CN117222663A

CN117222663A - 使用结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN117222663A
Application number: CN202280031428.5A
Authority: CN
Inventors: 让-玛丽·库勒洛特; 马克·帝罗士; 克里斯托弗·瑞安·摩根; 迈克尔·C·奈尔; 阿夫尼·沙阿
Original assignee: Dragonfly Therapy Co ltd
Current assignee: Dragonfly Therapy Co ltd
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2022-03-03
Publication date: 2023-12-12
Also published as: WO2022187539A1; US20230034186A1; EP4301774A1; JP2024508894A

Abstract

本公开涉及使用结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原如HER2的多特异性结合蛋白治疗癌症的方法。提供了所述多特异性结合蛋白与皮质类固醇的联合使用以降低输注相关反应的风险。还提供了所述多特异性结合蛋白在治疗具有低或中等HER2表达水平的癌症中的用途。本公开还涉及包含所述多特异性结合蛋白的药物制剂。

Description

使用结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白治疗癌症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年3月3日提交的美国临时专利申请号63/156,214的权益和优先权，该申请的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式以电子方式提交并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2022年2月28日，名为DFY-103WO_SL.txt，大小为194,985字节。

技术领域

本公开涉及使用结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原如HER2的多特异性结合蛋白治疗癌症的方法。在一个方面，所述多特异性结合蛋白与皮质类固醇联合使用以降低输注相关反应的风险。在另一个方面，使用所述多特异性结合蛋白来治疗具有低或中等HER2表达水平的癌症。本公开还涉及含有所述多特异性结合蛋白的药物制剂。

背景技术

尽管文献中报道了治疗癌症的大量研究工作和科学进展，但癌症仍然是一个重大的健康问题。正在开发癌症免疫疗法以利用患者自身的免疫系统来促进癌细胞的破坏。癌症免疫疗法激活的免疫细胞包括T细胞和自然杀伤(NK)细胞。例如，双特异性T细胞接合剂设计为引导T细胞贴靠肿瘤细胞，从而对肿瘤细胞产生细胞毒性。还已创建了结合NK细胞和肿瘤相关抗原(TAA)的双特异性抗体用于癌症治疗(参见例如WO 2016/134371)。

HER2是表皮生长因子受体家族中的跨膜糖蛋白。它是一种受体酪氨酸激酶，调节细胞存活、增殖和生长。HER2在人类恶性肿瘤中起重要作用。ERBB2基因在大约30％的人类乳癌中扩增或过表达。HER2过表达的乳癌患者的总生存率大大低于其癌症不过表达HER2的患者并且无病间隔更短。而且，HER2的过表达会导致乳癌转移的增加。还已知HER2的过表达发生在许多其他癌症类型中，包括卵巢癌、食管癌、膀胱和胃癌、唾液管癌、肺腺癌和侵袭形式的子宫癌如子宫浆液性子宫内膜癌。

已经研究了结合HER2和一种或多种免疫细胞表面蛋白的多特异性结合蛋白。例如，WO 2018/152518描述了结合HER2、NKG2D和CD16的多特异性结合蛋白。本公开在这些发展的基础上更进了一步并提供了用特定的HER2-靶向癌症免疫疗法治疗患者的临床方法，包括给药方案，具有期望的安全性和疗效。此外，本公开通过提供含有足够稳定且适合施用于患者的此类癌症免疫疗法的制剂而在本领域的早期发展基础上更进了一步。

发明内容

在各种实施方案中，本公开提供了使用多特异性结合蛋白治疗癌症的方法，所述多特异性结合蛋白具有结合肿瘤相关抗原如HER2的抗原结合位点、结合NKG2D的抗原结合位点和抗体Fc结构域。所述多特异性结合蛋白可与皮质类固醇联合使用以降低输注相关反应的风险。或者，所述多特异性结合蛋白可如本文所公开以高浓度配制成小体积，从而允许皮下施用并降低输注相关反应的风险。所述多特异性结合蛋白还可用于治疗具有低或中等HER2表达水平的癌症。

因此，在一个方面，本文提供了一种通过向有此需要的受试者施用治疗有效量的多特异性结合蛋白和治疗有效量的皮质类固醇以减少对多特异性结合蛋白的输注相关反应来治疗癌症的方法。所述多特异性结合蛋白并入：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和(c)结合CD16的第三抗原结合位点。在一些实施方案中，输注相关反应包括细胞因子释放综合征、过敏反应、发冷、发烧/发热、低血压、高血压、僵直、头痛、头晕、瘙痒、喉咙痛、喉头水肿、血管性水肿、发红/潮红、皮疹/荨麻疹、支气管痉挛、心动过速、心动过缓、心房纤颤、缺氧、呼吸窘迫/呼吸困难/呼吸短促/喘不过气的感觉、胸闷、恶心、呕吐、疼痛(例如，胸痛、背痛)、颤抖、震颤、肌痛、疲倦、失眠、虚弱、超敏反应和/或腹泻。在一些实施方案中，皮质类固醇为糖皮质激素。在一些实施方案中，糖皮质激素选自甲基泼尼松龙、地塞米松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、氟替卡松、氟米松、氟轻松、布地奈德、倍氯米松、环索奈德、可的松、去炎松、倍他米松、地夫可特、二氟泼尼酯、氯替泼诺、帕拉米松、替可的松或任何其的药学上可接受的盐。在特别的实施方案中，糖皮质激素为甲基泼尼松龙。在一些实施方案中，甲基泼尼松龙的有效量为125mg。在其他特别的实施方案中，糖皮质激素为地塞米松。

在一些实施方案中，皮质类固醇肠胃外施用。在一些实施方案中，皮质类固醇静脉内施用。在一些实施方案中，皮质类固醇经口施用。在一些实施方案中，皮质类固醇在多特异性结合蛋白的施用之前施用。在一些实施方案中，皮质类固醇在多特异性结合蛋白的施用之前6小时内施用。在一些实施方案中，皮质类固醇在多特异性结合蛋白的施用之前1小时内施用。

在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的抗组胺药。在一些实施方案中，抗组胺药为苯海拉明。在一些实施方案中，苯海拉明的治疗有效量为40–50mg。在一些实施方案中，抗组胺药静脉内施用。在一些实施方案中，抗组胺药在多特异性结合蛋白的施用之前60分钟内或30分钟内施用。

在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的退烧药。在一些实施方案中，退烧药为对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，对乙酰氨基酚的治疗有效量为800-1000mg。在一些实施方案中，退烧药静脉内施用。在一些实施方案中，退烧药在多特异性结合蛋白的施用之前60分钟内或30分钟内施用。

在一些实施方案中，肿瘤相关抗原为HER2。在一些实施方案中，癌症的HER2表达水平评分为1+或2+。

在另一个方面，本公开提供了一种通过向有此需要的受试者施用治疗有效量的多特异性结合蛋白来治疗HER2表达水平评分为1+的癌症的方法。所述多特异性结合蛋白并入：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

在另一个方面，本公开提供了一种通过向有此需要的受试者施用治疗有效量的多特异性结合蛋白来治疗HER2表达水平评分为2+的癌症的方法。所述多特异性结合蛋白并入：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

在一些实施方案中，癌症为实体瘤。在一些实施方案中，癌症为局部晚期或转移性实体瘤。在一些实施方案中，癌症选自乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌或胆囊癌。在特别的实施方案中，癌症为尿路上皮膀胱癌或转移性乳癌。

在一些实施方案中，在初始四周治疗周期中于第1天、第8天和第15天向受试者施用多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，在第22天不施用多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括在初始治疗周期之后的一个或多个后续四周治疗周期中的每一个中于第1天和第15天向受试者施用多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，每一剂包含选自5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^-3mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^-2mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1.0mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或50mg/kg的量的多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，通过静脉内输注施用多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，皮下施用多特异性结合蛋白。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白作为单一疗法使用。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用抗-PD-1抗体。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体为派姆单抗。在一些实施方案中，在初始治疗周期的第1天施用200mg派姆单抗。在一些实施方案中，如果受试者接受一个或多个后续治疗周期，则在后续治疗周期中每三周施用一次200mg派姆单抗。

在一些实施方案中，在初始四周周期的第1天向受试者施用皮质类固醇。在一些实施方案中，在初始四周周期的第1天向受试者施用抗组胺药。在一些实施方案中，在初始四周周期的第1天向受试者施用镇痛剂。

在一些实施方案中，将多特异性结合蛋白配制在包含组氨酸、糖或糖醇和聚山梨醇酯的药物组合物中，pH为5.5至6.5。在一些实施方案中，药物组合物包含大于50mg/mL的多特异性结合蛋白。

在另一个方面，本公开提供了一种通过向有此需要的受试者施用药物组合物来治疗癌症的方法，所述药物组合物包含：(i)大于50mg/mL的多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白并入(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点，(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点，和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点；(ii)组氨酸；(iii)糖或糖醇；和(iv)聚山梨醇酯，pH为5.5至6.5。

在另一个方面，本公开提供了一种通过向有此需要的受试者施用以下药物来治疗HER2表达水平评分为1+的癌症的方法：(i)包含以下的药物组合物：大于50mg/mL的多特异性结合蛋白、组氨酸、糖或糖醇、和聚山梨醇酯，pH为5.5至6.5，以及(ii)治疗有效量的皮质类固醇以减少对多特异性结合蛋白的一种或多种输注相关反应。所述多特异性结合蛋白并入：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

在另一个方面，本公开提供了一种通过向有此需要的受试者施用以下药物来治疗HER2表达水平评分为2+的癌症的方法：(i)含有大于50mg/mL的多特异性结合蛋白、组氨酸、糖或糖醇、和聚山梨醇酯的药物组合物，pH为5.5至6.5；以及(ii)治疗有效量的皮质类固醇以减少对多特异性结合蛋白的一种或多种输注相关反应。所述多特异性结合蛋白并入：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

在某些实施方案中，癌症为实体瘤。在某些实施方案中，癌症为局部晚期或转移性实体瘤。在某些实施方案中，癌症为乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌或胆囊癌。在某些实施方案中，癌症为尿路上皮膀胱癌或转移性乳癌。

在某些实施方案中，在初始四周治疗周期中于第1天、第8天和第15天向受试者施用药物组合物。在某些实施方案中，在第22天不施用药物组合物。在某些实施方案中，所述方法还包括在初始治疗周期之后的一个或多个后续四周治疗周期中的每一个中于第1天和第15天向受试者施用药物组合物。

在某些实施方案中，药物组合物的每个施用剂量包括施用选自5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^-3mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^-2mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1.0mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或50mg/kg的量的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，通过静脉内输注施用药物组合物。在某些实施方案中，皮下施用多特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，药物组合物作为单一疗法使用。

在其他实施方案中，所述方法还包括向受试者施用抗-PD-1抗体。在某些实施方案中，抗-PD-1抗体为派姆单抗。在某些实施方案中，在初始治疗周期的第1天施用200mg派姆单抗。在某些实施方案中，如果受试者接受一个或多个后续治疗周期，则在后续治疗周期中每三周施用一次200mg派姆单抗。

在某些实施方案中，在初始四周周期的第1天向受试者施用皮质类固醇。在某些实施方案中，在初始四周周期的第1天向受试者施用抗组胺药。在某些实施方案中，在初始四周周期的第1天向受试者施用退烧药。

在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其含有大于50mg/mL的多特异性结合蛋白组氨酸、糖或糖醇、和聚山梨醇酯，pH为5.5至6.5。所述多特异性结合蛋白并入(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

在前述药物组合物或使用药物组合物的方法中的任一项的一些实施方案中，所述药物组合物含有大于或等于60mg/mL、大于或等于70mg/mL、大于或等于80mg/mL、大于或等于90mg/mL、大于或等于100mg/mL、大于或等于125mg/mL、大于或等于150mg/mL、大于或等于175mg/mL、或大于或等于200mg/mL的多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物含有60-250mg/mL、60-225mg/mL、60-200mg/mL、60-175mg/mL、50-150mg/mL、60-150mg/mL、60-125mg/mL、60-100mg/mL、60-90mg/mL、60-80mg/mL、60-70mg/mL、70-250mg/mL、70-225mg/mL、70-200mg/mL、70-175mg/mL、70-150mg/mL、70-150mg/mL、70-125mg/mL、70-100mg/mL、70-90mg/mL、70-80mg/mL、80-250mg/mL、80-225mg/mL、80-200mg/mL、80-175mg/mL、80-150mg/mL、80-150mg/mL、80-125mg/mL、80-100mg/mL、80-90mg/mL、90-250mg/mL、90-225mg/mL、90-200mg/mL、90-175mg/mL、90-150mg/mL、90-150mg/mL、90-125mg/mL、90-100mg/mL、100-250mg/mL、100-225mg/mL、100-200mg/mL、100-175mg/mL、100-150mg/mL、100-125mg/mL、125-250mg/mL、125-225mg/mL、125-200mg/mL、125-175mg/mL、125-150mg/mL、150-250mg/mL、150-225mg/mL、150-200mg/mL、150-175mg/mL、175-250mg/mL、175-225mg/mL、175-200mg/mL、200-250mg/mL、或200-225mg/mL的多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物含有60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、或220mg/mL的多特异性结合蛋白。

在一些实施方案中，药物组合物的pH为5.8至6.2。在一些实施方案中，药物组合物的pH为5.95至6.05。在一些实施方案中，药物组合物中组氨酸的浓度为10至25mM。在一些实施方案中，药物组合物中组氨酸的浓度为约20mM。

在一些实施方案中，糖为糖醇为二糖。在一些实施方案中，二糖为蔗糖。在一些实施方案中，糖或糖醇为衍生自单糖的糖醇。在一些实施方案中，衍生自单糖的糖醇为山梨糖醇。在一些实施方案中，药物组合物中糖或糖醇的浓度为200至300mM。在一些实施方案中，药物制剂中糖或糖醇的浓度为约250mM。

在一些实施方案中，聚山梨醇酯为聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，药物组合物中聚山梨醇酯80的浓度为0.005％(w/v)至0.05％(w/v)。在一些实施方案中，药物组合物中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)。在一些实施方案中，如果有的话，药物制剂中NaCl的浓度为约10mM或更低。在一些实施方案中，如果有的话，药物制剂中NaCl的浓度为约1mM或更低。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点包括具有分别由SEQ ID NO:168、96和188的氨基酸序列表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域以及具有分别由SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域具有分别由SEQID NO:168、96和169的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；轻链可变结构域具有分别由SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在一些实施方案中，第一抗原结合位点的重链可变结构域具有与SEQ ID NO:94至少90％相同的氨基酸序列，轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:98至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原结合位点的重链可变结构域具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列，轻链可变结构域具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合NKG2D的第一抗原结合位点为Fab。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点包括具有分别由SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域以及具有分别由SEQ ID NO:119、120和121的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点的重链可变结构域具有与SEQ ID NO:195至少90％相同的氨基酸序列，第二抗原结合位点的轻链可变结构域具有与SEQ ID NO:196至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原结合位点的重链可变结构域具有SEQ ID NO:195的氨基酸序列，第二抗原结合位点的轻链可变结构域具有SEQ ID NO:196的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点为scFv。在一些实施方案中，第二抗原结合位点的轻链可变结构域经由柔性接头连接至第二抗原结合位点的重链可变结构域。在一些实施方案中，柔性接头具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第二抗原结合位点的轻链可变结构域位于第二抗原结合位点的重链可变结构域的N-末端。在一些实施方案中，第二抗原结合位点的重链可变结构域与第二抗原结合位点的轻链可变结构域形成二硫桥。在一些实施方案中，二硫桥在重链可变结构域的C44与轻链可变结构域的C100之间形成，氨基酸位置根据Kabat编号。在一些实施方案中，通过在重链可变结构域的位置44和轻链可变结构域的位置100处将野生型残基突变为半胱氨酸残基来在这些位置处引入半胱氨酸残基。在一些实施方案中，scFv具有SEQID NO:139的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白包括抗体Fc结构域。在一些实施方案中，抗体Fc结构域包括连接至第一抗原结合位点的第一抗体Fc多肽和连接至第二抗原结合位点的第二抗体Fc多肽。在一些实施方案中，第一抗体Fc多肽连接至第一抗原结合位点的重链部分。在一些实施方案中，第二抗原结合位点经由包括Ala-Ser的铰链连接至第二抗体Fc多肽。在一些实施方案中，第一和第二抗体Fc多肽各自包括人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。在一些实施方案中，第一和第二抗体Fc多肽各自具有与野生型人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二抗体Fc多肽并入促进异源二聚化的不同突变。在一些实施方案中，第一抗体Fc多肽为具有K360E和K409W置换的人IgG1 Fc序列。在一些实施方案中，第二抗体Fc多肽为具有Q347R、D399V和F405T置换的人IgG1 Fc序列。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白结合HER2并包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的第一多肽、具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第二多肽和具有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的第三多肽。

在另一个方面，本公开提供了一种通过向有此需要的受试者施用多特异性结合蛋白来治疗受试者的HER2-过表达胃癌的方法。所述多特异性结合蛋白并入：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

在某些实施方案中，所述胃癌为晚期胃癌或胃食管连接部癌症。在某些实施方案中，受试者先前接受过第一线治疗。在某些实施方案中，第一线治疗包括铂盐和氟吡啶与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗生物类似物联用。在某些实施方案中，受试者在第一线治疗后出现进展。在某些实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为3+的HER2表达水平。在其他实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为2+的HER2表达水平和HER2基因扩增(例如，通过原位杂交测得)。

在某些实施方案中，治疗胃癌的方法还包括向受试者施用抗-PD-1抗体。在某些实施方案中，抗-PD-1抗体为纳武单抗。在某些实施方案中，纳武单抗以120至600mg的剂量施用于受试者。在某些实施方案中，纳武单抗以480mg的剂量施用于受试者。在某些实施方案中，纳武单抗每四周施用一次。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白在一个或多个四周治疗周期中施用，并在相同治疗周期的第1天施用纳武单抗。在某些实施方案中，纳武单抗通过静脉内输注施用于受试者。

在某些实施方案中，治疗胃癌的方法还包括向受试者施用细胞骨架破坏化疗剂。在某些实施方案中，细胞骨架破坏化疗剂为白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，白蛋白结合型紫杉醇以50至300mg/m²的剂量施用于受试者。在某些实施方案中，白蛋白结合型紫杉醇以100mg/m²的剂量施用于受试者。在某些实施方案中，白蛋白结合型紫杉醇每四周施用三次。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白在一个或多个四周治疗周期中施用，并在相同治疗周期的第1天、第8天和第15天施用白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，在治疗周期的第22天不施用白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，白蛋白结合型紫杉醇通过静脉内输注施用于受试者。

在另一个方面，本公开提供了一种通过向有此需要的受试者施用多特异性结合蛋白来治疗受试者的三阴性乳癌的方法。所述多特异性结合蛋白并入：(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

在某些实施方案中，受试者不符合与抗-PD-L1疗法联合治疗的条件或者受试者的癌症是PD-L1阴性的。在某些实施方案中，受试者(a)在针对转移性疾病的联合化疗失败或辅助化疗6个月内复发后符合用白蛋白结合型紫杉醇治疗的条件；(b)患有无标准疗法或标准疗法已对其失败的癌症；或(c)患有晚期、任选地不可切除、复发性或转移性三阴性乳癌。在某些实施方案中，三阴性乳癌具有如根据免疫组织化学测量低于10的PD-L1评分(CPS)。在某些实施方案中，三阴性乳癌是转移性的或局部晚期的。在某些实施方案中，受试者先前未接受过化疗或靶向全身治疗。

在治疗胃癌或三阴性乳癌的方法的某些实施方案中，在初始治疗周期的第1天、第8天和第15天施用多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，在初始治疗周期的第22天不施用多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，在初始治疗周期之后，在一个或多个后续四周治疗周期的第1天和第15天施用多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，在每一剂中，多特异性结合蛋白以选自5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^-3mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^-2mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1.0mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和50mg/kg的量施用。在某些实施方案中，通过静脉内输注施用多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白作为单一疗法使用。

在某些实施方案中，第一抗原结合位点采取具有重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的Fab的格式。Fab的VH具有分别由SEQ ID NO:168、96和188的氨基酸序列表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列。Fab的VL具有分别由SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方案中，Fab的VH具有分别由SEQ ID NO:168、96和169的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方案中，Fab的VL具有分别由SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方案中，Fab的VH具有与SEQ ID NO:94至少90％相同的氨基酸序列，并且Fab的VL具有与SEQ ID NO:98至少90％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fab的VH具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列，并且Fab的VL具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第二抗原结合位点采取具有VH和VL的单链可变片段(scFv)的格式。scFv的VH具有分别由SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。scFv的VL具有分别由SEQ ID NO:119、120和121的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方案中，scFv的VH具有与SEQ ID NO:195至少90％相同的氨基酸序列，并且scFv的VL具有与SEQ ID NO:196至少90％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，scFv的VH具有SEQ ID NO:195的氨基酸序列，并且scFv的VL具有SEQ ID NO:196的氨基酸序列。在某些实施方案中，scFv的VL经由柔性接头连接至scFv的VH，例如，具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的柔性接头。在某些实施方案中，scFv的VL位于scFv的VH的N-末端。在某些实施方案中，scFv的VH与scFv的VL形成二硫桥，例如，在VH的C44与VL的C100之间形成二硫桥。在某些实施方案中，scFv具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列。

在某些实施方案中，抗体Fc结构域包括连接至Fab的第一抗体Fc序列和连接至scFv的第二抗体Fc序列。在某些实施方案中，第一抗体Fc序列连接至Fab的重链部分。在某些实施方案中，scFv经由具有氨基酸序列Ala-Ser的铰链连接至第二抗体Fc序列。在某些实施方案中，第一和第二抗体Fc序列各自具有人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。在某些实施方案中，第一和第二抗体Fc序列各自具有与野生型人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一和第二抗体Fc序列具有促进异源二聚化的不同突变。例如，在某些实施方案中，第一抗体Fc序列为并入K360E和K409W置换的人IgG1 Fc序列，和/或第二抗体Fc序列为并入Q347R、D399V和F405T置换的人IgG1 Fc序列。

在某些实施方案中，多特异性结合蛋白包含(a)具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的第一多肽、(b)具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第二多肽和(c)具有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的第三多肽。

在某些实施方案中，多特异性结合蛋白在施用之前已以10mg/mL至50mg/mL的浓度配制在药物组合物中。在某些实施方案中，药物组合物含有10mg/mL至25mg/mL的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物含有约15mg/mL的多特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，药物组合物具有在5.5至6.5的范围内的pH，例如，约6.0的pH。在某些实施方案中，药物组合物含有5至50mM的组氨酸。在某些实施方案中，药物组合物含有10至25mM的组氨酸。在某些实施方案中，药物组合物含有约20mM的组氨酸。

在某些实施方案中，药物组合物含有50至300mM的糖或糖醇(例如，蔗糖)。在某些实施方案中，药物组合物含有150至300mM的糖或糖醇。在某些实施方案中，药物组合物含有约250mM的糖或糖醇。

在某些实施方案中，药物组合物含有0.005％至0.05％mM(w/v)的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯-80)。在某些实施方案中，药物组合物含有0.005％至0.02％mM(w/v)的聚山梨醇酯。在某些实施方案中，药物组合物含有约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯。

在某些实施方案中，药物组合物含有(i)10mg/mL至50mg/mL的多特异性结合蛋白、(ii)5mM至50mM的组氨酸、(iii)50mM至300mM的蔗糖和(iv)0.005％至0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物含有(i)10mg/mL至25mg/mL的多特异性结合蛋白、(ii)10mM至25mM的组氨酸、(iii)150mM至300mM的蔗糖和(iv)0.005％至0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物含有(i)约15mg/mL的多特异性结合蛋白、(ii)约20mM的组氨酸、(iii)约250mM的蔗糖和(iv)约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯80，pH为约6.0。

下面呈现本公开的其他实施方案和细节。

附图说明

图1为异源二聚多特异性抗体例如三特异性结合蛋白(TriNKET)的图示。每个臂可以代表NKG2D结合结构域或肿瘤相关抗原结合结构域。在一些实施方案中，NKG2D结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域可以共享共同的轻链。

图2A-2E示意了多特异性结合蛋白例如三特异性结合蛋白(TriNKET)的五种示例性格式。如图2A中所示，NKG2D结合结构域或肿瘤相关抗原结合结构域可以采取scFv格式(左臂)。含有NKG2D靶向scFv、肿瘤相关抗原靶向Fab片段和异源二聚化抗体恒定区的抗体在本文中称为F3-TriNKET。含有肿瘤相关抗原靶向scFv、NKG2D靶向Fab片段和结合CD16的异源二聚化抗体恒定区/结构域的抗体在本文中称为F3’-TriNKET(图2E)。如图2B中所示，NKG2D结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域都可以采取scFv格式。图2C至2D为具有三个抗原结合位点的抗体的示意，包括两个结合肿瘤相关抗原的抗原结合位点和融合到异源二聚化抗体恒定区的NKG2D结合位点。这些抗体格式在本文中称为F4-TriNKET。图2C示意两个肿瘤相关抗原结合位点呈Fab片段格式，并且NKG2D结合位点呈scFv格式。图2D示意肿瘤相关抗原结合位点呈scFv格式，并且NKG2D结合位点呈scFv格式。图2E代表三特异性抗体(TriNKET)，其含有肿瘤相关抗原靶向scFv、NKG2D靶向Fab片段和结合CD16的异源二聚化抗体恒定区/结构域(“CD结构域”)。这种抗体格式在本文中称为F3’-TriNKET。在某些示例性多特异性结合蛋白中，抗体恒定区上的异源二聚化突变包括一个恒定结构域上的K360E和K409W；以及对面的恒定结构域上的Q347R、D399V和F405T(在CD结构域中示出为三角形锁与钥匙形状)。Fab片段的重链和轻链可变结构域之间的加粗条代表二硫键。

图3为Triomab形式的TriNKET的图示，它是一种维持IgG样形状的三功能双特异性抗体。该嵌合体由源自于两个亲本抗体的两个半抗体组成，每个半抗体具有一条轻链和一条重链。Triomab形式可以是含有1/2的大鼠抗体和1/2的小鼠抗体的异源二聚构建体。

图4为呈KiH共同轻链形式的TriNKET的图示，其涉及杵臼结构(KIH)技术。KiH是一种异源二聚体，含有2个与靶标1和2结合的Fab片段以及通过异源二聚化突变稳定的Fc结构域。呈KiH格式的TriNKET可以是具有2个与靶标1和靶标2结合的Fab片段的异源二聚构建体，含有两条不同的重链和与两条重链配对的一条共同的轻链。

图5为呈双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig^TM)形式的TriNKET的图示，其将两个单克隆抗体的靶标结合结构域经由柔性的天然存在的接头结合，并产生四价IgG样分子。DVD-Ig^TM为同源二聚构建体，其中靶向抗原2的可变结构域融合到靶向抗原1的Fab片段的可变结构域的N-末端。DVD-Ig^TM形式含有正常的Fc结构域。

图6为呈正交Fab片段界面(Ortho-Fab)形式的TriNKET的图示，其为含有2个融合到Fc的与靶标1和靶标2结合的Fab片段的异源二聚构建体。轻链(LC)-重链(HC)配对通过正交界面来确保。异源二聚化通过Fc结构域中的突变来确保。

图7为呈二合一Ig格式的TriNKET的图示。

图8为呈ES形式的TriNKET的图示，其为含有两个融合到Fc结构域的与靶标1和靶标2结合的不同Fab片段的异源二聚构建体。异源二聚化通过Fc结构域中的静电转向突变来确保。

图9为呈Fab臂交换形式的TriNKET的图示：通过将重链和附连的轻链(半分子)与来自于另一个分子的重链-轻链对交换来交换Fab片段臂从而产生双特异性抗体的抗体。Fab臂交换形式(cFae)是一种异源二聚体，含有2个与靶标1和2结合的Fab片段以及通过异源二聚化突变稳定的Fc结构域。

图10为呈SEED体形式的TriNKET的图示，其是一种异源二聚体，含有2个与靶标1和2结合的Fab片段以及通过异源二聚化突变稳定的Fc结构域。

图11为呈LuZ-Y形式的TriNKET的图示，其中使用亮氨酸拉链来诱导两个不同HC的异源二聚化。LuZ-Y形式为含有两个融合到Fc结构域的与靶标1和2结合的不同scFab的异源二聚体。异源二聚化通过融合到Fc结构域的C-末端的亮氨酸拉链基序来确保。

图12为呈Cov-X体形式的TriNKET的图示。

图13A-13B为呈Kλ体形式的TriNKET的图示，其为具有两个融合到通过异源二聚化突变稳定的Fc结构域的不同Fab片段的异源二聚构建体：靶向抗原1的一个Fab片段含有KLC，而靶向抗原2的第二个Fab片段含有λLC。图13A为Kλ体的一种形式的示例性图示；图13B为另一Kλ体的示例性图示。

图14为Oasc-Fab异源二聚构建体的图示，其包括与靶标1结合的Fab片段和与靶标2结合的scFab，二者均融合到Fc结构域。异源二聚化通过Fc结构域中的突变来确保。

图15为DuetMab的图示，其是一种异源二聚构建体，含有两个与抗原1和2结合的不同Fab片段以及通过异源二聚化突变稳定的Fc结构域。Fab片段1和2含有不同的S-S桥，其确保正确的轻链和重链配对。

图16为CrossmAb的图示，其是一种异源二聚构建体，具有两个与靶标1和2结合的不同Fab片段以及通过异源二聚化突变稳定的Fc结构域。CL和CH1结构域与VH和VL结构域被调换，例如CH1与VL内联融合，而CL与VH内联融合。

图17为Fit-Ig的图示，其是一种同源二聚构建体，其中与抗原2结合的Fab片段融合到与抗原1结合的Fab片段的HC的N-末端。该构建体含有野生型Fc结构域。

图18A为在50℃温育3周后通过动态光散射(DLS)测量的平均尺寸的相互作用图。图18B为在2-8℃温育3周后通过DLS测量的平均尺寸的相互作用图。

图19A为在50℃温育3周后通过DLS测量的单体尺寸的相互作用图。图19B为在2-8℃温育3周后通过DLS测量的单体尺寸的相互作用图。

图20A为在50℃温育3周通过尺寸排阻色谱法(SEC)测得的％主要物种的相互作用图。图20B为在2-8℃温育3周通过SEC测得的％主要物种的相互作用图。

图21A为在50℃温育3周通过SEC测得的％高分子量(％HMW)物种的相互作用图。图21B为在2-8℃温育3周通过SEC测得的％HMW物种的相互作用图。

图22A为在50℃温育3周通过SEC测得的％低分子量(％LMW)物种的相互作用图。图22B为在2-8℃、pH 6.0下温育3周通过SEC测得的％LMW物种的相互作用图。

图23A为在50℃温育3周通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)测得的％酸性物种的相互作用图。图23B为在4-8℃温育3周通过icIEF测得的仅对于蔗糖的％碱性物种的相互作用图。

图24A为在50℃温育3周通过icIEF测得的％主要物种的相互作用图。图24B-24D为在4℃及pH 5.5下(图24B)、pH 6.0下(图24C)和pH6.5下(图24D)温育3周通过icIEF测得的仅蔗糖制剂中的％主要物种的相互作用图。

图25A为在50℃温育3周通过icIEF测得的％碱性物种的相互作用图。图25B为在2-8℃温育3周通过icIEF测得的仅对于蔗糖的％碱性物种的相互作用图。

图26A为在50℃温育3周通过毛细管电泳(CE)测得的％纯度的相互作用图。图26B为在50℃温育3周通过CE测得的％杂质的相互作用图。

图27A为在50℃、pH 6.0下温育3周通过毛细管电泳(非还原)(CE(NR))测得的％主要物种的相互作用图。图27B为在2-8℃、pH 6.0下温育3周通过CE(NR)测得的％主要物种的相互作用图。

图28A为在50℃温育3周通过CE(NR)测得的％HMW物种的相互作用图。图28B为在2-8℃温育3周通过CE(NR)测得的％HMW物种的相互作用图。

图29A为在50℃温育3周通过CE(NR)测得的仅对于蔗糖的％LMW物种的相互作用图。图29B为在2-8℃温育3周通过CE(NR)测得的仅对于蔗糖的％LMW物种的相互作用图。

图30为在2-8℃或25℃储存的制剂中A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗随时间的浓度曲线的图。

图31A为容纳在不同浓度的聚山梨醇酯-80中的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗制剂的小瓶的图像。图31B为通过尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)测量的在特定时间点在不同温度下储存的制剂中A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的％单体物种的图。

图32A-32B为临床试验设计的示意图。图32A描述了剂量递增阶段的试验设计。图32B描述了疗效扩展队列阶段的试验设计。附图中使用的缩写包括：DL＝剂量水平；ComboPD-1＝与派姆单抗联合治疗；PK＝药代动力学；PD＝药效学；HER2 HIGH＝根据免疫组织化学，HER2高表达，评分为3+；MBC HER22+/1+＝转移性乳癌，根据免疫组织化学，HER2中等/低表达，评分为2+/1+；UBC 2L/3L＝尿路上皮膀胱癌第2线/第3线治疗。

图33A-33C为示出在NK细胞的存在下A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗对SKBR-3(图33A)、H661(图33B)和786-O(图33C)癌细胞的细胞毒性的线图。

图34A-34B为示出在NK细胞的存在下A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗对ZR-75-1(图34A)和MCF-7(图34B)癌细胞的细胞毒性的线图。

图35A-35C为示出在KHYG-1-CD16V细胞的存在下A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗对BT-20(图35A)、Hs578T(图35B)和DU4475(图35C)癌细胞的细胞毒性的线图。

具体实施方式

定义

为了便于本发明的理解，下文定义了许多术语和表述。

如本文所用，术语“一个(a/an)”指的是“一个或多个”并包括复数指称物，除非上下文不适合。

如本文所用，术语“Fab”和“scFv”是指各自包含抗原结合位点的两种不同形式的蛋白质片段。术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。在人类抗体中，抗原结合位点由分别也称为“VH”和“VL”的重(“H”)链和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度趋异的区段被称为“高变区”，它们插入在被称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在人类抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面。抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，并且每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物如骆驼和软骨鱼类中，抗原结合位点由提供“单结构域抗体”的单条抗体链形成。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、抗体的保留了抗原结合表面的抗原结合片段如Fab中或重组多肽如scFv中，scFv在单一多肽中使用肽接头将重链可变结构域连接到轻链可变结构域。除非另有说明，否则本文公开的重链或轻链可变区中的所有氨基酸位置均根据Kabat编号方式编号。

抗原结合位点的CDR可以通过Kabat等人,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等人,Sequences of protein of immunological interest.(1991)、Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)以及MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)中描述的方法来确定。当相互比较时，根据这些定义确定的CDR通常包括氨基酸残基的重叠或子集。在某些实施方案中，术语“CDR”为如由MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)和Martin A.,Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains,in Antibody Engineering,Kontermann and Dubel,eds.,Chapter31,pp.422-439,Springer-Verlag,Berlin(2001)所定义的CDR。在某些实施方案中，术语“CDR”为如由Kabat等人,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等人,Sequencesofprotein ofimmunological interest.(1991)所定义的CDR。在某些实施方案中，使用不同的惯例来定义抗体的重链CDR和轻链CDR。例如，在某些实施方案中，重链CDR根据MacCallum(出处同上)定义，而轻链CDR根据Kabat(出处同上)定义。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，而CDRL1、CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。

如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”指的是与癌症相关的任何抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、碳水化合物或脂质。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原在细胞的表面上表达。例如，肿瘤相关抗原可以在恶性细胞上或在肿瘤微环境中表达，如在肿瘤相关血管、细胞外基质、间充质基质或免疫浸润物上表达。

如本文所用，术语“HER2过表达”表征癌症，指的是根据ASCO/CAP HER2测试指南的HER2阳性癌症(Wolff等人,(2007)J.Clin.Oncol.25(1):118-45)和2018年更新版(Wolff等人,(2018)J.Clin.Oncol.36(20):2105-22)。HER2过表达癌症可具有根据免疫组织化学评分为3+的HER2表达水平，或者根据免疫组织化学评分为2+的HER2表达水平并还由ERBB2基因扩增(例如，通过原位杂交(ISH)、色原体原位杂交(CISH)、定量PCR或DNA测序确定)的检测进一步支持。

如本文所用，术语“药物制剂”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物特别适合于体内或离体诊断或治疗用途。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指待通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这样的生物体优选包括但不限于哺乳动物(例如，鼠科动物、类人猿、马科动物、牛科动物、猪科动物、灵长类动物、犬科动物、猫科动物等)，更优选包括人类。

如本公开中所使用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”及其他语法等同物包括减轻、缓和、改善或防止疾病、病患或症状，防止另外的症状，改善或防止症状的基础代谢原因，抑制疾病或病患，例如阻止疾病或病患的发展、缓解疾病或病患、导致疾病或病患的消退、缓解由疾病或病患引起的状况、或停止疾病或病患的症状，并旨在包括预防。该术语还包括实现治疗益处和/或预防益处。术语“治疗益处”是指根除或改善正在治疗的基础病症。另外，通过根除或改善与基础病症相关的一种或多种生理学症状来实现治疗益处，使得在患者中观察到改善，但患者可能仍然罹患该基础病症。

如本文所用，术语“有效量”是指化合物(例如，本发明的化合物)的足以实现有益或期望结果的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用，并且不旨在局限于特定的制剂或施用途径。

术语“约”是指在制剂的制备和疾病或病症的治疗中不改变药剂的疗效的药剂浓度或量的任何极小改变。在某些实施方案中，术语“约”可包括指定数值或数据点的±5％、±10％或±15％。

在本公开中，范围可以表达为从“约”一个特定的值和/或到“约”另一个特定的值。在表达这样的范围时，另一个方面包括从一个特定的值和/或到另一个特定的值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，可以理解该特定的值形成另一个方面。还应理解，每个范围的端点在相对于另一个端点并且独立于另一个端点方面都是重要的。还应理解，本公开中公开了许多值，并且除了该值本身之外，每个值还被公开为“约”该特定的值。还应理解，在整个申请中，数据以许多不同的格式提供，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应理解为大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10和15之间被认为被公开。还应理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。

在整个说明书中，当组合物被描述为具有、包括、含有、并入或包含特定组分时，或者当过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，意图是这些组合物和方法是容他性的或开放性的而不排除另外的、未叙述的组分或步骤。另外，预期存在基本上由所叙述的组分组成或由所叙述的组分组成的本发明的组合物，并且存在基本上由所叙述的步骤组成或由所叙述的步骤组成的根据本发明的过程和方法。

一般来说，除非另有说明，否则指定百分比的组合物均按重量计。此外，如果变量没有附带定义，则以该变量的先前定义为准。

多特异性结合蛋白

本公开提供了含有多特异性结合蛋白的药物组合物或药物制剂，所述多特异性结合蛋白具有结合肿瘤相关抗原如HER2的抗原结合位点、结合NKG2D的抗原结合位点和抗体Fc结构域。还提供了所述多特异性结合蛋白和药物制剂在治疗癌症如局部晚期或转移性实体瘤中的用途。所述多特异性结合蛋白能够结合癌细胞上的靶标(例如，HER2)以及自然杀伤细胞上的NKG2D和CD16。这样的结合使癌细胞接近自然杀伤细胞，这有利于自然杀伤细胞对癌细胞的直接和间接破坏。

多特异性结合蛋白的第一组分结合NKG2D受体表达细胞，其可包括但不限于NK细胞、NKT细胞、γδT细胞和CD8⁺αβT细胞。在NKG2D结合后，多特异性结合蛋白可能阻断天然配体如ULBP6和MICA与NKG2D结合并激活NK细胞。多特异性结合蛋白的第二组分与HER2表达细胞结合，其可包括但不限于乳癌、卵巢癌、食管癌、膀胱和胃癌、唾液管癌、肺腺癌和侵袭形式的子宫癌如子宫浆液性子宫内膜癌。多特异性结合蛋白的第三组分为抗体Fc结构域，其与表达CD16的细胞如NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和滤泡树突状细胞结合。

本文描述的多特异性结合蛋白可以采取多种格式。例如，一种格式涉及异源二聚多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链(图1)。第一免疫球蛋白重链包括经由接头或抗体铰链融合到由重链部分和轻链部分组成的Fab片段的第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，所述重链部分包括重链可变结构域和重链CH1结构域，所述轻链部分包括轻链可变结构域和轻链恒定结构域(CL)，并且Fab片段的重链和轻链部分配对并结合NKG2D。第二免疫球蛋白重链包括经由接头或抗体铰链融合到由重链可变结构域和轻链可变结构域组成的单链可变片段(scFv)的第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，所述重链可变结构域和轻链可变结构域配对并结合肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，上面描述的单链可变片段(scFv)经由铰链序列连接至抗体恒定结构域。在一些实施方案中，铰链具有氨基酸序列Ala-Ser。在一些其他实施方案中，铰链具有氨基酸序列Ala-Ser和Thr-Lys-Gly。铰链序列可以提供与靶标抗原结合的灵活性以及灵活性与最佳几何形状之间的平衡。

在一些实施方案中，上面描述的单链可变片段(scFv)包括重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域与轻链可变结构域形成二硫桥以增强scFv的稳定性。例如，二硫桥可以在重链可变结构域的C44残基与轻链可变结构域的C100残基之间形成，氨基酸位置根据Kabat编号。例如，在一些实施方案中，二硫桥在scFv的VH的位置44(C44)处的半胱氨酸残基(天然存在的或通过突变引入的)与scFv的VL的位置100(C100)处的半胱氨酸残基(天然存在的或通过突变引入的)之间形成。在一些实施方案中，重链可变结构域经由柔性接头连接至轻链可变结构域。可以使用任何合适的接头，例如(G4S)₄接头(SEQ ID NO:143)。在scFv的一些实施方案中，重链可变结构域位于轻链可变结构域的N-末端。在scFv的一些实施方案中，重链可变结构域位于轻链可变结构域的C末端。

本文描述的多特异性结合蛋白还可以包括一个或多个另外的抗原结合位点。所述另外的抗原结合位点可以任选地经由接头序列融合到恒定区CH2结构域的C-末端或恒定区CH3结构域的C-末端。在某些实施方案中，所述另外的抗原结合位点采取任选地二硫稳定的单链可变区(scFv)的形式，产生四价或三价多特异性结合蛋白。例如，多特异性结合蛋白包括NKG2D结合位点、TAA结合位点、结合TAA的第三抗原结合位点和足以结合CD16的抗体恒定区或其部分或者结合CD16的第四抗原结合位点。这些抗原结合位点中的任一个都可以采取Fab或scFv的形式，如上面描述的scFv。在一些实施方案中，第三抗原结合位点结合不同的TAA。在一些实施方案中，第三抗原结合位点与相同的TAA结合，图2C和2D中示出了示例性格式。因此，多特异性结合蛋白可以提供TAA的二价接合。在某些实施方案中，TAA与多特异性蛋白的二价接合可以稳定癌细胞表面上的TAA，并增强NK细胞对癌细胞的细胞毒性。TAA与多特异性蛋白的二价接合可以赋予多特异性蛋白与癌细胞的更强结合，从而促进NK细胞对癌细胞、特别是对表达低水平TAA的癌细胞的更强细胞毒性反应。

在Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1中，与CD16的相互作用主要集中在CH2结构域中的氨基酸残基Asp265–Glu 269、Asn 297–Thr 299、Ala327–Ile 332、Leu 234–Ser 239和碳水化合物残基N-乙酰基-D-葡糖胺上(参见Sondermann等人,Nature,406(6793):267-273)。基于已知的结构域，可以选择突变来增强或降低与CD16的结合亲和力，如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库，或者可以基于相互作用的已知三维结构来设计。

在一些实施方案中，抗体恒定结构域包括IgG抗体例如人IgG1抗体的CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，在抗体恒定结构域中引入突变以能够与另一抗体恒定结构域异源二聚化。例如，如果抗体恒定结构域源自人IgG1的恒定结构域，则抗体恒定结构域可以具有与人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列，其在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439的一个或多个位置处不同。本文公开的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置根据EU编号进行编号。

在一些实施方案中，抗体恒定结构域可以具有与人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列，其不同之处在于选自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E的一个或多个置换。

下面更详细地描述多特异性结合蛋白的各个组分。

NKG2D-结合位点

在与自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及癌细胞上的TAA结合后，多特异性结合蛋白可以与多于一种NK激活受体接合，并可能阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白可以激动人类的NK细胞。在一些实施方案中，多特异性结合蛋白可以激动人类和其他物种如啮齿动物和食蟹猴的NK细胞。

表1列出了可以组合地与NKG2D结合的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。在一些实施方案中，重链可变结构域和轻链可变结构域以Fab格式排列。这些NKG2D结合结构域与NKG2D的结合亲和力可能有所不同，但它们都会激活人类NK细胞。除非另有说明，否则表1中提供的CDR序列按Kabat确定。

表1.示例性NKG2D-结合位点

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在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:94相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:98相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:94至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:94的CDR1(SEQ ID NO:95或168)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:97或169)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:98至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:98的CDR1(SEQ ID NO:99)、CDR2(SEQ ID NO:100)和CDR3(SEQ ID NO:101)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:144相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:98相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:144至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:144的CDR1(SEQ ID NO:95或168)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:172或173)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:98至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:98的CDR1(SEQ ID NO:99)、CDR2(SEQ ID NO:100)和CDR3(SEQ ID NO:101)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:174相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:98相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:174至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:174的CDR1(SEQ ID NO:95或168)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:175或176)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:98至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:98的CDR1(SEQ ID NO:99)、CDR2(SEQ ID NO:100)和CDR3(SEQ ID NO:101)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:177相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:98相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:177至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:177的CDR1(SEQ ID NO:95或168)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:178或179)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:98至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:98的CDR1(SEQ ID NO:99)、CDR2(SEQ ID NO:100)和CDR3(SEQ ID NO:101)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:180相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:98相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:180至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:180的CDR1(SEQ ID NO:95或168)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:181或182)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:98至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:98的CDR1(SEQ ID NO:99)、CDR2(SEQ ID NO:100)和CDR3(SEQ ID NO:101)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:183相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:98相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:183至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:183的CDR1(SEQ ID NO:95或168)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:184或185)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:98至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:98的CDR1(SEQ ID NO:99)、CDR2(SEQ ID NO:100)和CDR3(SEQ ID NO:101)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:186相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:98相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:186至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:186的CDR1(SEQ ID NO:95或168)、CDR2(SEQ ID NO:96)和CDR3(SEQ ID NO:187或188)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:98至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:98的CDR1(SEQ ID NO:99)、CDR2(SEQ ID NO:100)和CDR3(SEQ ID NO:101)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:86相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:90相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:86至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:86的CDR1(SEQ ID NO:87或166)、CDR2(SEQ ID NO:88)和CDR3(SEQ ID NO:89或167)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:90至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:90的CDR1(SEQ ID NO:91)、CDR2(SEQ ID NO:92)和CDR3(SEQ ID NO:93)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:102相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:106相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:102至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:102的CDR1(SEQ ID NO:71或162)、CDR2(SEQ ID NO:72)和CDR3(SEQ IDNO:105或170)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:106至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:106的CDR1(SEQ ID NO:107)、CDR2(SEQ ID NO:108)和CDR3(SEQ ID NO:109)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:70相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:74相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:70至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:70的CDR1(SEQ ID NO:71或162)、CDR2(SEQ ID NO:72)和CDR3(SEQ ID NO:73或163)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:74至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:74的CDR1(SEQ ID NO:75)、CDR2(SEQ ID NO:76)和CDR3(SEQ ID NO:77)序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Fab包括与SEQ ID NO:78相关的重链可变结构域和与SEQ IDNO:82相关的轻链可变结构域。例如，Fab的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:78至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:78的CDR1(SEQ ID NO:79或164)、CDR2(SEQ ID NO:80)和CDR3(SEQ ID NO:81或165)序列相同的氨基酸序列。类似地，Fab的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:82至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:82的CDR1(SEQ ID NO:75)、CDR2(SEQ ID NO:76)和CDR3(SEQ ID NO:77)序列相同的氨基酸序列。

多特异性结合蛋白可以与NKG2D-表达细胞结合，其包括但不限于NK细胞、γδT细胞和CD8⁺αβT细胞。在NKG2D结合后，多特异性结合蛋白可能阻断天然配体如ULBP6和MICA与NKG2D结合并激活NK细胞。

在某些实施方案中，Fab或多特异性结合蛋白以2nM至120nM的K_D的亲和力与NKG2D结合，例如，2nM至110nM、2nM至100nM、2nM至90nM、2nM至80nM、2nM至70nM、2nM至60nM、2nM至50nM、2nM至40nM、2nM至30nM、2nM至20nM、2nM至10nM、约15nM、约14nM、约13nM、约12nM、约11nM、约10nM、约9nM、约8nM、约7nM、约6nM、约5nM、约4.5nM、约4nM、约3.5nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约0.5nM至约1nM、约1nM至约2nM、约2nM至3nM、约3nM至4nM、约4nM至约5nM、约5nM至约6nM、约6nM至约7nM、约7nM至约8nM、约8nM至约9nM、约9nM至约10nM、约1nM至约10nM、约2nM至约10nM、约3nM至约10nM、约4nM至约10nM、约5nM至约10nM、约6nM至约10nM、约7nM至约10nM或约8nM至约10nM之间。

在某些实施方案中，Fab以2nM至120nM的K_D与NKG2D结合，如通过表面等离子共振所测量。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白以2nM至120nM的K_D与NKG2D结合，如通过表面等离子共振所测量。在某些实施方案中，Fab以10nM至62nM的K_D与NKG2D结合，如通过表面等离子共振所测量。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白以10nM至62nM的K_D与NKG2D结合，如通过表面等离子共振所测量。

在一些实施方案中，上面描述的Fab连接至抗体Fc多肽。在一些实施方案中，Fab的重链部分连接至抗体Fc多肽的N-末端。

TAA结合位点

可以被多特异性结合蛋白靶向的肿瘤相关抗原(TAA)包括但不限于ANO1、BCMA、EpCAM、CAIX、CEA、CCR4、CD2、CD123、CD133、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD70、CLAUDIN-18.2、DLL3、EGFR/ERBB1、GD2、IGF1R、HER2/ERBB2、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSMA、间皮素、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、TROP2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4、PD1、5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A、FLT3、GPC3、CXCR4、ROR1、ROR2、HLA-E、PD-L1、VLA4、CD44、CD13、CD15、CD47、CLL1、CD81、CD23、CD79a、CD79b、CD80、CRLF2、SLAMF7、CD138、CA125、NaPi2b、Nectin4、ADAM8、ADAM9、SLC44A4、CA19-9、LILRBl、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5、ULRA 1、LILRA2、LILRA3、ULRA4、LILRA5和ULRA6、CCR8、CD7、CTLA4、CX3CR1、ENTPD1、HAVCR2、IL-1R2、PDCD1LG2、TIGIT、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、GEM、NT5E、TNFRSF18、MUC1、P-钙粘蛋白、Plexin-A1、TNFRSF10B、STEAP1、CDCP1、PTK7、Axl、erbB-3、EDNRB、Tyrp1、CD14、CD163、CSF3R、Siglec-9、ITGAM、VISTA、B7-H4(VTCN1)、CCR1、LRRC25、PTAFR、SIRPB1、TLR2、TLR4、CD300LB、ATP1A3、CCR5、MUC1(或MUC1-C)、Plexin-A1、TNFRSF10B、STEAP1、CDCP1、PTK7、AXL、EDNRB、OLR1和TYRP1。

在某些实施方案中，肿瘤相关抗原为HER2。表2列出了可以组合地与HER2结合的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，结合HER2的抗原结合位点采取scFv的形式。

表2.示例性的HER2结合位点

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或者，可以通过筛选与SEQ ID NO:138所定义的氨基酸序列或其成熟胞外片段的结合来鉴定可以与HER2结合的新抗原结合位点。

MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV(SEQ ID NO:138)

在一些实施方案中，scFv包括与SEQ ID NO:195相关的重链可变结构域和与SEQID NO:196相关的轻链可变结构域。例如，scFv的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:195至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:195的CDR1(SEQ ID NO:115)、CDR2(SEQ ID NO:116)和CDR3(SEQ IDNO:117)序列相同的氨基酸序列。类似地，scFv的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:196至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:196的CDR1(SEQ ID NO:119)、CDR2(SEQ ID NO:120)和CDR3(SEQ IDNO:121)序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列。

在一些实施方案中，scFv包括与SEQ ID NO:197相关的重链可变结构域和与SEQID NO:198相关的轻链可变结构域。例如，scFv的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:197至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:197的CDR1(SEQ ID NO:123)、CDR2(SEQ ID NO:124)和CDR3(SEQ IDNO:125)序列相同的氨基酸序列。类似地，scFv的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:198至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:198的CDR1(SEQ ID NO:127)、CDR2(SEQ ID NO:128)和CDR3(SEQ IDNO:129)序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv具有SEQ ID NO:189的氨基酸序列。

在一些实施方案中，scFv包括与SEQ ID NO:199相关的重链可变结构域和与SEQID NO:200相关的轻链可变结构域。例如，scFv的重链可变结构域可以与SEQ ID NO:199至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:199的CDR1(SEQ ID NO:131)、CDR2(SEQ ID NO:132)和CDR3(SEQ IDNO:133)序列相同的氨基酸序列。类似地，scFv的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO:200至少90％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同，和/或并入与SEQ ID NO:200的CDR1(SEQ ID NO:135)、CDR2(SEQ ID NO:136)和CDR3(SEQ IDNO:137)序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv具有SEQ ID NO:171的氨基酸序列。

上面描述的scFv包括重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域与轻链可变结构域形成二硫桥以增强scFv的稳定性。例如，二硫桥可以在重链可变结构域的C44残基与轻链可变结构域的C100残基之间形成，氨基酸位置根据Kabat编号。例如，在一些实施方案中，二硫桥在scFv的VH的位置44(C44)处的半胱氨酸残基(天然存在的或通过突变引入的)与scFv的VL的位置100(C100)处的半胱氨酸残基(天然存在的或通过突变引入的)之间形成。

scFv的VH和VL可以以各种取向定位。在某些实施方案中，VL位于VH的N-末端。在某些实施方案中，VL位于VH的C-末端。

scFv的VH和VL可以经由接头例如肽接头连接。在某些实施方案中，肽接头为柔性接头。关于接头的氨基酸组成，选择具有赋予柔性、不干扰本发明的蛋白质的其他结构域的结构和功能并且抵抗蛋白酶切割的性质的肽。例如，甘氨酸和丝氨酸残基通常提供蛋白酶抵抗性。在某些实施方案中，VL位于VH的N-末端并经由接头连接至VH。

接头(例如，柔性接头)的长度可以是“短的”，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基，或者是“长的”，例如至少13个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、15-50、15-40、15-30、15-25、15-20、20-50、20-40、20-30或20-25个氨基酸残基。

在某些实施方案中，接头包括(GS)_n(SEQ ID NO:204)、(GGS)_n(SEQ ID NO:205)、(GGGS)_n(SEQ ID NO:151)、(GGSG)_n(SEQ ID NO:153)、(GGSGG)_n(SEQ ID NO:156)和(GGGGS)_n(SEQ ID NO:157)序列，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些实施方案中，接头包括选自SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:150、SEQID NO:152和SEQ ID NO:154的氨基酸序列，如表3中所列。

表3.示例性接头

在特定的实施方案中，轻链可变结构域经由柔性接头例如(G₄S)₄接头(SEQ ID NO:143)连接至重链可变结构域的N-末端。

在一些实施方案中，上面描述的scFv经由铰链序列连接至抗体Fc多肽。在一些实施方案中，铰链包括氨基酸序列Ala-Ser。在一些其他实施方案中，铰链包括氨基酸序列Ala-Ser和Thr-Lys-Gly。铰链序列可以提供与靶标抗原结合的灵活性以及灵活性与最佳几何形状之间的平衡。

Fc结构域

多特异性结合蛋白的抗体Fc结构域包括连接至Fab的第一抗体Fc多肽和连接至scFv的第二抗体Fc多肽。两个抗体Fc多肽配对并形成结合CD16的二聚体。

在抗体Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1中，与CD16的相互作用主要集中在CH2结构域中的氨基酸残基Asp 265–Glu 269、Asn 297–Thr299、Ala 327–Ile 332、Leu 234–Ser 239和碳水化合物残基N-乙酰基-D-葡糖胺上(参见Sondermann等人,Nature,406(6793):267-273)。基于已知的结构域，可以选择突变来增强或降低与CD16的结合亲和力，如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库，或者可以基于相互作用的已知三维结构来设计。

异源二聚抗体重链的组装可以通过在同一细胞中表达两个不同的抗体重链序列来完成，这可导致每个抗体重链的同源二聚体的组装以及异源二聚体的组装。促进异源二聚体的优先组装可以通过在每个抗体重链恒定区的CH3结构域中并入不同的突变来实现，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480和US14/830336中所示。例如，可以通过在第一多肽和第二多肽内并入不同对的氨基酸置换来在基于人IgG1的CH3结构域中进行突变，这允许这两条链选择性地与彼此异源二聚化。下面示意的氨基酸置换的位置均根据Kabat中的EU索引来编号。

在一种情况下，第一多肽中的氨基酸置换用选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的较大氨基酸替换原始氨基酸，并且第二多肽中的至少一个氨基酸置换用选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)的较小氨基酸替换原始氨基酸，使得较大的氨基酸置换(隆凸)刚好放入到较小的氨基酸置换(空腔)的表面中。例如，一个多肽可以并入T366W置换，而另一个多肽可以并入三个置换，包括T366S、L368A和Y407V。

本发明的抗体重链可变结构域可以任选地与和抗体恒定区如包括铰链、CH2和CH3结构域、具有或不具有CH1结构域的IgG恒定区至少90％相同的氨基酸序列偶联。在一些实施方案中，恒定区的氨基酸序列与人抗体恒定区如人IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区至少90％相同。在一些其他实施方案中，恒定区的氨基酸序列与来自另一哺乳动物如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区至少90％相同。与人IgG1恒定区相比，可以向恒定区中并入一个或多个突变，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性的置换包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。本文公开的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置根据EU编号进行编号。

在某些实施方案中，可以并入到人IgG1恒定区的CH1中的突变可在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方案中，可以并入到人IgG1恒定区的Cκ中的突变可在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。

氨基酸置换可以选自表4中示出的以下置换组。

表4.促进异源二聚化的示例性Fc置换

	第一多肽	第二多肽
			组1	S364E/F405A	Y349K/T394F
组2	S364H/D401K	Y349T/T411E
			组3	S364H/T394F	Y349T/F405A
组4	S364E/T394F	Y349K/F405A
			组5	S364E/T411E	Y349K/D401K
组6	S364D/T394F	Y349K/F405A
			组7	S364H/F405A	Y349T/T394F
组8	S364K/E357Q	L368D/K370S
			组9	L368D/K370S	S364K
组10	L368E/K370S	S364K
			组11	K360E/Q362E	D401K
组12	L368D/K370S	S364K/E357L
			组13	K370S	S364K/E357Q
组14	F405L	K409R
			组15	K409R	F405L

或者，氨基酸置换可以选自表5中示出的以下置换组。

表5.促进异源二聚化的示例性Fc置换

	第一多肽	第二多肽
			组1	K409W	D399V/F405T
组2	Y349S	E357W
			组3	K360E	Q347R
组4	K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
			组5	Q347E/K360E/K409W	Q347R/D399V/F405T
组6	Y349S/K409W	E357W/D399V/F405T

或者，氨基酸置换可以选自表6中示出的以下置换组。

表6.促进异源二聚化的示例性Fc置换

	第一多肽	第二多肽
			组1	T366K/L351K	L351D/L368E
组2	T366K/L351K	L351D/Y349E
			组3	T366K/L351K	L351D/Y349D
组4	T366K/L351K	L351D/Y349E/L368E
			组5	T366K/L351K	L351D/Y349D/L368E
组6	E356K/D399K	K392D/K409D

或者，每个多肽链中的至少一个氨基酸置换可以选自表7。

表7.促进异源二聚化的示例性Fc置换

或者，至少一个氨基酸置换可以选自表8中的以下置换组，其中第一多肽栏中所示的位置被替换为任何已知的带负电荷的氨基酸，并且第二多肽栏中所示的位置被替换为任何已知的带正电荷的氨基酸。

表8.用于置换的示例性Fc位置

或者，至少一个氨基酸置换可以选自表9中的以下置换组，其中第一多肽栏中所示的位置被替换为任何已知的带正电荷的氨基酸，并且第二多肽栏中所示的位置被替换为任何已知的带负电荷的氨基酸。

表9.用于置换的示例性Fc位置

或者，氨基酸置换可以选自表10中的以下组。

表10.促进异源二聚化的示例性Fc置换

在选择Fc置换时，技术人员应理解表4-10中的第一多肽和第二多肽可分别对应于第一抗体Fc多肽和第二抗体Fc多肽。或者，表4-10中的第一多肽和第二多肽可分别对应于第二抗体Fc多肽和第一抗体Fc多肽。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在位置T366处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、L368和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、L368和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在位置T366处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、D399、S400和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、N390、K392、K409和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、N390、K392、K409和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、D399、S400和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、Y349、K360和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、E357、D399和F405的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、E357、D399和F405的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、K360、Q347和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自K370、K392、K409和K439的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自D356、E357和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自D356、E357和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自K370、K392、K409和K439的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、E356、T366和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、L351、L368、K392和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、L351、L368、K392和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、E356、T366和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于K360E和K409W置换，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于Q347R、D399V和F405T置换。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于Q347R、D399V和F405T置换，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于K360E和K409W置换。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T366W置换，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T366S、T368A和Y407V置换。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T366S、T368A和Y407V置换，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T366W置换。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T350V、L351Y、F405A和Y407V置换，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T350V、T366L、K392L和T394W置换。

在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T350V、T366L、K392L和T394W置换，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于T350V、L351Y、F405A和Y407V置换。

或者，或另外，可以通过在第一或第二多肽链中的任一个上引入S354C置换以及在相对的多肽链上引入Y349C置换(其在两个肽的界面内形成人工二硫桥)来增加异源多聚蛋白的结构稳定性。在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于S354C置换，并且抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的不同在于Y349C置换。

在选择Fc置换时，技术人员应理解上面描述的抗体恒定区的“一条多肽链”和“另一条多肽链”可分别对应于第一抗体Fc多肽和第二抗体Fc多肽。或者，上面描述的抗体恒定区的“一条多肽链”和“另一条多肽链”可分别对应于第二抗体Fc多肽和第一抗体Fc多肽。

示例性的多特异性结合蛋白

下面列出的是TriNKET的实例，其包括各自连接至抗体恒定区的HER2-结合scFv和NKG2D-结合Fab以及并入了使得能够实现两条Fc多肽链的异源二聚化的突变的抗体恒定区。scFv包括衍生自抗-HER2抗体(例如，曲妥珠单抗)的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且还包括VL的位置100和VH的位置44处氨基酸残基的Cys置换，从而促进scFv的VH与VL之间二硫桥的形成。VL经由(G₄S)₄接头(SEQ ID NO:143)连接至VH的N-末端，并且VH经由Ala-Ser接头连接至Fc的N-末端。Ala-Ser接头被包括在肘铰链区序列处以平衡灵活性与最佳几何形状。在某些实施方案中，可以在铰链处向Ala-Ser序列的N-末端或C-末端添加另外的序列Thr-Lys-Gly。如本文用于描述这些示例性TriNKET的，Fc结构域包括抗体铰链、CH2和CH3。

因此，下面描述的每个TriNKET都具有以下三个多肽链：

链A，从N-末端到C-末端包括：NKG2D结合Fab的VH、CH1和抗体Fc多肽；

链B，从N-末端到C-末端包括：HER2结合scFv的VL、(G₄S)₄接头(SEQ ID NO:143)、HER2结合scFv的VH、Ala-Ser接头和抗体Fc多肽；以及

链C，从N-末端到C-末端包括：NKG2D结合Fab的VL和轻链恒定结构域(CL)。

示例性TriNKET的氨基酸序列汇总于表11中。

在某些实施方案中，本公开的多特异性结合蛋白包括第一多肽链、第二多肽链和第三多肽链，其分别具有表11中公开的TriNKET的链A、链B和链C的氨基酸序列。

在一个示例性实施方案中，连接至NKG2D结合Fab片段的抗体Fc多肽并入突变Q347R、D399V和F405T，并且连接至HER2 scFv的抗体Fc多肽并入匹配的突变K360E和K409W以形成异源二聚体。在另一个示例性实施方案中，连接至NKG2D结合Fab片段的抗体Fc多肽并入杵突变T366S、L368A和Y407V，并且连接至HER2结合scFv的抗体Fc多肽并入“臼”突变T366W。在一个示例性实施方案中，连接至NKG2D结合Fab片段的抗体Fc多肽包括CH3结构域中的S354C置换，其与连接至HER2结合scFv的抗体Fc多肽上的Y349C置换形成二硫键。

表11.示例性的多特异性结合蛋白

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特定的TriNKET及其多肽链将在下文更详细地描述。在氨基酸序列中，(G₄S)₄(SEQID NO:143)和Ala-Ser接头用加粗下划线表示；scFv中形成二硫桥的Cys残基用加粗斜体下划线表示；Fc异源二聚化突变用加粗下划线表示；根据Kabat的CDR序列用下划线表示。

例如，本公开的TriNKET为A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括衍生自曲妥珠单抗的结合HER2的单链可变片段(scFv)(SEQ ID NO:139)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和衍生自A49的NKG2D-结合Fab片段，其连接至第二抗体Fc多肽。Fab片段包括具有重链可变结构域(SEQ ID NO:94)和CH1结构域的重链部分以及具有轻链可变结构域(SEQ ID NO:98)和轻链恒定结构域的轻链部分。重链可变结构域与CH1结构域连接，CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142序列的三个多肽。

SEQ ID NO:140代表经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽的HER2结合scFv的完整序列(scFv-Fc)。第一抗体Fc多肽包括用于异源二聚化的Q347R、D399V和F405T置换以及用于与SEQ ID NO:141中的Y349C置换形成二硫键的S354C置换，如下所述。scFv(SEQ ID NO:139)包括经由(G₄S)₄接头(SEQ ID NO:143)与曲妥珠单抗轻链可变结构域的N-末端连接的曲妥珠单抗重链可变结构域，该scFv表示为VL-(G₄S)₄-VH(“(G₄S)₄”由SEQ IDNO:143表示)。scFv的重链和轻链可变结构域还通过VL的C100与VH的C44之间的二硫桥连接，其分别是VL和VH中的Q100C和G44C置换的结果。

曲妥珠单抗scFv

曲妥珠单抗scFv-Fc(RVT)

SEQ ID NO:141代表Fab片段的重链部分，其包括NKG2D-结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO:94)和与第二抗体Fc多肽连接的CH1结构域。SEQ ID NO:141中的抗体Fc多肽在CH3结构域中包括Y349C置换，其与SEQ ID NO:140中的Fc多肽上的S354C置换形成二硫键。在SEQ ID NO:141中，抗体Fc多肽还包括用于与SEQ ID NO:140中的Fc异源二聚化的K360E和K409W置换。

A49 VH

A49 VH-CH1-Fc(EW)

SEQ ID NO:142代表Fab片段的轻链部分，其包括NKG2D-结合位点的轻链可变结构域(SEQ ID NO:98)和轻链恒定结构域。

A49 VL

本公开的另一个TriNKET为A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的HER2-结合scFv(SEQID NO:139)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至抗体Fc多肽；和衍生自A49MI的NKG2D-结合Fab片段，其连接至第二抗体Fc多肽。Fab片段包括重链部分和轻链部分，重链部分包括重链可变结构域(SEQ ID NO:144)和CH1结构域，轻链部分包括轻链可变结构域(SEQ ID NO:98)和轻链恒定结构域。重链可变结构域与CH1结构域连接，CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:140(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:145代表Fab片段的重链部分，其包括NKG2D-结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO:144)和与第一抗体Fc多肽连接的CH1结构域。在SEQ ID NO:144中，SEQ IDNO:94的CDR3中的蛋氨酸已被异亮氨酸置换(M→I置换；示出在SEQ ID NO:144和SEQ IDNO:145中的第三个括号[]内)。SEQ ID NO:145中的抗体Fc多肽在CH3结构域中包括Y349C置换，其与SEQ ID NO:140中的抗体Fc多肽中的S354C置换形成二硫键。在SEQ ID NO:145中，抗体Fc多肽还包括K360E和K409W置换。

A49MI VH

A49MI VH-CH1-Fc(EW)

本公开的另一个TriNKET为A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗。KiH是指杵臼结构(KiH)Fc技术，其涉及对CH3结构域进行工程设计以在每条重链中创建“杵”或“臼”以促进异源二聚化。KiH Fc技术背后的概念是通过用大残基(例如，EU编号中的T366W_CH3A)置换小残基来在一个CH3结构域(CH3A)中引入“杵”。为了容纳“杵”，通过用较小的残基(例如，T366S/L368A/Y407V_CH3B)替换与杵最邻近的残基来在另一个CH3结构域(CH3B)上创建互补的“臼”表面。“臼”突变通过结构引导的噬菌体文库筛选来优化(Atwell S,Ridgway JB,Wells JA,Carter P.,Stable heterodimers from remodeling the domain interface of ahomodimer using a phage display library,J.Mol.Biol.(1997)270(1):26–35)。KiH Fc变体的X-射线晶体结构(Elliott JM,Ultsch M,Lee J,Tong R,Takeda K,Spiess C等人,Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibodyhomodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction.J.Mol.Biol.(2014)426(9):1947–57；Mimoto F,Kadono S,Katada H,Igawa T,Kamikawa T,HattoriK.Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc domain variantwith improved affinity for FcγRs.Mol.Immunol.(2014)58(1):132–8)证实，异源二聚化因在CH3结构域间核心界面处空间互补性驱动的疏水相互作用而在热力学上有利，然而杵-杵和臼-臼界面分别由于空间位阻和有利相互作用的破坏而不利于同源二聚化。

A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的HER2-结合scFv(SEQ ID NO:139)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至并入“臼”置换T366S、L368A和Y407V的第一抗体Fc多肽；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与并入“杵”置换T366W的第二抗体Fc多肽连接。A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:146代表经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽的HER2结合scFv(SEQ ID NO:139)的完整序列(scFv-Fc)。第一抗体Fc多肽包括用于异源二聚化的T366S、L368A和Y407V置换以及用于与SEQ ID NO:147中的Y349C置换形成二硫键的S354C置换，如下所述。

曲妥珠单抗scFv-Fc(KiH)

SEQ ID NO:147代表Fab片段的重链部分，其具有衍生自A49的NKG2D-结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO:94)和与第二抗体Fc多肽连接的CH1结构域。SEQ ID NO:147中的抗体Fc多肽包括S354C置换，其与第一抗体Fc多肽的CH3结构域中的Y349C置换形成二硫键。在SEQ ID NO:147中，抗体Fc多肽还包括T366W置换。

A49 VH-CH1-Fc(KiH)

本公开的另一个TriNKET为A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的HER2-结合scFv(SEQ ID NO:139)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至并入“臼”置换T366S、L368A和Y407V的第一抗体Fc多肽；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与并入“杵”置换T366W的第二抗体Fc多肽连接。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:146(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)、SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:194代表Fab片段的重链部分，其具有衍生自A49MI的NKG2D-结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO:144)和与第二抗体Fc多肽连接的CH1结构域。SEQ ID NO:194中的抗体Fc多肽包括S354C置换，其与第一抗体Fc多肽的CH3结构域中的Y349C置换形成二硫键。在SEQ ID NO:194中，抗体Fc多肽还包括T366W置换。

A49MI VH-CH1-Fc(KiH)

本公开的另一个示例性TriNKET为A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的HER2-结合scFv(SEQID NO:139)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和衍生自A44的NKG2D-结合Fab片段，其连接至第二抗体Fc多肽。Fab片段包括具有重链可变结构域(SEQ ID NO:86)和CH1结构域的重链部分以及具有轻链可变结构域(SEQ ID NO:90)和轻链恒定结构域的轻链部分。重链可变结构域与CH1结构域连接，CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:140(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)、SEQID NO:155和SEQ ID NO:149序列的三个多肽。

SEQ ID NO:155代表衍生自A44的NKG2D-结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO:86)，其与第二抗体Fc多肽连接。SEQ ID NO:155中的抗体Fc多肽在CH3结构域中包括Y349C置换，其与第一抗体Fc多肽上的S354C置换形成二硫键。在SEQ ID NO:155中，抗体Fc多肽还包括K360E和K409W置换。

A44 VH

A44 VH-CH1-Fc(EW)

SEQ ID NO:149代表Fab片段的轻链部分，其包括NKG2D-结合位点的轻链可变结构域(SEQ ID NO:90)和轻链恒定结构域。

A44 VL

A44 VL-CL

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:149)

本公开的另一个示例性TriNKET为A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗。A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的HER2-结合scFv(SEQ ID NO:139)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至并入“臼”置换T366S、L368A和Y407V的第一抗体Fc多肽；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与并入“杵”置换T366W的第二抗体Fc多肽连接。A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:146(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:149(如在A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:148代表衍生自A44的NKG2D-结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO:86)，其与第二抗体Fc多肽连接。SEQ ID NO:148中的抗体Fc多肽在CH3结构域中包括Y349C置换，其与第一抗体Fc多肽上的S354C置换形成二硫键。在SEQ ID NO:148中，抗体Fc多肽还包括T366W置换。

A44 VH-CH1-Fc(KiH)

本公开的另一个TriNKET为A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗。A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括衍生自帕妥珠单抗的结合HER2的scFv(SEQ ID NO:189)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入Q347R、D399V和F405T置换，并且第二抗体Fc多肽并入K360E和K409W置换。A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:141(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:190代表经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽的HER2结合scFv的完整序列(scFv-Fc)。第一抗体Fc多肽并入用于异源二聚化的Q347R、D399V和F405T置换以及用于与SEQ ID NO:141中的Y349C置换形成二硫键的S354C置换，如上所述。scFv(SEQ ID NO:189)包括经由(G₄S)₄接头(SEQ ID NO:143)与帕妥珠单抗轻链可变结构域的N-末端连接的帕妥珠单抗重链可变结构域，该scFv表示为VL-(G₄S)₄-VH(“(G₄S)₄”由SEQ IDNO:143表示)。scFv的重链和轻链可变结构域还通过VL的C100与VH的C44之间的二硫桥连接，其分别是VL和VH中的Q100C和G44C置换的结果。

帕妥珠单抗scFv

帕妥珠单抗scFv-Fc

本公开的另一个示例性TriNKET为A49MI-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗。A49MI-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的HER2结合scFv(SEQ IDNO:189)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入Q347R、D399V和F405T置换，并且第二抗体Fc多肽并入K360E和K409W置换。A49MI-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:190(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中)、SEQ ID NO:145(如在A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET为A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗。A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:189)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入T366S、L368A和Y407V“臼”置换，并且第二抗体Fc多肽并入T366W“杵置换”。A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:147(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:191代表经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽的HER2结合scFv(SEQ ID NO:189)的完整序列(scFv-Fc)。第一抗体Fc多肽并入用于异源二聚化的T366S、L368A和Y407V置换以及用于与SEQ ID NO:191中的Y349C置换形成二硫键的S354C置换，如上所述。

帕妥珠单抗scFv-Fc(KiH)

本公开的另一个示例性TriNKET为A49MI-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:189)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入T366S、L368A和Y407V“臼”置换，并且第二抗体Fc多肽并入T366W“杵置换”。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:191(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中)、SEQ ID NO:194(如在A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET为A44-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗。A44-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的HER2结合scFv(SEQ IDNO:189)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入Q347R、D399V和F405T置换，并且第二抗体Fc多肽并入K360E和K409W置换。A44-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:190(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中)、SEQ ID NO:155(如在A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:149(如在A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET为A44-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗。A44-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括与A49-F3’-TriNKET-帕妥珠单抗中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:189)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入T366S、L368A和Y407V“臼”置换，并且第二抗体Fc多肽并入T366W“杵置换”。A44-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗包括具有SEQ ID NO:191(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-帕妥珠单抗中)、SEQ ID NO:148(如在A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:149(如在A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

本公开的另一个TriNKET为A49-F3’-TriNKET-MGAH22。A49-F3’-TriNKET-MGAH22包括衍生自MGAH22的结合HER2的scFv(SEQ ID NO:171)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入Q347R、D399V和F405T置换，并且连接至Fab片段的第二抗体Fc多肽并入K360E和K409W置换。A49-F3’-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:141(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:192代表经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽的HER2结合scFv的完整序列(scFv-Fc)。第一抗体Fc结构域并入用于异源二聚化的Q347R、D399V和F405T置换以及用于与SEQ ID NO:141中的Y349C置换形成二硫键的S354C置换，如上所述。scFv(SEQ ID NO:171)包括经由(G₄S)₄接头(SEQ ID NO:143)与帕妥珠单抗轻链可变结构域的N-末端连接的帕妥珠单抗重链可变结构域，该scFv表示为VL-(G₄S)₄-VH(“(G₄S)₄”由SEQID NO:143表示)。scFv的重链和轻链可变结构域还通过VL的C100与VH的C44之间的二硫桥连接，其分别是VL和VH中的G100C和G44C置换的结果。

MGAH22scFv

本公开的另一个TriNKET为A49MI-F3’-TriNKET-MGAH22。A49MI-F3’-TriNKET-MGAH22包括与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:171)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入Q347R、D399V和F405T置换，并且第二抗体Fc多肽并入K360E和K409W置换。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO:192(如在A49-F3’-TriNKET-MGAH22中)、SEQ ID NO:145(如在A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

本公开的另一个TriNKET为A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22。A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:171)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入T366S、L368A和Y407V“臼”置换，并且连接至Fab片段的第二抗体Fc多肽并入T366W“杵置换”。A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:147(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

SEQ ID NO:193代表经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽的HER2结合scFv(SEQ ID NO:171)的完整序列(scFv-Fc)。第一抗体Fc多肽并入用于异源二聚化的T366S、L368A和Y407V置换以及用于与SEQ ID NO:147中的Y349C置换形成二硫键的S354C置换，如上所述。

MGAH22 scFv-Fc(KiH)

本公开的另一个示例性TriNKET为A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:171)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A49MI-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入T366S、L368A和Y407V“臼”置换，并且第二抗体Fc多肽并入T366W“杵置换”。A49MI-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO:193(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22中)、SEQID NO:194(如在A49MI-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:142(如在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET为A44-F3’-TriNKET-MGAH22。A44-F3’-TriNKET-MGAH22包括与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:171)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入Q347R、D399V和F405T置换，并且第二抗体Fc多肽并入K360E和K409W置换。A44-F3’-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO:192(如在A49-F3’-TriNKET-MGAH22中)、SEQ ID NO:155(如在A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:149(如在A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

本公开的另一个示例性TriNKET为A44-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22。A44-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括与A49-F3’-TriNKET-MGAH22中相同的HER2结合scFv(SEQ ID NO:171)，其经由包括Ala-Ser的铰链连接至第一抗体Fc多肽；和与A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中相同的NKG2D-结合Fab片段，其CH1结构域与第二抗体Fc多肽连接。第一抗体Fc多肽并入T366S、L368A和Y407V“臼”置换，并且第二抗体Fc多肽并入T366W“杵置换”。A44-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22包括具有SEQ ID NO:193(如在A49-F3’-KiH-TriNKET-MGAH22中)、SEQ IDNO:148(如在A44-F3’-KiH-TriNKET-曲妥珠单抗中)和SEQ ID NO:149(如在A44-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗中)序列的三个多肽。

在某些实施方案中，本公开的TriNKET与包括EW-RVT Fc突变的上述示例性TriNKET中之一相同，除了连接至NKG2D-结合Fab片段的抗体Fc多肽并入了Q347R、D399V和F405T置换并且连接至HER2结合scFv的抗体Fc多肽并入了匹配的置换K360E和K409W以形成异源二聚体外。在某些实施方案中，本公开的TriNKET与包括KiH Fc突变的上述示例性TriNKET中之一相同，除了连接至NKG2D-结合Fab片段的抗体Fc多肽并入了T366S、L368A和Y407V“臼”置换并且连接至HER2结合scFv的抗体Fc多肽并入了T366W“杵”置换以形成异源二聚体外。

在某些实施方案中，本公开的TriNKET与上述示例性TriNKET中之一相同，除了连接至NKG2D-结合Fab片段的抗体Fc多肽在CH3结构域中包括S354C置换并且连接至HER2结合scFv的抗体Fc多肽在CH3结构域中包括匹配的Y349C置换以形成二硫键外。

如国际申请号PCT/US2019/045561中所述，本文公开的多特异性结合蛋白在体外测定和动物模型中有效减少肿瘤生长并杀伤癌细胞。例如，A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗在诱导NK细胞介导的针对各种人类癌细胞系的细胞毒性方面优于曲妥珠单抗，如表达低水平HER2(HER2+)的786-O细胞、表达中等水平HER2(HER2++)的H661细胞和表达高水平HER2(HER2+++)的SkBr3细胞。此外，所述多特异性结合蛋白不显著诱导NK介导的对健康非癌性人类细胞(例如，人类心肌细胞)的杀伤。

下面描述了可用于本文公开的任何治疗方法和制剂中的多特异性结合蛋白的具体实施方案。

在一些实施方案中，结合NKG2D的第一抗原结合位点包括具有分别具有SEQ IDNO:168、96和188的氨基酸序列的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)的重链可变结构域(VH)；以及具有分别具有SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域(VL)。在一些实施方案中，结合NKG2D的第一抗原结合位点包括具有与SEQ ID NO:94的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列的VH，以及具有与SEQ ID NO:98的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，结合NKG2D的第一抗原结合位点为Fab。

在一些实施方案中，结合HER2的第二抗原结合位点包括具有分别具有SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的VH；以及具有分别具有SEQ ID NO:119、120和121的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3的VL。在一些实施方案中，结合HER2的第二抗原结合位点包括具有与SEQ ID NO:195的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列的VH，以及具有与SEQ ID NO:196的氨基酸序列至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)相同的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，结合HER2的第二抗原结合位点为单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，scFv的VL经由柔性接头连接至scFv的VH。在一些实施方案中，柔性接头具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv的VL位于scFv的VH的N-末端。在一些实施方案中，scFv的VH与scFv的VL形成二硫桥(例如，在scFv的VH的残基C44与scFv的VL的残基C100之间)。在一些实施方案中，scFv具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体Fc结构域包含连接至结合NKG2D的Fab的第一抗体Fc序列和连接至结合HER2的scFv的第二抗体Fc序列。在一些实施方案中，第一抗体Fc序列连接至Fab的重链部分。在一些实施方案中，scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接至第二抗体Fc序列。在一些实施方案中，第一和第二抗体Fc序列各自包含人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。在一些实施方案中，第一和第二抗体Fc序列各自包含与野生型人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和第二抗体Fc序列包含促进异源二聚化的不同突变。在一些实施方案中，第一抗体Fc序列为包含K360E和K409W置换的人IgG1 Fc序列。在一些实施方案中，第二抗体Fc序列为包含Q347R、D399V和F405T置换的人IgG1 Fc序列。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白包括分别具有SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:142的氨基酸序列的第一多肽、第二多肽和第三多肽。

多特异性结合蛋白的产生

上面描述的多特异性结合蛋白可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术来制备。例如，可以将编码第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；并且可以将第一、第二和第三表达载体一起稳定地转染到宿主细胞中以产生多聚蛋白。

本领域技术人员应理解，在蛋白质的生产和/或储存期间，N-末端谷氨酸(E)或谷氨酰胺(Q)可以环化形成内酰胺(例如，自发地或由生产和/或储存期间存在的酶催化)。因此，在其中多肽的氨基酸序列的N-末端残基为E或Q的一些实施方案中，本文还涵盖其中E或Q被替换为焦谷氨酸的相应氨基酸序列。

本领域技术人员还应理解，在蛋白质生产和/或储存期间，蛋白质的C-末端赖氨酸(K)可以被移除(例如，自发地或由生产和/或储存期间存在的酶催化)。K的这种移除常在其C-末端处包括Fc结构域的蛋白质中观察到。因此，在其中多肽(例如，抗体Fc多肽)的氨基酸序列的C-末端残基为K的一些实施方案中，本文还涵盖了K被移除的相应氨基酸序列。

为了取得多特异性结合蛋白的最高产率，可以探索第一、第二和第三表达载体的不同比率以确定转染到宿主细胞中的最佳比率。转染后，可以使用本领域已知的方法如有限稀释、ELISA、FACS、显微镜术或Clonepix分离单克隆用于细胞库生成。

可以在适合于生物反应器放大并维持多特异性结合蛋白的表达的条件下培养克隆。可以使用本领域已知的方法分离和纯化多特异性结合蛋白，包括离心、深层过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用、交换层析和混合模式层析。

药物制剂

本公开还提供了含有浓度大于50mg/mL的本文公开的多特异性结合蛋白(例如，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)的药物组合物和药物制剂。所述药物制剂含有一种或多种赋形剂并保持在一定的pH下。如本文所用，术语“赋形剂”指的是添加到制剂中以提供所需的物理或化学性质例如pH、克分子渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的任何非治疗剂。

赋形剂和pH

本发明的药物组合物或药物制剂中的一种或多种赋形剂含有缓冲剂。如本文所用，术语“缓冲剂”是指当添加到水溶液中时能够在添加酸或碱时或在用溶剂稀释时保护溶液免于发生pH变化的一种或多种组分。除了磷酸盐缓冲剂之外，还可以使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、组氨酸缓冲剂等，在这种情况下，钠、钾或铵离子可以充当抗衡离子。

在某些实施方案中，缓冲剂或缓冲体系包括至少一种具有与pH 5.5-7.4的范围完全或部分重叠的缓冲范围的缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂具有约6.0±0.5的pKa。在某些实施方案中，缓冲剂含有组氨酸缓冲剂。在某些实施方案中，组氨酸以5至100mM、10至100mM、15至100mM、20至100mM、5至50mM、10至50mM、15至100mM、20至100mM、5至25mM、10至25mM、15至25mM、20至25mM、5至20mM、10至20mM、或15至20mM的浓度存在。在某些实施方案中，组氨酸以5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或50mM的浓度存在。在某些实施方案中，组氨酸以20mM的浓度存在。

本文公开的药物组合物或药物制剂可具有5.5至6.5的pH。例如，在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂具有5.5至6.5(即，6.0±0.5)、5.6至6.4(即，6.0±0.4)、5.7至6.3(即，6.0±0.3)、5.8至6.2(即，6.0±0.2)、5.9至6.1(即，6.0±0.1)或5.95至6.05(即，6.0±0.05)的pH。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂具有5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5的pH。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂具有6.0的pH。根据科学舍入规则，大于或等于5.95并小于或等于6.05的pH被舍入为6.0。

在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂的缓冲体系含有10至25mM的组氨酸，pH为6.0±0.2。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂的缓冲体系含有20mM的组氨酸，pH为6.0±0.2。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂的缓冲体系含有10至25mM的组氨酸，pH为6.0±0.05。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂的缓冲体系含有20mM的组氨酸，pH为6.0±0.05。

本文公开的药物组合物或药物制剂中的一种或多种赋形剂还可含有糖或糖醇。糖和糖醇可在药物组合物或药物制剂中用作热稳定剂。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有糖，例如单糖(葡萄糖、木糖或赤藓糖醇)、二糖(例如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖或半乳糖)或寡糖(例如，水苏糖)。在特定的实施方案中，药物组合物或药物制剂含有蔗糖。在某些实施方案中，药物组合物含有糖醇，例如衍生自单糖(例如，甘露糖醇、山梨糖醇或木糖醇)的糖醇、衍生自二糖(例如，乳糖醇或麦芽糖醇)的糖醇或衍生自寡糖的糖醇。在特定的实施方案中，药物组合物或药物制剂含有山梨糖醇。

制剂内所含的糖或糖醇的量可以根据具体情况和使用制剂的预期目的而异。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有50至300mM、50至250mM、100至300mM、100至250mM、150至300mM、150至250mM、200至300mM、200至250mM、或250至300mM的糖或糖醇。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有50mM、75mM、100mM、125mM、150mM、200mM、250mM或300mM的糖或糖醇。在特定的实施方案中，药物组合物或药物制剂含有250mM的糖或糖醇(例如，蔗糖或山梨糖醇)。

本文公开的药物组合物或药物制剂中的一种或多种赋形剂还含有表面活性剂。如本文所用，术语“表面活性剂”是指既含有疏水部分(例如，烷基链)又含有亲水部分(例如，羧基和羧酸根基团)的表面活性分子。表面活性剂可用于药物组合物或药物制剂中以减少治疗性蛋白质的聚集。适用于所述药物组合物或药物制剂中的表面活性剂通常是非离子表面活性剂并且包括但不限于聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)；失水山梨糖醇酯及衍生物；Triton；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-椰油酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-或异硬脂酰胺基丙基甜菜碱(例如，月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-或异硬脂酰胺基丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛磺酸二钠；和MONAQUAT^TM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics、PF68等)。在某些实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯。在某些实施方案中，表面活性剂为聚山梨醇酯80。

本发明的药物组合物或药物制剂内包含的非离子表面活性剂的量可以根据制剂所需的具体性质以及预期使用制剂的特定环境和目的而异。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有0.005％至0.5％、0.005％至0.2％、0.005％至0.1％、0.005％至0.05％、0.005％至0.02％、0.005％至0.01％、0.01％至0.5％、0.01％至0.2％、0.01％至0.1％、0.01％至0.05％、或0.01％至0.02％的非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％的非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)。非离子表面活性剂的浓度以％(w/v)值提供。

在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂是等张的。“等张”制剂为具有与人体血液基本上相同的渗透压的制剂。等张制剂通常具有约250至350mOsmol/kgH₂O的渗透压。等张性可以使用蒸气压或冰冷冻型渗透压计来测量。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂的克分子渗透压浓度为250至350mOsmol/kgH₂O。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂的克分子渗透压浓度为300至350mOsmol/kgH₂O。

药物组合物或药物制剂中可以包含物质如糖、糖醇和NaCl以获得所需的克分子渗透压浓度。在某些实施方案中，如果有的话，药物组合物或药物制剂中的NaCl浓度等于或低于10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM、0.5mM、0.1mM、50μM、10μM、5μM或1μM。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂中的NaCl浓度低于检测限。在某些实施方案中，在制备药物组合物或药物制剂时不添加NaCl。

本文公开的药物组合物或药物制剂还可包含一种或多种其他物质，如增量剂或防腐剂。“增量剂”为增加冻干混合物的质量并有助于冻干饼的物理结构的化合物(例如，方便保持开孔结构的基本上均匀的冻干饼的生产)。示意性的增量剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干制剂可含有这样的增量剂。防腐剂减少细菌作用并可例如方便多次使用(多剂量)制剂的生产。

多特异性结合蛋白可以以高浓度(例如，大于50mg/mL)配制在药物组合物或药物制剂中。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有大于或等于60mg/mL、大于或等于70mg/mL、大于或等于80mg/mL、大于或等于90mg/mL、大于或等于100mg/mL、大于或等于125mg/mL、大于或等于150mg/mL、大于或等于175mg/mL、或大于或等于200mg/mL的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有60-250mg/mL、60-225mg/mL、60-200mg/mL、60-175mg/mL、50-150mg/mL、60-150mg/mL、60-125mg/mL、60-100mg/mL、60-90mg/mL、60-80mg/mL、60-70mg/mL、70-250mg/mL、70-225mg/mL、70-200mg/mL、70-175mg/mL、70-150mg/mL、70-150mg/mL、70-125mg/mL、70-100mg/mL、70-90mg/mL、70-80mg/mL、80-250mg/mL、80-225mg/mL、80-200mg/mL、80-175mg/mL、80-150mg/mL、80-150mg/mL、80-125mg/mL、80-100mg/mL、80-90mg/mL、90-250mg/mL、90-225mg/mL、90-200mg/mL、90-175mg/mL、90-150mg/mL、90-150mg/mL、90-125mg/mL、90-100mg/mL、100-250mg/mL、100-225mg/mL、100-200mg/mL、100-175mg/mL、100-150mg/mL、100-125mg/mL、125-250mg/mL、125-225mg/mL、125-200mg/mL、125-175mg/mL、125-150mg/mL、150-250mg/mL、150-225mg/mL、150-200mg/mL、150-175mg/mL、175-250mg/mL、175-225mg/mL、175-200mg/mL、200-250mg/mL、或200-225mg/mL的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、或220mg/mL的多特异性结合蛋白。

示例性制剂

在某些实施方案中，本发明的药物组合物或药物制剂含有多特异性结合蛋白、组氨酸、糖或糖醇(例如，蔗糖或山梨糖醇)和聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为5.5至6.5。

在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、10至25mM的组氨酸、200至300mM的糖或糖醇(例如，蔗糖或山梨糖醇)和0.005％至0.05％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的糖或糖醇(例如，蔗糖或山梨糖醇)和0.01％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的糖或糖醇(例如，蔗糖或山梨糖醇)和0.01％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为5.8至6.2。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的糖或糖醇(例如，蔗糖或山梨糖醇)和0.01％的聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)，pH为5.95至6.05。

在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、10至25mM的组氨酸、200至300mM的蔗糖和0.005％至0.05％的聚山梨醇酯80，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的蔗糖和0.01％的聚山梨醇酯80，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的蔗糖和0.01％的聚山梨醇酯80，pH为5.8至6.2。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的蔗糖和0.01％的聚山梨醇酯80，pH为5.95至6.05。

在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、10至25mM的组氨酸、200至300mM的山梨糖醇和0.005％至0.05％的聚山梨醇酯80，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的山梨糖醇和0.01％的聚山梨醇酯80，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的山梨糖醇和0.01％的聚山梨醇酯80，pH为5.8至6.2。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至250mg/mL的多特异性结合蛋白、20mM的组氨酸、250mM的山梨糖醇和0.01％的聚山梨醇酯80，pH为5.95至6.05。

在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至50mg/mL的多特异性结合蛋白、5mM至50mM的组氨酸、50mM至300mM的蔗糖和约0.005％至0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80，pH为5.5至6.5。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有10至25mg/mL的多特异性结合蛋白、10mM至25mM的组氨酸、150mM至300mM的蔗糖和约0.005％至0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，pH为5.8至6.2。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有约15mg/mL的多特异性结合蛋白、约20mM的组氨酸、约250mM的蔗糖和约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯80，pH为约6.0。

多特异性结合蛋白的稳定性

本文公开的药物组合物或药物制剂表现出高水平的稳定性。当药物制剂内的多特异性结合蛋白在限定的条件下储存后保留可接受程度的物理性质、化学结构和/或生物功能时，该制剂是稳定的。

稳定性可以通过测定在限定温度下储存限定的时间量后制剂中保持天然构象的多特异性结合蛋白的百分比来量度。处于天然构象的蛋白质的百分比可以通过例如尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻高效液相色谱法)来测定，其中处于天然构象的蛋白质不聚集(在高分子量级分中洗脱)或降解(在低分子量级分中洗脱)。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，如通过尺寸排阻色谱法所测定，多于95％、96％、97％、98％或99％的多特异性结合蛋白具有天然构象。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，如通过尺寸排阻色谱法所测定，多于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的多特异性结合蛋白具有天然构象。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，如通过尺寸排阻色谱法所测定，少于0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的多特异性结合蛋白形成高分子量复合物(即，具有比天然蛋白质高的分子量)。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，如通过尺寸排阻色谱法所测定，少于1％、2％、3％、4％或5％的多特异性结合蛋白形成高分子量复合物(即，具有比天然蛋白质高的分子量)。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，如通过尺寸排阻色谱法所测定，少于0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的多特异性结合蛋白降解(即，具有比天然蛋白质低的分子量)。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，如通过尺寸排阻色谱法所测定，少于1％、1.5％、2％、2.5％或3％的多特异性结合蛋白降解(即，具有比天然蛋白质低的分子量)。

还可以通过测定相对于蛋白质的主要部分(“主要电荷形式”)而言存在于更酸性级分(“酸性形式”)中的多特异性结合蛋白的百分比来度量稳定性。虽然不希望受理论束缚，但蛋白质的脱酰胺化可能导致其变得带更多的负电荷并因此相对于未脱酰胺化的蛋白质更具酸性(参见例如Robinson,Protein Deamidation,(2002)PNAS 99(8):5283-88)。蛋白质的酸性形式的百分比可以通过离子交换色谱法(例如，阳离子交换高效液相色谱法)或成像毛细管等电聚焦(icIEF)来测定。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，药物组合物或药物制剂中至少50％、60％、70％、80％或90％的多特异性结合蛋白呈主要电荷形式。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，药物组合物或药物制剂中至少15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的多特异性结合蛋白呈主要电荷形式。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，药物组合物或药物制剂中不多于10％、20％、30％、40％或50％的多特异性结合蛋白呈酸性形式。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，药物组合物或药物制剂中不多于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％或85％的多特异性结合蛋白呈酸性形式。

还可以通过在用十二烷基硫酸钠(SDS)使蛋白质变性后进行电泳测定多特异性结合蛋白的纯度来度量稳定性。在存在或不存在减少蛋白质二硫键的试剂(例如，β-巯基乙醇)的情况下，蛋白质样品都可以变性。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，如通过在还原条件下(例如，在β-巯基乙醇的存在下)使蛋白质样品变性后进行毛细管电泳所测量，药物组合物或药物制剂中多特异性结合蛋白的纯度为至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，如通过在还原条件下(例如，在β-巯基乙醇的存在下)使蛋白质样品变性后进行毛细管电泳所测量，药物组合物或药物制剂中多特异性结合蛋白的纯度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，如通过在非还原条件下使蛋白质样品变性后进行毛细管电泳所测量，药物组合物或药物制剂中多特异性结合蛋白的纯度为至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，如通过在非还原条件下使蛋白质样品变性后进行毛细管电泳所测量，药物组合物或药物制剂中多特异性结合蛋白的纯度为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

还可以通过用动态光散射测定蛋白质溶液的参数来度量稳定性。Z-均值和多分散性指数(PDI)值表示溶液中颗粒的平均直径，当溶液中存在聚集体时，这些测量值会增加。单体％Pd值表示检测到的不同单体的分布，其中较低的值表示单分散溶液，这是优选的。通过DLS检测到的单体尺寸可用于确认主要群体为单体并表征可能存在的任何更高阶聚集体。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，药物组合物或药物制剂的Z-均值增加不超过5％、10％或15％。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，药物组合物或药物制剂的Z-均值增加不超过5％、10％、15％、20％或25％。在某些实施方案中，在于4℃温育3周后，药物组合物或药物制剂的PDI值增加不超过10％、20％、30％、40％或50％。在某些实施方案中，在于50℃温育3周后，药物组合物或药物制剂的PDI值增加不超过2倍、3倍、4倍或5倍。

确定药物组合物或药物制剂中多特异性结合蛋白的稳定性的示例性方法描述于本公开的实施例1中。另外，可以通过测量多特异性结合蛋白与其靶标的结合亲和力或多特异性结合蛋白在某些体外测定如WO 2018/152518中描述的NK细胞活化测定和细胞毒性测定中的生物活性来评估蛋白质的稳定性。

剂型

药物组合物或药物制剂可以作为液体制剂或冻干形式制备和储存。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂为在2-8℃(例如，4℃)下储存的液体制剂或在-20℃或更低温度下储存的冷冻制剂。制剂中的糖或糖醇用作冻干保护剂。

在药物使用之前，药物组合物或药物制剂可以在适合于施用途径的水性载体中稀释或重构。其他示例性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏液或右旋糖溶液。例如，当制备用于静脉内施用时，药物组合物或药物制剂可以在0.9％的氯化钠(NaCl)溶液或0.9％的NaCl溶液和0.01％的聚山梨醇酯80中稀释。在某些实施方案中，经稀释的药物组合物或药物制剂是等张的并适合通过静脉内输注来施用。

药物组合物或药物制剂含有适合储存的浓度的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有浓度为10-50mg/mL、10-40mg/mL、10-30mg/mL、10-25mg/mL、10-20mg/mL、10-15mg/mL、15-50mg/mL、15-40mg/mL、15-30mg/mL、15-25mg/mL、15-20mg/mL、20-50mg/mL、20-40mg/mL、20-30mg/mL、20-25mg/mL、30-50mg/mL、30-40mg/mL或40-50mg/mL的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有浓度为10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL或50mg/mL的多特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂包装在容器(例如，小瓶、袋子、笔或注射器)中。在某些实施方案中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方案中，容器中多特异性结合蛋白的量适合作为单剂量施用。在某些实施方案中，容器中多特异性结合蛋白的量适合以多剂量施用。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有0.1至2000mg的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有1至2000mg、10至2000mg、20至2000mg、50至2000mg、100至2000mg、200至2000mg、500至2000mg、1000至2000mg、0.1至1000mg、1至1000mg、10至1000mg、20至1000mg、50至1000mg、100至1000mg、200至1000mg、500至1000mg、0.1至500mg、1至500mg、10至500mg、20至500mg、50至500mg、100至500mg、200至500mg、0.1至200mg、1至200mg、10至200mg、20至200mg、50至200mg、100至200mg、0.1至100mg、1至100mg、10至100mg、20至100mg、50至100mg、0.1至50mg、1至50mg、10至50mg、20至50mg、0.1至20mg、1至20mg、10至20mg、0.1至10mg、1至10mg、或0.1至1mg的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有0.1mg、1mg、2mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1500mg或2000mg的多特异性结合蛋白。

治疗用途

与皮质类固醇联合使用

在一个方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂(作为单一疗法或在联合疗法中施用)和治疗有效量的皮质类固醇以减少对所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂的一种或多种输注相关反应。本公开还提供了一种本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂(作为单一疗法或在联合疗法中施用)，其与治疗有效量的皮质类固醇联合地用在治疗癌症的方法中，与皮质类固醇联用是为了减少对所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂的一种或多种输注相关反应。在联合疗法中，本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂可以与免疫疗法如抗-PD-1抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗)和/或化疗如细胞骨架破坏化疗剂(例如，紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西紫杉醇)联合。

可用于本发明中的皮质类固醇通常包括由肾上腺皮质产生的类固醇，如糖皮质激素和盐皮质激素，以及具有抗炎活性的天然存在的皮质类固醇的合成类似物和衍生物。在某些实施方案中，皮质类固醇为糖皮质激素。糖皮质激素结合糖皮质激素受体并通过抑制免疫反应来减轻炎症。在某些实施方案中，皮质类固醇为盐皮质激素。盐皮质激素结合盐皮质激素受体并起到调节血清中的Na⁺/K⁺浓度的作用。一些皮质类固醇可以同时具有糖皮质激素和盐皮质激素的功能。皮质类固醇的实例见公开于美国专利号10,799,599中。在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的皮质类固醇选自甲基泼尼松龙、地塞米松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、氟替卡松、氟米松、氟轻松、布地奈德、倍氯米松、环索奈德、可的松、去炎松、倍他米松、地夫可特、二氟泼尼酯、氯替泼诺、帕拉米松、替可的松、醛固酮、氯泼尼醇、可的伐唑、脱氧皮质酮、地奈德、去羟米松、二氟可龙、氟氯缩松、氟氢可的松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟可丁丁酯、氟可的松、氟可龙、氟米龙、氟氢缩松、哈西奈德、艾可米松(icomethasone)、甲基强的松、莫米松、罗氟奈德、RPR 106541及其相应的药学上可接受的衍生物，如二丙酸倍氯米松(无水物或一水合物)、单丙酸倍氯米松、地塞米松21-异烟酸酯、丙酸氟替卡松、醋丁艾可米松(icomethasone enbutate)、替可的松21-新戊酸酯和曲安奈德以及它们的药学上可接受的盐和/或衍生物。

在某些实施方案中，糖皮质激素为甲基泼尼松龙。甲基泼尼松龙的示例性有效量可以在8至200mg、20至200mg、25至200mg、50至200mg、75至200mg、100至200mg、125至200mg、150至200mg、175至200mg、25至175mg、50至175mg、75至175mg、100至175mg、125至175mg、150至175mg、20至150mg、25至150mg、50至150mg、75至150mg、100至150mg、125至150mg、25至125mg、50至125mg、75至125mg、100至125mg、25至100mg、50至100mg、75至100mg、25至75mg、50至75mg、25至50mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg或约200mg的范围内。在某些实施方案中，甲基泼尼松龙的有效量为约125mg。在某些实施方案中，通过口服施用的甲基泼尼松龙的有效量为8mg、16mg、32mg、48mg、64mg、80mg、96mg或120mg。

在某些实施方案中，糖皮质激素为地塞米松。地塞米松的示例性有效量可以在8-200mg、20-200mg、50-200mg、100-200mg、20-150mg、50-150mg、50-100mg、或100-150mg的范围内。在某些实施方案中，通过口服施用的地塞米松的有效量为20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、125mg或150mg。在某些实施方案中，通过口服施用的地塞米松的有效量为8mg、16mg、32mg、48mg、64mg、80mg、96mg或120mg。

在某些实施方案中，皮质类固醇肠胃外施用。在某些实施方案中，皮质类固醇静脉内施用。在某些实施方案中，皮质类固醇经口施用。

皮质类固醇可以在施用多特异性结合蛋白之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，皮质类固醇在施用多特异性结合蛋白之前(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之前)6小时内、5小时内、4小时内、3小时内、2小时内、1小时内、30分钟内、15分钟内或即刻施用。在某些实施方案中，皮质类固醇在施用多特异性结合蛋白之前(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之前)1小时内施用。在某些实施方案中，皮质类固醇与多特异性结合蛋白的施用同时施用。在某些实施方案中，将皮质类固醇和多特异性结合蛋白稀释到向受试者施用的单一药物组合物中。在某些实施方案中，皮质类固醇的施用持续时间和多特异性结合蛋白的施用持续时间完全或部分重叠。在某些实施方案中，皮质类固醇在施用多特异性结合蛋白之后(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之后)2小时、1小时或30分钟内施用。

在某些实施方案中，皮质类固醇在第一个周期的第1天施用(即，与第一剂量的多特异性结合蛋白联用)。在某些实施方案中，皮质类固醇仅在第一个周期的第1天施用(即，与第一剂量的多特异性结合蛋白联用)。在某些实施方案中，如果输注相关反应继续存在或复发，则进一步施用皮质类固醇。在某些实施方案中，输注相关反应包括持续性皮疹、腹泻、结肠炎、自身免疫性肝炎、关节炎、肾小球肾炎、心肌病或葡萄膜炎或其他炎症性眼部病患。

在某些实施方案中，皮质类固醇(例如，甲基泼尼松龙)在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前30至90分钟、40至90分钟、50至90分钟、60至90分钟、70至90分钟、80至90分钟、30至80分钟、40至80分钟、50至80分钟、60至80分钟、70至80分钟、30至70分钟、40至70分钟、50至70分钟、60至70分钟、30至60分钟、40至60分钟、50至60分钟、30至50分钟、40至50分钟、30至40分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟或约90分钟施用。

在某些实施方案中，受试者接受前驱给药治疗，包括在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂的60分钟内静脉内施用约125mg甲基泼尼松龙。在某些实施方案中，前驱给药治疗还包括在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前30至60分钟静脉内或口服施用40至50mg苯海拉明和800至1000mg对乙酰氨基酚。在某些实施方案中，在前驱给药治疗后向受试者施用约1.6、5.2、10、15或20mg/kg的多特异性结合蛋白(例如，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)。

对本文公开的多特异性结合蛋白的示例性输注相关反应包括细胞因子释放综合征、过敏反应、发冷、发烧/发热、低血压、高血压、僵直、头痛、头晕、瘙痒、喉咙痛、喉头水肿、血管性水肿、发红/潮红、皮疹/荨麻疹、支气管痉挛、心动过速、心动过缓、心房纤颤、缺氧、呼吸窘迫/呼吸困难/呼吸短促/喘不过气的感觉、胸闷、恶心、呕吐、疼痛(例如，胸痛、背痛)、颤抖、震颤、肌痛、疲倦、失眠、虚弱、超敏反应和腹泻。Shimabukuro-Vornhagen等人描述了细胞因子释放综合征的临床表现，包括但不限于发烧(例如，高烧)、疲劳、头痛、皮疹、关节痛、肌痛、低血压、需要血管升压类药物的循环性休克、血管渗漏、弥散性血管内凝血和多器官系统衰竭。在某些实施方案中，皮质类固醇的共同施用减少受试者中的一种或多种输注相关反应。

与抗组胺药联合使用

可以使用抗组胺药来避免或减轻对多特异性结合蛋白的变态反应(例如，过敏反应)。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的抗组胺药。示例性的抗组胺药见公开于美国专利号10,898,693中。在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的抗组胺药选自crivastine、氮卓斯汀、比拉斯汀(bilastine)、溴苯那敏、布可利嗪、溴苯海拉明、卡比沙明、西替利嗪、赛克利嗪、氯苯那敏、氯苯海拉明、氯马斯汀、色甘酸、赛庚啶、地氯雷他定、右溴苯那敏、右氯苯那敏、晕海宁、二甲茚定、苯海拉明、抗敏安、依巴斯汀、恩布拉敏、非索非那定、羟嗪、左西替利嗪、氯雷他定、奈多罗米、奥洛他定、苯茚达明、苯吡丙胺、苯托沙敏、异丙嗪、吡拉明、卢帕他定、曲吡那敏、曲普利啶及其组合。在某些实施方案中，抗组胺药为苯海拉明。在某些实施方案中，苯海拉明的治疗有效量为10至100mg、20至100mg、30至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、80至100mg、90至100mg、10至90mg、20至90mg、30至90mg、40至90mg、50至90mg、60至90mg、70至90mg、80至90mg、10至80mg、20至80mg、30至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、70至80mg、10至70mg、20至70mg、30至70mg、40至70mg、50至70mg、60至70mg、10至60mg、20至60mg、30至60mg、40至60mg、50至60mg、10至50mg、20至50mg、30至50mg、40至50mg、20至40mg、30至40mg、20至30mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg或约100mg。在某些实施方案中，苯海拉明的治疗有效量为40至50mg。

在某些实施方案中，抗组胺药肠胃外施用。在某些实施方案中，抗组胺药静脉内施用。在某些实施方案中，抗组胺药经口施用。

抗组胺药可以在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，抗组胺药在施用本文公开的多特异性结合蛋白(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之前)、药物组合物或药物制剂之前2小时内、1.5小时内、1小时(60分钟)内、45分钟内、30分钟内、15分钟内或即刻施用。在某些实施方案中，抗组胺药与每一剂量的多特异性结合蛋白一起施用。

在某些实施方案中，抗组胺药(例如，苯海拉明)在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前30至90分钟、40至90分钟、50至90分钟、60至90分钟、70至90分钟、80至90分钟、30至80分钟、40至80分钟、50至80分钟、60至80分钟、70至80分钟、30至70分钟、40至70分钟、50至70分钟、60至70分钟、30至60分钟、40至60分钟、50至60分钟、30至50分钟、40至50分钟、30至40分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟或约90分钟施用。

在某些实施方案中，受试者接受前驱给药治疗，包括在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前30至60分钟静脉内或经口施用40至50mg苯海拉明。在某些实施方案中，前驱给药治疗还包括在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前静脉内或口服施用800至100mg对乙酰氨基酚。

当本文公开的治疗方法包括多个剂量(例如，五个或更多个剂量)的多特异性结合蛋白时，在某些实施方案中，抗组胺药与多特异性结合蛋白的第一剂量、前两个剂量、前三个剂量、前四个剂量或前五个剂量一起施用。

与镇痛剂和退烧药联合使用

可以使用镇痛剂来缓解因施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂而导致的疼痛，无论是作为单一疗法施用还是作为与抗-PD-1抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)或细胞骨架破坏化疗剂的联合疗法施用。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的镇痛剂。示例性的镇痛剂见公开于美国专利申请公开号2015/0342989和美国专利号10,899,834中。在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的镇痛剂选自对乙酰氨基酚、水杨酰胺、双水杨酸酯、水杨酸甲酯、水杨酸镁、faislamine、乙柳酰胺、二氟尼柳、水杨酸胆碱镁、扑炎痛/贝诺酯和阿莫西匹林(amoxiprin)、乙酰水杨酸酯、醋氯芬酸(ceclofenac)、阿西美辛、阿氯芬酸、溴芬酸、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、萘丁美酮、奥沙美辛、丙谷美辛、舒林酸、托美汀、iminoprofen、苯恶洛芬、卡洛芬、右旋布洛芬、右酮洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生、吲哚洛芬、酮洛芬、酮咯酸、洛索洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸、甲芬那酸、氟灭酸、甲氯芬那酸、托芬那酸、屈噁昔康、氯诺昔康、美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康、安乃近(dipyrone)、阿扎丙宗、氯非宗、酮基保太松、安乃近(metamizole)、单苯基保泰松、羟基保泰松、非那宗、保泰松、苯磺唑酮、decoxib、罗非考昔、帕瑞考昔、依托考昔、可待因、二氢可待因、吗啡或吗啡衍生物或其药学上可接受的盐、二乙酰吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、左啡诺、羟吗啡酮、阿芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、度冷丁、美沙酮、纳布啡、丙氧芬和喷他佐辛及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，镇痛剂为对乙酰氨基酚。在某些实施方案中，对乙酰氨基酚的治疗有效量在325-1000mg、400-1000mg、500-1000mg、600-1000mg、700-1000mg、800-1000mg、900-1000mg、325-800mg、400-800mg、500-800mg、600-800mg、700-800mg、325-600mg、400-600mg或500-600mg的范围内。在某些实施方案中，对乙酰氨基酚的有效量为325mg、500mg、650mg、700mg、800mg、900mg或1000mg。

在某些实施方案中，镇痛剂肠胃外施用。在某些实施方案中，镇痛剂静脉内施用。在某些实施方案中，镇痛剂经口施用。

镇痛剂可以在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，镇痛剂在施用多特异性结合蛋白之前(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之前)2小时内、1.5小时内、1小时(60分钟)内、45分钟内、30分钟内、15分钟内或即刻施用。在某些实施方案中，镇痛剂与多特异性结合蛋白的施用同时施用。在某些实施方案中，将镇痛剂和多特异性结合蛋白稀释到向受试者施用的单一药物组合物中。在某些实施方案中，镇痛剂(例如，对乙酰氨基酚)与每一剂量的多特异性结合蛋白一起施用。

在某些实施方案中，镇痛剂(例如，对乙酰氨基酚)在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前30至90分钟、40至90分钟、50至90分钟、60至90分钟、70至90分钟、80至90分钟、30至80分钟、40至80分钟、50至80分钟、60至80分钟、70至80分钟、30至70分钟、40至70分钟、50至70分钟、60至70分钟、30至60分钟、40至60分钟、50至60分钟、30至50分钟、40至50分钟、30至40分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟或约90分钟施用。

在某些实施方案中，镇痛剂的施用持续时间和多特异性结合蛋白的施用持续时间完全或部分重叠。在某些实施方案中，镇痛剂在施用多特异性结合蛋白之后(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之后)2小时、1小时或30分钟内施用。

可以使用退烧药来防止或减少因施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂而导致的发烧，无论是作为单一疗法施用还是作为与抗-PD-1抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)或细胞骨架破坏化疗剂的联合疗法施用。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的退烧药。示例性的退烧药见公开于美国专利申请公开号2015/0342989中。在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的退烧药选自对乙酰氨基酚、水杨酰胺、双水杨酸酯、水杨酸甲酯、水杨酸镁、faislamine、乙柳酰胺、二氟尼柳、水杨酸胆碱镁、扑炎痛/贝诺酯和阿莫西匹林(amoxiprin)、乙酰水杨酸酯、醋氯芬酸(ceclofenac)、阿西美辛、阿氯芬酸、溴芬酸、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、萘丁美酮、奥沙美辛、丙谷美辛、舒林酸、托美汀、iminoprofen、苯恶洛芬、卡洛芬、右旋布洛芬、右酮洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生、吲哚洛芬、酮洛芬、酮咯酸、洛索洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸、甲芬那酸、氟灭酸、甲氯芬那酸、托芬那酸、屈噁昔康、氯诺昔康、美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康、安乃近(dipyrone)、阿扎丙宗、氯非宗、酮基保太松、安乃近(metamizole)、单苯基保泰松、羟基保泰松、非那宗、保泰松、苯磺唑酮、decoxib、罗非考昔、帕瑞考昔和依托考昔。在某些实施方案中，退烧药为对乙酰氨基酚。在某些实施方案中，对乙酰氨基酚的治疗有效量在325-1000mg、400-1000mg、500-1000mg、600-1000mg、700-1000mg、800-1000mg、900-1000mg、325-800mg、400-800mg、500-800mg、600-800mg、700-800mg、325-600mg、400-600mg或500-600mg的范围内。在某些实施方案中，对乙酰氨基酚的有效量为325mg、500mg、650mg、700mg、800mg、900mg或1000mg。

在某些实施方案中，退烧药肠胃外施用。在某些实施方案中，退烧药静脉内施用。在某些实施方案中，退烧药经口施用。

退烧药可以在施用多特异性结合蛋白之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，退烧药在施用多特异性结合蛋白之前(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之前)2小时、1.5小时、1小时(60分钟)、45分钟、30分钟或15分钟内施用。在某些实施方案中，退烧药与多特异性结合蛋白的施用同时施用。在某些实施方案中，将退烧药和多特异性结合蛋白稀释到向受试者施用的单一药物组合物中。在某些实施方案中，退烧药的施用持续时间和多特异性结合蛋白的施用持续时间完全或部分重叠。在某些实施方案中，退烧药在施用多特异性结合蛋白之后(例如，在开始施用多特异性结合蛋白之后)2小时、1小时或30分钟内施用。在某些实施方案中，退烧药(例如，对乙酰氨基酚)与每一剂量的多特异性结合蛋白一起施用。

退烧药可以在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，镇痛剂(例如，对乙酰氨基酚)在施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前30至90分钟、40至90分钟、50至90分钟、60至90分钟、70至90分钟、80至90分钟、30至80分钟、40至80分钟、50至80分钟、60至80分钟、70至80分钟、30至70分钟、40至70分钟、50至70分钟、60至70分钟、30至60分钟、40至60分钟、50至60分钟、30至50分钟、40至50分钟、30至40分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟或约90分钟施用。

在某些实施方案中，受试者接受前驱给药治疗，包括在施用所公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前30至60分钟静脉内或经口施用800至1000mg对乙酰氨基酚。在某些实施方案中，前驱给药治疗还包括在施用所公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂之前静脉内或口服施用40至50mg苯海拉明。

给药方案

在某些实施方案中，所述方法包括在初始四周治疗周期中于第1天、第8天和第15天向有此需要的受试者施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂(例如，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)。在某些实施方案中，在初始四周治疗周期中仅在这三天向受试者施用所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂。在特定的实施方案中，在第22天不向受试者施用所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂。该方案为剂量强化时间安排，其设计为在治疗过程期间尽可能早地达到靶标的最大饱和度，同时最大限度地减少患者的输注负担。

在某些实施方案中，所述方法还包括在初始治疗周期之后的一个或多个后续四周治疗周期中的每一个中于第1天和第15天向受试者施用所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂。在某些实施方案中，在每个后续四周治疗周期中仅在这两天向受试者施用所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂。在特定的实施方案中，在第8天或第22天不向受试者施用所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂。其中受试者每两周一次接受多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂的施用的后续治疗周期设计为在受试者中维持多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂的一定水平。在某些实施方案中，受试者接受至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个后续治疗周期。在某些实施方案中，受试者接受后续治疗周期直至癌症消退。

在某些实施方案中，所述方法包括作为单一疗法向有此需要的受试者施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂(例如，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)。在某些实施方案中，所述方法包括在四周治疗周期中以一小时输注静脉内施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂(例如，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)。

在某些实施方案中，所述方法包括向有此需要的受试者施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂(例如，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)，历时45至75分钟、50至75分钟、55至75分钟、60至75分钟、65至75分钟、70至75分钟、45至70分钟、50至70分钟、55至70分钟、60至70分钟、65至70分钟、45至65分钟、50至65分钟、55至65分钟、60至65分钟、45至60分钟、50至60分钟、55至60分钟、45至135分钟、60至135分钟、75至135分钟、90至135分钟、105至135分钟、120至135分钟、45至120分钟、60至120分钟、75至120分钟、90至120分钟、105至120分钟、45至105分钟、60至105分钟、75至105分钟、90至105分钟、45至90分钟、60至90分钟、75至90分钟、45至75分钟、60至75分钟、45至60分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约90分钟、约105分钟或约120分钟。

在某些实施方案中，相对于受试者的体重而言，初始和后续治疗周期中的一剂或多剂多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂含有0.1-20mg/kg、0.1-10mg/kg、0.1-5mg/kg、0.1-2mg/kg、0.1-1mg/kg、0.1-0.5mg/kg、0.1-0.2mg/kg、0.2-20mg/kg、0.2-10mg/kg、0.2-5mg/kg、0.2-2mg/kg、0.2-1mg/kg、0.2-0.5mg/kg、0.5-20mg/kg、0.5-10mg/kg、0.5-5mg/kg、0.5-2mg/kg、0.5-1mg/kg、1-20mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg或1-2mg/kg的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，相对于受试者的体重而言，初始和后续治疗周期中的一剂或多剂多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂含有0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg的多特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，相对于受试者的体重而言，初始和后续治疗周期中的每一剂多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂含有0.1-20mg/kg、0.1-10mg/kg、0.1-5mg/kg、0.1-2mg/kg、0.1-1mg/kg、0.1-0.5mg/kg、0.1-0.2mg/kg、0.2-20mg/kg、0.2-10mg/kg、0.2-5mg/kg、0.2-2mg/kg、0.2-1mg/kg、0.2-0.5mg/kg、0.5-20mg/kg、0.5-10mg/kg、0.5-5mg/kg、0.5-2mg/kg、0.5-1mg/kg、1-20mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg或1-2mg/kg的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，相对于受试者的体重而言，初始和后续治疗周期中的每一剂多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂含有相同量的在0.1-20mg/kg、0.1-10mg/kg、0.1-5mg/kg、0.1-2mg/kg、0.1-1mg/kg、0.1-0.5mg/kg、0.1-0.2mg/kg、0.2-20mg/kg、0.2-10mg/kg、0.2-5mg/kg、0.2-2mg/kg、0.2-1mg/kg、0.2-0.5mg/kg、0.5-20mg/kg、0.5-10mg/kg、0.5-5mg/kg、0.5-2mg/kg、0.5-1mg/kg、1-20mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg或1-2mg/kg的范围内的多特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，初始和后续治疗周期中的每一剂含有0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，初始和后续治疗周期中的每一剂含有0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg的多特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，初始和后续治疗周期中的每一剂含有5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^-3mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^- ²mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg或20mg/kg的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，初始和后续治疗周期中的每一剂含有5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^-3mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^- ²mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或50mg/kg的多特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂静脉内施用。例如，在某些实施方案中，所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂通过静脉内输注施用，例如使用预填充袋、预填充笔或预填充注射器。在某些实施方案中，本文公开的药物组合物或药物制剂中的多特异性结合蛋白在施用前被稀释。例如，在某些实施方案中，用氯化钠稀释药物组合物或药物制剂并从250ml盐水袋静脉内施用。静脉内输注可以持续约一小时(例如，50至80分钟)。在某些实施方案中，将袋连接至包括管和/或针的通道。

在某些实施方案中，所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂皮下施用。例如，在某些实施方案中，所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂使用注射器或自动注射器通过皮下注射施用。在某些实施方案中，所述多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂通过在腹部、手臂或大腿处皮下注射施用。在特定的实施方案中，适合皮下施用的药物组合物或药物制剂含有浓度大于50mg/mL的多特异性结合蛋白，如上文在药物制剂小节中所述。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有大于或等于60mg/mL、大于或等于70mg/mL、大于或等于80mg/mL、大于或等于90mg/mL、大于或等于100mg/mL、大于或等于125mg/mL、大于或等于150mg/mL、大于或等于175mg/mL、或大于或等于200mg/mL的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有60-250mg/mL、60-225mg/mL、60-200mg/mL、60-175mg/mL、50-150mg/mL、60-150mg/mL、60-125mg/mL、60-100mg/mL、60-90mg/mL、60-80mg/mL、60-70mg/mL、70-250mg/mL、70-225mg/mL、70-200mg/mL、70-175mg/mL、70-150mg/mL、70-150mg/mL、70-125mg/mL、70-100mg/mL、70-90mg/mL、70-80mg/mL、80-250mg/mL、80-225mg/mL、80-200mg/mL、80-175mg/mL、80-150mg/mL、80-150mg/mL、80-125mg/mL、80-100mg/mL、80-90mg/mL、90-250mg/mL、90-225mg/mL、90-200mg/mL、90-175mg/mL、90-150mg/mL、90-150mg/mL、90-125mg/mL、90-100mg/mL、100-250mg/mL、100-225mg/mL、100-200mg/mL、100-175mg/mL、100-150mg/mL、100-125mg/mL、125-250mg/mL、125-225mg/mL、125-200mg/mL、125-175mg/mL、125-150mg/mL、150-250mg/mL、150-225mg/mL、150-200mg/mL、150-175mg/mL、175-250mg/mL、175-225mg/mL、175-200mg/mL、200-250mg/mL、或200-225mg/mL的多特异性结合蛋白。在某些实施方案中，药物组合物或药物制剂含有60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、或220mg/mL的多特异性结合蛋白。

适合治疗的癌症

本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂可用于治疗各种类型的癌症。在某些实施方案中，癌症为实体瘤。在某些其他实施方案中，癌症为脑癌、膀胱癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌或子宫癌。在还其他的实施方案中，癌症为血管化肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(例如，血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、肢端雀斑样痣样黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、胆道癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺癌、类癌、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚层窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、高血糖素瘤、心癌、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛瘤、上皮内瘤样病变、上皮内鳞状细胞瘤、肝内胆管癌、浸润性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波西肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、雀斑型恶性黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌、神经上皮腺癌、结节性黑色素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、脊柱癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑色素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系统癌、子宫颈癌、子宫体癌、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、疣状癌、VIPoma、外阴癌、分化良好的癌或威尔姆斯肿瘤。

在某些实施方案中，癌症为恶性血液病。在某些实施方案中，恶性血液病为白血病。在某些实施方案中，白血病为急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征、急性T-淋巴母细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病或慢性骨髓性白血病的骨髓原始细胞危象。

在特定的实施方案中，可以用其中多特异性结合蛋白的第二抗原结合位点结合HER2的本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂治疗的癌症的类型包括但不限于乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、NSCLC、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌和胆囊癌。在某些实施方案中，癌症为实体瘤。在某些实施方案中，癌症为局部晚期或转移性实体瘤。在某些实施方案中，癌症为胃癌(例如，HER2高或HER23+)。在某些实施方案中，癌症为尿路上皮膀胱癌(例如，表达HER2的尿路上皮膀胱癌)。在某些实施方案中，癌症为转移性乳癌(例如，转移性三阴性乳癌)。在某些实施方案中，癌症为实体瘤(例如，HER2高或HER23+)。

在多个实施方案中，本文公开了一种在有此需要的受试者中治疗HER2过表达胃癌的方法，其包括施用有效量的本文公开的多特异性结合蛋白或药物制剂。在某些实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为3+的HER2表达水平。在其他实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为2+的HER2表达水平和HER2基因扩增(例如，通过原位杂交测得)。

在多个实施方案中，本文还公开了一种在有此需要的受试者中治疗HER2过表达胃癌的方法，其包括施用抗-PD-1抗体(例如，纳武单抗)和有效量的本文公开的多特异性结合蛋白或药物制剂。在某些实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为3+的HER2表达水平。在其他实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为2+的HER2表达水平和HER2基因扩增(例如，通过原位杂交测得)。

在多个实施方案中，本文还公开了一种在有此需要的受试者中治疗HER2过表达胃癌的方法，其包括施用白蛋白结合型紫杉醇和有效量的本文公开的多特异性结合蛋白或药物制剂。在某些实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为3+的HER2表达水平。在其他实施方案中，癌症具有根据免疫组织化学评分为2+的HER2表达水平和HER2基因扩增(例如，通过原位杂交测得)。

在多个实施方案中，本文还公开了一种在有此需要的受试者中治疗HER2过表达胃癌的方法，其包括与纳武单抗联合并进一步与白蛋白结合型紫杉醇联合地施用(例如，经由静脉内输注)有效量的本文公开的多特异性结合蛋白或药物制剂。在某些实施方案中，胃癌具有根据免疫组织化学评分为3+的HER2表达水平。在其他实施方案中，胃癌具有根据免疫组织化学评分为2+的HER2表达水平和HER2基因扩增(例如，通过原位杂交测得)。

在多个实施方案中，本文公开了一种在有此需要的受试者中治疗转移性三阴性乳癌(TNBC)的方法，其包括施用有效量的本文公开的多特异性结合蛋白或药物制剂。

在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2阳性癌症。确定癌症中HER2表达的方法包括但不限于免疫组织化学(IHC)。抗-HER2抗体(例如，Ventana4B5抗体和Bond Oracle CB11抗体)已被FDA批准用于检测HER2，并且免疫组织化学试剂盒(例如，HercepTest^TM)已可商购获得。如通过免疫组织化学所检测，肿瘤样品中HER2表达的水平可以根据ASCO/CAP指南(Wolff等人,(2007)J.Clin.Oncol.25(1):118-45)和2018年更新(Wolff等人,(2018)J.Clin.Oncol.36(20):2105-22)定量和评分为1+、2+或3+。根据2018年ASCO/CAP指南，如果样品中周向HER2膜染色完整、强烈并且在>10％的肿瘤细胞中(其易于使用低倍物镜识别并在同质且连续的侵袭性细胞群内观察到)，则癌症或肿瘤被评分为HER23+。如果在样品中>10％的肿瘤细胞中观察到弱至中度完整的HER2膜染色，则将癌症或肿瘤评分为HER22+。如果样品中>10％的肿瘤细胞中HER2的不完整膜染色微弱或几乎不可察觉，则将癌症或肿瘤评分为HER21+。如果未观察到HER2染色或者膜染色不完整且微弱或几乎不可察觉且在≤10％的肿瘤细胞中，则将癌症或肿瘤评分为HER2阴性。当癌症或肿瘤在此初始IHC评估中被评分为HER22+时，必须进行反射测试(同一试样，使用ISH)或新测试(如果有，用新试样，使用IHC或ISH)。基于反射测试或新测试的结果，癌症或肿瘤可能被重新评分为HER23+或1+。

应理解，ERBB2基因扩增通常与HER2过表达相关。确定癌症组织样品中ERBB2基因是否扩增可能有助于减少来自同一样品的免疫组织化学的假阳性结果(参见例如Sarode等人,(2015)Arch.Pathol.Lab.Med.139:922–28)。因此，在某些实施方案中，已通过ERBB2基因扩增来评估受试者的癌症或肿瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤携带ERBB2基因扩增，例如，平均ERBB2基因拷贝数大于或等于4.0个信号每个细胞(例如，大于或等于6.0个信号每个细胞)。在某些实施方案中，癌症或肿瘤(例如，HER21+癌症或肿瘤)具有小于4.0个信号每个细胞的平均ERBB2基因拷贝数。在某些实施方案中，癌症或肿瘤(例如，HER21+癌症或肿瘤)不具有ERBB2基因扩增。检测基因扩增的方法包括但不限于荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)、定量PCR和DNA测序。在某些实施方案中，ERBB2基因扩增通过FISH测定。在某些实施方案中，ERBB2基因扩增通过DNA测序(例如，深度测序)来测定。

可以采用新技术来评估患者样品中的HER2水平。例如，自动定量分析技术可以通过测量抗体缀合荧光团的强度来定量评估HER2表达。HERmark技术通过抗体结合荧光标签基于接近度的释放来测量HER2表达。定量IHC技术将抗体/抗原复合物转化为红点，随后计数以量化HER2表达。时间分辨荧光能量转移技术使得能够通过检测由两个非常接近的荧光团发出的荧光来评估HER2表达。定量实时聚合酶链反应技术使得能够定量测量样品中HER2mRNA的量。流式细胞术技术使得能够测量细胞表面上HER2蛋白的数量。这些测定法可以补充IHC或FISH测定法的结果，从而获得癌症或肿瘤中HER2水平的更准确评估。

例如，在某些实施方案中，癌症或肿瘤可以通过流式细胞术评估。如下文实施例5中所述，可以使用具有制造商预先确定的荧光团量的等效可溶性荧光染料分子(MESF)珠来生成校准曲线。该校准曲线可以用于将给定细胞群的几何平均荧光强度(MFI)与标准化分子数相关联。检测HER2蛋白的试剂可以是结合与荧光团偶联的HER2(例如，本文公开的HER2TriNKET)的蛋白。当样品为细胞系时，可以测定细胞上HER2蛋白数量的几何平均值。然后可以将具有确定的HER2水平的细胞系用作参考，例如在IHC测定中，以确定肿瘤样品中HER2的水平。事实上，使用SKBR3、MDA-MB-175和MDA-MB-231细胞系作为设置HercepTest的3级、1级和0级染色强度的参考。在某些实施方案中，每个细胞上具有几何平均500,000或更多(例如，600,000或更多、700,000或更多、800,000或更多、或900,000或更多)个HER2蛋白的细胞系对应于HER23+样品中具有完整、强烈的周向HER2膜染色的细胞；每个细胞上具有几何平均75,000至499,999(例如，80,000至499,999、90,000至499,999、100,000至499,999、110,000至499,999、120,000至499,999、85,000至399,999、90,000至399,999、100,000至399,999、110,000至399,999、115,000至399,999、120,000至399,999、85,000至299,999、90,000至299,999、95,000至299,999、100,000至299,999、105,000至299,999、110,000至299,999、85,000至199,999、90,000至199,999、95,000至199,999、100,000至199,999、105,000至199,999、或110,000至199,999)个HER2蛋白的细胞系对应于HER22+样品中具有弱至中度完整的HER2膜染色的细胞；每个细胞上具有几何平均10,000至74,999(例如，11,000至74,999、11,000至69,999、11,000至64,999、11,000至59,999、或11,000至54,999)个HER2蛋白的细胞系对应于HER21+样品中具有微弱或几乎不可察觉的、不完整的HER2膜染色的细胞。每个细胞上具有几何平均小于10,000(例如，9000或更少、8000或更少、7000或更少、6000或更少、5000或更少、4000或更少)个HER2蛋白的细胞系对应于HER20样品中的阴性膜染色。根据2018年ASCO/CAP指南，样品中多于10％的肿瘤细胞必须满足所需的HER2水平阈值。

在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为1+、2+或3+的癌症或肿瘤(例如，前三段中公开的癌症类型中的任一种)。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为1+或2+的癌症或肿瘤(例如，前三段中公开的癌症类型中的任一种)。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为2+或3+的癌症或肿瘤(例如，前三段中公开的癌症类型中的任一种)。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为1+的癌症或肿瘤(例如，前三段中公开的癌症类型中的任一种)。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为2+的癌症或肿瘤(例如，前三段中公开的癌症类型中的任一种)。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为3+的癌症或肿瘤(例如，前三段中公开的癌症类型中的任一种)。在某些实施方案中，HER2水平通过免疫组织化学(例如，HercepTest^TM)测定。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有显示出在至少或多于10％的肿瘤细胞中至少检测为微弱/几乎不可察觉的膜染色的HER2表达的肿瘤。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有显示出在至少或多于10％的肿瘤细胞中至少检测为弱至中度完整的膜染色的HER2表达的肿瘤。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有显示出在至少或多于10％的肿瘤细胞中至少检测为强烈完整的膜染色的HER2表达的肿瘤。

在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为1+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为脑癌、膀胱癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、血管化肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(例如，血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、肢端雀斑样痣样黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、胆道癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺癌、类癌、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚层窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、高血糖素瘤、心癌、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛瘤、上皮内瘤样病变、上皮内鳞状细胞瘤、肝内胆管癌、浸润性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波西肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、雀斑型恶性黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌、神经上皮腺癌、结节性黑色素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、脊柱癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑色素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系统癌、子宫颈癌、子宫体癌、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、疣状癌、VIPoma、外阴癌、分化良好的癌或威尔姆斯肿瘤。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为1+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为恶性血液病如白血病、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征、急性T-淋巴母细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病或慢性骨髓性白血病的骨髓原始细胞危象。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为1+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、NSCLC、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌、胆囊癌、尿路上皮膀胱癌或转移性乳癌。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为1+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为实体瘤，如局部晚期或转移性实体瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为HER2水平评分为1+的三阴性乳癌。在某些实施方案中，癌症或肿瘤的激素受体呈阳性(即，雌激素受体、黄体酮受体或两者呈阳性)而HER2呈阴性(例如，如通过IHC所评估)。根据2018年ASCO/CAP HER2检测指南更新，在IHC结果为0和1+或者IHC为2+而ISH测定法为阴性的情况下，乳癌被认为是HER2阴性的。因此，在某些实施方案中，癌症或肿瘤为雌激素受体和黄体酮受体呈阴性(例如，如通过IHC所评估)并且HER2水平评分为IHC 1+的三阴性乳癌。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为HER2水平评分为IHC 1+的激素受体阳性乳癌(例如，如通过IHC所评估)。在某些实施方案中，HER21+癌症或肿瘤具有小于4.0个信号每个细胞的平均ERBB2基因拷贝数。在某些实施方案中，HER21+癌症或肿瘤不具有ERBB2基因扩增。

在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为2+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为脑癌、膀胱癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、血管化肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(例如，血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、肢端雀斑样痣样黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、胆道癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺癌、类癌、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚层窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、高血糖素瘤、心癌、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛瘤、上皮内瘤样病变、上皮内鳞状细胞瘤、肝内胆管癌、浸润性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波西肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、雀斑型恶性黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌、神经上皮腺癌、结节性黑色素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、脊柱癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑色素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系统癌、子宫颈癌、子宫体癌、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、疣状癌、VIPoma、外阴癌、分化良好的癌或威尔姆斯肿瘤。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为2+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为恶性血液病如白血病、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征、急性T-淋巴母细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病或慢性骨髓性白血病的骨髓原始细胞危象。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为2+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、NSCLC、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌、胆囊癌、尿路上皮膀胱癌或转移性乳癌。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分为2+的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为实体瘤，如局部晚期或转移性实体瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为HER2水平评分为IHC 2+且ISH测定法为阴性的三阴性乳癌。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为HER2水平评分为IHC 2+且ISH测定法为阴性的激素受体阳性乳癌(例如，如通过IHC所评估)。在某些实施方案中，HER22+癌症或肿瘤具有小于4.0个信号每个细胞的平均ERBB2基因拷贝数。在某些实施方案中，HER22+癌症或肿瘤不具有ERBB2基因扩增。

在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平不高(即，评分为1+或2+)的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为脑癌、膀胱癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、血管化肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(例如，血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、肢端雀斑样痣样黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、胆道癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺癌、类癌、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚层窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、高血糖素瘤、心癌、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛瘤、上皮内瘤样病变、上皮内鳞状细胞瘤、肝内胆管癌、浸润性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波西肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、雀斑型恶性黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌、神经上皮腺癌、结节性黑色素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鼻窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、脊柱癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑色素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系统癌、子宫颈癌、子宫体癌、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、疣状癌、VIPoma、外阴癌、分化良好的癌或威尔姆斯肿瘤。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平不高(即，评分为1+或2+)的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为恶性血液病如白血病、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征、急性T-淋巴母细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病或慢性骨髓性白血病的骨髓原始细胞危象。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分不高(例如，评分为1+或2+)的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、NSCLC、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌、胆囊癌、尿路上皮膀胱癌和转移性乳癌。在某些实施方案中，通过本文公开的方法治疗的受试者患有HER2水平评分不高(即，评分为1+或2+)的癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤为实体瘤，如局部晚期或转移性实体瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为HER2水平评分为IHC 1+或IHC 2+且ISH测定法为阴性的三阴性乳癌。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为HER2水平评分为IHC 1+或IHC 2+且ISH测定法为阴性的激素受体阳性乳癌(例如，如通过IHC所评估)。在某些实施方案中，HER2水平评分不高(即，评分为1+或2+)的癌症或肿瘤具有小于4.0个信号每个细胞的平均ERBB2基因拷贝数。在某些实施方案中，HER2水平评分不高(即，评分为1+或2+)的癌症或肿瘤不具有ERBB2基因扩增。

在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者尚未接受过用于治疗癌症的既往疗法。在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者尚未接受过用于治疗癌症的既往化疗或免疫疗法。在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者已接受过既往疗法(例如，化疗或免疫疗法)，但尽管接受了既往疗法仍继续经历癌症进展。在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者已在接受既往疗法(例如，化疗或免疫疗法)后经历了癌症消退，但后来经历了癌症复发。在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者对既往疗法(例如，化疗或免疫疗法)不耐受。

在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者满足实施例3中描述的临床试验队列(例如，加速滴定队列、“3+3”剂量递增队列、安全性/PK/PD扩展队列、尿路上皮膀胱癌(UBC)队列、转移性乳癌(MBC)队列、HER2高表达(HER23+)篮式实体瘤队列或与派姆单抗联合治疗队列)的一项或多项纳入标准。在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者满足实施例3中描述的临床试验队列(例如，加速滴定队列、“3+3”剂量递增队列、安全性/PK/PD扩展队列、UBC队列、MBC队列、HER2高表达(HER23+)篮式实体瘤队列或与派姆单抗联合治疗队列)的所有纳入标准。

在某些实施方案中，本文提供了治疗具有一种或多种(例如，所有)以下特征的受试者的癌症的方法：

-经组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性实体瘤，尚无标准疗法，或标准疗法已失败；

-具有通过免疫组织化学检测到有记录的HER2表达的原发肿瘤；

-肿瘤活检中可检测到的erbb2扩增和/或erbb2激活突变；

-如使用CLIA认可的(或等效)方法通过免疫组织化学测定，患有表达HER2的肿瘤(筛选时至少为1+)；

-患有可通过RECIST 1.1用至少一个一维可测量病变测量的疾病；

-进入研究时ECOG体能状态为0或1并且估计的预期寿命至少为3个月；

-如通过超声心动描记术或多门采集(MUGA)扫描所测量，基线左心室射血分数(LVEF)≥55％；

-有足够的血液学功能，其定义为：白细胞(WBC)计数≥3×10⁹/L，绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)≥1.5×10⁹/L，淋巴细胞计数≥0.5×10⁹/L，血小板计数≥75×10⁹/L，并且血红蛋白≥9g/dL(可能已接受输血)；

-有足够的肝功能，其定义为总胆红素水平≤1.5×正常上限(ULN)，天冬氨酸转氨酶(AST)水平≤2.5×ULN，丙氨酸转氨酶(ALT)水平≤2.5×ULN，或者，对于患有有记录的向肝脏的转移性疾病的患者，AST和ALT水平≤5×ULN；和/或

-有足够的肾功能，其定义为根据Cockcroft-Gault公式估算肌酐清除率>50mL/min。

-符合按其标签接受纳武单抗治疗上皮来源恶性肿瘤的条件；或患有无标准疗法或标准疗法已失败的肿瘤；和

-已接受过抗-PD-1或抗-PD-L1作为前线疗法；或未接受过抗-PD-1或抗-PD-L1作为前线疗法并且已经历过3级或4级药物相关毒性或者与既往抗-PD-1或抗-PD-L1疗法相关的影响肺或神经系统的2级药物相关毒性。

-在转移性疾病联合疗法失败或辅助化疗6个月内复发后符合按其标签接受白蛋白结合型紫杉醇的条件，并且在过去六个月内未暴露于紫杉烷类药物；

-患有无标准疗法或标准疗法已失败的肿瘤；或

-患有晚期(不可切除/复发性/转移性)三阴性乳癌(TNBC)。

在某些实施方案中，本文提供了治疗患有尿路上皮膀胱癌(UBC)并具有一种或多种(例如，所有)以下特征的受试者的方法：

-经组织学或细胞学记录的尿路上皮(包括肾盂、输尿管、尿路尿路上皮、尿道)局部晚期或转移性移行细胞癌；

-受试者的最后一线治疗后发生放射学疾病进展；

-针对无法手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌接受过用一种(且不超过一种)含铂方案(例如，铂加另一种药物如吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星等)的治疗并在最后一次施用含铂方案作为辅助剂后6个月内发生放射学进展或复发，这将被视为第一线含铂方案的失败；

-用检查点抑制剂(即，抗-PD-1或抗-PD-L1)治疗，发生放射学进展(任选地，用基于铂的疗法与基于PD-1/PD-L1的疗法联合治疗)；和/或

-通过免疫组织化学测得HER2表达为至少1+。

在某些实施方案中，本文提供了治疗患有转移性乳癌(MBC)并具有一种或多种(例如，所有)以下特征的受试者的方法：

-经组织学证实的MBC；

-既往接受过不超过3线针对转移性疾病的细胞毒疗法；

-先前接受过用紫杉烷类药物和蒽环类药物的治疗，除非有蒽环类药物禁忌；

-根据IHC，肿瘤评分为1+或2+，并且如果评分为2+，则必须通过FDA批准的方法来判定肿瘤ERRB2扩增的存在；和/或

-最后一线全身治疗后发生放射学进展。

在某些实施方案中，本文提供了治疗患有三阴性乳癌(TNBC)并具有一种或多种(例如，所有)以下特征的受试者的方法：

-如通过免疫组织化学(例如，使用Agilent/Dako的PD-L1免疫组织化学22C3pharmDx测定法)所测量，肿瘤的PD-L1评分(CPS)低于10；

-经组织学记录的(转移性或局部晚期)TNBC，包括如根据美国医师学会(ACP)指南或等同物所定义使得受试者不符合用曲妥珠单抗的条件的HER2状态、阴性ER表达和阴性PR表达：

o如通过原位杂交所确定，缺乏HER2扩增(HER2与CEP17的比率小于2.0或单探针平均HER2基因拷贝数小于4个信号/细胞)，或如通过免疫组织化学所测量，HER2表达水平为0、1+或2+，和

o ER和PR阴性(如定义为经由免疫组织化学分析，<1％的细胞表达激素受体)；

-先前未接受过针对无法手术的局部晚期或转移性TNBC的化疗或靶向全身治疗；和/或

-患有可通过RECIST 1.1用至少一个一维可测量病变测量的疾病。

在某些实施方案中，本文提供了治疗患有HER23+肿瘤并具有一种或多种(例如，所有)以下特征的受试者的方法：

-除乳癌或胃癌外的任何实体瘤以及肿瘤内erbb2扩增史和以下情况之一：1)在最后一线治疗中放射学进展后6个月内受试者最近一次活检中记录的免疫组织化学评分为HER23+，或2)在筛选窗口期间，根据免疫组织化学，评分为HER23+；和

-使用至少一线已批准或已确立的疗法进行治疗。

在某些实施方案中，本文提供了治疗患有胃癌并具有一种或多种(例如，所有)以下特征的受试者的方法：

-如根据第七版美国癌症联合委员会(AJCC)分期，为晚期(不可切除/复发性/转移性)胃癌或胃食管连接部癌症；

-根据美国医师学会(ACP)指南，患有HER2阳性肿瘤，并因此符合曲妥珠单抗治疗的条件；

-先前接受过用第一线治疗的治疗，包括铂盐和氟吡啶与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗生物类似物联用；

-第一线治疗后有进展；

-已接受过仅一线治疗来治疗转移性疾病；

-患有可通过RECIST 1.1用至少一个一维可测量病变测量的疾病；和/或

-患有未知微卫星不稳定性(MSI)高的肿瘤。

在某些实施方案中，本文提供了治疗患有HER23+实体瘤并具有一种或多种(例如，所有)以下特征的受试者的方法：

-患有除乳癌或胃癌外的任何实体瘤以及肿瘤内erbb2扩增史和以下情况之一：1)在最后一线治疗中放射学进展后6个月内受试者最近一次活检中记录的免疫组织化学评分为HER23+，或2)在筛选窗口期间，根据免疫组织化学，评分为HER23+；和/或

-接受过用至少一线已批准或已确立的疗法的治疗。

在某些实施方案中，本文提供了治疗患有上皮来源恶性肿瘤并且符合按其标签用纳武单抗治疗的条件的受试者的方法。在某些实施方案中，本文提供了治疗患有转移性乳癌的受试者的方法，所述受试者对针对转移性疾病的联合化疗没有反应或在辅助化疗6个月内复发，在过去6个月中未暴露于紫杉烷类药物，并且符合按其标签用白蛋白结合型紫杉醇治疗的条件。

在某些实施方案中，本文提供了治疗已根据本文公开的方法治疗的受试者的癌症的方法，所述受试者不满足实施例3中描述的一项或多项排除标准。在某些实施方案中，根据本文公开的方法治疗的受试者不满足实施例3中描述的任何排除标准。

在某些实施方案中，本文提供了治疗受试者的癌症的方法，所述受试者：

-目前未接受免疫疗法、免疫抑制药物如化疗或全身性皮质类固醇治疗(变态反应的短期治疗或用全身性类固醇治疗免疫疗法相关不良事件(irAE)或用无全身效应或全身效应极小的局部或吸入类固醇的治疗除外)或其他实验药品；

-目前未使用靶向HER2的酪氨酸激酶抑制剂或任何靶向HER2或NKG2D的重组分子进行治疗；

-目前未使用生长因子如粒细胞集落刺激因子或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(促红细胞生成素和促红细胞生成素类似物除外)进行治疗；

-目前未使用双膦酸盐或地舒单抗进行治疗，除非在接受多特异性结合蛋白的首次施用之前超过14天开始治疗；

-先前未使用过专门靶向HER2通路的药物进行治疗(用单克隆抗体进行治疗并提供四周清除期的受试者或用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗并提供两周清除期的受试者除外)；

-目前未使用细胞减灭疗法、放射疗法(姑息性骨定向放射疗法除外)、细胞因子疗法(促红细胞生成素除外)、大手术(诊断性活检除外)进行治疗，也未在用多特异性结合蛋白治疗前28天内使用过任何研究药物；

-除了待由多特异性结合蛋白治疗的目标恶性肿瘤外，先前在过去三年内未患过恶性疾病(皮肤的基底细胞癌或鳞状细胞癌或者原位子宫颈癌除外)；

-没有快速进行性疾病；

-没有活跃的中枢神经系统(CNS)转移或病史；

-先前未接受过器官移植(包括自体或同种异体干细胞移植)；

-没有明显的急性或慢性感染(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)检测呈阳性)，或活动性或潜伏性乙型肝炎或活动性丙型肝炎；

-没有已存在的自身免疫性疾病(白癜风受试者除外)，在过去三年内需要使用全身性免疫抑制剂治疗超过28天，或临床相关的免疫缺陷(例如，异常γ-球蛋白血症或先天性免疫缺陷)，或在七天内发烧；

-没有已知的mAb严重超敏反应(≥3级NCI-CTCAE v5.0)、任何过敏反应史或非控制性哮喘(例如，部分控制性哮喘的三个或更多个特征)；

-没有与既往治疗相关的>1级NCI-CTCAE v5.0的持续毒性(脱发和感觉神经病≤2级除外)；

-不是怀孕或哺乳期的女性；

-没有已知的酒精或药物滥用情况；和/或

-没有严重的心脏病或健康状况，包括但不限于：

o纽约心脏协会III级或IV级心力衰竭或收缩功能障碍(LVEF<55％)病史；

o高风险不受控制的心律失常，即，静息时心率>100/分钟的心动过速；

o显著的室性心律失常(室性心动过速)或更高级别的AV阻滞(二度2型AV阻滞(Mobitz 2)或三度AV阻滞)；

o需要抗心绞痛药物的心绞痛；

o有临床意义的瓣膜性心脏病；

o心电图(ECG)上有透壁性梗塞的证据；或

o高血压控制不佳(定义为：收缩压>180mm Hg或舒张压>100mm Hg)。

预期本文公开的治疗患有上文指定的癌症的患者的方法可以与或不与用于减少一种或多种输注相关反应的皮质类固醇联合来进行。

单一疗法以及与其他癌症疗法的联合使用

本文公开的多特异性结合蛋白可以作为单一疗法使用或者与一种或多种疗法联合使用。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白根据本文公开的剂量方案作为单一疗法使用。在其他实施方案中，多特异性结合蛋白与根据已知适合于治疗患有特定癌症的特定受试者的剂量方案施用的一种或多种疗法联合使用，并且多特异性结合蛋白根据本文公开的剂量方案施用。在某些实施方案中，本文公开的治疗方法用作手术移除原发病灶的辅助手段。

可以与多特异性结合蛋白联合使用的示例性治疗剂包括例如放射、丝裂霉素、维甲酸、苯达莫司汀(ribomustin)、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁、二胺硝吖啶、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、阿维A酯、异维甲酸、链佐星、尼莫司汀、长春地辛、氟他胺、drogenil、butocin、卡莫氟、雷佐生、裂裥多糖(sizofilan)、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼氮芥、毕西巴尼(picibanil)、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、黄体酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ(IFN-γ)、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素-毒素连接物、白介素-2、黄体生成素释放因子以及前述药剂的变体，其可能表现出与其同源受体的不同结合或者血清半衰期的增加或减少。

可用作治疗癌症的联合疗法的一部分的另一类药剂为免疫检查点抑制剂。示例性的免疫检查点抑制剂包括抑制以下中的一种或多种的药剂：(i)细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序性细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4，和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗已被美国食品和药物管理局批准用于治疗黑色素瘤并可用作本文描述的联合疗法的一部分。

可用作治疗癌症的联合疗法的一部分的还其他药剂有靶向非检查点靶标的单克隆抗体药剂(例如，赫赛汀)和非细胞毒性剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)。

还其他类别的抗癌剂包括例如：(i)选自ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK和mTOR抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、Hedgehog信号传导通路抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷酸肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。

在某些实施方案中，本发明的方法还包括向受试者施用抗-PD-1抗体。许多抗-PD-1抗体已被开发用于治疗目的并见述于例如Gong等人,(2018)J.ImmunoTher Cancer 6:8中。

在某些实施方案中，抗-PD-1抗体为纳武单抗。在某些实施方案中，向受试者施用0.1至10mg/kg、0.1至3mg/kg、0.1至1mg/kg、0.1至0.3mg/kg、0.3至10mg/kg、0.3至3mg/kg、0.3至1mg/kg、1至10mg/kg、1至3mg/kg、或3至10mg/kg的纳武单抗。在某些实施方案中，向受试者施用120至600mg、120至480mg、120至360mg、120至240mg、240至600mg、240至480mg、240至360mg、360至600mg、360至480mg、或480至600mg纳武单抗。在某些实施方案中，向受试者施用120mg、240mg、360mg、480mg或600mg纳武单抗。在某些实施方案中，在初始治疗周期的第1天施用480mg纳武单抗。在某些实施方案中，如果受试者接受一个或多个后续治疗周期，则在后续治疗周期中每四周施用一次480mg纳武单抗，从每个后续治疗周期的第1天开始。在某些实施方案中，在四周治疗周期中以30分钟、35分钟、45分钟、50分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟或90分钟静脉内输注施用纳武单抗。

在某些实施方案中，在四周治疗周期中以30分钟、45分钟、60分钟、75分钟或90分钟静脉内输注施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂并以30分钟、45分钟、60分钟、75分钟或90分钟静脉内输注施用纳武单抗。在某些实施方案中，在四周治疗周期中以60分钟静脉内输注施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂并以30分钟静脉内输注施用纳武单抗。

在某些实施方案中，本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂在第一治疗周期中与纳武单抗联合施用，其中在第1天施用多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂和纳武单抗两者，而在第8天单独施用多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂在初始周期后的后续周治疗周期中与纳武单抗联合施用，其中在第1天施用多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂和纳武单抗两者。

在某些实施方案中，抗-PD-1抗体为派姆单抗。在某些实施方案中，向受试者施用100至300mg、110至300mg、120至300mg、130至300mg、140至300mg、150至300mg、160至300mg、170至300mg、180至300mg.190至300mg、200至300mg、210至300mg、220至300mg、230至300mg、240至300mg、250至300mg、260至300mg、270至300mg、280至300mg、290至300mg、100至280mg、110至280mg、120至280mg、130至280mg、140至280mg、150至280mg、160至280mg、170至280mg、180至280mg.190至280mg、200至280mg、210至280mg、220至280mg、230至280mg、240至280mg、250至280mg、260至280mg、270至280mg、100至260mg、110至260mg、120至260mg、130至260mg、140至260mg、150至260mg、160至260mg、170至260mg、180至260mg.190至260mg、200至260mg、210至260mg、220至260mg、230至260mg、240至260mg、250至260mg、100至240mg、110至240mg、120至240mg、130至240mg、140至240mg、150至240mg、160至240mg、170至240mg、180至240mg.190至240mg、200至240mg、210至240mg、220至240mg、230至240mg、100至220mg、110至220mg、120至220mg、130至220mg、140至220mg、150至220mg、160至220mg、170至220mg、180至220mg.190至220mg、200至220mg、210至220mg、100至200mg、110至200mg、120至200mg、130至200mg、140至200mg、150至200mg、160至200mg、170至200mg、180至200mg、或190至200mg派姆单抗。在某些实施方案中，向受试者施用125mg、150mg、175mg、200mg、225mg或250mg派姆单抗。在某些实施方案中，在初始治疗周期的第1天施用200mg派姆单抗。在某些实施方案中，如果受试者接受一个或多个后续治疗周期，则在后续治疗周期中每三周施用一次200mg派姆单抗，从第一后续治疗周期的第1天开始。在某些实施方案中，在三周治疗周期中以30分钟、35分钟、45分钟、50分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟或90分钟静脉内输注施用派姆单抗。

在某些实施方案中，在三周治疗周期中以30分钟、45分钟、60分钟、75分钟或90分钟静脉内输注施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂并以30分钟、45分钟、60分钟、75分钟或90分钟静脉内输注施用派姆单抗。在某些实施方案中，在三周治疗周期中以60分钟静脉内输注施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂并以30分钟静脉内输注施用派姆单抗。

在某些实施方案中，本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂在第一治疗周期中与派姆单抗联合施用，其中在第1天施用多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂和派姆单抗两者，而在第8天单独施用多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂。在某些实施方案中，多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂在初始周期后的后续3周治疗周期中与派姆单抗联合施用，其中在第1天施用多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂和派姆单抗两者。

在某些实施方案中，本发明的方法还包括向受试者施用细胞骨架破坏化疗剂。许多这样的药剂已被开发用于治疗目的并见述于例如Ong等人,(2020)Cancers 12(1):238中。在某些实施方案中，细胞骨架破坏化疗剂为白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，向受试者施用50至300mg/m²、50至200mg/m²、50至150mg/m²、50至100mg/m²、100至300mg/m²、100至200mg/m²、100至150mg/m²、150至300mg/m²、150至200mg/m²、或200至300mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，向受试者施用80mg/m²、100mg/m²、125mg/m²、200mg/m²或260mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，在初始治疗周期的第1天、第8天和第15天施用100mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，如果受试者接受一个或多个后续治疗周期，则在后续治疗周期中每四周施用三次100mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇，在每个后续治疗周期的第1天、第8天和第15天施用。在某些实施方案中，在四周治疗周期中以30分钟、35分钟、45分钟、50分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟或90分钟静脉内输注施用白蛋白结合型紫杉醇。

在某些实施方案中，在四周治疗周期中以30分钟、45分钟、60分钟、75分钟或90分钟静脉内输注施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂并以30分钟、45分钟、60分钟、75分钟或90分钟静脉内输注施用白蛋白结合型紫杉醇。在某些实施方案中，在四周治疗周期中以60分钟静脉内输注施用本文公开的多特异性结合蛋白、药物组合物或药物制剂并以30分钟静脉内输注施用白蛋白结合型紫杉醇。

治疗结果

在某些实施方案中，本文公开的治疗方法导致受试者或患者的疾病反应或生存期改善。例如，在某些实施方案中，疾病反应为完全反应、部分反应或疾病稳定。在某些实施方案中，生存期改善为无进展生存期(PFS)或总生存期改善。可以相对于开始本公开的治疗之前的一段时间来确定改善(例如，PFS)。确定BTC(例如，晚期BTC、转移性BTC)或胆道肿瘤治疗的疾病反应(例如，完全反应、部分反应或疾病稳定)和患者生存期(例如，PFS、总生存期)的方法是本领域常规的并涵盖在本文中。在一些实施方案中，在对经治疗的患者进行受累区域(例如，胸部/腹部和骨盆，其覆盖从胸廓入口的上部范围到趾骨联合的区域)的造影剂增强计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)之后根据RECIST 1.1来评价疾病反应。

实施例

现在一般性地描述本公开，通过参考以下实施例，将更容易理解本公开，纳入这些实施例仅出于示意本公开的某些方面和实施方案的目的，而不旨在以任何方式限制本公开的范围。

实施例1：A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的制剂、包装和储存

对表12中列出的制剂进行一式两份和随机化评价，以评估pH和赋形剂对A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(KermitBDS批号7443-C3,11.9mg/mL)的稳定性的影响。通过离心超滤(Amicon Ultra-430k devices MWCO)对A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗进行缓冲剂交换，交换为相应的缓冲剂和赋形剂组合，以达到30mg/mL的目标浓度。在最终缓冲剂交换和目标浓度确认后，使用带有Durapore膜的0.22μm EMD Millipore Ultrafree–CL离心过滤装置(Fisher Scientific Cat.#UFC40GVOS)对每个配制的样品进行过滤灭菌。无菌过滤后，每个制剂在层流罩中无菌处理。向配制的样品中添加聚山梨醇酯80(PS80)至最终浓度为0.01％。取出每个制剂的等分试样进行零时间测试，并将剩余材料分成两个大小相等的等分试样置入到2mL x13mm的去热原1型硼硅酸盐玻璃小瓶(West Pharmaceuticals Cat.#68000377)中，用13mm Fluorotec塞子(West Pharmaceuticals Cat.#19700302)塞住并密封。根据表13，使用零时间等分试样进行初始时间点测试。将一个小瓶储存在2-8℃下并将另一个小瓶置于50℃下进行为期3周的加速稳定性研究。在3周温育后，根据表13中指示的测试方法对2–8℃和50℃样品进行分析。

表12.评价的制剂

表13.制剂评价中使用的测定组

进行了A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的加速稳定性研究，其中将A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗制备成20种制剂，如表12中所示。样品一式两份运行并于2–8℃和50℃下温育3周。在零时间时和3周温育结束时，使用如表13中所罗列的测定法进行每个配制样品的测试。基于外观、浓度、pH和重量克分子渗透浓度，所有制剂表现相似并且与预期一致。

外观

在打开样品小瓶之前，在实验室环境条件下贴靠黑白背景观察样品。在零时间时和三周条件下，所有样品中均不存在可见颗粒。

紫外浓度测定

对于每个样品和条件，通过在光密度(OD)280nm处的紫外(UV)吸收来测定蛋白质浓度。表14中汇总了零时间时、在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后的蛋白质浓度。

pH测定

测定每个样品和条件的pH。表15中汇总了零时间时、在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后的pH值。

动态光散射

平衡300秒后，在25℃下收集动态光散射(DLS)样品。对每个样品收集五次测量结果。表16中汇总了零时间时、在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后的Z-均值。

还记录了平均多分散性指数(％PDI)。表17中汇总了零时间时、在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后的％PDI值。

对样品中的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗进行了进一步的DLS分析。表18中汇总了零时间时、在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后的平均单体多分散性百分比(％PD)。表19中汇总了零时间时、在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后的平均单体尺寸值。

表14.从UV吸收计算的蛋白质浓度

表15.pH值

表16.来自DLS的Z-均值

/>

表17.来自DLS的PDI值

/>

表18.单体％PD值

表19.单体尺寸值

/>

如通过DLS所评价的，平均尺寸和单体尺寸≤20nm，多分散性(PDI)≤0.300，所有A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗制剂均表现出构象稳定性。在评价赋形剂和pH组合时，在2–8℃和50℃下温育3周后，仅山梨糖醇和蔗糖的制剂相对于NaCl和山梨糖醇以及NaCl和蔗糖的组合制剂具有较低的平均尺寸(图18A和图18B中示出了比较模型)。在2-8℃和50℃下温育3周后，仅山梨糖醇和蔗糖的制剂与具有NaCl的组合制剂相比，平均单体尺寸也较低(图19A和图19B)。

尺寸排阻色谱法(SEC)

进行尺寸排阻色谱法以确定高分子量物种的百分比(％HMW)、主要物种的百分比(％主要)和低分子量物种的百分比(％LMW)。将样品在流动相缓冲剂(含有100mM的磷酸盐、150mM的氯化钠，pH 7.3)中稀释至2.0mg/mL并以100μg上样量进样。使用Tosoh G3000SWxl(7.8x 300mm,cat.#08541)色谱柱进行分离，检测波长为280nm，带宽为8nm。在零时间时和在2-8℃或50℃下温育3周后实时分析样品。表20中汇总了％HMW值，表21中汇总了％主要值，表22中汇总了％LMW值。

表20.％HMW SEC

表21.％主要峰SEC

表22.％LMW SEC

/>

在50℃下温育3周后，配制的样品具有在91.3％–95.2％的范围内的％主要峰值，其中相对于组合赋形剂NaCl和山梨糖醇以及NaCl和蔗糖，仅具有山梨糖醇和蔗糖的那些制剂保持较大的％主要峰和较低的％HMW物种(分别在图20A和图20A中示出)。重要的是，单一赋形剂蔗糖和山梨糖醇均在pH范围5.5–6.5内保持了％主要峰物种，并且当pH从5.5增至6.5时，两者仅显示出％HMW物种的略微升高。对于所有赋形剂，随着pH从5.5增至约6.2，％LMW物种呈降低趋势(图22A)。

在2-8℃下温育3周后，所有配制的样品均保持大于98％的主要物种峰百分比。相对于较高的pH值(pH 6.5)，较低pH值(5.5)的％主要峰更大，如图20B中所示。相对于组合赋形剂NaCl和山梨糖醇以及NaCl和蔗糖，单一赋形剂山梨糖醇和蔗糖趋向于较低的％HMW。对于所有赋形剂，增加的pH趋向于增加％HMW物种(图20B)。组合赋形剂的％LMW物种趋向于较低，但与pH无关(图22B)。

重量克分子渗透浓度

所有样品的重量克分子渗透浓度通过凝固点降低来测量。所有样品在所有条件下均保持重量克分子渗透浓度。表23中汇总了零时间时、在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后的重量克分子渗透浓度数据。

表23.重量克分子渗透浓度值

成像毛细管等电聚焦(icIEF)

为了进行电荷变体分析，使用了成像毛细管等电聚焦(icIEF)。通过将起始材料和样品在水中稀释至5mg/mL、然后以10μL样品对90μL反应混合物的比率与反应混合物合并来评价电荷异质性。反应混合物为1％的甲基纤维素、Pharmalyte 3-10、Pharmalyte 8-10.5、pI标志物5.12、pI标志物9.50和去离子水的组合。在运行样品之前准备并运行系统适用性标准品，它们以96孔板格式运行。采用的方法参数如下：聚焦周期#1＝1分钟，1500V，聚焦周期#2＝8分钟，3000V，检测＝5次曝光，样品上样＝55秒，低pI标志物＝5.12，300像素，高pI标志物＝9.50，1800像素。每18次进样运行一次起始材料以确保读数一致。

“主要峰”被标识为是零时间时配制样品中的主要峰。温育后，相同洗脱时间的峰可能已减小并且不再代表曲线下面积最大的峰，但仍被标识为“主要峰”。表24中汇总了在2-8℃下温育3周后和在50℃下温育3周后存在于酸性级分中的蛋白质百分比(％酸性)值。表25中汇总了存在于主要峰级分中的蛋白质百分比(％主要峰)值。表26中汇总了存在于碱性级分中的蛋白质百分比(％碱性)值。

表24.％酸性icIEF

表25.％主要峰icIEF

表26.％碱性峰icIEF

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对于在2-8℃下温育3周后的配制样品，％主要峰值范围为58.3％-62.2％，％酸性值范围为34.3％-38.4％，％碱性值范围为3.3％-3.7％。不存在拟合％主要峰数据的显著模型，表明pH和赋形剂对icIEF值均没有显著影响(图24B-24D)。赋形剂在％酸性和％碱性物种建模中也不显著，并且％酸性物种趋向于随pH增加而％碱性物种减少(图23B和图25B)。然而，如从所有值的狭窄范围观察到，这些变化是不大的。

对于在50℃下温育3周后的配制样品，％主要峰值范围为14.9％-22.7％，％酸性值范围为70.6％-81.6％，％碱性值范围为2.4％-8.8％。数据表明从％主要峰物种向％酸性物种的改变，％碱性与3周2-8℃温育结果保持相对一致。在评价3周50℃配制样品时，含有蔗糖作为唯一赋形剂的样品具有最高的％酸性物种(图23A)及最低的％主要峰和％碱性物种(图24A和图25A)。这在所有pH值(5.5–6.5)下都是一致的，而含有其他3种赋形剂的制剂则倾向于在较低的pH值下有较低的％酸性物种并且随着pH的增加而增加。

毛细管电泳(CE)

进行还原毛细管凝胶电泳来评估纯度。使用Sciex PA800+并在220nm处进行UV检测来评价SDS-CGE。通过在Beckman SDS样品缓冲剂中稀释100μg样品并添加5μLβ-巯基乙醇来制备样品。将样品在70℃下加热10分钟。使用正极性、1分钟缓变、15kV电压和20psi压力，20分钟内发生分离。毛细管长度为30.2cm，到检测器的长度为10.2cm。使用起始材料作为参考。表27中示出了样品百分比纯度的汇总。表28中示出了样品杂质百分比的汇总。

表27.％纯度

表28.％杂质

还进行了非还原毛细管凝胶电泳来评估纯度。使用Sciex PA800+并在220nm处进行UV检测来评价SDS-CGE。通过在Beckman SDS样品缓冲剂中稀释100μg样品并添加5μL250mM的碘乙酰胺来制备样品。将样品在70℃下加热10分钟。使用正极性、1分钟缓变、15kV电压和20psi压力，20分钟内发生分离。毛细管长度为30.2cm，到检测器的长度为10.2cm。使用起始材料作为参考。表29中示出了％HMW CE(NR)数据的汇总。表30中示出了％主要峰CE(NR)数据的汇总。表31中示出了％LMW CE(NR)数据的汇总。

表29.％HMW CE(NR)

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表30.％主要峰CE(NR)

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表31.％LMW CE(NR)

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如通过还原CE所评价的，在3周50℃样品中，仅山梨糖醇和仅蔗糖的制剂的％纯度值在pH范围(pH 5.5-6.5)内保持不变(图26A)，而组合赋形剂显示出关于pH的更多变化，在较低的pH值(5.5对6.5)下％纯度降低(图26B)。

如通过非还原CE所评价的，在3周50℃样品中，相对于组合赋形剂NaCl和山梨糖醇以及NaCl和蔗糖，仅包含山梨糖醇或仅包含蔗糖的制剂具有较低的％HMW物种(图27A和图28A)。pH水平对％主要峰值没有显著影响。

如通过还原和非还原CE所评价的，没有显著的模型来拟合3周2-8℃样品的还原CE数据，并且对于非还原CE数据，仅山梨糖醇和蔗糖的制剂具有更大的％主要峰物种(图27B)。

统计分析

使用Design Expert v9软件来分析趋势。表32中示出了分析的汇总。粗体模型未纳入在最终的优化评估中。

表32.分析模型汇总

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赋形剂选择

含有250mM山梨糖醇或250mM蔗糖作为赋形剂的制剂的性能比含有山梨糖醇和NaCl的组合或蔗糖和NaCl的组合的制剂更理想。因此，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的最佳制剂确定为20mM的组氨酸、250mM的蔗糖或山梨糖醇和0.01％的PS80，pH为6.0。

实施例2：A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗的高浓度制剂

高浓度A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗制剂的可行性分两个阶段进行评估：评估制剂的溶解度极限和短期稳定性。

为了评估溶解度，将来自超滤/渗滤(UF/DF)上样的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗药物物质交换到20mM组氨酸和250mM蔗糖的pH 6缓冲剂中，与实施例1中选择的且在实施例3中描述的临床研究中使用的药物制剂相同，但不含聚山梨醇酯-80。然后将A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗浓缩至大约233mg/mL并保持在5℃和25℃下，间歇性检查A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗蛋白质浓度。表33示出了所有时间点在每种储存条件下A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的平均浓度。

表33：高浓度制剂中A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗的浓度

在每种条件下48小时后，A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗浓度稳定至大约222-223mg/mL，并在120小时后保持在222-223mg/mL(图30)。这表明该制剂中A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的溶解度极限为大约222mg/mL。

通过如上所述将样品制备成蛋白质浓度为150mg/mL、175mg/mL和200mg/mL来评估短期稳定性。向每个浓度的溶液中添加0.01％(w/v)的聚山梨醇酯-80，与实施例1中选择的且在实施例3中描述的临床研究中使用的药物制剂相同。分别用0.3％(w/v)的聚山梨醇酯-80和0.05％(w/v)的聚山梨醇酯-80制备另外两个浓度在150mg/mL下的溶液以评估聚山梨醇酯-80浓度对高浓度A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗的稳定性的影响。将每种条件储存在5℃、25℃和40℃下并每周取样以进行有限的产品质量测试，包括外观(图31A)、A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗浓度和通过尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)测试纯度(图31B)。结果表明，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在这些制剂中在5℃和25℃下均保持稳定达两周。

实施例3：用A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗治疗局部晚期或转移性实体瘤

目标

该临床研究设计有两个阶段：剂量递增阶段和疗效，随后的疗效扩展队列阶段。该研究的剂量递增阶段的主要目标是评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的安全性和耐受性，并确定A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在不存在有效的标准疗法或者有复发性或对标准疗法不耐受的晚期(不可切除的、复发性或转移性)实体瘤患者中的最大耐受剂量。该研究的疗效扩展队列阶段的主要目标是根据改良的实体瘤反应评价标准1.1版(mRECIST 1.1)来评估总体反应率(ORR)。

该临床研究的次要目标是：

-表征A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的药代动力学；

-评价A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗的免疫原性并将其免疫原性与其暴露和临床活动相关联；

-评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的反应持续时间(DOR)；

-评估最佳总反应(BOR)；

-评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的无进展生存期(PFS)；

-评估总生存期(OS)时间；和

-评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与派姆单抗联合治疗的安全性。

研究设计

本研究为I/II阶段、开放标签、剂量递增研究及连续的平行组疗效扩展研究，设计为确定单独的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和与派姆单抗联用的安全性、耐受性、药代动力学(PK)、药效学(PD)和初步抗肿瘤活性。本研究由两部分组成：

(1)剂量递增部分(阶段I)分为以下三个阶段：

(A)加速滴定；

(B)“3+3”剂量递增；和

(C)安全性/药代动力学(PK)/药效学(PD)扩展队列

(2)疗效扩展队列部分(阶段II)分为以下四个队列：

(A)尿路上皮膀胱癌(UBC)

(B)转移性乳癌(MBC)

(C)HER2高表达(HER23+)篮式实体瘤

(D)与派姆单抗联合治疗。

在一个示例性实施方案中，招募到剂量递增部分和疗效扩展部分(UBC、MBC或篮式[HER23+]队列)中的患者以1小时输注静脉内接受A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗作为单一疗法，4周为一个治疗周期。对于治疗周期1，患者在第1天、第8天和第15天接受A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗。对于治疗周期2及后续周期，患者每2周(例如，第1天和第15天)接受一次A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗，直至确认进展、不可接受的毒性(如本实施例中“剂量限制性毒性(DLT)”部分所述)或任何退出试验或研究药品(IMP)的原因发生。招募到疗效扩展队列部分的派姆单抗联合治疗队列中的患者以1小时IV输注接受A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗并以30分钟IV输注接受派姆单抗，3周为一个治疗周期。在一个示例性实施方案中，与A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗一起按其标签施用200mg派姆单抗。

对于治疗周期1，患者在第1天接受A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗和派姆单抗，并在第8天单独接受A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗。对于治疗周期2及后续周期，患者每3周在每个周期的第1天接受一次A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗和派姆单抗，直至确认进展、不可接受的毒性(如本实施例中“剂量限制性毒性(DLT)”部分所述)或任何退出试验或IMP的原因发生。

经历确认的完全反应(CR)的患者在确认后接受最多12个月的治疗，由研究者决定。如果患者能从继续治疗中受益，则允许治疗超过12个月。

图32A和图32B为临床试验设计的示意图。图32A描述了剂量递增阶段的试验设计。图32B描述了疗效扩展队列阶段的试验设计。

纳入标准

招募到本实施例的临床研究中的任何队列中的患者的一般纳入标准包括：

-签署了书面知情同意书；

-年龄≥18岁(包括男性和女性患者)；

-原发肿瘤必须具有根据免疫组织化学记录的HER2表达；

-如通过超声心动描记术(优选)或多门采集(MUGA)扫描所测量，基线左心室射血分数(LVEF)≥55％；

-有足够的肝功能，其定义为总胆红素水平≤1.5×正常上限(ULN)，天冬氨酸转氨酶(AST)水平≤2.5×ULN，丙氨酸转氨酶(ALT)水平≤2.5×ULN，或者，对于患有有记录的向肝脏的转移性疾病的患者，AST和ALT水平≤5×ULN；

-有足够的肾功能，其定义为根据Cockcroft-Gault公式估算肌酐清除率>50mL/min；和

-根据WHO指南定义为1“高度有效”方法或2“有效”方法对有生育潜力的女性(WOCBP)患者进行了有效避孕。

招募到本实施例中描述的剂量递增部分的加速滴定或“3+3”剂量递增阶段中的患者的附加纳入标准包括：

-客观疾病的证据，但不需要可测量的病变；和

-可获得存档的肿瘤活检(≤6个月，至少8个载玻片)或在筛选窗口内获得的新鲜活检(至少10个载玻片和3个核心)。

招募到本实施例中描述的剂量递增部分的安全性/PK/PD扩展队列阶段中的患者的附加纳入标准包括：

-在筛选窗口期间获得的新鲜肿瘤活检，以具有福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)石蜡块或足够的未染色载玻片来进行IHC(至少3个未染色载玻片)，总共至少12个载玻片和至少3个新鲜核心；和

-在筛选时，根据IHC，HER2为至少1+。

招募到本实施例中描述的UBC扩展队列中的患者的附加纳入标准包括：

-受试者的最后一线治疗后发生放射学疾病进展；

-针对无法手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌用一种(且不超过一种)含铂方案(例如，铂加另一种药物如吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星等)治疗并在最后一次施用含铂方案作为辅助剂后6个月内发生放射学进展或复发，这将被视为第一线含铂方案的失败；

-用检查点抑制剂(即，抗-PD-1或抗-PD-L1)治疗，发生放射学进展(任选地，用基于铂的疗法与基于PD-1/PD-L1的疗法联合治疗)；

-根据IHC，HER2表达为至少1+；和

-可获得在筛选窗口期间获得的新鲜肿瘤活检，以具有福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)石蜡块或足够的未染色载玻片来进行IHC(至少3个未染色载玻片)，总共至少12个载玻片和至少3个新鲜核心。

招募到本实施例中描述的MBC扩展队列中的患者的附加纳入标准包括：

-经组织学证实的MBC；

-既往接受过不超过3线针对转移性疾病的细胞毒疗法；

-先前用紫杉烷类药物和蒽环类药物治疗过，除非有蒽环类药物禁忌；

-根据IHC，肿瘤评分为1+或2+，并且如果评分为2+，则必须通过FDA批准的方法来判定肿瘤ERRB2扩增的存在；

-最后一线全身治疗后发生放射学进展；和

招募到本实施例中描述的篮式(HER23+)队列中的患者的附加纳入标准包括：

-除乳癌或胃癌外的任何实体瘤以及肿瘤内ERBB2扩增史和以下情况之一：1)在最后一线治疗中放射学进展后6个月内最近一次活检中记录的IHC评分为HER23+，或2)在筛选窗口期间，根据IHC，评分为HER 3+；

-使用至少一线已批准或已确立的疗法进行治疗；和

招募到本实施例中描述的疗效扩展部分的派姆单抗联合治疗队列阶段中的患者的附加纳入标准包括：

-符合按其标签接受派姆单抗治疗上皮来源恶性肿瘤的条件；和

排除标准

招募到本实施例的临床研究中的患者的排除标准包括：

-使用未经许可的药物同时进行治疗，包括：

o免疫疗法、免疫抑制药物(包括化疗或全身性皮质类固醇，用于变态反应的短期治疗或用于irAE的治疗除外)或其他实验性药品；

■例外情况：

·短期施用全身性类固醇(例如，针对变态反应或irAE的管理)；

·没有全身效应或全身效应极小的类固醇(局部、吸入)；

o靶向HER2的TKI，或靶向HER2或NKG2D的任何重组分子；

o生长因子(粒细胞集落刺激因子或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；

■例外情况：

·可以开促红细胞生成素和促红细胞生成素类似物；或

o双膦酸盐或地舒单抗治疗；

■例外情况：双膦酸盐或地舒单抗，除非在接受A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的首次施用之前超过14天开始。

-先前用专门靶向HER2通路的药物治疗过。

■例外情况：mAb或酪氨酸激酶抑制剂(TKI)提供清除期(对于mAb或蛋白质治疗药：4周，而对于TKI：2周)。

-同时进行抗癌治疗(例如，细胞减灭疗法、放射疗法(姑息性骨定向放射疗法除外)、免疫疗法或细胞因子疗法(促红细胞生成素除外))，大手术(不包括既往的诊断性活检)，同时使用类固醇或其他免疫抑制剂进行全身性治疗，或在研究治疗开始前28天内使用过任何研究药物。

o例外情况：

■短期施用全身性类固醇(例如，针对变态反应或irAE的管理)；或

■双膦酸盐，前提是在首剂A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗之前至少14天开始治疗。

-除了本研究中待研究的目标恶性肿瘤外，过去3年内有既往恶性疾病，皮肤的基底细胞癌或鳞状细胞癌或原位子宫颈癌除外。

-快速进行性疾病。

-活跃的中枢神经系统(CNS)转移或病史。

-接受过任何器官移植，包括自体或同种异体干细胞移植。

-明显的急性或慢性感染(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)检测阳性史，或在筛选窗口期间检测到活动性或潜伏性乙型肝炎或活动性丙型肝炎)。

-已存在自身免疫性疾病(白癜风患者除外)，在过去3年内需要使用全身性免疫抑制剂治疗超过28天，或临床相关的免疫缺陷(例如，异常γ-球蛋白血症或先天性免疫缺陷)，或在第1天起7天内发烧。

-已知的mAb严重超敏反应(≥3级NCI-CTCAE v5.0)、任何过敏反应史或非控制性哮喘(例如，部分控制性哮喘的3个或更多个特征)。

-与既往治疗相关的>1级NCI-CTCAE v5.0的持续毒性，但脱发和感觉神经病≤2级是可接受的。

-研究期间女性怀孕或哺乳。

-已知酒精或药物滥用。

-严重的心脏病或健康状况，包括但不限于：

o需要抗心绞痛药物的心绞痛；

o有临床意义的瓣膜性心脏病；

o ECG上有透壁性梗塞的证据；

o高血压控制不佳(定义为：收缩压>180mm Hg或舒张压>100mm Hg)；和

o临床相关的不受控制的心脏风险因素、临床相关的肺部疾病或在研究者看来可能限制参与本研究的任何临床相关的健康状况。

-在研究者看来可能削弱患者的参与能力的所有其他重大疾病(例如，炎症性肠疾病)。

-任何妨碍理解或做出知情同意的精神病患。

-无法律行为能力或法律行为能力有限。

-无法签署知情同意书，包括遵守知情同意书(ICF)和本方案中列出的要求和限制。

剂量限制性毒性(DLT)

在每个队列中，评估安全性和耐受性。在前21天对招募到剂量递增部分中和派姆单抗联合队列中的患者评价剂量限制性毒性(DLT)。根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(NCI-CTCAE)v5.0，DLT为≥3级的药物不良反应，发生在剂量递增队列的DLT评价期间。药物不良反应可能是研究者和/或申办者怀疑与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗有关的不良事件。DLT定义为招募到剂量递增部分中和派姆单抗联合队列中的患者在治疗的前21天内发生任何以下情况：

-任何3至4级非血液学毒性，除以下外：

i.在没有最大限度的药物治疗的情况下，3级恶心、呕吐和腹泻持续<72小时；

ii.在没有最大限度的药物治疗的情况下，4级呕吐和腹泻持续<72小时；

iii.3级疲劳<5天；

iv.在没有最大限度的药物治疗的情况下，高血压3级。

-任何以下血液学毒性：

i.4级中性粒细胞减少症>5天；

ii.3级血小板减少症伴出血；

iii.4级血小板减少症。

-根据研究者的看法不大可能与研究治疗有关、不具有任何临床相关并且在适当的医疗管理下在7天内消退至≤1级的超出正常范围的单个实验室值除外。

DLT的观察期可包括所有患者的所有剂量队列的剂量递增部分中研究药品治疗的前3周，数据用于实施剂量递增算法以确定最大耐受剂量(MTD)。可以在剂量递增阶段中招募另外的患者并且可以收集不良事件；任选地，这些患者可以没有具体的DLT观察期。安全监测委员会可以采取保守的方法来确定治疗相关毒性与药物的相关性。治疗相关严重不良事件被认为与药物相关，除非与基础疾病或公认的合并症有明显的明确关系。

通过记录、报告和分析基线健康状况、不良事件(AE)、体检结果(包括生命体征及左心室射血分数的测定、心电图和实验室测试)来评估安全性。

剂量和施用

A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗剂量递增

在试验进入时给每名患者指定一个剂量水平。根据需要调整剂量水平以适应体重变化。递增至下一剂量水平的决定基于队列中所有患者均已达到第21天(DLT评价期)后的安全性评估。在某些实施方案中，患者每两周接受一次历时1小时(例如，50至70分钟)的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗IV输注。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的剂量基于每次药物施用前一天或当天测定的患者的体重来计算。在一个示例性实施方案中，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的起始剂量为5.2x 10^-5mg/kg，并且前8个剂量水平(DL)遵循剂量递增的加速设计并由单个患者队列组成，递增步长不大于3.3倍。如果观察到DLT，则将剂量递增切换至“3+3”设计，在观察到DLT的剂量水平上累积另外5名患者。

与加速滴定阶段相似，在“3+3”递增阶段中，剂量递增的进行将在剂量水平之间增加不超过3.3倍。表34罗列了根据体重(mg/kg)的起始剂量和递增方案的剂量水平(DL)。

表34：“加速滴定”和“3+3”剂量递增阶段中的示例性DL(单位：mg/kg体重)。

在一个示例性实施方案中，在“3+3”阶段期间，最初招募三名患者到给定剂量队列中。在招募第一名患者后，在不早于向第一名患者第二次注射A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗后2天招募第二名患者。在向第二名患者施用A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗后至少48小时随访后，对第三名患者给于A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗的首次施用。可以在特定的剂量队列招募超过3名患者(例如，如果在特定队列的前3名患者中观察到DLT，或已在DL 7招募了3名患者后)而在治疗开始之间没有任何预定义的时间间隔，除非在前3名患者的治疗过程中观察到输注反应或细胞因子释放综合征，或任何3级或更高级别的治疗相关毒性。在这样的情况下，重复前3名患者的相同预定义时间间隔。如果在任何这些患者中没有观察到DLT，则研究进行至向下一更高剂量队列中招募另外3名患者。如果1名患者在特定剂量下出现DLT，则向该同一剂量队列中招募另外3名患者。在特定剂量队列中超过1/6的患者出现DLT表明已超出MTD，故不再进行进一步的剂量递增(参见本实施例中的剂量限制性毒性(DLT)部分)。

在一个示例性实施方案中，一旦安全监测委员会确立了DL 10(1.6mg/kg)的安全性，则在DL9治疗至多10名另外的患者(每个DL总共至多16名患者)以增加该DL的安全性、PK和PD数据库，而累积将在DL 11按照“3+3”规则进行。类似的过程适用于DL 10至13。安全性/PK/PD扩展队列阶段的累积继续进行，无需预先定义的观察期。在筛选时(第1剂研究药品前30天内)和第6剂研究药品前1至7天内进行强制性肿瘤活检。在这些患者的治疗过程中生成安全性信息并传达给安全监测委员会。对于安全性/PK/PD扩展队列的后续DL，实施相同的过程。

疗效扩展队列剂量

如本实施例中先前提到的，有4个疗效扩展队列：UBC；MBC；篮式(HER23+)队列，其中患者患有HER2高表达实体瘤，且已接受至少1次由已确立或已批准的疗法组成的第一线治疗；以及与派姆单抗联合治疗。这些队列中的累积如下启动：

-在前三个队列(UBC、MBC和篮式(HER23+))中，在确定A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的剂量和时间安排后，启动3个单一疗法队列。

-一旦确立了DL11的安全性，就启动A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与派姆单抗联用的安全性磨合的累积。在与派姆单抗组合测试之前，在用A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗作为单一疗法的“3+3”剂量递增过程中，待与派姆单抗联用的A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗剂量被宣布为是安全的。

在前三个疗效扩展队列中，患者接受A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗作为单一疗法。这三个扩展队列中的每一个队列中可以招募至多40名患者，在对每个队列中的前20名患者观察至少3个月后进行无效性分析。在筛选时(第1剂研究药品前30天内)和第6剂研究药品前1至7天内进行强制性肿瘤活检。

在与派姆单抗联合治疗的疗效扩展队列中，患者在DL 10(以1小时IV输注)接受A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗并以200mg的批准剂量(以30分钟IV输注)接受派姆单抗，3周为一个治疗周期。本次安全性磨合练习与之前描述的“3+3”设计相同。本研究中的患者符合“纳入标准”部分中描述的患者纳入标准。

疗效扩展队列(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗单一疗法队列)期间的安全性

安全监测委员会持续监测来自参与患者的所有安全性信息。在一个示例性实施方案中，招募一组20名患者并随访4周。随后，此类安全性审查将在40名患者接受治疗后的4周内进行并随访至少4周。然后，在每次招募40名患者时实施类似的过程并随访至少4周。

疗效扩展队列(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与派姆单抗联合治疗队列)期间的安全性

与针对“3+3”剂量递增部分所述相似，持续监测来自参与患者的所有安全性信息。对于每名患者，在21天的DLT评价期审查安全性和耐受性数据，并确定进展到进一步的剂量施用。如果联合治疗可以安全进行，则招募一组20名患者并随访3周。

终点

本研究设计为评价主要和次要终点以评估A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗任选地与派姆单抗联用作为局部晚期或转移性实体瘤患者的治疗的临床获益。

主要终点和主要终点的分析

测量治疗的前三周期间DLT的发生作为剂量递增部分的主要终点。最大耐受剂量(MTD)在剂量递增部分期间确定并定义为6名接受治疗的患者中不超过1名患者经历DLT事件的最高剂量水平(DL)。最大耐受剂量通过来自剂量递增部分的个体患者数据确定。另外，为了最终的统计分析，可以分析以下内容：

-在每个剂量水平，DLT群体中在第一个DLT评价期期间经历DLT的患者的数量和比例；

-在每个剂量水平，DLT群体中患者在第一个DLT评价期期间经历的治疗中出现的不良事件的数量和比例。

测量如由独立终点审查委员会(IERC)裁定的根据mRECIST 1.1确认的总体反应率作为疗效扩展队列的主要终点。总体反应率定义为试验治疗开始后直至记录的疾病进展期间所有肿瘤评估访视中获得的最佳反应，同时考虑到以下确认要求。对于完全反应和部分反应，需要根据mRECIST 1.1确认反应。确认可以按定期安排的6周评估时间间隔来评价，但不早于完全反应或部分反应的初始记录后4周。部分反应的确认可以在部分反应的初始记录之后的下一次评估后的评估中确认。

疾病稳定的最佳总反应可能需要在研究治疗开始后至少37天的时间点确定疾病稳定的总体反应。对每名患者列出每次安排的肿瘤评估时的反应以及最佳总反应。

次要终点和次要终点的分析

研究的次要终点可能包括以下：

-根据NCI-CTCAE v5.0，对于所有剂量组/适应症，治疗中出现的不良事件的数量、严重程度和持续时间；

-根据NCI-CTCAE v5.0，治疗相关不良事件的数量、严重程度和持续时间；

-根据mRECIST 1.1的反应持续时间；

-药代动力学特征；

-根据mRECIST 1.1的最佳总反应；

-根据mRECIST 1.1的无进展生存期；

-总生存期时间；

-进行性疾病特征；

-抗-A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗抗体的血清滴度；

-HER2在肿瘤组织上的表达；

-ERBB2状态(扩增/非扩增、突变/非突变)；

-根据mRECIST 1.1，第13周未确认的反应(针对安全性/PK/PD扩展队列)；和

-根据mRECIST 1.1、按IERC的无进展生存期时间；根据mRECIST 1.1、按IERC的反应持续时间(针对疗效扩展队列)。

疗效参数

扩展部分中的主要疗效参数为根据mRECIST 1.1的最佳总反应。ORR将根据mRECIST 1确定。总体反应率在整个试验期间进行评价。对于部分反应或完全反应的最佳总反应，需要根据mRECIST 1.1确认反应。对每名患者列出每次安排的肿瘤评估时的反应以及最佳总反应。将总体反应率(定义为完全反应+部分反应)的数量和比例按队列列表。对于HER2高的篮式队列，将总体反应率的数量和比例针对每种肿瘤类型列表，每种肿瘤类型招募超过5名患者并治疗4周。将由少于5名患者(从1名患者到4名患者)代表的肿瘤类型表示为一个亚组。根据mRECIST 1.1，对扩展队列中具有确认的反应的每名患者计算反应持续时间并在所有队列中使用Kaplan-Meier方法进行分析。将无进展生存期时间和总生存期时间呈现在患者列表中并在招募了全部计划患者数量的扩展队列的完整分析集中使用Kaplan-Meier方法进行分析。

药代动力学特征

通过经验证的方法测定A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的血清浓度。估计并报告以下PK参数：

-AUC0→t：从给药时间到最后一次观察时间的浓度-时间曲线下面积(通过线性梯形法求和计算)；

-·AUC0→∞：从给药时间外推至无穷大的曲线下面积(通过线性梯形法求和计算并使用Clast/λz外推至无穷大)；

-λz：末端消除速率常数。λz的值由log(浓度)对时间的回归线的斜率确定，具有以下限制：(i)必须有至少3个连续的可测量浓度，(ii)所有浓度必须随时间下降，(iii)回归的相关系数(r)必须≥0.95；

-Cmax：给药后观察到的最大血清浓度；

-tmax：Cmax发生的时间；和

-t1/2：消除半衰期，以0.693/λz确定。

使用描述性统计汇总PK参数。描绘个体以及平均浓度-时间图。当分析完整性受到影响时，可以插补未解析的缺失数据。数据插补采用保守原则。

抗药物抗体的血清滴度：安全免疫原性测试策略遵循以下实施和进行：

-生物技术衍生治疗性蛋白质的免疫原性评估(参见Guideline onImmunogenicity Assessment of Therapeutic Proteins.18May 2017EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006Rev 1Committee for Medicinal Products for Human Use(CHMP)；欧洲药品管理局)；

-旨在用于体内临床使用的mAb的免疫原性评估(参见Guideline onImmunogenicity Assessment of Monoclonal Antibodies Intended for In VivoClinical Use.24May 2012EMA/CHMP/BMWP/86289/2010Committee for MedicinalProducts forHumanUse(CHMP)；欧洲药品管理局)；

-FDA(2009年草案)行业指南：Assay Development for Immunogenicity TestingofTherapeutic Proteins。

应用一种合格的方法，该方法在人血清中存在过量药物的情况下使用酸解离步骤来检测抗药物(即，抗-A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗)抗体。不需要在酸处理后去除药物。测定阳性样品的ADA滴度。

生物标志物

分别针对每个DL或队列为所有预先计划的时间点提供生物标志物的汇总统计。如适用，呈现出相对于基线水平的变化。基于每名患者显示特征随时间的变化。

安全性分析

暴露于A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的程度由持续时间(周)、施用次数、累积剂量(mg/kg)、剂量强度(mg/kg/周)、相对剂量强度(实际给予剂量/计划剂量)、剂量减少次数和剂量延迟次数表征。对安全性群体进行安全性分析。使用描述性统计按DL和队列对安全性终点列表。安全性评估基于对不良事件发生率的审查，包括特别关注的不良事件、药物不良反应以及生命体征、心电图、体重和实验室值(血液学和血清化学)的变化。治疗进行期定义为从第一剂研究治疗到最后一剂研究治疗的时间+30天，或新抗癌治疗的最早日期–1天，以先发生者为准。

不良事件(AE)

不良事件根据监管活动医学词典(MedDRA)进行编码。AE的严重程度使用NCI-CTCAE v5.0毒性分级量表进行分级。治疗中出现的不良事件(TEAE)为发作日期在治疗进行期期间或者事件的恶化在治疗进行期期间的那些AE。TEAE的发生率(无论归因)和定义为可能与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗相关的AE按优选项和系统器官类别进行汇总并根据强度和与A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的关系进行描述。所有过早/永久终止均按退出研究的主要原因进行汇总。TEAE的持续时间定义为发作与消退至基线之间的时间。3级和4级的持续时间由特定TEAE在其病程中达到3级或4级严重程度的时间段来定义。检查描述性统计以了解剂量相关ADR的迹象。

实验室变量

根据NCI-CTCAE将实验室结果按等级分类。汇总第一次试验治疗后最差的试验中等级。显示毒性等级从第一次治疗到最高等级的变化。不是NCI-CTCAE的一部分的变量的结果呈现为低于正常限值、在正常限值内或高于正常限值。这些分析中仅包括具有基线后实验室值的患者。

PE(包括生命体征、12导联心电图和经胸超声心动图(TT-ECHO)/MUGA)

记录PE数据，包括生命体征(体温、呼吸频率、心率和血压)和12导联ECG。

实施例4：用A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗治疗局部晚期或转移性实体瘤

目标

与实施例3中描述的研究相似，该临床研究设计有两个阶段：剂量递增阶段和疗效，随后的疗效扩展队列阶段。该研究的剂量递增阶段的主要目标是评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的安全性和耐受性，并确定A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在不存在有效的标准疗法或者有复发性或对标准疗法不耐受的晚期(不可切除的、复发性或转移性)实体瘤患者中的最大耐受剂量。该研究的疗效扩展队列阶段的主要目标是根据实体瘤反应评价标准1.1版(RECIST 1.1)来评估总体反应率(ORR)。

该临床研究的次要目标是：

-表征A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的药代动力学；

-评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的反应持续时间(DOR)；

-评估最佳总反应(BOR)；

-评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的无进展生存期(PFS)；

-评估总生存期(OS)时间；和

-评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗与派姆单抗、纳武单抗或白蛋白结合型紫杉醇联合治疗的安全性。

研究设计

本研究为I/II阶段、开放标签、剂量递增研究及连续的平行组疗效扩展研究，设计为确定单独的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和与派姆单抗、纳武单抗或白蛋白结合型紫杉醇联用的安全性、耐受性、药代动力学(PK)、药效学(PD)和初步抗肿瘤活性。本研究由两部分组成：

(1)剂量递增部分(阶段I)分为以下三个阶段：

(A)加速滴定；

(B)“3+3”剂量递增，其中施用A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗作为单一疗法，或作为联合疗法(例如，与纳武单抗或白蛋白结合型紫杉醇联合)；和

(C)安全性/药代动力学(PK)/药效学(PD)扩展队列，其中施用A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗作为单一疗法，或作为联合疗法(例如，与纳武单抗或白蛋白结合型紫杉醇联合)，并且

(2)疗效扩展队列部分(阶段II)分为以下五个队列：

(A)HER2高的胃癌(与纳武单抗联用)；

(B)HER2高的食管癌(与纳武单抗联用)；

(C)表达HER2的尿路上皮膀胱癌(UBC)；

(D)转移性三阴性乳癌(TNBC)，与白蛋白结合型紫杉醇联用；和

(E)HER2高表达(HER23+)篮式实体瘤。

与纳武单抗联用

对于DL1至DL11，以静脉内输注施用A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗，对于所有输注，历时至多2小时但不少于1小时。从DL12及更高开始，向接受纳武单抗联合治疗的患者施用A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(以静脉内输注施用，在C1的第1天、第8天和第15天历时至少3小时、至多4小时，对于所有后续输注，历时至多2小时但不少于1小时)和480mg纳武单抗(以30分钟静脉内输注施用)，4周为一个治疗周期。

与白蛋白结合型紫杉醇联用

对于DL1至DL11，以静脉内输注施用F3’-TriNKET-曲妥珠单抗，对于所有输注，历时至多2小时但不少于1小时。从DL12及更高开始，向与白蛋白结合型紫杉醇联用队列的患者施用F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(以静脉内输注施用，在C1的第1天、第8天和第15天历时至少3小时、至多4小时，对于所有后续输注，历时至多2小时但不少于1小时)和剂量为100mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇(以30分钟静脉内输注施用)，4周为一个治疗周期。

纳入标准

剂量递增阶段(“加速滴定”和“3+3”剂量递增部分)的患者具有以下纳入标准。

·经组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性实体瘤，尚无标准疗法，或标准疗法已失败。必须在档案组织或新鲜肿瘤活检中记录有根据免疫组织化学检测到的HER2表达和/或erbb2扩增和/或erbb2激活突变。

纳武单抗“3+3”队列中的患者具有以下纳入标准。

·患者符合按其标签接受纳武单抗治疗上皮来源恶性肿瘤的条件或患有无标准疗法或标准疗法已失败的肿瘤。

·患者已接受过抗PD-1或抗PD-L1作为前线疗法；或未接受过抗PD-1或抗-PD-L1作为前线疗法并且已经历过3级或4级药物相关毒性或与既往抗-PD-1或抗PD-L1疗法相关的与影响肺或神经系统的既往检查点疗法相关的2级药物相关毒性。

白蛋白结合型紫杉醇“3+3”队列中的患者具有以下纳入标准。

·患者符合按其标签用白蛋白结合型紫杉醇治疗的条件，其包括转移性乳癌、针对转移性疾病的联合化疗失败后或辅助化疗后6个月内复发。在这种情况下，额外的纳入标准还包括过去6个月内未暴露于紫杉烷类药物。

或

·患者患有无标准疗法或标准疗法已失败的肿瘤。在这种情况下，患者在过去6个月内也不应用紫杉烷类药物治疗过。

或

·患者患有第一线晚期(不可切除/复发性/转移性)TNBC。

安全性/PK/PD扩展部分(剂量递增阶段)中的患者具有以下纳入标准。

·经组织学或细胞学证实的局部晚期或转移性实体瘤，尚无标准疗法，或标准疗法已失败。患者肿瘤必须具有根据免疫组织化学使用CLIA认可的(或等效)方法记录的HER2表达。

·疾病必须可通过RECIST 1.1用至少1个一维可测量病变测量。

·可以得到在筛选窗口内获得的从复发性转移性或局部晚期疾病(如果适用)获得的筛选活检。来自骨转移的肿瘤组织无法评价PD-L1表达，因此不可接受。

·筛选时通过免疫组织化学测量的HER2水平为至少1+(可接受用档案组织来确定HER2状态)。

纳武单抗扩展队列中的患者另外具有以下纳入标准。

·患者符合按其标签接受纳武单抗治疗上皮来源恶性肿瘤的条件。

或

·针对该患者没有标准疗法，或标准疗法已失败。

·使用抗PE-1或抗PD-L1治疗期间出现3级或4级药物相关毒性。

·与影响肺或神经系统的既往检查点疗法相关的2级药物相关毒性。

白蛋白结合型紫杉醇扩展队列中的患者具有以下纳入标准。

或

·患者患有第一线晚期(不可切除/复发性/转移性)TNBC。

UBC疗效扩展队列中的患者具有以下纳入标准。

·经组织学或细胞学记录的尿路上皮(包括肾盂、输尿管、膀胱、尿道)局部晚期或转移性移行细胞癌。

·患者在其最后一线治疗后具有放射学疾病进展。

·患者已针对无法手术的局部晚期或转移性尿路上皮癌接受过一种(且不超过一种)含铂方案(例如，铂加另一种药物如吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星)并在最后一次施用含铂方案作为辅助剂后6个月内发生放射学进展或复发，这将被视为第一线含铂方案的失败。基于铂的疗法与基于PD-1/PD-L1的疗法的联用可能是可以接受的。

·使用针对胃癌制定的评估指南，通过IHC(CLIA认可的[或等效]测试)，患者具有至少1+的HER2表达。

TNBC疗效扩展队列中的患者具有以下纳入标准。

·如通过免疫组织化学(例如，使用Agilent/Dako的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx测定法)所测量，肿瘤的PD-L1评分(CPS)低于10。

·经组织学记录的(转移性或局部晚期)TNBC，包括如根据美国医师学会(ACP)指南或等同物所定义使得受试者不符合用曲妥珠单抗的条件的HER2状态、阴性ER表达和阴性PR表达。

o如通过原位杂交所确定，缺乏HER2扩增(HER2与CEP17的比率<2.0或单探针平均HER2基因拷贝数<4个信号/细胞)，或如通过免疫组织化学所测量，HER2表达水平为0、1+或2+。

o ER和PR阴性定义为经由免疫组织化学分析，表达激素受体的细胞<1％。

·没有针对无法手术的局部晚期或转移性TNBC的既往化疗或靶向全身治疗。

·允许对转移性疾病进行放射治疗或内分泌治疗。对这些治疗没有最低清除期的要求。患者应从放射的影响中恢复过来。

·如果治疗在招募前≥12个月完成，则新辅助或辅助环境中的既往化疗(包括紫杉烷类药物)是允许的。

·疾病必须可通过RECIST 1.1用至少1个一维可测量病变测量

胃癌队列中的患者具有以下纳入标准。

·根据第7版AJCC分期，为晚期(不可切除/复发性/转移性)胃癌或胃食管连接部癌症。

·根据ACP指南，患有肿瘤的患者已被宣布为HER2阳性(即符合用曲妥珠单抗治疗的条件)。

·患者已接受过第一线治疗，其包括铂盐和氟吡啶与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗生物类似物联用。

·患者在第一线治疗后有进展。

·患者已接受过仅一线治疗来治疗转移性疾病。

·疾病可通过RECIST 1.1用至少1个一维可测量病变测量。

·纳入时患者患有未知微卫星不稳定性(MSI)高的肿瘤(在研究期间发现其肿瘤具有高MSI的患者将留在研究中并且该信息将被记录在统计分析计划中)。

食管腺癌队列中的患者具有以下纳入标准。

·根据第7版AJCC分期，患者患有晚期(不可切除/复发性/转移性)食管癌。

·患者已接受过第一线治疗，其包括铂盐和氟吡啶与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗生物类似物联用；第一线治疗应不包括抗PD-1。

·患者在第一线治疗后有进展。

·患者已接受过仅一线治疗来治疗转移性疾病。

·疾病可通过RECIST 1.1用至少1个一维可测量病变测量。

HER23+实体瘤疗效扩展队列中的患者具有以下纳入标准。

·疾病可通过RECIST 1.1用至少1个一维可测量病变测量。

·患者患有任何实体瘤(乳癌或胃癌除外)和肿瘤上erbb2扩增史以及以下情况之一：1)在最后一线治疗中放射学进展后6个月内最近一次活检中通过IHC记录到HER23+；或2)在筛选窗口期间，通过IHC记录到HER 3+。

·患者已接受过至少一线已批准或已确立的治疗。

排除标准

招募到本实施例的临床研究中的患者的排除标准包括：

-使用未经许可的药物同时进行治疗，如未经许可的药物和治疗部分中所述。先前使用专门靶向HER2通路的药物(mAb或酪氨酸激酶抑制剂[TKI])进行的治疗是可以接受的，但需要提供清除期(对于mAb或蛋白质治疗药：4周，而对于TKI：2周)。

-同时进行抗癌治疗(例如，细胞减灭疗法、放射疗法[姑息性骨定向放射疗法除外]、免疫疗法或细胞因子疗法(促红细胞生成素除外))，大手术(不包括既往的诊断性活检)，同时使用类固醇或其他免疫抑制剂进行全身性治疗，或在研究治疗开始前28天内使用过任何研究药物。短期施用全身性类固醇(针对变态反应或irAE的管理)是允许的。注：接受双膦酸盐或地舒单抗的患者是符合条件的，前提是在首剂F3’-TriNKET-曲妥珠单抗之前至少14天开始治疗。

-除了本研究中待研究的目标恶性肿瘤外，过去3年内有既往恶性疾病，皮肤的基底细胞癌或鳞状细胞癌、低级别前列腺癌(格里森评分为6或更低)或原位子宫颈癌除外。

-预期寿命少于3个月。

-排除脑转移患者，除非满足所有以下标准：

a.CNS病变无症状且先前已接受过治疗

b.患者不需要每天持续进行类固醇治疗来替代肾上腺功能不全(以小于≤10mg泼尼松[或等同物]的剂量口服类固醇除外)

c.影像学显示从针对CNS转移的上次治疗起28天疾病稳定

-接受过任何器官移植，包括自体或同种异体干细胞移植。

-明显的急性或慢性感染(包括人类免疫缺陷病毒[HIV]检测阳性史，或在筛选窗口期间检测到活动性或潜伏性乙型肝炎或活动性丙型肝炎)。

-已存在自身免疫性疾病(白癜风患者除外)，在过去3年内需要使用全身性免疫抑制剂治疗超过28天，或临床相关的免疫缺陷(例如，异常γ-球蛋白血症或先天性免疫缺陷)，或在第1天起7天内发烧2级或更高。有自身免疫相关甲状腺机能减退病史并服用稳定剂量的甲状腺替代激素的患者可能符合本研究的条件。使用稳定的胰岛素治疗方案而具有受控的1型糖尿病的患者可能符合本研究的条件。

-已知的mAb严重超敏反应(≥3级NCI-CTCAE v5.0)、任何过敏反应史或非控制性哮喘(即，部分控制性哮喘的3个或更多个特征)。

-与既往治疗相关的>1级NCI-CTCAE v5.0的持续毒性，但脱发、内分泌疾病≤2级并且感觉神经病≤2级是可接受的。

-研究期间女性怀孕或哺乳。

-已知酒精或药物滥用。

-严重的心脏病或健康状况，包括但不限于：

a.纽约心脏协会III级或IV级心力衰竭或收缩功能障碍(LVEF<55％)病史。

b.高风险不受控制的心律失常，即，静息时心率>100/分钟的心动过速。

c.显著的室性心律失常(室性心动过速)或更高级别的AV阻滞(二度2型AV阻滞[Mobitz 2]或三度AV阻滞)。

d.需要抗心绞痛药物的心绞痛。

e.有临床意义的瓣膜性心脏病。

f.ECG上有透壁性梗塞的证据。

g.高血压控制不佳(定义为：收缩压>180mm Hg或舒张压>100mm Hg)。

h.临床相关的不受控制的心脏风险因素、临床相关的肺部疾病或可能限制参与本研究的任何临床相关的健康状况。

-由于晚期恶性肿瘤并发症或需要补充性氧疗而导致静息时严重呼吸困难。

-可能削弱患者的参与能力的所有其他重大疾病(例如，炎症性肠疾病)。

-任何妨碍理解或做出知情同意的精神病患。

-无法律行为能力或法律行为能力有限。

剂量限制性毒性

剂量限制性毒性如先前在实施例3中所述。

剂量和施用

阶段II-疗效扩展队列

两个队列被施用F3'-TriNKET-曲妥珠单抗作为单一疗法：

·表达HER2的UBC；和

·患有HER2高表达实体瘤的篮式(HER23+)患者，其已接受至少1次由已确立或已批准的疗法组成的第一线治疗。

两个队列被施用F3'-TriNKET-曲妥珠单抗作为与纳武单抗的联合疗法：

·HER2高的胃癌；和

·HER2高的食管癌。

一个队列被施用F3'-TriNKET-曲妥珠单抗作为与白蛋白结合型紫杉醇的联合疗法：

·患有晚期(局部复发性/不可切除/转移性)TNBC的患者。

在一个示例性实施方案中，在以不大于3.3倍的递增步长加速剂量递增之后，向患者施用初始八剂A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗。表35罗列了根据体重(mg/kg)的起始剂量和递增方案的剂量水平(DL)。

表35：“加速滴定”递增阶段中的示例性DL(单位：mg/kg体重)。

在示例性的“3+3”剂量递增部分中，接下来的六个剂量水平在表36中描述。

表36：“3+3”剂量递增阶段中的示例性DL(单位：mg/kg体重)。

在第1周期第1天(C1D1)，对受试者施用预防性前驱给药，包括对乙酰氨基酚、苯海拉明和皮质类固醇(例如，甲基泼尼松龙)。从C1D8开始，预防性前驱给药将仅包括对乙酰氨基酚和苯海拉明。

纳武单抗

在研究的剂量递增部分(阶段I)的与纳武单抗联合治疗队列中以480mg(按其标签)的批准剂量使用纳武单抗。

纳武单抗在每个28天周期的第1天施用，如其标签中所述。

在与纳武单抗联合治疗队列中，剂量递增将从DL10的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和480mg的纳武单抗(以30分钟静脉输注)开始，4周为一个治疗周期。纳武单抗将在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的施用之前施用。

白蛋白结合型紫杉醇。

白蛋白结合型紫杉醇队列中的施用将以DL10的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和剂量为100mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇(以30分钟静脉输注)开始进行，各在第1周期的第1天、第8天和第15天(按其标签)施用。

在后续周期中，将在第1天和第15天施用A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗并在第1天、第8天和第15天施用白蛋白结合型紫杉醇。

白蛋白结合型紫杉醇将在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的施用之前施用。

终点

本研究设计为评价主要和次要终点以评估A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗任选地与纳武单抗或白蛋白结合型紫杉醇联用作为局部晚期或转移性实体瘤患者的治疗的临床获益。

主要终点和主要终点的分析

测量治疗的前三周期间DLT的发生作为剂量递增部分的主要终点。

测量如由独立终点审查委员会(IERC)裁定的根据RECIST 1.1确认的总体反应率作为疗效扩展队列的主要终点。

次要终点和次要终点的分析

研究的次要终点可能包括以下：

-根据RECIST 1.1的反应持续时间；

-药代动力学特征；

-根据RECIST 1.1的最佳总反应；

-根据RECIST 1.1的无进展生存期；

-总生存期时间；

-进行性疾病特征；

-抗-A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗抗体的血清滴度；

-HER2在肿瘤组织上的表达；

-ERBB2状态(扩增/非扩增、突变/非突变)；

-根据RECIST 1.1，第13周未确认的反应(针对安全性/PK/PD扩展队列)；和

-根据RECIST 1.1的无进展生存期时间；根据RECIST 1.1的反应持续时间(针对疗效扩展队列)。

疗效参数

临床疗效参数将在完整的分析集中进行描述性分析。另外将根据统计分析计划中的进一步规范在疗效群体中计算反应率。可以考虑汇集来自次要和疗效扩展队列的数据以提高估计的准确性。进一步的细节将在统计分析计划中具体说明。

扩展部分中的主要疗效参数为根据RECIST 1.1的最佳总反应。

总体反应率评估将根据RECIST 1.1确定。总体反应率将在整个试验期间进行评价。对于部分反应或完全反应的最佳总反应，将需要根据RECIST 1.1确认反应。将对每名患者列出每次安排的肿瘤评估时的反应以及最佳总反应。总体反应率(定义为完全反应+部分反应)的数量和比例将被按队列列表。对于HER2高的篮式队列，总体反应率的数量和比例将被针对每种肿瘤类型列表，每种肿瘤类型招募超过5名患者并治疗4周。由少于5名患者(从1名患者到4名患者)代表的肿瘤类型将被表示为一个亚组。

根据RECIST 1.1，对扩展队列中具有确认的反应的每名患者计算反应持续时间并在所有队列中使用Kaplan-Meier方法进行分析。

无进展生存期时间和总生存期时间将被呈现在患者列表中并在招募了全部计划患者数量的扩展队列的完整分析集中使用Kaplan-Meier方法进行分析。

药代动力学特征、抗药物抗体的血清滴度、生物标志物、安全性分析、不良事件、实验室变量和体检均如先前在实施例3中所述进行评估。

实施例5：减少A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的输注相关反应

本实施例描述了设计用于在实施例4中描述的临床研究中减轻对A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的输注相关反应的联合疗法。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗输注的施用历时至多两小时并且不少于一小时。

在实施例4的临床研究的执行过程中观察到，施用退烧药和抗组胺药不足以充分预防此类输注相关反应的发生。具体来说，两名患者接受了0.52mg/kg的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗治疗。一名患者发生1级细胞因子释放综合征(CRS)事件，另一名患者发生了2级CRS事件。鉴于这些输注相关反应，开发了一种改进的方案以提高在2级输注相关反应的风险最大时完成A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的首次施用的可能性。

为了减轻输注相关反应，在单一疗法以及纳武单抗和白蛋白结合型紫杉醇联用队列中，对于接受了至少0.52mg/kg(DL9)的初始剂量的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的患者，在每名患者第一次输注A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的60分钟内静脉内施用125mg甲基泼尼松龙(或等同物)的前驱给药方案。另外，对于接受了至少0.052mg/kg(DL7)的初始剂量的A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的患者，在每剂A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗之前大约30至60分钟静脉内施用40-50mg的苯海拉明(或等同物)和800-1000mg的对乙酰氨基酚(或口服等同物)。仅在第一次A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗施用(即，第一个四周治疗周期的第1天)时提供甲基泼尼松龙(或等同物)。

观察到甲基泼尼松龙大幅降低了输注相关反应的发生率。四名患者通过静脉内输注接受了0.52mg/kg A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗治疗并在输注前接受了125mg的甲基泼尼松龙。仅一名患者出现了2级输注相关反应。在治疗该患者的同时中断输注。事件解决并重新开始输注。患者耐受了剩余的输注而没有任何进一步的事件。其他三名患者没有经历任何输注相关反应。

在临床研究中观察到进一步的输注相关反应，如下面表37中所汇总。仅向以0.52mg/kg或更大(即，DL9或以上)的初始剂量接受A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的患者提供甲基泼尼松龙(或等同物)。

表37：接受A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的患者中的输注相关反应

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*在整个本表中，“n”是指该患者组或该剂量水平下的患者数量。

如表37中所示，在接受0.52mg/kg或更大剂量(即，DL9或以上)的A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗的54名患者中，观察到总共18例输注相关反应，平均起来，每名患者0.33例输注相关反应。相比之下，在接受低于0.16mg/kg(即，DL7)或0.52mg/kg(即，DL8)的A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗的4名患者中，观察到总共6例输注相关反应，平均起来，每名患者1.5例输注相关反应。据了解，一般来说，更大剂量的基于蛋白质的肿瘤治疗可能伴有更严重的输注相关反应。因此，在没有施用甲基泼尼松龙(或等同物)的情况下，高剂量组(DL9至DL12)中每名患者的反应数量预计将为至少1.5，甚至更多。实际观察到的较小数字(0.33)表明，在这些患者组中施用甲基泼尼松龙(或等同物)大大改善了A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的输注相关反应。

实施例6：A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的细胞毒性

使用表达HER2的人类癌细胞系来评估在NK细胞的存在下TriNKET(A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和单克隆抗体的肿瘤抗原结合。表38中列出了所使用的细胞系。

表38：细胞溶解测定法中使用的细胞系

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通过流式细胞术测量这些细胞系的每个细胞表面上表达的HER2蛋白质的绝对数量。使用Alexa Fluor 647抗体标记试剂盒(Thermo Fisher,A20186)标记A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗。通过在经预热的培养基中用TrypLE解离靶标细胞来测定标记的TriNKET的饱和浓度。将细胞重悬于1x PBS中，调节至1x10⁶/ml，并一式两份地将50μl(5x10⁴)细胞铺在每个孔中。通过在1x PBS中按1:1000稀释Zombie NIR(423105)或ZombieAqua Fixable Viability染料(423102)储备液来制备活/死染色混合物。将细胞沉淀并重悬于50μl活/死染色混合物中，并在RT下温育15分钟。用FACS缓冲剂洗涤细胞2次，并重悬于50μl在FACS缓冲剂中连续稀释(3倍；从500nM开始)的标记的TriNKET中。将细胞在冰上避光温育1小时。用FACS缓冲剂洗涤细胞2次，并重悬于50μl固定缓冲剂(BioLegend)中。让细胞在RT下固定10分钟。用FACS缓冲剂洗涤细胞2次，并在BD FACSCelesta2 HTS机器上进行分析。

对于表面受体定量，将表达靶标的细胞解离，一式两份地铺板，并如上所述用活/死染料染色。然后用FACS缓冲剂洗涤细胞2次，并与饱和浓度的标记的TriNKET一起在冰上避光温育1小时。然后如上所述洗涤、固定细胞并准备在BD FACSCelesta2 HTS机器上进行分析。在相同的分析设置下运行Quantum Alexa Fluor 647MESF珠(Bangs Laboratories,647)以创建校准曲线。在FlowJo v10.7.1(BD)中分析数据。对单细胞(FSC-H对FSC-A)和活细胞(FSC-H对活/死)进行细胞门控。将Alexa Fluor 647珠的制造商预定义MESF值和几何平均荧光强度(gMFI)值在Prism 9.0中使用非线性拟合进行对数变换以创建校准曲线。将来自TriNKET染色细胞的对数变换gMFI值根据Prism 9.0中的校准曲线进行插值。将内插值转换为非对数值，减去背景(如由未染色的细胞群所确定)，并对标记程度进行归一化。表39中报告了重复孔的四舍五入平均受体数量。

表39：细胞溶解测定法中使用的细胞系上的HER2表达

细胞系	平均受体数量	HER2表达
			SKBR-3	678,876	高
H661	44,066	中等
			786-0	10,881	低
ZR-75-1	57,692	中等
			MCF-7	9,078	低
BT20	9,197	低
			Hs578T	4,146	低
DU4475	647	低

为了制备NK细胞，使用密度梯度离心从人外周血血沉棕黄层中分离出PBMC并洗涤。使用MACS阴性选择技术用磁珠从PBMC中分离出NK细胞。常规地确认NK细胞(CD3^-CD56⁺)纯度大于采集细胞的90％。将分离出的NK细胞静置过夜并在第二天用于细胞毒性测定中。

为了进行DELFIA细胞毒性测定，从培养物中采集上述表达HER2的人类癌细胞系。用HBS洗涤细胞，并以10⁶个细胞/mL重悬于生长培养基中以用BATDA试剂(Perkin ElmerAD0116)标记。遵循制造商的说明来标记靶标细胞。标记后，用HBS洗涤细胞三次，并以0.5x10⁵/mL重悬于原代NK细胞培养基中。

从培养物中取出静息的人NK细胞或表达KHYG-1-CD16V的细胞并沉淀，将细胞以0.1-2x10⁶个细胞/mL重悬于NK细胞培养基中，具体取决于所需的效应子与靶标的比率(E:T)。使用NK细胞的测定采用5:1E:T比率和10:1E:T比率与KHYG-1-CD16V细胞进行。在原代NK细胞培养基中制备4x A49-F3'-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗。在圆底TC 96孔板中，添加100μl标记的靶标细胞、50μl 4x TriNKET/mAb和50μl效应细胞。通过沉淀标记的靶标细胞来制备背景对照孔，并向含有100μl原代NK细胞培养基的背景孔中加入100μl上清液。通过向含有100μl原代NK细胞培养基的孔中加入100μl标记的靶标细胞来制备自发释放孔。通过向含有80μl原代NK细胞培养基和20μl 10％的TritonX-100溶液的孔中加入100μl标记的靶标细胞来制备最大释放孔。将测定板在37℃、5％CO₂下温育2-3小时。

培养2-3小时后，从温育箱中取出板，并通过在300g下离心3分钟来沉淀细胞。向制造商提供的洁净的微孔板中转移20μl培养上清液，并向每个孔中加入200μl室温铕溶液。将板避光并以250rpm在板摇床上温育15分钟。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读取荧光水平。

如下计算特异性裂解的百分比：％特异性裂解＝(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)*100％

如图33A-图33C中所示，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗比单独的曲妥珠单抗更强效地促进NK细胞介导的SKBR-3(图33A)和786-0(图33C)细胞的细胞溶解，并且对H661细胞具有相当的细胞溶解作用(图33B)。针对SKBR-3细胞(HER2高)，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在3名健康供体中在增强NK细胞介导的细胞溶解方面表现出为0.008±0.003nM的EC50，并且在触发NK细胞介导的杀伤方面表现出比曲妥珠单抗高2.5倍的效力。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗的最大裂解因实验和个体供体而异。针对H661细胞(HER2中等)，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗在触发NK细胞介导的杀伤方面表现出相似的效力(0.054±0.032nM的EC50)，在存在A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗的情况下最大裂解更大。针对786-O肾细胞癌细胞(HER2低)，只有A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗(而非曲妥珠单抗)有效于诱导靶标细胞裂解(EC500.638±0.461nM)。

使用两种激素受体(HR)+HER2-管腔A型乳癌细胞系评估A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗增强NK细胞介导的杀伤的能力。ZR75-1细胞是雌激素受体(ER)阳性、黄体酮受体(PR)+/-且HER2中等的。MCF-7细胞是ER+、PR+且HER2低的。如图34A中所示，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗在ZR75-1细胞的裂解中表现出高效力，EC50为0.043nM。与单独的NK细胞相比，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗还增强NK细胞介导的针对MCF-7细胞的杀伤，EC50为0.878nM(图34B)。

如图35A-35B中所示，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗比单独的曲妥珠单抗更强效地促进BT-20和Hs578T TNBC细胞在KHYG-1-CD16V细胞作用下的细胞介导细胞溶解。与曲妥珠单抗(1.48nM和11.85％的最大裂解)相比，A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗针对BT-20细胞系表现出1.16nM的EC50和54.99％的最大裂解(图35A)。虽然曲妥珠单抗对KHYG-1-CD16V细胞介导的针对Hs578T细胞的杀伤没有影响，但A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗增强了KHYG-1-CD16V细胞杀伤，EC50为0.376nM，最大裂解为52.76％(图35B)。A49-F3’-TriNKET-曲妥珠单抗和曲妥珠单抗均不增强KHYG-1-CD16V细胞介导的对DU4475细胞的杀伤(图35C)。评估的所有三种细胞系均具有低水平的HER2表达。

通过引用并入

本文提及的每个专利文献和科学文章的全部公开内容出于所有目的通过引用并入。

等同物

在不背离本公开的精神或基本特征的情况下，本公开可以以其他具体形式来实施。因此，前述实施方案在所有方面都应视为是示意性的而不是限制本文描述的公开内容。不同实施方案的各种结构元件和各种公开的方法步骤可以以各种组合和排列来利用，并且所有这样的变体都被认为是本公开的形式。因此，本公开的范围由附随的权利要求而不是由前面的描述来指示，并且落入权利要求的等同物的含义和范围内的所有改变均旨在涵盖于其中。

序列表

<110> 蜻蜓疗法股份有限公司

<120> 使用结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白治疗癌症的方法

<130> P232064CN1-P

<150> 63/156,214

<151> 2021-03-03

<160> 205

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

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<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 1

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<223> 人工序列描述：合成多肽

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<223> 人工序列描述：合成多肽

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<223> 人工序列描述：合成多肽

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<223> 人工序列描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<223> 人工序列描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 36

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 40

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 41

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 43

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

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<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 45

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

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Gly

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成肽

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<212> PRT

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<223> 人工序列描述：合成多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 49

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Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

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Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

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<210> 51

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 51

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 52

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

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Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

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Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

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Cys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 54

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 55

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1 5 10

<210> 56

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 56

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 57

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 60

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Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 61

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 62

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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<223> 人工序列描述：合成肽

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成肽

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Gly

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<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

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<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 66

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<223> 人工序列描述：合成肽

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Thr

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<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 69

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<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

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Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 71

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 72

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Gly

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 73

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 74

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 75

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 76

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 77

Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 79

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 80

Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

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Gly

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 81

Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp

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Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 82

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 83

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly

50

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<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 84

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser

50

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 85

Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro Thr

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<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 86

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 87

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 88

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 89

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 90

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 91

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 92

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 93

Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 94

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 95

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 96

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 97

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 98

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 99

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 100

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 101

Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 102

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Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 103

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 103

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

35 40

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 104

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

35 40

<210> 105

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 105

Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 106

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 106

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 107

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 107

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 108

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 108

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 109

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 109

Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe Thr

1 5

<210> 110

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 110

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 111

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 111

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 112

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 112

Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 113

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 113

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 114

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 114

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 115

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 115

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

1 5

<210> 116

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 116

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr

1 5

<210> 117

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 117

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 118

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 118

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 119

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5

<210> 120

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 120

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 121

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 121

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 122

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 122

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 123

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 123

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

1 5

<210> 124

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 124

Asn Pro Asn Ser Gly Gly

1 5

<210> 125

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 125

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 126

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 126

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 127

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 127

Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala

1 5

<210> 128

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 128

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 129

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 129

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 130

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 130

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 131

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 131

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

1 5

<210> 132

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 132

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr

1 5

<210> 133

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 133

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 134

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 134

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 135

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 135

Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5

<210> 136

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 136

Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr

1 5

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 137

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 138

<211> 1255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 138

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr

1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly

1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu

1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser

1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu

1085 1090 1095

Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser

1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val

1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu

1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala

1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

<210> 139

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 139

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

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210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 140

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 140

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

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225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

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275 280 285

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325 330 335

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340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

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<210> 141

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 141

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

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355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

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385 390 395 400

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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

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Ser Pro Gly

450

<210> 142

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 142

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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100 105 110

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115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

130 135 140

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

165 170 175

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

180 185 190

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195 200 205

Glu Cys

210

<210> 143

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 143

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 144

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 144

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 145

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 145

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

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115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

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180 185 190

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

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Ser Pro Gly

450

<210> 146

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 146

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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275 280 285

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Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly

385 390 395 400

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405 410 415

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

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465 470 475

<210> 147

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 147

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

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405 410 415

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Ser Pro Gly

450

<210> 148

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 148

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 149

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 149

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 150

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 150

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 151

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(80)

<223> 此序列可涵盖1-20个"Gly Gly Gly Ser"重复单元

<400> 151

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

<210> 152

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 152

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

85 90 95

Gly Gly Gly Ser

100

<210> 153

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(80)

<223> 此序列可涵盖1-20个"Gly Gly Ser Gly"重复单元

<400> 153

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly

65 70 75 80

<210> 154

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 154

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Ser Gly Gly

100

<210> 155

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 155

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser

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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

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Pro Gly

450

<210> 156

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(100)

<223> 此序列可涵盖1-20个"Gly Gly Ser Gly Gly"重复单元

<400> 156

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Ser Gly Gly

100

<210> 157

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(100)

<223> 此序列可涵盖1-20个"Gly Gly Gly Gly Ser"重复单元

<400> 157

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

85 90 95

Gly Gly Gly Ser

100

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

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Ser Tyr Ala Ile Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

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Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 160

Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly

1 5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 161

Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 162

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 162

Ser Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 163

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 163

Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 164

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 164

Gly Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 165

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 165

Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 166

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 166

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 167

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 167

Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 168

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 168

Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 169

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 169

Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 170

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 170

Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 171

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 171

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala

245

<210> 172

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 172

Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 173

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 173

Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 174

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 174

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 175

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 175

Ala Arg Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 176

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 176

Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 177

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 177

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 178

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 178

Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 179

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 179

Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 180

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 180

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 181

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 181

Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 182

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 182

Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 183

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 183

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 184

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 184

Ala Arg Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 185

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 185

Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 186

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (102)..(102)

<223> M、L、I、V、Q或F

<400> 186

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 187

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> M、L、I、V、Q或F

<400> 187

Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 188

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> M、L、I、V、Q或F

<400> 188

Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 189

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 189

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

245

<210> 190

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 190

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

290 295 300

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys

370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 191

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 191

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

195 200 205

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

290 295 300

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 192

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 192

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr

245 250 255

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

260 265 270

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

275 280 285

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

290 295 300

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

325 330 335

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

340 345 350

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro

370 375 380

Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

385 390 395 400

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

405 410 415

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

435 440 445

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

450 455 460

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 193

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 193

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

145 150 155 160

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

195 200 205

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ser Asp Lys Thr His Thr

245 250 255

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

260 265 270

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

275 280 285

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

290 295 300

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

325 330 335

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

340 345 350

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

370 375 380

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

385 390 395 400

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

405 410 415

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

435 440 445

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

450 455 460

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 194

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 194

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 195

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 195

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 196

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 196

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 197

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 197

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 198

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 198

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 199

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 199

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 200

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 200

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 201

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 201

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser

20

<210> 202

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<400> 202

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 203

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成肽

<400> 203

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 204

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(40)

<223> 此序列可涵盖1-20个"Gly Ser"重复单元

<400> 204

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20 25 30

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

35 40

<210> 205

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成多肽

<220>

<221> 位点

<222> (1)..(60)

<223> 此序列可涵盖1-20个"Gly Gly Ser"重复单元

<400> 205

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

50 55 60

Claims

1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用：

(i)治疗有效量的多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和

(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点；和

(ii)治疗有效量的皮质类固醇以减少对所述多特异性结合蛋白的一种或多种输注相关反应。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述输注相关反应包括细胞因子释放综合征、过敏反应、发冷、发烧、低血压、高血压、僵直、头痛、头晕、瘙痒、喉咙痛、喉头水肿、血管性水肿、潮红、皮疹、支气管痉挛、心动过速、心动过缓、心房纤颤、缺氧、呼吸困难、呼吸窘迫、胸闷、恶心、呕吐、颤抖、震颤、疼痛、疲倦、失眠、虚弱、超敏反应和腹泻。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述皮质类固醇为糖皮质激素。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述糖皮质激素选自甲基泼尼松龙、地塞米松、氢化可的松、泼尼松、泼尼松龙、氟替卡松、氟米松、氟轻松、布地奈德、倍氯米松、环索奈德、可的松、去炎松、倍他米松、地夫可特、二氟泼尼酯、氯替泼诺、帕拉米松、替可的松和其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述糖皮质激素为甲基泼尼松龙。

6.根据权利要求5所述的方法，其中甲基泼尼松龙的所述有效量为125mg。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述糖皮质激素为地塞米松。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述皮质类固醇肠胃外施用。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述皮质类固醇静脉内施用。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述皮质类固醇经口施用。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述皮质类固醇在所述多特异性结合蛋白的施用之前施用。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述皮质类固醇在所述多特异性结合蛋白的施用之前6小时内施用。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述皮质类固醇在所述多特异性结合蛋白的施用之前1小时内施用。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的抗组胺药。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗组胺药为苯海拉明。

16.根据权利要求15所述的方法，其中苯海拉明的所述治疗有效量为40-50mg。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述抗组胺药静脉内施用。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述抗组胺药在所述多特异性结合蛋白的施用之前60分钟内或30分钟内施用。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的退烧药。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述退烧药为对乙酰氨基酚。

21.根据权利要求20所述的方法，其中对乙酰氨基酚的所述治疗有效量为800-1000mg。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述退烧药静脉内施用。

23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述退烧药在所述多特异性结合蛋白的施用之前60分钟内或30分钟内施用。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原为HER2。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述癌症具有评分为1+或2+的HER2表达水平。

26.一种治疗具有评分为1+的HER2表达水平的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和

(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点。

27.一种治疗具有评分为2+的HER2表达水平的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的多特异性结合蛋白，其中所述多特异性结合蛋白包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述癌症为局部晚期或转移性实体瘤。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌和胆囊癌。

31.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述癌症为尿路上皮膀胱癌或转移性乳癌。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中在初始四周治疗周期中于第1天、第8天和第15天向所述受试者施用所述多特异性结合蛋白。

33.根据权利要求32所述的方法，其中在第22天不施用所述多特异性结合蛋白。

34.根据权利要求32或33所述的方法，所述方法还包括在所述初始治疗周期之后在一个或多个后续四周治疗周期中向所述受试者施用所述多特异性结合蛋白，其中在每个后续治疗周期的第1天和第15天施用所述多特异性结合蛋白。

35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中每一剂以选自5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^-3mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^- ²mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1.0mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和50mg/kg的量包含所述多特异性结合蛋白。

36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中通过静脉内输注施用所述多特异性结合蛋白。

37.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中皮下施用所述多特异性结合蛋白。

38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合蛋白作为单一疗法使用。

39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用抗-PD-1抗体。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述抗-PD-1抗体为派姆单抗。

41.根据权利要求40所述的方法，其中在所述初始治疗周期的第1天施用200mg派姆单抗。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中如果所述受试者接受一个或多个后续治疗周期，则在所述后续治疗周期中每三周施用一次200mg派姆单抗。

43.根据权利要求32-42中任一项所述的方法，其中在所述初始四周周期的第1天向所述受试者施用皮质类固醇。

44.根据权利要求32-43中任一项所述的方法，其中在所述初始四周周期的第1天向所述受试者施用抗组胺药。

45.根据权利要求32-44中任一项所述的方法，其中在所述初始四周周期的第1天向所述受试者施用退烧药。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中将所述多特异性结合蛋白配制在包含组氨酸、糖或糖醇和聚山梨醇酯的药物组合物中，pH为5.5至6.5。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述药物组合物包含大于50mg/mL的所述多特异性结合蛋白。

48.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)大于50mg/mL的多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点，

(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点，和

(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分，或者结合CD16的第三抗原结合位点；以及

(ii)组氨酸；

(iii)糖或糖醇；和

(iv)聚山梨醇酯，

pH为5.5至6.5。

49.一种治疗具有评分为1+的HER2表达水平的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用：

(i)药物组合物，所述药物组合物包含大于50mg/mL的多特异性结合蛋白、组氨酸、糖或糖醇、和聚山梨醇酯，pH为5.5至6.5，其中所述多特异性结合蛋白包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和

50.一种治疗具有评分为2+的HER2表达水平的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和

51.根据权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述癌症为局部晚期或转移性实体瘤。

53.根据权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳癌、甲状腺癌、胃癌、肾细胞癌、肺腺癌、前列腺癌、胆管癌、子宫癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、食管癌、皮肤鳞癌、唾液腺癌、胆道癌、肺鳞癌、间皮瘤、肝癌、肉瘤、膀胱癌和胆囊癌。

54.根据权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述癌症为尿路上皮膀胱癌或转移性乳癌。

55.根据权利要求48-54中任一项所述的方法，其中在初始四周治疗周期中于第1天、第8天和第15天向所述受试者施用所述药物组合物。

56.根据权利要求55所述的方法，其中在第22天不施用所述药物组合物。

57.根据权利要求55或56所述的方法，所述方法还包括在所述初始治疗周期之后在一个或多个后续四周治疗周期中向所述受试者施用所述药物组合物，其中在每个后续治疗周期的第1天和第15天施用所述药物组合物。

58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述药物组合物的每个施用剂量包括施用选自5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^- ³mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^-2mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1.0mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg、20mg/kg和50mg/kg的量的所述多特异性结合蛋白。

59.根据权利要求48-58中任一项所述的方法，其中通过静脉内输注施用所述药物组合物。

60.根据权利要求48-58中任一项所述的方法，其中皮下施用所述药物组合物。

61.根据权利要求48-60中任一项所述的方法，其中所述药物组合物作为单一疗法使用。

62.根据权利要求48-60中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用抗-PD-1抗体。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗-PD-1抗体为纳武单抗。

64.根据权利要求63所述的方法，其中每四周施用一次480mg的纳武单抗。

65.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗-PD-1抗体为派姆单抗。

66.根据权利要求65所述的方法，其中在所述初始治疗周期的第1天施用200mg派姆单抗。

67.根据权利要求65或66所述的方法，其中如果所述受试者接受一个或多个后续治疗周期，则在所述后续治疗周期中每三周施用一次200mg派姆单抗。

68.根据权利要求48-60中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用细胞骨架破坏化疗剂。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述细胞骨架破坏化疗剂为白蛋白结合型紫杉醇。

70.根据权利要求69所述的方法，其中每四周施用三次100mg/m²的白蛋白结合型紫杉醇。

71.根据权利要求70所述的方法，其中在每个四周治疗周期的第1天、第8天和第15天施用白蛋白结合型紫杉醇。

72.根据权利要求55-71中任一项所述的方法，其中在所述初始四周周期的第1天向所述受试者施用皮质类固醇。

73.根据权利要求55-72中任一项所述的方法，其中在所述初始四周周期的第1天向所述受试者施用抗组胺药。

74.根据权利要求55-73中任一项所述的方法，其中在所述初始四周周期的第1天向所述受试者施用退烧药。

75.一种药物组合物，所述药物组合物包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点，

(b)结合肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点，和

(ii)组氨酸；

(iii)糖或糖醇；和

(iv)聚山梨醇酯，

pH为5.5至6.5。

76.根据权利要求46-74中任一项所述的方法或根据权利要求75所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含大于或等于60mg/mL、大于或等于70mg/mL、大于或等于80mg/mL、大于或等于90mg/mL、大于或等于100mg/mL、大于或等于125mg/mL、大于或等于150mg/mL、大于或等于175mg/mL、或大于或等于200mg/mL的所述多特异性结合蛋白。

77.根据权利要求46-74中任一项所述的方法或根据权利要求75所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含60-250mg/mL、60-225mg/mL、60-200mg/mL、60-175mg/mL、50-150mg/mL、60-150mg/mL、60-125mg/mL、60-100mg/mL、60-90mg/mL、60-80mg/mL、60-70mg/mL、70-250mg/mL、70-225mg/mL、70-200mg/mL、70-175mg/mL、70-150mg/mL、70-150mg/mL、70-125mg/mL、70-100mg/mL、70-90mg/mL、70-80mg/mL、80-250mg/mL、80-225mg/mL、80-200mg/mL、80-175mg/mL、80-150mg/mL、80-150mg/mL、80-125mg/mL、80-100mg/mL、80-90mg/mL、90-250mg/mL、90-225mg/mL、90-200mg/mL、90-175mg/mL、90-150mg/mL、90-150mg/mL、90-125mg/mL、90-100mg/mL、100-250mg/mL、100-225mg/mL、100-200mg/mL、100-175mg/mL、100-150mg/mL、100-125mg/mL、125-250mg/mL、125-225mg/mL、125-200mg/mL、125-175mg/mL、125-150mg/mL、150-250mg/mL、150-225mg/mL、150-200mg/mL、150-175mg/mL、175-250mg/mL、175-225mg/mL、175-200mg/mL、200-250mg/mL、或200-225mg/mL的所述多特异性结合蛋白。

78.根据权利要求46-74中任一项所述的方法或根据权利要求75所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL或220mg/mL的所述多特异性结合蛋白。

79.根据权利要求46-78中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述pH为5.8至6.2。

80.根据权利要求79所述的方法或药物组合物，其中所述pH为5.95至6.05。

81.根据权利要求46-80中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述药物组合物中组氨酸的浓度为10至25mM。

82.根据权利要求81所述的方法或药物组合物，其中所述药物组合物中组氨酸的浓度为约20mM。

83.根据权利要求46-82中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述糖或糖醇为二糖。

84.根据权利要求83所述的方法或药物组合物，其中所述二糖为蔗糖。

85.根据权利要求46-84中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述糖或糖醇为衍生自单糖的糖醇。

86.根据权利要求85所述的方法或药物组合物，其中所述衍生自单糖的糖醇为山梨糖醇。

87.根据权利要求46-86中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述药物组合物中所述糖或糖醇的浓度为200至300mM。

88.根据权利要求87所述的方法或药物组合物，其中所述药物制剂中所述糖或糖醇的浓度为约250mM。

89.根据权利要求46-88中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯80。

90.根据权利要求89所述的方法或药物组合物，其中所述药物组合物中聚山梨醇酯80的浓度为0.005％(w/v)至0.05％(w/v)。

91.根据权利要求90所述的方法或药物组合物，其中所述药物组合物中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01％(w/v)。

92.根据权利要求46-91中任一项所述的方法或药物组合物，其中如果有的话，所述药物制剂中NaCl的浓度为约10mM或更低。

93.根据权利要求92所述的方法或药物组合物，其中如果有的话，所述药物制剂中NaCl的浓度为约1mM或更低。

94.根据权利要求1-93中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，并且其中

(a)所述重链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:168、96和188的氨基酸序列表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列；并且

(b)所述轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

95.根据权利要求94所述的方法或药物组合物，其中

(a)所述重链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:168、96和169的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗原结合位点的所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:94至少90％相同的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:98至少90％相同的氨基酸序列。

97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗原结合位点的所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。

98.根据权利要求1-97中任一项所述的方法或药物组合物，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点为Fab。

99.根据权利要求1-98中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，并且其中

(a)所述重链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

(b)所述轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:119、120和121的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

100.根据权利要求98所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点的所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:195至少90％相同的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:196至少90％相同的氨基酸序列。

101.根据权利要求98或100所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点的所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列。

102.根据权利要求1-101中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点为scFv。

103.根据权利要求1-102中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点的所述轻链可变结构域经由柔性接头连接至所述第二抗原结合位点的所述重链可变结构域。

104.根据权利要求103所述的方法或药物组合物，其中所述柔性接头包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。

105.根据权利要求103或104所述的方法或药物组合物，其中所述柔性接头由SEQ IDNO:143的氨基酸序列组成。

106.根据权利要求102-105中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点的所述轻链可变结构域位于所述第二抗原结合位点的所述重链可变结构域的N-末端。

107.根据权利要求1-106中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点的所述重链可变结构域与所述第二抗原结合位点的所述轻链可变结构域形成二硫桥。

108.根据权利要求107所述的方法或药物组合物，其中所述二硫桥在所述重链可变结构域的C44与所述轻链可变结构域的C100之间形成。

109.根据权利要求99-108中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述scFv包含SEQID NO:139的氨基酸序列。

110.根据权利要求1-109中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述多特异性结合蛋白的要素(c)为抗体Fc结构域。

111.根据权利要求110所述的方法或药物组合物，其中所述抗体Fc结构域包含连接至所述第一抗原结合位点的第一抗体Fc序列和连接至所述第二抗原结合位点的第二抗体Fc序列。

112.根据权利要求111所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗体Fc序列连接至所述第一抗原结合位点的重链部分。

113.根据权利要求111或112所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗原结合位点经由包含Ala-Ser的铰链连接至所述第二抗体Fc序列。

114.根据权利要求111-113中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗体Fc序列和所述第二抗体Fc序列各自包含人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。

115.根据权利要求114所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗体Fc序列和所述第二抗体Fc序列各自包含与野生型人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列。

116.根据权利要求111-115中任一项所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗体Fc序列和所述第二抗体Fc序列包含一对促进异源二聚化的突变。

117.根据权利要求116所述的方法或药物组合物，其中所述第一抗体Fc序列为包含K360E和K409W置换的人IgG1 Fc序列。

118.根据权利要求116或117所述的方法或药物组合物，其中所述第二抗体Fc序列为包含Q347R、D399V和F405T置换的人IgG1 Fc序列。

119.根据权利要求1-118中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合蛋白结合HER2并包含：

(a)包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的第一多肽；

(b)包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第二多肽；和

(c)包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的第三多肽。

120.一种在有此需要的受试者中治疗HER2-过表达胃癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和

121.根据权利要求120所述的方法，其中所述胃癌为晚期胃癌或胃食管连接部癌症。

122.根据权利要求120或121所述的方法，其中所述受试者先前接受过第一线治疗。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述第一线治疗包括铂盐和氟吡啶与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗生物类似物联用。

124.根据权利要求122或123所述的方法，其中所述受试者在所述第一线治疗后出现进展。

125.根据权利要求120-124中任一项所述的方法，其中所述癌症具有：

根据免疫组织化学评分为3+的HER2表达水平；或

根据免疫组织化学评分为2+的HER2表达水平和HER2基因扩增。

126.根据权利要求120-125中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用抗-PD-1抗体。

127.根据权利要求126所述的方法，其中所述抗-PD-1抗体为纳武单抗。

128.根据权利要求127所述的方法，其中以120至600mg的剂量向所述受试者施用纳武单抗。

129.根据权利要求128所述的方法，其中以480mg的剂量向所述受试者施用纳武单抗。

130.根据权利要求127-129中任一项所述的方法，其中每四周施用一次纳武单抗。

131.根据权利要求130所述的方法，其中所述多特异性结合蛋白在一个或多个四周治疗周期中施用，并在相同治疗周期的第1天施用纳武单抗。

132.根据权利要求127-131中任一项所述的方法，其中通过静脉内输注向所述受试者施用纳武单抗。

133.根据权利要求120-132中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用细胞骨架破坏化疗剂。

134.根据权利要求133所述的方法，其中所述细胞骨架破坏化疗剂为白蛋白结合型紫杉醇。

135.根据权利要求134所述的方法，其中以50至300mg/m²的剂量向所述受试者施用白蛋白结合型紫杉醇。

136.根据权利要求134或135所述的方法，其中以100mg/m²的剂量向所述受试者施用白蛋白结合型紫杉醇。

137.根据权利要求134-136中任一项所述的方法，其中每四周施用三次白蛋白结合型紫杉醇。

138.根据权利要求137所述的方法，其中所述多特异性结合蛋白在一个或多个四周治疗周期中施用，并在相同治疗周期的第1天、第8天和第15天施用白蛋白结合型紫杉醇。

139.根据权利要求138所述的方法，其中在所述治疗周期的第22天不施用白蛋白结合型紫杉醇。

140.根据权利要求134-139中任一项所述的方法，其中通过静脉内输注向所述受试者施用白蛋白结合型紫杉醇。

141.一种在有此需要的受试者中治疗三阴性乳癌的方法，所述方法包括向所述受试者施用多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含：

(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；

(b)结合HER2的第二抗原结合位点；和

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述受试者不符合与抗-PD-L1疗法联合治疗的条件或者所述受试者的所述癌症是PD-L1阴性的。

143.根据权利要求141或142所述的方法，其中所述受试者：

(a)在针对转移性疾病的联合化疗失败或辅助化疗6个月内复发后符合用白蛋白结合型紫杉醇治疗的条件；

(b)患有无标准疗法或标准疗法对其失败的癌症；或

(c)患有晚期、任选地不可切除、复发性或转移性三阴性乳癌。

144.根据权利要求141-143中任一项所述的方法，其中所述三阴性乳癌具有如根据免疫组织化学测量低于10的PD-L1评分(CPS)。

145.根据权利要求141-144中任一项所述的方法，其中所述三阴性乳癌是转移性的或局部晚期的。

146.根据权利要求141-145中任一项所述的方法，其中所述受试者先前未接受过化疗或靶向全身治疗。

147.根据权利要求120-146中任一项所述的方法，其中在初始治疗周期的第1天、第8天和第15天施用所述多特异性结合蛋白。

148.根据权利要求147所述的方法，其中在所述初始治疗周期的第22天不施用所述多特异性结合蛋白。

149.根据权利要求147或148所述的方法，其中在所述初始治疗周期之后，在一个或多个后续四周治疗周期的第1天和第15天施用所述多特异性结合蛋白。

150.根据权利要求120-149中任一项所述的方法，其中在每一剂中以选自5.2×10^-5mg/kg、1.6×10^-4mg/kg、5.2×10^-4mg/kg、1.6×10^-3mg/kg、5.2×10^-3mg/kg、1.6×10^-2mg/kg、5.2×10^-2mg/kg、1.6×10^-1mg/kg、0.52mg/kg、1.0mg/kg、1.6mg/kg、5.2mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg和50mg/kg的量施用所述多特异性结合蛋白。

151.根据权利要求120-150中任一项所述的方法，其中通过静脉内输注施用所述多特异性结合蛋白。

152.根据权利要求120-151中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合蛋白作为单一疗法使用。

153.根据权利要求120-152中任一项所述的方法，其中所述第一抗原结合位点包含Fab，所述Fab包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且其中

(a)所述Fab的所述VH包含分别由SEQ ID NO:168、96和188的氨基酸序列表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列；并且

(b)所述Fab的所述VL包含分别由SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

154.根据权利要求153所述的方法，其中

(a)所述Fab的所述VH包含分别由SEQ ID NO:168、96和169的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

155.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述Fab的所述VH包含与SEQ ID NO:94至少90％相同的氨基酸序列，并且所述Fab的所述VL包含与SEQ ID NO:98至少90％相同的氨基酸序列。

156.根据权利要求153-155中任一项所述的方法，其中所述Fab的所述VH包含SEQ IDNO:94的氨基酸序列，并且所述Fab的所述VL包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。

157.根据权利要求153-156中任一项所述的方法，其中所述第二抗原结合位点包含单链可变片段(scFv)，所述scFv包含VH和VL，并且其中

(a)所述scFv的所述VH包含分别由SEQ ID NO:115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列；并且

(b)所述scFv的所述VL包含分别由SEQ ID NO:119、120和121的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列。

158.根据权利要求157所述的方法，其中所述scFv的所述VH包含与SEQ ID NO:195至少90％相同的氨基酸序列，并且所述scFv的所述VL包含与SEQ ID NO:196至少90％相同的氨基酸序列。

159.根据权利要求157或158所述的方法，其中所述scFv的所述VH包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列，并且所述scFv的所述VL包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列。

160.根据权利要求157-159中任一项所述的方法，其中所述scFv的所述VL经由柔性接头连接至所述scFv的所述VH。

161.根据权利要求160所述的方法，其中所述柔性接头包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。

162.根据权利要求160或161所述的方法，其中所述柔性接头由SEQ ID NO:143的氨基酸序列组成。

163.根据权利要求157-162中任一项所述的方法，其中所述scFv的所述VL位于所述scFv的所述VH的N-末端。

164.根据权利要求157-163中任一项所述的方法，其中所述scFv的所述VH与所述scFv的所述VL形成二硫桥。

165.根据权利要求164所述的方法，其中所述二硫桥在所述VH的C44与所述VL的C100之间形成。

166.根据权利要求157-165中任一项所述的方法，其中所述scFv包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列。

167.根据权利要求153-166中任一项所述的方法，其中所述抗体Fc结构域包含连接至所述Fab的第一抗体Fc序列和连接至所述scFv的第二抗体Fc序列。

168.根据权利要求167所述的方法，其中所述第一抗体Fc序列连接至所述Fab的重链部分。

169.根据权利要求167或168所述的方法，其中所述scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接至所述第二抗体Fc序列。

170.根据权利要求167-169中任一项所述的方法，其中所述第一抗体Fc序列和所述第二抗体Fc序列各自包含人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。

171.根据权利要求170所述的方法，其中所述第一抗体Fc序列和所述第二抗体Fc序列各自包含与野生型人IgG1抗体的氨基酸234-332至少90％相同的氨基酸序列。

172.根据权利要求167-171中任一项所述的方法，其中所述第一抗体Fc序列和所述第二抗体Fc序列包含促进异源二聚化的不同突变。

173.根据权利要求172所述的方法，其中所述第一抗体Fc序列为包含K360E和K409W置换的人IgG1 Fc序列。

174.根据权利要求172或173所述的方法，其中所述第二抗体Fc序列为包含Q347R、D399V和F405T置换的人IgG1 Fc序列。

175.根据权利要求153-174中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合蛋白包含：

(a)包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的第一多肽；

(b)包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第二多肽；和

(c)包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的第三多肽。

176.根据权利要求120-175中任一项所述的方法，其中所述多特异性结合蛋白在所述施用之前已以10mg/mL至50mg/mL的浓度配制在药物组合物中。

177.根据权利要求176所述的方法，其中所述药物组合物包含10mg/mL至25mg/mL的所述多特异性结合蛋白。

178.根据权利要求176或177所述的方法，其中所述药物组合物包含约15mg/mL的所述多特异性结合蛋白。

179.根据权利要求176-178中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含5至50mM的组氨酸。

180.根据权利要求179所述的方法，其中所述药物组合物包含10至25mM的组氨酸。

181.根据权利要求179或180所述的方法，其中所述药物组合物包含约20mM的组氨酸。

182.根据权利要求176-181中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含50至300mM的糖或糖醇。

183.根据权利要求182所述的方法，其中所述药物组合物包含150至300mM的糖或糖醇。

184.根据权利要求182或183所述的方法，其中所述药物组合物包含约250mM的糖或糖醇。

185.根据权利要求182-184中任一项所述的方法，其中所述糖为蔗糖。

186.根据权利要求176-185中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含0.005％至0.05％mM(w/v)的聚山梨醇酯。

187.根据权利要求186所述的方法，其中所述药物组合物包含0.005％至0.02％mM(w/v)的聚山梨醇酯。

188.根据权利要求186或187所述的方法，其中所述药物组合物包含约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯。

189.根据权利要求186-188中任一项所述的方法，其中所述聚山梨醇酯为聚山梨醇酯-80。

190.根据权利要求176-189中任一项所述的方法，其中所述药物组合物具有在5.5至6.5的范围内的pH。

191.根据权利要求190所述的方法，其中所述药物组合物具有约6.0的pH。

192.根据权利要求176-191中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含：

(i)10mg/mL至50mg/mL的所述多特异性结合蛋白；

(ii)5mM至50mM的组氨酸；

(iii)50mM至300mM的蔗糖；和

(iv)0.005％至0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80，

pH为5.5至6.5。

193.根据权利要求176-192中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含：

(i)10mg/mL至25mg/mL的所述多特异性结合蛋白；

(ii)10mM至25mM的组氨酸；

(iii)150mM至300mM的蔗糖；和

(iv)0.005％至0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80，

pH为5.5至6.5。

194.根据权利要求176-193中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含：

(i)约15mg/mL的所述多特异性结合蛋白；

(ii)约20mM的组氨酸；

(iii)约250mM的蔗糖；和

(iv)约0.01％(w/v)的聚山梨醇酯80，

pH为约6.0。