳水化合物修饰可以通过(例如)改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，使一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除该位点处的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利No.5,714,350和6,350,861中更详细地描述。
另外，或者可替代地，可以制备糖基化类型改变的抗体，如岩藻糖基残基数目减少的低岩藻糖基化抗体，或等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过(例如)在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域中已有描述，能够用作宿主细胞在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物中缺乏岩藻糖。通过使用两种替代载体定向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因，产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见Yamane等的美国专利申请No.20040110704和Yamane-Ohnuki等.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。另一个例子是，Hanai等的EP1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，FUT8基因编码岩藻糖转移酶，通过减少或消除了α(1，6)键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现为低岩藻糖基化。Hanai等也描述了用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上添加岩藻糖的酶活性低或不具有这种酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。Presta的PCT公布WO 03/035835记载了一种变异CHO细胞系，Lec13细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体为低岩藻糖基化(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342记载了表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的工程化细胞系，因此该工程化细胞系中表达的抗体表现为等分GlcNac结构增加，导致抗体的ADCC活性提高(参见，Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。此外，抗体的岩藻糖残基可以用岩藻糖苷酶切下。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.等.(1975)Biochem.14：5516-23)。
本发明涉及的对此处所述抗体的另一种修饰是PEG化。例如，为了提高抗体的生物(例如血清)半衰期，可以将该抗体PEG化。为了PEG化一种抗体，一般在一个或多个PEG基团可与抗体或抗体片段连接的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物进行反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。本文使用的术语“聚乙二醇”包括用来衍生化其他蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，将要PEG化的抗体是无糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的方法在本领域中公知，并且可以应用于本发明的抗体。参见，例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0401 384。
抗体工程化方法
如上所述，能够利用具有此处公开的VH和VK序列的抗-PSMA抗体，通过修饰VH和/或VK序列或与之连接的恒定区，产生新的抗-PSMA抗体。因此，在本发明的另一方面，利用本发明的抗-PSMA抗体(例如1C3、2A10、2F5或2C6)的结构特征，产生结构上相关的抗-PSMA抗体，该结构上相关的抗体保留本发明抗体的至少一种功能特性，如与人PSMA结合。如上所述，例如，1C3、2A10、2F5或2C6的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，从而产生另外的重组工程化的本发明的抗-PSMA抗体。其他类型的修饰包括以上部分所述的修饰。用于工程化方法的起始材料是此处提供的一种或多种VH和/或VK序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不一定实际制备(即表达为蛋白质)具有此处提供的一种或多种VH和/或VK序列或其一个或多个CDR区的抗体。而是利用该序列中所含的信息作为起始材料，产生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗-PSMA抗体的方法，包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的CDR1序列、选自SEQ ID NO：13、14、15和16的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：17、18、19和20的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24的CDR1序列、选自SEQ ID NO：25、26、27和28的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：29、30、31和32的CDR3序列；
(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和
(c)将所述改变的抗体序列表达为蛋白质。
可以利用标准分子生物学技术制备和表达所述改变的抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的抗体保留此处所述抗-PSMA抗体的一种、一些或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：与表达PSMA的LNCaP细胞系特异性结合。
改变的抗体的功能特性可以用本领域中使用的和/或此处所述的(如实施例中所述的)标准试验(例如流式细胞术、结合测定)来评价。
在本发明抗体的工程化方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分抗-PSMA抗体编码序列随机或选择性引入突变，并可以针对结合活性和/或如此处所述的其他功能特性，筛选获得的修饰的抗-PSMA抗体。突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和筛选抗体突变的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也记载了利用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。
编码本发明的抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法与其他细胞成分或其他掺杂物(例如其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel等ed.(1987)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York。本发明的核酸可以是，例如，DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。
本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如，由如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体，可以从文库中回收编码该抗体的核酸。
本发明优选的核酸分子是编码1C3、2A10、2F5或2C6单克隆抗体的VH和VL序列的核酸分子。编码1C3、2A10、2F5或2C6的VH序列的DNA序列分别在SEQ ID NO：33、34、35和36中示出。编码1C3、2A10、2F5或2C6的VL序列的DNA序列分别在SEQ ID NO：37、38、39和40中示出。
一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在阅读框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码VH区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与只编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子有效连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码VL区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选的是κ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO：48)的另外一个片段有效连接，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其VL和VH区通过该柔性连接体连接(参见，例如Bird等(1988)Science242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348：552-554)。
本发明的单克隆抗体的产生
本发明的单克隆抗体(mAb)能够通过多种技术制备，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善建立的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是公知的。
本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述获得的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见，例如，Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见，例如，Winter的美国专利No.5,225,539，和Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这种抗PSMA人单克隆抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称作HuMAb小鼠和KM小鼠TM的小鼠，并且在此通称为“人Ig小鼠”。
HuMab小鼠(Medarex，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源μ和κ链基因座失活的定向突变(参见，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降低，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，从而产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同上；综述Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰，在下面的文献中详细描述：Taylor，L.等(1992)Nucleic AcidsResearch 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)InternationalImmunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：825-5130；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6：579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，这些文献的内容全文在此引入作为参考。进一步参见，Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；和Surani等人的美国专利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布号WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公布号WO01/14424。
在另一实施方案中，可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本发明的人抗体。这种小鼠在此被称为“KM小鼠TM”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中详细描述。
再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-PSMA抗体。例如，可以使用一种被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统，这种小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-PSMA抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述。另外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，其能够用来产生本发明的抗-PSMA抗体。
本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中已经建立。参见，例如，Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
本发明的人单克隆抗体也可以用SCID小鼠制备，该SCID小鼠中重构了人免疫细胞，因此在免疫时能够产生人抗体应答。这种小鼠在例如Wilson等人的美国专利No.5,476,996和5,698,767中描述。
人Ig小鼠的免疫
当使用人Ig小鼠产生本发明的人抗体时，可以根据Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO01/14424所述，用表达PSMA的细胞系如LNCaP细胞系(ATCC CRL-1740)、纯化的或富集的PSMA抗原和/或重组PSMA制剂、或PSMA融合蛋白免疫该小鼠。优选地，第一次输注时小鼠为6-16周龄。例如，可以使用纯化的或重组的PSMA抗原的制剂(5-50μg)腹膜内免疫人Ig小鼠。
产生抗PSMA完全人单克隆抗体的详细程序在下面的实施例1中描述。应用各种抗原积累的经验证明，当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，转基因小鼠产生应答。但是，发现除弗氏佐剂之外的佐剂也是有效的。另外，发现在没有佐剂时，全细胞具有高度免疫原性。在免疫方案进程中用眼眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下所述)筛选血浆，用具有足够抗-PSMA人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原对小鼠进行静脉内加强免疫，3天后处死并且取出脾脏。预期每次免疫可能需要2-3次融合。每一种抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另外，HCo7和HCo12转基因可以杂交，产生具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的一种小鼠。可替代的或者另外，可以使用KM小鼠TM系。
产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤的制备
为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。针对抗原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，使用50％PEG，将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。细胞以大约2×105的密度接种于平底微量滴定板中，接着在含有20％胎克隆血清，18％“653”条件基质，5％Origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中温育两周。大约两周之后，在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA根据人单克隆IgM和IgG抗体筛选各孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天之后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗体至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体，选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱下来的IgG通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，用1.43的消光系数根据OD280确定浓度。可将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。
产生本发明单克隆抗体的转染瘤的制备
利用(例如)本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)science 229：1202)，也能在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)，获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将该DNA插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在上下文中，术语“有效连接”意思是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达宿主细胞相匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可被插入到分开的载体中，或者，更通常地，将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如，抗体基因片段上与载体上的互补限制性位点连接，或者如果不存在限制性位点的活，则平端连接)。通过将本文描述的抗体的轻链和重链可变区插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段与载体中的CH区段有效连接，而VK区段与载体中的CL区段有效连接，可以产生任意抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者可替代的，重组表达载体可以编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与该抗体链基因的氨基末端符合阅读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还带有控制该抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如在Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990))中描述。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调节元件也可由来自诸如SRα启动子系统等不同来源的序列组成，SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列和人1型T细胞白血病病毒的长末端重复序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Ce11.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调节序列以外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于筛选载体已经导入其中的宿主细胞(参见，例如，Axel等人的美国专利No.4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，选择性标记基因一般给已经导入载体的宿主细胞带来抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达该抗体，因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。据报道，抗体基因的原核表达无法高产率地产生活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，和DHFR选择性标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，用于NSO骨髓瘤细胞的另一种优选表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，培养足以使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间，而产生抗体。可应用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
抗体与抗原结合的表征
通过(例如)流式细胞术，可以检测本发明的抗体与PSMA的结合。简要地说，从组织培养瓶中新鲜收获LNCaP细胞，制备单细胞悬液。LNCaP细胞悬液直接用第一抗体染色或在用10％多聚甲醛的PBS溶液固定后染色。将约1百万个细胞重悬浮在含有0.5％BSA和50-200μg/ml第一抗体的PBS中，在冰上温育30分钟。用含有0.1％BSA，0.01％NaN3的PBS洗涤细胞两次，重悬浮在100μl的1∶100稀释的FITC-偶联的山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)中，再在冰上温育30分钟。再次洗涤细胞两次，重悬浮在0.5ml洗涤缓冲液中，用FACSCalibur血细胞计数器(Becton-Dickinson，San Jose，CA)分析荧光染色。
可替代地，通过(例如)标准ELISA，可以检测本发明的抗体与PSMA的结合。简要地说，用0.25μg/ml的纯化PSMA在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向各个孔中加入抗体的稀释液(例如，来自PSMA免疫小鼠的血浆的稀释液)，并且在37℃下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板，之后与偶联到碱性磷酸酶上的第二试剂(例如，对于人抗体，为山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下温育1小时。洗涤后，培养板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并且在OD 405-650下分析。优选地，用表现出最高效价的小鼠进行融合。
如上所述的ELISA分析也可以用来筛选表现出与PSMA免疫原有阳性反应性的杂交瘤。将与PSMA高亲合力结合的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。从每个杂交瘤中选择保留母细胞反应性的一个克隆(通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，保存在-140℃下，用于抗体纯化。
为了纯化抗-PSMA抗体，选择的杂交瘤在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，并且使用1.43的消光系数根据OD280确定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。
为了确定选择的抗-PSMA单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用商售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以使用如上所述的PSMA包被的ELISA板，应用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可以使用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb的结合。此外，也可以用放射标记的抗体进行竞争研究，未标记的竞争抗体可以在Scatchard分析中检测，如下文实施例中进一步描述。
为了确定被纯化的抗体的同种型，可以用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭之后，平板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照物在室温下反应1-2小时。这些孔然后与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述使平板显色并且分析。
可以通过Western印迹法进一步检测抗-PSMA人IgG与PSMA抗原的反应性。简要地说，制备PSMA并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待检测的单克隆抗体探针结合。人IgG的结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)显色。
免疫偶联物
另一方面，本发明涉及与诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素等治疗性部分偶联的抗-PSMA抗体或其片段。这些偶联物在此被称为“免疫偶联物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
能与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它们的衍生物。刺孢霉素抗体偶联物的一个例子是可作为商品购得的(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。
可以利用本领域使用的连接体技术将细胞毒素与本发明的抗体偶联。已经用于将细胞毒素与抗体偶联的连接体类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的连接体。可以选择(例如)在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的连接体，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。
关于细胞毒素的类型、用于偶联治疗剂与抗体的连接体和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本发明的抗体也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性免疫偶联物。能够与诊断或治疗性使用的抗体偶联的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、碘125、铟111、钇90和镥177。制备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫偶联物的例子可以作为商品获得，包括ZevalinTM(IDECPharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法使用本发明的抗体制备放射性免疫偶联物。
本发明的抗体偶联物可用于改变特定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy”，in单克隆抗体And Cancer Therapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom 等，“Antibodies For Drug Delivery”，inControlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，in单克隆抗体’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in单克隆抗体ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
双特异性分子
另一方面，本发明涉及包含本发明的抗-PSMA抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接到另一个功能性分子上，如另一个肽或蛋白质(例如另一个抗体或受体的配体)上，从而生成可与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体实际上可以被衍生化或连接到一个以上的其他功能性分子上，从而生成可与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子也包括在本文使用的术语“双特异性分子”内。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可与一个或多个其他结合分子如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)，从而得到双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，其具有至少一种对于PSMA的第一结合特异性和对于第二种目标表位的第二结合特异性。在本发明的一个特定实施方案中，第二种目标表位是Fc受体，如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括既能与表达FcγR或FcαR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))结合，又能与表达PSMA的靶细胞结合的双特异性分子。这些双特异性分子将表达PSMA的细胞导向于效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达PSMA的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或超氧阴离子的产生。
在双特异性分子是多特异性分子的本发明的一个实施方案中，除抗-Fc结合特异性和抗-PSMA结合特异性之外，该分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方案中，该第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白质结合因而增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是与诸如抗原或受体等特定分子结合，从而导致结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可与Fc受体或靶细胞抗原结合。可替代的，抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性所结合的实体。例如，抗增强因子部分可与细胞毒性T细胞结合(如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞，该细胞导致针对靶细胞的免疫应答增强)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括(例如)Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。该抗体也可以是轻链或重链二聚体，或任何其最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利No.4,946,778所述，该专利的内容引入本文作为参考。
在一个实施方案中，对于Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，该单克隆抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。本文使用的术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因中的任意一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型分组为3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，对单体IgG表现出高亲和力(108-109M-1)。
某些优选抗-Fcγ单克隆抗体的制备和表征由Fanger等人在PCT申请WO 88/00052和美国专利号4,954,617中描述，将其内容整体引入本文作为参考。这些抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点处与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位结合，因而，其结合基本不被生理学水平的IgG阻断。可用于本发明中的特定抗-FcγRI抗体为mAb22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC保藏号为HB9469。在另外一些实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征在Graziano，R.F.等(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和PCT公布WO 94/10332中描述。产生H22抗体的细胞系以HA022CL1的名称保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为CRL 11177。
在另外一些优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由可与人IgA受体如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，该抗体的结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”包括位于染色体19上的一个α-基因的基因产物(FcαRI)。已知该基因编码几个55-110kDa的可变剪接跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者均具有中等亲和力(约5×107M-1)，在暴露于诸如G-CSF或GM-CSF的细胞因子后该亲和力增加(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology16：423-440)。已描述了4种FcαRI-特异性单克隆抗体，它们被确定为A3、A59、A62和A77，它们在IgA配体结合域之外与FcαRI结合(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.148：1764)。
FcαRI和FcγRI是用于本发明的双特异性分子的优选触发受体，因为它们(1)主要表达于诸如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞的免疫效应细胞上；(2)高水平表达(如每个细胞表达5,000-100,000个)；(3)是细胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介质；(4)介导导向于它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
优选人单克隆抗体，可以在本发明的双特异性分子中使用的其他抗体包括鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
可通过应用本领域中公知的方法偶联组成的结合特异性，如抗-FcR和抗-PSMA结合特异性，来制备本发明的双特异性分子。例如，双特异性分子的每一种结合特异性可分开生成，然后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己基-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mit.No.78，118-132)；Brennan等(1985)Science 229：85-513和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375所描述的方法。优选的偶联剂为SATA和硫代-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可通过两个重链的C-末端铰链区的巯基键合而偶联。在一个特别优选的实施方案中，对铰链区进行修饰以使其在偶联前含有奇数个，优选1个巯基残基。
可替代的，两种结合特异性可在同一载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb x mAb，mAb x Fab，Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法例如在美国专利No.5,260,203、美国专利No.5,455,030、美国专利No.4,881,175、美国专利No.5,132,405，美国专利No.5,091,513、美国专利No.5,476,786、美国专利No.5,013,653、美国专利No.5,258,498和美国专利No.5,482,858中描述。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或Western印迹分析来证实。这些试验中的每一个通常通过应用对目标复合物具有特异性的标记试剂(如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以利用识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，这些复合物可利用多种其他免疫分析中的任一种来检测。例如，可对抗体进行放射性标记并且在放射免疫测定(RIA)中使用(参见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，1986年3月，在此引入作为参考)。通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或者通过放射自显影方法，能够检测放射性同位素。
药物组合物
另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的抗体或免疫偶联物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以含有与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体组合(或免疫偶联物或双特异性分子)。
本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的抗-PSMA抗体联合至少一种其他的抗炎剂或免疫抑制剂。可在联合治疗中使用的治疗剂的例子在下面本发明抗体的应用一节中更详细地描述。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子包裹上一种材料，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用诸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。
这些组合物还可含有辅料，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了任何常规介质或试剂任何与活性化合物不相容以外，包括其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基础分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的受试者和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。
调节剂量方案，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于抗体的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。一个治疗方案的例子需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本发明的抗-PSMA抗体的优选剂量方案包括经静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用如下剂量方案之一给药：(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在该情况中，每种抗体的给药剂量落在所述范围内。抗体通常多次给药。单次给药之间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不定期的，例如通过测定患者中抗靶抗原的抗体的血液水平来确定。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。
可替代地，抗体也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况下需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应、而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、应用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料、接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史、以及医学领域中公知的类似因素。
本发明的抗-PSMA抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于PSMA+肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，更优选至少约60％，更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。可替代地，也可以通过本领域技术人员公知的试验检查该化合物的体外抑制能力，来评价组合物的这种性能。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如受试者的大小、受试者症状的严重程度和选择的特定组合物或给药途径。
本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。如此处所用的短语“肠胃外给药”是指肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可替代地，本发明的抗体也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利在此引入作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。
在某些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本发明的应用和方法
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有涉及诊断和治疗与PSMA表达有关的疾病的许多体外和体内诊断和治疗应用。例如，这些分子可以施用于(例如)在体外或离体培养的细胞，或者例如在体内施用于人类受试者，从而治疗、预防或诊断多种疾病。本文使用的术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、猪、鸡、鸟类、两栖类动物和爬行类动物。优选的受试者包括患有与PSMA表达有关的疾病的人类患者。这些方法特别适合治疗患有异常PSMA表达相关疾病的人类患者。当抗PSMA抗体与另一种药物一起给药时，这两种药物可以相继或同时给药。
在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如抗体或免疫偶联物)的适当途径在本领域中公知，可以由本领域技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过(例如静脉内或皮下)注射给药。使用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或配方。
在一个实施方案中，可以在开始时检测本发明的抗体与体外治疗或诊断应用有关的结合活性。例如，可以利用ELISA和流式细胞测定法检测本发明的组合物。而且，可以测定这些分子引发至少一种效应细胞介导的效应细胞活性(包括抑制表达PSMA的细胞的生长和/或杀伤)的活性。测定效应细胞介导的ADCC的方案在下面的实施例中描述。
A.检测方法
在一个实施方案中，本发明的抗体可以用来检测PSMA的水平，或在膜表面上含有PSMA的细胞的水平，然后可以将这些水平与特定疾病症状相关联。
在一个具体实施方案中，本发明提供检测样品中PSMA抗原的存在或测定细胞表面上PSMA抗原的量的方法，包括在允许在抗体或其部分与PSMA之间形成复合物的条件下，将样品和对照样品与特异性结合PSMA的抗体或其抗原结合部分相接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比复合物形成的不同指示样品中存在PSMA抗原。例如，可以使用本发明的组合物进行本领域众所周知的标准检测方法，如ELISA和流式细胞测定。
因此，在一个方面，本发明进一步提供检测样品中PSMA(例如人PSMA抗原)的存在或测定PSMA的量的方法，包括在允许在抗体或其部分与PSMA之间形成复合物的条件下，将样品和对照样品与特异性结合PSMA的本发明的抗体或其抗原结合部分相接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比复合物形成的不同指示样品中存在PSMA。
本发明的组合物也可以用来靶向表达PSMA的细胞，例如用于标记这些细胞。为此应用，可以将结合剂与可被检测到的分子连接。因此，本发明提供用于离体或在体内定位表达PSMA的细胞的方法。可检测标记物可以是，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
B.PSMA+细胞的生长的抑制
该抗体可以用来抑制表达PSMA的细胞的生长，这又可以与PSMA表达相关的某些疾病症状的预防或缓解相关联。与非疾病状态相比疾病状态期间PSMA表达的差异可以如下确定：在允许在抗体与PSMA之间形成复合物的条件下，使来自该疾病患者的试样和对照样品与抗PSMA抗体接触。检测在抗体与PSMA之间形成的任何复合物，并对样品和对照进行比较。
例如，该抗体可以用来在体内或在体外引起一种或多种下列生物活性：抑制表达PSMA的细胞的生长和/或杀伤；在人效应细胞存在下介导表达PSMA的细胞的吞噬作用或ADCC；抑制可溶性PSMA的脱落。如本文所述，与岩藻糖基化形式的抗体相比，本发明的抗体表现出增强的ADCC活性。
因此，在另一方面，本发明提供一种抑制PSMA+细胞的生长的方法，包括在足以诱导所述细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的条件下，使所述细胞接触抗-PSMA抗体。例如，该细胞可以是肿瘤细胞。在一个优选实施方案中，抗-PSMA抗体是人抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以用来调节靶细胞上的PSMA水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽(capping)以及将其清除。抗-Fc受体抗体的混合物也可以用于该目的。
靶标特异性效应细胞，例如与本发明的组合物连接的效应细胞，也可以用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性细胞、自然杀伤细胞和其他带有IgG或IgA受体的细胞。需要时，效应细胞可以从所治疗的受试者中获得。靶标特异性效应细胞可以作为在生理学可接受的溶液中的细胞悬浮液施用。施用的细胞数可以是108-109个的数量级，但是根据治疗目的而不同。通常，该量足以获得在靶细胞处例如在表达PSMA的肿瘤细胞处的局部化，以及通过例如吞噬作用实现对细胞的杀伤。施用途径也可以不同。
应用靶标特异性效应细胞的治疗可以与其他清除靶细胞的技术一起进行。例如，使用本发明的组合物和/或带有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤治疗可以与化学治疗一起使用。另外，可以应用联合免疫治疗将两种不同的细胞毒性效应群体导向至肿瘤细胞排斥。
C.免疫偶联物的应用和联合治疗
在一个实施方案中，通过将化合物与抗体连接，本发明的免疫偶联物可以将目标化合物(例如治疗剂、标记物、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向至具有PSMA细胞表面受体的细胞。因此，本发明也提供用于离体或在体内定位表达PSMA的细胞的方法(例如应用可检测标记物，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。可替代地，免疫偶联物通过将细胞毒素或放射性毒素靶向至PSMA，也可以用来杀伤具有PSMA细胞表面受体的细胞，如表达PSMA的肿瘤细胞，由此消除肿瘤细胞。
在另外一些实施方案中，可以另外用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的药物治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在治疗过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。
在另一实施方案中，可以对用本发明的抗体组合物治疗的患者另外施用(在施用本发明的抗体之前、同时或之后)另一种治疗剂，如增强或加强人抗体的治疗效果的细胞毒剂或放射性毒剂。抗体可以与该治疗剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与该治疗剂分开给药。对于后者(分开给药)，抗体可以在治疗剂之前、之后或同时给药，或者可以与其他已知治疗(如抗癌治疗，例如放射治疗)共同应用。这些治疗剂特别包括，抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲，它们本身仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平时有效。顺铂以100mg/ml的剂量静脉内给药，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的剂量静脉内给药，每21天1次。本发明的抗-PSMA抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，它们通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同机制起作用。这种共同给药能够解决由于发展耐药性或肿瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应性)引起的问题。
D.癌症的治疗
已经证明PSMA在肿瘤细胞如前列腺癌肿瘤细胞上表达，也已证明在靠近癌细胞的血管内皮细胞如尿道上皮癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞和肝转移性腺癌细胞上表达(见美国专利No.6,136,311)。因此，本发明的抗体通过抑制表达PSMA的肿瘤细胞的生长或者通过抑制靠近肿瘤细胞的血管内皮细胞的生长，可以用来治疗癌症。因此，在另一实施方案中，本发明提供一种抑制受试者中肿瘤生长的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞是PSMA+，其中给受试者施用本发明的抗-PSMA抗体，使肿瘤的生长受到抑制。对于人类受试者，抗体优选是人源化或人抗体。在一个优选实施方案中，肿瘤细胞是前列腺癌细胞。在其他实施方案中，肿瘤细胞来自于诸如结肠癌、肾癌、直肠癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤等癌。
本发明的治疗方法包括给受试者施用有效治疗或预防疾病的量的本发明的抗体组合物。抗体组合物可以单独施用或与诸如细胞毒剂或放射性毒剂等另一种治疗剂一起施用(与抗体偶联或与抗体一起施用)，该另一种治疗剂与抗体组合物联合或协同起作用，以治疗或预防与PSMA表达相关的疾病。
本发明的治疗方法还包括给受试者联合施用抗-PSMA抗体和另一种药物，如抗肿瘤剂，该另一种药物与抗体组合物联合或协同作用，以治疗或预防与PSMA表达有关的疾病。如本文所示，抗-PSMA抗体7F12和泰索帝(多西紫杉醇)联用导致在动物模型中抑制肿瘤生长，以及治愈动物与肿瘤相关的恶病质(见实施例8)。不受机理所限制，据认为使用抗肿瘤剂导致肿瘤块的损害，因此使抗体、效应细胞或替代效应成分能够改进地进入，导致更有效的细胞毒性。在一个实施方案中，使用抗肿瘤剂导致肿瘤块的损害，从而使效应细胞能够进入肿瘤，导致肿瘤细胞的更有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在另一个实施方案中，使用抗肿瘤剂例如微管抑制剂使肿瘤细胞对由抗PSMA介导的杀伤本质上更敏感。在本发明的一个实施方案中，施用抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂获得的协同或加合效应不依赖于或者并非起因于PSMA抗原对基底侧质膜的顶极性(apicalpolarity)的逆转。
本文使用的术语“抗-PSMA抗体”包括与人前列腺特异性膜抗原特异性结合的任何抗体。这些抗体的例子包括本文所述的抗体、美国专利申请No.10/059989和PCT公开号WO 03064606A3所述的抗体，或美国临时申请No.60/660431所述的抗体。上述每一申请的完整内容均引入本文作为参考。
本文使用的术语“抗肿瘤剂”包括可以用来(例如部分或全部)破坏或帮助破坏肿瘤的任何试剂。在一个实施方案中，抗肿瘤剂能够引起肿瘤块的损害，由此使效应细胞能够更容易地进入肿瘤，导致肿瘤细胞的更有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。术语“抗肿瘤剂”包括化疗剂、血管发生抑制剂、微管阻断剂、免疫调节剂、DNA嵌入剂/交联剂、DNA合成抑制剂、DNA-RNA转录调节剂、酶抑制剂和基因调节剂。
术语“化疗剂”包括任何可以用来治疗癌症(例如前列腺癌)的试剂。化疗剂包括烷化剂、抗代谢物、植物生物碱、抗肿瘤抗生素和类固醇激素。化疗剂的具体例子包括但不限于全反式维甲酸、氨鲁米特、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素(Blenoxane)、白消安(Myeleran)、卡铂、碳铂(伯尔定)、卡莫司汀(BCNU)、卡培他滨、CCNU(洛莫司汀)、苯丁酸氮芥(留可然)、2-氯脱氧腺苷(2-CDA；克拉屈滨、克拉立平)、顺-铂(Platinol)、顺铂(顺-DDP)、顺铂硫酸博来霉素、苯丁酸氮芥、环磷酰胺(Cytoxanl CTX)、环磷酰胺羟基脲、阿糖胞苷(Ara-C；胞嘧啶阿拉伯糖苷)、柔红霉素(Cerubidine)、达卡巴嗪(DTIC；二甲基三氮烯咪唑羧酰胺)、更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；柔毛霉素)、己烯雌酚、多西紫杉醇(泰索帝)、去氧氟尿苷、多柔比星(亚德里亚霉素)、表柔比星、乙炔雌二醇(Ethinyl estradoil)、依托泊苷(Etopaside)(VP-16、VePesid)、氟尿嘧啶(5-Fu；氟脲嘧啶脱氧核苷、氟脱氧尿嘧啶；FUdR)、氟达拉滨(Fludara)、氟他胺、氟甲睾酮、吉西他滨(Gemzar)、赫赛汀(曲妥单抗；抗-HER 2单克隆抗体)、羟基脲(Hydrea)、己酸羟孕酮、伊达比星、异环磷酰胺(Ifex)、干扰素α、伊立替康(CPT-11)、L-天冬酰胺酶、亮丙瑞林、二氯甲基二乙胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑(Melphelan)(Alkeran)、巯嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)、氨甲喋呤(MTX；甲氨喋呤)、丝裂霉素(丝裂霉素C)、米托坦(o，p′-DDD)、米托蒽醌(Novantrone)、奥沙利铂、紫杉醇(Taxol)、培美曲塞、喷司他丁(2-脱氧柯福霉素)、普卡霉素(光辉霉素)、泼尼松、丙卡巴肼(Matulane；N-甲基肼、MIH)、Rituxin(Rituximap)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链佐星、红豆杉醇(Taxol)、他莫昔芬、替尼泊苷、Tertiposide、丙酸睾丸酮、硫鸟嘌呤(6-硫代鸟嘌呤；TG)、塞替派、雷替曲塞(Raltitrexed)、托泊替康(和美新；(S)-10-[(二甲氨基)甲基]4-乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃[3′，4′)、曲奥舒凡(Ovastat)、戊柔比星、长春碱(VLB；Velban)、长春新碱(Oncovin)、长春地辛和长春瑞滨(Navelbine)。
术语“微管阻断剂”包括任何能够破坏微管的正常组织和动力学的药物。微管阻断剂的例子包括但不限于紫杉烷类(泰素(紫杉醇)、泰索帝(多西紫杉醇))、长春花碱类(长春碱、长春新碱(Oncovin)、长春地辛(Eldisine、Fildesin)、长春瑞滨(Navelbine))、2-甲氧雌二醇(2ME2)、雌莫司汀、埃博霉素(epothilones)、秋水仙碱、多拉司他汀15、诺考达唑、鬼臼毒素、根霉素。
术语“血管发生抑制剂”和“抗血管发生剂”在本文中可以互换使用，包括任何能够阻止或抑制血管形成的药物。血管发生抑制剂的具体例子包括但不限于制管张素K1-3、Arresten、aaAT、血管能抑素、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑制素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、(±)-沙利度胺和肿瘤抑素。
术语“免疫调节剂”包括任何调节(例如刺激)免疫应答的药物。免疫调节剂的例子包括，例如单独或组合的抗-PD1抗体和抗-CTLA-4抗体，尤其如2005年5月9日提交的美国临时申请No.60/679,466；PCT公开WO 01/14424；2005年11月21日提交的美国临时申请60/738,434；和2005年12月8日提交的美国临时申请-----------(代理人案卷号MEDX-0124US2或04280/1203401-US1)所述，其完整内容引入本文作为参考。
在本发明的方法中可以使用的其他免疫调节剂包括阻断共刺激信号(例如CD28或ICOS)的抗体、通过CTLA4激活抑制信号的抗体、和/或抗其他免疫细胞标记物(例如CD40、CD40配体或细胞因子)、融合蛋白(例如CTLA4-Fc、PD-1-Fc)和免疫抑制药物(例如雷帕霉素、环孢素A或FK506)的抗体。免疫调节剂的其他例子包括硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸(1018ISS)、GVAX(一种GM-CSF基因疫苗)、白介素(例如，白介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7(CYT 99 07)、-8、-9、-10、-11、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29和-30)，例如重组白介素抗体，例如IL-2，例如阿地白介素，例如重组白介素(例如重组白介素-21(rIL-21))，例如IL-11，例如奥普瑞白介素，例如白介素受体拮抗剂，例如IL-1受体拮抗剂，例如阿那白滞素、葡糖脑苷脂酶，例如伊米苷酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子和T细胞因子。
DNA嵌入剂/交联剂的例子包括但不限于博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)(顺铂)、美法仑、米托蒽醌和奥沙利铂。
DNA合成抑制剂的例子包括但不限于(±)-氨甲喋呤(氨甲喋呤)、3-氨基-1，2，4-苯并三唑1，4-二氧化物、氨喋呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5′-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲和丝裂霉素C。
DNA-RNA转录调节剂的例子包括但不限于放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、高三尖杉酯碱和伊达比星。
酶抑制剂的例子包括但不限于S(+)-喜树碱、姜黄色素、(-)-鱼藤素、5，6-二氯苯-咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美坦、福司曲星、Hispidin、2-亚氨基-1-咪唑烷乙酸(环肌酸)、洛伐他汀、曲古抑菌素A、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 34和酪氨酸磷酸化抑制剂AG879。
基因调节剂的例子包括但不限于5-氮杂-2′-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化甾醇(维生素D3)、4-羟泰米芬、褪黑激素、米非司酮、雷洛昔芬、全反式视黄醛(维生素A醛)、维甲酸、全反式(维生素A酸)、9-顺式-维甲酸、13-)顺式-维甲酸、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬和曲格列酮。
本发明的方法还包括给受试者联合施用免疫偶联物(包含与诸如细胞毒素或放射性同位素等治疗剂连接的抗-PSMA抗体或其抗原结合部分)和抗肿瘤剂，该抗肿瘤剂与抗体组合物一起或协同作用，治疗或预防与PSMA表达有关的疾病。
本发明的方法进一步包括给受试者联合施用双特异性分子(包含与第二功能部分连接的抗-PSMA抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与该抗体不同的结合特异性)和抗肿瘤剂，该抗肿瘤剂与抗体组合物一起或协同作用，治疗或预防与PSMA表达有关的疾病。抗肿瘤剂可以以本领域公知或者如本文(见药物组合物)所述的任意治疗有效剂量施用。
抗-PSMA抗体可以与一种抗肿瘤剂联合施用。抗-PSMA抗体也可以与两种或多种抗肿瘤剂联合施用。
抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂可以同时施用。例如，抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂可以在一种药物制剂中一起施用。在另一实施方案中，抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂可以作为两种或多种分开的药物制剂同时施用。
抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂也可以在不同时间施用。例如，抗肿瘤剂可以在施用抗-PSMA抗体之前施用(例如在施用抗-PSMA抗体之前约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、24或48小时)。或者，抗-PSMA抗体可以在施用抗肿瘤剂之前施用(例如在施用抗肿瘤剂之前约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、24或48小时)。在一个实施方案中，可以按照本文表1所述的给药方案，联合施用抗-PSMA抗体与抗肿瘤剂。
药盒
本发明的范围内还包括含有本发明的抗体和使用说明的药盒。该药盒可以进一步含有一种或多种另外的药物，如免疫刺激剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或一种或多种本发明的其他抗体(例如，具有补充活性的人抗体，它与PSMA抗原上与第一人抗体不同的表位结合)。药盒一般包括标明该药盒内容物目标用途的标签。术语标签包括在药盒上提供或与药盒一起提供或以其他方式随药盒提供的任何书面或记录材料。
本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将这些实施例理解为进一步的限制。全部附图和在本申请中引用的全部参考文献、专利和公开专利申请的内容均在此引用作为参考。
实施例
实施例1：抗PSMA人单克隆抗体的制备
抗原
免疫方案使用表达PSMA的前列腺癌细胞系LNCaP(ATCC CRL-1740)的细胞作为抗原。
转基因HuMAb小鼠
用表达人抗体基因的HuMAb转基因小鼠的HCo12系制备抗PSMA的完全人单克隆抗体。在该小鼠系中，已经如Chen等(1993)EMBO J.12：815-5120所述将内源小鼠κ轻链基因纯合地破坏，并且已经如PCT公布WO 01/09187的实施例1所述将内源小鼠重链基因纯合地破坏。而且该小鼠系携带如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology14：845-851所述的人κ轻链转基因KCo5，和如PCT公开WO 01/09187的实施例2所述的人重链转基因HCo12。
HuMab的免疫：
为了产生抗PSMA的完全人单克隆抗体，用表达PSMA的LNCaP细胞作为抗原免疫HuMAb小鼠。对于HuMab小鼠的一般性免疫方案在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851和PCT公开WO98/24884中描述。在第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。用5-10×106细胞腹膜内(IP)、皮下(Sc)或通过足垫注射免疫HuMAb小鼠。
转基因小鼠用在完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原腹膜内免疫两次，然后用在不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原IP免疫3-21天(最多总共11次免疫)。通过眼眶后采血监测免疫应答。通过ELISA对血浆进行筛选(如下文所述)，用具有足够的抗-PSMA人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原经静脉内对小鼠进行加强免疫，3天后处死并取出脾脏。典型地，每种抗原进行10-35个融合。每种抗原免疫几十只小鼠。
产生抗-PSMA抗体的HuMab小鼠的选择
为了选择产生可与PSMA结合的抗体的HuMab小鼠，通过流式细胞术针对与表达PSMA的前列腺癌细胞系LNCaP结合而不与阴性前列腺癌细胞系结合，筛查来自被免疫小鼠的血清。简要地说，通过LNCaP细胞与20μg/ml的抗PSMA抗体一起温育，评价抗PSMA抗体的结合。洗涤细胞，用FITC-标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。进一步如Fishwild，D.等(1996)所述，通过ELISA检测与表达PSMA的LNCaP细胞结合而不与不表达PSMA的前列腺癌细胞结合的抗体与PSMA的结合。简要地说，用在PBS中浓度为1-2μg/ml的纯化PSMA以100μl/孔的量包被微量滴定板，4℃下温育过夜，然后用PBS/Tween(0.05％)中的5％胎牛血清以200μl/孔封闭。将来自PSMA免疫的小鼠的血清稀释液加入各孔中，在室温下温育1-2小时。用PBS/Tween洗板，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG多克隆抗体在室温下温育1小时。洗涤后，培养板用ABTS底物(Sigma，A-1888，0.22mg/ml)显色，并用分光光度计在OD 415-495下分析。用显示最高抗-PSMA抗体效价的小鼠进行融合。融合如下文所述进行，通过ELISA检测杂交瘤上清液的抗-PSMA活性。
产生抗PSMA人单克隆抗体的杂交瘤的产生
根据标准程序，用PEG将从HuMab小鼠中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后根据抗原特异性抗体的产生筛选获得的杂交瘤。使用50％PEG(Sigma)将来自被免疫小鼠的脾细胞单细胞悬液与1/4数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC CRL 1581)融合。将细胞以约1×105/孔的密度接种于平底微量滴定板上，然后在选择性培养基中温育约两周，该培养基含有10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件介质、在DMEM(Mediatech，CRL 10013，含有高浓度葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠)中的3-5％origen(IGEN)+5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma，CRL P-7185)。1-2周后，将细胞在用HT替代了HAT的培养基中培养。然后通过ELISA(如上所述)针对人抗PSMA单克隆IgG抗体筛查各个孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果对于人IgG仍然是阳性，则通过有限稀释将抗PSMA单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量的抗体用于进一步表征。
选择杂交瘤克隆1C3、2A10、2F5、2C6进一步分析。
实施例2：人单克隆抗体1C3、2A10、2F5和2C6的结构表征
利用标准PCR技术分别从1C3、2A10、2F5和2C6杂交瘤中获得编码1C3、2A10、2F5和2C6单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并利用标准DNA测序技术进行测序。
1C3的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1A和SEQID NO：33和1中。
1C3的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1B和SEQID NO：37和5中。
1C3重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，1C3重链应用了来自人种系VH 3-30.3的VH区段、未确定的D区段和来自人种系JH 6b的JH区段。1C3VH序列与种系VH 3-30.3序列的比对显示在图5中。利用Kabat CDR区确定系统对1C3VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1A和5以及SEQ ID NO：9、13和17所示。
1C3轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，1C3轻链应用了来自人种系VK L18的VL区段和来自人种系JK4的JK区段。1C3VL序列与种系VK L18序列的比对显示于图7中。利用Kabat CDR区确定系统对1C3VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1B和7以及SEQ ID NO：21、25和29所示。
2A10的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2A和SEQ ID NO：34和2中。
2A10的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2B和SEQ ID NO：38和6中。
2A10重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，2A10重链应用了来自人种系VH 5-51的VH区段、来自人种系7-27的D区段和来自人种系JH 2的JH区段。2A10VH序列与种系VH5-51序列的比对显示于图6中。利用Kabat CDR区确定系统对2A10VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2A和6以及SEQ ID NO：10、14和18所示。
2A10轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，2A10轻链应用了来自人种系VK L18的VL区段和来自人种系JK 4的JK区段。2A10VL序列与种系VK L18序列的比对显示于图7中。利用Kabat CDR区确定系统对2A10VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2B和7以及SEQ ID NO：22、26和30所示。
2F5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3A和SEQID NO：35和3中。
2F5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3B和SEQID NO：39和7中。
2F5重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，2F5重链应用了来自人种系VH 5-51的VH区段、来自人种系7-27的D区段和来自人种系JH 2的JH区段。2F5VH序列与种系VH5-51序列的比对显示于图6中。利用Kabat CDR区确定系统对2F5VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图3A和6以及SEQ ID NO：11、15和19所示。
2F5轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，2F5轻链应用了来自人种系VK L18的VL区段和来自人种系JK 4的JK区段。2F5 VL序列与种系VK L18序列的比对显示于图7中。利用Kabat CDR区确定系统对2F5VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图3B和7以及SEQ ID NO：23、27和31所示。
2C6的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4A和SEQID NO：36和4中。
2C6的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4B和SEQID NO：40和8中。
2C6重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，2C6重链应用了来自人种系VH 5-51的VH区段、来自人种系6-13的D区段和来自人种系JH 4b的JH区段。2C6VH序列与种系VH5-51序列的比对显示于图6中。利用Kabat CDR区确定系统对2C6VH序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图4A和6以及SEQ ID NO：12、16和20所示。
2C6轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，2C6轻链应用了来自人种系VK L6的VL区段和来自人种系JK3的JK区段。2C6VL序列与种系VK L6序列的比对显示于图8中。利用Kabat CDR区确定系统对2C6 VL序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图4B和8以及SEQ ID NO：24、28和32所示。
实施例3：抗-PSMA人单克隆抗体的结合特异性表征
在该实施例中，通过利用表达PSMA的前列腺癌细胞系的流式细胞术以及通过使用纯化的PSMA的ELISA检测了结合特异性。
通过流式细胞术检测结合特异性
利用表达人PSMA的前列腺癌细胞系LNCaP通过流式细胞术检测了抗-PSMA人单克隆抗体的特异性。2F5、2A10和2C6抗-PSMA人单克隆抗体的结合如下评价：将LNCaP细胞与不同浓度的抗-PSMA人单克隆抗体一起温育。洗涤细胞，用FITC-标记的抗-人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。人抗-PSMA单克隆抗体7F12(如PCT公开WO03/064606所述)作为阳性对照，非-PSMA特异性同种型对照抗体作为阴性对照。结果显示在图9中。抗-PSMA人单克隆抗体2F5、2A10和2C6与表达PSMA的LNCaP细胞特异性结合。
通过ELISA检测结合特异性
抗-PSMA抗体与免疫纯化的PSMA结合的比较通过标准ELISA进行，以检查对于PSMA结合的特异性。
从LNCaP细胞免疫纯化PSMA，检测与抗-PSMA人单克隆抗体1C3、2A10、2F5和2C6的结合。进行标准ELISA程序。以5μg/ml的浓度加入抗-PSMA人单克隆抗体，以1∶2连续稀释向下滴定。与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊-抗-人IgG(κ链特异性)多克隆抗体作为第二抗体。人抗-PSMA单克隆抗体7F12作为阳性对照，空白作为阴性对照。结果显示在图10中。抗-PSMA人单克隆抗体2A10和2F5与PSMA高特异性结合。在ELISA测定中，抗-PSMA人单克隆抗体1C3和2C6显示为可检测到，但是只与PSMA低水平结合，提示在ELISA测定中这些抗体与受阻的表位结合。
实施例4：抗-PSMA单克隆抗体的结合亲和力的Scatchard分析
采用Scatchard分析检测了2A10抗体对表达PSMA的前列腺癌LNCaP细胞系的结合亲和力。
LNCaP细胞从ATCC获得(CRL-1740)并在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中生长。胰蛋白酶消化该细胞，用基于Tris的结合缓冲液(24mM Tris pH 7.2，137mM NaCl，2.7mM KCl，2mM葡萄糖，1mM CaCl2，1mM MgCl2，0.1％BSA)洗一次，用结合缓冲液将细胞调节至2×106细胞/ml。微孔板(MAFB NOB)用1％脱脂奶粉水溶液包被，并在4℃下贮存过夜。用0.2ml结合缓冲液洗板三次。向最大结合孔中加入单独50微升缓冲液(总结合)。向对照孔中加入单独25微升缓冲液(非特异性结合)。向所有孔中加入体积为25μl的不同浓度的125I-抗-PSMA抗体。向对照孔中加入体积为25μl的100倍过量的不同浓度的未标记的抗体，并向所有孔中加入在结合缓冲液中的25μl LNCaP细胞(2×106细胞/ml)。将板在4℃摇床上以200RPM温育2小时。在温育结束时，用0.2ml冷洗涤缓冲液(24mM Tris pH7.2，500mM NaCl，2.7mM KCl，2mM葡萄糖，1mM CaCl2，1mM MgCl2，0.1％BSA)洗微孔板三次。取出滤膜，用γ计数器计数。使用Prism软件(San Diego，CA)用单位点结合参数进行平衡结合的评价。
根据上述Scatchard结合测定，2A10抗体对于LNCaP细胞的KD接近0.8nM。
实施例5：表位竞争结合测定
利用竞争测定比较抗-PSMA单克隆抗体2A10与已知的抗-PSMA抗体7F12(在PCT公开WO 03/064606中描述)，以检测两种抗体是否与相同的表位区结合。
LNCaP细胞从ATCC获得(CRL-1740)，并在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中生长。胰蛋白酶消化该细胞，用基于Tris的结合缓冲液(24mM Tris pH 7.2，137mM NaCl，2.7mM KCl，2mM葡萄糖，1mM CaCl2，1mM MgCl2，0.1％BSA)洗涤一次，将细胞在结合缓冲液中调节至2×106细胞/ml。微孔板(MAFB N0B)用1％脱脂奶粉水溶液包被，并在4℃下贮存过夜。用0.2ml结合缓冲液洗板三次。向孔中加入25微升单独的缓冲液(非特异性结合)。向所有孔中加入体积为25μl的固定浓度的125I-抗-PSMA抗体。向孔中加入体积为25μl的不同浓度的未标记的抗体，并向所有孔中加入在结合缓冲液中的LNCaP细胞(2×106细胞/ml)。将板在4℃摇床上以200RPM温育2小时。在温育结束时，用0.2ml冷洗涤缓冲液(24mM Tris pH 7.2，500mM NaCl，2.7mM KCl，2mM葡萄糖，1mM CaCl2，ImM MgCl2，0.1％BSA)洗微孔板三次。取出滤膜，用γ计数器计数。使用Prism软件(San Diego，CA)用单位点结合参数进行平衡结合的评价。同种型对照抗体作为阴性对照。针对125I-2A10的竞争结合的结果显示在图11A中，针对125I-7F12的竞争结果显示在图11B中。结果表明，加入未标记的7F12抗体抑制了标记的2A10与LNCaP细胞的结合，加入未标记的2A10抗体抑制了标记的7F12与LNCaP细胞的结合。这证明2A10和7F12抗-PSMA抗体与PSMA上相同或非常类似的表位结合。
实施例6：抗-PSMA单克隆抗体的内化
使用Hum-Zap内化试验检测了抗-PSMA HuMAb向表达PSMA的前列腺癌细胞中内化的能力。Hum-Zap通过第二抗体的结合检测第一人抗体的内化，该第二抗体具有对偶联到毒素肥皂草毒蛋白(saporin)上的人IgG的亲和性。
表达PSMA的前列腺癌细胞系LNCaP以2.5×104细胞/孔接种到100μl孔中过夜或在次日两个小时的时间。向孔中加入初始浓度为30nM的抗-PSMA抗体2A10或7F12，以1∶3连续稀释向下滴定。对于PSMA非特异性的同种型对照抗体作为阴性对照。以11nM的浓度加入Hum-Zap(Advanced Targeting Systems，IT-22-25)，将板温育48小时。然后用1.0μCi 3H-胸苷对板进行脉冲24小时，收获，用Top Count闪烁计数仪(Packard Instruments)读数。结果显示在图12中。抗-PSMA抗体2A10显示在表达PSMA的LNCap前列腺癌细胞中3H-胸苷掺入依赖于抗体浓度地降低。该数据证明抗-PSMA抗体2A10内化到前列腺癌细胞系中。
实施例7：通过差示扫描量热法测定抗-PSMA单克隆抗体的热稳定性
使用对抗体熔解温度的量热分析，将抗-PSMA单克隆抗体2A10与7F12抗体的热稳定性进行比较。
在与自动采样器(MicroCal LLC，Northampton，MA，USA)组合的VP-毛细管DSC差示扫描微热量计平台上进行熔解温度的量热学测量。样品细胞体积为0.144mL。关于糖基化和脱糖基化形式的抗体的变性数据如下获得：将浓度为2.3μM的样品以1℃/min的速度从30℃加热到95℃。蛋白质样品存在于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在参照细胞中使用相同的缓冲液，通过比较获得摩尔热容。对观察到的热解曲线进行基线校正，使用Origin v7.0软件基于2步模型分析标准化的数据。克隆2A10具有较高的热稳定性，Tm为71.43℃，与之相比，克隆7F12为63.05℃。
实施例8：泰索帝和7F12抗体联合对体内肿瘤异种移植物的治疗
应用在CB17.SCID雄性小鼠中生长的LNCaP人前列腺癌异种移植物，检测了抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝(多西紫杉醇)的抗肿瘤效果。
表达高水平PSMA的LNCaP前列腺癌细胞从ATCC获得(Cat#CRL-1740)，并按照ATCC的说明在体外扩增。来自于Taconic的8周大的雄性CB17.SCID小鼠每只在右胁皮下植入在0.2mlPBS/Matrigel(1∶1)中的2.5×106LNCaP细胞。从植入后三周开始，每周两次对小鼠称重，并使用电子测径器测量肿瘤体积。肿瘤体积以高度×宽度×长度计算。将具有180mm3的血管化肿瘤(根据肿瘤外观来确定)的小鼠随机分配到治疗组中，并且在第0天按照个体体重给药。在给药后约60天时监测小鼠的肿瘤生长，并在研究结束时终止。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3)时，对小鼠施以安乐死。给药信息总结在表1中。泰索帝通过尾静脉以Q3Dx5静脉(iv)给药。同种型对照抗体利妥昔单抗和抗-PSMA 7F12抗体以Q3Dx5腹膜内(ip)给药，然后以Q7Dx6给药。
表1：给药信息
  治疗   每组数量   泰索帝剂量，静脉内(mg/kg)   抗体剂量，腹膜内(mg/kg)   给药方案
  PBS   10   第0，3，7，10，14，21，28，35，42，49，56天
  泰索帝2   10   2   0   第0，3，7天
  泰索帝4   10   4   0   第0，3，7天
  同种型抗体利妥昔单抗   10   0   30   第0，3，7，10，14，21，28，35，42，49，56天
  7F12抗体   10   0   30   第0，3，7，10，14，21，28，35，42，49，56天
  泰索帝2+7F12抗体   10   2   30   第0，3，7天，对于泰索帝第0，3，7，10，14，21，28，35，42，49，56天
  泰索帝2+   10   2   30   第0，3，7天，对于泰索帝
  同种型利妥昔单抗   第0，3，7，10，14，21，28，35，42，49，56天
  泰索帝4+7F12抗体   10   4   30   第0，3，7天，对于泰索帝第0，3，7，10，14，21，28，35，42，49，56天
  泰索帝4+同种型利妥昔单抗   10   4   30   第0，3，7天，对于泰索帝第0，3，7，10，14，21，28，35，42，49，56天
上述实验的结果显示在图13-16中。如图13A-13B和图14A-14B所示，单独的30mg/kg抗-PSMA 7F12抗体适度地降低了LNCaP肿瘤的生长。泰索帝在检测的两种剂量(即2和4mg/kg)下显示剂量依赖的抗肿瘤生长效果。30mg/kg抗-PSMA 7F12抗体和4mg/kg泰索帝联合治疗显示出优于每个单独治疗的效果，并且导致LNCaP肿瘤生长接近完全抑制(见图13A-13B和图15A-15B)。如图13C-13D和图15C-15D所示，这种联合方案也治愈了LNCaP肿瘤相关恶病质的小鼠。30mg/kg抗-PSMA 7F12抗体和2mg/kg泰索帝联合治疗也显示出优于每个单独治疗的效果(见图13A-13D和图16A-16D)。上述数据证明了抗-PSMA 7F12抗体联合泰索帝化疗在治疗如前列腺肿瘤等肿瘤中具有加成和可能协同的效应。
实施例8：毒素偶联的抗-PSMA抗体对前列腺癌细胞系的细胞杀伤的评价
在该实施例中，利用细胞增殖试验检测了与毒素偶联的抗-PSMA单克隆抗体杀伤PSMA+前列腺癌细胞系的能力。
抗-PSMA HuMAb抗体2A10与毒素通过连接体如肽、腙或二硫化物连接体偶联。可以与本发明抗体偶联的毒素化合物的例子在2005年9月26日提交的代理人案卷号为04280/100M629US3的申请中描述。将表达PSMA的前列腺癌细胞系LNCaP以2.5×104细胞/孔接种在100μl孔中3小时。向孔中加入初始浓度为30nM的抗-PSMA抗体-毒素偶联物，并以1∶3连续稀释向下滴定。对于PSMA非特异性的同种型对照抗体作为阴性对照。使板在3小时时洗涤一次或连续洗涤下温育72小时。然后用1.0μCi 3H-胸苷对板进行脉冲24小时，收获，并用Top Count闪烁计数器(Packard Instruments，Meriden，CT)读数。结果显示在图17A(3小时洗涤)和17B(连续洗涤)中。在表达PSMA的LNCaP前列腺癌细胞中，抗-PSMA抗体2A10显示抗体-毒素浓度依赖性的3H-胸苷掺入减少。抗-PSMA抗体2A10的EC50值对于洗涤测定为0.157nM，对于连续洗涤测定为0.0643nM。该数据证明抗-PSMA当与毒素偶联时对于前列腺癌细胞具有细胞毒性。
实施例9：体内研究
在该实施例中，检测与毒素偶联的抗-PSMA单克隆抗体在体内杀伤PSMA+前列腺癌细胞系的能力
A.体内肿瘤异种移植物的治疗
抗-PSMA HuMAb 2A10和同种型对照抗体均更换缓冲液为含有50mM NaCl和2mM DTPA的0.1M磷酸盐缓冲液pH8.0，并浓缩至6mg/ml。然后通过以下步骤将这两种抗体硫醇化：与25倍摩尔过量的2-亚氨硫醇(iminothiolane)室温温育1小时，然后使用Sephadex G-25柱脱盐到含有50mM NaCl和2mM DTPA的0.1M磷酸盐缓冲液pH6.0中。硫醇化抗体然后保持在冰上，测定导入的硫醇基团的数量。这通过硫醇化抗体样品与二硫双吡啶(DTDP)反应来实现。测量在280nm处的吸光度，以确定样品中的蛋白质浓度，然后将每个样品的一等份(0.9ml)与0.1ml DTDP(在乙醇中的5mM贮存溶液)在室温下温育10分钟。单独缓冲液+DTDP的空白样品在旁边温育。测量在324nm处的吸光度，使用硫代吡啶的消光系数19800M-1定量每个抗体中存在的硫醇基团数目。对于抗-PSMA，每个抗体导5.3个硫醇基团，对于同种型对照为6.0个。
硫醇化抗体然后与相对于硫醇基团摩尔浓度3倍摩尔过量的化合物A一起温育。
Figure A20068000534700871
化合物A
向硫醇化抗体中加入化合物A在DMSO中的5mM贮存溶液以及足以使DMSO终浓度为10％(v/v)的DMSO。在室温下温育3小时后，使用三乙醇胺将温育混合物的pH升高到7.0。然后在用含50mM NaCl和5％(v/v)DMSO的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)预平衡的SephacrylS200柱上通过大小排阻层析纯化抗体-化合物A偶联物。收集并合并含有单体偶联物的级分。然后在氮气下在搅拌单元中使用10kDa截止膜浓缩获得的纯化的偶联物。参照以前测量的抗体和化合物A在每一波长下的消光系数，利用在280nm和340nm处的吸光度确定偶联物的浓度和取代比(每个抗体分子上连接的药物分子的数目)。可以与本发明抗体偶联的其他毒素化合物的例子在2005年9月26日提交的代理人案卷号为04280/100M629US3的共同拥有的美国专利申请中描述。
用LNCaP检测了与化合物A偶联的抗-PSMA(2A10克隆)的抗肿瘤效果，LNCaP是在雄性CB17.SCID小鼠(可从Taconic，Germantown，NY获得)中生长的人前列腺癌异种移植物。表达高水平的PSMA的LNCaP前列腺癌细胞从ATCC获得(Cat#CRL-1740)，并按照ATCC的说明在体外扩增。来自于Taconic的8周大的雄性CB17.SCID小鼠每只在右胁皮下植入在0.2ml PBS/Matrigel(1∶1)中的2.5×106LNCaP细胞。从植入后三周开始，每周两次对小鼠称重，并使用电子测径器肿瘤测量肿瘤的三维。单个肿瘤体积以高度×宽度×长度计算。将具有适当大小的血管化肿瘤(根据肿瘤外观来确定)的小鼠随机分配到治疗组中，并且在第0天按个体体重给药。在给药后约60天时监测小鼠的肿瘤生长，并在研究结束时终止。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3)时，对小鼠施以安乐死。该异种移植物研究的设计在表2中概述。
表2.LNCaP异种移植物研究概述
  处理   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组只数   给药途径   第-1天时的平均肿瘤体积(mm3)
  载体   -   3   腹膜内   100
  同种型抗体-化合物A偶联物   0.3   3   腹膜内   100
  2A10-化合物A偶联物   0.3   3   腹膜内   100
如图18所示，0.3μmole/kg(参照细胞毒素化合物A的摩尔数)的2A10-化合物A偶联物诱导建立的所有三个小LNCaP肿瘤完全消失。
B.剂量-应答研究
抗-PSMA(2A10)更换缓冲液为含有50mM NaCl和2mM DTPA的0.1M磷酸盐缓冲液pH8.0，并浓缩至5.6mg/ml。然后通过以下步骤将该抗体硫醇化：与7.5倍摩尔过量的2-亚氨硫醇在室温下温育1小时，然后使用Sephadex G-25柱脱盐到含有5mM甘氨酸、2mM DTPA和3％(v/v)甘油的50mM HEPES缓冲液pH 6.0中。硫醇化抗体然后保持在冰上，同时测定导入的硫醇基团的数目。这通过硫醇化抗体样品与二硫双吡啶(DTDP)反应来实现。测量在280nm处的吸光度，以确定样品中的蛋白质浓度，然后将每个样品的一等份(0.9m1)与0.1mlDTDP(在乙醇中的5mM贮存溶液)在室温下温育10分钟。单独缓冲液+DTDP的空白样品在旁边温育。测量在324nm处的吸光度，使用硫代吡啶的消光系数19800M-1定量每个抗体中存在的硫醇基团数目。
硫醇化抗体然后与相对于硫醇基团摩尔浓度2倍摩尔过量的化合物A一起温育。向硫醇化抗体中加入化合物A在10％(v/v)DMSO/90％(v/v)乙二醇二甲醚中的5mM贮存溶液以及足以使终浓度为10％(v/v)的乙二醇二甲醚。在室温下温育2小时后，通过离子交换层析纯化抗体-化合物A偶联物。将反应混合物加到用缓冲液A(50mMHEPES，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH 6.0)预平衡的SP-Sepharose柱上。用缓冲液A洗柱，然后用95％缓冲液A，5％缓冲液B(50mM HEPES，1M NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH 7.2)洗柱，然后用10％缓冲液B，90％缓冲液A洗脱抗体-化合物A偶联物。收集并合并含有单体偶联物的级分，并加入乙醇胺将pH调节至7.2。然后将获得的纯化的偶联物透析到50mM HEPES，100mM NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH 7.2中，然后在氮气下在搅拌单元中使用10kDa截止膜浓缩。参照以前测量的抗体和化合物A在每一波长下的消光系数，利用在280nm和340nm处的吸光度确定偶联物的浓度和取代比(每个抗体分子上连接的药物分子的数目)。除了用15％缓冲液B，85％缓冲液A从离子交换柱上洗脱偶联物以外，用相同的方法制备同种型对照(抗-CD70 2H5)偶联物。
如上所述使用在雄性CB17.SCID小鼠中生长的LNCaP人前列腺癌异种移植物测定偶联物的效果和选择性。该异种移植物研究的设计在表3中概述。
表3.LNCaP异种移植物研究概述
  处理   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组只数   给药途径   第-1天时的平均肿瘤体积(mm3)
  载体   -   9   腹膜内   160
  同种型抗体-化合物A   0.05，0.15，0.30，0.45，0.60，0.90   9   腹膜内   160
  2A10-化合物A   0.05，0.15，0.30，0.45，0.60，0.90   9   腹膜内   160
如表3和图19-20所示，0.15μmole/kg抗-PSMA-化合物A(图19)具有优于0.90μmole/kg同种型对照-化合物A的抗肿瘤效果，表示出至少＞6倍的选择性(图20)。0.90μmole/kg抗-PSMA-化合物A仅显示短暂的毒性(图21-22)，低于最大耐受剂量。因此，在LNCaP-荷瘤小鼠中鉴定到抗-PSMA-化合物A具有大于6倍的治疗指数。
C.对大肿瘤的效果
抗-PSMA(2A10)更换缓冲液为含有50mM NaCl和2mM DTPA的0.1M磷酸盐缓冲液pH8.0，并浓缩至5.6mg/ml。然后通过以下步骤将该抗体硫醇化：与9倍摩尔过量的2-亚氨硫醇在室温下温育1小时，然后使用Sephadex G-25柱脱盐到含有5mM甘氨酸、2mM DTPA和3％(v/v)甘油的50mM HEPES缓冲液pH 6.0中。硫醇化抗体然后保持在冰上，同时测定导入的硫醇基团的数目。这通过硫醇化抗体样品与二硫双吡啶(DTDP)反应来实现。测量在280nm处的吸光度，以确定样品中的蛋白质浓度，然后将每个样品的一等份(0.9ml)与0.1mlDTDP(在乙醇中的5mM贮存溶液)在室温下温育10分钟。单独缓冲液+DTDP的空白样品在旁边温育。测量在324nm处的吸光度，使用硫代吡啶的消光系数19800M-1定量每个抗体中存在的硫醇基团的数目。
硫醇化抗体然后与相对于硫醇基团摩尔浓度2倍摩尔过量的化合物A一起温育。向硫醇化抗体中加入化合物A在10％(v/v)DMSO/90％(v/v)乙二醇二甲醚中的5mM贮存溶液以及足以使终浓度为10％(v/v)的乙二醇二甲醚。在室温下温育2小时后，通过离子交换层析纯化抗体-化合物A偶联物。将反应混合物加到用50mM HEPES，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH 6.0(缓冲液A)预平衡的SP-Sepharose柱上。用缓冲液A洗柱，然后用95％缓冲液A，5％缓冲液B(50mM HEPES，1M NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH 7.2)洗柱，然后用10％缓冲液B，90％缓冲液A洗脱抗体-化合物A偶联物。收集并合并含有单体偶联物的级分，加入乙醇胺将pH调节至7.2。然后将获得的纯化的偶联物透析到50mM HEPES，100mM NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH 7.2中，在氮气下在搅拌单元中使用10kDa截止膜浓缩。参照以前测量的抗体和化合物A在每一波长下的消光系数，利用在280nm和340nm处的吸光度确定偶联物的浓度和取代比(每个抗体分子上连接的药物分子的数目)。除了用15％缓冲液B，85％缓冲液A从离子交换柱上洗脱偶联物以外，用相同的方法制备同种型对照(抗-CD70 2H5)偶联物。
如上所述使用在雄性CB17.SCID小鼠中生长的LNCaP人前列腺癌异种移植物测定偶联物的效果和选择性。该异种移植物研究的设计在表4和5中概述。
表4.LNCaP异种移植物研究概述
  处理   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组只数   给药途径   第-1天时的平均肿瘤体积(mm3)
  载体   -   8   静脉内   240
  同种型抗体-化合物A   0.15   8   静脉内   240
  2A10-化合物A   0.15   8   静脉内   240
如表4和图23所示，单次低剂量的0.15μmole/kg抗-PSMA-化合物A大大抑制了已建立的平均大小为240mm3的大LNCaP肿瘤的生长。相反，0.15μmole/kg同种型对照-化合物A具有最低的抗-肿瘤效果。如表5和图24所示，单次剂量的0.30μmole/kg抗-PSMA-化合物A诱导了平均大小为430mm3的极大肿瘤的消退并抑制了其生长。
表5.LNCaP异种移植物研究概述
  处理   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组只数   给药途径   第-1天时的平均肿瘤体积(mm3)
  载体   -   6   腹膜内   430
  2A10-化合物A   0.15，0.30，0.45   6   腹膜内   430
在本说明书中提到的或参考的每个专利申请、专利、出版物和其他公开文件都完整引入本文作为参考，如同每个专利申请、专利、出版物和其他公开文件均单独地引入作为参考。
尽管已经参照具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不背离本发明和所附权利要求书的真实精神和范围的情况下，可以进行各种变化和等同替代。另外，也可以进行修改以使具体情况、材料、物质组成、方法、方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改预期在所附权利要求书的范围内。
序列表概述
  SEQ ID NO   序列   SEQ ID NO   序列
  1   VH氨基酸1C3   21   VK CDR1氨基酸1C3
  2   VH氨基酸2A10   22   VK CDR1氨基酸2A10
  3   VH氨基酸2F5   23   VK CDR1氨基酸2F5
  4   VH氨基酸2C6   24   VK CDR1氨基酸2C6
  5   VK氨基酸1C3   25   VK CDR2氨基酸1C3
  6   VK氨基酸2A10   26   VK CDR2氨基酸2A10
  7   VK氨基酸2F5   27   VK CDR2氨基酸2F5
  8   VK氨基酸2C6   28   VK CDR2氨基酸2C6
  9   VH CDR1氨基酸1C3   29   VK CDR3氨基酸1C3
  10   VH CDR1氨基酸2A10   30   VK CDR3氨基酸2A10
  11   VH CDR1氨基酸2F5   31   VK CDR3氨基酸2F5
  12   VH CDR1氨基酸2C6   32   VK CDR3氨基酸2C6
  13   VH CDR2氨基酸1C3   33   VH核苷酸1C3
  14   VH CDR2氨基酸2A10   34   VH核苷酸2A10
  15   VH CDR2氨基酸2F5   35   VH核苷酸2F5
  16   VH CDR2氨基酸2C6   36   VH核苷酸2C6
  17   VH CDR3氨基酸1C3   37   VK核苷酸1C3
  18   VH CDR3氨基酸2A10   38   VK核苷酸2A10
  19   VH CDR3氨基酸2F5   39   VK核苷酸2F5
  20   VH CDR3氨基酸2C6   40   VK核苷酸2C6
  41   VH 3-30.3种系氨基酸   43   VK L18种系氨基酸
  42   VH 5-51种系氨基酸   44   VK L6
  45   JH6b种系氨基酸   47   JK3种系氨基酸
  46   JK4种系氨基酸   48   (Gly4-Ser)3氨基酸
<110>米德列斯公司
<12o>抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人单克隆抗体
<130>MXI-334PC
<140>
<141>
<150>60/748,417
<151>2005-12-08
<160>48
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>124
<212>PRT
<213>人
<400>1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
  1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn
             20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>3
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>3
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
  1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn
             20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>4
<211>121
<212>PRT
<213>人
<400>4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
  1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
             20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Ser Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>5
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>5
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>6
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>6
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>7
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>7
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ile Lys
            100                 105
<210>8
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
                 85                  90              95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
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<212>PRT
<213>人
<400>9
Ser Tyr Ala Met His
  1               5
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>10
Ser Asn Trp Ile Gly
  1               5
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>11
Ser Asn Trp Ile Gly
  1               5
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>人
<400>12
Asn Tyr Trp Ile Gly
  1               5
<210>13
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>13
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
  1               5                  10                  15
Gly
<210>14
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>14
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
  1               5                  10                  15
Gly
<210>15
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>15
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
  1               5                  10                  15
Gly
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>人
<400>16
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
  1               5                  10                  15
Gly
<210>17
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>17
Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
  1               5                  10                  15
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>18
Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu
  1               5                  10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>19
Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu
  1               5                  10
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>20
Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr
  1               5                  10
<210>21
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>21
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
  1               5                  10
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>22
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala
  1               5                  10
<210>23
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>23
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala
  1               5                  10
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>24
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
  1               5                  10
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>25
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
  1               5
<210>26
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>26
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
  1               5
<210>27
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>27
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
  1               5
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>人
<400>28
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
  1               5
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>29
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
  1               5
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>30
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
  1               5
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>31
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
  1               5
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>32
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Phe Thr
  1               5                  10
<210>33
<211>372
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(372)
<400>33
cag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg    48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat    96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
gct atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg    144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
gca gtt ata tca tat gat gga aac aat aaa tac tac gca gac tcc gtg    192
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat    240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt    288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg aga gcc gtc ccc tgg gga tcg agg tac tac tac tac ggt atg gac    336
Ala Arg Ala Val Pro Trp Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
            100                 105                 110
gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca                    372
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>34
<211>357
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<400>34
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag    48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ero Gly Glu
  1               5                  10                  15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc agt aac    96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn
             20                  25                  30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg    144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc    192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac    240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt    288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg agg caa act ggt ttc ctc tgg tcc tcc gat ctc tgg ggc cgt ggc    336
Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Ser Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
acc ctg gtc act gtc tcc tca                                        357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>35
<211>357
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(357)
<400>35
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag    48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
  1               5                  10                  15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agt ttt acc agc aac    96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Asn
             20                  25                  30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg    144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc    192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tac    240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg cag tgg aac agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt    288
Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg aga caa act ggt ttc ctc tgg tcc ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc    336
Ala Arg Gln Thr Gly Phe Leu Trp Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
acc ctg gtc act gtc tcc tca                                        357
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>36
<211>363
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(363)
<400>36
gag gtg cag ctg gtg cag tct gga tca gag gtg aaa aag ccc ggg gag    48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
  1               5                  10                  15
tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc aac tac    96
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
             20                  25                  30
tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg    144
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
ggg atc atc tat cct ggt gac tct gat acc aga tac agc ccg tcc ttc    192
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc agc acc gcc tat    240
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt    288
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg agt ccc ggg tat acc agc agt tgg act tct ttt gac tac tgg ggc    336
Ala Ser Pro Gly Tyr Thr Ser Ser Trp Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                                363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>37
<211>321
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>37
gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga    48
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag ggc att agc agt gct    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag cag aaa tca ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc    144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
ttt gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc    192
Phe Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aac agt tat cct ctc    288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa                        321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>38
<211>321
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(321)
<400>38
gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga    48
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag gac att agc agt gct    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc    144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc    192
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
tat gga tct ggg aca gat ttc act cte acc atc aac agc ctg cag cct    240
Tyr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg ctc    288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa                        321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>39
<211>327
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(327)
<400>39
gcc atc cag ttg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga    48
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag gac att agc agt gct    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag cag aaa ccg ggg aaa gct cct aag ctc ctg atc    144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc    192
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg ctc    288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
                 85                  90                  95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa atc aaa                327
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ile Lys
            100                 105
<210>40
<211>324
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>40
gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg    48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
  1               5                  10                  15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt agc agc tac    96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc    144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc agg ttc agt ggc    192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt ggg tct ggg acs gsc ttc sct ctc acc atc agc agc cta gag cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc aac tgg ccc cta    288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
                 85                  90                  95
ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa                    324
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
<210>41
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>41
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg
<210>42
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
  1               5                  10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
             20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
         35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
     50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Arg
<210>43
<211>95
<212>PRT
<213>人
<400>43
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
                 85                  90                  95
<210>44
<211>94
<212>PRT
<213>人
<400>44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
  1               5                  10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
                 85                  90
<210>45
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>45
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
  1               5                  10                  15
Thr Val Ser Ser
             20
<210>46
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>46
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
  1               5                  10
<210>47
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>47
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
  1               5                  10
<210>48
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成Gly-Ser连接体
<400>48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  1               5                  10                  15

Claims (55)

1.一种特异性结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的分离的人单克隆抗体，其中该抗体的熔解温度至少为67℃。
2.权利要求1的抗体，其熔解温度至少为69℃。
3.权利要求1的抗体，其熔解温度至少为71℃。
4.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括产自或来源于人VH3-30.3基因的重链可变区，其中该抗体与PSMA特异性结合。
5.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
a)人VH3-30.3基因的重链可变区；和
b)人VKL18基因的轻链可变区；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
6.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括产自或来源于人VKL18基因的轻链可变区，其中该抗体与PSMA特异性结合。
7.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括：
a)人VH5-51基因的重链可变区；和
b)人VKL18基因的轻链可变区；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
8.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO：13、14、15和16的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO：17、18、19和20的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO：25、26、27和28的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO：29、30、31和32的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中该抗体与PSMA特异性结合。
9.权利要求8的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：9的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：21的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：25的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：29的轻链可变区CDR3。
10.权利要求8的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：10的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：22的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：30的轻链可变区CDR3。
11.权利要求8的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR3。
12.权利要求8的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：12的重链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；
(c)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR1；
(e)包含SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR2；和
(f)包含SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR3。
13.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含选自SEQ ID NO：5、6、7、8的氨基酸序列的轻链可变区；
其中该抗体与PSMA特异性结合
14.权利要求13的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的轻链可变区。
15.权利要求13的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链可变区。
16.权利要求13的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链可变区。
17.权利要求13的抗体，该抗体包括：
(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和
(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。
18.一种组合物，其包含权利要求1-17中任一项的抗体或其抗原结合部分，和药学上可接受的载体。
19.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的权利要求1-17中任一项的抗体或其抗原结合部分。
20.一种组合物，其含有权利要求19的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
21.权利要求19的免疫偶联物，其中所述治疗剂是细胞毒素。
22.一种组合物，其含有权利要求21的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
23.权利要求19的免疫偶联物，其中所述治疗剂是放射性同位素。
24.一种组合物，其含有权利要求23的免疫偶联物和药学上可接受的载体。
25.一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的权利要求1-17中任一项的抗体或其抗原结合部分，该第二功能部分具有与所述抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
26.一种组合物，其含有权利要求25的双特异性分子和药学上可接受的载体。
27.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-17中任一项的抗体或其抗原结合部分。
28.一种表达载体，其包含权利要求27的核酸分子。
29.一种宿主细胞，其包含权利要求28的表达载体。
30.一种含有人免疫球蛋白重链和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达权利要求1-17中任一项的抗体。
31.由权利要求30的小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生所述抗体。
32.一种抑制受试者中肿瘤生长的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA，该方法包括给该受试者施用有效抑制肿瘤生长的量的权利要求1-17中任一项的抗体或其抗原结合部分。
33.权利要求32的方法，其中所述肿瘤是前列腺癌肿瘤。
34.权利要求32的方法，其中所述肿瘤是选自结肠癌、肾癌、直肠癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌或黑素瘤的癌症的肿瘤。
35.一种制备抗-PSMA抗体的方法，该方法包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：9、10、11和12的CDR1序列、选自SEQ ID NO：13、14、15和16的CDR2序列、和选自SEQ ID NO：17、18、19和20的CDR3序列；
或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：21、22、23和24的CDR1序列、选自SEQ ID NO：25、26、27和28的CDR2序列、和选自SEQ ID NO：29、30、31和32的CDR3序列；
(b)改变至少一个可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，所述序列选自重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列，从而产生至少一个改变的抗体序列；和
(c)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
36.一种抑制或阻止受试者中肿瘤生长的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA，该方法包括给受试者联合施用均为有效抑制或阻止肿瘤生长的量的抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和抗肿瘤剂。
37.权利要求36的方法，其中给所述受试者联合施用所述抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和所述抗肿瘤剂导致对所述肿瘤生长抑制的协同效应。
38.权利要求36的方法，其中所述抗肿瘤剂引起肿瘤块的损害，由此导致肿瘤的更有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
39.权利要求36的方法，其中所述抗-PSMA抗体是权利要求1-17中任一项的抗体。
40.权利要求36的方法，其中所述抗-PSMA抗体是7F12抗体。
41.权利要求36的方法，其中所述抗-PSMA抗体是2A10抗体。
42.权利要求36的方法，其中所述肿瘤是前列腺癌肿瘤。
43.权利要求36的方法，其中所述肿瘤是选自结肠癌、肾癌、直肠癌、尿道上皮癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌和黑素瘤的癌症的肿瘤。
44.权利要求36的方法，其中所述抗肿瘤剂是化疗剂。
45.权利要求44的方法，其中所述化疗剂是泰索帝(多西紫杉醇)。
46.权利要求36的方法，其中所述抗肿瘤剂是抗血管发生剂。
47.权利要求46的方法，其中所述抗血管发生剂选自制管张素K1-3、Arresten、aaAT、血管能抑素、DL-α-二氟甲基鸟氨酸、内皮抑制素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素、沙利度胺和肿瘤抑素。
48.权利要求36的方法，其中所述抗肿瘤剂是免疫调节剂。
49.权利要求48的方法，其中所述免疫调节剂选自抗-PD1抗体、抗-CTLA-4抗体、硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸(1018 ISS)、GM-CSF基因疫苗、白介素-2、白介素-7(CYT 99 07)、白介素-12和白介素-21。
50.一种刺激受试者中肿瘤的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA，该方法包括给受试者联合施用抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和抗肿瘤剂，其量均为有效刺激肿瘤的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的量。
51.一种抑制受试者中与肿瘤相关的恶病质的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA，该方法包括给受试者联合施用抗-PSMA抗体或其抗原结合部分和抗肿瘤剂，其量均为有效抑制受试者中与肿瘤相关的恶病质的量。
52.一种组合物，其含有有效抑制或阻止肿瘤生长的量的抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂以及药学上可接受的载体。
53.一种组合物，其含有有效刺激肿瘤的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的量的抗-PSMA抗体和抗肿瘤剂以及药学上可接受的载体。
54.一种鉴定能够与抗-PSMA抗体在抑制或阻止肿瘤生长中协同作用的抗肿瘤剂的方法，其中该肿瘤的细胞或靠近该肿瘤的血管内皮细胞表达PSMA，该方法包括：
使指示成分接触：
(a)单独的待测抗肿瘤剂，
(b)单独的抗-PSMA抗体，和
(c)待测抗肿瘤剂和抗-PSMA抗体，并且
将(a)单独的待测抗肿瘤剂和(b)单独的抗-PSMA抗体抑制或阻止肿瘤生长的能力与(c)待测抗肿瘤剂和抗-PSMA抗体抑制或阻止肿瘤生长的能力进行比较，其中(c)抑制或阻止肿瘤生长的程度大于(a)和(b)的加合效应将导致鉴定出能够与抗-PSMA抗体在抑制或阻止肿瘤生长中协同作用的抗肿瘤剂。
55.权利要求54的方法，其中所述指示成分是肿瘤的动物模型。
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