BR112012024964B1 - molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, seu uso e processo de produção, bem como composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

ANTICORPO DE CADEIA ÚNICA BIESPECÍFICO PSMAXCD3, SEUS USO E PROCESSO DE PRODUÇÃO, BEM COMO SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo de cadeia única biespecífico que compreende um primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epitopo de seres humanos e um primata não chimpanzé da cadeia CD3 épsilon, em que o epítopo é parte de uma sequência de aminoácidos compreendida no grupo que consiste na SEQ ID N Os. 2, 4, 6 e 8, e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos que codifica a referida molécula de anticorpo de cadeia única biespecífico, bem como vetores e células hospedeiras e um processo para a sua produção. A presente invenção diz ainda respeito a composições farmacêuticas compreendendo a referida molécula de anticorpo de cadeia única biespecífico e usos médicos da referida molécula de anticorpo de cadeia única biespecífico.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única que compreende um primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3 épsilon de seres humanos e primata não chimpanzé, em que o epítopo é parte de uma sequência de aminoácidos compreendida no grupo que consiste na SEQ ID NO: 2, 4, 6 e 8, e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar ao antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos que codifica a referida molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, bem como vetores e células hospedeiras e um processo para a sua produção. A presente invenção diz ainda respeito a composições farmacêuticas compreendendo a referida molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única e as utilizações médicas da referida molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única.

[0002] O reconhecimento de célula T é mediado por meio dos receptores de células T delta, alfa beta e gama distribuídos clonotipicamente (TCR), que interagem com as moléculas carregadas com peptídeo do MHC peptídeo (pMHC) (Davis & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395 a 402). As cadeias específicas de antígeno do TCR não possuem domínios de sinalização, mas em vez disso estão acopladas ao aparelho de sinalização de múltiplas subunidades conservadas CD3 (Cell Call, 111 (2002), 967 a 979, Alarcon, Immunol Rev. 191 (2003), 38 a 46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7 a 27). O mecanismo pelo qual a ligação de TcR está diretamente comunicada ao aparelho de sinalização continua a ser uma questão fundamental na biologia da célula T (Alarcon, loc cit, Davis, Cell 110 (2002), 285 a 287). Parece claro que as respostas de células T sustentadas envolvem o acoplamento do correceptor, oligomerização de TcR, e um arranjo de ordem superior de complexos TCR-pMHC na sinapse imunológica (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289 a R291, Davis, Nat. Immunol 4. (2003), 217 a 224). No entanto a sinalização TcR ocorre muito cedo na ausência destes eventos, e pode incluir uma alteração conformacional induzida por meio do ligante em células CD3 épsilon (Alarcon, loc. Cit., Davis (2002), loc. Cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174 a 11179, Gil, Cell 109 (2002), 901 a 912). As subunidades épsilon, gama, delta e zeta do complexo de sinalização associado com o outro para formar um heterodímero CD3 épsilon-gama, um heterodímero CD3 épsilon-delta, e um homodímero CD3 zeta-zeta (Call, loc. Cit.).

[0003] Vários estudos têm revelado que as moléculas CD3 são importantes para a expressão adequada da superfície celular de TcR beta alfa e desenvolvimento normal das células T (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528 a 8536, Wang, J. Exp. Med. Chem. 188 (1998), 1375 a 1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441 a 447). A estrutura de solução dos fragmentos do ectodomínio do camundongo heterodímero CD3 épsilon gama mostrou que as subunidades gama épsilon são ambos domínios Ig C2 definidos, que interagem uns com os outros para formar uma configuração de dímero lado a lado não usual (Sun, Cell 105 (2001), 913 a 923). Embora o caule rico em cisteína parece desempenhar um papel importante na condução de dimerização CD3 (Su, loc. Cit., Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12.807 a 12.816), por meio da interação dos domínios extracelulares de CD3 épsilon e CD3 gama é suficiente para a montagem destas proteínas com TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84 a 92, Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532 a 536). Embora ainda controverso, a estequiometria dominante do TcR provavelmente compreende um heterodímero gama CD3 épsilon, um heterodímero delta CD3 épsilon e um homodímero zeta zeta (Call, loc. Cit.). Dado o papel central do heterodímero gama CD3 épsilon de ser humano na resposta imune, a estrutura cristalina do complexo ligado ao anticorpo OKT3 terapêutico foi recentemente elucidado (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675 a 7680).

[0004] Um certo número de estratégias terapêuticas modula a imunidade das células T, visando a sinalização de TcR, especialmente os anticorpos monoclonais anti-CD3 humano de (mAbs) que são largamente utilizados clinicamente em regimes imunossupressores. O OKT3 mAb específico de camundongo CD3 foi o primeiro mAb licenciado para utilização em seres humanos (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23 a 29) e é largamente utilizada clinicamente como um agente imunossupressor no transplante (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422 a 430, Chatenoud, Nat. Transplant Rev. Immunol. 3 (2003), 123 a 132, Kumar,. Proc. 30 (1998), 1351 a 1352), a diabetes do tipo 1 (Chatenoud (2003), loc. cit.) e psoríase (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907 a 1913). Além disso, os mAbs anti-CD3 podem induzir a sinalização de células T parcial e anergia clonal (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413 a 1422). OKT3 tem sido descrito na literatura como um potente mitógeno de células T (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708 a 18), bem como um matador de células T potente (Wong, Transplantation 50 (1990), 683 a 9). OKT3 exibe ambas as atividades de uma forma dependente do tempo; a ativação precoce seguinte de células T que levam à liberação de citocinas, com a administração ainda de OKT3 depois que bloqueia todas as funções da célula T conhecidas. Isso é devido por causa do bloqueio posterior da função das células T de que OKT3 encontrou ampla aplicação como um imunossupressor em esquemas de terapia para a redução ou até mesmo a abolição de rejeição dos tecidos do enxerto.

[0005] OKT3 reverte a rejeição de aloenxerto de tecido, muito provavelmente através do bloqueio da função de todas as células T, as quais desempenham um papel importante na rejeição aguda. OKT3 reage com e bloqueia a função do complexo CD3 na membrana das células T humanas, que está associado com a estrutura de reconhecimento de antígenos de células T (TCR) e é essencial para a transdução do sinal. A subunidade a qual TCR/CD3 está ligado por OKT3 tem sido objeto de vários estudos. Embora algumas evidências apontaram para uma especificidade de OKT3 para a subunidade épsilon do complexo TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol 1 (1989), 546 a 50; Kjer-Nielsen PNAS 101, (2004), 7675 a 7680). Outra evidência mostrou que OKT3 ligando-se ao complexo de TCR/CD3 requer outras subunidades desse complexo para estar presente (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047 a 52).

[0006] Outros anticorpos específicos bem conhecidos para a molécula CD3 são listados na Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546 a 50. Como indicado acima, tais CD3 específicos são capazes de induzir as respostas de células T diferentes a produção de linfocinas, tais como (Von Wussow, J. Immunol 127 (1981), 1197, Palacious, J. Immunol 128 (1982), 337), a proliferação (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708 a 18) e um supressor de indução de células T (Kunicka, em "Lymphocyte Typing II" 1 (1986), 223). Ou seja, dependendo das condições experimentais, o anticorpo monoclonal específico CD3 pode inibir ou induzir a citotoxicidade (Leewenberg, J. Immunol 134 (1985), 3770,. Phillips, J. Immunol 136 (1986) 1579;. Platsoucas, Proc Natl. Acad Sci EUA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell Immunol 108 (1987), 283-96, Mentzer, J. Immunol 135 (1985), 34,. Landegren, J. Exp. Med. 155.. (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol 31, 94 a 106; Xu (2000), Cell Immunol 200, 16 a 26; Kimball (1995), Transpl Immunol 3, 212 a 221).

[0007] Embora muitos dos anticorpos CD3 descritos na técnica têm sido relatados para reconhecer a subunidade CD3 épsilon do complexo CD3, a maioria delas na verdade se ligam aos epítopos conformacionais e, dessa maneira, apenas reconhecem CD3 épsilon no contexto nativo do TCR. Os epítopos conformacionais são caracterizados pela presença de dois ou mais resíduos de aminoácidos discretos que são separados na sequência primária, mas se juntam na superfície da molécula, quando o polipeptídeo prega na proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Lavide, (1990) Cell 61, 553 a 6). Os epítopos conformacionais ligados por CD3 épsilon descritos na técnica podem ser separados em dois grupos. No grupo principal, os referidos epítopos são formados por meio de duas subunidades, por exemplo, CD3 da cadeia CD3 épsilon e CD3 gama ou CD3 de cadeia delta. Por exemplo, verificou-se em vários estudos que os anticorpos monoclonais CD3 épsilon mais amplamente utilizados OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 e Leu-4 não se ligam a células transfectadas individualmente com a cadeia CD3 épsilon. No entanto, estes anticorpos marcaram células duplamente transfectadas com uma combinação de CD3 épsilon, mais ou CD3 gama ou CD3 delta (Tunnacliffe, loc cit, Law, Int. Immunol 14 (2002), 389 a 400, Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047 a 52; Coulie, Eur. J. Immunol 21 (1991), 1703 a 9). Em um segundo grupo menor, o epítopo conformacional está a ser formada dentro da subunidade CD3 épsilon por si. Um membro deste grupo é, por exemplo mAb APA 1/1 que foi levantado contra CD3 épsilon desnaturado (Risueno, Blood 106 (2005), 601 a 8). Tomados em conjunto, a maior parte dos anticorpos CD3 épsilon descritos na técnica reconhecem os epítopos conformacionais localizados em duas ou mais subunidades de CD3. Os resíduos de aminoácidos discretos que formam a estrutura tridimensional destes epítopos podem, dessa maneira, serem localizados tanto na subunidade CD3 épsilon ou sobre a subunidade CD3 épsilon e outras subunidades CD3, tais como CD3 gama ou CD3 delta.

[0008] Um outro problema que diz respeito ao anticorpo CD3 é que muitos CD3 foram encontrados para serem específicos da espécie. Os anticorpos anti-CD3 monoclonais - como é válido em geral para todos os outros anticorpos monoclonais - por meio da função de reconhecimento altamente específico de moléculas-alvo. Eles reconhecem apenas um único sítio, ou epítopo, em sua molécula CD3 alvo. Por exemplo, um dos anticorpos mais amplamente utilizados e melhor caracterizados como monoclonais específicos para o complexo CD3 é OKT-3. Este anticorpo reage com o chimpanzé CD3, mas não com o homólogo CD3 de outros primatas, tais como macacos ou com CD3 de cães (Sandusky et al., J. Med. Chem. Primatol. 15 (1986), 441 a 451). Da mesma forma, WO2005/118635 ou WO2007/033230 descrevem os anticorpos monoclonais humanos CD3 épsilon, que reagem com CD3 épsilon humano, mas não com CD3 épsilon de rato, camundongo, coelho, ou primatas não chimpanzé tais como macacos rhesus, macaco cinomolgo, ou macaco babuíno. O anticorpo monoclonal anti-CD3 UCHT-1 também é reativo com CD3 de chimpanzé, mas não com CD3 de macacos (dados próprios). Por outro lado, existem também exemplos de anticorpos monoclonais, que reconhecem antígenos de macacos, mas não os seus homólogos humanos. Um exemplo deste grupo é o anticorpo monoclonal FN-18 dirigido para CD3 de macacos (Uda et al., J. Med. Chem. Primatol. 30 (2001), 141 a 147). Curiosamente, verificou-se que os linfócitos periféricos de cerca de 12% dos macacos cinomolgos não apresentava reatividade ao anticorpo monoclonal anti-CD3 de macaco rhesus (FN- 18), devido a um polimorfismo do antígeno CD3 em macacos. Uda et al. descreveu uma substituição de dois aminoácidos na sequência de CD3 de macacos cinomolgos, que não são reativos com FN-18 de anticorpos, em comparação com células CD3 derivados de animais, os quais são reativos com anticorpos FN-18 (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105 a 10; Uda et al, J Med Primatol 33 (2004), 34 a 7).

[0009] A capacidade de discriminação, isto é, a especificidade de espécie, inerente, não só para anticorpos monoclonais CD3 (e fragmentos destes), mas os anticorpos monoclonais, em geral, é um obstáculo significativo para o seu desenvolvimento como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças humanas. A fim de obter a aprovação do mercado, nenhum medicamento novo candidato deve passar por testes rigorosos. Este teste pode ser subdividido em fases pré-clínicas e clínicas: Considerando que o último - subdividido em fases geralmente conhecidas como clínicas I, II e III - é realizada em pacientes humanos, o primeiro é realizado em animais. O objetivo do ensaio pré- clínico é demonstrar que o medicamento candidato tem a atividade desejada, e mais importante ainda é seguro. Somente quando a segurança em animais e possível eficácia do medicamento candidato foi determinada em testes pré-clínicos deste medicamento candidato será aprovado para testes clínicos em seres humanos por meio da respectiva autoridade reguladora. Candidatos a fármacos podem ser testados para a segurança em animais nas três seguintes formas: (i) de uma espécie em causa, isto é, de uma espécie em que os candidatos a fármacos podem reconhecer os antígenos de ortólogos, (ii) em um animal transgênico contendo os antígenos humanos e (iii) por meio da utilização de um substituto para o candidato a fármaco que pode ligar os antígenos de ortólogos presentes no animal. As limitações de animais transgênicos são que esta tecnologia é tipicamente limitada a roedores. Entre os roedores e o homem existem diferenças significativas na fisiologia e os resultados de segurança não podem ser facilmente extrapolados para seres humanos. As limitações de um substituto para o candidato a fármaco é a composição de matéria diferente em comparação com o candidato a fármaco real e, muitas vezes, os animais utilizados são roedores com a limitação como discutido acima. Portanto, os dados pré-clínicos gerados em roedores são de poder preditivo limitado em relação ao candidato de fármaco. A abordagem de escolha para os testes de segurança é o uso de uma espécie em causa, de preferência, um primata menor. A limitação agora de anticorpos monoclonais adequados para a intervenção terapêutica no homem descrito na técnica é a de que as espécies correspondentes são primatas superiores, em especial os chimpanzés. Os chimpanzés são considerados como espécies ameaçadas de extinção e, devido à sua natureza humana, o uso desses animais para testes de segurança de fármaco foi proibido na Europa e em outros lugares é muito restrito. CD3 também foi usado com sucesso como um alvo para anticorpos biespecíficos de cadeia única, a fim de redirecionar as células T citotóxicas para células patológicas, resultando na depleção das células doentes do organismo em causa (WO 99/54440, WO 04/106380). Por exemplo, Bargou et al. (Science 321 (2008):974 a 7) relataram recentemente sobre a atividade clínica de uma construção de anticorpo CD19xCD3 biespecífico chamada blinatumomab, que tem o potencial para envolver todas as células T citotóxicas em pacientes humanos para a lise das células cancerosas. As doses tão baixas como 0,005 mg por metro quadrado por dia em doentes de linfoma não Hodgkin levou a uma eliminação de células alvo no sangue. As regressões tumorais completas e parciais foram observadas pela primeira vez com uma dose de 0,015 mg, e todos os sete pacientes tratados com uma dose de 0,06 mg experimentaram a regressão do tumor. Blinatumomab também levou a depuração de células tumorais da medula óssea e fígado. Embora este estudo estabeleceu uma prova clínica de conceito para a potência terapêutica do formato de anticorpo biespecífico de cadeia única no tratamento de câncer de células sanguíneas derivada, existe ainda a necessidade de conceitos de sucesso para as terapias de outros tipos de câncer.

[00010] Em 2008, cerca de 186.320 homens serão diagnosticados com câncer de próstata nos Estados Unidos e cerca de 28.660 homens morrerão da doença. O relatório mais recente sobre a mortalidade por câncer mostra que, em 2004, a taxa global de morte por câncer de próstata entre os homens americanos foi de 25 por 100.000. No final de 1980, a adoção generalizada do antígeno prostático específico (PSA) representou um grande avanço no tratamento do câncer de próstata. Este teste mede a quantidade de proteína de PSA no sangue, o que muitas vezes é elevada em pacientes com câncer da próstata. Em 1986, a U.S. Food e Drug Administration aprovou o uso do teste de PSA para monitorar pacientes com câncer de próstata e, em 1994, adicionalmente, aprovado o seu uso como um teste de rastreio para esta doença. Devido à implementação generalizada de teste de PSA nos Estados Unidos, cerca de 90 por cento de todos os cânceres de próstata são diagnosticados atualmente em um estágio inicial, e, consequentemente, os homens estão sobrevivendo mais após o diagnóstico. No entanto, os resultados de dois ensaios clínicos em curso, o teste de rastreamento da próstata, pulmão, colorretal e ovário patrocinados por NCI, (PLCO) e o Estudo Europeu de triagem para câncer de próstata (ERSPC) serão necessários para determinar se o exame APE realmente salva vidas. Os ensaios clínicos em curso ao longo dos últimos 25 anos têm investigado a eficácia de compostos naturais e sintéticos na prevenção do câncer de próstata. Por exemplo, o Teste de Prevenção do Câncer de Próstata (PCPT), que envolveu cerca de 19.000 homens saudáveis, descobriram que a finasterida, um fármaco aprovado para o tratamento da hiperplasia prostática benigna (BPH), a qual é um alargamento benigno da próstata, reduz o risco de desenvolver câncer de próstata em 25 por cento. Outro julgamento, o selênio e Teste de prevenção de Câncer de vitamina E (SELECT), está estudando mais de 35.000 homens para determinar se suplementos diários de selênio e vitamina E podem reduzir a incidência de câncer de próstata em homens saudáveis. Outros testes de prevenção do câncer de próstata estão atualmente avaliando o potencial de proteção de multivitaminas, vitaminas C e D, soja, chá verde, e licopeno, que é um composto natural encontrado no tomate. Um estudo, realizado em 2005, mostrou que os gêneros específicos foram fundidos em 60 a 80 por cento dos tumores da próstata analisados. Este estudo representa a primeira observação de rearranjos não aleatórios de gêneros no câncer de próstata. Esta alteração genética pode, eventualmente, ser utilizada como um biomarcador para auxiliar no diagnóstico e, possivelmente, o tratamento desta doença. Outros estudos demonstraram que as variações genéticas em uma região específica do cromossoma 8 pode aumentar o risco de um homem desenvolver câncer da próstata. Estas variações genéticas responsáveis por cerca de 25 por cento dos cânceres da próstata que ocorrem em homens brancos. Eles são as primeiras variantes genéticas validadas que aumentam o risco de desenvolver câncer de próstata e pode ajudar os cientistas a entender melhor as causas genéticas da doença. Existe também a investigação em curso que examina como as proteínas circulantes no sangue de um paciente pode ser utilizada para melhorar o diagnóstico do câncer da próstata e outros cânceres. Em 2005, os cientistas identificaram um grupo de proteínas específico que são produzidas pelo sistema imunitário de um paciente em resposta a tumores da próstata. Estas proteínas, um tipo de autoanticorpos, foram capazes de detectar a presença de células cancerosas da próstata em amostras de sangue, com maior precisão do que 90 por cento. Quando utilizado em combinação com o PSA, as proteínas do sangue e outros podem, eventualmente, ser usados para reduzir o número de resultados falso-positivos obtidos com o teste de PSA sozinho e, por conseguinte, reduzir o número de biópsias da próstata desnecessárias que são realizadas em cada ano devido aos resultados do teste de PSA falso-positivos.

[00011] Além do PSA, vários outros marcadores para o câncer da próstata têm sido identificados, incluindo, por exemplo, o antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata (STEAP) (Hubert et al. PNAS 96 (1999), 14523 a 14528), o antígeno de células-tronco da próstata (PSCA) (Reiter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1735 a 1740, 1998) e o antígeno de membrana específico da próstata (PSMA; PSM) (Israeli et al, Cancer Res 53 (1993.). PSMA foi originalmente definido pelo anticorpo monoclonal (MAb) 7E11 derivado a partir da imunização com uma preparação de membrana parcialmente purificada a partir da linhagem de células de linfonodo de adenocarcinoma prostático (LNCaP) (Horoszewicz et al., Anticancer Res. 7 (1987), 927 a 35). O fragmento 2,65-kb de cDNA que codifica a proteína foi clonado e PSMA subsequentemente mapeado no cromossoma 11p11.2 (Israeli et al, loc cit, O'Keefe et al, Biochem Biophys Acta 1443 (1998), 113 a 127). A análise inicial do PSMA demonstrou expressão generalizada dentro das células do epitélio secretor prostático. A marcação imuno-histoquímica mostrou que PSMA estava ausente a moderadamente expresso em tecidos hiperplásicos e benignos, aa etapa que os tecidos malignos corados com maior intensidade (Horoszewicz et al., loc. cit.). As investigações subsequentes têm recapitulado estes resultados e evidenciou expressão de PSMA como uma característica universal em praticamente todos os tecidos da próstata examinadas até à data. Estes relatórios demonstram ainda que a expressão de PSMA aumenta abruptamente proporcional a agressividade do tumor (Burger et al, Int. J. Cancer 100 (2002), 228 a 237, Chang et al, Cancer Res 59 (1999), 3192 a 98, Chang et al, Urology 57 (2001), 1179 a 1183), e Kawakami Nakayama, Cancer Res. 57 (1997), 2321 a 24;. Liu et al., Cancer Res 57 (1997), 3629 a 34;. Lopes et al, Cancer Res. 50 (1990), 6423 a 29, Silver et al, Cancer Res Clin 9 (2003), 6357 a 62; Sweat et al, Urology 52 (1998), 637 a 40, Troyer et al, Int. J. Cancer 62 (1995), 552 a 558; Wright et al, Urology 48 (1996), 326 a 334). Consistente com a correlação entre a expressão PSMA e a fase do tumor, o aumento dos níveis de PSMA estão associados com câncer da próstata independente do androgênio (CaP). Análise de amostras de tecido de pacientes com câncer da próstata demonstrou níveis elevados de PSMA após a castração cirúrgica ou terapia de privação de androgênio. Ao contrário da expressão do antígeno específico da próstata, que é desregulado após ablação do androgênio, expressão de PSMA é significativamente aumentada em ambas espécimes tumorais primárias e metastáticas (Kawakami et al., Wright et ai., Loc. Cit.). Consistente com a expressão elevada em tumores independentes de androgênio, a transcrição PSMA também é conhecida por ser desregulada por meio de esteroides, e a administração de testosterona medeia uma redução dramática na proteína PSMA e níveis de mRNA (Israeli et al., Cancer Res. 54 (1994), 1807 a 1811, Wright et al, loc cit). PSMA também é altamente expressa em tumores prostáticos secundários e doença metastática oculta. A análise imuno-histoquímica revelou a expressão relativamente intensa e uniforme, PSMA dentro de lesões metastáticas localizadas para os gânglios linfáticos, ossos, tecidos moles, e pulmões em comparação com os tecidos prostáticos benignos (Chang et al (2001), loc cit, Murphy et al, Cancer 78 (1996), 809 a 818; Sweat et al, loc cit). Alguns relatos indicaram também expressão limitada de PSMA em tecidos extraprostáticos, incluindo um subconjunto de túbulos proximais renais, algumas células da membrana da borda em escova do intestino, e as células raras nas criptas intestinais (Chang et al. (1999), Horoszewicz et al., Israel et al. (1994), Lopes et al., Troyer et al., loc. cit.). No entanto, os níveis de PSMA nestes tecidos são geralmente de duas a três ordens de grandeza menos do que as observadas na próstata (Sokoloff et al., Prostate 43 (2000), 150 a 157). PSMA também é expresso na neovasculatura associada ao tumor da maioria dos tumores sólidos examinados ainda não está presente no endotélio vascular normal (Chang et al. (1999), Liu et al., Silver et al., Loc. Cit.). Embora o significado da expressão PSMA dentro da vasculatura é desconhecido, a especificidade para o endotélio associado ao tumor faz de PSMA um alvo potencial para o tratamento de muitas formas de malignidade.

[00012] Embora tenha sido colocado muito esforço na identificação de novos alvos para abordagens terapêuticas para o câncer, o câncer ainda é uma das doenças mais diagnosticadas. Em vista disso, há ainda a necessidade de tratamentos eficazes para o câncer.

[00013] A presente invenção proporciona uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única que compreende um primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε (épsilon) de humano e primata não chimpanzé, em que o epítopo é parte de uma sequência de aminoácidos compreendida no grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6 e 8, e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar ao antígeno de membrana específico da próstata (PSMA).

[00014] Apesar das células T envolverem anticorpos biespecíficos de cadeia única descritos na técnica tendo grande potencial terapêutico no tratamento de doenças malignas, a maioria destas moléculas biespecíficas são limitadas na medida em que são específicas da espécie e reconhecem apenas antígeno humano, e - devido à semelhança genética - provável homólogo do chimpanzé. A vantagem da presente invenção é o fornecimento de um anticorpo biespecífico de cadeia única que compreende um domínio de ligação que exibe especificidade de espécies cruzadas para humanos e primatas não chimpanzés da cadeia CD3 épsilon.

[00015] Na presente invenção, um fragmento polipeptídico de 1 a 27 resíduos de aminoácidos do N-terminal do domínio extracelular de CD3 épsilon foi surpreendentemente identificado que - em contraste com todos os outros epítopos conhecidos de células CD3 épsilon descrito na técnica - mantém a sua integridade na estrutura tridimensional quando retirado do seu ambiente nativo, no complexo CD3 (e, opcionalmente, fundido com uma sequência de aminoácidos heterólogos, tal como EpCAM ou uma imunoglobulina parte Fc). A presente invenção, portanto, proporciona uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única que compreende um primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de um fragmento N-terminal de 1 a 27 resíduos de aminoácidos de polipeptídeo do domínio extracelular de CD3 épsilon (CD3 épsilon, que é, por exemplo, retirada do seu ambiente nativo e/ou constituído por (apresentada na superfície de) uma célula T) do ser humano e pelo menos um primata não chimpanzé de cadeia CD3 épsilon, em que o epítopo é parte de um aminoácido da sequência compreendida no grupo que consiste na SEQ ID NOs: 2, 4, 6 e 8, e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar ao antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). Os primatas não chimpanzé preferenciais são aqui mencionados em outro lugar. Pelo menos, um (ou uma seleção dos mesmos ou todos) do (s) primatas (s) selecionado (s) a partir de Callithrix jacchus; Saguinus oedipus, Saimiri sciureus, e Macaca fascicularis (ou SEQ ID 631 ou 632 ou ambos), é (são) particularmente preferidos. Macaca mulatta, também conhecido como macaco rhesus está também previsto como outro primata preferido. É, portanto, previsto que os anticorpos da presente invenção ligam-se a (são capazes de se ligarem a) o epítopo independente do contexto de um fragmento de 1 a 27 resíduos de aminoácidos de polipeptídeo do domínio extracelular do N-terminal de CD3 épsilon humana e de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus, Saimiri sciureus, e Macaca fascicularis (ou SEQ ID NO: 631 ou 632 ou ambos), e opcionalmente também Macaca mulatta. Uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única que compreende um primeiro domínio de ligação, tal como definido na presente invenção pode ser obtido (é obtenível por) ou podem ser fabricados de acordo com o protocolo estabelecido no WO 2008/119567 (em particular no Exemplo 2 do documento WO 2008/119567). Para este fim, prevê-se a (a) imunização de camundongos com um fragmento de 1 a 27 resíduos de aminoácidos de polipeptídeo do domínio extracelular do N-terminal de CD3 épsilon de humano e/ou Saimiri sciureus, (b) a geração de um anticorpo murino imune scFv biblioteca, (c) a identificação de ligantes específicos de CD3 épsilon por testar a capacidade de se ligar a, pelo menos, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, e 8.

[00016] O contexto de independência do epítopo CD3 fornecido na presente invenção corresponde aos primeiros 27 aminoácidos do N- terminal de CD3 épsilon, ou fragmentos funcionais deste trecho de 27 aminoácidos. A frase "independente de contexto," como utilizado na presente invenção em relação ao epítopo CD3 significa que a ligação da presente invenção descrito na presente invenção, as moléculas de ligação de moléculas/de anticorpo não conduzem a uma mudança ou modificação da conformação, sequência ou estrutura que envolve o determinante antigênico ou epítopo. Em contraste, o epítopo CD3 reconhecido por uma molécula CD3 convencional de ligação (por exemplo, tal como descrito em WO 99/54440 ou WO 04/106380) está localizada sobre a cadeia de CD3 épsilon do C-terminal para os N- terminal de 1 a 27 aminoácidos independentes de contexto do epítopo, em que ele só tem a conformação correta se for integrado no resto da cadeia épsilon e mantido na posição direita estérica por meio da heterodimerização da cadeia épsilon quer com a faixa CD3 ou de cadeia delta. Os domínios de ligação Anti-CD3, como parte de uma molécula de cadeia única PSMAxCD3 biespecífico como aqui proporcionadas têm sido descritos no documento WO 2008/119567. Estes domínios de ligação são gerados (e dirigidos) contra um contexto independente do epítopo CD3 prevendo uma melhoria surpreendente clínica no que respeita à redistribuição das células T e, deste modo, um perfil de segurança mais favorável. Sem estar limitado pela teoria, uma vez que o epítopo CD3 é independente de contexto, formando um subdomínio autônomo suficiente por si próprio sem influência sobre o resto do complexo CD3, o domínio CD3 ligação da molécula biespecífica de cadeia única PSMAxCD3 proporcionado na presente invenção induz mudanças menos alostéricas em conformação CD3 do que as moléculas de ligação convencionais CD3 (como moléculas fornecidas nos documentos WO 99/54440 ou WO 04/106380), que reconhecem os epítopos CD3 dependentes do contexto.

[00017] O contexto de independência do epítopo CD3 que é reconhecido por meio do domínio de CD3 de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção está associado com menos ou nenhuma redistribuição de células T (a redistribuição da célula T iguala com um episódio inicial de queda e recuperação subsequente dos contagem absoluta de células T), durante a fase inicial do tratamento com o referido anticorpo PSMAxCD3 biespecífico de cadeia única da presente invenção. Estes resultados em um melhor perfil de segurança do anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção em comparação com as moléculas de ligação convencionais CD3 conhecidas na técnica, que reconhecem os epítopos CD3 dependentes do contexto. Particularmente, porque a redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação CD3 é um importante fator de risco para eventos adversos, como eventos adversos do SNC, anticorpos PSMAxCD3 de cadeia biespecífica único da presente invenção ao reconhecer um independente de contexto, em vez de um contexto dependente do CD3 epítopo tem uma vantagem substancial sobre a segurança das moléculas de ligação CD3 conhecidas na técnica. Pacientes com tais eventos SNC adversos relacionados à redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais CD3 geralmente sofrem de confusão e desorientação, em alguns casos, também de incontinência urinária. Confusão é uma mudança no estado mental em que o paciente não é capaz de pensar com o seu nível normal de clareza. Geralmente, o paciente tem dificuldades para se concentrar e pensar não só turva quanto incertamente, mas muitas vezes significativamente mais lento. Os pacientes com eventos adversos do SNC relacionados com a redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais CD3 também podem sofrer de perda de memória. Frequentemente, a confusão leva à perda da capacidade de reconhecer pessoas, lugares, tempo ou a data. Sentimentos de desorientação são comuns em confusão, e a capacidade de tomada de decisão é prejudicada. Os eventos adversos SNC relacionados à redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais CD3 pode ainda compreender discurso turvo e/ou dificuldade em encontrar as palavras. Este distúrbio pode prejudicar ambos, a expressão e compreensão da língua, bem como ler e escrever. Além da incontinência urinária, a vertigem e tonturas também podem acompanhar eventos adversos SNC relacionados com a redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais CD3 em alguns pacientes. A manutenção da estrutura tridimensional dentro dos referidos fragmentos de polipeptídeo dos 27 aminoácidos do N-terminal de CD3 épsilon podem ser usados para a geração de, de preferência, seres humanos, os domínios de ligação que são capazes de se ligar ao fragmento N-terminal do polipeptídeo em CD3 épsilon in vitro e para o nativo (subunidade épsilon do CD3) CD3 complexo sobre as células T in vivo com a mesma afinidade de ligação. Estes dados indicam fortemente que o fragmento N-terminal como descrito na presente invenção constitui uma conformação terciária, que é semelhante à sua estrutura normalmente existentes in vivo. Um teste muito sensível para a importância da integridade estrutural dos referidos fragmentos de polipeptídeo dos 27 aminoácidos do N-terminal de CD3 épsilon foi realizado. Os aminoácidos individuais dos fragmentos de polipeptídeo dos 27 aminoácidos do N-terminal de CD3 épsilon foram alterados para alanina (varrimento de alanina) para testar a sensibilidade dos fragmentos de polipeptídeo dos 27 aminoácidos do N-terminal de CD3 épsilon para menor interrupções. Os domínios de ligação específicos CD3, como parte da cadeia de anticorpo biespecífico PSMAxCD3 único da presente invenção foram usados para testar para a ligação com os mutantes de alanina dos fragmentos de polipeptídeo dos 27 aminoácidos do N-terminal de CD3 épsilon (vide WO 2008/119567 ). As trocas individuais dos primeiros cinco resíduos de aminoácidos na extremidade N-terminal do fragmento e dois dos aminoácidos nas posições 23 e 25 dos fragmentos de polipeptídeo dos 27 aminoácidos do N-terminal de CD3 épsilon eram críticos para a ligação das moléculas de anticorpo. A substituição dos resíduos de aminoácidos na região da posição de 1 a 5 resíduos que compõem o Q (glutamina na posição 1), D (ácido aspártico na posição 2), G (glicina na posição 3), N (asparagina na posição 4), e E (ácido glutâmico na posição 5) para Alanina aboliu a ligação do, de preferência anticorpo de cadeia humana, PSMAxCD3 biespecífico único da presente invenção para o referido fragmento. Enquanto que, para pelo menos algumas das, de preferência anticorpo de cadeia humana, PSMAxCD3 biespecífico único da presente invenção, dois resíduos de aminoácidos na extremidade do C-terminal do referido fragmento de T (treonina na posição 23) e I (isoleucina na posição 25) reduziu a energia de ligação para o, de preferência anticorpo de cadeia humana, PSMAxCD3 biespecífico único da presente invenção.

[00018] Inesperadamente, verificou-se que dessa maneira isolado, de preferência humano, PSMAxCD3 anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção não só reconhece o fragmento do N- terminal humano de CD3 épsilon, mas também os correspondentes homólogos fragmentos de CD3 épsilon de primatas, incluindo vários Macacos New -WORLD (Mico, Callithrix jacchus, Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) e Macacos Old - World (Macaca fascicularis, também conhecido como Macacos cinomolgos, ou Macaca mulatta, também conhecido como macaco rhesus). Deste modo, a especificidade multi- primata do anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção foi detectada. As análises de sequências seguintes confirmaram que seres humanos e primatas partilham uma sequência homóloga altamente no estiramento na extremidade do N-terminal do domínio extracelular de CD3 épsilon.

[00019] A sequência de aminoácidos dos referidos fragmentos N- terminais mencionados acima de CD3 épsilon está representada na SEQ ID NO: 2 (humano), SEQ ID NO: 4 (Callithrix jacchus), SEQ ID NO: 6 (Saguinus oedipus), SEQ ID NO: 8 (Saimiri sciureus), SEQ ID NO: 631 QDGNEEMGSI TQTPYQVSISGTTILTC ou SEQ ID NO: 632 QDGNEEMGSITQTPYQVSISG TTVILT (Macaca fascicularis, também conhecido como macaco cinomolgos), e SEQ ID NO: 633 QDGNEEMGSI TQTPYHVSISGTTVILT (Macaca mulatta, também conhecido como macaco rhesus).

[00020] O segundo domínio de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção se liga ao antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). De preferência, o segundo domínio de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia única PSMAxCD3 se liga ao PSMA humano ou um primata não chimpanzé PSMA, mais preferido liga-se ao PSMA humano e um PSMA primata não chimpanzé e, portanto, é trans-espécie específica; mesmo mais preferido para o PSMA humano e o PSMA macaque (e, portanto, é específico de espécies cruzadas também). Particularmente preferido, o PSMA macaque é o macaco Cinomolgo PSMA e/ou o PSMA macaco rhesus. No entanto, não está excluído do âmbito da presente invenção, que o segundo domínio de ligação pode também ligar-se aos homólogos PSMA de outras espécies, tais como para o homólogo de PSMA em roedores.

[00021] O câncer de próstata é o segundo maior caso de câncer em homens. Para 2008, estima-se que 186.320 homens serão diagnosticados com câncer de próstata nos Estados Unidos e cerca de 28.660 homens morrerão da doença. O risco de câncer de próstata é fortemente relacionado à idade: muitos poucos casos são registrados em homens com menos de 50 e de três quartos dos casos ocorrem em homens com mais de 65 anos. O maior número de casos é diagnosticado em pessoas na faixa de 70 a 74 anos de idade. Atualmente, a taxa de crescimento da população idosa é significativamente mais elevada do que a da população total. Por volta de 2025 a 2030, as projeções indicam que a população acima de 60 anos será crescente 3,5 vezes mais rápido que a população total. A proporção de idosos é projetada para mais do dobro em todo o mundo durante o próximo meio século, o que significa que um aumento na incidência de câncer de próstata diagnosticado é esperado para o futuro. A expressão altamente restrita de PSMA e a sua regulação positiva em fases mais avançadas da doença e metastática do câncer da próstata, bem como o seu papel como neoantígeno na vasculatura do tumor de vários tipos diferentes de outros tumores sólidos qualifica PSMA como antígeno alvo atraente para a terapia à base de anticorpo de câncer. Como mostrado nos exemplos a seguir, o anticorpo PSMAxCD3 biespecífico de cadeia única da presente invenção proporciona uma ferramenta vantajosa, a fim de matar as células que expressam PSMA-cancerosas humanas, como exemplificado pela linhagem celular do câncer de próstata LNCaP humano. Além disso, a atividade citotóxica do anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção é mais elevada do que a atividade citotóxica dos anticorpos descritos no estado da técnica. Uma vez que, de preferência, tanto o CD3 e o domínio de PSMA de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção são espécies cruzadas reativas, isto é, específica com os antígenos humanos e primatas não chimpanzé, ele pode ser usado para a avaliação pré-clínica de atividade, segurança e/ ou perfil farmacocinéticos destes domínios de ligação em primatas e - na forma idêntica - como fármaco em seres humanos.

[00022] Vantajosamente, a presente invenção proporciona também anticorpos PSMAxCD3 biespecíficos de cadeia única compreendendo um segundo domínio de ligação que se liga tanto ao PSMA humano e para o homólogo de PSMA macaque, ou seja, o homólogo de um primata não chimpanzé. Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico de cadeia única, dessa maneira, compreende um segundo domínio de ligação que exibe especificidade de espécies cruzadas para o ser humano e um não chimpanzé PSMA primata. Neste caso, a molécula de anticorpo biespecífico idêntico de cadeia única pode ser utilizada tanto para a avaliação pré-clínica de atividade, segurança e/ou perfil farmacocinético desses domínios de ligação em primatas e como fármaco em seres humanos. Colocar em outras palavras, a mesma molécula pode ser usada em estudos animais pré-clínicos, dessa maneira como em estudos clínicos em seres humanos. Isto leva a resultados muito comparáveis e uma potência muito maior-preditiva dos estudos em animais em comparação com as espécies específicas de moléculas substitutas. Uma vez que tanto o CD3 quanto o domínio de PSMA de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção são espécies cruzadas reativas, isto é, com os antígenos específicos dos primatas humanos e não chimpanzé, que pode ser utilizado tanto para a avaliação pré-clínica de atividade de segurança, e/ou o perfil farmacocinético desses domínios de ligação em primatas e - na forma idêntica - como fármaco em seres humanos. Deve entender-se que, em uma modalidade preferida, a especificidade de espécies cruzadas do primeiro domínio e a segunda ligação dos anticorpos da presente invenção é idêntica.

[00023] Verificou-se na presente invenção que é possível gerar um, de preferência humano, anticorpo PSMAxCD3 biespecífico de cadeia única em que a molécula idêntica pode ser utilizada em ensaios com animais pré-clínico, dessa maneira como ensaios clínicos e ainda na terapia em seres humanos. Isto deve-se à identificação inesperada do, de preferência anticorpo de cadeia humana, PSMAxCD3 biespecífico único, a qual, para além de ligação para CD3 épsilon humana e PSMA, respectivamente, (e devido à semelhança genética provável que a contraparte chimpanzé), liga-se também aos homólogos dos referidos antígenos de não primatas, incluindo chimpanzés Macacos do novo mundo e Macacos do velho mundo. Como mostrado nos Exemplos que se seguem, de preferência o dito humano, o anticorpo biespecífico de cadeia PSMAxCD3 único da presente invenção pode ser utilizado como agente terapêutico contra diversas doenças, incluindo, mas não se limitando, ao câncer. O PSMAxCD3 anticorpo biespecífico de cadeia única é particularmente vantajoso para o tratamento do câncer, tumores sólidos, de preferência, mais preferencialmente, carcinomas e câncer da próstata. Em vista do acima exposto, a necessidade de construir um anticorpo PSMAxCD3 substituto biespecífico de cadeia única para testar em uma espécie filogenética distante (de humanos) desaparece. Como resultado, a molécula idêntica pode ser usada em testes pré- clínicos de animais como se destina a ser administrado a seres humanos em ensaios clínicos, bem como após a aprovação do mercado e a administração do fármaco terapêutico. A capacidade de usar a mesma molécula de ensaios em animais pré-clínicos como em administração a seres humanos depois praticamente elimina, ou pelo menos reduz, o perigo de que os dados obtidos em ensaios com animais pré-clínicos tendo aplicabilidade limitada ao caso humano. Em suma, a obtenção de dados de segurança pré-clínicos em animais usando a mesma molécula que irá, na verdade, ser administrados a seres humanos faz muito para assegurar a aplicabilidade dos dados para um cenário humana relevante. Em contraste, em métodos convencionais que utilizam moléculas de substituição, as referidas moléculas de substituição têm de ser molecularmente adaptadas para o sistema de teste de animais utilizados para a avaliação pré-clínica de segurança. Dessa maneira, a molécula a ser utilizada em terapia humana, de fato, difere na sequência e também provavelmente na estrutura da molécula de substituto utilizada em testes pré-clínicos nos parâmetros farmacocinéticos e/ou atividade biológica, com a consequência de que os dados obtidos em ensaios com animais pré-clínicos têm aplicabilidade limitada/transferência para o caso humano. A utilização de moléculas de substituição requer a construção, a produção, purificação e caracterização de uma construção completamente nova. Isto leva a custos adicionais de desenvolvimento e tempo necessários para a obtenção dessa molécula. Em suma, os substitutos têm de ser desenvolvidos separadamente, em adição ao fármaco real a ser utilizado em terapia humana, de modo que duas linhas de desenvolvimento de duas moléculas têm de ser realizadas. Portanto, uma vantagem principal do, de preferência humano, anticorpos PSMAxCD3 de cadeia única biespecíficos da presente invenção exibem especificidade de espécies cruzadas descritas na presente invenção é que a molécula idêntica pode ser utilizada para agentes terapêuticos em seres humanos e em animais de testes pré-clínicos.

[00024] É preferível que pelo menos um dos ditos primeiro e segundo domínios de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção é enxertado com CDR, humanizado ou humano, como definido em maior detalhe abaixo. De preferência, ambos os primeiro e segundo domínios de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção são enxertados com CDR, humanizado ou humano. Para o anticorpo de cadeia, de preferência humano, PSMAxCD3 biespecífico única da presente invenção, a geração de uma resposta imune contra a referida molécula de ligação é excluída, ao máximo possível, de administração da molécula de pacientes humanos.

[00025] Uma outra vantagem principal da, de preferência anticorpo de cadeia humana, PSMAxCD3 biespecífico único da presente invenção é a sua aplicabilidade para testes pré-clínicos em primatas diferentes. O comportamento de um candidato de fármaco em animais deve, idealmente, ser indicativo do comportamento esperado deste candidato a fármaco após a administração a seres humanos. Como resultado, os dados obtidos a partir de testes pré-clínicos, tais devem, portanto, em geral, possuir um poder altamente preditivo para o caso humano. No entanto, como já foi aprendido com o desfecho trágico da recente fase I de ensaios clínicos em TGN1412 (um anticorpo monoclonal CD28), um medicamento candidato pode agir de forma diferente em uma espécie de primatas do que nos seres humanos: Considerando que, em testes pré-clínicos do referido anticorpo nenhum ou apenas limitado adverso os efeitos foram observados em estudos em animais realizados com macacos cinomolgos, seis pacientes humanos desenvolveram falência múltipla de órgãos após a administração do referido anticorpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Os resultados destes dramáticos, não desejados eventos negativos sugerem que pode não ser suficiente para limitar a testes pré-clínicos de apenas um (não primata chimpanzé) espécies. O fato de que o PSMAxCD3 anticorpo de cadeia única biespecífica da presente invenção liga-se a uma série de macacos do novo mundo e do Velho Mundo pode ajudar a ultrapassar os problemas enfrentados no caso mencionado acima. Por conseguinte, a presente invenção proporciona meios e métodos para minimizar as diferenças de espécies em efeitos quando as fármacos para terapia humana estão a ser desenvolvidas e testadas.

[00026] Com o, de preferência humano, o anticorpo PSMAxCD3de cadeia única biespecífico de espécies cruzadas específicas da presente invenção é também já não é necessário adaptar o animal de teste para o candidato a medicamento destinado à administração a seres humanos, como por exemplo, a criação de animais transgênicos. O anticorpo PSMAxCD3, de preferência humano, biespecífico de cadeia única da presente invenção exibem especificidade de espécies cruzadas de acordo com os usos e os métodos da presente invenção podem ser utilizados diretamente para os testes pré-clínicos em primatas não chimpanzé, sem qualquer manipulação genética dos animais. Como é bem conhecido por aqueles versados na técnica, as abordagens em que o animal de teste está adaptado para o candidato de fármaco sempre o risco de que os resultados obtidos em ensaios de segurança pré-clínicos são menos representativos e preditivo para seres humanos, devido à modificação do animal. Por exemplo, em animais transgênicos, as proteínas codificadas pelos transgenes são muitas vezes altamente super-expressos. Dessa maneira, os dados obtidos para a atividade biológica de um anticorpo contra este antígeno proteína pode ser limitado no seu valor preditivo para os seres humanos em que a proteína é expressa em níveis muito mais baixos, mais fisiológicas.

[00027] Uma outra vantagem dos usos do anticorpo PSMAxCD3humano, de preferência de cadeia única biespecífica da presente invenção exibem espécies cruzadas específicas é o fato de chimpanzés como uma espécie em extinção são evitados para testes em animais. Os chimpanzés são os parentes mais próximos aos seres humanos e foram recentemente agrupados na família dos hominídeos com base no sequenciamento do genoma de dados (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Portanto, os dados obtidos com chimpanzé é geralmente considerado como sendo altamente preditivo para seres humanos. No entanto, devido à sua condição de espécies em vias de extinção, o número de chimpanzés, que pode ser utilizado para experiências médicas, é muito limitada. Como indicado acima, a manutenção de chimpanzés para a experimentação animal é, portanto, onerosa e eticamente problemática. Os usos da, de preferência anticorpo PSMAxCD3 de cadeia humano, biespecífico único da presente invenção evitar ambas as objeções éticas e encargos financeiros durante os testes pré-clínicos, sem prejudicar a qualidade aplicabilidade, ou seja, os dados do teste animal obtidos. Em vista disso, os usos do, de preferência anticorpo PSMAxCD3 de cadeia humana, biespecífico único da presente invenção proporcionam uma alternativa razoável para estudos em chimpanzés.

[00028] Ainda uma outra vantagem do, de preferência humano, o anticorpo PSMAxCD3biespecífico de cadeia única da presente invenção é a capacidade de extração de múltiplas amostras de sangue ao usá-lo como parte de testes pré-clínicos de animais, por exemplo no decurso dos estudos farmacocinéticos com animais. As extrações múltiplas de sangue pode ser muito mais facilmente obtida com um primata não chimpanzé do que com animais inferiores, por exemplo, um camundongo. A extração de amostras de sangue múltiplas permite o teste contínuo dos parâmetros de sangue para a determinação dos efeitos biológicos induzidos pelo, de preferência anticorpo PSMAxCD3 de cadeia humana, biespecífico único da presente invenção. Além disso, a extração de amostras de sangue múltiplas permite ao pesquisador avaliar o perfil farmacocinético da, de preferência anticorpo PSMAxCD3 de cadeia humana, biespecífico único da presente invenção, tal como definido na presente invenção. Além disso, os potenciais efeitos colaterais, que podem ser induzidas pelo dito, de preferência humano, o anticorpo PSMAxCD3 biespecífico de cadeia única da presente invenção reflete-se os parâmetros no sangue podem ser medidos em amostras de sangue extraído diferentes durante o decurso da administração do referido anticorpo. Isto permite a determinação do perfil de toxicidade do, de preferência anticorpo PSMAxCD3 de cadeia humana, biespecífico único da presente invenção, tal como definido na presente invenção.

[00029] As vantagens dos anticorpos PSMAxCD3, de preferência humano, de cadeia única biespecífica da presente invenção tal como definido na presente invenção exibe a especificidade de espécies cruzadas que podem ser brevemente resumidos como se segue:

[00030] Em primeiro lugar, o anticorpo PSMAxCD3, de preferência humano, de cadeia única biespecífico da presente invenção tal como definido na presente invenção, em testes pré-clínicos utilizados é o mesmo que o utilizado na terapia humana. Dessa maneira, já não é necessário o desenvolvimento de duas moléculas, que podem diferir nas suas propriedades farmacocinéticas e atividade biológica. Isto é altamente vantajoso na medida em que, por exemplo, os resultados farmacocinéticos estão mais diretamente transferíveis e aplicáveis à fixação humana do que por exemplo em abordagens convencionais substitutas.

[00031] Em segundo lugar, os usos do anticorpo PSMAxCD3, de preferência humano, biespecífico de cadeia único da presente invenção tal como definido na presente invenção para a preparação de agentes terapêuticos em seres humanos é de menor custo e de trabalho intensivo do que as abordagens de substituição.

[00032] Em terceiro lugar, o anticorpo PSMAxCD3, de preferência humano, biespecífico de cadeia única da presente invenção, tal como definido na presente invenção pode ser utilizado para testes pré- clínicos, não só em uma espécie de primata, mas de uma série de diferentes espécies de primatas, limitando dessa maneira o risco de diferenças de potencial entre espécies primatas e humanas.

[00033] Em quarto lugar, o chimpanzé como espécie em perigo para testes em animais pode ser evitado, se desejado.

[00034] Em quinto lugar, várias amostras de sangue podem ser extraídas por extensos estudos farmacocinéticos.

[00035] Em sexto lugar, devido à origem humana das moléculas de ligação, preferivelmente humanas, de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a geração de uma reação imunitária contra as referidas moléculas de ligação é minimizada quando administrado a pacientes humanos. A indução de uma resposta imune com anticorpos específicos para um candidato a fármaco derivado de uma espécie não humana, como por exemplo, um camundongo que conduz ao desenvolvimento de anticorpos humanos anti-camundongos (HAMA) contra moléculas terapêuticas de origem murina está excluída.

[00036] Por último, mas não menos importante, o uso terapêutico do anticorpo PSMAxCD3 biespecífico de cadeia única da presente invenção proporciona uma nova e inventiva abordagem terapêutico para o câncer, tumores sólidos, de preferência, mais preferencialmente, carcinomas e câncer da próstata. Como mostrado, nos exemplos a seguir, o anticorpo PSMAxCD3 biespecífico de cadeia única da presente invenção proporciona uma ferramenta vantajosa para matar as células de câncer da próstata humana expressando PSMA. Além disso, a atividade citotóxica do anticorpo PSMAxCD3 biespecífico de cadeia único da presente invenção é mais elevada do que a atividade dos anticorpos descritos no estado da técnica.

[00037] Como notado acima na presente invenção, a presente invenção proporciona polipeptídeos, ou seja, anticorpos biespecíficos de cadeia única, que compreende um primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε primata humano e não chimpanzé e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar ao PSMA. O segundo domínio de ligação liga-se de preferência para PSMA humano e um não chimpanzé PSMA primata. A vantagem de moléculas de anticorpo de cadeia única biespecífico como candidatos a fármacos cumprindo os requisitos do anticorpo biespecífico de cadeia única preferido da presente invenção é a utilização de tais moléculas em ensaios com animais pré-clínicos, dessa maneira como em estudos clínicos e ainda para a terapia em seres humanos. Em uma modalidade preferida, as transespécies específicas de anticorpos biespecíficos de cadeia única da presente invenção, o segundo domínio de ligação de ligação a PSMA humano. Em uma molécula específica de espécies cruzadas biespecíficas de acordo com a presente invenção, o domínio de ligação de ligação a um epítopo de humanos e não chimpanzé da cadeia épsilon primata CD3 situa na ordem de VH-VL ou VL-VH no N- terminal ou no C-terminal da molécula biespecífica. Exemplos de moléculas específicas de espécies cruzadas biespecíficas de acordo com a presente invenção em diferentes arranjos de VH-VL e a cadeia nos primeiro e o segundo domínios de ligação encontram-se descritos nos exemplos em anexo.

[00038] Como utilizado na presente invenção, um "anticorpo biespecífico de cadeia única" denota uma única cadeia polipeptídica compreendendo dois domínios de ligação. Cada domínio de ligação compreende uma região variável de uma cadeia pesada do anticorpo ("região VH"), em que a região VH do primeiro domínio de ligação ligase especificamente com a molécula CD3 ε, e da região VH do segundo domínio de ligação se liga especificamente ao PSMA. Os dois domínios de ligação estão opcionalmente ligados um ao outro por um espaçador curto de polipeptídeo. Um exemplo não limitativo de um espaçador polipeptídico é Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) e a repetição do mesmo. Cada domínio de ligação pode compreender, adicionalmente, uma região variável de uma cadeia leve de anticorpo ("região VL"), a região VH e a região VL dentro de cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação são ligadas uma à outra através de um ligante polipeptídico, por exemplo, do tipo descrito e reivindicado na EP 623679 B1, mas em qualquer caso, o tempo suficiente para permitir que a região VH e a região VL do primeiro domínio de ligação e da região VH e da região VL do segundo domínio de ligação ao par de uns com os outros de tal modo que, em conjunto, eles são capazes de se ligar especificamente aos respectivos primeiro e segundo domínios de ligação.

[00039] O termo "proteína" é bem conhecido na técnica e descreve os compostos biológicos. As proteínas compreendem uma ou mais cadeias de aminoácidos (polipeptídeos), em que os aminoácidos estão ligados entre si através de uma ligação peptídica. O termo "polipeptídeo" tal como utilizado na presente invenção, descreve um grupo de moléculas, que consiste em mais de 30 aminoácidos. De acordo com a presente invenção, o grupo de polipeptídeos compreende "proteínas", desde que as proteínas consistem em uma única cadeia polipeptídica. Também em conformidade com a definição do termo "polipeptídeo", o mesmo descreve fragmentos de proteínas, desde que esses fragmentos consistem em mais de 30 aminoácidos. Os polipeptídeos podem ainda formar multímeros, tais como dímeros, trímeros e oligômeros maiores, isto é, que consiste em mais do que uma molécula de polipeptídeo. As moléculas polipeptídicas que formam tais dímeros, trímeros, etc, podem ser idênticas ou não idênticas. As correspondentes estruturas de ordem superior de tais multímeros são, consequentemente, denominadas homo- ou heterodímeros, homo- ou heterotrímeros etc. Um exemplo para um hereteromultímero é uma molécula de anticorpo, o qual, na sua forma de ocorrência natural, é constituído por duas cadeias polipeptídicas leves idênticas e duas cadeias polipeptídicas pesadas idênticas. Os termos "polipeptídeo" e "proteína" referem-se também a polipeptídeos/proteínas modificadas naturalmente, em que a modificação é efetuada por exemplo, por meio das modificações pós- traducionais tais como a glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Tais modificações são bem conhecidas na técnica.

[00040] O termo "domínio de ligação" caracteriza a ligação com a presente invenção, um domínio de um polipeptídeo que se liga especificamente a/interage com uma dada estrutura/alvo/antígeno/epítopo. Dessa maneira, o domínio de ligação é uma "interação antígeno-local". O termo "interação antígeno-local" define, de acordo com a presente invenção, um motivo de um polipeptídeo, o qual é capaz de interagir, especificamente, com um antígeno específico ou um grupo específico de antígenos, por exemplo, o antígeno idêntico em diferentes espécies. A dita ligação/interação é entendida também para definir um "reconhecimento específico". O termo "reconhece especificamente" significa, de acordo com a presente invenção, que a molécula de anticorpo é capaz de interagir especificamente com e/ou de ligação para pelo menos dois, preferivelmente pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro aminoácidos de um antígeno, por exemplo, o antígeno CD3 humano, tal como definido no presente documento. Tais ligação podem ser exemplificadas por meio da especificidade de uma "fechadura e chave de princípio". Dessa maneira, os motivos específicos na sequência de aminoácidos do domínio de ligação e o antígeno ligam uns aos outros como um resultado da sua estrutura primária, secundária ou terciária, dessa maneira como o resultado de modificações secundárias da referida estrutura. A interação específica do sítio de interação com o antígeno com o seu antígeno específico pode resultar também em uma ligação simples do sítio ao dito antígeno. Além disso, a interação específica do domínio de ligação/sítio de interação do antígeno com o seu antígeno específico pode, alternativamente, provocar o desenvolvimento de um sinal, por exemplo, devido à indução de uma alteração de conformação do antígeno, uma oligomerização do antígeno, etc. Um exemplo preferido de um domínio de ligação de acordo com a presente invenção é um anticorpo. O domínio de ligação pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal ou derivado de um anticorpo monoclonal ou policlonal.

[00041] O termo "anticorpo" compreende derivados ou fragmentos funcionais dos mesmos que ainda mantêm a especificidade de ligação. As técnicas para a produção de anticorpos são bem conhecidas na técnica e descritos, por exemplo, em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, Harlow e Lane " Antibodies: Using Anticorpies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, e Little "Recombinant Antibodies for Immunotheraphy" Cambridge University Press 2009. O termo "anticorpo" também inclui as imunoglobulinas (Igs) de diferentes classes (por exemplo, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) e subclasses (tais como IgG1, IgG2, etc.).

[00042] A definição do termo "anticorpo" também inclui as modalidades tais como a cadeia quimérica única e anticorpos humanizados, bem como fragmentos de anticorpos, tais como, inter alia, fragmentos Fab. Os fragmentos de anticorpos ou os derivados dos mesmos compreendem ainda fragmentos F(ab')2, Fv, scFv ou anticorpos de domínio único, domínio único variável de anticorpos de imunoglobulina ou domínio único de domínio variável que compreende apenas uma variável, que pode ser de VH ou VL, que se ligam especificamente a um antígeno ou epítopo independente de outras regiões ou domínios V, vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988) e (1999) e Little (2009), loc. cit. Tal domínio variável de imunoglobulina simples, abrange não só um anticorpo de domínio único isolado variável polipeptídeo, mas também polipeptídeos maiores que compreendem um ou mais monômeros de uma sequência de domínio variável de anticorpo de polipeptídeo único.

[00043] Vários procedimentos são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para a produção de tais anticorpos e/ou fragmentos. Dessa maneira, os derivados (do anticorpo) podem também ser produzidos por meio dos peptidomiméticos. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (vide, inter alia, Patente U.S. 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única específicos de polipeptídeo (s) eleito (s). Além disso, os animais transgênicos podem ser utilizados para expressar anticorpos humanizados ou humanos específicos para polipeptídeos e proteínas de fusão da presente invenção. Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica, proporcionando os anticorpos produzidos por meio das culturas contínuas de linhagens de células podem ser utilizados. Exemplos de tais técnicas incluem a técnica de hibridoma (Kohler e Milstein Nature 256 (1975), 495 a 497), a técnica do trioma, técnica do hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) e a técnica do hibridoma-EBV para produzir os anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies e Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77 a 96). A ressonância de plasma de superfície, como empregue no sistema BIAcore pode ser utilizada para aumentar a eficiência de anticorpos de fagos que se ligam a um epítopo de um polipeptídeo alvo, tais como CD3 épsilon ou PSMA (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97 a 105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7 a 13). Prevê- se igualmente no âmbito da presente invenção que o termo "anticorpo" compreende os construtos de anticorpo, que podem ser expressos em um hospedeiro, tal como descrito na presente invenção a seguir, por exemplo, os construtos de anticorpo que podem ser transfectados e/ou transduzidos por, inter alia, vetores plasmídicos ou vírus.

[00044] O termo "ligação específica", tal como utilizado de acordo com a presente invenção significa que o domínio de ligação não tem ou significativamente não reage de forma cruzada com os polipeptídeos que têm estrutura similar, como os que se dirigiram para o domínio de ligação, e que pode ser expressa por uma mesma célula como o polipeptídeo de interesse. A reatividade cruzada de um painel de domínios de ligação sob investigação pode ser testada, por exemplo, por meio da avaliação de ligação do dito painel de domínios de ligação sob condições convencionais (vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988) e (1999) e Little (2009), loc. cit. Exemplos para a interação específica de um domínio de ligação com um antígeno específico compreendem a especificidade de um ligante para o seu receptor. A dita definição compreende particularmente a interação de ligantes, que induzem um sinal na ligação ao seu receptor específico. Os ditos de exemplos de interação, que também é especialmente constituído por meio da referida definição, é a interação de um determinante antigênico (epítopo) com o domínio de ligação (sítio de ligação antigênica) de um anticorpo.

[00045] O termo "especificidade cruzada de espécies" ou "especificidade interespécies", tal como utilizado na presente invenção, designa a ligação de um domínio de ligação descrito na presente invenção para a molécula alvo mesmo em seres humanos e primatas não chimpanzé. Dessa maneira, a "especificidade cruzada de espécie" ou "especificidade inter-espécies" é para ser entendido como as interespécies de reatividade para a mesma molécula de "X", expressas em diferentes espécies, mas não para uma molécula diferente de "X". A especificidade cruzada de espécies de um anticorpo monoclonal que reconhece CD3 humano épsilon, para um primata não chimpanzé CD3 épsilon, por exemplo, CD3 épsilon de macaque, podem ser determinados, por exemplo, através de análise FACS. A análise FACS é realizada de um modo que o anticorpo monoclonal respectivo é testado para a ligação a células humanas e primatas não chimpanzé de, por exemplo, células de macacos, expressando os referidos antígenos de CD3 épsilon de humanos e primatas não chimpanzé, respectivamente. Um ensaio apropriado é mostrado nos exemplos seguintes. O objeto acima mencionado é aplicável a mutatis mutandis para o antígeno PSMA: A especificidade de espécies cruzadas de um anticorpo monoclonal que reconhece, por exemplo, PSMA humano, com um PSMA primata não chimpanzé, por exemplo, macaque PSMA, pode ser determinado, por exemplo, através de análise FACS. A análise FACS é realizada de um modo que o anticorpo monoclonal respectivo é testado para a ligação a células humanas e não chimpanzé de primatas, por exemplo, células de macacos, expressando os referidos antígenos PSMA humanos e primatas não chimpanzé , respectivamente.

[00046] Tal como utilizado na presente invenção, CD3 épsilon denota uma molécula expressa como parte do receptor de célula T e tem o significado como geralmente lhe é atribuído na técnica anterior. No ser humano, que engloba de forma individual ou de forma independente combinou todas as subunidades CD3conhecidas, por exemplo, CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gama, CD3 zeta, CD3 alfa e CD3 beta. Os antígenos de primata não chimpanzé, não humanos, como aqui referidos são, por exemplo, CD3 de Macaca fascicularis e CD3 de Macaca mulatta. Na Macaca fascicularis, que engloba CD3 épsilon FN- 18 negativo e CD3 épsilon FN-18 positivo, CD3 gama e CD3 delta. Na Macaca mulatta, que engloba CD3 épsilon, CD3 gama e CD3 delta. Preferencialmente, o referido CD3, tal como utilizado na presente invenção é CD3 épsilon.

[00047] O CD3 épsilon humano está indicado em número de acesso GenBank No.NM_000733 e compreende SEQ ID NO: 1. O CD3 gama humano é indicada no número de acesso GenBank NO. NM_000073. O CD3 delta humano é indicado no número de acesso GenBank NM_000732.

[00048] O CD3 épsilon "FN-18 negativo" de Macaca fascicularis (isto é CD3 épsilon não reconhecido pelo anticorpo monoclonal FN-18 devido a um polimorfismo tal como descrito acima) está indicado no número de acesso GenBank AB073994.

[00049] O CD3 épsilon "FN-18 positivo" de Macaca fascicularis (isto é CD3 épsilon reconhecido pelo anticorpo monoclonal FN-18) é indicada no número de acesso GenBank AB073993. O CD3 gama de Macaca fascicularis é indicado no número de acesso GenBank AB073992. O CD3 delta de Macaca fascicularis é indicado no número de acesso GenBank AB073991.

[00050] As sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos dos respectivos homólogos de CD3 épsilon gama e delta de Macaca mulatta podem ser identificadas e isoladas por meio de técnicas recombinantes descritas na técnica (Sambrook et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3 a edição, 2001). Isto aplica-se, mutatis mutandis, para os homólogos de CD3 épsilon, gama e delta de outros primatas não chimpanzé tal como definidos na presente invenção. A identificação da sequência de aminoácidos de Callithrix jacchus, Saimiri sciureus e Saguinus oedipus é descrito nos exemplos em anexo. A sequência de aminoácidos do domínio extracelular do CD3 épsilon de Callithrix jacchus é representada na SEQ ID NO: 3, a um dos Saguinus oedipus é representada na SEQ ID NO: 5 e a um dos Saimiri sciureus é representada na SEQ ID NO: 7.

[00051] O PSMA humano está indicado no número de acesso GenBank 'AY101595'. A clonagem do homólogo de PSMA de macaco é demonstrada nos exemplos a seguir, as correspondentes sequências de cDNA e de aminoácidos são mostradas na SEQ ID NOs: 223 e 224, respectivamente.

[00052] Em conformidade com o acima exposto, o termo "epítopo" define um determinante antigênico, o qual é especificamente ligado/identificados por um domínio de ligação como definido na presente invenção. O domínio de ligação pode ligar-se especificamente a/interagir com epítopos conformacionais ou contínuos, que são únicas para a estrutura de alvo, por exemplo, a cadeia CD3 épsilon de humano e primata não chimpanzé ou o PSMA humano e primata não chimpanzé. Um epítopo conformacional ou descontínuo é caracterizado por antígenos polipeptídicos pela presença de dois ou mais resíduos de aminoácidos discretas que são separados na sequência primária, mas se juntam na superfície da molécula de polipeptídeo, quando as pregas na proteína nativa/antígeno (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Lavide, (1990) Cell 61, 553 a 6). Os dois ou mais resíduos de aminoácidos discretas que contribuem para o epítopo está presente em seções separadas de uma ou mais cadeia (s) de polipeptídeo (s). Estes resíduos se juntam na superfície da molécula que a (s) cadeia (s) polipeptídica (s) prega em uma estrutura tri-dimensional a fim de constituir o epítopo. Em contraste, um epítopo contínuo ou linear composto por dois ou mais resíduos de aminoácidos discretos, que estão presentes em um único segmento linear de uma cadeia polipeptídica. Dentro da presente invenção, um epítopo CD3 "dependente do contexto" refere-se a conformação do dito epítopo. Tal epítopo dependente do contexto, localizado na cadeia de CD3 épsilon, apenas pode desenvolver a sua conformação correta se for integrado no resto da cadeia épsilon e mantido na posição correta por meio da heterodimerização da cadeia épsilon com qualquer cadeia CD3 gama ou delta . Em contraste, um epítopo CD3 independente de contexto, tal como fornecido na presente invenção refere-se a um resíduo de 1 a 27 aminoácidos do polipeptídeo no N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo de CD3 épsilon. Este resíduo de 1 a 27 aminoácidos do polipeptídeo no N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo, mantém a sua integridade estrutural tridimensional e conformação correta quando retirado do seu ambiente nativo, no complexo CD3. O contexto de independência do resíduo de 1 a 27 aminoácidos do polipeptídeo no N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo, que faz parte do domínio extracelular de CD3 épsilon, representa, portanto, um epítopo que é completamente diferente dos epítopos de CD3 épsilon descrito em ligação com um método para a preparação de moléculas de ligação humanas no documento WO 2004/106380. O referido método utilizado exclusivamente expressa CD3 épsilon recombinante. A conformação do presente CD3 épsilon unicamente recombinante expresso diferia da adotada na sua forma natural, isto é, a forma na qual a subunidade CD3 épsilon do complexo TCR/CD3 existe como parte de um complexo não covalente com o delta CD3 ou gama CD3 da subunidade do complexo de RCT/CD3. Quando tal exclusivamente expressa a proteína recombinante CD3 épsilon é utilizada como um antígeno para a seleção de anticorpos a partir de uma biblioteca de anticorpos, os anticorpos específicos para esse antígeno são identificados a partir da biblioteca embora tal biblioteca não contém anticorpos com especificidade para antígenos próprios/autoantígenos. Isto é devido ao fato de apenas a proteína recombinante expressa CD3 épsilon não existir in vivo, mas não é um autoantígeno. Por conseguinte, as sub-populações de células B que expressam anticorpos específicos para esta proteína ainda não foram esgotadas in vivo; uma biblioteca de anticorpos construídas a partir de células B tais que contêm o material genético para os anticorpos específicos para a proteína recombinante CD3 épsilon expressa unicamente.

[00053] No entanto, uma vez que o contexto independente do resíduo de 1 a 27 aminoácidos do polipeptídeo no N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo, é um epítopo, que se enovela, na sua forma nativa, os domínios de ligação de acordo com a presente invenção não podem ser identificados por meio de métodos baseados na abordagem descrita em WO 2004/106380. Portanto, verificou-se em testes que as moléculas de ligação como descrito em WO 2004/106380 não são capazes de se ligar aos resíduo de 1 a 27 aminoácidos do polipeptídeo no N-terminal da cadeia CD3 épsilon. Dessa maneira, as moléculas anti-CD3 convencionais de ligação ou moléculas de anticorpo anti-CD3 (por exemplo, tal como descrito em WO 99/54440) se ligam a cadeia CD3 épsilon, em uma posição que é mais no C-terminal do que a situada independente de contexto do resíduo de 1 a 27 aminoácidos do polipeptídeo no N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo proporcionado na presente invenção. As moléculas de anticorpo da técnica anterior OKT3 e UCHT-1 têm também uma especificidade para a subunidade épsilon do complexo TCR/CD3 entre os resíduos de aminoácidos 35 a 85 e, por conseguinte, o epítopo destes anticorpos é também mais localizado no terminal C. Além disso, UCHT-1 liga-se à cadeia de CD3 épsilon, em uma região entre os resíduos de aminoácidos 43 a 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol 1 (1989), 546-50, Kjer- Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675 a 7680; Salmeron, J. Immunol 147 (1991), 3047 a 52). Portanto, da técnica anterior, as moléculas de anti- CD3 não se ligam a e não são dirigidas contra o definido na presente invenção independente de contexto de epítopo de resíduos de 1 a 27 aminoácidos no N-terminal (ou um fragmento funcional do mesmo). Em particular, o estado da técnica não apresenta moléculas de anti-CD3, que se liga especificamente ao epítopo dos resíduos de aminoácidos 1 a 27 N-terminal de contexto independente e que são transversais à espécie de ligação, isto é, específica para humanos e primatas não chimpanzés CD3 épsilon.

[00054] Para a geração de um, de preferência humano, domínio de ligação composto de uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, por exemplo, os anticorpos monoclonais que se ligam a ambos os CD3 épsilon humanos e primatas não chimpanzé (por exemplo, macaco CD3 épsilon) ou anticorpos monoclonais que se ligam a ambos os PSMA humanos e primatas não chimpanzé podem ser usados.

[00055] Como usado na presente invenção, "ser humano" e "homem" refere-se à espécie Homo sapiens. No que diz respeito às utilizações médicas das construções descritas neste documento são envolvidos, pacientes humanos estão a ser tratados com a mesma molécula.

[00056] É preferível que pelo menos um dos ditos primeiro e segundo domínios de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção é enxertado com CDR, humanizado ou humano. De preferência, ambos os primeiro e segundo domínios de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção são enxertados com CDR, humanizado ou humano.

[00057] O termo anticorpo "humano", tal como utilizado na presente invenção, deve ser entendido no sentido de que o anticorpo biespecífico de cadeia única, tal como definido no presente documento, compreende (a) a (s) sequência (s) de aminoácido (s) contida (s) no repertório da linhagem germinativa humana do anticorpo. Para efeitos da presente definição, o referido anticorpo biespecífico de cadeia única pode, portanto, ser considerado humano se for constituído por uma tal sequência de ácido (a) humano da linhagem germinativa (s) de aminoácido, ou seja, se a sequência de aminoácido (s) do anticorpo biespecífico de cadeia única em questão é (são) idêntica (s) a (a) linhagem germinativa humana da expressa sequência de aminoácido (s). Um anticorpo biespecífico de cadeia única, tal como definido na presente invenção, pode também ser considerado como humano se for constituído por (a) sequência (s) que se desviam (s) a partir da sua sequência da linhagem germinativa mais próximo (a) humana (s) por não mais do que seria de esperar devido para a marca de mutação somática. Além disso, os anticorpos de muitos mamíferos não humanos, por exemplo, roedores, tais como camundongos e ratos, compreende as sequências VH CDR3 de aminoácidos que se pode esperar a existir no repertório de anticorpos expressos humanos. Qualquer sequência de tal (is) origem humana ou não humana, que pode ser esperada a existir no repertório humano expresso também seria considerada "humano" para os fins da presente invenção.

[00058] Tal como utilizado na presente invenção, o termo "humanizado", "humanização", as variantes "tipo humano" ou gramaticalmente relacionadas aos mesmos são utilizadas indiferentemente para se referir a um anticorpo biespecífico de cadeia única compreendendo, pelo menos, um dos seus domínios de ligação de pelo menos uma região determinante de complementaridade ("CDR") de um anticorpo não humano ou um fragmento do mesmo. As abordagens de humanização encontram-se descritas, por exemplo, em WO 91/09968 e U.S. 6.407.213. Como exemplos não limitativos, o termo abrange o caso em que uma região variável de pelo menos um domínio de ligação compreende uma região CDR única, por exemplo, a região CDR3 da VH (CDRH3), a partir de um outro animal não humano, por exemplo um roedor, bem como o caso em que uma ou ambas as regiões variáveis compreendem em cada um dos seus respectivos primeiro, segundo e terceiro CDRs das ditas CDRs de animal não humano. No caso em que todas as CDRs de um domínio de ligação do anticorpo biespecífico de cadeia única foram substituídos pelos seus equivalentes correspondentes a partir, por exemplo, um roedor, um tipicamente fala a respeito de "CDR de enxerto", e este termo deve ser entendido como sendo abrangido por meio das variantes do termo "humanizado" ou gramaticalmente relacionado ao mesmo como utilizado na presente invenção. As variantes do termo "humanizado" ou gramaticalmente relacionados do mesmo abrange também os casos em que, para além da substituição de uma ou mais regiões CDR em um VH e/ou VL do primeiro e/ou segundo domínio de ligação adicional de mutação/s (por exemplo, substituições) de, pelo menos, um único aminoácido nas regiões do resíduo/s na estrutura ("FR") entre os CDRs foi/foram efetuadas de tal modo que os aminoácidos em que/essas posições correspondem/s para o amino ácido/s em que a/as posição/s, em que o animal a partir do qual as regiões CDR utilizadas para substituição é/são derivadas. Como é conhecido na técnica, tais mutações individuais muitas vezes são feitas nas regiões de enquadramento na sequência de CDR de enxertos, a fim de restaurar a afinidade original de ligação do anticorpo não humano utilizado como um doador de CDR para a sua molécula alvo. O termo "humanização" pode ainda abranger (a) substituição de aminoácido (s) nas regiões CDR a partir de um animal não humano com o aminoácido (s) de uma região CDR correspondente de um anticorpo humano, para além das substituições do aminoácido nas regiões de estrutura, tal como descrito acima.

[00059] Como usado aqui, o termo "homólogo" ou o termo "homologia" é para ser entendido como se segue: A homologia entre proteínas e DNA é frequentemente celebrada com base de similaridade de sequência, especialmente em bioinformática. Por exemplo, em geral, se dois ou mais gêneros tenham sequências de DNA altamente semelhantes, é provável que elas sejam homólogas. Mas similaridade de sequência pode surgir a partir de ancestrais diferentes: sequências curtas podem ser similares ao acaso, e as sequências podem ser semelhantes porque ambas foram selecionadas para se ligar a uma proteína específica, tal como um fator de transcrição. Tais sequências são semelhantes, mas não homólogas. As regiões de sequências que são homólogas são também chamadas conservadas. Isto não deve ser confundido com a conservação nas sequências de aminoácidos em que o aminoácido em uma posição específica foi alterado, mas as propriedades físico-químicas do aminoácido permanecem inalteradas. As sequências homólogas são de dois tipos: ortólogas e parálogas. As sequências homólogas são ortólogas se estivessem separadas por um evento de especiação: quando uma espécie diverge em duas espécies separadas, as cópias diferentes de um único gênero em espécies resultantes são consideradas ortólogas. Ortólogas, ou gêneros ortólogos, são gêneros em diferentes espécies que são semelhantes um ao outro, porque eles originados a partir de um antepassado comum. A evidência mais forte que os dois gêneros são semelhantes ortólogos é o resultado de uma análise filogenética da linhagem de gêneros. Gêneros que são encontrados dentro de um clado são ortólogos, descendem de um ancestral comum. Ortólogos frequentemente, mas não sempre, têm a mesma função. As sequências ortólogas fornecem informações úteis em estudos taxonômicos de classificação de organismos. O padrão de divergência genética pode ser usado para traçar o parentesco entre os organismos. Dois organismos que estão intimamente relacionados são susceptíveis de mostrar sequências de DNA muito semelhantes entre dois ortólogos. Por outro lado, um organismo que se encontra mais distante evolutivamente de outro organismo é susceptível de apresentar uma maior divergência na sequência de ortólogos em estudo. As sequências homólogas são parálogas se estivessem separadas por um evento de duplicação de gênero: se um gênero em um organismo é repetido para ocupar duas posições diferentes no mesmo genoma, em seguida, as duas cópias são parálogas. Um conjunto de sequências que são parálogas é chamado de parálogos do outro. Parálogos tipicamente têm a mesma função ou similar, mas, por vezes, não: devido à ausência de pressão seletiva sobre original de uma cópia do gênero duplicado, esta cópia é livre para sofrer mutações e adquirir novas funções. Um exemplo pode ser encontrado em roedores, como ratos e camundongos. Os roedores possuem um par de gêneros de insulina parálogos, embora não esteja claro se alguma divergência em função tenha ocorrido. Os gêneros parálogos frequentemente pertencem à mesma espécie, mas isso não é necessário: por exemplo, o gênero da hemoglobina dos seres humanos e do gênero da mioglobina de chimpanzés são parálogos. Este é um problema comum em bioinformática: quando os genomas de diferentes espécies foram sequenciados e os gêneros homólogos foram encontrados, não se pode concluir imediatamente que esses gêneros tenham a mesma função ou semelhante, uma vez que poderia ser parálogos cuja função divergiu.

[00060] Tal como utilizado na presente invenção, um "primata não chimpanzé" ou suas variantes gramaticais refere-se a qualquer animal primata (por exemplo, não humano), mas diferente do chimpanzé, isto é, com exceção de um animal pertencente ao gênero Pan, e incluindo as espécies Pan paniscus e Pan troglodytes, também conhecido como Anthropopithecus troglodytes ou Satyrus Simia. Deve ser entendido, contudo, que é possível que os anticorpos da presente invenção também se podem ligar com os primeiro e/ou segundo domínios de ligação aos epítopos respectivos dos fragmentos/etc. dos referidos chimpanzés. A intenção é simplesmente para evitar os testes em animais, que são levadas a cabo com os chimpanzés, se desejado. Dessa maneira, é também previsto que, em outra modalidade, os anticorpos da presente invenção também se ligam com os seus primeiro e/ou segundo domínios de ligação aos epítopos respectivos de chimpanzés. O "primata", "espécies de primatas", "primatas" ou variantes gramaticais dos mesmos denotam uma ordem de mamíferos eutherian divididos em duas subordens de prossímios e antropoides e macacos compreendendo, macacos e lémures. Especificamente, "primatas" como utilizado na presente invenção compreende a subordem Strepsirrhini (non-tarsier prosimians), incluindo a ordem acima Lemuriformes (o mesmo incluindo the superfamilies Cheirogaleoidea e Lemuroidea), a ordem acima Chiromyiformes (o mesmo incluindo a família Daubentoniidae) e a ordem acima Lorisiformes (o mesmo incluindo as famílias Lorisidae e Galagidae). "Primatas" como usado na presente invenção também compreende a subordem Haplorrhini, incluindo a ordem acima Tarsiiformes (o mesmo incluindo a família Tarsiidae), a ordem acima Simiiformes (o mesmo incluindo Platyrrhini, ou macacos do novo mundo, e Catarrhini, incluindo Cercopithecidea, ou macacos do velho mundo).

[00061] As espécies primatas não chimpanzé pode ser entendidas dentro do significado da presente invenção como sendo um lemur, um tarsier, um gibão, um mico (pertencendo a macacos do novo mundo da família Cebidae) ou um macaco do velho mundo (pertencendo a superfamília Cercopithecoidea).

[00062] Como usado na presente invenção, o termo "macaco do velho mundo" compreende qualquer macaco que se encaixe na superfamília Cercopithecoidea, o mesmo subdividido nas famílias: Cercopithecinae, as quais são principalmente Africana, mas incluem os diversos gêneros de macacos os quais são asiáticos e norte-africanos; e Colobinae, os quais incluem a maioria dos Gêneros asiáticos mas também os macacos africanos colobus.

[00063] Especificamente, dentro da subfamília Cercopithecinae, um primata não chimpanzé vantajoso pode ser a partir da tribo Cercopithecini, dentro do gênero Allenopithecus (Allen's Swamp Macaco, Allenopithecus nigroviridis); dentro do gênero Miopithecus (Angolan Talapoin, Miopithecus talapoin; Gabon Talapoin, Miopithecus ogouensis); dentro do gênero Erythrocebus (Patas Macaco, Erythrocebus patas); dentro do gênero Chlorocebus (Macaco Green, Chlorocebus sabaceus; Grivet, Chlorocebus aethiops; Bale Mountains Vervet, Chlorocebus djamdjamensis; Macaco Tantalus, Chlorocebus tantalus; Macaco Vervet, Chlorocebus pygerythrus; Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); ou dentro do gênero Cercopithecus (Macaco Dryas ou Macaco Salongo, Cercopithecus dryas; Macaco Diana, Cercopithecus diana; Macaco Roloway, Cercopithecus roloway; Macaco Greater Spot-nosed, Cercopithecus nictitans; Macaco Blue, Cercopithecus mitis; Macaco Silvide, Cercopithecus doggetti; Macaco Golden, Cercopithecus kandti; Macaco Sykes's, Cercopithecus albogularis; Macaco Mona, Cercopithecus mona; Macaco Campbell's Mona, Cercopithecus campbelli; Macaco Lowe's Mona, Cercopithecus lowei; Macaco Crested Mona, Cercopithecus pogonias; Macaco Wolf's Mona, Cercopithecus wolfi; Macaco Dent's Mona, Cercopithecus denti; Macaco Lesser Spot-nosed, Cercopithecus petaurista; White-throated Guenon, Cercopithecus erythrogaster; Sclater's Guenon, Cercopithecus sclateri; Red-eared Guenon, Cercopithecus erythrotis; Moustached Guenon, Cercopithecus cephus Macaco; Red-tailed, Cercopithecus ascanius; Macaco L'Hoest's, Cercopithecus lhoesti; Macaco Preuss's, Cercopithecus preussi; Macaco Sun-tailed, Cercopithecus solatus; Macaco Hamlyn's ou Macaco Owl-faced, Cercopithecus hamlyni; Macaco De Brazza's, Cercopithecus neglectus).

[00064] Alternativamente, um primata não chimpanzé vantajoso, também dentro da subfamília Cercopithecinae, mas dentro da tribo Papionini, pode ser a partir de dentro do gênero Macaca (Barbary Macaque, Macaca sylvanus; Lion-tailed Macaque, Macaca silenus; Southern Pig-tailed Macaque ou Beruk, Macaca nemestrina; Northern Pig-tailed Macaque, Macaca leonina; Pagai Island Macaque ou Bokkoi, Macaca pagensis; Siberut Macaque, Macaca siberu; Moor Macaque, Macaca maura; Booted Macaque, Macaca ochreata; Tonkean Macaque, Macaca tonkeana; Heck's Macaque, Macaca hecki; Gorontalo Macaque, Macaca nigriscens; Celebes Crested Macaque ou Black "Ape", Macaca nigra; macaco cinomolgo ou Crab-eating Macaque ou Long-tailed Macaque ou Kera, Macaca fascicularis; Stump-tailed Macaque ou Bear Macaque, Macaca arctoides; Rhesus Macaque, Macaca mulatta; Formosan Rock Macaque, Macaca cyclopis; Japanese Macaque, Macaca fuscata; Toque Macaque, Macaca sinica; Bonnet Macaque, Macaca radiata; Barbary Macaque, Macaca sylvanmus; Assam Macaque, Macaca assamensis; Tibetan Macaque ou Milne-Edwards' Macaque, Macaca thibetana; Arunachal Macaque ou Munzala, Macaca munzala); dentro do gênero Lophocebus (Gray-cheeked Mangabey, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; Black Crested Mangabey, Lophocebus aterrimus; Opdenbosch's Mangabey, Lophocebus opdenboschi; Highland Mangabey, Lophocebus kipunji); dentro do gênero Papio (Hamadryas Baboon, Papio hamadryas; Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio anubis; Yellow Baboon, Papio cynocephalus; Chacma Baboon, Papio ursinus); dentro do gênero Theropithecus (Gelada, Theropithecus gelada); dentro do gênero Cercocebus (Sooty Mangabey, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus atys lunulatus; Collared Mangabey, Cercocebus torquatus; Agile Mangabey, Cercocebus agilis; Golden-bellied Mangabey, Cercocebus chrysogaster; Tana River Mangabey, Cercocebus galeritus; Sanje Mangabey, Cercocebus sanjei); ou dentro do gênero Mandrillus (Mandrill, Mandrillus sphinx; Drill, Mandrillus leucophaeus).

[00065] Mais preferido é Macaca fascicularis (também conhecido como Macaco cinomolgo e, portanto, nos Exemplos nomeados "Cinomolgo") e Macaca mulatta (macaco rhesus, nomeado "rhesus").

[00066] Dentro da subfamília Colobinae, um primata não chimpanzé vantajoso pode ser a partir do grupo africano, dentro do gênero Colobus (Black Colobus, Colobus satanas; Angola Colobus, Colobus angolensis; King Colobus, Colobus polykomos; Ursine Colobus, Colobus vellerosus; Mantled Guereza, Colobus guereza); dentro do gênero Piliocolobus (Western Red Colobus, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; Pennant's Colobus, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; Preuss's Red Colobus, Piliocolobus preussi; Thollon's Red Colobus, Piliocolobus tholloni; Central African Red Colobus, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; Ugandan Red Colobus, Piliocolobus tephrosceles; Uzyngwa Red Colobus, Piliocolobus gordonorum; Zanzibar Red Colobus, Piliocolobus kirkii; Tana River Red Colobus, Piliocolobus rufomitratus); ou dentro do gênero Procolobus (Olive Colobus, Procolobus verus).

[00067] Dentro da subfamília Colobinae, um primata não chimpanzé vantajoso pode ser alternativamente a partir do grupo Langur (leaf macaco), dentro do gênero Semnopithecus (Nepal Gray Langur, Semnopithecus schistaceus; Kashmir Gray Langur, Semnopithecus ajax; Tarai Gray Langur, Semnopithecus hector; Northern Plains Gray Langur, Semnopithecus entellus; Black-footed Gray Langur, Semnopithecus hypoleucos; Southern Plains Gray Langur, Semnopithecus dussumieri; Tufted Gray Langur, Semnopithecus priam); dentro do grupo T. vetulus ou do gênero Trachypithecus (Purplefaced Langur, Trachypithecus vetulus; Nilgiri Langur, Trachypithecus johnii); dentro the T. cristatus grupo of do gênero Trachypithecus (Javan Lutung, Trachypithecus auratus; Silvery Leaf Macaco ou Silvery Lutung, Trachypithecus cristatus; Indochinese Lutung, Trachypithecus germaini; Tenasserim Lutung, Trachypithecus barbei); dentro do grupo T. obscurus do gênero Trachypithecus (Dusky Leaf Macaco ou Spectacled Leaf Macaco, Trachypithecus obscurus; Phayre's Leaf Macaco, Trachypithecus phayrei); dentro do grupo T. pileatus do gênero Trachypithecus (Capped Langur, Trachypithecus pileatus; Shortridge's Langur, Trachypithecus shortridgei; Gee's Golden Langur, Trachypithecus geei); dentro do grupo T. francoisi do gênero Trachypithecus (Francois' Langur, Trachypithecus francoisi; Hatinh Langur, Trachypithecus hatinhensis; White-headed Langur, Trachypithecus poliocephalus; Laotian Langur, Trachypithecus laotum; Delacour's Langur, Trachypithecus delacouri; Indochinese Black Langur, Trachypithecus ebenus); ou dentro do gênero Presbytis (Sumatran Surili, Presbytis melalophos; Banded Surili, Presbytis femoralis; Sarawak Surili, Presbytis chrysomelas; White-thighed Surili, Presbytis siamensis; White-fronted Surili, Presbytis frontata; Javan Surili, Presbytis comata; Thomas's Langur, Presbytis thomasi; Hose's Langur, Presbytis hosei; Maroon Leaf Macaco, Presbytis rubicunda; Mentawai Langur ou Joja, Presbytis potenziani; Natuna Island Surili, Presbytis natunae).

[00068] Dentro da subfamília Colobinae, um primata não chimpanzé vantajoso pode ser alternativamente a partir de um grupo Odd-Nosed, dentro do gênero Pygathrix (Red-shanked Douc, Pygathrix nemaeus; Black-shanked Douc, Pygathrix nigripes; Gray-shanked Douc, Pygathrix cinerea); dentro do gênero Rhinopithecus (Golden Snub-nosed Macaco, Rhinopithecus roxellana; Black Snub-nosed Macaco, Rhinopithecus bieti; Gray Snub-nosed Macaco, Rhinopithecus brelichi; Tonkin Snubnosed Langur, Rhinopithecus avunculus); dentro do gênero Nasalis (Proboscis Macaco, Nasalis larvatus); ou dentro do gênero Simias (Pigtailed Langur, Simias concolor).

[00069] Como usado na presente invenção, o termo "mico" refere-se a qualquer um dos Macacos do novo mundo do gênero Callithrix, por exemplo, pertencendo a Atlantic marmosets do subgênero Callithrix (sic!) (Common Marmoset, Callithrix (Callithrix) jacchus; Black-tufted Marmoset, Callithrix (Callithrix) penicillata; Wied's Marmoset, Callithrix (Callithrix) kuhlii; White-headed Marmoset, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; Buffy-headed Marmoset, Callithrix (Callithrix) flaviceps; Buffy- tufted Marmoset, Callithrix (Callithrix) aurita); pertencendo ao Amazonian marmosets do subgênero Mico (Rio Acari Marmoset, Callithrix (Mico) acariensis; Manicore Marmoset, Callithrix (Mico) manicorensis; Silvery Marmoset, Callithrix (Mico) argentata; White Marmoset, Callithrix (Mico) leucippe; Emilia's Marmoset, Callithrix (Mico) emiliae; Black-headed Marmoset, Callithrix (Mico) nigriceps; Marca's Marmoset, Callithrix (Mico)marcai; Black-tailed Marmoset, Callithrix (Mico) melanura; Santarem Marmoset, Callithrix (Mico) humeralifera; Maués Marmoset, Callithrix (Mico) mauesi; Gold-e-white Marmoset, Callithrix (Mico) chrysoleuca; Hershkovitz's Marmoset, Callithrix (Mico) intermedia; Satéré Marmoset, Callithrix (Mico) saterei); Roosmalens' Dwarf Marmoset pertencendo ao subgênero Callibella (Callithrix (Callibella) humilis); ou Pygmy Marmoset pertencendo ao subgênero Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).

[00070] Outro gênero de Macacos do novo mundo compreendem saguis do gênero Saguinus (compreendendo o grupo S. oedipus, o grupo S. midas, o grupo S. nigricollis, o grupo S. mystax, o grupo S. bicolor e o grupo S. inustus) e macacos-de-cheiro do gênero Samiri (por exemplo Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini)

[00071] Em uma modalidade preferida da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, um primata não chimpanzé é um macaco do novo mundo. Em uma modalidade mais preferida, o macaco do novo mundo é um macaco do gênero Papio gênero Macaque. De uma maneira mais preferida, o macaco do gênero Macaque é Assamese macaque (Macaca assamensis), Barbary macaque (Macaca sylvanus), Bonnet macaque (Macaca radiata), Booted ou Sulawesi-Booted macaque (Macaca ochreata), Sulawesi- crested macaque (Macaca nigra), Formosan rock macaque (Macaca cyclopsis), Japanese snow macaque ou Japanese macaque (Macaca fuscata), Cynomologus macaco ou crab-eating macaque ou long-tailed macaque ou Java macaque (Macaca fascicularis), Lion-tailed macaque (Macaca silenus), Pigtailed macaque (Macaca nemestrina), Rhesus macaque (Macaca mulatta), Tibetan macaque (Macaca thibetana), Tonkean macaque (Macaca tonkeana), Toque macaque (Macaca sinica), Stump-tailed macaque ou Red-faced macaque ou Bear macaco (Macaca arctoides), ou Moor macaque (Macaca maurus). Mais preferivelmente, o macaco do gênero Papio é Hamadryas Baboon, Papio hamadryas; Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio anubis; Yellow Baboon, Papio cynocephalus; Chacma Baboon, Papio ursinus.

[00072] Em uma modalidade preferida alternativa, a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, um primata não chimpanzé é um macaco do novo mundo. Em uma modalidade mais preferida de polipeptídeo, o macaco do novo mundo é um macaco do gênero Callithrix (sagui), do gênero ou da espécie Saguinus Samiri. Mais preferivelmente, o macaco do gênero Callithrix é Callithrix jacchus, o macaco do gênero Saguinus é Saguinus oedipus e o macaco do gênero Samiri é Saimiri sciureus.

[00073] O termo "antígeno de superfície celular" como utilizado na presente invenção denota uma molécula, que é exibida na superfície de uma célula. Na maioria dos casos, esta molécula será localizada dentro ou sobre a membrana plasmática da célula de tal modo que pelo menos uma parte dessa molécula permanece acessível a partir do exterior da célula na forma terciária. Um exemplo não limitativo de uma molécula de superfície celular, que está localizada na membrana plasmática é uma proteína transmembrana que compreende, na sua conformação terciária, regiões de hidrofilicidade e hidrofobicidade. Aqui, pelo menos uma região hidrofóbica permite que a molécula da superfície celular para ser incorporada ou inserida na membrana plasmática celular hidrofóbica, enquanto as regiões hidrofílicas estendem em ambos os lados da membrana plasmática para o citoplasma e no espaço extracelular, respectivamente. Exemplos não limitativos de moléculas da superfície celular que estão localizados na membrana plasmática são proteínas que foram modificadas em um resíduo de cisteína para suportar um grupo palmitoíla, proteínas modificadas em um resíduo de cisteína C-terminal para suportar um grupo farnesila, ou proteínas que foram modificadas no C-terminal para dar umaâncora de glicosil fosfatidil inositol ("GPI"). Estes grupos permitem a ligação covalente de proteínas para a superfície externa da membrana de plasma, onde permanecerão acessíveis para reconhecimento pelas moléculas extracelulares, tais como anticorpos. Exemplos de antígenos de superfície celular são CD3 épsilon e PSMA. Tal como descrito na presente invenção acima, PSMA é um antígeno da superfície celular que é um alvo para a terapia do câncer, incluindo, mas não se limitando a tumores sólidos, de preferência, carcinomas e câncer da próstata.

[00074] À luz disto, PSMA pode também ser caracterizado como um antígeno de tumor. O termo "antígeno de tumor", tal como utilizado na presente invenção, pode ser entendido como os antígenos que são apresentados em células tumorais. Estes antígenos podem ser apresentados na superfície da célula, com uma parte extracelular, que é frequentemente combinada com uma parte da transmembrana e citoplasmático da molécula. Estes antígenos podem ser apresentados, por vezes apenas por células tumorais, e nunca para os normais. Os antígenos tumorais podem ser exclusivamente expressos em células de tumor ou podem representar uma mutação específica do tumor em comparação com as células normais. Neste caso, eles são chamados antígenos específicos de tumores. Mais comuns são os antígenos que são apresentados por meio das células de tumor e as células normais, e são chamados antígenos associados a tumores. Estes antígenos associados a tumores podem ser super-expressos em relação a células normais ou são acessíveis para a ligação do anticorpo nas células tumorais devido à estrutura compacta menos do tecido do tumor em comparação com o tecido normal. Um exemplo para um antígeno de tumor, de acordo com a presente invenção é o PSMA.

[00075] Tal como descrito na presente invenção acima a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção liga-se com o primeiro domínio de ligação a um epítopo da cadeia CD3ε (épsilon) de humano e primata não chimpanzé, em que o epítopo é parte de uma sequência de aminoácidos no grupo constituído por 27 resíduos de aminoácidos como ilustrado na SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 8, ou um fragmento funcional do mesmo.

[00076] Em linha com a presente invenção, prefere-se para a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, que diz epítopo é parte de uma sequência de aminoácidos que compreende 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos.

[00077] Mais de preferência, em que o dito epítopo compreende pelo menos a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E).

[00078] Dentro da presente invenção, um fragmento funcional dos resíduos de aminoácido 1 a 27 N-terminal significa que o referido fragmento funcional é ainda um epítopo independente de contexto mantendo a sua integridade estrutural tridimensional quando retirado do seu ambiente nativo, no complexo CD3 (e fusionado com uma sequência de aminoácidos heteróloga, como EpCAM ou uma parte Fc de imunoglobulina, por exemplo, como mostrado no Exemplo 3.1 da patente WO 2008/119567). A manutenção da estrutura tridimensional dentro do fragmento de polipeptídeo de 27 aminoácidos do N-terminal ou fragmento funcional do mesmo de CD3 épsilon podem ser usados para a geração de domínios de ligação que se ligam ao fragmento do polipeptídeo de CD3 épsilon N-terminal in vitro e para o complexo CD3 nativo (CD3 da subunidade de épsilon) em células T in vivo com a mesma afinidade de ligação. Dentro da presente invenção, um fragmento funcional de 1 a 27 resíduos de aminoácidos do N-terminal significa que os domínios de ligação CD3 proporcionados na presente invenção podem ainda ligar-se a estes fragmentos funcionais de uma forma independente de contexto. Aquele que é versado na técnica está ciente dos métodos de mapeamento de epítopos para determinar quais os resíduos de aminoácidos de um epítopo é reconhecido pelo anti-CD3 tais domínios de ligação (por exemplo, varrimento de alanina, vide exemplos de WO 2008/119567).

[00079] Em uma modalidade da presente invenção, a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção compreende um domínio (primeiro) de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3ε humano e de primatas não chimpanzé e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar ao antígeno de superfície celular PSMA.

[00080] Dentro da presente invenção, é ainda preferível que o segundo domínio de ligação que se liga ao antígeno de superfície celular PSMA humano e/ou um PSMA de primata não chimpanzé . Particularmente preferido, o segundo domínio de ligação se liga ao PSMA humano e um PSMA de primata não chimpanzé , de preferência, um PSMA de macaco. É para ser entendido, que o segundo domínio de ligação se liga a pelo menos um PSMA primata não chimpanzé, no entanto, pode também ligar-se a dois, três ou mais, PSMA de primatas não chimpanzé homólogos. Por exemplo, o segundo domínio de ligação pode ligar-se ao PSMA de macaco cinomolgo e PSMA para o macaco Rhesus.

[00081] A presente invenção, incluindo todos os métodos, usos, kits, etc descritos na presente invenção, também se relaciona com os domínios de ligação secundária como tal (ou seja, não no contexto de um anticorpo biespecífico de cadeia única). "Como tal" inclui ainda formatos de anticorpos biespecíficos que não os anticorpos de cadeia única como descrito na presente invenção, por exemplo, fragmentos de anticorpos (compreendendo o domínio secundário), anticorpos humanizados, proteínas de fusão que compreendem os domínios secundários, etc. Formatos de anticorpos que não os anticorpos biespecíficos de cadeia única da presente invenção são também descritos acima na presente invenção.

[00082] Para a geração do segundo domínio de ligação da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, por exemplo, anticorpos biespecíficos de cadeia única, tal como definido na presente invenção, os anticorpos monoclonais que se ligam a ambos o antígeno de superfície da celular PSMA respectivo, tais como humano e/ou primata não chimpanzé podem ser utilizados. Os domínios de ligação apropriados para o polipeptídeo biespecífico como definido na presente invenção, por exemplo podem ser derivados de espécies cruzadas de anticorpos monoclonais específicos por meio dos métodos recombinantes descritos na técnica. Um anticorpo monoclonal de ligação a um antígeno de superfície celular humana e para o homólogo do referido antígeno da superfície celular em primatas não chimpanzé pode ser testada por ensaios de FACS tal como descrito acima. É evidente para os versados na técnica que a interespécies de anticorpos específicos podem também ser gerados por meio de técnicas de hibridoma descrito na literatura (Milstein e Kohler, Nature 256 (1975), 495 a 7). Por exemplo, os camundongos podem ser imunizados alternativamente com antígenos de superfície celular de humanos e primata não chimpanzé , tal como PSMA. A partir destes camundongos, transespécies específicas de células de hibridoma produtoras de anticorpos são isoladas através de tecnologia de hibridoma e analisadas por FACS, como acima definidas. A geração e análise de polipeptídeos biespecíficos, tais como anticorpos biespecíficos de cadeia única que exibem especificidade cruzada de espécies, tal como descrito na presente invenção é mostrado nos exemplos seguintes. As vantagens dos anticorpos biespecíficos de cadeia única que exibem especificidade cruzada de espécies incluem os pontos enumerados na presente invenção.

[00083] É particularmente preferido para a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, que o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3 ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma região VL compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 selecionado de: (a) CDR-L1 como descrito na SEQ ID NO: 27, CDR-L2 como descrito na SEQ ID NO: 28 e CDR-L3 como descrito na SEQ ID NO: 29; (b) CDR-L1 como descrito na SEQ ID NO: 117, CDR-L2 como descrito na SEQ ID NO: 118 e CDR-L3 como descrito na SEQ ID NO: 119; e (c) CDR-L1 como descrito na SEQ ID NO: 153, CDR-L2 como descrito na SEQ ID NO: 154 e CDR-L3 como descrito na SEQ ID NO: 155.

[00084] As regiões variáveis, ou seja, a cadeia leve variável ("L" ou "VL") e a cadeia pesada variável ("H" ou "VH") são conhecidas na técnica para proporcionar o domínio de ligação de um anticorpo. Estas regiões variáveis abrigam as regiões determinantes complementares.

[00085] O termo "região determinante de complementaridade" (CDR) é bem conhecido na técnica para ditar a especificidade do antígeno de um anticorpo. O termo "CDR-L" ou "L CDR" ou "LCDR" refere-se a CDR em VL, enquanto que o termo "CDR-H" ou "H CDR" ou HCDR "refere- se aos CDRs na VH.

[00086] Em uma modalidade preferida alternativa, a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3 ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma região VH compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR H3 selecionado a partir de: (a) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 12, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 13 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 14; (b) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 30, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 31 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 32; (c) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 48, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 49 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 50; (d) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 66, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 67 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 68; (e) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 84, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 85 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 86; (f) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 102, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 103 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 104; (g) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 120, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 121 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 122; (h) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 138, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 139 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 140; (i) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 156, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 157 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 158; e (j) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 174, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 175 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 176.

[00087] É ainda preferido que o domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3 ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma região de VL selecionada a partir do grupo consistindo em uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ou 165.

[00088] É preferível que, alternativamente, o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3 ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma região VH selecionada do grupo consistindo em uma região VH, como representado na SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ou 181.

[00089] Mais preferencialmente, a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção é caracterizado por o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3 ε de humano e primata não chimpanzé, que compreende uma região VL e uma região VH selecionada do grupo consistindo em: (a) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 17 ou 21 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 15 ou 19; (b) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 35 ou 39 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 33 ou 37; (c) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 53 ou 57 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 51 ou 55; (d) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 71 ou 75 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 69 ou 73; (e) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 89 ou 93 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 87 ou 91; (f) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 107 ou 111 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 105 ou 109; (g) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 125 ou 129 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 123 ou 127; (h) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 143 ou 147 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 141 ou 145; (i) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 161 ou 165 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 159 ou 163; e (j) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 179 ou 183 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 177 ou 181.

[00090] De acordo com uma modalidade preferida da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, os pares de regiões VH e regiões VL do primeiro domínio de ligação de ligação de CD3 épsilon estão no formato de um anticorpo de cadeia única (scFv). As regiões VH e VL são dispostas na ordem de VH-VL ou VL- VH. É preferível que a região VH está posicionada no N-terminal a uma sequência de ligação. A região VL está posicionada C-terminalmente da sequência ligante. Colocar em outras palavras, a disposição de domínio no domínio CD3 da ligação da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção é de preferência de VH-VL, com o referido domínio de ligação CD3 localizado no C-terminal para o segundo (antígeno de superfície celular, tal como PSMA) domínio de ligação. Preferivelmente, o VH-VL compreende ou é SEQ ID NO: 185.

[00091] Uma modalidade preferida da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única acima descrita da presente invenção é caracterizada por o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de cadeia CD3ε de humano e de primatas não chimpanzé compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ou 187.

[00092] A presente invenção diz ainda respeito a um anticorpo biespecífico de cadeia única descrito acima, em que o segundo domínio de ligação liga-se ao antígeno de superfície celular PSMA.

[00093] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única acima caracterizada compreende um grupo de uma das seguintes sequências como CDR H1, H2 CDR, CDR H3, L1 CDR, CDR L2 e L3 de CDR no segundo domínio de ligação selecionado entre o grupo que consiste em: a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 226-228 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 231-233; b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 240-242 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 245-247; c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 254-256 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 259-261; d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 268-270 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 273-275; e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 618-620 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 623-625; f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 282-284 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 287-289; g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 296-298 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 301-303; h) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 310-312 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 315-317; i) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 324-326 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 329-331; j) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 338-340 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 343-345; k) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 352-354 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 357-359; l) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 366-368 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 371-373; m) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 380-382 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 385-387; n) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 394-396 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 399-401; o) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 408-410 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 413-415; p) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 422-424 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 427-429; q) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 436-438 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 441-443; r) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 450-452 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 455-457; s) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 464-466 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 469-471; t) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 478-480 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 483-485; u) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 492-494 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 497-499; v) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 506-508 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 511-513; w) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 520-522 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 525-527; x) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 534-536 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 539-541; y) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 548-550 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 553-555; z) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 562-564 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 567-569; aa) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 576-578 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 581-583; ab) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 590-592 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 595-597; e ac) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 604-606 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 609-611.

[00094] Um grupo preferido de molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única compreende um grupo de uma das seguintes sequências como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 e CDR L3 no segundo domínio de ligação selecionado a partir do grupo consistindo em: a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 226-228 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 231-233; b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 240-242 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 245-247; c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 254-256 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 259-261; d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 268-270 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 273-275; e e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 618-620 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 623-625.

[00095] Essas moléculas compreendem um segundo domínio de ligação que se liga ao antígeno de superfície celular PSMA consistindo em uma cadeia VH derivada de uma molécula parental PSMA de ligação específica e uma cadeia VL derivada de uma molécula de ligação que tem uma especificidade para um antígeno diferente, por exemplo, para a molécula de adesão das células epiteliais (EpCAM), também conhecida como CD326. Foi surpreendentemente encontrado que as moléculas de ligação com essa combinação específica de uma cadeia VH derivada de uma molécula parental PSMA de ligação específica e uma VL de cadeia derivados de uma molécula de ligação específica parente EpCAM exclusivamente ligam a PSMA, mas não para EpCAM. As especificidades de ligação deste grupo de PSMA específicos domínios de ligação compreendidas na molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção são descritos no exemplo 3 em anexo.

[00096] Outro grupo preferido de molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única compreende um grupo de uma das seguintes sequências como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 e CDR L3 no segundo domínio de ligação selecionado a partir do grupo consistindo em: a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 282-284 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 287-289; b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 296-298 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 301-303; c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 310-312 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 315-317; d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 324-326 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 329-331; e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 338-341 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 343-345; f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 352-354 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 357-359; e g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 366-368 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 371-373.

[00097] Outro grupo preferido também de molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única compreende um grupo das seguintes sequências como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 e CDR L3 no segundo domínio de ligação selecionado a partir do grupo consistindo em: a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 380-382 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 385-387; b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 394-396 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 399-401; c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 408-410 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 413-415; d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 422-424 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 427-429; e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 436-438 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 441-443; f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 450-452 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 455-457; g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 464-466 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 469-471; h) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 478-480 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 483-485; i) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 492-494 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 497-499; j) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 506-508 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 511-513; k) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 520-522 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 525-527; l) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 534-536 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 539-541; m) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 548-550 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 553-555; n) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 562-564 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 567-569; o) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 576-578 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 581-583; p) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 590-592 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 595-597; e q) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 604-606 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 609-611.

[00098] É preferido que a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção que o segundo domínio de ligação ao qual se liga ao antígeno de superfície celular PSMA compreende um grupo das seguintes sequências como as cadeias VH- e VL no segundo domínio de ligação selecionado a partir do grupo consistindo em: a) de SEQ ID NO: b) de SEQ ID NO: c) de SEQ ID NO: d) de SEQ ID NO: e) de SEQ ID NO: f) de SEQ ID NO: g) de SEQ ID NO: VH de SEQ ID VH de SEQ ID VH de SEQ ID VH de SEQ ID VH de SEQ ID VH de SEQ ID VH de SEQ ID uma cadeia VL uma cadeia VL uma cadeia VL uma cadeia VL uma cadeia VL uma cadeia VL uma cadeia VL h) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 314; i) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 328; j) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 342; k) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 356; l) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 370; m) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 384; n) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 398; o) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 412; p) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 426; q) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 440; r) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 454; s) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 468; t) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 482; u) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 496; v) uma cadeia VH de SEQ de SEQ ID NO: 510; w) uma cadeia VH de SEQ ID NO: 519 e uma cadeia VL de SEQ ID NO: 524; x) uma cadeia VH de SEQ ID NO: 533 e uma cadeia VL de SEQ ID NO: 538; y) uma cadeia VH de SEQ ID NO: 547 e uma cadeia VL de SEQ ID NO: 552; z) uma cadeia VH de SEQ ID NO: 561 e uma cadeia VL de SEQ ID NO: 566; aa) uma cadeia VH de SEQ ID NO: 575 e uma cadeia VL de SEQ ID NO: 580; ab) uma cadeia VH de SEQ ID NO: 589 e uma cadeia VL de SEQ ID NO: 594; e ac) uma cadeia VH de SEQ ID NO: 603 e uma cadeia VL de SEQ ID NO: 608.

[00099] As cadeias VH- e VL- acima são também mostradas nas SEQ ID NOs: 235, 249, 263, 277, 627, 291, 305, 319, 333, 347, 361, 375, 389, 403, 417, 431, 445, 459, 473, 487, 501, 515, 529, 543, 557, 571, 585, 599 e 613, respectivamente.

[000100] As sequências (sequência de aminoácidos e sequência de nucleotídeos) das regiões correspondente VL- e VH do segundo domínio de ligação da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, bem como dos respectivos scFvs são mostrados na listagem de sequências.

[000101] Na molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, os domínios de ligação estão dispostos na ordem VL-VH-VH-VL, VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VL ou VH-VL-VH-VL, tal como exemplificado nos exemplos em anexo. Preferencialmente, os domínios de ligação estão dispostos na ordem VH PSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 ou VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3.

[000102] Uma modalidade particularmente preferida da presente invenção diz respeito a um polipeptídeo caracterizado acima, em que a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única compreende uma sequência selecionada a partir de: (a) uma sequência de aminoácido como descrita em qualquer uma das SEQ ID NOs: 237, 251, 265, 279, 629, 293, 307, 321, 335, 349, 363, 377, 391, 405, 419, 433, 447, 461, 475, 489, 503, 517, 531, 545, 559, 573, 587, 601 ou 615; (b) uma sequência de aminoácido codificada por meio de uma sequência de ácido nucleico como descrito em qualquer uma das SEQ ID NOs: 238, 252, 266, 280, 630, 294, 308, 322, 336, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476, 490, 504, 518, 532, 546, 560, 574, 588, 602 ou 616.

[000103] A presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única compreendendo uma sequência de aminoácidos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 237, 251, 265, 279, 629, 293, 307, 321, 335, 349, 363, 377, 391, 405, 419, 433, 447, 461, 475, 489, 503, 517, 531, 545, 559, 573, 587, 601 ou 615, bem como as sequências de aminoácidos de pelo menos 96 % idêntica, preferencialmente 97 %, mais preferido pelo menos 98 % idêntica, mais preferido pelo menos 99 % idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NOs: 237, 251, 265, 279, 629, 293, 307, 321, 335, 349, 363, 377, 391, 405, 419, 433, 447, 461, 475, 489, 503, 517, 531, 545, 559, 573, 587, 601 ou 615. A presente invenção refere-se também às correspondentes sequências de ácidos nucleicos, como descrito em qualquer uma das SEQ ID NOs: 238, 252, 266, 280, 630, 294, 308, 322, 336, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476, 490, 504, 518, 532, 546, 560, 574, 588, 602 ou 616, bem como as sequências de ácidos nucleicos de pelo menos 96 % idêntica, preferencialmente 97 %, mais preferido pelo menos 98 % idêntica, o mais preferido pelo menos 99 % idêntica às sequências de ácido nucleico apresentadas na SEQ ID NOs: 238, 252, 266, 280, 630, 294, 308, 322, 336, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476, 490, 504, 518, 532, 546, 560, 574, 588, 602 ou 616. É para ser entendido que a identidade de sequência é determinada ao longo de toda a sequência nucleotídica ou do aminoácido. Para alinhamentos de sequências, por exemplo, os programas Gap ou BestFit podem ser utilizados (Needleman e Wunsch J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453, Smith e Waterman, Adv. Appl Math 2 (1981), 482 a 489), que está contido no pacote de software GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991). É um método de rotina para aqueles que são versados na técnica para determinar e identificar uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos possuindo por exemplo, 96 % (97 %, 98 % ou 99 %) de identidade de sequência com as sequências de nucleotídeos ou aminoácidos do anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, usando um exemplo dos programas acima mencionados. Por exemplo, de acordo com a hipótese Crick’s Wobble, a base 5' no anti-códon não é tão limitado espacialmente como as outras duas bases, e podem, dessa maneira, ter um emparelhamento de bases não padrão. Colocando em outras palavras: a terceira posição no tripleto um códon pode variar de modo a que dois tripletos que diferem nesta terceira posição pode codificar o mesmo resíduo de aminoácido. A referida hipótese é bem conhecida para aquele que é versado na técnica (vide, por exemplo http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis;. Crick, J Mol Biol 19 (1966): 548 a 55).

[000104] Arranjos de domínio preferenciais nas construções de anticorpo PSMAxCD3 biespecíficos de cadeia única da presente invenção são apresentados nos exemplos seguintes.

[000105] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os anticorpos biespecíficos de cadeia única são espécies cruzadas específicas para CD3 épsilon e para o antígeno de superfície celular PSMA humano e primata não chimpanzé , reconhecidos pelo seu segundo domínio de ligação.

[000106] Em uma modalidade alternativa da presente invenção proporciona uma sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única acima descrito da presente invenção.

[000107] A presente invenção também diz respeito a um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção.

[000108] Muitos vetores adequados são conhecidos para os especialistas em biologia molecular, a escolha de qual vai depender da função desejada e incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores utilizados convencionalmente em engenharia genética. Os métodos que são bem conhecidos para aquele que é versado na técnica pode ser utilizado para construir vários plasmídeos e vetores, vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (Loc cit.) E Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, NY (1989), (1994). Alternativamente, os polinucleotídeos e vetores da presente invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para distribuição a células alvo. Como discutido em maiores detalhes abaixo, um vetor de clonagem foi usado para isolar as sequências individuais de DNA. As sequências relevantes podem ser transferidas para vetores de expressão em que a expressão de um polipeptídeo específico é necessária. Os vetores de clonagem pBluescript SK típicos incluem, pGEM, pUC9, pBR322 e pGBT9. Os vetores de expressão típicos incluem PTRE, PCAL-n-EK, PESP-1, pOP13CAT.

[000109] Preferencialmente, o referido vetor compreende uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência reguladora ligada operativamente a referida sequência de ácido nucleico definidas no presente documento.

[000110] O termo "sequência de regulação" refere-se a sequências de DNA, que são necessárias para efetuar a expressão de sequências codificantes às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Em procariontes, as sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossômica, e terminadores. Em eucariotos, as sequências controle geralmente incluem promotores, terminadores e, em alguns casos, intensificadores, ou fatores de transcrição transativadores. A "sequência controle" pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é necessária para expressão, e pode também incluir componentes adicionais vantajosos.

[000111] O termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes dessa maneira descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar na sua forma pretendida. Uma sequência controle "operativamente ligada" a uma sequência de codificação está ligada de tal modo que a expressão da sequência de codificação é conseguida em condições compatíveis com as sequências de controle. No caso de a sequência controle ser um promotor, é óbvio para aquele que é versado na técnica que a fita dupla de ácido nucleico é de preferência usada.

[000112] Dessa maneira, o vetor é, de preferência, recitado um vetor de expressão. Um "vetor de expressão" é uma construção que pode ser usado para transformar um hospedeiro selecionado para a expressão e proporciona uma sequência de codificação no hospedeiro selecionado. Os vetores de expressão podem ser, por exemplo, vetores de clonagem, vetores binários ou vetores de integração. A expressão compreende a transcrição da molécula de ácido nucleico, de preferência em um mRNA traduzível. Os elementos de regulação que asseguram a expressão em procariotos e/ou células eucarióticas são bem conhecidos para aquele que é versado na técnica. No caso de células eucarióticas, que incluem normalmente promotores que asseguram a iniciação da transcrição e opcionalmente sinais poli-A asseguram a terminação da transcrição e a estabilização do transcrito. Os possíveis elementos de regulação que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o PL, lac, trp ou tac em E. coli, o promotor, e exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucariotas são o promotor AOX1 ou GAL1 na levedura ou o CMV-, SV40, promotor de RSV (vírus do sarcoma de Rous), intensificador de CMV-, intensificador SV40 ou um íntron de globina em células de mamíferos e de outros animais.

[000113] Ao lado de elementos, que são responsáveis pela iniciação de transcrição tais elementos reguladores podem também compreender sinais de terminação da transcrição, tais como o sítio SV40-poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo. Além disso, dependendo do sistema de expressão utilizado sequências líder capaz de dirigir o polipeptídeo para um compartimento celular ou segregá-lo para o meio podem ser adicionados à sequência de codificação da sequência de ácido nucleico recitado e são bem conhecidos na técnica, vide por exemplo, WO 2008/119567. A (s) sequência (s) de comando (s) é (são) montada (s) em fase apropriada com a iniciação da tradução, e sequências de terminação e, de preferência, uma sequência líder capaz de dirigir a secreção da proteína traduzida, ou uma sua porção, para o espaço periplasmático ou meio extracelular. Opcionalmente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação N-terminal conferindo as características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso; vide supra. Neste contexto, os vetores de expressão adequados são conhecidos na técnica, tais como cDNA de vetor de expressão Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA ou pEF- neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 e Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50 (3), 141 a 150) ou pSPORT1 (GIBCO BRL).

[000114] De preferência, as sequências de controle da expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar a transfecção de células hospedeiras eucarióticas, mas as sequências de controle para hospedeiros procariotos podem também ser utilizadas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão de elevado nível das sequências nucleotídicas, e, conforme desejado, a coleta e a purificação da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção pode seguir, vide, por exemplo, os exemplos em anexo.

[000115] Um sistema de expressão alternativo que pode ser utilizado para expressar uma proteína de interação de ciclo celular em um sistema de inseto. Em um tal sistema, o vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é utilizado como vetor para expressar genes exógenos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência codificante de uma molécula de ácido nucleico recitada pode ser clonada em uma região não essencial do vírus, tais como o gene da poliedrina, e colocadas sob o controle do promotor da poliedrina. A inserção bem sucedida da referida sequência de codificação irá tornar o gene da poliedrina inativo e produzir vírus recombinante sem a proteína de revestimento. Os vírus recombinantes são então utilizados para infetar as células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia em que a proteína da presente invenção é expressa (Smith, J. Virol 46 (1983), 584,. Engelhard, Proc Nat Acad Sci EUA 91. (1994), 3224 a 3227).

[000116] Os elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores transcricionais, assim como traducionais. Vantajosamente, os vetores acima descritos da presente invenção compreendem um marcador selecionável e/ou scorable.

[000117] Os genes marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células transformadas e, por exemplo, tecidos de plantas, e as plantas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, resistência antimetabolito como base de seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143 a 149), npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, kanamicina e paromicina (Herrera- Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987 a 995 ) e higro, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481 a 485). Os gêneros adicionais selecionáveis foram descritos, nomeadamente trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc Natl Acad Sci EUA 85 (1988), 8047); isomerase de manose-6- fosfato, que permite que as células utilizem a manose (WO 94/20627) e ODC (ornitina-descarboxilase) que confere resistência ao inibidor da ornitina-descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, Em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed) ou desaminase de Aspergillus terreus, que confere resistência à blasticidina S (Tamura, Biosci Biotechnol Biochem 59 (1995.), 2336 a 2338).

[000118] Marcadores úteis scorable são também conhecidos para aquele que é versado na técnica e estão disponíveis comercialmente. Vantajosamente, o referido marcador é um gene que codifica a luciferase (Giacomin, Pl Sci 116 (1996), 59 a 72, Scikantha, J. Bact 178 (1996), 121), a proteína verde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett 389 (. 1996), 44 a 47) ou beta-glucuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901 a 3907). Esta modalidade é particularmente útil para o rastreio simples e rápida de células, tecidos e organismos que contêm um vetor recitado.

[000119] Como descrito acima, a molécula de ácido nucleico recitado pode ser usado sozinho ou como parte de um vetor para expressar a Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção em células, para, por exemplo, a purificação, mas também para fins de terapia gênica. As moléculas de ácidos nucleicos ou vetores que contêm a (s) sequência (s) de DNA (s) que codifica para qualquer uma das moléculas de anticorpo acima biespecífico de cadeia única descrita na presente invenção é introduzida nas células, que por sua vez, produzem o polipeptídeo de interesse. A terapia gênica, que se baseia na introdução de genes terapêuticos em células por técnicas ex vivo ou in vivo é uma das aplicações mais importantes da transferência de genes. Os vetores adequados, métodos ou sistemas de administração de genes para terapia genética in vitro ou in vivo de encontram-se descritos na literatura e são conhecidos para aquele que é versado na técnica, vide, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534 a 539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911 a 919; Anderson, Science 256 (1992), 808 a 813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370 a 374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 10771086; Onodera, Blood 91 (1998), 30 a 36; Verma, Gênero Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289 a 292; Verzeletti, Hum.. Gênero Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714 a 716; WO 94/29469, WO 97/00957, US 5.580.859; US 5.589.466, ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635 a 640; dos Santos Coura e Nardi Virol J. (2007), 4:99. As moléculas de ácidos nucleicos recitadas e vetores podem ser concebidos para introdução direta ou para introdução através de lipossomas ou vetores virais (por exemplo, adenoviral, retroviral) na célula. De preferência, a referida célula é uma linhagem celular germinal, célula embrionária, ou célula de ovo ou derivados dos mesmos, a maior parte das células, de preferência dito é uma célula- tronco. Um exemplo de uma célula-tronco embrionária pode ser, inter alia, uma célula-tronco, tal como descrito em Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. US 90 (1993), 8424 a 8428.

[000120] A presente invenção também proporciona um hospedeiro transformado ou transfectado com um vetor da presente invenção. O referido hospedeiro pode ser produzido através da introdução do vetor acima descrito da presente invenção, ou a molécula de ácido nucleico acima descrita da presente invenção no hospedeiro. A presença de pelo menos um vetor, ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico no hospedeiro podem mediar a expressão de um gene que codifica os anticorpos das construções de cadeia única acima descritas.

[000121] A molécula de ácido nucleico ou vetor descrito da presente invenção, o qual é introduzido no hospedeiro ou pode integrar-se no genoma do hospedeiro ou pode ser mantido extracromossomicamente.

[000122] O hospedeiro pode ser qualquer célula procariota ou eucariota.

[000123] O termo "procariota" pretende incluir todas as bactérias que podem ser transformadas ou transfectadas com moléculas de DNA ou de RNA para a expressão de uma proteína da presente invenção. Os hospedeiros procarióticos podem incluir gram negativas dessa maneira como bactérias gram-positivas, tais como, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. O termo "eucariota" pretende incluir leveduras, plantas superiores, células de insetos e de preferência mamíferos. Consoante o hospedeiro utilizado em um processo de produção recombinante, a proteína codificada por meio do polinucleotídeo da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Especialmente preferida é a utilização de um plasmídeo ou um vírus que contenha a sequência de codificação da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção e ele fusionado geneticamente um FLAG-tag N-terminal e/ou His- C- terminal. De preferência, o comprimento do referido identificador FLAG é de cerca de 4 a 8 aminoácidos, mais preferencialmente de 8 aminoácidos. Um polinucleotídeo acima descrito pode ser utilizado para transformar ou transfectar o hospedeiro utilizando qualquer uma das técnicas vulgarmente conhecidas por aqueles que são versados na técnica. Além disso, os métodos para a preparação de genes fusionados, ligados operacionalmente e expressando-se em, por exemplo, células de mamíferos e bactérias, são bem conhecidos na técnica (Sambrook, loc cit.).

[000124] Preferencialmente, o dito hospedeiro é uma bactéria ou uma célula de inseto, plantas, fungos ou animal.

[000125] É especialmente previsto que o hospedeiro recitado pode ser uma célula de mamífero. As células hospedeiras particularmente preferidas compreendem as células CHO, células COS, linhagens de células de mieloma tais como SP2/0 ou NS/0. Tal como ilustrado nos exemplos de WO 2008/119567 para outras moléculas da mesma classe, particularmente preferidas são as células CH como hospedeiros.

[000126] A dita célula hospedeira mais preferivelmente é uma célula humana ou uma linhagem de células humanas, por exemplo, PER.C6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19: 163 a 168).

[000127] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se dessa maneira a um processo para a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, o dito processo compreendendo a cultura de um hospedeiro da presente invenção em condições que permitam a expressão da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção e a recuperação do polipeptídeo produzido a partir da cultura.

[000128] Os hospedeiros transformados podem ser crescidos em fermentadores e cultivados de acordo com técnicas conhecidas na técnica para atingir um crescimento celular ótimo. A molécula de anticorpo biespecíficao de cadeia única da presente invenção pode então ser isolada a partir do meio de crescimento, lisados celulares ou frações de membranas celulares. O isolamento e purificação das moléculas de anticorpos biespecíficos de cadeia única expressas através de microrganismos, por exemplo, pode ser feita por quaisquer meios convencionais, tais como, por exemplo, separações cromatográficas preparativas e separações imunológicas, tais como as que envolvem a utilização de anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos, por exemplo, contra uma etiqueta da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção ou, como descrito nos exemplos anexos.

[000129] As condições para a cultura de um hospedeiro, que permitem a expressão são conhecidas na técnica para depender do sistema hospedeiro e do sistema de expressão/vetor utilizado em tal processo. Os parâmetros a serem modificados, a fim de atingir as condições que permitam a expressão de um polipeptídeo recombinante são conhecidos na técnica. Dessa maneira, as condições adequadas podem ser determinadas pelo versado na técnica, na ausência de entrada adicional da presente invenção.

[000130] Uma vez expressa, a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, eletroforese em gel e semelhantes, vide, Scopes, "Protein Purification", Springer -Verlag, NY (1982). Os polipeptídeos substancialmente puros de, pelo menos, cerca de 90 a 95 % de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99 % ou mais de homogeneidade são as mais preferidas para usos farmacêuticos. Uma vez purificado, parcialmente ou até à homogeneidade como desejado, a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção podem então ser utilizados terapeuticamente (incluindo extracorporalmente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio. Além disso, exemplos de métodos para a recuperação da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção a partir de uma cultura são descritas em pormenor nos exemplos apensos de WO 2008/119567 para outras moléculas da mesma classe. A recuperação pode também ser alcançada através de um método para o isolamento da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção capaz de se ligar a um epítopo CD3 épsilon de humanos e não primata chimpanzé (CD3 ε), o método compreendendo as etapas de: (a) contatar o (s) polipeptídeo (s) com um fragmento N- terminal do domínio extracelular de CD3 ε máximas de 27 aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu- Glu-Met-Gly (SEQ ID NO: 211) ou Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO: 212), fixado por intermédio da sua extremidade C-terminal a uma fase sólida; (b) eluir o (s) polipeptídeo (s) ligado (s) a partir do referido fragmento, e (c) isolamento do (s) polipeptídeo (s) a partir do eluato de (b).

[000131] Prefere-se que o (s) polipeptídeo (s) isolado (s) pelo método acima da presente invenção é (são) de origem humana.

[000132] Este método, ou o isolamento da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única do presente invenção é entendido como um método para o isolamento de um ou mais polipeptídeos diferentes, com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3 ε compreende na sua extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO: 211) ou Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO: 212) a partir de uma pluralidade de candidatos polipeptídicos, bem como um método para a purificação de um polipeptídeo a partir de uma solução. Um exemplo não limitante para o último método para a purificação de uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única a partir de uma solução é, por exemplo, a purificação de uma molécula de anticorpo expressas de forma recombinante biespecífica de cadeia única a partir de um sobrenadante de cultura ou a partir de uma preparação de tal cultura.

[000133] Como afirmado acima o fragmento utilizado neste método é um fragmento N-terminal do domínio extracelular da molécula CD3ε de primata. A sequência de aminoácidos do domínio extracelular da molécula CD3 ε de espécies diferentes é representada na SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7. As duas formas do octâmero no N-terminal são mostrados na SEQ ID NOs: 211 e 212. É preferível que esta extremidade N- terminal está livremente disponível para a ligação dos polipeptídeos de ser identificados pelo método da presente invenção. O termo "livremente disponível" é entendido no contexto da presente invenção, como sem motivos adicionais, tais como um identificador His. A interferência de um tal identificador His, com uma molécula de ligação descrito na presente invenção é descrita em WO 2008/119567.

[000134] De acordo com este método o referido fragmento é fixado através da sua extremidade C-terminal a uma fase sólida. O versado na técnica irá facilmente e sem qualquer inventivo eleger um suporte de fase sólida adequado dependente da modalidade usada do método da presente invenção. Exemplos para um suporte sólido incluem, mas não estão limitadas a matrizes tais como por exemplo esferas (grânulos, esferas de agarose, esferas de sefarose poliestireno, esferas de dextrano), as placas (placas de cultura ou de placas de cavidades múltiplas), bem como chips conhecidas por exemplo a partir de Biacore ®. A seleção dos meios e métodos para a fixação/imobilização do fragmento para o referido suporte sólido dependerão da escolha do suporte sólido. Um método vulgarmente utilizado para a fixação/imobilização é um acoplamento por meio de uma N- hidroxissuccinimida (NHS). A química de acoplamento subjacente a esta, dessa maneira como métodos alternativos de fixação/imobilização são conhecidos do versado na técnica, por exemplo, a partir de "Hermanson Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc. (1996). Para a fixação de/para imobilização sobre cromatográfica suporta os seguintes meios são comumente utilizados: sefarose ativada por NHS (por exemplo, HiTrap-NHS da GE Life Science-Amersham), sefarose ativada por CnBr (por exemplo, GE Life Science-Amersham), esferas de dextrano ativadas por NHS (Sigma) ou polimetacrilato ativado. Estes reagentes também podem ser utilizados em uma abordagem de batelada. Além disso, as esferas de dextrano compreendendo óxido de ferro (por exemplo, disponível a partir de Miltenyi) podem ser utilizadas em uma abordagem de batelada. Estas esferas podem ser utilizadas em combinação com um ímã para a separação das esferas a partir de uma solução. Os polipeptídeos podem ser imobilizados em um chip de Biacore (chips CM5, por exemplo) através da utilização de carboximetildextrano ativado por NHS. Outros exemplos de um suporte sólido adequado são as placas com múltiplas cavidades amina reativas (por exemplo, placas Nunc ImmobilizerTM).

[000135] De acordo com este método o referido fragmento do domínio extracelular de CD3 épsilon pode ser diretamente acoplado ao suporte sólido ou através de um segmento de aminoácidos, que pode ser um agente de ligação ou de outra proteína/porção polipeptídica. Alternativamente, o domínio extracelular de CD3 épsilon pode ser acoplado indiretamente através de um ou mais adaptador (es) de molécula (s).

[000136] Os meios e métodos para a eluição de um peptídeo ou polipeptídeo ligado a um epítopo imobilizado são bem conhecidos na técnica. O mesmo é válido para os métodos de isolamento do (s) polipeptídeo (s) identificado (s) a partir do eluato.

[000137] Um método para o isolamento de uma ou mais moléculas de anticorpo biespecífico de cadeia única diferente(s) com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3 ε compreende na sua extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn- Glu-Glu-Gly-X (com X sendo Met ou Ile) a partir de uma pluralidade de candidatos de polipeptídeos podem compreender uma ou mais etapas dos seguintes métodos para a seleção de antígenos específicos de entidades:

[000138] Os domínios de ligação CD3 ε específicos podem ser selecionados a partir de repertórios de anticorpos derivados. A biblioteca de apresentação de fagos pode ser construída com base em procedimentos padrão, como por exemplo, descrito em "Display Phage: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. O formato dos fragmentos de anticorpos na biblioteca de anticorpos scFv pode ser, mas em geral pode também ser um fragmento Fab ou mesmo um fragmento de anticorpo de domínio único. Para o isolamento de fragmentos de anticorpo de bibliotecas de fragmentos de anticorpo naive pode ser usado. Para a seleção de entidades ligantes potencialmente imunogênicas baixas em uso terapêutico mais tarde, as bibliotecas de fragmentos de anticorpos humanos podem ser favoráveis para a seleção direta de fragmentos de anticorpos humanos. Em alguns casos, eles podem formar a base para as bibliotecas de anticorpos sintéticos (Knappik et al. J Mol. Biol. 2000, 296:57 ff). O formato correspondente pode ser Fab, scFv (tal como descrito abaixo), ou anticorpos de domínio (DABS, como revisto em Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21:484 e ss.)

[000139] É também conhecido na técnica que, em muitos casos não há fonte de anticorpo imune humano disponível contra o antígeno alvo. Portanto, os animais são imunizados com o antígeno alvo e as respectivas bibliotecas de anticorpos isoladas a partir de tecido animal, tal como por exemplo, o baço ou PBMCs. O fragmento N-terminal pode ser biotinilado ou ligado covalentemente a proteínas, como KLH, ou albumina de soro bovino (BSA). De acordo com abordagens comuns, os camundongos são utilizados para a imunização. Alguns dos repertórios de anticorpos imunes de origem não humana podem ser especialmente favoráveis por outras razões, por exemplo, quanto à presença de anticorpos de domínio único (VHH) derivados de espécies cameloide (tal como descrito no Muyldermans, J Biotechnol 74:277; De Genst et al Dev Como Immunol 2006, 30:187 e ss.). Por conseguinte, um formato correspondente da biblioteca de anticorpos podem ser fragmentos Fab, scFv (tal como descrito abaixo), ou anticorpos de domínio único (VHH).

[000140] Em uma abordagem possível, camundongos F1 de dez semanas de idade de cruzamentos de Balb/c x C57black podem ser imunizados com células inteiras, por exemplo, expressando EpCAM transmembrana no N-terminal exibindo como fusão traducional dos aminoácidos N-terminais de 1 a 27 da cadeia CD3ε madura. Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com a proteína de fusão 1-27 CD3 épsilon-Fc (uma abordagem correspondente é descrita nos exemplos do WO 2008/119567). Após a imunização de reforço(s), as amostras de sangue podem ser tomadas e o título de anticorpos do soro contra células CD3-positivas T pode ser testado, por exemplo, na análise por FACS. Normalmente, os títulos séricos são significativamente maiores nos imunizados do que em animais não imunizados.

[000141] Os animais imunizados podem formar a base para a construção de bibliotecas de anticorpos imunes. Exemplos de tais bibliotecas compreendem as bibliotecas de exibição em fagos. Tais bibliotecas podem ser geralmente construídas com base em procedimentos padrão, como por exemplo descrito em "Display Phage: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[000142] Os anticorpos não humanos podem também ser humanizados através de apresentação de fagos, devido à geração de bibliotecas de anticorpos mais variáveis que podem ser posteriormente enriquecidos para ligantes durante a seleção.

[000143] Em uma abordagem de exibição em fagos de qualquer um dos conjuntos de fagos que exibem as bibliotecas de anticorpo formam uma base para selecionar as entidades de ligação utilizando o antígeno correspondente, como molécula alvo. A etapa central na qual fagos específicos ao antígeno, ligados ao antígeno são isolados, é designada como panning.. Devido à apresentação dos fragmentos de anticorpos na superfície dos fagos, este método geral é chamado de exibição em fagos. Um método preferido para a seleção é a utilização de proteínas pequenas, tais como o domínio de fago filamentoso N2 traducionalmente fusionada ao N-terminal do scFv exibido pelo fago. Outro método de exibição conhecido na técnica, que pode ser usado para isolar entidades de ligação é o método de visualização do ribossoma (revisto em Groves e Osbourn, Expert Opin Biol Ther 2005, 5:125 ff;. Lipovsek & Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290: 52 e ss.) A fim de demonstrar a ligação de partículas de fago de scFv a uma proteína de fusão 1-27 CD3 ε-Fc de uma biblioteca de fagos clonados carregando o repertório scFv pode ser colhida a partir do sobrenadante de cultura respectivo por PEG (polietilenoglicol). Partículas de ScFv de fagos podem ser incubados com a proteína de fusão CD3ε imobilizado Fc. A proteína de fusão CD3 ε Fc imobilizada pode ser revestida em uma fase sólida. As entidades ligantes podem ser eluídas e o eluído pode ser utilizado para a infecção de hospedeiros bacterianos novos não infectados. Os hospedeiros bacterianos com sucesso com uma cópia transduzidas fagemídeo, que codifica um fragmento scFv- humano, podem ser selecionados novamente para resistência à carbenicilina e subsequentemente infectadas com por exemplo VCMS fago auxiliar 13 para iniciar a segunda rodada de exibição de anticorpos e seleção in vitro. Um total de 4 a 5 ciclos de seleções é realizado, normalmente. A ligação de entidades ligantes isoladas pode ser testada em células Jurkat positivas CD3 épsilon, células HPBALL, PBMCs ou células eucarióticas transfectadas que transportam a sequência CD3ε N-terminal fusionada com EpCAM exibida na superfície utilizando um ensaio de citometria de fluxo (vide, WO 2008/119567).

[000144] Preferencialmente, o método acima referido pode ser um método, em que o fragmento do domínio extracelular de CD3 ε consiste em um ou mais fragmentos de um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma representada na SEQ ID NOs: 2, 4, 6 ou 8. Mais preferivelmente, o referido fragmento é de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 resíduos de aminoácidos de comprimento.

[000145] Este método de identificação de uma Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única pode ser um método de rastreio de uma pluralidade de moléculas de biespecíficos de anticorpo de cadeia única compreendendo um cruzamento de espécies de ligação específica do domínio de ligação a um epítopo CD3 ε de humano e primata não chimpanzé. Alternativamente, o método de identificação é um método de purificação/isolamento de uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única que compreende um cruzamento de espécies de domínio de ligação específico de ligação a um epítopo CD3ε de humano e primata não chimpanzé.

[000146] Além disso, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção ou um anticorpo biespecífico de cadeia única tal como produzido pelo processo descrito acima. De preferência, a referida composição é uma composição farmacêutica.

[000147] A presente invenção proporciona também uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, tal como definido na presente invenção, ou produzido de acordo com o processo tal como definido na presente invenção, em que a referida molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única é para utilização na prevenção, tratamento ou melhoria do câncer. De preferência, o referido câncer é um tumor sólido, mais preferencialmente um carcinoma ou câncer da próstata. É preferível que a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única compreende ainda as formulações adequadas de veículos, estabilizantes e/ou excipientes. Além disso, é preferível que a referida molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única é adequada para ser administrada em combinação com um fármaco adicional. O referido fármaco pode ser um composto não proteico ou um composto proteináceo e podem ser administrados simultaneamente ou não simultaneamente com a Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, tal como definido no presente documento.

[000148] De acordo com a presente invenção, a "composição farmacêutica" se refere a uma composição para administração a um paciente, preferivelmente um paciente humano. A composição farmacêutica particular preferida da presente invenção compreende anticorpos biespecíficos de cadeia única dirigidos contra e gerado contra epítopos CD3 contexto independentes . De preferência, a composição farmacêutica compreende formulações adequadas de veículos, estabilizantes e/ou excipientes. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende uma composição para administração parentérica, transdérmica, intraluminal, intra-arterial, intratecal e/ou intranasal ou por injeção direta no tecido. É em particular previsto que a referida composição é administrada a um paciente através de infusão ou injeção. A administração das composições adequadas pode ser efetuada por diferentes vias, por exemplo, por via subcutânea intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, tópica ou intradérmica. Em particular, a presente invenção proporciona uma administração contínua da composição adequada. Como um exemplo não limitativo, sem interrupção, isto é, a administração contínua pode ser realizada por um sistema de bomba de pequena usada pelo paciente para medir o fluxo de agente terapêutico para dentro do corpo do paciente. A composição farmacêutica compreendendo os anticorpos biespecíficos de cadeia única dirigidos contra e gerado contra CD3 contexto independentes epítopos da presente invenção podem ser administradas utilizando os ditos sistemas de bomba. Os sistemas de bombas deste tipo são geralmente conhecidos na técnica, e geralmente dependem de troca periódica de cartuchos contendo o agente terapêutico a ser infundido. Ao trocar o cartucho de tal sistema de uma bomba, uma interrupção temporária do fluxo ininterrupto de outro modo do agente terapêutico para dentro do corpo do paciente pode seguir. Em tal caso, a fase de administração antes da substituição do cartucho e a fase de administração de substituição do cartucho seguinte ainda seria considerado, na acepção do meio farmacêutico e métodos da presente invenção em conjunto, formam uma "administração contínua" de tal agente terapêutico.

[000149] A administração contínua ou ininterrupta destes anticorpos biespecíficos de cadeia única dirigida contra e gerado contra epítopos CD3 contexto independentes da presente invenção podem ser subcutânea ou introvenosa por via de um dispositivo de administração de fluido ou sistema de bomba de pequeno incluindo um mecanismo de condução de fluido para dirigir fluido para fora um reservatório e de um mecanismo de acionamento para acionar o mecanismo de acionamento. Os sistemas de bomba para a administração subcutânea pode incluir uma agulha ou cânula para penetrar a pele de um paciente e fornecendo a composição apropriada para dentro do corpo do paciente. Os referidos sistemas de bomba podem ser fixados diretamente ou ligados à pele do paciente de forma independente de uma artéria, veia ou de sangue, o que permite um contato direto entre o sistema de bomba e a pele do paciente. O sistema de bomba pode ser fixado à pele do paciente, durante 24 horas até vários dias. O sistema de bomba pode ser de pequeno tamanho, com um reservatório para pequenos volumes. Como um exemplo não limitativo, o volume do reservatório para a composição farmacêutica adequada para ser administrada pode situar-se entre 0,1 e 50 mL.

[000150] A administração contínua pode ser transdérmica por meio de um adesivo usado na pele e substituída periodicamente. Um versado na técnica tem conhecimento de sistemas de entrega de fármacos do adesivo adequado para este fim. É digno de nota que a administração transdérmica é especialmente passível de administração contínua, como a troca de um primeiro adesivo esgotado pode vantajosamente ser realizado simultaneamente com a colocação de um adesivo novo, em segundo lugar, por exemplo, sobre a superfície da pele imediatamente adjacente ao primeiro adesivo de esgotado e imediatamente antes da remoção do primeiro adesivo esgotado. As questões de interrupção do fluxo ou o queda de energia não surgem.

[000151] A composição da presente invenção, que compreende, em especial os anticorpos biespecíficos de cadeia única dirigidos contra e gerado contra epítopos CD3 independente de contexto pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como óleo/água, vários tipos de emulsões de agentes umectantes, soluções estéreis, lipossomas, etc. As composições que compreendem tais veículos podem ser formuladas por meio dos métodos convencionais bem conhecidos. As formulações podem incluir carboidratos, as soluções tampão, aminoácidos e/ou tensoativos. Os carboidratos podem ser açúcares não redutores, de preferência, sacarose, trealose, octassulfato de sorbitol ou xilitol. Tais formulações podem ser utilizadas para administração contínua, que podem ser intravenosa ou subcutânea com e/ou sem sistemas de bomba. Os aminoácidos podem ser aminoácidos carregados, de preferência, acetato de lisina, lisina, arginina, glutamato e/ou histidina. Os agentes tensoativos podem ser detergentes, de preferência com um peso molecular de > 1,2 KD e/ou de um poliéter, de preferência com um peso molecular de > 3 KD. Exemplos não limitativos para os detergentes preferidos são o Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 ou Tween 85. Exemplos não limitativos de poliéteres preferidos são o PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ou PEG 5000. Os sistemas tampão usados na presente invenção podem ter um pH preferido de 5-9, e pode compreender citrato, succinato, fosfato, histidina e acetato. As composições da presente invenção podem ser administradas ao sujeito em uma dose adequada que pode ser determinada, por exemplo, por estudos de doses crescentes por meio da administração de doses crescentes da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção exibem especificidade entre espécies aqui descritas para primatas não chimpanzé, por exemplo, macacos. Conforme estabelecido acima, a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção exibe especificidade de espécies cruzadas descrita na presente invenção pode ser vantajosamente utilizado de forma idêntica em testes pré-clínicos em primatas não chimpanzé e como fármaco em seres humanos. Estas composições podem também ser administradas em combinação com outros fármacos proteicos e não proteicos. Estes fármacos podem ser administrados simultaneamente com a composição que compreende a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, como definido na presente invenção, ou separadamente, antes ou depois da administração do referido polipeptídeo, em tempo útil intervalos definidos e doses. O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e fatores clínicos. Como é bem conhecido nas artes médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície do corpo, idade, do composto particular a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outras medicamentos a ser administrados concomitantemente. As preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões, e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soluções salinas e tamponadas. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de dextrose e sódio, Ringer com lactato, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer), e similares. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes. Além disso, a composição da presente invenção pode compreender veículos proteicos, como, por exemplo, albumina de soro ou imunoglobulina, de preferência de origem humana. Prevê-se que a composição da presente invenção pode compreender, para além da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção definida na presente invenção, ainda mais agentes biologicamente ativos, em função da utilização pretendida da composição. Tais agentes podem ser fármacos que atuam no sistema gastrointestinal, os fármacos que atuam como substâncias citostáticas, fármacos, fármacos impedem inibidores de imunorreações hiperuriquemia (por exemplo, corticosteroide), fármacos que modulam a resposta inflamatória, fármacos que atuam sobre o sistema circulatório e/ou agentes, tais como as citoquinas conhecidas na técnica.

[000152] A atividade biológica da composição farmacêutica como definido na presente invenção pode ser determinada, por exemplo, por ensaios de citotoxicidade, como descrito nos exemplos a seguir, em WO 99/54440 ou por Schlereth et al. (Cancer Immunol Immunother 20 (2005), 1 a 12). "Eficácia" ou "eficácia in vivo" como utilizado na presente invenção refere-se a resposta ao tratamento com a composição farmacêutica da presente invenção, por exemplo, usando critérios padronizados de resposta do NCI. O sucesso ou a eficácia in vivo da terapia utilizando a composição farmacêutica da presente invenção refere-se a eficácia da composição para a sua finalidade pretendida, ou seja, a capacidade da composição para causar o efeito desejado, ou seja, a depleção de células patológicas, por exemplo, células tumorais. A eficácia in vivo pode ser monitorada por meio dos métodos padrão estabelecidos para as respectivas entidades de doença, incluindo, mas não limitado à contagem de glóbulos brancos, diferenciais, classificação de células ativadas por meio da fluorescência, aspiração de medula óssea. Além disso, várias doenças específicas parâmetros de química clínica e outros métodos estabelecidos padrões podem ser usados. Além disso, tomografia auxiliada por computador, raios X, tomografia de ressonância magnética nuclear (por exemplo, para avaliação da resposta Nacional Cancer Institute critérios de base [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, RI Fisher, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Relatório de um workshop internacional para padronizar critérios de resposta para os linfomas não Hodgkin. NCI Patrocinados Grupo de Trabalho Internacional J Clin Oncol 1999 Apr; 17 (4): 1244]), tomografia por meio da emissão de tomografia, a contagem de células brancas do sangue, os diferenciais, classificação de células ativadas por meio da fluorescência, aspiração de medula óssea, biópsias de nódulos linfáticos/histologias e vários parâmetros cancerosos específicas de química clínica (por exemplo, lactato desidrogenase) e outros métodos padrão estabelecidos podem ser usados.

[000153] Outro grande desafio para o desenvolvimento de fármacos, tais como a composição farmacêutica da presente invenção é a modulação previsível das propriedades farmacocinéticas. Para este fim, o perfil farmacocinético do fármaco candidato, ou seja, um perfil dos parâmetros farmacocinéticos que traz efeito na capacidade de um fármaco em particular para o tratamento de uma determinada condição, é estabelecido. Os parâmetros farmacocinéticos do fármaco que influenciam a capacidade de um fármaco para o tratamento de uma determinada entidade de doença incluem, mas não estão limitados a: meia-vida, volume de distribuição, o metabolismo hepático de primeira passagem e o grau de ligação ao soro sanguíneo. A eficácia de um determinado agente de fármaco pode ser influenciada por cada um dos parâmetros acima mencionados.

[000154] O termo "Meia-vida" significa que o tempo em que 50 % de um fármaco administrado é eliminado por meio de processos biológicos, por exemplo, metabolismo, excreção, etc.

[000155] Por "metabolismo hepático de primeira passagem" é entendida a propensão de um medicamento a ser metabolizado em contato pela primeira vez com o fígado, ou seja, durante a sua primeira passagem através do fígado.

[000156] O termo "volume de distribuição" significa o grau de retenção de um fármaco ao longo dos vários compartimentos do corpo, como por exemplo, espaços intracelulares e extracelulares, tecidos e órgãos, etc., e a distribuição do fármaco no interior destes compartimentos.

[000157] O termo "grau de ligação do soro de sangue", a propensão de um fármaco para interagir com e se ligar a proteínas séricas, tais como albumina, conduzindo a uma redução ou a perda de atividade biológica do fármaco.

[000158] Os parâmetros farmacocinéticos adicionais incluem a biodisponibilidade, tempo de atraso (TLAG), Tmax, as taxas de absorção, mais o início e/ou a Cmax para uma dada quantidade de fármaco administrado.

[000159] O termo "biodisponibilidade" significa a quantidade de um fármaco no compartimento do sangue.

[000160] O termo "tempo de retardo" significa o intervalo de tempo entre a administração do fármaco e a sua detecção e capacidade de medição no sangue ou no plasma.

[000161] O termo "Tmax" é o tempo após o qual a concentração sanguínea máxima do fármaco é atingida, e "Cmax" é a concentração sanguínea máxima obtida com um determinado fármaco. O tempo para atingir uma concentração de sangue ou de tecido do fármaco que é necessária para o seu efeito biológico é influenciado por todos os parâmetros. Os parâmetros farmacocinéticos de anticorpos biespecíficos de cadeia única que exibem especificidade de espécies cruzadas, que pode ser determinada em ensaios em animais pré- clínicos em primatas não chimpanzé como delineado acima, são também apresentados, por exemplo na publicação por Schlereth et al. (Cancer Immunol Immunother 20 (2005), 1 a 12).

[000162] O termo "toxicidade", tal como utilizado na presente invenção refere-se aos efeitos tóxicos de um fármaco manifesto em eventos adversos ou eventos adversos graves. Estes eventos adversos podem referir-se a uma falta de tolerabilidade do fármaco, em geral, e/ou a falta de tolerância local após a administração. Toxicidade pode também incluir efeitos teratogênicos ou cancerígenos causados pelo fármaco.

[000163] O termo "segurança", "segurança in vivo" ou "tolerância" como utilizado na presente invenção define a administração de um fármaco sem induzir efeitos adversos graves diretamente após a administração (tolerância local) e durante um longo período de aplicação do fármaco. "Segurança", " segurança in vivo" ou "tolerância" pode ser avaliada por exemplo, em intervalos regulares durante o tratamento e o período de acompanhamento. As medidas incluem a avaliação clínica, por exemplo, manifestações de órgãos, e rastreio de alterações laboratoriais. A avaliação clínica pode ser realizada e desviando para resultados normais gravadas/codificada de acordo com NCI-CTC e/ou padrões MedDRA. As manifestações de órgãos podem incluir critérios tais como a alergia/imunologia do sangue/medula óssea, arritmia cardíaca, coagulação e outros semelhantes, tal como estabelecido, por exemplo, nos Critérios de terminologia comum para v3.0 de eventos adversos (CTCAE). Os parâmetros laboratoriais que podem ser testados incluem, por exemplo, hematologia, química clínica, o perfil de coagulação e de análise da urina e exames de outros fluidos corporais, tais como soro, plasma, fluido espinhal ou licor linfoide, e semelhantes. Segurança pode, portanto, ser avaliada, por exemplo, pelo exame físico, técnicas de imagem (ou seja, ultrassom, raios X, tomografia computadorizada, ressonância magnética (MRI), outras medidas com dispositivos técnicos (eletrocardiograma, por exemplo), sinais vitais, medindo parâmetros laboratoriais e gravação de eventos adversos, por exemplo, eventos adversos em primatas não chimpanzé nos usos e métodos de acordo com a presente invenção pode ser examinado por meio de métodos histopatológicos e/ou histoquímica.

[000164] O termo "dose eficaz e não tóxica", tal como utilizado na presente invenção refere-se a uma dose tolerável do anticorpo biespecífico de cadeia única, tal como definido na presente invenção, que é suficientemente elevada para causar depleção de células patológicas, a eliminação de tumores, encolhimento do tumor ou a estabilização da doença sem, ou essencialmente sem grandes efeitos tóxicos. Tais doses eficazes e não tóxicas podem ser determinadas, por exemplo, estudos de escalonamento de dose descrita na técnica e deve ser inferior à dose induzindo graves eventos adversos (toxicidade limitante da dose, DLT).

[000165] Os termos acima são também referidos, por exemplo, na avaliação pré-clínica de segurança de farmacêuticos derivados da biotecnologia S6; Orientações Tripartite Harmonizadas ICH; Reunião do Comitê de Direção ICH em 16 de julho de 1997.

[000166] Além disso, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, ou produzida de acordo com o processo de acordo com a presente invenção para a prevenção, tratamento ou melhoria do câncer. De preferência, o referido câncer é um tumor sólido, de preferência, um carcinoma ou câncer da próstata. De preferência, a referida composição farmacêutica compreende ainda formulações adequadas de veículos, estabilizantes e/ou excipientes.

[000167] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma utilização de uma molécula/polipeptídeo de anticorpo biespecífico de cadeia única tal como definido na presente invenção acima, ou produzido de acordo com um processo como definido na presente invenção acima, para a preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, tratamento ou melhoria de uma doença. Preferencialmente, a referida doença é o câncer. Mais preferivelmente, o referido câncer é um tumor sólido, de preferência, um carcinoma ou câncer da próstata.

[000168] Em uma outra modalidade preferida da utilização da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção a referida composição farmacêutica é adequada para ser administrada em combinação com uma fármaco adicional, isto é, como parte de uma coterapia. No referido coterapia, um agente ativo pode ser opcionalmente incluído na mesma composição farmacêutica, como a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, ou podem ser incluídos em uma composição farmacêutica em separado. Neste último caso, a referida composição farmacêutica em separado é adequado para administração antes, simultaneamente ou após a administração da referida composição farmacêutica, compreendendo a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção. Um fármaco adicional ou a composição farmacêutica pode ser um composto não proteico ou um composto proteico. No caso em que o fármaco adicional é um composto proteico, é vantajoso que o composto proteináceo seja capaz de fornecer um sinal de ativação para as células efetoras imunitárias.

[000169] De preferência, o referido composto proteico ou composto não proteico podem ser administrados simultaneamente ou não simultaneamente com a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico tal como aqui anteriormente definido, um vetor tal como definido tal como acima definido, ou um hospedeiro, tal como definido tal como definido acima neste documento.

[000170] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a prevenção, tratamento ou melhoria de uma doença em um indivíduo com a necessidade do mesmo, compreendendo o referido método a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção. Preferencialmente, a referida doença é o câncer. De preferência, o referido câncer é um tumor sólido, de preferência, um carcinoma ou câncer da próstata.

[000171] Em uma outra modalidade preferida do método da presente invenção, a referida composição farmacêutica é adequada para ser administrada em combinação com uma fármaco adicional, isto é, como parte de uma coterapia. Na referida coterapia, um agente ativo pode ser opcionalmente incluído na mesma composição farmacêutica, como a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, ou pode ser incluído em uma composição farmacêutica em separado. Neste último caso, a referida composição farmacêutica em separado é adequada para administração antes, simultaneamente ou após a administração da referida composição farmacêutica, compreendendo a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção. Um fármaco adicional ou uma composição farmacêutica pode ser um composto não proteico ou um composto proteico. No caso em que o fármaco adicional é um composto proteico, é vantajoso que o composto proteináceo seja capaz de fornecer um sinal de ativação para as células efetoras imunitárias.

[000172] De preferência, o referido composto proteico ou composto não proteico pode ser administrado simultaneamente ou não simultaneamente com a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico tal como aqui anteriormente definido, um vetor tal como definido tal como acima definido, ou um hospedeiro, tal como definido tal como definido acima neste documento.

[000173] É preferível que o método acima descrito da presente invenção que o referido indivíduo seja um ser humano.

[000174] Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um kit que compreende uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, um vetor da presente invenção, ou de um hospedeiro da presente invenção.

[000175] Estas e outras modalidades são descritas e abrangidas na descrição e exemplos da presente invenção. As técnicas recombinantes e métodos são descritos em imunologia por exemplo em Sambrook et al. Clonagem Molecular: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edição, 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Literatura adicional sobre qualquer um dos anticorpos, métodos, utilizações e compostos a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser recuperados a partir de bibliotecas e bases de dados públicos, utilizando por exemplo dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline", disponível na Internet, podem ser utilizados, por exemplo, sob http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Outras bases de dados e endereços, tais como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, ou incluídas na homepage do EMBL-serviços sob http://www.embl.de/ services/index.html são conhecidos do versado na técnica e podem também ser obtidos utilizando, por exemplo, http://www. google.com.

[000176] As figuras mostram: Figura 1

[000177] A análise de ligação FACS das designadas interespécies das construções específicas biespecíficos de cadeia única para as células CHO transfectadas com o PSMA humano, linhagem celular humana T HPB-ALL CD3+, células CHO transfectadas com um PSMA macaco macaque e linhagem de células T 4119 LnPx. A marcação para FACS é realizada como descrito no Exemplo 2.1. A linha grossa representa as células incubadas com o sobrenadante de cultura de células que são em seguida incubadas com o anticorpo anti-His e o anticorpo de detecção marcado PE. A linha fina histograma reflete o controle negativo: células incubadas apenas com o anticorpo anti-His e o anticorpo de detecção. Figura 2

[000178] A atividade citotóxica induzida por meio da designação das construções específicas biespecíficos de cadeia única redirecionadas para linhagens celulares alvo indicadas. As células T humanas CD4/CD56 estimuladas são utilizadas como células efetoras, as células CHO transfectadas com PSMA humana como células alvo. O ensaio é realizado como descrito no Exemplo 2.2.

[000179] A presente invenção é adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos ilustrativos não limitativos que proporcionam uma melhor compreensão da presente invenção e das suas muitas vantagens. EXEMPLOS 1. Geração e caracterização de PSMA e moléculas de anticorpo biespecífica de cadeia única CD3 cruzada de espécies específicas 1.1 Clonagem e expressão do antígeno PSMA humano em células CHO

[000180] A sequência do antígeno PSMA humano ('AY101595', mRNA de antígeno da membrana específica da próstata Homo sapiens, cds completas, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez) foi utilizada para obter uma molécula sintética por meio da síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento de síntese de genes foi também concebido de modo a conter um sítio Kozak para a expressão eucariótica da construção e os sítios de restrição no início e no final do DNA. Os sítios de restrição Xbal introduzidos na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', foram utilizados durante a etapa de clonagem para a expressão do plasmídeo pEFDHFR designado como descrito em Mack et al. (Mack M et al, Proc Natl Acad Sci EUA 1995, 92:7021-5 e Raum et al Cancer Immunol Immunother (2001) 50 (3)). Após verificação da sequência do plasmídeo foi usado para transfectar células CHO/dhfr- como se segue. Uma sequência verificada de plasmídeo foi usada para transfectar células CHO/dhfr- (ATCC No. CRL 9096; cultivadas em RPMI 1640 com glutamina estabilizado obtido Biochrom AG de Berlim, Alemanha, suplementado com FCS a 10 %, 1% de penicilina/estreptomicina todos obtidos a partir de Biochrom AG de Berlim, Alemanha, a partir de nucleosídeos de uma solução stock de reagentes de grau de cultura de células obtidas a partir Chemie GmbH Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha, para uma concentração final de 10 ug /mL de adenosina, 10 ug/mL de desoxiadenosina e 10 ug/mL de timidina, em uma incubadora a 37°C, umidade de 95% e 7% de CO2). A transfecção foi realizada utilizando o reagente de transfecção PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e de 5 ug de DNA de plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Depois de uma cultura de 24 horas, as células foram lavadas uma vez com PBS e novamente cultivadas em meio de cultura de células mencionadas acima, exceto que o meio utilizado não foi suplementado com FCS dialisado e nucleosídeos (obtido a partir de Biochrom AG de Berlim, Alemanha). Dessa maneira, o meio de cultura celular não continha nucleosídeos e dessa maneira a seleção foi aplicada sobre as células transfectadas. Aproximadamente, 14 dias após a transfecção o crescimento de células resistentes foi observado. Após um adicional de 7 a 14 dias os transfectantes foram testados positivos para expressão da construção através de FACS. A expressão da proteína eucariótica em células CHO deficiente em DHFR é realizada como descrito por Kaufmann RJ (1990) Methods Enzymol. 185, 537 a 566. A amplificação do gene da quimera é induzida por meio das concentrações crescentes de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até MTX a 20 nM 1.2 Clonagem e expressão do antígeno PSMA de macaco em células CHO

[000181] A sequência do cDNA de PSMA macaque (cinomolgo) foi obtido por um conjunto de cinco PCRs em cDNA a partir da próstata de macaco macaque preparado de acordo com protocolos padrão. As seguintes condições de reação foram utilizadas: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos, seguido por 40 ciclos com 94°C durante 1 minuto, 52°C durante 1 minuto e 72°C durante 1,5 minutos, seguido de um ciclo de terminal de 72°C durante 3 minutos, e os iniciadores a seguir foram utilizados: • iniciador direto: 5’-catgtggcccaggttcgagg-3‘ (SEQ ID NO: 213) • iniciador reverso: 5’-gacataccacacaaattcaatacgg-3’ (SEQ ID NO: 214) • iniciador direto: 5’-gctctgctcgcgccgagatgtgg-3’ (SEQ ID NO: 215) • iniciador reverso: 5’-acgctggacaccacctccagg-3’ (SEQ ID NO: 216) • iniciador direto: 5’-ggttctatgagtgggcagagg-3’ (SEQ ID NO: 217) • iniciador reverso: 5’-attgttgtggctgcttggagc-3’ (SEQ ID NO: 218) • iniciador direto: 5’-gggtgaagtcctatccagatgg-3’ (SEQ ID NO: 219) • iniciador reverso: 5’-gtgctctgcctgaagcaattcc-3’ (SEQ ID NO: 220) • iniciador direto: 5’-ctcggcttcctcttcgggtgg-3’ (SEQ ID NO: 221) • iniciador reverso: 5’-gcatattcatttgctgggtaacctgg-3‘ (SEQ ID NO: 222)

[000182] Estes PCRs geraram cinco fragmentos sobrepostos, os quais foram isolados e sequenciados de acordo com protocolos convencionais, utilizando os iniciadores de PCR e, dessa maneira, fornecidos a uma porção da sequência de cDNA codificadora do códon macaque PSMA 3 ao códon último da proteína madura. Para gerar uma construção para a expressão de macaco PSMA um fragmento de cDNA foi obtido por meio da síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a sequência de cDNA e de aminoácidos da construção está listada na SEQ ID 223 e 224). Nesta construção, a sequência de codificação de macaque PSMA de aminoácido 3 ao último aminoácido da proteína madura PSMA seguido por meio de um códon de parada foi fusionado na estrutura com a sequência de codificação dos dois primeiros aminoácidos da proteína PSMA humana. O fragmento de síntese de genes foi também concebido de modo a conter um sítio Kozak para a expressão eucariótica da construção e sítios de restrição no início e no final do fragmento contendo o cDNA. O introduzidos os sítios de restrição Xbal, na extremidade 5 'e Sall na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. O fragmento de síntese de gene foi clonado através de XbaI e SalI de um plasmídeo designado os seguintes protocolos pEF-DHFR padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Um clone com a sequência de nucleotídeos de sequência verificada foi transfectado em células CHO deficientes em DHFR para expressão eucariótica da construção. A expressão da proteína eucariótica em células CHO deficiente em DHFR foi efetuada tal como descrito por Kaufmann RJ (1990) Methods Enzymol. 185, 537 a 566. A amplificação do gênero da quimera foi induzida por meio das concentrações crescentes de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até MTX a 20 nM. Exemplo 2 2.1 Fluxo de análise por meio da citometria de ligação dos PSMA e de anticorpos CD3 biespecíficos de espécies cruzadas específicas

[000183] A fim de testar a funcionalidade das construções de anticorpo biespecíficos de espécies cruzadas específicas de no que diz respeito à capacidade de ligação ao PSMA humano e macaco e CD3 de humano e macaco, em uma análise FACS foi realizada. Para este efeito, as células CHO transfectadas com PSMA humano e CD3 humano positiva de células T da linhagem celular de leucemia de HPB- ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) foram utilizados para verificar a ligação a antígenos humanos. A reatividade de ligação a antígenos de macacos foi testado usando o PSMA transfectante de macaque gerado e uma linhagem de células T macaque 4119LnPx (gentilmente cedido pelo Prof Fickenscher, Instituto de Higiene, Virology, Erlangen- Nuernberg, publicada em Knappe A, et al, e H Fickenscher., Blood 2000, 95, 3256 a 61).

[000184] A análise de citrometria de fluxo foi realizada como se segue:

[000185] 200.000 células das linhagens celulares respectivas foram incubadas durante 30 min em gelo com 50 uL da proteína purificada das construções de anticorpo biespecíficos de espécies cruzadas específicas (2 ug/mL) ou sobrenadantes de cultura de células de células transfectadas que expressam as construções de anticorpo biespecíficos de espécies cruzadas específicas. As células foram lavadas duas vezes em PBS com FCS a 2% e a ligação da construção foi detectada com um anticorpo murino anti-His (anticorpo Penta Sua; Qiagen; diluído 1:20 em 50 uL de PBS com FCS a 2%). Após a lavagem, anticorpos ligados anti- His foram detectados com um anticorpo de Fc-gama específica (Dianova) conjugado com ficoeritrina, diluído a 1:100 em PBS com FCS a 2%. Sobrenadante de células não transfectadas CHO foi utilizada como controle negativo para a ligação com as linhagens de células T. A cadeia única da construção com especificidade irrelevante alvo foi usada como controle negativo para a ligação com as células CHO transfectadas PSMA.

[000186] A citometria de fluxo foi realizada em um aparelho de FACS- Calibur, o software CellQuest foi usado para a aquisição e análise de dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). A coloração FACS e medição da intensidade de fluorescência foram realizada como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[000187] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia única, que são espécies cruzadas específicas para PSMA e espécies cruzadas específicas para CD3 humano e macaco foi claramente detectável, como mostrado na figura 1. Na análise FACS mostrou todos as construções de ligação para CD3 e PSMA, em comparação com os respectivos controles negativos. Os anticorpos biespecíficos de espécies cruzadas de CD3 de humano e macaco e de antígenos PSMA humanos e macaque foi demonstrada. 2.2 Bioatividade do PSMA e anticorpos biespecíficos de cadeia única CD3 de espécies cruzadas específicas

[000188] A bioatividade dos anticorpos biespecíficos de cadeia única gerados foi analisada por crómio 51 (51Cr) A libertação em ensaios de citotoxicidade in vitro usando células humanas PSMA positivas da linhagem das células CHO. As células efetoras estimuladas humanas CD4/CD56 empobrecidas PBMC são usadas.

[000189] A geração de CD4/CD56 estimulada empobrecida PBMC foi realizada como se segue:

[000190] Revestimento de uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen) foi realizada com um anticorpo disponível comercialmente anti-CD3 específicos (por exemplo, OKT3, Othoclone) em uma concentração final de 1 ug/mL durante 1 hora a 37 ° C. A proteína não ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMC foram isoladas de frasco do sangue periférico (30 a 50 mL de sangue humano) por meio da centrifugação em gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMC foram adicionados à placa de Petri pré-revestido em 120 mL de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/FCS a 10%/IL-2 20 U/mL (Proleukin, Chiron) e estimuladas por 2 dias. No terceiro dia, as células foram recolhidas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/mL e as células foram cultivadas novamente durante um dia, no mesmo meio de cultura de células como descrito acima. Pela depleção de células T CD4 + e CD56 + células NK de acordo com protocolos convencionais CD8 + de linfócitos T citotóxicos (CTL) foram enriquecidas.

[000191] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e marcadas com 51Cr 11,1 MBq, em um volume final de 100 uL de meio RPMI com FCS a 50% durante 45 minutos a 37°C. Subsequentemente, as células alvo marcadas foram lavadas 3 vezes com 5 mL de meio RPMI e depois usadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi realizado em uma placa de 96 cavidades em um volume total de 250 μL RPMI suplementado (como acima) com um E:T proporção de 10:1. 1 ug/mL das trans-espécies específicas biespecíficas das moléculas de anticorpo de cadeia única e 20 triplas diluições do mesmo foram aplicados. O tempo de ensaio foi de 18 horas e a citotoxicidade foi medida como valores relativos de crómio libertado no sobrenadante relacionado com a diferença de lise máxima (adição de Triton-X) e a lise espontânea (sem células efetoras). Todas as medições foram realizadas em quadruplicado. A Medição da atividade de crómio nos sobrenadantes foi realizada com um contador gama Wizard 3'' (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colónia, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi realizada com Prism 5, para o Windows (versão 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta a dose sigmoidal tipicamente têm valores de R2> 0,90, conforme determinado pelo software. Os valores de EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para comparação da bioatividade.

[000192] Como mostrado na figura 2, todos as construções de anticorpo biespecíficos de cadeia única geradas entre espécies específicas demonstram a atividade citotóxica contra células alvo humanas PSMA positivas estimuladas induzida por meio da depleção de PBMC humana CD4/CD56. Exemplo 3: Análise de ligação de scFvs contra várias linhagens de células 3.1. Expressão de construções de anticorpo de cadeia única em E. coli

[000193] As moléculas de scFv EpCAM 4-7 (WO 99/25818), PM74- G3, PM52-H3,-C3 PM52, PM75 e PM91-A10-B6 são expressas através da utilização do plasmídeo pComb3H5BFlag/His em que as construções de expressão (por exemplo, scFv ) incluem a tag (DYKDDDDK) e o tag His6. O DNA de plasmídeo de cada molécula scFv é transformada em 100 uL de choque térmico células competentes E. coli TG1 e plaqueadas em agar LB-carbenicilina. A E. coli transformada com um pComb3H5BFlag/His contendo scFv VL- e VH- solúvel segmento produzir em quantidades suficientes após a indução com IPTG a 1 mM. Devido a uma sequência sinal adequada, o scFv de cadeia é exportada para o periplasma, onde ela se enovela para uma conformação funcional.

[000194] Uma única colônia de bactérias de E. Coli TG1 a partir das placas de transformação é escolhida para preparações periplásmicas em pequena escala e crescidas em meio SB-(por exemplo, 10 mL), suplementado com MgCl2 a 20 mM e 50μg/mL carbenicilina (e re- dissolvido em PBS (por exemplo, 1 mL) após a colheita. por quatro ciclos de congelamento a -70 ° C e descongelamento a 37 ° C, a membrana externa das bactérias é destruída pelo choque térmico e as proteínas periplasmáticas, incluindo os scFvs solúveis são libertados para o sobrenadante. Após eliminação das células intactas e os debris de célula por meio da centrifugação, o sobrenadante contendo o scFv anti-PSMA é recolhido e utilizado para a determinação da ligação das linhagens de células diferentes. 3.2. Análise de ligação de citometria de fluxo de construções de anticorpo de cadeia única a várias linhagens celulares

[000195] As preparações periplasmáticas de clones de E. coli que produzem as moléculas de scFv EpCAM 4-7, PM74-G3, PM52-H3,-C3 PM52, PM75 e PM91-A10-B6 são usadas para examinar a ligação específica para PSMA humano ou EpCAM humano das linhagens celulares transfectadas. Como controle negativo, as células CHO não transfectadas são usadas.

[000196] Para a citometria de fluxo 2,5 x105 de células são incubadas com 50 uL de scFv preparação periplasmática. A ligação de scFv para as células é detectada com um anticorpo anti-His (Penta-His Antibody, BSA livre, Qiagen GmbH, Hilden, FRG) a 2 ug/mL, em 50 uL de PBS com FCS a 2%. Como um reagente de segunda etapa de R-Ficoeritrina conjugada purificado por afinidade F(ab')2, o fragmento de IgG de cabra anti-camundongo (Fc-gama fragmento específico), diluído a 1:100 em 50 uL de PBS com FCS a 2% (Dianova, Hamburg, FRG) é usado. As amostras são medidas em uma FACSscan (BD Biosciences, Heidelberg, FRG).

[000197] A citometria de fluxo é realizada em um aparelho de FACS- Calibur, o software CellQuest é utilizado para a aquisição e análise de dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). FACS coloração e medição da intensidade de fluorescência são realizadas como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[000198] scFv EpCAM 4-7 mostraram forte ligação com o EpCAM humano da linhagem de células CHO transfectadas, mas nenhuma ligação significativa com as células humanas transfectadas PSMA ou não transfectadas. Em contraste scFvs PM74-G3, PM52-H3,-C3 PM52, PM75 e PM91-A10-B6 mostrou forte ligação a células humanas PSMA células CHO transfectadas, mas não para EpCAM humano transfectadas ou transfectadas CHO. (Os resultados de ligação de célula periplasmática dos extratos das scFvs respectivas nas diferentes linhagens de células transfectadas são apresentadas na tabela 1). Tabela 1: Resultados das análises de FACS: '+' indica sinal de ligação, "-" indica que não há sinal de ligação significativa

LEGENDA DAS TABELAS: • human = humano • VL of = VL de .... • VH of = VH de • squirrel monkey = Macaco squirrel • Swine = Suíno • Cadeia de epsilon CD3 humana • 19 amino acid immunoglobulin leader peptide = • Peptídeo líder de imunoglobulina de 19 aminoácidos • murine igG1 heavy chain constant region = • Região constante de cadeia pesada igG1 murina • human lambdia light chain constant region • Região constante de cadeia leve de lâmbda humana • Leader = Líder • humanCD3 (N-terminus) • CD3 humana (N-terminal) • forward primer = Iniciador avançado • reverse primer = Iniciador reverso • Cynomolgus = Cinomolgo

Claims (10)

1. Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro domínio de ligação que é um sítio de interação do antígeno capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε (épsilon) de humano e Callithrix jacchus, Saguinis oedipus ou Saimiri sciureus, em que o epítopo é parte de uma sequência de aminoácidos compreendida no grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 4, 6 ou 8, e compreende pelo menos a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (QDGNE), e em que o primeiro domínio de ligação compreende uma região VL compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 selecionados a partir de: (a) CDR-L1, como descrito na SEQ ID NO: 27, CDR-L2, como descrito na SEQ ID NO: 28 e CDR-L3, como descrito na SEQ ID NO: 29; (b) CDR-L1, como descrito na SEQ ID NO: 117, CDR-L2, como descrito na SEQ ID NO: 118 e CDR-L3, como descrito na SEQ ID NO: 119; e (c) CDR-L1, como descrito na SEQ ID NO: 153, CDR-L2, como descrito na SEQ ID NO: 154 e CDR-L3, como descrito na SEQ ID NO: 155, e em que o primeiro domínio de ligação compreende uma região VH compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 selecionados a partir de: (a) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 12, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 13 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 14; (b) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 30, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 31 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 32; (c) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 48, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 49 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 50; (d) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 66, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 67 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 68; (e) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 84, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 85 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 86; (f) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 102, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 103 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 104; (g) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 120, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 121 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 122; (h) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 138, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 139 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 140; (i) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 156, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 157 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 158; e (j) CDR-H1 como descrito na SEQ ID NO: 174, CDR-H2 como descrito na SEQ ID NO: 175 e CDR-H3 como descrito na SEQ ID NO: 176; e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar ao antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), em que o segundo domínio de ligação compreende um grupo das seguintes sequências como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 e CDR L3 no segundo domínio de ligação selecionado de: a) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 254-256 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 259-261; b) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 268-270 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 273-275; c) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 618-620 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 623-625; d) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 282-284 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 287-289; e) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 296-298 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 301-303; f) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 310-312 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 315-317; g) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 324-326 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 329-331; h) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 338-340 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 343-345; i) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 352-354 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 357-359; e j) CDR H1-3 de SEQ ID NO: 366-368 e CDR L1-3 de SEQ ID NO: 371-373.

2. Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma região de VL selecionada a partir do grupo que consiste em uma região VL, como descrito na SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ou 165.

3. Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma região VH selecionada do grupo consistindo em uma região VH, como descrito na SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ou 181.

4. Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma região de VL e uma região de VH selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 17 ou 21 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 15 ou 19; (b) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 35 ou 39 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 33 ou 37; (c) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 53 ou 57 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 51 ou 55; (d) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 71 ou 75 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 69 ou 73; (e) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 89 ou 93 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 87 ou 91; (f) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 107 ou 111 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 105 ou 109; (g) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 125 ou 129 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 123 ou 127; (h) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 143 ou 147 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 141 ou 145; (i) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 161 ou 165 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 159 ou 163; e (j) uma região VL como descrita na SEQ ID NO: 179 ou 183 e uma região VH como descrita na SEQ ID NO: 177 ou 181.

5. Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o primeiro domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε de humano e primata não chimpanzé compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ou 187.

6. Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência selecionada a partir de: (A) uma sequência de aminoácidos tal como descrita em qualquer uma das SEQ ID NOs: 237, 251, 265, 279, 629, 293, 307, 321, 335, 349, 363, 377, 391, 405, 419, 433, 447, 461, 475, 489, 503, 517, 531, 545, 559, 573, 587, 601 ou 615; e (B) uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico tal como descrita em qualquer uma das SEQ ID NOs: 238, 252, 266, 280, 630, 294, 308, 322, 336, 350, 364, 378, 392, 406, 420, 434, 448, 462, 476, 490, 504, 518, 532, 546, 560, 574, 588, 602 ou 616.

7. Molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que contém um tag, preferencialmente um His-tag C-terminal.

8. Processo para a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a molécula de anticorpo de cadeia única biespecífico, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em condições que permitam a expressão da molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, e a recuperação do polipeptídeo produzido a partir da cultura.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou produzida de acordo com o processo como definido na reivindicação 8.

10. Uso de uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia única, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou produzida de acordo com o processo como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, tratamento ou melhoria do câncer de tumor sólido, preferivelmente um câncer de próstata ou carcinoma.