BR112020015994A2 - Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer - Google Patents

Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer Download PDF

Info

Publication number
BR112020015994A2
BR112020015994A2 BR112020015994-8A BR112020015994A BR112020015994A2 BR 112020015994 A2 BR112020015994 A2 BR 112020015994A2 BR 112020015994 A BR112020015994 A BR 112020015994A BR 112020015994 A2 BR112020015994 A2 BR 112020015994A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
sequence
cells
Prior art date
Application number
BR112020015994-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregory P. Chang
Ann F. Cheung
Asya Grinberg
Eva Gutierrez
William Haney
Nicolai Wagtmann
Bradley M. LUNDE
Bianka Prinz
Original Assignee
Dragonfly Therapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dragonfly Therapeutics, Inc. filed Critical Dragonfly Therapeutics, Inc.
Publication of BR112020015994A2 publication Critical patent/BR112020015994A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464424—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464429—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Abstract

é descrita a terapia de combinação de um câncer com uma proteína de ligação multiespecífica que liga um antígeno associado ao tumor, o receptor nkg2d e cd16, em combinação com um segundo agente anticâncer. também são descritas composições farmacêuticas da proteína de ligação multiespecífica e métodos terapêuticos úteis para o tratamento de câncer em combinação com um segundo agente anticâncer.

Description

TERAPIA DE COMBINAÇÃO DO CÂNCER QUE ENVOLVE PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO MULTIESPECÍFICAS QUE ATIVAM CÉLULAS NATURAL KILLER REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório Série No. 62/628178 depositado em 8 de fevereiro de 2018, cuja divulgação é por este meio incorporada a adendo por referência na íntegra para todos os efeitos.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] É descrita a terapia combinada de um câncer com uma proteína de ligação multiespecífica que liga um antígeno associado ao tumor, o receptor NKG2D e CD16, em combinação com um segundo agente anticâncer. Também são descritas composições farmacêuticas da proteína de ligação multiespecífica e métodos terapêuticos úteis para o tratamento de câncer em combinação com um segundo agente anticâncer.
FUNDAMENTOS
[0003] O câncer continua sendo um problema de saúde significativo, apesar dos esforços substanciais de pesquisa e dos avanços científicos relatados na literatura para o tratamento desta doença. Alguns dos cânceres diagnosticados com mais frequência incluem câncer de próstata, câncer de mama e câncer de pulmão. O câncer de próstata é a forma mais comum de câncer nos homens. O câncer de mama continua sendo a principal causa de morte nas mulheres. As opções de tratamento atuais para esses cânceres não são eficazes para todos os pacientes e/ou podem ter efeitos colaterais adversos substanciais. Outros tipos de câncer também permanecem desafiadores para o tratamento, usando as opções terapêuticas existentes.
[0004] As imunoterapias do câncer são desejáveis porque são altamente específicas e podem facilitar a destruição de células cancerígenas usando o próprio sistema imunológico do paciente. As proteínas de fusão, como os agentes biespecíficos de células T, são imunoterapias de câncer descritas na literatura que se ligam a células tumorais e células T para facilitar a destruição de células tumorais. Anticorpos que se ligam a certos antígenos associados a tumores e a certas células imunes foram descritos na literatura. Ver, por exemplo, WO 2016/134371 e WO 2015/095412.
[0005] As células natural killer (NK) são um componente do sistema imunológico inato e constituem aproximadamente 15% dos linfócitos circulantes. As células NK se infiltram em praticamente todos os tecidos e foram originalmente caracterizadas por sua capacidade de eliminar células tumorais efetivamente sem a necessidade de sensibilização prévia. As células NK ativadas eliminam as células alvo por meios semelhantes às células T citotóxicas - ou seja, por grânulos citolíticos que contêm perforina e granzimas, bem como pelas vias dos receptores de morte. As células NK ativadas também secretam citocinas inflamatórias como IFN-gama e quimiocinas que promovem o recrutamento de outros leucócitos para o tecido alvo.
[0006] As células NK respondem aos sinais através de uma variedade de receptores ativadores e inibitórios em sua superfície. Por exemplo, quando as células NK encontram células autóctones saudáveis, sua atividade é inibida pela ativação dos receptores do tipo imunoglobulina (KIRs). Alternativamente, quando as células NK encontram células estranhas ou células cancerígenas, elas são ativadas por meio de seus receptores ativadores (por exemplo NKG2D, NCRs, DNAM1). As células NK também são ativadas pela região constante de algumas imunoglobulinas através dos receptores CD16 em sua superfície. A sensibilidade geral das células NK à ativação depende da soma dos sinais estimuladores e inibitórios.
SUMÁRIO
[0007] Em um aspecto, a invenção fornece um método para melhorar a morte das células tumorais direta ou indiretamente, o método inclui a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint; uma citocina; um agonista de TLR; um agonista do STING; um agente quimioterápico; um agente alvo do câncer que interfere com moléculas específicas nas células cancerígenas envolvidas no crescimento ou na sobrevivência das células cancerígenas, incluindo, por exemplo, inibidores de quinase, como Ibrutinibe, Vemurafenibe ou Gleevec; um vírus oncolítico; uma vacina; radiação; uma terapia NK adotiva que envolve a infusão de células NK expandidas ex vivo, uma terapia de células T adotivas que envolve a infusão de células T expandidas ex vivo, incluindo células que foram modificadas in vitro para expressar um receptor de antígeno quimérico (por exemplo, células CAR-T); uma terapia de transplante de células-tronco (SCT) e um agente que induz senescência celular.
[0008] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de câncer em um sujeito em necessidade, o método compreendendo a administração ao sujeito de uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente alvo de câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia de NK adotivas que envolve infusão de células NK expandidas ex vivo, uma terapia de células T adotivas que envolve a infusão de células T expandidas ex vivo, incluindo células que foram modificadas in vitro para expressar um receptor de antígeno quimérico (por exemplo, células CAR-T), um transplante de células-tronco (SCT) e um agente que induz senescência celular.
[0009] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um bloqueador de checkpoint selecionado entre: um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-KIR, um anticorpo anti-NKG2A, um anticorpo anti-LAG3 e um anticorpo anti-TIM3.
[0010] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com uma citocina incluindo interferons e interleucinas, como IL-2, IL-15, IL- 12, INFα, IL-21, PEG-IL-2 (interleucina-2 modificada com polietileno glicol) e heterodímeros IL15/IL15R.
[0011] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agonista de TLR selecionado entre um agonista de TLR7, um agonista de TLR8, um agonista de TLR7/8, um agonista de TLR9, um agonista de TLR4 e um agonista de TLR3.
[0012] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agonista STING ADU-S100.
[0013] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agente quimioterápico incluindo agentes alquilantes, como ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucil, melfalano, dacarbazina (DTIC), nitrosoureias, temozolomida (dacarbazina oral); antraciclinas, tais como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarubicina, mitoxantrona e valrubicina; disruptores citoesqueléticos, tais como paclitaxel, nab-paclitaxel,
docetaxel, abraxane e taxotere; epotilonas; inibidores de histona desacetilase, tais como vorinostat e romidepsina; inibidores da topoisomerase I, tais como irinotecano e topotecano; inibidores da topoisomerase II, tais como etoposido, teniposido e tafluposido; inibidores de quinase como bortezomibe, erlotinibe, gefitinibe, imatinibe, vemurafenibe e vismodegibe; análogos nucleotídicos e análogos precursores, tais como azacitidina, azatioprina, capecitabina; antibióticos peptídicos tais como bleomicina e actinomicina; agentes à base de platina, como carboplatina, cisplatina e oxaliplatina; retinoides como tretinoína e alitretinoína; e alcaloides e derivados da vinca, como vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina.
[0014] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um bloqueador de checkpoint selecionado entre: nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, lirilumab e monalizumab.
[0015] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agonista TLR selecionado entre: R848/resiquimod, VTX-2337, imiquimod e oligodesoxinucleotídeo CpG.
[0016] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antígeno associado a um tumor em uma célula cancerígena e o receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer para ativar as células natural killer, composições farmacêuticas compreendendo essas proteínas de ligação multiespecíficas e terapêutica métodos que utilizam essas proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, inclusive para o tratamento de câncer. Tais proteínas podem envolver mais de um tipo de receptor ativador de NK e podem bloquear a ligação de ligantes naturais ao NKG2D. Em certas modalidades, a proteína pode agonizar células NK em humanos e em outras espécies, como roedores e/ou macacos cynomolgus. Vários aspectos e modalidades da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.
[0017] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica pode incorporar um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D; um segundo sítio de ligação ao antígeno que liga um antígeno associado ao tumor; e um domínio Fc do anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16 ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16.
[0018] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é trivalente, o que inclui um primeiro e um segundo sítio de ligação ao antígeno que ambos se ligam ao mesmo antígeno associado ao tumor; um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; e um domínio Fc do anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para ligar CD16.
[0019] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é tetravalente, que inclui um primeiro e um segundo sítio de ligação ao antígeno que ambos se ligam ao mesmo antígeno associado ao tumor; um terceiro e quarto sítio de ligação ao antígeno que ambos se ligam a NKG2D; e um domínio Fc do anticorpo, uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16.
[0020] Os sítios de ligação ao antígeno podem incorporar, cada um, um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo e um domínio variável de cadeia leve do anticorpo (por exemplo, dispostos como em um anticorpo ou fundidos em conjunto a partir de um scFv), ou um ou mais dos sítios de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de domínio único, como um anticorpo V HH como um anticorpo camelídeo ou um anticorpo VNAR como aqueles encontrados em peixes cartilaginosos. Em alguns casos, o antígeno associado ao tumor pode ser selecionado do grupo que consiste em HER2, CD20, CD33, antígeno de maturação de células B (BCMA), EpCAM, CD2, CD19, CD25, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, CLL1/CLEC12A, FLT3, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4, HLA-E e PD-L1.
[0021] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve, cada um compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticas às sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve de um sítio de ligação ao antígeno divulgado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende a região 1 de determinação da complementaridade da cadeia pesada (CDR1), a região 2 da determinação da complementaridade da cadeia pesada (CDR2) e a região 3 da região determinante da complementaridade (CDR3) e a sequências CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve, como divulgado na Tabela 1 do sítio de ligação ao antígeno.
[0022] Por exemplo, em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
[0023] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
[0024] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 104; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
[0025] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[0026] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
[0027] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
115. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 118; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 120 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.
[0028] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 124 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
125. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 117 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129. Em algumas modalidades, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; e o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.
[0029] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[0030] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[0031] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.
[0032] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
[0033] Em algumas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno que se liga ao NKG2D compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, o domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72.
[0034] Outro aspecto da invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente. O método compreende a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento para tratar o câncer. Exemplos de câncer para tratamento utilizando as proteínas de ligação multiespecíficas incluem, por exemplo, um carcinoma que expressa HER2.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0035] FIG. 1 é uma representação de uma proteína de ligação multiespecífica que contém um domínio de ligação ao NKG2D (braço direito), um domínio de ligação ao antígeno associado ao tumor (braço esquerdo) e um domínio Fc ou uma porção do mesmo que se liga ao CD16.
[0036] FIG. 2 é uma representação de uma proteína de ligação multiespecífica que contém um domínio de ligação a NKG2D no formato scFv (braço direito), um domínio de ligação ao antígeno associado ao tumor (braço esquerdo) e um domínio Fc ou uma porção do mesmo que se liga ao CD16.
[0037] FIG. 3 é uma representação de um TriNKET na forma Triomab, que é um anticorpo trifuncional e biespecífico que mantém uma forma semelhante a IgG. Essa quimera consiste em dois meios anticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma pesada, que se originam de dois anticorpos parentais. A forma Triomab é uma construção heterodimérica contendo ½ de anticorpo de rato e ½ de anticorpo de camundongo.
[0038] FIG. 4 é uma representação de um TriNKET na forma KiH Common Light Chain (LC), que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). KiH é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2 e um FC estabilizado por mutações de heterodimerização. O TriNKET no formato KiH pode ser uma construção heterodimérica com 2 fabs que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2, contendo 2 cadeias pesadas diferentes e uma cadeia leve comum que emparelha com ambas as HC.
[0039] FIG. 5 é uma representação de um TriNKET na forma de imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-Ig™, "dual-variable domain immunoglobulin"), que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de peptídeos de ligação flexíveis de ocorrência natural e produz uma molécula tetravalente do tipo IgG. DVD-Ig ™ é uma construção homodimérica em que o antígeno 2 de direcionamento de domínio variável é fundido ao terminal N do domínio variável do antígeno 1 de direcionamento de Fab. O construto contém Fc normal.
[0040] FIG. 6 é uma representação de um TriNKET na forma Orthogonal Fab interface (Ortho-Fab), que é uma construção heterodimérica que contém 2 Fabs que se ligam ao alvo1 e ao alvo2 fundidos a Fc. O emparelhamento LC-HC é assegurado pela interface ortogonal. A heterodimerização é assegurada por mutações no FC.
[0041] FIG. 7 é uma representação de um TrinKET no formato 2 in1Ig.
[0042] FIG. 8 é uma representação de um TriNKET na forma ES, que é uma construção heterodimérica contendo 2 Fabs diferentes que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2 fundidos ao FC. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc.
[0043] FIG. 9 é uma representação de um TriNKET na forma Fab Arm Exchange: anticorpos que trocam braços Fab trocando uma cadeia pesada e cadeia leve anexada (meia molécula) com um par de cadeia pesada-leve de outra molécula, resultando em anticorpos biespecíficos. A forma Fab Arm Exchange (cFae) é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2 e um FC estabilizado por mutações de heterodimerização.
[0044] FIG. 10 é uma representação de um TriNKET na forma de SEED Body, que é um heterodímero contendo 2 Fabs que se ligam aos alvos 1 e 2 e um FC estabilizado por mutações de heterodimerização.
[0045] FIG. 11 é uma representação de um TriNKET na forma LuZ-Y, na qual o zíper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de duas HCs diferentes. A forma LuZ-Y é um heterodímero contendo 2 scFabs diferentes que se ligam aos alvos 1 e 2, fundidos ao FC. A heterodimerização é assegurada através de motivos com zíper de leucina fundidos ao terminal C do FC.
[0046] FIG. 12 é uma representação de um TriNKET na forma Cov-X-Body.
[0047] FIGS. 13A-13B são representações de TriNKETs nas formas ĸλ- Body, que são construções heterodiméricas com 2 Fabs diferentes fundidos a Fc estabilizados por mutações de heterodimerização: o antígeno alvo 1 Fab1 contém LC kappa, enquanto o segundo antígeno alvo 2 Fab contém LC lambda. FIG. 13A é uma representação exemplar de uma forma de um ĸλ-Body; FIG. 13B é uma representação exemplar de outro ĸλ-Body.
[0048] FIG. 14 é um gráfico que demonstra a afinidade de ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) com NKG2D recombinante humano em um ensaio ELISA.
[0049] FIG. 15 é um gráfico que demonstra a afinidade de ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) com NKG2D recombinante de cynomolgus em um ensaio ELISA.
[0050] FIG. 16 é um gráfico que demonstra a afinidade de ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) com NKG2D recombinante humano em um ensaio ELISA.
[0051] FIG. 17 é um gráfico que demonstra a ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) a células EL4 que expressam NKG2D humano por citometria de fluxo, mostrando o "fold over background" para a média de intensidade de fluorescência (MFI, "mean fluorescence intensity").
[0052] FIG. 18 é um gráfico que demonstra a ligação de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) a células EL4 que expressam NKG2D de camundongo por citometria de fluxo, mostrando o "fold over background" para a média de intensidade de fluorescência (MFI).
[0053] FIG. 19 é um gráfico que demonstra afinidade de ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) ao NKG2D-Fc humano recombinante, competindo com o ligante natural ULBP-6.
[0054] FIG. 20 é um gráfico que demonstra a afinidade de ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) ao NKG2D-Fc humano recombinante, competindo com o ligante natural MICA.
[0055] FIG. 21 é um gráfico que demonstra a afinidade de ligação específica dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) ao NKG2D-Fc de camundongo recombinante, competindo com o ligante natural Rae-1 delta.
[0056] FIG. 22 é um gráfico que mostra a ativação de NKG2D humano por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) quantificando a porcentagem de células positivas para TNF-alfa que expressam proteínas de fusão zeta NKG2D- CD3 humanas.
[0057] FIG. 23 é um gráfico que mostra a ativação de NKG2D de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) quantificando a porcentagem de células positivas para TNF-alfa que expressam proteínas de fusão zeta NKG2D-CD3 de camundongo.
[0058] FIG. 24 é um gráfico que mostra a ativação de células NK humanas por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0059] FIG. 25 é um gráfico que mostra a ativação de células NK humanas por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0060] FIG. 26 é um gráfico que mostra a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0061] FIG. 27 é um gráfico que mostra a ativação de células NK de camundongo por domínios de ligação a NKG2D (listados como clones).
[0062] FIG. 28 é um gráfico que mostra o efeito citotóxico de domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) nas células tumorais.
[0063] FIG. 29 é um gráfico que mostra a temperatura de fusão dos domínios de ligação a NKG2D (listados como clones) medidos por fluorimetria de varredura diferencial.
[0064] FIG. 30 é um gráfico que mostra a ativação aprimorada de células NK humanas por proteínas de ligação multiespecíficas.
[0065] FIG. 31 é um gráfico que mostra proteínas de ligação multiespecíficas induziu níveis mais altos de citotoxicidade para células alvo de tumor por células NK humanas.
[0066] FIG. 32 é um gráfico que mostra proteínas de ligação multiespecíficas induziu níveis mais altos de citotoxicidade para células alvo de tumor por células NK humanas.
[0067] FIG. 33 é um gráfico que mostra proteínas de ligação multiespecíficas induziu níveis mais altos de citotoxicidade para células alvo de tumor por células NK humanas.
[0068] FIG. 34 é um gráfico que mostra proteínas de ligação multiespecíficas induziu níveis mais altos de citotoxicidade para células alvo de tumor por células NK humanas.
[0069] FIG. 35 é um gráfico que mostra proteínas de ligação multiespecíficas induziu níveis mais altos de citotoxicidade para células alvo de tumor por células NK de camundongo.
[0070] FIG. 36 é um gráfico que mostra proteínas de ligação multiespecíficas induziu níveis mais altos de citotoxicidade para células alvo de tumor por células NK de camundongo.
[0071] FIG. 37 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados a CD33 para NKG2D expresso em células EL4. FIG. 37 mostra a ligação dos dois TriNKETs quando um domínio de ligação a CD33 é usado como o segundo braço de direcionamento.
[0072] FIG. 38 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados a HER2 a NKG2D expresso em células EL4. FIG. 38 mostra os mesmos dois domínios de ligação a NKG2D agora emparelhados com um segundo braço de direcionamento HER2.
[0073] FIG. 39 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados a BCMA para NKG2D expresso em células EL4.
[0074] FIG. 40 é um histograma de TriNKETs direcionados a CD20 que se ligam a NKG2D expresso em células EL4. As células EL4 não coradas foram utilizadas como controle negativo para o sinal de fluorescência. Não coradas: preenchida; CD20-TriNKET-F04: linha contínua; CD20-TriNKET-C26: linha tracejada.
[0075] FIG. 41 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados a CD33 para CD33 expresso em células AML humanas MV4-11.
[0076] FIG. 42 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados a HER2 a HER2 expresso em células de carcinoma de células renais 786-O humanas.
[0077] FIG. 43 é um perfil de ligação de TriNKETs direcionados a BCMA para BCMA expresso em células de mieloma humano MM.1S.
[0078] FIG. 44 é um histograma de TriNKETs direcionados a CD20 que se ligam a CD20 expresso em células de linfoma humano Raji. As células não coradas foram utilizadas como controle negativo para o sinal de fluorescência. Não coradas: preenchida; CD20-TriNKET-F04: linha contínua; CD20-TriNKET-C26: linha tracejada.
[0079] FIGs. 45A-45B são gráficos de barras da ativação sinérgica de células NK usando CD16 e NKG2D. FIG. 45A demonstra níveis de CD107a; FIG. 45B demonstra níveis de IFNγ; FIG. 45C demonstra níveis de CD107a. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. Os dados são representativos de cinco experimentos independentes, usando cinco doadores saudáveis diferentes.
[0080] FIG. 46 é um gráfico de barras que mostra a ativação de células NK usando TriNKETs visando NKG2D e CD16. Os anticorpos testados eram de isotipos de IgG1 humana. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP.
[0081] FIGs. 47A - 47C são gráficos de barras que demonstram que TriNKETs e trastuzumab foram capazes de ativar células NK humanas primárias em cocultura com células tumorais humanas positivas para HER2, indicadas por um aumento na degranulação de CD107a e na produção de citocinas IFNγ. Comparados ao anticorpo monoclonal trastuzumab, ambos os TriNKETs mostraram ativação superior de células NK humanas com uma variedade de células cancerígenas HER2 humanas. FIG. 47A mostra que as células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células SkBr-3. FIG. 47B mostra que as células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Colo201. FIG. 47C mostra que as células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células HCC1954.
[0082] FIGs. 48A - 48B são gráficos de linhas que demonstram a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas descansadas ou ativadas por IL-2 em cocultura com a linhagem celular AML humana que expressa CD33 MV4-11. FIG. 48A mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso. FIG. 48B mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas ativadas por IL-2 do mesmo doador.
[0083] FIGs. 49A - 49B são gráficos de barras que demonstram o aprimoramento da atividade citotóxica pelo TriNKET usando células NK humanas ativadas por IL-2 e em repouso. FIG. 49A mostra lise percentual específica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas em repouso. FIG. 49B mostra uma lise percentual específica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas ativadas por IL-2.
[0084] FIGs. 50A - 50B são gráficos de barras demonstrando que os TriNKETs oferecem a maior vantagem contra os cânceres médios e baixos de HER2 em comparação com o trastuzumab. FIG. 50A mostra a eliminação de células tumorais HER2 high-SkBr-3 por células NK humanas ativadas. FIG. 50B mostra a eliminação de células tumorais com baixa HER2-786-O por células NK humanas. Os TriNKETs oferecem uma vantagem maior em comparação ao trastuzumab contra células cancerígenas com baixa expressão de HER2.
[0085] FIGs. 51A - 51C são histogramas que mostram que a expressão do FcRγI de alta afinidade (CD64) em três linhagens celulares AML humanas, linhagem celular Molm-13 (FIG. 51A), linhagem celular Mv4-11 (FIG. 51B) e linhagem celular THP-1 (FIG. 51C).
[0086] FIGs. 52A - 52B são gráficos de linhas de ativação de anticorpo monoclonal ou mediada por TriNKET de células NK humanas em cocultura com células Molm-13 (FIG. 52B) ou THP-1 (FIG. 52A).
[0087] FIGs. 53A - 53C são gráficos de linha de ensaios de citotoxicidade de NK humana usando as três linhas de células AML humanas como alvos. FIG. 53A mostra que as células Mv4-11, que expressam CD64, mas em um nível inferior ao THP-1, mostraram eficácia reduzida com o anti-CD33 monoclonal. FIG. 53B demonstra que um anticorpo monoclonal contra CD33 mostra boa eficácia contra células Molm-13, que não expressam CD64. FIG. 53C demonstra que as células
THP-1 não mostraram efeito apenas com anti-CD33 monoclonal. As identidades dos gráficos de linhas anotadas na FIG. 53C também são aplicáveis aos gráficos de linhas nas FIGs. 53A-53B.
[0088] FIGs. 54A & 54B são gráficos de barras que mostram que as células B de um doador de saúde são sensíveis à lise mediada por TriNKET.
[0089] FIGs. 54C & 54D são gráficos de barras que mostram que as células mieloides são resistentes à lise mediada por TriNKET.
[0090] FIG. 55 são gráficos de linha da eliminação de células tumorais SkBr- 3 por hPBMC mediada por TriNKETs em coculturas de longo prazo.
[0091] FIG. 56 é um fluxograma do desenho do estudo da eficácia subcutânea de SC2.2 sobre RMA/S-HER2.
[0092] FIG. 57 são gráficos de linhas mostrando que SC2.2 não tem efeito no crescimento subcutâneo de tumores RMA/S-HER2.
[0093] FIGs. 58A - 58B são gráficos que mostram a ligação in vitro por mcFAE-C26.99 TriNKET. 60 µg/mL de anticorpos indicados com diluições de quatro vezes foram adicionados a 2x105 células tumorais B16F10 (FIG. 58A) ou células EL4-mNKG2D (FIG. 58B). A ligação foi avaliada usando um anticorpo secundário de PE anti-camundongo de cabra seguido por análise citométrica de fluxo.
[0094] FIG. 59 é um gráfico mostrando aumento da citotoxicidade de NK mediada por mcFAE-C26.99 TriNKET.
[0095] FIGs. 60A - 60B mostram a eficácia antitumoral de mcFAE-C26.99 TriNKET nos modelos B16F10 sc. Os camundongos foram tratados intraperitonealmente com (FIG. 60A) anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 e anticorpo monoclonal anti-Tyrp-1 de camundongo ou (FIG. 60B) anticorpo monoclonal de IgG2a de camundongo controle de isotipo C1.18.4 e mCFAE-C26.99 TriNKET, injetados na dose de 150 μg (dias 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 21). O crescimento do tumor foi avaliado por 28 dias. Os gráficos mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais.
[0096] FIGs. 61A - 61B mostram eficácia antitumoral de mcFAE-C26.99 TriNKET em modelos B16F10 iv. FIG. 61A representa a carga tumoral quando os anticorpos foram administrados em uma dose de 150 μg (dias 4, 6, 8, 11, 13, 15). FIG. 61B representa carga de tumor quando os anticorpos foram administrados em uma dose de 150 μg (dias 7, 9, 11, 13, 15). 18 dias após o desafio do tumor, os camundongos foram sacrificados e as metástases pulmonares de superfície foram pontuadas.
[0097] FIG. 62 é um gráfico de barras mostrando que células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Raji CD20+.
[0098] FIG. 63 é um gráfico de barras que mostra a ativação da NK humana em cultura com células de mieloma humano MM.1S positivas para BCMA.
[0099] FIG. 64 é um gráfico que mostra que TriNKETs melhoram a lise de células NK humanas de células de mieloma KMS12-PE.
[0100] FIG. 65 é um gráfico que mostra que o BCMA direcionado a TriNKETs com diferentes domínios de ligação a NKG2D aprimora a lise de células NK humanas de células de mieloma KMS12-PE.
[0101] FIGs. 66A - 66C são gráficos de linhas mostrando os efeitos da terapia de combinação usando mcFAE-C26.99 TriNKET e anticorpos anti-PD-1 nos modelos B16F10 sc. FIG. 66A são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com controle isotipo anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo C1.18.4 com anticorpo monoclonal 2A3 de IgG2a de rato ou com mcFAE-C26.99. FIG. 66B são gráficos de linhas mostrando o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com controles de isotipo ou clone de anticorpo monoclonal anti-PD-1 RPM1-14. FIG. 66C são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com a combinação de mcFAE-C26.99 e anticorpo monoclonal anti-PD-1. O crescimento do tumor foi avaliado por 30 dias. Os gráficos mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais.
[0102] FIGs. 67A - 67C são gráficos de linhas mostrando os efeitos da terapia de combinação usando mcFAE-C26.99 TriNKET e IL-2 humana recombinante nos modelos B16F10 sc. FIG. 67A são gráficos de linhas mostrando o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com o anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 ou com mcFAE-C26.99. FIG. 67B são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com controle de isotipo ou com IL-2. FIG. 67C são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm 3)
em camundongos tratados intraperitonealmente com uma combinação de mcFAE- C26.99 e IL-2. O crescimento do tumor foi avaliado por 40 dias com 3 camundongos do grupo de combinação que permaneceram livres de tumor. Os gráficos mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais.
[0103] FIG. 68 é um gráfico de linhas que mostra que a ligação tri-específica em uma molécula é importante para a atividade máxima das células NK.
[0104] FIG. 69 é uma construção heterodimérica Oasc-Fab que inclui a ligação do Fab ao alvo 1 e a ligação do scFab ao alvo 2 fundido ao F C. A heterodimerização é assegurada por mutações no FC.
[0105] FIG. 70 é um DuetMab, que é uma construção heterodimérica contendo 2 Fabs diferentes que se ligam aos antígenos 1 e 2 e FC estabilizados por mutações de heterodimerização. Os Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que garantem o emparelhamento correto de LC e HC.
[0106] FIG. 71 é um CrossmAb, que é uma construção heterodimérica com 2 Fabs diferentes que se ligam ao alvo 1 e 2 fundidos a Fc estabilizado por heterodimerização. Os domínios CL e CH1 e os domínios VH e VL são alternados, por exemplo, CH1 é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com VH.
[0107] FIG. 72 é um Fit-Ig, que é uma construção homodimérica em que a ligação de Fab ao antígeno 2 é fundida ao terminal N de HC de Fab que se liga ao antígeno 1. A construção contém FC do tipo selvagem.
[0108] FIGs. 73A - 73D são gráficos de linhas que mostram a lise percentual de células alvo 786-O por células NK repousadas (FIG. 73A) ou células NK ativadas por IL-2 (FIG. 73B), IL-12 (FIG. 73C) ou IL -15 (FIG. 73D) na presença de trastuzumab ou um HER2-TriNKET.
[0109] FIGs. 74A - 74D são gráficos de linhas que mostram a porcentagem de lise das células alvo Molm-13 por células NK repousadas (FIG. 74A) ou células NK ativadas por IL-2 (FIG. 74B), IL-12 (FIG. 74C) ou IL -15 (FIG. 74D) na presença de lintuzumab, um anticorpo monoclonal anti-CD33 proprietário ou um CD33- TriNKET.
[0110] FIGs. 75A - 75D são gráficos de linhas que mostram a lise percentual de células-alvo KMS12-PE por células NK em repouso (FIG. 75A) ou células NK ativadas por IL-2 (FIG. 75B), IL-12 (FIG. 75C) ou IL -15 (FIG. 75D) na presença do anticorpo monoclonal BCMA EM-901 ou um BCMA-TriNKET.
[0111] FIGs. 76A - 76D são gráficos de linhas que mostram a lise percentual de células-alvo KMS12-PE por células NK em repouso (FIG. 76A) ou células NK ativadas por pomalidomida (FIG. 76B), IL-2 (FIG. 76C) ou uma combinação de IL- 2 e pomalidomida (FIG. 76D) na presença do anticorpo monoclonal BCMA EM-901 ou um BCMA-TriNKET.
[0112] FIGs. 77A - 77B são gráficos que mostram a análise por citometria de fluxo de células T CD8+ purificadas e células alvo HCC1954.
[0113] FIGs. 78A - 78B são gráficos de linhas que mostram o crescimento de células alvo HCC1954 na presença de células T CD8 + e um HER2-TriNKET, pembrolizumab ("Keytruda") ou uma combinação dos mesmos. As células T CD8+ utilizadas na FIG. 78A e FIG. 78B foram isoladas de diferentes doadores.
[0114] FIG. 79 é um gráfico de linhas que mostra o crescimento de células alvo Skbr-3 na presença de PBMCs e um HER2-TriNKET, um agonista de TLR ou uma combinação dos mesmos.
[0115] FIGs. 80A - 80C são gráficos de linhas que mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais inoculados com células tumorais B16F10 e tratados com 7,5 mg/kg mcFAE-C26.99 TriNKET ou 7,5 mg/kg de isotipo anticorpo IgG2a anticorpo monoclonal C1.18.4 (FIG. 80A), 1 µg de IL-12 murino recombinante (rmIL-12) ou 7,5 mg/kg de anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo controle C1.18.4 (FIG. 80B) ou uma combinação de 7,5 mg/kg de mcFAE-C26.99 TriNKET e 1 µg rmIL-12 (FIG. 80C). Nas FIGs. 80B e 80C, os painéis inferiores representam plotagem em pequena escala do eixo y.
[0116] FIG. 81 é uma curva de Kaplan-Meier mostrando a porcentagem de animais que sobreviveram após a inoculação de células tumorais B16F10 e os tratamentos de 7,5 mg/kg de anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4, 7,5 mg/kg de mcFAE-C26.99 TriNKET, 1 µg de rmIL- 12 ou uma combinação de 7,5 mg/kg de mcFAE-C26.99 TriNKET e 1 µg de rmIL-
12.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0117] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antígeno associado a um tumor em uma célula cancerígena e o receptor NKG2D e receptor CD16 em células natural killer para ativar as células natural killer,
composições farmacêuticas compreendendo essas proteínas de ligação multiespecíficas e métodos terapêuticos que utilizam essas proteínas multiespecíficas e composições farmacêuticas, inclusive para o tratamento de câncer. Vários aspectos da invenção são apresentados abaixo nas seções; no entanto, aspectos da invenção descrita em um ponto particular não devem ser limitados a qualquer determinada seção.
[0118] Para facilitar a compreensão da presente invenção, uma série de termos e frases é definida abaixo.
[0119] Os termos “um”, “uma”, “o” e "a", conforme usados neste documento, significam “um ou mais” e incluem o plural, a menos que o contexto seja inadequado.
[0120] Conforme usado neste documento, o termo "sítio de ligação ao antígeno" refere-se à parte da molécula de imunoglobulina que participa da ligação ao antígeno. Em anticorpos humanos, o sítio de ligação do antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis N-terminal ("V") das cadeias pesadas ("H") e leves ("L"). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve são referidos como "regiões hipervariáveis", que são interpostas entre trechos flanqueantes mais conservados conhecidos como "regiões framework" ou "FRs". Assim, o termo "FR" se refere a sequências de aminoácidos que são encontradas naturalmente entre e adjacentes a regiões hipervariáveis em imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo humano, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas relativas entre si no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação a antígeno. A superfície de ligação a antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado, e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são referenciadas como "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". Em certos animais, como camelos e peixes cartilaginosos, o sítio de ligação ao antígeno é formado por uma única cadeia de anticorpos, fornecendo um "anticorpo de domínio único". Os sítios de ligação ao antígeno podem existir em um anticorpo intacto, em um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que retém a superfície de ligação ao antígeno ou em um polipeptídeo recombinante, como um scFv, usando um peptídeo de ligação para conectar o domínio variável da cadeia pesada a o domínio variável da cadeia leve em um único polipeptídeo.
[0121] O termo "antígeno associado ao tumor", conforme usado neste documento, significa qualquer antígeno que inclui, mas não se limita a, uma proteína, glicoproteína, gangliosídeo, carboidrato, lipídio que está associado ao câncer. Esse antígeno pode ser expresso em células malignas ou no microambiente tumoral, como vasos sanguíneos associados a tumores, matriz extracelular, estroma mesenquimal ou infiltrados imunes.
[0122] Conforme usados neste documento, os termos "sujeito" e "paciente" se referem a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos neste documento. Tais organismos incluem, preferencialmente, mas não se limitam a, mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos e semelhantes) e, preferencialmente, incluem seres humanos.
[0123] Conforme usado neste documento, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de um composto (por exemplo, um composto da presente invenção) suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não está destinada a se limitar a uma formulação ou via de administração específica. Conforme usado neste documento, o termo "tratamento" inclui todo efeito, por exemplo, diminuir, reduzir, modular, melhorar ou eliminar, que resulte na melhoria da patologia, doença, distúrbio e semelhantes ou na melhoria de um sintoma destes.
[0124] Conforme usado neste documento, o termo "composição farmacêutica" refere-se à combinação de um agente ativo com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vivo ou ex vivo.
[0125] Conforme usado neste documento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrão, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões (por exemplo, tal como emulsões óleo/água ou água/óleo), e vários tipos de agentes molhantes. As composições podem incluir também estabilizantes e conservantes. Para exemplos de carreadores, estabilizadores e adjuvantes, ver, por exemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].
[0126] Conforme usado neste documento, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, ácido ou base) de um composto da presente invenção que, quando da administração ao sujeito, é capaz de prover um composto desta invenção ou um resíduo ou metabolito ativo respectivo. Conforme é conhecido daqueles versados na técnica, os "sais" dos compostos da presente invenção podem ser derivados de ácidos e bases inorgânicas ou orgânicas. Exemplos de ácidos incluem, mas não estão limitados a ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfônico, tartárico, acético, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, ácido fórmico, benzoico, malônico, naftaleno-2-sulfônico, ácido benzenossulfônico e semelhantes. Outros ácidos, tais como oxálico, embora não sejam eles próprios farmaceuticamente aceitáveis, podem ser utilizados na preparação de sais úteis como intermediários na obtenção dos compostos da invenção e dos seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis.
[0127] Exemplos de bases incluem, mas não estão limitados a metal alcalino (por exemplo, sódio), metal alcalino-terroso (por exemplo, magnésio), amoníaco e compostos de fórmula NW4+, em que W é C1-4 alquil e semelhantes.
[0128] Exemplos de sais incluem, mas não estão limitados a: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, fluco-heptanoato, glicerofosfato, hemi- sulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloreto, hidrobrometo, iodidrato, 2- hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, tosilato, undecanoato e semelhantes. Outros exemplos de sais incluem ânions dos compostos da presente invenção combinados com um cátion adequado tal como Na +, NH4+ e NW4+ (em que W é um grupo C1-4 alquil) e semelhantes.
[0129] Para utilização terapêutica, os sais dos compostos da presente invenção são contemplados como sendo farmaceuticamente aceitáveis. No entanto, sais de ácidos e bases que não são farmaceuticamente aceitáveis podem também encontrar utilização, por exemplo, na preparação ou purificação de um composto farmaceuticamente aceitável.
[0130] Ao longo da descrição, quando as composições são descritas como possuindo, incluindo, ou compreendendo componentes específicos, ou em que os processos e os métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo passos específicos, é contemplado que, além disso, há composições da presente invenção que consistem essencialmente de, ou consistem de, os componentes recitados, e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente em, ou consistem em, os passos de processamento referidos.
[0131] Como um assunto geral, as composições que especificam uma percentagem estão em peso, salvo indicação em contrário. Além disso, se uma variável não é acompanhada por uma definição, então a definição anterior da variável controla. I. PROTEÍNAS
[0132] A invenção fornece proteínas de ligação multiespecíficas que se ligam a um antígeno associado a um tumor em uma célula cancerígena e o receptor NKG2D e o receptor CD16 em células natural killer para ativar a célula natural killer. As proteínas de ligação multiespecíficas são úteis nas composições farmacêuticas e métodos terapêuticos descritos neste documento. A ligação da proteína de ligação multiespecífica ao receptor NKG2D e CD16 na célula natural killer aumenta a atividade da célula natural killer em direção à destruição de uma célula cancerígena. A ligação da proteína de ligação multiespecífica a um antígeno associado ao tumor em uma célula cancerígena aproxima a célula cancerígena da célula natural killer, o que facilita a destruição direta e indireta da célula cancerígena pela célula natural killer. Uma descrição adicional de proteínas de ligação multiespecíficas exemplificativas é fornecida abaixo.
[0133] O primeiro componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga a células que expressam receptores NKG2D, que podem incluir, mas não estão limitadas a, células NK, células T γδ e células T CD8+ αβ. Em algumas modalidades, após a ligação a NKG2D, as proteínas de ligação multiespecíficas podem bloquear a ligação a NKG2D por ligantes naturais, como ULBP6 e MICA.
[0134] O segundo componente das proteínas de ligação multiespecíficas se liga a um ou mais antígenos associados a tumores, que podem incluir, mas não estão limitados a, HER2, CD20, CD33, , BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD-L1.
[0135] O terceiro componente para as proteínas de ligação multiespecíficas se liga às células que expressam CD16, um receptor Fc na superfície dos leucócitos, incluindo células natural killer, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos e células dendríticas foliculares.
[0136] As proteínas de ligação multiespecíficas podem assumir vários formatos, como mostrado, mas não limitado aos exemplos abaixo. Um formato é um anticorpo heterodimérico, multiespecífico, que inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina. A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um primeiro domínio variável da cadeia pesada e um primeiro domínio opcional da cadeia pesada CH1. A cadeia leve da imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve; juntamente com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, a cadeia leve de imunoglobulina forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio opcional da cadeia pesada CH1 que pode emparelhar com uma cadeia leve de imunoglobulina idêntica àquela que é emparelhada com a primeira imunoglobulina cadeia pesada, exceto que quando a cadeia leve de imunoglobulina é emparelhada com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, o sítio de ligação ao antígeno resultante se liga a um antígeno tumoral. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar a CD16 (FIG.1).
[0137] Outro exemplo de formato envolve um anticorpo heterodimérico, multiespecífico, que inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma cadeia leve de imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina. A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) fundido através de um peptídeo de ligação ou de uma dobradiça de anticorpo a uma única cadeia Fv (scFv) que se liga a NKG2D. Uma variedade de peptídeos de ligação pode ser usada para vincular o scFv ao primeiro domínio Fc ou dentro do próprio scFv. Além disso, o scFv pode incorporar mutações que permitem a formação de uma ligação dissulfeto para estabilizar a estrutura geral do scFv. O scFv também pode incorporar mutações para modificar o ponto isoelétrico da primeira cadeia pesada de imunoglobulina geral e/ou para permitir uma purificação mais fácil a jusante. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina inclui um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3) e um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio opcional da cadeia pesada CH1. A cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina emparelha-se com a cadeia leve de imunoglobulina e se liga a um antígeno tumoral. O primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar a CD16 (FIG. 2).
[0138] Um formato alternativo das proteínas multiespecíficas heterodiméricas inclui uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina, uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina, uma primeira cadeia leve de imunoglobulina e uma segunda cadeia leve de imunoglobulina. A primeira cadeia pesada de imunoglobulina inclui um primeiro domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um primeiro domínio variável da cadeia pesada e um primeiro domínio opcional da cadeia pesada CH1. A primeira cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve. Juntamente com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, a primeira cadeia leve de imunoglobulina forma um sítio de ligação ao antígeno que liga um antígeno tumoral. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um segundo domínio Fc (dobradiça-CH2-CH3), um segundo domínio variável da cadeia pesada e um segundo domínio opcional da cadeia pesada CH1. A segunda cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve e um domínio constante da cadeia leve. Juntamente com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, a cadeia leve de imunoglobulina forma um sítio de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo antígeno tumoral. A segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode se emparelhar com uma cadeia leve de imunoglobulina, que pode ser idêntica à cadeia leve de imunoglobulina que se emparelha com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina, exceto que quando a cadeia leve de imunoglobulina é emparelhada com a segunda cadeia pesada de imunoglobulina, a ligação ao antígeno resultante sítio é um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno tumoral. Em certas modalidades, o primeiro domínio Fc e o segundo domínio Fc juntos são capazes de se ligar a CD16 (FIG. 1).
[0139] Um ou mais motivos de ligação adicionais podem ser fundidos ao terminal C do domínio CH3 da região constante, opcionalmente através de uma sequência de peptídeos de ligação. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao antígeno pode ser uma região variável estabilizada por cadeia única ou dissulfeto (ScFv) ou pode formar uma molécula tetravalente ou trivalente.
[0140] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Triomab, que é um anticorpo trifuncional e biespecífico que mantém uma forma semelhante a IgG. Essa quimera consiste em dois meios anticorpos, cada um com uma cadeia leve e uma pesada, que se originam de dois anticorpos parentais.
[0141] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica é a forma KiH Common Light Chain (LC), que envolve a tecnologia knobs-into-holes (KIHs). O KIH envolve a engenharia de domínios CH3 para criar um "knob" ("botão") ou um "hole" ("buraco") em cada cadeia pesada para promover a heterodimerização. O conceito por trás da tecnologia Fc "Knobs-on-Holes (KiH)" era introduzir um "knob" em um domínio CH3 (CH3A), substituindo um pequeno resíduo por um volumoso (ou seja, T366WCH3A na numeração da UE). Para acomodar o "knob", uma superfície complementar de "hole" foi criada no outro domínio CH3 (CH3B) substituindo os resíduos vizinhos mais próximos do knob por outros menores (por exemplo, T366S/L368A/Y407VCH3B). A mutação "hole" foi otimizada pela triagem da biblioteca de fagos guiada por estrutura (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Heterodímeros estáveis da remodelação da interface de domínio de um homodímero usando uma biblioteca de exibição de fagos. J. Mol Biol (1997) 270 (1): 26–35). Estruturas de cristal de raios-X de variantes de KiH Fc (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction.J Mol Biol (2014) 426 (9): 1947– 57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for
FcgammaRs.Mol Immunol (2014) 58(1):132–8) demonstraram que a heterodimerização é termodinamicamente favorecida por interações hidrofóbicas impulsionadas pela complementaridade estérica na interface principal do domínio inter-CH3, enquanto as interfaces knob-knob e hole-hole não favorecem homodimerização devido a impedimento estérico e interrupção das interações favoráveis, respectivamente.
[0142] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-Ig™), que combina os domínios de ligação ao alvo de dois anticorpos monoclonais por meio de peptídeos de ligação flexíveis que ocorrem naturalmente e produz uma molécula tetravalente do tipo IgG.
[0143] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Orthogonal Fab interface (Ortho-Fab). Na abordagem ortho-Fab IgG (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32 (2): 191–8), o design regional baseado em estrutura introduz mutações complementares na interface LC e HCVH-CH1 em apenas um Fab, sem que sejam feitas alterações no outro Fab.
[0144] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está no formato 2 in1Ig. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma ES, que é uma construção heterodimérica contendo 2 Fabs diferentes que se ligam ao alvo 1 e ao alvo 2 fundidos ao F C. A heterodimerização é assegurada por mutações de direção eletrostática no Fc. Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de ĸλ-Body, que é uma construção heterodimérica com 2 Fabs diferentes fundidos a Fc estabilizados por mutações de heterodimerização: o antígeno 1 de direcionamento Fab1 contém LC kappa, enquanto o segundo antígeno 2 de direcionamento Fab contém LC lambda. FIG. 13A é uma representação exemplar de uma forma de um ĸλ-Body; FIG. 13B é uma representação exemplar de outro ĸλ-Body.
[0145] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma Fab Arm Exchange (anticorpos que trocam braços Fab pela troca de uma cadeia pesada e cadeia leve anexada (meia molécula) por um par de cadeia leve pesada de outra molécula, o que resulta em anticorpos biespecíficos). Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de SEED Body (a plataforma de domínio de troca de cadeias (SEED) foi projetada para gerar moléculas semelhantes a anticorpos assimétricas e biespecíficas, uma capacidade que expande aplicações terapêuticas de anticorpos naturais. Esta plataforma de engenharia de proteínas é baseada na troca de sequências estruturalmente relacionadas de imunoglobulina dentro dos domínios CH3 conservados. O design do SEED permite a geração eficiente de heterodímeros AG/GA, enquanto desfavorece a homodimerização dos domínios CH3 SEED AG e GA.(Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)). Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma LuZ-Y, na qual o zíper de leucina é usado para induzir a heterodimerização de duas HCs diferentes. (Wranik, BJ. Et al., J. Biol. Chem. (2012), 287: 43331-9).
[0146] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Cov-X-Body (em CovX-Bodies biespecíficos, dois peptídeos diferentes são unidos usando um peptídeo de ligação de azetidinona ramificada e fundidos ao anticorpo de estrutura em andaime sob condições suaves de uma maneira específica do sítio. Enquanto os farmacóforos são responsáveis por atividades funcionais, a estrutura em andaime de anticorpo confere meia-vida longa e distribuição semelhante a Ig. Os farmacóforos podem ser quimicamente otimizados ou substituídos por outros farmacóforos para gerar anticorpos biespecíficos otimizados ou únicos. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52); 22611- 22616).
[0147] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está em uma forma heterodimérica Oasc-Fab que inclui a ligação do Fab ao alvo 1 e a ligação do scFab ao alvo 2 fundido ao Fc. A heterodimerização é assegurada por mutações no FC.
[0148] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma DuetMab, que é uma construção heterodimérica contendo 2 Fabs diferentes que se ligam ao antígeno 1 e 2 e FC estabilizados por mutações de heterodimerização. Os Fab 1 e 2 contêm pontes S-S diferenciais que garantem o emparelhamento correto de LC e HC.
[0149] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de CrossmAb, que é uma construção heterodimérica com 2 Fabs diferentes que se ligam ao Alvo 1 e 2 fundidos a Fc estabilizado por heterodimerização. Os domínios CL e CH1 e os domínios VH e VL são alternados, por exemplo, CH1 é fundido em linha com VL, enquanto CL é fundido em linha com VH.
[0150] Em algumas modalidades, a proteína de ligação multiespecífica está na forma de Fit-Ig, que é uma construção homodimérica em que a ligação do Fab ao antígeno 2 é fundida ao terminal N do HC do Fab que se liga ao antígeno 1. O construto contém Fc do tipo selvagem.
[0151] A Tabela 1 lista sequências peptídicas de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve que, em combinação, podem se ligar a NKG2D. Salvo indicação em contrário, as sequências de CDR fornecidas na Tabela 1 são determinadas sob Kabat. Tabela 1 Clones Sequência de aminoácidos da Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada região variável da cadeia leve ADI-27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT
AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYNSYPITFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:1) (SEQ ID NO:2) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC EIVLTQSPGTLSLSPGERATL 27724 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK SCRASQSVSSSYLAWYQQK
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR PGQAPRLLIYGASSRATGIP VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD DRFSGSGSGTDFTLTISRLE TAVYYCARARGPWSFDPWGQG PEDFAVYYCQQYGSSPITFG
TLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 27740 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSIGSWLAWYQQKP (A40) GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS
VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYHSFYTFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 27741 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSIGSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQSNSYYTFGG TLVTVSS GTKVEIK
(SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 27743 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYNSYPTFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO:10) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC ELQMTQSPSSLSASVGDRV 28153 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK TITCRTSQSISSYLNWYQQK
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR PGQPPKLLIYWASTRESGVP VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD DRFSGSGSGTDFTLTISSLQ TAVYYCARARGPWGFDPWGQG PEDSATYYCQQSYDIPYTFG
TLVTVSS QGTKLEIK (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO: 12) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 28226 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP (C26) GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS
VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYGSFPITFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:13) (SEQ ID NO:14) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 28154 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTDFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQSKEVPWTFG
TLVTVSS QGTKVEIK (SEQ ID NO:15) (SEQ ID NO:16) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29399 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYNSFPTFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:18) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29401 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSIGSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYDIYPTFGGG
TLVTVSS TKVEIK (SEQ ID NO:19) (SEQ ID NO:20) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29403 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYDSYPTFGG TLVTVSS GTKVEIK
(SEQ ID NO:21) (SEQ ID NO:22) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29405 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYGSFPTFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:23) (SEQ ID NO:24) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29407 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYQSFPTFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:25) (SEQ ID NO:26) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29419 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYSSFSTFGG
TLVTVSS GTTVEVEK (SEQ ID NO:27) (SEQ ID NO:28) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29421 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYESYSTFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:29) (SEQ ID NO:30) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29424 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYDSFITFGGG
TLVTVSS TKVEIK (SEQ ID NO:31) (SEQ ID NO:32) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29425 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYQSYPTFGG
TLVTVSS GTKVEIK (SEQ ID NO:33) (SEQ ID NO:34) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29426 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSIGSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYHSFPTFGG TLVTVSS GTKVEIK
(SEQ ID NO:35) (SEQ ID NO:36) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29429 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSIGSWLAWYQQKP
GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYELYSYTFG
TLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:37) (SEQ ID NO:38) ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29447 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP (F47) GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS
VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCQQYDTFITFGGG
TLVTVSS TKVEIK (SEQ ID NO:39) (SEQ ID NO:40) ADI- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC DIVMTQSPDSLAVSLGERATI 27727 KASGGTFSSYAISWVRQAPGQG NCKSSQSVLYSSNNKNYLA
LEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGR WYQQKPGQPPKLLIYWAST VTITADESTSTAYMELSSLRSED RESGVPDRFSGSGSGTDFT TAVYYCARGDSSIRHAYYYYGM LTISSLQAEDVAVYYCQQYY
DVWGQGTTVTVSS STPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:41) (SEQ ID NO:42) ADI- QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCT EIVLTQSPATLSLSPGERATL 29443 VSGGSISSSSYYWGWIRQPPGK SCRASQSVSRYLAWYQQKP (F43) GLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSR GQAPRLLIYDASNRATGIPA
VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTDFTLTISSLEP TAVYYCARGSDRFHPYFDYWG EDFAVYYCQQFDTWPPTFG
QGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:43) (SEQ ID NO:44) ADI- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT 27744 AASGFTFSSYAMSWVRQAPGK ITCRASQGIDSWLAWYQQK (A44) GLEWVSAISGSGGSTYYADSVK PGKAPKLLIYAASSLQSGVP
GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA SRFSGSGSGTDFTLTISSLQ EDTAVYYCAKDGGYYDSGAGD PEDFATYYCQQGVSYPRTF
YWGQGTLVTVSS GGGTKVEIK (SEQ ID NO:45) (SEQ ID NO:46) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO: CDR1 (SEQ ID NO:54) - 51) - FTFSSYAMS ou CDR1 RASQGIDSWLA (SEQ ID NO: 90) - SYAMS CDR2 (SEQ ID NO:55) - CDR2 (SEQ ID NO: 52) - AASSLQS AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:56) - CDR3 não Kabat (SEQ ID NO: QQGVSYPRT 53) - AKDGGYYDSGAGDY ou CDR3 (SEQ ID NO: 91) -
DGGYYDSGAGDY ADI- EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT 27749 AASGFTFSSYSMNWVRQAPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKP (A49) GLEWVSSISSSSSYIYYADSVKG GKAPKLLIYAASSLQSGVPS
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE RFSGSGSGTDFTLTISSLQP DTAVYYCARGAPMGAAAGWFD EDFATYYCQQGVSFPRTFG
PWGQGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:47) (SEQ ID NO:48) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO: CDR1 (SEQ ID NO:60) - 57) - FTFSSYSMN ou CDR1 RASQGISSWLA (SEQ ID NO: 92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:61) - CDR2 (SEQ ID NO:58) - AASSLQS SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:62) - CDR3 não Kabat (SEQ ID NO: QQGVSFPRT 59) - ARGAPMGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO: 93) -
GAPMGAAAGWFDP ADI- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC EIVLTQSPGTLSLSPGERATL 29463 KASGYTFTGYYMHWVRQAPGQ SCRASQSVSSNLAWYQQKP (F63) GLEWMGWINPNSGGTNYAQKF GQAPRLLIYGASTRATGIPAR
QGRVTMTRDTSISTAYMELSRL FSGSGSGTEFTLTISSLQSE RSDDTAVYYCARDTGEYYDDDD DFAVYYCQQDDYWPPTFGG
HGMDVWGQGTTVTV GTKVEIK (SEQ ID NO:49) (SEQ ID NO:50) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO:63) CDR1 (SEQ ID NO:66) - - YTFTGYYMH ou CDR1 (SEQ ID RASQSVSSNLA NO: 94) - GYYMH CDR2 (SEQ ID NO:67) - CDR2 (SEQ ID NO:64) - GASTRAT WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:68) - CDR3 não Kabat (SEQ ID NO:65) QQDDYWPPT - ARDTGEYYDTDDHGMDV ou CDR3 (SEQ ID NO:95) -
DTGEYYDTDDHGMDV ADI- QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTC DIQMTQSPSTLSASVGDRVT 29404 AVYGGSFSGYYWSWIRQPPGK ITCRASQSISSWLAWYQQKP (F04) GLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSR GKAPKLLIYKASSLESGVPS
VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAD RFSGSGSGTEFTLTISSLQP
TAVYYCARARGPWSFDPWGQG DDFATYYCEQYDSYPTFGG TLVTVSS (SEQ ID NO:78) GTTVEVEK (SEQ ID NO:79) ADI- QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSC DIVMTQSPDSLAVSLGERATI 28200 KASGGTFSSYAISWVRQAPGQG NCESSQSLLNSGNQKNYLT
LEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGR WYQQKPGQPPKPLIYWAST VTITADESTSTAYMELSSLRSED RESGVPDRFSGSGSGTDFT TAVYYCARRGRKASGSFYYYYG LTISSLQAEDVAVYYCQNDY
MDVWGQGTTVTVSS SYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:80) (SEQ ID NO:81) A49MQ EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT
AASGFTFSSYSMNWVRQAPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKP GLEWVSSISSSSSYIYYADSVKG GKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE RFSGSGSGTDFTLTISSLQP DTAVYYCARGAPQGAAAGWFD EDFATYYCQQGVSFPRTFG
PWGQGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:96) (SEQ ID NO:48) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO:57) CDR1 (SEQ ID NO:60) - - FTFSSYSMN ou CDR1 (SEQ ID RASQGISSWLA NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:61) - CDR2 (SEQ ID NO:58) - AASSLQS SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:62) - CDR3 não Kabat (SEQ ID NO:97) QQGVSFPRT - ARGAPQGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO:98) -
GAPQGAAAGWFDP A49ML EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT
AASGFTFSSYSMNWVRQAPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKP GLEWVSSISSSSSYIYYADSVKG GKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE RFSGSGSGTDFTLTISSLQP DTAVYYCARGAPLGAAAGWFD EDFATYYCQQGVSFPRTFG
PWGQGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:99) (SEQ ID NO:48) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO:57) CDR1 (SEQ ID NO:60) - - FTFSSYSMN ou CDR1 (SEQ ID RASQGISSWLA NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:61) - CDR2 (SEQ ID NO:58) - AASSLQS SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:62) - CDR3 não Kabat (SEQ ID QQGVSFPRT NO:100) - ARGAPLGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO:101) -
GAPLGAAAGWFDP A49MI EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT
AASGFTFSSYSMNWVRQAPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKP GLEWVSSISSSSSYIYYADSVKG GKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE RFSGSGSGTDFTLTISSLQP DTAVYYCARGAPIGAAAGWFDP EDFATYYCQQGVSFPRTFG
WGQGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:102) (SEQ ID NO:48) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO:57) CDR1 (SEQ ID NO:60) - - FTFSSYSMN ou CDR1 (SEQ ID RASQGISSWLA NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:61) - CDR2 (SEQ ID NO:58) - AASSLQS SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:62) - CDR3 não Kabat (SEQ ID QQGVSFPRT NO:103) - ARGAPIGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO:104) -
GAPIGAAAGWFDP A49MF EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT
AASGFTFSSYSMNWVRQAPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKP GLEWVSSISSSSSYIYYADSVKG GKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE RFSGSGSGTDFTLTISSLQP DTAVYYCARGAPFGAAAGWFD EDFATYYCQQGVSFPRTFG
PWGQGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:105) (SEQ ID NO:48) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO:57) CDR1 (SEQ ID NO:60) - - FTFSSYSMN ou CDR1 (SEQ ID RASQGISSWLA NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:61) - CDR2 (SEQ ID NO:58) - AASSLQS SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:62) - CDR3 não Kabat (SEQ ID QQGVSFPRT NO:106) - ARGAPFGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO:107) -
GAPFGAAAGWFDP A49MV EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT
AASGFTFSSYSMNWVRQAPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKP GLEWVSSISSSSSYIYYADSVKG GKAPKLLIYAASSLQSGVPS RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE RFSGSGSGTDFTLTISSLQP DTAVYYCARGAPVGAAAGWFD EDFATYYCQQGVSFPRTFG
PWGQGTLVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:108) (SEQ ID NO:48) CDR1 não Kabat (SEQ ID NO:57) CDR1 (SEQ ID NO:60) - - FTFSSYSMN ou CDR1 (SEQ ID RASQGISSWLA NO:92) - SYSMN CDR2 (SEQ ID NO:61) - CDR2 (SEQ ID NO:58) - AASSLQS SISSSSSYIYYADSVKG CDR3 (SEQ ID NO:62) - CDR3 não Kabat (SEQ ID QQGVSFPRT NO:109) - ARGAPVGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO:110) -
GAPVGAAAGWFDP A49- EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSC DIQMTQSPSSVSASVGDRVT consens AASGFTFSSYSMNWVRQAPGK ITCRASQGISSWLAWYQQKP o GLEWVSSISSSSSYIYYADSVKG GKAPKLLIYAASSLQSGVPS
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE RFSGSGSGTDFTLTISSLQP
DTAVYYCARGAPXGAAAGWFD EDFATYYCQQGVSFPRTFG PWGQGTLVTVSS, em que X é GGTKVEIK M, L, I, V, Q ou F (SEQ ID NO:48) (SEQ ID NO:111) CDR1 (SEQ ID NO:60) - CDR1 não Kabat (SEQ ID NO:57) RASQGISSWLA - FTFSSYSMN ou CDR1 (SEQ ID CDR2 (SEQ ID NO:61) - NO:92) - SYSMN AASSLQS CDR2 (SEQ ID NO:58) - CDR3 (SEQ ID NO:62) -
SISSSSSYIYYADSVKG QQGVSFPRT CDR3 não Kabat (SEQ ID NO:112) - ARGAPXGAAAGWFDP ou CDR3 (SEQ ID NO:113) –
GAPXGAAAGWFDP, em que X é M, L, I, V, Q ou F ADI- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC EIVLTQSPATLSLSPGERATL 29378 KASGYTFTSYYMHWVRQAPGQ SCRASQSVSSYLAWYQQKP (E78) GLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQ GQAPRLLIYDASNRATGIPA
GRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR RFSGSGSGTDFTLTISSLEP SEDTAVYYCAREGAGFAYGMDY EDFAVYYCQQSDNWPFTFG
YYMDVWGKGTTVTVSS GGTKVEIK (SEQ ID NO:114) (SEQ ID NO:115) CDR1 não Kabat (SEQ ID CDR1 (SEQ ID NO:119) - NO:116) - YTFTSYYMH ou CDR1 RASQSVSSYLA (SEQ ID NO:122) - SYYMH CDR2 (SEQ ID NO:120) - CDR2 (SEQ ID NO:117) - DASNRAT IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:121) - CDR3 não Kabat (SEQ ID QQSDNWPFT NO:118) - AREGAGFAYGMDYYYMDV ou CDR3 (SEQ ID NO:123) -
EGAGFAYGMDYYYMDV ADI-29379 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC EIVMTQSPATLSVSPGERAT (E79) KASGYTFTSYYMHWVRQAPGQ LSCRASQSVSSNLAWYQQK
GLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQ PGQAPRLLIYGASTRATGIPA GRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR RFSGSGSGTEFTLTISSLQS SEDTAVYYCARGAPNYGDTTHD EDFAVYYCQQYDDWPFTFG
YYYMDVWGKGTTVTV GGTKVEIK (SEQ ID NO:124) (SEQ ID NO:125) CDR1 não Kabat (SEQ ID CDR1 (SEQ ID NO:127) - NO:116) - YTFTSYYMH ou CDR1 RASQSVSSNLA (SEQ ID NO:122) - SYYMH CDR2 (SEQ ID NO:128) - CDR2 (SEQ ID NO:117) - GASTRAT IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:129) - CDR3 não Kabat (SEQ ID QQYDDWPFT NO:126) - ARGAPNYGDTTHDYYYMDV ou CDR3 (SEQ ID NO:130) -
GAPNYGDTTHDYYYMDV
[0152] Alternativamente, um domínio variável da cadeia pesada definido pela SEQ ID NO:69 pode ser emparelhado com um domínio variável da cadeia leve definido pela SEQ ID NO:70 para formar um sítio de ligação ao antígeno que pode se ligar a NKG2D, como ilustrado na US 9.273.136. SEQ ID NO:69
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGL GDGTYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:70
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLL PSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTV L
[0153] Alternativamente, um domínio variável da cadeia pesada definido pela SEQ ID NO:71 pode ser emparelhado com um domínio variável da cadeia leve definido pela SEQ ID NO:72 para formar um sítio de ligação ao antígeno que pode se ligar a NKG2D, como ilustrado na US 7.879.985. SEQ ID NO:71
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGH ISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIW
GQGTMVTVSS SEQ ID NO:72
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR ATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
[0154] Dentro do domínio Fc, a ligação a CD16 é mediada pela região de dobradiça e pelo domínio CH2. Por exemplo, na IgG1 humana, a interação com CD16 é focada principalmente nos resíduos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 e resíduo de carboidrato N- acetil-D-glucosamina no domínio CH2 (ver Sondermann et al, Nature, 406(6793):267-273). Com base nos domínios conhecidos, as mutações podem ser selecionadas para aprimorar ou reduzir a afinidade de ligação ao CD16, como o uso de bibliotecas exibidas em fagos ou bibliotecas de cDNA exibidas na superfície de leveduras ou podem ser projetadas com base na estrutura tridimensional conhecida do interação.
[0155] A montagem de cadeias pesadas de anticorpos heterodiméricos pode ser realizada expressando duas sequências diferentes de cadeias pesadas de anticorpos na mesma célula, o que pode levar à montagem de homodímeros de cada cadeia pesada de anticorpos, bem como à montagem de heterodímeros. A promoção da montagem preferencial de heterodímeros pode ser realizada incorporando diferentes mutações no domínio CH3 de cada região constante da cadeia pesada de anticorpos, como mostrado nas US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207,
US13/866756, US14/647480, US14/830336. Por exemplo, mutações podem ser feitas no domínio CH3 com base na IgG1 humana e incorporando pares distintos de substituições de aminoácidos dentro de um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo que permite que essas duas cadeias se heterodimerizem seletivamente uma com a outra. As posições das substituições de aminoácidos ilustradas abaixo são numeradas de acordo com o índice da UE como em Kabat.
[0156] Em um cenário, uma substituição de aminoácidos no primeiro polipeptídeo substitui o aminoácido original por um aminoácido maior, selecionado entre arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) ou triptofano (W) e pelo menos um amino a substituição de ácido no segundo polipeptídeo substitui o (s) aminoácido (s) original (s) por um (s) aminoácido (s) menor (s), escolhido (s) de alanina (A), serina (S), treonina (T) ou valina (V), de modo que a maior substituição de aminoácidos (uma protuberância) se encaixa na superfície das substituições menores de aminoácidos (uma cavidade). Por exemplo, um polipeptídeo pode incorporar uma substituição T366W e o outro pode incorporar três substituições, incluindo T366S, L368A e Y407V.
[0157] Um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo da invenção pode opcionalmente ser acoplado a uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo, tal como uma região constante de IgG incluindo domínios de dobradiça, CH2 e CH3 com ou sem domínio CH1. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo humano, como uma região constante de IgG1 humana, uma região constante de IgG2, uma região constante de IgG3 ou uma região constante de IgG4. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos da região constante é pelo menos 90% idêntica a uma região constante de anticorpo de outro mamífero, como coelho, cachorro, gato, camundongo ou cavalo. Uma ou mais mutações podem ser incorporadas na região constante em comparação com a região constante de IgG1 humana, por exemplo em Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 e/ou K439. Substituições exemplares incluem, por exemplo, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E,
S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D e K439E.
[0158] Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas no CH1 de uma região constante de IgG1 humana podem estar no aminoácido V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 e/ou V173. Em certas modalidades, mutações que podem ser incorporadas no Cκ de uma região constante de IgG1 humana podem estar no aminoácido E123, F116, S176, V163, S174 e/ou T164.
[0159] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 2. Tabela 2 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 S364E/F405A Y349K/T394F Conjunto 2 S364H/D401K Y349T/T411E Conjunto 3 S364H/T394F Y349T/F405A Conjunto 4 S364E/T394F Y349K/F405A Conjunto 5 S364E/T411E Y349K/D401K Conjunto 6 S364D/T394F Y349K/F405A Conjunto 7 S364H/F405A Y349T/T394F Conjunto 8 S364K/E357Q L368D/K370S Conjunto 9 L368D/K370S S364K Conjunto 10 L368E/K370S S364K Conjunto 11 K360E/Q362E D401K Conjunto 12 L368D/K370S S364K/E357L Conjunto 13 K370S S364K/E357Q Conjunto 14 F405L K409R Conjunto 15 K409R F405L
[0160] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na
Tabela 3. Tabela 3 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 K409W D399V/F405T Conjunto 2 Y349S E357W Conjunto 3 K360E Q347R Conjunto 4 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Conjunto 5 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T Conjunto 6 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
[0161] Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem ser selecionadas a partir dos seguintes conjuntos de substituições mostrados na Tabela 4. Tabela 4 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo Conjunto 1 T366K/L351K L351D/L368E Conjunto 2 T366K/L351K L351D/Y349E Conjunto 3 T366K/L351K L351D/Y349D Conjunto 4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E Conjunto 5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E Conjunto 6 E356K/D399K K392D/K409D
[0162] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos em cada cadeia polipeptídica pode ser selecionada a partir da Tabela 5. Tabela 5 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo L351Y, D399R, D399K, S400K, T366V, T366I, T366L, T366M, S400R, Y407A, Y407I, Y407V N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F K392D, K392E, K409F, K409W, T411D e T411E
[0163] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de substituições na Tabela 6, em que as posições indicadas na coluna Primeiro Polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido e as posições indicadas na coluna Segunda Polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido carregado positivamente conhecido. Tabela 6 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo K392, K370, K409 ou K439 D399, E356 ou E357
[0164] Alternativamente, pelo menos uma substituição de aminoácidos pode ser selecionada a partir do seguinte conjunto de substituições na Tabela 7, em que as posições indicadas na coluna Primeiro Polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido carregado positivamente conhecido e as posições indicadas na coluna Segunda Polipeptídeo são substituídas por qualquer aminoácido carregado negativamente conhecido. Tabela 7 Primeiro Polipeptídeo Segundo Polipeptídeo D399, E356 ou E357 K409, K439, K370 ou K392
[0165] Alternativamente, ou além disso, a estabilidade estrutural de uma proteína heteromultimérica pode ser aumentada através da introdução de S354C na primeira ou segunda cadeia polipeptídica e Y349C na cadeia polipeptídica oposta, que forma uma ponte dissulfeto artificial na interface dos dois polipeptídeos.
[0166] As proteínas multiespecíficas descritas acima podem ser produzidas usando a tecnologia de DNA recombinante bem conhecida por um versado na técnica. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica a primeira cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um primeiro vetor de expressão; uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica a segunda cadeia pesada de imunoglobulina pode ser clonada em um segundo vetor de expressão; uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia leve de imunoglobulina pode ser clonada em um terceiro vetor de expressão; os primeiro, segundo e terceiro vetores de expressão podem ser estavelmente transfectados juntos em células hospedeiras para produzir as proteínas multiméricas.
[0167] Para alcançar o maior rendimento da proteína multiespecífica, diferentes proporções do primeiro, segundo e terceiro vetor de expressão podem ser exploradas para determinar a proporção ideal para a transfecção nas células hospedeiras. Após a transfecção, os clones únicos podem ser isolados para geração de banco de células usando métodos conhecidos na técnica, como diluição limitada, ELISA, FACS, microscopia ou Clonepix.
[0168] Os clones podem ser cultivados em condições adequadas para a ampliação do biorreator e a expressão mantida da proteína multiespecífica. As proteínas multiespecíficas podem ser isoladas e purificadas usando métodos conhecidos na técnica, incluindo centrifugação, filtração em profundidade, lise celular, homogeneização, congelamento-descongelamento, purificação por afinidade, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca de interação hidrofóbica e modo misto cromatografia. II. Características dos TriNKETs
[0169] Em certas modalidades, os TriNKETs descritos neste documento, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a um antígeno associado a um tumor, se ligam a células que expressam NKG2D humano. Em certas modalidades, os TriNKETs, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a um antígeno associado ao tumor, se ligam ao antígeno associado ao tumor em um nível comparável ao de um anticorpo monoclonal que possui o mesmo domínio de ligação ao antígeno associado ao tumor. Por exemplo, TriNKETs que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a HER2 do Trastuzumab podem se ligar ao HER2 expresso nas células em um nível comparável ao do Trastuzumab.
[0170] No entanto, os TriNKETs descritos neste documento são mais eficazes na redução do crescimento de tumores e na eliminação de células cancerígenas. Por exemplo, um TriNKET da presente divulgação que visa células tumorais/cancerígenas que expressam HER2 é mais eficaz que SC2.2 - uma molécula biespecífica de cadeia única construída a partir de um scFv derivado de trastuzumab ligado ao ULBP-6, um ligante para NKG2D. SC2.2 se liga a células cancerígenas HER2 + e células NK NKG2D+ simultaneamente. Portanto, a eficácia de SC2.2 na redução do número de células cancerígenas HER2 + foi investigada. Ensaios de ativação e citotoxicidade in vitro demonstraram que SC2.2 foi eficaz na ativação e eliminação das células NK. No entanto, SC2.2 falhou em demonstrar eficácia no modelo de tumor subcutâneo RMA/S-HER2. A eficácia de SC2.2 também foi testada in vivo usando um modelo de camundongo singeneico com superexpressão de RMA/S-HER2. Neste modelo de camundongo, SC2.2 falhou em demonstrar o controle do crescimento do tumor em comparação com o controle do veículo. Assim, embora SC2.2 tenha sido capaz de ativar e eliminar células NK e se ligasse às células cancerígenas HER2+, essas propriedades eram insuficientes para controlar efetivamente o crescimento do tumor HER2+.
[0171] Em certas modalidades, os TriNKETs descritos neste documento, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação ao antígeno associado ao tumor, ativam células NK humanas primárias ao serem cultivados com células tumorais que expressam o antígeno. A ativação das células NK é marcada pelo aumento na degranulação de CD107a e na produção de citocinas IFNγ. Além disso, em comparação com um anticorpo monoclonal que inclui o domínio de ligação ao antígeno associado ao tumor, os TriNKETs mostram uma ativação superior das células NK humanas na presença de células tumorais que expressam o antígeno. Por exemplo, em comparação com o anticorpo monoclonal trastuzumab, os TriNKETs da presente divulgação com um domínio de ligação a HER2 têm uma ativação superior das células NK humanas na presença de células cancerígenas que expressam HER2.
[0172] Em certas modalidades, TriNKETs descritos neste documento, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a um antígeno associado a um tumor, aumentam a atividade de células NK humanas descansadas e ativadas por IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antígeno. As células NK em repouso mostraram menos produção de IFNγ de fundo e degranulação de CD107a do que as células NK ativadas por IL-2. Em certas modalidades, as células NK ativadas por IL-2 mostram uma porcentagem maior de células que se tornam IFNγ+; CD107a+ após estimulação com TriNKETs.
[0173] Em certas modalidades, os TriNKETs descritos neste documento, que incluem um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação a um antígeno associado a um tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados a tumores, incluindo CD20, BCMA e HER2), aumentam a atividade citotóxica de repouso e células NK humanas ativadas com IL-2 na presença de células tumorais que expressam o antígeno. Além disso, TriNKETs (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47- TriNKET e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno associado a um tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados a tumores, incluindo CD20, BCMA e HER2), direcionam mais potentemente as respostas das células NK ativadas e descansadas contra as células tumorais, em comparação com um anticorpo monoclonal que inclui o mesmo sítio de ligação ao antígeno associado ao tumor. Em certas modalidades, os TriNKETs oferecem vantagem contra células tumorais que expressam antígenos tumorais médios e baixos em comparação com anticorpos monoclonais que incluem o mesmo sítio de ligação ao antígeno tumoral. Portanto, uma terapia incluindo TriNKETs pode ser superior a uma terapia de anticorpos monoclonais. Em todas essas configurações, os TriNKETs induziram maior ativação das células NK e maior morte de células tumorais, quando as células NK foram incubadas com IL-2 em comparação com as células NK sem IL-2, demonstrando sinergia entre TriNKETs e IL-2.
[0174] Em certas modalidades, comparados aos anticorpos monoclonais, os TriNKETs descritos neste documento (por exemplo, A40-TriNKET, A44- TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2) são vantajosos no tratamento de cânceres com alta expressão do receptor Fc (FcR) ou cânceres residentes em um microambiente do tumor com altos níveis de FcR. Os anticorpos monoclonais exercem seus efeitos no crescimento tumoral através de múltiplos mecanismos, incluindo ADCC, CDC, fagocitose e bloqueio de sinal, entre outros. Entre os FcγRs, CD16 tem a menor afinidade para IgG Fc; FcγRI (CD64) é o FcR de alta afinidade, que se liga cerca de 1000 vezes mais fortemente ao IgG Fc do que o CD16. O CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas, como a linhagem mieloide, e pode ser expresso em tumores derivados desses tipos de células, como a leucemia mieloide aguda (AML). As células imunes que se infiltram no tumor, como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e são conhecidas por se infiltrar no microambiente do tumor. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente do tumor pode ter um efeito prejudicial na terapia com anticorpos monoclonais. A expressão de CD64 no microambiente do tumor dificulta para esses anticorpos o engate de CD16 na superfície das células NK, pois os anticorpos preferem se ligar ao receptor de alta afinidade. Os TriNKETs, através do direcionamento de dois receptores de ativação na superfície das células NK, podem superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 (no tumor ou no microambiente do tumor) na terapia de anticorpos monoclonais. Independentemente da expressão de CD64 nas células tumorais, os TriNKETs são capazes de mediar as respostas das células NK humanas contra todas as células tumorais, porque o direcionamento duplo de dois receptores de ativação nas células NK fornece uma ligação específica mais forte às células NK.
[0175] Em algumas modalidades, os TriNKETs descritos neste documento (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04- TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2) fornece um melhor perfil de segurança através da redução de efeitos colaterais fora do tumor no alvo. As células natural killer e as células T CD8 são capazes de lisar diretamente as células tumorais, embora os mecanismos pelos quais as células NK e as células T CD8 reconheçam as células autóctones normais das tumorais sejam diferentes. A atividade das células NK é regulada pelo equilíbrio de sinais dos receptores de ativação (NCRs, NKG2D, CD16, etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A, etc.). O equilíbrio desses sinais de ativação e inibição permite que as células NK determinem as células autóctones saudáveis a partir de células autóctones estressadas, infectadas por vírus ou transformadas. Esse mecanismo de autotolerância "incorporado" ajudará a proteger o tecido saudável normal das respostas das células NK. Para estender esse princípio, a autotolerância das células NK permitirá que os TriNKETs atinjam antígenos expressos tanto no próprio como no tumor sem efeitos colaterais fora do tumor ou com uma janela terapêutica aumentada. Ao contrário das células natural killer, as células T requerem o reconhecimento de um peptídeo específico apresentado pelas moléculas de MHC para funções de ativação e efetoras. As células T têm sido o principal alvo da imunoterapia, e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar as respostas das células T contra o tumor. Os biespecíficos de células T, inibidores de checkpoint e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem de toxicidades limitantes da dose. Os biespecíficos de células T e as células CAR-T trabalham em torno do sistema de reconhecimento TCR-MHC usando domínios de ligação para direcionar antígenos na superfície das células tumorais e usando domínios de sinalização manipulados para transduzir os sinais de ativação na célula efetora. Embora sejam eficazes na obtenção de uma resposta imune antitumoral, essas terapias costumam ser associadas à síndrome de liberação de citocinas (CRS) e a efeitos colaterais fora do tumor no alvo. Os TriNKETs são únicos nesse contexto, pois eles não substituem os sistemas naturais de ativação e inibição de células NK. Em vez disso, os TriNKETs são projetados para influenciar o equilíbrio e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, mantendo a tolerância de NK a uma saúde saudável.
[0176] Em algumas modalidades, os TriNKETs descritos neste documento, incluindo um domínio de ligação ao NKG2D (por exemplo, A40-TriNKET, A44- TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2) atrasam a progressão do tumor com mais eficácia do que os anticorpos monoclonais que incluem o mesmo domínio de ligação ao antígeno tumoral. Em algumas modalidades, os TriNKETs incluindo um domínio de ligação a NKG2D e um domínio de ligação ao antígeno tumoral são mais eficazes contra metástases de câncer do que anticorpos monoclonais que incluem o mesmo domínio de ligação ao antígeno tumoral.
[0177] A descrição acima descreve vários aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente contempla especificamente todas as combinações e permutações dos aspectos e das modalidades. III. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
[0178] A invenção fornece métodos para o tratamento de câncer usando uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43- TriNKET, F47-TriNKET, e F63-TriNKET), que inclui um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2) e/ou uma composição farmacêutica descrita neste documento. Os métodos podem ser usados para tratar uma variedade de cânceres, incluindo um tumor sólido, um linfoma e uma leucemia. O tipo de câncer a ser tratado é desejavelmente compatível com o tipo de célula cancerígena à qual a proteína de ligação multiespecífica se liga. Por exemplo, o tratamento de um câncer que expressa molécula de adesão celular epitelial
(EpCAM), como um câncer de cólon que expressa EpCAM, é desejavelmente tratado usando uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento que se liga a NKG2D, CD16 e EpCAM. Aspectos e modalidades adicionais dos métodos terapêuticos são descritos abaixo.
[0179] Por conseguinte, um aspecto da invenção fornece um método de tratamento de câncer em um paciente, em que o método compreende a administração a um paciente em necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação multiespecífica descrita neste documento (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, e F63-TriNKET), que inclui um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2) para tratar o câncer. Exemplos de câncer para tratamento incluem tumor sólido, leucemia e linfoma.
[0180] O método terapêutico pode ser caracterizado de acordo com o câncer a ser tratado. Por exemplo, em certas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Em certas outras modalidades, o câncer é câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de colo do útero, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de endométrio, câncer de esôfago, leucemia, câncer de pulmão, câncer de fígado, melanoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de estômago, câncer de testículo ou câncer uterino. Em ainda outras modalidades, o câncer é um tumor vascularizado, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, carcinoma de células pequenas, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma (por exemplo, um angiossarcoma ou condrossarcoma), câncer de laringe, câncer de parotídeo, câncer do trato biliar, câncer da tireoide, melanoma lentiginoso acral, queratoses actínicas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoide cístico, adenomas, adenossarcoma, carcinoma adenoescamoso, câncer do canal anal, câncer anal, câncer anorretal, tumor astrocítico, carcinoma de glândulas bartolinas, carcinoma de célula basal, câncer biliar, câncer nos ossos, câncer da medula óssea, câncer brônquico, carcinoma de glândula brônquica, carcinoide, colangiocarcinoma, condossarcoma, papiloma/carcinoma do plexo coroide, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, carcinoma de células claras, câncer de tecido conjuntivo, cistoadenoma, câncer do sistema digestório, câncer do duodeno, câncer do sistema endócrino, tumor do seio endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal do endométrio, adenocarcinoma endometrioide, câncer das células endoteliais, câncer ependimário, câncer das células epiteliais, sarcoma de Ewing, câncer de olhos e órbita, câncer genital feminino, hiperplasia nodular focal, câncer de vesícula biliar, câncer de antro gástrico, câncer de fundo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, câncer de coração, hemangioblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática, câncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, doença de Hodgkin, câncer de íleo, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de célula escamosa interepitelial, câncer do ducto biliar intra-hepático, carcinoma de célula escamosa invasiva, câncer jejuno, câncer das juntas, sarcoma de Kaposi, câncer pélvico, carcinoma de células grandes, câncer do intestino grosso, leiomiossarcoma, melanomas de lentigo maligno, linfoma, câncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliais malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, câncer meníngeo, câncer mesotelial, carcinoma metastático, câncer de boca, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiplo, câncer muscular, câncer do trato nasal, câncer do sistema nervoso, adenocarcinoma neuroepitelial melanoma nodular, câncer de pele não epitelial, linfoma não-Hodgkin, carcinoma de células tipo grão de aveia ("oat cells"), câncer oligodendroglial, câncer de cavidade oral, osteossarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, câncer de pênis, câncer de faringe, tumores da hipófise, plasmocitoma, pseudossarcoma, blastoma pulmonar, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer do sistema respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, câncer de seio, câncer de pele, carcinoma de células pequenas, câncer do intestino delgado, câncer de músculo liso, câncer de tecido mole, tumor secretor de somatostatina, câncer de coluna, carcinoma de células escamosas, câncer de músculo estriado, câncer submesotelial, melanoma disseminativo superficial, leucemia de células T, câncer de língua, carcinoma indiferenciado, câncer de ureter, câncer de uretra, câncer de bexiga urinária, câncer do sistema urinário, câncer de colo uterino, câncer de corpo uterino, melanoma uveal, câncer vaginal, carcinoma verrucoso, VIPoma, câncer de vulva, carcinoma bem diferenciado ou tumor de Wilms.
[0181] Em certas outras modalidades, o câncer é um linfoma não-Hodgkin,
como um linfoma de células B ou um linfoma de células T. Em certas modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de células B, como um linfoma de células B grandes difuso, linfoma de células B primário do mediastino, linfoma folicular, linfoma linfocítico de células pequenas, linfoma das células do manto, linfoma de células B da zona marginal, linfoma de células B da zona marginal extranodal, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma de células B da zona marginal esplênica, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmocítico, leucemia de células pilosas ou linfoma do sistema nervoso central (SNC). Em certas outras modalidades, o linfoma não-Hodgkin é um linfoma de células T, como um linfoma linfoblástico T precursor, linfoma de células T periférico, linfoma de células T cutâneo, linfoma de células T angioimunoblástico, linfoma de células T/natural killer extranodal, linfoma de células T do tipo enteropatia, linfoma de células T do tipo paniculite subcutânea, linfoma anaplásico de células grandes ou linfoma de células T periférico.
[0182] O câncer a ser tratado pode ser caracterizado de acordo com a presença de um antígeno específico expresso na superfície da célula cancerígena. Em certas modalidades, a célula cancerígena expressa um ou mais dos seguintes: HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD-L1.
[0183] Em certas modalidades, uma proteína da presente divulgação é usada em um método para melhorar a morte de células tumorais (sinônimo de lise, morte, ablação, redução da sobrevivência ou proliferação celular, e semelhantes) direta ou indiretamente, ou na fabricação de um medicamento para uso em um método para melhorar a morte de células tumorais (sinônimo de lise, morte, ablação, redução da sobrevivência ou proliferação celular, e semelhantes) direta ou indiretamente, expondo um tumor ou célula cancerígena e células natural killer a uma proteína da presente divulgação (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, e F63- TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2). A célula tumoral que responde a uma proteína, conforme descrito acima, expressa o antígeno associado ao tumor ao qual o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga. Por exemplo, em uma modalidade exemplificativa, o C26-TriNKET-CD20 é usado para direcionar um tumor ou célula cancerígena que expressa CD20 (em repouso ou ativado); em outra modalidade exemplificativa, o C26-TriNKET-BMCA é usado para direcionar um tumor ou célula cancerígena que expressa BMCA (em repouso ou ativado).
[0184] Em certas modalidades, uma proteína da presente divulgação é usada em um método de tratamento de um câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, ou na fabricação de um medicamento para uso em um método de tratamento de um câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o que envolve administração ao sujeito de uma proteína ou uma formulação incluindo a proteína da presente divulgação (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, e F63-TriNKET), que incluem um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2). A célula cancerígena que responde a uma proteína, conforme descrito acima, expressa o antígeno associado ao tumor ao qual o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga. Por exemplo, em uma modalidade exemplificativa, o C26-TriNKET-CD20 é usado para direcionar uma célula cancerígena que expressa CD20 (em repouso ou ativado); em outra modalidade exemplificativa, o C26- TriNKET-BMCA é usado para direcionar um tumor ou célula cancerígena que expressa BMCA (em repouso ou ativado). IV. TERAPIA DE COMBINAÇÃO
[0185] Outro aspecto da invenção fornece terapia de combinação. As proteínas de ligação multiespecífica descritas neste documento podem ser usadas em combinação com agentes terapêuticos adicionais para tratar o câncer.
[0186] Em um aspecto, a invenção fornece um método para melhorar a morte das células tumorais direta ou indiretamente, o método inclui a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint; uma citocina;
um agonista de TLR; um agonista do STING; um agente quimioterápico; um agente alvo do câncer que interfere com moléculas específicas nas células cancerígenas envolvidas no crescimento ou na sobrevivência das células cancerígenas, incluindo, por exemplo, inibidores de quinase, como Ibrutinibe, Vemurafenibe ou Gleevec; um vírus oncolítico; uma vacina; radiação; uma terapia NK adotiva que envolve a infusão de células NK ou células T expandidas ex vivo, incluindo células que foram modificadas in vitro para expressar um receptor de antígeno quimérico (por exemplo, células CAR-T); e transplante de células-tronco (SCT).
[0187] Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico compreende uma célula CAR-T. A tecnologia CAR-T é conhecida na técnica e é descrita na Patente U.S. No. 10.174.095, Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2015/0283178 e revisada em Guedan et al., Mol Ther Methods Clin Dev. (2018) 12:145-156. Os CARs podem ter como alvo uma variedade de antígenos. Por exemplo, em certas modalidades, a célula CAR-T expressa ou é capaz de expressar um CAR que liga especificamente um antígeno associado ao tumor, por exemplo, CD19, CD22, BCMA, PSMA, mesotelina (MSLN), ROR1, WT1, L1CAM, MUC16 ou LeY. Em certas modalidades, o antígeno associado ao tumor ligado ao CAR é o mesmo antígeno ligado ao segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína de ligação multiespecífica. Em certas modalidades, o CAR compreende um sítio de ligação ao antígeno que é o mesmo ou substancialmente o mesmo que o segundo sítio de ligação ao antígeno da proteína de ligação multiespecífica.
[0188] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento do câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração ao sujeito de uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint; uma citocina; um agonista de TLR; um agonista do STING; um agente quimioterápico; um agente alvo do câncer que interfere com moléculas específicas nas células cancerígenas envolvidas no crescimento ou na sobrevivência das células cancerígenas, incluindo, por exemplo,
inibidores de quinase, como Ibrutinibe, Vemurafenibe ou Gleevec; um vírus oncolítico; uma vacina; radiação; uma terapia NK adotiva que envolve a infusão de células NK ou células T expandidas ex vivo, incluindo células que foram modificadas in vitro para expressar um receptor de antígeno quimérico (por exemplo, células CAR-T); e transplante de células-tronco (SCT).
[0189] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um bloqueador de checkpoint selecionado entre: um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-KIR, um anticorpo anti-NKG2A, um anticorpo anti-LAG3 e um anticorpo anti-TIM3.
[0190] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com uma citocina incluindo interferons e interleucinas, como IL-2, IL-15, IL- 12, INFα, IL-21, PEG-IL-2 (interleucina-2 modificada com polietileno glicol) e heterodímeros IL15/IL15R.
[0191] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agonista de TLR selecionado entre um agonista de TLR7, um agonista de TLR8, um agonista de TLR7/8, um agonista de TLR9, um agonista de TLR4 e um agonista de TLR3.
[0192] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agonista STING ADU-S100.
[0193] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agente quimioterápico incluindo agentes alquilantes, como ciclofosfamida, mecloretamina, clorambucil, melfalano, dacarbazina (DTIC), nitrosoureias, temozolomida (dacarbazina oral); antraciclinas, tais como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarubicina, mitoxantrona e valrubicina; disruptores citoesqueléticos, tais como paclitaxel, nab-paclitaxel, docetaxel, abraxane e taxotere; epotilonas; inibidores de histona desacetilase, tais como vorinostat e romidepsina; inibidores da topoisomerase I, tais como irinotecano e topotecano; inibidores da topoisomerase II, tais como etoposido, teniposido e tafluposido; inibidores de quinase como bortezomibe, erlotinibe, gefitinibe, imatinibe, vemurafenibe e vismodegibe; análogos nucleotídicos e análogos precursores, tais como azacitidina, azatioprina, capecitabina; antibióticos peptídicos tais como bleomicina e actinomicina; agentes à base de platina, como carboplatina, cisplatina e oxaliplatina; retinoides como tretinoína e alitretinoína; e alcaloides e derivados da vinca, como vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina.
[0194] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção dele suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um bloqueador de checkpoint selecionado entre: nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, lirilumab e monalizumab.
[0195] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agonista TLR selecionado entre: R848/resiquimod, VTX-2337, imiquimod e oligodesoxinucleotídeo CpG.
[0196] A presente divulgação fornece um método para melhorar a morte de células tumorais direta ou indiretamente e/ou um método de tratamento de câncer com uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar ao CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga ao CD16, em combinação com um agente que induz senescência celular. O agente que induz as células cancerígenas à senescência, sensibilizando assim as células para matar e/ou eliminar as células imunes (por exemplo, células NK). A senescência celular pode ser induzida por vários eventos celulares, como a parada do ciclo celular, dano ao DNA e inibição da cascata da proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK). Os agentes que induzem a senescência celular são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Ruscetti et al., Science (2018) 362, 1416–22; e Herranz et al., J. Clin. Invest. (2018) 128(4):1238-1246. Em certas modalidades, o agente que induz a senescência celular compreende uma combinação de um agente que induz a parada do ciclo celular, como um inibidor de uma quinase dependente de ciclina (CDK) e um inibidor de uma quinase MAPK (MEK). Em certas modalidades, o agente que induz senescência celular compreende uma combinação de um inibidor de CDK4/6 (por exemplo, palbociclibe, abemaciclibe ou ribociclibe) e um inibidor de MEK1/2 (por exemplo, trametinibe, cobimetinibe, refametinibe ou selumetinibe).
[0197] As proteínas da invenção também podem ser usadas como um complemento para a remoção cirúrgica da lesão primária.
[0198] A quantidade de proteína de ligação multiespecífica e agente terapêutico adicional e o tempo relativo de administração podem ser selecionados a fim de alcançar um efeito terapêutico combinado desejado. Por exemplo, ao administrar uma terapia de combinação a um paciente em necessidade de tal administração, os agentes terapêuticos na combinação, ou uma composição ou composições farmacêuticas compreendendo os agentes terapêuticos, podem ser administrados em qualquer ordem como, por exemplo, sequencialmente, concorrentemente, juntos, simultaneamente e similares. Além disso, por exemplo, uma proteína de ligação multiespecífica pode ser administrada durante um tempo em que o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) exerce(m) seu efeito profilático ou terapêutico, ou vice-versa. V. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0199] A presente divulgação também apresenta composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína descrita neste documento (por exemplo, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET, e F63- TriNKET), que inclui um domínio de ligação para um antígeno associado ao tumor (exemplos não limitativos de antígenos associados ao tumor, incluindo CD20, BCMA e HER2). A composição pode ser formulada para uso em uma variedade de sistemas de distribuição de drogas. Um ou mais excipientes ou carreadores fisiologicamente aceitáveis também podem ser incluídos na composição para formulação adequada. As formulações adequadas para uso na presente divulgação são encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadélfia, Pa., 17ª ed., 1985. Para uma breve revisão dos métodos para administração de medicamentos, ver, por exemplo, Langer Science 249: 1527-1533 (1990).
[0200] A formulação de distribuição de drogas intravenosas da presente divulgação pode estar contida em uma bolsa, uma caneta ou uma seringa. Em certas modalidades, a bolsa pode ser conectada a um canal que compreende um tubo e/ou uma agulha. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. Em certas modalidades, a formulação pode ser liofilizada e contida em cerca de 12 a 60 frascos. Em certas modalidades, a formulação pode ser liofilizada e 45 mg da formulação liofilizada podem estar contidos em um frasco. Em certas modalidades, a formulação liofilizada de cerca de 40 mg – cerca de 100 mg pode estar contida em um frasco. Em certas modalidades, a formulação liofilizada de 12, 27 ou 45 frascos é combinada para obter uma dose terapêutica da proteína na formulação da droga intravenosa. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco a cerca de 1000 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 600 mg/frasco. Em certas modalidades, a formulação pode ser uma formulação líquida e armazenada como cerca de 250 mg/frasco.
[0201] A presente divulgação pode existir em uma formulação farmacêutica aquosa líquida incluindo uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína em uma solução tamponada que forma uma formulação.
[0202] Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais, ou podem ser filtradas estéreis. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso na forma em que se encontra ou liofilizadas, a preparação liofilizada sendo combinada com um carreador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações será tipicamente entre 3 e 11, preferivelmente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e ainda preferivelmente entre 7 e 8, tal como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em várias unidades de dose única, cada uma contendo uma quantidade fixa do(s) agente(s) acima mencionado(s). A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível.
[0203] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece uma formulação com uma vida útil prolongada incluindo a proteína da presente divulgação, em combinação com manitol, ácido cítrico monohidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico di-hidratado, di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado, cloreto de sódio, polissorbato 80, água e hidróxido de sódio.
[0204] Em certas modalidades, uma formulação aquosa é preparada incluindo a proteína da presente divulgação em uma solução tamponada com pH. O tampão desta invenção pode ter um pH que varia de cerca de 4 a cerca de 8, por exemplo, de cerca de 4,5 a cerca de 6,0, ou de cerca de 4,8 a cerca de 5,5, ou pode ter um pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Faixas intermediárias aos pHs citados acima também se destinam a fazer parte desta divulgação. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores citados acima como limites superior e/ou inferior devem ser incluídos. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro dessa faixa incluem acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (como succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato e outros tampões de ácidos orgânicos.
[0205] Em certas modalidades, a formulação inclui um sistema tampão que contém citrato e fosfato para manter o pH em uma faixa de cerca de 4 a cerca de
8. Em certas modalidades, a faixa de pH pode ser de cerca de 4,5 a cerca de 6,0 ou de cerca de pH 4,8 a cerca de 5,5 ou em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a cerca de 5,2. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui ácido cítrico monohidratado, citrato de sódio, fosfato dissódico di-hidratado e/ou di- hidrogenofosfato de sódio di-hidratado. Em certas modalidades, o sistema tampão inclui cerca de 1,3 mg/ml de ácido cítrico (por exemplo, 1,305 mg/ml), cerca de 0,3 mg/ml de citrato de sódio (por exemplo, 0,305 mg/ml), cerca de 1,5 mg/ml de fosfato dissódico di-hidratado (por exemplo 1,53 mg/ml), cerca de 0,9 mg/ml de di- hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (por exemplo, 0,86) e cerca de 6,2 mg/ml de cloreto de sódio (por exemplo, 6,165 mg/ml). Em certas modalidades, o sistema tampão inclui 1-1,5 mg/ml de ácido cítrico, 0,25 a 0,5 mg/ml de citrato de sódio, 1,25 a 1,75 mg/ml de fosfato dissódico di-hidratado, 0,7 a 1,1 mg/ml de di- hidrogenofosfato de sódio di-hidratado e 6,0 a 6,4 mg/ml de cloreto de sódio. Em certas modalidades, o pH da formulação é ajustado com hidróxido de sódio.
[0206] Um poliol, que atua como um tonicificante e pode estabilizar o anticorpo, também pode ser incluído na formulação. O poliol é adicionado à formulação numa quantidade que pode variar em relação à isotonicidade desejada da formulação. Em certas modalidades, a formulação aquosa pode ser isotônica. A quantidade de poliol adicionado também pode ser alterada em relação ao peso molecular do poliol. Por exemplo, uma quantidade mais baixa de um monossacarídeo (por exemplo, manitol) pode ser adicionada, em comparação com um dissacarídeo (como a trealose). Em certas modalidades, o poliol que pode ser usado na formulação como um agente de tonicidade é manitol. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 5 a cerca de 20 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 7,5 a 15 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 10-14 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração de manitol pode ser de cerca de 12 mg/ml. Em certas modalidades, o poliol sorbitol pode ser incluído na formulação.
[0207] Um detergente ou surfactante também pode ser adicionado à formulação. Detergentes exemplificativos incluem detergentes não iônicos, como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80 etc..) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188). A quantidade de detergente adicionada é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de partículas na formulação e/ou reduz a adsorção. Em certas modalidades, a formulação pode incluir um surfactante que é um polissorbato. Em certas modalidades, a formulação pode conter o polissorbato detergente 80 ou Tween 80. Tween 80 é um termo usado para descrever o acetato de sorbitano e polioxietileno (20) (ver Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4ª ed., 1996). Em certas modalidades, a formulação pode conter entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 10 mg/mL de polissorbato 80, ou entre cerca de 0,5 mg/mL e cerca de 5 mg/mL. Em certas modalidades, cerca de 0,1% de polissorbato 80 pode ser adicionado à formulação.
[0208] Nas modalidades, o produto proteico da presente divulgação é formulado como uma formulação líquida. A formulação líquida pode ser apresentada com uma concentração de 10 mgmL em frasco eithera USP/Ph Eur tipo I 50R fechado com uma rolha de borracha e vedado com um fecho de vedação de crimpagem de alumínio. A rolha pode ser feita de elastômero conforme USP e Ph Eur. Em certas modalidades, os frascos podem ser preenchidos com 61,2 mL da solução do produto proteico, a fim de permitir um volume extraível de 60 mL. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser diluída com solução salina a 0,9%.
[0209] Em certas modalidades, a formulação líquida da divulgação pode ser preparada como uma solução de concentração de 10 mg/mL em combinação com um açúcar em níveis de estabilização. Em certas modalidades, a formulação líquida pode ser preparada em um carreador aquoso. Em certas modalidades, um estabilizador pode ser adicionado em uma quantidade não superior à que pode resultar em uma viscosidade indesejável ou inadequada para administração intravenosa. Em certas modalidades, o açúcar pode ser dissacarídeos, por exemplo, sacarose. Em certas modalidades, a formulação líquida também pode incluir um ou mais de um agente tampão, um surfactante e um conservante.
[0210] Em certas modalidades, o pH da formulação líquida pode ser definido por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base pode ser hidróxido de sódio.
[0211] Ademais à agregação, a desamidação é uma variante comum de produto de peptídeos e proteínas que pode ocorrer durante a fermentação, clarificação da colheita/célula, purificação, armazenamento de substância de droga/produto de droga e durante a análise da amostra. Desamidação é a perda de NH3 de uma proteína que forma um intermediário succinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário da succinimida resulta em uma diminuição em massa de 17 daltons a partir do peptídeo de origem. A hidrólise subsequente resulta em um aumento em massa de 18 daltons. O isolamento do intermediário succinimida é difícil devido à instabilidade sob condições aquosas. Como tal, a desamidação é tipicamente detectável como um aumento em massa de 1 dalton. A desamidação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspártico. Os parâmetros que afetam a taxa de desamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, força iônica, sequência primária, conformação polipeptídica local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácidos adjacentes a Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de desamidação. Gly e Ser após um Asn em sequências de proteínas resultam em uma maior suscetibilidade à desamidação.
[0212] Em certas modalidades, a formulação líquida da presente divulgação pode ser preservada sob condições de pH e umidade para impedir a desaminação do produto proteico.
[0213] O carreador de interesse neste documento é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Carreadores ilustrativos podem incluir água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0214] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0215] As formulações intravenosas (IV) podem ser a via de administração preferencial em casos particulares, como quando um paciente está no hospital após o transplante recebendo todas as drogas pela via IV. Em certas modalidades, a formulação líquida é diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% antes da administração. Em certas modalidades, o produto farmacêutico diluído para injeção é isotônico e adequado para administração por infusão intravenosa.
[0216] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas "formadoras de bases". Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, nesse caso, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0217] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0218] O carreador de interesse neste documento é um que seja farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida. Carreadores ilustrativos podem incluir água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0219] A presente divulgação pode existir em uma formulação liofilizada incluindo as proteínas e um lioprotetor. O lioprotetor pode ser açúcar, por exemplo, dissacarídeos. Em certas modalidades, o lioprotetor pode ser sacarose ou maltose. A formulação liofilizada também pode incluir um ou mais de um agente tampão, um surfactante, um agente de volume e/ou um conservante.
[0220] A quantidade de sacarose ou maltose útil para estabilização do produto farmacêutico liofilizado pode estar em uma razão em peso de pelo menos 1:2 de proteína para sacarose ou maltose. Em certas modalidades, a razão em peso de proteína para sacarose ou maltose pode ser de 1:2 a 1:5.
[0221] Em certas modalidades, o pH da formulação, antes da liofilização, pode ser definido por adição de um ácido e/ou base farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o ácido farmaceuticamente aceitável pode ser ácido clorídrico. Em certas modalidades, a base farmaceuticamente aceitável pode ser hidróxido de sódio.
[0222] Antes da liofilização, o pH da solução que contém a proteína da presente divulgação pode ser ajustado entre 6 e 8. Em certas modalidades, a faixa de pH para o produto farmacêutico liofilizado pode ser de 7 a 8.
[0223] Em certas modalidades, um sal ou componentes de tampão podem ser adicionados em uma quantidade de 10 mM - 200 mM. Os sais e/ou tampões são farmaceuticamente aceitáveis e são derivados de vários ácidos conhecidos (inorgânicos e orgânicos) com metais ou aminas "formadoras de bases". Em certas modalidades, o tampão pode ser tampão de fosfato. Em certas modalidades, o tampão pode ser tampões de glicinato, carbonato, citrato, nesse caso, íons de sódio, potássio ou amônio podem servir como contra-íon.
[0224] Em certas modalidades, um "agente de volume" pode ser adicionado. Um "agente de volume" é um composto que adiciona massa a uma mistura liofilizada e contribui para a estrutura física do bolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poros abertos). Os agentes de volume ilustrativos incluem manitol, glicina, polietileno glicol e sorbitol. As formulações liofilizadas da presente invenção podem conter tais agentes de volume.
[0225] Um conservante pode ser opcionalmente adicionado às formulações deste documento para reduzir a ação bacteriana. A adição de um conservante pode, por exemplo, facilitar a produção de uma formulação multiuso (doses múltiplas).
[0226] Em certas modalidades, o produto farmacêutico liofilizado pode ser constituído por um carreador aquoso. O carreador de interesse neste documento é um que seja farmaceuticamente aceitável (por exemplo, seguro e não tóxico para administração a um humano) e é útil para a preparação de uma formulação líquida, após liofilização. Diluentes ilustrativos podem incluir água estéril para injeção (SWFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.
[0227] Em certas modalidades, o produto farmacêutico liofilizado da presente divulgação é reconstituído com Água Estéril para Injeção, USP (SWFI) ou Injeção de Cloreto de Sódio a 0,9%, USP. Durante a reconstituição, o pó liofilizado se dissolve em uma solução.
[0228] Em certas modalidades, o produto proteico liofilizado da presente divulgação é constituído para cerca de 4,5 mL de água para injeção e diluído com solução salina a 0,9% (solução de cloreto de sódio).
[0229] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas desta invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente.
[0230] A dose específica pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 50-5000 mg de proteína. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser adaptada ao peso corporal aproximado ou à área de superfície do paciente. Outros fatores na determinação da dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou evitada, a gravidade da doença, a via de administração e a idade, sexo e condição médica do paciente. Um refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento é feito rotineiramente por aqueles versados na técnica, especialmente diante às informações de dosagem e ensaios divulgados neste documento. A dosagem também pode ser determinada através do uso de ensaios conhecidos para determinar as dosagens usadas em conjunto com dados de resposta à dose apropriados. A dosagem de um paciente individual pode ser ajustada conforme o progresso da doença é monitorado. Os níveis sanguíneos da construção ou complexo direcionável em um paciente podem ser medidos para verificar se a dose precisa ser ajustada para alcançar ou manter uma concentração eficaz. A farmacogenômica pode ser usada para determinar quais construções e/ou complexos direcionáveis e dosagens dos mesmos são mais prováveis de serem eficazes para um determinado indivíduo (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).
[0231] No geral, as dosagens com base em peso corporal são de cerca de 0,01 μg a cerca de 100 mg por kg em peso corporal, tal como cerca de 0,01 μg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 10 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 1 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 100 μg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 50 μg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 10 μg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 1 μg/kg em peso corporal, cerca de 0,01 μg a cerca de 0,1 μg/kg em peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 10 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 1 mg/kg em peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 100 μg/kg em peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 10 μg/kg em peso corporal, cerca de 0,1 μg a cerca de 1 μg/kg em peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 10 mg/kg em peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 1 mg/kg em peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 100 μg/kg em peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 50 μg/kg em peso corporal, cerca de 1 μg a cerca de 10 μg/kg em peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 10 mg/kg em peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 1 mg/kg em peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 100 μg/kg em peso corporal, cerca de 10 μg a cerca de 50 μg/kg em peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 50μg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 10 mg/kg em peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 1 mg/kg em peso corporal, cerca de 50 μg a cerca de 100 μg/kg em peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 10 mg/kg em peso corporal, cerca de 100 μg a cerca de 1 mg/kg em peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 1 mg a cerca de 10 mg/kg em peso corporal, cerca de 10 mg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal, cerca de 10 mg a cerca de 50 mg/kg em peso corporal, cerca de 50 mg a cerca de 100 mg/kg em peso corporal.
[0232] As doses podem ser administradas uma ou mais vezes ao dia, semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. As pessoas versadas na técnica podem facilmente estimar as taxas de repetição para a dosagem com base nos tempos de permanência medidos e nas concentrações da construção ou complexo direcionável nos fluidos corporais ou tecidos. A administração da presente invenção pode ser intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, intracavitária, por perfusão através de um cateter ou por injeção intralesional direta. Isso pode ser administrado uma ou mais vezes por dia, uma ou mais vezes por semana, uma ou mais vezes por mês e uma ou mais vezes por ano.
[0233] A descrição acima descreve vários aspectos e modalidades da invenção. O pedido de patente contempla especificamente todas as combinações e permutações dos aspectos e das modalidades.
EXEMPLOS
[0234] A invenção agora, sendo descrita de forma geral, será mais facilmente compreendida pela referência aos exemplos seguintes, que estão incluídos apenas para fins de ilustração de determinados aspectos e modalidades da presente invenção e não são destinados a limitar a invenção. Exemplo 1 – Domínios de ligação ao NKG2D se ligam ao NKG2D Os domínios de ligação ao NKG2D se ligam ao NKG2D recombinante purificado
[0235] As sequências de ácidos nucleicos dos ectodomínios NKG2D de humanos, camundongos ou cynomolgus foram fundidas com sequências de ácidos nucleicos que codificam domínios Fc IgG1 humanos e introduzidas nas células de mamíferos para serem expressas. Após purificação, as proteínas de fusão NKG2D- Fc foram adsorvidas nos poços das microplacas. Após o bloqueio dos poços com albumina de soro bovino para impedir a ligação não específica, os domínios de ligação ao NKG2D foram titulados e adicionados aos poços pré-adsorvidos com proteínas de fusão NKG2D-Fc. A ligação do anticorpo primário foi detectada usando um anticorpo secundário que foi conjugado à peroxidase de rábano silvestre e reconhece especificamente uma cadeia leve kappa humana para evitar a reatividade cruzada de Fc. 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB), um substrato para peroxidase de rábano silvestre, foi adicionado aos poços para visualizar o sinal de ligação, cuja absorvância foi medida em 450 nM e corrigida em 540 nM. Um clone do domínio de ligação ao NKG2D, um controle de isotipo ou um controle positivo (selecionado a partir da SEQ ID NO: 45-48 ou clones de NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis na eBioscience) foi adicionado a cada poço.
[0236] O controle do isotipo mostrou ligação mínima às proteínas NKG2D- Fc recombinantes, enquanto o controle positivo se ligou mais fortemente aos antígenos recombinantes. Os domínios de ligação ao NKG2D produzidos por todos os clones demonstraram ligação através das proteínas NKG2D-Fc recombinantes de humanos, camundongos e cynomolgus, embora com afinidades variadas de clone para clone. Geralmente, cada clone anti-NKG2D se liga ao NKG2D-Fc recombinante de humanos (FIG. 14) e cynomolgus (FIG. 15) com afinidade semelhante, mas com menor afinidade ao NKG2D-Fc recombinante de camundongos (FIG. 16). Os domínios de ligação ao NKG2D se ligam a células que expressam NKG2D
[0237] As linhagens celulares de linfoma de camundongo EL4 foram modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico de domínio de sinalização NKG2D - CD3 zeta humano ou de camundongo. Um clone de ligação ao NKG2D, um controle de isotipo ou um controle positivo foi usado a uma concentração de 100 nM para colorir NKG2D extracelular expresso nas células EL4. A ligação do anticorpo foi detectada usando anticorpos secundários IgG anti- humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e o "fold over background" (FOB) foi calculado usando o meio de intensidade de fluorescência (MFI) das células que expressam NKG2D em comparação com as células EL4 parentais.
[0238] Os domínios de ligação ao NKG2D produzidos por todos os clones se ligaram a células EL4 que expressam NKG2D humano e de camundongo. Anticorpos de controle positivo (selecionados da SEQ ID NO: 45-48, ou clones de NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis na eBioscience) deram o melhor sinal de ligação FOB. A afinidade de ligação ao NKG2D para cada clone foi semelhante entre as células que expressam NKG2D humano (FIG. 17) e de camundongo (FIG. 18). Exemplo 2 – Domínios de ligação ao NKG2D bloqueiam o ligante natural que se liga ao NKG2D Concorrência Com ULBP-6
[0239] As proteínas NKG2D-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas nos poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Uma concentração saturante de ULBP-6-His-biotina foi adicionada aos poços, seguida pela adição dos clones do domínio de ligação ao NKG2D. Após uma incubação de 2 horas, os poços foram lavados e a ULBP-6-His-biotina que permaneceu ligada aos poços revestidos com NKG2D-Fc foi detectada por estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano silvestre e substrato de TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de ULBP-6-His- biotina que foi impedida de se ligar às proteínas NKG2D-Fc nos poços. O anticorpo de controle positivo (selecionado da SEQ ID NO: 45-48) e vários domínios de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de ULBP-6 ao NKG2D, enquanto o controle de isotipo mostrou pouca competição com ULBP-6 (FIG. 19). Competição Com MICA
[0240] As proteínas MICA-Fc humanas recombinantes foram adsorvidas nos poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Adicionou-se NKG2D-Fc-biotina aos poços seguidos pelos domínios de ligação ao NKG2D. Após incubação e lavagem, a NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligada aos poços revestidos com MICA-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi impedida de se ligar aos poços revestidos com MICA-Fc. O anticorpo de controle positivo (selecionado da SEQ ID NO: 45-48) e vários domínios de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação de MICA ao NKG2D, enquanto o controle de isotipo mostrou pouca competição com MICA (FIG. 20). Competição Com Rae-1 delta
[0241] O Rae-1delta-Fc de camundongo recombinante (adquirido da R&D Systems) foi adsorvido nos poços de uma microplaca e os poços foram bloqueados com albumina de soro bovino para reduzir a ligação não específica. Adicionou-se NKG2D-Fc-biotina de camundongo aos poços seguidos pelos domínios de ligação ao NKG2D. Após incubação e lavagem, a NKG2D-Fc-biotina que permaneceu ligada aos poços revestidos com Rae-1delta-Fc foi detectada usando estreptavidina-HRP e substrato de TMB. A absorvância foi medida a 450 nM e corrigida a 540 nM. Após subtrair o fundo, a ligação específica dos domínios de ligação ao NKG2D às proteínas NKG2D-Fc foi calculada a partir da porcentagem de NKG2D-Fc-biotina que foi impedida de se ligar aos poços revestidos com Rae- 1delta-Fc. O controle positivo (selecionado a partir da SEQ ID NO: 45-48 ou dos clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis na eBioscience) e vários clones de domínio de ligação ao NKG2D bloquearam a ligação Rae-1delta ao NKG2D de camundongo, enquanto o anticorpo de controle de isotipo mostrou pouca competição com Rae-1delta (FIG. 21). Exemplo 3 – Clones de domínio de ligação ao NKG2D ativam NKG2D
[0242] As sequências de ácido nucleico de NKG2D humano e de camundongo foram fundidas com sequências de ácido nucleico que codificam um domínio de sinalização CD3 zeta para obter construções de receptor de antígeno quimérico (CAR). As construções NKG2D-CAR foram então clonadas em um vetor retroviral usando a montagem de Gibson e transfectadas em células expi293 para produção retroviral. As células EL4 foram infectadas com vírus contendo NKG2D- CAR juntamente com 8 µg/mL de polibeno. 24 horas após a infecção, os níveis de expressão de NKG2D-CAR nas células EL4 foram analisados por citometria de fluxo e foram selecionados clones que expressam altos níveis de NKG2D-CAR na superfície celular.
[0243] Para determinar se os domínios de ligação ao NKG2D ativam o NKG2D, eles foram adsorvidos nos poços de uma microplaca e as células NKG2D- CAR EL4 foram cultivadas nos poços revestidos com fragmento de anticorpo por 4 horas na presença de brefeldina-A e monensina. A produção de TNF-alfa intracelular, um indicador para ativação de NKG2D, foi testada por citometria de fluxo. A porcentagem de células positivas para TNF-alfa foi normalizada para as células tratadas com o controle positivo. Todos os domínios de ligação ao NKG2D ativaram NKG2D humano (FIG. 22) e de camundongo (FIG. 23). Exemplo 4 – Domínios de ligação ao NKG2D ativam células NK Células NK humanas primárias
[0244] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK (CD3 - CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com grânulos magnéticos de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas era tipicamente >95%. As células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 por 24-48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca na qual os domínios de ligação ao NKG2D foram adsorvidos e cultivados em meio contendo anticorpo anti-CD107a conjugado com fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após a cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração de CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3- CD56+ para avaliar a ativação de células NK. O aumento nas células duplamente positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de uma melhor ativação das células NK através do envolvimento de dois receptores de ativação em vez de um receptor. Os domínios de ligação ao NKG2D e o controle positivo (selecionados da SEQ ID NO: 45-48) mostraram uma porcentagem maior de células NK se tornando CD107a+ e IFN-gama+ do que o controle de isotipo (FIG. 24 e FIG. 25 representam dois experimentos independentes, cada um usando PBMC de um doador diferente para a preparação de células NK). Células NK de camundongo primárias
[0245] Os baços foram obtidos de camundongos C57Bl/6 e esmagados através de uma coloração de células de 70 µm para obter suspensão de célula única. As células foram sedimentadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido da Thermo Fisher Scientific #A1049201; cloreto de amônio a 155 mM, bicarbonato de potássio a 10 mM, EDTA a 0,01 mM) para remover os glóbulos vermelhos. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/mL de hIL-2 por 72 horas antes de serem colhidas e preparadas para o isolamento de células NK. As células NK (CD3-NK1.1+) foram então isoladas a partir de células do baço usando uma técnica de depleção negativa com grânulos magnéticos com tipicamente >90% de pureza. As células NK isoladas foram purificadas em meio contendo 100 ng/mL de mIL-15 por 48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca na qual os domínios de ligação ao NKG2D foram adsorvidos e cultivados em meio contendo anticorpo anti-CD107a conjugado com fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após a cultura em poços revestidos com o domínio de ligação ao NKG2D, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, NK1.1 e IFN-gama. A coloração de CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3- NK1.1+ para avaliar a ativação de células NK. O aumento nas células duplamente positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de uma melhor ativação das células NK através do envolvimento de dois receptores de ativação em vez de um receptor. Os domínios de ligação ao NKG2D e o controle positivo (selecionados a partir dos clones NKG2D anti-camundongo MI-6 e CX-5 disponíveis na eBioscience) mostraram uma porcentagem maior de células NK se tornando CD107a+ e IFN-gama+ do que o controle de isotipo (FIG. 26 e FIG. 27 representam dois experimentos independentes, cada um usando um camundongo diferente para a preparação de células NK). Exemplo 5 – Domínios de ligação ao NKG2D permitem citotoxicidade de células tumorais alvo
[0246] Os ensaios de ativação de células NK primárias em humanos e camundongos demonstram marcadores de citotoxicidade aumentados em células NK após a incubação com domínios de ligação ao NKG2D. Para abordar se isso se traduz em aumento da lise de células tumorais, foi utilizado um ensaio baseado em células onde cada domínio de ligação ao NKG2D foi desenvolvido em um anticorpo monoespecífico. A região Fc foi usada como um braço de direcionamento, enquanto a região Fab (domínio de ligação ao NKG2D) atuou como outro braço de direcionamento para ativar as células NK. As células THP-1, que são de origem humana e expressam altos níveis de receptores Fc, foram usadas como alvo do tumor e foi usado um Kit de Citotoxicidade Perkin Elmer DELFIA. As células THP- 1 foram marcadas com reagente BATDA e ressuspensas em 10 5 células/mL em meio de cultura. As células THP-1 marcadas foram então combinadas com anticorpos NKG2D e células NK de camundongo isoladas em poços de uma placa de microtitulação a 37oC por 3 horas. Após a incubação, 20 µl do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 µl de solução de Europium e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por um leitor de placas PheraStar equipado com um módulo de fluorescência resolvido no tempo (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise específica foi calculada de acordo com as instruções do kit.
[0247] O controle positivo, ULBP-6 - um ligante natural para NKG2D, mostrou aumento da lise específica das células alvo THP-1 pelas células NK de camundongo. Os anticorpos NKG2D também aumentaram a lise específica das células alvo THP-1, enquanto o anticorpo de controle do isotipo mostrou lise específica reduzida. A linha pontilhada indica lise específica de células THP-1 por células NK de camundongo sem adição de anticorpo (FIG. 28). Exemplo 6 – anticorpos NKG2D mostram alta termoestabilidade
[0248] As temperaturas de fusão dos domínios de ligação ao NKG2D foram testadas usando fluorimetria de varredura diferencial. As temperaturas de fusão aparentes extrapoladas são altas em relação aos anticorpos IgG1 típicos (FIG. 29). Exemplo7 – Proteínas de ligação multiespecíficas exibem capacidade aprimorada para ativar células NK
[0249] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK (CD3 - CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com grânulos magnéticos de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas era tipicamente >95%. As células NK isoladas foram então cultivadas em meio contendo 100 ng/mL de IL-2 por 24-48 horas antes de serem transferidas para os poços de uma microplaca na qual as proteínas de ligação multiespecíficas e biespecíficas foram adsorvidas respectivamente, e cultivadas em meio contendo anticorpo anti-CD107a conjugado com fluoróforo, brefeldina-A e monensina. Após a cultura, as células NK foram testadas por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração de CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3- CD56+ para avaliar a ativação de células NK. O aumento nas células duplamente positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de uma melhor ativação das células NK. AL2.2 é uma proteína de ligação multiespecífica contendo domínio de ligação ao HER2 (trastuzumab), domínio de ligação ao NKG2D (ULBP-6) e um domínio Fc de IgG1 humano. Isso foi feito através de uma reação controlada de troca de braço Fab
(cFAE) a partir do homodímero trastuzumab e do homodímero ULBP-6-Fc (ver Labrijn et al. Nature Protocols 9, 2450-2463). SC2.2 é uma proteína de cadeia única, incluindo um scFv derivado de trastuzumab e ULBP-6 (SEQ ID NO:73). SEQ ID NO: 73
MAAAAIPALLLCLPLLFLLFGWSRARRDDPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCA VQGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTMAWKAQNPVLREVVDILTEQL LDIQLENYTPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSIDGQTFLLFDSEKRMWT TVHPGARKMKEKWENDKDVAMSFHYISMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAP LAMSSGTTQLRATATTLILCCLLIILPCFILPGI
[0250] A análise da coloração de CD107a e IFN-gama indicou que o IgG de controle de isotipo não mostrou ativação das células NK, enquanto uma porcentagem maior de células NK se tornou CD107a+ e IFN-gama+ após estimulação com uma proteína de ligação multiespecífica em comparação com uma proteína biespecífica, demonstrando maior ativação das células NK através do envolvimento de dois receptores de ativação (NKG2D e CD16) em vez de apenas um (NKG2D) (FIG. 30). Espera-se que este aumento na ativação das células NK se traduza em morte celular mais potente. Exemplo 8 – Proteínas de ligação multiespecíficas exibem citotoxicidade aprimorada em relação a células tumorais alvo Ensaio de citotoxicidade em células NK humanas primárias
[0251] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK (CD3 - CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com grânulos magnéticos de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas era tipicamente >95%. As células NK foram então cultivadas durante a noite em meios contendo 100 ng/mL de IL-2 antes de serem usadas em ensaios de citotoxicidade. No dia seguinte, as células NK foram ressuspensas a 5x105 células/mL em meio de cultura fresco. As células SkBr-3 de células de câncer de mama humanas foram marcadas com reagente BATDA de acordo com o Kit de Citotoxicidade Perkin Elmer DELFIA e ressuspensas a 5x10 4 células/mL em meio de cultura. Várias diluições das proteínas de ligação multiespecíficas foram feitas em meio de cultura. As células NK, as células SkBr-3 marcadas e as proteínas de ligação multiespecíficas foram então combinadas em poços de uma placa de microtitulação e incubadas a 37 oC por 3 horas. Após a incubação, 20 µl do sobrenadante da cultura foram removidos, misturados com 200 µl de solução de Europium e incubados com agitação por 15 minutos no escuro. A fluorescência foi medida ao longo do tempo por um leitor de placas PheraStar equipado com um módulo de fluorescência resolvido no tempo (Excitação 337 nm, Emissão 620 nm) e a lise específica foi calculada de acordo com as instruções do kit. AL0.2 é uma proteína de ligação multiespecífica contendo domínio de ligação ao HER2 (trastuzumab), domínio de ligação ao NKG2D (selecionado da SEQ ID NO: 1-44)) e um domínio Fc de IgG1 humano. Isso foi feito através de uma reação controlada de troca de braço Fab (cFAE) a partir do homodímero trastuzumab e homodímero anti-NKG2D. AL0.2si é baseado em AL0.2 e contém uma mutação D265A adicional no domínio Fc que anula a ligação ao CD16. O trastuzumab-si é baseado no trastuzumab e contém uma mutação D265A adicional no domínio Fc que anula a ligação ao CD16. AL2.2 é uma proteína de ligação multiespecífica contendo domínio de ligação ao HER2 (trastuzumab), domínio de ligação ao NKG2D (ULBP-6) e um domínio Fc de IgG1 humano. SC2.2 é uma proteína de cadeia única, incluindo um scFv derivado de trastuzumab e ULBP-6.
[0252] AL0.2 mostrou lise aprimorada de células alvo SkBr-3 por células NK humanas do que o trastuzumab de maneira dependente da dose, com um valor de p de 0,0311 em EC50 (FIG. 31). AL0.2si (FIG. 32) e trastuzumab-si (FIG. 33) mostraram redução na potência e na lise específica máxima das células SkBr-3 em comparação com AL0.2, com um valor de p de 0,0002 e 0,0001 em EC50, respectivamente (FIGS. 32-33). Além disso, AL0.2 mostrou lise aprimorada de células SkBr-3 do que AL2.2 de maneira dependente da dose (FIG. 34). O IgG de controle de isotipo não mostrou aumento na lise específica em nenhuma das concentrações testadas. Juntos, os dados demonstraram que proteínas de ligação multiespecíficas que envolvem 2 receptores de ativação em células NK e um antígeno tumoral, induzem a morte mais potente de células tumorais por células NK humanas em comparação com proteínas biespecíficas que envolvem um receptor de ativação em células NK e um antígeno tumoral. Ensaio de citotoxicidade em células NK de camundongo primárias
[0253] Os baços foram obtidos de camundongos C57Bl/6 e esmagados através de uma coloração de células de 70 µm para obter suspensão de célula única. As células foram sedimentadas e ressuspensas em tampão de lise ACK (adquirido da Thermo Fisher Scientific #A1049201; cloreto de amônio a 155 mM, bicarbonato de potássio a 10 mM, EDTA a 0,01 mM) para remover os glóbulos vermelhos. As células restantes foram cultivadas com 100 ng/mL de hIL-2 por 72 horas antes de serem colhidas e preparadas para o isolamento de células NK. As células NK (CD3-NK1.1+) foram então isoladas a partir de células do baço usando uma técnica de depleção negativa com grânulos magnéticos com tipicamente >90% de pureza. As células NK purificadas foram cultivadas em meios contendo 100 ng/mL de mIL-15 por 48 horas antes de ressuspensas em meio de cultura a 10 6 células/mL para ensaios citotóxicos. RMA-HER2-dTomato, uma linhagem celular de tumor de camundongo projetada para expressar HER2 e dTomato, e sua contraparte de controle, células RMA que expressam zsGreen, foram usadas como alvos. As células foram ressuspensas a 2x105 células/mL em meio de cultura e semeadas em poços de uma microplaca na razão de 1:1. Diluições de proteína multiespecífica foram feitas em meios de cultura e adicionadas às células RMA juntamente com as células NK. Após incubação durante a noite a 37 oC com 5% de CO2, a porcentagem de células RMA-HER2-dTomato e RMA-zsGreen foi determinada por citometria de fluxo usando o repórter fluorescente para identificar os dois tipos de células. Morte de célula alvo específica = (1- ((% de células RMA- Ca2T-dTomato no grupo de tratamento * % de células RMA-zsGreen no grupo controle)/(% de células RMA-Ca2T-dTomato no grupo de controle * % de células RMA-zsGreen no grupo de tratamento))) * 100%.
[0254] AL2.2 é mais potente no redirecionamento das respostas das células NK aos alvos tumorais do que SC2.2 (FIG. 36) e trastuzumab (FIG. 35). A proteína de controle mostrou pouco impacto na morte alvo específica. Esses dados demonstram que as proteínas de ligação multiespecíficas que envolvem 2 receptores de ativação em células NK e um antígeno tumoral, induzem a morte mais potente de células tumorais por células NK de camundongo em comparação com proteínas biespecíficas que envolvem um receptor de ativação em células NK e um antígeno tumoral. Exemplo 9 – Proteínas de ligação multiespecíficas se ligam ao NKG2D
[0255] As linhagens celulares de linfoma de camundongo EL4 foram modificadas para expressar NKG2D humano. As proteínas de ligação triespecíficas
(TriNKETs) que contêm um domínio de ligação ao NKG2D, um domínio de ligação ao antígeno associado a um tumor (como um domínio de ligação a CD33-, HER2-, CD20- ou BCMA) e um domínio Fc que se liga ao CD16 como mostrado na FIG. 1, foram testadas quanto à sua afinidade com NKG2D extracelular expressa em células EL4. A ligação das proteínas de ligação multiespecíficas ao NKG2D foi detectada usando anticorpos secundários IgG anti-humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e o "fold over background" (FOB) foi calculado usando o meio de intensidade de fluorescência (MFI) das células que expressam NKG2D em comparação com as células EL4 parentais.
[0256] Os TriNKETs testados incluem CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao CD33), CD33-TriNKET-F04 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao CD33), HER2-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao HER2), HER2-TriNKET-F04 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao HER2), CD20- TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao CD20), CD20-TriNKET-F04 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao CD20), BCMA-TriNKET-C26 (ADI-28226 e um domínio de ligação ao BCMA), BCMA-TriNKET-F04 (ADI-29404 e um domínio de ligação ao BCMA), BCMA-TriNKET-F43 (ADI-29443 e um domínio de ligação ao BCMA), e BCMA-TriNKET-F47 (ADI-29447 e um domínio de ligação ao BCMA). O domínio de ligação ao HER2 usado nas moléculas testadas era composto por um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve de Trastuzumab. O domínio de ligação ao CD33 era composto por um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve listados abaixo. SEQ ID NO:74:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYVVHWVRQAPGQGLEWMGYIN
PYND CDR1
GTKYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDYRYEVYGMDY
WGQ CDR2 CDR3
GTLVTVSS SEQ ID NO:75:
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCTASSSVNYIHWYQQKPGQPPKLLIYDTSKVASG
VPAR CDR1 CDR1
FSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQQWRSYPLTFGQGTKLEIK CDR3 O domínio de ligação ao CD20 usado nas moléculas testadas era composto por um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve. O domínio de ligação ao BCMA usado nas moléculas testadas era composto por um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve conforme listado abaixo. Domínio variável de cadeia pesada EM-801 (SEQ ID NO:82):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISG
SGG CDR1 CDR2
STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQG TLVTVSS CDR3 Domínio variável de cadeia leve EM-801 (SEQ ID NO:83):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR
ATGI CDR1 CDR2
PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK CDR3 Domínio variável de cadeia pesada EM-901 (SEQ ID NO:76)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISG
PGSST CDR1 CDR2
YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTL VTVSS CDR3 Domínio variável de cadeia leve EM-901 (SEQ ID NO:77)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSDEYLSWYQQKPGQAPRLLIHSASTR
ATGIPD CDR1 CDR2
RFSGSGSGTDFTLAISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIK CDR3
[0257] Os dados mostram que um TriNKET da presente divulgação se liga ao NKG2D quando a proteína inclui um domínio de ligação ao antígeno tumoral, como CD33, HER2, CD20 e BCMA. Exemplo 10 – Proteínas de ligação multiespecíficas se ligam aos antígenos tumorais humanos As proteínas de ligação triespecíficas se ligam a CD33, HER2, CD20 e
BCMA
[0258] A linhagem celular AML humana MV4-11 que expressa CD33 foi usada para testar a ligação de TriNKETs ao antígeno associado ao tumor. Os TriNKETs e o anticorpo monoclonal anti-CD33 parental foram incubados com as células e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários IgG anti-humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e o "fold over background" (FOB) foi calculado usando o meio de intensidade de fluorescência (MFI) dos TriNKETs e o anticorpo anti-CD33 monoclonal parental normalizado para controles secundários de anticorpos. CD33-TriNKET-C26 e CD33-TriNKET-F04 mostram níveis comparáveis de ligação ao CD33 em comparação com o anticorpo anti-CD33 parental (FIG. 41).
[0259] As linhagens celulares de câncer humano que expressam HER2 foram usadas para testar a ligação dos TriNKETs ao antígeno associado ao tumor. A linhagem celular de carcinoma de células renais 786-O expressa baixos níveis de HER2. Os TriNKETs e opcionalmente o anticorpo monoclonal anti-HER2 parental (Trastuzumab) foram incubados com as células e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários IgG anti-humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e o "fold over background" (FOB) foi calculado usando o meio de intensidade de fluorescência (MFI) dos TriNKETs e Trastuzumab normalizado para controles secundários de anticorpos. HER2- TriNKET-C26 e HER2-TriNKET-F04 mostram níveis comparáveis de ligação ao HER2 expressos em células 786-O em comparação com Trastuzumab (FIG. 42).
[0260] As células de mieloma humano MM.1S que expressam BCMA foram usadas para testar a ligação de TriNKETs ao antígeno associado ao tumor BCMA. Os TriNKETs e opcionalmente o anticorpo monoclonal anti-BCMA parental (EM- 801) foram incubados com as células e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários IgG anti-humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e o "fold over background" (FOB) foi calculado usando o meio de intensidade de fluorescência (MFI) dos TriNKETs e EM-801 normalizado para controles secundários de anticorpos. C26--TriNKET-BCMA, F04- TriNKET-BCMA, F43-TriNKET-BCMA e F47-TriNKET-BCMA mostram níveis comparáveis de ligação ao BCMA expressos nas células MM.1S em comparação com EM-801 (FIG. 43).
[0261] As células de linfoma humano Raji que expressam CD20 foram usadas para testar a ligação de TriNKETs ao antígeno associado ao tumor CD20. Os TriNKETs foram incubados com as células e a ligação foi detectada usando anticorpos secundários IgG anti-humano conjugados com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo e o histograma foi plotado. Conforme mostrado na FIG. 44, CD20-TriNKET-C26 e CD20-TriNKET-F04 se ligam igualmente ao CD20. Exemplo 11 – Proteínas de ligação multiespecíficas ativam células NK
[0262] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK (CD3 - CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com grânulos magnéticos de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas era tipicamente >90%. As células NK isoladas foram cultivadas em meios contendo 100 ng/mL de IL-2 para ativação ou repouso durante a noite sem citocina. As células NK ativadas por IL-2 foram usadas dentro de 24- 48 horas após a ativação.
[0263] As células cancerígenas humanas que expressam um antígeno tumoral foram colhidas e ressuspensas em meios de cultura a 2x10 6 células/mL. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs direcionados ao antígeno tumoral foram diluídos em meio de cultura. As células NK ativadas foram colhidas, lavadas e ressuspensas a 2x106 células/mL em meio de cultura. As células cancerígenas foram então misturadas com anticorpos monoclonais/TriNKETs e células NK ativadas na presença de IL-2. Brefeldin-A e monensina também foram adicionadas à cultura mista para bloquear o transporte de proteínas para fora da célula, para coloração de citocinas intracelulares. Adicionou-se anti-CD107a conjugado com fluoróforo à cultura mista e a cultura foi incubada durante 4 horas antes das amostras serem preparadas para análise FACS usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, CD56 e IFN-gama. A coloração de CD107a e IFN-gama foi analisada em células CD3- CD56+ para avaliar a ativação de células NK. O aumento nas células duplamente positivas para CD107a/IFN-gama é indicativo de uma melhor ativação das células NK através do envolvimento de dois receptores de ativação em vez de um receptor.
[0264] Os TriNKETs mediam a ativação de células NK humanas cocultivadas com células SkBr-3 que expressam HER2 (FIG. 47A), células Colo201 (FIG. 47B) e células HCC1954 (FIG. 47C), respectivamente, conforme indicado por um aumento da desgranulação de CD107a e produção de IFN-gama. As células SkBr-3 e as células HCC1954 têm altos níveis de expressão de superfície HER2 e Colo201 tem expressão média de HER2. Comparados ao anticorpo monoclonal trastuzumab, os TriNKETs mostram ativação superior de células NK humanas na presença de células cancerígenas humanas. As células NK sozinhas, as células NK mais as células SkBr-3 são usadas como controles negativos.
[0265] Os TriNKETs (C26-TriNKET-HER2 e F04-TriNKET-HER2) mediam a ativação de células NK humanas cocultivadas com células AML Mv4-11 humanas que expressam CD33 e mostraram um aumento na desgranulação de CD107a e na produção de IFN-gama. Comparados ao anticorpo monoclonal anti-CD33, os TriNKETs (C26-TriNKET-HER2 e F04-TriNKET-HER2) mostraram uma ativação superior das células NK humanas na presença de células cancerígenas humanas que expressam HER2 (FIG. 47A-47C). As células NK humanas primárias são ativadas por TriNKETs em cocultura com o alvo que expressa as linhagens celulares de câncer humano
[0266] A cocultura de células NK humanas primárias com células cancerígenas humanas CD20 positivas resultou na ativação mediada por TriNKET de células NK humanas primárias (FIG. 62). Os TriNKETs que direcionam CD20 (por exemplo, C26-TriNKET-CD20 e F04-TriNKET-CD20), mediaram a ativação de células NK humanas cocultivadas com células Raji CD20-positivas, como indicado por um aumento na desgranulação de CD107a e produção de citocinas IFNγ (FIG. 62). Comparado ao anticorpo monoclonal Rituximab, ambos os TriNKETs (por exemplo, C26-TriNKET-CD20 e F04-TriNKET-CD20) mostraram ativação superior das células NK humanas (FIG. 62). Rituximab_vH
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYP
GN CDR1 CDR2
GDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYF NVWGAGTTVTVSA (SEQ ID NO:84) CDR3 Rituximab_vL
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLAS
GVP CDR1 CDR2 VRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:85) CDR3
[0267] A cocultura de células NK humanas primárias com células de mieloma MM.1S BCMA positivas resultou na ativação mediada por TriNKET das células NK humanas primárias. Os TriNKETs que direcionam BCMA (por exemplo, C26-TriNKET-BCMA e F04-TriNKET-BCMA), mediaram a ativação de células NK humanas cocultivadas com células de mieloma MM.1S, como indicado por um aumento na desgranulação de CD107a e produção de citocinas IFNγ (FIG. 63). Comparado ao isotipo TriNKET, os TriNKETs direcionados ao BCMA (por exemplo, A44-TriNKET-BMCA, A49-TriNKET-BMCA, C26-TriNKET-BMCA, F04-TriNKET- BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F47-TriNKET-BMCA, e F63- TriNKET-BMCA) mostraram aumento na atividade das células NK (FIG. 63). Exemplo 12 – Proteínas de ligação triespecíficas permitem citotoxicidade de células cancerígenas alvo
[0268] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK (CD3 - CD56+) foram isoladas usando seleção negativa com grânulos magnéticos de PBMCs, e a pureza das células NK isoladas era tipicamente >90%. As células NK isoladas foram cultivadas em meios contendo 100 ng/mL de IL-2 para ativação ou repouso durante a noite sem citocina. As células NK ativadas por IL-2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade.
[0269] Para testar a capacidade das células NK humanas de lisar células cancerígenas na presença de TriNKETs, foi usado um ensaio de citotoxicidade não radioativa cyto Tox 96 da Promega (G1780), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células cancerígenas humanas que expressam um antígeno tumoral foram colhidas, lavadas e ressuspensas em meios de cultura a 1- 2x105/mL. As células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas, lavadas e ressuspensas a 105-2,0x106 células/mL no mesmo meio de cultura que o das células cancerígenas. Em cada poço de uma placa de 96 poços, 50 µl da suspensão de células cancerígenas foram misturados com 50 µl de suspensão de células NK com ou sem TriNKETs que direcionam o antígeno tumoral expresso nas células cancerígenas. Após incubação a 37 °C com 5% de CO 2 por 3 horas e 15 minutos, foi adicionado tampão de lise 10x aos poços contendo apenas células cancerígenas e aos poços contendo apenas meios para lise máxima e controles de reagente negativo, respectivamente. A placa foi então colocada de volta na incubadora por mais 45 minutos para atingir um total de 4 horas de incubação. As células foram então sedimentadas e o sobrenadante da cultura foi transferido para uma nova placa de 96 poços e misturado com um substrato para desenvolvimento. A nova placa foi incubada por 30 minutos à temperatura ambiente e a absorvância foi lida a 492 nm em um SpectraMax i3x. A porcentagem de lise específica das células cancerígenas foi calculada da seguinte forma: % de Lise específica = ((lise experimental – lise espontânea apenas de células NK – lise espontânea apenas de células cancerígenas)/(Lise máxima – controle de reagente negativo)) x 100%.
[0270] Os TriNKETs mediam a citotoxicidade de células NK humanas contra a linhagem celular AML humana Molm-13 CD33 positiva. Conforme mostrado na FIG. 53B, as células NK humanas em repouso foram misturadas com células cancerígenas Molm-13, e TriNKETs (por exemplo, C26-TriNKET-CD33 e F04- TriNKET-CD33) são capazes de aprimorar a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso de maneira responsiva à dose contra as células cancerígenas. A linha pontilhada indica a atividade citotóxica de células NK em repouso sem TriNKETs. As células NK humanas ativadas foram misturadas com as células cancerígenas Molm-13 e os TriNKETs aprimoram ainda mais a atividade citotóxica das células NK humanas ativadas, em comparação com um anticorpo anti-CD33, de maneira responsiva à dose contra as células cancerígenas (FIG. 53B).
[0271] Os TriNKETs aumentam a citotoxicidade das células NK contra alvos com baixa expressão superficial em comparação com a atividade citotóxica de trastuzumab, um anticorpo monoclonal anti-HER2. As células NK humanas em repouso foram misturadas com células tumorais SkBr que expressam HER2 e células cancerígenas 786-O que expressam HER2 e a capacidade do TriNKETs de aumentar a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso contra as altas e baixas células cancerígenas que expressam HER2 em uma maneira responsiva à dose foi testada. As linhas pontilhadas na FIG. 50A e FIG. 50B indicam a atividade citotóxica das células NK em repouso contra as células cancerígenas na ausência de TriNKETs. Conforme mostrado na FIG. 50B, ao misturar células NK humanas ativadas com baixas células 786-O que expressam HER2 e o TriNKET (por exemplo, CD26-TriNKET-HER2 e F04-TriNKET-HER2) com atividade citotóxica responsiva à dose das células NK humanas ativadas contra as células cancerígenas foi observado.
[0272] A lise mediada por TriNKET de células de mieloma BCMA positivo foi testada. A FIG. 64 mostra a lise mediada por TriNKET de células de mieloma KMS12-PE BCMA positivo por células efetoras NK humanas em repouso. Dois TriNKETs (cFAE-A49.801 e cFAE-A49.901) usando o mesmo domínio de ligação ao NKG2D (A49), mas diferentes domínios de direcionamento ao BCMA foram testados quanto à eficácia in vitro. Ambos os TriNKETs aprimoraram a lise de células NK de células KMS12-PE em uma extensão semelhante, mas os TriNKETs que usam o domínio de direcionamento ao EM-901 forneceram aumento de potência.
[0273] A FIG. 65 mostra a atividade citotóxica de vários TriNKETs usando diferentes domínios de ligação ao NKG2D (A40, A44, A49, C26 e F47), mas o mesmo domínio de direcionamento ao BCMA. A alteração do domínio de ligação ao NKG2D do TriNKET direcionado ao BCMA produziu variações na morte máxima, bem como na potência dos TriNKETs. Todos os TriNKETs demonstraram aumento da morte de células alvo KMS12-PE em comparação com o anticorpo monoclonal EM-901 (FIG. 65). Exemplo 13
[0274] A ativação sinérgica de células NK humanas através da reticulação de NKG2D e CD 16 foi investigada. Ensaio de ativação de células NK humanas primárias
[0275] As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue humano periférico usando centrifugação em gradiente de densidade. As células NK foram purificadas a partir de PBMCs usando grânulos magnéticos negativos (StemCell # 17955). As células NK eram >90% CD3-CD56+ conforme determinado por citometria de fluxo. As células foram então expandidas 48 horas em meios contendo 100 ng/mL de hIL-2 (Peprotech #200-02) antes do uso em ensaios de ativação. Os anticorpos foram revestidos em uma placa de fundo plano de 96 poços a uma concentração de 2 µg/ml (anti-CD16, Biolegend # 302013) e 5 µg/mL (anti-NKG2D, R&D #MAB139) em 100 µl de PBS estéril durante a noite a 4 °C seguido de lavagem completa dos poços para remover o excesso de anticorpo. Para a avaliação da desgranulação, as células NK ativadas por IL-2 foram ressuspensas a 5×105 células/ml em meio de cultura suplementado com 100 ng/mL de hIL2 e 1 µg/mL de mAb anti-CD107a conjugado com APC (Biolegend # 328619). Adicionaram-se 1×105 células/poço às placas revestidas com anticorpo. Os inibidores de transporte de proteínas Brefeldin A (BFA, Biolegend # 420601) e Monensin (Biolegend # 420701) foram adicionados a uma diluição final de 1:1000 e 1:270, respectivamente. As células revestidas foram incubadas por 4 horas a 37 °C em 5% de CO2. Para coloração intracelular de IFN-γ, as células NK foram marcadas com mAb anti-CD3 (Biolegend # 300452) e anti-CD56 (Biolegend # 318328) e subsequentemente fixadas e permeabilizadas e marcadas com mAb anti-IFN-γ (Biolegend # 506507). As células NK foram analisadas quanto à expressão de CD107a e IFN-γ por citometria de fluxo após a separação de células CD56+CD3- vivas.
[0276] Para investigar a potência relativa da combinação de receptores, foi realizada a reticulação de NKG2D ou CD16 e a reticulação de ambos os receptores por estímulo ligado à placa. Conforme mostrado na Figura 45 (FIGs. 45A-45C), o estímulo combinado de CD16 e NKG2D resultou em níveis altamente elevados de CD107a (desgranulação) (FIG. 45A) e/ou produção de IFN-γ (FIG. 45B). As linhas pontilhadas representam um efeito aditivo de estímulos individuais de cada receptor.
[0277] Os níveis de CD107a e a produção de IFN-γ intracelular de células NK ativadas por IL-2 foram analisados após 4 horas de estímulo ligado à placa com anti-CD16, anti-NKG2D ou uma combinação de ambos os anticorpos monoclonais.
Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. FIG. 45A demonstra níveis de CD107a; FIG. 45B demonstra níveis de IFNγ; FIG. 45C demonstra níveis de CD107a e IFN- γ. Os dados mostrados nas FIGs. 45A-45C são representativos de cinco experimentos independentes, usando cinco doadores saudáveis diferentes.
[0278] A desgranulação de CD107a e a produção de IFN-γ intracelular de células NK ativadas por IL-2 foram analisadas após 4 horas de estímulo ligado à placa com trastuzumab, anti-NKG2D ou TriNKET derivado dos domínios de ligação do trastuzumab e do anticorpo anti-NKG2D (FIG. 46). Em todos os casos, os anticorpos testados eram do isotipo IgG1 humano. Os gráficos indicam a média (n = 2) ± DP. Exemplo 14 Avaliação da ligação do TriNKET ao NKG2D humano expresso em células
[0279] As células EL4 transduzidas com NKG2D humano foram usadas para testar a ligação ao NKG2D humano expresso em células. Os TriNKETs foram diluídos para 20 µg/mL e depois diluídos em série. As diluições de mAb ou TriNKET foram usadas para colorir células, e a ligação do TriNKET ou mAb foi detectada usando um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, o MFI de ligação foi normalizado para controles secundários de anticorpos para obter valores de "fold over background". Avaliação da ligação do TriNKET aos antígenos de câncer humano expresso em células
[0280] As linhagens celulares de câncer humano que expressam CD33 ou HER2 foram usadas para avaliar a ligação ao antígeno tumoral de TriNKETs derivada de diferentes clones direcionados ao NKG2D. A linhagem celular AML humana MV4-11 foi usada para avaliar a ligação de TriNKETs ao CD33 expresso em células. A linhagem celular de carcinoma de células renais humana 786-O expressa baixos níveis de HER2 e foi usada para avaliar a ligação do TriNKET ao HER2 expresso em células. Os TriNKETs foram diluídos para 20 µg/mL e foram incubados com as respectivas células. A ligação do TriNKET foi detectada usando um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado com fluoróforo. As células foram analisadas por citometria de fluxo, o MFI de ligação ao CD33 e HER2 expressos em células foi normalizado para controles secundários de anticorpos para obter valores de "fold over background". Determinação da capacidade de ligação ao anticorpo de linhagens celulares humanas de câncer HER2 positivo
[0281] A capacidade de ligação ao anticorpo (ABC) das linhagens celulares humanas de câncer HER2 positivo foi medida. Foi usado o kit Quantum Simply Cellular da Bangs Lab (#815) e as instruções do fabricante foram seguidas para a preparação de grânulos marcadas com anticorpos. Resumidamente, cada uma das quatro populações de grânulos foi corada com uma quantidade saturante de anticorpo anti-HER2, e as populações de células também foram coradas com uma quantidade saturante do mesmo anticorpo. Os dados da amostra foram adquiridos para cada população de grânulos, bem como as populações de células. A planilha QuickCal, fornecida com o kit, foi usada para a geração de uma curva padrão e extrapolação dos valores ABC para cada uma das linhagens celulares. Ativação de células NK primárias por TriNKETs
[0282] As PBMCs foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. As células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com grânulos magnéticos; a pureza das células NK isoladas era tipicamente >90% CD3-CD56+. As células NK isoladas foram cultivadas em meios contendo 100 ng/mL de IL-2 para ativação ou repouso durante a noite sem citocina. As células NK ativadas por IL-2 foram usadas 24-48 horas depois; as células NK em repouso foram sempre usadas no dia após a purificação.
[0283] As linhagens celulares de câncer humano que expressam um alvo de câncer de interesse foram colhidas da cultura e as células foram ajustadas para 2x106 células/mL. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs direcionados ao alvo de câncer de interesse foram diluídos em meio de cultura. As células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas da cultura, as células foram lavadas e ressuspensas a 2x106 células/mL em meio de cultura. IL-2 e anti-CD107a conjugado com fluoróforo foram adicionados às células NK para a cultura de ativação. Brefeldin-A e monensina também foram diluídas no meio de cultura para bloquear o transporte de proteínas para fora da célula, para coloração de citocinas intracelulares. Em uma placa de 96 poços, 50 µl de alvos tumorais, mAbs/TriNKETs, BFA/monensina e células NK foram adicionados para um volume total de cultura de 200 µl. A placa foi cultivada por 4 horas antes das amostras serem preparadas para análise FACS.
[0284] Após a cultura de ativação de 4 horas, as células foram preparadas para análise por citometria de fluxo usando anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, CD56 e IFNγ. A coloração de CD107a e IFNγ foi analisada em populações CD3-CD56+ para avaliar a ativação de células NK. Ensaio de citotoxicidade em células NK humanas primárias
[0285] As PBMCs foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. As células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com grânulos magnéticos, a pureza das células NK isoladas era tipicamente >90% CD3-CD56+. As células NK isoladas foram cultivadas em meios contendo 100 ng/mL de IL-2 ou colocadas em repouso durante a noite sem citocina. As células NK ativadas por IL- 2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade. Ensaio de liberação Cyto Tox 96 LHD:
[0286] A capacidade das células NK humanas de lisar células tumorais foi medida com ou sem a adição de TriNKETs usando o ensaio de citotoxicidade não radioativa cyto Tox 96 da Promega (G1780). As linhagens celulares humanas de câncer que expressam um alvo de câncer de interesse foram colhidas da cultura, as células foram lavadas com PBS e ressuspensas no meio de cultura a 1-2x105 células/mL para uso como células alvo. Foram adicionados 50 µL da suspensão de células alvo a cada poço. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs que direcionam um antígeno de câncer de interesse foram diluídos no meio de cultura, 50 µl de mAb diluído ou TriNKET foram adicionados a cada poço. As células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas da cultura, as células foram lavadas e ressuspensas a 105 - 2,0x106 células/mL em meio de cultura, dependendo da razão E:T desejada. Foram adicionados 50 µL de células NK a cada poço da placa para produzir um total de 150 µL de volume de cultura. A placa foi incubada a 37 oC com 5% de CO2 por 3 horas e 15 minutos. Após a incubação, foi adicionado tampão de lise 10x apenas aos poços das células alvo e apenas aos poços contendo o meio, para lise máxima e controles de volume. A placa foi então colocada de volta na incubadora por mais 45 minutos para produzir um total de 4 horas de incubação antes do desenvolvimento.
[0287] Após a incubação, a placa foi removida da incubadora e as células foram sedimentadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 50 µl de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa e 50 µl de solução de substrato foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada por 30 minutos à temperatura ambiente. Foram adicionados 50 µL de solução de parada a cada poço e a absorvância foi lida a 492 nm em um SpectraMax i3x. % de Lise específica foi calculada da seguinte forma: % de Lise específica = ((Liberação experimental – Liberação espontânea do efetor – Liberação espontânea do alvo)/(Liberação máxima – Liberação espontânea)) * 100%. Ensaio de citotoxicidade DELFIA:
[0288] As linhagens celulares de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram colhidas da cultura, as células foram lavadas com PBS e ressuspensas em meios de crescimento a 106 células/mL para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para a marcação das células alvo. Após a marcação, as células foram lavadas 3x com PBS e ressuspensas em 0,5 - 1,0x105 células/mL em meio de cultura. Para preparar os poços de fundo, uma alíquota das células marcadas foi deixada de lado e as células foram removidas do meio. 100 µl do meio foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicado para evitar perturbar as células sedimentadas. Foram adicionados 100 µL de células marcadas com BATDA a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram salvos para liberação espontânea das células alvo e os poços foram preparados para lise máxima das células alvo por adição de 1% de Triton-X. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos no meio de cultura e 50 µl de mAb diluído ou TriNKET foram adicionados a cada poço. As células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas da cultura, as células foram lavadas e ressuspensas a 10 5 - 2,0x106 células/mL em meio de cultura, dependendo da razão E:T desejada. Foram adicionados 50 µL de células NK a cada poço da placa para produzir um total de 200 µL de volume de cultura. A placa foi incubada a 37 oC com 5% de CO2 por 2-3 horas antes de desenvolver o ensaio.
[0289] Após a cultura durante 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram sedimentadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 20 µl de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante, 200 µl de solução de europium à temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em um agitador de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando os instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. % de Lise específica foi calculada da seguinte forma: % de Lise específica = ((Liberação experimental – Liberação espontânea)/(Liberação máxima – Liberação espontânea)) * 100%. Ensaio de citotoxicidade em PBMC humano a longo prazo:
[0290] As células alvo SkBr-3 foram marcadas com BacMam 3.0 NucLight Verde (#4622) para permitir o rastreamento das células alvo. O protocolo do fabricante foi seguido para a marcação de células-alvo SkBr-3. A anexina V vermelha (Essen Bioscience # 4641) foi diluída e preparada de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs foram diluídos no meio de cultura. 50 µl de mAbs ou TriNKETs, Anexina V e células NK em repouso foram adicionados aos poços de uma placa de 96 poços já contendo células SkBr-3 marcadas; foram adicionados 50 µl de meio de cultura completo para um total de 200 µl de volume de cultura.
[0291] A coleção de imagens foi configurada no IncuCyte S3. As imagens para os canais de fase, verde e vermelho foram coletadas a cada hora, com 2 imagens por poço. A análise das imagens foi realizada no software IncuCyte S3. Máscaras para os canais verde e vermelho foram criadas para contar o número de células tumorais e células positivas para annexin V, respectivamente. Para calcular a % de células alvo Mv4-11 positivas para a anexina V, foi utilizada a seguinte fórmula. % De células SkBr-3 positivas para a Anexina V = ((contagem de objetos sobrepostos)/(contagem de objetos verdes)) * 100%. Comparando um TriNKET direcionado às células cancerígenas HER + com SC2.2
[0292] Um TriNKET direcionado ao HER2 é mais eficaz que o Trastuzumab na redução do número de células SkBr-3 e apenas 60% das células do tempo zero foram deixadas após 60 horas. Um TriNKET da presente divulgação direcionado ao HER2 que expressa células tumorais/cancerosas é mais efetivo que SC2.2 -
uma molécula biespecífica de cadeia única construída a partir de um scFv derivado de trastuzumab ligado ao ULBP-6, um ligante para NKG2D. SC2.2 se liga a células cancerígenas HER2+ e células NK NKG2D+ simultaneamente. Portanto, a eficácia de SC2.2 na redução do número de células cancerígenas HER2+ foi investigada. Ensaios de ativação e citotoxicidade in vitro demonstraram que SC2.2 foi eficaz na ativação e eliminação das células NK. No entanto, SC2.2 falhou em demonstrar eficácia no modelo de tumor subcutâneo RMA/S-HER2. A eficácia de SC2.2 também foi testada in vivo usando um modelo de camundongo singênico com superexpressão de RMA/S-HER2. Neste modelo de camundongo, SC2.2 falhou em demonstrar o controle do crescimento do tumor em comparação com o controle do veículo. Assim, embora SC2.2 tenha sido capaz de ativar e eliminar células NK e se ligar às células cancerígenas HER2+, essas propriedades eram insuficientes para controlar efetivamente o crescimento do tumor HER2+. Avaliação da meia-vida sérica de SC2.2 em camundongos C57Bl/6
[0293] Para determinar a meia-vida sérica de SC2.2 em camundongos C57Bl/6, SC2.2 foi marcado com uma tag fluorescente para rastrear sua concentração in vivo. SC2.2 foi marcado com IRDye 800CW (Licor # 929-70020). A proteína marcada foi injetada por via intravenosa em 3 camundongos C57Bl/6 e o sangue foi retirado de cada camundongo nos momentos indicados. Após a coleta, o sangue foi centrifugado a 1000g por 15 minutos e o soro foi coletado de cada amostra e armazenado a 4 oC até que tivessem sido coletados em todos os momentos.
[0294] O soro foi fotografado usando um sistema de imagem por infravermelho Odyssey CLx, o sinal fluorescente do canal 800 foi quantificado usando o software Image J. As intensidades da imagem foram normalizadas até o primeiro momento e os dados foram ajustados a uma equação de declínio bifásico. Neste sistema experimental, a meia-vida beta de SC2.2 foi calculada em cerca de 7 horas. Teste in vivo de SC2.2 contra tumores subcutâneos RMA/S-HER2
[0295] Um estudo in vivo foi projetado de acordo com a FIGURA 56 para testar a eficácia de SC2.2 contra tumores RMA/S-HER2 subcutâneos. 106 células RMA/S transduzidas com HER2 humano foram injetadas por via subcutânea no flanco de 20 camundongos C57Bl/6. A partir do dia 2 após a inoculação do tumor,
SC2.2 foi administrado diariamente por injeção IP. O SC2.2 foi administrado em concentrações alta e baixa, juntamente com um controle de veículo. A partir do dia 4 após a inoculação do tumor, os tumores foram medidos segunda, quarta e sexta- feira durante o estudo. O volume tumoral foi calculado usando a seguinte fórmula: Volume tumoral = Comprimento x largura x altura Ligação de TriNKETs à células que expressam NKG2D humano
[0296] Foi determinada a capacidade de um TriNKET de se ligar a células que expressam NKG2D humano. A FIGURA 37 e FIGURA 38 mostram ligação responsiva à dose de dois TriNKETs contendo diferentes domínios de ligação a NKG2D. A FIGURA 37 mostra a ligação dos dois TriNKETs quando um domínio de ligação a CD33 é usado como o segundo braço de direcionamento. A FIGURA 38 mostra os mesmos dois domínios de ligação a NKG2D agora emparelhados com um segundo braço de direcionamento HER2. Os seis domínios de ligação a NKG2D mantêm o mesmo perfil de ligação nos dois domínios de direcionamento de tumor. Ligação de TriNKETs à células que expressam antígenos de câncer humano
[0297] Foi determinada a capacidade de um TriNKET de se ligar a células que expressam o antígeno do câncer humano. A FIGURA 41 e FIGURA 42 mostram a ligação de TriNKETs a CD33 expresso em células (FIGURA 41) e HER2 (FIGURA 42). A ligação do TriNKET ao antígeno expresso em células foi consistente entre os domínios de ligação ao NKG2D. TriNKETs ligados a níveis comparáveis como o anticorpo monoclonal precursor. Capacidade de ligação ao anticorpo de linhagens celulares humanas de câncer positivo para HER2
[0298] A Tabela 8 mostra os resultados da quantificação de superfície HER2. As células SkBr-3 e HCC1954 foram identificadas como tendo altos níveis (+++) de superfície HER2. ZR-75-1 e o Colo201 apresentaram níveis médios (++) de superfície HER2 e o 786-O apresentou o nível mais baixo de HER2 (+).
[0299] Tabela 8: ABC das linhagens celulares de câncer positivas para HER2 Linhagem Celular Expressão de HER2 ABC
786-0 Baixo 28,162 Colo201 Meio 273,568 ZR-75-1 Meio 281,026 SkBr-3 Alto 6,820,532 HCC1954 Alto 10,569,869 As células NK humanas primárias são ativadas por TriNKETs em cocultura com linhagens de câncer humanas que expressam níveis variáveis de HER2
[0300] As FIGURAS 47A - 47C demonstram que TriNKETs e trastuzumab foram capazes de ativar células NK humanas primárias em cocultura com células tumorais humanas positivas para HER2, indicadas por um aumento na degranulação de CD107a e na produção de citocinas IFNg. Comparados ao anticorpo monoclonal trastuzumab, ambos os TriNKETs mostraram ativação superior de células NK humanas com uma variedade de células cancerígenas HER2 humanas.
[0301] A FIGURA 47A mostra que as células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células SkBr-3. A FIGURA 47B mostra que as células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células Colo201. A FIGURA 47C mostra que as células NK humanas são ativadas por TriNKETs quando cultivadas com células HCC1954. TriNKETs aumentam a atividade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2
[0302] As FIGURAS 48A - 48B demonstram a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso ou ativadas por IL-2 em cocultura com a linhagem celular AML humana que expressa CD33 MV4-11. A FIGURA 48A mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas em repouso. A FIGURA 48B mostra a ativação mediada por TriNKET de células NK humanas ativadas por IL-2 do mesmo doador. As células NK em repouso mostraram menos produção de IFNγ secundário e degranulação de CD107a do que as células NK ativadas por IL-2. As células NK em repouso mostraram uma mudança maior na produção de IFNγ e desgranulação de CD107a em comparação com as células NK ativadas por IL-2. Células NK ativadas por IL-2 mostram uma porcentagem maior de células que se tornam IFNγ+; CD107a+ após estimulação com TriNKETs. TriNKETs aumentam a citotoxicidade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2
[0303] As FIGURAS 49A - 49B demostram o aumento da atividade citotóxica do TriNKET usando células NK humanas ativadas por IL-2 e em repouso. A FIGURA 49A mostra lise percentual específica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas em repouso. A FIGURA 49B mostra uma lise percentual específica de células tumorais SkBr-3 por células NK humanas ativadas por IL-2. As populações de células NK ativadas por IL-2 e em repouso vieram do mesmo doador. Comparado ao trastuzumab, o TriNKETs responde de maneira mais potente às células SkBr-3 por populações de células NK ativadas ou em repouso. TriNKETs aumentam a citotoxicidade das células NK contra alvos com baixa expressão superficial
[0304] As FIGURAS 50A-50B mostram que os TriNKETs fornecem uma vantagem maior contra câncer HER2 médio e baixo em comparação com o trastuzumab. A FIGURA 50A mostra a eliminação de células tumorais com alta HER2 SkBr-3 por células NK humanas ativadas. A FIGURA 50B mostra a eliminação de células tumorais com baixa HER2-786-O por células NK humanas. Os TriNKETs fornecem uma vantagem maior em comparação ao trastuzumab contra células cancerígenas com baixa expressão de HER2. Os TriNKETs oferecem a maior vantagem contra alvos com baixa expressão superficial. A vantagem dos TriNKETs no tratamento de cânceres com alta expressão de FcR ou em microambientes tumorais com altos níveis de FcR
[0305] A terapia com anticorpos monoclonais foi aprovada para o tratamento de muitos tipos de câncer, incluindo tumores hematológicos e sólidos. Embora o uso de anticorpos monoclonais no tratamento do câncer tenha melhorado os resultados dos pacientes, ainda existem limitações. Estudos mecanísticos demonstraram que os anticorpos monoclonais exercem seus efeitos no crescimento tumoral através de múltiplos mecanismos, incluindo ADCC, CDC, fagocitose e bloqueio de sinal, entre outros.
[0306] Mais notavelmente, acredita-se que o ADCC seja um mecanismo importante através do qual os anticorpos monoclonais exercem seu efeito. O ADCC depende do engate do anticorpo Fc do FcγRIII de baixa afinidade (CD16) na superfície das células natural killer, que mediam a lise direta da célula tumoral. Dentre FcγR, CD16 tem a menor afinidade por IgG Fc, FcγRI (CD64) é o FcR de alta afinidade e se liga com cerca de 1000 vezes mais força a IgG Fc do que CD16.
[0307] O CD64 é normalmente expresso em muitas linhagens hematopoiéticas, como a linhagem mieloide, e pode ser expresso em tumores derivados desses tipos de células, como a leucemia mieloide aguda (AML). As células imunes que se infiltram no tumor, como MDSCs e monócitos, também expressam CD64 e são conhecidas por se infiltrar no microambiente do tumor. A expressão de CD64 pelo tumor ou no microambiente do tumor pode ter um efeito prejudicial na terapia com anticorpos monoclonais. A expressão de CD64 no microambiente do tumor dificulta para esses anticorpos o engate de CD16 na superfície das células NK, pois os anticorpos preferem se ligar ao receptor de alta afinidade. Através do direcionamento de dois receptores de ativação na superfície das células NK, os TriNKETs podem ser capazes de superar o efeito prejudicial da expressão de CD64 na terapia de anticorpos monoclonais. Expressão de FcRγI (CD64) em três linhagens celulares AML
[0308] Um sistema de cultura in vitro foi desenvolvido para testar a atividade de TriNKETs e anticorpos monoclonais contra tumores com altos e baixos níveis de expressão superficial de CD64. Molm-13 e THP-1 são duas linhagens de células AML humanas que têm expressão semelhante da CD33 superficial, mas as células Molm-13 não expressam CD64, enquanto as células THP-1 expressam CD64 em sua superfície (FIGURAS 51A - 51C). Utilizando anticorpos monoclonais ou TriNKETs direcionados ao CD33 alvo, foi testado o efeito da expressão de CD64 pelo tumor na terapia com anticorpos monoclonais ou TriNKET. As FIGURAS 51A - 51C mostram que a expressão do FcRγI de alta afinidade (CD64) em três linhagens celulares AML humanas, linhagem celular Molm-13 (FIGURA 51A), linhagem celular Mv4-11 (FIGURA 51B) e linhagem celular THP-1 (FIGURA 51C). As células Molm-13 não expressam CD64, enquanto as células Mv4-11 têm um nível baixo e THP-1 um nível elevado de CD64 da superfície celular. Os TriNKETs têm uma vantagem em direcionar células tumorais com alta expressão superficial de FcRs
[0309] As FIGURAS 52A - 52B mostram ativação de células NK humanas mediadas por anticorpo monoclonal ou mediada por TriNKET em cocultura com células Molm-13 (FIGURA 52B) ou THP-1 (FIGURA 52A). Um anticorpo monoclonal contra CD33 humano demonstrou boa ativação de células NK humanas, no sistema de cocultura Molm-13, como evidenciado pelo aumento da desgranulação de CD107a e produção de IFNγ. O anticorpo monoclonal não tem efeito no sistema de cocultura THP-1, onde altos níveis de CD64 estão presentes no tumor. Curiosamente, os TriNKETs foram eficazes contra as células Molm-13 (FIGURA 52B) e THP-1 (FIGURA 52A), enquanto os anticorpos monoclonais não conseguem ativar as células NK em cultura com células FcR-Hi THP-1, indicando que os TriNKETs são capazes de superar a ligação ao CD64 no tumor e direcionar efetivamente as células NK para ativação. O direcionamento duplo de dois receptores de ativação nas células NK forneceu uma ligação específica mais forte às células NK. Os anticorpos monoclonais, que apenas visam CD16 nas células NK, podem ser ligados por outros FcRs de alta afinidade e impedir o engate de CD16 nas células NK.
[0310] Os ensaios de citotoxicidade de células NK humanas usando os sistemas de cocultura Molm-13 e THP-1 fornecem evidências adicionais para apoiar a eficácia dos TriNKETs na presença de altos níveis de CD64. Nestes ensaios de citotoxicidade, foi utilizada uma terceira linhagem celular AML humana, Mv4-11. As células Mv4-11 expressam baixos níveis de CD64 e se enquadram entre as células THP-1 e Molm-13 para os níveis de CD64 em sua superfície (FIGURAS 51A - 51C). TriNKETs demonstram eficácia em linhagens celulares AML, independentemente da expressão de FcγRI
[0311] As FIGURAS 53A - 53C mostram ensaios de citotoxicidade humana NK usando as três linhagens celulares AML humanas como alvos. Um anticorpo monoclonal contra CD33 mostra boa eficácia contra células Molm-13 (FIGURA 53B), que não expressam CD64. Células Mv4-11 (FIGURA 53A), que expressam CD64, mas em um nível inferior ao THP-1, mostraram eficácia reduzida com o anti- CD33 monoclonal. As células THP-1 (FIGURA 53C) não mostraram efeito apenas com anti-CD33 monoclonal. Independentemente da expressão de CD64 nas células tumorais, os TriNKETs foram capazes de mediar as respostas das células NK humanas contra todas as células tumorais testadas aqui.
[0312] As FIGURAS 53A - 53C mostram que as células THP-1 foram protegidas contra a terapia de anticorpos monoclonais, devido a altos níveis de expressão de FcR de alta afinidade em sua superfície. O TriNKETs contornou essa proteção direcionando dois receptores de ativação na superfície das células NK. Os dados de citotoxicidade correlacionaram-se diretamente com o que foi visto nos experimentos de ativação de cocultura. Os TriNKETs foram capazes de contornar a proteção da terapia com mAb observada com células THP-1 e induzir a lise mediada por células NK, apesar dos altos níveis de FcR. Eliminação de células B mieloides normais e normais em culturas de PBMC: o TriNKET fornece melhor perfil de segurança através de menos efeitos colaterais fora do tumor no alvo
[0313] As células natural killer e as células T CD8 são capazes de lisar diretamente as células tumorais, embora os mecanismos pelos quais as células NK e as células T CD8 reconheçam as células autóctones normais das tumorais sejam diferentes. A atividade das células NK é regulada pelo equilíbrio de sinais dos receptores de ativação (NCRs, NKG2D, CD16, etc.) e inibitórios (KIRs, NKG2A, etc.). O equilíbrio desses sinais de ativação e inibição permite que as células NK determinem as células autóctones saudáveis a partir de células autóctones estressadas, infectadas por vírus ou transformadas. Esse mecanismo de autotolerância "incorporado" ajudará a proteger o tecido saudável normal das respostas das células NK. Para estender esse princípio, a autotolerância das células NK permitirá que os TriNKETs atinjam antígenos expressos tanto na autóctone como no tumor sem efeitos colaterais fora do tumor ou com uma janela terapêutica aumentada.
[0314] Ao contrário das células natural killer, as células T requerem o reconhecimento de um peptídeo específico apresentado pelas moléculas de MHC para funções de ativação e efetoras. As células T têm sido o principal alvo da imunoterapia, e muitas estratégias foram desenvolvidas para redirecionar as respostas das células T contra o tumor. Os biespecíficos de células T, inibidores de checkpoint e células CAR-T foram todos aprovados pelo FDA, mas frequentemente sofrem de toxicidades limitantes da dose. Os biespecíficos de células T e as células CAR-T trabalham em torno do sistema de reconhecimento TCR-MHC usando domínios de ligação para direcionar antígenos na superfície das células tumorais e usando domínios de sinalização manipulados para transduzir os sinais de ativação na célula efetora. Embora sejam eficazes na obtenção de uma resposta imune antitumoral, essas terapias costumam ser associadas à síndrome de liberação de citocinas (CRS) e a efeitos colaterais fora do tumor no alvo. Os TriNKETs são únicos nesse contexto, pois eles não vão "sobrepor" os sistemas naturais de ativação e inibição de células NK. Em vez disso, os TriNKETs são projetados para influenciar o equilíbrio e fornecer sinais de ativação adicionais às células NK, mantendo a tolerância de NK a uma autóctone saudável.
[0315] As PBMCs foram isoladas do sangue total por centrifugação em gradiente de densidade. Quaisquer glóbulos vermelhos contaminantes foram lisados por incubação em tampão de lise ACK. Os PBMCs foram lavados 3x em PBS e o total de PBMCs foi contado. Os PBMCs foram ajustados para 106 células/mL em meio de cultura celular primário. 1 mL de PBMCs foram semeados em cavidades de uma placa de 24 cavidades, os TriNKETs ou mAbs indicados foram adicionados às culturas de PBMC a 10 µg/mL. As células foram cultivadas durante a noite a 37 oC com CO2 a 5%. No dia seguinte (24 horas depois), as PBMCs foram colhidas da cultura e preparadas para a análise FACS. A porcentagem de CD45+; Células B CD19+ e CD45+; CD33+; células mieloides CD11b + foram analisadas nos diferentes grupos de tratamento.
[0316] As FIGURAS 54B e 54D mostram que as células mieloides autólogas são protegidas das respostas das células NK mediadas por TriNKET. As FIGURAS 54A e 54B mostram que as células B de um doador saudável são sensíveis à lise mediada por TriNKET, enquanto as células mieloides são resistentes à lise de TriNKET. PBMCs tratadas com TriNKETs direcionado a CD20 mostraram frequência reduzida de células B CD19+ com a população de linfócitos CD45+ (FIGURA 54A), mas nenhum efeito na população de linfócitos CD45+, CDD3-, CD56- (FIGURA 54C). Nestas culturas, a frequência de células mieloides CD45+, CD19+ (FIGURA 54B) ou a frequência de células mieloides CD33+, CD 33+, CD11b+ (FIGURA 54D) não foram alteradas. TriNKETs mediam a eliminação de células tumorais SkBr-3 por hPBMC em coculturas de longo prazo Ensaio de citotoxicidade em PBMC humano primário
[0317] A FIGURA 55 mostra a eliminação a longo prazo de células SkBr-3 em cultura com PBMCs humanas. Quando cultivadas sozinhas, as células SkBr-3 proliferam e quase dobram em 60 horas. Quando PBMCs humanos são adicionados às células SkBr-3 em cultura, a taxa de proliferação é atrasada e, quando um isotipo de controle TriNKET direcionado a CD33 é adicionado, a proliferação também é atrasada, mas em menor grau. Quando as culturas são tratadas com Trastuzumab SkBr-3, elas não proliferam e, após 60 horas, apenas 80% das células do tempo zero são deixadas. Como as células SkBr-3 são sensíveis ao bloqueio do sinal HER2, o efeito no crescimento das células SkBr-3 pode ser mediado pelo bloqueio do sinal HER2 ou por funções efetoras de Fc, como o ADCC. Exemplo 15 Eficácia antitumoral de TriNKETs mcFAE-C26.99 in vitro
[0318] Para verificar as atividades de ligação do TriNKET cFAE-C26.99 murino, a ligação direta foi medida em comparação com seus anticorpos monoclonais por ensaios de citometria de fluxo contra células de melanoma B16F10 Tyrp-1-positivas (FIGURA 58A) e a NKG2D murina que superexpressa a linhagem EL4 (EL4-mNKG2D FIGURA 58B).
[0319] Para testar se os TriNKETs mcFAE-C26.99 mantinham a capacidade de mediar a citotoxicidade, foi medido a eliminação de alvos tumorais B16F10 positivos para Tyrp-1 por células NK ativadas por IL-2 de murino. Conforme mostrado na FIGURA 59, células NK murinas aumentaram sua atividade citotóxica na presença de mcFAE-C26.99. É importante ressaltar que o anticorpo monoclonal anti-Tyrp-1 TA99 exibiu apenas efeitos marginais. Citotoxicidade aumentada de NK mediada por TriNKET mcFAE-C26.99
[0320] Cerca de 5x103 células de melanoma B16F10 por poço foram semeadas dois dias antes do ensaio. No dia do experimento, foram adicionadas 5x104 células NK ativadas por IL-2 murinas na presença de anticorpo monoclonal TA99 ou TriNKET mcFAE-C26.99 (mcFAE-C26.99 é um heterodímero de mC26 e TA99 com IgG2c de camundongo como as mutações Fc. Gm referem-se a mutações de heterodimerização usadas para gerar heterodímero). Foram utilizados 20 μg/mL de anticorpos com diluições de quatro vezes. Após 4 horas de cocultura, a porcentagem de citotoxicidade foi avaliada usando o kit CytoTox96 para liberação de LDH. A linha pontilhada representa citotoxicidade basal na ausência de anticorpos. mC26_hvL_mCL (seção em negrito) (aminoácidos sublinhados em itálico são as mutações de heterodimerização usadas para gerar heterodímero):
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLE SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIKRAD
AAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWT DQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:86) mC26_hvH_IgG2CGmB
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDH SGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPW GQGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNS GSLSSGVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVDKKIE PRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVD VSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKE FKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMIKGFL
PAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSRLRVQKSTWERGSLFACS VVHEGLHNHLTTKTISRSLGK (SEQ ID NO:87) TA99_mvL_mCL
DIQMSQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWYQQKQGKSPHLLVYDAKTLA DGVPSRFSGSGSGTQYSLKISSLQTEDSGNYYCQHFWSLPFTFGSGTKLEIKRA DAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSW
TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:88) TA99_mvH_IgG2CGmA
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKTSGFNIKDYFLHWVRQRPDQGLEWIGWINPD NGNTVYDPKFQGTASLTADTSSNTVYLQLSGLTSEDTAVYFCTRRDYTYEKAAL DYWGQGASVIVSSAKTTAPSVYPLAPVCGGTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLT WNSGSLSSGVHTFPALLQSGLYTLSSSVTVTSNTWPSQTITCNVAHPASSTKVD KKIEPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCV VVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMS GKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMIT
GFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYLMYSKLTVQKSTWERGSLF ACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGK (SEQ ID NO:89) Exemplo 16 Eficácia antitumoral de TriNKETs mcFAE-C26.99 in vivo
[0321] Para testar se mcFAE-C26.99 desencadeia funções antitumorais in vivo, os camundongos C57BL/6 foram injetados por via subcutânea com 2x10 5 células tumorais B16F10. Os camundongos foram tratados com o controle de isotipo, anticorpo monoclonal TA99 ou com o TriNKET mNFAF-C26.99. O tratamento com o anticorpo monoclonal TA99 mostrou progressão tumoral semelhante à do grupo controle tratado com o isotipo. No entanto, a administração do TriNKET mcFAE-C26.99 resultou em progressão tardia do tumor em comparação com o grupo tratado com isotipo. Cerca de 2x105 células de melanoma B16F10 foram injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos C57BL/6. No dia 6 após a inoculação do tumor, os ratos foram randomizados (n = 10 por grupo). Os camundongos foram tratados intraperitonealmente com (FIGURA 60A) anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 e anticorpo monoclonal anti-Tyrp-1 de camundongo ou (FIGURA 60B) anticorpo monoclonal de IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 e TriNKET mCFAE-C26.99, injetados na dose de 150 μg (dias 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 21). O crescimento do tumor foi avaliado por 28 dias. Os gráficos mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais.
[0322] Além do modelo subcutâneo de tumor B16F10, o TriNKET mcFAE- C26.99 também foi testado quanto à eficácia do tumor em um cenário de tumor disseminado. 1x105 células B16F10 foram injetadas intravenosamente em camundongos. O tratamento começou no dia 4 ou 7 com uma dose baixa (300 μg/injeção) e alta (600 μg/injeção) de anticorpos. No dia 18 após a inoculação do tumor, as metástases pulmonares foram contadas. O tratamento iniciado nos dias 4 e 7 após a inoculação do tumor resultou em um número reduzido de metástases pulmonares quando o anticorpo monoclonal TA99 ou TriNKET mcFAE-C26.99 foi usado em alta concentração em comparação com o grupo controle tratado com isotipo. Em concentrações baixas, apenas o TriNKET mcFAE-C26.99 diminuiu a carga do tumor (FIGURA 61A). Efeitos semelhantes foram observados quando os anticorpos foram administrados a partir do dia 7 após a inoculação do tumor. No geral, a terapia TriNKET mcFAE-C26.99 resultou em menor número de metástases pulmonares em comparação com o anticorpo monoclonal TA99 em todas as condições testadas. Cerca de 1x105 células de melanoma B16F10 foram injetadas via intravenosa na veia da cauda de camundongos C57BL/6 (n = 8 por grupo). Os camundongos foram deixados sem tratamento ou tratados intraperitonealmente com anticorpo monoclonal de controle (isotipo, clone C1.18.4), anticorpo monoclonal TA99 ou TriNKET TA99 (mcFAE-C26.99). A FIGURA 61A representa a carga tumoral quando os anticorpos foram administrados em uma dose de 150 μg (dias 4, 6, 8, 11, 13, 15). A FIGURA 61B representa carga de tumor quando os anticorpos foram administrados em uma dose de 150 μg (dias 7, 9, 11, 13, 15). 18 dias após o desafio tumoral, os camundongos foram sacrificados e as metástases pulmonares superficiais foram pontuadas. Exemplo 17 Terapias de combinação com TriNKETs mcFAE-C26.99 in vivo
[0323] Os níveis de resposta antitumoral de proteínas multiespecíficas da presente divulgação quando combinados com outro agente antitumoral foram determinados. Para determinar se as respostas imunes antitumorais mediadas pelo mcFAE-C26.99 podem ser amplificadas, foram realizados estudos de combinação usando anticorpos anti-PD-1 ou citocinas IL-2. Os camundongos C57BL/6 foram injetados por via subcutânea com 2x105 células tumorais B16F10. Os camundongos foram tratados com o controle de isotipo, TriNKET mcFAE-C26.99, um anticorpo monoclonal anti-PD-1, ou a combinação de mcFAE-C26.99 e anticorpo monoclonal anti-PD-1. A monoterapia com mcFAE-C26.99 ou anti-PD-1 resultou em 10% de camundongos respondedores. No entanto, a terapia de combinação de mcFAE-C26.99 e anticorpo monoclonal anti-PD-1 atrasou a progressão do tumor e levou a 40% de camundongos respondedores em comparação com o grupo tratado com isotipo. Terapia de combinação com anticorpo monoclonal anti-PD-1
[0324] Cerca de 2x105 células de melanoma B16F10 foram injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos C57BL/6. No dia 6 após a inoculação do tumor, os camundongos foram randomizados (n = 10 por grupo). Os camundongos foram tratados intraperitonealmente com o anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 com o anticorpo monoclonal de IgG2a de rato 2A3 e mcFAE-C26.99; com controles de isotipo e clone de anticorpo monoclonal anti-PD-1 RPM1-14; ou combinação de mcFAE-C26.99 e anticorpo monoclonal anti-PD-1. Os animais foram injetados como indicado acima com doses únicas de 150 µg (mcFAE-C26.99 e C1.18.4) e 200 µg (anticorpo monoclonal anti-PD-1 e 2A3). O crescimento do tumor foi avaliado por 30 dias. Os gráficos nas FIGURAS 66A - 66C mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais. A FIGURA 66A são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 com anticorpo monoclonal 2A3 de IgG2a de rato ou com mcFAE-C26.99. A FIGURA 66B são gráficos de linhas mostrando o tamanho do tumor (mm 3) em camundongos tratados intraperitonealmente com controles de isotipo ou clone de anticorpo monoclonal anti-PD-1 RPM1-14. A FIGURA 66C são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com a combinação de mcFAE-C26.99 e anticorpo monoclonal anti-PD-1. Terapia de combinação com IL-2
[0325] Os efeitos no tamanho do tumor após a administração de uma combinação de mcFAE-C26.99 e IL-2 humana recombinante também foram avaliados. Os camundongos C57BL/6 foram injetados por via subcutânea com 2x105 células tumorais B16F10. Esses camundongos foram tratados com o controle de isotipo, TriNKET mcFAE-C26.99 ou IL-2 individualmente, ou tratados com uma combinação de mcFAE-C26.99 e IL-2. A monoterapia com mcFAE-C26.99 (FIGURA 67A) ou IL-2 (FIGURA 67B) resultou em 10% de camundongos respondedores. No entanto, a terapia de combinação (FIGURA 67C) atrasou a progressão do tumor e levou a 70-90% de camundongos respondedores em comparação com o grupo tratado com isotipo.
[0326] Para este experimento, 2x105 células de melanoma B16F10 foram injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos C57BL/6. No dia 6 após a inoculação do tumor, os camundongos foram randomizados (n = 10 por grupo). Os murganhos foram tratados intraperitonealmente com o anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 ou mcFAE-C26.99; com controle de isotipo ou IL-2; ou com uma combinação de mcFAE-C26.99 e IL-2. Os animais foram injetados como indicado acima com doses únicas de 150 μg (mcFAE-C26.99 e C1.18.4) e 100,000 UI (IL-2, duas vezes por dia). O crescimento do tumor foi avaliado por 40 dias com 3 camundongos do grupo de combinação que permaneceram livres de tumor. Os gráficos mostram curvas de crescimento tumoral de camundongos individuais.
[0327] A FIGURA 67A são gráficos de linhas mostrando o tamanho do tumor (mm3) em camundongos tratados intraperitonealmente com o anticorpo monoclonal IgG2a de camundongo de controle de isotipo C1.18.4 ou com mcFAE-C26.99. A FIGURA 67B são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm 3) em camundongos tratados intraperitonealmente com controle de isotipo ou com IL-2. A FIGURA 67C são gráficos de linhas que mostram o tamanho do tumor (mm 3) em camundongos tratados intraperitonealmente com uma combinação de mcFAE- C26.99 e IL-2. Exemplo 18 Atividade citotóxica de células NK humanas em repouso mediadas por TriNKETs, anticorpos monoclonais ou anticorpos biespecíficos contra células positivas para HER2
[0328] As PBMCs foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. As PBMCs isoladas foram lavadas e preparadas para isolamento de células NK. As células NK foram isoladas usando uma técnica de seleção negativa com grânulos magnéticos; a pureza das células NK isoladas era tipicamente >90% CD3-CD56+. As células NK isoladas foram cultivadas em meios contendo 100 ng/mL de IL-2 ou colocadas em repouso durante a noite sem citocina. As células NK ativadas por IL- 2 ou em repouso foram usadas no dia seguinte em ensaios de citotoxicidade. Ensaio de citotoxicidade DELFIA:
[0329] As linhagens celulares de câncer humano que expressam um alvo de interesse foram colhidas da cultura, as células foram lavadas com PBS e ressuspensas em meios de crescimento a 106 células/mL para marcação com reagente BATDA (Perkin Elmer AD0116). As instruções do fabricante foram seguidas para a marcação das células alvo. Após a marcação, as células foram lavadas 3x com PBS e ressuspensas em 0,5 - 1,0x105 células/mL em meio de cultura. Para preparar os poços de fundo, uma alíquota das células marcadas foi deixada de lado e as células foram removidas dos meios. 100 µl dos meios foram cuidadosamente adicionados aos poços em triplicado para evitar perturbar as células sedimentadas. Foram adicionados 100 µL de células marcadas com BATDA a cada poço da placa de 96 poços. Os poços foram salvos para liberação espontânea das células alvo e os poços foram preparados para lise máxima das células alvo por adição de Triton-X a 1%. Os anticorpos monoclonais ou TriNKETs contra o alvo tumoral de interesse foram diluídos no meio de cultura e 50 µl de mAb diluído ou TriNKET foram adicionados a cada poço. As células NK em repouso e/ou ativadas foram colhidas da cultura, as células foram lavadas e ressuspensas a 10 5 - 2,0x106 células/mL em meios de cultura, dependendo da razão E:T desejada. Foram adicionados 50 µL de células NK a cada poço da placa para produzir um total de 200 µL de volume de cultura. A placa foi incubada a 37°C com CO2 a 5% por 2-3 horas antes de desenvolver o ensaio.
[0330] Após a cultura durante 2-3 horas, a placa foi removida da incubadora e as células foram sedimentadas por centrifugação a 200 g por 5 minutos. 20 µl de sobrenadante da cultura foram transferidos para uma microplaca limpa fornecida pelo fabricante, 200 µl de solução de europium em temperatura ambiente foram adicionados a cada poço. A placa foi protegida da luz e incubada em um agitador de placas a 250 rpm por 15 minutos. A placa foi lida usando os instrumentos Victor 3 ou SpectraMax i3X. A % de Lise específica foi calculada da seguinte forma: % de Lise específica = ((Liberação experimental – Liberação espontânea)/(Liberação máxima – Liberação espontânea)) * 100%. A combinação de anticorpo monoclonal e engatador biespecífico de células NK não recapitula a atividade do TriNKET
[0331] A FIGURA 68 mostra a atividade citotóxica de células NK humanas em repouso mediadas por TriNKETs, anticorpos monoclonais ou anticorpos biespecíficos contra a linhagem celular Colo-201 positiva para HER2. Um TriNKET (ADI-29404 (F04)) direcionado a HER2 induziu a lise máxima de células Colo-201 por células NK humanas em repouso. A mutação D265A foi introduzida no domínio CH2 do TriNKET para revogar a ligação ao FcR. O HER2-TriNKET (ADI-29404 (F04))-D265A falha ao mediar a lise das células Colo-201, demonstrando a importância do direcionamento duplo de CD16 e NKG2D nas células NK. Para demonstrar ainda mais a importância do direcionamento duplo nas células NK, o anticorpo monoclonal Trastuzumab foi usado para direcionar o HER2 e mediar o ADCC pelas células NK, o Trastuzumab sozinho foi capaz de aumentar a lise das células NK das células Colo-201, mas a lise máxima alcançada pelo Trastuzumab sozinho foi cerca de 4x menor em comparação com o TriNKET. Para entender a importância de ter o CD16 e o NKG2D direcionados para a mesma molécula, a atividade do TriNKET (ADI-29404 (F04)) foi comparada à atividade de um anticorpo biespecífico direcionado ao HER2 e NKG2D combinado com Trastuzumab. Quando usada em concentrações equimolares, a combinação de biespecífico e Trastuzumab não foi capaz de mediar a lise máxima das células Colo-201 por células NK humanas em repouso. A falha da combinação Trastuzumab + biespecífico demonstra a importância de conter a ligação triespecífica de TriNKETs em uma molécula. Exemplo 19
[0332] O Exemplo 14 demonstra que HER2-, CD33- e BCMA-TriNKETs aumentaram a citotoxicidade de células NK humanas em repouso e ativadas por IL-2. Este exemplo caracteriza ainda os efeitos dos TriNKETs nas células NK humanas ativadas por IL-12 e IL-15. A citotoxicidade foi medida no contexto de três antígenos diferentes associados ao tumor, HER2, CD33 e BCMA, com células NK isoladas de PBMC humano usando o ensaio de citotoxicidade DELFIA, conforme descrito no Exemplo 14.
[0333] Para medir a citotoxicidade contra células que expressam HER2, as células NK humanas foram cultivadas com IL-2, IL-12 ou IL-15, ou foram deixadas repousar durante a noite sem citocinas. As células NK em repouso ou ativadas por citocina foram cocultivadas com células tumorais 786-O com baixo nível de HER2 na presença de trastuzumab diluído em série ou um HER2-TriNKET derivado de trastuzumab. Conforme mostrado na FIGURA 73A, as células NK humanas em repouso não mostraram eliminação das células alvo 786-O e o trastuzumab não foi capaz de aumentar a lise das células alvo 786-O. O HER2-TriNKET foi capaz de aumentar a lise das células NK em repouso das células alvo 786-O, mas a lise atingiu apenas cerca de 20%. Conforme mostrado nas FIGURAS 73B-D, as células NK ativadas por citocinas mostraram cerca de 20% da lise específica quando cocultivadas com células-alvo 786-O. Ao contrário das células NK em repouso, o trastuzumab foi capaz de aumentar a atividade das células NK ativadas por citocinas para cerca de 40% da lise específica. O HER2-TriNKET melhorou de forma mais potente a lise de células alvo 786-O por células NK ativada por citocina. A lise específica também alcançou um valor máximo mais alto com o HER2- TriNKET em comparação com o trastuzumab com células efetoras NK ativadas por citocinas.
[0334] Para medir a citotoxicidade contra células que expressam CD33, as células NK humanas foram cultivadas com IL-2, IL-12 ou IL-15, ou foram deixadas repousar durante a noite sem citocinas. As células NK em repouso ou ativadas por citocinas foram cocultivadas com células tumorais Molm-13 positivas para CD33 na presença de lintuzumab diluído em série, um anticorpo monoclonal anti-CD33 proprietário ou um CD33-TriNKET derivado do anticorpo anti-CD33 proprietário. Conforme mostrado na FIGURA 74A, as células NK humanas em repouso não demonstraram eliminação de células alvo Molm-13, e ambos os anticorpos monoclonais levaram a apenas um pequeno aumento na lise por células NK das células alvo Molm-13. Conforme mostrado nas FIGURAS 74B-D, o CD33-TriNKET foi capaz de aumentar a lise por células NK em repouso das células alvo Molm-13 para cerca de 30% da lise específica. As células NK ativadas por citocinas mostraram cerca de 35-55% de lise quando cocultivadas com células alvo Molm-
13. Ao contrário das células NK em repouso, ambos os anticorpos monoclonais foram capazes de aumentar a atividade das células NK ativadas por citocinas para cerca de 60-70% de lise específica. O CD33-TriNKET melhorou de forma mais potente a lise de células alvo Molm-13 por células NK ativada por citocina. A lise específica também alcançou um valor máximo mais alto com o CD33-TriNKET em comparação com qualquer um dos anticorpos monoclonais com células efetoras NK ativadas por citocinas.
[0335] Para medir a citotoxicidade contra células que expressam BCMA, as células NK humanas foram cultivadas com IL-2, IL-12 ou IL-15, ou foram deixadas repousar durante a noite sem citocinas. Células NK em repouso ou ativadas por citocina foram cocultivadas com células tumorais KMS12-PE positivas para BCMA na presença de anticorpo anti-BCMA EM-901 diluído em série ou um BCMA- TriNKET derivado de EM-901. Conforme mostrado na FIGURA 75A, células NK humanas em repouso não demonstraram eliminação de células alvo KMS12-PE, e EM-901 e BCMA-TriNKET mostraram apenas um pequeno aumento na lise por células NK das células alvo KMS12-PE. Conforme mostrado nas FIGURAS 75B-D, as células NK ativadas por citocinas mostraram cerca de 10-40% de lise quando cocultivadas com células-alvo KMS12-PE, o grau de lise variando para células NK tratadas com as diferentes citocinas. Ao contrário das células NK em repouso, o EM-901 foi capaz de aumentar a atividade das células NK ativadas por citocinas para cerca de 40-80% de lise específica dependendo da citocina usada. O BCMA- TriNKET melhorou de forma mais potente a lise de células alvo KMS12-PE por células NK ativada por citocina. A lise específica também alcançou um valor máximo mais alto com o BCMA-TriNKET em comparação com o anticorpo monoclonal precursor com células efetoras NK ativadas por citocinas.
[0336] A pomalidomida é um composto relatado como possuindo atividade imunomoduladora. Para avaliar o efeito da pomalidomida e/ou IL-2 na citotoxicidade das células NK contra células que expressam BCMA, as células NK humanas foram deixadas repousar ou cultivadas com IL-2, pomalidomida ou combinação de IL-2 e pomalidomida durante a noite. Células NK em repouso ou ativadas foram cocultivadas com células alvo KMS12-PE na presença de EM-901 diluído em série ou um BCMA-TriNKET derivado de EM-901. Conforme mostrado na FIGURA 76A, as células NK humanas em repouso não demonstraram eliminação das células alvo KMS12-PE. O EM-901 mostrou apenas um pequeno aumento na lise por células NK das células alvo KMS12-PE, enquanto o BCMA-TriNKET demonstrou lise específica mais alta e mais potente. Conforme mostrado na FIGURA 76B, células NK ativadas por pomalidomida mostraram lise semelhante de células alvo KMS12- PE que células NK em repouso. O BCMA-TriNKET aumentou a lise das células alvo pelas células NK ativadas por pomalidomida em um grau maior do que o aumento da lise pelas células NK em repouso. Conforme mostrado na FIGURA 76C, as células NK ativadas por IL-2 lisaram cerca de 20% das células alvo na cocultura. O EM-901 aumentou a lise de células NK das células-alvo KMS12-PE para cerca de 40%, enquanto o BCMA-TriNKET aumentou a lise específica para cerca de 60%. Portanto, as células NK foram mais ativas após o tratamento com IL-2 em comparação com o tratamento com pomalidomida. Quando a IL-2 e a pomalidomida são combinadas para a ativação das células NK, as células NK demonstram atividade ainda maior de cerca de 30% de lise específica. O EM-901 aumentou a lise das células NK ativadas por IL-2/pomalidomida para cerca de 60%, e o BCMA-
TriNKET aumentou a lise para cerca de 80%. Este resultado demonstrou maior potência de um TriNKET comparado ao seu anticorpo precursor e é consistente com as outras condições testadas neste exemplo. Exemplo 20
[0337] Este exemplo mostra a citotoxicidade de células T CD8 + humanas contra células-alvo que expressam HER2 na presença de um pembrolizumab de anticorpo anti-PD-1 e HER2-TriNKET.
[0338] Brevemente, as PBMCs humanas foram isoladas das camadas leucoplaquetárias de sangue periférico humano usando centrifugação em gradiente de densidade. PBMCs isoladas foram estimuladas com 1 µg/ml de Concanavalina A (ConA) a 37 oC por 18 horas. Em seguida, a ConA foi removida e as PBMCs foram cultivadas com 25 U/ml de IL-2 a 37oC por 4 dias. As células T CD8+ foram purificadas usando um método de seleção negativa com esferas magnéticas. As células T CD8+ purificadas foram cultivadas em meios contendo 10 ng/ml de IL-15 a 37oC por 3-14 dias.
[0339] A pureza da população celular, bem como a expressão de NKG2D, CD16 e PD-1, foram avaliadas. Resumidamente, as células foram coradas com anticorpos conjugados com fluoróforo contra CD3, CD8, CD56, CD4, NKG2D e CD16 e analisadas por citometria de fluxo. Conforme mostrado na FIGURA 77A, as células T CD8+ eram de alta pureza. As células T CD3+CD8+ eram uniformemente positivas para NKG2D e negativas para CD16. Cerca de 20% das células T CD3+CD8+ expressaram PD-1.
[0340] A linhagem celular de câncer humano HCC1954 que expressava HER2, transduzida com BacMam 3.0 NucLight Verde (#4622) para permitir o rastreamento das células, foi usada como células alvo. As células foram coradas com anticorpos conjugados com fluoróforo contra HER2 e PD-L1, e a expressão de HER2 e PD-L1 foi analisada por citometria de fluxo. Conforme mostrado na FIGURA 77B, a expressão de HER2 e PD-L1 foi detectada nas células HCC1954.
[0341] O efeito de um HER2-TriNKET, pembrolizumab e uma combinação dos mesmos na citotoxicidade das células T foi avaliado usando um ensaio de citotoxicidade de células T CD8+ a longo prazo. Resumidamente, as células alvo HCC1954 foram colhidas da cultura, lavadas, ressuspensas em meio de crescimento e plaqueadas a 5,000 células/poço em uma placa de 96 poços. A placa foi incubada a 37 oC com CO2 a 5% durante a noite. O HER2-TriNKET, pembrolizumab e seus respectivos controles de isotipo foram diluídos em meio de cultura. 50 µl de anticorpos e TriNKETs combinados foram adicionados a cada poço. As células T efetoras CD8+ foram colhidas da cultura, lavadas e ressuspensas a 1x106 células/mL (para a razão E:T de 10:1) ou 2,5x106 células/mL (para a razão E:T de 25:1) no meio de cultura. 50 µl de células T CD8 + foram adicionados a cada poço da placa para produzir um total de 200 µl de volume de cultura em cada poço. A placa foi incubada a 37 oC com CO2 a 5% por até 7 dias. As imagens nos canais de fase e verde foram coletadas a cada hora, com 2 imagens por poço, utilizando um instrumento IncuCyte S3. As imagens foram analisadas no software IncuCyte S3. O número de células tumorais vivas nos poços foi representado pela contagem de objetos verdes.
[0342] Conforme mostrado na FIGURA 78A, a combinação de 20 nM HER2- TriNKET e 6,7 nM, 20 nM ou 67 nM de pembrolizumab mostrou um efeito de eliminação tumoral mais forte do que o HER2-TriNKET ou pembrolizumab isoladamente. O efeito da combinação foi mais substancial com maior razão E:T e aumento da concentração de pembrolizumab. Um efeito de combinação semelhante foi observado com células T CD8+ efetoras isoladas de um doador diferente, quando o HER2-TriNKET foi usado em uma dose baixa de 0,04 nM e o pembrolizumab foi usado em 67 nM (FIGURA 78B). Exemplo 21
[0343] Este exemplo mostra a citotoxicidade de PBMCs humanas contra uma linhagem celular de câncer de mama humana Skbr-3 que expressa HER2 na presença de um HER2-TriNKET e um agonista de TLR (Invivogen TL8-506).
[0344] Resumidamente, as células Skbr-3 foram transduzidas para expressar estavelmente NucLight Verde (Essen BioScience 4475). Após a seleção da puromicina, as células foram colhidas da cultura e ressuspensas em meio de cultura. Adicionaram-se 3x103 células alvo a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano em 100 µl de meio. A placa foi incubada a 37 oC com CO2 a 5% por 20 horas.
[0345] Adicionaram-se 50 µL de HER2-TriNKET e/ou agonista de TLR diluído em meio de cultura em concentrações finais de ensaio de 10 µg/ml e 50 µg/ml, respectivamente. PBMCs humanos processados recentemente foram ressuspensos em 1,2x106 células/mL em meio de cultura, e 50 µl das PBMCs foram adicionados a todos os poços, exceto no grupo controle somente alvo (que recebeu 50 µl do meio de cultura). A placa foi colocada no instrumento Incucyte (Essen BioScience) durante o ensaio, com imagens de fase e verde fluorescentes adquiridas a cada hora por quatro dias. As contagens de células foram obtidas usando máscaras de eventos verdes com restrições mínimas de área para excluir detritos. A contagem de células em cada ponto do tempo foi normalizada até a contagem inicial de células verdes SKBR-3 para obter porcentagem de crescimento.
[0346] Conforme mostrado na FIGURA 79, a adição de PBMCs humanos isoladamente não exerceu efeito sobre a proliferação de células-alvo SKBR-3, mas a inclusão simultânea do HER2-TriNKET na cultura permitiu que os PBMCs inibissem substancialmente o crescimento de células tumorais. Na dose testada, o agonista do TLR estimulou os PBMCs a reduzir lentamente a população de células SKBR-3 a partir da contagem inicial. A combinação de HER2-TriNKET e agonista de TLR foi a mais potente, facilitando a eliminação de quase todas as células-alvo em 4 dias. Exemplo 22
[0347] O Exemplo 17 demonstra que mcFAE-C26.99 TriNKET suprimiu o crescimento tumoral sozinho ou em combinação com IL-2 ou com um anticorpo monoclonal anti-PD-1 no modelo de camundongo de xenoenxerto de células tumorais B16F10. Este exemplo caracteriza ainda a combinação de mcFAE-C26.99 TriNKET com IL-12.
[0348] Brevemente, 2x105 células de melanoma B16F10 foram injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos C57BL/6. No dia 5 após a inoculação do tumor, os camundongos foram randomizados (n = 10 por grupo). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com (A) 7,5 mg/kg TriNKET mcFAE-C26.99 ou 7,5 mg/kg de anticorpo monoclonal IgG2a de controle de isotipo de camundongo C1.18.4, (B) 1 µg de IL-12 murino recombinante (rmIL-12) ou 7,5 mg/kg de anticorpo monoclonal IgG2a de controle de isotipo de camundongo C1.18.4 ou (C) uma combinação de 7,5 mg/kg de m TriNKET cFAE-C26.99 e 1 µg de rmIL-12. O crescimento do tumor foi avaliado por 61 dias e a sobrevivência dos camundongos foi monitorada.
[0349] Conforme mostrado nas FIGURAS 80A-C, a monoterapia de TriNKET mcFAE-C26.99 (FIGURA 80A) ou IL-12 murina (FIGURA 80B) foi eficaz por si só na supressão do crescimento do tumor B16F10, mas a terapia de combinação de TriNKET mcFAE-C26.99 e IL -12 (FIGURA 80C) teve um efeito mais substancial, levando à regressão completa do tumor em 40% dos camundongos tratados. Conforme mostrado na FIGURA 81, a sobrevida global foi significativamente estendida pela terapia combinada: 70% dos camundongos tratados com a terapia de combinação ainda estavam vivos no dia 61, enquanto o tempo médio de sobrevida foi de apenas 20 dias no grupo controle e no grupo tratado com TriNKET, e 37 dias no grupo de tratamento com agente único IL-12.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0350] A divulgação completa de cada um dos documentos de patentes e artigos científicos referidos neste documento são incorporados por referência para todos os fins.
EQUIVALENTES
[0351] A invenção pode ser incorporada de outras formas específicas sem se afastar do espírito ou das características essenciais da mesma. As modalidades precedentes devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos ilustrativas ao invés de limitantes da invenção descrita neste documento. O escopo da invenção, portanto, é indicado pelas reivindicações anexadas em vez de sê-lo pela descrição acima, e todas as alterações que vêm dentro do significado e alcance de equivalência das reivindicações destinam-se a serem abrangidas nestas.

Claims (47)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para melhorar a morte celular de tumor direta ou indiretamente, o método caracterizado pelo fato que compreende a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
2. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da região 1 de determinação de complementaridade (CDR1) representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, uma sequência da região 2 de determinação de complementaridade (CDR2) representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 e uma sequência da região 3 de determinação da complementaridade (CDR3) representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 113; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
62.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
62.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
62.
6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
62.
7. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 61 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
62.
8. Método para melhorar a morte celular de tumor direta ou indiretamente, o método caracterizado pelo fato que compreende a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.
9. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos
90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
56.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
56.
12. Método para melhorar a morte celular de tumor direta ou indiretamente, o método caracterizado pelo fato que compreende a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de
STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e o domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
13. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49 e o domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da
CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 95; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
15. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 65; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 66, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 67 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
16. Método para melhorar a morte celular de tumor direta ou indiretamente, o método caracterizado pelo fato que compreende a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115.
17. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 114 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 115.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 123; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 119, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116, uma sequência de CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 118; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 119, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 120 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.
20. Método para melhorar a morte celular de tumor direta ou indiretamente, o método caracterizado pelo fato que compreende a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 124 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125.
21. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um bloqueador de checkpoint, uma citocina, um agonista de TLR, um agonista de STING, um agente quimioterápico, um agente direcionado ao câncer, um vírus oncolítico, uma vacina, radiação, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular, em que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 124 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 125.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117 e uma da CDR3 sequência representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, uma sequência CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e uma sequência CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência da
CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 116, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 117 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 126; e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência da CDR1 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 127, uma sequência da CDR2 representada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 128 e uma sequência da CDR3 representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129.
24. Método para melhorar a morte celular de tumor direta ou indiretamente, o método caracterizado pelo fato que compreende a exposição de um tumor e células natural killer a uma proteína que compreende: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um agonista de TLR, um agonista de STING, um vírus oncolítico, uma vacina, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular.
25. Método para tratar câncer em um sujeito em necessidade do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao sujeito de uma proteína compreendendo: (a) um primeiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a NKG2D; (b) um segundo sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno associado ao tumor; e (c) um domínio Fc do anticorpo ou uma porção do mesmo suficiente para se ligar a CD16, ou um terceiro sítio de ligação ao antígeno que se liga a CD16; ou uma formulação compreendendo a proteína; em combinação com um segundo agente terapêutico selecionado entre: um agonista de TLR, um agonista de STING, um vírus oncolítico, uma vacina, uma terapia adotiva de NK, uma terapia de transplante de células tronco (SCT), terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e um agente que induz senescência celular.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que o bloqueador de checkpoint é selecionado entre: um anticorpo anti-PD1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-KIR, um anticorpo anti-NKG2A, um anticorpo anti-LAG3 e um anticorpo anti-TIM3.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada dentre: heterodímeros IL- 2, IL-15, IL-12, INFα, IL-21, PEG-IL-2 e IL15/IL15R.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que o agonista de TLR é selecionado dentre um agonista de TLR7, um agonista de TLR8, um agonista de TLR7/8, um agonista de TLR9, um agonista de TLR4 e um agonista de TLR3.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que o agonista STING é ADU-S100.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterápico é paclitaxel, nab-paclitaxel ou ciclofosfamida.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que o bloqueador de checkpoint é selecionado dentre: nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab, avelumab, ipilimumab, tremelimumab, lirilumab e monalizumab.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo fato de que o agonista de TLR é selecionado dentre: R848/resiquimod, VTX-2337, imiquimod e oligodesoxinucleotídeo CpG.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-7, 9-11, 13- 15, 17-19 e 21-32, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia mieloide aguda, leucemia mielomonocítica aguda, linfoma de células B, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, linfoma difuso de células B grandes, câncer esofágico, sarcoma de Ewing, linfoma folicular, câncer gástrico, câncer gastrointestinal, tumores estromais gastrointestinais, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, carcinoma de células renais, neuroblastoma, câncer de pulmão de células não pequenas, tumores neuroendócrinos, câncer de ovário e câncer de pâncreas, câncer de próstata, sarcomas, câncer de pulmão de pequenas células, linfoma de células T, câncer de testículo, carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer urotelial, câncer infiltrados por células supressoras derivadas de mieloides, cânceres com deposição de matriz extracelular, cânceres com altos níveis de estroma reativo e cânceres com neoangiogênese.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-33, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno da proteína se liga ao NKG2D em humanos, primatas não humanos e roedores.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-34, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve estão presentes no mesmo polipeptídeo.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-36, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve do primeiro sítio de ligação ao antígeno tem uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do segundo sítio de ligação ao antígeno.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-34, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo de domínio único.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de domínio único é um fragmento VHH ou um fragmento VNAR.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-36, 39 e 40, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é um anticorpo de domínio único.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é um fragmento V HH ou um fragmento
VNAR.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-40, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-43, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado ao tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em EpCAM, CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 e PD-L1.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-44, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende uma porção de um domínio Fc do anticorpo suficiente para se ligar a CD16, em que o domínio Fc do anticorpo compreende domínios de dobradiça e CH2.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-44, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica aos aminoácidos 234-332 de um anticorpo IgG1 humano.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-7, 9-11, 13- 15, 17-19 e 21-46, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
BR112020015994-8A 2018-02-08 2019-02-08 Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer BR112020015994A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862628178P 2018-02-08 2018-02-08
US62/628,178 2018-02-08
PCT/US2019/017284 WO2019157332A1 (en) 2018-02-08 2019-02-08 Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020015994A2 true BR112020015994A2 (pt) 2020-12-15

Family

ID=67548481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020015994-8A BR112020015994A2 (pt) 2018-02-08 2019-02-08 Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20210079102A1 (pt)
EP (1) EP3749347A4 (pt)
JP (2) JP2021512914A (pt)
KR (1) KR20200118824A (pt)
CN (1) CN112040971A (pt)
AU (1) AU2019218125A1 (pt)
BR (1) BR112020015994A2 (pt)
CA (1) CA3090236A1 (pt)
CL (1) CL2020002036A1 (pt)
EA (1) EA202091887A1 (pt)
IL (1) IL276457A (pt)
MX (1) MX2020008333A (pt)
PE (1) PE20210375A1 (pt)
SG (1) SG11202007579TA (pt)
WO (1) WO2019157332A1 (pt)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
SG11202007945UA (en) * 2018-02-20 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
WO2020033664A1 (en) * 2018-08-08 2020-02-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
EA202091888A1 (ru) * 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
CN113286808A (zh) 2018-10-23 2021-08-20 蜻蜓疗法股份有限公司 异二聚体Fc融合蛋白
WO2021138407A2 (en) * 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
JP2023522972A (ja) 2020-04-22 2023-06-01 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のための製剤、投薬量レジメン、及び製造工程
CN113699107B (zh) * 2021-10-27 2022-02-01 东莞再立健生物科技有限公司 一种外周血nkt细胞培养液及培养方法
CN114853905B (zh) * 2022-04-14 2022-11-22 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 一种基因修饰nk细胞与抗体联合使用治疗肿瘤方案

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0906498A2 (pt) * 2008-01-22 2015-07-14 Biogen Idec Inc Anticorpo ron e seus usos
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
LT2970473T (lt) * 2013-03-14 2017-10-25 Bristol-Myers Squibb Company Dr5 agonisto ir anti-pd-1 antagonisto derinys ir naudojimo būdai
JP2018503399A (ja) * 2015-01-14 2018-02-08 コンパス セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 多特異性免疫調節抗原結合構築物
AR100680A1 (es) * 2015-01-26 2016-10-26 Macrogenics Inc Anticuerpos anti-dr5 y moléculas que comprenden dominios de unión de dr5 de los mismos
CA2990511A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
US20180327499A1 (en) * 2015-11-13 2018-11-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti- nkg2d single domain antibodies and uses thereof
EP3419643A4 (en) * 2016-02-24 2020-04-01 Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. SMC COMBINATION THERAPY FOR TREATING CANCER
WO2017165464A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
US11549099B2 (en) * 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
GB201610044D0 (en) * 2016-06-08 2016-07-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2017220988A1 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Multispecific antibodies for immuno-oncology
AU2018219887A1 (en) * 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
WO2019051308A1 (en) * 2017-09-07 2019-03-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. NKG2D, CD16 BINDING PROTEINS AND ANTIGEN ASSOCIATED WITH A TUMOR
CN113286808A (zh) * 2018-10-23 2021-08-20 蜻蜓疗法股份有限公司 异二聚体Fc融合蛋白
PE20221404A1 (es) * 2019-08-30 2022-09-15 Dragonfly Therapeutics Inc Formulaciones farmaceuticas y regimenes de dosificacion para proteinas de union multiespecificas que se unen a her2, nkg2d y cd16 para el tratamiento del cancer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023106601A (ja) 2023-08-01
PE20210375A1 (es) 2021-03-02
US20230227562A1 (en) 2023-07-20
SG11202007579TA (en) 2020-09-29
JP2021512914A (ja) 2021-05-20
EP3749347A4 (en) 2021-11-03
WO2019157332A1 (en) 2019-08-15
IL276457A (en) 2020-09-30
US20210079102A1 (en) 2021-03-18
EP3749347A1 (en) 2020-12-16
US20230303702A1 (en) 2023-09-28
EA202091887A1 (ru) 2020-10-23
KR20200118824A (ko) 2020-10-16
CN112040971A (zh) 2020-12-04
AU2019218125A1 (en) 2020-08-20
MX2020008333A (es) 2020-09-21
CA3090236A1 (en) 2019-08-15
CL2020002036A1 (es) 2021-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11834506B2 (en) Multi-specific binding proteins that bind NKG2D, CD16, and a tumor-associated antigen for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
US20230227562A1 (en) Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16, and a tumor-associated antigen
US20200095327A1 (en) Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
US11884732B2 (en) Proteins binding HER2, NKG2D and CD16
BR112021002278A2 (pt) proteínas que ligam nkg2d, cd16 e um antígeno associado a tumor
BR112019016424A2 (pt) proteínas de ligação a bcma, nkg2d e cd16
BR112020005078A2 (pt) proteínas de ligação a nkg2d, cd16, e molécula 1 semelhante a lecitina de tipo c (cll-1)
BR112021002213A2 (pt) proteínas de ligação multi-específicas que se ligam her2, nkg2d e cd16 e métodos de uso
US20200024353A1 (en) Proteins binding psma, nkg2d and cd16
BR112019017256A2 (pt) proteínas de ligação gd2, nkg2d e cd16
BR112019017237A2 (pt) proteínas que se ligam a cd123, nkg2d e cd16
RU2809125C2 (ru) Полиспецифические связывающие белки для активации клеток-натуральных киллеров и их терапевтическое применение для лечения злокачественного новообразования
EA044644B1 (ru) Комбинированная терапия рака с применением мультиспецифических связывающих белков, которые активируют естественные клетки-киллеры

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]