CN107090044A - 跨物种特异性PSMAxCD3双特异性单链抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性单链抗体分子，其包含：能够结合至人类与非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域，其中该表位是包含在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6以及SEQ ID NO.8中的氨基酸序列的一部分；以及能够结合至前列腺‑特异性膜抗原(PSMA)的第二结合域。本发明还提供编码所述双特异性单链抗体分子的核酸以及载体与宿主细胞和用于其生产的方法。本发明还涉及包含所述双特异性单链抗体分子的药物组合物以及所述双特异性单链抗体分子的医学用途。

Description

跨物种特异性PSMAxCD3双特异性单链抗体
技术领域
本发明涉及双特异性单链抗体分子，其包含能够结合至人类与非黑猩 猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域，其中该表位是包含在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6以及SEQ ID NO.8中的氨 基酸序列的一部分，所述双特异性单链抗体分子还包含能够结合至前列腺 -特异性膜抗原(PSMA)的第二结合域。本发明还提供编码所述双特异性单链抗体分子的核酸以及载体与宿主细胞和用于其生产的方法。本发明进一 步涉及包含所述双特异性单链抗体分子的药物组合物以及所述双特异性 单链抗体分子的医学用途。
背景技术
T细胞识别由以克隆方式分布的αβ以及γδT细胞受体(TcR)介导， 所述T细胞受体与肽MHC(pMHC)的肽负载分子相互作用(Davis& Bjorkman,Nature 334(1988),395-402)。TcR的抗原特异性链不具有信号传 导结构域，而是被耦联到保守的多亚基的信号传导装置CD3(Call,Cell 111 (2002),967-979,Alarcon,Immunol.Rev.191(2003),38-46,MalissenImmunol. Rev.191(2003),7-27)。将TcR连接直接传送至信号传导装置的机制在T细 胞生物学中仍然是一个基本的疑问(Alarcon，上述引用文；Davis,Cell 110 (2002),285-287)。看起来清楚的是：持续的T细胞反应涉及辅助受体参与、 TcR寡聚合以及TcR-pMHC复合物在免疫学突触中的较高次序排列(Davis& van der Merwe,Curr.Biol.11(2001),R289-R291,Davis,Nat.Immunol.4 (2003),217-224)。然而，非常早的TcR信号传导在没有这些事件时发生，并 且可涉及CD3ε的配体诱导的构象变化(Alarcon，上述引用文；Davis(2002)， 上述引用文；Gil,J.Biol.Chem.276(2001),11174-11179；Gil,Cell 109(2002), 901-912)。信号传导复合物的ε、γ、δ以及ζ亚基彼此缔合以形成CD3ε-γ 异源二聚体、CD3ε-δ异源二聚体以及CD3ζ-ζ同源二聚体(Call，上述引用 文)。各种研究表明：CD3分子对于αβTcR的适当细胞表面表达和正常的T 细胞发育是重要的(Berkhout,J.Biol.Chem.263(1988),8528-8536；Wang,J. Exp.Med.188(1998),1375-1380；Kappes,Curr.Opin.Immunol.7(1995),441-447)。小鼠CD3εγ异源二聚体的胞外域片段的溶液结构显示：εγ亚基 均是C2组Ig结构域，它们相互作用以形成独特的边-对-边的二聚体构型(Sun, Cell 105(2001),913-923)。虽然富含半胱氨酸的茎似乎在驱动CD3二聚时起 重要作用(Su，上述引用文；Borroto,J.Biol.Chem.273(1998),12807-12816)， 但是经由CD3ε和CD3γ的胞外域的相互作用足以将这些蛋白质与TcRβ组 合(Manolios,Eur.J.Immunol.24(1994),84-92；Manolios&Li,Immunol.Cell Biol.73(1995),532-536)。虽然仍存在争议，但是TcR的主要化学计量学最 有可能包含一个αβTcR、一个CD3εγ异源二聚体、一个CD3εδ异源二聚体 以及一个CD3ζζ同源二聚体(Call，上述引用文)。鉴于人CD3εγ异源二聚 体在免疫反应中的中心作用，结合至治疗性抗体OKT3的这个复合物的晶体 结构最近已被阐明(Kjer-Nielsen,PNAS 101,(2004),7675-7680)。
许多治疗策略通过靶向TcR信号传导来调节T细胞免疫，特别是在临床 上广泛应用于免疫抑制方案的抗人CD3单克隆抗体(mAb)。CD3-特异性小 鼠mAb OKT3是第一个被许可使用于人的mAb(Sgro,Toxicology 105(1995), 23-29)，并且在移植(Chatenoud,Clin.Transplant 7(1993),422-430；Chatenoud, Nat.Rev.Immunol.3(2003),123-132；Kumar,Transplant.Proc.30(1998), 1351-1352)、1型糖尿病(Chatenoud(2003)，上述引用文)以及牛皮癣(Utset, J.Rheumatol.29(2002),1907-1913)中被广泛地用于临床免疫抑制剂。此外， 抗-CD3mAb可引起局部的T细胞信号传导以及克隆不应答(Smith,J.Exp.Med.185(1997),1413-1422)。OKT3在文献中被描述为有效的T细胞有丝分 裂原(VanWauve,J.Immunol.124(1980),2708-18)以及有效的T细胞杀手 (Wong,Transplantation50(1990),683-9)。OKT3以时间依赖的方式展现这 些活性；随着T细胞的早期活化导致细胞因子释放，在进一步管理OKT3后 阻止所有已知的T细胞功能。正是由于T细胞功能的这一较晚阻断，OKT3 作为免疫抑制剂广泛应用在用于降低或甚至消除同种异体移植组织排斥的治疗方案中。
OKT3最可能通过阻断所有T细胞的功能来改变同种异体移植的组织排 斥，这在急性排斥中发挥了重要作用。OKT3与人T细胞膜上的CD3复合 物反应并阻断CD3复合物的功能，所述CD3复合物与T细胞的抗原识别结 构(TCR)结合并且对于信号传导是必要的。哪一个TCR/CD3的亚基由OKT3 结合已经是许多研究的主题。虽然一些证据指出，OKT3对TCR/CD3复合 物的ε-亚基有特异性(Tunnacliffe,Int.Immunol.1(1989),546-50；Kjer-Nielsen,PNAS 101,(2004),7675-7680)。进一步的证据表明，OKT3结合TCR/CD3 复合物需要这个复合物的其他亚基存在(Salmeron,J.Immunol.147(1991), 3047-52)。
其他熟知的对CD3分子特异的抗体已列于Tunnacliffe,Int.Immunol.1 (1989),546-50。正如上面所指出的，这些CD3特异性抗体能够诱导各种T 细胞反应，例如淋巴因子产生(Von Wussow,J.Immunol.127(1981),1197； Palacious,J.Immunol.128(1982),337)、增殖(Van Wauve,J.Immunol.124 (1980),2708-18)以及抑制T细胞诱导(Kunicka，在“Lymphocyte Typing II” 1(1986),223中)。也就是说，取决于实验情况，CD3特异性单克隆抗体可 抑制或诱导细胞毒性(Leewenberg,J.Immunol.134(1985),3770；Phillips,J.Immunol.136(1986)1579；Platsoucas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981), 4500；Itoh,Cell.Immunol.108(1987),283-96；Mentzer,J.Immunol.135(1985), 34；Landegren,J.Exp.Med.155(1982),1579；Choi(2001),Eur.J.Immunol.31, 94-106；Xu(2000),CellImmunol.200,16-26；Kimball(1995),Transpl. Immunol.3,212-221)。
虽然已报道了许多本领域中描述的CD3抗体识别CD3复合物的CD3ε 亚基，事实上它们多数结合构象表位，并且，因此只识别在TCR原生环境 中的CD3ε。构象表位的特征在于存在两个或更多个在一级序列中分开的离 散的氨基酸残基，当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，所述残基在分子的表面 上聚到一起(Sela,(1969)Science 166,1365和Laver,(1990)Cell 61,553-6)。 在现有技术中描述的CD3ε抗体所结合的构象表位可被分成2个组。在主要 的组中，所述表位由2个CD3亚基(例如，CD3ε链、CD3γ或CD3δ链的 2个CD3亚基)形成。例如，在一些研究中已发现：最被广泛使用的CD3ε 单克隆抗体OKT3、WT31、UCHT1、7D6和Leu-4不结合至单独被CD3-ε 链转染的细胞。然而，这些抗体染色细胞由CD3ε加上CD3γ或CD3δ的组 合双重转染(Tunnacliffe，上述引用文；Law,Int.Immunol.14(2002),389-400； Salmeron,J.Immunol.147(1991),3047-52；Coulie,Eur.J.Immunol.21(1991),1703-9)。在第二个较小的组中，构象表位在CD3ε亚基本身内形成。这个组 的成员例如已针对变性的CD3ε出现的mAb APA 1/1(Risueno,Blood 106 (2005),601-8)。一并考虑，多数在本领域中被描述的CD3ε抗体识别位于两 个或更多个CD3亚基上的构象表位。形成这些表位3-维结构的离散的氨基 酸残基可因此坐落在CD3ε亚基本身上或在CD3ε亚基和其他CD3亚基(诸 如CD3γ或CD3δ)上。
另一个关于CD3抗体的问题是许多CD3抗体已被发现具有物种特异性。 抗-CD3单克隆抗体(如一般而言适用于任何其他的单克隆抗体)通过高特 异性识别它们的靶分子而起作用。它们只识别在它们的靶CD3分子上的单 一位点或表位。例如，一个对CD3复合物特异的最广泛使用且表征最充分 的单克隆抗体是OKT-3。这个抗体与黑猩猩CD3反应但不与其它灵长类动 物(例如猕猴)的CD3同源物或与狗的CD3反应(Sandusky等人,J.Med.Primatol.15(1986),441-451)。相似地，WO2005/118635或WO2007/033230 描述人单克隆CD3ε抗体，其与人CD3ε但不与小鼠、大鼠、兔子或非黑猩 猩灵长类动物(例如恒河猴、石蟹猕猴或狒狒)的CD3ε反应。抗-CD3单 克隆抗体UCHT-1也与来自黑猩猩的CD3反应但不与来自猕猴的CD3反应 (自有数据)。另一方面，也有识别猕猴抗原但不识别它们的人对应物的单 克隆抗体的实例。这个组的一个实例是针对来自猕猴的CD3的单克隆抗体 FN-18(Uda等人,J.Med.Primatol.30(2001),141-147)。有趣地，已发现来 自大约12％石蟹猕猴的外周血淋巴细胞由于猕猴的CD3抗原的多态性而缺 乏与抗-恒河猴的CD3单克隆抗体(FN-18)反应的活性。Uda等人描述了相 较于与FN-18抗体反应的源自动物的CD3，不与FN-18抗体反应的石蟹猕 猴的CD3序列中的2个氨基酸的替换(Uda等人,J Med Primatol.32(2003), 105-10；Uda等人,J Med Primatol.33(2004),34-7)。
识别能力(即，物种特异性，不仅CD3单克隆抗体(以及它们的片段) 是固有的，对于一般的单克隆抗体也是固有的)对于所述抗体发展作为用于 治疗人类疾病的治疗药物而言是一个重大的阻碍。为了获得上市许可，任何 新的候选药物必须经过严格的测试。这个测试可以细分成临床前以及临床阶 段，而临床阶段进一步被细分成一般已知的临床I、II和III期，在人类患者 中进行，临床前阶段在动物中进行。临床前测试的目的是证明候选药物具有 所需的活性并且最重要地是安全的。只有当动物的安全性以及该候选药物可 能的有效性已在临床测试前建立时，这个候选药物将被批准由各自的监管机 构用于人类临床测试。可通过下列3种方式在动物中测试候选药物的安全性： (i)在相关物种中，即在药物候选物可识别同源物抗原的物种中，(ii)在含有人 抗原的转基因动物中，以及(iii)通过使用可以结合动物体内存在的同源物抗 原的候选药物替代品。转基因动物的限制使得这个技术通常被限制于啮齿类 动物。啮齿类动物与人在生理学上有显著的不同，安全性结果不能轻易地外 推到人类。候选药物替代品的局限性在于与实际候选药物相比是不同的物质 组成，并且使用的动物经常是如上面所讨论的具有局限的啮齿类动物。因此， 相比于候选药物，在啮齿类动物中产生的临床前数据的预测能力有限。安全 性测试方法的选择是利用相关的物种，优选低等的灵长类动物。本领域描述 的适用于人的治疗性干预的单克隆抗体的现有限制是：相关物种是较高等的 灵长类动物，特别是黑猩猩。黑猩猩被认为是濒危物种，并且由于它们类似 人类的本质，这类动物用于药物安全性测试在欧洲已被禁止，并且在其他地 方也被严格限制。为了将细胞毒性T细胞重定向至病理细胞，CD3已成功地被用作双特异性单链抗体的靶标，导致病变细胞从不同的生物体内耗竭(WO 99/54440；WO04/106380)。例如，Bargou等人(Science 321(2008):974-7) 最近报道的具有临床活性的CD19xCD3双特异性抗体构建体被称为 blinatumomab，其具有使人患者的所有细胞毒性T细胞用于癌细胞裂解的潜 力。在非霍奇金氏淋巴瘤患者中，使用低至每天每平方米0.005毫克的剂量 导致血液中的靶细胞的消除。部分以及完全的肿瘤消退最先在0.015毫克的 剂量水平观察到，并且在0.06毫克的剂量水平下治疗的全部7位患者均经历 了肿瘤消退。Blinatumomab也导致肿瘤细胞从骨髓以及肝中清除。虽然这个 研究建立了关于双特异性单链抗体形式在治疗血细胞衍生癌的治疗效力的 临床证据或概念，但是仍然需要用于治疗其他类型癌症的成功概念。
在2008年，估计有186,320男性在美国将被新诊断出患有前列腺癌，并 且大约28,660男性将死于这种疾病。最近一份关于癌症死亡率的报告显示： 在2004年，美国人中前列腺癌的总死亡率为每100,000例有25例。在20 世纪80年代末，广泛地采用前列腺-特异性抗原(PSA)测试，在前列腺癌 的管理上代表了一个重大的改进。这个测试测量血中PSA蛋白的量，其在 前列腺癌患者中往往是升高的。在1986年，美国食品药物管理局(FDA) 批准了使用PSA测试来监测具有前列腺癌的患者，并且在1994年还批准其 用作本病的筛选试验。由于PSA测试在美国广泛地实施，约90％的前列腺 癌在早期被诊断出，并且，因此患者在诊断后存活更久。然而，需要NCI- 资助的前列腺、肺、结肠直肠与卵巢(PLCO)筛查试验以及筛查前列腺癌 的欧洲研究(ERSPC)这2个进行中的临床试验的结果，以确定PSA筛查 是否能拯救生命。在过去25年中进行着的临床试验已调查了天然与合成的 化合物在预防前列腺癌的效力。例如，招收近19,000位健康男性的前列腺癌 预防试验(PCPT)发现：被批准用于治疗良性前列腺增生(BPH，一种非 癌的前列腺肿大)的药物非那雄胺，将罹患前列腺癌的风险减少25％。另一 个试验，硒与维生素E癌症预防试验(SELECT)研究超过35,000位男性以确定每天补充硒以及维生素E是否可降低健康男性前列腺癌的发病率。其他 预防前列腺癌的试验目前正在评估综合维生素、维生素C与D、大豆、绿茶 以及在番茄中被发现的天然化合物番茄红素的保护潜力。一篇在2005年报 导的研究显示，特定基因融合于60％至80％的被分析的前列腺肿瘤中。这个 研究代表首次在前列腺癌中观察到非随机基因重排。这种基因的改变最终可 用作生物标记物，以帮助本病的诊断及可能的治疗。其他研究已表明：在8号染色体特定区域内的遗传变异可以增加人罹患前列腺癌的风险。这些基因 变异导致约25％的前列腺癌发生在白人男性中。它们是第一个被确认增加罹 患前列腺癌风险的基因变异体，并且可帮助科学家更好地了解这个疾病的遗 传原因。也有持续的研究探讨了在患者血液中循环的蛋白质如何可用于改善 前列腺以及其他癌症的诊断。在2005年，科学家鉴定了由患者的免疫系统 响应于前列腺肿瘤而产生的特定蛋白质。这些蛋白质是一种自身抗体，其能 够以大于90％的准确度来检测血液样品中前列腺癌细胞的存在。当与PSA 组合使用时，这些以及其他的血液蛋白最终可用于减少仅用PSA测试获得 的假阳性结果的数目，并且因此降低了由于假阳性PSA测试结果而每年进 行的大量的不必要的前列腺活检。
除了PSA之外，已经鉴定了数种用于前列腺癌的其他标记物，包括例 如：前列腺的6次跨膜的上皮抗原(STEAP)(Hubert等人,PNAS 96(1999), 14523-14528)、前列腺干细胞抗原(PSCA)(Reiter等人,Proc.Nat.Acad.Sci. 95:1735-1740,1998)以及前列腺特异性膜抗原(PSMA；PSM)(Israeli等 人,Cancer Res.53(1993))。PSMA起初由源自淋巴结前列腺腺癌(LNCaP) 细胞系的部分纯化的膜制剂免疫的单克隆抗体(MAb)7E11定义 (Horoszewicz等人,Anticancer Res.7(1987),927-35)。克隆编码PSMA蛋白 的2.65kb的cDNA片段，随后映射到染色体11p11.2(Israeli等人，上述引 用文；O'Keefe等人,Biochem.Biophys.Acta1443(1998),113-127)。PSMA的 初步分析证明了在前列腺分泌上皮细胞内的广泛表达。免疫组化染色显示： PSMA在增生以及良性组织中缺乏至中度表达，而恶性组织以最大强度染色 (Horoszewicz等人，上述引用文)。后续的研究证实了这些结果，并表明PSMA表达为目前在几乎每个被检查的前列腺组织的普遍特征。这些报告进 一步表明PSMA的表达与肿瘤侵袭性特别成比例地增加(Burger等人,Int.J. Cancer 100(2002),228-237；Chang等人,Cancer Res.59(1999),3192-98； Chang等人,Urology 57(2001),1179-83；Kawakami和Nakayama,Cancer Res. 57(1997),2321-24；Liu等人,Cancer Res.57(1997),3629-34；Lopes等人, Cancer Res.50(1990),6423-29；Silver等人,Clin.Cancer Res.9(2003),6357-62；Sweat等人,Urology 52(1998),637-40；Troyer等人,Int.J.Cancer 62 (1995),552-558；Wright等人,Urology 48(1996),326-334)。与在PSMA表达 和肿瘤分期之间的相关性一致，PSMA的水平提高与雄性激素-非依赖性前 列腺癌(PCa)有关。前列腺癌患者的组织样本分析表明，在身体阉割或雄 性激素耗竭的治疗后PSMA的水平升高。不像前列腺特异性抗原的表达即在 雄性激素消除后PSMA减量调节，在原发性和转移性肿瘤样品中PSMA表达均显著地增加(Kawakami等人、Wright等人，上述引用文)。与在雄性激 素-非依赖性的肿瘤中表达升高相一致，PSMA转录也被认为是由类固醇减 量调节，并且睾丸激素给药介导PSMA蛋白以及mRNA的水平显著地降低 (Israeli等人,Cancer Res.54(1994),1807-11；Wright等人，上述引用文)。 PSMA也在继发性前列腺肿瘤以及隐匿性转移疾病中高度表达。免疫组化分 析显示：相较于良性前列腺组织，位于淋巴结、骨、软组织和肺的转移病灶 内的PSMA的表达相对激烈和均一(Chang等人(2001)，上述引用文；Murphy 等人,Cancer 78(1996),809-818；Sweat等人，上述引用文)。一些报告还显 示，在包括肾脏近端小管的亚组、小肠刷状缘膜的一些细胞以及在结肠隐窝 的稀少细胞的前列腺外组织中，PSMA表达有限(Chang等人(1999)、 Horoszewicz等人、Israeli等人(1994)、Lopes等人、Troyer等人，上述引用 文)。然而，PSMA在这些组织中的水平通常是2到3个数量级，小于在前 列腺中观察到的(Sokoloff等人,Prostate 43(2000),150-157)。PSMA也表达 于多数被检查的实体癌的肿瘤相关的血管新生系统中，但是在正常的血管内 皮中是缺少的(Chang等人(1999)、Liu等人、Silver等人，上述引用文)。 虽然PSMA在血管内表达的显著性是未知的，但是与肿瘤相关的血管内皮细 胞的特异性使PSMA成为用于治疗多种形式的恶性肿瘤的潜在靶标。
虽然已经把许多的精力放在鉴定用于癌症治疗方法的新靶标上，但是癌 症仍是最常被诊断的疾病之一。鉴于此，仍然需要对于癌症的有效治疗。
发明内容
本发明提供一种双特异性单链抗体分子，其包含能够结合至人类及非黑 猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域，其中，该表位是包含在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8中的氨基酸序列的 一部分；和能够结合至前列腺-特异性膜抗原(PSMA)的第二结合域。
虽然本领域描述的T细胞-接合的双特异性单链抗体对于治疗恶性疾病 有很大的治疗潜力，但是这些双特异性分子大多数被限制在：它们是物种特 异性的并且只识别人类抗原，以及由于基因相似性可能识别黑猩猩对应物。 本发明的优点是提供一种双特异性单链抗体，其包含对于人类以及非黑猩猩 灵长类动物的CD3ε链显示具有跨物种特异性的结合域。
在本发明中令人惊奇地发现，相比于本领域描述的全部其它已知的CD3 ε的表位，当CD3ε的胞外域的N-端1-27个氨基酸残基多肽片段从其在CD3 复合物中的原生环境取出时(并且任选地融合到外源氨基酸序列，例如 EpCAM或免疫球蛋白Fc部分时)，所述多肽片段维持其三维结构完整性。 因此，本发明提供一种双特异性单链抗体分子，其包含第一结合域，所述第 一结合域能够结合至人类以及至少一种非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的 CD3ε(CD3ε是，例如，从它的原生环境取出和/或由T-细胞包含的(存在 于其表面))的胞外域的N-端1-27个氨基酸残基多肽片段的表位，其中，该 表位是包含在SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8 中的氨基酸序列的一部分；以及第二结合域，所述第二结合域能够结合至前 列腺-特异性膜抗原(PSMA)。在此处及其它地方被提及的非黑猩猩灵长类 动物是优选的。至少一种(或其中所选或全部)灵长类动物选自白鬓狨；绒 顶柽柳猴、松鼠猴以及马来猴(SEQ ID 631或SEQ ID 632或者这两者)是 特别优选的。恒河猕猴(也被称为恒河猴)也设想作为另一种优选的灵长类 动物。因此设想：本发明的抗体结合至(能够结合至)人类以及白鬓狨、绒 顶柽柳猴、松鼠猴和马来猴(SEQ ID 631或SEQ ID 632或者这两者)、以及 任选地恒河猕猴的CD3ε的胞外域的N-端1-27个氨基酸残基多肽片段的环 境独立表位。可根据在WO 2008/119567(特别是WO 2008/119567的实施例 2)中的操作获得(可由此获得)或制造如本文定义的包含第一结合域的双 特异性单链抗体分子。为此，设想(a)用人类和/或松鼠猴的CD3ε的胞外域 的N-端1-27个氨基酸残基多肽片段免疫小鼠；(b)产生免疫鼠抗体scFv文库；(c)通过测试至少结合至SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.8的能力来鉴定CD3ε特异性结合物。
本发明所提供的环境独立的CD3表位对应于CD3ε的前27个N-端氨基 酸或者这27个氨基酸伸展物的功能性片段。如本文所用，关于CD3表位的 用语“环境独立”意指本文描述的本发明的结合分子/抗体分子的结合不会引 起构象、序列、在抗原决定簇或表位周围的结构的改变或修饰。相比之下， 由常见的CD3结合分子(例如，如公开在WO 99/54440或WO04/106380) 识别的CD3表位位于环境独立表位的CD3ε链C-端至N-端的1-27个氨基 酸上，其中若它被嵌在ε链的其余部分内并通过ε链与CD3γ或δ链的异二 聚体化而被保持在正确的空间位置时，它仅采取正确的构象。
如本文提供的作为PSMAxCD3双特异性单链分子的一部分的抗-CD3结 合域，已在WO 2008/119567有描述。针对环境独立的CD3表位产生(且指 向)的这些结合域提供了关于T细胞再分布的惊人的临床改善，并且因此提 供了更有利的安全性。不被理论所限制，由于CD3表位是环境独立的，形 成自给自足的子域而对CD3复合物的其余部分影响不大，因此，相比于识 别环境独立的CD3表位的常规CD3结合分子(如WO 99/54440或WO 04/106380中提供的分子)，本文提供的PSMAxCD3双特异性单链分子的CD3 结合域在CD3构象上诱发较少的异位变化。
在用本发明所述的PSMAxCD3双特异性单链抗体治疗的开始阶段期 间，由本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体的CD3结合域识别的环境独 立的CD3表位与T细胞再分布(T细胞再分布等同于T细胞绝对计数的首 次下降期和随后的恢复)相关较少或无相关。相比于本领域已知的识别环境 依赖的CD3表位的常规CD3结合分子，这些使得本发明的PSMAxCD3双 特异性单链抗体具有较佳的安全性。特别地，因为T细胞再分布在用CD3 结合分子治疗的开始阶段期间是不良事件的主要风险因素，如CNS不良事 件，所以通过识别环境独立的而不是环境依赖的CD3表位的本发明的 PSMAxCD3双特异性单链抗体具有很大的安全性，优于本领域已知的CD3 结合分子。在用常规CD3结合分子治疗的开始阶段期间具有与T细胞再分 布有关的这类CNS不良事件的患者通常思维混淆和迷失方向，在一些情况下，还会出现尿失禁。混淆是一种精神状态的改变，其中患者不能够以他或 她的正常的清晰水平来思考。患者通常难以集中，并且思考不仅模糊不清而 且时常显著地被放慢。在用常规CD3结合分子治疗的开始阶段期间具有与T 细胞再分布有关的CNS不良事件的患者还可能丧失记忆。频繁地，思维混 淆导致丧失识别人、地方、时间或日期的能力。迷失方向的感觉在思维混淆 中是常见的，并且做出判断的能力受损。在用常规CD3结合分子治疗的开始阶段期间与T细胞再分布有关的CNS不良事件还进一步包括语音模糊不 清和/或选字困难。这种障碍可能会削弱语言的表达与理解，以及阅读和写作。 除了尿失禁之外，在一些患者中，在用常规CD3结合分子治疗的开始阶段 期间与T细胞再分布有关的CNS不良事件还可能伴有眩晕以及头昏眼花。
在提及的CD3ε的N-端27个氨基酸多肽片段内的3维结构的维持可用 于产生能够以相同的结合亲和力在体外结合至N-端CD3ε多肽片段以及在 体内结合至在T细胞上的原生的CD3复合物(的CD3ε亚基)的结合域， 优选人类的结合域。这些数据有力地表明：如本文描述的N-端片段形成类 似于其体内正常存在的结构的三级构象。进行了关于CD3ε的N-端多肽片 段的氨基酸1-27的结构完整的重要性的非常灵敏的测试。CD3ε的N-端多 肽片段的氨基酸1-27的各个氨基酸被改变成丙氨酸(丙氨酸扫描)，以测试 CD3ε的N-端多肽片段的氨基酸1-27对于轻微破坏的灵敏度。CD3特异性 结合域作为本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体的一部分，用于测试与 CD3ε的N-端多肽片段的氨基酸1-27的丙氨酸-突变体的结合(见WO 2008/119567)。在片段的N-端处的前5个氨基酸残基以及在CD3ε的N-端 多肽片段的氨基酸1-27的第23和25位的2个氨基酸的个别互换，对于这 些抗体分子的结合是关键的。将包含残基Q(在第1位处的谷氨酰胺)、D (在第2位处的天冬氨酸)、G(在第3位处的甘氨酸)、N(在第4位处的 天冬酰胺)以及E(在第5位处的谷氨酸)的第1-5位的区域中的氨基酸残 基替换成丙氨酸，消除了本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人 类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)与所述片段的结合。然而，对于至少 一些本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特 异性单链抗体)，在提及的片段T(在第23位处的苏氨酸)以及I(在第25 位处的异亮氨酸)的C-端处的2个氨基酸残基，降低了对本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体) 的结合能。
意外地，已发现如此分离的本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优 选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)，不仅识别人CD3ε的N-端片段， 而且识别各种灵长类动物的CD3ε的相应同源片段，所述灵长类动物包括新 世界猴(狨猴，白鬓狨；绒顶柽柳猴；松鼠猴)和旧世界猴(马来猴，也被 称为石蟹猕猴；或恒河猕猴，也被称为恒河猴)。因此，检测到本发明的 PSMAxCD3双特异性单链抗体的多灵长类动物特异性。下列的序列分析证 实，人类和灵长类动物在CD3ε的胞外域的N-端处共有高度同源的序列延 伸物。
前面所提及的CD3ε的N-端片段的氨基酸序列描述于SEQ ID NO.2(人 类)、SEQ IDNO.4(白鬓狨)；SEQ ID NO.6(绒顶柽柳猴)；SEQ ID NO.8 (松鼠猴)；SEQ IDNO.631QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTILTC或SEQ ID NO.632QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT(马来猴，也被称为石蟹猕猴) 以及SEQ ID NO.633QDGNEEMGSITQTPYHVSISGTTVILT(恒河猕猴，也 被称为恒河猴)。
本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体的第二结合域结合至前列腺-特 异性膜抗原(PSMA)。优选地，该PSMAxCD3双特异性单链抗体的第二结 合域结合至人类PSMA或非黑猩猩灵长类动物PSMA；更优选地，它结合至 人类PSMA以及非黑猩猩灵长类动物PSMA，并且因此是跨物种特异性的； 更优选地，结合至人类PSMA以及猕猴PSMA(并且因此也是跨物种特异性 的)。特别优选地，猕猴PSMA是石蟹猕猴PSMA和/或恒河猴PSMA。然而， 不排除在本发明范围外的是：该第二结合域也可结合至其他物种的PSMA同 源物(例如啮齿类动物的PSMA同源物)。
前列腺癌是男性的第二大癌症。在2008年，估计美国有186,320位男性 将被新诊断出患有前列腺癌，并且大约28,660位男性将死于这种疾病。患前 列腺癌的风险与年龄强相关：非常少的病例为出现在50岁以下的男性中， 而四分之三的病例发生在超过65岁的男性中。最大数目的病例被诊断出现 在70-74岁的男性中。目前，老年人口的增长率显著高于总人口。到2025-2030 年，预测指出60岁以上人口的增长速度将是总人口的3.5倍。在下半个世纪， 预测世界各地老年人的比例将超过2倍，这意味着未来诊断出的前列腺癌的 发生率将进一步增加。PSMA的高度受限表达和它在前列腺癌的发展阶段与 转移性疾病中的增量调节以及它在许多不同类型的其他实体瘤的肿瘤血管 上作为新抗原的作用使得PSMA能够作为以抗体为基础的癌症治疗的有吸 引力的靶标抗原。正如在下列实施例中所示，本发明的PSMAxCD3双特异 性单链抗体提供了杀死表达PSMA的人类癌细胞(如作为例示的人类前列腺 癌细胞系LNCaP)的有利工具。此外，本发明的PSMAxCD3双特异性单链 抗体的细胞毒活性要比本领域描述的抗体的细胞毒活性高。由于优选本发明 的PSMAxCD3双特异性单链抗体的CD3和PSMA结合域均是跨物种特异性 的(即，与人类以及非黑猩猩灵长类动物抗原反应)，它可用于这些结合域 在灵长类动物中以及以相同形式作为人用药物的安全性、活性和/或药代动力 学特征的临床前评价。
有利地，本发明还提供包含结合至人类PSMA以及猕猴PSMA同源物 (即，非黑猩猩灵长类动物的同源物)的第二结合域的PSMAxCD3双特异 性单链抗体。在一个优选的实施方案中，该双特异性单链抗体因此包含对于 人类以及非黑猩猩灵长类动物PSMA显示具有跨物种特异性的第二结合域。 在这种情况下，同样的双特异性单链抗体分子可用于这些结合域在灵长类动 物中和作为人用药物的安全性、活性和/或药代动力学特征的临床前评价。换言之，相同分子可用于在临床前动物研究以及人类的临床研究。这使得结 果高度可比较，并且相较于物种-特异性替代分子，动物研究的预测能力大 幅增加。由于本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体的CD3和PSMA结合 域都是跨物种特异性的，即，与人类以及非黑猩猩灵长类动物的抗原反应， 其可用于这些结合域在灵长类动物以及以同样的形式作为人用药物的安全 性、活性和/或药代动力学特征的临床前评价。将会理解的是：在一个优选的 实施方案中，本发明的抗体的第一和第二结合域的跨物种特异性是相同的。
在本发明中已发现，可以产生一种PSMAxCD3双特异性单链抗体(优 选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)，其中相同的分子可用于临床前动 物试验以及临床研究并甚至用于人类的治疗。这是由于意想不到地发现该 PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体) 除了分别结合至人类CD3ε以及PSMA之外，(并且由于可能与黑猩猩对应 物的基因相似性)，还可结合至非黑猩猩灵长类动物(包括新世界猴以及旧 世界猴)的所述抗原的同源物。正如下面实施例中所示，本发明的所述 PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体) 可用作治疗剂来对抗各种疾病，包括、但不限于癌症。该PSMAxCD3双特 异性单链抗体特别有利地用于治疗癌症，优选实体瘤，更优选癌以及前列腺 癌。鉴于上述，需要构建PSMAxCD3双特异性单链抗体的替代物，以测试 远离亲源(人类)的物种的消失。结果，因为意欲将药物投入到临床试验以 及后续的市场许可和治疗药物的给药，将相同的分子用于动物临床前试验。 能够使用与日后施用给人类的相同分子来进行临床前动物试验，实际上消除 了或者至少大大降低了在临床前动物试验中所获得的数据对人类方案的适 用性有限的危险。简而言之，使用与将实际施用给人类的相同分子在动物中 获得临床前安全性数据，确实会确保该数据对人类相关方案适用。相比之下， 在使用替代分子的常规方法中，这种替代分子必须被以分子方式适应于用于 临床前安全评价的动物试验体系。因此，用于人类治疗的分子实际上在序列 上以及可能在结构上不同于用于临床前试验药代动力学参数和/或生物活性 的替代分子，结果是在临床前动物试验中所获得的数据对于人类方案的适用 性/可转移性有限。替代分子的使用需要构建、生产、纯化以及表征全新的构 建体。这将导致需要额外的开发成本和时间来获得该分子。总之，除了用于 人类治疗的实际药物，还得单独开发替代物，故需要进行2种分子的2个开发生产线。因此，显示具有跨物种特异性的本发明的PSMAxCD3双特异性 单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)的一个主要优点是， 可以将相同的分子用作人类以及临床前动物试验中的治疗剂。
优选地，所述本发明的双特异性单链抗体的第一或第二结合域的至少一 者是CDR-移植的、人源化的或人类的，如下文更详细所述。优选地，所述 本发明的双特异性单链抗体的第一以及第二结合域均是CDR-移植的、人源 化的或人类的。对于本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的 PSMAxCD3双特异性单链抗体)，对人类患者给药时，抵抗所述结合分子的 免疫反应的产生对抗被最大可能程度地排除。
本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特 异性单链抗体)的另一个主要优点是，它适用于各种灵长类动物的临床前试 验。理想的候选药物在动物中的作用应该能够反应出该候选药物施用给人类 后的预期作用。结果，因此从此类临床前试验获得的数据一般而言应该具有 对人类方案的高度预测力。然而，从最近的TGN1412(CD28单克隆抗体) I期临床试验的不幸结果可知，候选药物在灵长类动物物种和人类中有不同作用：在石蟹猕猴的动物研究中已观察到所述抗体在临床前试验中没有或仅 有有限的不良反应，但是6位人类患者在施用所述抗体后发展为多脏器功能 衰竭(Lancet 368(2006),2206-7)。这些剧烈的、非预期负面事件的结果表 明，将临床前试验限制于仅一种(非黑猩猩灵长类动物)物种未必是足够的。 事实上，本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体结合至一系列的新世界猴 和旧世界猴，可有助于克服上述例子中所面临的问题。因此，本发明提供在 开发和测试用于人类治疗的药物时将物种差异的影响最小化的手段和方法。
关于本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3 双特异性单链抗体)，使测试动物适应于意欲施用给人类的候选药物，例如， 建立转基因动物，也不再是必要的。根据本发明的用途和方法显示具有跨物 种特异性的本发明PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3 双特异性单链抗体)可直接用于非黑猩猩灵长类动物的临床前试验，没有动 物的任何遗传操作。正如本领域技术人员熟知的，使测试动物适应于候选药 物的方法经常承受如下风险：在临床前安全性测试中获得的结果较少有代表 性，并且由于该动物的修饰对于人类的预测力较低。例如，在转基因动物中， 由转基因编码的蛋白质经常被高度过表达。因此，所获得的抗体对抗该蛋白 质抗原的生物活性的数据可能在它们对人类(该蛋白质在人中以更低、更生 理学的水平表达)的预测值方面有限。
显示具有跨物种特异性的本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优 选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)的用途的另一个优点是以下事实： 黑猩猩作为一种濒危物种，被避免用于动物试验。黑猩猩是人类最接近的亲 属，并且最近根据基因组测序数据而被分入人科(Wildman等人,PNAS 100 (2003),7181)。因此，用黑猩猩获得的数据通常被认为是对于人类高度预测 的。然而，由于它们的状态为濒危物种，可用于医学实验的黑猩猩的数目被 高度限制。如上所述的，因此，维持黑猩猩用于动物试验是昂贵并且具有伦 理问题的。本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3 双特异性单链抗体)的使用避免了在临床前试验期间的伦理异议以及财政负 担，并且没有损害质量(即，所获得的动物试验数据的适用性)。鉴于此， 本发明的优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体的使用在黑猩猩研究上 提供了一个合理选择。
本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特 异性单链抗体)的又一优点是，当用它作为动物临床前试验(例如在动物药 代动力学研究的过程中)的一部分时，提取多个血液样本的能力。非黑猩猩 灵长类动物要比低等动物(例如，小鼠)更容易进行多次血液提取。多个血 液样品的提取允许持续测试血液参数，以测定由本发明的PSMAxCD3双特 异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)诱导的生物效 应。再者，多个血液样品的提取使研究者能够评估如本文定义的本发明的 PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体) 的药代动力学特征。此外，反映在血液参数中的可由所述本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体) 诱导的可能副作用，可在施用所述抗体过程期间提取的不同血液样品中进行 测量。这允许测定如本文定义的本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体(优 选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)的可能毒性。
显示具有跨物种特异性的如本文定义的本发明的PSMAxCD3双特异性 单链抗体(优选人类的PSMAxCD3双特异性单链抗体)的优点，可被简要 地概述如下：
第一，用于临床前试验的如本文定义的本发明的(优选人类的) PSMAxCD3双特异性单链抗体与用于人类患者的抗体是相同的。因此，不 再需要开发在药代动力学性质以及生物活性上可能不同的2个独立分子。这 是高度有利的，原因在于，例如相比于传统替代方法，所述药代动力学结果 能够直接转移和应用于人类情况。
第二，与替代方法相比，将如本文定义的本发明的(优选人类的) PSMAxCD3双特异性单链抗体用于制备人类的治疗药物时，成本和劳动密 集度更低。
第三，如本文定义的本发明的(优选人类的)PSMAxCD3双特异性单 链抗体可用于的临床前试验不仅为在一种灵长类动物物种中，而且在一系列 不同的灵长类动物物种中，从而限制了灵长类动物和人类之间潜在的物种差 异的风险。
第四，如果必需，作为濒危物种的黑猩猩可避免用于动物试验。
第五，可提取多个血液样本以用于广泛的药物动力学研究。
第六，由于根据本发明的一个优选实施方案的结合分子(优选人类的结 合分子)的人类来源，当给人类患者施用时，产生的对抗所述结合分子的免 疫反应被降到最低。排除了诱导出对源自非人类物种的候选药物特异性的抗 体的免疫反应，所述非人类物种例如导致出现对抗鼠来源的治疗分子的人类 抗小鼠抗体(HAMA)的小鼠。
最后但并非最不重要的是，本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体的 治疗用途提供一种新颖、有创造性的用于癌症的治疗方法，所述癌症优选为 实体瘤，更优选为癌和前列腺癌。如在下述实施例中所示的，本发明的 PSMAxCD3双特异性单链抗体为杀死表达PSMA的人类前列腺癌细胞提供 了有利的工具。再者，本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体的细胞毒活 性要比本领域描述的抗体的活性高。
正如上述指出的，本发明提供多肽，即，双特异性单链抗体，其包含能 够结合至人类及非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域以及能够 结合至PSMA的第二结合域。所述第二结合域优选地结合至人类PSMA以 及非黑猩猩灵长类动物PSMA。双特异性单链抗体分子作为实现本发明的优 选双特异性单链抗体要求的候选药物，其优点是此类分子用于临床前动物试 验以及临床研究甚至用于人类的治疗。在本发明的跨物种特异性的双特异性 单链抗体的一个优选实施方案中，该结合至PSMA的第二结合域是人类的。 在根据本发明的跨物种特异性的双特异性分子中，该结合至人类与非黑猩猩 灵长类动物CD3ε链的表位的结合域以VH-VL或VL-VH的次序位于该双 特异性分子的N-端或C-端处。在所述第一和第二结合域中呈VH-以及VL- 链不同排列的根据本发明的跨物种特异性的双特异性分子，其实例描述于所 附的实施例中。
如本文所用的，“双特异性单链抗体”表示包含2个结合域的单多肽链。 每个结合域包含一个来自抗体重链(“VH区域”)的可变区域，其中，所述 第一结合域的VH区域特异性地结合至CD3ε分子，所述第二结合域的VH 区域特异性地结合至PSMA。2个结合域任选地由短间隔多肽彼此相连。间 隔多肽的非限制性实例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)及其重复序列。 每个结合域可另外包含一个来自抗体轻链(“VL区域”)的可变区域，在所 述第一和第二结合域内的该VH区域和VL区域经由连接多肽彼此相连，例 如在EP 623679 B1中所陈述和要求的类型，但在任何情况下长到足以允许所 述第一结合域的VH区域和VL区域以及所述第二结合域的VH区域和VL 区域彼此配对，以使得它们能够一起特异性地结合至相应的第一和第二结合 域。
术语“蛋白质”是本领域熟知的，并且描述生物化合物。蛋白质包括一 或多个氨基酸链(多肽)，从而氨基酸经由肽键彼此结合。如本文所述的， 术语“多肽”描述由超过30个氨基酸组成的分子类别。依据本发明，只要蛋 白质由单链多肽组成，则多肽类别包括“蛋白质”。此外，符合该定义，术语 “多肽”描述蛋白质的片段，只要这些片段由超过30个氨基酸组成即可。多 肽可进一步形成多聚体，如二聚体、三聚体和较高级的寡聚物(即，由一个 以上的多肽分子组成)。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同 的或不同的。此类多聚体的对应的高阶结构相应称为同源-或异源二聚体、 同源-或异源三聚体等。异源多聚体的实例是抗体分子，其自然发生形式由2 条相同的轻多肽链和2条相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白质”也指 经天然修饰的多肽/蛋白质，其中所述修饰通过如翻译后修饰(例如糖基化、 乙酰化、磷酸化等等)进行。此类修饰是本领域熟知的。
根据本发明，术语“结合域”表征多肽的特异性地结合至/相互作用于给定 靶标结构/抗原/表位的结构域。因此，该结合域是“抗原相互作用位点”。根 据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义多肽的基序，该基序能够特异性地 与特定抗原或特异抗原组(例如，在不同物种中的相同抗原)相互作用。所 述结合/相互作用也理解为定义“特异性识别”。根据本发明，术语“特异性地 识别”指抗体分子能够特异性地相互作用于和/或结合至抗原的至少2个氨基 酸，优选至少3个氨基酸，更优选至少4个氨基酸，例如如本文定义的人类 CD3抗原。此类结合可以“锁钥原理”的特异性为例。因此，在结合域的氨基 酸序列中的特定基序和抗原彼此结合，以形成它们的一级、二级或三级结构 以及导致该结构的二级修饰。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相 互作用也可导致所述位置与抗原的简单结合。再者，结合域/抗原相互作用位 点与其特异性抗原的特异性相互作用或者导致信号的启动，例如，起因于诱 到抗原构象形的改变、抗原的寡聚合等。与本发明相符的结合域的优选实施 例是抗体。该结合域可以是单克隆抗体或多克隆抗体或者源自单克隆抗体或 多克隆抗体。
术语“抗体”包含仍然维持结合特异性的衍生物或功能性片段。生产抗体 的技术是本领域熟知的，并且描述于，例如Harlow和Lane“Antibodies,A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988；Harlow和 Lane“Using Antibodies:ALaboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999以及Little“Recombinant Antibodies for Immunotherapy” Cambridge University Press 2009。术语“抗体”还包括不同类别的免疫球蛋白 (Ig's)(如，IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)及其亚类(如IgG1、IgG2等)。
术语“抗体”的定义还包括如嵌合的、单链和人源化抗体以及抗体片段 (尤其像Fab片段)的实施方案。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab')2、Fv、 scFv片段或单结构域抗体、单可变结构域抗体或者仅包含一个可变结构域 (可以是特异性地结合至抗原或表位而无关其它V区域或结构域的VH或 VL)的免疫球蛋白单可变结构域；参见，例如，Harlow和Lane(1988)与(1999) 以及Little(2009)，上述引用文。所述免疫球蛋白单一可变结构域不仅包括 经分离的抗体单可变结构域多肽，而且包括含有抗体单可变结构域多肽序列 的一个或多个单体的较大多肽。
各种操作程序是本领域已知的，并且可被用于生产此类抗体和/或片段。 因此，所述(抗体)衍生物也可通过模拟肽生产。进一步地，所述生产单链 抗体的技术(尤其是参见美国专利4,946,778)可适用于生产对选定多肽具有 特异性的单链抗体。此外，转基因动物可被用于表达对本发明的多肽和融合 蛋白质特异性的人源化或人类抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用提供由 连续细胞系培养产生的抗体的任何技术。这类技术的实例包括杂交瘤技术( 和Milstein Nature 256(1975),495-497)、三体瘤技术、人类B-细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)以及生产人类单克隆抗 体的EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。如用于BIAcore系统的表面等离子体共振可 被用于增加结合至靶标多肽(如CD3ε或PSMA)的表位的噬菌体抗体的效 率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J. Immunol.Methods 183(1995),7-13)。还可以设想，在本发明上下文中：术语 “抗体”包括可在如下文所述的宿主中表达的抗体构建体，例如，可经由尤其 是病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。
如根据本发明所用的术语“特异性相互作用”指结合域不或不显著地与 多肽交叉反应，所述多肽具有与被结合域结合的那些多肽类似的结构并且由 与目标多肽相同的细胞表达。可以测试处于调查中的一组结合域的交叉反 应，例如通过评估在常规条件下所述组结合域的结合(参见，例如，Harlow 和Lane(1988)与(1999)以及Little(2009)，上述引用文。结合域与特异性抗原 的特异性相互作用的实例包括配体对其受体的特异性。所述定义特别包括配 体的相互作用，在结合至其特异性受体时配体诱发信号。所述定义还特别包括的所述相互作用的实例，为抗原决定簇(表位)与抗体的结合域(抗原结 合位点)的相互作用。
如本文所用的术语“跨物种特异性”或“物种间特异性”指本文描述的结合 域与人类以及非黑猩猩灵长类动物中的相同靶标分子结合。因此，“跨物种 特异性”或“物种间特异性”被理解为对在不同物种中表达的相同分子“X”而 非对非“X”的分子的物种间反应性。例如，可通过FACS分析测定识别例如 人类CD3ε的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类动物CD3ε(例如猕猴CD3ε) 的跨物种特异性。所述FACS分析以下述方式进行：测试各个单克隆抗体与分别表达所述人类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε抗原的人类和非黑猩猩灵 长类动物细胞(例如，猕猴细胞)的结合。适当的分析将示于下面的实施例 中。上面所提及的主题物比照应用于PSMA抗原：例如，可通过FACS分析 测定识别例如人类PSMA的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类动物PSMA(例如 猕猴PSMA)的跨物种特异性。所述FACS分析以下述方式进行：测试各个 单克隆抗体与分别表达所述人类和非黑猩猩灵长类动物PSMA抗原的人类 和非黑猩猩灵长类动物细胞(例如，猕猴细胞)的结合。
如本文所用的，CD3ε代表作为T细胞受体的一部分表达的分子并且具 有如通常将其归属在现有技术中的含义。在人类，它包括个别的或独立地组 合形式的所有已知的CD3亚基，例如，CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、CD3 α和CD3β。如本文所指的非黑猩猩灵长类动物的非人类CD3抗原是例如马 来猴CD3以及恒河猕猴CD3。在马来猴中，它包括CD3εFN-18阴性和CD3 εFN-18阳性、CD3γ以及CD3δ。在恒河猕猴中，它包括CD3ε、CD3γ以 及CD3δ。优选地，如本文所用的所述CD3是CD3ε。
人类CD3ε显示于GenBank登录号NM_000733并且包含SEQ ID NO.1。 人类CD3γ显示于GenBank登录号NM_000073。人类CD3δ显示于GenBank 登录号NM_000732。
马来猴的CD3ε“FN-18阴性”(即，因为如上面所提到的多态性而不被 单克隆抗体FN-18识别的CD3ε)被显示在GenBank登录号AB073994。
马来猴的CD3ε“FN-18阳性”(即，被单克隆抗体FN-18识别的CD3ε) 显示于GenBank登录号AB073993。马来猴的CD3γ显示于GenBank登录号 AB073992。马来猴的CD3δ显示于GenBank登录号AB073991。
恒河猕猴的各个CD3ε、γ以及δ同源物的核酸序列以及氨基酸序列可 通过本领域描述的重组技术(Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,3rd edition 2001)进行鉴定和分 离。这比照适用于如本文定义的其他非黑猩猩灵长类动物的CD3ε、γ和δ 同源物。白鬓狨、松鼠猴以及绒顶柽柳猴的氨基酸序列的鉴定描述于所附的 实施例中。白鬓狨的CD3ε胞外域的氨基酸序列显示于SEQID NO:3，绒顶 柽柳猴的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:5，松鼠猴的氨基酸序列显示于SEQID NO:7。
人类PSMA显示于GenBank登录号'AY101595'。猕猴的PSMA同源物 的克隆描述于下列的实施例中，对应的cDNA和氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO.223以及SEQ ID NO.224。
与上面一致地，术语“表位”定义由如本文定义的结合域特异性地结合/ 鉴定的抗原决定簇。该结合域可特异性地结合至/相互作用于构象或连续的表 位，所述表位对于靶标结构是特有的，例如人类和非黑猩猩灵长类动物CD3 ε链或者人类和非黑猩猩灵长类动物PSMA。多肽抗原的构象或不连续表位 的特征在于：存在2个或更多个在一级序列中分开的离散的氨基酸残基，当 该多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，所述残基在该分子的表面上聚在一起 (Sela,(1969)Science 166,1365和Laver,(1990)Cell 61,553-6)。促成所述表位的2个或更多个离散的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的分离部分。 当所述多肽链折叠成3维结构以构成该表位时，这些残基在该分子的表面上 聚在一起。相比之下，连续或线性表位由2个或更多个离散的氨基酸残基组 成，该氨基酸残基存在于多肽链的单一线性区段。在本发明中，“环境依赖 的”CD3表位指所述表位的构象。此位于CD3的ε链的环境依赖表位，若它 被嵌在ε链的其余部分内并通过ε链与CD3γ或δ链的异二聚体化而被保持 在正确位置时，仅发展它的正确构象。相比之下，如本文提供的环境独立的 CD3表位指CD3ε的N-端1-27个氨基酸残基多肽或其功能性片段。在将此 N-端1-27个氨基酸残基多肽或其功能性片段从其在CD3复合物的天然环境 中取出时，维持其3维结构完整性和正确的构象。因此，该N-端1-27个氨 基酸残基多肽或其功能性片段(作为CD3ε胞外域的一部分)的环境独立性 提供了完全不同于在WO 2004/106380中结合用于制备人类结合分子的方法 描述的CD3ε的表位。所述方法采用单独表达的重组CD3ε。这个单独表达 的重组CD3ε的构象不同于在其天然形式下采取的构象，所述天然形式即 TCR/CD3复合物的CD3ε亚基作为TCR/CD3复合物的CD3δ或CD3-γ亚 基的非共价复合物一部分存在的形式。当此单独表达的重组CD3ε蛋白用作 用于选择来自抗体文库的抗体的抗原时，对该抗原特异性的抗体从该文库中 被识别出来，虽然此文库不含具有对自身抗原/自体抗原特异性的抗体。这是 由于以下事实：单独表达的重组CD3ε蛋白质不在体内存在；它不是自体抗 原。因此，表达对这个蛋白质特异性的抗体的B细胞亚群在体内没有被耗竭； 从该类B细胞构建的抗体文库将含有对单独表达的重组CD3ε蛋白特异性的 抗体的遗传材料。
然而，由于该环境独立的N-端1-27个氨基酸残基多肽或其功能性片段 是以其天然形式折叠的表位，与本发明一致的结合域不能通过基于在WO 2004/106380中描述的手段的方法进行鉴定。因此，可能会在测试中证实， 如公开于WO 2004/106380的结合分子不能结合至CD3ε链的N-端1-27个 氨基酸残基。因此，传统的抗-CD3结合分子或抗-CD3抗体分子(例如，如 公开于WO 99/54440中)相比于本文提供的环境独立的N-端1-27个氨基酸残 基多肽或功能性片段，在更靠近C-端的位置处结合CD3ε链。现有技术中 的抗体分子OKT3和UCHT-1也对TCR/CD3复合物的在氨基酸残基35至 85的ε-亚基具有特异性，并且这些抗体的表位也更靠近C-端。此外，UCHT-1 结合的CD3ε链位于氨基酸残基43至77的区域(Tunnacliffe,Int.Immunol.1 (1989),546-50；Kjer-Nielsen,PNAS 101,(2004),7675-7680；Salmeron,J. Immunol.147(1991),3047-52)。因此，现有技术的抗-CD3分子没有结合至 并且没有指向对抗本文定义的环境独立的N-端1-27个氨基酸残基表位(或 其功能性片段)。特别地，本领域的技术状态无法提供特异性结合至环境独 立的N-端1-27个氨基酸残基表位并且是跨物种特异性(即，结合至人类和 非黑猩猩灵长类动物CD3ε)的抗-CD3分子。
为了产生包含于本发明的双特异性单链抗体分子的结合域(优选人类的 结合域)，可使用例如结合至人类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε(例如猕猴 CD3ε)的单克隆抗体或者结合至人类和非黑猩猩灵长类动物PSMA的单克 隆抗体。
如本文所用的，“人类(human)”以及“人”(man)指物种智人。就本文 描述的构建体的医学用途而言，人类患者用相同的分子进行治疗。
优选地，所述本发明的双特异性单链抗体的第一或第二结合域的至少一 者是CDR-移植的、人源化的或人类的。优选地，所述本发明的双特异性单 链抗体的第一以及第二结合域是CDR-移植的、人源化的或人类的。
如本文所用的，术语“人类”抗体被理解意为：如本文定义的双特异性单 链抗体包括人类生殖细胞系抗体谱所含有的氨基酸序列。出于本文定义的目 的，如果双特异性单链抗体由此类人类生殖细胞系氨基酸序列组成的话，即， 若要考虑的双特异性单链抗体的氨基酸序列与表达的人类生殖细胞系氨基 酸序列相同的话，所述双特异性单链抗体可因此被视为人类的。如果如本文 定义的双特异性单链抗体由偏离它的(它们的)最亲近的人类生殖细胞系序 列的序列不超过预期(由体细胞超突变的印记导致的)的序列组成，所述双特异性单链抗体也可被视为人类的。此外，许多非人类哺乳动物(例如啮齿 类动物，如小鼠和大鼠)的抗体包含其中一个可预期也存在于表达的人类抗 体谱的VH CDR3氨基酸序列。出于本发明的目的，可预期存在于表达的人 类谱的人类或非人类来源的任何此类序列也被视为“人类的”。
如本文所用的，术语“人源化的”、“人源化”、“类人的”或其语法上相关 的变体可在涉及双特异性单链抗体时被互换使用，该双特异性单链抗体包 含：在其至少一个结合域中的至少一个互补决定区(“CDR”)，所述CDR来 自非人类抗体或其片段。人源化手段描述于例如WO 91/09968和US 6,407,213中。作为非限制性实例，该术语包括以下情况：其中至少一个结合 域的可变区包括来自另一非人类动物(如啮齿类动物)的单CDR区域，例 如VH的第三CDR区域(CDRH3)；以及以下情况：其中可变区之一或二者 在其相应的第一、第二和第三CDR中的每一个处都包含来自所述非人类动 物的CDR。在该双特异性单链抗体的结合域的所有CDR已由来自例如啮齿 类动物的相应等价物替换时，典型地叫法为“CDR-移植”，并且这个术语被理 解为由如本文所用的术语“人源化的”或其语法上相关的变体包括。术语“人 源化的”或其语法上相关的变体还包含以下情况：其中除了在该第一和/或第 二结合域的VH和/或VL内替换一个或多个CDR区域之外，还在CDR之间 的框架(“FR”)区域内已产生至少一个单一氨基酸残基的进一步突变(例如 替换)，使得在那个/那些位置处的氨基酸对应于在动物(用于替换的CDR 区域源自所述动物)的那个/那些位置处的氨基酸。如本领域已知的，为了恢 复用作其靶标分子的CDR-供体的非人类抗体的初始结合亲合力，经常在CDR-移植后在框架区域内进行此类个别突变。除了上述的框架区域中的氨 基酸替换外，术语“人源化的”可进一步包括将来自非人类动物的CDR区域 的氨基酸替换成来自人类抗体的对应的CDR区域的氨基酸的氨基酸替换。
如本文所用的，术语“同源物”或“同源”应被理解为如下：在蛋白质和 DNA之间的同源性经常根据序列相似性而被断定，特别是在生物信息学中。 例如，一般而言，若2个或更多个基因具有高度相似的DNA序列，则它们 很可能是同源的。但是序列相似性可从不同的祖先产生：短序列的相似可能 是偶然的，而且序列相似可能是因为这两者均被选择结合至特定蛋白质，例 如转录因子。这样的序列是相似的，但没有同源性。同源的序列区域也被称 为保守的。这不与氨基酸序列的保守相混淆，在后者情况下，特定位置处的 氨基酸已改变但氨基酸的物理化学性质保持不变。同源的序列有2种类型： 直系同源和旁系同源。如果同源的序列因为物种形成事件而被分开，则它们 是直系同源的：当物种分化成2个分开的物种时，在所形成的物种中的单一 基因的分化副本被称为是直系同源的。直系同源物或直系同源基因是彼此相 似的不同物种中的基因，因为它们源自相同的祖先。2个相似的基因是直系 同源的最有力的证据是基因谱系的系统发育分析的结果。在一个进化枝内发 现的基因是直系同源物，来自相同的祖先。直系同源物经常、但非总是具有 相同的功能。直系同源序列给生物体的分类学分类研究提供有用的信息。遗 传分化的图谱可用于追踪生物体的关系。关系非常接近的2个生物体在2个 直系同源物之间可能显示非常相似的DNA序列。相比之下，在进化上从另 一个生物体进一步进化的生物体可能在研究的直系同源物的序列上显示出 较大分化。如果同源的序列因为基因复制事件而被分开，则它们是旁系同源的：若生物体的基因被复制到占据相同基因组的2个不同的位置，那么这2 个拷贝是旁系同源的。旁系同源的一组序列称为互相为旁系同源物。旁系同 源物通常具有相同或相似的功能，但有时候则不是这样：由于在重复基因的 一个拷贝上缺乏初始的筛选压力，因此这个拷贝自由突变并且获得新功能。 实例可见于啮齿类动物(如大鼠和小鼠)。啮齿类动物具有一对旁系同源的 胰岛素基因，虽然不清楚是否已发生功能上的任何分化。旁系同源基因常常 属于相同物种，但这不是必需的：例如，人类的血红蛋白基因与黑猩猩的肌 红蛋白基因是旁系同源物。这在生物信息学上是一个常见的问题：当已测序 不同物种的基因组并且已发现同源基因时，不能立即推断这些基因具有相同 或相似的功能，因为它们可能是功能已分化的旁系同源物。
如本文所用的，“非黑猩猩灵长类动物(non-chimpanzee primate或 non-chimpprimate)”或其语法上的变体是指不是黑猩猩的任何灵长类动物 (即，非人类)(即，不是属于黑猩猩属的动物)，并且包括侏儒黑猩猩(Pan paniscus)以及黑猩猩(Pan troglodytes)(也被称为Anthropopithecus troglodytes 或猩猩(Simia satyrus)物种。然而，将被理解的是：本发明的抗体还可以 以它们的第一和/或第二结合域结合至所述黑猩猩的相应表位/片段等。如果 需要，本发明仅避免用黑猩猩实施的动物试验。因此在另一个实施方案中， 还设想的是：本发明的抗体还可以以其第一和/或第二结合域结合至黑猩猩的 相应表位。“灵长类动物(primate或primates”、“灵长类动物物种(primate species)”或其语法上的变体代表被分成原猴类和类人猿类的2个亚目的真 哺乳亚纲哺乳动物的一目，并且包括猿、猴以及狐猴。特别地，如本文使用 的“灵长类动物”包括原猴亚目(非眼镜猴原猴)，包括下目Lemuriformes(它 本身包括超科鼠狐猴以及狐猴)、下目Chiromyiformes(它本身包括猴科)以 及下目Lorisiformes(它本身包括懒猴和婴猴科)。如本文使用的“灵长类动 物”还包括简鼻亚目，包括下目Tarsiiformes(它本身包括眼镜猴科)、下目 Simiiformes(它本身包括广鼻类或新世界猴以及狭鼻类，狭鼻类包括猴科或 旧世界猴)。
在本发明的含义内，非黑猩猩灵长类动物物种可被理解为是狐猴、眼镜 猴、长臂猴、一绒猿(属于卷尾猴科的新世界猴)或旧世界猴(属于猴超科)。
如本文所用的，“旧世界猴”包括任何落在猴超科内的猴子，猴超科本身 被细分成：猴亚科，主要是非洲属但包括亚洲和北非的猕猴的分化属；和疣 猴亚科，它包括大部分的亚洲属和非洲疣猴。
特别地，在猴亚科内，有益的非黑猩猩灵长类动物可来自Tribe Cercopithecini，在短肢猴属(genus Allenopithecus)(菲氏叶猴(Allen's Swamp Monkey)，短肢猴(Allenopithecus nigroviridis))内；在侏长尾猴属(genus Miopithecus)(侏长尾猴(Angolan Talapoin)，侏长尾猴(Miopithecus talapoin)； 加蓬侏长尾猴(GabonTalapoin)，加蓬侏长尾猴(Miopithecus ogouensis)) 内；在赤猴属(genusErythrocebus)(赤猴(Patas Monkey)，赤猴(Erythrocebus patas))内；在绿猴属(genusChlorocebus)(绿猴(Green Monkey)，绿猴 (Chlorocebus sabaceus)；素领猴(Grivet)，绿猴(Chlorocebus aethiops)； 贝尔山绿猴(Bale Mountains Vervet)，贝尔山绿猴(Chlorocebus djamdjamensis)；坦塔梦斯绿猴(Tantalus Monkey)，坦塔梦斯绿猴(Chlorocebus tantalus)；黑长尾猴(Vervet Monkey)，黑长尾猴(Chlorocebuspygerythrus)；布鲁克绿猴(Malbrouck)，布鲁克绿猴(Chlorocebus cynosures)] 内；或者在长尾猴属(genus Cercopithecus)(德赖斯长尾猴(Dryas Monkey) 或Salongo Monkey，德赖斯长尾猴(Cercopithecus dryas)；黛安娜长尾(Diana Monkey)，黛安娜长尾(Cercopithecus diana)；加纳长尾猴(Roloway Monkey)， 罗洛威须长尾猴(Cercopithecus roloway)；大白鼻猴(Greater Spot-nosed Monkey)，大白鼻长尾猴(Cercopithecus nictitans)；蓝猴(Blue Monkey)， 青长尾猴(Cercopithecus mitis)；银长尾猴(Silver Monkey)，银长尾猴 (Cercopithecus doggetti)；金长尾猴(GoldenMonkey)，金长尾猴 (Cercopithecus kandti)；赛克斯猴(Sykes's Monkey)，白喉长尾猴(Cercopithecus albogularis)；摩那猴(Mona Monkey)，白额长尾猴(Cercopithecusmona)；坎氏摩那猴(Campbell's Mona Monkey)，坎氏长尾 猴(Cercopithecuscampbelli)；洛氏摩那猴(Lowe's Mona Monkey)，洛氏长 尾猴(Cercopithecus lowei)；冠毛长尾猴(Crested Mona Monkey)，冠毛长 尾猴(Cercopithecus pogonias)；狼莫纳猴(Wolf's Mona Monkey)，邬氏长 尾猴(Cercopithecus wolfi)；丹氏长尾猴(Dent's MonaMonkey)，丹氏长尾 猴(Cercopithecus denti)；小白鼻长尾猴(Lesser Spot-nosedMonkey)，小 白鼻长尾猴(Cercopithecus petaurista)；白领青长尾猴(White-throatedGuenon)，赤腹长尾猴(Cercopithecus erythrogaster)，斯氏长尾猴(Sclater's Guenon)，斯氏长尾猴(Cercopithecus sclateri)；红耳长尾猴(Red-eared Guenon)，红耳长尾猴(Cercopithecus erythrotis)；髭长尾猴(Moustached Guenon)，髭长尾猴(Cercopithecuscephus)；红尾长尾猴(Red-tailed Monkey)， 红尾长尾猴(Cercopithecus ascanius)；尔氏长尾猴(L'Hoest's Monkey)，尔 氏长尾猴(Cercopithecus lhoesti)；高山长尾猴(Preuss's Monkey)，高山长 尾猴(Cercopithecus preussi)；阳光长尾猴(Sun-tailedMonkey)，阳光长尾 猴(Cercopithecus solatus)；哈姆林氏猴(Hamlyn's Monkey)或枭面猴 (Owl-faced Monkey)，枭面长尾猴(Cercopithecus hamlyni)；德氏长尾猴(De Brazza's Monkey)，白臀长尾猴(Cercopithecus neglectus))内。
或者，有益的非黑猩猩灵长类动物(也在猴亚科以及在Tribe Papionini 内)可来自在猕猴属(genus Macaca)(巴巴利猕猴(Barbary Macaque)，巴 巴利猕猴(Macacasylvanus)；狮尾猴(Lion-tailed Macaque)，狮尾猴(Macaca silenus)；南方豚尾猕猴(Southern Pig-tailed Macaque)或豚尾猕猴(Beruk)， 豚尾猕猴(Macaca nemestrina)；北方豚尾猴(Northern Pig-tailed Macaque)， 北方豚尾猕猴(Macaca leonina)；明打威猕猴(Pagai Island Macaque)或明 打威猕猴(Bokkoi)，明打威猕猴(Macaca pagensis)；西比路岛猕猴(Siberut Macaque)，西比路岛猕猴(Macaca siberu)；摩尔猕猴(MoorMacaque)，摩 尔猕猴(Macaca maura)；穿靴猕猴(Booted Macaque)，穿靴猕猴(Macacaochreata)；通金猕猴(Tonkean Macaque)，通金猕猴(Macaca tonkeana)； 黑克猕猴(Heck's Macaque)，黑克猕猴(Macaca hecki)；浅黑猕猴(Gorontalo Macaque)，浅黑猕猴(Macacanigriscens)；黑冠猕猴(Celebes Crested Macaque)或黑"猴"(Black"Ape")，黑冠猕猴(Macaca nigra)；石蟹猕猴或 食蟹猴(Crab-eating Macaque)或长尾猴(Long-tailedMacaque)或猴(Kera)， 马来猴(Macaca fascicularis)；短尾猴(Stump-tailed Macaque)或短尾猴(Bear Macaque)，短尾猴(Macaca arctoides)；恒河猕猴(Rhesus Macaque)，猕猴(Macaque)；台湾猕猴(Formosan Rock Macaque)，台湾猕猴(Macaca cyclopis)；日本猕猴(Japanese Macaque)，日本猕猴(Macaca fuscata)；斯 里兰卡猴(Toque Macaque)，斯里兰卡猴(Macaca sinica)；绮帽猕猴(Bonnet Macaque)，冠毛猕猴(Macaca radiata)；巴巴利猕猴(Barbary Macaque)， 巴巴利猕猴(Macaca sylvanmus)；熊猴(Assam Macaque)，熊猴(Macaca assamensis)；藏猕猴(Tibetan Macaque)或藏猕猴(Milne-Edwards'Macaque)，藏猕猴(Macaca thibetana)；阿鲁纳卡猕猴(Arunachal Macaque)或阿鲁纳 卡猕猴(Munzala)，阿鲁纳卡猕猴(Macaca munzala))内；在白脸猴属(genus Lophocebus)(白颊白眉猴(Gray-cheeked Mangabey)，白颊白眉猴(Lophocebus albigena)；Lophocebusalbigena albigena；Lophocebus albigena osmani； Lophocebus albigena johnstoni；黑毛白眉猴(Black Crested Mangabey)，黑毛 白眉猴(Lophocebus aterrimus)；Opdenbosch's Mangabey，Lophocebus opdenboschi；高地白睑猴(Highland Mangabey)，高地白睑猴(Lophocebus kipunji))内；在狒狒属(genus Papio)(阿拉伯狒狒(HamadryasBaboon)， 阿拉伯狒狒(Papio hamadryas)；几内亚狒狒(Guinea Baboon)，几内亚狒 狒(Papio papio)；绿狒狒(Olive Baboon)，猎神狒狒(Papio Anubis)；黄 狒狒(YellowBaboon)，草原狒狒(Papio cynocephalus)；南非大狒(Chacma Baboon)，豚尾狒狒(Papioursinus))内；在狮尾狒属(genus Theropithecus) (狮尾狒(Gelada)，狮尾狒(Theropithecus gelada))内；在白眉猴属(genus Cercocebus)(乌黑白眉猴(SootyMangabey)，白顶白眉猴(Cercocebus atys)； Cercocebus atys atys；Cercocebus atyslunulatus；白领白眼睑猴(Collared Mangabey)，白领白眼睑猴(Cercocebus torquatus)；敏白眉猴(Agile Mangabey)，敏白眉猴(Cercocebus agilis)；金腹白眉猴(Golden-bellied Mangabey)，金腹白眉猴(Cercocebus chrysogaster)，塔纳河白眉猴(Tana RiverMangabey)，冠毛白眉猴(Cercocebus galeritus)；狲氏白睑猴(Sanje Mangabey)，狲氏白睑猴(Cercocebus sanjei))内；或者在山魈属(genus Mandrillus)(山魈(Mandrill)，山魈(Mandrillus sphinx)；鬼狒(Drill)，鬼 狒(Mandrillus leucophaeus))内。
最优选的是马来猴(也被称为石蟹猕猴，因此，在实施例中被命名为“石 蟹猴”)以及恒河猕猴(恒河猴，被命名为“罗猴”)。
在疣猴亚科内，有益的非黑猩猩灵长类动物可来自于非洲族群，在疣猴 属(genusColobus)(黑疣猴(Black Colobus)，黑疣猴(Colobus satanas)； 安哥拉疣猴(AngolaColobus)，安哥拉疣猴(Colobus angolensis)；黑白疣 猴(King Colobus)，黑白疣猴(Colobus polykomos)；花斑疣猴(Ursine Colobus)，花斑疣猴(Colobus vellerosus)；东黑白疣猴(Mantled Guereza)， 东黑白疣猴(Colobus guereza))内；在红疣猴属(genusPiliocolobus)(西 方红疣猴(Western Red Colobus)，西方红疣猴(Piliocolobusbadius)； Piliocolobus badius badius；Piliocolobus badius temminckii；红色残余部分猿 (Piliocolobus badius waldronae)；东方红疣(Pennant's Colobus)，东方红疣(Piliocolobus pennantii)；Piliocolobus pennantii pennantii；尼日尔三角洲红 色疣猴(Piliocolobus pennantii epieni)；Piliocolobus pennantii bouvieri；普氏 红疣猴(Preuss's Red Colobus)，普氏红疣猴(Piliocolobus preussi)；Thollon's RedColobus，Piliocolobus tholloni；中非红疣猴(Central African Red Colobus)， 中非红疣猴(Piliocolobus foai)；Piliocolobus foai foai；Piliocolobus foai ellioti；Piliocolobus foai oustaleti；Piliocolobus foai semlikiensis；Piliocolobus foaiparmentierorum；乌干达红疣猴(Ugandan Red Colobus)，乌干达红疣猴 (Piliocolobustephrosceles)；Uzyngwa Red Colobus，Piliocolobus gordonorum； 桑给巴尔红疣猴(Zanzibar Red Colobus)，桑给巴尔红疣猴(Piliocolobus kirkii)；塔那河红疣猴(TanaRiver Red Colobus)，塔那河红疣猴(Piliocolobus rufomitratus))内；或在绿疣猴属(genus Procolobus)(绿疣猴(Olive Colobus)， 绿疣猴(Procolobus verus))内。
在疣猴亚科内，有益的非黑猩猩灵长类动物可或者来自叶猴(Langur) (叶猴(leaf monkey))族群，在长尾叶猴属(genus Semnopithecus)内(尼 泊尔长尾叶猴(NepalGray Langur)，喜山长尾叶猴(Semnopithecus schistaceus)；喀什米尔长尾叶猴(KashmirGray Langur)，喀什米尔长尾叶 猴(Semnopithecus ajax)；达顿灰叶猴(Tarai GrayLangur)，达顿灰叶猴 (Semnopithecus hector)，哈努曼叶猴(Northern Plains GrayLangur)，哈努 曼叶猴(Semnopithecus entellus)；黑足长尾叶猴(Black-footed GrayLangur)， 黑足长尾叶猴(Semnopithecus hypoleucos)；南平原灰叶猴(Southern PlainsGray Langur)，南平原灰叶猴(Semnopithecus dussumieri)；(Tufted Gray Langur)，毛冠灰叶猴(Semnopithecus priam))内；在紫脸叶猴(T.vetulus) 族群或乌叶猴属(genusTrachypithecus)(紫脸叶猴(Purple-faced Langur)， 紫脸叶猴(Trachypithecusvetulus)；尼尔吉里猴(Nilgiri Langur)，黑乌叶猴 (Trachypithecus johnii))内；在乌叶猴属(genus Trachypithecus)的银色乌 叶猴(T.cristatus)族群(爪哇叶猴(JavanLutung)，乌叶猴(Trachypithecus auratus)；银叶猴(Silvery Leaf Monkey)或银叶猴(Silvery Lutung)，银色 乌叶猴(Trachypithecus cristatus)；Indochinese Lutung，Trachypithecus germaini；丹那沙林乌叶猴(Tenasserim Lutung)，丹那沙林乌叶猴(Trachypithecus barbei))内；在乌叶猴属的郁乌叶猴(T.obscures)族群(眼 镜食叶猴(Dusky Leaf Monkey)或眼镜食叶猴(Spectacled Leaf Monkey)， 郁乌叶猴(Trachypithecus obscurus)；菲氏叶猴(Phayre's Leaf Monkey)，菲 氏叶猴(Trachypithecus phayrei))内；在乌叶猴属的戴帽叶猴(T.pileatus) 族群(戴帽叶猴(Capped Langur)，戴帽叶猴(Trachypithecus pileatus)；邵 力殊叶猴(Shortridge'sLangur)，邵力殊叶猴(Trachypithecus shortridgei)； 金叶猴(Gee's Golden Langur)，金叶猴(Trachypithecus geei))内；在乌叶 猴属的黑叶猴(T.francoisi)族群(黑叶猴(Francois'Langur)，黑叶猴 (Trachypithecus francoisi)；海亭叶猴(Hatinh Langur)，海亭叶猴 (Trachypithecus hatinhensis)；白头叶猴(White-headed Langur)，白头叶猴(Trachypithecus poliocephalus)；老挝叶猴(Laotian Langur)，老挝叶猴(Trachypithecus laotum)；德氏黑叶猴(Delacour's Langur)，德氏黑叶猴(Trachypithecus delacouri)；印支黑乌叶猴(Indochinese Black Langur)，印 支黑乌叶猴(Trachypithecus ebenus))内；或者在莱猴属(genus Presbytis) (苏门答腊叶猴(Sumatran Surili)，黑脊叶猴(Presbytis melalophos)；印尼 叶猴(Banded Surili)，印尼叶猴(Presbytis femoralis)；沙劳越叶猴(Sarawak Surili)，沙劳越叶猴(Presbytischrysomelas)；白腿叶猴(White-thighed Surili)， 白腿叶猴(Presbytis siamensis)；白额叶猴(White-fronted Surili)，白额叶猴 (Presbytis frontata)；爪哇叶猴(JavanSurili)，爪哇叶猴(Presbytis comata)； 托马斯叶猴(Thomas's Langur)，托马斯叶猴(Presbytis thomasi)；何氏叶猴 (Hose's Langur)，何氏叶猴(Presbytis hosei)；红叶猴(Maroon Leaf Monkey)， 红叶猴(Presbytis rubicunda)；孟他维岛长尾叶猴(MentawaiLangur)或白 颊叶猴(Joja)，白颊叶猴(Presbytis potenziani)；纳土纳岛叶猴(NatunaIsland Surili)，纳土纳岛叶猴(Presbytis natunae))内。
在疣猴亚科内，有益的非黑猩猩灵长类动物可或者来自仰鼻族群 (Odd-Nosedgroup)，在白臀叶猴属(genus Pygathrix)(白臀叶猴(Red-shanked Douc)，白臀叶猴(Pygathrix nemaeus)；黑腿白臀叶猴 (Black-shanked Douc)，黑腿白臀叶猴(Pygathrixnigripes)；灰腿白臀叶猴 (Gray-shanked Douc)，灰腿白臀叶猴(Pygathrix cinerea))内；在仰鼻猴属 (genus Rhinopithecus)(川金丝猴(Golden Snub-nosed Monkey)，川金丝猴 (Rhinopithecus roxellana)；滇金丝猴(Black Snub-nosed Monkey)，滇金丝 猴(Rhinopithecus bieti)；黔金丝猴(Gray Snub-nosed Monkey)，黔金丝猴(Rhinopithecus brelichi)；越南金丝猴(Tonkin Snub-nosed Langur)，越南金 丝猴(Rhinopithecus avunculus))内；在长鼻猴属(genus Nasalis)(象鼻猴 (ProboscisMonkey)，长鼻猴(Nasalis larvatus))内；或者在豚尾叶猴属 (genus Simias)(豚尾叶猴(Pig-tailed Langur)，豚尾叶猴(Simias concolor)) 内。
如此处所用的，术语“狨猴(marmoset)”代表任何狨属(genus Callithrix) 的新世界猴，例如属于狨亚属(subgenus Callithrix)(原文如此！)(普通狨 (CommonMarmoset)，普通狨(Callithrix(Callithrix)jacchus)；黑耳狨 猴(Black-tuftedMarmoset)，丛尾狨(Callithrix(Callithrix)penicillata)； 维氏狨(Wied's Marmoset)，维氏狨(Callithrix(Callithrix)kuhlii)；白头 狨(White-headed Marmoset)，白头狨(Callithrix(Callithrix)geoffroyi)； 黄冠狨(Buffy-headed Marmoset)，黄冠狨(Callithrix(Callithrix)flaviceps)， 白耳狨(Buffy-tufted Marmoset)，白耳狨(Callithrix(Callithrix)aurita)) 的大西洋狨猴(Atlantic marmosets)；属于Mico亚属(里约狨猴(Rio Acari Marmoset)，里约狨猴(Callithrix(Mico)acariensis)；ManicoreMarmoset， Callithrix(Mico)manicorensis；银毛猴(Silvery Marmoset)，银毛猴(Callithrix(Mico)argentata)；白狨(White Marmoset)，白狨(Callithrix (Mico)leucippe)；艾氏狨(Emilia's Marmoset)，艾氏狨(Callithrix(Mico) emiliae)；黑头狨(Black-headed Marmoset)，黑头狨(Callithrix(Mico) nigriceps)；马氏狨(Marca'sMarmoset)，马氏狨(Callithrix(Mico)marcai)； 黑尾狨(Black-tailed Marmoset)，黑尾狨(Callithrix(Mico)melanura)； 白肩狨(Santarem Marmoset)，白肩狨(Callithrix(Mico)humeralifera)； Maués Marmoset，Callithrix(Mico)mauesi；黄肢狨(Gold-and-white Marmoset)，黄肢狨(Callithrix(Mico)chrysoleuca)；贺氏狨(Hershkovitz'sMarmoset)，贺氏狨(Callithrix(Mico)intermedia)；SatéréMarmoset, Callithrix(Mico)saterei)的亚马逊河狨猴(Amazonian marmosets)；属 于卢氏亚属(subgenusCallibella)(卢氏倭狨(Callithrix(Callibella))humilis)) 的Roosmalens'DwarfMarmoset；或者属于倭狨亚属(subgenus Cebuella)(倭 狨(Callithrix(Cebuella)pygmaea)的侏儒狨猴(Pygmy Marmoset)。
新世界猴的其它属包括獠狨属(包括绒顶柽柳猴-族群、绢毛猴族群、 黑须柽柳猴族群、长须柽柳猴族群、斑绢猴族群以及烙印柽柳猴族群)的獠 狨(tamarins)以及Samiri属(即，松鼠猴、红背松鼠猴、马河松鼠、亚马 逊松鼠猴、黑松鼠猴)的松鼠猴。
在本发明的双特异性单链抗体分子的一个优选实施方案中，该非黑猩猩 灵长类动物是旧世界猴。在该多肽的一个更优选实施方案中，该旧世界猴是 狒狒属猕猴属的猴子。最优选地，猕猴属的猴子是熊猴(Assamese macaque) (熊猴(Macaca assamensis))、巴巴利猕猴(Barbary macaque)(巴巴利猕 猴(Macaca sylvanus))、绮帽猕猴(BonnetMacaque)(冠毛猕猴(Macaca radiata))、穿靴(Booted)或苏拉威西穿靴猕猴(Sulawesi-Booted macaque) (穿靴猕猴(Macaca ochreata))、苏拉威西冠猴(Sulawesi crestedmacaque) (黑冠猕猴(Macaca nigra))、台湾猕猴(Formosan rock macaque)(台湾猕 猴(Macaca cyclopis))、日本雪猕猴(Japanese snow Macaque)或日本猕猴 (Japanesemacaque)(日本猕猴(Macaca fuscata))、食蟹猴(Cynomologus monkey)或食蟹猴(crab-eating macaque)或长尾猴(Long-tailed macaque) 或爪哇猕猴(Java macaque)(马来猴(Macaca fascicularis))、狮尾猴 (Lion-tailed Macaque)(狮尾猴(Macaca silenus))、豚尾猕猴(Pigtailed macaque)(豚尾猕猴(Macaca nemestrina))、恒河猕猴(RhesusMacaque) (恒河猕猴(Macaca mulatta))、藏猕猴(Tibetan macaque)(藏猕猴(Macacathibetana))、通金猕猴(Tonkean Macaque)(通金猕猴(Macaca tonkeana))、 斯里兰卡猴(Toque macaque)(斯里兰卡猴(Macaca sinica))、短尾猴 (Stump-tailed macaque)或胭脂猴(Red-faced macaque)或短尾猴(Bear macaque)(短尾猴(Macaca arctoides))或者摩尔猕猴(Moor macaque)(摩 尔猕猴(Macaca maurus))。最优选地，狒狒属的猴子是阿拉伯狒狒 (Hamadryas Baboon)，阿拉伯狒狒(Papio hamadryas)；几内亚狒狒(GuineaBaboon)，几内亚狒狒(Papio papio)；绿狒狒(Olive Baboon)，猎神狒狒(Papio Anubis)；黄狒狒(Yellow Baboon)，草原狒狒(Papio cynocephalus)；南非 大狒(Chacma Baboon)，豚尾狒狒(Papio ursinus)。
在本发明的双特异性单链抗体分子的一个可选择的优选的实施方案中， 该非黑猩猩灵长类动物是新世界猴。在该多肽的一个更优选地实施例中，该 新世界猴是狨属(狨猿)、獠狨属或Samiri属的猴子。最优选地，狨属的猴 子是白鬓狨，獠狨属的猴子是绒顶柽柳猴以及Samiri属的猴子是松鼠猴。
如本文所用的，术语“细胞表面抗原”是指展示在细胞表面上的分子。在 大多数情况下，这个分子将位于细胞的原生质膜中或其上，使得这个分子的 至少一部分以三级结构的形式保持从细胞外可接触。位于原生质膜中的细胞 表面分子的非限制性的实例是其三级构象包括亲水性和疏水性区域的跨膜 蛋白。这里，至少一个疏水性区域容许该细胞表面分子嵌入或者插入细胞的 疏水性原生质膜中，而亲水性区域在原生质膜的任一侧分别延伸至细胞质和 细胞外隙中。位于原生质膜上的细胞表面分子的非限制性实例是以下蛋白：所述蛋白在半胱氨酸残基处被修饰以带有棕榈酰基、在C-端半胱氨酸残基处 被修饰以带有法尼基或者在C-端被修饰以带有糖基磷脂酰肌醇(“GPI”)锚。 这些基团容许蛋白质共价连接至原生质膜的外表面，在此处它们保持可以被 外细胞分子(例如抗体)识别。细胞表面抗原的实例是CD3ε和PSMA。如 上述的，PSMA是细胞表面抗原，是用于治疗癌症(包括但不限于实体瘤， 优选癌和前列腺癌)的靶标。
鉴于此，PSMA也可被表征为肿瘤抗原。如本文所用的，术语“肿瘤抗 原”可理解为那些存在于肿瘤细胞上的抗原。这些抗原以胞外部分呈现在细 胞表面上，所述胞外部分常与所述分子的跨膜和胞质部分相组合。这些抗原 有时候仅由肿瘤细胞呈现，而从未由正常细胞呈现。肿瘤抗原可专门表达在 肿瘤细胞上，或者相比于正常细胞，肿瘤抗原可呈现肿瘤特异性突变。在这 种情况下，它们被称为肿瘤-特异性抗原。更常见的是由肿瘤细胞以及正常 细胞呈现的抗原，它们被称为肿瘤相关抗原。相比于正常细胞，这些肿瘤相 关抗原可被过度表达，或者由于肿瘤组织与正常组织相比结构较不紧密，这 些肿瘤相关抗原在肿瘤细胞中可以进行抗体结合。一个符合本发明的肿瘤抗 原的实例是PSMA。
如上面描述的，本发明的双特异性单链抗体分子以所述第一结合域结合 至人类以及非黑猩猩灵长类动物CD3ε(epsilin)链的表位，其中，该表位是 包含在如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8中 所示的27个氨基酸残基或者其功能性片段中的氨基酸序列的一部分。
按照本发明，对于本发明的双特异性单链抗体分子优选的是：所述表位 是包含26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10、9、8、7、6或5个氨基酸的氨基酸序列的一部分。
更优选地，其中，所述表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (QDGNE)。
在本发明中，该N-端1-27个氨基酸残基的功能性片段是指，当从其在 CD3复合物的天然环境中取出(并且被融合至异源氨基酸序列，例如EpCAM 或免疫球蛋白Fc部分，如在WO 2008/119567的实施例3.1中公开的)时，所 述功能性片段仍然是维持其3维结构完整性的环境独立的表位。在CD3ε的 27个氨基酸N-端多肽或其功能性片段内的3维结构的维持可被用于产生结 合域，所述结合域以相同结合亲和力在体外结合至N-端CD3ε多肽片段， 在体内结合至T细胞上的天然CD3复合物(的CD3ε亚基)。在本发明中， 该N-端1-27个氨基酸残基的功能性片段是指本文提供的CD3结合域仍然可 以以环境独立的方式结合至此类功能性片段。本领域技术人员知道用于表位 定位的方法，从而确定表位的哪些氨基酸残基可被此类抗-CD3的结合域识 别(例如，丙氨酸扫描；参见WO 2008/119567的实施例)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的双特异性单链抗体分子包括能够 结合至人类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的(第一)结合域和能够 结合至细胞表面抗原PSMA的第二结合域。
在本发明中，进一步优选地：所述第二结合域结合至人类细胞表面抗原 PSMA和/或非黑猩猩灵长类动物PSMA。特别优选地，所述第二结合域结合 至人类PSMA以及非黑猩猩灵长类动物PSMA，优选猕猴PSMA。要理解的 是：所述第二结合域结合至至少一种非黑猩猩灵长类动物PSMA，然而，它 也可结合至2、3或更多种非黑猩猩灵长类动物PSMA同源物。例如，所述 第二结合域可结合至石蟹猕猴PSMA和恒河猴PSMA。
包括本文描述的所有方法、用途、试剂盒等的本发明也与所述第二结合 域本身(即，非上下文中的双特异性单链抗体)相关。“本身”进一步包括非 本文描述的双特异性单链抗体的抗体形式，例如抗体片段(包含该第二结构 域)、人源化抗体、包含该第二结构域的融合蛋白等。本发明的双特异性单 链抗体以外的抗体形式也如上所述。
为了产生本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域(例如，如本文 定义的双特异性单链抗体)，还可以利用结合至相应的人类和/或非黑猩猩灵 长类动物的细胞表面抗原(如PSMA)的单克隆抗体。针对如本文定义的双 特异性多肽的适当的结合域例如可通过本领域描述的重组方法来自跨物种 特异性的单克隆抗体。结合至人类细胞表面抗原以及黑猩猩灵长类动物的所 述细胞表面抗原的同源物的单克隆抗体，可以通过如上所述的FACS分析进 行测定。对于本领域技术人员显而易见的是：跨物种特异性抗体也可由文献(Milstein和Nature 256(1975),495-7)中描述的杂交瘤技术产生。例 如，小鼠可选择地用人类和非黑猩猩灵长类动物细胞表面抗原(诸如PSMA) 进行免疫。从这些小鼠中，经由杂交瘤技术分离生产跨物种特异性抗体的杂 交瘤细胞，然后通过如上所述的FACS进行分析。双特异性多肽(如本文描 述的显示具有跨物种特异性的双特异性单链抗体)的产生和分析示于下面的 实施例。显示具有跨物种特异性的双特异性单链抗体的优点包括在此所列举 的观点。
对于本发明的双特异性单链抗体分子特别优选的是：能够结合至人类和 非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含VL区域，所述VL 区域含有选自下列的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO.27中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO.28中所示的 CDR-L2以及如SEQ ID NO.29中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO.117中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO.118中所示的 CDR-L2以及如SEQ ID NO.119中所示的CDR-L3；以及
(c)如SEQ ID NO.153中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO.154中所示的 CDR-L2以及如SEQ ID NO.155中所示的CDR-L3。
可变区域，即可变轻链(“L”或“VL”)以及可变重链(“H”或“VH”)在 本领域中理解为提供抗体的结合域。这个可变区域含有互补决定区。
术语“互补决定区”(CDR)是本领域熟知的，用于指示抗体的抗原特异性。 术语“CDR-L”或“L CDR”或“LCDR”是指在VL中的CDR，而术语“CDR-H” 或“H CDR”或HCDR”是指在VH中的CDR。
在本发明的双特异性单链抗体分子的一个可选择的优选实施方案中，该 能够结合至人类以及非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含 VH区域，所述VH区域含有选自下列的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3：
(a)如SEQ ID NO.12中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.13中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.14中所示的CDR-H3；
(b)如SEQ ID NO.30中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.31中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.32中所示的CDR-H3；
(c)如SEQ ID NO.48中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.49中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.50中所示的CDR-H3；
(d)如SEQ ID NO.66中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.67中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.68中所示的CDR-H3；
(e)如SEQ ID NO.84中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.85中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.86中所示的CDR-H3；
(f)如SEQ ID NO.102中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.103中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.104中所示的CDR-H3；
(g)如SEQ ID NO.120中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.121中所示 的CDR-H2以及如SEQ ID NO.122中所示的CDR-H3；
(h)如SEQ ID NO.138中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.139中所示 的CDR-H2以及如SEQ ID NO.140中所示的CDR-H3；
(i)如SEQ ID NO.156中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.157中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.158中所示的CDR-H3；以及
(j)如SEQ ID NO.174中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.175中所示的 CDR-H2以及如SEQ ID NO.176中所示的CDR-H3。
进一步优选地，该能够结合至人类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表 位的结合域包含VL区域，所述VL区域选自如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO.125、SEQ IDNO.129、SEQ ID NO.161或SEQ ID NO.165 中所示的VL区域。
可选择地优选地：该能够结合至人类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε链表 位的第一结合域包含VH区域，所述VH区域选自如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.33、SEQID NO.37、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.55、 SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO. 105、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.127、SEQ IDNO.141、 SEQ ID NO.145、SEQ ID NO.159、SEQ ID NO.163、SEQ ID NO.177或SEQ IDNO.181中所示的VH区域。
更优选地，本发明的双特异性单链抗体分子的特征在于该能够结合至人 类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域，其包含选自下列的 VL区域和VH区域：
(a)如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.21中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.15或SEQID NO.19中所示的VH区域；
(b)如SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.39中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.33或SEQID NO.37中所示的VH区域；
(c)如SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.57中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.51或SEQID NO.55中所示的VH区域；
(d)如SEQ ID NO.71或SEQ ID NO.75中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.69或SEQID NO.73中所示的VH区域；
(e)如SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.93中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.87或SEQID NO.91中所示的VH区域；
(f)如SEQ ID NO.107或SEQ ID NO.111中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.105或SEQ ID NO.109中所示的VH区域；
(g)如SEQ ID NO.125或SEQ ID NO.129中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.123或SEQ ID NO.127中所示的VH区域；
(h)如SEQ ID NO.143或SEQ ID NO.147中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.141或SEQ ID NO.145中所示的VH区域；
(i)如SEQ ID NO.161或SEQ ID NO.165中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.159或SEQ ID NO.163中所示的VH区域；以及
(j)如SEQ ID NO.179或SEQ ID NO.183中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.177或SEQ ID NO.181中所示的VH区域。
根据本发明的双特异性单链抗体分子的一个优选实施方案，在该结合至 CD3ε的第一结合域中成对的VH-区域和VL-区域呈单链抗体(scFv)的形 式。该VH和VL区域以VH-VL或VL-VH的次序排列。优选地，该VH- 区域的N-端被定位到一个连接序列。该VL-区域的C-端被定位到连接序列。 换句话说，在本发明的双特异性单链抗体分子的CD3结合域中的结构域排 列优选地是VH-VL，其中所述CD3结合域的C-端位于第二(细胞表面抗原， 如PSMA)结合域。优选地，该VH-VL是或包含SEQ ID NO.185。
本发明的如上所述的双特异性单链抗体分子的一个优选实施方案的特 征在于：该能够结合至人类和非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结 合域包含选自SEQ IDNO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.61、SEQID NO.77、SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.95、SEQ ID NO.97、SEQ ID NO.113、SEQ ID NO.115、SEQ ID NO. 131、SEQ ID NO.133、SEQ ID NO.149、SEQ ID NO.151、SEQ ID NO.167、 SEQID NO.169、SEQ ID NO.185或SEQ ID NO.187的氨基酸序列。
本发明进一步涉及上述的双特异性单链抗体，其中所述第二结合域结合 至该细胞表面抗原PSMA。
根据本发明的一个优选实施方案，上述表征的双特异性单链抗体分子包 含下列序列组作为在该第二结合域中的CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2以及CDR L3，所述序列组选自：
a)SEQ ID NO:226-228的CDR H1-3以及SEQ ID NO:231-233的CDR L1-3；
b)SEQ ID NO:240-242的CDR H1-3以及SEQ ID NO:245-247的CDR L1-3；
c)SEQ ID NO:254-256的CDR H1-3以及SEQ ID NO:259-261的CDR L1-3；
d)SEQ ID NO:268-270的CDR H1-3以及SEQ ID NO:273-275的CDR L1-3；
e)SEQ ID NO:618-620的CDR H1-3以及SEQ ID NO:623-625的CDR L1-3；
f)SEQ ID NO:282-284的CDR H1-3以及SEQ ID NO:287-289的CDR L1-3；
g)SEQ ID NO:296-298的CDR H1-3以及SEQ ID NO:301-303的CDR L1-3；
h)SEQ ID NO:310-312的CDR H1-3以及SEQ ID NO:315-317的CDR L1-3；
i)SEQ ID NO:324-326的CDR H1-3以及SEQ ID NO:329-331的CDR L1-3；
j)SEQ ID NO:338-340的CDR H1-3以及SEQ ID NO:343-345的CDR L1-3；
k)SEQ ID NO:352-354的CDR H1-3以及SEQ ID NO:357-359的CDR L1-3；
l)SEQ ID NO:366-368的CDR H1-3以及SEQ ID NO:371-373的CDR L1-3；
m)SEQ ID NO:380-382的CDR H1-3以及SEQ ID NO:385-387的CDR L1-3；
n)SEQ ID NO:394-396的CDR H1-3以及SEQ ID NO:399-401的CDR L1-3；
o)SEQ ID NO:408-410的CDR H1-3以及SEQ ID NO:413-415的CDR L1-3；
p)SEQ ID NO:422-424的CDR H1-3以及SEQ ID NO:427-429的CDR L1-3；
q)SEQ ID NO:436-438的CDR H1-3以及SEQ ID NO:441-443的CDR L1-3；
r)SEQ ID NO:450-452的CDR H1-3以及SEQ ID NO:455-457的CDR L1-3；
s)SEQ ID NO:464-466的CDR H1-3以及SEQ ID NO:469-471的CDR L1-3；
t)SEQ ID NO:478-480的CDR H1-3以及SEQ ID NO:483-485的CDR L1-3；
u)SEQ ID NO:492-494的CDR H1-3以及SEQ ID NO:497-499的CDR L1-3；
v)SEQ ID NO:506-508的CDR H1-3以及SEQ ID NO:511-513的CDR L1-3；
w)SEQ ID NO:520-522的CDR H1-3以及SEQ ID NO:525-527的CDR L1-3；
x)SEQ ID NO:534-536的CDR H1-3以及SEQ ID NO:539-541的CDR L1-3；
y)SEQ ID NO:548-550的CDR H1-3以及SEQ ID NO:553-555的CDR L1-3；
z)SEQ ID NO:562-564的CDR H1-3以及SEQ ID NO:567-569的CDR L1-3；
aa)SEQ ID NO:576-578的CDR H1-3以及SEQ ID NO:581-583的CDR L1-3；
ab)SEQ ID NO:590-592的CDR H1-3以及SEQ ID NO:595-597的CDR L1-3；以及，
ac)SEQ ID NO:604-606的CDR H1-3以及SEQ ID NO:609-611的CDR L1-3。
双特异性单链抗体分子的优选组包括下列序列的组作为在该第二结合 域中的CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2以及CDR L3，其 选自：
a)SEQ ID NO:226-228的CDR H1-3以及SEQ ID NO:231-233的CDR L1-3；
b)SEQ ID NO:240-242的CDR H1-3以及SEQ ID NO:245-247的CDR L1-3；
c)SEQ ID NO:254-256的CDR H1-3以及SEQ ID NO:259-261的CDR L1-3；
d)SEQ ID NO:268-270的CDR H1-3以及SEQ ID NO:273-275的CDR L1-3；以及，
e)SEQ ID NO:618-620的CDR H1-3以及SEQ ID NO:623-625的CDR L1-3。
这些分子包含结合至该细胞表面抗原PSMA的第二结合域，所述第二结 合域由源自亲本PSMA特异性结合分子的VH-链和源自对不同抗原(即，也 被称为CD326的上皮细胞黏附分子(EpCAM))有特异性的结合分子的VL- 链组成。令人惊讶地发现：具有此源自亲本PSMA特异性结合分子的VH- 链和源自亲本EpCAM特异性结合分子的VL-链的特定组合的结合分子专门 结合至PSMA而不是EpCAM。这个被包含在本发明的双特异性单链抗体分 子中的PSMA特异性结合域组的结合特异性在所附的实施例3中描述。
双特异性单链抗体分子的另一优选组包括下列序列的组作为在该第二 结合域中的CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2以及CDR L3， 其选自：
a)SEQ ID NO:282-284的CDR H1-3以及SEQ ID NO:287-289的CDR L1-3；
b)SEQ ID NO:296-298的CDR H1-3以及SEQ ID NO:301-303的CDR L1-3；
c)SEQ ID NO:310-312的CDR H1-3以及SEQ ID NO:315-317的CDR L1-3；
d)SEQ ID NO:324-326的CDR H1-3以及SEQ ID NO:329-331的CDR L1-3；
e)SEQ ID NO:338-341的CDR H1-3以及SEQ ID NO:343-345的CDR L1-3；
f)SEQ ID NO:352-354的CDR H1-3以及SEQ ID NO:357-359的CDR L1-3；以及，
g)SEQ ID NO:366-368的CDR H1-3以及SEQ ID NO:371-373的CDR L1-3。
双特异性单链抗体分子的另一优选组包括下列序列的组作为在该第二 结合域中的CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2以及CDR L3， 其选自：
a)SEQ ID NO:380-382的CDR H1-3以及SEQ ID NO:385-387的CDR L1-3；
b)SEQ ID NO:394-396的CDR H1-3以及SEQ ID NO:399-401的CDR L1-3；
c)SEQ ID NO:408-410的CDR H1-3以及SEQ ID NO:413-415的CDR L1-3；
d)SEQ ID NO:422-424的CDR H1-3以及SEQ ID NO:427-429的CDR L1-3；
e)SEQ ID NO:436-438的CDR H1-3以及SEQ ID NO:441-443的CDR L1-3；
f)SEQ ID NO:450-452的CDR H1-3以及SEQ ID NO:455-457的CDR L1-3；
g)SEQ ID NO:464-466的CDR H1-3以及SEQ ID NO:469-471的CDR L1-3；
h)SEQ ID NO:478-480的CDR H1-3以及SEQ ID NO:483-485的CDR L1-3；
i)SEQ ID NO:492-494的CDR H1-3以及SEQ ID NO:497-499的CDR L1-3；
j)SEQ ID NO:506-508的CDR H1-3以及SEQ ID NO:511-513的CDR L1-3；
k)SEQ ID NO:520-522的CDR H1-3以及SEQ ID NO:525-527的CDR L1-3；
l)SEQ ID NO:534-536的CDR H1-3以及SEQ ID NO:539-541的CDR L1-3；
m)SEQ ID NO:548-550的CDR H1-3以及SEQ ID NO:553-555的CDR L1-3；
n)SEQ ID NO:562-564的CDR H1-3以及SEQ ID NO:567-569的CDR L1-3；
o)SEQ ID NO:576-578的CDR H1-3以及SEQ ID NO:581-583的CDR L1-3；
p)SEQ ID NO:590-592的CDR H1-3以及SEQ ID NO:595-597的CDR L1-3；以及
q)SEQ ID NO:604-606的CDR H1-3以及SEQ ID NO:609-611的CDR L1-3。
对于本发明的双特异性单链抗体分子优选的是：所述结合至该细胞表面 抗原PSMA的第二结合域包括下列序列的组作为在该第二结合域中的VH- 和VL-链，其选自：
a)SEQ ID NO:225的VH-链以及SEQ ID NO:230的VL-链；
b)SEQ ID NO:239的VH-链以及SEQ ID NO:244的VL-链；
c)SEQ ID NO:253的VH-链以及SEQ ID NO:258的VL-链；
d)SEQ ID NO:267的VH-链以及SEQ ID NO:272的VL-链；
e)SEQ ID NO:617的VH-链以及SEQ ID NO:622的VL-链；
f)SEQ ID NO:281的VH-链以及SEQ ID NO:286的VL-链；
g)SEQ ID NO:295的VH-链以及SEQ ID NO:300的VL-链；
h)SEQ ID NO:309的VH-链以及SEQ ID NO:314的VL-链；
i)SEQ ID NO:323的VH-链以及SEQ ID NO:328的VL-链；
j)SEQ ID NO:337的VH-链以及SEQ ID NO:342的VL-链；
k)SEQ ID NO:351的VH-链以及SEQ ID NO:356的VL-链；
l)SEQ ID NO:365的VH-链以及SEQ ID NO:370的VL-链；
m)SEQ ID NO:379的VH-链以及SEQ ID NO:384的VL-链；
n)SEQ ID NO:393的VH-链以及SEQ ID NO:398的VL-链；
o)SEQ ID NO:407的VH-链以及SEQ ID NO:412的VL-链；
p)SEQ ID NO:421的VH-链以及SEQ ID NO:426的VL-链；
q)SEQ ID NO:435的VH-链以及SEQ ID NO:440的VL-链；
r)SEQ ID NO:449的VH-链以及SEQ ID NO:454的VL-链；
s)SEQ ID NO:463的VH-链以及SEQ ID NO:468的VL-链；
t)SEQ ID NO:477的VH-链以及SEQ ID NO:482的VL-链；
u)SEQ ID NO:491的VH-链以及SEQ ID NO:496的VL-链；
v)SEQ ID NO:505的VH-链以及SEQ ID NO:510的VL-链；
w)SEQ ID NO:519的VH-链以及SEQ ID NO:524的VL-链；
x)SEQ ID NO:533的VH-链以及SEQ ID NO:538的VL-链；
y)SEQ ID NO:547的VH-链以及SEQ ID NO:552的VL-链；
z)SEQ ID NO:561的VH-链以及SEQ ID NO:566的VL-链；
aa)SEQ ID NO:575的VH-链以及SEQ ID NO:580的VL-链；
ab)SEQ ID NO:589的VH-链以及SEQ ID NO:594的VL-链；以及
ac)SEQ ID NO:603的VH-链以及SEQ ID NO:608的VL-链。
上述VH-和VL-链也分别示于SEQ ID NO:235、249、263、277、627、 291、305、319、333、347、361、375、389、403、417、431、445、459、 473、487、501、515、529、543、557、571、585、599以及613。
本发明的双特异性单链抗体分子的第二结合域对应的VL-和VH-区域以 及相应的scFv的序列(氨基酸序列和核苷酸序列)示于序列表中。
在本发明的双特异性单链抗体分子中，该结合域以VL-VH-VH-VL、 VL-VH-VL-VH、VH-VL-VH-VL或VH-VL-VL-VH的次序排列，如所附的 实施例中所示。优选地，该结合域以VHPSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 或VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3的次序排列。
本发明的一个特别优选的实施方案涉及上述表征的多肽，其中所述双特 异性单链抗体分子包括选自下列的序列：
(a)如SEQ ID NO:237、251、265、279、629、293、307、321、335、 349、363、377、391、405、419、433、447、461、475、489、503、517、 531、545、559、573、587、601或615中的任一个中所示的氨基酸序列；
(b)由如SEQ ID NO:238、252、266、280、630、294、308、322、336、 350、364、378、392、406、420、434、448、462、476、490、504、518、 532、546、560、574、588、602或616中的任一个中所示的核酸序列编码的 氨基酸序列。
本发明涉及的双特异性单链抗体分子包含如SEQ ID NO:237、251、265、 279、629、293、307、321、335、349、363、377、391、405、419、433、 447、461、475、489、503、517、531、545、559、573、587、601或615 中的任一个中所示的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:237、251、265、279、 629、293、307、321、335、349、363、377、391、405、419、433、447、 461、475、489、503、517、531、545、559、573、587、601或615的氨基 酸序列有至少96％同一性、优选97％、更优选至少98％同一性、最优选至少 99％同一性的氨基酸序列。本发明还涉及如SEQ ID NO:238、252、266、280、 630、294、308、322、336、350、364、378、392、406、420、434、448、 462、476、490、504、518、532、546、560、574、588、602或616中的任 一个所示的相对应的核酸序列，以及与示于SEQ ID NO:238、252、266、280、 630、294、308、322、336、350、364、378、392、406、420、434、448、 462、476、490、504、518、532、546、560、574、588、602或616的核酸 序列有至少96％同一性、优选97％、更优选至少98％同一性、最优选至少 99％同一性的核酸序列。应当理解的是：在整个核苷酸或氨基酸序列上确定 序列同一性。关于序列比对，例如，可以使用程序Gap或BestFit(Needleman 和Wunsch J.Mol.Biol.48(1970),443-453；Smith和Waterman,Adv.Appl. Math 2(1981),482-489)，它被包含在GCG软体包(GeneticsComputer Group, 575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711(1991))中。对本领域的技 术人员来说这是一个常规的方法，即通过使用例如上述程序之一来测定和鉴 定与本发明的双特异性单链抗体的核苷酸或氨基酸序列具有例如96％(97％、 98％或99％)序列同一性的核苷酸或氨基酸序列。例如，根据克里克的摆动 假说，反密码子上的5'碱基不像其他2个碱基有空间限制，从而可具有非标 准的碱基配对。换句话说：密码子三联体中的第三位可变化，从而在此第三 位有区别的2个三联体可编码相同的氨基酸残基。所述假说是本领域技术人 员熟知的(参见例如http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis；Crick,J Mol Biol 19(1966):548–55)。
在本发明的PSMAxCD3双特异性单链抗体构建体中优选的结构域排列 在下面的实施例中示出。
在本发明的一个优选实施方案中，该双特异性单链抗体对CD3ε和由它 们的第二结合域识别的人类与非黑猩猩灵长类动物细胞表面抗原PSMA是 跨物种特异性的。
在一个备选实施方案中，本发明提供编码上述本发明的双特异性单链抗 体分子的核酸序列。
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体。
许多适合的载体是分子生物学领域的技术人员已知的，载体的选择取决 于需要的功能，并且包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体以及常规用于基因工程 的其他载体。可以用本领域的技术人员熟知的方法构建各种质粒和载体；参 见，例如，描述于Sambrook等人(上述引用文)和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,NY (1989),(1994)的技术。可选择地，本发明的多核苷酸和载体可重构成脂质体 以递送至靶细胞。如下面进一步详细讨论地，将克隆载体用于分离DNA的 各个序列。在需要表达特定多肽的情况下，相关序列可被转移至表达载体中。典型的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322以及pGBT9。 典型的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。
优选地，所述载体包含的核酸序列是可操作地连接至本文定义的上述核 酸序列的调节序列。
术语“调控序列”是指DNA序列，其对于实现它们连接的编码序列的表 达是必要的。此类控制序列的性质随宿主生物体的不同而不同。在原核生物 中，一般而言，控制序列包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生 物中，一般而言，控制序列包括启动子、终止子以及在某些情况下包括增强 子、反式作用因子或转录因子。术语“控制序列”意在在最低限度上包括其存 在为表达必需的所有组份，并且还可包括另外的有益组份。
术语“可操作地连接”是指并列位置，其中描述的组份处于允许它们以它 们所预期的方式作用的关系。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以使得 该编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现的方式而连接。在该控制 序列是启动子的情况下，对本领域的技术人员显而易见的是优选使用双链核 酸。
因此，优选地，所列举的载体是表达载体。“表达载体”是一种构建体， 可被用于转化选择的宿主并且在该选择的宿主中提供编码序列的表达。表达 载体可以是，例如克隆载体、双元载体或整合载体。表达包括优选地将核酸 分子转录成可翻译的mRNA。确保在原核和/或真核细胞中表达的调控元件 是本领域技术人员所熟知的。在真核细胞的情况下，它们通常包括确保转录 起始的启动子和可选的确保转录终止及转录物稳定的poly-A信号。可能容 许在原核宿主细胞中表达的调控元件包括，例如，在大肠杆菌中的PL、lac、 trp或tac启动子，而容许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母菌 中的AOX1或GAL1启动子或者在哺乳动物或其他动物细胞中的CMV-、 SV40、RSV-启动子(Rous肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或球蛋 白内含子。
除了负责转录起始的元件以外，这些调控元件还可包括转录终止信号， 如在多核苷酸下游的SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于使 用的表达系统，可将能够把多肽导向至细胞隔室或将它分泌至介质内的前导 序列添加至所述的核酸序列的编码序列中，并且所述前导序列是本领域熟知 的；参见，例如WO 2008/119567。前导序列在适合的阶段与翻译、启动和 终止序列一起装配，并且优选地，前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分 分泌至细胞周质间隙或细胞外介质内。任选地，异源序列可编码融合蛋白， 该融合蛋白包括赋予所需特性(例如，被表达的重组产物的稳定性或纯化简 化)的N-端识别肽；参见，如上述。在本文中，适合的表达载体是本领域 已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、 pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo (Mack等人PNAS(1995)92,7021-7025以及Raum等人Cancer ImmunolImmunother(2001)50(3),141-150)或pSPORT1(GIBCO BRL)。
优选地，在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中，所述表达控制序列 是真核启动子系统，但也可以使用原核宿主的控制序列。一但该载体被导入 到适当的宿主中，该宿主被维持在适合核苷酸序列高水平表达的条件下，并 且如果需要，之后可进行本发明的双特异性单链抗体分子的收集和纯化；参 见，例如，所附的实施例。
被用于表达细胞周期相互作用蛋白的另一种表达系统是昆虫系统。在这 个系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体，以在草地贪 夜蛾细胞中或在粉纹夜蛾幼虫中表达外源基因。上述的核酸分子的编码序列 可被克隆至病毒的非必需区域，如，多角体蛋白基因，并且被放置在多角体 蛋白启动子的控制之下。所述编码序列的成功插入将使多角体蛋白基因处于 非活动状态并且产生缺乏外壳蛋白壳的重组病毒。然后用重组病毒感染草地 贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，本发明的蛋白在其中表达(Smith,J.Virol.46(1983),584；Engelhard,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91(1994),3224-3227)。
附加的调控元件可包括转录以及翻译增强子。有利地，上述的本发明的 载体包括可选择的和/或可评价(scorable)标记物。
可用于选择被转化细胞以及例如植物组织和植物的选择性标记物基因 是本领域技术人员熟知的，所述选择性标记物基因包括，例如，以抗代谢物 抗性作为选择基础的赋予对甲氨蝶呤抗性的dhfr(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994),143-149)；赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素以及巴 龙霉素抗性的npt(Herrera-Estrella,EMBOJ.2(1983),987-995)以及赋予对 潮霉素抗性的hygro(Marsh,Gene 32(1984),481-485)。还描述了另外的可 选择的基因，即容许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB；容许细胞利用组氨醇 代替组氨酸的hisD(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),8047)；容 许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)的甘露糖-6-磷酸异构酶以及赋予对鸟氨 酸脱羧酶抑制剂、2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO抗性的ODC(鸟氨酸脱 羧酶)(McConlogue,1987,In:CurrentCommunications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)或者赋予对杀稻瘟菌素S抗性的来自土曲 霉的脱氨酶(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。
有用的可评价标记物也是本领域技术人员已知的并且有市售。有利地， 所述标记物是编码萤光素酶(Giacomin,Pl.Sci.116(1996),59-72；Scikantha, J.Bact.178(1996),121)、绿色萤光蛋白(Gerdes,FEBS Lett.389(1996), 44-47)或β-葡萄糖醛酸酶(Jefferson,EMBO J.6(1987),3901-3907)的基因。 这个实施方案对于简单以及快速筛选含有所述载体的细胞、组织以及生物体 是特别有用的。
如上所述，为了达到例如纯化还有基因治疗的目的，所述核酸分子可被 单独使用或作为载体的一部分使用，以在细胞中表达本发明的双特异性单链 抗体分子。这些含有编码上述任一种本发明的双特异性单链抗体分子的DNA 序列的核酸分子或载体被导入细胞，继而所述细胞产生目标多肽。基于通过 离体或体内技术将治疗基因导入细胞的基因治疗，是基因转移的最重要的应 用之一。用于体外或体内基因治疗的适合的载体、方法或基因递送系统已描 述于文献中并且是本领域技术人员已知的；参见，例如，Giordano,NatureMedicine 2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson, Science256(1992),808-813；Verma,Nature 389(1994),239；Isner,Lancet 348 (1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Onodera,Blood 91(1998),30-36；Verma,Gene Ther.5(1998),692-699；Nabel,Ann.NY Acad. Sci.811(1997),289-292；Verzeletti,Hum.Gene Ther.9(1998),2243-51；Wang, Nature Medicine 2(1996),714-716；WO 94/29469；WO 97/00957，US 5,580,859；US 5,589,466；或者Schaper,CurrentOpinion in Biotechnology 7 (1996),635-640；dos Santos Coura和Nardi Virol J.(2007),4:99。所述核酸分子 和载体可被设计为直接导入或通过脂质体或病毒(例如，腺病毒、逆转录病 毒)载体导入至细胞内。优选地，所述细胞是生殖细胞系细胞、胚胎细胞或 卵细胞或者由其衍生的，最优选地，所述细胞是干细胞。胚胎干细胞的实例 尤其可以是如描述于Nagy,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993),8424-8428中 的干细胞。
本发明还提供了用本发明的载体转化或转染的宿主。所述宿主可以通过 将上述的本发明的载体或上述的本发明的核酸分子导入该宿主内产生。在宿 主中至少一种载体或至少一种核酸分子的存在可调节编码上述的单链抗体 构建体的基因的表达。
导入宿主内的本发明所述的核酸分子或载体可合并至该宿主的基因组 内或它可被维持在染色体外。
宿主可以是任何原核或真核细胞。
术语“原核生物”是指包括所有可被DNA或RNA分子转化或转染以表达 本发明的蛋白质的细菌。原核生物宿主可包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细 菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌以及枯草芽孢杆菌。术 语“真核生物”是指包括酵母菌、高等植物、昆虫和优选的哺乳动物细胞。取 决于在重组生产过程中采用的宿主，由本发明的多核苷酸所编码的蛋白质可 被糖基化或非糖基化。特别优选的是使用含有本发明的双特异性单链抗体分 子编码序列的质粒或病毒，并且该编码序列以遗传方式融合了N-端FLAG- 标签和/或C-端His-标签。优选地，所述FLAG-标签的长度是大约4至8个 氨基酸、最优选8个氨基酸。可以使用上述的多核苷酸，以利用本领域技术 人员通常已知的技术来转化或转染宿主。再者，用于制备融合、可操作地连 接的基因和例如在哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法是本领域技术人 员熟知的(Sambrook，上述引文)。
优选地，所述宿主是细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
特别设想的是：所述宿主可以是哺乳动物细胞。特别优选的宿主细胞包 括CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞株如SP2/0或NS/0。如在WO 2008/119567的实施例中对于同类的其他分子所示例的，特别优选的是CHO- 细胞作为宿主。
更优选地，所述宿主细胞是人类细胞或人类细胞株，例如per.c6(Kroos,Biotechnol.Prog.,2003,19:163-168)。
在其它实施方案中，本发明涉及一种用于生产本发明的双特异性单链抗 体分子的方法，所述方法包括在允许本发明的双特异性单链抗体分子表达的 条件下培养本发明的宿主并从培养物中回收产生的多肽。
被转化的宿主可在发酵罐中生长并且根据本领域已知的技术进行培养 以达到最佳的细胞生长。然后可以从生长培养基、细胞裂解液、或细胞膜组 分中分离本发明的双特异性单链抗体分子。例如经微生物表达的双特异性单 链抗体分子的分离和纯化可以通过任何常规方法，例如，制备色谱分离和免 疫学分离，正如那些涉及使用靶向例如本发明的双特异性单链抗体分子的标 签的或如在所附实施例中描述的单克隆或多克隆抗体的方法。
允许表达的培养宿主的条件是本领域已知的，且取决于用于此方法的宿 主系统和表达系统/载体。为了达到允许重组多肽表达的条件而被修饰的参数 是本领域已知的。因此，适当的条件可由本领域技术人员无需进一步的创造 性工作投入的情况下确定。
经表达后，本发明的双特异性单链抗体分子可根据本领域的标准操作程 序被纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳以及类似操作；参 见，Scopes,"ProteinPurification",Springer-Verlag,NY(1982)。对于药学用途， 优选具有至少大约90至95％同质性的基本上纯的多肽，最优选98至99％或 更高同质性。经纯化后(部分的或根据需要达到同质)，本发明的双特异性 单链抗体分子可被用于治疗(包括体外)或者开发和执行分析程序。此外， 用于从培养物中回收本发明的双特异性单链抗体分子的方法详细描述于所附的WO 2008/119567的关于同类的其他分子的实施例中。回收也可以通过 分离能够结合至人类以及非黑猩猩灵长类动物CD3ε的表位的本发明的双 特异性单链抗体分子的方法实现，该方法包括下列步骤：
(a)使该多肽与含有氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ IDNO.211)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQ ID NO.212) 的最多27个氨基酸的CD3ε的胞外域的N-端片段(经由它的C-端被固定至 固相)接触；
(b)洗脱与所述片段结合的多肽；以及
(c)从(b)的洗脱液中分离该多肽。
优选地，本发明通过上述方法所分离的多肽具有人类来源。
这个方法或本发明的双特异性单链抗体分子的分离被理解为用于从多 个候选多肽中分离一种或多种不同多肽(对其N-端包括氨基酸序列 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly(SEQ ID NO.211)或 Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQ ID NO.212)的CD3ε的胞外域片段 具有相同的特异性)的方法以及用于从溶液中纯化多肽的方法。对于后一用于从溶液中纯化双特异性单链抗体分子的方法的非限制性实例是例如从培 养悬浮液或来自此类培养物的制备物中纯化被重组表达的双特异性单链抗 体分子。
如上所述的，用于这个方法的片段是灵长类动物CD3ε分子的胞外域的 N-端片段。不同物种的CD3ε分子的胞外域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、 3、5和7中所示。2种形式的N-端八聚体示于SEQ ID NO:211和212。优 选地，这个N-端对于所述由本发明的方法识别的多肽的结合而言是自由获 取的。术语“自由获取的”在本发明的上下文中被理解为无外加的动机，如 His-标签。该His-标签与本文描述的结合分子的干扰在WO 2008/119567中 描述。
根据所述方法，所述片段经由它的C-端被固定至固相。本领域的技术人 员依赖本发明的方法使用的实施方案将容易并且无创造性工作困扰地选择 合适的固相支持物。固体支持物包括但不限于基质类珠粒(例如琼脂糖珠、 琼脂糖凝胶珠、聚苯乙烯珠、葡聚糖珠)、板(培养板或多孔板)以及已知 的芯片(例如来自)。将该片段固定/固定化至所述固相支持物的手 段和方法的选择取决于选择的固相支持物。通常使用的用于固定/固定化的方 法是通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯耦合。这种耦合以及用于固定/固定 化的替代方法的化学机理是本领域技术人员已知的，例如，来自Hermanson “BioconjugateTechniques”,Academic Press,Inc.(1996)。对于固定至/固定化在 色谱载体上，通常使用下列工具：NHS-活化的琼脂糖凝胶(例如GE Life Science-Amersham的HiTrap-NHS)、CnBr-活化的琼脂糖凝胶(例如，GE Life Science-Amersham)、NHS-活化的葡聚糖珠(Sigma)或活化的聚甲基丙烯酸 酯。这些试剂也可用在批次方法中。此外，包括氧化铁的葡聚糖珠(例如， 可获得自Miltenyi)可用在批次方法中。这些珠粒可与磁体组合使用，以从 溶液中分离珠粒。可通过使用NHS活化的羧甲基葡聚糖，将多肽固定在Biacore芯片(例如CM5芯片)上。适当的固相支持物的其它实例是胺活性 的多孔板(例如Nunc ImmobilizerTM板)。
根据该方法，所述CD3ε的胞外域的片段可直接地或通过氨基酸的延伸 物(可以是连接物或其他蛋白质/多肽部分)偶合至该固相支持物。可选择地， CD3ε的胞外域可通过一个或多个接头分子被间接耦合。
用于洗脱结合至被固定化的表位的肽或多肽的手段和方法是本领域公 知的。同样适用于从洗脱液中分离被识别的多肽(们)的方法。
用于从多个候选多肽中分离一种或多种不同双特异性单链抗体分子(对 于在其N-端包括氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly(X是Met或 Ile)的CD3ε的胞外域的片段具有相同的特异性)的方法可包括下列用于选 择抗原特异性实体的方法的一个或多个步骤：
CD3ε特异性结合域可选自抗体衍生库。噬菌体展示文库可根据如描述 于“PhageDisplay:A Laboratory Manual”；Ed.Barbas,Burton,Scott& Silverman；Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001的标准操作程序来构建。 抗体库中的抗体片段的形式可以是scFv，但一般而言也可以是Fab片段或甚 至单域抗体片段。为了分离抗体片段，可使用天然的抗体片段文库。对于选 择潜在的低免疫原性的结合实体用于以后的治疗，人类抗体片段文库对于人 类抗体片段的直接选择可以是有利的。在一些情况下，它们可形成合成抗体 文库的基础(Knappik等人J Mol.Biol.2000,296:57ff)。相对应的形式可以 是Fab、scFv(如下所述的)或域抗体(dAbs，如在Holt等人,Trends Biotechnol. 2003,21:484ff中所综述的)。
在本领域中还已知的是：在许多情况下没有对抗靶标抗原的可用的免疫 人类抗体源。因此用靶标抗原和分离自动物组织例如脾脏或PBMC的各自的 抗体文库免疫动物。N-端片段可被生物素化或共价地连结至蛋白质，如KLH 或牛血清白蛋白(BSA)。根据常见的方法，啮齿类动物被用于免疫。一些 非人类来源的免疫抗体库可以因为其他原因(例如源自骆驼类物种的单域抗 体(VHH)的存在)而特别有利(如描述于Muyldermans,JBiotechnol.74:277； De Genst等人Dev Como Immunol.2006,30:187ff)。因此抗体文库的对应形 式可以是Fab、scFv(如下所述的)或单域抗体(VHH)。
在一个可行的方法中，来自balb/cx C57black杂交的10周龄F1小鼠可 以用全细胞免疫，所述全细胞例如表达N-端呈现为翻译融合成熟的CD3ε链 的N-端氨基酸1至27的跨膜EpCAM。或者，小鼠可用1-27CD3ε-Fc融合 蛋白免疫(相应的方法描述于WO 2008/119567的实施例中)。在加强免疫之 后，取出血液样品并且对抗CD3-阳性T细胞的抗体血清效价可在如FACS 分析中进行测试。通常，血清效价在免疫的动物中显著地高于在非免疫的动 物中。
免疫的动物可形成构建免疫抗体文库的基础。这种文库的实例包括噬菌 体展示文库。这种文库一般而言可根据如在“Phage Display:A Laboratory Manual”；Ed.Barbas,Burton,Scott&Silverman；Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001中公开的标准操作程序构建。
非人类抗体也可通过噬菌体展示而被人源化，这是由于产生更多可变抗 体文库，这些文库可随后在选择期间针对结合物进行富集。
在噬菌体展示方法中，呈现抗体文库的噬菌体集合中的任一个都形成用 各自抗原作为靶标分子选择结合实体的基础。分离抗原特异性的抗原结合的 噬菌体的中心步骤称为淘选。因为抗体片段展示在噬菌体的表面上，这个通 用的方法被称为噬菌体展示。选择的一个优选方法为使用小蛋白，如经翻译 融合至由噬菌体展示的scFv的N-端的丝状噬菌体N2域。本领域已知的可 用来分离结合实体的另一种展示方法是核糖体展示方法(在Groves& Osbourn,Expert Opin Biol Ther.2005,5:125ff；Lipovsek&Pluckthun,JImmunol Methods 2004,290:52ff中综述的)。为了证明scFv噬菌体颗粒结合 至1-27CD3ε-Fc融合蛋白，带有经克隆的scFv谱的噬菌体文库可通过PEG (聚乙二醇)从各自的培养上清液中收获。ScFv噬菌体颗粒与被固定的CD3ε Fc融合蛋白一起培养。该被固定的CD3εFc融合蛋白可被涂覆到固相。可 以洗脱结合实体，然后洗脱液可用于感染新鲜的未被感染的细菌宿主。被编 码人类scFv片段的噬菌粒拷贝成功转导的的细菌宿主可就羧苄西林抗性再 次进行筛选，并且随后用例如VCMS 13辅助噬菌体感染，以开始第二轮的 抗体展示以及体外筛选。通常总共进行4至5轮筛选。可以使用流式细胞仪， 在CD3ε阳性Jurkat细胞、HPBall细胞、PBMC或经转染的携带融合至表面 展示的EpCAM的N-端CD3ε序列的真核细胞上测试经分离的结合实体的结 合(参见WO 2008/119567)。
优选地，上述方法可以是以下方法：其中CD3ε的胞外域的片段由具有 SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8中所示的任 一个的氨基酸序列的多肽的一个或多个片段组成。更优选地，所述片段的长 度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27个氨基酸残基。
这个识别双特异性单链抗体分子的方法可以是一种筛选多个包含结合 至人类以及非黑猩猩灵长类动物CD3ε的表位的跨物种特异性结合域的双特 异性单链抗体分子的方法。或者，识别的方法是一种纯化/分离包含结合至人 类以及非黑猩猩灵长类动物CD3ε的表位的跨物种特异性结合域的双特异性 单链抗体分子的方法。
此外，本发明提供一种组合物，所述组合物包含本发明的双特异性单链 抗体分子或通过如上所述的方法生产的双特异性单链抗体。优选地，所述组 合物是一种药物组合物。
本发明还提供如本文定义的或根据如本文定义的方法生产的双特异性 单链抗体分子，其中所示双特异性单链抗体分子用于预防、治疗或改善癌症。 优选地，所述癌症是实体瘤，更优选地，为癌或前列腺癌。优选地，该双特 异性单链进一步包含载体、稳定剂和/或赋形剂的适合制剂。此外，优选地， 所示双特异性单链抗体分子适合与另外的药物组合给药。所述药物可以是非 蛋白质性的化合物或蛋白质性的化合物，并且可与如本文定义的双特异性单 链抗体分子同时地或非同时地给药。
根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于向患者给药的组合物，优选人 类患者。特别优选的本发明的药物组合物包括靶向对抗环境独立的CD3表 位且针对其产生的双特异性单链抗体。优选地，所述药物组合物包括载体、 稳定剂和/或赋形剂的适合制剂。在一个优选实施方案中，所述药物组合物包 括用于胃肠外的、透皮的、腔内的、动脉内的、鞘内和/或鼻内给药或者通过 直接注射到组织内的组合物。特别设想的是所述组合物通过输注或注射向患 者给药。适合的组合物的给药可有许多方式，例如，通过静脉内的、腹膜内 的、皮下的、肌内的、局部的或皮内给药。特别地，本发明提供该适合的组 合物不间断的给药。作为非限制性的实例，可通过患者所戴的计量治疗剂到 达患者体内的量的小泵系统实现不间断的即连续给药。该包含靶向对抗本发 明的环境独立的CD3表位且针对其产生的双特异性单链抗体的药物组合物 可通过使用所述泵系统进行给药。所述泵系统一般而言是本领域已知的，并 且通常依靠周期性地更换含有要被输注的治疗剂的药筒。当更换泵系统中的 药筒时，可能接着发生到达患者体内的本应不间断流动的治疗剂的暂时中 断。在这样的情况下，在药筒更换前的给药阶段和在药筒更换后的给药阶段 仍会被认为是在药学手段的含义内，并且本发明的方法共同构成此类治疗剂 的一个“不间断给药”。
这些靶向对抗本发明的环境独立的CD3表位且针对其产生的双特异性 单链抗体的连续或不间断的给药可借助流体递送装置或小泵系统(包括用于 驱使流体离开储库的流体驱动机构以及用于致动该驱动机构的致动器)进行 静脉内或皮下给药。用于皮下给药的泵系统可包括用于穿透患者皮肤并将适 合的组合递送到该患者体内的针或插管。无需静脉、动脉或血管，所述泵系 统可直接固定或附着至患者皮肤，从而使得泵系统与患者的皮肤可直接接 触。所述泵系统可被附着在患者皮肤24小时至数天。所述泵系统可以是具有小体积储库的小尺寸。作为非限制性的实例，用于给药的适合的药物组合 物的储库的体积可以是0.1至50ml。
连续给药可以是借助佩戴在皮肤上并定期替换的贴片的透皮给药。本领 域技术人员知道适于此目的的用于药物递送的贴片系统。注意到的是：透皮 给药特别地适于不间断的给药，因为先被用完的贴片的调换可有利地同时以 一片新贴片的替换而完成，例如在皮肤的表面上毗连至先用完的贴片以及立 即在移除先用完的贴片之前。不会产生流体中断或动力不足的问题。
包含靶向对抗环境独立的CD3表位且针对其产生的特别的双特异性单 链抗体的本发明的组合物可进一步包含药学上可接受的载体。适合的药物载 体的实例是本领域熟知的，包括溶液(例如磷酸盐缓冲盐水溶液)、水、乳 剂(如油/水乳剂)、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。包含此类载 体的组合物可通过众所周知的常规方法配制。制剂可包括碳水化合物、缓冲 溶液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可以是非还原糖，优选海藻糖、 蔗糖、八硫酸酯、山梨糖醇或木糖醇。这样的制剂可用于可具有和/或不具有 泵系统的静脉内或皮下的连续给药。氨基酸可以是带电荷的氨基酸，优选赖 氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸。表面活性剂可以是洗涤剂 (优选>1.2KD的分子量)和/或聚醚(优选>3KD的分子量)。优选地，优 选洗涤剂的非限制性实例是Tween 20、Tween 40、Tween60、Tween 80或 Tween 85。优选聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 5000。本发明使用的缓冲剂系统可优选pH 5-9，并且可包括柠檬酸盐、 琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和醋酸盐。本发明的组合物可以以适合的剂量给 个体给药，所述剂量可例如通过剂量递增研究确定，所述研究通过给非黑猩 猩灵长类动物(例如，猕猴)施用剂量渐增的显示具有本文描述的跨物种特 异性的本发明的双特异性单链抗体分子进行。如上所述，显示具有本文描述 的跨物种特异性的本发明的双特异性单链抗体分子可有利地以在非黑猩猩 灵长类动物的临床前试验中以及作为人用药物的同样形式使用。这些组合物 也可与其他蛋白质性的和非蛋白质性的药物组合给药。这些药物可与包含如 本文定义的本发明的双特异性单链抗体分子的组合物同时给药，或者以适时 地被定义的间隔和剂量在施用所述多肽之前或之后分开给药。给药方案是由 主治医生和临床因素决定的。如在医学领域中熟知的，任何一位患者的剂量 均取决于许多因素(包括患者的体型、体表面积、年龄、给药的特定化合物、 性别、给药时间和途径、一般健康状况以及要同时给药的其他药物)。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶液 的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯(如 油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇的/水性溶液、乳剂或悬浮液(包括生理盐 水以及缓冲介质)。胃肠外的载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖 与氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉内的载体包括流体和营养补充物、电 解质补充剂(如以林格氏葡萄糖为基础的那些)以及类似物。防腐剂和其他 添加剂也可存在，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体以及类似物。 此外，本发明的组合物可包括蛋白质性的载体，例如，血清白蛋白或免疫球 蛋白，优选人类来源。据设想，除了本文定义的本发明的双特异性单链抗体 分子之外，本发明的组合物可进一步包括生物活性剂，这取决于组合物的预 期用途。此类药剂可以是作用于胃肠系统的药物、作用如细胞抑制剂的药物、 预防高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎性反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域已知的药剂，例如细胞因 子。
本文定义的药物组合物的生物活性可例如通过细胞毒性分析测定，如在 下列实例中描述：WO 99/54440或Schlereth等人(Cancer Immunol. Immunother.20(2005),1-12)。如本文所用的，“有效性”或“体内有效性“是指 使用例如标准化的NCI反应标准的通过用本发明的药物组合物治疗的反应。 使用本发明的药物组合物治疗成功或体内有效性是指该组合物对其预定目 的的有效性，即该组合物引起其所欲的效果的能力，所述效果即，病理细胞 (例如癌细胞)的耗竭。体内有效性可通过对不同的疾病实体建立的标准方 法进行监测，所述方法包括、但不限于白血细胞计数、分类、荧光活化细胞 分选、骨髓穿刺。此外，可使用各种疾病特定临床化学参数和其他建立的标 准方法。此外，可使用计算机辅助体层摄影术、X-射线、核磁共振断层扫描 (例如，以美国国家癌症研究所标准为基础的反应评估[Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,Vose J, Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP。Report of aninternational workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin'slymphomas.NCI Sponsored International Working Group.J Clin Oncol.1999 Apr；17(4):1244])、正电子发射断层扫描、白血细胞计数、分类、荧光活化细 胞分选、骨髓穿刺、淋巴结活检/组织学和各种癌症特定临床化学参数(例如， 乳酸脱氢酶)以及其他既定的标准方法。
在开发药物(如本发明的药物组合物)中的另一项重大挑战是可预测的 药代动力学性质的调整。为此，建立了候选药物的药代动力学特征，即，影 响特定药物在给定病况下治疗能力的药代动力学参数的图谱。影响药物治疗 某个疾病实体的能力的药物药代动力学参数包括、但不限于：半衰期、分布 容量、肝首过代谢和血清结合的程度。给定药物试剂的有效性可被上面所提 到的各个参数影响。
“半衰期”是指50％的施用药物通过生物处理(例如，代谢、排泄等)而 被消除的时间。
所谓“肝首过代谢”是指药物在与肝脏第一次接触(即，其第一次穿过肝 脏的期间)而被代谢的倾向。
“分布容量”是指遍及身体的各个隔室(例如细胞内和细胞外的空间、 组织以及器官等)时药物的保留程度，以及药物在这些隔室内的分布。
“血清结合程度"是指药物与血清蛋白(如白蛋白)相互作用并结合至血 清蛋白、从而导致药物生物活性降低或丧失的倾向。
药代动力学参数还包括生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收速率、 给定量的施用药物的更多发作(onset)和/或Cmax。
“生物有效性”是指药物在血液隔室中的量。
“滞后时间"是指药物的给药和它在血液或血浆中的检出与可测性之间 的时间延迟。
“Tmax”是在此时间后药物达到最大血药浓度的时间，“Cmax”是获得的 给定药物的最大血药浓度。达到其生物效应所需的药物的血液或组织浓度的 时间受所有参数影响。显示具有跨物种特异性的双特异性单链抗体的药代动 力学参数(可在如上所列的非黑猩猩灵长类动物的临床前动物试验中测定) 也在例如Schlereth等人的刊物(CancerImmunol.Immunother.20(2005), 1-12)中提出。
如本文所用的，术语“毒性”是指在不良事件或严重的不良事件中表现的 药物的毒性效用。这些不良事件可能是指在给药之后药物的整体耐受性的缺 乏和/或局部耐受性的缺乏。毒性还可包括药物引起的畸形的或致癌作用。
如本文所用的，术语“安全性”、“体内安全性”或者“耐受性”定义在给药 之后(局部耐受性)以及在药物应用的较长期间，药物的给药没有直接地诱 发严重的不良事件。“安全性”、“体内安全性”或者“耐受性”可例如在治疗以 及后续时间段期间在规律的间隔下进行评估。测试包括临床评价(例如器官 表现)以及实验室异常的筛选。可进行临床评价，并且根据NCI-CTC和/或 MedDRA标准，可记录或编码偏离正常的结果。器官表现可包括以下标准， 如过敏/免疫、血液/骨髓、心律失常、凝血功能以及如在常见不良事件评价 标准v3.0(CTCAE)中所提出的类似标准。可被测试的实验室参数包括例如 血液学、临床化学、凝血情况与尿液分析以及其他体液如血清、血浆、淋巴 或脊髓液、液体的检查以及类似参数。因此，安全性可例如通过体检、影像 学技术即超声、x-射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、使用技术设备(如 心电图)的其他测量、生命体征，通过测量实验室参数和记录不良事件来评估。例如，根据本发明的用途和方法，非黑猩猩灵长类动物的不良事件可通 过组织病理学和/或组织化学的方法检查。
如本文所用的，术语“有效且无毒的剂量”是指如本文定义的双特异性单 链抗体的可耐受的剂量，该剂量高到足以耗竭病理细胞、肿瘤消除、肿瘤缩 小或稳定疾病而没有或基本上没有主要毒性作用。所述有效且无毒的剂量可 例如通过本领域描述的剂量递增研究测定确定并且应该低于诱发严重不良 事件的剂量(即剂量限制毒性，DLT)。
上述术语也参考例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline； ICH SteeringCommittee meeting on July 16,1997。
此外，本发明涉及用于预防、治疗或改善癌症的包含本发明的或根据本 发明的方法生产的双特异性单链抗体分子的药物组合物。优选地，所述癌症 是实体瘤(优选癌或前列腺癌)。优选地，所述药物组合物进一步包含载体、 稳定剂和/或赋形剂的适合制剂。
另一方面，本发明涉及如上述定义的或根据上述定义的方法生产的双特 异性单链抗体分子/多肽用于制备预防、治疗或改善疾病的药物组合物的用 途。优选地，所述疾病是癌症。更优选地，所述癌症是实体瘤(优选癌或前 列腺癌)。
在本发明的双特异性单链抗体分子的用途的另一个优选实施方案中，所 述药物组合物适于与另外的药物(即，作为共同疗法的一部分)组合给药。 在所述共同疗法中，活性剂可任选地与本发明的双特异性单链抗体分子包含 在相同的药物组合物中或者可被包含在分开的药物组合物中。在后一种情况 下，所述分开的药物组合物适于在所述包含本发明的双特异性单链抗体分子 的药物组合物的给药前、同时或之后给药。所述另外的药物或药物组合物可 以是非蛋白质性的化合物或蛋白质性的化合物。在所述另外的药物是蛋白质 性的化合物的情况下，有利的是该蛋白质性的化合物能够提供用于免疫效应 细胞的激活信号。
优选地，所述蛋白质性的化合物或非蛋白质性的化合物可与本发明的双 特异性单链抗体分子、如上文定义的核酸分子、如上文定义的载体或如上文 定义的宿主同时地或非同时地给药。
本发明的另一方面涉及一种用于在有此需要的受试者中预防、治疗或改 善疾病的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的药物组合物的步骤。优 选地，所述疾病是癌症。优选地，所述癌症是实体瘤(优选癌或前列腺癌)。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述药物组合物适于与另外 的药物(即，作为共同疗法的一部分)组合给药。在所述共同疗法中，活性 剂可任选地与本发明的双特异性单链抗体分子包含在相同的药物组合物中 或者可被包含在分开的药物组合物中。在后面的这种情况下，所述分开的药 物组合物适合于在所述包含本发明的双特异性单链抗体分子的药物组合物 的给药前、同时或之后给药。所述另外的药物或药物组合物可以是非蛋白质 性的化合物或蛋白质性的化合物。在所述另外的药物是蛋白质性的化合物的情况下，有利的是该蛋白质性的化合物能够提供用于免疫效应细胞的激活信 号。
优选地，所述蛋白质性的化合物或非蛋白质性的化合物可与本发明的双 特异性单链抗体分子、如上文定义的核酸分子、如上文定义的载体或如上文 定义的宿主同时地或非同时地给药。
对上述的本发明的方法优选地，所述受试者是人。
又一方面，本发明涉及含有本发明的双特异性单链抗体分子、本发明的 核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主的试剂盒。
这些以及其他实施例公开并包含于本发明的描述部分和实施例中。免疫 学的重组技术和方法描述于例如Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual；ColdSpring Harbor Laboratory Press,3rd edition 2001； Lefkovits；Immunology MethodsManual；The Comprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press,1997；Golemis；Protein-Protein Interactions:A Molecular Cloning Manual；Cold SpringLaboratory Press,2002。关于根据本发 明采用的抗体、方法、用途和化合物中任一个的其它文献可利用例如电子设 备在公共图书馆查询系统和数据库检索。例如，可利用在互联网可获得的公 共数据库“Medline”，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html 上。其他的数据库和网址，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/或者在http://www.embl.de/services/index.html上所列的EMBL服务首页，均是本领 域技术人员已知的，并且，还可使用例如http://www.google.com获得。
附图说明
图1
指定的跨物种特异性的双特异性单链构建体与用人类PSMA转染的 CHO细胞、人类CD3+T细胞株HPB-ALL、用猕猴PSMA转染的CHO 细胞以及猕猴T细胞株4119LnPx的FACS结合分析。如实施例2.1中所 述进行FACS染色。粗线代表随后用抗-his抗体和PE标记的检测抗体孵育 的用细胞培养上清液孵育的细胞。细直方图线反映阴性对照：仅用抗-his 抗体和检测抗体孵育的细胞。
其中，
图1(1)：PSMA 76-B10衍生物；
图1(2)：PSMA 76-B10衍生物；
图1(3)：PSMA 34C7衍生物；
图1(4)：PSMA 29-G1衍生物；
图2：
由重新定向到靶细胞株的指定的跨物种特异性的双特异性单链构建 体诱导的细胞毒活性。经刺激的CD4-/CD56-人类T细胞用作效应细胞，用 人类PSMA转染的CHO细胞用作靶细胞。分析如实施例2.2所述进行。
其中，
图2(1)：PSMA特异性
A)效应细胞：经刺激的人类T细胞；靶细胞：用人类PSMA转染的 CHO细胞；B)效应细胞：经刺激的人类T细胞；靶细胞：用人类PSMA 转染的CHO细胞；
图2(2)：PSMA特异性
C)效应细胞：经刺激的人类T细胞；靶细胞：用人类PSMA转染的 CHO细胞；D)效应细胞：经刺激的人类T细胞；靶细胞：用人类PSMA 转染的CHO细胞；
图2(3)：PSMA特异性
E)效应细胞：经刺激的人类T细胞；靶细胞：用人类PSMA转染的 CHO细胞；
本发明此外借助以下示例性的非限制性实施例进行描述，所述实施例 使得更好地理解本发明及其多个优点。
具体实施方式
实施例1 PSMA和CD3跨物种特异性的双特异性单链抗体分子的产 生与表征
1.1 人类PSMA抗原在CHO细胞上的克隆与表达
通过根据标准操作程序的基因合成，将人类PSMA抗原的序列 (‘AY101595’，智人前列腺特异膜抗原mRNA，完整的cds，美国国家生 物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)用于获得合成分子。 基因合成片段还被设计为含有用于构建体真核表达的Kozak位点和在 DNA的起始以及末端的限制性位点。被导入的限制性位点(在5'端的XbaI 和在3'端的SalI)在克隆步骤期间被用在Mack等人(Mack M等人,ProcNatl Acad Sci USA 1995；92:7021-5以及Raum等人Cancer Immunol Immunother(2001)50(3))描述的称为pEFDHFR的表达质粒内。在序列确 认之后，使用质粒转染CHO/dhfr-细胞，如下所述。经序列确认的质粒被 用来转染CHO/dhfr-细胞(ATCC No.CRL 9096；培养于具有获自Biochrom AG Berlin,Germany的稳定的谷氨酰胺的RPMI 1640中，所述RPMI 1640 补充有10％FCS、1％青霉素/链霉素(全部获自Biochrom AG Berlin, Germany)和来自细胞培养级试剂的母液的核苷(获自Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)(终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml 脱氧腺苷以及10μg/ml胸苷)，在培养箱(37℃、95％湿度以及7％CO2) 中)。根据制造商的操作规程，使用PolyFect转染试剂(Qiagen GmbH, Hilden,Germany)和5μg的质粒DNA进行转染。在24小时的培养后，用 PBS洗涤细胞一次，并且在上述培养基中再次培养(该培养基没有补充核 苷和经透析的FCS(获自Biochrom AG Berlin,Germany获得))。因此该细 胞培养基不含核苷并由此在经转染的细胞上进行筛选。在转染之后大约14 天，观察到抗性细胞生长。在另外7至14天后，转染子经由FACS测试 呈阳性即表达构建体。在DHFR缺乏的CHO细胞中真核生物的蛋白质表 达如由Kaufmann RJ(1990)Methods Enzymol.185,537-566描述地进行。 构建体的基因扩增通过增加甲氨喋呤(MTX)的浓度至高达20nM MTX 的最终浓度而被诱导。
1.2 猕猴PSMA抗原在CHO细胞上的克隆与表达
猕猴PSMA(石蟹猕猴)的cDNA序列通过在来自根据标准规程制备 的猕猴前列腺的cDNA上的一组5次PCR获得。下列的反应条件：1个循 环的在94℃下历时2分钟，然后以94℃历时1分钟、52℃历时1分钟以 及72℃历时1.5分钟进行40个循环，接着进行72℃历时3分钟的最终循 环，并且使用以下引物：
·正向引物：5'-cactgtggcccaggttcgagg-3'(SEQ ID NO.213)
反向引物：5'-gacataccacacaaattcaatacgg-3'(SEQ ID NO.214)
·正向引物：5'-gctctgctcgcgccgagatgtgg-3'(SEQ ID NO.215)
反向引物：5'-acgctggacaccacctccagg-3'(SEQ ID NO.216)
·正向引物：5'-ggttctactgagtgggcagagg-3'(SEQ ID NO.217)
反向引物：5'-acttgttgtggctgcttggagc-3'(SEQ ID NO.218)
·正向引物：5'-gggtgaagtcctatccagatgg-3'(SEQ ID NO.219)
反向引物：5'-gtgctctgcctgaagcaattcc-3'(SEQ ID NO.220)
·正向引物：5'-ctcggcttcctcttcgggtgg-3'(SEQ ID NO.221)
反向引物：5'-gcatattcatttgctgggtaacctgg-3'(SEQ ID NO.222)
这些PCR产生5个重叠片段，所述片段根据标准规程使用PCR引物 进行分离和测序，并且由此提供编码猕猴PSMA的成熟蛋白质的自第3个 密码子至最后一个密码子的cDNA序列的一部分。为了产生用于表达猕猴 PSMA的构建体，提供根据标准规程的基因合成获得cDNA片段(构建体 的cDNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO.223和224)。在这个构建体中， 其后为终止密码子的成熟PSMA蛋白质的第3个氨基酸至最后一个氨基酸 的猕猴PSMA的编码序列在框架内被融合至人类PSMA蛋白质的前2个 氨基酸的编码序列。该基因合成片段还被设计为含有用于构建体的真核表 达的Kozak位点和在该含有cDNA的片段的起始以及末端的限制性位点。 被导入的限制性位点(在5'端的XbaI以及在3'端的SalI)在下列克隆操作程序中使用。基因合成片段根据标准规程经XbaI和SalI被克隆至称为 pEF-DHFR的质粒内。上述的操作程序根据标准的规程(Sambrook, Molecular Cloning；A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))进行。具有经序列 确认的核苷酸序列的克隆被转染至DHFR缺乏的CHO细胞内，以用于构 建体的真核表达。在DHFR缺乏的CHO细胞中真核生物的蛋白质表达如 由Kaufmann RJ(1990)Methods Enzymol.185,537-566描述地进行。构建 体的基因扩增通过增加甲氨喋呤(MTX)的浓度至高达20nM MTX的最 终浓度而被诱导。
实施例2
2.1 PSMA和CD3跨物种特异性的双特异性抗体的流式细胞术结合分 析
为了测试跨物种特异性的双特异性抗体构建体关于对人类和猕猴 PSMA以及对人类和猕猴CD3的结合能力的功能，进行了FACS分析。为 此，将用人类PSMA转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞 系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检查对人类抗原的结 合。通过使用产生的猕猴PSMA转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由 Fickenscher教授(Hygiene Institute,Virology,Erlangen-Nuernbe)友情提供； 公开于Knappe A等人，和Fickenscher H.,Blood 2000,95,3256-61中]测试 对猕猴抗原的结合反应性。
流式细胞术分析进行如下：
不同细胞株的200.000个细胞与50μl的经纯化的跨物种特异性的双特 异性抗体构建体的蛋白质(2μg/ml)或表达跨物种特异性的双特异性抗体 构建体的转染细胞的培养上清液在冰上孵育，历时30分钟。这些细胞在 具有2％FCS的PBS中洗涤2次，然后用鼠抗-His抗体(Penta His抗体； Qiagen；在50μl具有2％FCS的PBS中以1:20稀释)检测该构建体的结 合。洗涤之后，用被缀合至藻红素的Fcγ-特异性抗体(Dianova)(在具有 2％FCS的PBS中以1:100稀释)检测结合的抗-His抗体。未被转染的CHO 细胞的上清液用作结合至T细胞系的阴性对照。具有不相关的靶标特异性 的单链构建体用作结合至经PSMA转染的CHO细胞的阴性对照。
在FACS-Calibur设备上进行流式细胞术；CellQuest软件用于获得和 分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。FACS染色和测量荧 光强度如在CurrentProtocols in Immunology(Coligan,Kruisbeek,Margulies, Shevach and Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述地进行。
可清楚地检测到对PSMA跨物种特异性的和对人类与猕猴CD3跨物 种特异性的单链分子的双特异性结合，如图1所示。在FACS分析中，相 比于各自的阴性对照，所有构建体均显示结合至CD3和PSMA。证明了双 特异性抗体对人类和猕猴CD3以及对人类和猕猴PSMA抗原的跨物种特 异性。
2.2 PSMA和CD3跨物种特异性的双特异性单链抗体的生物活性
使用人类PSMA阳性细胞系CHO细胞，在体外细胞毒性分析中通过 铬51(51Cr)释放，分析产生的双特异性单链抗体的生物活性。作为效应 细胞，使用经刺激的人类CD4/CD56耗竭的PBMC。
经刺激的CD4/CD56耗竭的PBMC的产生如下进行：
在37℃下，用终浓度为1μg/ml的市售抗-CD3特异性抗体(例如OKT3, Othoclone)涂布皮氏培养皿(145mm直径，Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen)1小时。未结合的蛋白质通过PBS的一个洗涤步骤而被去 除。根据标准规程通过Ficoll密度梯度离心从外周血(30-50ml人类血液) 分离新鲜的PBMC。将3-5x107PBMC添加至已涂布的皮氏培养皿中的120ml的RPMI 1640中，所述RPMI 1640具有稳定的谷氨酰胺/10％ FCS/IL-2 20U/ml(Proleukin,Chiron)，并且刺激2天。在第3天，收集这 些细胞并且用RPMI 1640洗涤1次。将IL-2添加至20U/ml的最终浓度， 并且这些细胞在与上述相同的细胞培养基中再次培养1天。通过根据标准 规程耗竭CD4+T细胞和CD56+NK细胞，富集了CD8+细胞毒性T淋巴细 胞(CTL)。
用PBS清洗靶细胞2次并且在37℃下，在最终体积为100μl的具有 50％FCS的RPMI中用11.1MBq 51Cr进行标记，历时45分钟。随后用5ml RPMI洗涤这些被标记的靶细胞3次并且接着用于细胞毒性分析中。该分 析在96孔板中、在250μl总体积的具有E:T比10:1的补充的RPMI(如上 面)中进行。应用1μg/ml的跨物种特异性的双特异性单链抗体分子和其 20份3倍稀释液。分析时间是18小时，并且以在上清液中被释放的铬相 对于最大裂解(添加Triton-X)与自发裂解(无效应细胞)的差值的相对 值，测量细胞毒性。所有测量重复四次。上清液中的铬活性的测量用Wizard 3”γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。实 验数据的分析用Windows的Prism 5(5.01版,GraphPad SoftwareInc.,San Diego,California,USA)进行。如由软件所确定的，S形的剂量反应曲线典 型地具有R2值>0.90。由分析程序计算出的EC50值被用于比较生物活性。
如图2所示，所有产生的跨物种特异性的双特异性单链抗体构建体证 明了生物毒活性对抗由经刺激的人类CD4/CD56耗竭的PBMC所引发的 PSMA阳性靶细胞。
实施例3 scFv对抗各种细胞系的结合分析
3.1.在大肠杆菌中单链抗体构建体的表达
scFv分子EpCAM 4-7(WO 99/25818)、PM74-G3、PM52-H3、PM52-C3、 PM75-A10以及PM91-B6通过使用质粒pComb3H5BFlag/His表达，其中表 达构建体(例如scFv)包括Flag-标签(DYKDDDDK)和His6-标签。各个scFv 分子的质粒DNA被转化到100μl热休克感受态大肠杆菌TG1中，然后在羧 苄西林LB-琼脂上进行涂板。在用1mM IPTG诱导后，用含有VL-和VH-区段的pComb3H5BFlag/His转化的大肠杆菌产生足够数量的可溶性scFv。由 于适合的信号序列，该scFv-链被输出至细胞周质内，在该处它折叠成功能 性构象。
挑取来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落，用于细胞周质的小规 模制备并且在补充了20mM MgCl2和羧苄西林50μg/ml的SB-培养基(例如 10ml)中生长，以及在收集后再溶解于PBS(例如1ml)。通过4轮的在-70℃ 下冷冻、在37℃下解冻，细菌的外膜因为温度冲击被破坏，并且可溶性的细 胞周质蛋白(包括scFv)被释放至上清液中。在通过离心去除完整的细胞和 细胞碎片之后，收集含有抗-PSMA scFv的上清液并且用于结合至不同细胞系的测定。
3.2 单链抗体构建体对各种细胞系的流式细胞术结合分析
产生scFv分子EpCAM 4-7、PM74-G3、PM52-H3、PM52-C3、PM75-A10 以及PM91-B6的大肠杆菌克隆的细胞周质制备物被用来检验对人类PSMA 或人类EpCAM转染的细胞株的特异性结合。未被转染的CHO细胞用作阴 性对照。
关于流式细胞术，用50μl的scFv细胞周质制备物孵育2,5x105个细胞。 scFv对这些细胞的结合用在50μl具有2％FCS的PBS中的2μg/ml抗-His抗 体(Penta-His抗体，没有BSA，Qiagen GmbH，Hilden,FRG)检测。作为 第二步骤试剂，使用R-藻红素-缀和的亲和纯化的F(ab')2片段、山羊抗小鼠 IgG(特定的Fc-γ片段)(在50μl具有2％FCS的PBS(Dianova,Hamburg,FRG) 中以1:100稀释)。样品在FACSscan(BD biosciences,Heidelberg,FRG)上测量。
流式细胞术在FACS-Calibur设备上进行；CellQuest软件用于获得和分 析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。FACS染色和测量荧光强 度如在CurrentProtocols in Immunology(Coligan,Kruisbeek,Margulies, Shevach and Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述地进行。
scFv EpCAM 4-7显示出对人类EpCAM转染的CHO细胞的强结合，但 对人类PSMA转染的或未被转染的细胞无显著的结合。相比之下，scFv PM74-G3、PM52-H3、PM52-C3、PM75-A10以及PM91-B6显示出对人类 PSMA转染的CHO细胞的强结合，但没有对人类EpCAM转染的CHO细胞 或未被转染的CHO细胞的强结合(不同的scFv的细胞周质细胞提取物在被 转染的不同细胞系上的结合结果见表1)。
表1.FACS分析的结果：'+'表示结合信号，'–'表示无显著的结合信号

Claims (33)

1.一种双特异性单链抗体分子，其包含第一结合域和第二结合域，所述第一结合域为抗原相互作用位点且能够结合至人类与白鬓狨、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε(epsilon)链的表位，其中所述表位是包含在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8中的氨基酸序列的一部分且至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(QDGNE)，所述第二结合域能够结合至人类和/或非黑猩猩灵长类动物前列腺-特异性膜抗原(PSMA)，
并且所述双特异性单链抗体分子包含下列序列作为在所述第二结合域中的CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2以及CDR L3，所述序列选自：
a)SEQ ID NO:226-228的CDR H1-3以及SEQ ID NO:231-233的CDR L1-3；
b)SEQ ID NO:254-256的CDR H1-3以及SEQ ID NO:259-261的CDR L1-3；
c)SEQ ID NO:268-270的CDR H1-3以及SEQ ID NO:273-275的CDR L1-3；
d)SEQ ID NO:618-620的CDR H1-3以及SEQ ID NO:623-625的CDR L1-3；
e)SEQ ID NO:282-284的CDR H1-3以及SEQ ID NO:287-289的CDR L1-3；
f)SEQ ID NO:296-298的CDR H1-3以及SEQ ID NO:301-303的CDR L1-3；
g)SEQ ID NO:310-312的CDR H1-3以及SEQ ID NO:315-317的CDR L1-3；
h)SEQ ID NO:324-326的CDR H1-3以及SEQ ID NO:329-331的CDR L1-3；
i)SEQ ID NO:338-340的CDR H1-3以及SEQ ID NO:343-345的CDR L1-3；
j)SEQ ID NO:352-354的CDR H1-3以及SEQ ID NO:357-359的CDR L1-3；
k)SEQ ID NO:366-368的CDR H1-3以及SEQ ID NO:371-373的CDR L1-3；
l)SEQ ID NO:380-382的CDR H1-3以及SEQ ID NO:385-387的CDR L1-3。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述表位是包含在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6以及SEQ ID NO.8中的氨基酸序列的一部分且至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。
3.根据权利要求1所述的双特异性单链抗体分子，其中，所述第一或第二结合域的至少一个是CDR-移植的、人源化的或人类的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性单链抗体分子，其中，能够结合至人类与非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含VL区域，所述VL区域含有选自下列的CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3：
(a)如SEQ ID NO.27中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO.28中所示的CDR-L2以及如SEQ IDNO.29中所示的CDR-L3；
(b)如SEQ ID NO.117中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO.118中所示的CDR-L2以及如SEQID NO.119中所示的CDR-L3；以及
(c)如SEQ ID NO.153中所示的CDR-L1、如SEQ ID NO.154中所示的CDR-L2以及如SEQID NO.155中所示的CDR-L3。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性单链抗体分子，其中，能够结合至人类与非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含VH区域，所述VH区域含有选自下列的CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3：
(a)如SEQ ID NO.12中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.13中所示的CDR-H2以及如SEQ IDNO.14中所示的CDR-H3；
(b)如SEQ ID NO.30中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.31中所示的CDR-H2以及如SEQ IDNO.32中所示的CDR-H3；
(c)如SEQ ID NO.48中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.49中所示的CDR-H2以及如SEQ IDNO.50中所示的CDR-H3；
(d)如SEQ ID NO.66中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.67中所示的CDR-H2以及如SEQ IDNO.68中所示的CDR-H3；
(e)如SEQ ID NO.84中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.85中所示的CDR-H2以及如SEQ IDNO.86中所示的CDR-H3；
(f)如SEQ ID NO.102中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.103中所示的CDR-H2以及如SEQID NO.104中所示的CDR-H3；
(g)如SEQ ID NO.120中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.121中所示的CDR-H2以及如SEQID NO.122中所示的CDR-H3；
(h)如SEQ ID NO.138中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.139中所示的CDR-H2以及如SEQID NO.140中所示的CDR-H3；
(i)如SEQ ID NO.156中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.157中所示的CDR-H2以及如SEQID NO.158中所示的CDR-H3；以及
(j)如SEQ ID NO.174中所示的CDR-H1、如SEQ ID NO.175中所示的CDR-H2以及如SEQID NO.176中所示的CDR-H3。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性单链抗体分子，其中，能够结合至人类与非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含VL区域，所述VL区域选自如SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.125、SEQ ID NO.129、SEQ ID NO.161或SEQ ID NO.165中所示的VL区域。
7.根据权利要求1或3和5中任一项所述的双特异性单链抗体分子，其中，能够结合至人类与非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含VH区域，所述VH区域选自如SEQID NO.15、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.55、SEQID NO.69、SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.87、SEQ ID NO.91、SEQ ID NO.105、SEQ ID NO.109、SEQ ID NO.123、SEQ ID NO.127、SEQ ID NO.141、SEQ ID NO.145、SEQ ID NO.159、SEQ IDNO.163、SEQ ID NO.177或SEQ ID NO.181中所示的VH区域。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性单链抗体分子，其中，能够结合至人类与非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含选自下列的VL区域和VH区域：
(a)如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.21中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.15或SEQ IDNO.19中所示的VH区域；
(b)如SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.39中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.33或SEQ IDNO.37中所示的VH区域；
(c)如SEQ ID NO.53或SEQ ID NO.57中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.51或SEQ IDNO.55中所示的VH区域；
(d)如SEQ ID NO.71或SEQ ID NO.75中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.69或SEQ IDNO.73中所示的VH区域；
(e)如SEQ ID NO.89或SEQ ID NO.93中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.87或SEQ IDNO.91中所示的VH区域；
(f)如SEQ ID NO.107或SEQ ID NO.111中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.105或SEQID NO.109中所示的VH区域；
(g)如SEQ ID NO.125或SEQ ID NO.129中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.123或SEQID NO.127中所示的VH区域；
(h)如SEQ ID NO.143或SEQ ID NO.147中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.141或SEQID NO.145中所示的VH区域；
(i)如SEQ ID NO.161或SEQ ID NO.165中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.159或SEQID NO.163中所示的VH区域；以及
(j)如SEQ ID NO.179或SEQ ID NO.183中所示的VL区域以及如SEQ ID NO.177或SEQID NO.181中所示的VH区域。
9.根据权利要求8所述的双特异性单链抗体分子，其中，能够结合至人类与非黑猩猩灵长类动物CD3ε链的表位的第一结合域包含选自SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的双特异性单链抗体分子，其中，所述结合域以VH PSMA-VLPSMA-VH CD3-VL CD3或VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3的次序排列。
11.根据权利要求10所述的双特异性单链抗体分子，其中，所述双特异性单链抗体分子包含选自下列的序列：
(a)如SEQ ID NO:237、251、265、279、629、293、307、321、335、349、363、377、391、405、419、433、447、461、475、489、503、517、531、545、559、573、587、601或615中的任一个所示的氨基酸序列；以及
(b)由如SEQ ID NO:238、252、266、280、630、294、308、322、336、350、364、378、392、406、420、434、448、462、476、490、504、518、532、546、560、574、588、602或616中的任一个所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
12.一种核酸序列，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的双特异性单链抗体分子。
13.一种载体，其包含根据权利要求12所述的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的载体，其中，所述载体进一步包含可操作地连接至根据权利要求12所述的核酸序列的调节序列。
15.根据权利要求14所述的载体，其中，所述载体是表达载体。
16.一种用根据权利要求13至15中任一项所述的载体转化或转染的宿主。
17.一种用于生产根据权利要求1至11中任一项所述的双特异性单链抗体分子的方法，所述方法包括在允许表达根据权利要求1至11中任一项所述的双特异性单链抗体分子的条件下培养根据权利要求16所述的宿主，以及从培养物中回收产生的多肽。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项所述的或根据权利要求17所述的方法生产的双特异性单链抗体分子。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其用于预防、治疗或改善癌症。
20.根据权利要求1至11中任一项所述的或根据权利要求17所述的方法生产的双特异性单链抗体分子，其用于预防、治疗或改善癌症。
21.根据权利要求19所述的药物组合物或根据权利要求20所述的双特异性单链抗体分子，其中，所述癌症是实体瘤，优选癌或前列腺癌。
22.根据权利要求18、19或21所述的药物组合物或根据权利要求20或21所述的双特异性单链抗体分子，其任选地进一步包含载体、稳定剂和/或赋形剂的适合制剂。
23.根据权利要求18、19、21或22所述的药物组合物或根据权利要求20、21或22所述的双特异性单链抗体分子，其中，所述双特异性单链抗体分子或药物组合物适于与另外的药物组合给药。
24.根据权利要求23所述的药物组合物或双特异性单链抗体分子，其中，所述药物是非蛋白质性的化合物或蛋白质性的化合物。
25.根据权利要求24所述的药物组合物或双特异性单链抗体分子，其中，所述蛋白质性的化合物或非蛋白质性的化合物与根据权利要求20、21或22所述的双特异性单链抗体分子或根据权利要求18或19所述的药物组合物同时地或非同时地给药。
26.根据权利要求1至11中任一项所述的或根据权利要求17所述的方法生产的双特异性单链抗体分子在制备用于预防、治疗或改善疾病的药物组合物中的用途。
27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述疾病是癌症。
28.根据权利要求27所述的用途，其中，所述癌症是实体瘤，优选癌或前列腺癌。
29.根据权利要求26、27或28所述的用途，其中，所述药物组合物与另外的药物组合给药。
30.根据权利要求29所述的用途，其中，所述药物是非蛋白质性的化合物或蛋白质性的化合物。
31.根据权利要求30所述的用途，其中，所述蛋白质性的化合物或非蛋白质性的化合物与根据权利要求18或19所述的药物组合物同时地或非同时地给药。
32.根据权利要求26或27至31所述的用途，其中，所述受试者是人。
33.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至11中任一项所述的双特异性单链抗体分子、根据权利要求12所述的核酸分子、根据权利要求13至15中任一项所述的载体或根据权利要求16所述的宿主。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021004400A1 (zh) * 2019-07-06 2021-01-14 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种表达cd3抗体受体复合物的免疫细胞及其用途

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2352763B2 (en) * 2008-10-01 2022-09-21 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens
JP6130097B2 (ja) * 2008-10-01 2017-05-17 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰアルファ×ＣＤ３の異種間特異的二重特異性単鎖抗体
US10981998B2 (en) 2008-10-01 2021-04-20 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
KR101820535B1 (ko) * 2008-10-01 2018-01-19 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간특이적 ｐｓｍａｘｃｄ3 이중특이적 단일쇄 항체
TWI638833B (zh) 2010-11-30 2018-10-21 中外製藥股份有限公司 細胞傷害誘導治療劑
CA2833019A1 (en) 2011-04-22 2012-10-26 Emergent Product Development Seattle, Llc Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositions and methods
SG10201509588TA (en) * 2011-05-21 2015-12-30 Macrogenics Inc CD3-Binding Molecules Capable Of Binding To Human And Non-Human CD3
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3620473A1 (en) * 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
GB201303308D0 (en) * 2013-02-25 2013-04-10 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102531517B1 (ko) * 2013-07-05 2023-05-12 젠맵 에이/에스 인간화 또는 키메라 cd3 항체
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
UA120753C2 (uk) 2013-12-17 2020-02-10 Дженентек, Інк. Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
ME03666B (me) 2014-03-28 2020-10-20 Xencor Inc Bispecifična antitela koja se vezuju za cd38 i cd3
KR102568808B1 (ko) 2014-04-07 2023-08-18 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역활성화 항원 결합 분자
JP6894702B2 (ja) * 2014-05-13 2021-06-30 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子
US9212225B1 (en) 2014-07-01 2015-12-15 Amphivena Therapeutics, Inc. Bispecific CD33 and CD3 binding proteins
BR112016030740A2 (pt) 2014-07-01 2018-02-20 Pfizer Inc. diacorpos heterodiméricos biespecíficos e seus usos
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
AU2015294834B2 (en) 2014-07-31 2021-04-29 Amgen Research (Munich) Gmbh Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
EP2982693A1 (en) 2014-08-07 2016-02-10 Affimed Therapeutics AG CD3 binding domain
US20170240631A1 (en) 2014-08-08 2017-08-24 Alector Llc Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
KR20170084327A (ko) 2014-11-26 2017-07-19 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 cd38에 결합하는 이형이량체 항체
JP2018520642A (ja) * 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
KR20180002782A (ko) * 2015-05-06 2018-01-08 얀센 바이오테크 인코포레이티드 전립선 특이적 막 항원(psma) 이중특이성 결합제 및 그의 용도
WO2016182064A1 (ja) * 2015-05-13 2016-11-17 中外製薬株式会社 多重抗原結合分子融合体、医薬組成物、線状エピトープの同定方法、および多重抗原結合分子融合体の製造方法
JP2018516248A (ja) 2015-05-29 2018-06-21 アンフィヴェナ セラピューティクス，インク． 二重特異性のｃｄ３３およびｃｄ３結合タンパク質を使用する方法
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
JOP20160154B1 (ar) * 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها
US11713358B2 (en) 2015-08-28 2023-08-01 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
WO2017053469A2 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
JP7058219B2 (ja) * 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
KR20180101623A (ko) * 2016-02-03 2018-09-12 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Psma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
EA039859B1 (ru) 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
CN109641037B (zh) * 2016-04-13 2022-09-06 西安奥瑞单抗生物技术有限公司 抗psma抗体及其用途
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
CN109641049B (zh) 2016-06-21 2023-07-07 特尼奥生物股份有限公司 Cd3结合抗体
US10316088B2 (en) 2016-06-28 2019-06-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
CR20220578A (es) 2016-09-14 2023-01-17 Teneobio Inc Anticuerpos de unión a cd3
AU2017328633A1 (en) 2016-09-15 2019-03-21 Novimmune Sa Bispecific antibody display on phage surface
WO2018071500A1 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Agenus Inc. Anti-lag-3 antibodies and methods of use thereof
EP3541843A1 (en) 2016-11-15 2019-09-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
ES2955074T3 (es) 2017-02-20 2023-11-28 Dragonfly Therapeutics Inc Proteínas que se unen a HER2, NKG2D Y CD16
JP7029822B2 (ja) * 2017-03-29 2022-03-04 タイペイ・メディカル・ユニバーシティ 抗原特異的ｔ細胞及びその使用
US11427642B2 (en) 2017-06-20 2022-08-30 Teneoone, Inc. Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
JP7303126B2 (ja) 2017-06-20 2023-07-04 テネオバイオ， インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体
PT3601358T (pt) 2017-08-03 2023-08-30 Alector Llc Anticorpos anti-trem2 e métodos de uso dos mesmos
KR20200064096A (ko) 2017-10-14 2020-06-05 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 항체, 활성화 가능한 항체, 이중특이적 항체 및 이중특이적 활성화 가능한 항체 및 이들의 사용 방법
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
MX2020006322A (es) 2017-12-19 2020-09-18 Xencor Inc Proteinas de fusion il-2 fc modificadas.
AU2018392088A1 (en) 2017-12-22 2020-08-13 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD22
TW201940518A (zh) 2017-12-29 2019-10-16 美商安進公司 針對ｍｕｃ１７和ｃｄ３之雙特異性抗體構建體
BR112020016190A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Domínios variáveis de anticorpos direcionando o receptor nkg2d
CA3089287A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
CA3093330A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Novimmune Sa Anti-cd3 epsilon antibodies and methods of use thereof
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
HUE061078T2 (hu) * 2018-07-31 2023-05-28 Heidelberg Pharma Res Gmbh PSMA elleni humanizált ellenanyagok
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
US11472890B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
CN110156890B (zh) * 2019-04-09 2021-02-02 苏州大学 Semaphorin7A单克隆抗体及其在制备用于治疗炎症疾病药物方面的应用
AU2020291938A1 (en) 2019-06-14 2022-01-20 Teneobio, Inc. Multispecific heavy chain antibodies binding to CD22 and CD3
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
CA3164385A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Aptevo Research And Development Llc Formulations for protein therapeutics
US20230151102A1 (en) 2020-01-13 2023-05-18 Aptevo Research And Development Llc Methods and compositions for preventing adsorption of therapeutic proteins to drug delivery system components
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
EP4200332A1 (en) 2020-08-19 2023-06-28 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
EP4240768A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Amgen Inc. Multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity
JP2023552812A (ja) * 2020-12-09 2023-12-19 ジャナックス セラピューティクス，インク． Ｐｓｍａおよびエフェクタ細胞抗原を標的とする腫瘍活性化抗体に関連する組成物ならびに方法
US20240034806A1 (en) * 2020-12-09 2024-02-01 Janux Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to tumor activated antibodies targeting trop2 and effector cell antigens
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
WO2022234102A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Cd20 and cd22 targeting antigen-binding molecules for use in proliferative diseases
AU2022276523A1 (en) 2021-05-21 2024-01-18 Aptevo Research And Development Llc Dosing regimens for protein therapeutics
WO2023183231A1 (en) 2022-03-21 2023-09-28 Amgen Inc. Combination therapy methods with t-cell engaging molecules for treatment of prostate cancer
WO2023218027A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Amgen Research (Munich) Gmbh Multichain multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1867586A (zh) * 2003-10-16 2006-11-22 麦克罗梅特股份公司 多特异性的去免疫化cd3结合物
WO2006125481A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Universitätsklinikum Freiburg Monoclonal antibodies and single chain antibody fragments against cell-surface prostate specific membrane antigen
WO2008119565A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific binding domain
WO2009017823A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health Of Human Services, National Institutes Of Health A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
JP3626187B2 (ja) 1993-06-07 2005-03-02 バイカル インコーポレイテッド 遺伝子治療に適するプラスミド
WO1997000957A1 (en) 1995-06-23 1997-01-09 President And Fellows Of Harvard College Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
DK1032660T3 (da) 1997-11-17 2010-01-18 Micromet Ag Fremgangsmåde til identivicering af bindingsstedsdominans som bevarer evnen til at binde til en epitop
KR100508289B1 (ko) 1998-04-21 2005-08-17 마이크로메트 에이지 Ｃｄ１９×ｃｄ３ 특이 폴리펩티드 및 그의 용도
RU2179862C1 (ru) * 2000-12-26 2002-02-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "МедБиоСпектр" Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата, моноклональное антитело к cd3-антигену т-лимфоцитов человека, гибридома и способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки
SI1629011T1 (sl) 2003-05-31 2010-05-31 Micromet Ag Humane molekule za vezavo anti hu cd
BRPI0511782B8 (pt) 2004-06-03 2021-05-25 Novimmune Sa anticorpos anti-cd3, uso e método de produção dos mesmos, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada e vetor
KR20070115967A (ko) 2005-02-18 2007-12-06 메다렉스, 인코포레이티드 전립선 특이 막 항원(ｐｓｍａ)에 대한 인간 모노클로날항체
AU2006291005A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Novimmune S.A. Anti-CD3 antibody formulations
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
AU2006315500A1 (en) * 2005-11-14 2007-05-24 Psma Development Company, Llc. Compositions of and methods of using stabilized PSMA dimers
KR101626988B1 (ko) * 2007-04-03 2016-06-02 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 이중특이적인 결합제들
WO2008119567A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
JP4970211B2 (ja) * 2007-10-18 2012-07-04 ヘキサゴン・メトロジー株式会社 ３次元形状測定器
JP6130097B2 (ja) 2008-10-01 2017-05-17 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー ＰＳＣＡ×ＣＤ３、ＣＤ１９×ＣＤ３、Ｃ−ＭＥＴ×ＣＤ３、エンドシアリン×ＣＤ３、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＩＧＦ−１Ｒ×ＣＤ３、またはＦＡＰアルファ×ＣＤ３の異種間特異的二重特異性単鎖抗体
US10981998B2 (en) * 2008-10-01 2021-04-20 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
KR101820535B1 (ko) 2008-10-01 2018-01-19 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간특이적 ｐｓｍａｘｃｄ3 이중특이적 단일쇄 항체
EP2352763B2 (en) 2008-10-01 2022-09-21 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1867586A (zh) * 2003-10-16 2006-11-22 麦克罗梅特股份公司 多特异性的去免疫化cd3结合物
WO2006125481A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-30 Universitätsklinikum Freiburg Monoclonal antibodies and single chain antibody fragments against cell-surface prostate specific membrane antigen
WO2008119565A2 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific binding domain
WO2009017823A2 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health Of Human Services, National Institutes Of Health A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
P.BUHLER等: "A bispecific diabody directed against prostate-specific membrane antigen and CD3 induces T-cell mediated lysis of prostate cancer cells", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER》 *
PATRICK BUHLER等: "Target-dependent T-cell Activation by Coligation with a PSMA×CD3 Diabody Induces Lysis of Prostate Cancer Cells", 《JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021004400A1 (zh) * 2019-07-06 2021-01-14 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种表达cd3抗体受体复合物的免疫细胞及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012024964A2 (pt) 2017-07-18
IL222197A0 (en) 2012-12-31
TW201134942A (en) 2011-10-16
JP6153862B2 (ja) 2017-06-28
AU2011234443A1 (en) 2012-09-27
EP2552964A1 (en) 2013-02-06
EP2552964B1 (en) 2019-10-02
MX348360B (es) 2017-06-07
CA2793139A1 (en) 2011-10-06
KR20130088013A (ko) 2013-08-07
AR080868A1 (es) 2012-05-16
TWI653333B (zh) 2019-03-11
JP2013528569A (ja) 2013-07-11
RU2012143519A (ru) 2014-05-10
MX2012011405A (es) 2013-01-29
AU2011234443B2 (en) 2014-05-22
CN103025759A (zh) 2013-04-03
RU2617942C2 (ru) 2017-04-28
NZ602209A (en) 2014-08-29
BR112012024964B1 (pt) 2021-05-25
WO2011121110A1 (en) 2011-10-06
SG183937A1 (en) 2012-10-30
US20130129730A1 (en) 2013-05-23
KR101799922B1 (ko) 2017-11-21
CA2793139C (en) 2023-08-08
ZA201206572B (en) 2019-10-30
US9587036B2 (en) 2017-03-07

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