ES2582603T5 - Anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla con especificidad por antígenos diana de alto peso molecular - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla con especificidad por antígenos diana de alto peso molecular
La presente Invención proporciona un método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse a los antígenos de superficie celular de dominio extracelular con un dominio extracelular de alto peso molecular tal como se define en las reivindicaciones.
La unificación de dos sitios de unión de antígeno de diferente especificidad en un único constructo, los anticuerpos biespecíficos tienen la capacidad para reunir dos antígenos diferenciados con especificidad exquisita y, por tanto, tienen un gran potencial como agentes terapéuticos. Este potencial se reconoció en una fase más temprana, conduciendo a varios enfoques para obtener tales anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos se prepararon originariamente mediante la fusión de dos hibridomas, que pueden producir cada uno una diferente inmunoglobullna. El hibridoma híbrido resultante, o cuadroma, podía producir anticuerpos que portaban la especificidad de antígeno del primer hibridoma original así como la del segundo hibridoma original (Milsteln et al., (1983) Nature 305, 537). Sin embargo, los anticuerpos que resultaban de cuadromas presentaban a menudo propiedades no deseadas debido a la presencia de una parte de anticuerpo Fe.
Debido en gran medida a tales dificultades, los Intentos se centraron más tarde en la creación de constructos de anticuerpos que resultaban de la unión de dos fragmentos de anticuerpo scFv mientras que se omitía la parte Fe presente en inmunoglobulinas completas. Cada unidad de scFv en tales constructos estaba compuesta por un dominio variable de cada una de las cadenas de anticuerpo pesadas (VH) y ligeras (VL), unidas unas con otras mediante un ligador de pollpeptldo sintético, modificándose a menudo este último mediante ingeniería genética de modo que sea mínimamente inmunogénico mientras que siga siendo máximamente resistente a la proteóllsls. Se unieron unidades de scFv respectivas mediante varías técnicas incluyendo la Incorporación de un espaciador de polipéptido corto (habitualmente de menos de 10 aminoácidos) que hace de puente entre las dos unidades de scFv, creando de ese modo un anticuerpo blespecífico de cadena sencilla. El anticuerpo blespecífico de cadena sencilla resultante es por tanto una especie que contiene dos pares de VH/VL de diferente especificidad en una única cadena de polipéptido, en la que los dominios VH y VL en una unidad de scFv respectiva están separados por un ligador de polipéptido lo suficientemente largo como para permitir la asociación intramolecular entre estos dos dominios, y en el que las unidades de scFv así formadas están unidas de manera contigua unas con otras a través de un espaciador de polipéptido mantenido lo suficientemente corto como para Impedir la asociación no deseada entre, por ejemplo, el dominio VH de una unidad de scFv y el VL de la otra unidad de scFv.
Los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla de la forma general descrita anteriormente tienen la ventaja de que la secuencia de nucleótldos que codifica para los cuatro dominios V, dos llgadores y un espaciador puede incorporarse en un organismo de expresión hospedador adecuado bajo el control de un único promotor. Esto aumenta la flexibilidad con la que pueden diseñarse estos constructos así como el grado de control del experimentador durante su producción.
Se han obtenido resultados experimentales notables usando tales anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla diseñados para el tratamiento de tumores malignos (Mack, J. Immunol. (1997) 158, 3965-70; Mack, PNAS (1995) 92, 7021-5; Kufer, Cáncer Immunol. Immunother. (1997) 45, 193-7; Lóffler, Blood (2000) 95, 2098-103) y enfermedades no malignas (Brühl, J. Immunol. (2001) 166, 2420-6); Brischwein etal. J Immunother. (2007) 30(8), 798-807; Bargou, etal. (2008) Science 321, 974). Si en tales anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla, una unidad de scFv puede activar células cltotóxicas, por ejemplo células T cltotóxicas, dentro del sistema inmunitario uniéndose específicamente a un antígeno en las células cltotóxicas, mientras que la otra unidad de scFv se une específicamente a un antígeno en una célula maligna destinada para su destrucción. De esta manera, se ha mostrado que tales anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla activan y redirigen el potencial cltotóxico del sistema inmunitario a la destrucción de células patológicas, especialmente malignas. En ausencia de constructos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla de este tipo, las células malignas prollferarían por lo demás sin inhibición.
Cuando se diseñan nuevos anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden una unidad de scFv que pueden reclutar células cltotóxicas, por ejemplo células T cltotóxicas, mientras que la otra unidad de scFv se une específicamente a un antígeno en una célula diana que ha de eliminarse por la célula cltotóxica reclutada, se ha observado que la diferente combinación de scFv en los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla muestran diferente efectividad en la eliminación de las células diana. La elección de un candidato prometedor es un procedimiento intensivo y que lleva mucho tiempo.
El documento WO 2007/042261 describe anticuerpos biespecíficos contra CD3 y EGFR. El documento WO 2004/106381 describe anticuerpos biespecíficos contra CD3 para el tratamiento de trastornos relacionados con células B.
Maletz etal. (2001), International Journal of Cáncer, vol. 93, n.° 3, págs. 409-416, describe anticuerpos biespecíficos contra CD3 para eliminar células cancerosas epiteliales.
Wolf et al. (2005), Drug Discovery Today, vol. 10, n.° 18, págs. 1237-1244, se refiere a moléculas biespecíficas captadores de células T (BiTE).
Anomynous (2008), “Phase I Study of the BiTE TM Blinatumomab (MT103) in patients with minimal residential disease of B-precursor acute ALL”, cita en Internet, págs. 1-3, se refiere a la molécula biespecífica captadora de células MT 103.
Bühler et al. (2007), Cáncer Immunology Immunotherapy 57 (1): 43-52 y el documento W02006/125481 describen diacuerpos biespecíficos dirigidos contra CD3 y PSMA.
Kipriyanov et al. (1998), Int J Cáncer 77 (5): 763-772 describe un diacuerpo biespecífico CD3 x CD19 para la lisis mediada por células T de células B malignas.
El documento US5726044 describe ADN producidos mediante técnicas recombinantes para Inducir la expresión y posterior secreción de una proteína diana.
La presente Invención proporciona métodos para la solución de este problema para anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que se unen con un dominio una células citotóxlcas, es decir células T citotóxicas, y con el segundo dominio de unión a antígenos diana con un dominio extracelular de alto peso molecular.
Por consiguiente, en el presente documento se da a conocer un método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse a los antígenos de superficie celular de dominio extracelular con un dominio extracelular de alto peso molecular, dichos anticuerpos se describen en el presente documento. Se describen en la técnica diferentes dominios de unión, que pueden usarse como primer dominio de unión, y en la lista de secuencias adjunta. Tal como resulta evidente a partir de lo anterior, la elección de un dominio antigénlco en una célula diana para la preparación de un dominio de unión a célula diana de un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla es la etapa crítica para la provisión de nuevos anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que permiten una eliminación eficaz de células diana a través de lisis de células T redirigida. Una primera opción para la elección de un dominio antigénlco en una célula diana para la preparación de un dominio de unión a célula diana de un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla podría ser un dominio, que sea fácilmente accesible desde un punto de vista estérico. Por consiguiente, el experto en la técnica elegiría en ese caso proteínas de superficie celular en células diana con epítopos de dominio extracelular de alto peso molecular que son los más alejados de la superficie de la célula diana y son los más expuestos, por tanto lo más accesibles para células T y por tanto particularmente potentes en la redirección de la citotoxicidad de células T. Sin embargo, se ha encontrado sorprendentemente que epítopos alejados de la membrana de antígenos de superficie de la célula diana con un dominio extracelular de alto peso molecular muestran una escasa potencia de redirección de citotoxicidad de células T.
El método de la Invención proporciona orientación para la elección de regiones antigénlcas de antígenos de superficie celular con un dominio extracelular de alto peso molecular que permiten la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla con una alta potencia para citotoxicidad de células T redirigida. Estos antígenos de superficie celular con un dominio extracelular de alto peso molecular son proteínas integrales de membrana de tipo I o tipo II con una parte extracelular de > 640 aminoácidos. La parte extracelular de este grupo de proteínas de membrana se pliega independientemente, por tanto se forma por un único tramo continuo de aminoácidos extracelulares adyacentes a la región transmembrana en la secuencia primaría de la proteína. Para satisfacer el requisito de un dominio extracelular de alto peso molecular en el contexto de la Invención, el dominio extracelular comprende esencialmente más de 640 aminoácidos. Opcionalmente el dominio extracelular se caracteriza por al menos un subdomlnlo definido funcional y/o estructuralmente formado por tramos discontinuos de aminoácidos extracelulares dentro de la secuencia primaría de la proteína. En el método de la presente Invención, los antígenos de superficie celular comprenden el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), la proteína de activación de fibroblastos a (FAPa), el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-MET), endosialina (TEM1 o CD248) y el receptor del factor de crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF-1R).
PSMA y FAPa son moléculas de superficie celular para las que se conocen en la técnica la estructura cristalina y, por tanto, la estructura tridimensional del dominio extracelular. Estos antígenos muestran una composición de dominio discontinua compacta del dominio extracelular. Se ha encontrado sorprendentemente que anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que se unen a epítopos con una distancia de hasta 60 A desde el átomo de C alfa del decimotercer aminoácido extracelular contando desde la unión de la región extracelular y transmembrana (átomo de C de referencia) muestran una alta eficiencia significativa en la lisis de células T redirigida de las células diana. En contraposición a esto, se reduce la eficiencia en la lisis de células T redirigida de células diana de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que se unen sólo a epítopos con una distancia de más de 60 A desde el átomo de C de referencia y por tanto hace que tales anticuerpos biespecíficos resulten poco atractivos para un desarrollo clínico.
c-MET, TEM1 e IGF-1R son moléculas de superficie celular que tienen una secuencia consecutiva de dominios extracelulares plegados independientemente formados por una secuencia correspondiente de tramos continuos de aminoácidos extracelulares dentro de la secuencia primaría de la proteína. Se ha encontrado sorprendentemente que anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que se unen a epítopos dentro de los primeros 640 residuos de aminoácido contando desde la unión de la reglón extracelular y transmembrana muestran una alta eficiencia significativa en la lisis de células T redirigida de células diana. En contraposición a esto, se reduce la eficiencia en la lisis de células T redirigida de células diana de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que se unen sólo a epítopos dentro de los residuos de aminoácido por encima del residuo de aminoácido número 640 contando desde la unión de la región extracelular y transmembrana y por tanto hace que tales anticuerpos biespecíficos resulten poco atractivos para un desarrollo clínico.
Basándose en estos hallazgos la Invención se refiere a un método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), que comprende las etapas de:
(a) proporcionar al menos tres tipos de células hospedadoras que expresan
(I) el dominio extracelular humano wt de PSMA (SEQ ID NO: 447) en la superficie celular;
(¡I) una forma mutada del PSMA humano wt en la superficie celular, en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 140, 169, 191, 308, 334, 339, 344, 624, 626, 716, 717 y 721 se muían a los residuos de aminoácido correspondientes del PSMA de rata wt; y
(iii) el dominio extracelular wt de rata de PSMA en la superficie celular;
(b) poner en contacto cada tipo de células hospedadoras (i), (¡i) y (iii) de la etapa (a) con los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla y células T efectoras; y
(c) Identificar y aislar los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que median en la lisis de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular humano wt de PSMA en la superficie celular según (b)(¡) y de células hospedadoras que expresan la forma mutada del PSMA humano wt en la superficie celular según (b)(ii) pero no de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular wt de rata de PSMA en la superficie celular según b(iii).
Tal como se indicó anteriormente, el antígeno de membrana específico de próstata (PSMA; PSM) es un antígeno grande que se encuentra dentro de la definición proporcionada de antígenos de superficie celular con un dominio extracelular de alto peso molecular. Israeli et al. (Cáncer Res. 53: 227-230, 1993) clonaron un ADNc de 2,65 kb para un antígeno de membrana específico de próstata detectado con un anticuerpo monoclonal producido contra la línea celular de carcinoma de próstata humano LNCaP. El gen de PSMA codifica para una proteína de 750 aminoácidos que tiene un peso molecular aparente de 100 kD (debido a modificación postraduccional) y se expresa por células de próstata normales y neoplásicas. PSMA se definió originariamente mediante el anticuerpo monoclonal (AcM) 7E11 derivado de la Inmunización con una preparación de membrana parcialmente purificada de la línea celular de adenocarcinoma de próstata en ganglio linfático (LNCaP) (Horoszewicz etal., Anticancer Res. 7 (1987), 927-35). Se clonó un fragmento de ADNc de 2,65 kb que codificaba para la proteína de PSMA y posteriormente se mapeó en el cromosoma 11 p11.2 (Israeli etal., loe. cit.-, O’Keefe etal., Biochem. Biophys. Acta 1443 (1998), 113-127). El análisis Inicial de PSMA demostró una expresión generalizada dentro de las células del epitelio secretor de la próstata. La tinción ¡nmunohlstoquímlca demostró que la expresión de PSMA era de ausente a moderada expresada en tejidos hlperplásicos y benignos, mientras que los tejidos malignos se tiñeron con la mayor Intensidad (Horoszewicz et al., loe. cit.). Investigaciones posteriores han recapitulado estos resultados y han demostrado la expresión de PSMA como característica universal en prácticamente todos los tejidos de próstata examinados hasta la fecha. Estos Informes demuestran además que la expresión de PSMA aumenta de manera vertiginosa proporcional a la agresividad del tumor (Burger etal., Int. J. Cáncer 100 (2002), 228-237; Chang etal., Cáncer Res. 59 (1999), 3192-98; Chang et al., Urology 57 (2001), 1179-83), Kawakami y Nakayama, Cáncer Res. 57 (1997), 2321-24; Liu et al., Cáncer Res. 57 (1997), 3629-34; Lopes et al., Cáncer Res. 50 (1990), 6423-29; Silver et al., Clin. Cáncer Res. 9 (2003), 6357-62; Sweat et al., Urology 52 (1998), 637-40; Troyer etal., Int. J. Cáncer 62 (1995), 552-558; Wright et al., Urology 48 (1996), 326-334). De manera acorde a la correlación entre la expresión de PSMA y el estadio tumoral, se asocian niveles aumentados de PSMA con cáncer de próstata independiente de andrógenos (PCa). El análisis de muestras de tejido de pacientes con cáncer de próstata han demostrado niveles elevados de PSMA después de castración física o terapia de privación androgénica. A diferencia de la expresión del antígeno específico de próstata, que está regulado por disminución después de ablación androgénica, la expresión de PSMA aumenta significativamente en muestras de tumor tanto primario como metastásico (Kawakami et al., Wright et al., loe. cit.). De manera acorde a la expresión elevada en tumores independientes de andrógenos, se sabe también que la transcripción de PSMA está regulada por disminución por esteroides, y la administración de testosterona media en una drástica reducción de los niveles de ARNm y proteína de PSMA (Israeli et al., Cáncer Res. 54 (1994), 1807-11; Wright et al., loe. cit.). PSMA se expresa también altamente en tumores de próstata secundarios y enfermedad metastásica oculta. El análisis ¡nmunohlstoquímlco ha revelado una expresión relativamente intensa y homogénea de PSMA dentro de lesiones metastásicas localizadas en los ganglios linfáticos, hueso, tejido blando y pulmones en comparación con tejidos de próstata benignos (Chang et al. (2001), loe. cit.; Murphy et al., Cáncer 78 (1996), 809-818; Sweat et al., loe. cit.). Algunos Informes han Indicado también la expresión limitada de PSMA en tejidos extraprostáticos, incluyendo un subconjunto de túbulos proximales renales, algunas células de la membrana intestinal de borde en cepillo, y células poco comunes en las criptas colónicas (Chang et al. (1999), Horoszewicz et al., Israeli etal. (1994), Lopes etal., Troyer etal., loe. cit.). Sin embargo, los niveles de PSMA en estos tejidos son generalmente de dos a tres órdenes de magnitud menores que los observados en la próstata (Sokoloff et al., Prostate 43 (2000), 150-157). PSMA se expresa también en la neovasculatura asociada a tumor de la mayor parte de cánceres sólidos examinados pero está ausente en el endotelio vascular normal (Chang etal. (1999), Liu etal., Sllver et al., loe. cit.). Aunque se desconoce la Importancia de la expresión de PSMA dentro de la vasculatura, la especificidad por endotelio asociado a tumor hace que PSMA sea una diana potencial para el tratamiento de muchas formas de tumor maligno.
Tal como resulta evidente a partir de SEQ ID NO: 447, el dominio extracelular de PSMA comprende 707 residuos de aminoácido. El aa número 13 contando desde la unión de la reglón extracelular y transmembrana (átomo de C de referencia) es una histidina. La identificación de los residuos de aminoácido que van a mutarse para el PSMA humano mutante se describe en detalle en el ejemplo 2 adjunto. Según el método de la invención, todos los residuos de aminoácido que no coinciden entre el dominio extracelular de PSMA de rata y de ser humano y que tienen una distancia de más de 60 A desde el átomo de C de referencia se mutan de la secuencia humana a la secuencia de rata. Esta mutación da como resultado una transformación de todas las reglones antlgénicas con una distancia de más de 60 A desde el átomo de C de referencia de la forma específica de ser humano a la forma específica de roedor. Anticuerpos, por ejemplo anticuerpos biespecíficos que son específicos para epítopos humanos que comprenden reglones antlgénicas con una distancia de más de 60 A desde el átomo de C de referencia (específicos para epítopos distales a la membrana) no se unen al PSMA humano mutante y al PSMA de roedor. Por consiguiente, el método de la invención permite una discriminación de anticuerpos que se unen a epítopos que comprenden reglones antlgénicas con una distancia de más de 60 A desde el átomo de C de referencia (anticuerpos específicos para epítopos dlstales a la membrana) y una identificación positiva y el aislamiento de anticuerpos específicos para epítopos del PSMA humano dentro de una distancia de menos de 60 A desde el átomo de C de referencia (anticuerpos específicos para epítopos proximales a la membrana).
Tal como resulta evidente a partir de los ejemplos adjuntos, se ha observado sorprendentemente que la distancia del epítopo desde la membrana celular es un factor crítico para la potencia cltotóxica de un anticuerpo blespecífico de cadena sencilla que capta células T efectoras y células diana, tales como células PSMA+. El efecto general que subyace a la distancia entre el epítopo, que se une por un anticuerpo blespecífico de cadena sencilla acorde, desde la membrana celular de una célula diana se ejemplifica en un modelo en el ejemplo 1 adjunto. Sin embargo, lo que constituyó una sorpresa según este ejemplo, fue la gran extensión de la pérdida de lisis de la célula diana observada entre un tamaño de diana de 640 aa (D1) y 679 aa (D3). A pesar de esta pequeña diferencia en el tamaño de diana, hubo más pérdida de lisis de célula diana que desde 679 aa (D3) hasta 1319 aa (D1 D3). Por tanto, se encontró Inesperadamente un tamaño de diana de 640 aa como umbral superior para los epítopos alejados de la membrana de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla, para poder inducir todavía cltotoxicldad de células T redirigida con una potencia razonable sin requerir compensación por la influencia negativa de mayor distancia de la membrana mediante otras propiedades del Acbcs tal como una afinidad muy alta por el antígeno diana. Además, la potencia cltotóxica relativa a la distancia del epítopo unido por un anticuerpo blespecífico de cadena sencilla se demuestra en los ejemplos 3 y 4.
Se describen ejemplos de ensayos para realizar las etapas del método según la invención en los ejemplos adjuntos.
La invención se refiere además a un método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular de la proteína de activación de fibroblastos a (FAPa), que comprende las etapas de:
(a) proporcionar al menos tres tipos de células hospedadoras que expresan
(I) el dominio extracelular humano wt de FAPa (SEQ ID NO: 448) en la superficie celular;
(¡I) una forma mutada de la FAPa humana wt en la superficie celular, en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 144, 185, 186, 229, 267, 273, 274, 278, 284, 301, 328, 329, 331, 335 y 362 se mutan a los residuos de aminoácido correspondientes de la FAPa de ratón wt; y
(iii) el dominio extracelular wt de ratón de FAPa en la superficie celular;
(b) poner en contacto cada tipo de células hospedadoras (I), (¡I) y (iii) de la etapa (a) con los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla y células T efectoras; y
(c) identificar y aislar los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que median en la lisis de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular humano wt de FAPa en la superficie celular según (b)(¡) y de células hospedadoras que expresan la forma mutada de la FAPa humana wt en la superficie celular según (b)(ii) pero no de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular wt de ratón de FAPa en la superficie celular según b(iii).
Otro antígeno grande según la definición anterior es la proteasa de superficie celular, la proteína de activación de fibroblastos alfa (FAP alfa). En el cáncer epitelial, la Invasión y metástasis de células epiteliales malignas en tejidos normales está acompañada por cambios adaptatlvos en el estroma de sostén derivado del mesénqulma de los órganos diana. Se ha comentado que la expresión génlca alterada en estas células del estroma no transformadas proporciona dianas potenciales para terapia. FAP alfa es un ejemplo de este tipo para una diana de fibroblastos tumorales activados en estroma tumoral. La proteína de activación de fibroblastos alfa es una gllcoproteína de superficie celular ¡nduclble que ha sido Identificada originariamente en fibroblastos en cultivo usando el anticuerpo monoclonal F19. Estudios inmunohistoquímicos han mostrado que FAP alfa se expresa de manera transitoria en determinados tejidos mesenqulmatosos fetales normales pero que tejidos adultos normales así como células malignas epiteliales, neurales y hematopoyéticas son generalmente negativas para FAP alfa. Sin embargo, la mayor parte de los tipos comunes de cánceres epiteliales contienen abundantes fibroblastos del estroma reactivos con FAP alfa. Se clonó ADNc de FAP alfa y se publicó en GenBank (número de registro NM 004460). La proteína FAP alfa humana predlcha es una proteína Integral de membrana de tipo II con un dominio extracelular C-terminal grande, que contiene 6 posibles sitios de N-glicosllaclón, 13 residuos de clsteína y 3 segmentos que corresponden a dominios catalíticos altamente conservados de serina proteasas; un segmento transmembrana hidrófobo; y una cola citoplasmática corta. FAP-alfa muestra una identidad de aminoácidos del 48% con dipeptidil peptidasa IV (DPP4) y una identidad del 30% con la proteína relacionada con DPP4 (DPPX). El análisis de transferencia de tipo Northern detectó una ARNm de FAP alfa de 2,8 kb en fibroblastos. La seprasa es una gelatlnasa Integral de membrana de 170 kD cuya expresión se correlaciona con la ¡nvaslvldad de células de melanoma y carcinoma humano. Goldsteln et al. (Biochim. Biophys. Acta 1361: 11-19, 1997) clonaron y caracterizaron el ADNc de seprasa correspondiente. Los autores encontraron que la seprasa y FAP alfa son la misma proteína y productos del mismo gen. Pineiro-Sanchez et al. (J. Biol. Chem. 272: 7595-7601, 1997) aislaron proteína seprasa/FAP alfa de las membranas celulares y vesículas liberadas de células de melanoma humano LOX. Los Inhibidores de serina proteasas bloquearon la actividad gelatinasa de seprasa/FAP alfa, lo que sugiere que seprasa/FAP alfa contiene un(os) residuo(s) de serina catalíticamente activo(s). Los autores encontraron que seprasa/FAP alfa se compone de subunldades de 97 kD monoméricas, N-glicosiladas que son proteolítlcamente Inactivas. Concluyeron que seprasa/FAP alfa es similar a DPP4 porque sus actividades proteolítlcas dependen de la asociación de subunldades. Debido a su actividad de degradación de gelatina y colágeno de tipo I y tipo IV desnaturalizado con calor, se ha sugerido un papel para seprasa/FAP alfa en la remodelación de la matriz extracelular, el crecimiento tumoral y la metástasis de cánceres. Además, seprasa/FAP alfa muestra un patrón de expresión restringido en tejidos normales y una expresión uniforme en el estroma de sostén de muchos tumores malignos. Por tanto, puede usarse seprasa/FAP alfa como diana para estudiar el concepto de selección como diana del estroma tumoral para ¡nmunoterapla de cáncer epitelial humano. Sin embargo, aunque se han ¡nielado varios ensayos clínicos para Investigar el papel de seprasa/FAP alfa como diana de antígeno tumoral, enfoques convencionales de ¡nmunoterapla o Inhibición de la actividad enzlmátlca de seprasa/FAP alfa hasta ahora no han dado aún como resultado eficacia terapéutica (véanse por ejemplo Welt et al., J. Clin. Oncol. 12:1193-203, 1994; Narra et al., Cáncer Biol. Ther. 6, 1691-9, 2007; Henry et al., Clinical Cáncer Research 13, 1736-1741, 2007). Tal como resulta evidente a partir de SEQ ID NO: 448, el dominio extracelular de FAPa comprende 734 residuos de aminoácido. El aa número 13 contando desde la unión de la reglón extracelular y transmembrana (átomo de C de referencia) es una metlonlna. Se describe la Identificación de los residuos de aminoácido que van a mutarse para la FAPa humana mutante en detalle en el ejemplo 5 adjunto. Según el método de la Invención, todos los residuos de aminoácido que no coinciden entre el dominio extracelular de FAPa de ratón y de ser humano y que tienen una distancia de más de 60 A desde el átomo de C de referencia se mutan de la secuencia humana a la secuencia de ratón.
Además, la Invención se refiere a un método para la selección de anticuerpos blespecíflcos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-MET), endosialina (TEM1) y el receptor del factor de crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF-1R), que comprende las etapas de:
(a) Identificar los 640 residuos de aminoácido proxlmales a la membrana del homólogo humano y de roedor del dominio extracelular de c-MET, TEM1 o IGF-1R;
(b) proporcionar células hospedadoras que expresan
(i) el dominio extracelular wt humano de c-MET (SEQ ID NO: 439), TEM1 (SEQ ID NO: 443) o IGF-1R (SEQ ID NO: 446) en la superficie celular;
¡I) una proteína de fusión que comprende los 640 residuos de aminoácido proxlmales a la membrana humanos identificados en la etapa (a) y los >640 residuos de aminoácido de roedor de c-MET, TEM1 o IGF-1R; y
(iii) el dominio extracelular wt de roedor de c-MET, TEM1 o IGF-1 R;
(c) poner en contacto las células hospedadoras según la etapa (b) con los anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla y células T efectoras; y
(d) Identificar y aislar los anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla que median en la lisis de células hospedadoras según (b)(¡) y (b)(ii) pero no de células hospedadoras según b(iii).
Tal como se describió anteriormente en el presente documento, c-MET, TEM1 e IGF-1R son proteínas integrales de membrana de tipo I o tipo II con una parte extracelular de más de 640 aminoácidos. La secuencia consecutiva del dominio extracelular comprende tramos continuos de aminoácidos extracelulares dentro de la secuencia primaría de la proteína y un subdomlnlo extracelular plegado Independientemente formado por un único tramo continuo.
El receptor del factor de crecimiento de hepatocitos MET (C-MET) está implicado en la progresión y diseminación de numerosos tipos de cáncer humano. El oncogén MET, que codifica para la tlroslna cinasa receptora (RTK) para el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y el factor de dispersión (SF), controla programas genéticos que conducen al crecimiento, la Invasión y protección celular frente a la apoptosls. La activación desregulada de MET es crítica no sólo para la adquisición de propiedades tumorlgénlcas sino también para la consecución del fenotipo invasivo (Trusolino, L. & Comoglio, P. M. (2002) Nat. Rev. Cáncer 2, 289-300). El papel de MET en tumores humanos surgió de varios enfoques experimentales y se probó de manera Inequívoca mediante el descubrimiento de mutaciones activantes de MET en formas heredadas de carcinomas (Schmidt et al., Nat. Genet. 16 (1997), 68-73; Kim etal., J. Med. Genet. 40 (2003), e97). Es frecuente la activación constitutiva de MET en cánceres esporádicos, y varios estudios han mostrado que el oncogén MET se sobreexpresa en tumores de histotipos específicos o se activa a través de mecanismos autocrlnos (para una lista véase http://www.val.org/met/). Además, el gen MET se amplifica en metástasis hematógenas de carcinomas colorrectales (Di Renzo et al., Clin. Cáncer Res. 1 (1995), 147-154). El factor de dispersión (SF) secretado en cultivo por fibroblastos, que tienen la capacidad para Inducir la disociación intercelular de células epiteliales, y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un potente mitógeno para hepatocitos en cultivo derivados de plaquetas o de la sangre de pacientes con Insuficiencia hepática aguda, Identificados Independientemente como llgandos de Met resultó ser la misma molécula. Met y SF/HGF se expresan ampliamente en una variedad de tejidos. La expresión de Met (el receptor) se confina normalmente a células de origen epitelial, mientras que la expresión de SF/HGF (el ligando) se restringe a células de origen mesenqulmatoso. Met es una proteína transmembrana producida como precursor de cadena sencilla. El precursor se escinde proteolítlcamente en un sitio de furlna para producir una subunldad a altamente gllcosllada y completamente extracelular de 50 kD y una subunldad p de 145 kD con una reglón extracelular grande (Implicada en la unión del ligando), un segmento que abarca la membrana, y una reglón ¡ntracelular (que contiene la actividad catalítica) (Giordano (1989) 339: 155-156). Las cadenas a y p están unidas con enlaces disulfuro. La parte extracelular de Met contiene una reglón de homología con semaforlnas (dominio sema, que Incluye la cadena a completa y la parte N-terminal de la cadena p de Met), una secuencia relacionada con Met (MRS) rica en clsteína seguida por repeticiones ricas en gllclna-prollna (G-P), y cuatro estructuras similares a inmunoglobulina (Birchmeier et al., Nature Rev. 4 (2008), 915-25). La región ¡ntracelular de Met contiene tres regiones: (1) un segmento yuxtamembrana que contiene: (a) un residuo de serina (Ser 985) que, cuando se fosforila por proteína cinasa C o por cinasas dependientes de Ca2+-calmodulina regula por disminución la actividad de cinasas receptoras, Gandlno et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 1815-20); y (b) una tirosina (Tyr 1003) que se une a la ubiquitina ligasa Cbl responsable de la poliubiquitinación, endocitosis y degradación de Met (Peschard et al., Mol. Cell 8 (2001), 995-1004); (2) el dominio de tirosina cinasa que, tras la activación del receptor, experimenta transfosforilación en Tyr1234 y Tyr1235; (3) la región C-terminal, que comprende dos tirosinas cruciales (Tyr1349 y Tyr1356) insertadas en un motivo degenerado que representa un sitio de anclaje de múltiples sustratos que puede reclutar varios adaptadores posteriores que contienen el receptor de Met con dominios de homología con Src 2 (SH2), ya que la mayor parte de tlroslna cinasas receptoras (RTK) usan diferentes tirosinas para unirse a moléculas de señalización específicas. Se demostró que las dos tirosinas de los sitios de anclaje eran necesarias y suficientes para la transducclón de señales tanto in vitro como in vivo (Maina etal., Cell 87 (1996), 531-542; Ponzetto etal., Cell 77 (1994), 261-71).
Un ejemplo adicional de una molécula que tiene un dominio extracelular grande es el marcador de endotello tumoral (TEM) endosialina (= TEM1). Los TEM se sobreexpresan durante la angiogénesis tumoral (St. Croix et al., Science 289 (2000), 1197-1202). A pesar del hecho de que no se han caracterizado sus funciones en detalle hasta la fecha, está bien establecido que se expresan fuertemente en células endotellales vasculares en estudios en tumores y embriones en desarrollo (Carson-Walter et al., Cáncer Res. 61: 6649-6655, 2001). Por consiguiente, la endosialina, una proteína transmembrana de tipo I de 165 kDa, se expresa en la superficie celular del endotello de vasos sanguíneos tumorales en una amplia gama de cánceres humanos pero no se detectan en vasos sanguíneos u otros tipos de célula en muchos tejidos normales. Es una molécula similar a lectina de tipo C de 757 aminoácidos que se compone de un péptldo señal líder, cinco dominios extracelulares globulares (Incluyendo un dominio de lectina de tipo C, un dominio con similitud con el patrón Sushi/ccp/scr y tres repeticiones de EGF), seguido por una región similar a mucina, un segmento transmembrana y una cola cltoplasmátlca corta (Chrlstlan et al., J. Biol. Chem. 276: 7408-7414, 2001). La proteína central endosialina porta ollgosacáridos con uniones a O, abundantemente slalllados y es sensible a O-sialoglicoproteína endopeptldasa, situándola en el grupo de moléculas similares a sialomucina. Los 360 aminoácidos N-termlnales de endosialina muestran homología con trombomodullna, un receptor Implicado en la regulación de la coagulación sanguínea, y con el receptor del complemento C1qRp. Esta relación estructural Indica una función para endosialina como receptor del endotello tumoral. Aunque el ARNm de endosialina se expresa de manera ubicua en células endotellales en tejidos humanos normales y somáticos murínos, la proteína de endosialina se restringe en gran medida al cuerpo lúteo y tejidos altamente anglogénlcos tales como el tejido granular de tumores o heridas en cicatrización (Opavsky etal., J. Biol. Chem. 276 (2001, 38795-38807; Rettig etal., PNAS 89 (1992), 10832-36). La expresión de la proteína de endosialina está regulada por incremento en células endotellales tumorales de carcinomas (mesotelloma de mama, de riñón, de pulmón, colorrectal, de colon, de páncreas), sarcomas y tumores neuroectodérmicos (melanoma, glioma, neuroblastoma) (Rettig et al., loe. cit.).
Además, la endoslallna se expresa a bajo nivel en un subconjunto de fibroblastos de estroma tumoral (Brady et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (2004), 1274-83; Opavsky et al., loe. cit.). Debido a su distribución restringida en tejido normal y abundante expresión en células endoteliales tumorales de muchos tipos diferentes de tumores sólidos, se ha comentado la endosialina como diana para estrategias de tratamiento antiangiogénico basadas en anticuerpos del cáncer. Sin embargo, hasta la fecha, no hay enfoques terapéuticos eficaces que usen endosialina como diana del endotelio tumoral.
Un ejemplo todavía adicional de un antígeno grande es el receptor del factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-IR o IGF-1R). IGF-IR es un receptor con actividad tirosina cinasa que tiene una homología del 70% con el receptor de insulina IR. IGF-IR es una glicoproteína de peso molecular de aproximadamente 350.000. Es un receptor heterotetramérico del que cada mitad (unidas mediante puentes disulfuro) se compone de una subunidad a extracelular y de una subunidad beta transmembrana. IGF-IR se une a IGF I e IGF II con una afinidad muy alta pero puede unirse igualmente a insulina con una afinidad de 100 a 1000 veces menos. A la inversa, el IR se une a insulina con una afinidad muy alta aunque los ICF sólo se unen al receptor de insulina con una afinidad 100 veces menor. El dominio de tirosina cinasa de IGF-IR y de IR tiene una homología de secuencia muy alta aunque las zonas de homología más débiles afectan respectivamente a la región rica en cisterna situada en la subunidad alfa y la parte C-terminal de la subunidad beta. Las diferencias de secuencia observadas en la subunidad a están situadas en la zona de unión de los ligandos y, por tanto, dan origen a las afinidades relativas de IGF-IR y de IR por los IGF e insulina respectivamente. Las diferencias en la parte C-terminal de la subunidad beta dan como resultado una divergencia en las rutas de señalización de los dos receptores; mediando IGF-IR en efectos mitogénicos, de diferenciación y antiapoptosis, mientras que la activación del IR implica principalmente efectos a nivel de las rutas metabólicas (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332: F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253:1-6, 1999). Las proteínas tirosina cinasas citoplasmáticas se activan mediante la unión del ligando al dominio extracelular del receptor. La activación de las cinasas implica a su vez la estimulación de diferentes sustratos ¡ntracelulares, incluyendo IRS-1, IRS-2, Shcy Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). Los dos sustratos principales de IGF-IR son IRS y Shc que median, mediante la activación de numerosos efectores posteriores, en la mayoría de los efectos de crecimiento y diferenciación relacionados con la unión de los IGF a este receptor. La disponibilidad de sustratos puede dictar por consiguiente el efecto biológico final relacionado con la activación del IGF-IR. Cuando predomina IRS-1, las células tienden a proliferar y transformarse. Cuando predomina Shc, las células tienden a diferenciarse (Valentinis B. eta!:, J. Biol. Chem. 274:12423-12430, 1999). Para que la ruta implicada principalmente para los efectos de protección contra la apoptosis es la ruta de las fosfatidil-inositol 3-cinasas (Pl 3-cinasas) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31:80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). El papel del sistema de IGF en la carcinogénesis se ha convertido en objeto de una intensa investigación en los últimos diez años. Este interés siguió al descubrimiento del hecho de que además de sus propiedades mitogénicas y antiapoptosis, IGF-IR parece requerirse para el establecimiento y mantenimiento de un fenotipo transformado. De hecho, está bien establecido que una sobreexpresión o una activación constitutiva de IGF-IR conduce, en una gran variedad de células, a un crecimiento de las células independiente del sostén en medios carentes de suero de ternero fetal, y a la formación de tumores en ratones desnudos. Esto no es en sí mismo una propiedad única puesto que una gran variedad de productos de genes sobreexpresados pueden transformar células, incluyendo un buen número de receptores de factores de crecimiento. Sin embargo, el descubrimiento crucial que ha demostrado claramente el papel principal desempeñado por IGF-IR en la transformación ha sido la demostración de que las células R, en las que se ha inactivado el gen que codifica para IGF.IR, son totalmente resistentes a la transformación por diferentes agentes que habitualmente pueden transformar las células, tales como la proteína E5 del virus del papiloma bovino, una sobreexpresión de EGFR o de PDGFR, el antígeno T de SV40, ras activado o la combinación de estos dos últimos factores (Sell C. et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 90: 11217-11221, 1993; Sell C. etal., Mol. Cell. Biol., 14:3604-3612, 1994; Morrione A. J., Viral., 69:5300-5303, 1995; Coppola D. etal., Mol. Cell. Biol., 14:458a-4595, 1994; DeAngelisT etal., J. Cell. Physiol., 164:214-221, 1995). IGF-IR se expresa en una gran variedad de tumores y de líneas tumorales y los IGF amplifican el crecimiento tumoral a través de su unión a IGF-IR. Otros argumentos a favor del papel de IGF-IR en la carcinogénesis proceden de estudios que usan anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra el receptor o que usan dominantes negativos de IGF-IR. En efecto, los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra IGF-IR inhiben la proliferación de numerosas líneas celulares en cultivo y el crecimiento de células tumorales in vivo (Arteaga C. et al., Cáncer Res., 49:6237-6241, 1989 Li etal., Biochem. Biophys. Res. Com., 196:92-98, 1993; Zia F etal., J. Cell. Biol., 24:269-275, 1996; Scotlandi K et al., Cáncer Res., 58:4127-4131, 1998). Asimismo, se ha mostrado en los trabajos de Jiang et al. (Oncogene, 18:6071-6077,1999) que un dominante negativo de IGF-IR puede inhibir la proliferación tumoral.
El término “antígeno de superficie celular” tal como se usa en el presente documento indica una molécula, que se presenta sobre la superficie de una célula. En la mayor parte de los casos, esta molécula estará ubicada en o sobre la membrana plasmática de la célula de tal manera que al menos parte de esta molécula sigue siendo accesible desde el exterior la célula en forma terciaria. Un ejemplo no limitativo de una molécula de superficie celular, que está ubicada en la membrana plasmática es una proteína transmembrana que comprende, en su conformación terciaria, reglones de hidrofilicidad e hidrofobicidad. En este caso, al menos una reglón hidrófoba permite que se Incluya la molécula de superficie celular, o se Inserte en la membrana plasmática hidrófoba de la célula mientras que las reglones hldrófilas se extienden a ambos lados de la membrana plasmática en el citoplasma y el espacio extracelular, respectivamente. Ejemplos no limitativos de moléculas de superficie celular que están ubicadas sobre la membrana plasmática son proteínas que se han modificado en un residuo de clsteína para que porte un grupo palmitoílo, proteínas modificadas en un residuo de cisterna C-terminal para que porte un grupo farnesilo o proteínas que se han modificado en el extremo C-terminal para que porten un anclaje de glicosil-fosfatidil-inositol (“GPI”). Estos grupos permiten la unión covalente de proteínas a la superficie externa de la membrana plasmática, donde siguen siendo accesibles para el reconocimiento por moléculas extracelulares tales como anticuerpos. Ejemplos de antígenos de superficie celular son CD3 (en particular CD3e), PSMA, FAPa, c-MET, endosialina e IGF-IR. Tal como se describió anteriormente en el presente documento, PSMA, FAPa, c-MET, endosialina e IGF-IR son antígenos de superficie celular que son dianas para la terapia del cáncer, Incluyendo, pero sin limitarse a tumores sólidos.
En vista de esto, los antígenos diana PSMA, FAPa, c-MET, endosialina e IGF-IR pueden caracterizarse también como antígenos tumorales. El término “antígeno tumoral” tal como se usa en el presente documento puede entenderse como aquellos antígenos que se presentan en células tumorales. Estos antígenos pueden presentarse en la superficie celular con una parte extracelular, que se combina a menudo con una parte transmembrana y citoplasmática de la molécula. Estos antígenos pueden presentarse a veces sólo por células tumorales y nunca por las normales. Los antígenos tumorales pueden expresarse exclusivamente en células tumorales o podrían representar una mutación específica de tumor en comparación con células normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor. Más comunes son los antígenos que se presentan por células tumorales y células normales, y se denominan antígenos asociados a tumor. Estos antígenos asociados a tumor pueden sobreexpresarse en comparación con las células normales o son accesibles para la unión a anticuerpos en células tumorales debido a la estructura menos compacta del tejido tumoral en comparación con el tejido normal.
Según la presente Invención, un dominio de proteína plegado Independientemente se define como una parte diferenciada de una proteína formada por un único tramo continuo de aminoácidos dentro de la secuencia primaria de la proteína, por ejemplo que se conoce a partir de su estructura cristalina, que adopta la “conformación correcta” sin requerir sostén de otras partes de la proteína o que se predice que lo hará mediante comparación con modelos de Markow ocultos en bibliotecas de dominios de secuencia descritos, tales como PFAM (Bateman (2000) Nucleic Acids Res. 28: 263-266) y SMART (Schultz (2000) Nucleic Acids Res. 28: 231-234), búsquedas de similitud de secuencia en bases de datos con las herramientas BLAST y PSI-BLAST (Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) que se basan en el concepto de un ancestro evolutivo común entre secuencias homologas secuencialmente o cualquier otro método de predicción de dominios del estado de la técnica. Los dominios plegados independientemente de la misma cadena de proteína se unen a menudo mediante un segmento flexible de aminoácidos, contándose cada mitad del segmento flexible hasta su dominio de proteína plegado independientemente adyacente. Los dominios plegados Independientemente de la misma proteína pueden conectarse en una molécula precursora mediante un sitio de escisión de proteasas y después de procesamiento proteolítico puede residir en dos cadenas de proteína conectadas diferentes en la molécula madura. Los dominios de proteína plegados Independientemente pueden comprender subdomlnlos definidos funcional y/o estructuralmente que no adoptan su conformación correcta sin requerir sostén por otras partes de la proteína porque están formados por tramos discontinuos de aminoácidos extracelulares dentro de la secuencia primaría de la proteína o se mantiene en su conformación correcta por partes adyacentes u otras partes de la proteína.
El término “método para la selección”, y respectivamente el término “seleccionar” indica en el contexto de la presente Invención la Identificación y el aislamiento de uno o más anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla de una población de anticuerpos candidatos. En particular, los anticuerpos candidatos se someten a prueba en entornos independientes para determinar la unión y la mediación de la citotoxlcidad para cada una de las tres poblaciones de células hospedadoras diferentes. Las poblaciones de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que van a someterse a prueba y los métodos para la generación de tales poblaciones se describen en los ejemplos adjuntos. Puesto que el método permite el aislamiento de uno o más anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla, se entiende también que el método es un método para la producción de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla. Por supuesto, tal método para la producción Implica la producción de la población de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla, de la que se aíslan el uno o más, que se unen a los epítopos proximales a la membrana.
Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo biespecífico de cadena sencilla” indica una única cadena de polipéptido que comprende dos dominios de unión. Cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo (“región VH”), en el que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente a la molécula de CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente al dominio extracelular de una proteína de membrana en una célula diana, por ejemplo a PSMA, FAPa, c-MET, endosialina/TEM1 o IGF-1R. Los dos dominios de unión se conectan opcionalmente entre sí mediante un espaciador de polipéptido corto. Un ejemplo no limitativo de un espaciador de polipéptido es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) y repeticiones del mismo. Cada dominio de unión puede comprender adicionalmente una región variable de una cadena ligera de anticuerpo (“región VL”), conectándose la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo entre sí a través de un ligador de polipéptido, por ejemplo del tipo dado a conocer y reivindicado en el documento EP 623679 B1, pero en cualquier caso lo suficientemente largo como para permitir que la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión se apareen unas con otras de tal manera que, conjuntamente, pueden unirse específicamente a los dominios de unión primero y segundo respectivos.
El término “proteína” se conoce bien en la técnica y describe compuestos biológicos. Las proteínas comprenden una o más cadenas de aminoácidos (polipéptidos), mediante las cuales los aminoácidos se unen entre sí a través de un enlace peptídico. El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento describe un grupo de moléculas, que consiste en más de 30 aminoácidos. Según la invención, el grupo de polipéptidos comprende “proteínas” siempre que las proteínas consistan en una única cadena de polipéptido. También en línea con la definición, el término “polipéptido” describe fragmentos de proteínas siempre que estos fragmentos consistan en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar además multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman tales dímeros, trímeros etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de tales multímeros se denominan, por consiguiente, homo o heterodímeros, homo o heterotrímeros, etc. Un ejemplo de un hereteromultímero es una molécula de anticuerpo, que, en su forma que se produce de manera natural, consiste en dos cadenas ligeras de polipéptido idénticas y dos cadenas pesadas de polipéptido idénticas. Los términos “polipéptido” y “proteína” también se refieren a proteínas/polipéptidos modificados de manera natural en los que se efectúa la modificación, por ejemplo, mediante modificaciones postraduccionales como glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Tales modificaciones se conocen bien en la técnica.
El término “dominio de unión” caracteriza, en relación con la presente Invención, un dominio de un polipéptido que se une específicamente a/interacciona con una estructura/antígeno/epítopo diana dado. Por tanto, el dominio de unión es un “sitio de interacción con antígeno”.
El término “sitio de Interacción con antígeno” define, según la presente Invención, un motivo de un polipéptido, que puede interaccionar específicamente con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos, por ejemplo el antígeno idéntico en diferentes especies. Dicha unlón/lnteracción se entiende también que define un “reconocimiento específico”. El término “que reconoce específicamente” significa según esta Invención que la molécula de anticuerpo puede ¡nteraccionar específicamente con y/o unirse a al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro aminoácidos de un antígeno, por ejemplo el antígeno CD3 humano y los antígenos diana tal como se definen en el presente documento. Tal unión puede ejemplificarse mediante la especificidad de un “principio de llave y cerradura”. Por tanto, motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno se unen entre sí como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria así como el resultado de modificaciones secundarías de dicha estructura. La Interacción específica del sitio de Interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar resultado también una unión sencilla de dicho sitio al antígeno. Además, la interacción específica del dominio de unlón/sitio de Interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado alternativamente la Iniciación de una señal, por ejemplo debido a la Inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerízación del antígeno, etc.
El término “anticuerpo” comprende derivados o fragmentos funcionales del mismo que conservan todavía la especificidad de unión. Se conocen bien en la técnica técnicas para la producción de anticuerpos y se describen, por ejemplo en Harlow y Lañe “Antibodies, A Laboratory Manual”, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Harlow y Lañe “Using Antibodies: A Laboratory Manual” Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1999. El término “anticuerpo” también comprende ¡nmunoglobulinas (Ig) de diferentes clases (es decir IgA, IgG, IgM, IgD e IGE) y subclases (tales como lgG1, lgG2 etc.).
La definición del término “anticuerpo” incluye también realizaciones tales como anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos de anticuerpo, como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo o derivados comprenden además fragmentos F(ab’)2, Fv, scFv o anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de un solo dominio variable o un solo dominio variable de inmunoglobulina que comprende únicamente un dominio variable, que podría ser VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otros dominios o regiones V; véase, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) y (1999), loe. cit. Un solo dominio variable de Inmunoglobulina de este tipo engloba no sólo un polipéptido de un solo dominio de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia de polipéptido de un solo dominio de anticuerpo.
Se conocen en la técnica diversos procedimientos y pueden usarse para la producción de tales anticuerpos y/o fragmentos. Por tanto, los derivados (de anticuerpo) pueden producirse también por peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, entre otros, la patente estadounidense 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para polipéptido(s) elegido(s). Además, pueden usarse animales transgénlcos para expresar anticuerpos humanizados o humanos específicos para polipéptidos y proteínas de fusión. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos de tales técnicas Incluyen la técnica del hlbrídoma (Kohler y Milstein Nature 256 (1975), 495-497), la técnica del trloma, la técnica del hlbrídoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica del hlbrídoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé etal., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Puede usarse resonancia por plasmones de superficie tal como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de anticuerpos de fago que se unen a un epítopo de un polipéptido diana, tal como CD3 (épsilon), PSMA o FAPa, c-MET, TEM1 o IGF-1R (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Se prevé también en el contexto de esta invención que el término “anticuerpo” comprenda constructos de anticuerpos, que pueden expresarse en un hospedador tal como se describe a continuación en el presente documento, por ejemplo constructos de anticuerpos que pueden transfectarse y/o transducirse a través de, entre otros, virus o vectores de plásmido.
El término “interacción específica” tal como se usa según la presente Invención significa que el dominio de unión no experimenta reacción cruzada o no lo hace significativamente con polipéptidos que tienen estructura similar a los que se unen por el dominio de unión, y que podrían expresarse por las mismas células que el polipéptido de interés. Puede someterse a prueba la reactividad cruzada de un panel de dominios de unión en Investigación, por ejemplo, evaluando la unión de dicho panel de dominios de unión en condiciones convencionales (véanse, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Los ejemplos de la interacción específica de un dominio de unión con un antígeno específico comprenden la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende particularmente la Interacción de ligandos, que Inducen una señal tras su unión a su receptor específico. Los ejemplos de dicha interacción, que está también particularmente comprendida por dicha definición, es la Interacción de un determinante antigénlco (epítopo) con el dominio de unión (sitio de unión antigénlco) de un anticuerpo.
Según una realización preferida del método de la Invención, el primer dominio de unión se une a CD3 épsilon (CD3e) de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus. En este contexto, se prefiere particularmente que el primer dominio de unión pueda unirse a un epítopo de ser humano y Callithrix jacchus, la cadena de CD3e de Saguinus oedipus o Saimirí sciureus se une a un epítopo, que forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO. 2, 4, 6 y 8.
Tal como se usa en el presente documento, “ser humano” y “hombre” se refieren a la especie Homo sapiens. En lo que respecta a los usos médicos de los constructos descritos en el presente documento, los pacientes humanos van a tratarse con la misma molécula.
El término anticuerpo “humano” tal como se usa en el presente documento ha de entenderse que significa que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento, comprende (una) secuencia(s) de aminoácidos contenlda(s) en el repertorio de anticuerpos de línea germinal humana. Para los fines de definición en el presente documento, dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla puede considerarse por tanto humano si consiste en tal(es) secuencia(s) de aminoácidos de línea germinal humana, es decir si la secuencia(s) de aminoácidos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla en cuestión es/son ¡déntica(s) a (una) secuencia(s) de aminoácidos de línea germinal humana expresada(s). Un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento también puede considerarse humano si consiste en (una) secuencia(s) que se desvía(s) de su(s) secuencia(s) de línea germinal humana más próxlma(s) en no más de lo que se esperaría debido a la huella de hlpermutación somática. Adicionalmente, los anticuerpos de muchos mamíferos no humanos, por ejemplo roedores tales como ratones y ratas, comprenden secuencias de aminoácidos de CDR3 de VH que puede esperarse que existan también en el repertorio de anticuerpos humanos expresado. Cualquiera de tal(es) secuencia(s) de origen humano o no humano que puede esperarse que existan en el repertorio humano expresado se consideraría “humana” también para los fines de la presente Invención.
Aunque los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla captadores de células T descritos en la técnica tienen gran potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades malignas, la mayor parte de estas moléculas biespecíficas están limitadas porque son específicas de la especie y reconocen sólo antígeno humano, y, debido a similitud genética, probablemente el homólogo de chimpancé.
En el presente documento, los ejemplos descritos de primeros dominios de unión preferidos se unen a un fragmento de polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal del dominio extracelular de CD3 épsilon. Se Identificó sorprendentemente este fragmento de polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido que, a diferencia de todos los demás epítopos conocidos de CD3 épsilon descritos en la técnica, mantiene su integridad estructural tridimensional cuando se extrae de su entorno nativo en el complejo CD3 (y se fusiona opcionalmente a una secuencia de aminoácidos heterolóloga tal como EpCAM o una parte Fe de ¡nmunoglobulina).
CD3 épsilon se extrae, por ejemplo, de su entorno nativo y/o está comprendida por (presentado sobre la superficie de) una célula T.
Se prevé también Macaca mulatta, también conocido como mono Rhesus como otro primate preferido. Por tanto, se prevé que anticuerpos se unan (que pueden unirse a) al epítopo independiente del contexto de un fragmento de polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal del dominio extracelular de CD3 épsilon de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus, Saimirí sciureus y Macaca fascicularis (o bien SEQ ID 863 o bien 864 o ambas), y opcionalmente también a Macaca mulatta. Una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión tal como se describe en el presente documento puede obtenerse (es obtenible mediante) o puede fabricarse según el protocolo expuesto en los ejemplos adjuntos (en particular el ejemplo 2). Para ello, se prevé (a) inmunizar ratones con un fragmento de polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-termlnal del dominio extracelular de CD3 épsilon de ser humano y/o Saimirí sciureus; (b) generar una biblioteca de scFv de anticuerpos murinos inmunitarios; (c) Identificar elementos de unión específicos de CD3 épsilon sometiendo a prueba la capacidad para unirse a al menos las SEQ ID NO. 2,4, 6 y 8.
La independencia del contexto del epítopo CD3 proporcionado en el presente documento corresponde a los primeros 27 aminoácidos N-termlnales de CD3 épsilon o fragmentos funcionales de este tramo de 27 aminoácidos. La expresión “independiente del contexto,” tal como se usa en el presente documento en relación con el epítopo CD3 significa que la unión de las moléculas de unlón/moléculas de anticuerpo de la Invención descritas en el presente documento no conduce a un cambio o una modificación de la conformación, secuencia o estructura que rodea al determinante antigénico o epítopo. En cambio, el epítopo CD3 reconocido por una molécula de unión a CD3 convencional (por ejemplo tal como se da a conocer en los documentos WO 99/54440 o WO 04/106380) se localiza en la cadena de CD3 épsilon de manera C-termlnal con respecto a los 1-27 aminoácidos N-termlnales del epítopo independiente del contexto, donde sólo adopta la conformación correcta si se incluye dentro de la parte restante de la cadena épsilon y se mantiene en la posición estérica adecuada mediante heterodimerlzación de la cadena épsilon con cualquiera de la cadena gamma o delta de CD3. Dominios de unión de anticuerpos anti-CD3 como parte de moléculas de cadena sencilla biespecíficas tal como se proporcionan en el presente documento y se generan (y dirigen) contra un epítopo CD3 independiente del contexto prevén una mejora clínica sorprendente con respecto a la redistribución de células T y, por tanto, un perfil de seguridad más favorable. Sin querer restringirse por la teoría, puesto que el epítopo CD3 es independiente del contexto, formando un subdominio autosuficiente autónomo sin mucha Influencia sobre la parte restante del complejo CD3, el dominio de unión a CD3 de las moléculas de cadena sencilla biespecíficas proporcionadas en el presente documento induce menos cambios alostéricos en la conformación de CD3 que las moléculas de unión a CD3 convencionales (como las moléculas proporcionadas en los documentos WO 99/54440 o WO 04/106380), que reconocen epítopos CD3 dependientes del contexto.
La independencia del contexto del epítopo CD3 que se reconoce por el dominio de unión a CD3 de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla, aislados respectivamente mediante el método de la Invención, se asocia con menos o sin redistribución de células T (la redistribución de células T equivale a un episodio Inicial de disminución y posterior recuperación de los recuentos absolutos de células T) durante la fase inicial de tratamiento con dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla. Esto da como resultado un mejor perfil de seguridad de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla en comparación con moléculas de unión a CD3 convencionales conocidas en la técnica, que reconocen epítopos CD3 dependientes del contexto. Particularmente, dado que la redistribución de células T durante la fase Inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 es un factor de riesgo importante para acontecimientos adversos, como acontecimientos adversos del SNC, los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla al reconocer un epítopo CD3 independiente del contexto en vez de uno dependiente del contexto, tiene una ventaja de seguridad sustancial con respecto a las moléculas de unión a CD3 conocidas en la técnica. Los pacientes con tales acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase Inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales padecen habitualmente confusión y desorientación, en algunos casos también Incontinencia urinaria. La confusión es un cambio en el estado mental en el que el paciente no puede pensar con su nivel de claridad habitual. El paciente tiene habitualmente dificultades para concentrarse y el pensamiento no sólo es difuso y poco claro sino que a menudo se ralentiza significativamente. Los pacientes con acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase Inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden padecer también pérdida de memoria. Con frecuencia, la confusión conduce a la pérdida de la capacidad para reconocer personas, lugares, la hora o la fecha. Son comunes sensaciones de desorientación en la confusión, y se ve alterada la capacidad para tomar decisiones. Los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase Inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden comprender además habla farfullante y/o dificultades para encontrar las palabras. Este trastorno puede afectar tanto la expresión como la comprensión del lenguaje así como de la lectura y la escritura. Además de la Incontinencia urinaria, también pueden acompañar vértigo y mareo a los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de células T durante la fase Inicial de tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales en algunos pacientes.
El mantenimiento de la estructura tridimensional dentro del fragmento de polipéptido de 27 aminoácidos N-termlnal de CD3 épsilon mencionado puede usarse para la generación de dominios de unión, preferiblemente humanos, que pueden unirse al N fragmento de polipéptido de CD3 épsilon -terminal in vitro y al complejo CD3 nativo (subunidad de CD3 épsilon del mismo) en células T in vivo con la misma afinidad de unión. Estos datos Indican fuertemente que el fragmento N-terminal tal como se describe en el presente documento forma una conformación terciaria, que es similar a su estructura que existe normalmente in vivo. Se realizó una prueba muy sensible de la importancia de la integridad estructural de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido N-termlnal de CD3 épsilon. Los aminoácidos Individuales de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido N-termlnal de CD3 épsilon se cambiaron a alanina (barrido de alanlna) para someter a prueba la sensibilidad de los aminoácidos 1-27 del fragmento de polipéptido N-terminal de CD3 épsilon para perturbaciones menores.
Inesperadamente, se ha encontrado que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, preferiblemente humano, así aislado no sólo reconoce el fragmento N-termlnal humano de CD3 épsilon, sino también los fragmentos homólogos correspondientes de CD3 épsilon de diversos primates, incluyendo monos del nuevo mundo (tití, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimirí sciureus) y monos del viejo mundo (Macaca fascicularis, también conocido como macaco cinomolgo; o Macaca mulatta, también conocido como mono Rhesus). Por tanto, puede detectarse especificidad por múltiples primates de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla. La especificidad por múltiples primates de los dominios de unión se define en el presente documento como especificidad entre especies.
La secuencia de aminoácidos de los fragmentos N-termlnales mencionados anteriormente de CD3 épsilon se representan en SEQ ID No. 2 (humano), SEQ ID No. 4 (Callithrix jacchus); SEQ ID No. 6 (Sagúi ñus oedipus); SEQ ID No. 8 (Saimirí sciureus)] SEQ ID No. 863 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTILTC o SEQ ID No. 864 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT (Macaca fascicularís, también conocido como macaco cinomolgo) y SEQ ID No. 865 QDGNEEMGSITQTPYHVSISGTTVILT (Macaca mulatta, también conocido como mono Rhesus).
El término “especificidad entre especies” o “especificidad interespecies” tal como se usa en el presente documento significa la unión de un dominio de unión descrito en el presente documento a la misma molécula diana en seres humanos y primates distintos de chimpancé. Por tanto, “especificidad entre especies” o “especificidad interespecies” ha de entenderse como una reactividad ¡nterespecles con la misma molécula “X” expresada en diferentes especies, pero no con una molécula distinta de “X”. Puede determinarse la especificidad entre especies de un anticuerpo monoclonal que reconoce por ejemplo CD3 épsilon humano, con un CD3 épsilon de primate distinto de chimpancé, por ejemplo CD3 épsilon de macaco, por ejemplo, mediante análisis de FACS. El análisis de FACS se lleva a cabo de manera que el anticuerpo monoclonal respectivo se somete a prueba para determinar la unión a células de ser humano y primate distinto de chimpancé, por ejemplo células de macaco, que expresan dichos antígenos CD3 épsilon de ser humano y de primate distinto de chimpancé, respectivamente. Se muestra un ensayo apropiado en los siguientes ejemplos. El contenido mencionado anteriormente se aplica cambiando lo que se deba cambiar para los antígenos diana PSMA, FAPa, endosialina (TEM1), c-MET e IGF-1R: puede determinarse la especificidad entre especies de un anticuerpo monoclonal que reconoce por ejemplo PSMA humano, por un PSMA de primate distinto de chimpancé, por ejemplo PSMA de macaco, por ejemplo, mediante análisis de FACS. El análisis de FACS se lleva a cabo de manera que el anticuerpo monoclonal respectivo se somete a prueba para determinar la unión a células de ser humano y primate distinto de chimpancé, por ejemplo células de macaco, que expresan dichos antígenos PSMA de ser humano y primate distinto de chimpancé, respectivamente.
Tal como se usa en el presente documento, CD3 épsilon indica una molécula expresada como parte del receptor de células T y tiene el significado que se le atribuye normalmente en la técnica anterior. En ser humano, engloba en forma combinada individual o independientemente todas las subunidades de CD3 conocidas, por ejemplo CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gamma, CD3 zeta, CD3 alfa y CD3 beta. Los antígenos CD3 no humanos, de primate distinto de chimpancé a los que se hace referencia en el presente documento son, por ejemplo, CD3 de Macaca fascicularís y CD3 de Macaca mulatta. En Macaca fascicularís, engloba CD3 épsilon negativo para FN-18 y CD3 épsilon positivo para FN-18, CD3 gamma y CD3 delta. En Macaca mulatta, engloba CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta. Preferiblemente, dicho CD3 tal como se usa en el presente documento es CD3 épsilon.
El CD3 épsilon humano se indica en el n.° de registro GenBank NM 000733 y comprende SEQ ID NO. 1. El CD3 gamma humano se indica en el n.° de registro GenBank NM 000073. El CD3 delta humano se indica en el n.° de registro GenBank NM 000732.
El CD3 épsilon “negativo para FN-18” de Macaca fascicularís (es decir CD3 épsilon no reconocido por el anticuerpo monoclonal FN-18 debido a un polimorfismo tal como se expuso anteriormente) se indica en el n.° de registro GenBank AB073994.
El CD3 épsilon “positivo para FN-18” de Macaca fascicularís (es decir CD3 épsilon reconocido por anticuerpo monoclonal FN-18) se indica en el n.° de registro GenBank AB073993. El CD3 gamma de Macaca fascicularís se Indica en el n.° de registro GenBank AB073992. El CD3 delta de Macaca fascicularís se indica en el n.° de registro GenBank AB073991.
Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de los homólogos respectivos de CD3 épsilon, gamma y delta de Macaca mulatta pueden identificarse y aislarse mediante técnicas recomblnantes descritas en la técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Coid Spring Harbor Laboratory Press, 3a edición 2001). Esto se aplica cambiando lo que se deba cambiar a los homólogos de CD3 épsilon, gamma y delta de otros primates distintos de chimpancé tal como se definen en el presente documento. La Identificación de la secuencia de aminoácidos de Callithrix jacchus, Saimirí sciureus y Saguinus oedipus se describe en los ejemplos adjuntos. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del CD3 épsilon de Callithrix jacchus se representa en SEQ ID NO: 3, la de Saguinus oedipus se representa en SEQ ID NO: 5 y la de Saimirí sciureus se representa en SEQ ID NO: 7.
En línea con lo anterior, el término “epítopo” define un determinante antigénico, que se une/identifica específicamente por un dominio de unión tal como se define en el presente documento. El dominio de unión puede unirse específicamente a/interaccionar con epítopos conformacionales o continuos, que son únicos para la estructura diana, por ejemplo la cadena de CD3 épsilon de ser humano y primate distinto de chimpancé. Un epítopo conformacional o continuo se caracteriza para antígenos de polipéptido por la presencia de dos o más residuos de aminoácido diferenciados que están separados en la secuencia primaria, pero que se juntan en la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Los dos o más residuos de aminoácido diferenciados que contribuyen al epítopo están presentes en secciones Independientes de una o más cadena(s) de polipéptido. Estos residuos se juntan en la superficie de la molécula cuando la(s) cadena(s) de polipéptido se pllega(n) en una estructura tridimensional para constituir el epítopo. En cambio, un epítopo continuo o lineal consiste en dos o más residuos de aminoácido diferenciados, que están presentes en un único segmento lineal de una cadena de polipéptido. Dentro de la presente invención, un epítopo CD3 “dependiente del contexto” se refiere a la conformación de dicho epítopo. Un epítopo dependiente del contexto de este tipo, localizado en la cadena épsilon de CD3, sólo puede desarrollar su conformación correcta si se incluye dentro de la parte restante de la cadena épsilon y se mantiene en la posición adecuada mediante heterodimerización de la cadena épsilon con la cadena o bien gamma o bien delta de CD3. En cambio, un epítopo CD3 independiente del contexto tal como se proporciona en el presente documento se refiere a un polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-termlnal o un fragmento funcional del mismo de CD3 épsilon. Este polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-termlnal o un fragmento funcional del mismo mantiene su integridad estructural tridimensional y conformación correcta cuando se extrae de su entorno nativo en el complejo CD3. La independencia del contexto del polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-termlnal o un fragmento funcional del mismo, que forma parte del dominio extracelular de CD3 épsilon, representa, por tanto, un epítopo que es completamente diferente a los epítopos de CD3 épsilon descritos en relación con un método para la preparación de moléculas de unión humanas en el documento WO 2004/106380. Dicho método usó CD3 épsilon recomblnante expresado exclusivamente. La conformación de este CD3 épsilon recomblnante expresado exclusivamente difería de la que adoptaba en su forma natural, es decir, la forma en la que existe la subunidad épsilon de CD3 del complejo TCR/CD3 como parte de un complejo no covalente con la subunidad o bien CD3-delta o bien CD3-gamma del complejo TCR/CD3. Cuando tal proteína de CD3 épsilon recombinante expresado exclusivamente se usa como antígeno para la selección de anticuerpos a partir de una biblioteca de anticuerpos, se identifican anticuerpos específicos para este antígeno de la biblioteca aunque una biblioteca de este tipo no contenga anticuerpos con especificidad por antígenos propios/autoantígenos. Esto se debe al hecho de que la proteína de CD3 épsilon recomblnante expresado exclusivamente no existe in vivo; no es un autoantígeno. Por consiguiente, no se han reducido las subpoblaclones de células B que expresan anticuerpos específicos para esta proteína in vivo; una biblioteca de anticuerpos construida a partir de tales células B contendría material genético para anticuerpos específicos para la proteína de CD3 épsilon recombinante expresado exclusivamente.
Sin embargo, puesto que el polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal independiente del contexto o un fragmento funcional del mismo es un epítopo, que se pliega en su forma nativa, no pueden identificarse dominios de unión en línea con la presente invención mediante métodos basados en el enfoque descrito en el documento WO 2004/106380. Por tanto, podría verificarse en pruebas que moléculas de unión tal como se dan a conocer en el documento WO 2004/106380 no pueden unirse a los 1-27 residuos de aminoácido N-terminales de la cadena de CD3 épsilon. Así, moléculas de unión antl-CD3 o moléculas de anticuerpo antl-CD3 convencionales (por ejemplo tal como se dan a conocer en el documento WO 99/54440) se unen a la cadena de CD3 épsilon en una posición que está ubicada de manera más C-terminal que el polipéptido de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal Independiente del contexto o un fragmento funcional proporcionado en el presente documento. Las moléculas de anticuerpo OKT3 y UCHT-1 de la técnica anterior también tienen una especificidad por la subunidad épsilon del complejo TCR/CD3 entre los residuos de aminoácido 35 a 85 y, por consiguiente, el epítopo de estos anticuerpos está ubicado también de manera más C-terminal. Además, UCHT-1 se une a la cadena de CD3 épsilon en una reglón entre los residuos de aminoácido 43 a 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680; Salmerón, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52). Por tanto, las moléculas anti-CD3 de la técnica anterior no se unen a y no están dirigidas contra el epítopo de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal Independiente del contexto definido en el presente documento (o un fragmento funcional del mismo). En particular, el estado de la técnica no puede proporcionar moléculas anti-CD3 que se unen específicamente al epítopo de 1-27 residuos de aminoácido N-terminal independiente del contexto y que son específicas entre especies, es decir se unen a CD3 épsilon de ser humano y de primate distinto de chimpancé.
Tal como se usa en el presente documento, el término “humanizado”, “humanización”, “similar a humano” o variantes relacionadas gramaticalmente del mismo se usan de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo blespecíflco de cadena sencilla que comprende en al menos uno de sus dominios de unión al menos una reglón determinante de la complementariedad (“CDR”) de un anticuerpo no humano o fragmento del mismo. Se describen enfoques de humanización, por ejemplo, en los documentos WO 91/09968 y US 6.407.213. Como ejemplos no limitativos, el término engloba el caso en el que una reglón variable de al menos un dominio de unión comprende una única región CDR, por ejemplo la tercera región CDR de la VH (CDRH3), de otro animal no humano, por ejemplo un roedor, así como el caso en el que una o ambas región/regiones variable(s) comprende(n) en cada una de sus respectivas CDR primera, segunda y tercera, las CDR de dicho animal no humano. En el caso de que todas las CDR de un dominio de unión del anticuerpo blespecífico de cadena sencilla se hayan reemplazado por sus equivalentes correspondientes de, por ejemplo, un roedor, se habla normalmente de “injerto de CDR”, y este término ha de entenderse como que está englobado por el término “humanizado” o variantes relacionadas gramaticalmente del mismo tal como se usan en el presente documento. El término “humanizado” o variantes relacionadas gramaticalmente del mismo engloba también casos en los que, además del reemplazo de una o más reglones CDR dentro de una VH y/o VL del primer y/o segundo dominio de unión, se ha(n) realizado mutación/mutaciones adicional(es) (por ejemplo, sustituciones) de al menos un único residuo de aminoácido dentro de las reglones de marco (“FR”) entre las CDR de tal manera que los aminoácidos en esa(s) posiciones corresponde(n) al/a los aminoácldo(s) en esa(s) posiciones en el animal del que se derivan las reglones CDR usadas para el reemplazo. Tal como se conoce en la técnica, tales mutaciones individuales se realizan a menudo en las reglones de marco tras Injerto de CDR para restaurar la afinidad de unión original del anticuerpo no humano usado como donador de CDR para su molécula diana. El término “humanizado” puede englobar además (una) sustitución/sustituciones de aminoácidos en las reglones CDR de un animal no humano alia los aminoácldo(s) de una reglón CDR correspondiente de un anticuerpo humano, además de las sustituciones de aminoácidos en las reglones de marco tal como se describió anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “homólogo” u “homología” ha de entenderse tal como sigue: se concluye a menudo homología entre proteínas y ADN basándose en la similitud de secuencia, especialmente en bioinformática. Por ejemplo, en general, si dos o más genes tienen secuencias de ADN altamente similares, es probable que sean homólogos. Pero puede surgir similitud de secuencia de diferentes ancestros: secuencias cortas pueden ser similares por casualidad, y pueden ser similares secuencias debido a que ambas se seleccionaron para unirse a una proteína particular, tal como un factor de transcripción. Tales secuencias son similares pero no homologas. Las regiones de secuencia que son homologas también se denominan conservadas. Esto no ha de confundirse con la conservación en secuencias de aminoácidos en las que el aminoácido en una posición específica ha cambiado pero las propiedades fisicoquímicas del aminoácido permanecen inalteradas. Las secuencias homologas son de dos tipos: ortólogas y parálogas. Las secuencias homologas son ortólogas si se separaron por un acontecimiento de evolución de las especies: cuando una especie diverge a dos especies Independientes, las coplas divergentes de un único gen en las especies resultantes se dice que son ortólogas. Ortólogos, o genes ortólogos, son genes en diferentes especies que son similares entre sí porque se originaron a partir de un ancestro común. La prueba más evidente de que dos genes similares son ortólogos es el resultado de un análisis filogenétlco del linaje del gen. Los genes que se encuentran dentro de un ciado son ortólogos, descendieron de un ancestro común. Los ortólogos tienen a menudo, pero no siempre, la misma función. Las secuencias ortólogas proporcionan Información útil en estudios de clasificación taxonómica de organismos. El patrón de divergencia genética puede usarse para seguir la pista a la relación de los organismos. Es probable que dos organismos que están relacionados de manera muy estrecha presenten secuencias de ADN muy similares entre dos ortólogos. A la inversa, es probable que un organismo que se ha retirado adicionalmente de manera evolutiva de otro organismo presente una mayor divergencia en la secuencia de los ortólogos que están estudiándose. Las secuencias homologas son parálogas si se separaron por un acontecimiento de duplicación génica: si se duplica un gen en un organismo para ocupar dos posiciones diferentes en el mismo genoma, entonces las dos copias son parálogas. Un conjunto de secuencias que son parálogas se denominan parálogos entre sí. Los parálogos tienen normalmente la misma función o similar, pero a veces no: debido a la falta de la presión selectiva original sobre una copla del gen duplicado, esta copia tiene libertad para mutar y adquirir nuevas funciones. Puede encontrarse un ejemplo en roedores tales como ratas y ratones. Los roedores tienen un par de genes de insulina parálogos, aunque no está claro si se ha producido alguna divergencia en la función. Los genes parálogos pertenecen a menudo a la misma especie, pero esto no es necesario: por ejemplo, el gen de hemoglobina de seres humanos y el gen de mloglobina de los chimpancés son parálogos. Esto es un problema común en bioinformática: cuando se han secuenciado genomas de diferentes especies y se han encontrado genes homólogos, no puede concluirse inmediatamente que estos genes tienen la misma función o similar, ya que podrían ser parálogos cuya función ha divergido.
Un “primate distinto de chimpancé” o “primate que no es chimpancé” o variantes gramaticales del mismo se refiere a cualquier animal primate (es decir no humano) distinto del chimpancé, es decir distinto de un animal perteneciente al género Pan, y que incluye las especies Pan paniscus y Pan troglodytes, también conocidos como Anthropopithecus troglodytes o Simia satyrus. Sin embargo, se entenderá que es posible que los anticuerpos puedan unirse también con su primer y/o segundo dominio de unión a los epítopos/fragmentos respectivos, etc. de dichos chimpancés. La Intención es evitar meramente pruebas en animales que se llevan a cabo con chimpancés, si se desea. Por tanto también se prevé que los anticuerpos también se unan con su primer y/o segundo dominio de unión a los epítopos de chimpancés respectivos. Un “primate”, “especie de primate”, “primates” o variantes gramaticales de los mismos Indican un orden de mamíferos euterios dividido en los dos subórdenes de proslmios y antropoides y que comprenden simios, monos y lémures. Específicamente, “primates” tal como se usa en el presente documento comprende el suborden Strepsirrhini (prosimios no tareeros), incluyendo el infraorden Lemuriformes (que incluye a su vez las superfamilias Cheirogaleoidea y Lemuroidea), el infraorden Chiromyiformes (que incluye a su vez la familia Daubentoniidae) y el infraorden Lorisifomnes (que Incluye a su vez las familias Lorísidae y Galagidae). “Primates” tal como se usa en el presente documento también comprende el suborden Haplorrhini, que incluye el infraorden Tarsiifomnes (que incluye a su vez la familia Tarsiidae), el infraorden Simiifomnes (que incluye a su vez los Platyrrhini, o monos del nuevo mundo, y los Catarrhini, que incluyen los Cercopithecidea, o monos del viejo mundo).
La especie de primate distinto de chimpancé puede entenderse que es un lémur, un tareero, un gibón, un tití (perteneciente a los monos del nuevo mundo de la familia Cebidae) o un mono del viejo mundo (perteneciente a la superfamilia Cercopithecoidea).
Tal como se usa en el presente documento, un “mono del viejo mundo” comprende cualquier mono que se encuentre en la superfamilia Cercopithecoidea, subdividida a su vez en las familias: los Cercopithecinae, que son principalmente africanos pero incluyen los diversos géneros de macacos que son asiáticos y norteafricanos; y los Colobinae, que incluyen la mayor parte de los géneros asiáticos pero también los monos colobos africanos.
Específicamente, dentro de la subfamilia Cercopithecinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede proceder de la tribu Cercopithecini, dentro del género Allenopithecus (mono de Alien, Allenopithecus nigroviridis); dentro del género Miopithecus (talapoin sureño, Miopithecus talapoin; talapoin norteño, Miopithecus ogouensis); dentro del género Erythrocebus (mono patas, Erythrocebus patas); dentro del género Chiorocebus (mono verde, Chlorocebus sabaceus; cercopiteco tota, Chiorocebus aetiops; cercopiteco de las montañas Bale, Chiorocebus djamdjamensis; cercopiteco tántalo, Chlorocebus tantalus; cercopiteco verde, Chlorocebus pygerythrus; cercopiteco Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); o dentro del género Cercopithecus (mono Dryas o cercopiteco Salongo, Cercopithecus dryas; cercopiteco Diana, Cercopithecus diana; cercopiteco de Roloway, Cercopithecus roioway; cercopiteco de nariz blanca, Cercopithecus nictitans; mono azul, Cercopithecus mitis; mono de plata, Cercopithecus doggetti; mono dorado, Cercopithecus kandti; cercopiteco de cuello blanco, Cercopithecus albogularis; cercopiteco mona, Cercopithecus mona; cercopiteco de Campbell, Cercopithecus campbelli; cercopiteco de Lowe, Cercopithecus lowei; cercopiteco coronado de Grey, Cercopithecus pogonias; cercopiteco de Wolf, Cercopithecus wolfi; cercopiteco de Dent, Cercopithecus denti; cercopiteco menor, Cercopithecus petaurista; cercopiteco de garganta blanca, Cercopithecus erythrogaster; cercopiteco de Sclater, Cercopithecus sclateri; cercopiteco de orejas rojas, Cercopithecus erythrotis; cercopiteco de hocico azul, Cercopithecus cephus; cercopiteco de cola roja, Cercopithecus ascanius; cercopiteco de L'Hoest, Cercopithecus Ihoesti; cercopiteco de Preuss, Cercopithecus preussi; cercopiteco de Gabón, Cercopithecus solatus; cercopiteco de Hamlyn o cercopiteco de cara de búho, Cercopithecus hamlyni; cercopiteco de Brazza, Cercopithecus neglectus). Alternativamente, un primate distinto de chimpancé ventajoso, también dentro de la subfamilia Cercopithecinae pero dentro de la tribu Papionini, puede estar dentro del género Macaca (macaco de Gibraltar, Macaca sylvanus; macaco de cola de león, Macaca silenus; macaco cola de cerdo sureño o Beruk, Macaca nemestrina; macaco cola de cerdo norteño, Macaca leonina; macaco de Pagai o Bokkoi, Macaca pagensis; macaco de Siberut, Macaca siberu; macaco moro, Macaca maura; macaco calzado, Macaca ochreata; macaco de Togian, Macaca tonkeana; macaco de Heck, Macaca hecki; macaco de Gorontalo, Macaca nigriscens; macaco crestado de Célebes o “mono” negro, Macaca nigra; macaco cinomolgo o macaco cangrejero o macaco de cola larga o Kera, Macaca fascicularis; macaco cola de muñón o macaco rabón, Macaca arctoides; macaco Rhesus, Macaca mulatta; macaco de Formosa, Macaca cyclopis; macaco japonés, Macaca fuscata; macaco de Srí Lanka, Macaca sínica; macaco coronado, Macaca radiata; macaco de Gibraltar, Macaca sylvanmus; macaco de Assam, Macaca assamensis; macaco tibetano o macaco de Milne-Edwards, Macaca thibetana; macaco de Arunachal o Munzala, Macaca munzala); dentro del género Lophocebus (mangabeye de mejillas grises, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; mangabeye de cresta negra, Lophocebus aterrimus; mangabeye de Opdenbosch, Lophocebus opdenboschi; mangabeye de montaña, Lophocebus kipunji); dentro del género Papio (babuino hamadríade, Papio hamadryas; papión de Guinea, Papio; papión oliva, Papio anubis; papión amarillo, Papio cynocephalus; papión chacma, Papio ursinus); dentro del género Theropithecus (gelada, Theropithecus gelada); dentro del género Cercocebus (mangabeye gris, Cercocebus atys; Cercocebus atys; Cercocebus atys lunulatus; mangabeye de boina roja, Cercocebus torquatus; mangabeye ágil, Cercocebus agilis; mangabeye de vientre dorado, Cercocebus chrysogaster; mangabeye del río Tana, Cercocebus galeritus; mangabeye del río Sanje, Cercocebus sanjei); o dentro del género Mandrillus (mandril, Mandrillus sphinx; dril, Mandrillus leucophaeus).
El más preferido es Macaca fascicularis (también conocido como macaco cinomolgo y, por tanto, en los ejemplos denominado “cinomolgo”) y Macaca mulatta (mono Rhesus, denominado “Rhesus”).
Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser del grupo africano, dentro del género Colobus (colobo negro, Colobus satanas; colobo angoleño, Colobus angolensis; colobo rey, Colobus polykomos; colobo ursino, Colobus vellerosus; colobo oriental negro y blanco, Colobus guereza); dentro del género Piliocolobus (colobo rojo occidental, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; colobo de Pennant, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; colobo rojo de Preuss, Piliocolobus preussi; colobo rojo de Thollon, Piliocolobus tholloni; colobo rojo centroafricano, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; colobo rojo ugandés, Piliocolobus tephrosceles; colobo rojo de Udzungwa, Piliocolobus gordonorum; colobo rojo de Zanzíbar, Piliocolobus kirkii; colobo rojo del río Tana, Piliocolobus rufomitratus); o dentro del género Procolobus (colobo oliva, Procolobus verus). Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser alternativamente del grupo de los langures (mono arbóreo), dentro del género Semnopithecus (langur gris de Nepal, Semnopithecus schistaceus; langur gris de Cachemira, Semnopithecus ajax; langur gris de Tarai, Semnopithecus hector, langur común, Semnopithecus entellus; langur gris de pies negros, Semnopithecus hypoleucos; langur gris de las planicies del Sur, Semnopithecus dussumieri; langur gris moñudo, Semnopithecus priam); dentro del grupo de T. vetulus o el género Trachypithecus (langur de cara púrpura, Trachypithecus vetulus; langur de Nilgiri, Trachypithecus johnii); dentro del grupo de T. cristatus del género Trachypithecus (lutung de Java, Trachypithecus auratus; langur plateado o lutung plateado, Trachypithecus cristatus; lutung de Indochina, Trachypithecus germaini; lutung de Tenasserim, Trachypithecus barbei); dentro del grupo de T. obscurus del género Trachypithecus (langur oscuro o langur de anteojos, Trachypithecus obscurus; langur de Phayre, Trachypithecus phayrei); dentro del grupo de T. pileatus del género Trachypithecus (langur capuchino, Trachypithecus pileatus; langur de Shortridge, Trachypithecus shortridgei; langur dorado, Trachypithecus geei); dentro del grupo de T. francoisi del género Trachypithecus (langur de Francois, Trachypithecus francoisi; langur de Ha Tinh, Trachypithecus hatinhensis; langur de cabeza blanca, Trachypithecus polyocephalus; langur laosiano, Trachypithecus laotum; langur de Delacour, Trachypithecus delacouri; langur negro de Indochina, Trachypithecus ebenus); o dentro del género Presbytis (surili de Sumatra, Presbytis melalophos; surili de bandas, Presbytis femoralis; surili de Sarawak, Presbytis chrysomelas; surili de muslos blancos, Presbytis siamensis; surili de frente blanca, Presbytis frontata; surili de Java, Presbytis comata; langur de Thomas, Presbytis thomasi; langur de Hose, Presbytis hosei; langur marrón, Presbytis rubicunda; langur de Mentawai o colilargo, Presbytis potenziani; surili de la isla Natuna, Presbytis natunae).
Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser alternativamente del grupo de los monos narigudos, dentro del género Pygathrix (duc de canillas rojas, Pygathrix nemaeus; duc de canillas negras, Pygathrix nigripes; duc de patas grises, Pygathrix cinérea); dentro del género Rhinopithecus (langur chato dorado, Rhinopithecus roxellana; langur negro de nariz chata, Rhinopithecus bieti; langur gris de nariz chata, Rhinopithecus brelichi; langur de nariz chata de Tonkin, Rhinopithecus avunculus); dentro del género Nasalis (mono narigudo, Nasalis larvatus); o dentro del género Simias (langur cola de cerdo, Simias concolor).
Tal como se usa en el presente documento, el término “titr indica cualquier mono del nuevo mundo del género Callithrix, por ejemplo pertenecientes a los titís atlánticos de subgénero Callithrix (sic) (tití común, Callithrix (Callithrix) jacchus; tití de pinceles negros, Callithrix (Callithrix) penicillata; tití de orejas negras, Callithrix (Callithrix) kuhlii; tití de cabeza blanca, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; tití de cabeza amarilla, Callithrix (Callithrix) flaviceps; tití de orejas blancas, Callithrix (Callithrix) aurita)\ pertenecientes a los titís amazónicos del subgénero Mico (tití del río Acari, Callithrix (Mico) acariensis; tití de Manicoré, Callithrix (Mico) manicorensis; tití plateado, Callithrix (Mico) argentata; tití blanco, Callithrix (Mico) leucippe; tití de Snethlage, Callithrix (Mico) emiliae; tití de cabeza negra, Callithrix (Mico) nigriceps; tití de Marca, Callithrix (Mico) marcai; tití de cola negra, Callithrix (Mico) melanura; tití de Santarem, Callithrix (Mico) humeralifera; tití de Maués, Callithrix (Mico) mauesi; tití dorado y blanco, Callithrix (Mico) chrysoleuca; tití de Aripuana, Callithrix (Mico) intermedia; tití de Satéré, Callithrix (Mico) saterei); tití enano de Roosmalen perteneciente al subgénero Calllbella (Callithrix (Callibella) humilis)-, o el tití pigmeo perteneciente al subgénero Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).
Otros géneros de los monos del nuevo mundo comprenden tamarinos del género Saguinus (que comprende el grupo de S. oedipus, el grupo de S. midas, el grupo de S. nigricollis, el grupo de S. mystax, el grupo de S. bicolor y el grupo de S. inustus) y monos ardilla del género Samiri (por ejemplo Saimirí sciureus, Saimirí oerstedii, Saimirí ustus, Saimirí boliviensis, Saimirí vanzolini).
Por consiguiente, el presente método proporciona también anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana que comprenden un segundo dominio de unión que se une tanto al antígeno humano diana como al homólogo de antígeno diana de macaco, es decir el homólogo de un primate distinto de chimpancé. Preferiblemente, el anticuerpo blespecífico de cadena sencilla comprende por tanto un segundo dominio de unión que presenta especificidad entre especies para el antígeno diana de ser humano y de un primate distinto de chimpancé. En este caso, la molécula de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla Idéntica puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacoclnétlco de estos dominios de unión en primates así como fármaco en seres humanos. Dicho de otro modo, la misma molécula puede usarse en estudios preclínicos en animales así como en estudios clínicos en seres humanos. Esto conduce a resultados altamente comparables y un poder de predicción muy aumentado de los estudios en animales en comparación con moléculas sustltutas específicas de la especie. Puesto que tanto el CD3 como el dominio de unión a antígeno diana del anticuerpo blespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana son específicos entre especies, es decir reactivos con los antígenos de ser humano y de primates distintos de chimpancé, puede usarse tanto para la evaluación preclínica de la seguridad, actividad y/o el perfil farmacoclnétlco de estos dominios de unión en primates así como (en forma Idéntica) fármaco en seres humanos. Se entenderá que, preferiblemente, la especificidad entre especies de los dominios de unión primero y segundo de los anticuerpos es Idéntica.
Se ha encontrado en la presente invención que es posible generar un anticuerpo blespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano en el que puede usarse la molécula Idéntica en pruebas preclínicas en animales, así como estudios clínicos e Incluso en terapia en seres humanos. Este se debe a la Identificación Inesperada del anticuerpo blespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, que además de unirse a CD3 épsilon humano y antígeno diana, respectivamente, (y debido a similitud genética probablemente con el homólogo de chimpancé), también se une a los homólogos de dichos antígenos de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus. El anticuerpo blespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la Invención puede usarse como agente terapéutico contra diversas enfermedades, Incluyendo, pero sin limitarse, a cáncer. En vista de lo anterior, desaparece la necesidad de construir un anticuerpo blespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana sustituto para pruebas en una especie filogenética distante (de los seres humanos). Como resultado, puede usarse la molécula Idéntica en pruebas preclínicas en animales tal como pretende administrarse a seres humanos en pruebas clínicas así como tras la aprobación para la comercialización y la administración terapéutica de fármacos. La capacidad para usar la misma molécula para pruebas preclínicas en animales como en la administración posterior a seres humanos elimina prácticamente, o al menos reduce enormemente, el peligro de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tengan una aplicabilidad limitada al caso humano. Brevemente, la obtención de datos de seguridad preclínicos en animales usando la misma molécula que se administrará realmente a seres humanos no garantiza en gran medida la aplicabilidad de los datos a un escenario relevantes para seres humanos. En cambio, en enfoques convencionales que usan moléculas sustltutas, dichas moléculas sustltutas han de adaptarse de manera molecular al sistema de prueba en animales usado para la evaluación preclínica de la seguridad. Por tanto, la molécula que va a usarse en terapia en seres humanos difiere de hecho en la secuencia y también probablemente en la estructura de la molécula sustltuta usada en pruebas preclínicas en parámetros farmacoclnétlcos y/o actividad biológica, con la consecuencia de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tienen aplicabilidad / capacidad de transferencia limitada al caso humano. El uso de moléculas sustltutas requiere la construcción, producción, purificación y caracterización de un constructo completamente nuevo. Este conduce a tiempo y costes de desarrollo adicionales necesarios para obtener esa molécula. En suma, tienen que desarrollarse sustitutos por separado además del fármaco que va a usarse en realidad en terapia en seres humanos, de modo que tienen que llevarse a cabo dos líneas de desarrollo para dos moléculas. Por tanto, una ventaja importante del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención que muestra especificidad entre especies descrito en el presente documento es que puede usarse la molécula idéntica para agentes terapéuticos en seres humanos y en pruebas preclínicas en animales.
Se prefiere que al menos uno de dichos dominios de unión primero o segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla del método de la Invención esté injertado con CDR, sea humanizado o humano, tal como se expone en más detalle a continuación. Preferiblemente, ambos dominios de unión primero y segundo del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla del método de la Invención están Injertados con CDR, son humanizados o humanos. Para el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la Invención, se excluye la generación de una reacción ¡nmunltarla frente a dicha molécula de unión en el máximo grado posible tras la administración de la molécula a pacientes humanos.
Otra ventaja importante del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la Invención es su aplicabilidad para pruebas preclínicas en diversos primates. El comportamiento de un candidato a fármaco en animales debe ser Indicativo de manera ideal del comportamiento esperado de este candidato a fármaco tras la administración a seres humanos. Como resultado, los datos obtenidos a partir de tales pruebas preclínicas deben tener por tanto generalmente un alto poder de predicción para el caso humano. Sin embargo, tal como se aprendió a partir del trágico desenlace del reciente ensayo clínico de fase I con TGN1412 (un anticuerpo monoclonal frente a CD28), un candidato a fármaco puede actuar de diferente manera en una especie de primate que en seres humanos: aunque en pruebas preclínicas de dicho anticuerpo no se han observado efectos adversos o sólo limitados en estudios en animales realizados con macacos cinomolgos, seis pacientes humanos desarrollaron fallo multiorgánlco tras la administración de dicho anticuerpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Los resultados de estos acontecimientos no deseados, dramáticos sugieren que puede no ser suficiente limitar las pruebas preclínicas a una sola especie (primate distinto de chimpancé). El hecho de que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana del método de la Invención se une a una serie de monos del nuevo mundo y del viejo mundo puede ayudar a superar los problemas encarados en el caso mencionado anteriormente. Por consiguiente, el método de la presente invención proporciona métodos para minimizar diferencias entre especies en los efectos cuando están desarrollándose y sometiéndose a prueba fármacos para terapia en seres humanos.
Con el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana preferiblemente humano específico entre especies del método de la Invención, tampoco es necesario ya adaptar el animal de prueba al candidato a fármaco destinado para la administración a seres humanos, tal como por ejemplo la creación de animales transgénlcos. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la Invención que presenta especificidad entre especies según los métodos de Invención puede usarse directamente para pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancé, sin ninguna manipulación genética de los animales. Tal como saben bien los expertos en la técnica, los enfoques en los que el animal de prueba se adapta al candidato a fármaco siempre corren el riesgo de que los resultados obtenidos en las pruebas preclínicas de seguridad sean menos representativos y predictivos para seres humanos debido a la modificación del animal. Por ejemplo, en animales transgénicos, las proteínas codificadas por los transgenes a menudo se sobreexpresan altamente. Por tanto, los datos obtenidos para la actividad biológica de un anticuerpo contra este antígeno de proteína pueden estar limitados en cuanto a su valor de predicción para seres humanos en los que la proteína se expresa a niveles mucho menores, más fisiológicos.
Una ventaja adicional de los usos descritos en el presente documento del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana preferiblemente humano del método de la Invención que presenta especificidad entre especies es el hecho de que se evitan los chimpancés como especie en peligro para las pruebas en animales. Los chimpancés son los parientes más cercanos de los seres humanos y se agruparon recientemente en la familia de los homínidos basándose en los datos de secuenciación del genoma (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Por tanto, se consideran generalmente los datos obtenidos con chimpancé como altamente predictivos para seres humanos. Sin embargo, debido a su estatus como especie en peligro, el número de chimpancés que puede usarse para experimentos médicos está altamente restringido. Tal como se estableció anteriormente, por tanto, el mantenimiento de chimpancés para pruebas en animales es tanto costoso como éticamente problemático. Los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la Invención, evitan tanto las objeciones éticas como la carga económica durante pruebas preclínicas sin perjuicio de la calidad, es decir la aplicabilidad, de los datos obtenidos en las pruebas en animales. En vista de esto, los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la Invención prevén una alternativa razonable a los estudios en chimpancés.
Una ventaja todavía adicional del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la Invención es la capacidad para extraer múltiples muestras de sangre cuando se usa como parte de pruebas preclínicas en animales, por ejemplo en el transcurso de estudios farmacocinéticos en animales. Las múltiples extracciones de sangre pueden obtenerse mucho más fácilmente con un primate distinto de chimpancé que con animales inferiores, por ejemplo un ratón. La extracción de múltiples muestras de sangre permite someter a prueba de manera continua parámetros sanguíneos para la determinación de los efectos biológicos inducidos por el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención. Además, la extracción de múltiples muestras de sangre permite al investigador evaluar el perfil farmacocinético del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención tal como se define en el presente documento. Además, pueden medirse posibles efectos secundarios, que pueden inducirse por dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención reflejados en parámetros sanguíneos en diferentes muestras de sangre extraídas durante el transcurso de la administración de dicho anticuerpo. Esto permite la determinación del posible perfil de toxicidad del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención tal como se define en el presente documento.
Las ventajas del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención tal como se define en el presente documento que presenta especificidad entre especies pueden resumirse brevemente tal como sigue:
En primer lugar, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención tal como se define en el presente documento usado en pruebas preclínicas es el mismo que se usa en terapia en seres humanos. Por tanto, ya no es necesario desarrollar dos moléculas independientes, que pueden diferir en sus propiedades farmacocinéticas y actividad biológica. Esto es altamente ventajoso porque, por ejemplo, los resultados farmacocinéticos pueden transferirse y aplicarse más directamente al caso humano que, por ejemplo, en enfoques con sustitutos convencionales.
En segundo lugar, los usos del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención tal como se define en el presente documento para la preparación de agentes terapéuticos en ser humano es menos costoso y requiere menos mano de obra que los enfoques con sustitutos.
En tercer lugar, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana, preferiblemente humano, del método de la invención tal como se define en el presente documento puede usarse para pruebas preclínicas no sólo en una especie de primate, sino en una serie de diferentes especies de primate, limitando de ese modo el riesgo de posibles diferencias entre especies entre primates y ser humano.
En cuarto lugar, puede evitarse el chimpancé como especie en peligro para pruebas en animales si se desea.
En quinto lugar, pueden extraerse múltiples muestras de sangre para estudios farmacocinéticos extensos.
En sexto lugar, debido al origen humano de las moléculas de unión, preferiblemente humanas, según el método de la invención, la generación de una reacción inmunitaria frente a dichas moléculas de unión se minimiza cuando se administran a pacientes humanos. Se excluye la inducción de una respuesta inmunitaria con anticuerpos específicos para un candidato a fármaco derivado de una especie no humana como por ejemplo un ratón que conduce al desarrollo de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) contra moléculas terapéuticas de origen murino.
En último lugar, pero no menos importante, el uso terapéutico del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana del método de la invención proporciona un enfoque terapéutico novedoso e inventivo para cáncer, preferiblemente tumores sólidos, más preferiblemente carcinomas y cáncer de próstata. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana del método de la invención proporciona una herramienta ventajosa para destruir células diana humanas que expresan antígeno diana, por ejemplo células cancerosas. Además, la actividad citotóxica del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a CD3 x antígeno diana del método de la invención es mayor que la actividad de anticuerpos descritos en la técnica para las dianas ejemplificadas.
Se prefiere además para el método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla de la invención tal como se describe en el presente documento que el primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y C allithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saim irí sciureus comprenda una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:
(a) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 27, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 28 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 29;
(b) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 117, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 118 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 119; y
(c) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 153, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 154 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 155.
Más preferiblemente, el primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y primate distinto de chimpancé comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 35, 39,125, 129,161 o 165.
Se prefiere alternativamente para el método de la Invención que el primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saim irí sciureus comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:
(a) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 12, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 13 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 14;
(b) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 30, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 31 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 32;
(c) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 48, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.49 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 50;
(d) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 66, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 67 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 68;
(e) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 84, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 85 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 86;
(f) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 102, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 103 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 104;
(g) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 120, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 121 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 122;
(h) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 138, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 139 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 140;
(i) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 156, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 157 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 158; y
(j) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 174, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO. 175 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 176.
Más preferiblemente, el dominio de unión que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y primate distinto de chimpancé comprende una reglón VH seleccionada del grupo que consiste en una reglón VH tal como se representa en SEQ ID NO. 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181.
Se prefiere para el método de la invención que el primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saim irí sciureus comprenda una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 17 o 21 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 15 o 19;
(b) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 35 o 39 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 33 o 37;
(c) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 53 o 57 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 51 o 55;
(d) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 71 o 75 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 69 o 73;
(e) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 89 o 93 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 87 o 91;
(f) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 107 o 111 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 105 o 109;
(g) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 125 o 129 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 123 o 127;
(h) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 143 o 147 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 141 o 145;
(i) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 161 o 165 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 159 o 163; y
Q) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 179 o 183 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 177 o 181.
Más preferiblemente, el primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y primate distinto de chimpancé comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41,43, 59,61,77, 79, 95, 97, 113,115, 131, 133, 149, 151,167, 169,185 o 187.
Tal como se comentó ya anteriormente en el presente documento, también se prefiere para el método de la Invención que también el segundo dominio de unión se una a epítopos/sitios de unión en el dominio extracelular de un antígeno de alto peso molecular de ser humano y primate distinto de chimpancé.
En el método de la Invención, el segundo dominio de unión se une a epítopos/sitios de unión en el dominio extracelular de c-MET. Este antígeno diana y sus características de expresión se han descrito anteriormente en el presente documento. El receptor de tirosina cinasa MET con una región extracelular de 908 aa con la siguiente disposición secuendal de dominios extracelulares plegados Independientemente de proxlmales a la membrana a distales a la membrana: cuatro dominios de Ig de 362 aa conjuntamente (residuos 563-924), un dominio rico en cisterna de 42 aa (residuos 520-561), la cadena beta de un dominio sema de 212 aa (residuos 308-519) y la cadena alfa del dominio sema de 282 aa (residuos 25-307). Por consiguiente, se prefiere para el método de la Invención, que el segundo dominio de unión se una a epítopos/sitios de unión en los cuatro dominios de Ig (SEQ ID NO: 436), un dominio rico en cisterna (SEQ ID NO: 437) o la cadena beta de un dominio sema (SEQ ID NO: 438) del dominio extracelular de c-MET, que están todos por debajo del umbral de 640 aa.
En una realización alternativamente preferida del método de la Invención, el segundo dominio de unión se une a epítopos/sitios de unión en el dominio extracelular de endosialina (TEM1). Este antígeno diana y sus características de expresión se han descrito anteriormente en el presente documento. Para la endosialina, se describe en la técnica un dominio extracelular que consiste en 665 aa y la siguiente disposición secuendal de dominios extracelulares plegados Independientemente de proxlmales a la membrana a distales a la membrana: un dominio de mucina de 326 aa (residuos 360-685), tres dominios similares a EGF de 116 aa conjuntamente (residuos 235-350), un dominio Sushi/SCR/CCP de 55 aa (residuos 176-230) y un dominio de lectina de tipo C de 129 aa (residuos 29-157). Por consiguiente, se prefiere para el método de la Invención que el segundo dominio de unión se una a epítopos/sitios de unión en el dominio de mucina (SEQ ID NO: 440), los tres dominios similares a EGF (SEQ ID NO: 441) o el dominio Sushi/SCR/CCP (SEQ ID NO: 442) del dominio extracelular de TEM1.
Alternativamente en el método de la Invención, el segundo dominio de unión se une a epítopos/sitios de unión en el dominio extracelular de IGF-1R. Este antígeno diana y sus características de expresión se han descrito anteriormente en el presente documento. Para la endosialina, se describe en la técnica un dominio extracelular que consiste en 905 aa y la siguiente disposición secuendal de dominios extracelulares plegados Independientemente de proxlmales a la membrana a distales a la membrana: tres dominios de fibronectina tipo III de 447 aa conjuntamente (residuos 460-906), un dominio L2 de 160 aa (residuos 300-459), un dominio rico en cisterna de 149 aa (residuos 151-299) y un dominio L1 de 150 aa (residuos 1-150). Por consiguiente, se prefiere para el método de la Invención que el segundo dominio de unión se una a epítopos/sitios de unión en los tres dominios de fibronectina tipo III (SEQ ID NO: 444) y el dominio L2 (SEQ ID NO: 445) del dominio extracelular de IGF-1R.
Por consiguiente, la memoria descriptiva describe un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que puede unirse a CD3 épsilon (CD3e) de ser humano y primate distinto de chimpancé, en el que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en los grupos que consisten en las SEQ ID NO 2, 2, 6 y 8, y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular del PSMA humano mutado definido en el presente documento que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 447 pero no al dominio extracelular del PSMA de roedor. En otras palabras, el anticuerpo biespecífico del método de la invención se une específicamente a epítopos proximales a la membrana, es decir epítopos formados sólo por residuos de aminoácido del dominio extracelular de PSMA, cuyo átomo de C alfa tiene una distancia de menos de 60 A desde el átomo de C de referencia (el átomo de C alfa del aa número 13 contando desde la unión de la región extracelular y transmembrana). Las características superiores específicas de estos anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla PSMAxCD3 se han descrito anteriormente en el presente documento. Además, se ejemplifican anticuerpos correspondientes y se caracterizan en los ejemplos adjuntos.
Se prefiere para el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que pueda unirse a CD3 épsilon (CD3e) y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular del PSMA humano mutado definido en el presente documento que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 447 pero no al dominio extracelular del PSMA de roedor, que el primer dominio que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y primate distinto de chimpancé comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25,41,43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113,115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.
Se da a conocer en el presente documento para los anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla que el segundo dominio comprende una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:
(a) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 269, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO: 270 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 271;
(b) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 283, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO: 284 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 285;
(c) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 297, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO: 298 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 299;
(d) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 311, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO: 312 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 313;
(e) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 325, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 326 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 327;
(f) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 255, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 256 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 257; y
(g) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 481, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO. 482 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 483.
También se da a conocer en el presente documento para los anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla que el segundo dominio comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:
(a) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 274, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO: 275 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 276;
(b) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 288, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO: 289 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 290;
(c) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 302, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO: 303 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 304;
(d) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 316, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO: 317 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 318;
(e) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 330, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO: 331 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 332;
(f) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 260, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO: 261 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 262; y
(g) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 476, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO: 477 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO.478.
Para un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla dado a conocer en el presente documento el segundo dominio comprende una reglón VL y una reglón VH seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 268 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 273;
(b) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 282 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 287;
(c) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 296 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 301;
(d) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 310 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 315;
(e) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 324 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 329;
(f) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 254 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO. 259; y
(g) una región VL tal como se representa en SEQ ID NO. 480 y una región VH tal como se representa en SEQ ID NO.475.
Se da a conocer en el presente documento que el segundo dominio comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 278, 292, 306,320, 334, 485 o 264.
Se prefiere para el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que puede unirse a CD3 épsilon (CD3e) de ser humano y Callithrixjacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular de la quimera de PSMA humano mutado que el primer dominio que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y primate distinto de chimpancé comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61,77, 79, 95, 97,113, 115,131, 133,149, 151,167, 169,185 o 187.
Además en el presente documento, se da a conocer una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, en la que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende una secuencia seleccionada de:
(a) una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO. 280, 294, 308, 322, 336, 266 o 487;
(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 281,295, 309, 267, 323, 337 o 488; y
(c) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96% a la secuencia de aminoácidos de (a) o (b).
En el presente documento, se da a conocer una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 280, 294, 266, 308, 322, 336 o 487, así como una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96, 97, 98 o el 99% a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 280, 294, 266, 308, 322, 336 o 487. La memoria descriptiva también se refiere a las secuencias de ácido nucleico correspondientes tal como se representan en cualquiera de las SEQ ID NO: 281,295, 267, 309, 323, 337 o 488.
Se muestran disposiciones preferidas de dominios en los constructos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla PSMAxCD3 en los siguientes ejemplos.
El método de la invención proporciona un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que puede unirse a CD3 épsilon (CD3e) de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular de la quimera de FAPa humana mutada definida en el presente documento que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 448 pero no al dominio extracelular de la FAPa de roedor. En otras palabras, el anticuerpo biespecífico del método de la invención se une específicamente a epítopos proximales a la membrana, es decir epítopos formados sólo por residuos de aminoácido del dominio extracelular de FAPa, cuyo átomo de C alfa tiene una distancia de menos de 60 A desde el átomo de C de referencia (el átomo de C alfa del aa número 13 contando desde la unión de la región extracelular y transmembrana).
En el presente documento se da a conocer una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente que comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionado de:
CDR H1-3 de SEQ ID NO: 1137 - 1139 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 1132 -1134.
Las secuencias de las regiones VH y VL correspondientes del segundo dominio de unión de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla del método de la invención así como de los ScFv respectivos se muestran en la lista de secuencias.
Se da a conocer que una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión, que puede unirse al dominio extracelular de la quimera de FAP alfa humana mutada definida en el presente documento que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 488 pero no al dominio extracelular de la FAP alfa de roedor, seleccionados del grupo que consiste en:
a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 808 - 810 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: -813 - 815;
b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 794 - 796 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 799 - 801;
c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 738 - 740 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 743 - 745;
d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 752 - 754 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 757 - 759;
e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 822 - 824 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 827 - 829;
f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 766 - 768 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 771 - 773; y
g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 780 - 782 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 785 - 787.
En la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla del método de la Invención, los dominios de unión están dispuestos en el orden VL-VH-VH-VL, VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VL o VH-VL-VL-VH, tal como se ejemplifica en los ejemplos adjuntos. Preferiblemente, los dominios de unión están dispuestos en el orden VH FAP alfa-VL FAP alfa-VH CD3-VL CD3 o VL FAP alfa -VH FAP alfa -VH CD3-VL CD3. Más preferido, los dominios de unión están dispuestos en el orden VL FAP alfa-VH FAP alfa-VH CD3-VL CD3.
Se prefiere para el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que puede unirse a CD3 épsilon (CD3e) de ser humano y primate distinto de chimpancé y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular de la quimera de FAPa humana mutada definida en el presente documento que el primer dominio que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y primate distinto de chimpancé comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61,77, 79, 95, 97,113, 115,131, 133,149, 151,167, 169,185 o 187.
Se prefiere particularmente una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente en la que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende una secuencia seleccionada de: (a) una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO. 819, 805, 749, 763, 833, 7770 791;
(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 820, 806, 750, 764, 834, 778 o 792; y
(c) una secuencia de aminoácidos Idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96% a la secuencia de aminoácidos de (a) o (b).
En el presente documento se describe una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 819, 805, 749, 763, 833, 777 o 791, así como a una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 85%, preferiblemente el 90%, más preferido Idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96, 97, 98 o el 99% a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 819, 805, 749, 763, 833, 777 o 791. También se dan a conocer las secuencias de ácido nucleico correspondientes tal como se representan en cualquiera de las SEQ ID NO: 820, 806, 750, 764, 834, 778 o 792, así como a secuencias de ácido nucleico idénticas en al menos el 85%, preferiblemente el 90%, más preferido idénticas en al menos el 95%, lo más preferido idénticas en al menos el 96, 97, 98 o el 99% a las secuencias de ácido nucleico mostradas en las SEQ ID NO: 820, 806, 750, 764, 834, 778 o 792.
Se muestran disposiciones preferidas de dominios en los constructos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla FAPaxCD3 en los siguientes ejemplos.
Alternativamente, en el presente documento se describe un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión que puede unirse a CD3 épsilon (CD3e) de ser humano y Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus y un segundo dominio de unión que puede unirse a los cuatro dominios de Ig (SEQ ID NO: 436), un dominio rico en cisterna (SEQ ID NO: 437) o la cadena beta de un dominio sema (SEQ ID NO: 438) del dominio extracelular de c-MET.
Se da a conocer que una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionado del grupo que consiste en:
a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: -500 - 502 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: -505 - 507;
b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 514 - 516 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 519 - 521;
c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 528 - 530 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 533 - 535;
d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 542 - 544 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 547 - 549;
e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 556 - 558 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 561 - 563;
f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 570 - 572 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 575 - 577;
g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 584 - 586 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 589 - 591;
h) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 598 - 600 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 603 - 605;
i) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 612 - 614 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 617 - 619;
j) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 626 - 628 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 631 - 633;
k) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 640 - 642 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 645 - 647;
l) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 654 - 656 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 659 - 661;
m) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 668 - 670 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 673 - 675;
n) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 682 - 684 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 687 - 689;
o) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 696 - 698 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 701 - 703;
p) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 710 - 712 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 715 - 717; y
q) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 724 - 726 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 729 - 731.
Las secuencias de las reglones VH y VL correspondientes del segundo dominio de unión de la molécula de anticuerpo blespecíflco de cadena sencilla del método de la Invención así como de los ScFv respectivos se muestran en la lista de secuencias.
En la molécula de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla del método de la Invención, los dominios de unión están dispuestos en el orden VL-VH-VH-VL, VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VL o VH-VL-VL-VH, tal como se ejemplifica en los ejemplos adjuntos. Preferiblemente, los dominios de unión están dispuestos en el orden VH C-MET-VL C-MET-VH CD3-VL CD3 O VL C-MET-VH CD3-VL CD3.
Más preferiblemente, el primer dominio que puede unirse a un epítopo de cadena de CD3e de ser humano y primate distinto de chimpancé comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25,41,43, 59,61,77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.
En el presente documento se describe una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente, en la que la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende una secuencia seleccionada de:
(a) una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de SEQ ID NO. 511, 525, 539, 553, 567 o 581;
(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 512, 526, 540, 554, 568 o 582; y
(c) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96% a la secuencia de aminoácidos de (a) o (b).
En el presente documento se describe una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 511, 525, 539, 553, 567 o 581, así como a una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96, 97, 98 o el 99% a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 511, 525, 539, 553, 567 o 581. En el presente documento también se describen las secuencias de ácido nucleico correspondientes tal como se representan en cualquiera de las SEQ ID NO: 512, 526, 540, 554, 568 o 582.
Se muestran disposiciones preferidas de dominios en los constructos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla c-METxCD3 en los siguientes ejemplos.
En el presente documento se da a conocer un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio de mucina (SEQ ID NO: 440), los tres dominios similares a EGF (SEQ ID NO: 441) o el dominio Sushi/SCR/CCP (SEQ ID NO: 442) del dominio extracelular de endosialina (TEM1).
Preferiblemente, el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25,41,43, 59,61,77, 79, 95, 97,113, 115,131,133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.
En el presente documento se da a conocer un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión que puede unirse a los tres dominios de flbronectina tipo III (SEQ ID NO: 444), el dominio L2 (SEQ ID NO: 445) del dominio extracelular de IGF-1R.
Se da a conocer que una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente comprende un grupo de las siguientes secuencias as CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionado del grupo que consiste en:
a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: -836 - 838 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: -841 - 843; y
b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 850 - 852 y CDR L1-3 de SEQ ID NO: 855 - 857.
Las secuencias de las reglones VH y VL correspondientes del segundo dominio de unión de la molécula de anticuerpo blespecíflco de cadena sencilla del método de la Invención así como de los ScFv respectivos se muestran en la lista de secuencias.
En la molécula de anticuerpo blespecíflco de cadena sencilla del método de la Invención los dominios de unión están dispuestos en el orden VL-VH-VH-VL, VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VL o VH-VL-VL-VH, tal como se ejemplifica en los ejemplos adjuntos. Preferiblemente, los dominios de unión están dispuestos en el orden VH IGF-1R-VL IGF-1R-VH CD3-VL CD3 O VL IGF-1R-VH CD3-VL CD3.
Preferiblemente, el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25,41,43, 59,61,77, 79, 95,97, 113,115, 131,133, 149, 151,167, 169,185 o 187.
Se prefiere particularmente que una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla caracterizada anteriormente comprenda una secuencia seleccionada de:
(a) una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 847 o 861;
(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 848 o 862; y
(c) una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96% a la secuencia de aminoácidos de (a) o (b).
La memoria descriptiva describe una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 847 o 861, así como a una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 85%, preferiblemente el 90%, más preferido idéntica en al menos el 95%, lo más preferido idéntica en al menos el 96, 97, 98 o el 99% a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 847 o 861. La memoria descriptiva también describe las secuencias de ácido nucleico correspondientes tal como se representan en cualquiera de las SEQ ID NO: 848 o 862.
Se muestran disposiciones preferidas de dominios en los constructos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla IGF-1RxCD3 en los siguientes ejemplos.
Tal como se describió anteriormente en el presente documento, la especificidad de un anticuerpo se entiende generalmente que está determinada por las secuencias de CDR. Por consiguiente, para mantener la especificidad de un grupo dado de CDR, por ejemplo tres CDR de una cadena pesada y tres CDR de una cadena ligera, la secuencia de estas CDR tiene que conservarse. Por consiguiente, las variantes de anticuerpos individuales biespecíficos tal como se describen en el presente documento son preferiblemente variantes que tienen más de una sustitución de aminoácidos en regiones FR en vez de las CDR. Ha de entenderse que la identidad de secuencia se determina a lo largo de toda la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. Para alineaciones de secuencias, pueden usarse por ejemplo, los programas Gap o BestFit (Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453; Smith y Waterman, Adv. Appl. Math 2 (1981), 482-489), que están contenidos en el paquete de software GCG (Genetic Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711 (1991). Es un método de rutina para los expertos en la técnica determinar e Identificar una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que tiene por ejemplo una identidad de secuencia del 85% (el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99%) con las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos del anticuerpo de cadena sencilla Individual biespecífico usando por ejemplo uno de los programas mencionados anteriormente. Por ejemplo, según la hipótesis del titubeo de Crlck, la base en 5' en el anticodón no está tan confinada espacialmente como las otras dos bases, y por tanto podría tener un apareamiento de bases no convencional. Dicho de otro modo: la tercera posición en un triplete de codón puede variar de modo que dos tripletes que difieren en esta tercera posición pueden codificar para el mismo residuo de aminoácido. Dicha hipótesis la conoce bien el experto en la técnica (véase por ejemplo http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis; Crick, J Mol Biol 19 (1966): 548-55).
La presente memoria descriptiva describe una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla descrita anteriormente.
La presente memoria descriptiva también describe un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento.
Los expertos en biología molecular conocen muchos vectores adecuados, cuya opción dependerá de la función deseada e incluyen plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados convenclonalmente en ingeniería genética. Pueden usarse métodos que conocen bien los expertos en la técnica para construir diversos plásmidos y vectores; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (loe cit.) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994).
Alternativamente, los pollnucleótldos y vectores pueden reconstituirse en llposomas para la administración a células diana. Tal como se comenta con detalle adicional a continuación, se usó un vector de clonación para aislar secuencias de ADN Individuales. Pueden transferirse secuencias relevantes a vectores de expresión cuando se requiere la expresión de un polipéptido particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.
Preferiblemente dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia reguladora operativamente unida a dicha secuencia de ácido nucleico definida en el presente documento.
El término “secuencia reguladora” se refiere a secuencias de ADN, que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes a las que se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, las secuencias de control Incluyen generalmente promotores, sitios de unión al ribosoma y terminadores. En eucariotas generalmente las secuencias de control Incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. El término “secuencia de control” pretende Incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también pueden Incluir componentes ventajosos adicionales.
El término “operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida para ellos. Una secuencia de control “operativamente unida” a una secuencia codificante se liga de tal manera que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control. En caso de que la secuencia de control sea un promotor, resulta obvio para un experto en la técnica que se usa preferiblemente ácido nucleico bicatenario.
Por tanto, el vector citado es preferiblemente un vector de expresión. Un “vector de expresión” es un constructo que puede usarse para transformar un hospedador seleccionado y prevé la expresión de una secuencia codificante en el hospedador seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser por ejemplo vectores de clonación, vectores binarlos o vectores de Integración. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico preferiblemente en un ARNm traducible. Los expertos en la técnica conocen bien elementos reguladores que garantizan la expresión en células procariotas y/o eucariotas. En el caso de células eucariotas, comprenden normalmente promotores que garantizan la Iniciación de la transcripción y opcionalmente señales de poll-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor PL, lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, de SV40, de VSR (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un ¡ntrón de globlna en células de mamífero y otros animales.
Además de elementos que son responsables de la Iniciación de la transcripción, tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio de poll-A de SV40 o el sitio de poll-A de tk, en el sentido de 3' del pollnucleótldo. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, pueden añadirse secuencias líder que pueden dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo en el medio, a la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico citada y se conocen bien en la técnica; véanse también los ejemplos adjuntos. La(s) secuencia(s) líder se ensambla(n) en una fase apropiada con las secuencias de traducción, Iniciación y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder que puede dirigir la secreción de la proteína traducida, o una parte de la misma, en el espacio perlplasmátlco o el medio extracelular. Opclonalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que confiere características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado; véase anteriormente. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA o pEF-neo (Mack etal. PNAS (1995) 92, 7021-7025 y Raum et al. Cáncer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) o pSPORTI (GIBCO BRL).
Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas de promotor eucariota en vectores que pueden transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para hospedadores procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el hospedador apropiado, se mantiene el hospedador en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótldos, y según se desee, puede seguir la recogida y purificación de la molécula de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla; véanse, por ejemplo, los ejemplos adjuntos.
Un sistema de expresión alternativo, que puede usarse para expresar una proteína de Interacción en el ciclo celular es un sistema de insecto. En un sistema de este tipo, se usa virus de la poliedrosis nuclear de Autographa califomica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico citada puede clonarse en una reglón no esencial del virus, tal como el gen de la pollhedrlna, y colocarse bajo el control del promotor de pollhedrlna. La Inserción satisfactoria de dicha secuencia codificante volverá el gen de la pollhedrlna Inactivo y producirá virus recombinante que carece de proteína de la cubierta. Entonces se usan los virus recombinantes para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa la proteína (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).
Elementos reguladores adicionales pueden Incluir potencladores transcripcionales así como traducclonales. Ventajosamente, los vectores descritos anteriormente comprenden un marcador seleccionable y/o puntuadle.
Los genes de marcador seleccionable útiles para la selección de células transformadas y, por ejemplo, tejido vegetal y plantas los conocen bien los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, resistencia antimetabolitos como base para la selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Relss, Plant Physiol. (Life Sel. Adv.) 13 (1994) , 143-149); npt, que marcador seleccionable a los amlnogllcósldos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, concretamente trpB, que permite que las células utilicen ¡ndol en lugar de trlptófano; hlsD, que permite que las células utilicen hlstlnol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomerasa que permite que las células utilicen mañosa (documento WO 94/20627) y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al Inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-omitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Coid Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).
Los expertos en la técnica también conocen marcadores puntuadles útiles y están comercialmente disponibles. Ventajosamente, dicho marcador es un gen que codifica para luciferasa (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o pglucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta realización es particularmente útil para un examen sencillo y rápido de células, tejidos y organismos que contienen un vector citado.
Tal como se describió anteriormente, la molécula de ácido nucleico citada puede usarse sola o como parte de un vector para expresar el polipéptido en células, para purificación, por ejemplo, pero también para fines de terapia génlca. Las moléculas de ácido nucleico o los vectores que contienen la(s) secuencla(s) de ADN que codlfica(n) para una cualquiera de las moléculas de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla descritos anteriormente se Introducen en las células que producen a su vez el polipéptido de Interés. La terapia génlca, que se basa en Introducir genes terapéuticos en células mediante técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Se describen vectores, métodos o sistemas de inserción génica adecuados para terapia génlca in vitro o in vivo en la bibliografía y los conoce el experto en la técnica; véanse, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995) , 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documento WO 94/29469; documento WO 97/00957, documento US 5.580.859; documento US 5.589.466; o Schaper, Current Opinión in Biotechnology 7 (1996), 635-640, dos Santos Coura and Nardi Viral J. (2007), 4:99. Las moléculas de ácido nucleico y los vectores citados pueden diseñarse para la Introducción directa o para la Introducción mediante llposomas o vectores virales (por ejemplo, adenovlrales, retrovirales) en la célula.
También se describe una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector tal como se describe en el presente documento. Dicha célula hospedadora puede producirse introduciendo el vector descrito anteriormente en el presente documento o la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente en el hospedador. La presencia de al menos un vector o al menos una molécula de ácido nucleico en el hospedador puede mediar en la expresión de un gen que codifica para los constructos de anticuerpos de cadena sencilla descritos anteriormente.
La molécula de ácido nucleico descrita o el vector descrito en el presente documento, que se introduce en la célula hospedadora puede o bien Integrarse en el genoma de la célula hospedadora o bien puede mantenerse de manera extracromosómica.
El hospedador puede ser cualquier célula procariota o eucariota.
El término “procariota” pretende incluir todas las bacterias, que pueden transformarse o transfectarse con moléculas de ADN o ARN para la expresión de una proteína. Los hospedadores procariotas pueden Incluir bacterias gram negativas así como gram positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término “eucariota” pretende incluir células de levadura, plantas superiores, insectos y preferiblemente de mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recomblnante, la proteína codificada por el pollnucleótldo puede ser gllcosllado o puede ser no gllcosllado. Se prefiere especialmente el uso de un plásmldo o un virus que contiene la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla y fusionado genéticamente al mismo una etiqueta FLAG N-terminal y/o una cola de Hls C-terminal. Preferiblemente, la longitud de dicha etiqueta FLAG es de aproximadamente 4 a 8 aminoácidos, lo más preferiblemente 8 aminoácidos. Puede usarse un pollnucleótldo descrito anteriormente para transformar o transfectar el hospedador usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos habituales en la técnica. Además, se conocen bien en la técnica métodos para preparar genes fusionados, operativamente unidos y expresarlos en, por ejemplo, células de mamífero y bacterias (Sambrook, loe cit.).
Preferiblemente, dicho hospedador es una bacteria o una célula de Insecto, fúnglca, vegetal o de animal.
Se prevé particularmente que el hospedador citado puede ser una célula de mamífero. Las células hospedadoras particularmente preferidas comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mleloma como SP2/0 o NS/0. Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, se prefieren particularmente células CHO como hospedadores.
Más preferiblemente, dicha célula hospedadora es una célula humana o línea celular humana, por ejemplo per.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168).
La presente descripción también describe un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula hospedadora tal como se define en el presente documento en condiciones que permitan la expresión de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento y recuperar el polipéptido producido del cultivo.
Pueden hacerse crecer los hospedadores transformados en fermentadores y cultivarse según técnicas conocidas en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. La molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla puede aislarse entonces del medio de crecimiento, Usados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de, por ejemplo, moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla expresados de manera microbiana puede ser mediante cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones ¡nmunológicas tales como las que Implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra una etiqueta de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se describe en los ejemplos adjuntos.
Se sabe en la técnica que las condiciones para el cultivo de un hospedador, que permiten la expresión dependen del sistema de hospedador y el sistema/vector de expresión usado en tal procedimiento. Los parámetros que han de modificarse para lograr condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante se conocen en la técnica. Por tanto, pueden determinarse condiciones adecuadas por el experto en la técnica en ausencia de una entrada Inventiva adicional.
Una vez expresado, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla puede purificarse según procedimientos convencionales de la técnica, Incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, “Protein Purificaron”, Springer-Verlag, N.Y. (1982). Se prefieren polipéptidos sustancial mente puros de una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95%, y una homogeneidad del 98 al 99% o más son los más preferidos, para usos farmacéuticos. Una vez purificada, parcialmente o hasta la homogeneidad deseada, la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla puede usarse entonces de manera terapéutica (incluyendo de manera extracorpórea) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo. Además, se describen ejemplos para métodos para la recuperación de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla de un cultivo con detalle en los ejemplos adjuntos.
En el presente documento también se describe una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se describe en el presente documento o un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se produce mediante el procedimiento tal como se describe en el presente documento.
En el presente documento también se describe una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se describe en el presente documento, o producida según el procedimiento tal como se describe en el presente documento, en la que dicha molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla es para su uso en un método en la prevención, el tratamiento o la mejora del cáncer. Preferiblemente, dicho cáncer es un tumor sólido, más preferiblemente un carcinoma o cáncer de próstata. El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla comprende además formulaciones adecuadas de portadores, estabilizadores y/o excipientes. Además, dicha molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla es adecuada para administrarse en combinación con un fármaco adicional. Dicho fármaco puede ser un compuesto no proteico o un compuesto proteico y puede administrarse de manera simultánea o no a la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento.
El término “composición farmacéutica” se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de portadores, estabilizadores y/o excipientes. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, ¡ntraarterial, ¡ntratecal y/o ¡ntranasal o mediante inyección directa en el tejido. Se prevé en particular que dicha composición se administre a un paciente a través de infusión o inyección. Puede efectuarse la administración de las composiciones adecuadas de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, ¡ntraperitoneal, subcutánea, Intramuscular, tópica o intradérmica. Se prevé una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como ejemplo no limitativo, la administración ininterrumpida, es decir continua puede realizarse mediante un pequeño sistema de bomba que lleva puesto el paciente para dosificar el flujo de entrada de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra y generados contra epítopos CD3 independientes del contexto puede administrarse usando dichos sistemas de bomba. Tales sistemas de bomba se conocen generalmente en la técnica, y comúnmente se basan en el cambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que va a infundirse. Cuando se cambia el cartucho en un sistema de bomba de este tipo, puede seguir una interrupción temporal del flujo por lo demás ininterrumpido de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. En tal caso, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración tras el reemplazo del cartucho se considerarían todavía dentro del significado de los medios farmacéuticos y métodos de la invención componen conjuntamente una “administración ininterrumpida” de tal agente terapéutico.
La administración continua o ininterrumpida de estos anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra y generados contra epítopos CD3 independientes del contexto puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de administración de fluido o pequeño sistema de bomba que Incluye un mecanismo de conducción de fluidos para conducir fluido fuera de un depósito y un mecanismo de accionamiento para accionar el mecanismo de conducción. Los sistemas de bomba para la administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar en la piel de un paciente y suministrar la composición adecuada en el cuerpo del paciente. Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o adherirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo de ese modo un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba puede fijarse a la piel del paciente durante de 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de pequeño tamaño con un depósito para pequeños volúmenes. Como ejemplo no limitativo, el volumen del depósito para que se administre la composición farmacéutica adecuada puede ser de entre 0,1 y 50 mi.
La administración continua puede ser transdérmica por medio de un parche puesto sobre la piel y reemplazado a intervalos. Un experto en la técnica conoce sistemas de parche para la administración de fármacos adecuados para este fin. Ha de observarse que la administración transdérmica es especialmente propicia para la administración ininterrumpida, ya que puede lograrse ventajosamente el cambio de un primer parche agotado de manera simultánea a la colocación de un nuevo, segundo parche, por ejemplo en la superficie de la piel de manera inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de la retirada del primer parche agotado. No surgen problemas de Interrupción del flujo o fallo de pilas.
La actividad biológica de la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede determinarse por ejemplo mediante ensayos de citotoxicidad, tal como se describen en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schleret et al. (Cáncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). “Eficacia” o “eficacia in vivo" tal como se usan en el presente documento se refiere a la respuesta a la terapia mediante la composición farmacéutica de la invención, usando por ejemplo criterios de respuesta del NCI normalizados. El éxito o la eficacia in vivo de la terapia usando una composición farmacéutica se refiere a la efectividad de la composición para su fin pretendido, es decir la capacidad de la composición para producir su efecto deseado, es decir reducción de células patológicas, por ejemplo células tumorales. La eficacia in vivo puede monitorizarse mediante métodos convencionales establecidos para las entidades de enfermedad respectivas Incluyendo, pero sin limitarse a recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, pueden usarse diversos parámetros de bioquímica clínica específicos de enfermedad y otros métodos convencionales establecidos. Además, pueden usarse tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo para la evaluación de la respuesta basada en los criterios del Instituto Nacional del Cáncer [Cheson BD, Homing SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher Rl, Connores JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Cárter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an International workshop to standardize response criteria for no Hodgkin’s lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), exploración mediante tomografía de emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/hlstologías de ganglios linfáticos, y diversos parámetros de bioquímica clínica específicos de cáncer (por ejemplo lactato deshidrogenasa) y otros métodos convencionales establecidos.
Otro reto importante en el desarrollo de fármacos es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para ello, se establece un perfil farmacocinético del candidato a fármaco, es decir un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco particular para tratar un estado dado. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que Influyen en la capacidad de un fármaco para tratar una determinada entidad de enfermedad incluyen, pero no se limitan a: semivida, volumen de distribución, metabolismo hepático de primer paso y el grado de unión a suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede verse influida por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.
“Semivida” significa el tiempo en el que se elimina el 50% de un fármaco administrado a través de procesos biológicos, por ejemplo metabolismo, excreción, etc.
Por “metabolismo hepático de primer paso” quiere decirse la propensión de un fármaco a metabolizarse tras el primer contacto con el hígado, es decir durante su primer paso a través del hígado.
“Volumen de distribución” significa el grado de retención de un fármaco en la totalidad de los diversos compartimentos del cuerpo, como por ejemplo espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos.
“Grado de unión a suero sanguíneo” significa la propensión de un fármaco a interaccionar con y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, lo que conduce a una reducción o pérdida de actividad biológica del fármaco.
Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de demora (Tdemora), Tmáx, tasas de absorción, más el ¡nido y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrado.
“Biodisponibilidad” significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo.
“Tiempo de demora” significa la demora temporal entre la administración del fármaco y su detección y capacidad de medición en sangre o plasma.
“Tmáx” es el tiempo después de que se alcanza la concentración máxima en sangre del fármaco, y “Cmáx” es la concentración en sangre obtenida de manera máxima con un fármaco dado. El tiempo hasta alcanzar una concentración en sangre o tejido del fármaco que se requiere para su efecto biológico se ve influido por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que presentan especificidad entre especies, que pueden determinarse en pruebas preclínicas en animales en primates distintos de chimpancé tal como se describió de forma breve anteriormente también se exponen por ejemplo en la publicación de Schleret etal. (Cáncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 -12).
El término “toxicidad” tal como se usa en el presente documento se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves. Estos acontecimientos secundarios podrían referirse a la falta de tolerabíüdad del fármaco en general y/o una falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos provocados por el fármaco.
El término “seguridad”, “seguridad in vivo" o “tolerabíüdad” tal como se usa en el presente documento define la administración de un fármaco sin inducir acontecimientos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un periodo de aplicación más prolongado del fármaco. La “seguridad”, “seguridad in vivo" o “tolerabíüdad” pueden evaluarse por ejemplo a intervalos regulares durante el tratamiento y el período de seguimiento. Las mediciones incluyen evaluación clínica, por ejemplo manifestaciones orgánicas, y detección de anomalías de laboratorio. La evaluación clínica puede llevarse a cabo y registrarse/codificarse la desviación con respecto a los hallazgos normales según los criterios de NCICTC y/o MedDRA. Las manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tal como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación y similares, tal como se expone por ejemplo en los Criterios Comunes de Terminología para acontecimientos adversos v3.0 (CTCAE). Los parámetros de laboratorio que pueden someterse a prueba incluyen por ejemplo hematología, bioquímica clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros líquidos corporales tales como suero, plasma, liquido linfoide o cefalorraquídeo, liquido intervalvular y similares. Por tanto, puede evaluarse la seguridad por ejemplo medíante examen físico, técnicas de obtención de imágenes (es decir ecografía, radiografía, exploraciones medíante TC, obtención de imágenes medíante resonancia magnética (IRM), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, mediante la medición de parámetros de laboratorio y el registro de acontecimientos adversos.
El término “dosis eficaz y no tóxica” tal como se usa en el presente documento se refiere a una dosis tolerable del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla tal como se define en el presente documento que es lo suficientemente alta como para producir la reducción de células patológicas, eliminación de tumores, contracción de tumores o estabilización de enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos importantes. Tales dosis eficaces y no tóxicas pueden determinarse por ejemplo mediante estudios de ampliación de dosis descritos en la técnica y deben estar por debajo de la dosis que induce acontecimientos secundarios adversos graves (dosis limitante de toxicidad, DLT). También se hace referencia a los términos anteriores por ejemplo en the Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting de 16 de julio de 1997.
Además, la memoria descriptiva describe una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla o producida según el procedimiento descrito en el presente documento para la prevención, el tratamiento o la mejora del cáncer o una enfermedad autoinmunitaria. Preferiblemente, dicho cáncer es un:
(a) un tumor sólido, más preferiblemente un carcinoma o cáncer de próstata;
(b) un carcinoma, sarcoma, güoblastoma/astrodtoma, melanoma, mesoteüoma, tumor de Wilms o un tumor maligno hematopoyético tal como leucemia, linfoma o mieloma múltiple;
(c) carcinomas (mesoteüoma de mama, de riñón, de pulmón, colorrectal, de colon, de páncreas), sarcomas, y tumores neuroectodérmicos (melanoma, güoma, neuroblastoma);
(d) cáncer epitelial; o
(e) cáncer de huesos o tejidos blandos (por ejemplo sarcoma de Ewing), cáncer de mama, de hígado, de pulmón, de cabeza y cuello, colorrectal, de próstata, lelomlosarcoma, cervicouterino y endometrial, cáncer de ovario, de próstata y de páncreas.
Preferiblemente, dicha composición farmacéutica además comprende formulaciones adecuadas de portadores, estabilizadores y/o excipientes.
Además, la memoria descriptiva se refiere a un kit que comprende una molécula de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla, una molécula de ácido nucleico, un vector o una célula hospedadora.
Estos y otras realizaciones se dan a conocer y están englobadas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Se describen técnicas y métodos recombinantes en inmunología por ejemplo en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Coid Spring Harbor Laboratory Press, 3a edición 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Coid Spring Laboratory Press, 2002. Puede recuperarse bibliografía adicional referente a uno cualquiera de los anticuerpos, métodos, usos y compuestos que van a emplearse según la presente Invención de bibliotecas y bases de datos públicas, usando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública “Medline”, disponible en Internet, puede utilizarse, por ejemplo en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Además las bases de datos y direcciones tales como http://www.ncbl.nlm.nlh.gov/ o enumeradas en la página Inicial de EMBL-servIces en http://www.embl.de/servlces/lndex.html las conoce el experto en la técnica y también pueden obtenerse usando, por ejemplo, http://www.google.com.
Las figuras muestran:
Figura 3
Alineación de secuencias de aminoácidos de PSMA humano y de rata maduro de longitud completa. Las posiciones de aminoácidos homólogos de coincidencia errónea están subrayadas y destacadas con estilo de carácter en negrita. La numeración de posiciones de aminoácidos se refiere a PSMA humano y comienza con el aminoácido metlonlna codificado por el codón de Iniciación de PSMA humano. Dominio ¡ntracelular aa 1 - aa 19; dominio transmembrana aa 20 - aa 43; dominio extracelular aa 44 - aa 750.
Figura 4
Análisis de unión de FACS de Acbcs anti-PSMA humano basados en I2C con células CHO transfectadas con PSMA humano (sin mutar), PSMA de rata mutado al aminoácido humano homólogo en cada posición de aminoácido con coincidencia errónea con una distancia a la membrana de £ 60Á, y PSMA de rata sin mutar. Las líneas en negrita muestran tinción mediante sobrenadante de cultivo celular de células CHO transfectadas con constructos de anticuerpos blespecíficos dirigidos hacia PSMA. Sobrenadante de cultivo celular de células CHO sin transfectar sirvió como control negativo (líneas delgadas). Los Acbcs dirigidos hacia PSMA P1xl2C, P2xl2C, P3xl2C, P4xl2C y P5xl2C se unen a PSMA humano (sin mutar) pero no a PSMA de rata sin mutar ni mutado y por tanto esto confirma una distancia a la membrana de < 60Á para el epítopo de PSMA de cada uno de estos constructos biespecíficos. En cambio, los Acbcs dirigidos hacia PSMA D1xl2C y D2xl2C no se unen a PSMA de rata sin mutar pero sí a PSMA humano (sin mutar) y de rata mutado de manera acorde a epítopos de PSMA con una distancia a la membrana £ 60Á.
Figura 5
Citotoxicidad de células T redirigida mediante Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C hacia células CHO transfectadas con PSMA humano tal como se mide en un ensayo de liberación de cromo 51 (51Cr). Como fuente de células T efectoras se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas. La razón de células diana con respecto a efectoras fue de 10:1. Se usaron Acbcs dirigidos hacia PSMA como sobrenadantes de cultivo celular a partir de células CHO transfectadas a diferentes diluciones tal como se Indica. La duración del ensayo fue de 18 horas. Los Acbcs dirigidos hacia PSMA P1xl2C, P2xl2C, P3xl2C, P4xl2C y P5xl2C, cuyos epítopos de PSMA tienen una distancia a la membrana de < 60Á son sustancial mente más potentes en redirigir la citotoxicidad de células T que los Acbcs dirigidos hacia PSMA D1xl2C y D2xl2C, cuyos epítopos de PSMA tienen una distancia a la membrana de £ 60Á.
Figura 6
Análisis de unión de FACS de Acbcs anti-PSMA humano basados en I2C con células CHO transfectadas con PSMA humano (sin mutar), PSMA de rata mutado al aminoácido humano homólogo en cada posición de aminoácido con coincidencia errónea con una distancia a la membrana de £ 60Á, y PSMA de rata sin mutar. Las líneas en negrita muestran tinción mediante sobrenadante de cultivo celular de células CHO transfectadas con constructos de anticuerpos blespecíficos dirigidos hacia PSMA. Sobrenadante de cultivo celular de células CHO sin transfectar sirvió como control negativo (líneas delgadas). El Acbcs dirigido hacia PSMA P6xl2C se une a PSMA humano (sin mutar) pero no a PSMA de rata sin mutar ni mutado y por tanto esto confirma una distancia a la membrana de < 60Á para el epítopo de PSMA de este constructo blespecífico. En cambio, el Acbcs dirigido hacia PSMA D3xl2C no se une a PSMA de rata sin mutar pero sí a PSMA humano (sin mutar) y de rata mutado de manera acorde a un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana £ 60Á.
Figura 7
Citotoxicidad de células T redirigida mediante Acbcs dirigidos hada PSMA basados en I2C hada células CHO transfectadas con PSMA humano tal como se mide en un ensayo de liberación de cromo 51 (51Cr). Como fuente de células T efectoras se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas. La razón de células diana con respecto a efectoras fue de 10:1. Se usaron Acbcs dirigidos hada PSMA como sobrenadantes de cultivo celular a partir de células CHO transfectadas a diferentes diluciones tal como se Indica. La duración del ensayo fue de 18 horas. El Acbcs dirigido hada PSMA P6xl2C, cuyo epítopo de PSMA tiene una distancia a la membrana de < 60Á es sustancialmente más potente en redirigir la citotoxicidad de células T que el Acbcs dirigido hada PSMA D3xl2C, cuyo epítopo de PSMA tiene una distancia a la membrana de £ 60Á.
Figura 8
Análisis de unión de FACS de Acbcs basados en I2C dirigidos hada epítopos de PSMA proximales a la membrana con células CHO transfectadas con PSMA de macaco, la línea celular de leucemia de células T humanas positivas para CD3 HPB-ALL y la línea de células T de macaco positivas para CD34119LnPx. Las líneas en negrita muestran tinción mediante sobrenadante de cultivo celular de células CHO transfectadas con constructos de anticuerpos biespecíficos dirigidos hada PSMA designados. Sobrenadante de cultivo celular de células CHO sin transfedar sirvió como control negativo (líneas delgadas). Los Acbcs dirigidos hada PSMA designados además de a PSMA humano también se unen a PSMA de macaco, CD3 humano y CD3 de macaco.
Figura 9
Alineación de secuencias de aminoácidos de FAPa humana y murina madura de longitud completa. Las posiciones de aminoácidos homólogos de coincidencia errónea están subrayadas y destacadas con estilo de carácter en negrita. La numeración de las posiciones de aminoácidos se refiere a FAPalfa humana y comienza con el aminoácido metionlna codificado por el codón de Iniciación de FAPalfa humana. Dominio ¡ntracelular aa 1 - aa 9; dominio transmembrana aa 10 - aa 26; dominio extracelular aa 27 - aa 760.
Figura 10
Análisis de unión de FACS de expresión en la superficie celular con células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa murina tal como se describe en el ejemplo 6.3 y células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 6.4, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en los ejemplos 6.3 y 6.4. Las líneas en negrita representan células incubadas con los anticuerpos de detección (el anticuerpo frente a penta-His en el caso de FAPalfa murina y el anticuerpo M2 anti-FLAG en el caso del antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos. Las líneas delgadas representan los controles negativos. Para ambas líneas celulares el solapamlento de los hlstogramas para el anticuerpo M2 anti-FLAG y el anticuerpo frente a penta-His, respectivamente, muestra un nivel de expresión significativo del antígeno respectivo. Los niveles de expresión fueron comparables para las dos líneas celulares.
Figura 11
Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla designados frente a células CHO que expresan FAPalfa humana tal como se describe en el ejemplo 6.1, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO que expresan FAPalfa de macaco tal como se describe en el ejemplo 6.15 y la línea de células T de macaco 4119LnPx, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en los ejemplos 6.13 y 6.16. Las líneas en negrita representan células incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Las líneas delgadas representan los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla los solapamlentos de los hlstogramas muestran unión específica del constructo a FAPalfa humana y de macaco y CD3 humano y de macaco.
Figura 12
Los diagramas muestran resultados de ensayos de liberación de cromo que miden la actividad citotóxlca inducida por constructos específicos de cadena sencilla frente a FAPalfa designados redirígldos hacia las líneas de células diana indicadas generadas tal como se describe en los ejemplos 6.1, 6.3 y 6.4. También se usaron células efectoras tal como se Indica. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el ejemplo 6.14. Los diagramas demuestran claramente para cada constructo el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras humanas contra células diana positivas para FAPalfa humana y células diana positivas para el antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos. No pudo detectarse reclutamiento significativo de actividad citotóxlca de células T efectoras humanas contra células diana positivas para FAPalfa murina.
Figura 13
Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla designados frente a células CHO que expresan c-MET humano tal como se describe en el ejemplo 7.17, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO que expresan c-MET de macaco tal como se describe en el ejemplo 7.17 y la línea de células T de macaco 4119LnPx, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en los ejemplos 7.13 y 7.16. Las líneas en negrita representan células Incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Los histogramas rellenos muestran los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a c-MET humano y de macaco y CD3 humano y de macaco.
Figura 14
Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla designados frente a células CHO que expresan el antígeno c-MET murino tal como se describe en el ejemplo 7.17, células CHO que expresan el antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 7.17 y células CHO que expresan el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos tal como se describe en el ejemplo 7.17, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 7.13. Las líneas en negrita representan células Incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Los histogramas rellenos muestran los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Se usó un anticuerpo M2 anti-FLAG para detectar niveles de expresión de los antígenos respectivos. Para cada línea celular el solapamiento de los histogramas para el anticuerpo M2 anti-FLAG muestra altos niveles de expresión del antígeno respectivo. Los niveles de expresión fueron comparables para las tres líneas celulares. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo al antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos pero no al antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos y no al antígeno c-MET murino.
Figura 15
Los diagramas muestran resultados de ensayos de liberación de cromo que miden la actividad cltotóxica Inducida por constructos específicos de cadena sencilla frente a c-MET designados redlrigidos hacia las líneas de células diana Indicadas generadas tal como se describe en el ejemplo 7.17. También se usaron células efectoras tal como se indica. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el ejemplo 7.14. Los diagramas demuestran claramente para cada constructo el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras humanas contra células diana positivas para c-MET humano. No pudo detectarse reclutamiento significativo de actividad cltotóxica de células T efectoras humanas contra células diana positivas para c-MET murino y células diana positivas para el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos, respectivamente.
Figura 16
Análisis de unión de FACS de anticuerpos de scFv específicos entre especies designados frente a células CHO que expresan c-MET humano tal como se describe en el ejemplo 7.17, células CHO que expresan el antígeno c-MET murino tal como se describe en el ejemplo 7.17, células CHO que expresan el antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 7.17 y células CHO que expresan el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos tal como se describe en el ejemplo 7.17, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 7.9. Las líneas en negrita representan células Incubadas con preparaciones periplasmáticas que contienen los anticuerpos de scFv específicos frente a c-MET. Los histogramas rellenos muestran los controles negativos. El tampón usado para las preparaciones periplasmáticas se usó como control negativo. Para cada anticuerpo de scFv específicos frente a c-MET los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a c-MET humano y c-MET humano con epítopos dlstales a la membrana murinos. No pudo detectarse unión significativa a células positivas para c-MET murino y a células positivas para el c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos, respectivamente.
Figura 17
Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla designados frente a células CHO que expresan IGF-1R humano tal como se describe en el ejemplo 9.1, la línea de células T CD3+ humanas HPB-ALL, células CHO que expresan IGF-1R de macaco tal como se describe en el ejemplo 9.15 y la línea de células T de macaco 4119LnPx, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en los ejemplos 9.13 y 9.16. Las líneas en negrita representan células Incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Los histogramas rellenos muestran los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a IGF-1R humano y de macaco y CD3 humano y de macaco.
Figura 18
Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla designados frente a células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R murino tal como se describe en el ejemplo 9.3, células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R humano con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 9.4 y células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos tal como se describe en el ejemplo 9.5, respectivamente. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 9.13. Las líneas en negrita representan células Incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Los histogramas rellenos muestran los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo al antígeno de IGF-1R humano con epítopos dlstales a la membrana murinos pero no al antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos y no al antígeno de IGF-1R murino.
Figura 19
Los diagramas muestran resultados de ensayos de liberación de cromo que miden la actividad cltotóxica Inducida por constructos específicos de cadena sencilla frente a IGF-1R designados redirigidos hacia las células CHO que expresan IGF-1R humano tal como se describe en el ejemplo 9.1. Se usaron células efectoras tal como se indica. Los ensayos se realizaron tal como se describe en el ejemplo 9.14. Los diagramas demuestran claramente para cada constructo el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras humanas contra células diana positivas para IGF-1R humano.
Figura 20
Análisis de unión de FACS de constructos biespecíficos de cadena sencilla designados frente a células CHO que expresan quimeras de PSMA humano / de rata designadas tal como se describe en el ejemplo 10.2.1. La tinción de FACS se realizó tal como se describe en el ejemplo 10.2.2. Las líneas en negrita representan células Incubadas con sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Los histogramas rellenos muestran los controles negativos. Se usó sobrenadante de células CHO sin transfectar como control negativo. Para cada constructo biespecífico de cadena sencilla los solapamientos de los histogramas muestran unión específica del constructo a los constructos quiméricos huPSMArat140-169, huPSMArat281-284, huPSMArat300-344, huPSMArat683-690 y huPSMArat716-750. En comparación con las señales obtenidas para el otro constructo biespecífico de cadena sencilla hay una clara ausencia de unión para el constructo de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMA-P7 HL x I2C HL al constructo de PSMA quimérico huPSMArat598-617.
Figura 21
La figura muestra señales de unión obtenidas con preparaciones periplasmátlcas del anticuerpo de scFv del elemento de unión específico para PSMA de PSMA-D4 HL x I2C HL a péptidos de 15 meros que abarcan el dominio extracelular de PSMA humano y se solapan con sus péptidos adyacentes en 14 aminoácidos. Las señales obtenidas para los péptidos se representan gráficamente en el eje de las x en el orden de los péptidos N-terminales a la Izquierda hacia los péptidos C-terminales a la derecha. La Intensidad de señales de ELISA usando detección de His se representa gráficamente en el eje de las y. El ELISA se realizó tal como se describe en el ejemplo 10.3. Puede detectarse una señal máxima diferenciada para el péptldo que abarca los aminoácidos de treonina 334 a treonina 339.
Figura 22
El diagrama muestra resultados de un ensayo de citotoxicidad CytoTox-GloTM que mide la actividad citotóxica de células T humanas sin estimular inducidas mediante constructos biespecíficos de cadena sencilla específicos frente a PSMA designados contra células CHO que expresan PSMA humano tal como se describe en el ejemplo 2.1. El ensayo se realizó tal como se describe en el ejemplo X.4. El diagrama demuestra claramente la actividad cltotóxica superior de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a PSMA, PSMA-P7 HL x I2C HL, dirigido a un epítopo diana proximal a la membrana de PSMA humano con respecto a anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a PSMA, PSMAD4 HL x I2C HL, dirigido a un epítopo diana distal a la membrana de PSMA humano.
Leyendas de tabla
Tabla 1
Todos los aminoácidos extracelulares de PSMA humano con coincidencia errónea con la secuencia de aminoácidos de PSMA de rata homologa. Los aminoácidos de PSMA humano extracelular con coincidencia errónea, cuyos átomos de C alfa tienen una distancia de £ 60 A desde el átomo de C alfa del declmotercer aminoácido de PSMA humano extracelular (es decir el aa de referencia) contando desde la unión de la reglón extracelular y transmembrana se marcan en negrita. La distancias entre átomos de C alfa de dos aminoácidos dentro de PSMA humano se determinaron usando la estructura cristalina de PSMA humano (n.° de registro 1Z8L; obtenido del RCSB pdb, banco de datos de proteínas del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics; http://www.rcsb.org/pdb) y el “modo de medición de distancia” del software “3D molecule viewer” (un componente de Vector NTI Suite 8.0, Informax Inc.). La numeración de posiciones de aminoácidos se refiere a PSMA humano y comienza con el aminoácido metionina codificado por el codón de iniciación de PSMA humano. El aa de referencia es histidina en la posición 56.
Tabla 2
Todos los aminoácidos extracelulares de FAPalfa humana con coincidencia errónea con la secuencia de aminoácidos de FAPalfa murina homologa. Los aminoácidos de FAPalfa humana extracelular con coincidencia errónea, cuyos átomos de C alfa tienen una distancia de £ 60 A desde el átomo de C alfa del decimotercer aminoácido de FAPalfa humana extracelular (es decir el aa de referencia) contando desde la unión de la región extracelular y transmembrana se marcan en negrita. La distancias entre átomos de C alfa de dos aminoácidos dentro de FAPalfa humana se determinaron usando la estructura cristalina de FAPalfa humana (n.° de registro 1Z68; obtenido del RCSB pdb, banco de datos de proteínas del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics; http://www.rcsb.org/pdb) y el “modo de medición de distancia” del software “3D molecule viewer” (un componente de Vector NTI Suite 8.0, Informax Inc.). La numeración de posiciones de aminoácidos se refiere a FAPalfa humana y comienza con el aminoácido metionina codificado por el codón de iniciación de FAPalfa humana. El aa de referencia es metionina en la posición 39.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos ilustrativos que proporcionan una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas.
Ejemplos
1. Citotoxicidad con respecto a la distancia de la distancia de epítopos de célula diana desde la membrana de célula diana
1.1. Generación de células CHO que expresan el antígeno de EpCAM humano
Se usó la secuencia del antígeno de EpCAM humano (‘NM 002354, transductor de señales de calcio asociado con tumor 1 (TACSTD1) de Homo sapiens, ARNm, Centro Nacional para Información Biotecnológica, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) para obtener una molécula sintética mediante síntesis génica según protocolos convencionales. También se diseñó el fragmento de síntesis génica para contener un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del ADN. Los sitios de restricción introducidos Xbal en el extremo 5' y Salí en el extremo 3' se usaron en los siguientes procedimientos de clonación. Se clonó el fragmento de síntesis génica a través de Xbal y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realizó la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
1.2. Generación de células CHO que expresan proteínas de fusión de EpCAM-hNG2
Se obtuvieron las secuencias codificantes de proteínas de fusión de EpCAM-hNG2, EpCAM-D1-hNG2 (SEQ ID NO: 189 y 190), EpCAMD3-hNG2 (SEQ ID NO: 191 y 192), EpCAM-D1 D3-hNG2 (SEQ ID NO: 193 y 194), EpCAM-D1 D2-hNG2 (SEQ ID NO: 195 y 196) y EpCAM-hNG2 (SEQ ID NO: 197 y 198), mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseñó el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina seguida posteriormente por EpCAM humano, la parte extracelular respectiva de NG2 humano y el dominio transmembrana y citoplasmático del NG2 humano (Pluschke (1996) PNAS 93: 9710-9715). Se conectaron los diferentes componentes mediante ligadores peptídicos cortos. También se diseñaron los fragmentos de síntesis génica para introducir sitios de restricción en el extremo 5' (Eco Rl) y en el extremo 3’ (Sal I) para la clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Para cada proteína de fusión de EpCAM-hNG2 se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas. Se realizó la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
1.3. Generación de anticuerpo biespecífico individual frente a EpCAM y CD35-10 x I2C
El anticuerpo biespecífico de cadena sencilla 5-10 x I2C que comprende el dominio de unión de scFv 5-10 (en disposición VL-VH) dirigido hacia EpCAM humano (Brischwein (2007) J Immunother 30: 798-807) y el dominio de unión de scFv I2C (en disposición VL-VH) dirigido hada CD3éps¡lon en células T humanas se obtuvo mediante síntesis génica. Se diseñó el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo, seguido por un péptldo líder de inmunoglobullna de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante del anticuerpo blespecífico de cadena sencilla 5-10 x I2C, seguido en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 199 y 200). También se diseñó el fragmento de síntesis génica para Introducir sitios de restricción adecuados al comienzo (EcoRI) y al final del fragmento (Sal I) para la clonación del fragmento de síntesis génica en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realizó la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se recogió sobrenadante de cultivo celular y se usó en los experimentos posteriores.
1.4. Citometría de flujo de células CHO transfectadas con diferentes proteínas de fusión de EpCAM-hNG2
La presencia del epítopo de EpCAM de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla 5-10 x I2C en las células CHO transfectadas con EpCAM nativo y las proteínas de fusión de EpCAM-hNG2, EpCAM-D1-hNG2, EpCAM-D3-hNG2, EpCAM-D1 D3-hNG2, EpCAM-D1 D2-hNG2 y EpCAM-hNG2, respectivamente, se confirmó mediante citometría de flujo con el anticuerpo lgG1 parental murina AcM 5-10 tal como se describe (Brischwein (2007) J Immunother 30: 798-807). El resultado se muestra en la figura 1.
1.5. Citotoxicidad de células T redirigida mediante Acbcs 5-10 x I2C contra células CHO transfectadas con diferentes proteínas de fusión de EpCAM-hNG2
Se midió la citotoxicidad de células T redirigida mediante Acbcs 5-10 x I2C contra células CHO transfectadas con diferentes proteínas de fusión de EpCAM-hNG2 en un ensayo de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr). Como fuente de células T efectoras se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas. Se obtuvieron PBMC humanas estimuladas de la siguiente manera: Se recubrió una placa Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se eliminó proteína sin unir mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Flcoll según protocolos convencionales. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron las células de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales se enriquecieron linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Se lavaron las células diana dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavaron las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. Se realizó el ensayo en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl de RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de E:T de 10:1. Se añadió Acbcs 5-10 x I2C como sobrenadante de cultivo de células CHO transfectadas a diferentes diluciones. El tiempo de ensayo fue de 18 horas. Se midió la citotoxicidad como valores relativos de cromo liberado relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. Se realizó la medición de la actividad de cromo liberado con un contador gamma Wlzard 3” (Perkln Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realizó el análisis de los datos experimentales con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas tenían normalmente valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software. Tal como se muestra en la figura 2 la citotoxicidad de células T redirigida mediante Acbcs 5-10 x I2C contra las células diana indicadas depende de manera crítica de la distancia variable del epítopo de EpCAM diana de Acbcs 5-10 x I2C en los diferentes antígenos de modelo de EpCAM-hNG2 desde la membrana de la célula diana. El orden descendiente de citotoxicidad de células T con distancia a la membrana creciente del epítopo diana tal como se facilita entre paréntesis es de EpCAMCHO (control positivo) > EpCAM-D1-hNG2 (640 aa) > EpCAM-D3-hNG2 (679 aa) > EpCAM-D1D3-hNG2 (871 aa). No hubo ninguna actividad citotóxlca detectadle contra células CHO que expresaban EpCAM-D1D2-hNG2 (1511 aa) o EpCAMhNG2 (2190 aa).
2. Generación de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de PSMA humano
2.1 Generación de células CHO que expresan PSMA humano
Se obtiene la secuencia codificante de PSMA humano tal como se publica en GenBank (número de registro NM 004476) mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de PSMA humano y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 201 y 202). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, Xbal en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se utilizan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de Xbal y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
2.2 Generación de una proteína de fusión de PSMA humano soluble
Se usan la secuencia codificante de PSMA humano tal como se describió en el ejemplo 2.1 y la secuencia codificante de Lag3 murino tal como se publica en GenBank (número de registro NM 008479) para la construcción de una secuencia de ADNc artificial que codifica para una proteína de fusión soluble de PSMA humano y Lag3 murino. Para generar un constructo para la expresión de la proteína de fusión de PSMA humano soluble se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génlca según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 203 y 204). Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de Lag3 murino desde el aminoácido 1 hasta el 441 correspondiente al péptido señal y los dominios extracelulares de Lag3 murino, seguido en marco por la secuencia codificante de un Seri-Gly4-Seri-ligador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante de la proteína de PSMA humano desde el aminoácido 44 hasta el 750 correspondiente a los dominios extracelulares de PSMA humano, seguido en marco por la secuencia codificante de un Ser-i-Gly-i-ligador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción Introducidos, Xbal en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génlca a través de Xbal y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo todos los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronlc F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente se usa un clon del plásmido de expresión con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia para transfección y expresión de proteína en el sistema de expresión FreeStyle 293 (Invltrogen GmbH, Karísruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se obtiene sobrenadante que contiene la proteína expresada, se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante a -20°C.
Se realiza la purificación de la proteína de fusión de PSMA humano soluble de la siguiente manera: se usan el sistema Akta® Explorer (GE Health Systems) y el software Unicom® para cromatografía. Se realiza cromatografía de afinidad por metales Inmovilizados (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se carga con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 mi) a la columna (10 mi) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se lava la columna con tampón A para eliminar muestra no unida. Se eluye la proteína unida usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M, imidazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: el 20% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: el 100% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Se combinan las fracciones de proteína eluidas de la etapa 2 para purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad para Investigación y se adquieren de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
Se realiza cromatografía de filtración en gel en una columna de calidad preparativa HILoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equl. (citrato 25 mM, Usina 200 mM, glicerol al 5%, pH 7,2). Se someten las muestras de proteína eluldas (velocidad de flujo de 1 ml/min) a SDS-PAGE convencional e inmunotransferencia de tipo Western para la detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Se determinan concentraciones de proteínas usando DO 280 nm.
2.3 Generación de células CHO que expresan PSMA de rata
Se usa la secuencia de PSMA de rata (NM 057185, folato hidrolasa de Rattus norvegicus (Folhl), ARNm, Centro Nacional para Información Blotecnológlca, http://www.ncbl.nlm.nlh.gov/entrez) para obtener una molécula de ADNc sintética mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante completa del antígeno PSMA de rata, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 205 y 206). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3' (Salí) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se Induce amplificación génlca para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
2.4 Generación de células CHO que expresan un antígeno PSMA humano mutado con epítopos distales a la membrana de rata
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno PSMA humano mutado con epítopos dlstales a la membrana de rata mediante síntesis génlca según protocolos convencionales Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante completa del antígeno PSMA humano mutado en 12 posiciones de aminoácidos específicas tal como se explica a continuación, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 207 y 208). Todos los aminoácidos extracelulares de PSMA humano con coincidencia errónea con la secuencia de rata homologa, cuyos átomos de C alfa tienen una distancia de £ 60 A desde el átomo de C alfa del declmotercer aminoácido extracelular (es decir el aa de referencia) contando desde la unión de la reglón extracelular y transmembrana, se mutan al aminoácido de rata con coincidencia errónea homólogo. Esto se aplica a los 12 aminoácidos que se Indican en la tabla 1 y se marcan en negrita. Los aminoácidos con coincidencia errónea homólogos entre PSMA humano y de rata se Identifican mediante alineación de secuencias tal como se muestra en la figura 3. También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (Xba I) y en el extremo 3' (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génlca para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
2.5 Generación de células CHO que expresan un antígeno PSMA de rata mutado con epítopos distales a la membrana humanos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno PSMA de rata mutado con epítopos distales a la membrana humanos mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante completa del antígeno PSMA de rata mutado en las mismas 12 posiciones de aminoácidos extracelulares específicas que las Identificadas en el ejemplo anterior 2.4 al aminoácido humano homólogo respectivo, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 209 y 210). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para introducir sitios de restricción en el extremo 5’ (EcoRI I) y en el extremo 3’ (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génica para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
2.6 Inmunización de ratones usando una proteína de fusión de PSMA humano soluble
Se inmunizan ratones F1 de doce semanas de edad de cruces BALB/c x C57BL/6 con la proteína de fusión de PSMA humano soluble tal como se describió en el ejemplo 2.2. Para ello, para cada animal se mezclan 40 pg de la proteína de fusión de PSMA humano soluble con 10 nmol de un CpG-oligonucleótido modificado con tioato (5'-tccatgacgttcctgatgct-3’) en 300 pl de PBS y se inyectan por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21, 42 y opcionalmente 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se extraen muestras de sangre y se someten a prueba títulos séricos de anticuerpo contra PSMA humano mediante citometría de flujo según protocolos convencionales. Para ello se incuban 200.000 células de las células CHO transfectadas con PSMA humano tal como se describió en el ejemplo 2.1 durante 30 min sobre hielo con 50 pl de suero de los animales inmunizados diluido 1:1000 en PBS con FCS al 2%. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión de anticuerpos séricos con un anticuerpo específico de Fcgamma de ratón (Dianova) conjugado con ficoeritrína, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa suero de los animales obtenido antes de la inmunización como control negativo. Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002). Se usan animales que demuestran reactividad en suero significativa contra PSMA humano tal como se determina mediante el análisis de FACS en el experimento posterior.
2.7 Generación de una biblioteca de scFV de anticuerpos murinos inmunitarios: Construcción de una biblioteca de anticuerpos combinatoria y presentación en fago
Tres días después de la última inmunización de refuerzo se recogen esplenocitos de animales reactivos para la preparación de ARN total según protocolos convencionales.
Se construye una biblioteca de fragmentos de ADN de región variable de cadena pesada (VH) de Ig y región variable de cadena ligera (kappa) (VK) de inmunoglobulina (Ig) murina mediante RT-PCR con ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetiza ADNc según protocolos convencionales.
Se diseñan los cebadores de una manera que da lugar a un sitio de reconocimiento de 5'-Xhol y uno de 3'-BstEII para los fragmentos V de cadena pesada amplificados y a un sitio de reconocimiento de 5’-Sacl y uno de 3’-Spel para los fragmentos de ADN de VK amplificados.
Para la amplificación mediante PCR de los fragmentos de ADN de VH ocho cebadores específicos de la familia de 5'-VH diferentes (MVH1 (GC)AG GTG CAG CTC GAG TCA GGA CCT SEQ ID NO: 211; MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT SEQ ID NO: 212; MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT SEQ ID NO: 213; MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA SEQ ID NO: 214; MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG TCT GGA SEQ ID NO: 215; MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT SEQ ID NO: 216; MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG TCT GGG GGA SEQ ID NO: 217; MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT SEQ ID NO: 218) se combina cada uno con un cebador de 3’-VH (3’MuVHBstEII tga gga gao ggt gao cgt ggt ccc ttg gcc coa g SEQ ID NO: 219); para la amplificación mediante PCR de los fragmentos de cadena VK siete cebadores específicos de la familia de 5’-VK diferentes (MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT SEQ ID NO: 220; MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC SEQ ID NO: 221; MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA SEQ ID NO: 222; MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA SEQ ID NO: 223; MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA CCC AGA CTC CA SEQ ID NO: 224; MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA SEQ ID NO: 225; MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA CAC AGT CTC CA SEQ ID NO: 226) se combina cada uno con un cebador de 3’-VK (3’MuVkHindlll/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat etc aag ctt ggt ccc SEQ ID NO: 227).
Se usa el siguiente programa de PCR para la amplificación: desnaturalización a 94°C durante 20 s; hibridación de cebadores a 52°C durante 50 s y extensión de cebadores a 72°C durante 60 s y 40 ciclos, seguido por una extensión final de 10 min a 72°C.
Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Después se transforma la biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante en 300 pl de células de Escheríchia cotí XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm, Gene-pulser de Biorad) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión de fenotipo, se seleccionan transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 mi de cultivo en Super Broth (SB) líquido durante la noche. Después se recogen las células mediante centrifugación y se lleva a cabo la preparación de plásmldos usando un kit de preparación de plásmldos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligan 2800 ng de este ADN de plásmldo que contiene la biblioteca de VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transforman de nuevo en dos alícuotas de 300 pl de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño de biblioteca de scFv de VH-VK total (fragmento variable de cadena sencilla) de más de 107 clones Independientes.
Después de la expresión de fenotipo y lenta adaptación a carbenicilina, se transfieren las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos en medio de selección de SB-carbenlclllna (SB con carbenicilina 50 pg/ml). Después se Infectan las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos con una dosis Infecciosa de 1012 partículas de fago cooperador VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fago M13 filamentoso, en el que cada partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica para un fragmento de scFv murino y presenta la proteína de scFv correspondiente como fusión de traducción con una proteína de recubrimiento de fago III. Más tarde se usa esta combinación de fagos que presenta la biblioteca de anticuerpos para la selección de entidades de unión a antígeno.
2.8 Selección basada en presentación en fago de elementos de unión a diana proxlmales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno PSMA humano mutado con epítopos distales a la membrana de rata
Se recoge la biblioteca de fagos que porta el repertorio de scFv clonado del sobrenadante de cultivo respectivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden aproximadamente de 1011 a 1012 partículas de fago de scFv en 0,4 mi de PBS/BSA al 0,1% y se incuban con de 105 a 107 células CHO que expresan el antígeno PSMA humano mutado con epítopos dlstales a la membrana de rata tal como se describió en el ejemplo 2.4 durante 1 hora sobre hielo con agitación lenta. Se hacen crecer previamente estas células CHO, se recogen mediante centrifugación, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Se eliminan fagos de scFv que no se unen específicamente a las células CHO mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Después de lavar, se eluyen entidades de unión de las células resuspendlendo las células en HCI-glIcIna pH 2,2 (Incubación de 10 mln con posterior agitación con vértex) y después de la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usa el eluato para la Infección de un cultivo de E. coli XL1 Blue sin infectar reciente (DO600 > 0,5). Se selecciona de nuevo el cultivo de E. coli que contiene células de E. coli satisfactoriamente transducidas con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento de scFv murino, por su resistencia a carbenicilina y posteriormente se Infecta con fago cooperador VCMS 13 para comenzar la segunda ronda de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente se lleva a cabo un total de 4 a 5 rondas de selecciones.
2.9 Examen para detectar elementos de unión a diana proxlmales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno PSMA humano, el antígeno PSMA de rata y el antígeno PSMA de rata mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos
Se aísla ADN de plásmldo correspondiente a 4 y 5 rondas de cribado a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína de scFv soluble, se escinden fragmentos de ADN de VH-VL de los plásmldos (Xhol-Spel). Se clonan estos fragmentos a través de los mismos sitios de restricción en el plásmldo pComb3H5BFIag/His que se diferencia del pComb3H5BHis original en que el constructo de expresión (por ejemplo scFv) incluye una etiqueta Flag (TGDYKDDDDK) entre el scFv y la cola His6 y se delecionan las proteínas de fago adicionales. Después de la ligación, se transforma cada combinación (diferentes rondas de cribado) de ADN de plásmido en 100 pl de E. coli TG1 o XLI blue competentes para choque térmico y se siembran en placa sobre carbenlclllna-agar LB. Se escogen colonias Individuales en 100 pl de LB-carb (LB con carbenicilina 50 pg/ml).
Después de la inducción con IPTG 1 mM, E. coli transformadas con pComb3H5BFIag/His que contiene un segmento de VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes. Debido a una secuencia señal adecuada, el scFv se exporta al Interior del periplasma en el que se pliega en una conformación funcional.
Se escogen colonias bacterianas de E. coli Individuales a partir de las placas de transformación para preparaciones periplasmáticas a pequeña escala y se hacen crecer en medio SB (por ejemplo 10 mi) complementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 pg/ml y vuelven a disolverse en PBS (por ejemplo 1 mi) después de la recogida. Se aplica un choque de temperatura mediante cuatro rondas de congelación a -70°C y descongelación a 37°C mediante lo cual se destruye la membrana exterior de las bacterias y se liberan las proteínas periplasmáticas solubles Incluyendo los scFv en el sobrenadante. Después de la eliminación de células Intactas y residuo celular mediante centrifugación, se recoge el sobrenadante que contiene los scFv murinos antl-PSMA humano y se usa para examen adicional.
Se realiza examen de los scFV aislados para detectar elementos de unión a diana proxlmales a la membrana mediante cltometría de flujo con células CHO que expresan el antígeno PSMA humano tal como se describió en el ejemplo 2.1, el antígeno PSMA de rata tal como se describió en el ejemplo 2.3 y el antígeno PSMA de rata mutado con epítopos distales a la membrana humanos tal como se describió en el ejemplo 2.5. Para la cltometría de flujo se Incuban 2,5x105 células de las líneas celulares respectivas con 50 pl de sobrenadante. Se detecta la unión de los constructos con un anticuerpo anti-His (anticuerpo frente a penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa se usa un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoerítrlna, IgG de cabra antl-ratón (específica de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, RFA). Se miden las muestras con un instrumento FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Sólo se seleccionan para su uso adicional constructos que muestran unión a células CHO que expresan el antígeno PSMA humano y no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno PSMA de rata y además no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno PSMA de rata mutado con epítopos distales a la membrana humanos.
2.10 Generación de equivalentes humanos/humanlzados de scFv no humanos frente a epítopos diana proxlmales a la membrana de PSMA humano
Se alinea la región VH de un scFv murino anti-PSMA frente a un epítopo diana proximal a la membrana de PSMA humano contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpo humano. Se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano que tiene la homología más próxima con la VH no humana y se realiza una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Hay varios residuos de reglón de marco de la VH no humana que se diferencian de las reglones de marco de VH humana (“diferentes posiciones de reglón de marco”). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y actividad del anticuerpo frente a su diana.
Para construir una biblioteca que contiene las CDR murinas y en cada posición de reglón de marco que se diferencia de la secuencia de VH humana elegida ambos residuos posibles (el residuo de aminoácido humano y el murino materno), se sintetizan oligonucleótidos degenerados. Estos oligonucleótidos incorporan en las posiciones diferentes el residuo humano con una probabilidad del 75% y el residuo murino con una probabilidad del 25%. Para una VH humana, por ejemplo, tienen que sintetizarse seis de estos oligonucleótidos que se solapan en un tramo terminal de aproximadamente 20 nucleótldos. Para ello uno de cada dos cebadores es un cebador antlsentldo. Se deleclonan sitios de restricción dentro de los oligonucleótidos necesarios para la clonación posterior.
Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótldos, dependiendo del número de cebadores que se necesitan para abarcar la secuencia V completa.
Se mezclan estos por ejemplo seis cebadores en cantidades ¡guales (por ejemplo 1 pl de cada cebador (disoluciones madre de cebadores de 20 a 100 pM) con respecto a 20 pl de reacción PCR) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón para PCR, nucleótldos y Taq polimerasa. Se incuba esta mezcla a 94°C durante 3 minutos, 65°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, 59°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y a 72°C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesls en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 pares de bases del gel según métodos convencionales.
Después se usa este producto de PCR como molde para una reacción PCR convencional usando cebadores que Incorporan sitios de restricción para clonación N-termlnales y C-terminales adecuados. Se aísla fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH de aproximadamente 350 nucleótldos) mediante electroforesis en gel de agarosa según métodos convencionales. De esta manera se amplifica suficiente fragmento de ADN de VH. Este fragmento de VH es ahora una combinación de fragmentos de VH que tienen cada uno una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las posiciones de reglón de marco diferentes respectivas (combinación de VH humanizada). Se realiza el mismo procedimiento para la reglón VL del scFv murino anti-PSMA frente a un epítopo diana proximal a la membrana de PSMA humano (combinación de VL humanizada).
Después se combina la combinación de VH humanizada con la combinación de VL humanizada en el vector de presentación en fago pComb3H5Bhls para formar una biblioteca de scFv funcionales de la que se seleccionan, después de la presentación en fago filamentoso, elementos de unión anti-PSMA frente a epítopos diana proxlmales a la membrana de PSMA humano, se examinan, se identifican y se confirman tal como se describió anteriormente para el scFV anti-PSMA no humano (murino) parental. Luego se analizan clones Individuales para determinar propiedades y secuencia de aminoácidos favorables. Se prefieren aquellos scFv, que son los de homología de secuencia de aminoácidos más próxima con segmentos V de línea germinal humana.
Se convierten scFv anti-PSMA humanos/humanizados frente a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano en anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla recombinantes y se caracterizan adlclonalmente tal como sigue.
2.11 Generación de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de PSMA humano
Se convierten scFv anti-PSMA frente a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano con propiedades y secuencia de aminoácidos favorables en anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla recomblnantes uniéndolos a través de un Gly4-Seri-ligador con el scFv específico frente a CD3, I2C (SEQ ID NO: 185), para dar como resultado constructos con la disposición de dominios VHpsma -(Gly4Ser-i)3 -VLpsma - SeriG^Sen - VHcd3 -(Gly4Ser-i)3 - VLcd3 - Alternativamente pueden generarse constructos adicionales con diferentes disposiciones de dominios según protocolos convencionales. Para la expresión en células CHO las secuencias codificantes de (i) una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobulina N-terminal que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak y (¡I) una cola Hls6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unen ambas en marco a la secuencia de nucleótidos que codifica para los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla antes de la Inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtiene mediante síntesis génlca en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
2.12 Expresión y purificación de moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidas a epítopos diana proxlmales a la membrana de PSMA humano
Se expresan moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla en células de ovarlo de hámster chino (CHO). Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica de los constructos mediante adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se recoge sobrenadante de cultivo celular y se usa en los experimentos posteriores. Para generar sobrenadante para purificación después de dos pases de cultivo estacionario se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronlc F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente, se expresan transitoriamente constructos en células HEK 293. Se realiza la transfección con reactivo 293fectin (Invitrogen, n.° 12347-019) según el protocolo del fabricante. Además se expresan alternativamente los constructos en células CHO deficientes en DHFR transfectadas transitoriamente usando por ejemplo reactivo de transfección FuGENE® HD (Roche Diagnostics GmbH, n.° de cat. 04709691001) según el protocolo del fabricante.
Se usan el sistema Akta® Explorer (GE Health Systems) y software Unicom® para cromatografía. Se realiza cromatografía de afinidad por metales Inmovilizados (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se carga con ZnCÍ2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 mi) a la columna (10 mi) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se lava la columna con tampón A para eliminar muestra no unida. Se eluye la proteína unida usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M, ¡mldazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: el 20% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: el 100% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Se combinan las fracciones de proteína eluldas de la etapa 2 para purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad para investigación y se adquieren de Slgma (Delsenhofen) o Merck (Darmstadt).
Se realiza cromatografía de filtración en gel en una columna de calidad preparativa HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equl. (cltrato 25 mM, Usina 200 mM, glicerol al 5%, pH 7,2). Se someten las muestras de proteína eluldas (velocidad de flujo de 1 ml/min) a SDS-PAGE convencional e inmunotransferencia de tipo Western para la detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Se determinan concentraciones de proteínas usando DO 280 nm.
Se analiza la proteína de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla purificada en SDS PAGE en condiciones reductoras realizadas con geles de Bis Tris al 4-12% de colada previa (Invitrogen). Se realizan la preparación de muestras y la aplicación según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determina el peso molecular con patrón de proteínas MultIMark (Invitrogen). Se tiñe el gel con Coomassle coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada es normalmente >95% tal como se determina mediante SDS-PAGE.
El anticuerpo blespecífico de cadena sencilla tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas tal como se determina mediante filtración en gel en PBS.
Se realiza inmunotransferencia de tipo Western usando una membrana Optltran® BA-S83 y el módulo de transferencia de Invitrogen según el protocolo proporcionado por el fabricante. El anticuerpo usado se dirige contra la cola de His (Penta His, Qiagen) y se usa una IgG de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) como reactivo de segunda etapa, y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Una banda detectada a 52 kD corresponde a anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla purificados.
2.13 Análisis de unión mediante citometría de flujo de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano
Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de constructos de anticuerpos biespecíficos con respecto a la capacidad para unirse a CD3 y a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano, respectivamente, se realiza un análisis de FACS. Con este fin se usan células CHO transfectadas con PSMA humano tal como se describió en el ejemplo 2.1 y la línea celular de leucemia de células T positivas para CD3 humano HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483). Para la confirmación de la unión a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano se usan, además, células CHO que expresan el antígeno PSMA de rata tal como se describió en el ejemplo 2.3 y células CHO que expresan el antígeno PSMA de rata mutado con epítopos distales a la membrana humanos tal como se describió en el ejemplo 2.5. Se Incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%).
Después de lavar, se detectan anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoerítrlna, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa sobrenadante de células no transfectadas como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols ¡n Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulles, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Sólo se seleccionan para su uso adicional aquellos constructos que muestran unión blespecíflca a CD3 humano así como a PSMA humano y no se unen ni al antígeno PSMA de rata ni al antígeno PSMA de rata mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos.
2.14 Bloactlvldad de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano
Se analiza la bloactlvldad de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las células CHO transfectadas con PSMA humano descritas en el ejemplo 2.1. Como células efectoras se usan PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas.
Se obtienen PBMC humanas estimuladas de la siguiente manera:
Se recubre una placa Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se elimina proteína no unida mediante una etapa de lavado con PBS. Se aíslan las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Flcoll según protocolos convencionales. Se añaden 3 - 5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-220 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. En el tercer día se recogen las células y se lavan una vez con RPMI 1640. Se añade IL 2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivan de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales se enriquecen linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+.
Se lavan las células diana dos veces con PBS y se marcan con 11,1 MBq de 51Cren un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavan las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usan en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realiza en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl de RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de E:T de 10:1. Se aplican 1 pg/ml de molécula de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla purificada y 20 diluciones triples de la misma. El tiempo de ensayo es de 18 horas. Se mide la citotoxicidad como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se realizan por cuadruplicado. Se realiza la medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes con un contador gamma Wizard 3” (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realiza el análisis de los datos experimentales con Prlsm 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas tienen normalmente valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software. Se usan valores de CE50 calculados mediante el programa de análisis para comparación de la bloactlvldad.
Sólo se seleccionan para su uso adicional aquellos constructos que muestran potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras contra células diana positivas para PSMA.
2.15 Generación de células CHO que expresan PSMA de macaco
Se obtiene la secuencia de ADNc de PSMA de macaco mediante un conjunto de cinco PCR con ADNc de próstata de mono macaco preparado según protocolos convencionales. Se usan las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos con 94°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto y 72°C durante 1,5 minutos seguido por un ciclo terminal de 72°C durante 3 minutos y los siguientes cebadores:
1. cebador directo: 5’-cactgtggcccaggttcgagg-3’ SEQ ID NO: 228
cebador inverso: 5’-gacataccacacaaattcaatacgg-3’ SEQ ID NO: 229
2. cebador directo: 5’-gctctgctcgcgccgagatgtgg-3’ SEQ ID NO: 230
cebador inverso: 5’-acgctggacaccacctccagg-3’ SEQ ID NO: 231
3. cebador directo: 5’-ggttctactgagtgggcagagg-3’ SEQ ID NO: 232
cebador inverso: 5’-acttgttgtggctgcttggagc-3’ SEQ ID NO: 233
4. cebador directo: 5’-gggtgaagtcctatccagatgg-3’ SEQ ID NO: 234
cebador inverso: 5’-gtgctctgcctgaagcaattcc-3’ SEQ ID NO: 235
5. cebador directo: 5’-ctcggcttcctcttcgggtgg-3’ SEQ ID NO: 236
cebador inverso: 5’-gcatattcatttgctgggtaacctgg-3’ SEQ ID NO: 237
Esas PCR generan cinco fragmentos solapantes, que se aíslan y secuencian según protocolos convencionales usando los cebadores de PCR, y de ese modo proporcionan una parte de la secuencia de ADNc que codifica para PSMA de macaco desde el codón 3 hasta el último codón de la proteína madura. Para generar un constructo para la expresión de PSMA de macaco se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génica según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 238 y 239). En este constructo la secuencia codificante de PSMA de macaco desde el aminoácido 3 hasta el último aminoácido de la proteína de PSMA madura seguida por un codón de terminación se fusiona en marco con la secuencia codificante de los dos primeros aminoácidos de la proteína de PSMA humano. También se diseña el fragmento de síntesis génica para contener un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento que contiene el ADNc. Los sitios de restricción Introducidos, Xbal en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se utilizan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de Xbal y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
2.16 Análisis mediante citometría de flujo de especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano
Con el fin de someter a prueba la especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano se investiga la capacidad de los constructos para unirse a PSMA de macaco y CD3 de macaco, respectivamente, mediante análisis de FACS. Con este fin se usan las células CHO transfectadas con PSMA de macaco tal como se describió en el ejemplo 2.15 y la línea de células T de macaco 4119LnPx (amablemente proporcionada por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Eriangen-Nuemberg; publicada en Knappe A, etal., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos blespecíficos específicos entre especies. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dlanova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa sobrenadante de células no transfectadas como control negativo. Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-Interscience, 2002).
Ejemplo 3
3.1. Generación de anticuerpos blespecíficos Individuales dirigidos hacia PSMA y CD3
Se obtuvieron mediante síntesis génlca anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla que comprendían o bien dominio de unión de scFv P1, P2, P3, P4 o P5 contra un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana de < 60° o bien el dominio de unión de scFv D1 o D2 contra un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana de £ 60° y el dominio de unión de scFv I2C dirigido a CD3-épsilon en células T humanas. Se diseñaron los fragmentos de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucaríotas del constructo, seguido por un péptldo líder de ¡nmunoglobullna de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante del anticuerpo blespecífico de cadena sencilla, seguido en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. Las disposiciones de reglones variables así como las SEQ ID NO de las secuencias de ADNc y de aminoácidos se Indican en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3:
Figure imgf000046_0001
También se diseñaron los fragmentos de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción adecuados al comienzo (EcoRI) y al final del fragmento (Sal I) para la clonación del fragmento de síntesis génlca en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum etal. Cáncer Immunol Immunother50 (2001) 141-150). Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucaríotas del constructo. Se realizó la expresión de proteínas en eucaríotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se recogió sobrenadante de cultivo celular y se usó en los experimentos posteriores.
3.2. Distancia a la membrana < 60Á o £ 60Á de epítopos de PSMA reconocidos por Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C
Se llevó a cabo la confirmación de epítopos de anticuerpos blespecíficos Individuales dirigidos hacia PSMA mediante citometría de flujo con células CHO transfectadas con PSMA humano (sin mutar), PSMA de rata sin mutar y PSMA de rata mutado al aminoácido humano homólogo en cada posición de aminoácido con coincidencia errónea con una distancia a la membrana de £ 60 A tal como se describió en el ejemplo 2.
Se incubaron 200.000 células de cada transfectante de CHO durante 30 min sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresaban los constructos de anticuerpos blespecíficos dirigidos hacia PSMA. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detectó la unión del constructo con un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectaron los anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usó medio de cultivo celular como control negativo. Se realizó citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usó el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizaron la tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols ¡n Immunology (Coligan, Krulsbeek, Margulles, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La figura 4 muestra que Acbcs dirigidos hacia PSMA P1xl2C, P2xl2C, P3xl2C, P4xl2C y P5xl2C se unen a PSMA humano (sin mutar) pero no a PSMA de rata sin mutar ni mutado y por tanto esto confirma una distancia a la membrana de < 60 A para el epítopo de PSMA de cada uno de estos constructos blespecíficos. En cambio, Acbcs dirigidos hacia PSMA D1xl2C y D2xl2C no se unen a PSMA de rata sin mutar pero sí a PSMA humano (sin mutar) y de rata mutado de manera acorde a epítopos de PSMA con una distancia a la membrana £ 60 A.
3.3. Cltotoxlcldad relativa de células T redirigida mediante Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C con epítopos de PSMA con una distancia a la membrana < 60Á y £ 60Á
Se midió la cltotoxlcldad de células T redirigida mediante Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C contra células CHO transfectadas con PSMA humano en un ensayo de liberación de cromo 51 (51Cr). Como fuente de células T efectoras se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas. Se obtuvieron PBMC humanas estimuladas de la siguiente manera: se recubrió una placa Petrl (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se eliminó proteína sin unir mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Flcoll según protocolos convencionales. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-2 20 U/ml (Proleukln, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron las células de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales se enriquecieron linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Se lavaron las células diana dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavaron las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxlcidad. Se realizó el ensayo en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de células E:T de 10:1. Se añadieron Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C como sobrenadantes de cultivo de células CHO transfectadas a diferentes diluciones. El tiempo de ensayo fue de 18 horas. Se midió la citotoxlcidad como valores relativos de cromo liberado relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. Se realizó la medición de la actividad de cromo liberado con un contador gamma Wlzard 3” (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realizó el análisis de los datos experimentales con Prlsm 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas tenían normalmente valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software.
Tal como se muestra en la figura 5 los 5 Acbcs dirigidos hacia PSMA, cuyos epítopos de PSMA tienen una distancia a la membrana de < 60 A, son sustancialmente más potentes en redirigir la citotoxlcidad de células T que los otros dos Acbcs dirigidos hacia PSMA, cuyos epítopos de PSMA tienen una distancia a la membrana de £ 60Á.
4. Generación de anticuerpos biespecíficos Individuales adicionales dirigidos a CD3 y epítopos diana proxlmales a la membrana de PSMA humano
Se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpos humanos VH1 1-03 (http://vbasa.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto de región de marco para CDRH1 (SEQ ID NO 260), CDRH2 (SEQ ID NO 261) y CDRH3 (SEQ ID NO 262). Para VH1 1-03 tienen que sintetizarse los siguientes oligonucleótidos degenerados que se solapan en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos (para ello uno de cada dos cebadores es un cebador antisentido):
5’P6-VH-A-Xhol (SEQ ID NO: 449)
CTT GAT CTC GAG TCC GGC SCT GAG STG RWG AAG CCT GGC GCC TCC GTG AAG RTG TCCTGC AAG GCC TCC GGCTAC
3'P6-VH-B (SEQ ID NO: 450)
CCA TTC CAG CMS CTG GCC GGG TKY CTG TYT CAC CCA GTG CAT CAC GTA GCC GGT GAAGGT GTA GCC GGA GGCCTT GCA
5'P6-VH-C (SEQ ID NO: 451)
CCC GGC CAG SKG CTG GAA TGG ATS GGC TAC ATC AAC CCT TAC AAC GAC GTG ACC CGG TAC AAC GGC AAG TTC AAG
3'P6-VH-D (SEQ ID NO: 452)
TTC CAT GTA GGC GGT GGA GGM GKA CKT GTC KCT GGT AAK GGT GRC
TYT GCC CTT GAA CTT GCC GTT GTA
5'P6-VH-E (SEQ ID NO: 453)
TCC ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC RGC CTG ASG TCT GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC TGC GCC AGG GGC
3’P6-VH-F-BstEII (SEQ ID NO: 454)
CGA TAC GGT GAC CAG AGT GCC TCT GCC CCA GGA GTC GAA GTA GTA CCA GTT CTC GCC CCT GGC GCA GTA GTA
Este conjunto de cebadores abarca la secuencia de VH completa.
Dentro de este conjunto se mezclan cebadores en cantidades ¡guales (por ejemplo 1 pl de cada cebador (disoluciones madre de cebadores 20 a 100 pM) con respecto a 20 pl de reacción PCR) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón para PCR, nucleótidos y Taq polimerasa. Se incuba esta mezcla a 94°C durante 3 minutos, 65°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, 59°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y a 72°C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 del gel según métodos convencionales.
Después se usa el producto de PCR de VH como molde para una reacción PCR convencional usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. Se aísla fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH de aproximadamente 350 nucleótidos) mediante electroforesis en gel de agarosa según métodos convencionales. De esta manera se amplifica suficiente fragmento de ADN de VH.
Se elige la secuencia de VL de línea germinal de anticuerpos humanos Vkll A1 (http://vbasa.mrc-cpe.cam.ac.uk/) como contexto de región de marco para CDRL1 (SEQ ID NO: 255), CDRL2 (SEQ ID NO: 256) y CDRL3 (SEQ ID NO: 257). Para Vkll A1 tienen que sintetizarse los siguientes oligonucleótidos degenerados que se solapan en un tramo terminal de aproximadamente 15-20 nucleótidos (para ello uno de cada dos cebadores es un cebador anti sentido):
5’P6-VL-A-Sacl (SEQ ID NO: 455)
CTT GATGAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA SYC TCC CTG SCT GTG ACT CTG GGC CAG CSG GCC TCC ATC TCT TGC CGG
3'P6-VL-B (SEQ ID NO: 456)
CCA GTG CAT GAA GGT GTT GTC GTA GGA GTC GAT GGACTC GGA GGC CCG GCA AGA GAT GGA GGC
5'P6-VL-C (SEQ ID NO: 457)
ACC TTC ATG CAC TGG TWT CAG CAG ARG CCT GGC CAGYCT CCT MRC CKG CTG ATC TWC CGG GCC TCT ATC CTG GAA
3'P6-VL-D (SEQ ID NO: 458)
CAG GGTGAA GTC GGT GCC GGA GCC AGA GCC GGA GAA CCG GKC AGG GAY GCC GGA TTC CAG GAT AGA GGC CCG
5'P6-VL-E (SEQ ID NO: 459)
ACC GAC TTC ACC CTG AMA ATC TMC CST GTG GAG GCCGAS GAC GTG GSC RYC TAC TAC TGC CAC CAG
3’P6-VL-F-BsiWI/Spel (SEQ ID NO: 460)
ACT CAG ACT AGT CGT ACG CTT GAT TTC CAG CTT GGT CCC TCC GCC
GAA GGT GTA AGG GTC CTC GAT GGA CTG GTG GCA GTA GTA
Este conjunto de cebadores abarca la secuencia de VL correspondiente completa.
Dentro de este conjunto se mezclan cebadores en cantidades ¡guales (por ejemplo 1 pl de cada cebador (disoluciones madre de cebadores de 20 a 100 pM) con respecto a 20 pl de reacción PCR) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón para PCR, nucleótidos y Taq polimerasa. Se incuba esta mezcla a 94°C durante 3 minutos, 65°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, 59°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y a 72°C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 del gel según métodos convencionales.
Después se usa el producto de PCR de VL como molde para una reacción PCR convencional usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados.
Se aísla el fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VL aproximadamente 330 nucleótldos) mediante electroforesls en gel de agarosa según métodos convencionales. De esta manera se amplifica suficiente fragmento de ADN de VL.
Se combina el producto de PCR de VH basado en VH1 1-03 final (es decir el repertorio de VH humana/humanizada) con el producto de PCR de VL basado en Vkll A1 final (es decir el repertorio de VL humana/humanizada) en el vector de presentación en fago pComb3H5Bhis. Esta combinación de VH-VL forma una biblioteca de scFv funcionales de la que se seleccionan, después de la presentación en fago filamentoso, elementos de unión anti-PSMA, se examinan, se identifican y se confirman tal como se describe a continuación:
Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémldo pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Después se transforma la biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante en 300 ul de células de Escheríchia cotí XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm, Gene-pulser de Biorad) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión de fenotipo, se seleccionan transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 mi de cultivo en Super Broth (SB) líquido durante la noche. Después se recogen las células mediante centrifugación y se lleva a cabo la preparación de plásmldos usando un kit de preparación de plásmldos comercial mente disponible (Qiagen).
Se ligan 2800 ng de este ADN de plásmldo que contiene la biblioteca de VL (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transforman de nuevo en dos alícuotas de 300 ul de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño de biblioteca de scFV de VH-VL total (fragmento variable de cadena sencilla) de más de 107 clones independientes.
Después de la expresión de fenotipo y lenta adaptación a carbenicilina, se transfieren las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos en medio de selección de SB-carbenlcilina (SB con carbenicilina 50 ug/ml). Después se Infectan las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago cooperador VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fago M13 filamentoso, en el que las partículas de fago contienen ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica para un fragmento de scFv y presentan la proteína de scFv correspondiente como fusión de traducción con una proteína de recubrimiento de fago III. Se usa esta combinación de fagos que presenta la biblioteca de anticuerpos para la selección de entidades de unión a antígeno.
Con este fin se recoge la biblioteca de fagos que porta el repertorio de scFv clonado del sobrenadante de cultivo respectivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden aproximadamente de 1011 a 1012 partículas de fago de scFv en 0,4 mi de PBS/BSA al 0,1% y se incuban con de 105 a 107 células de línea celular de cáncer de próstata humano positivas para PSMAc LNCaP (n.° de ATCCCRL-1740) durante 1 hora sobre hielo con agitación lenta. Se recogen estas células LNCaP previamente mediante centrifugación, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na al 0,05%). Se eliminan los fagos de scFv que no se unen específicamente a células LNCaP mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na al 0,05%). Después de lavar, se eluyen entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina pH 2,2 (Incubación de 10 mln con posterior agitación con vórtex) y después de la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usa el eluato para la Infección de un cultivo de E. co liXL1 Blue sin Infectar reciente (DO600 > 0,5). El cultivo de E. coli que contiene células de E. coli satisfactoriamente transducidas con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento de scFv humano/humanizado, vuelve a seleccionarse por su resistencia a carbenicilina y posteriormente se infecta con fago cooperador VCMS 13 para comenzar la segunda ronda de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Se lleva a cabo un total de 4 a 5 rondas de selecciones, normalmente.
Con el fin de examinar para detectar elementos de unión específicos para PSMA se aísla ADN de plásmido correspondiente a 4 y 5 rondas de cribado a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína de scFv soluble, se escinden fragmentos de ADN de VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Se clonan estos fragmentos a través de los mismos sitios de restricción en el plásmldo pComb3H5BFIag/Hls que se diferencia del pComb3H5BHis original en que el constructo de expresión (es decir el scFv) incluye una etiqueta Flag (DYKDDDDK) en su extremo C-terminal antes de la cola Hls6 y que el dominio III/N2 de proteína de fago y el dominio lll/CT de proteína se han delecionado. Después de la ligación, se transforma cada combinación (diferentes rondas de cribado) de ADN de plásmido en 100 pl de E. coli TG1 o XLI blue competentes para choque térmico y se siembran en placa sobre carbenlcilina-agar LB. Se escogen colonias Individuales en 100 pl de LB carb (carbenicilina 50 ug/ml).
E. coli transformadas con pComb3H5BFIag/His que contiene un segmento de VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la Inducción con IPTG 1 mM. Debido a una secuencia señal adecuada, la cadena de scFv se exporta al Interior del periplasma en el que se pliega en una conformación funcional.
Se escogen colonias bacterianas de E. coli TG1 individuales de las placas de transformación para preparaciones periplasmáticas a pequeña escala y se hacen crecer en medio SB (por ejemplo 10 mi) complementado con MgCk 20 mM y carbenicilina 50 pg/ml y se redisuelven en PBS (por ejemplo 1 mi) después de la recogida. Mediante cuatro rondas de congelación a -70°C y descongelación a 37°C, se destruye la membrana exterior de las bacterias mediante choque de temperatura y se liberan las proteínas periplasmáticas solubles incluyendo los scFv en el sobrenadante. Después de la eliminación de células Intactas y residuo celular mediante centrifugación, se recoge el sobrenadante que contiene los scFv anti-PSMA y se usa para la Identificación de elementos de unión específicos para PSMA de la siguiente manera:
Se somete a prueba la unión de scFv a PSMA mediante cltometría de flujo con la línea celular de cáncer de próstata humano positiva para PSMA LNCaP (n.° de ATCCCRL-1740). Se usa una preparación periplasmática a pequeña escala tal como se describió anteriormente sin ningún crecimiento de bacterias como control negativo.
Para la citometría de flujo se incuban 2,5x105 células con 50 ul de preparación periplasmática de scFv o con 5 pg/ml de scFv purificado en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Se detecta la unión de scFv con un anticuerpo anti-His (anticuerpo frente a penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa se usa un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón (específica de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, RFA). Se miden las muestras con un instrumento FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Luego se analizan clones Individuales para determinar propiedades y secuencia de aminoácidos favorables. Se convierten scFv específicos de PSMA en anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla recomblnantes uniéndolos a través de un GlyíSen-ligador con el scFv específico de CD3 I2C (SEQ ID NO: 185) o cualquier otro scFv específico de CD3 de la invención para dar como resultado constructos con la disposición de dominios VHpsma -(Gly4Ser-i)3 -VLpsma - S eriG IyíS en - VHcd3 -(Gly4Ser-i)3 - VLcd3 o disposiciones de dominios alternativas tales como VLpsma -(Gly4Ser-i)3 - VHpsma - Gly4Seri - VHqd3 -(Gly4Sen)3 - VLcd3- Para la expresión en células CHO las secuencias codificantes de (I) una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobullna N-terminal que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak y (¡I) una cola Hls6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unen ambas en marco a la secuencia de nucleótldos que codifica para los anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla antes de la Inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtiene mediante síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se lleva a cabo la transfecclón de los plásmldos de expresión generados tal como se describió en el ejemplo 3.1. Se realizan la expresión de proteínas y purificación de constructos de anticuerpos blespecíficos, confirmación mediante citometría de flujo de la unión a CD3 y a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano así como el análisis de bloactlvldad mediante ensayo de cltotoxlcldad tal como se describió en el ejemplo 2. Todos los demás procedimientos del estado de la técnica se llevan a cabo según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)).
Sólo se seleccionan para su uso adicional aquellos constructos de anticuerpos blespecíficos que se unen a CD3 y a epítopos diana proximales a la membrana de PSMA humano y muestran potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras contra células diana positivas para PSMA.
Ejemplo 4
4.1. Generación de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla dirigidos hacia PSMA y CD3
Se obtuvieron mediante síntesis génica anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla que comprendían o bien dominio de unión de scFv P6 contra un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana de < 60 A o bien dominio de unión de scFv D3 contra un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana de £ 60 A y el dominio de unión de scFv I2C dirigido a CD3épsilon en células T humanas. Se diseñaron los fragmentos de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo, seguido por un péptido líder de ¡nmunoglobullna de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante del anticuerpo blespecíflco de cadena sencilla, seguido en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. Las disposiciones de reglones variables así como las SEQ ID NO de las secuencias de ADNc y aminoácidos se Indican en la tabla 4 a continuación.
Tabla 4:
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También se diseñaron los fragmentos de síntesis génica para Introducir sitios de restricción adecuados al comienzo (EcoRI) y al final del fragmento (Sal I) para la clonación del fragmento de síntesis génica en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum etal. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realizó la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se recogió sobrenadante de cultivo celular y se usó en los experimentos posteriores.
4.2. Distancia a la membrana < 60Á o £ 60Á de epítopos de PSMA reconocido por Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C
Se llevó a cabo la confirmación de epítopos de anticuerpos blespecíflcos Individuales dirigidos hacia PSMA mediante citometría de flujo con células CHO transfectadas con PSMA humano (sin mutar), PSMA de rata sin mutar y PSMA de rata mutado al aminoácido humano homólogo en cada posición de aminoácido con coincidencia errónea con una distancia a la membrana de £ 60Á tal como se describió en el ejemplo 2.
Se incubaron 200.000 células de cada transfectante de CHO durante 30 min sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos blespecíficos dirigidos hacia PSMA. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detectó la unión del constructo con un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectaron los anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usó medio de cultivo celular como control negativo. Se realizó citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usó el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizaron la tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols ¡n Immunology (Coligan, Krulsbeek, Margulles, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La figura 6 muestra que el Acbcs dirigido hacia PSMA P6xl2C se une a PSMA humano (sin mutar) pero no a PSMA de rata sin mutar ni mutado y por tanto esto confirma una distancia a la membrana de < 60 A para el epítopo de PSMA de este constructo blespecíflco. En cambio, el Acbcs dirigido hacia PSMA D3xl2C no se une a PSMA de rata sin mutar pero sí a PSMA humano (sin mutar) y de rata mutado de manera acorde a un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana £ 60Á.
4.3. Cltotoxlcldad relativa de células T redirigida mediante Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C con epítopos de PSMA con una distancia a la membrana < 60Á y £ 60Á
Se midió la cltotoxlcldad de células T redirigida mediante Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C contra células CHO transfectadas con PSMA humano en un ensayo de liberación de cromo 51 (51Cr). Como fuente de células T efectoras se usaron PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas. Se obtuvieron PBMC humanas estimuladas de la siguiente manera: se recubrió una placa Petrl (145 mm de diámetro, Grelner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se eliminó proteína sin unir mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Flcoll según protocolos convencionales. Se añadieron 3 - 5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-2 20 U/ml (Proleukln, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día se recogieron las células y se lavaron una vez con RPMI 1640. Se añadió IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivaron las células de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales se enriquecieron linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Se lavaron las células diana dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavaron las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usaron en el ensayo de cltotoxlcldad. Se realizó el ensayo en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl de RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de células E:T de 10:1. Se añadieron Acbcs dirigidos hacia PSMA basados en I2C como sobrenadantes de cultivo de células CHO transfectadas a diferentes diluciones. El tiempo de ensayo fue de 18 horas. Se midió la cltotoxlcldad como valores relativos de cromo liberado relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se llevaron a cabo por cuadruplicado. Se realizó la medición de la actividad de cromo liberado con un contador gamma Wlzard 3” (Perkln Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realizó el análisis de los datos experimentales con Prlsm 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas tenían normalmente valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software.
Tal como se muestra en la figura 7 el Acbcs dirigido hacia PSMA P6xl2C, cuyo epítopo de PSMA tiene una distancia a la membrana de < 60 A es sustanclalmente más potente en redirigir la cltotoxlcldad de células T que el Acbcs dirigido hacia PSMA D3xl2C, cuyo epítopo de PSMA tiene una distancia a la membrana de £ 60 A.
Ejemplo 5: Unión de reacción cruzada a PSMA y CD3 humano y de primate distinto de chimpancé de Acbcs basados en I2C contra epítopos de PSMA proximales a la membrana
5.1. Clonación y expresión de antígeno de PSMA de cinomolgo con células CHO
Se obtuvo la secuencia de ADNc de PSMA de macaco tal como se describió en el ejemplo 2.15. Tal como se describió anteriormente, estas PCR generaron cinco fragmentos solapantes, que se aislaron y secuenciaron según protocolos convencionales usando los cebadores de PCR, y de ese modo proporcionaron una parte de la secuencia de ADNc que codifica para PSMA de macaco desde el codón 3 hasta el último codón de la proteína madura. Para generar un constructo para la expresión de PSMA de macaco se obtuvo un fragmento de ADNc mediante síntesis génica según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 238 y 239). En este constructo la secuencia codificante de PSMA de macaco desde el aminoácido 3 hasta el último aminoácido de la proteína de PSMA madura seguido por un codón de terminación se condensó en marco con la secuencia codificante de los dos primeros aminoácidos de la proteína de PSMA humano. También se diseñó el fragmento de síntesis génica para contener un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento que contiene el ADNc. Los sitios de restricción introducidos, Xbal en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usaron en los siguientes procedimientos de clonación. Se clonó el fragmento de síntesis génica a través de Xbal y Salí en un plásmido denominado pEFDHFR siguiendo protocolos convencionales. Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realizó la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
5.2. Análisis de unión mediante citometría de flujo de Acbcs basados en I2C contra epítopos proximales a la membrana de PSMA humano con PSMA de primate distinto de chimpancé y con CD3 humano y de primate distinto de chimpancé
La unión de los Acbcs P1xl2C, P2xl2C, P3xl2C, P4xl2C, P5xl2C y P6xl2C dirigidos contra epítopos de PSMA proximales a la membrana a células CHO que expresan PSMA humano se muestra mediante citometría de flujo en los ejemplos 3 y 4.
Se analizó la unión de estos Acbcs a PSMA de macaco así como a CD3 humano y de macaco mediante citometría de flujo usando células CHO transfectadas con PSMA de macaco, la línea celular de leucemia de células T positivas para CD3 humano HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) y la línea de células T de macaco positiva para CD3 4119LnPx (amablemente proporcionada por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Eriangen-Nuemberg; publicada en Knappe A, etal., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Los resultados se muestran en la figura 8. Se incubaron 200.000 células de la población celular respectiva durante 30 min sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células CHO transfectadas con los constructos de anticuerpos biespecíficos dirigidos hacia PSMA. Se lavaron las células dos veces en PBS y se detectó la unión del constructo con un anticuerpo murino sin marcar frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectaron los anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Se usó medio de cultivo reciente como control negativo.
Se realizó citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usó el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizaron la tinción de FACS y medición de la intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
6. Generación de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana
6.1 Generación de células CHO que expresan FAPalfa humana
Se obtiene la secuencia codificante de FAPalfa humana tal como se publica en GenBank (número de registro NM 004460) mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína FAPalfa humana y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 366 y 367). También se diseña el fragmento de síntesis génica para introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, Xmal en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de Xmal y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum etal. Cáncer Immunol Immunother50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucarlotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
6.2 Generación de una proteína de fusión de FAPalfa humana soluble
Se usan la secuencia codificante de FAPalfa humana tal como se describió en el ejemplo 6.1 y la secuencia codificante de Lag3 murino tal como se publica en GenBank (número de registro NM 008479) para la construcción de una secuencia de ADNc artificial que codifica para una proteína de fusión soluble de FAPalfa humana y Lag3 murino. Para generar un constructo para la expresión de la proteína de fusión de FAPalfa humana soluble se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génlca según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 368 369). Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de Lag3 murino desde el aminoácido 1 hasta el 441 correspondiente al péptido señal y los dominios extracelulares de Lag3 murino, seguido en marco por la secuencia codificante de un Seri-Gly4-Seri-ligador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante de la proteína FAPalfa humana desde el aminoácido 27 hasta el 760 correspondiente a los dominios extracelulares de FAPalfa humana, seguido en marco por la secuencia codificante de un Ser-i-Glyi-ligador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción Introducidos, Spel en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génlca a través de Spel y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo todos los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronlc F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente se usa un clon del plásmido de expresión con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia para transfección y expresión de proteína en el sistema de expresión FreeStyle 293 (Invltrogen GmbH, Karísruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se obtiene sobrenadante que contiene la proteína expresada, se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante a -20°C.
La purificación de la proteína de fusión de FAPalfa humana soluble se realiza de la siguiente manera: Se usan el sistema Akta® Explorer (GE Health Systems) y el software Unicom® para cromatografía. Se realiza cromatografía de afinidad por metales Inmovilizados (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se carga con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 mi) a la columna (10 mi) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se lava la columna con tampón A para eliminar muestra no unida. Se eluye la proteína unida usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M, imidazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: el 20% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: el 100% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Se combinan las fracciones de proteína eluidas de la etapa 2 para purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad para Investigación y se adquieren de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
Se realiza cromatografía de filtración en gel en una columna de calidad preparativa HILoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equi. (citrato 25 mM, Usina 200 mM, gllcerol al 5%, pH 7,2). Se someten las muestras de proteína eluidas (velocidad de flujo de 1 ml/min) a SDS-PAGE convencional e inmunotransferencia de tipo Western para la detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Se determinan concentraciones de proteínas usando DO 280 nm.
6.3 Generación de células CHO que expresan FAPalfa murina
Se usa la secuencia de FAPalfa murina (NM 007986, proteína de activación de fibroblastos (Fap) de Mus musculus, ARNm, Centro Nacional para Información Biotecnológica, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) para obtener una molécula de ADNc sintética mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante del antígeno de FAPalfa mu riña completo, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 370 y 371). También se genera un constructo alternativo idéntico al constructo mencionado anteriormente excepto por una cola de 6 histidinas C-terminal en lugar de la etiqueta FLAG. También se diseña el fragmento de síntesis génica para introducir sitios de restricción en el extremo 5’ (EcoRI) y en el extremo 3’ (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génica para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. La expresión en la superficie celular de FAPalfa murina mediante los transfectantes generados se confirma por análisis de unión mediante cltometría de flujo realizado tal como se describe en el presente documento. En el caso del constructo con la cola de 6 histidinas se usó un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%) y se detectó con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina. Se confirmó la expresión de FAPalfa murina tal como se muestra en la figura 10.
6.4 Generación de células CHO que expresan un antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante del antígeno de FAPalfa humana completo mutado en 15 posiciones de aminoácidos específicas tal como se explica a continuación, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 372 y 373). Todos los aminoácidos extracelulares de FAPalfa humana con coincidencia errónea con la secuencia murina homologa, cuyos átomos de C alfa tienen una distancia de £ 60Á desde el átomo de C alfa del decimotercer aminoácido extracelular (es decir el aa de referencia) contando desde la unión de la región extracelular y transmembrana, se mutan al aminoácido murino con coincidencia errónea homólogo. Esto se aplica a los 15 aminoácidos que se Indican en la tabla 2 y se marcan en negrita. Los aminoácidos con coincidencia errónea homólogos entre FAPalfa humana y murina se Identifican mediante alineación de secuencias tal como se muestra en la figura 9. También se diseña el fragmento de síntesis génica para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3' (Salí) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se eliminan sitios de restricción Internos mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génica. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génica para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
La expresión en la superficie celular de FAPalfa humana mutada con epítopos distales a la membrana murinos mediante los transfectantes generados se confirma por análisis de unión mediante citometría de flujo realizado tal como se describe en el presente documento usando un anticuerpo M2 anti-FLAG (Sigma-Aldrich, Inc.; diluido 1:900 en 50 pl de PBS con FCS al 2%) detectado con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina. La expresión de FAPalfa humana mutada con epítopos distales a la membrana murinos se confirmó tal como se muestra en la figura 10.
6.5 Generación de células CHO que expresan un antígeno de FAPalfa murina mutado con epítopos distales a la membrana humanos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno de FAPalfa murina mutado con epítopos distales a la membrana humanos mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante del antígeno de FAPalfa murina completo mutado en las mismas 15 posiciones de aminoácidos extracelulares específicas tal como se Identificaron en el ejemplo 6.4 anterior con respecto al aminoácido humano homólogo respectivo, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 374 y 375). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3’ (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se Induce amplificación génlca para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
6.6 Inmunización de ratones usando una proteína de fusión de FAPalfa humana soluble
Se Inmunizan ratones F1 de doce semanas de edad de cruces BALB/c x C57BL/6 con la proteína de fusión de FAPalfa humana soluble tal como se describió en el ejemplo 6.2. Para ello, para cada animal se mezclan 40 pg de la proteína de fusión de FAPalfa humana soluble con 10 nmol de un CpG-oligonucleótido modificado con tioato (5'-tccatgacgttcctgatgct-3’) en 300 pl de PBS y se inyectan por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21, 42 y opcionalmente 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se extraen muestras de sangre y se someten a prueba títulos séricos de anticuerpo contra FAPalfa humana mediante citometría de flujo según protocolos convencionales. Para ello se Incuban 200.000 células de las células CHO transfectadas con FAPalfa humana tal como se describió en el ejemplo 6.1 durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de suero de los animales Inmunizados diluido 1:1000 en PBS con FCS al 2%. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión de anticuerpos séricos con un anticuerpo específico de Fc-gamma de ratón (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa suero de los animales obtenido antes de la Inmunización como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols ¡n Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Se usan animales que demuestran reactividad en suero significativa contra FAPalfa humana tal como se determina mediante el análisis de FACS en el experimento posterior.
6.7 Generación de una biblioteca de scFV de anticuerpos murlnos inmunitarios: Construcción de una biblioteca de anticuerpos combinatoria y presentación en fago
Tres días después de la última Inmunización de refuerzo se recogen esplenocitos de animales reactivos para la preparación de ARN total según protocolos convencionales.
Se construye una biblioteca de fragmentos de ADN de región variable de cadena pesada (VH) de Ig y región variable de cadena ligera (kappa) (VK) de inmunoglobulina (Ig) murina mediante RT-PCR con ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetiza ADNc según protocolos convencionales, véase el ejemplo 2.7.
Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Después se transforma la biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante en 300 pl de células de Escheríchia cotí XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm, Gene-pulser de Biorad) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión de fenotipo, se seleccionan transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHIs en 100 mi de cultivo en Super Broth (SB) líquido durante la noche. Después se recogen las células mediante centrifugación y se lleva a cabo la preparación de plásmldos usando un kit de preparación de plásmldos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligan 2800 ng de este ADN de plásmldo que contiene la biblioteca de VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transforman de nuevo en dos alícuotas de 300 pl de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño de biblioteca de scFv de VH-VK total (fragmento variable de cadena sencilla) de más de 107 clones independientes.
Después de la expresión de fenotipo y lenta adaptación a carbenicilina, se transfieren las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos en medio de selección de SB-carbenlcilina (SB con carbenicilina 50 pg/ml). Después se Infectan las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago cooperador VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fago M13 filamentoso, en el que cada partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica para un fragmento de scFv murino y presenta la proteína de scFv correspondiente como fusión de traducción con una proteína de recubrimiento de fago III. Más tarde se usa esta combinación de fagos que presenta la biblioteca de anticuerpos para la selección de entidades de unión a antígeno.
6.8 Selección basada en presentación en fago de elementos de unión a diana proximales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos
Se recoge la biblioteca de fagos que porta el repertorio de scFv clonado del sobrenadante de cultivo respectivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden aproximadamente de 1011 a 1012 partículas de fago de scFv en 0,4 mi de PBS/BSA al 0,1% y se incuban con de 105 a 107 células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describió en el ejemplo 6.4 durante 1 hora sobre hielo con agitación lenta. Se hacen crecer previamente estas células CHO, se recogen mediante centrifugación, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Se eliminan fagos de scFv que no se unen específicamente a las células CHO mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Después de lavar, se eluyen entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina pH 2,2 (Incubación de 10 mln con posterior agitación con vórtex) y después de la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usa el eluato para la Infección de un cultivo de E. coliXL1 Blue sin infectar reciente (DO600 > 0,5). Se selecciona de nuevo el cultivo de E. coli que contiene células de E. coli satisfactoriamente transducidas con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento de scFv murino, por su resistencia a carbenicilina y posteriormente se infecta con fago cooperador VCMS 13 para comenzar la segunda ronda de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente se lleva a cabo un total de 4 a 5 rondas de selecciones.
6.9 Examen para detectar elementos de unión a diana proximales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa humana, el antígeno de FAPalfa murina y el antígeno de FAPalfa murina mutado con epítopos distales a la membrana humanos
Se aísla ADN de plásmldo correspondiente a 4 y 5 rondas de cribado a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína de scFv soluble, se escinden fragmentos de ADN de VH-VL de los plásmldos (Xhol-Spel). Se clonan estos fragmentos a través de los mismos sitios de restricción en el plásmldo pComb3H5BFIag/His que se diferencia del pComb3H5BHis original en que el constructo de expresión (por ejemplo scFv) incluye una etiqueta Flag (TGDYKDDDDK) entre el scFv y la cola His6 y se delecionan las proteínas de fago adicionales. Después de la ligación, se transforma cada combinación (diferentes rondas de cribado) de ADN de plásmido en 100 pl de E. coli TG1 o XLI blue competentes para choque térmico y se siembran en placa sobre carbenlcilina-agar LB. Se escogen colonias Individuales en 100 pl de LB-carb (LB con carbenicilina 50 pg/ml).
Después de la inducción con IPTG 1 mM, E. coli transformadas con pComb3H5BFIag/His que contiene un segmento de VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes. Debido a una secuencia señal adecuada, el scFv se exporta al Interior del periplasma en el que se pliega en una conformación funcional.
Se escogen colonias bacterianas de E. coli Individuales a partir de las placas de transformación para preparaciones periplasmáticas a pequeña escala y se hacen crecer en medio SB (por ejemplo 10 mi) complementado con MgCk 20 mM y carbenicilina 50 pg/ml y se redisuelven en PBS (por ejemplo 1 mi) después de la recogida. Se aplica un choque de temperatura mediante cuatro rondas de congelación a -70°C y descongelación a 37°C mediante lo cual se destruye la membrana exterior de las bacterias y se liberan las proteínas periplasmáticas solubles Incluyendo los scFv en el sobrenadante. Después de la eliminación de células intactas y residuo celular mediante centrifugación, se recoge el sobrenadante que contiene los scFv murinos anti-FAPalfa humana y se usa para el examen adicional. Se realiza examen de los scFV aislados para detectar elementos de unión a diana proximales a la membrana mediante citometría de flujo con células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa humana tal como se describió en el ejemplo 6.1, el antígeno de FAPalfa murina tal como se describió en el ejemplo 6.3 y el antígeno de FAPalfa murina mutado con epítopos distales a la membrana humanos tal como se describió en el ejemplo 6.5.
Para la citometría de flujo se incuban 2,5x105 células de las líneas celulares respectivas con 50 pl de sobrenadante. Se detecta la unión de los constructos con un anticuerpo anti-His (anticuerpo frente a penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa se usa un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón (específica de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, RFA). Se miden las muestras con un instrumento FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Sólo se seleccionan para su uso adicional constructos que muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa humana y no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa murina y además no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa murina mutado con epítopos distales a la membrana humanos.
6.10 Generación de equivalentes humanos/humanlzados de scFv no humanos frente a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana
Se alinea la región VH de un scFv murino anti-FAPalfa frente a un epítopo diana proximal a la membrana de FAPalfa humana contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpo humano. Se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano que tiene la homología más próxima con la VH no humana y se realiza una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Hay varios residuos de región de marco de la VH no humana que se diferencian de las regiones de marco de VH humana (“diferentes posiciones de región de marco”). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y actividad del anticuerpo frente a su diana.
Para construir una biblioteca que contiene las CDR murinas y en cada posición de reglón de marco que se diferencia de la secuencia de VH humana elegida ambos residuos posibles (el residuo de aminoácido humano y el murlno materno), se sintetizan oligonucleótidos degenerados. Estos oligonucleótidos incorporan en las posiciones diferentes el residuo humano con una probabilidad del 75% y el residuo murlno con una probabilidad del 25%. Para una VH humana, por ejemplo, tienen que sintetizarse seis de estos oligonucleótidos que se solapan en un tramo terminal de aproximadamente 20 nucleótidos. Para ello uno de cada dos cebadores es un cebador antisentido. Se delecionan sitios de restricción dentro de los oligonucleótidos necesarios para la clonación posterior.
Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótidos, dependiendo del número de cebadores que se necesitan para abarcar la secuencia V completa.
Se mezclan estos por ejemplo seis cebadores en cantidades ¡guales (por ejemplo 1 pl de cada cebador (disoluciones madre de cebadores de 20 a 100 pM) con respecto a 20 pl de reacción PCR) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón para PCR, nucleótidos y Taq polimerasa. Se incuba esta mezcla a 94°C durante 3 minutos, 65°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, 59°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y a 72°C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesís en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 pares de bases del gel según métodos convencionales.
Después se usa este producto de PCR como molde para una reacción PCR convencional usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. Se aísla fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH de aproximadamente 350 nucleótidos) mediante electroforesís en gel de agarosa según métodos convencionales. De esta manera se amplifica suficiente fragmento de ADN de VH. Este fragmento de VH es ahora una combinación de fragmentos de VH que tienen cada uno una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las posiciones de región de marco diferentes respectivas (combinación de VH humanizada). Se realiza el mismo procedimiento para la región VL del scFv murino anti-FAPalfa frente a un epítopo diana proximal a la membrana de FAPalfa humana (combinación de VL humanizada).
Después se combina la combinación de VH humanizada con la combinación de VL humanizada en el vector de presentación en fago pComb3H5Bhis para formar una biblioteca de scFv funcionales de la que se seleccionan, después de la presentación en fago filamentoso, elementos de unión antí-FAPalfa frente a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana, se examinan, se identifican y se confirman tal como se describió anteriormente para el scFv no humano (murino) parental antí-FAPalfa. Luego se analizan clones individuales para determinar propiedades y secuencia de aminoácidos favorables. Se prefieren aquellos scFv que son más próximos en cuanto a la homología de secuencia de aminoácidos a segmentos V de línea germinal humana.
Se convierten scFv anti-FAPalfa humanos/humanizados frente a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana en anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla recombinantes y se caracterizan adícíonalmente tal como sigue.
6.11 Generación de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana
Se convierten scFv anti-FAPalfa frente a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana con propiedades y secuencia de aminoácidos favorables en anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla recombinantes uniéndolos a través de un Gly4Seri-ligador con el I2C de scFv específico de CD3 (SEQ ID NO: 185) para dar como resultado constructos con la disposición de dominios V H FAPaifa -(Gly4Seri)3 - V L FAPaifa - SeriGly4Ser-i - V H Cd3 -(Gly4Ser-i)3 - V L c d 3.
Se diseñaron anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana tal como se expone en la siguiente tabla 5:
Tabla 5: Formatos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana
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Alternativamente pueden generarse constructos adicionales con diferentes disposiciones de dominios según protocolos convencionales. Para la expresión en células CHO las secuencias codificantes de (I) una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobullna N-terminal que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak y (¡I) una cola Hls6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unen ambos en marco a la secuencia de nucleótldos que codifica para los anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla antes de la Inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtiene mediante síntesis génlca en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se Induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
6.12 Expresión y purificación de moléculas de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla dirigidas a epítopos diana proxlmales a la membrana de FAPalfa humana
Se expresan moléculas de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla en células de ovarlo de hámster chino (CHO). Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica de los constructos mediante adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se recoge sobrenadante de cultivo celular y se usa en los experimentos posteriores. Para generar sobrenadante para purificación después de dos pases de cultivo estacionario se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronlc F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente, se expresan transitoriamente constructos en células HEK 293. Se realiza la transfecclón con reactivo 293fectln (Invitrogen, n.° 12347-019) según el protocolo del fabricante. Además se expresan alternativamente los constructos en células CHO deficientes en DHFR transfectadas transitoriamente usando por ejemplo reactivo de transfección FuGENE® HD (Roche Diagnostics GmbH, n.° de cat. 04709691001) según el protocolo del fabricante.
Se usan el sistema Akta® Explorer (GE Health Systems) y el software Unicom® para cromatografía. Se realiza cromatografía de afinidad por metales Inmovilizados (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se carga con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 mi) a la columna (10 mi) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se lava la columna con tampón A para eliminar muestra no unida. Se eluye la proteína unida usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M, ¡mldazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: el 20% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: el 100% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Se combinan las fracciones de proteína eluldas de la etapa 2 para purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad para Investigación y se adquieren de Slgma (Delsenhofen) o Merck (Darmstadt).
Se realiza cromatografía de filtración en gel en una columna de calidad preparativa HILoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equl. (cltrato 25 mM, Usina 200 mM, gllcerol al 5%, pH 7,2). Se someten las muestras de proteína eluldas (velocidad de flujo de 1 ml/min) a SDS-PAGE convencional e inmunotransferencia de tipo Western para la detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Se determinan concentraciones de proteínas usando DO 280 nm.
Se analiza la proteína de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla purificada en SDS PAGE en condiciones reductoras realizadas con geles de Bis Tris al 4-12% de colada previa (Invitrogen). Se realizan la preparación de muestras y la aplicación según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determina el peso molecular con patrón de proteínas MultIMark (Invitrogen). Se tiñe el gel con Coomassle coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada es normalmente >95% tal como se determina mediante SDS-PAGE.
El anticuerpo blespecífico de cadena sencilla tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas tal como se determina mediante filtración en gel en PBS.
Se realiza Inmunotransferencia de tipo Western usando una membrana Optltran® BA-S83 y el módulo de transferencia de Invitrogen según el protocolo proporcionado por el fabricante. El anticuerpo usado se dirige contra la cola de His (Penta His, Qiagen) y se usa una Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) como reactivo de segunda etapa, y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Una banda detectada a 52 kD corresponde a anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla purificados.
6.13 Análisis de unión mediante cltometría de flujo de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana
Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de constructos de anticuerpos biespecíficos con respecto a la capacidad para unirse a CD3 y a FAPalfa humana, respectivamente, se realiza un análisis de FACS. Con este fin se usan células CHO transfectadas con FAPalfa humana tal como se describió en el ejemplo 6.1 y la línea celular de leucemia de células T positivas para CD3 humano HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483). Se Incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa sobrenadante de células no transfectadas como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Sólo se seleccionan para su uso adicional aquellos constructos que muestran unión biespecífica a CD3 humano así como a FAPalfa humana.
La unión biespecífica de las moléculas de cadena sencilla indicadas anteriormente pudo detectarse claramente tal como se muestra en la figura 11. En el análisis de FACS todos los constructos mostraron unión a CD3 humano y a FAPA humana en comparación con el control negativo.
6.14 Bloactivldad de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana
Se analiza la bioactivldad de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las células CHO transfectadas con FAPalfa humana descritas en el ejemplo 6.1. Para confirmar que sólo se recluta bioactividad significativa mediante unión a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana se usan, además, células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa murina tal como se describió en el ejemplo 6.3 y células CHO que expresan el antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describió en el ejemplo 6.4. Como células efectoras se usan PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas.
Se obtienen PBMC humanas estimuladas de la siguiente manera:
Se recubre una placa Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se elimina proteína no unida mediante una etapa de lavado con PBS. Se aíslan las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Flcoll según protocolos convencionales. Se añaden 3-5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-220 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. En el tercer día se recogen las células y se lavan una vez con RPMI 1640. Se añade IL 2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivan de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales se enriquecen linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+.
Se lavan las células diana dos veces con PBS y se marcan con 11,1 MBq de 51Cren un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavan las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usan en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realiza en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl de RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de E:T de 10:1. Se aplican sobrenadante de células que expresan las moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla en una concentración final del 6,6% y 14 diluciones triples del mismo. El tiempo de ensayo es de 18 horas. Se mide la citotoxicidad como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se realizan por cuadruplicado. Se realiza la medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes con un contador gamma Wlzard 3” (Perkln Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realiza el análisis de los datos experimentales con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas tienen normalmente valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software. Sólo se seleccionan para su uso adicional aquellos constructos que muestran potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras contra células diana positivas para FAPalfa. Tal como se muestra en la figura 12 todos los anticuerpos blespecíficos generados dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana demostraron actividad citotóxica contra células diana positivas para FAPA humana y células diana positivas para el antígeno de FAPalfa humana mutado con epítopos dlstales a la membrana murlnos provocado por PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas pero no reclutaron actividad citotóxica significativa contra células diana positivas para FAPalfa murina. De ese modo se confirmó el reclutamiento específico de actividad citotóxica mediante unión a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana.
6.15 Generación de células CHO que expresan FAPalfa de macaco
Se obtiene la secuencia de ADNc de FAPalfa de macaco mediante un conjunto de cuatro PCR con ADNc de piel de mono macaco preparado según protocolos convencionales. Se usan las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94°C durante 3 minutos seguido por 40 ciclos con 94°C durante 0,5 minutos, 56°C durante 0,5 minutos y 72°C durante 3 minutos seguido por un ciclo terminal de 72°C durante 3 minutos y los siguientes cebadores:
1. cebador directo: 5’-cagcttccaactacaaagacagac-3’ SEQ ID NO: 376
cebador inverso: 5’-tttcctcttcataaacccagtctgg-3’ SEQ ID NO: 377
2. cebador directo: 5’-ttgaaacaaagaccaggagatccacc-3’ SEQ ID NO: 378
cebador inverso: 5’-agatggcaagtaacacacttcttgc-3’ SEQ ID NO: 379
3. cebador directo: 5'-gaagaaacatctacagaattagcattgg-3' SEQ ID NO: 380
cebador inverso: 5’-cacatttgaaaagaccagttccagatgc-3’ SEQ ID NO: 381
4. cebador directo: 5'-agattacagctgtcagaaaattcatagaaatgg-3' SEQ ID NO: 382
cebador inverso: 5’-atataaggttttcagattctgatacaggc-3’ SEQ ID NO: 383
Estas PCR generan cuatro fragmentos solapantes, que se aíslan y secuencian según protocolos convencionales usando los cebadores de PCR, y de ese modo proporcionan la secuencia de ADNc que codifica para FAPalfa de macaco. Para generar un constructo para la expresión de FAPalfa de macaco se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génlca según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 384 y 385). Este constructo contiene la secuencia codificante completa de FAPalfa de macaco seguida por un codón de terminación. También se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener un sitio de Kozak para la expresión en eucaríotas del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento que contiene el ADNc. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génlca a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
6.16 Análisis mediante cltometría de flujo de especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana
Con el fin de someter a prueba la especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de FAPalfa humana se Investiga la capacidad de los constructos para unirse a FAPalfa de macaco y CD3 de macaco, respectivamente, mediante análisis de FACS. Con este fin se usan las células CHO transfectadas con FAPalfa de macaco tal como se describió en el ejemplo 6.15 y la línea de células T de macaco 4119LnPx (amablemente proporcionada por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuemberg; publicada en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se Incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos blespecíficos específicos entre especies. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo murlno frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan anticuerpos antl-HIs unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dlanova) conjugado con ficoerltrlna, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa sobrenadante de células no transfectadas como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols ¡n Immunology (Coligan, Krulsbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión específica entre especies de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente pudo detectarse claramente tal como se muestra en la figura 11. En el análisis de FACS todos los constructos mostraron unión a CD3 de macaco y FAPA de macaco en comparación con el control negativo.
7. Generación de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de c-MET humano
7.1 Generación de células CHO que expresan c-MET humano
Se obtiene la secuencia codificante de c-MET humano tal como se publica en GenBank (número de registro NM 000245) mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de c-MET humano y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 368 y 387). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se eliminan sitios de restricción mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génlca. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum etal. Cáncer Immunol Immunother50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se Induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
7.2 Generación de una proteína de fusión de c-MET humano soluble
Se usa la secuencia codificante modificada de c-MET humano tal como se describió en el ejemplo 7.1 para la construcción de una secuencia de ADNc artificial que codifica para una proteína de fusión soluble de c-MET humano y Fe de lgG1 murina. Para generar un constructo para la expresión de la proteína de fusión de c-MET humano soluble se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génlca según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 388 y 389). Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de c-MET humano desde el aminoácido 1 hasta el 932 correspondiente al péptldo señal y los dominios extracelulares de c-MET humano, seguido en marco por la secuencia codificante de un Seri-Gly4-Ser-i-ligador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante de la región de bisagra y la parte de Fc-gamma de lgG1 murina, seguido en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génlca a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo todos los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente se usa un clon del plásmido de expresión con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia para transfecclón y expresión de proteína en el sistema de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karisruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se obtiene sobrenadante que contiene la proteína expresada, se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante a -20°C.
Para la purificación de la proteína de fusión de c-MET humano soluble se prepara una columna de afinidad de Fe de cabra anti-ratón según protocolos convencionales usando un anticuerpo específico de fragmento Fe de IgG de cabra antl-ratón purificado por afinidad comercial mente disponible con reacción cruzada mínima frente a proteínas séricas humanas, bovinas y equinas (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Usando esta columna de afinidad se aísla la proteína de fusión fuera del sobrenadante de cultivo celular en un sistema Akta Explorer (GE Amersham) y se eluye mediante ácido cítrico. Se neutraliza y se concentra el eluato.
7.3 Generación de células CHO que expresan c-MET murino
Se usa la secuencia de c-MET murino (NM 008591 proto-oncogén met de Mus musculus (Met), ARNm, Centro Nacional para Información Blotecnológica, http://www.ncbi.nlm.nlh.gov/entrez) para obtener una molécula de ADNc sintética mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobullna que comprende un codón de iniciación incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG, seguido en marco por la secuencia codificante completa del c-MET murino maduro (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 390 y 391). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3' (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se eliminan sitios de restricción internos mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génlca. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se induce amplificación génlca para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
7.4 Generación de células CHO que expresan un antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobulina que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG, seguido en marco por la secuencia codificante de la cadena alfa del dominio sema de c-MET murino maduro seguido en marco por c-MET humano de la cadena beta del dominio sema hasta el codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 392 y 393). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3' (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se eliminan sitios de restricción Internos mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génlca. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génlca para expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
7.5 Generación de células CHO que expresan un antígeno c-MET murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno c-MET murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobulina que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG, seguido en marco por la secuencia codificante de la cadena alfa del dominio sema de c-MET humano maduro, seguido en marco por c-MET murino de la cadena beta del dominio sema hasta el codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 394 y 395). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3' (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se eliminan sitios de restricción Internos medíante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génlca. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada medíante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génlca para expresión de antígeno aumentada medíante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
7.6 Inmunización de ratones usando una proteína de fusión de c-MET humano soluble
Se Inmunizan ratones F1 de doce semanas de edad de cruces BALB/c x C57BL/6 con la proteína de fusión de c-MET humano soluble tal como se describió en el ejemplo 7.2. Para ello para cada animal se mezclan 40 pg de la proteína de fusión de c-MET humano soluble con 10 nmol de un CpG-oligonucleótido modificado con tioato (5’-tccatgacgttcctgatgct-3’) en 300 pl de PBS y se inyectan por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21, 42 y opclonalmente 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se extraen muestras de sangre y se someten a prueba los títulos séricos de anticuerpo contra c-MET humano mediante citometría de flujo según protocolos convencionales. Para ello se incuban 200.000 células de las células CHO transfectadas con c-MET humano tal como se describe en el ejemplo 7.17 durante 30 min sobre hielo con 50 pl de suero de los animales inmunizados diluido 1:1000 en PBS con FCS al 2%. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión de anticuerpos séricos con un anticuerpo específico de Fc-gamma de ratón (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa suero de los animales obtenido antes de la inmunización como control negativo. Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson blosclences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Se usan animales que demuestran reactividad en suero significativa contra c-MET humano tal como se determina mediante el análisis de FACS en el experimento posterior.
7.7 Generación de una biblioteca de scFV de anticuerpos murinos inmunitarios: Construcción de una biblioteca de anticuerpos combinatoria y presentación en fago
Tres días después de la última inmunización de refuerzo se recogen esplenocltos de animales reactivos para la preparación de ARN total según protocolos convencionales.
Se construye una biblioteca de fragmentos de ADN de reglón variable de cadena pesada (VH) de Ig y reglón variable de cadena ligera (kappa) (VK) de inmunoglobulina (Ig) murina mediante RT-PCR con ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetiza ADNc según protocolos convencionales, véase el ejemplo 2.7.
Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Después se transforma la biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante en 300 pl de células de Escheríchia cotí XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm, Gene-pulser de Biorad) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones Independientes. Después de una hora de expresión de fenotipo, se seleccionan transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BH¡s en 100 mi de cultivo en Super Broth (SB) líquido durante la noche. Después se recogen las células mediante centrifugación y se lleva a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligan 2800 ng de este ADN de plásmido que contiene la biblioteca de VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transforman de nuevo en dos alícuotas de 300 pl de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño de biblioteca de scFv de VH-VK total (fragmento variable de cadena sencilla) de más de 107 clones Independientes.
Después de la expresión de fenotipo y lenta adaptación a carbenicilina, se transfieren las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos en medio de selección de SB-carbeniclllna (SB con carbenicilina 50 pg/ml). Después se infectan las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos con una dosis Infecciosa de 1012 partículas de fago cooperador VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fago M13 filamentoso, en el que cada partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHIs monocatenario que codifica para un fragmento de scFv murino y presenta la proteína de scFv correspondiente como fusión de traducción con una proteína de recubrimiento de fago III. Más tarde se usa esta combinación de fagos que presenta la biblioteca de anticuerpos para la selección de entidades de unión a antígeno.
7.8 Selección basada en presentación en fago de elementos de unión a diana proximales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos
Se recoge la biblioteca de fagos que porta el repertorio de scFv clonado del sobrenadante de cultivo respectivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden aproximadamente de 1011 a 1012 partículas de fago de scFv en 0,4 mi de PBS/BSA al 0,1% y se incuban con de 105 a 107 células CHO que expresan el antígeno c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 7.17 durante 1 hora sobre hielo con agitación lenta. Se hacen crecer previamente estas células CHO, se recogen mediante centrifugación, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Se eliminan fagos de scFv que no se unen específicamente a las células CHO mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Después de lavar, se eluyen entidades de unión de las células resuspendlendo las células en HCI-glIcIna pH 2,2 (Incubación de 10 mln con posterior agitación con vértex) y después de la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usa el eluato para la Infección de un cultivo de E. coliXL1 Blue sin infectar reciente (DO600 > 0,5). Se selecciona de nuevo el cultivo de E. coli que contiene células de E. coli satisfactoriamente transducidas con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento de scFv murino, por su resistencia a carbenicilina y posteriormente se Infecta con fago cooperador VCMS 13 para comenzar la segunda ronda de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente se lleva a cabo un total de 4 a 5 rondas de selecciones.
7.9 Examen para detectar elementos de unión a diana proxlmales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno c-MET humano, el antígeno c-MET murino, el antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murlnos y el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos
Se aísla ADN de plásmldo correspondiente a 4 y 5 rondas de cribado a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína de scFv soluble, se escinden fragmentos de ADN de VH-VL de los plásmldos (Xhol-Spel). Se clonan estos fragmentos a través de los mismos sitios de restricción en el plásmldo pComb3H5BFIag/His que se diferencia del pComb3H5BHis original en que el constructo de expresión (por ejemplo scFv) incluye una etiqueta Flag (TGDYKDDDDK) entre el scFv y la cola His6 y se delecionan las proteínas de fago adicionales. Después de la ligación, se transforma cada combinación (diferentes rondas de cribado) de ADN de plásmido en 100 pl de E. coli TG1 o XLI blue competentes para choque térmico y se siembran en placa sobre carbenlclllna-agar LB. Se escogen colonias Individuales en 100 pl de LB-carb (LB con carbenicilina 50 pg/ml).
Después de la inducción con IPTG 1 mM, E. coli transformadas con pComb3H5BFIag/His que contiene un segmento de VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes. Debido a una secuencia señal adecuada, el scFv se exporta al Interior del periplasma en el que se pliega en una conformación funcional.
Se escogen colonias bacterianas de E. coli Individuales a partir de las placas de transformación para preparaciones periplasmáticas a pequeña escala y se hacen crecer en medio SB (por ejemplo 10 mi) complementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 pg/ml y se redisuelven en PBS (por ejemplo 1 mi) después de la recogida. Se aplica un choque de temperatura mediante cuatro rondas de congelación a -70°C y descongelación a 37°C mediante lo cual se destruye la membrana exterior de las bacterias y se liberan las proteínas periplasmáticas solubles Incluyendo los scFv en el sobrenadante. Después de la eliminación de células Intactas y residuo celular mediante centrifugación, se recoge el sobrenadante que contiene los scFv murlnos antl-c-MET humano y se usa para examen adicional.
Se realiza examen de los scFV aislados para detectar elementos de unión a diana proxlmales a la membrana mediante cltometría de flujo con células CHO que expresan el antígeno c-MET humano tal como se describe en el ejemplo 7.17, el antígeno c-MET murino tal como se describe en el ejemplo 7.17, el antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 7.17 y el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos tal como se describe en el ejemplo 7.17.
Para la citometría de flujo se incuban 2,5x105 células de las líneas celulares respectivas con 50 pl de sobrenadante. Se detecta la unión de los constructos con un anticuerpo anti-His (anticuerpo frente a penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa se usa un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón (específica de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, RFA). Se miden las muestras con un instrumento FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Sólo se seleccionan para su uso adicional constructos que muestran unión a células CHO que expresan el antígeno c-MET humano y muestran unión a células CHO que expresan el antígeno c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos y no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno c-MET murino y además no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos.
Se generaron scFv específicos para epítopos proxlmales a la membrana de c-MET humano tal como se describió anteriormente y se designan tal como se expone en la siguiente tabla 6:
Tabla 6: Designación de fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla
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La unión a diana proximal a la membrana de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente pudo detectarse claramente tal como se muestra en la figura 16. En el análisis de FACS todos los constructos mostraron unión al antígeno c-MET humano y mostraron unión al antígeno c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos y no mostraron unión al antígeno c-MET murino y tampoco mostraron unión al antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos en comparación con el control negativo.
7.10 Generación de equivalentes humanos/humanizados de scFv no humanos frente a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano
Se alinea la región VH de un scFv murino anti-c-MET frente a un epítopo diana proximal a la membrana de c-MET humano contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpo humano. Se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano que tiene la homología más próxima con la VH no humana y se realiza una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Hay varios residuos de reglón de marco de la VH no humana que se diferencian de las reglones de marco de VH humana (“diferentes posiciones de reglón de marco”). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y actividad del anticuerpo frente a su diana.
Para construir una biblioteca que contiene las CDR murinas y en cada posición de reglón de marco que se diferencia de la secuencia de VH humana elegida ambos residuos posibles (el residuo de aminoácido humano y el murino materno), se sintetizan oligonucleótidos degenerados. Estos oligonucleótidos incorporan en las posiciones diferentes el residuo humano con una probabilidad del 75% y el residuo murino con una probabilidad del 25%. Para una VH humana, por ejemplo, tienen que sintetizarse seis de estos oligonucleótidos que se solapan en un tramo terminal de aproximadamente 20 nucleótldos. Para ello uno de cada dos cebadores es un cebador antlsentldo. Se deleclonan sitios de restricción dentro de los oligonucleótidos necesarios la clonación posterior.
Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótldos, dependiendo del número de cebadores que se necesitan para abarcar la secuencia V completa.
Se mezclan estos por ejemplo seis cebadores en cantidades ¡guales (por ejemplo 1 pl de cada cebador (disoluciones madre de cebadores de 20 a 100 pM) con respecto a 20 pl de reacción PCR) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón para PCR, nucleótldos y Taq polimerasa. Se incuba esta mezcla a 94°C durante 3 minutos, 65°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, 59°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y a 72°C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesls en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 pares de bases del gel según métodos convencionales.
Después se usa este producto de PCR como molde para una reacción PCR convencional usando cebadores que Incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. Se aísla fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH de aproximadamente 350 nucleótldos) mediante electroforesis en gel de agarosa según métodos convencionales. De esta manera se amplifica suficiente fragmento de ADN de VH. Este fragmento de VH es ahora una combinación de fragmentos de VH que tienen cada uno una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las posiciones de reglón de marco diferentes respectivas (combinación de VH humanizada). Se realiza el mismo procedimiento para la región VL del scFv murino anti-c-MET frente a un epítopo diana proximal a la membrana de c-MET humano (combinación de VL humanizada).
Después se combina la combinación de VH humanizada con la combinación de VL humanizada en el vector de presentación en fago pComb3H5Bhis para formar una biblioteca de scFv funcionales de la que se seleccionan, después de presentación en fago filamentoso, elementos de unión antl-c-MET frente a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano, se examinan, se identifican y se confirman tal como se describió anteriormente para el scFV no humano (murino) parental antl-c-MET. Luego se analizan clones Individuales para determinar propiedades y secuencia de aminoácidos favorables. Se prefieren aquellos scFv que son más próximos en cuanto a la homología de secuencia de aminoácidos a segmentos V de línea germinal humana.
Se convierten scFv humanos/humanizados anti-c-MET frente a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano en anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla recomblnantes y se caracterizan adlclonalmente tal como sigue.
7.11 Generación de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano
Se convierten scFv anti-c-MET frente a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano con propiedades y secuencia de aminoácidos favorables en anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla recomblnantes uniéndolos a través de un GlyíSen-ligador con el I2C de scFv específico de CD3 (SEQ ID NO: 185) para dar como resultado constructos con la disposición de dominios VHc-met -(Gly4Ser-i)3 - VLc-met - SenGIyíSen - VHcd3 -(G ly4 S er-i)3 - V L c d 3
Se diseñaron anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano tal como se expone en la siguiente tabla 7:
Tabla 7: Formatos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano
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Alternativamente pueden generarse constructos adicionales con diferentes disposiciones de dominios según protocolos convencionales. Para la expresión en células CHO las secuencias codificantes de (i) una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobulina N-terminal que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak y (¡I) una cola Hls6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unen ambos en marco a la secuencia de nucleótidos que codifica para los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla antes de la Inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtiene mediante síntesis génlca en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
7.12 Expresión y purificación de moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidas a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano
Se expresan moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla en células de ovario de hámster chino (CHO). Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica de los constructos mediante adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario se recoge sobrenadante de cultivo celular y se usa en los experimentos posteriores. Para generar sobrenadante para purificación después de dos pases de cultivo estacionario se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamlna 4,0 mM con Pluronlc F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente, se expresan transitoriamente constructos en células HEK 293. Se realiza la transfección con reactivo 293fectin (Invitrogen, n.° 12347-019) según el protocolo del fabricante. Además se expresan alternativamente los constructos en células CHO deficientes en DHFR transfectadas transitoriamente usando por ejemplo reactivo de transfección FuGENE® HD (Roche Diagnostics GmbH, n.° de cat. 04709691001) según el protocolo del fabricante.
Se usan el sistema Akta® Explorer (GE Health Systems) y el software Unicom® para cromatografía. Se realiza cromatografía de afinidad por metales Inmovilizados (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se carga con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 mi) a la columna (10 mi) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se lava la columna con tampón A para eliminar muestra no unida. Se eluye la proteína unida usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M, ¡mldazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: el 20% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: el 100% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Se combinan las fracciones de proteína eluidas de la etapa 2 para purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad para Investigación y se adquieren de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
Se realiza cromatografía de filtración en gel en una columna de calidad preparativa HILoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equi. (citrato 25 mM, Usina 200 mM, gllcerol al 5%, pH 7,2). Se someten las muestras de proteína eluidas (velocidad de flujo de 1 ml/min) a SDS-PAGE convencional e inmunotransferencia de tipo Western para la detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Se determinan concentraciones de proteínas usando DO 280 nm.
Se analiza la proteína de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla purificada en SDS PAGE en condiciones reductoras realizadas con geles de Bis Tris al 4-12% de colada previa (Invitrogen). Se realizan la preparación de muestras y la aplicación según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determina el peso molecular con patrón de proteínas MultIMark (Invitrogen). Se tiñe el gel con Coomassle coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada es normalmente >95% tal como se determina mediante SDS-PAGE.
El anticuerpo blespecífico de cadena sencilla tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas tal como se determina mediante filtración en gel en PBS.
Se realiza ¡nmunotransferencla de tipo Western usando una membrana Optltran® BA-S83 y el módulo de transferencia de Invitrogen según el protocolo proporcionado por el fabricante. El anticuerpo usado se dirige contra la cola de His (Penta His, Qiagen) y se usa una Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) como reactivo de segunda etapa, y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Una banda detectada a 52 kD corresponde a anticuerpos blespecíflcos de cadena sencilla purificados.
7.13 Análisis de unión mediante cltometría de flujo de anticuerpos blespecíflcos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano
Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de constructos de anticuerpos blespecíflcos con respecto a la capacidad para unirse a CD3 y a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano, respectivamente, se realiza un análisis de FACS. Con este fin se usan células CHO transfectadas con c-MET humano tal como se describe en el ejemplo 7.17 y la línea celular de leucemia de células T positivas para CD3 humano HPB-ALL (DSMZ, Braunschwelg, ACC483). Para la confirmación de la unión a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano se usan, además, células CHO que expresan el antígeno c-MET murlno tal como se describe en el ejemplo 7.17, células CHO que expresan el antígeno c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 7.17 y células CHO que expresan el antígeno c-MET murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos tal como se describe en el ejemplo 7.17. Se incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa sobrenadante de células no transfectadas como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols ¡n Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulles, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Sólo se seleccionan para su uso adicional aquellos constructos que muestran unión blespecífica a CD3 humano así como a c-MET humano y no se unen ni al antígeno c-MET murino ni al antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos.
La unión blespecífica de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente pudo detectarse claramente tal como se muestra en la figura 13. En el análisis de FACS todos los constructos mostraron unión a CD3 humano y c-MET humano en comparación con el control negativo. La unión a diana proxlmal a la membrana de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente pudo detectarse claramente tal como se muestra en la figura 14. En el análisis de FACS todos los constructos mostraron unión al antígeno c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos y no mostraron unión al antígeno c-MET murino y además no mostraron unión al antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos en comparación con el control negativo. Se confirmó la expresión de los antígenos c-MET mediante detección con un anticuerpo M2 anti-FLAG tal como se describe en el presente documento. En el análisis de FACS también mostrado en la figura 14, células CHO transfectadas con el antígeno c-MET murino, el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos y el antígeno c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos, respectivamente, mostraron expresión comparable de los antígenos tal como se detecta con el anticuerpo anti-FLAG.
7.14 Bloactlvldad de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano
Se analiza la bloactlvldad de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las células CHO transfectadas con c-MET humano descritos en el ejemplo 7.17. Para confirmar que sólo se recluta bloactlvldad significativa mediante unión a epítopos diana proximales a la membrana de c-MET humano se usan, además, células CHO que expresan c-MET murino y el antígeno c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos, respectivamente, ambos tal como se describe en el ejemplo 7.17. Como células efectoras se usan PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas.
Se obtienen PBMC humanas estimuladas de la siguiente manera:
Se recubre una placa Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se elimina proteína no unida mediante una etapa de lavado con PBS. Se aíslan las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Ficoll según protocolos convencionales. Se añaden 3-5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-220 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. En el tercer día se recogen las células y se lavan una vez con RPMI 1640. Se añade IL 2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivan de nuevo las células durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente.
Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales se enriquecen linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+.
Se lavan las células diana dos veces con PBS y se marcan con 11,1 MBq de 51Cren un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavan las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usaron en el ensayo de cltotoxlcldad. El ensayo se realiza en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl de RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de E:T de 10:1. Se aplican sobrenadante de células que expresan las moléculas de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla en una concentración final de 50% y 20 diluciones triples del mismo. El tiempo de ensayo es de 18 horas. Se mide la cltotoxlcldad como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las mediciones se realizan por cuadruplicado. Se realiza la medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes con un contador gamma Wlzard 3” (Perkln Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realiza el análisis de los datos experimentales con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas tienen normalmente valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software. Sólo se seleccionan para su uso adicional aquellos constructos que muestran potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras contra células diana positivas para c-MET.
Tal como se muestra en la figura 15 todos los anticuerpos blespecíficos generados dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de c-MET humano demostraron actividad citotóxica contra células diana positivas para c-MET humano provocado por PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas pero no reclutaron actividad citotóxica significativa contra células diana positivas para c-MET murlno y células diana positivas para el antígeno c-MET murlno mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos. De ese modo se confirmó el reclutamiento específico de actividad citotóxica a través de unión a epítopos diana proxlmales a la membrana de c-MET humano.
7.15 Generación de células CHO que expresan c-MET de macaco
Se obtiene la secuencia de ADNc de c-MET de macaco mediante un conjunto de 5 PCR con ADNc de hígado de mono macaco preparado según protocolos convencionales. Se usan las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos seguido por 40 ciclos con 94°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto y 72°C durante 3 minutos seguido por un ciclo terminal de 72°C durante 3 minutos y los siguientes cebadores:
1. cebador directo: 5’-aggaattcaccatgaaggcccccgctgtgcttgcacc-3’ SEQ ID NO: 396
cebador inverso: 5’-ctccagaggcatttccatgtagg-3’ SEQ ID NO: 397
2. cebador directo: 5’-gtccaaagggaaactctagatgc-3’ SEQ ID NO: 398
cebador inverso: 5’-ggagacactggatgggagtccagg-3’ SEQ ID NO: 399
3. cebador directo: 5’-catcagagggtcgcttcatgcagg-3’ SEQ ID NO: 400
cebador inverso: 5’-gctttggttttcagggggagttgc-3’ SEQ ID NO: 401
4. cebador directo: 5’-atccaaccaaatcttttattagtggtgg-3’ SEQ ID NO: 402
cebador inverso: 5’-gacttcattgaaatgcacaatcagg-3’ SEQ ID NO: 403
5. cebador directo: 5’-tgctctaaatccagagctggtcc-3’ SEQ ID NO: 404
cebador inverso: 5’-gtcagataagaaattccttagaatcc-3’ SEQ ID NO: 405
Estas PCR generan cinco fragmentos solapantes, que se aíslan y secuencian según protocolos convencionales usando los cebadores de PCR, y de ese modo proporcionan una parte de la secuencia de ADNc que codifica para c-MET de macaco desde el codón 10 del péptldo líder hasta el último codón de la proteína madura. Para generar un constructo para la expresión de c-MET de macaco se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génlca según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 406 y 407). En este constructo la secuencia codificante de c-MET de macaco desde el aminoácido 10 del péptido líder hasta el último aminoácido de la proteína de c-MET madura seguido por un codón de terminación se fusiona en marco con la secuencia codificante de los aminoácidos 1 a 9 del péptldo líder de la proteína de c-MET humano. También se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener un sitio de Kozak para la expresión en eucarlotas del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento que contiene el ADNc. Los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se eliminan sitios de restricción Internos mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génlca. Se clona el fragmento de síntesis génlca a través de EcoRI y Salí en un plásmldo denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
7.16 Análisis mediante cltometría de flujo de especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de c-MET humano
Con el fin de someter a prueba la especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de c-MET humano se Investiga la capacidad de los constructos para unirse a c-MET de macaco y CD3 de macaco, respectivamente, mediante análisis de FACS. Con este fin se usan las células CHO transfectadas con c-MET de macaco tal como se describe en el ejemplo 7.17 y la línea de células T de macaco 4119LnPx (amablemente proporcionada por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Eriangen- Nuemberg; publicada en Knappe A, etal., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos blespecíficos específicos entre especies. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo murino frente a penta-His (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dlanova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa sobrenadante de células no transfectadas como control negativo. Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan la tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-Interscience, 2002).
La unión específica entre especies de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente pudo detectarse claramente tal como se muestra en la figura 13. En el análisis de FACS todos los constructos mostraron unión a CD3 de macaco y c-MET de macaco en comparación con el control negativo.
7.17 Generación de células CHO con expresión potenciada de dominios extracelulares de c-MET humano, c-MET de macaco, c-MET murino, c-MET murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos y c-MET humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos, respectivamente
Se usan las secuencias codificantes modificadas de c-MET humano, c-MET de macaco, c-MET murino, c-MET murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos y c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos tal como se describió anteriormente para la construcción de secuencias de ADNc artificiales que codifican para proteínas de fusión de los dominios extracelulares de c-MET humano, c-MET de macaco, c-MET murino, c-MET murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos y c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos, respectivamente, con una variante truncada de EpCAM humano. Para generar constructos para la expresión de estas proteínas de fusión de c-MET, se obtienen fragmentos de ADNc mediante síntesis génlca según protocolos convencionales (el ADNc y secuencias de aminoácidos de los constructos se indican en SEQ ID NO: 489 y 490 para c-MET humano, 491 y 492 para c-MET de macaco, 493 y 494 para c-MET murino, 495 y 496 para c-MET murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos y 497 y 498 para c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos). Se diseñan los fragmentos de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo, seguido por la secuencia codificante de un péptldo líder de ¡nmunoglobullna de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG (sólo en el caso de los constructos murino y humano mutado y murino mutado), seguido en marco por la secuencia codificante de los dominios extracelulares de c-MET humano, c-MET de macaco, c-MET murino, c-MET murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos y c-MET humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos, respectivamente, seguido en marco por la secuencia codificante de un Seri-Gly4-Seri-Glyi-l¡gador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante del dominio transmembrana y dominio ¡ntracelular de EpCAM humano (tal como se publica en GenBank; número de registro NM 002354; aminoácidos 266 a 314 [contando desde el codón de Iniciación] excepto por una mutación puntual en la posición 279 con ¡soleuclna en lugar de vallna) y un codón de terminación. También se diseñan los fragmentos de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clonan los fragmentos de síntesis génica a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se transfectan clones con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas de los constructos. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica de los constructos mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
8. Generación de anticuerpos blespecíflcos de cadena sencilla dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de endoslallna humana
8.1 Generación de células CHO que expresan endoslallna humana
Se obtiene la secuencia codificante de endoslallna humana tal como se publica en GenBank (número de registro NM 020404) mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de endoslallna humana, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta Flag y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO 408 y 409). También se diseña el fragmento de síntesis génica para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y Xbal en el extremo 3', se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de EcoRI y Xbal en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
8.2 Generación de una proteína de fusión de endosialina humana soluble
Se usa la secuencia codificante de endosialina humana tal como se describe en el ejemplo 8.1 para la construcción de una secuencia de ADNc artificial que codifica para una proteína de fusión soluble de endosialina humana y Fe de lgG1 murina. Para generar un constructo para la expresión de la proteína de fusión de endosialina humana soluble se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génica según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO 410 y 411). Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de endoslallna humana desde el aminoácido 1 hasta el 685 correspondiente al péptido señal y los dominios extracelulares de endosialina humana, seguido en marco por la secuencia codificante de un Thri-Gly4-Seri-ligador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante de la región bisagra y la parte de Fe gamma de lgG1 murina, seguida en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. También se diseña el fragmento de síntesis génica para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5’ y Xbal en el extremo 3’, se usan en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de EcoRI y Xbal en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo todos los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario, se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F - 68 al 1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente, se usa un clon del plásmido de expresión con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia para transfección y expresión de proteína en el sistema de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karisruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se obtiene sobrenadante que contiene la proteína expresada, se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante a -20°C.
Para la purificación de la proteína de fusión de endosialina humana soluble, se prepara una columna de afinidad de Fe de cabra anti-ratón según protocolos convencionales usando un anticuerpo específico de fragmento Fe de IgG de cabra anti-ratón purificado por afinidad comercialmente disponible con mínima reacción cruzada con proteínas séricas humanas, bovinas y equinas (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Usando esta columna de afinidad se aísla la proteína de fusión fuera del sobrenadante de cultivo celular con un sistema Akta Explorer (GE Amersham) y se eluye mediante ácido cítrico. Se neutraliza y se concentra el eluato.
8.3 Generación de células CHO que expresan el antígeno de endosialina murina
Se usa la secuencia de endosialina murina (NM 054042 antígeno de endosialina de Mus musculus, endosialina (Cd248), ARNm; Centro Nacional para la Información Biotecnológica, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) para obtener una molécula de ADNc sintética mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobullna que comprende un codón de iniciación incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta Flag, seguida en marco por la secuencia codificante completa de endosialina murina madura (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO 412 y 413). También se diseña el fragmento de síntesis génica para introducir sitios de restricción en el extremo 5’ (EcoRI) y en el extremo 3’ (Sal I) del fragmento de ADNc para clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se Induce amplificación génica para la expresión aumentada del antígeno mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
8.4 Generación de células CHO que expresan un antígeno de endosialina humana mutada con epítopos distales a la membrana murinos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno de endosialina humana mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobullna que comprende un codón de iniciación incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta Flag, seguida en marco por la secuencia codificante del dominio de lectlna de tipo C de endosialina murina madura seguida en marco por endosialina humana desde el dominio Sushi/SCR/CCP hasta el codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO 414 y 415). También se diseña el fragmento de síntesis génica para introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3' (Sal I) del fragmento de ADNc para clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se Induce amplificación génica para la expresión aumentada del antígeno mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
8.5 Generación de células CHO que expresan un antígeno de endosialina murina mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno de endosialina murina mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobullna que comprende un codón de iniciación incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta Flag, seguida en marco por la secuencia codificante del dominio de lectlna de tipo C de endosialina humana madura seguida en marco por endosialina murina desde el dominio Sushi/SCR/CCP hasta el codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO 416 y 417). También se diseña el fragmento de síntesis génica para introducir sitios de restricción en el extremo 5’ (EcoRI) y en el extremo 3' (Sal I) del fragmento de ADNc para clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se eliminan sitios de restricción internos mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génica. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se Induce amplificación génica para la expresión aumentada del antígeno mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
8.6 Inmunización de ratones usando una proteína de fusión de endosialina humana soluble
Se Inmunizan ratones F1 de doce semanas de edad procedentes de cruzamientos BALB/c x C57BL/6 con la proteína de fusión de endosialina humana soluble tal como se describe en el ejemplo 8.2. Para ello, para cada animal se mezclan 40 pg de la proteína de fusión de endosialina humana soluble con 10 nmol de un ollgonucleótldo CpG modificado con tioato (5’-tccatgacgttcctgatgct-3’) en 300 pl de PBS y se les inyecta por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21,42 y opclonalmente 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se extraen muestras de sangre y se someten a prueba los títulos séricos de anticuerpo contra endosialina humana mediante citometría de flujo según protocolos convencionales. Para ello, se incuban 200.000 células de las células CHO transfectadas con endosialina humana tal como se describe en el ejemplo 8.1 durante 30 min en hielo con 50 pl de suero de los animales inmunizados diluidos 1:1000 en PBS con FCS al 2%. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión de anticuerpos en suero con un anticuerpo específico de Fe gamma de ratón (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa el suero de los animales obtenido antes de la inmunización como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un instrumento FACS-Callbur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan la tinción con FACS y la medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocols ¡n Immunology (Coligan, Krulsbeek, Margulles, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Se usan los animales que demuestran una reactividad sérica significativa contra endosialina humana tal como se determina mediante el análisis de FACS en el experimento posterior.
8.7 Generación de una biblioteca de ScFv de anticuerpos murinos inmunitarios: Construcción de una biblioteca combinatoria de anticuerpos y presentación en fago
Tres días después de la última inmunización de refuerzo, se recogen esplenocltos de animales reactivos para la preparación de ARN total según protocolos convencionales.
Se construye una biblioteca de fragmentos de ADN de región variable (VK) de cadena ligera (kappa) de inmunoglobulina (Ig) y región variable (VH) de cadena pesada de Ig mediante RT-PCR con ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetiza ADNc según protocolos convencionales, véase el ejemplo 2.7.
Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Entonces se transforma la biblioteca combinatoria de anticuerpos dando como resultado 300 pl de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm, Gene-pulser de Biorad) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones Independientes. Después de una hora de expresión de fenotipo, se seleccionan transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BH¡s en 100 mi de cultivo en Super Broth (SB) líquido durante la noche. Después se recogen las células mediante centrifugación y se lleva a cabo preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligan 2800 ng de este ADN de plásmido que contiene la biblioteca de VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digerido con Xhol-BstEII) y se transforman de nuevo en dos alícuotas de 300 pl de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño de biblioteca de scFv de VH-VK total (fragmento variable de cadena sencilla) de más de 107 clones Independientes.
Después de la expresión de fenotipo y lenta adaptación a carbenicilina, se transfieren las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos a medio de selección de SB-carbenlclllna (SB con carbenicilina 50 pg/ml). Después se infectan las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos con una dosis Infecciosa de 1012 partículas de fago cooperador VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fago M13 filamentoso, en el que cada partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica para un fragmento de scFv murino y presenta la proteína de scFv correspondiente como fusión de traducción con una proteína de recubrimiento de fago III. Más tarde se usa esta combinación de fagos que presenta la biblioteca de anticuerpos para la selección de entidades de unión a antígeno.
8.8 Selección basada en presentación en fago de elementos de unión a diana proximales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno de endosialina humana mutado con epítopos distales a la membrana murinos
Se recoge la biblioteca de fagos que porta el repertorio de scFv clonado del sobrenadante de cultivo respectivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden aproximadamente de 1011 a 1012 partículas de fago de scFv en 0,4 mi de PBS/BSA al 0,1% y se incuban con de 105 a 107 células CHO que expresan el antígeno de endosialina humana mutado con epítopos dlstales a la membrana murinos tal como se describe en el ejemplo 8.4 durante 1 hora en hielo con agitación lenta. Se hacen crecer previamente estas células CHO, se recogen mediante centrifugación, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Se eliminan fagos de scFv que no se unen específicamente a las células CHO mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Después de lavar, se eluyen entidades de unión de las células resuspendlendo las células en HCI-glIcIna pH 2,2 (Incubación de 10 mln con posterior agitación con vértex) y después de la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usa el eluato para la Infección de un cultivo de E. co liX L1 Blue sin Infectar nuevo (DO600 > 0,5). Se selecciona de nuevo el cultivo de E. coli que contiene células de E. coli satisfactoriamente transducidas con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento de scFv murino, para determinar la resistencia a carbenicilina y posteriormente se Infecta con fago cooperador VCMS 13 para ¡nielar la segunda ronda de presentación de anticuerpo y selección in vitro. Normalmente se llevan a cabo un total de 4 a 5 rondas de selecciones.
8.9 Examen para elementos de unión a diana proxlmales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno de endoslallna humana, el antígeno de endoslallna murina y el antígeno de endoslallna murina mutado con epítopos distales a la membrana humanos
Se aísla ADN de plásmido correspondiente a 4 y 5 rondas de cribado de cultivos de E. coli después de selección. Para la producción de proteína de scFv soluble, se escinden fragmentos de ADN de VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Se clonan estos fragmentos a través de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFIag/Hls que difiere del plásmido original pComb3H5BHis en que el constructo de expresión (por ejemplo scFv) incluye una etiqueta Flag (TGDYKDDDDK) entre el scFv y la cola Hls6 y se deleclonan las proteínas de fago adicionales. Después de ligación, se transforma cada combinación (diferentes rondas de cribado) de ADN de plásmido ADN en 100 pl de E. coli TG1 o XLI blue competentes para choque térmico y se siembran en placa sobre carbenicilina LB-agar. Se escogen colonias Individuales en 100 pl de LB-carb (LB con carbenicilina 50 pg/ml).
Después de la inducción con IPTG 1 mM, E. coli transformadas con pComb3H5BFIag/His que contiene un segmento de VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes. Debido a una secuencia señal adecuada, el scFv se exporta al Interior del periplasma en el que se pliega en una conformación funcional.
Se escogen colonias bacterianas de E. coli Individuales a partir de las placas de transformación para preparaciones periplasmáticas a pequeña escala y se hacen crecer en medio SB (por ejemplo 10 mi) suplementado con MgCk 20 mM y carbenicilina 50 pg/ml (y se redisuelven en PBS (por ejemplo 1 mi) después de la recogida. Se aplica un choque de temperatura mediante cuatro rondas de congelación a -70°C y descongelación a 37°C mediante lo cual se destruye la membrana exterior de las bacterias y se liberan las proteínas periplasmáticas solubles Incluyendo los scFv en el sobrenadante. Después de la eliminación de células Intactas y residuo celular mediante centrifugación, se recoge el sobrenadante que contiene los scFv murinos anti-endosialina humana y se usan para examen adicional.
Se realiza examen de los scFV aislados para detectar elementos de unión a diana proxlmales a la membrana mediante cltometría de flujo con células CHO que expresan el antígeno de endoslallna humana tal como se describió en el ejemplo 8.1, el antígeno de endoslallna murina tal como se describió en el ejemplo 8.3 y el antígeno de endoslallna murina mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos tal como se describió en el ejemplo 8.5.
Para la citometría de flujo, se incuban 2,5x105 células de las líneas celulares respectivas con 50 pl de sobrenadante. Se detecta la unión de los constructos con un anticuerpo anti-His (anticuerpo frente a penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa, se usa un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón (específica del fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, RFA). Se miden las muestras con un instrumento FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Sólo se seleccionan para uso adicional los constructos que muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de endoslallna humana y no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de endoslallna murina y además no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de endoslallna murina mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos.
8.10 Generación de equivalentes humanos/humanlzados de scFv no humanos frente a epítopos diana proxlmales a la membrana de endoslallna humana
Se alinea la reglón VH de un scFv murino antl-endoslallna frente a un epítopo diana proxlmal a la membrana de endoslallna humana contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpo humano. Se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano que tiene la homología más próxima con la VH no humana y se realiza una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Hay varios residuos de reglón de marco de la VH no humana que difieren de las reglones de marco de VH humana (“diferentes posiciones de reglón de marco”). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y actividad del anticuerpo frente a su diana.
Para construir una biblioteca que contiene las CDR murinas y en cada posición de reglón de marco que difiere de la secuencia de VH humana elegida los dos posibles residuos (el residuo de aminoácido humano y murino materno), se sintetizan ollgonucleótldos degenerados. Estos ollgonucleótldos Incorporan en las posiciones diferentes el residuo humano con una probabilidad del 75% y el residuo murino con una probabilidad del 25%. Para una VH humana por ejemplo tienen que sintetizarse seis de estos ollgonucleótldos que solapan en un tramo terminal de aproximadamente 20 nucleótldos. Para ello, uno de cada dos cebadores es un cebador antlsentldo. Se deleclonan sitios de restricción dentro de los ollgonucleótldos necesarios para la clonación posterior.
Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótidos, dependiendo del número de cebadores que son necesarios para abarcar toda la secuencia V.
Se mezclan estos por ejemplo seis cebadores en cantidades ¡guales (por ejemplo 1 pl de cada cebador (disoluciones madre de cebador de 20 a 100 p.M) con respecto a 20 pl de reacción PCR) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón para PCR, nucleótidos y Taq polimerasa. Se incuba esta mezcla a 94°C durante 3 minutos, 65°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, 59°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y a 72°C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesís en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 pares de bases del gel según métodos convencionales.
Después se usa este producto de PCR como molde para una reacción PCR convencional usando cebadores que incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. Se aísla el fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH de aproximadamente 350 nucleótidos) mediante electroforesis en gel de agarosa según métodos convencionales. De esta manera se amplifica suficiente fragmento de ADN de VH. Este fragmento VH es ahora una combinación de fragmentos de VH que tienen cada uno una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las posiciones de región de marco diferentes respectivas (combinación de VH humanizada). Se realiza el mismo procedimiento para la región VL del scFv murino ant¡-endos¡al¡na frente a un epítopo diana proximal a la membrana de endosíaüna humana (combinación de VL humanizada).
Después se combina la combinación de VH humanizada con la combinación de VL humanizada en el vector de presentación en fago pComb3H5Bhis para formar una biblioteca de scFv funcionales de la que se seleccionan, después de presentación en fago filamentoso, elementos de unión ant¡-endos¡al¡na a epítopos diana proximales a la membrana de endosíaüna humana, se examinan, se identifican y se confirman tal como se describió anteriormente para el scFv anti-endosialina no humano (murino) parental. Luego se analizan clones individuales para determinar propiedades favorables y la secuencia de aminoácidos. Se prefieren aquellos scFv, que son los de homología de secuencia de aminoácidos más próxima con segmentos V de línea germinal humana.
Se convierten scFv anti-endosialina humanos/humanizados frente a epítopos diana proximales a la membrana de endosíaüna humana en anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla recombinantes y se caracterizan adícíonalmente tal como sigue.
8.11 Generación de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de endosíaüna humana
Se convierten scFV anti-endosialina frente a epítopos diana proximales a la membrana de endosíaüna humana con propiedades y secuencia de aminoácidos favorables en anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla recombinantes uniéndolos a través de un GlyíSen-ligador con el scFv específico de CD3 I2C (SEQ ID NO: 185) para dar como resultado constructos con la disposición de dominios V H endos¡ai¡na -(Gly4Ser-i)3 -V L endos¡ai¡na - S e n G Iy íS e n - V H cd 3 -(Gly4Seri)3-VLcD3- Alternativamente pueden generarse constructos adicionales con diferentes disposiciones de dominios según protocolos convencionales. Para la expresión en células CHO las secuencias codificantes de (¡) una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobuüna N-terminal que comprende un codón de iniciación incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak y (¡i) una cola His6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unen todas en marco a la secuencia de nucleótidos que codifica para los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla antes de la inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtiene medíante síntesis génica en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada medíante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo medíante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
8.12 Expresión y purificación de moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidas a epítopos diana proximales a la membrana de endosíaüna humana
Se expresan moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla en células de ovario de hámster chino (CHO). Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica de los constructos medíante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario, se recoge el sobrenadante de cultivo celular y se usa en los experimentos posteriores. Para generar sobrenadante para purificación después de dos pases de cultivo estacionario, se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente, se expresan de manera transitoria los constructos en células HEK 293. Se realiza la transfecclón con reactivo 293fectln (Invitrogen, n.° 12347-019) según el protocolo del fabricante. Además se expresan alternativamente los constructos en células CHO deficientes en DHFR transfectadas de manera transitoria usando por ejemplo el reactivo de transfección FuGENE® HD (Roche Diagnostics GmbH, n.° de cat. 04709691001) según el protocolo del fabricante. Se usan el sistema Akta® Explorer (GE Health Systems) y el software Unicom® para cromatografía. Se realiza cromatografía de afinidad por metales Inmovilizados (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se carga con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 mi) a la columna (10 mi) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se lava la columna con tampón A para eliminar muestra no unida. Se eluye la proteína unida usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M, imidazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: el 20% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: el 100% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Se combinan las fracciones de proteína eluldas de la etapa 2 para purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad para Investigación y se adquieren de Slgma (Delsenhofen) o Merck (Darmstadt).
Se realiza cromatografía de filtración en gel en una columna de calidad preparativa HILoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equl. (cltrato 25 mM, Usina 200 mM, gllcerol al 5%, pH 7,2). Se someten las muestras de proteína eluldas (velocidad de flujo de 1 ml/min) a SDS-PAGE convencional e inmunotransferencia de tipo Western para la detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Se determinan concentraciones de proteínas usando DO 280 nm.
Se analiza la proteína de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla purificada en SDS PAGE en condiciones reductoras realizadas con geles de Bis Tris al 4-12% prefabricados (Invitrogen). Se realizan la preparación y aplicación de muestras según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determina el peso molecular con el patrón de proteína MultIMark (Invitrogen). Se tiñe el gel con Coomassle coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada es normalmente >95% tal como se determina mediante SDS-PAGE.
El anticuerpo blespecífico de cadena sencilla tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas tal como se determina mediante filtración en gel en PBS.
Se realiza Inmunotransferencia de tipo Western usando una membrana Optltran® BA-S83 y el módulo de transferencia de Invitrogen según el protocolo proporcionado por el fabricante. El anticuerpo usado está dirigido contra la cola de His (penta-His, Qiagen) y se usa una Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) como reactivo de segunda etapa, y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Una banda detectada a 52 kD corresponde a anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla purificados.
8.13 Análisis de unión por cltometría de flujo de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de endoslallna humana
Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de constructos de anticuerpos blespecíficos con respecto a la capacidad para unirse a CD3 y a epítopos diana proxlmales a la membrana de endoslallna humana, respectivamente, se realiza un análisis de FACS. Para este fin, se usan células CHO transfectadas con endoslallna humana tal como se describió en el ejemplo 8.1 y la línea celular de leucemia de células T positivas para CD3 humano HPB-ALL (DSMZ, Braunschwelg, ACC483). Para confirmación de la unión a epítopos diana proxlmales a la membrana de endoslallna humana, además, se usan células CHO que expresan el antígeno de endoslallna murlna tal como se describió en el ejemplo 8.3 y células CHO que expresan el antígeno de endoslallna murlna mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos tal como se describió en el ejemplo 8.5. Se Incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos blespecíficos. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo frente a penta-His murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan los anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dlanova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa el sobrenadante de células no transfectadas como control negativo. Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocolos in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002). Sólo se seleccionan para uso adicional aquellos constructos que muestran unión blespecífica a CD3 humano así como a endoslallna humana y no se unen ni al antígeno de endoslallna murlna ni al antígeno de endoslallna murina mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos.
8.14 Bioactívidad de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de endosíaüna humana
Se analiza la bioactívidad de los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla generados mediante ensayos de cltotoxicldad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las células CHO transfectadas con endosíaüna humana descritas en el ejemplo 8.1. Como células efectoras, se usan PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas.
Las PBMC humanas estimuladas se obtienen tal como sigue:
Se recubre una placa Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercial mente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se retira la proteína no unida mediante una etapa de lavado con PBS. Se aíslan las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Flcoll según protocolos convencionales. Se añaden 3-5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-220 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogen las células y se lavan una vez con RPMI 1640. Se añade IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivan las células de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales, se enriquece en linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+.
Se lavan las células diana dos veces con PBS y se marcan con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavan las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usan en el ensayo de citotoxlcidad. Se realiza el ensayo en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl de RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de E:T de 10:1. Se aplican 1 pg/ml de molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla purificada y 20 diluciones triples de la misma. El tiempo de ensayo es de 18 horas. Se mide la citotoxlcidad como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Se realizan todas las mediciones por cuadruplicado. Se realiza la medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes con un contador gamma Wizard 3” (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realiza el análisis de los datos experimentales con Prlsm 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas normalmente tienen valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software. Se usan los valores de CE50 calculados por el programa de análisis para la comparación de la bioactivldad.
Sólo se seleccionan para uso adicional aquellos constructos que muestran un potente reclutamiento de actividad citotóxlca de células T efectoras contra células diana positivas para endosialina.
8.15 Generación de células CHO que expresan endosialina de macaco
Se obtiene la secuencia de ADNc de endosialina de macaco mediante un conjunto de 2 PCR con ADNc de colon de macaco preparado según protocolos convencionales. Se usan las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 95°C durante 5 minutos seguido por 40 ciclos con 95°C durante 45 segundos, 50°C durante 45 segundos y 72°C durante 2 minutos seguido por un ciclo terminal de 72°C durante 5 minutos y los siguientes cebadores para la primera PCR: cebador directo: 5’-atatgaattcgccaccatgctgctgcgcctgttgctggcc-3’ SEQ ID NO: 418
cebador inverso: 5’-gtcttcatcttcctcatcctcccc-3’ SEQ ID NO: 419
Se usan las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 95°C durante 5 minutos seguido por 40 ciclos con 95°C durante 45 segundos, 58°C durante 45 segundos y 72°C durante 2 minutos seguido por un ciclo terminal de 72°C durante 5 minutos y los siguientes cebadores para la segunda PCR:
cebador directo: 5’-gtcaactacgttggtggcttcgagtg-3’ SEQ ID NO: 420
cebador inverso: 5’-ggtctagatcacttatcgtcatcatctttgtagtccacgctggttctgcaggtctgc-3’ SEQ ID NO: 421
Se realizan las reacciones PCR con la adición de betaína con calidad para PCR hasta una concentración final de 1 M. Esas PCR generan dos fragmentos solapantes, que se aíslan y secuencian según protocolos convencionales usando los cebadores de PCR, y de ese modo proporcionan una parte de la secuencia de ADNc que codifica para endosialina de macaco desde el codón 9 del péptido líder hasta el codón 733 de la proteína madura. Para generar un constructo para la expresión de endosialina de macaco se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génlca según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 422 y 423). En este constructo la secuencia codificante de endosialina de macaco desde el aminoácido 9 del péptido líder hasta el aminoácido 733 de la proteína madura, seguida en marco por la secuencia codificante de aminoácido 734 hasta el último aminoácido de la proteína de endosialina humana madura, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación se fusiona en marco con la secuencia codificante de los aminoácidos 1 a 8 del péptldo líder de la proteína de endoslallna humana. También se diseña el fragmento de síntesis génica para contener un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo y sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento que contiene el ADNc. Se usan los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Xbal en el extremo 3', en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de EcoRI y Xbal en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum etal. Cáncer Immunol Immunother50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
8.16 Análisis por citometría de flujo de especificidad entre especies de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de endoslallna humana
Con el fin de someter a prueba la especificidad entre especies de anticuerpos biespecíficos dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de endoslallna humana se Investiga la capacidad de los constructos para unirse a endosialina de macaco y CD3 de macaco, respectivamente, mediante análisis de FACS. Para este fin, se usan las células CHO transfectadas con endosialina de macaco tal como se describió en el ejemplo 8.15 y la línea de células T de macaco 4119LnPx (amablemente proporcionada por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicada en Knappe A, eta l., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se Incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos biespecíficos específicos entre especies. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo frente a penta-His murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan los anticuerpos anti-HIs unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dlanova) conjugado con flcoeritrlna, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa el sobrenadante de células no transfectadas como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocolos ¡n Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
9. Generación de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano
9.1 Generación de células CHO que expresan IGF-1R humano
Se obtiene la secuencia codificante de IGF-1R humano tal como se publica en GenBank (número de registro NM 000875) mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de IGF-1R humano y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 424 y 425). También se diseña el fragmento de síntesis génica para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Se usan los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3' en los siguientes procedimientos de clonación. Se elimina un sitio de restricción Interno mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en el fragmento de síntesis génica (BspEI: nucleótido 18: de A C). Se clona el fragmento de síntesis génica a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEFDHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
9.2 Generación de una proteína de fusión de IGF-1R humano soluble
Se usa la secuencia codificante modificada de IGF-1R humano tal como se describió en el ejemplo 9.1 para la construcción de una secuencia de ADNc artificial que codifica para una proteína de fusión soluble de IGF-1R humano y Fe de lgG1 murina. Para generar un constructo para la expresión de la proteína de fusión de IGF-1R humano soluble, se obtiene un fragmento de ADNc mediante síntesis génica según protocolos convencionales (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 426 y 427). Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante de la proteína de IGF-1R humano desde el aminoácido 1 hasta el 935 correspondiente al péptido señal y dominios extracelulares de IGF-1R humano, seguido en marco por la secuencia codificante de un Seri-Gly4-Ser-i-ligador artificial, seguido en marco por la secuencia codificante de la región bisagra y la parte de Fe gamma de lgG1 murina, seguida en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Se usan los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3' en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génlca a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo todos los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario, se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronlc F - 68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente se usa un clon del plásmido de expresión con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia para transfección y expresión de proteína en el sistema de expresión FreeStyle 293 (Invltrogen GmbH, Karísruhe, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se obtiene sobrenadante que contiene la proteína expresada, se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante a -20°C. Para la purificación de la proteína de fusión de IGF-1R humano soluble, se prepara una columna de afinidad de Fe de cabra anti-ratón según protocolos convencionales usando un anticuerpo específico de fragmento Fe de IgG de cabra anti-ratón purificado por afinidad comercialmente disponible con mínima reacción cruzada con proteínas séricas humanas, bovinas y equinas (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Usando esta columna de afinidad, se aísla la proteína de fusión fuera del sobrenadante de cultivo celular con un sistema Akta Explorer (GE Amersham) y se eluye mediante ácido cítrico. Se neutraliza y se concentra el eluato
9.3 Generación de células CHO que expresan IGF-1R murino
Se usa la secuencia de IGF-1R murino (NM 010513 receptor I del factor de crecimiento similar a Insulina de Mus musculus (Igf 1 r), ARNm, Centro Nacional para Información Biotecnológica, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) para obtener una molécula de ADNc sintética mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobulina que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG, seguida en marco por la secuencia codificante completa de IGF-1R murino maduro (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 428 y 429). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3' (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol.
185, 537-566. Se induce amplificación génlca para la expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
9.4 Generación de células CHO que expresan un antígeno de IGF-1R humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno de IGF-1R humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génlca para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de ¡nmunoglobulina que comprende un codón de Iniciación Incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG, seguida en marco por la secuencia codificante del dominio L1 y el dominio rico en cisterna de IGF-1R murino maduro seguido en marco por IGF-1R humano desde el dominio L2 hasta el the codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 430 y 431). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción en el extremo 5' (EcoRI) y en el extremo 3’ (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada medíante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génica para la expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
9.5 Generación de células CHO que expresan un antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos
Se obtiene la secuencia codificante de un antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos mediante síntesis génica según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener la secuencia codificante de una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un codón de iniciación incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG, seguida en marco por el dominio L1 y el dominio rico en cisterna de IGF-1R humano maduro seguido en marco por IGF-1R murino desde el dominio L2 hasta el codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se indica en SEQ ID NO: 432 y 433). También se diseña el fragmento de síntesis génica para introducir sitios de restricción en el extremo 5’ (EcoRI) y en el extremo 3’ (Sal I) del fragmento de ADNc para su clonación en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce amplificación génica para la expresión de antígeno aumentada mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
9.6 Inmunización de ratones usando una proteína de fusión de IGF-1R humano soluble
Se inmunizan ratones F1 de doce semanas de edad procedentes de cruzamientos BALB/c x C57BL/6 con la proteína de fusión de IGF-1R humano soluble tal como se describió en el ejemplo 9.2. Para ello, para cada animal se mezclan 40 pg de la proteína de fusión de IGF-1R humano soluble con 10 nmol de un oligonucleótido CpG modificado con tioato (5’-tccatgacgttcctgatgct-3’) en 300 pl de PBS y se les inyecta por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21,42 y opcionalmente 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se extraen muestras de sangre y se someten a prueba los títulos séricos de anticuerpo contra IGF-1R humano mediante citometría de flujo según protocolos convencionales. Para ello, se incuban 200.000 células de las células CHO transfectadas con IGF-1R humano tal como se describió en el ejemplo 9.1 durante 30 min sobre hielo con 50 mi de suero de los animales inmunizados diluidos 1:1000 en PBS con FCS al 2%. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión de anticuerpos séricos con un anticuerpo específico de Fc-gamma de ratón (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa el suero de los animales obtenido antes de la inmunización como control negativo. Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocolos ¡n Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Se usan los animales que demuestran reactividad en suero significativa contra IGF-1R humano tal como se determina mediante el análisis de FACS en el experimento posterior.
9.7 Generación de una biblioteca de scFV de anticuerpos murinos inmunitarios: Construcción de una biblioteca de anticuerpos combinatoria y presentación en fago
Tres días después de la última inmunización de refuerzo se recogen esplenocitos de animales reactivos para la preparación de ARN total según protocolos convencionales.
Se construye una biblioteca de fragmentos de ADN de región variable (VK) de cadena ligera (kappa) de inmunoglobulina (Ig) murina y región variable (VH) de cadena pesada de Ig mediante RT-PCR con ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetiza ADNc según protocolos convencionales, véase el ejemplo 2.7.
Se ligan 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). Después se transforma la biblioteca de anticuerpos combinatoria resultante en 300 pl de células de Escheríchia cotí XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm, Gene-pulser de Biorad) dando como resultado un tamaño de biblioteca de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión de fenotipo, se seleccionan transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 mi de cultivo en Super Broth (SB) líquido durante la noche. Después se recogen las células mediante centrifugación y se lleva a cabo preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).
Se ligan 2800 ng de este ADN de plásmldo que contiene la biblioteca de VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transforman de nuevo en dos alícuotas de 300 pl de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes mediante electroporación (2,5 kV, cubeta con hueco de 0,2 cm, 25 pFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño de biblioteca de scFv de VH-VK total (fragmento variable de cadena sencilla) de más de 107 clones Independientes.
Después de la expresión de fenotipo y lenta adaptación a carbenicilina, se transfieren las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos en medio de selección de SB-carbenlclllna (SB con carbenicilina 50 pg/ml). Después se Infectan las células de E. coli que contienen la biblioteca de anticuerpos con una dosis Infecciosa de 1012 partículas de fago cooperador VCSM13 dando como resultado la producción y secreción de fago M13 filamentoso, en el que cada partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica para un fragmento de scFv murino y presenta la proteína de scFv correspondiente como fusión de traducción con una proteína de recubrimiento de fago III. Más tarde se usa esta combinación de fagos que presenta la biblioteca de anticuerpos para la selección de entidades de unión a antígeno.
9.8 Selección basada en presentación en fago de elementos de unión a diana proxlmales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos
Se recoge la biblioteca de fagos que porta el repertorio de scFv clonado del sobrenadante de cultivo respectivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspenden aproximadamente de 1011 a 1012 partículas de fago de scFv en 0,4 mi de PBS/BSA al 0,1% y se incuban con de 105 a 107 células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R humano mutado con epítopos distales a la membrana murinos tal como se describió en el ejemplo 9.4 durante 1 hora sobre hielo con agitación lenta. Se hacen crecer previamente estas células CHO, se recogen mediante centrifugación, se lavan en PBS y se resuspenden en PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Se eliminan fagos de scFv que no se unen específicamente a las células CHO mediante hasta cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1% (que contiene azida de Na). Después de lavar, se eluyen entidades de unión de las células resuspendlendo las células en HCI-glIcIna pH 2,2 (Incubación de 10 mln con posterior agitación con vértex) y después de la neutralización con Tris 2 M pH 12, se usa el eluato para la Infección de un cultivo de E. co liX L1 Blue sin Infectar nuevo (DO600 > 0,5). Se selecciona de nuevo el cultivo de E. coli que contiene células de E. coli satisfactoriamente transducidas con una copia de fagémido, que codifica para un fragmento de scFv murino, por su resistencia a carbenicilina y posteriormente se Infecta con fago cooperador VCMS 13 para comenzar la segunda ronda de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente se lleva a cabo un total de 4 a 5 rondas de selecciones.
9.9 Examen para detectar elementos de unión a diana proxlmales a la membrana con células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R humano, el antígeno de IGF-1R murino y el antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos
Se aísla ADN de plásmldo correspondiente a 4 y 5 rondas de cribado a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína de scFv soluble, se escinden fragmentos de ADN de VH-VL de los plásmldos (Xhol-Spel). Se clonan estos fragmentos a través de los mismos sitios de restricción en el plásmldo pComb3H5BFIag/His que se diferencia del pComb3H5BHis original en que el constructo de expresión (por ejemplo scFv) incluye una etiqueta Flag (TGDYKDDDDK) entre el scFv y la cola His6 y se delecionan las proteínas de fago adicionales. Después de la ligación, se transforma cada combinación (diferentes rondas de cribado) de ADN de plásmido en 100 pl de E. coli TG1 o XLI blue competentes para choque térmico y se siembran en placa sobre carbenlclllna-agar LB. Se escogen colonias Individuales en 100 pl de LB carb (LB con carbenicilina 50 pg/ml).
Después de la inducción con IPTG 1 mM, E. coli transformadas con pComb3H5BFIag/His que contiene un segmento de VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes. Debido a una secuencia señal adecuada, el scFv se exporta al Interior del perlplasma en el que se pliega en una conformación funcional.
Se escogen colonias bacterianas de E. coli Individuales a partir de las placas de transformación para preparaciones periplasmáticas a pequeña escala y se hacen crecer en medio SB (por ejemplo 10 mi) suplementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 pg/ml (y se redisuelven en PBS (por ejemplo 1 mi) después de la recogida. Se aplica un choque de temperatura mediante cuatro rondas de congelación a -70°C y descongelación a 37°C mediante lo cual se destruye la membrana exterior de las bacterias y se liberan las proteínas periplasmáticas solubles Incluyendo los scFv en el sobrenadante. Después de la eliminación de células Intactas y residuo celular mediante centrifugación, se recoge el sobrenadante que contiene los scFv murinos anti-IGF-1R humano y se usa para examen adicional.
Se realiza examen de los scFV aislados para detectar elementos de unión a diana proxlmales a la membrana mediante cltometría de flujo con células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R humano tal como se describió en el ejemplo 9.1, el antígeno de IGF-1R murino tal como se describió en el ejemplo 9.3 y el antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos tal como se describió en el ejemplo 9.5.
Para la citometría de flujo, se incuban 2,5x105 células de las líneas celulares respectivas con 50 pl de sobrenadante. Se detecta la unión de los constructos con un anticuerpo anti-His (anticuerpo frente a penta-His, libre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 pg/ml en 50 pl de PBS con FCS al 2%. Como reactivo de segunda etapa, se usa un fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-ratón (específica del fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 pl de PBS con FCS al 2% (Dianova, Hamburgo, RFA). Se miden las muestras con un instrumento FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).
Sólo se seleccionan para uso adicional los constructos que muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R humano y no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R murino y además no muestran unión a células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos distales a la membrana humanos.
9.10 Generación de equivalentes humanos/humanlzados de scFv no humanos frente a epítopos diana proxlmales a la membrana de IGF-1R humano
Se alinea la región VH de un scFv murino anti-IGF-1R frente a un epítopo diana proximal a la membrana de IGF-1R humano contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpo humano.
Se elige la secuencia de VH de línea germinal de anticuerpo humano que tiene la homología más próxima con la VH no humana y se realiza una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Hay varios residuos de reglón de marco de la VH no humana que difieren de las reglones de marco de VH humana (“diferentes posiciones de región de marco”). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y actividad del anticuerpo frente a su diana.
Para construir una biblioteca que contiene las CDR murinas y en cada posición de reglón de marco que difiere de la secuencia de VH humana elegida los dos posibles residuos (el residuo de aminoácido humano y murino materno), se sintetizan ollgonucleótldos degenerados. Estos ollgonucleótldos Incorporan en las posiciones diferentes el residuo humano con una probabilidad del 75% y el residuo murino con una probabilidad del 25%. Para una VH humana por ejemplo tienen que sintetizarse seis de estos ollgonucleótldos que solapan en un tramo terminal de aproximadamente 20 nucleótldos. Para ello uno de cada dos cebadores es un cebador antlsentldo. Se deleclonan sitios de restricción dentro de los ollgonucleótldos necesarios para la clonación posterior.
Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótldos, dependiendo del número de cebadores que son necesarios para abarcar toda la secuencia V.
Se mezclan estos por ejemplo seis cebadores en cantidades ¡guales (por ejemplo 1 mi de cada cebador (disoluciones madre de cebador de 20 a 100 pM) con respecto a 20 pl de reacción PCR) y se añaden a una mezcla de PCR que consiste en tampón para PCR, nucleótldos y Taq polimerasa. Se incuba esta mezcla a 94°C durante 3 minutos, 65°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, 59°C durante 1 minuto, 56°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y a 72°C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hace correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aísla el producto de un tamaño de desde 200 hasta 400 pares de bases del gel según métodos convencionales.
Después se usa este producto de PCR como molde para una reacción PCR convencional usando cebadores que Incorporan sitios de restricción para clonación N-terminales y C-terminales adecuados. Se aísla el fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH de aproximadamente 350 nucleótldos) mediante electroforesis en gel de agarosa según métodos convencionales. De esta manera se amplifica suficiente fragmento de ADN de VH. Este fragmento VH es ahora una combinación de fragmentos de VH que tienen cada uno una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las posiciones de reglón de marco diferentes respectivas (combinación de VH humanizada). Se realiza el mismo procedimiento para la región VL del scFv murino anti-IGF-1R frente a un epítopo diana proximal a la membrana de IGF-1R humano (combinación de VL humanizada).
Después se combina la combinación de VH humanizada con la combinación de VL humanizada en el vector de presentación en fago pComb3H5Bhls para formar una biblioteca de scFv funcionales de la que se seleccionan, después de presentación en fago filamentoso, elementos de unión antl-IGF-1R a epítopos diana proxlmales a la membrana de IGF-1R humano, se examinan, se identifican y se confirman tal como se describió anteriormente para el scFv anti-IGF-1R no humano (murino) parental. Luego se analizan clones Individuales para determinar propiedades favorables y la secuencia de aminoácidos. Se prefieren aquellos scFv, que son los de homología de secuencia de aminoácidos más próxima con segmentos V de línea germinal humana.
Se convierten scFv anti-IGF-1R humanos/humanizados frente a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano en anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla recombinantes y se caracterizan adlclonalmente tal como sigue.
9.11 Generación de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano
Se convierten scFv anti-IGF-1R frente a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano con propiedades y secuencia de aminoácidos favorables en anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla recomblnantes uniéndolos a través de a G^Ser-Higador con el scFv específico de CD3 I2C (SEQ ID) para dar como resultado constructos con la disposición de dominios V H igf-ir -(Gly4Ser-i)3 -V L igf-ir - SenGIyíSen - VHcd3 -(Gly4Ser-i)3 VLcd3 - Se diseñaron anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano tal como se expone en la siguiente tabla 8:
Tabla 8: Formatos de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla basados en I2C dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano
Figure imgf000082_0001
Alternativamente pueden generarse constructos adicionales con diferentes disposiciones de dominios según protocolos convencionales. Para la expresión en células CHO las secuencias codificantes de (i) una secuencia líder de cadena pesada de inmunoglobullna N-terminal que comprende un codón de iniciación incluido dentro de una secuencia consenso de Kozak y (¡I) una cola Hls6 C-terminal seguida por un codón de terminación se unen todas en marco a la secuencia de nucleótidos que codifica para los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla antes de la Inserción del fragmento de ADN resultante tal como se obtiene mediante síntesis génlca en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pEF-DHFR (Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótidos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
9.12 Expresión y purificación de moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla dirigidas a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano
Se expresan moléculas de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla en células de ovario de hámster chino (CHO). Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se induce la amplificación génica de los constructos mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario, se recoge el sobrenadante de cultivo celular y se usa en los experimentos posteriores. Para generar sobrenadante para purificación después de dos pases de cultivo estacionario, se hacen crecer las células en frascos rotativos con medio de soja líquido HyQ PF CHO libre de nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronlc F-68 al 0,1%; HyClone) durante 7 días antes de la recogida. Se retiran las células mediante centrifugación y se almacena el sobrenadante que contiene la proteína expresada a -20°C. Alternativamente, se expresan de manera transitoria los constructos en células HEK 293. Se realiza la transfección con reactivo 293fectin (Invitrogen, n.° 12347-019) según el protocolo del fabricante. Además se expresan alternativamente los constructos en células CHO deficientes en DHFR transfectadas de manera transitoria usando por ejemplo el reactivo de transfección FuGENE® HD (Roche Diagnostics GmbH, n.° de cat. 04709691001) según el protocolo del fabricante. Se usan el sistema Akta® Explorer (GE Health Systems) y el software Unicom® para cromatografía. Se realiza cromatografía de afinidad por metales Inmovilizados (“IMAC”) usando un Fractogel EMD chelate® (Merck) que se carga con ZnCl2 según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 mi) a la columna (10 mi) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. Se lava la columna con tampón A para eliminar muestra no unida. Se eluye la proteína unida usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, NaCI 0,1 M, imidazol 0,5 M) según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: el 20% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Etapa 2: el 100% de tampón B en 6 volúmenes de columna
Se combinan las fracciones de proteína eluidas de la etapa 2 para purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad para Investigación y se adquieren de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).
Se realiza cromatografía de filtración en gel en una columna de calidad preparativa HILoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equi. (citrato 25 mM, Usina 200 mM, gllcerol al 5%, pH 7,2). Se someten las muestras de proteína eluidas (velocidad de flujo de 1 ml/min) a SDS-PAGE convencional e inmunotransferencia de tipo Western para la detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). Se determinan concentraciones de proteínas usando DO 280 nm.
Se analiza la proteína de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla purificada en SDS PAGE en condiciones reductoras realizadas con geles de Bis Tris al 4-12% prefabricados (Invitrogen). Se realizan la preparación y aplicación de muestras según el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determina el peso molecular con el patrón de proteína MultiMark (Invitrogen). Se tiñe el gel con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada es normalmente >95% tal como se determina mediante SDS-PAGE.
El anticuerpo blespecífico de cadena sencilla tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas tal como se determina mediante filtración en gel en PBS.
Se realiza ¡nmunotransferencla de tipo Western usando una membrana Optltran® BA-S83 y el módulo de transferencia de Invitrogen según el protocolo proporcionado por el fabricante. El anticuerpo usado está dirigido contra la cola de His (penta-His, Qiagen) y se usa una Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) como reactivo de segunda etapa, y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Una banda detectada a 52 kD corresponde a anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla purificados.
9.13 Análisis de unión por cltometría de flujo de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de IGF-1R humano
Con el fin de someter a prueba la funcionalidad de constructos de anticuerpos blespecíficos con respecto a la capacidad para unirse a CD3 y a epítopos diana proximales a la membrana de IGF-1R humano, respectivamente, se realiza un análisis de FACS. Para este fin, se usan células CHO transfectadas con IGF-1R humano tal como se describió en el ejemplo 9.1 y la línea celular de leucemia de células T positivas para CD3 humano HPB-ALL (DSMZ, Braunschwelg, ACC483). Para la confirmación de la unión a epítopos diana proxlmales a la membrana de IGF-1R humano, además, se usan células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R murino tal como se describió en el ejemplo 9.3, células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R humano mutado con epítopos distales a la membrana murlnos tal como se describió en el ejemplo 9.4 y células CHO que expresan el antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos tal como se describió en el ejemplo 9.5. Se Incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos blespecíficos. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo penta-His murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan los anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa el sobrenadante de células no transfectadas como control negativo.
Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocolos ¡n Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulles, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
Sólo se seleccionan para uso adicional aquellos constructos que muestran unión blespecífica a CD3 humano así como a IGF-1R humano y que no se unen ni al antígeno de IGF-1R murino ni al antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos.
La unión blespecífica de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente era claramente detectadle tal como se muestra en la figura 17. En el análisis de FACS, todos los constructos mostraron unión a CD3 humano e IGF-1R humano en comparación con el control negativo. La unión a la diana proxlmal a la membrana de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente era claramente detectadle tal como se muestra en la figura 19. En el análisis de FACS, todos los constructos mostraron unión al antígeno de IGF-1R humano mutado con epítopos dlstales a la membrana murlnos y no mostraron unión al antígeno de IGF-1R murino y además no mostraron unión al antígeno de IGF-1R murino mutado con epítopos dlstales a la membrana humanos en comparación con el control negativo.
9.14 Bloactlvldad de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de IGF-1R humano
Se analiza la bloactlvldad de los anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla generados mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las células CHO transfectadas con IGF-1R humano descritas en el ejemplo 9.1. Como células efectoras, se usan PBMC con reducción de CD4/CD56 humanas estimuladas.
Se obtienen las PBMC humanas estimuladas tal como sigue:
Se recubre una placa Petri (145 mm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (por ejemplo OKT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 pg/ml durante 1 hora a 37°C. Se retira la proteína no unida mediante una etapa de lavado con PBS. Se aíslan las PBMC recientes de sangre periférica (30 - 50 mi de sangre humana) mediante centrifugación en gradiente de Flcoll según protocolos convencionales. Se añaden 3 - 5 x 107 PBMC a la placa Petri previamente recubierta en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10% / IL-220 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. Al tercer día se recogen las células y se lavan una vez con RPMI 1640. Se añade IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivan las células de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante reducción de células T CD4+ y células NK CD56+ según protocolos convencionales se enriquece en linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+.
Se lavan las células diana dos veces con PBS y se marcan con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 pl de RPMI con FCS al 50% durante 60 minutos a 37°C. Posteriormente se lavan las células diana marcadas 3 veces con 5 mi de RPMI y después se usan en el ensayo de cltotoxlcldad. Se realiza el ensayo en una placa de 96 pocilios en un volumen total de 250 pl de RPMI complementado (tal como anteriormente) con una razón de E:T de 10:1. Se aplica el sobrenadante de células que expresan las moléculas de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla en una concentración final del 50% y 20 diluciones dobles del mismo. El tiempo de ensayo es de 18 horas.
Se mide la cltotoxlcldad como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante relacionados con la diferencia de lisis máxima (adición de Trlton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Se realizan todas las mediciones por cuadruplicado. Se realiza la medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes con un contador gamma Wlzard 3” (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). Se realiza el análisis de los datos experimentales con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Las curvas de dosis-respuesta sigmoideas normalmente tienen valores de R2 >0,90 tal como se determina mediante el software.
Sólo se seleccionan para uso adicional aquellos constructos que muestran un potente reclutamiento de actividad citotóxica de células T efectoras contra células diana positivas para IGF-1R.
9.15 Generación de células CHO que expresan IGF-1R de macaco
Se obtiene la secuencia codificante de IGF-1R de macaco tal como se publica en GenBank (número de registro XM 001100407) mediante síntesis génlca según protocolos convencionales. Se diseña el fragmento de síntesis génica para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucariotas del constructo seguido por la secuencia codificante del IGF-1R de macaco proteína y un codón de terminación (la secuencia de ADNc y de aminoácidos del constructo se Indica en SEQ ID NO: 434 y 435). También se diseña el fragmento de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final del fragmento. Se usan los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3' en los siguientes procedimientos de clonación. Se clona el fragmento de síntesis génica a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum etal. Cáncer Immunol Immunother50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevan a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realiza la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se Induce la amplificación génlca del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
9.16 Análisis por cltometría de flujo de especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de IGF-1R humano
Con el fin de someter a prueba la especificidad entre especies de anticuerpos blespecíficos dirigidos a epítopos diana proxlmales a la membrana de IGF-1R humano, se Investiga la capacidad de los constructos para unirse a IGF-1R de macaco y CD3 de macaco, respectivamente, mediante análisis de FACS. Para este fin, se usan las células CHO transfectadas con IGF-1R de macaco tal como se describió en el ejemplo 9.15 y la línea de células T de macaco 4119LnPx (amablemente proporcionada por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Eriangen-Nuernberg; publicada en Knappe A, eta l., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se Incuban 200.000 células de las líneas celulares respectivas durante 30 mln sobre hielo con 50 pl de sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan los constructos de anticuerpos blespecíficos específicos entre especies. Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2% y se detecta la unión del constructo con un anticuerpo frente a penta-His murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 pl de PBS con FCS al 2%). Después de lavar, se detectan los anticuerpos antl-HIs unidos con un anticuerpo específico de Fe gamma (Dlanova) conjugado con flcoeritrlna, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2%. Se usa el sobrenadante de células no transfectadas como control negativo. Se realiza citometría de flujo con un aparato FACS-Calibur, se usa el software CelIQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson blosclences, Heidelberg). Se realizan tinción de FACS y medición de la Intensidad de fluorescencia tal como se describe en Current Protocolos ¡n Immunology (Coligan, Krulsbeek, Margulles, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).
La unión específica entre especies de las moléculas de cadena sencilla Indicadas anteriormente era claramente detectadle tal como se muestra en la figura 17. En el análisis de FACS, todos los constructos mostraron unión a CD3 de macaco y IGF-1R de macaco en comparación con el control negativo.
Se generan equivalentes humanos/humanlzados de scFv específicos para IGF-1R contenidos en las moléculas blespecíficas de cadena sencilla tal como se describe en el presente documento. Se realizan la clonación de moléculas de unión basadas en estos scFv humanos/humanlzados y la expresión y purificación de estas moléculas blespecíficas de cadena sencilla tal como se describió anteriormente. Se realizan el análisis de unión blespecífica mediante cltometría de flujo y el análisis de bloactlvldad mediante ensayos de cltotoxlcldad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) tal como se describió anteriormente. Basándose en la unión blespecífica demostrada y la cltotoxlcldad reclutada, se seleccionan para uso adicional moléculas de unión.
Ejemplo 10
10.1. Generación de anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla dirigidos contra PSMA y CD3
Se obtuvieron anticuerpos blespecíficos de cadena sencilla que comprenden o bien el dominio de unión de scFv P7 contra un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana < 60 Á o dominio de unión de scFv D4 contra un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana > 60 A y el dominio de unión de scFv I2C dirigido a CD3épsilon con células T humanas mediante síntesis génlca. Se diseñaron los fragmentos de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucaríotas del constructo, seguido por un péptldo líder de ¡nmunoglobullna de 19 aminoácidos, seguido en marco por la secuencia codificante del anticuerpo blespecífico de cadena sencilla, seguida en marco por la secuencia codificante de una cola de 6 histidinas y un codón de terminación. Las disposiciones de reglones variables así como las SEQ ID NO de las secuencias de ADNc y de aminoácidos se Indican en la tabla 9 a continuación.
Figure imgf000085_0001
También se diseñaron los fragmentos de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción adecuados al comienzo (EcoRI) y al final del fragmento (Sal I) para la clonación del fragmento de síntesis génlca en el vector de expresión en células de mamífero pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum etal. Cáncer Immunol Immunother50 (2001) 141 - 150). Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucaríotas del constructo. Se realizó la expresión de proteínas en eucaríotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. Después de dos pases de cultivo estacionario, se recogió sobrenadante de cultivo celular y se usó en los experimentos posteriores.
10.2 Mapeo de epítopos de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla reactiva con PSMA y CD3, PSMA-P7 HL x I2C HL
Se confirmó un epítopo de PSMA con una distancia < 60 A a la membrana de anticuerpo blespecífico de cadena sencilla PSMA-P7 HL x I2C HL mediante mapeo de epítopos usando constructos de PSMA quiméricos.
10.2.1 Generación de células CHO que expresan quimeras de PSMA humano / de rata
Se usó PSMA de Rattus norvegicus, que no se une por el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a PSMA PSMA-P7 HL x I2C HL, para producir quimeras con PSMA humano. Por tanto, la creación de una quimera en la región que contiene el epítopo de unión de un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a PSMA conduce a la pérdida de unión de dicho anticuerpo biespecífico de cadena sencilla al constructo de PSMA respectivo.
Se usaron la secuencia codificante de PSMA humano tal como se publica en GenBank (número de registro NM 004476) y la secuencia codificante de PSMA de rata (NM 057185, folato hidrolasa (Folhl) de Rattus norvegicus, ARNm, Centro Nacional para Información Biotecnológica, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) para la generación de los constructos quiméricos.
Se diseñó un conjunto de 6 constructos de ADNc quiméricos y se generó mediante síntesis génica según protocolos convencionales. En los constructos, se cambiaron segmentos de las secuencias codificantes para los aminoácidos 140 a 169, 281 a 284, 300 a 344, 589 a 617, 683 a 690 y 716 a 750, respectivamente por las secuencias homologas de PSMA de rata.
Se generaron constructos de PSMA quiméricos tal como se describió anteriormente y se denominaron tal como se expone en la siguiente tabla 10:
Tabla 10: Designación de constructos de PSMA quiméricos
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Se diseñaron los fragmentos de síntesis génlca para contener en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión en eucaríotas del constructo seguido por la secuencia codificante de las proteínas de PSMA quiméricas, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta FLAG y un codón de terminación. También se diseñaron los fragmentos de síntesis génlca para Introducir sitios de restricción al comienzo y al final de los fragmentos. Se usaron los sitios de restricción Introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3', en los siguientes procedimientos de clonación. Se eliminaron sitios de restricción Internos no deseados mediante mutación silenciosa de la secuencia codificante en los fragmentos de síntesis génlca. Se clonaron los fragmentos de síntesis génlca a través de EcoRI y Salí en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos convencionales. Se llevaron a cabo los procedimientos mencionados anteriormente según protocolos convencionales (Sambrook, Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, 3a edición, Coid Spring Harbour Laboratory Press, Coid Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia de nucleótldos verificada mediante la secuencia en células CHO deficientes en DHFR para la expresión en eucariotas del constructo. Se realizó la expresión de proteínas en eucariotas en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Se indujo la amplificación génica del constructo mediante concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.
10.2.2 Análisis de unión por cltometría de flujo para el mapeo de epítopos de la molécula de anticuerpo blespecíflco de cadena sencilla reactiva con PSMAy CD3, PSMA-P7 HL x I2C HL usando proteínas de PSMA quiméricas
Con el fin de determinar el epítopo de unión del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a PSMA, PSMA-P7 HL x I2C HL se realizó un análisis de FACS. Para este fin, se usaron células CHO transfectadas con moléculas de PSMA quiméricas humanas / de rata tal como se describió en el ejemplo 10.2.1 anterior. Se realizó un análisis de FACS con sobrenadante de células CHO que expresan PSMA-P7 HL x I2C HL tal como se describe en el presente documento. Se realizó la detección de la unión de PSMA-P7 HL x I2C HL usando un anticuerpo frente a penta-His murino y como reactivo de segunda etapa un anticuerpo específico de Fe gamma conjugado con ficoeritrina. Se usó el sobrenadante de células no transfectadas como control negativo. Se usó el sobrenadante de células CHO que expresan el constructo de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMA-D4 HL x I2C HL que da reacción cruzada con PSMA de rata como control para la expresión de los constructos de PSMA quiméricos.
Tal como se muestra en la figura 20 ambos anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla frente a PSMA, PSMA-P7 HL x I2C HL y PSMA-D4 HL x I2C HL, mostraron unión a los constructos quiméricos huPSMArat140-169, huPSMArat281-284, huPSMArat300-344, huPSMArat683-690 y huPSMArat716-750. Tal como se muestra además en la figura 20, hay una ausencia de unión para PSMAP7 HL x I2C HL al constructo huPSMArat598-617, que demuestra la presencia de su epítopo de unión en la reglón de los aminoácidos 598 a 617 de PSMA humano.
Tal como se muestra en la tabla 1, los aminoácidos 598 a 617 constituyen un epítopo proxlmal a la membrana tal como se define en el presente documento. En conclusión, los resultados del mapeo basándose en los constructos de PSMA quiméricos demuestran que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMA-P7 HL x I2C HL reconoce un epítopo diana proxlmal a la membrana de PSMA humano con una distancia a la membrana < 60 A tal como se define en el presente documento.
10.3 Mapeo de epítopos de la molécula de anticuerpo biespecífico de cadena sencilla reactiva con PSMA y CD3, PSMA-D4 HL x I2C HL
Se confirmó un epítopo de PSMA con una distancia a la membrana > 60 A del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMA-D4 HL x I2C HL mediante mapeo de epítopos usando un enfoque de barrido de péptldos. El barrido de péptldos usa péptldos solapantes de una proteína dada y analiza la unión de anticuerpos a péptldos Inmovilizados mediante ensayos de ¡nmunoabsorclón ligados a enzimas (ELISA). Se realizaron experimentos de mapeo de epítopos con el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla frente a PSMA, PSMA-D4 HL x I2C HL tal como se describe en detalle en Bernard etal. 2004, J. Biol. Chem., 279: 24313 -22 y Teeling etal. 2006, J Immunol., 177: 362-71.
En resumen, se sintetizaron 693 péptidos de 15 meros diferentes que abarcan toda la secuencia de aminoácidos extracelular de PSMA humano y se solapan con cada péptldo de 15 meros vecino en 14 aminoácidos. Se recubrieron estos péptidos en pocilios de ELISA en un formato de placa de 384 pocilios. Para esta serie de experimentos, se produjo el fragmento scFv anti-PSMA del anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMA-D4 HL x I2C HL en E. coli y se usó para ELISA como extractos periplasmáticos en bruto preparados tal como se describe en el presente documento. Se incubó el anticuerpo de scFv con los péptidos y se detectó la unión específica usando un anticuerpo antl-HIs. Se midieron las señales de unión en un lector de ELISA de 384 pocilios. Tal como se muestra en la figura 21, se obtuvo una señal máxima clara para un péptldo que abarcaba los aminoácidos treonlna 334 a treonina 339, lo que demuestra la presencia del epítopo de unión de PSMA-D4 HL x I2C HL en la reglón de los aminoácidos 334 a 339 de PSMA humano. Tal como se muestra en la tabla 1, la treonlna 334 y treonlna 339 constituyen un epítopo distal a la membrana tal como se define en el presente documento.
En conclusión, los resultados del mapeo basándose en barrido de péptldos demuestran que el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMA-D4 HL x I2C HL reconoce un epítopo diana distal a la membrana de PSMA humano con una distancia a la membrana > 60 A tal como se define en el presente documento.
10.4 Análisis comparativo de la actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos de cadena sencillas dirigidos a epítopos diana proximales a la membrana y distales a la membrana de PSMA humano
Se analizó la bioactividad de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla mediante un ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo™ con PBMC humanas no estimuladas usando las células CHO transfectadas con PSMA humano descritas en el ejemplo 2.1. Como células efectoras, se usaron PBMC humanas no estimuladas.
Se obtuvieron PBMC humanas no estimuladas de la siguiente manera:
Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll a partir de preparaciones enriquecidas en linfocitos (capas leucocíticas), un producto secundario de los bancos de sangre que recogen sangre para transfusiones. Se suministraron las capas leucocíticas por un banco de sangre local y se prepararon PBMC el mismo día de la recogida de sangre. Después de la centrifugación de densidad de Ficoll y lavados extensos con PBS de Dulbecco (Gibco), se retiraron los eritrocitos restantes de las PBMC a través de incubación con tampón de lisis de eritrocitos (NH4CI 155 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 100 pM). Se retiraron las plaquetas a través del sobrenadante tras centrifugación de PBMC a 100xg. Los linfocitos restantes englobaban principalmente linfocitos B y T, células NK y monocitos.
Se mantuvieron las PBMC en cultivo a 37°C y el 5% de CO2 en medio RPMI (Gibco) con FBS al 10% (Gibco). Se realizaron todos los procedimientos según protocolos convencionales (Current Protocolos in Immunology; Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober; Wiley-lnterscience, 2002)
Se usó el ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo™ (kit de Promega) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Se realizó cada medición por triplicado con series de dilución definidas de anticuerpos biespecíficos específicos de PSMA purificados (de 0,001 ng/ml a 250 ng/ml) y controles apropiados para definir la lisis espontánea (células efectoras y diana sin anticuerpos biespecíficos) y lisis máxima (adición del detergente digitonina a células).
Se mezclaron 10000/pocillo de células diana y 100000/pocillo de células efectoras en una razón definida, con las células efectoras en exceso (razón de E:T de 10:1). Después de la incubación a 37°C durante 20-24 horas, se añadió el reactivo del ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo (AAF-Glo™; parte del kit CytoTox-Glo de Promega) a todos los pocilios. Se mezclaron las células y el reactivo mediante agitación orbital y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se realizó la determinación del número de células muertas posteriormente midiendo la luminiscencia con un lector de placas (espectrofluorímetro TECAN). La señal medida se correlaciona directamente con la cantidad de células Usadas.
Basándose en esos valores médicos, se calcularon los valores de citotoxicidad de cada muestra individual según la siguiente fórmula:
S [%] = (V — B) / (M — B)
Donde S es la toxicidad específica, V es el valor medido, B es el promedio de los valores de blanco y M es el promedio de lisis máxima.
Tal como se muestra en la figura 22, el anticuerpo biespecífico PSMA-P7 HL x I2C HL dirigido a un epítopo diana proximal a la membrana de PSMA humano (tal como se muestra en el ejemplo 10.2) demostró actividad citotóxica superior contra células diana positivas para PSMA humano en comparación con el anticuerpo biespecífico de cadena sencilla PSMA-D4 HL x I2C HL dirigido a un epítopo diana distal a la membrana de PSMA humano (tal como se muestra en el ejemplo 10.3).
Tabla 1:
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Tabla 2:
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular del antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), que comprende las etapas de:
    (a) proporcionar al menos tres tipos de células hospedadoras que expresan
    (i) el dominio extracelular humano wt de PSMA que tiene SEQ ID NO: 447 en la superficie celular; (¡i) una forma mutada del PSMA humano wt en la superficie celular, en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 140, 169, 191, 308, 334, 339, 344, 624, 626, 716, 717 y 721 se mutan a los residuos de aminoácido correspondientes del PSMA de rata wt; y
    (iii) el dominio extracelular wt de rata de PSMA en la superficie celular;
    (b) poner en contacto cada tipo de células hospedadoras (i), (¡i) y (iii) de la etapa (a) con los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla y células T efectoras; e
    (c) Identificar y aislar los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que median en la lisis de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular humano wt de PSMA en la superficie celular según (b)(¡) y de células hospedadoras que expresan la forma mutada del PSMA humano wt en la superficie celular según (b)(¡¡) pero no de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular wt de rata de PSMA en la superficie celular según b(iii).
    Un método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular de la proteína de activación de fibroblastos a (FAPa), que comprende las etapas de: (a) proporcionar al menos tres tipos de células hospedadoras que expresan
    (I) el dominio extracelular humano wt de FAPa que tiene SEQ ID NO: 448 en la superficie celular; (¡I) una forma mutada de la FAPa humana wt en la superficie celular, en la que los residuos de aminoácido en las posiciones 144, 185, 186, 229, 267, 273, 274, 278, 284, 301, 328, 329, 331, 335 y 362 se mutan a los residuos de aminoácido correspondientes de la FAPa de ratón wt; y (¡II) el dominio extracelular wt de ratón de FAPa en la superficie celular;
    (b) poner en contacto cada tipo de células hospedadoras (I), (¡I) y (¡II) de la etapa (a) con los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla y células T efectoras; e
    (c) Identificar y aislar los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que median en la lisis de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular humano wt de FAPa en la superficie celular según (b)(i) y de células hospedadoras que expresan la forma mutada de la FAPa humana wt en la superficie celular según (b)(¡¡) pero no de células hospedadoras que expresan el dominio extracelular wt de ratón de FAPa en la superficie celular según b(iii).
    Un método para la selección de anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que comprenden un primer dominio de unión que puede unirse a un epítopo de CD3 y un segundo dominio de unión que puede unirse al dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-MET), endosialina (TEM1) y el receptor del factor de crecimiento similar a insulina tipo 1 (IGF-1R), que comprende las etapas de:
    (a) Identificar los 640 residuos de aminoácido proxlmales a la membrana del homólogo humano y de roedor del dominio extracelular de c-MET, TEM1 o IGF-1R;
    (b) proporcionar células hospedadoras que expresan
    (i) el dominio extracelular humano wt de c-MET, TEM1 o IGF-1 R en la superficie celular;
    (¡I) una proteína de fusión que comprende los 640 residuos de aminoácido proxlmales a la membrana humanos Identificados en la etapa (a) y los >640 residuos de aminoácido de roedor de c-MET, TEM1 o IGF-1 R; y
    (iii) el dominio extracelular wt de roedor de c-MET, TEM1 o IGF-1 R;
    (c) poner en contacto las células hospedadoras según la etapa (b) con los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla y células T efectoras; e
    (d) identificar y aislar los anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla que median en la lisis de células hospedadoras según (b)(¡) y (b)(ii) pero no de células hospedadoras según b(iii).
    El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer dominio de unión se une a CD3 épsilon (CD3e) de ser humano y C allithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saim irí sciureus.
    El método según la reivindicación 4, en el que el primer dominio de unión comprende una reglón VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:
    (a) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 27, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    28 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 29;
    (b) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 117, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    118 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 119; y
    (c) CDR-L1 tal como se representa en SEQ ID NO. 153, CDR-L2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    154 y CDR-L3 tal como se representa en SEQ ID NO. 155.
    El método según la reivindicación 4, en el que el primer dominio de unión comprende una reglón VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:
    (a) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 12, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    13 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 14;
    (b) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 30, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    31 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 32;
    (c) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 48, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    49 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 50;
    (d) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 66, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    67 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 68;
    (e) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 84, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    85 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 86;
    (f) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 102, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    103 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 104;
    (g) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 120, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    121 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 122;
    (h) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 138, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    139 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 140;
    (i) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 156, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    157 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 158; y
    (j) CDR-H1 tal como se representa en SEQ ID NO. 174, CDR-H2 tal como se representa en SEQ ID NO.
    175 y CDR-H3 tal como se representa en SEQ ID NO. 176.
    El método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el segundo dominio de unión se une a epítopos/sitios de unión seleccionados del grupo que consiste en:
    epítopos/sltlos de unión en los cuatro dominios de Ig que tienen SEQ ID NO: 436, un dominio rico en clsteína que tiene SEQ ID NO: 437 o la cadena beta de un dominio sema que tiene SEQ ID NO: 438 del dominio extracelular de c-MET,
    epítopos/sltlos de unión en el dominio de muclna que tiene SEQ ID NO: 440, los tres dominios similares a EGF que tienen SEQ ID NO: 441, o el dominio Sushi/SCR/CCP que tiene SEQ ID NO: 442 del dominio extracelular de TEM1, y
    epítopos/sltlos de unión en los tres dominios de fibronectlna tipo III que tienen SEQ ID NO: 444, y el dominio L2 que tiene SEQ ID NO: 445 del dominio extracelular de IGF-1R.
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