KR20200118824A - 자연 살해 세포를 활성화시키는 다중-특이성 결합 단백질을 수반하는 암의 병용 요법 - Google Patents

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그레고리 피. 창
안 에프. 청
아샤 그린버그
에바 구티에레즈
윌리암 해니
니콜라이 바그트만
브래들리 엠. 룬드
비안카 프린츠
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드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

종양 연관 항원, NKG2D 수용체 및 CD16에 결합하는 다중-특이성 결합 단백질을 제2 항암제와 병용하는, 암의 병용 요법이 기재된다. 또한 다중-특이성 결합 단백질의 약제학적 조성물, 및 제2 항암제와 병용하는 암 치료에 유용한 치료 방법이 기재된다.

Description

자연 살해 세포를 활성화시키는 다중-특이성 결합 단백질을 수반하는 암의 병용 요법
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2018년 2월 8일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/628,178호의 유익 및 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 모든 목적을 위해 전문이 참조에 의해 원용된다.
기술분야
종양 연관 항원, NKG2D 수용체 및 CD16에 결합하는 다중-특이성 결합 단백질을 제2 항암제와 병용하는 암의 병용 요법이 기재된다. 또한 다중-특이성 결합 단백질의 약제학적 조성물, 및 제2 항암제와 병용하는 암 치료에 유용한 치료 방법이 기재된다.
암은 이 질환을 치료하기 위한 실질적인 연구 노력 및 문헌에 보고된 과학적 진보에도 불구하고 상당한 건강상의 문제로 지속되고 있다. 일부 가장 빈번하게 진단되는 암은 전립선암, 유방암 및 폐암을 포함한다. 전립선암은 남성에서 가장 흔한 형태의 암이다. 유방암은 여성 사망의 주된 원인으로 남아있다. 이들 암에 대한 현재의 치료는 모든 환자에 대해 효과적이지 않고/않거나 실질적인 부작용을 가질 수 있다. 다른 유형의 암은 또한 존재하는 치료적 선택사항을 이용하여 치료하는 데 난제로 남아있다.
암 면역요법은 이들이 고도로 특이적이고 환자 자신의 면역계를 이용하여 암 세포의 파괴를 용이하게 할 수 있기 때문에 바람직하다. 융합 단백질, 예컨대 이중특이성 T-세포 관여자는 종양 세포의 파괴를 용이하게 하기 위해 종양 세포 및 T-세포에 결합하는 문헌에 기재된 암 면역치료제이다. 특정 종양-연관 항원에 그리고 특정 면역 세포에 결합하는 항체는 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어 WO 2016/134371 및 WO 2015/095412 참조.
자연 살해(Natural killer: NK) 세포는 선천성 면역계 성분이며, 순환 림프구의 대략 15%를 구성한다. NK 세포는 사실상 모든 조직을 침윤하며, 본래 사전 민감화에 대한 필요 없이 종양 세포를 효과적으로 사멸시키는 능력을 특징으로 하였다. 활성화된 NK 세포는 세포독성 T 세포와 유사한 수단에 의해 - 즉, 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포독성 과립을 통해서 뿐만 아니라 사멸 수용체 경로를 통해 표적 세포를 사멸시킨다. 활성화된 NK 세포는 또한 표적 조직에 대한 다른 백혈구의 보충을 촉진시키는 염증 사이토카인, 예컨대 IFN-감마 및 케모카인을 분비한다.
NK 세포는 표면 상에서 다양한 활성화 및 저해 수용체를 통해 신호에 반응한다. 예를 들어, NK 세포가 건강한 자가-세포를 만날 때, 이들의 활성은 살해-세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR)의 활성화를 통해 저해된다. 대안적으로, NK 세포가 외래 세포 또는 암 세포와 만날 때, 이들은 이들의 활성화 수용체(예를 들어, NKG2D, NCR, DNAM1)를 통해 활성화된다. NK 세포는 또한 표면 상에서 CD16 수용체를 통해 일부 면역글로불린의 불변 영역에 의해 활성화된다. 활성화에 대한 NK 세포의 전반적 민감도는 자극 신호와 저해 신호의 합에 따른다.
일 양상에서, 본 발명은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질에, 관문 차단제(checkpoint blocker); 사이토카인; TLR 작용제; STING 작용제; 화학치료제; 예를 들어, 키나제 저해제, 예컨대 이브루티닙(Ibrutinib), 베무라페닙(Vemurafenib) 또는 글리벡(Gleevec)을 비롯한, 암 세포 성장 또는 생존에 연루된 암 세포에서 특정 분자를 방해하는 암 표적제; 종양용해 바이러스; 백신; 방사선; 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 변형된 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 비롯한, 생체외에서 확장된 NK 세포의 주입을 수반하는 양자 NK 요법, 생체외에서 확장된 T 세포의 주입을 수반하는 양자 T 세포 요법; 줄기 세포 이식(stem cell transplant: SCT) 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여, 종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질; 또는 단백질을 포함하는 제형을, 관문 차단제; 사이토카인; TLR 작용제; STING 작용제; 화학치료제; 예를 들어, 키나제 저해제, 예컨대 이브루티닙, 베무라페닙 또는 글리벡을 비롯한, 암 세포 성장 또는 생존에 연루된 암 세포에서 특정 분자를 방해하는 암 표적제; 종양용해 바이러스; 백신; 방사선; 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 변형된 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 비롯한, 생체외에서 확장된 NK 세포의 주입을 수반하는 양자 NK 요법, 생체외에서 확장된 T 세포의 주입을 수반하는 양자 T 세포 요법; 줄기 세포 이식(SCT) 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여, 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체, 항-KIR 항체, 항-NKG2A 항체, 항-LAG3 항체 및 항-TIM3 항체로부터 선택된 관문 차단제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을, 인터페론 및 인터류킨, 예컨대 IL-2, IL-15, IL-12, INFα, IL-21, PEG-IL-2(폴리에틸렌 글리콜-변형 인터류킨-2), 및 IL15/IL15R 이형이량체를 포함하는 사이토카인과 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR7/8 작용제, TLR9 작용제, TLR4 작용제 및 TLR3 작용제로부터 선택된 TLR 작용제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 STING 작용제 ADU-S100과 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 알킬화제, 예컨대 사이클로포스파마이드, 메클로르에타민, 클로람부실, 멜팔란, 다카바진(DTIC), 나이트로소유레아, 테모졸로마이드 (경구 다카바진); 안트라사이클린, 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 및 발루비신; 세포골격 붕괴제, 예컨대 파클리탁셀, 납-파클리탁셀(nab-paclitaxel), 도세탁셀, 아브락산, 및 탁소텔; 에포틸론(epothilone); 히스톤 데아세틸라제 저해제, 예컨대 보리노스탯(bortezomib) 및 로미뎁신(romidepsin); 토포아이소머라제 I의 저해제, 예컨대 이리노테칸 및 토포테칸; 토포아이소머라제 II의 저해제, 예컨대 에토포사이드, 테니포사이드 및 타플루포사이드; 키나제 저해제, 예컨대 보르테조밉, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 베무라페닙 및 비스모데깁; 뉴클레오타이드 유사체 및 전구체 유사체, 예컨대 아자시티딘, 아자티오프린, 카펙시타빈; 펩타이드 항생제, 예컨대 블레오마이신 및 악티노마이신; 백금계 제제, 예컨대 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴; 레티노이드, 예컨대 트레티노인 및 알리트레티노인; 및 빈카 알칼로이드 및 유도체, 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하는 화학치료제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 릴리루맙, 및 모날리주맙으로부터 선택된 관문 차단제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 R848/레시퀴모드, VTX-2337, 이미퀴모드, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드로부터 선택된 TLR 작용제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 암세포 상의 종양-연관 항원 및 자연 살해 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체에 결합하는 다중-특이성 결합 단백질, 이러한 다중-특이성 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물, 및 암 치료를 위해 이러한 다중-특이성 단백질 및 약제학적 조성물을 이용하는 치료 방법을 제공한다. 이러한 단백질은 한 가지 초과의 NK 활성화 수용체에 맞물릴 수 있으며, NKG2D에 대한 천연 리간드의 결합을 차단시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질은 인간에서, 그리고 다른 종, 예컨대 설치류 및/또는 사이노몰거스 원숭이에서 NK 세포를 작용화시킬 수 있다. 본 발명의 다양한 양상 및 실시형태는 이하에 추가로 상세하게 기재한다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 혼입시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 동일한 종양-연관 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위; NKG2D에 결합하는 제3 항원 결합 부위; 및 CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부를 포함하는, 3가이다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 동일한 종양-연관 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위; NKG2D에 결합하는 제3 항원 결합 부위 및 제4 항원 결합 부위; 및 CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부를 포함하는, 4가이다.
항원-결합 부위는 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인(예를 들어, 항체에서와 같이 배열되거나, 함께 융합되어 scFv를 형성함)을 혼입시킬 수 있거나, 항원-결합 부위 중 하나 이상은 단일 도메인 항체, 예컨대 낙타과 항체와 같은 VHH 항체 또는 연골어류에서 발견되는 것과 같은 VNAR 항체일 수 있다. 일부 예에서, 종양-연관 항원은 HER2, CD20, CD33, B-세포 성숙 항원 (BCMA), EpCAM, CD2, CD19, CD25, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, CLL1/CLEC12A, FLT3, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4, HLA-E 및 PD-L1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 각각 표 1에 개시된 항원 결합 부위의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 항원 결합 부위의 표1에개시된 바와 같은 중쇄 상보성-결정 영역 1(CDR1), 상보성-결정 영역 2(CDR2), 및 상보성-결정 영역 3(CDR3) 서열 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 113의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 93의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 104의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 103의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 91의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 51의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 94의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 67의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 68의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 63의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 65의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 67의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 68의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 114의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 115의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 122의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 123의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 119의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 120의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 121의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 116의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 118의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 119의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 120의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 121의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 124의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 125의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 122의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 130의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 127의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 128의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 129의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 116의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 126의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 127의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 128의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 129의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 41의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 42의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 43의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 44의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 70의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NKG2D에 결합하는 항원 결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하되, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 71의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 72의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 암을 치료하기 위해 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 다중-특이성 결합 단백질을 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 다중-특이성 결합 단백질을 이용하는 치료를 위한 예시적인 암은, 예를 들어, HER2를 발현시키는 암종을 포함한다.
도 1은 NKG2D-결합 도메인(우측 아암(arm)), 종양 연관 항원-결합 도메인(좌측 아암) 및 CD16에 결합하는 Fc 도메인 또는 이의 일부를 함유하는 다중-특이성 결합 단백질의 표현을 도시한 도면.
도 2는 scFv 형식에서 NKG2D-결합 도메인(우측 아암), 종양 연관 항원-결합 도메인(좌측 아암) 및 CD16에 결합하는 Fc 도메인 또는 이의 일부를 함유하는 다중-특이성 결합 단백질의 표현을 도시한 도면.
도 3은 IgG-유사 형상을 유지하는 3작용성, 이중특이성 항체인 트리오맙(Triomab) 형태의 TriNKET의 표현을 도시한 도면. 이 키메라는 2개의 절반 항체로 이루어지는데, 각각은 2개의 모 항체로부터 유래된 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 가진다. 트리오맙 형태는 ½의 래트 항체 및 ½의 마우스 항체를 함유하는 이형이량체 작제물이다.
도 4는 노브-인투-홀(knobs-into-hole: KIH) 기술을 수반하는 KiH 공통 경쇄(Light Chain: LC) 형태에서 TriNKET의 표현을 도시한 도면. KiH는 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 Fab, 및 이형이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 함유하는 이형이량체이다. KiH 형식에서 TriNKET는 2개의 상이한 중쇄 및 HC 둘 다와 짝지어지는 공통 경쇄를 함유하는 표적 1 및 표적 2에 결합하는 2개의 fab를 갖는 이형이량체 작제물일 수 있다.
도 5는 가요성의 천연 유래 링커를 통해 2개의 단클론성 항체의 표적 결합 도메인을 합하고, 4가 IgG - 유사 분자를 수득하는 이중-가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig(상표명))에서 TriNKET의 표현을 도시한 도면. DVD-Ig(상표명)는 가변 도메인 표적화 항원 2가 Fab 표적화 항원 1 작제물의 가변 도메인의 N 말단에 융합되고 정상 Fc를 함유하는 동형이량체 작제물이다.
도 6은 Fc에 융합된 표적1 및 표적2에 대해 2개의 Fab를 함유하는 이형이량체 작제물인, 직교성 Fab 계면(오쏘-Fab)에서의 TriNKET 표현을 도시한 도면. LC-HC 쌍은 직교성 계면에 의해 보장된다. 이형이량체화는 Fc에서의 돌연변이에 의해 보장된다.
도 7은 투인원(2 in1)Ig 형식의 TrinKET 표현을 도시한 도면.
도 8은 FC에 융합된 표적 1 및 표적 2에 2개의 상이한 Fab 결합을 함유하는 이형이량체 작제물인 ES 형태의 TriNKET 표현을 도시한 도면. 이형이량체화는 Fc에서의 정전기적 스티어링 돌연변이에 의해 보장된다.
도 9는 Fab 아암 교환 형태: 중쇄 및 부착된 경쇄(절반-분자)를 다른 분자로부터의 중쇄-경쇄쌍으로 교환함으로써 Fab 아암을 교환하여, 이중특이성 항체를 초래하는 항체의 TriNKET 표현을 도시한 도면. Fab 아암 교환 형태(cFae)는 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 Fab, 및 이형이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 함유하는 이형이량체이다.
도 10은 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 Fab, 및 이형이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 FC를 함유하는 이형이량체인, SEED Body 형태의 TriNKET 표현을 도시한 도면.
도 11은 류신 지퍼가 2개의 상이한 HC의 이형이량체화를 유도하기 위해 사용되는 LuZ-Y 형태의 TriNKET 표현을 도시한 도면. LuZ-Y 형태는 FC에 융합된 표적 1 및 2에 결합하는 2개의 상이한 scFab를 함유하는 이형이량체이다. 이형이량체화는 FC의 C-말단에 융합된 류신 지퍼 모티프를 통해 보장된다.
도 12는 Cov-X-Body 형태의 TriNKET 표현을 도시한 도면.
도 13A 내지 도 13B는 이형이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc에 융합된 2개의 상이한 Fab를 갖는 이형이량체 작제물인 ĸλ형태의 TriNKET 표현을 도시한 도면: Fab1 표적화 항원 1은 카파 LC를 함유하는 한편, 제2 Fab 표적화 항원 2는 람다 LC를 함유한다. 도 13A는 ĸλ의 한 형태의 예시적 표현이며; 도 13B는 다른 ĸλ의 예시적 표현이다.
도 14는 ELISA 분석에서 인간 재조합 NKG2D에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 결합 친화도를 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 15는 ELISA 분석에서 사이노몰거스 재조합 NKG2D에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 결합 친화도를 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 16은 ELISA 분석에서 마우스 재조합 NKG2D에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 결합 친화도를 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 17은 배경에 대한 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI) 배수를 나타내는 유세포분석에 의한 인간 NKG2D를 발현시키는 EL4 세포에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 결합을 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 18은 배경에 대한 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI) 배수를 나타내는 유세포분석에 의한 마우스 NKG2D를 발현시키는 EL4 세포에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 결합을 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 19는 천연 리간드 ULBP-6과 경쟁함으로써 재조합 인간 NKG2D-Fc에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 특이적 결합 친화도를 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 20은 천연 리간드 MICA와 경쟁함으로써 재조합 인간 NKG2D-Fc에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 특이적 결합 친화도를 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 21은 천연 리간드 Rae-1 델타와 경쟁함으로써 재조합 마우스 NKG2D-Fc에 대한 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 특이적 결합 친화도를 보여주는 그래프를 도시한 도면.
도 22는 인간 NKG2D-CD3 제타 융합 단백질을 발현시키는 TNF-알파 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 NKG2D-결합 도메인에 의한 인간 NKG2D(클론으로서 열거함)의 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 23은 마우스 NKG2D-CD3 제타 융합 단백질을 발현시키는 TNF-알파 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 NKG2D-결합 도메인에 의한 마우스 NKG2D(클론으로서 열거함)의 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 24는 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)에 의한 인간 NK 세포의 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 25는 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)에 의한 인간 NK 세포의 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 26은 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)에 의한 마우스 NK 세포의 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 27은 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)에 의한 마우스 NK 세포의 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 28은 종양 세포 상의 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 세포독성 효과를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 29는 시차 주사 형광측정법에 의해 측정된 NKG2D-결합 도메인(클론으로서 열거함)의 융점을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 30은 다중-특이성 결합 단백질에 의한 인간 NK 세포의 향상된 활성화를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 31은 다중-특이성 결합 단백질은 인간 NK 세포에 의한 종양 표적 세포에 대해 보다 고수준의 세포독성을 유도한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 32는 다중-특이성 결합 단백질은 인간 NK 세포에 의한 종양 표적 세포에 대해 보다 고수준의 세포독성을 유도한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 33은 다중-특이성 결합 단백질은 인간 NK 세포에 의한 종양 표적 세포에 대해 보다 고수준의 세포독성을 유도한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 34는 다중-특이성 결합 단백질은 인간 NK 세포에 의한 종양 표적 세포에 대해 보다 고수준의 세포독성을 유도한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 35는 다중-특이성 결합 단백질은 마우스 NK 세포에 의한 종양 표적 세포에 대해 보다 고수준의 세포독성을 유도한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 36은 다중-특이성 결합 단백질은 마우스 NK 세포에 의한 종양 표적 세포에 대해 보다 고수준의 세포독성을 유도한다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 37은 EL4 세포 상에서 발현된 NKG2D에 대한 CD33-표적화 TriNKET의 결합 프로파일을 도시한 도면. 도 37은 CD33-결합 도메인이 제2 표적화 아암으로서 사용될 때 2개의 TriNKET의 결합을 도시한 도면.
도 38은 EL4 세포 상에서 발현된 NKG2D에 대한 HER2-표적화 TriNKET의 결합 프로파일을 도시한 도면. 도 38은 HER2 제2 표적화 아암과 현재 짝지어진 동일한 2개의 NKG2D-결합 도메인을 도시한 도면.
도 39는 EL4 세포 상에서 발현된 NKG2D에 대한 BCMA-표적화 TriNKET의 결합 프로파일을 도시한 도면.
도 40은 EL4 세포 상에서 발현된 NKG2D에 결합하는 CD20-표적화 TriNKET의 히스토그램을 도시한 도면. 비염색 EL4 세포를 형광 신호의 음성 대조군으로서 사용하였다. 비염색: 채워진 것; CD20-TriNKET-F04: 실선; CD20-TriNKET-C26: 파선.
도 41은 MV4-11 인간 AML 세포 상에서 발현된 CD33에 대한 CD33-표적화 TriNKET의 결합 프로파일을 도시한 도면.
도 42는 인간 786-O 신세포 암종 세포 상에서 발현된 HER2에 대한 HER2-표적화 TriNKET의 결합 프로파일을 도시한 도면.
도 43은 MM.1S 인간 골수종 세포 상에서 발현된 BCMA에 대한 BCMA-표적화 TriNKET의 결합 프로파일을 도시한 도면.
도 44은 Raji 인간 림프종 세포 상에서 발현된 CD20에 결합하는 CD20-표적화 TriNKET의 히스토그램을 도시한 도면. 비염색 세포를 형광 신호의 음성 대조군으로서 사용하였다. 비염색: 채워진 것; CD20-TriNKET-F04: 실선; CD20-TriNKET-C26: 파선.
도 45A 내지 도 45B는 CD16 및 NKG2D를 이용하는 NK 세포의 상승적 활성화의 막대 그래프를 도시한 도면. 도 45A는 CD107a의 수준을 보여주고; 도 45B는 IFNγ의 수준을 보여주며; 도 45C는 CD107a의 수준을 보여준다. 그래프는 평균(n = 2) ±SD를 나타낸다. 데이터는 5명의 상이한 건강한 공여자를 이용하는 5가지 독립적 실험의 표현을 도시한 도면.
도 46은 NKG2D 및 CD16을 표적화하는 TriNKET를 이용하는 NK 세포의 활성화를 나타내는 막대 그래프를 도시한 도면. 시험한 항체는 인간 IgG1 아이소타입을 가진다. 그래프는 평균(n = 2) ±SD를 나타낸다.
도 47A 내지 도 47c은 TriNKET 및 트라스투주맙이 HER2-양성 인간 종양 세포와의 공동 배양물에서 1차 인간 NK 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 보여주며, CD107a 탈과립 및 IFNγ 사이토카인 생성의 증가로 나타낸, 막대 그래프를 도시한 도면. 단클론성 항체 트라스투주맙에 비해, TriNKET는 둘 다 다양한 인간 HER2 암 세포에 의한 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 나타낸다. 도 47A는 인간 NK 세포는 SkBr-3 세포와 함께 배양시킬 때 TriNKET에 의해 활성화된다는 것을 나타낸다. 도 47B는 인간 NK 세포는 Colo201 세포와 함께 배양시킬 때 TriNKET에 의해 활성화된다는 것을 나타낸다. 도 47c는 인간 NK 세포는 HCC1954 세포와 함께 배양시킬 때 TriNKET에 의해 활성화된다는 것을 나타낸다.
도 48A 내지 도 48B는 CD33-발현 인간 AML 세포주 MV4-11과의 공동 배양물에서 휴지 또는 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 보여주는 선 그래프를 도시한 도면. 도 48A는 휴지 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 도시한 도면. 도 48B는 동일한 공여자로부터의 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 도시한 도면.
도 49A 내지 도 49B는 IL-2-활성화된 및 휴지 인간 NK 세포를 이용하여 세포독성 활성의 TriNKET 향상을 보여주는 막대 그래프를 도시한 도면. 도 49A는 휴지 인간 NK 세포의 SkBr-3 종양 세포의 특이적 용해 백분율을 나타낸다. 도 49B는 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 SkBr-3 종양 세포의 특이적 용해 백분율을 나타낸다.
도 50A 내지 도 50B는 TriNKET가 트라스투주맙에 비해 HER2가 중간이거나 낮은 암에 대해 가장 큰 이점을 제공한다는 것을 보여주는 막대 그래프. 도 50A는 HER2 고-SkBr-3 종양 세포의 활성화된 인간 NK 세포 사멸을 도시한 도면. 도 50B는 HER2 저-786-O 종양 세포의 인간 NK 세포 사멸을 도시한 도면. TriNKET는 낮은 HER2 발현을 갖는 암 세포에 대한 트라스투주맙에 비해 더 큰 이점을 제공한다.
도 51A 내지 도 51C는 3가지 인간 AML 세포주, Molm-13 세포주(도 51A), Mv4-11 세포주(도 51B) 및 THP-1 세포주(도 51C)에 대한 고친화도 FcRγ(CD64)의 발현을 나타내는 히스토그램을 도시한 도면.
도 52A 내지 도 52B는 Molm-13(도 52B) 또는 THP-1(도 52A) 세포 중 하나와의 공동-배양물에서 인간 NK 세포의 단클론성 항체 또는 TriNKET 매개 활성화의 선 그래프를 도시한 도면.
도 53A 내지 도 53c는 표적으로서 3가지의 인간 AML 세포주를 이용하는 인간 NK 세포독성 분석의 선 그래프를 도시한 도면. 도 53A는 CD64를 발현시키지만, THP-1보다는 더 낮은 수준인 Mv4-11 세포가 단클론성 항-CD33에 의해 감소된 효능을 나타낸다는 것을 나타낸다. 도 53B는 CD33에 대한 단클론성 항체가 CD64를 발현시키지 않는 Molm-13 세포에 대해 양호한 효능을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 53c는 THP-1 세포는 단클론성 항-CD33 단독에 의해 효과 없음을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 53c에서 주목하는 선 그래프의 독자성은 도 53A 내지 도 53B의 선 그래프에 적용 가능하다.
도 54A 내지 도 54B는 건강한 공여자로부터의 B 세포가 TriNKET-매개 용해에 민감하다는 것을 나타내는 막대 그래프를 도시한 도면.
도 54C 및 도 54D는 골수종 세포가 TriNKET-매개 용해에 대해 저항성이라는 것을 나타내는 막대 그래프를 도시한 도면.
도 55는 장기간 공동배양물에서 SkBr-3 종양 세포의 TriNKET-매개 hPBMC 사멸의 선 그래프를 도시한 도면.
도 56은 RMA/S-HER2 피하 SC2.2 효능의 연구 설계의 흐름도를 도시한 도면.
도 57은 SC2.2가 피하 RMA/S-HER2 종양 성장에 대해 효과가 없다는 것을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면.
도 58A 내지 도 58B는 mcFAE-C26.99 TriNKET에 의한 시험관내 결합을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 4배 희석에 의한 60㎍/㎖의 표시 항체를 2×105개의 B16F10 종양 세포(도 58A) 또는 EL4-mNKG2D 세포에 첨가하였다(도 58B). 염소 항-마우스 PE 2차 항체 다음에 유세포 분석을 이용하여 결합을 평가하였다.
도 59는 mcFAE-C26.99 TriNKET에 의해 매개되는 증가된 NK 세포독성을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 60A 내지 도 60B는 B16F10 s.c. 모델에서 mcFAE-C26.99 TriNKET의 항-종양 효능을 도시한 도면. 마우스를 150㎍의 용량으로 주사되는(제6일, 제8일, 제10일, 제12일, 제14일, 제16일 및 제21일)(도 60A) 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4 및 마우스 항-Tyrp-1 단클론성 항체 또는 (도 60B) 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4 및 mcFAE-C26.99 TriNKET을 복강내로 처리하였다 . 28일 동안 종양 성장을 평가하였다. 그래프는 개개 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 61A 내지 도 61B는 B16F10 i.v. 모델에서 mcFAE-C26.99 TriNKET의 항-종양 효능을 도시한 도면. 도 61A는 항체를 150㎍ 용량으로(제4일, 제6일, 제8일, 제11일, 제13일, 제15일) 투여할 때의 종양 부담을 나타낸다. 도 61B는 항체를 150㎍ 용량으로(제7일, 제9일, 제11일, 제13일, 제15일) 투여할 때의 종양 부담을 나타낸다. 종양 시험감염 후 18일에, 마우스를 안락사시키고 나서, 표면 폐 전이를 점수화하였다.
도 62는 CD20+ Raji 세포와 함께 배양시킬 때 인간 NK 세포가 TriNKET에 의해 활성화된다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 63은 BCMA 양성 MM.1S 인간 골수종 세포가 있는 배양물에서의 인간 NK 활성화를 나타내는 막대 그래프를 도시한 도면.
도 64는 TriNKET가 KMS12-PE 골수종 세포의 인간 NK 세포 용해를 향상시킨다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 65는 상이한 NKG2D-결합 도메인을 갖는 BCMA 표적화 TriNKET가 KMS12-PE 골수종 세포의 인간 NK 세포 용해를 향상시킨다는 것을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 66a 내지 도 66c는 B16F10 s.c. 모델에서 mcFAE-C26.99 TriNKET 및 항-PD-1 항체를 이용하는 병용 요법의 효과를 나타내는 선 그래프를 도시한 도면. 도 66a는 래트 IgG2a 단클론성 항체 2A3을 갖는 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4, 또는 mcFAE-C26.99로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 66b는 아이소타입 대조군 또는 항-PD-1 단클론성 항체 클론 RPM1-14로 복강내로 처리한 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 66c는 mcFAE-C26.99 및 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 30일 동안 종양 성장을 평가하였다. 그래프는 개개 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 67a 내지 도 67c는 B16F10 s.c. 모델에서 mcFAE-C26.99 TriNKET 및 재조합 인간 IL-2를 이용하는 병용 요법의 효과를 나타내는 선 그래프를 도시한 도면. 도 67a는 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4 또는 mcFAE-C26.99로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 67b는 아이소타입 대조군 또는 IL-2로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 67c는 mcFAE-C26.99 및 IL-2의 조합물로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 무 종양으로 남아있는 조합 그룹으로부터의 3마리 마우스를 이용하여 40일 동안 종양 성장을 평가하였다. 그래프는 개개 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 68은 한 분자에서의 삼중-특이성 결합이 최대 NK 세포 활성에 중요하다는 것을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면.
도 69는 표적 1에 대한 Fab 결합 및 FC에 융합된 표적 2에 대한 scFab 결합을 포함하는 Oasc-Fab 이형이량체 작제물을 도시한 도면. 이형이량체화는 Fc에서의 돌연변이에 의해 보장된다.
도 70은 항원 1 및 2에 대해 2개의 상이한 Fab 및 이형이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc를 함유하는 이형이량체 작제물인 DuetMab를 도시한 도면. Fab 1 및 2는 정확한 LC 및 HC 짝짓기를 보장하는 상이한 S-S 브리지를 함유한다.
도 71은 이형이량체화에 의해 안정화된 Fc에 융합된 표적 1 및 2에 대해 2개의 상이한 Fab 결합을 갖는 이형이량체 작제물인 CrossmAb을 도시한 도면. CL 및 CH1 도메인 및 VH 및 VL 도메인은 전환되며, 예를 들어, CH1은 VL을 따라 융합되는 반면, CL은 VH를 따라 융합된다.
도 72는 항원 2에 대한 Fab 결합이 항원 1에 결합하는 Fab의 HC의 N 말단에 융합되는 동형이량체 작제물인 Fit-Ig를 도시한 도면. 작제물은 야생형 FC를 함유한다.
도 73A 내지 도 73D는 트라스투주맙 또는 HER2-TriNKET의 존재 하에, 휴지 NK 세포(도 73A) 또는 IL-2(도 73B), IL-12(도 73C), 또는 IL-15(도 73D)에 의해 활성화된 NK 세포에 의한 786-O 표적 세포의 용해 백분율을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면.
도 74A 내지 도 74D는 린투주맙, 등록상표 항-CD33 단클론성 항체, 또는 CD33-TriNKET의 존재 하에, 휴지 NK 세포(도 74A) 또는 IL-2(도 74B), IL-12(도 74C) 또는 IL-15(도 74D)에 의해 활성화된 NK 세포에 의한 Molm-13 표적 세포의 용해 백분율을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면.
도 75A 내지 도 75D는 BCMA 단클론성 항체 EM-901 또는 BCMA-TriNKET의 존재 하에, 휴지 NK 세포(도 75A) 또는 IL-2(도 75B), IL-12(도 75C) 또는 IL-15 (도 75D)에 의해 활성화된 NK 세포에 의한 KMS12-PE 표적 세포의 용해 백분율을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면.
도 76A 내지 도 76D는 BCMA 단클론성 항체 EM-901 또는 BCMA-TriNKET의 존재 하에, 휴지 NK 세포(도 76A) 또는 포말리도마이드(도 76B), IL-2(도 76C), 또는 IL-2와 포말리도마이드의 조합물(도 76D)에 의해 활성화된 NK 세포에 의한 KMS12-PE 표적 세포의 용해 백분율을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면.
도 77A 내지 도 77B는 정제된 CD8+ T 세포 및 HCC1954 표적 세포의 유세포 분석을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 78a 내지 도 78b는 CD8+ T 세포 및 HER2-TriNKET, 펨브롤리주맙 ("키트루다(Keytruda)"), 또는 이들의 조합물의 존재 하에 HCC1954 표적 세포의 성장을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면. 도 78a 및 도 78b에서 사용되는 CD8+ T 세포는 상이한 공여자로부터 단리되었다.
도 79는 PBMC 및 HER2-TriNKET, a TLR 작용제, 또는 이들의 조합물의 존재 하에 Skbr-3 표적 세포의 성장을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면.
도 80a 내지 도 80c는 B16F10 종양 세포를 접종하고 7.5㎎/㎏ mcFAE-C26.99 TriNKET 또는 7.5㎎/㎏ 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4(도 80a), 1㎍ 재조합 뮤린 IL-12(rmIL-12) 또는 7.5㎎/㎏ 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4(도 80b), 또는 7.5㎎/㎏ mcFAE-C26.99 TriNKET와 1㎍ rmIL-12의 조합물(도 80c)로 처리한 개개 마우스의 종양 성장 곡선을 나타내는 선 그래프를 도시한 도면. 도 80b 및 도 80c에서, 하부 패널은 작은 축적의 y-축 상의 플롯팅을 나타낸다.
도 81은 B16F10 종양 세포 접종 및 7.5㎎/㎏ 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4, 7.5㎎/㎏ mcFAE-C26.99 TriNKET, 1㎍ rmIL-12, 또는 7.5㎎/㎏ mcFAE-C26.99 TriNKET와 1㎍ rmIL-12의 조합물의 처리 후에 생존한 동물의 백분율을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 도시한 도면.
본 발명은 암세포 상의 종양-연관 항원 및 자연 살해 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체에 결합하는 다중-특이성 결합 단백질, 이러한 다중-특이성 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물, 및 암 치료를 위해 이러한 다중-특이성 단백질 및 약제학적 조성물을 이용하는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 양상은 하기 부문에 제시하지만; 그러나, 하나의 특정 부문에 기재된 본 발명의 양상은 임의의 특정 부문으로 제한되지 않는다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구를 이하에 정의한다.
본 명세서에서 사용되는 단수 용어는 "하나 이상"을 의미하며, 문맥에서 부적절하지 않다면 복수를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-결합 부위"는 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자이 부분을 지칭한다. 인간 항체에서, 항원 결합　부위는　중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도로 분기된 신장부는 프레임워크 영역" 또는 "FR"로 알려진 더 보존된 측접 신장부 사이에 개재된 "초가변 영역"으로서 지칭된다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 내 초가변영역 사이에 그리고 초가변 영역에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 인간 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 항원-결합 표면을 형성하기 위해 3차원 공간에서 서로에 대해 배치된다. 항원-결합 표면은 결합 항원의 3차원 표면에 대해 상보적이며, 각각의 중쇄 및 경쇄의 3개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로서 지칭된다. 특정 동물, 예컨대 낙타 및 연골 어류에서, 항원-결합 부위는 "단일 도메인 항체"를 제공하는 단일 항체쇄에 의해 형성된다. 항원-결합 부위는, 단일 폴리펩타이드 내 경쇄 가변 도메인에 중쇄 가변 도메인을 연결하기 위해 펩타이드 링커를 이용하여, 무손상 항체에, 항원-결합 표면을 보유하는 항체의 항원-결합 단편에, 또는 재조합 폴리펩타이드, 예컨대 scFv에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "종양 연관 항원"은 암과 연관된 단백질, 당단백질, 강글리오사이드, 탄수화물, 지질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 항원을 의미한다. 이러한 항원은 악성 세포 상에서 또는 종양 미세환경에서, 예컨대 종양-연관 혈관, 세포외 기질, 중간엽 기질 또는 면역 침윤물 상에서 발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 바람직하게는 포유류(예를 들어, 뮤린, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 더 바람직하게는 인간을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 유리한 또는 목적하는 결과를 달성하는 데 충분한 화합물(예를 들어, 본 발명의 화합물)의 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투약량으로 투여될 수 있고, 특정 제형 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는"은 병태, 질환, 장애 등의 개선을 초래하는 임의의 효과, 예를 들어, 적어짐, 감소, 조절, 개선 또는 제거 또는 이들의 증상의 개선을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 특히 적합한 조성물을 만드는 비활성 또는 활성인 담체와 활성제의 조합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 표준 약제학적 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀션(예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀션), 및 다양한 유형의 습윤제를 지칭한다. 조성물은 또한 안정제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정제 및 보조제의 예에 대해, 예를 들어, 문헌[Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]] 참조.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 대상체에 대한 투여 시, 본 발명의 화합물 또는 이의 활성 대사물질 또는 잔사를 제공할 수 있는 본 발명의 화합물의 임의의 약제학적으로 허용 가능한 염(예를 들어, 산 또는 염기)을 지칭한다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물의 "염"은 무기 또는 유기산 및 염기로부터 유래될 수 있다. 예시적인 산은 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 석신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 폼산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 자체는 약제학적으로 허용 가능하지 않더라도, 다른 산, 예컨대 옥살산은 본 발명의 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 산 부가 염을 얻는 데 중간체로서 유용한 염의 제조에서 사용될 수 있다.
예시적인 염기는 알칼리 금속(예를 들어, 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘) 수산화물, 암모니아, 및 화학식 NW4 +의 화합물 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 식 중 W는 C1-4 알킬이다.
예시적인 염은 아세트산염, 아디프산염, 알긴산염, 아스파르트산염, 벤조산염, 벤젠설폰산염, 중황산염, 부티르산염, 시트르산염, 캄포산염, 캄포설폰산염, 사이클로펜탄프로피온산염, 디글루콘산염, 도데실황산염, 에탄설폰산염, 푸머르산염, 플루코헵탄산, 글리세로인산염, 헤미황산염, 헵탄산염, 헥산산염, 염산염, 브로민화수소산, 요오드화수소, 2-하이드록시엔탄설폰산, 락트산염, 말레산, 메탄설폰산염, 2-나프탈렌설폰산염, 니코틴산염, 옥살산염, 팔모산염, 펙틴산염, 과화산염, 페닐프로피온산염, 피크르산염, 피발산염, 프로피온산염, 석신산염, 타르타르산염, 티오시안산염, 토실산염, 운데칸산염 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 염의 다른 예는 적합한 양이온, 예컨대 Na+, NH4 + 및 NW4 +(여기서, W는 C1-4 알킬기임) 등과 함께 조제된 본 발명의 화합물의 음이온을 포함한다.
치료적 용도를 위해, 본 발명의 화합물의 염은 약제학적으로 허용 가능한 것으로 상정된다. 그러나, 약제학적으로 허용 가능하지 않은 산 및 염기의 염은, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 화합물의 제조 또는 정제에서의 용도를 발견할 수 있다.
명세서 전체적으로, 조성물이 특정 성분을 갖거나, 포함하는 것으로 기재된 경우, 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나, 포함하는 것으로 기재된 경우, 추가적으로, 열거된 성분으로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 본 발명의 조성물이 있다는 것, 및 인용 가공 단계로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 본 발명에 따른 공정 및 방법이 있다는 것이 상정된다.
일반적 물질로서, 백분율로 명시하는 조성물은 달리 구체화되지 않는 한, 중량백분율이다. 추가로, 변수가 정의되지 않는다면, 변수의 이전의 정의로 조절한다.
I. 단백질
본 발명은 자연 살해 세포를 활성화시키기 위해 암 세포 상의 종양-연관 항원 및 자연 살해 세포 상의 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체에 결합하는 다중-특이성 결합 단백질을 제공한다. 다중-특이성 결합 단백질은 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 및 치료적 방법에서 유용하다. 자연 살해 세포 상에서 NKG2D 수용체 및 CD16 수용체에 대한 다중-특이성 결합 단백질의 결합은 암세포의 파괴에 대한 자연 살해 세포의 활성을 향상시킨다. 암세포 상의 종양-연관 항원에 대한 다중-특이성 결합 단백질은 암 세포를 자연 살해 세포에 근접하게 가져오는데, 이는 자연 살해 세포에 의한 암 세포의 직접적 및 간접적 파괴를 용이하게 한다. 예시적인 다중-특이성 결합 단백질의 추가적인 설명을 이하에 제공한다.
다중-특이성 결합 단백질의 제1 성분은 NK 세포, γδ T 세포　및　CD8+　αβ T 세포를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는, NKG2D 수용체-발현 세포에 결합한다. 일부 실시형태에서, NKG2D-결합 시, 다중-특이성 결합 단백질은 NKG2D에 대한 결합으로부터 천연 리간드, 예컨대 ULBP6 및 MICA를 차단할 수 있다.
다중-특이성 결합 단백질의 제2 성분은 HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 및 PD-L1을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 종양-연관 항원에 결합한다.
다중-특이성 결합 단백질에 대한 제3 성분은 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 비만 세포 및 소포 수지상 세포를 포함하는 백혈구 표면 상에서 Fc 수용체인 CD16을 발현시키는 세포에 결합한다.
다중-특이성 결합 단백질은 이하의 실시예에 나타내지만, 제한되지 않는 몇몇 형식을 취할 수 있다. 하나의 형식은 제1 면역글로불린 중쇄, 제2 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 이형이량체, 다중-특이성 항체이다. 제1 면역글로불린 중쇄는 제1 Fc(힌지-CH2-CH3) 도메인, 제1 가변 중쇄 도메인 및 선택적 제1 CH1 중쇄 도메인을 포함한다. 면역글로불린 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하고; 제1 면역글로불린 중쇄와 함께, 면역글로불린 경쇄는 NKG2D에 결합하는 항원-결합 부위를 형성한다. 제2 면역글로불린 중쇄는 제2 Fc(힌지-CH2-CH3) 도메인, 제2 가변 중쇄 도메인, 및 제1 면역글로불린 중쇄와 짝지어지는 것과 동일한 면역글로불린 경쇄와 짝지어질 수 있는 제2 선택적 CH1 중쇄 도메인을 포함하며, 면역글로불린 경쇄가 제2 면역글로불린 중쇄와 짝지어질 때를 제외하고, 얻어진 항원 결합 부위는 종양 항원에 결합한다. 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 함께 CD16에 결합할 수 있다(도 1).
다른 예시적인 형식은 제1 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하는 이형이량체, 다중-특이성 항체를 수반한다. 제1 면역글로불린 중쇄는 NKG2D에 결합하는 단일쇄 Fv(scFv)에 링커 또는 항체 힌지를 통해 융합된 제1 Fc(힌지-CH2-CH3) 도메인을 포함한다. 다양한 링커는 제1 Fc 도메인에 또는 scFv 그 자체에 scFv를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, scFv는 전반적 scFv 구조를 안정화시키는 이황화결합의 형성을 가능하게 하는 돌연변이를 혼입시킬 수 있다. scFv는 또한 전반적 제1 면역글로불린 중쇄의 등전점을 변형시키기 위해 그리고/또는 더 손쉬운 하류의 정제를 가능하게 하기 위해 돌연변이를 혼입시킬 수 있다. 제2 면역글로불린 중쇄는 제2 Fc(힌지-CH2-CH3) 도메인, 제2 가변 중쇄 도메인 및 선택적 제2 CH1 중쇄 도메인을 포함한다. 면역글로불린 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제2 면역글로불린 중쇄는 면역글로불린 경쇄와 짝지어지고, 종양 항원에 결합한다. 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 함께 CD16에 결합할 수 있다(도 2).
이형이량체 다중-특이성 단백질의 대안의 형식은 제1 면역글로불린 중쇄, 제2 면역글로불린 중쇄, 제1 면역글로불린 경쇄 및 제2 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 제1 면역글로불린 중쇄는 제1 Fc(힌지-CH2-CH3) 도메인, 제1 가변 중쇄 도메인 및 선택적 제1 CH1 중쇄 도메인을 포함한다. 제1 면역글로불린 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 면역글로불린 중쇄와 함께, 제1 면역글로불린 경쇄는 종양 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 형성한다. 제2 면역글로불린 중쇄는 제2 Fc(힌지-CH2-CH3) 도메인, 제2 가변 중쇄 도메인 및 선택적 제2 CH1 중쇄 도메인을 포함한다. 제2 면역글로불린 경쇄는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함한다. 제2 면역글로불린 중쇄와 함께, 면역글로불린 경쇄는 동일한 종양 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 형성한다. 제2 면역글로불린 중쇄는 제1 면역글로불린 중쇄와 짝지어지는 면역글로불린 경쇄와 동일할 수 있는 면역글로불린 경쇄와 짝지어질 수 있으며, 면역글로불린 경쇄가 제2 면역글로불린 중쇄와 짝지어질 때를 제외하고, 얻어진 항원 결합 부위는 종양 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위이다. 특정 실시형태에서, 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 함께 CD16에 결합할 수 있다(도 1).
하나 이상의 추가적인 결합 모티프는 선택적으로 링커 서열을 통해, 불변 영역 CH3 도메인의 C-말단에 융합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 부위는 단일쇄 또는 이황화물-안정화된 가변 영역(ScFv)일 수 있거나 4가 또는 3가 분자를 형성할 수 있었다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 IgG-유사 형상을 유지하는 3작용성, 이중특이성 항체인 트리오맙(Triomab) 형태이다. 이 키메라는 2개의 절반 항체로 이루어지는데, 각각은 2개의 모 항체로부터 유래된 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 가진다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 노브-인투-홀(KIH) 기술을 수반하는 KiH 공통 경쇄(LC) 형태이다. KIH는 이형이량체화를 촉진시키기 위해 각각의 중쇄에서 "노브" 또는 "홀" 중 하나를 생성하도록 CH3 도메인 조작을 수반한다. "노브-인투-홀(KiH)" Fc 기술 이면의 개념은 작은 잔기의 거대 잔기로의 치환(즉, EU 넘버링에서 T366WCH3A)에 의해 하나의 CH3 도메인(CH3A)에 "노브"를 도입하는 것이다. "노브"를 수용하기 위해, 상보성 "홀" 표면은 가장 가까운 이웃하는 잔기를 더 작은 잔기를 갖는 노브로 대체함으로써(즉, T366S/L368A/Y407VCH3B) 다른 CH3 도메인 (CH3B) 상에서 생성되었다. "홀" 돌연변이는 구조화-가이드된 파지 라이브러리 선별에 의해 최적화되었다(Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P.　Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library.　J Mol Biol　(1997)　270(1):26-35). KiH Fc 변이체의 X-선 결정 구조(Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al.,　Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction.　J Mol Biol　(2014)　426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K.　Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs.　Mol Immunol　(2014)　58(1):132-8)는 이형이량체화가 CH3 도메인간 코어 계면에서 정적 상보성에 의해 유도되는 소수성 상호작용에 의해 열역학적으로 선호되는 반면, 노브-노브 및 홀-홀 계면이 각각 바람직한 상호작용의 입체 장애 및 붕괴때문에 동형이량체화를 선호하지 않는다는 것을 입증하였다.
일부 실시형태에서, 가요성 천연 유래 링커를 통해 두 단클론성 항체의 표적 결합 도메인을 합하고, 4가의 IgG - 유사 분자를 수득하는 다중-특이성 결합 단백질은 이중-가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig(상표명)) 형태이다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 직교성 Fab 계면(오쏘-Fab) 형태이다. 오쏘-Fab IgG 접근(Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al.　Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface.　Nat. Biotechnol.　(2014)　32(2):191-8)에서, 다른 Fab에 대해 만들어지는 임의의 변화 없이, 구조-기반 영역 설계가 하나의 Fab에서만 LC 및 HCVH-CH1 계면에 상보성 돌연변이를 도입한다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 2 in1Ig 형식이다. 일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 FC에 융합된 표적 1 및 표적 2에 결합하는 2개의 상이한 Fab를 함유하는 이형이량체인 ES 형태이다. 이형이량체화는 Fc에서의 정전기적 스티어링 돌연변이에 의해 보장된다. 일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 이형이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 Fc에 융합된 2개의 상이한 Fab를 갖는 이형이량체 작제물인 ĸλ 형태이다: Fab1 표적화 항원 1은 카파 LC를 함유하는 한편, 제2 Fab 표적화 항원 2는 람다 LC를 함유한다. 도 13A는 ĸλ의 한 형태의 예시적 표현이며; 도 13B는 다른 ĸλ의 예시적 표현이다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 Fab 아암 교환 형태(중쇄 및 부착된 경쇄(절반-분자)를 다른 분자로부터의 중쇄-경쇄쌍으로 교환함으로써 Fab 아암을 교환하여, 이중특이성 항체를 초래하는 항체)이다. 일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 SEED Body 형태(가닥-교환 조작 도메인(SEED) 플랫폼은 천연 항체의 치료적 적용분야를 확장시키는 능력인 비대칭 및 이중특이성 항체-유사 분자를 생성하도록 설계됨)이다. 이 단백질 조작 플랫폼은 보존된 CH3 도메인 내에서 면역글로불린의 구조적으로 관련된 서열 교환에 기반한다. SEED 설계는 AG/GA 이형이량체의 효율적인 생성을 허용하는 한편, AG 및 GA SEED CH3 도메인의 동형이량체화를 선호하지 않는다.　(Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)). 일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 류신 지퍼가 두 상이한 HC의 이형이량체화를 유도하는 데 사용되는 LuZ-Y 형태이다. (Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 Cov-X-Body 형태이다(이중특이성 CovX-Bodies에서, 두 상이한 펩타이드는 분지형 아제티딘온 링커를 이용하여 함께 결합되고, 부위-특이적 방식으로 온화한 조건 하에 스캐폴드 항체에 융합된다). 약물특이분자단은 기능적 활성을 초래하는 반면, 항체 스캐폴드는 긴 반감기 및 Ig-유사 분포를 부여한다. 약물특이분자단은 화학적으로 최적화될 수 있거나, 최적화된 또는 독특한 이중특이성 항체를 생성하기 위해 다른 약물특이분자단으로 대체된다. (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611-22616).
일부 실시형태에서, 일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 표적 1에 결합하는 Fab 및 Fc에 융합된 표적 2에 결합하는 scFab를 포함하는 Oasc-Fab 이형이량체 형태이다. 이형이량체화는 Fc에서의 돌연변이에 의해 보장된다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 이형이량체화 돌연변이에 의해 안정화된 항원 1 및 2 및 FC에 대한 2개의 상이한 Fab 결합을 함유하는 이형이량체 작제물인 DuetMab 형태이다. Fab 1 및 2는 정확한 LC 및 HC 짝짓기를 보장하는 상이한 S-S 브리지를 함유한다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 이형이량체화에 의해 안정화된 Fc에 융합된 표적 1 및 2에 대한 2개의 상이한 Fab를 갖는 이형이량체 작제물인 CrossmAb 형태이다. CL 및 CH1 도메인 및 VH 및 VL 도메인은 전환되며, 예를 들어, CH1은 VL을 따라 융합되는 반면, CL은 VH를 따라 융합된다.
일부 실시형태에서, 다중-특이성 결합 단백질은 항원 2에 대한 Fab 결합이 항원 1에 결합하는 Fab의 HC의 N 말단에 융합되는 동형이량체 작제물인 Fit-Ig 형태이다. 작제물은 야생형 Fc를 함유한다.
표 1은 조합하여, NKG2D에 결합할 수 있는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 펩타이드 서열을 열거한다. 달리 표시되지 않는 한, 표 1에 제공된 CDR 서열은 카바트(Kabat) 하에 결정된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
대안적으로, 서열번호 69로 정해지는 중쇄 가변 도메인은 미국 특허 제9,273,136호에 설명되는 바와 같이, NKG2D에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 형성하기 위해 서열번호 70으로 정해지는 경쇄 가변 도메인과 짝지어질 수 있다.
Figure pct00009
대안적으로, 서열번호 71로 정해지는 중쇄 가변 도메인은 미국 특허 제7,879,985호에 설명되는 바와 같이, NKG2D에 결합할 수 있는 항원-결합 부위를 형성하기 위해 서열번호 72로 정해지는 경쇄 가변 도메인과 짝지어질 수 있다.
Figure pct00010
Fc 도메인 내에서, CD16 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 의해 매개된다. 예를 들어, 인간 IgG1 내에서, CD16과의 상호작용은 CH2 도메인에서 아미노산 잔기 Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 및 탄수화물 잔기 N-아세틸-D-글루코사민에 주로 중점을 둔다(문헌[Sondermann et al, Nature, 406(6793):267-273] 참조). 공지된 도메인에 기반하여, 돌연변이는, 예컨대 파지-디스플레이된 라이브러리 또는 효모 표면-디스플레이된 cDNA 라이브러리를 이용함으로써 CD16에 대한 결합 친화도를 향상시키거나 감소시키도록 선택될 수 있거나, 공지된 3차원의 상호작용 구조에 기반하여 설계될 수 있다.
이형이량체 항체 중쇄의 조립체는 각각의 항체 중쇄의 동형이량체의 조립체뿐만 아니라 이형이량체의 조립체를 야기할 수 있는, 동일 세포에서 두 상이한 항체 중쇄 서열을 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이형이량체의 바람직한 조립체를 촉진시키는 것은 미국 특허 제13/494870호, 미국 특허 제16/028850호, 미국 특허 제11/533709호, 미국 특허 제12/875015호, 미국 특허 제13/289934호, 미국 특허 제14/773418호, 미국 특허 제12/811207호, 미국 특허 제13/866756호, 미국 특허 제14/647480호, 미국 특허 제14/830336호에 나타낸 각각의 항체 중쇄 불변 영역의 CH3 도메인에 상이한 돌연변이를 혼입함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 인간 IgG1에 기반하여 CH3 도메인에서 생성될 수 있으며, 이들 2개의 쇄가 서로 선택적으로 이형이량체화되는 것을 가능하게 하는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드 내의 아미노산 치환의 별개의 쌍을 혼입한다. 이하에 설명하는 아미노산 치환의 위치는 모두 카바트에서와 같이 EU 지표에 따라 넘버링된다.
하나의 시나리오에서, 제1 폴리펩타이드에서 아미노산 치환은 본래의 아미노산을 알기닌(R), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y) 또는 트립토판(W)으로부터 선택된 더 큰 아미노산으로 대체하고, 제2 폴리펩타이드에서 적어도 하나의 아미노산 치환은 본래의 아미노산(들)을 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 또는 발린(V)으로부터 선택된 더 작은 아미노산(들)으로 대체하여, 더 큰 아미노산 치환부(돌기)는 더 작은 아미노산 치환부(공동)의 표면에 끼워진다. 예를 들어, 하나의 폴리펩타이드는 T366W 치환을 혼입할 수 있고, 다른 폴리펩타이드는 T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는 3개의 치환을 혼입할 수 있다.
본 발명의 항체 중쇄 가변 도메인은 선택적으로 항체 불변 영역, 예컨대 CH1 도메인이 있거나 없는 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG 불변 영역에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 불변 영역의 아미노산 서열은 인간 항체 불변 영역, 예컨대 인간 IgG1 불변 영역, IgG2 불변 영역, IgG3 불변 영역, 또는 IgG4 불변 영역에 대해 적어도 90% 동일하다. 일부 다른 실시형태에서, 불변 영역의 아미노산 서열은 다른 포유류, 예컨대 토끼, 개, 고양이, 마우스 또는 말로부터의 항체 불변 영역에 대해 적어도 90% 동일하다. 하나 이상의 돌연변이는, 예를 들어 Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 및/또는 K439에서 인간 IgG1 불변 영역에 비교되는 바와 같은 불변 영역 내로 혼입될 수 있다. 예시적인 치환은, 예를 들어, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D 및 K439E를 포함한다.
특정 실시형태에서, 인간 IgG1 불변 영역의 CH1 내로 혼입될 수 있는 돌연변이는 아미노산 V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 및/또는 V173에서일 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간 IgG1 불변 영역의 Cκ 내로 혼입될 수 있는 돌연변이는 아미노산 E123, F116, S176, V163, S174 및/또는 T164에서일 수 있다.
대안적으로, 아미노산 치환은 표 2에 나타낸 치환의 다음의 세트로부터 선택될 수 있었다.
Figure pct00011
대안적으로, 아미노산 치환은 표 3에 나타낸 치환의 다음의 세트로부터 선택될 수 있었다.
Figure pct00012
대안적으로, 아미노산 치환은 표 4에 나타낸 치환의 다음의 세트로부터 선택될 수 있었다.
Figure pct00013
대안적으로, 각각의 폴리펩타이드 쇄에서 적어도 하나의 아미노산 치환은 표 5로부터 선택될 수 있었다.
Figure pct00014
대안적으로, 적어도 하나의 아미노산 치환은 표 6에서 다음의 치환 세트로부터 선택될 수 있었고, 제1 폴리펩타이드 열에 표시된 위치(들)가 임의의 공지된 음으로 하전된 아미노산으로 대체되는 경우에, 제2 폴리펩타이드 열에 표시된 위치(들)는 임의의 공지된 양으로 하전된 아미노산으로 대체된다.
Figure pct00015
대안적으로, 적어도 하나의 아미노산 치환은 표 7에서 다음의 치환 세트로부터 선택될 수 있었고, 제1 폴리펩타이드 열에 표시된 위치(들)가 임의의 공지된 양으로 하전된 아미노산으로 대체되는 경우에, 제2 폴리펩타이드 열에 표시된 위치(들)는 임의의 공지된 음으로 하전된 아미노산으로 대체된다.
Figure pct00016
대안적으로, 또는 추가로, 이형이량체 단백질의 구조적 안정성은 두 폴리펩타이드 계면 내에 인공적인 이황화 브리지를 형성하는, 제1 폴리펩타이드 쇄 또는 제2 폴리펩타이드 쇄 중 하나 상에 S354C, 그리고 마주보는 폴리펩타이드 쇄 상에 Y349C를 도입함으로써 증가될 수 있다.
상기 기재한 다중-특이성　단백질은 당업자에게 잘 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 제1 면역글로불린을 암호화하는 제1 핵산 서열은 제1 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있고; 제2 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 제2 핵산 서열은 제2 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있으며; 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 제3 핵산 서열은 제3 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있고; 제1, 제2 및 제3 발현 벡터는 숙주 세포 내로 함께 안정하게 형질감염되어 다량체 단백질을 　생성할 수 있다.
다중-특이성 단백질의 가장 높은 수율을 달성하기 위해, 상이한 비의 제1, 제2 및 제3 발현 벡터를 연구하여 숙주 세포 내로 형질감염을 위한 최적의 비를 결정할 수 있다. 형질감염 후, 당업계에 공지된 방법, 예컨대 제한 희석, ELISA, FACS, 현미경 또는 클론픽스(Clonepix)를 이용하여 세포 은행 생성을 위해 단일 클론이 단리될 수 있다.
클론은 생물반응기 규모확대에 적합한 조건 하에 배양되고, 다중-특이성 단백질의 발현을 유지할 수 있다. 다중-특이성 단백질은 원심분리, 심층여과, 세포 용해, 균질화, 동결융해, 친화도 정제, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 교환 크로마토그래피 및 혼합 방식 크로마토그래피를 포함하는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 단리되고 정제될 수 있다.
II. TriNKET의 특징
특정 실시형태에서, NKG2D-결합 도메인 및 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인을 포함하는 본 명세서에 기재된 TriNKET는 인간 NKG2D를 발현시키는 세포에 결합한다. 특정 실시형태에서, NKG2D-결합 도메인 및 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인을 포함하는 TriNKET는 동일한 종양 연관 항원-결합 도메인을 갖는 단클론성 항체와 비슷한 수준으로 종양 연관 항원에 결합한다. 예를 들어, 트라스투주맙(Trastuzumab)로부터의 NKG2D-결합 도메인 및 HER2-결합 도메인을 포함하는 TriNKET는 트라스투주맙와 비슷한 수준으로 세포 상에서 발현되는 HER2에 결합할 수 있다.
그러나, 본 명세서에 기재된 TriNKET는 종양 성장을 감소시키고 암 세포를 감소시키는 데 더 효과적이다. 예를 들어, HER2 발현 종양/암 세포를 표적화하는 본 개시내용의 TriNKET는 SC2.2보다 더 효과적이다 -단일쇄 이중특이성 분자는 NKG2D에 대한 리간드인 ULBP-6에 연결된 트라스투주맙으로부터 유래된 scFv로부터 구성된다. SC2.2는 HER2+ 암 세포 및 NKG2D+ NK 세포는 동시에 결합한다. 따라서, HER2+ 암세포 수를 감소시킴에 있어서 SC2.2의 유효성이 연구되었다. 시험관내 활성화 및 세포독성 분석은 SC2.2가 NK 세포를 활성화시키고 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 입증하였다. 그러나, SC2.2는 RMA/S-HER2 피하 종양 모델에서의 효능을 입증하지 못하였다. SC2.2의 효능은 또한 상승적 마우스 모델을 과발현시키는 RMA/S-HER2를 이용하여 생체내에서 시험되었다. 이 마우스 모델에서, SC2.2는 비히클 대조군에 비해 종양 성장의 제어를 입증하지 못하였다. 따라서, SC2.2는 NK 세포를 활성화시키고 사멸시킬 수 있고, HER2+ 암 세포에 결합하지만, 이들 특성은 HER2+ 종양 성장을 효과적으로 제어하는 데 불충분하였다.
특정 실시형태에서, NKG2D-결합 도메인 및 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인을 포함하는 본 명세서에 기재된 TriNKET는 항원을 발현시키는 종양 세포와 함께 배양할 때 1차 인간 NK 세포를 활성화시킨다. NK 세포 활성화는 CD107a 탈과립 및 IFNγ 사이토카인 생성의 증가로 표시된다. 더 나아가, 종양 연관 항원-결합 도메인을 포함하는 단클론성 항체에 비해, TriNKET는 항원을 발현시키는 종양 세포의 존재 하에 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 나타낸다. 예를 들어, 단클론성 항체 트라스투주맙에 비해, HER2-결합 도메인를 갖는 본 개시내용의 TriNKET는 HER2-발현 암 세포의 존재 하에 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 가진다.
특정 실시형태에서, NKG2D-결합 도메인 및 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인을 포함하는 본 명세서에 기재된 TriNKET는 항원을 발현시키는 종양 세포의 존재 하에 휴지 및 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 활성을 향상시킨다. 휴지된 NK 세포는 IL-2-활성화된 NK 세포 보다 더 적은 배경 IFNγ 생성 및 CD107a 탈과립을 나타내었다. 특정 실시형태에서, IL-2-활성화된 NK 세포는 TriNKET에 의한 자극 후에 IFNγ+; CD107a+가 되는 세포의 더 큰 백분율을 나타낸다.
특정 실시형태에서, NKG2D-결합 도메인 및 종양 연관 항원(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)에 대한 결합 도메인을 포함하는 본 명세서에 기재된 TriNKET는 항원을 발현시키는 종양 세포의 존재 하에 휴지 및 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 세포독성 활성을 향상시킨다. 더 나아가, 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 TriNKET(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)는 동일한 종양 연관 항원 결합 부위를 포함하는 단클론성 항체에 비해 종양 세포에 대한 활성화 및 휴지 NK 세포 반응을 더 강력하게 지시한다. 특정 실시형태에서, TriNKET는 동일한 종양 항원 결합 부위를 포함하는 단클론성 항체에 비해 중간 및 낮은 종양 항원을 발현시키는 종양 세포에 대해 이점을 제공한다. 따라서, TriNKET를 포함하는 요법은 단클론성 항체 요법보다 우수할 수 있다. 모든 이들 상황에서, TriNKET는 NK 세포의 더 큰 활성화, 및 더 큰 종양 세포 사멸을 유도하여, IL-2가 없는 NK 세포와 비교되는 IL-2와 함께 NK 세포가 인큐베이션될 때, TriNKET와 IL-2 간의 상승작용을 입증한다.
특정 실시형태에서, 단클론성 항체에 비해, 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 본 명세서에 기재된 TriNKET(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)는 고수준의 Fc 수용체(FcR)가 있는 암, 또는 고수준의 FcR이 있는 종양 미세환경에 존재하는 암을 치료하는 데 유리하다. 단클론성 항체는 ADCC, CDC, 식세포작용, 및 특히 신호 차단을 포함하는 다중 메커니즘에도 불구하고 종양 성장에 대해 이들의 효과를 발휘한다. FcγR 중에서, CD16은 IgG Fc에 대해 가장 낮은 친화도를 가지며; FcγRI(CD64)는 CD16보다 IgG에 약 1000배 더 강하게 결합하는 고친화도 FcR이다. CD64는 다수의 조혈 계통, 예컨대 골수 계통 상에서 정상적으로 발현되고, 이들 세포 유형으로부터 유래된 종양, 예컨대 급성 골수 백혈병(AML)에 대해 발현될 수 있다. 종양 내로 침윤하는 면역 세포, 예컨대 MDSC 및 단핵구는 또한 CD64를 발현시키고, 종양 미세환경을 침윤시키는 것으로 알려져 있다. 종양에 의한 또는 종양 미세환경에서 CD64의 발현은 단클론성 항체 요법에 대해 유해한 효과를 가질 수 있다. 항체가 고친화도 수용체에 결합하는 것을 선호하기 때문에, 종양 미세환경에서 CD64의 발현은 이들 항체가 NK 세포 표면 상의 CD16에 맞물리는 것을 어렵게 만든다. NK 세포 표면 상에서 2개의 활성화 수용체를 표적화함에도 불구하고 TriNKET는 단클론성 항체 요법에 대해 (종양 또는 종양 미세환경 상에서) CD64 발현의 유해한 효과를 극복할 수 있다. 종양 세포 상의 CD64 발현과 상관없이, NK 세포 상에서 2개의 활성화 수용체의 이중 표적화가 NK 세포에 대한 더 강한 특이적 결합을 제공하기 때문에 TriNKET는 종양 세포에 대한 인간 NK 세포 반응을 매개할 수 있다.
일부 실시형태에서, 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 본 명세서에 기재된 TriNKET(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)는 감소된 표적 비표(on-target off-tumor) 부작용을 통해 더 양호한 안전성 프로파일을 제공한다. NK 세포 및 CD8 T 세포가 자신을 정상으로 인식하는 메커니즘은 종양세포와 다르지만 자연살해 세포와 CD8 T 세포는 둘 다 종양 세포를 직접적으로 용해시킬 수 있다. NK 세포의 활성은 활성화(NCR, NKG2D, CD16 등) 및 저해(KIR, NKG2A 등) 수용체로부터의 신호 균형에 의해 조절된다. 이들 활성화 신호와 저해 신호의 균형은 NK 세포가 스트레스, 바이러스 감염 또는 형질전환 자가-세포로부터 건강한 자가 세포를 결정하게 한다. 자가 관용(self-tolerance)의 이러한 '빌트인(built-in)' 메커니즘은 정상의 건강한 조직을 NK 세포 반응으로부터 보호하도록 도울 것이다. 이런 원칙을 연장시키기 위해, NK 세포의 자가 관용은 TriNKET가 종양을 벗어난 부작용 없이, 또는 증가된 치료적 창에 의해 자가와 종양 둘 다에 대해 발현된 항원을 표적화하는 것을 가능하게 할 것이다. 자연 살해 세포와 달리, T 세포는 활성화 및 효과기 기능에 대한 MHC 분자에 의해 제시되는 특정 펩타이드의 인식을 필요로 한다. T 세포는 면역요법의 1차 표적이었고, T 세포 반응이 종양으로 다시 보내지는 다수의 전략이 개발되었다. T 세포 이중특이성, 관문 저해제 및 CAR-T 세포는 모두 FDA에 의해 승인되었지만, 종종 용량-제한 독성을 겪고 있다. T 세포 이중특이성 및 CAR-T 세포는 종양 세포 표면 상에서 표적 항원에 대한 결합 도메인을 이용하고, 효과기 세포에 활성화 신호를 도입하도록 조작된 신호전달 도메인을 이용함으로써 TCR-MHC 인식 시스템 주변에서 작동한다. 항-종양 면역 반응을 유발하는데 효과적이지만, 이들 요법은 종종 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome: CRS) 및 표적 비표적 부작용과 결합된다. TriNKET는 NK 세포 활성화 및 저해의 천연 시스템보다 더 중요하지 않기 때문에 이와 관련하여 독특하다. 대신에, TriNKET는 균형이 흔들리도록 설계되며, NK 세포에 대한 추가적인 활성화 신호를 제공하는 한편, 건강체 자신에 대한 NK 관용을 유지한다.
일부 실시형태에서, 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인 (CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 NKG2D-결합 도메인을 포함하는 본 명세서에 기재된 TriNKET(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)는 동일한 종양 항원-결합 도메인을 포함하는 단클론성 항체보다 더 효과적으로 종양 진행을 지연시킨다. 일부 실시형태에서, NKG2D-결합 도메인 및 종양 항원-결합 도메인을 포함하는 TriNKET는 동일한 종양 항원-결합 도메인을 포함하는 단클론성 항체보다 암 전이에 대해 더 효과적이다.
상기 설명은 본 발명의 다중 양상 및 실시형태를 기재한다. 본 출원은 양상 및 실시형태의 모든 조합 및 순열을 구체적으로 상정한다.
III. 치료적 적용분야
본 발명은 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 본 명세서에 기재된 다중-특이성 결합 단백질(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET) 및/또는 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 고형 종양, 림프종 및 백혈병을 포함하는 다양한 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료될 암의 유형은 다중-특이성 결합 단백질에 결합하는 암 세포 유형과 바람직하게 매칭된다. 예를 들어, 상피세포 접착 분자(EpCAM)를 발현시키는 암, 예컨대 EpCAM을 발현시키는 결장암의 치료는 NKG2D, CD16 및 EpCAM에 결합하는 본 명세서에 기재된 다중-특이성 결합 단백질을 이용하여 바람직하게 치료된다. 치료 방법의 추가적인 양상 및 실시형태는 이하에 기재된다.
따라서, 본 발명의 일 양상은 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 암을 치료하기 위해 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 다중-특이성 결합 단백질(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)을 암 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료를 위한 예시적인 암은 고형 종양, 백혈병 및 림프종을 포함한다.
치료 방법은 치료될 암에 따라 특성규명될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 특정 다른 실시형태에서, 암은 뇌암, 두경부암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 백혈병, 폐암, 간암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 직장암, 신장암, 위암, 고환암 또는 자궁암이다. 또 다른 실시형태에서, 암은 혈관 종양, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 흑색종, 신경교종, 신경아세포종, 육종(예를 들어, 혈관육종 또는 연골육종), 후두암, 이하선암, 담도암, 갑상선암, 말단 흑자성 흑색종, 광선각화증, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 샘낭암종, 선종, 선육종, 선 평편상피암종, 항문관암, 항문암, 항문직장암, 성상세포종, 큰질어귀샘암, 기저세포 암종, 담즙암, 골암, 골수암, 기관지암, 기관지샘 암종, 카시노이드, 담관암종, 연골육종, 맥락얼기 유두종/암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 투명세포 암종, 결합조직암, 낭선종, 소화계통암, 십이지장암, 내분비계암, 내배엽동종양, 자궁내막증식증, 자궁내막 기질세포 육종, 자궁내막모양 선암종, 내피세포암, 뇌실막세포, 상피세포암, 유잉 육종, 눈 및 안와암, 여성생식기 암, 국소결절성 과증식, 담낭암, 날문방암, 위 기저부 암, 가스트린종, 교모세포종, 글루카곤종, 심장암, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간샘종, 간 선종증, 간담도암, 간세포 암종, 호지킨병, 회장암, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평세포 신생물, 간내 담도암, 침윤성 편평세포암종, 공장암, 관절암, 카포씨 육종, 골반암, 거대 세포 암종, 대장암, 평활근육종, 악성 흑색점 흑색종, 림프종, 남성 생식기암, 악성 흑색종, 악성 중피세포 종양, 수아세포종, 수질상피종, 뇌막암, 중피암, 전이성 암종, 구강암, 점막표피모양 암종, 다발성 골수종, 근육암, 비강관암, 신경계암, 신경상피 선암종 결절성 흑색종, 비-상피 피부암, 비-호지킨 림프종, 연맥 세포 암종, 핍지교종암, 구강암, 골육종, 유두상 장액성 선암종, 음경암, 인두암, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 가육종, 폐 아세포종, 직장암, 신세포 암종, 호흡계 암, 망막아세포종, 횡문근육종, 육종, 장액성 암종, 부비강암, 피부암, 소세포 암종, 소장암, 평활근육암, 연조직암, 소마토스타틴-분비 종양, 척추암, 편평세포암종, 선조 근육암, 중피세포하층암, 표재 확산 흑색종, T 세포 백혈병, 설암, 미분화 암종, 요관암, 요도암, 소변 방광암, 비뇨기계암, 자궁경부암, 자궁몸통암, 포도막 흑색종, 질암, 사마귀모양 암종, VIPoma, 외음부암, 고분화 암종 또는 윌름 종양이다.
특정 다른 실시형태에서, 암은 비호지킨 림프종, 예컨대 B-세포 림프종 또는 T-세포 림프종이다. 특정 실시형태에서, 비-호지킨 림프종은 B-세포 림프종, 예컨대 미만성 거대 B-세포 림프종, 원발성 종격동 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 소형 림프구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 변연대 B-세포 림프종, 림프절외 변연대 B-세포 림프종, 결절성 변연대 B-세포 림프종, 비장 변연대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 림프형질세포성 림프종, 모발세포 백혈병 또는 원발 중추신경계(CNS) 림프종이다. 특정 다른 실시형태에서, 비-호지킨 림프종은 T-세포 림프종, 예컨대 전구체 T-림프아구성 림프종, 말초 T-세포 림프종, 피부 T-세포 림프종, 혈관면역아세포성 T-세포 림프종, 림프절외 자연살해/T-세포 림프종, 장병증 유형 T-세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T-세포 림프종, 역형성 거대 세포 림프종 또는 말초 T-세포 림프종이다.
치료될 암은 암 세포 표면 상에서 발현되는 특정 항원의 존재에 따라 특성규명될 수 있다. 특정 실시형태에서, 암세포는 다음 중 하나 이상을 발현시킨다: HER2, CD20, CD33, BCMA, EpCAM, CD2, CD19, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 및 PD-L1.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 단백질은 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 본 개시내용의 단백질(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)에 종양 또는 암세포 및 자연 살해 세포를 노출시킴으로써, 직접적으로 또는 간접적으로 종양 세포 사멸(용해, 사멸, 절제, 생존 또는 세포 증식의 감소 등과 동의어)을 향상시키는 방법, 또는 직접적으로 또는 간접적으로 종양 세포 사멸(용해, 사멸, 절제, 생존 또는 세포 증식의 감소 등과 동의어)을 향상시키는 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용된다. 상기 기재한 바와 같은 단백질에 대해 반응성인 종양 세포는 단백질의 제2 항원-결합 부위에 결합하는 종양-연관 항원을 발현시킨다. 예를 들어, 예시적인 실시형태에서, C26-TriNKET-CD20은 CD20-발현 종양 또는 암세포(휴지 또는 활성화)를 표적화하기 위해 사용되며; 다른 예시적인 실시형태에서, C26-TriNKET-BMCA는 BMCA-발현 종양 또는 암세포(휴지 또는 활성화)를 표적화하기 위해 사용된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 단백질은 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 본 개시내용의 단백질(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)을 포함하는 단백질 또는 제형의 대상체에 대한 투여를 수반하는, 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법, 또는 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용된다. 상기 기재한 바와 같은 단백질에 대해 반응성인 암 세포는 단백질의 제2 항원-결합 부위에 결합하는 종양-연관 항원을 발현시킨다. 예를 들어, 예시적인 실시형태에서, C26-TriNKET-CD20은 CD20-발현 종양 또는 암세포(휴지 또는 활성화)를 표적화하기 위해 사용되며; 다른 예시적인 실시형태에서, C26-TriNKET-BMCA는 BMCA-발현 세포(휴지 또는 활성화)를 표적화하기 위해 사용된다.
IV. 병용 요법
본 발명의 다른 양상은 병용 요법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 다중-특이성 결합 단백질은 암을 치료하기 위해 추가적인 치료제와 병용하여 사용된다.
일 양상에서, 본 발명은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법을 제공하되, 상기 방법은 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질에, 관문 차단제(checkpoint blocker); 사이토카인; TLR 작용제; STING 작용제; 화학치료제; 예를 들어, 키나제 저해제, 예컨대 이브루티닙(Ibrutinib), 베무라페닙(Vemurafenib) 또는 글리벡(Gleevec)을 비롯한, 암 세포 성장 또는 생존에 연루된 암 세포에서 특정 분자를 방해하는 암 표적제; 종양용해 바이러스; 백신; 방사선; 키메라 항원 수용체를 발현시키도록 시험관내에서 변형된 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 비롯한, 생체외에서 확장된 NK 세포 또는 T 세포의 주입을 수반하는 양자 NK 세포 요법; 및 줄기 세포 이식(stem cell transplant: SCT)으로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여 종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 치료제는 CAR-T 세포를 포함한다. CAR-T 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 제10,174,095호, 미국 특허 출원 공개 제2015/0283178호에 기재되어 있고, 문헌[Guedan et al., Mol Ther Methods Clin Dev. (2018) 12:145-156]에서 검토된다. CAR은 다양한 항원을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, CAR-T 세포는 종양-연관 항원, 예를 들어, CD19, CD22, BCMA, PSMA, 메소텔린(MSLN), ROR1, WT1, L1CAM, MUC16 또는 LeY를 발현시키거나, 이들에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, CAR에 의해 결합되는 종양-연관 항원은 다중-특이성 결합 단백질의 제2 항원-결합 부위에 의해 결합되는 동일한 항원이다. 특정 실시형태에서, CAR은 다중-특이성 결합 단백질의 제2 항원-결합 부위와 동일하거나 실질적으로 동일한 항원-결합 부위를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 암 치료가 필요한 대상체의 암 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위; 또는 단백질을 관문 차단제; 사이토카인; TLR 작용제; STING 작용제; 화학치료제; 암세포 성장 또는 생존에 연루된 암 세포에서 특정 분자를 방해하는 암 표적제, 예를 들어, 키나제 저해제, 예컨대 이브루티닙, 베무라페닙 또는 글리벡; 종양용해 바이러스; 백신; 방사선; 키메라 항원 수용체(예를 들어, CAR-T 세포)를 발현시키기 위해 시험관내에서 변형된 세포를 비롯한, 생체외에서 확장된 NK 세포 또는 T 세포의 주입을 수반하는 양자 NK 요법; 및 줄기 세포 이식(SCT)으로부터 선택된 제2 치료제와 조합하여, 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체, 항-KIR 항체, 항-NKG2A 항체, 항-LAG3 항체 및 항-TIM3 항체로부터 선택된 관문 차단제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을, 인터페론 및 인터류킨, 예컨대 IL-2, IL-15, IL-12, INFα, IL-21, PEG-IL-2(폴리에틸렌 글리콜-변형 인터류킨-2), 및 IL15/IL15R 이형이량체를 포함하는 사이토카인과 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR7/8 작용제, TLR9 작용제, TLR4 작용제 및 TLR3 작용제로부터 선택된 TLR 작용제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 STING 작용제 ADU-S100과 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 알킬화제, 예컨대 사이클로포스파마이드, 메클로르에타민, 클로람부실, 멜팔란, 다카바진(DTIC), 나이트로소유레아, 테모졸로마이드 (경구 다카바진); 안트라사이클린, 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 및 발루비신; 세포골격 붕괴제, 예컨대 파클리탁셀, 납-파클리탁셀(nab-paclitaxel), 도세탁셀, 아브락산, 및 탁소텔; 에포틸론(epothilone); 히스톤 데아세틸라제 저해제, 예컨대 보리노스탯(bortezomib) 및 로미뎁신; 토포아이소머라제 I의 저해제, 예컨대 이리노테칸 및 토포테칸; 토포아이소머라제 II의 저해제, 예컨대 에토포사이드, 테니포사이드 및 타플루포사이드; 키나제 저해제, 예컨대 보르테조밉, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 베무라페닙 및 비스모데깁; 뉴클레오타이드 유사체 및 전구체 유사체, 예컨대 아자시티딘, 아자티오프린, 카펙시타빈; 펩타이드 항생제, 예컨대 블레오마이신 및 악티노마이신; 백금계 제제, 예컨대 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴; 레티노이드, 예컨대 트레티노인 및 알리트레티노인; 및 빈카 알칼로이드 및 유도체, 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하는 화학치료제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 두르발루맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙, 릴리루맙, 및 모날리주맙으로부터 선택된 관문 차단제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 R848/레시퀴모드, VTX-2337, 이미퀴모드, 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드로부터 선택된 TLR 작용제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법 및/또는 (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위; (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및 (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인 또는 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위를 포함하는 단백질을 세포 노화를 유도하는 제제와 병용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 제제는 암 세포를 노화로 유도하여, 세포를 면역 세포(예를 들어, NK 세포)에 의한 사멸 및/또는 클리어런스에 민감화시킨다. 세포 노화는 다수의 세포 사건, 예컨대 세포주기 저지, DNA 손상, 및 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK) 캐스케이드의 저해에 의해 유도될 수 있다. 세포 노화를 유도하는 제제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Ruscetti et al., Science (2018) 362, 1416-22; 및 Herranz et al., J. Clin. Invest. (2018) 128(4):1238-1246]에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 세포 노화를 유도하는 제제는 세포 주기 저지를 유도하는 제제, 예컨대 사이클린-의존적 키나제(CDK)의 저해제, 및 MAPK 키나제(MEK)의 저해제의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포 노화를 유도하는 제제는 CDK4/6 저해제(예를 들어, 팔보시클립, 아베마시클립 또는 리보시클립) 및 MEK1/2 저해제(예를 들어, 트라메티닙, 콤비메티닙, 레파메티닙 또는 셀루메티닙)의 조합물을 포함한다.
본 발명의 단백질은 또한 원발성 병변의 수술적 제거에 대한 부가물로서 사용될 수 있다.
다중-특이성 결합 단백질의 양 및 추가적인 치료제 및 상대적 투여 시간은 목적하는 병용 치료 효과를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 치료가 필요한 환자에게 병용 요법을 투여할 때, 조합물의 치료제, 또는 약제학적 조성물 또는 치료제를 포함하는 조성물은 임의의 순서로, 예컨대 순차적으로, 병행하여, 함께, 동시 등으로 투여될 수 있다. 추가로, 예를 들어, 다중-특이성 결합 단백질은 추가적인 치료제(들)가 예방적 또는 치료적 효과가 이의 예방적 또는 치료적 효과를 발휘할 때, 또는 그 반대일 때 투여될 수 있다.
V. 약제학적 조성물
본 개시내용은 또한 종양 연관 항원에 대한 결합 도메인(CD20, BCMA, 및 HER2를 포함하는 종양 연관 항원의 비제한적 예)을 포함하는 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 단백질(예를 들어, A40-TriNKET, A44-TriNKET, A49-TriNKET, C26-TriNKET, F04-TriNKET, F43-TriNKET, F47-TriNKET 및 F63-TriNKET)을 함유하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체는 또한 적절한 제형을 위해 조성물에 포함될 수 있다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985]에서 발견된다. 약물 전달을 위한 방법의 간략한 검토에 대해, 문헌[Langer (Science 249:1527-1533, 1990)] 참조.
본 개시내용의 정맥내 약물 전달 제형은 백(bag), 펜 또는 주사기에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서, 백은 관 및/또는 바늘을 포함하는 통로에 연결될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제형은 동결건조 제형 또는 액체 제형일 수 있다. 특정 실시형태에서, 제형은 냉동건조(동결건조)되고, 약 12 내지 60개의 바이알에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제형은 동결건조될 수 있고, 45㎎의 냉동 건조 제형이 하나의 바이알에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약 40㎎ 내지 약 100㎎의 냉동건조된 제형은 하나의 바이알에 함유될 수 있다. 특정 실시형태에서, 정맥내 약물 제형에서 단백질의 치료적 용량을 얻도록 12, 27 또는 45개의 바이알로부터의 냉동 건조 제형이 합쳐진다. 특정 실시형태에서, 제형은 액체 제형일 수 있고, 약 250㎎/바이알 내지 약 1000㎎/바이알로서 저장된다. 특정 실시형태에서, 제형은 액체 제형일 수 있고, 약 600㎎/바이알로서 저장된다. 특정 실시형태에서, 제형은 액체 제형일 수 있고, 약 250㎎/바이알로서 저장된다.
본 개시내용은 제형을 형성하는 완충 용액에서 치료적 유효량의 단백질을 포함하는 액체 수성 약제학적 제형으로 존재할 수 있었다.
이들 조성물은 통상적인 멸균 기법에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균여과될 수 있다. 얻어진 수용액은 있는 그대로 사용하기 위해 패키징되거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 합쳐진다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 더 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 및 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 고체 형태로 얻어진 조성물은 고정량의 상기 언급한 제제 또는 제제들을 각각 함유하는 다회 단일 용량 단위로 패키징될 수 있다. 고체 형태의 조성물은 또한 유연한 양을 위해 용기에 패키징될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 단백질을 만니톨, 시트르산 일수화물, 시트르산나트륨, 인산이나트륨 2수화물, 인산이수소나트륨 2수화물, 염화나트륨, 폴리솔베이트 80, 물 및 수산화나트륨과 병용하여 포함하는 장기간의 보관 수명을 갖는 제형을 제공한다.
특정 실시형태에서, pH 완충 용액에 본 개시내용의 단백질을 포함하는 수성 제형이 제조된다. 본 발명의 완충제는 pH가 약 4 내지 약 8, 예를 들어, 약 4.5 내지 약 6.0, 또는 약 4.8 내지 약 5.5 범위일 수 있거나, pH는 약 5.0 내지 약 5.2일 수 있다. 상기 열거된 pH에 대해 중간의 범위도 또한 본 개시내용의 부분인 것으로 의도된다. 예를 들어, 상한 및/또는 하한으로서 임의의 상기 열거된 값의 조합을 이용하는 값의 범위는 포함되는 것으로 의도된다. 본 범위 내에서 pH를 제어하는 완충제의 예는 아세트산염(예를 들어, 아세트산나트륨), 석신산염(예컨대 석신산나트륨), 글루콘산, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제형은 약 4 내지 약 8 범위의 pH를 유지하기 위해 시트르산염 및 인산염을 함유하는 완충제 시스템을 포함한다. 특정 실시형태에서, pH 범위는 약 4.5 내지 약 6.0, 또는 약 pH 4.8 내지 약 5.5, 또는 약 5.0 내지 약 5.2의 pH 범위일 수 있다. 특정 실시형태에서, 완충제 시스템은 시트르산 일수화물, 시트르산나트륨, 인산이나트륨 2수화물 및/또는 인산이수소나트륨 2수화물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 완충제 시스템은 약 1.3㎎/㎖의 시트르산(예를 들어, 1.305㎎/㎖), 약 0.3㎎/㎖의 시트르산나트륨(예를 들어, 0.305㎎/㎖), 약 1.5㎎/㎖의 인산이나트륨 2수화물(예를 들어, 1.53㎎/㎖), 약 0.9㎎/㎖의 인산이수소나트륨 2수화물(예를 들어, 0.86) 및 약 6.2㎎/㎖의 염화나트륨(예를 들어, 6.165㎎/㎖)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 완충제 시스템은 1 내지 1.5㎎/㎖의 시트르산, 0.25 내지 0.5㎎/㎖의 시트르산나트륨, 1.25 내지 1.75㎎/㎖의 인산이나트륨 2수화물, 0.7 내지 1.1㎎/㎖의 인산이수소나트륨 2수화물, 및 6.0 내지 6.4㎎/㎖의 염화나트륨을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제형의 pH는 수산화나트륨에 의해 조절된다.
등장제로서 작용하고 항체를 안정화시킬 수 있는 폴리올은 또한 제형에 포함될 수 있다. 폴리올은 제형의 목적하는 등장성에 대해 변할 수 있는 양으로 제형에 첨가된다. 특정 실시형태에서, 수성 제형은 등장성일 수 있다. 첨가된 폴리올의 양은 또한 폴리올의 분자량에 대해 변경될 수 있다. 예를 들어, 이당류(예컨대 트레할로스)에 비해 더 소량의 단당류(예를 들어, 만니톨)가 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 제형에서 등장제로서 사용될 수 있는 폴리올은 만니톨이다. 특정 실시형태에서, 만니톨 농도는 약 5 내지 약 20㎎/㎖일 수 있다. 특정 실시형태에서, 만니톨 농도는 약 7.5 내지 15㎎/㎖일 수 있다. 특정 실시형태에서, 만니톨 농도는 약 10 내지 14㎎/㎖일 수 있다. 특정 실시형태에서, 만니톨 농도는 약 12㎎/㎖일 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리올 솔비톨은 제형에 포함될 수 있다.
세정제 또는 계면활성제가 또한 제형에 첨가될 수 있다. 예시적인 세정제는 비이온성 세정제, 예컨대 폴리솔베이트(예를 들어, 폴리솔베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함한다. 첨가되는 세정제의 양은 제형화된 항체의 응집을 감소시키고/시키거나 제형 내 미립자의 형성을 최소화하고/하거나 흡착을 감소시키는 것이다. 특정 실시형태에서, 제형은 폴리솔베이트인 계면활성제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제형은 세정제 폴리솔베이트 80 또는 Tween 80을 함유할 수 있다. Tween 80은 폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄모노올리에이트를 기재하기 위해 사용되는 용어이다(문헌[Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th edi., 1996] 참조). 특정 실시형태에서, 제형은 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 10㎎/㎖, 또는 약 0.5㎎/㎖ 내지 약 5㎎/㎖의 폴리솔베이트 80을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약 0.1%의 폴리솔베이트 80이 제형에 첨가될 수 있다.
실시형태에서, 본 개시내용의 단백질 생성물은 액체 제형으로서 제형화된다. 액체 제형은 고무 마개로 밀폐되고 알루미늄 크림프 밀봉 마개로 밀봉된 eithera USP/Ph Eur I형 50R 바이알에서 10㎎/㎖ 농도로 제공될 수 있다. 마개는 USP 및 Ph Eur을 준수하는 엘라스토머로 만들어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 바이알은 60 ㎖의 추출 가능한 용적을 가능하게 하기 위해 61.2㎖의 단백질 생성물 용액으로 채울 수 있다. 특정 실시형태에서, 액체 제형은 0.9% 식염수 용액으로 희석될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 액체 제형은 안정화 수준에서 당과 조합된 10㎎/㎖ 농도 용액으로서 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, 액체 제형은 수성 담체에서 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, 안정제는 정맥내 투여에 바람직하지 않은 또는 부적합한 점성도를 초래할 수 있는 양 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 당은 이당류, 예를 들어, 수크로스일 수 있다. 특정 실시형태에서, 액체 제형은 또한 완충제, 계면활성제 및 보존제를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 액체 제형의 pH는 약제학적으로 허용 가능한 산 및/또는 염기의 첨가에 의해 설정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 산은 염산일 수 있다. 특정 실시형태에서, 염기는 수산화나트륨일 수 있다.
응집에 추가로, 탈아마이드화는 발효, 채취/세포 정화, 정제, 약물 물질/약물 제품 저장 동안 그리고 샘플 분석 동안 생길 수 있는 펩타이드 및 단백질의 통상적인 생성물 변형이다. 탈아마이드화는 가수분해를 겪을 수 있는 석신이미드를 형성하는 단백질로부터의 NH3의 상실이다. 석신이미드 중간체는 모 펩타이드의 17 달톤 질량 감소를 초래한다. 후속적 가수분해는 18 달톤 질량 증가를 초래한다. 석신이미드 중간체의 단리는 수성 조건 하의 불안정성 때문에 어렵다. 이렇게 해서, 탈아마이드화는 전형적으로 1 달톤의 질량 증가로서 검출 가능하다. 아스파라긴의 탈아마이드화는 아스파르트산 또는 아이소아스파르트산 중 하나를 초래한다. 탈아마이드화 속도에 영향을 미치는 매개변수는 pH, 온도, 용매 유전상수, 이온강도, 주요 서열, 국소 폴리펩타이드 입체배좌 및 3차 구조를 포함한다. 폴리펩타이드쇄에서 Asn에 인접한 아미노산 잔기는 탈아마이드화 속도에 영향을 미친다. 단백질 서열에서 Asn 다음의 Gly 및 Ser은 탈아마이드화에 대한 더 큰 민감성을 초래한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 액체 제형은 단백질 생성물의 탈아미노화를 방지하기 위한 pH 및 습도 조건 하에 보존된다.
본 명세서의 관심 대상의 수성 담체는 약제학적으로 허용 가능하고(인간에 대한 투여용으로 안전하며 비독성) 액체 제형 제제에 대해 유용한 것이다. 예시적인 담체는 멸균 주사용수(SWFI), 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 인산염-완충 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
보존제는 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본 명세서의 제형에 선택적으로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어, 다회 사용(다회 용량) 제형의 생성을 용이하게 할 수 있다.
정맥내(IV) 제형은 특정 예에서, 예컨대 IV 경로를 통해 모든 약물을 받는 이식 후에 환자가 병원에 있을 때 바람직한 투여 경로일 수 있다. 특정 실시형태에서, 액체 제형은 투여 전에 0.9% 염화나트륨 용액으로 희석된다. 특정 실시형태에서, 주사용 희석 약물 제품은 등장성이며 정맥내 주입에 의한 투여에 적합하다.
특정 실시형태에서, 염 또는 완충제 성분은 10mM 내지 200mM의 양으로 첨가?? 수 있다. 염 및/또는 완충제는 약제학적으로 허용 가능하며, "염기 형성" 금속 또는 아민과의 다양한 공지된 산(무기산 및 유기산)으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 완충제는 인산염 완충제일 수 있다. 특정 실시형태에서, 완충제는 글리신산염, 탄산염, 시트르산염 완충제일 수 있으며, 이 경우에, 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온은 반대이온으로서 작용할 수 있다.
보존제는 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본 명세서의 제형에 선택적으로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어, 다회 사용(다회 용량) 제형의 생성을 용이하게 할 수 있다.
본 명세서의 관심 대상의 수성 담체는 약제학적으로 허용 가능하고(인간에 대한 투여용으로 안전하며 비독성) 액체 제형 제제에 대해 유용한 것이다. 예시적인 담체는 멸균 주사용수(SWFI), 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 인산염-완충 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
본 개시내용은 단백질 및 동결보호제를 포함하는 동결건조 제형으로 존재할 수 있었다. 동결보호제는 당, 예를 들어, 이당류일 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결보호제는 수크로스 또는 말토스일 수 있다. 동결건조된 제형은 또한 완충제, 계면활성제, 증량제 및/또는 보존제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
동결건조된 약물 제품의 안정화에 유용한 수크로스 또는 말토스의 양은 수크로스 또는 말토스에 대해 적어도 1:2의 중량비일 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질 대 수크로스 또는 말토스 중량비는 1:2 대 1:5를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 동결건조 전에 제형의 pH는 약제학적으로 허용 가능한 산 및/또는 염기의 첨가에 의해 설정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 산은 염산일 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 염기는 수산화나트륨일 수 있다.
동결건조 후에, 본 개시내용의 단백질을 함유하는 용액의 pH는 6 내지 8로 조절될 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결건조된 약물 제품에 대한 pH 범위는 7 내지 8일 수 있다.
특정 실시형태에서, 염 또는 완충제 성분은 10mM 내지 200mM의 양으로 첨가될 수 있다. 염 및/또는 완충제는 약제학적으로 허용 가능하며, "염기 형성" 금속 또는 아민과의 다양한 공지된 산(무기산 및 유기산)으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 완충제는 인산염 완충제일 수 있다. 특정 실시형태에서, 완충제는 글리신산염, 탄산염, 시트르산염 완충제일 수 있으며, 이 경우에, 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 이온은 반대이온으로서 작용할 수 있다.
특정 실시형태에서, "증량제"가 첨가될 수 있다. "증량제"는 동결건조된 혼합물에 덩어리를 첨가하고 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여하는(예를 들어, 개방 포어 구조를 유지하는 본질적으로 균일한 동결건조 케이크의 생성을 용이하게 하는) 화합물이다. 예시적인 증량제는 만니톨, 글리신, 폴리에틸렌 글리콜 및 솔비톨을 포함한다. 본 발명의 동결건조된 제형은 이러한 증량제를 함유할 수 있다.
보존제는 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본 명세서의 제형에 선택적으로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어, 다회 사용(다회 용량) 제형의 생성을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시형태에서, 동결건조된 약물 제품은 수성 담체로 구성될 수 있다. 본 명세서의 관심 대상의 수성 담체는 약제학적으로 허용 가능하고(예를 들어, 인간에 대한 투여용으로 안전하며 비독성) 동결건조 후에 액체 제형 제제에 대해 유용한 것이다. 예시적인 희석제는 멸균 주사용수(SWFI), 주사용 정균수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 인산염-완충 식염수), 멸균 식염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 동결건조된 약물 제품은 주사용 멸균수, USP(SWFI) 또는 0.9% 염화나트륨 주사액, USP로 재구성된다. 재구성 동안, 동결건조된 분말은 용액 내로 용해된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 동결건조된 단백질 생성물은 약 4.5 ㎖의 주사용수로 구성되고, 0.9% 식염수 용액(염화나트륨 용액)으로 희석된다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투약량 수준은 환자에 대한 독성 없이, 특정 환자에 대해 목적하는 치료적 반응을 달성하는 데 유효한 활성 성분의 양, 조성, 및 투여 방식을 얻기 위해 변화될 수 있다.
구체적인 용량은 각각의 환자에 대해 균일한 용량, 예를 들어, 50 내지 5000㎎의 단백질일 수 있다. 대안적으로, 환자의 용량은 환자의 대략의 체중 또는 표면적에 맞춰질 수 있다. 적절한 용량을 결정함에 있어서 다른 인자는 치료 또는 예방될 질환 또는 병태, 질환의 중증도, 투여 경로, 연령, 성별 및 환자의 의학적 병태를 포함할 수 있다. 치료를 위한 적절한 투약량을 결정하는 데 필수적인 계산의 추가적인 개선은 특히 투약량 정보 및 본 명세서에 개시된 분석에 비추어 당업자에 의해 일상적으로 이루어진다. 투약량은 또한 적절한 용량-반응 데이터와 함께 사용되는 투약량을 결정하기 위한 공지된 분석의 사용을 통해 결정될 수 있다. 개개 환자의 투약량은 질환의 진행이 모니터링됨에 따라 조절될 수 있다. 투약량이 유효 농도에 도달되거나 유지되도록 조절될 필요가 있는지의 여부를 알아보기 위해 환자에서 표적화 가능한 작제물 또는 복합체의 혈액 수준이 측정될 수 있다. 약물유전체학은 표적화 가능한 작제물 및/또는 복합체, 및 이의 투약량이 주어진 개체에 대해 가장 유효할 가능성이 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다(Schmitz et al.,　Clinica Chimica Acta 　308: 43-53, 2001; Steimer et al.,　Clinica Chimica Acta 　308: 33-41, 2001).
일반적으로, 체중에 기반한 투약량은 약 0.01㎍ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 예컨대 약 0.01㎍ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 1㎎/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 100㎍/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 50㎍/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 10㎍/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 1㎍/㎏의 체중, 약 0.01㎍ 내지 약 0.1㎍/㎏의 체중, 약 0.1㎍ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 0.1㎍ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 0.1㎍ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 약 0.1㎍ 내지 약 1㎎/㎏의 체중, 약 0.1㎍ 내지 약 100㎍/㎏의 체중, 약 0.1㎍ 내지 약 10㎍/㎏의 체중, 약 0.1㎍ 내지 약 1㎍/㎏의 체중, 약 1㎍ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 1㎍ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 1㎍ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 약 1㎍ 내지 약 1㎎/㎏의 체중, 약 1㎍ 내지 약 100㎍/㎏의 체중, 약 1㎍ 내지 약 50㎍/㎏의 체중, 약 1㎍ 내지 약 10㎍/㎏의 체중, 약 10㎍ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 10㎍ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 10㎍ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 약 10㎍ 내지 약 1㎎/㎏의 체중, 약 10㎍ 내지 약 100㎍/㎏의 체중, 약 10㎍ 내지 약 50㎍/㎏의 체중, 약 50㎍ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 50㎍ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 50㎍ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 약 50㎍ 내지 약 1㎎/㎏의 체중, 약 50㎍ 내지 약 100㎍/㎏의 체중, 약 100㎍ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 100㎍ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 100㎍ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 약 100㎍ 내지 약 1㎎/㎏의 체중, 약 1㎎ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 1㎎ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 1㎎ 내지 약 10㎎/㎏의 체중, 약 10㎎ 내지 약 100㎎/㎏의 체중, 약 10㎎ 내지 약 50㎎/㎏의 체중, 약 50㎎ 내지 약 100㎎/㎏의 체중이다.
용량은 1일, 1주, 1개월 또는 1년에 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년마다 1회로 주어질 수 있다. 당업자는 체액 또는 조직에서 측정된 체류 시간 및 표적화 가능한 작제물 또는 복합체의 농도에 기반하여 투약을 위한 반복 속도를 용이하게 추정할 수 있다. 본 발명의 투여는 카테터를 통한 관류에 의한 또는 직접 병변내 주사에 의한 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흉막내, 초내일 수 있다. 이는 1일에 1회 이상, 1주에 1회 이상, 1개월에 1회 이상, 및 1년에 1회 이상으로 투여될 수 있다.
상기 설명은 본 발명의 다중 양상 및 실시형태를 기재한다. 본 출원은 양상 및 실시형태의 모든 조합 및 순열을 구체적으로 상정한다.
실시예
이제 일반적으로 기재되는 본 발명은 본 발명의 특정 양상 및 실시형태의 예시적 목적을 위해서만 포함되고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 다음의 실시예를 참조로 하여 더욱 용이하게 이해할 것이다.
실시예 1 - NKG2D-결합 도메인은 NKG2D에 결합한다
NKG2D-결합 도메인은 정제된 재조합 NKG2D에 결합한다
인간, 마우스 또는 사이토몰거스 NKG2D 엑토도메인의 핵산 서열은 인간 IgG1 Fc 도메인을 암호화하는 핵산 서열과 융합되고, 발현될 포유류 세포 내로 도입된다. 정제 후에, NKG2D-Fc 융합 단백질을 마이크로플레이트의 웰에 흡착시켰다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 소 혈청 알부민으로 웰을 차단시킨 후에, NKG2D-결합 도메인을 적정하고, NKG2D-Fc 융합 단백질로 사전 흡착시킨 웰에 첨가하였다. Fc 교차 반응성을 피하기 위해 겨자무과산화효소에 접합되고 인간 카파 경쇄를 특이적으로 인식하는 2차 항체를 이용하여 1차 항체 결합을 검출하였다. 겨자무과산화효소에 대한 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 결합 신호를 시각화하기 위해 웰에 첨가하였고, 이의 흡광도를 450nM에서 측정하고 540nM에서 보정하였다. NKG2D-결합 도메인 클론, 아이소타입 대조군 도는 양성 대조군(이바이오사이언스(eBioscience)에서 입수 가능한 서열번호 45 내지 48, 또는 항-마우스 NKG2D 클론 MI-6 및 CX-5로부터 선택)을 각각의 웰에 첨가하였다.
아이소타입 대조군은 재조합 NKG2D-Fc 단백질에 대한 최소 결합을 나타낸 반면, 양성 대조군은 재조합 항원에 대해 가장 강하게 결합되었다. 모든 클론에 의해 생성된 NKG2D-결합 도메인은, 클론에 따라 친화도가 다를 수 있지만, 인간, 마우스 및 사이노몰거스 재조합 NKG2D-Fc 단백질에 걸쳐 결합을 입증하였다. 일반적으로, 각각의 항-NKG2D 클론은 인간(도 14) 및 사이노몰거스(도 15) 재조합 NKG2D-Fc에 유사한 친화도로 결합되지만, 마우스(도 16) 재조합 NKG2D-Fc에 대해 더 낮은 친화도로 결합된다.
NKG2D-결합 도메인은 세포 발현 NKG2D에 결합한다
EL4 마우스 림프종 세포주는 인간 또는 마우스 NKG2D - CD3 제타 신호전달 도메인 키메라 항원 수용체를 발현시키기 위해 조작하였다. NKG2D-결합 클론, 아이소타입 대조군 또는 양성 대조군은 EL4 세포 상에서 발현된 세포외 NKG2D를 염색하기 위해 100nM 농도에서 사용하였다. 형광단-접합 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여 항체 결합을 검출하였다. 세포는 유세포분석에 의해 분석하고, 배경에 대한 배수(fold-over-background: FOB)는 NKG2D-발현 세포의 평균 형광 강도 (MFI)를 이용하여 계산하고, 모 EL4 세포에 비교하였다.
NKG2D-결합 도메인은 인간 및 마우스 NKG2D를 발현시키는 EL4 세포에 결합된 모든 클론에 의해 생성되었다. 양성 대조군 항체(이바이오사이언스에서 입수 가능한 서열번호 45 내지 48, 또는 항-마우스 NKG2D 클론 MI-6 및 CX-5로부터 선택됨)는 가장 우수한 FOB 결합 신호를 제공한다. 각각의 클론에 대한 NKG2D 결합 친화도는 인간(도 17) 및 마우스(도 18) NKG2D를 발현시키는 세포 간에 유사하였다.
실시예 2 - NKG2D-결합 도메인은 NKG2D에 대한 천연 리간드 결합을 차단한다
ULBP-6과의 경쟁
재조합 인간 NKG2D-Fc 단백질을 마이크로플레이트의 웰에 흡착시켰고, 웰을 소 혈청 알부민으로 차단시켜 비특이적 결합을 감소시켰다. 포화 농도의 ULBP-6-His-바이오틴을 웰에 첨가한 후에, NKG2D-결합 도메인 클론을 첨가하였다. 2-시간의 인큐베이션 후에, 웰을 세척하고 나서, NKG2D-Fc 코팅 웰에 결합된 채로 남아있는 ULBP-6-His-바이오틴은 겨자무과산화효소 및 TMB 기질에 접합된 스트렙타비딘에 의해 검출하였다. 흡광도는 450nM에서 측정하고 540nM에서 보정하였다. 배경 차감 후에, NKG2D-Fc 단백질에 대한 NKG2D-결합 도메인의 특이적 결합은 웰 내 NKG2D-Fc 단백질에 대한 결합이 차단된 ULBP-6-His-바이오틴의 백분율로부터 계산하였다. 양성 대조군 항체(서열번호 45 내지 48로부터 선택됨) 및 다양한 NKG2D-결합 도메인은 NKG2D에 대한 ULBP-6 결합을 차단하였지만, 아이소타입 대조군은 ULBP-6(도 19)과의 경쟁을 거의 나타내지 않았다.
MICA과의 경쟁
재조합 인간 MICA-Fc 단백질을 마이크로플레이트의 웰에 흡착시켰고, 웰을 소 혈청 알부민으로 차단시켜 비특이적 결합을 감소시켰다. NKG2D-Fc-바이오틴을 웰에 첨가한 후에 NKG2D-결합 도메인을 첨가하였다. 인큐베이션 및 세척 후에, 스트렙타비딘-HRP 및 TMB 기질을 이용하여 MICA-Fc 코팅 웰에 결합된 채로 남아있는 NKG2D-Fc-바이오틴을 검출하였다. 흡광도는 450nM에서 측정하고 540nM에서 보정하였다. 배경 차감 후에, NKG2D-Fc 단백질에 대한 NKG2D-결합 도메인의 특이적 결합은 MICA-Fc 코팅 웰에 대한 결합이 차단된 NKG2D-Fc-바이오틴의 백분율로부터 계산하였다. 양성 대조군 항체(서열번호 45 내지 48로부터 선택됨) 및 다양한 NKG2D-결합 도메인은 NKG2D에 대한 MICA 결합을 차단하였지만, 아이소타입 대조군은 MICA(도 20)과의 경쟁을 거의 나타내지 않았다.
Rae-1 델타와의 경쟁
재조합 마우스 Rae-1델타-Fc(알앤디 시스템즈(R&D Systems)로부터 구입)을 마이크로플레이트의 웰에 흡착시켰고, 웰을 소 혈청 알부민으로 차단시켜 비특이적 결합을 감소시켰다. 마우스 NKG2D-Fc-바이오틴을 웰에 첨가한 후에 NKG2D-결합 도메인을 첨가하였다. 인큐베이션 및 세척 후에, 스트렙타비딘-HRP 및 TMB 기질을 이용하여 Rae-1델타-Fc 코팅 웰에 결합된 채로 남아있는 NKG2D-Fc-바이오틴을 검출하였다. 흡광도는 450nM에서 측정하고 540nM에서 보정하였다. 배경 차감 후에, NKG2D-Fc 단백질에 대한 NKG2D-결합 도메인의 특이적 결합은 Rae-1델타-Fc 코팅 웰에 대한 결합이 차단된 NKG2D-Fc-바이오틴의 백분율로부터 계산하였다. 양성 대조군(서열번호 45 내지 48, 또는 이바이오사이언스에서 입수 가능한 항-마우스 NKG2D 클론 MI-6 및 CX-5로부터 선택) 및 다양한 NKG2D-결합 도메인 클론은 마우스 NKG2D에 대한 Rae-1델타를 차단시킨 반면, 아이소타입 대조군 항체는 Rae-1델타와의 경쟁을 거의 나타내지 않았다(도 21).
실시예 3 - NKG2D -결합 도메인 클론은 NKG2D를 활성화시킨다
인간 및 마우스 NKG2D의 핵산 서열을 CD3 제타 신호전달 도메인을 암호화하는 핵산 서열에 융합시켜 키메라 항원 수용체(CAR) 작제물을 얻는다. 이어서, NKG2D-CAR 작제물은 깁본(Gibson) 조립체를 이용하여 레트로바이러스 내로 클로닝시켰고, 레트로바이러스 생성을 위해 expi293 세포 내로 형질감염시켰다. EL4 세포는 8㎍/㎖ 폴리브렌과 함께 NKG2D-CAR을 함유하는 바이러스로 감염시켰다. 감염 후 24시간에, EL4 세포에서 NKG2D-CAR의 발현 수준을 유세포분석에 의해 분석하였고, 세포 표면 상에서 고수준의 NKG2D-CAR을 발현시키는 클론을 선택하였다.
NKG2D-결합 도메인이 NKG2D를 활성화시키는지의 여부를 결정하기 위해, 이들을 마이크로플레이트 웰에 흡착시켰고, NKG2D-CAR EL4 세포를 브레펠딘-A 및 모네신의 존재 하에 4시간 동안 항체 단편-코팅 웰 상에서 배양시켰다. 세포내 TNF-알파 생성, NKG2D 활성화를 위한 지표를 유세포분석에 의해 분석하였다. TNF-알파 양성 세포의 백분율을 양성 대조군으로 처리한 세포에 정규화시켰다. 모든 NKG2D-결합 도메인은 인간(도 22)과 마우스(도 23) NKG2D를 활성화시켰다.
실시예 4 - NKG2D-결합 도메인은 NK 세포를 활성화시킨다
1차 인간 NK 세포
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. NK 세포(CD3- CD56+)를 PBMC로부터 자기 비드에 의한 음성 선택을 이용하여 단리시켰고, 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 95% 초과였다. 이어서, 단리된 NK 세포를 24 내지 48시간 동안 100ng/㎖의 IL-2를 함유하는 배지에서 배양시킨 후에, 이들을 NKG2D-결합 도메인이 흡착된 마이크로플레이트의 웰에 옮기고, 형광단-접합 항-CD107a 항체, 브레펠딘-A 및 모네신을 함유하는 배지에서 배양시켰다. 배양 후에, NK 세포는 CD3, CD56 및 IFN-감마에 대해 형광단-접합 항체를 이용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. CD3- CD56+ 세포에서 CD107a 및 IFN-감마 염색을 분석하여 NK 세포 활성화를 평가하였다. CD107a/IFN-감마 이중-양성 세포의 증가는 하나의 수용체보다는 2개의 활성화 수용체의 맞물림을 통해 더 양호한 NK 세포 활성화를 나타낸다. NKG2D-결합 도메인 및 양성 대조군(서열번호 45 내지 48로부터 선택됨)은 더 높은 백분율의 NK 세포가 아이소타입 대조군보다는 CD107a+ 및 IFN-감마+가 된다는 것을 나타내었다(도 24 및 도 25는 NK 세포 제제에 대해 상이한 공여자의 PBMC를 이용하는 각각 2가지의 독립적 실험을 나타낸다).
1차 마우스 NK 세포
비장을 C57Bl/6 마우스로부터 얻어서 70㎛ 셀 스트레이너를 통해 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포를 펠릿화시키고, ACK 용해 완충제(써모피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) #A1049201으로부터 구입; 155mM 염화암모늄, 10mM 중탄산칼륨, 0.01mM EDTA)에서 재현탁시켜 적혈구를 제거한다. 남아있는 세포를 100ng/㎖ hIL-2와 함께 72시간 동안 배양시킨 후에 채취하고 NK 세포 단리물을 제조한다. 이어서, 전형적으로 90% 초과의 순도로 자기 비드를 이용하는 음성 고갈 기법을 이용하여 비장 세포로부터 NK 세포(CD3-NK1.1+)를 단리시켰다. 이어서, 정제된 NK 세포를 48시간 동안 100ng/㎖의 mIL-15를 함유하는 배지에서 배양시킨 후에, 이들을 NKG2D-결합 도메인이 흡착된 마이크로플레이트의 웰에 옮기고, 형광단-접합 항-CD107a 항체, 브레펠딘-A 및 모네신을 함유하는 배지에서 배양시켰다. NKG2D-결합 도메인-코팅 웰에서 배양 후에, NK 세포는 CD3, NK1.1 및 IFN-감마에 대해 형광단-접합 항체를 이용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. CD3- NK1.1+ 세포에서 CD107a 및 IFN-감마 염색을 분석하여 NK 세포 활성화를 평가하였다. CD107a/IFN-감마 이중-양성 세포의 증가는 하나의 수용체보다는 2개의 활성화 수용체의 맞물림을 통해 더 양호한 NK 세포 활성화를 나타낸다. NKG2D-결합 도메인 및 양성 대조군(이바이오사이언스에서 입수 가능한 항-마우스 NKG2D 클론 MI-6 및 CX-5로부터 선택됨)은 더 높은 백분율의 NK 세포가 아이소타입 대조군보다는 CD107a+ 및 IFN-감마+가 된다는 것을 나타내었다(도 26 및 도 27은 NK 세포 제제에 대해 상이한 마우스를 이용하는 각각 2가지의 독립적 실험을 나타낸다).
실시예 5 - NKG2D-결합 도메인은 표적 종양 세포의 세포독성을 가능하게 한다
인간 및 마우스 1차 NK 세포 활성화 분석은 NKG2D-결합 도메인과 함께 인큐베이션 후에 NK 세포에 대해 증가된 세포독성 마커를 입증한다. 이것이 증가된 종양 세포 용해로 번역되는지의 여부를 처리하기 위해, 각각의 NKG2D-결합 도메인이 단일특이성 항체로 진행되는 세포 기반 분석을 이용하였다. Fc 영역을 하나의 표적화 아암으로서 사용한 반면, Fab 영역(NKG2D-결합 도메인)은 NK 세포를 활성화시키는 다른 표적화 아암으로서 작용하였다. 인간 유래이며 고수준의 Fc 수용체를 발현시키는 THP-1 세포를 종양 표적으로서 사용하였고, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) DELFIA 세포독성 키트를 사용하였다. THP-1 세포를 BATDA 시약으로 표지하고, 배양 배지에서 105개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 이어서, 표지된 THP-1 세포를 37oC에서 3시간 동안 미량정량판의 웰에서 NKG2D 항체 및 단리된 마우스 NK 세포와 조합하였다. 인큐베이션 후에, 20㎕의 배양물 상청액을 제거하고, 200㎕의 유로퓸(Europium) 용액과 혼합하고 나서, 암실에서 15분 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 시간분해 형광 모듈(여기 337㎚, 방출 620㎚)을 구비한 페라스타(PheraStar) 플레이트 판독기에 의해 시간에 따른 형광을 측정하였고, 키트 설명서에 따라 특이적 용해를 계산하였다.
양성 대조군, ULBP-6 - NKG2D에 대한 천연 리간드는 마우스 NK 세포에 의한 THP-1 표적 세포의 증가된 특이적 용해를 나타내었다. NKG2D 항체는 또한 THP-1 표적 세포의 특이적 용해를 증가시킨 반면, 아이소타입 대조군 항체는 감소된 특이적 용해를 나타내었다. 점선은 첨가한 항체 없이 마우스 NK 세포에 의한 THP-1 세포의 특이적 용해를 나타낸다(도 28).
실시예 6 - NKG2D 항체는 높은 열안정성을 나타낸다
시차주사 형광측정을 이용하여 NKG2D-결합 도메인의 융점을 분석하였다. 추론된 겉보기 융점은 전형적 IgG1 항체에 비해 높다(도 29).
실시예 7 - 다중-특이성 결합 단백질은 NK 세포를 활성화시키는 향상된 능력을 나타낸다
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. NK 세포(CD3- CD56+)를 PBMC로부터 자기 비드에 의한 음성 선택을 이용하여 단리시켰고, 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 95% 초과였다. 이어서, 단리된 NK 세포를 24 내지 48시간 동안 100ng/㎖의 IL-2를 함유하는 배지에서 배양시킨 후에, 이들을 다중-특이성 및 이중 특이성 결합 단백질이 각각 흡착된 마이크로플레이트의 웰에 옮기고, 형광단-접합 항-CD107a 항체, 브레펠딘-A 및 모네신을 함유하는 배지에서 배양시켰다. 배양 후에, NK 세포는 CD3, CD56 및 IFN-감마에 대해 형광단-접합 항체를 이용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. CD3- CD56+ 세포에서 CD107a 및 IFN-감마 염색을 분석하여 NK 세포 활성화를 평가하였다. CD107a/IFN-감마 이중-양성 세포의 증가는 더 양호한 NK 세포 활성화를 나타낸다. AL2.2는 HER2-결합 도메인(트라스투주맙), NKG2D-결합 도메인(ULBP-6) 및 인간 IgG1 Fc 도메인을 함유하는 다중-특이성 결합 단백질이다. 트라스투주맙 동형이량체 및 ULBP-6-Fc 동형이량체로부터 시작된 제어된 Fab-아암 교환 반응(cFAE)을 통해 이루어졌다(문헌[Labrijn et al. Nature Protocols 9, 2450-2463] 참조). SC2.2는 트라스투주맙 및 ULBP-6로부터 유래된 scFv를 포함하는 단일쇄 단백질(서열번호 73)이다.
Figure pct00017
CD107a 및 IFN-감마 염색의 분석은 아이소타입 대조군 IgG가 NK 세포의 활성화를 나타내지 않았지만, 이중특이성 단백질에 비해 다중-특이성 결합 단백질에 의한 자극 후 더 높은 백분율의 NK 세포가 CD107a+ 및 IFN-감마+로 된 것을 나타내었는데, 이는 단지 하나(NKG2D)보다는 두 활성화 수용체(NKG2D 및 CD16)의 맞물림을 통한 더 강한 NK 세포 활성화를 입증한다(도 30). NK 세포 활성화의 이런 증가는 더 강한 종양 세포 사멸로 번역되는 것이 예상된다.
실시예 8 - 다중-특이성 결합 단백질은 표적 종양 세포에 대해 향상된 세포독성을 나타낸다
1차 인간 NK 세포의 세포독성 분석
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. NK 세포(CD3- CD56+)를 PBMC로부터 자기 비드에 의한 음성 선택을 이용하여 단리시켰고, 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 95% 초과였다. 이어서, NK 세포를 세포독성 분석에서 사용하기 전에 100ng/㎖ IL-2를 함유하는 배지에서 밤새 배양시켰다. 다음 날, NK 세포를 신선한 배양 배지에서 5×105개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 인간 유방암 세포인 SkBr-3 세포를 퍼킨 엘머 DELFIA 세포독성 키트에 따라 BATDA 시약으로 표지하고, 배양 배지에서 5×104개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 배양 배지에 다중-특이성 결합 단백질의 다양한 희석물을 만들었다. 이어서, NK 세포, 표지된 SkBr-3 세포 및 다중-특이성 결합 단백질을 미량정량판의 웰에서 합치고 나서, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 20㎕의 배양물 상청액을 제거하고, 200㎕의 유로퓸(Europium) 용액과 혼합하고 나서, 암실에서 15분 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 시간분해 형광 모듈(여기 337㎚, 방출 620㎚)을 구비한 페라스타(PheraStar) 플레이트 판독기에 의해 시간에 따른 형광을 측정하였고, 키트 설명서에 따라 특이적 용해를 계산하였다. AL0.2는 HER2-결합 도메인(트라스투주맙), NKG2D-결합 도메인(서열번호 1 내지 44로부터 선택됨) 및 인간 IgG1 Fc 도메인을 함유하는 다중-특이성 결합 단백질이다. 트라스투주맙 동형이량체 및 항-NKG2D 동형이량체로부터 시작된 제어된 Fab-아암 교환 반응(cFAE)을 통해 이루어졌다. AL0.2si는 AL0.2에 기반하며, CD16 결합을 없앤 Fc 도메인에서의 추가적인 D265A 돌연변이를 함유한다. 트라스투주맙-si는 트라스투주맙에 기반하며, CD16 결합을 없앤 Fc 도메인에서의 추가적인 D265A 돌연변이를 함유한다. AL2.2는 HER2-결합 도메인(트라스투주맙), NKG2D-결합 도메인(ULBP-6) 및 인간 IgG1 Fc 도메인을 함유하는 다중-특이성 결합 단백질이다. SC2.2는 트라스투주맙 및 ULBP-6로부터 유래된 scFv를 포함하는 단일쇄 단백질이다.
AL0.2는 EC50에서 0.0311의 p 값으로, 용량 의존적 방식에서 트라스투주맙보다는 인간 NK 세포에 의한 SkBr-3 표적 세포의 향상된 용해를 나타내었다(도 31). AL0.2si(도 32) 및 트라스투주맙-si(도 33)는 EC50에서 각각 0.0002, 및 0.0001의 p-값으로, AL0.2에 비해 SkBr-3 세포의 효능과 최대 특이적 용해의 감소를 나타내었다(도 32 내지 도 33). 추가로, AL0.2는 용량-의존적 방식에서 AL2.2보다는 SkBr-3 세포의 향상된 용해를 나타내었다(도 34). 아이소타입 대조군 IgG는 시험한 임의의 농도에서 특이적 용해의 증가를 나타내지 않았다. 종합하면, 데이터는 NK 세포 상의 2개의 활성화 수용체 및 1개의 종양 항원과 맞물리는 다중-특이성 결합 단백질이 NK 세포 상의 1개의 활성화 수용체 및 하나의 종양 항원과 맞물리는 이중특이성 단백질에 비해 인간 NK 세포에 의한 종양 세포의 더 강력한 사멸을 유도한다는 것을 입증하였다.
1차 마우스 NK 세포의 세포독성 분석
비장을 C57Bl/6 마우스로부터 얻어서 70㎛ 셀 스트레이너를 통해 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포를 펠릿화시키고, ACK 용해 완충제(써모피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) #A1049201으로부터 구입; 155mM 염화암모늄, 10mM 중탄산칼륨, 0.01mM EDTA)에서 재현탁시켜 적혈구를 제거한다. 남아있는 세포를 100ng/㎖ hIL-2와 함께 72시간 동안 배양시킨 후에 채취하고 NK 세포 단리물을 제조한다. 이어서, 전형적으로 90% 초과의 순도로 자기 비드를 이용하는 음성 고갈 기법을 이용하여 비장 세포로부터 NK 세포(CD3-NK1.1+)를 단리시켰다. 정제된 NK 세포를 세포독성 분석 동안 106개의 세포/㎖로 배양 배지에서 재현탁시키기 전에 48시간 동안 100ng/㎖ mIL-15를 함유하는 배지에서 배양시켰다. RMA-HER2-dTomato, HER2 및 dTomato를 발현시키도록 조작된 마우스 종양 세포주, 및 이의 대조군 상대, zsGreen을 발현시키는 RMA 세포를 표적으로서 사용하였다. 세포를 배양 배지에서 2×105개의 세포/㎖로 재현탁시키고, 1:1 비로 미량정량판의 웰에 파종시켰다. 배양 배지에 다중-특이성 단백질의 희석물을 만들었고, NK 세포와 함께 RMA 세포에 첨가하였다. 37℃에서 밤새 5% CO2와 함께 인큐베이션 후에, 두 가지 세포 유형을 동정하기 위해 형광 리포터를 이용하여 RMA-HER2-dTomato 및 RMA-zsGreen 세포의 백분율을 유세포분석에 의해 결정하였다. 특정 표적 세포 사멸 = (1- ((처리군에서 RMA-Ca2T-dTomato 세포% * 대조군에서 RMA-zsGreen 세포%)/(대조군에서 RMA-Ca2T-dTomato 세포% * 처리군에서 RMA-zsGreen 세포%))) * 100%.
AL2.2는 SC2.2(도 36) 및 트라스투주맙(도 35) 보다 종양 표적에 NK 세포 반응을 다시 보내는 데 있어서 더 강력하다. 대조군 단백질은 특정 표적 사멸에 대해 영향을 거의 나타내지 않았다. 이들 데이터는 NK 세포 상의 2개의 활성화 수용체 및 1개의 종양 항원과 맞물리는 다중-특이성 결합 단백질이 NK 세포 상의 1개의 활성화 수용체 및 하나의 종양 항원과 맞물리는 이중특이성 단백질에 비해 마우스 NK 세포에 의한 종양 세포의 더 강력한 사멸을 유도한다는 것을 입증한다.
실시예 9 - 다중 특이성 결합 단백질은 NKG2D에 결합한다
EL4 마우스 림프종 세포주는 인간 NKG2D를 발현시키도록 조작하였다. NKG2D-결합 도메인, 종양-연관 항원 결합 도메인(예컨대 CD33-, HER2-, CD20- 또는 BCMA-결합 도메인) 및 도 1에 나타내는 바와 같이 CD16에 결합하는 Fc 도메인을 각각 함유하는 삼중특이성 결합 단백질(TriNKET)은 EL4 세포 상에서 발현된 세포외 NKG2D에 대한 그들의 친화도에 대해 검사하였다. 형광단-접합 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하는 NKG2D에 대한 다중-특이성 결합 단백질의 결합을 검출하였다. 세포는 유세포분석에 의해 분석하고, 배경에 대한 배수(fold-over-background: FOB)는 NKG2D-발현 세포의 평균 형광 강도 (MFI)를 이용하여 계산하고, 모 EL4 세포에 비교하였다.
시험한 TriNKET는 CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 및 CD33-결합 도메인), CD33-TriNKET-F04 (ADI-29404 및 CD33-결합 도메인), HER2-TriNKET-C26 (ADI-28226 및 HER2-결합 도메인), HER2-TriNKET-F04 (ADI-29404 및 HER2-결합 도메인), CD20-TriNKET-C26 (ADI-28226 및 CD20-결합 도메인), CD20-TriNKET-F04 (ADI-29404 및 CD20-결합 도메인), BCMA-TriNKET-C26 (ADI-28226 및 BCMA-결합 도메인), BCMA-TriNKET-F04 (ADI-29404 및 BCMA-결합 도메인), BCMA-TriNKET-F43 (ADI-29443 및 BCMA-결합 도메인), 및 BCMA-TriNKET-F47(ADI-29447 및 BCMA-결합 도메인)을 포함한다. 시험한 분자에서 사용되는 HER2-결합 도메인은 트라스투주맙의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성되었다. CD33-결합 도메인은 이하에 열거되는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성되었다.
Figure pct00018
시험한 분자에서 사용되는 CD20-결합 도메인은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성되었다. 시험한 분자에서 사용되는 BCMA-결합 도메인은 이하에 열거되는 바와 같은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성되었다.
Figure pct00019
데이터는 단백질이 종양 항원-결합 도메인, 예컨대 CD33, HER2, CD20 및 BCMA를 포함할 때, 본 개시내용의 TriNKET가 NKG2D에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 다중-특이성 결합 단백질은 인간 종양 항원에 결합한다
삼중특이성 결합 단백질은 CD33, HER2, CD20 및 BCMA에 결합한다
CD33을 발현시키는 인간 AML 세포주 MV4-11을 사용하여 종양 연관 항원에 대한 TriNKET의 결합을 분석하였다. TriNKET 및 모 항-CD33 단클론성 항체를 세포와 함께 인큐베이션시켰고, 형광단-접합 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여 결합을 검출하였다. 세포는 유세포분석에 의해 분석하고, 2차 항체 대조군에 대해 정규화시킨 TriNKET 및 모 단클론성 항-CD33 항체로부터의 평균 형광 강도(MFI)를 이용하여 배경에 대한 배수(FOB)를 계산하였다. CD33-TriNKET-C26, 및 CD33-TriNKET-F04는 모 항-CD33 항체에 비해 CD33에 대해 비슷한 수준의 결합을 나타낸다(도 41).
HER2를 발현시키는 인간 암 세포주를 사용하여 종양 연관 항원에 대한 TriNKET의 결합을 분석하였다. 신세포 암종 세포주 786-O는 저수준의 HER2를 발현시킨다. TriNKET 및 선택적으로 모 항-HER2 단클론성 항체(트라스투주맙)를 세포와 함께 인큐베이션시켰고, 형광단-접합 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여 결합을 검출하였다. 세포는 유세포분석에 의해 분석하고, 2차 항체 대조군에 대해 정규화시킨 TriNKET 및 트라스투주맙으로부터의 평균 형광 강도(MFI)를 이용하여 배경에 대한 배수(FOB)를 계산하였다. HER2-TriNKET-C26 및 HER2-TriNKET-F04는 트라스투주맙에 비교하여 786-O 세포 상에서 발현된 HER2에 대해 비슷한 수준의 결합을 나타낸다(도 42).
BCMA를 발현시키는 MM.1S 인간 골수종 세포를 사용하여 종양 연관 항원 BCMA에 대한 TriNKET의 결합을 분석하였다. TriNKET 및 선택적으로 모 항-BCMA 단클론성 항체(EM-801)를 세포와 함께 인큐베이션시켰고, 형광단-접합 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여 결합을 검출하였다. 세포는 유세포분석에 의해 분석하고, 2차 항체 대조군에 대해 정규화시킨 TriNKET 및 EM-801로부터의 평균 형광 강도(MFI)를 이용하여 배경에 대한 배수(FOB)를 계산하였다. C26--TriNKET-BCMA, F04-TriNKET-BCMA, F43-TriNKET-BCMA 및 F47-TriNKET-BCMA는 EM-801에 비교하여 MM.1S 세포 상에서 발현된 BCMA에 대해 비슷한 수준의 결합을 나타낸다(도 43).
CD20을 발현시키는 Raji 인간 림프종 세포를 사용하여 종양 연관 항원 CD20에 대한 TriNKET의 결합을 분석한다. TriNKET를 세포와 함께 인큐베이션시켰고, 형광단-접합된 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여 결합을 인큐베이션시켰다. 유세포분석에 의해 세포를 분석하였고, 히스토그램을 플롯팅하였다. 도 44에 나타낸 바와 같이, CD20-TriNKET-C26 및 CD20-TriNKET-F04는 CD20에 동일하게 결합한다.
실시예 11 - 다중 특이성 결합 단백질은 NK 세포를 활성화시킨다
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. NK 세포(CD3- CD56+)를 PBMC로부터 자기 비드에 의한 음성 선택을 이용하여 단리시켰고, 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 90% 초과였다. 단리된 NK 세포는 사이토카인 없이 밤새 활성화 또는 휴지를 위해 100ng/㎖ IL-2를 함유하는 배지에서 배양시켰다. 활성화 후 24 내지 48시간 이내에 IL-2-활성화된 NK 세포를 사용하였다.
종양 항원을 발현시키는 인간 암 세포를 채취하고 나서, 2×106개의 세포/㎖로 배양 배지에서 재현탁시켰다. 종양 항원을 표적화하는 단클론성 항체 또는 TriNKET를 배양 배지에서 희석시켰다. 활성화된 NK 세포를 채취하고 나서, 세척하고, 배양 배지에서 2×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 이어서, 암 세포를 IL-2의 존재 하에 단클론성 항체/TriNKET 및 활성화된 NK 세포와 혼합하였다. 브레펠딘-A 및 모넨신을 또한 혼합 배양물에 첨가하여 세포내 사이토카인 염색을 위해 세포 밖의 단백질 수송을 차단시켰다. 형광단-접합 항-CD107a를 혼합 배양물에 첨가하였고, 배양물을 4시간 동안 인큐베이션시킨 후에, CD3, CD56 및 IFN-감마에 대한 형광단-접합 항체를 이용하여 FACS 분석에 대해 샘플을 제조하였다. CD3- CD56+ 세포에서 CD107a 및 IFN-감마 염색을 분석하여 NK 세포 활성화를 평가하였다. CD107a/IFN-감마 이중-양성 세포의 증가는 하나의 수용체보다는 2개의 활성화 수용체의 맞물림을 통해 더 양호한 NK 세포 활성화를 나타낸다.
TriNKET는 CD107a 탈과립 및 IFN-감마 생성의 증가로 표시되는 바와 같이 각각 HER2-발현 SkBr-3 세포(도 47A), Colo201 세포(도 47B), 및 HCC1954 세포(도 47c)와 함께 공동 배양시킨 인간 NK 세포의 활성화를 매개한다. SkBr-3 세포 및 HCC1954 세포는 고수준의 표면 HER2 발현을 가지며, Colo201은 중간의 HER2 발현을 가진다. 단클론성 항체 트라스투주맙에 비해, TriNKET는 인간 암 세포의 존재 하에 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 나타낸다. NK 세포 단독, NK 세포 + SkBr-3 세포는 음성 대조군으로서 사용한다.
TriNKET(C26-TriNKET-HER2 및 F04-TriNKET-HER2)는 CD107a 탈과립 및 IFN-감마 생성의 증가로 나타내는 CD33-발현 인간 AML Mv4-11 세포와 함께 공동배양시킨 인간 NK 세포의 활성화를 매개한다. 단클론성 항-CD33 항체에 비해, TriNKET(C26-TriNKET-HER2 및 F04-TriNKET-HER2)는 HER2를 발현시키는 인간 암 세포의 존재 하에 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 나타내었다(도 47A 내지 도 47c).
1차 인간 NK 세포는 인간암 세포주를 발현시키는 표적과의 공동 배양물에서 TriNKET에 의해 활성화된다
CD20-양성 인간 암 세포와 1차 인간 NK 세포의 공동배양물은 1차 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 초래하였다(도 62). CD107a 탈과립 및 IFNγ사이토카인 생성의 증가로 표시한 바와 같이, TriNKET 표적화 CD20(예를 들어, C26-TriNKET-CD20 및 F04-TriNKET-CD20)는 CD20-양성 Raji 세포와 함께 공동 배양시킨 인간 NK 세포의 활성화를 매개하였다(도 62). 단클론성 항체 리툭시맙에 비해, TriNKET(예를 들어, C26-TriNKET-CD20 및 F04-TriNKET-CD20)는 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 나타낸다(도 62).
Figure pct00020
BCMA-양성 MM.1S 골수종 세포와 1차 인간 NK 세포의 공동배양물은 1차 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 초래하였다. CD107a 탈과립 및 IFNγ 사이토카인 생성의 증가로 표시한 바와 같이, TriNKET 표적화 BCMA(예를 들어, C26-TriNKET-BMCA 및 F04-TriNKET-BMCA)는 MM.1S 골수종 세포와 함께 공동 배양시킨 인간 NK 세포의 활성화를 매개하였다(도 63). 아이소타입 TriNKET에 비해, TriNKET 표적화 BCMA(예를 들어, A44-TriNKET-BMCA, A49-TriNKET-BMCA, C26-TriNKET-BMCA, F04-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F43-TriNKET-BMCA, F47-TriNKET-BMCA 및 F63-TriNKET-BMCA)는 증가된 NK 세포 활성을 나타내었다(도 63).
실시예 12 - 삼중특이성 결합 단백질은 표적 암 세포의 세포독성을 가능하게 한다
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. NK 세포(CD3- CD56+)를 PBMC로부터 자기 비드에 의한 음성 선택을 이용하여 단리시켰고, 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 90% 초과였다. 단리된 NK 세포는 사이토카인 없이 밤새 활성화 또는 휴지를 위해 100ng/㎖ IL-2를 함유하는 배지에서 배양시켰다. 다음날에 세포독성 분석에서 IL-2-활성화 또는 휴지 NK 세포를 사용하였다.
TriNKET의 존재 하에 암 세포를 용해시키는 인간 NK 세포의 능력을 시험하기 위해, 프로메가(Promega)로부터의 cyto Tox 96 비-방사성 세포독성 분석(G1780)을 제조업자의 설명서에 따라 사용하였다. 간략하게, 종양 항원을 발현시키는 인간 암 세포를 채취하고 나서, 세척하고, 1 내지 2×105개의 세포/㎖로 배양 배지에서 재현탁시켰다. 휴지 및 활성화된 NK 세포를 채취하고 나서, 세척하고, 암 세포와 동일한 배양 배지에서 105 내지 2.0×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 96 웰 플레이트의 각각의 웰에서, 50㎕의 암세포 현탁액을 암 세포 상에서 발현된 종양 항원을 표적화하는 TriNKET가 있는 또는 이것이 없는 50㎕의 NK 세포 현탁액과 혼합하였다. 37℃에서 5% CO2와 함께 3시간 15분 동안 인큐베이션시킨 후에, 각각 암 세포만을 함유하는 웰에, 최대 용해를 위한 배지만을 함유하는 웰 및 음성 시약 대조군에 10x 용해 완충제를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 총 4-시간의 인큐베이션에 도달하도록 추가 45분 동안 인큐베이션에 다시 넣었다. 이어서, 세포를 펠릿화시키고, 배양물 상청액을 새로운 96 웰 플레이트에 옮기고, 진행을 위해 기질과 혼합하였다. 새로운 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰고, 흡광도를 SpectraMax i3x 상에서 492 ㎚로 판독하였다. 암 세포의 특이적 용해 백분율을 다음과 같이 계산하였다: 특이적 용해% = ((실험적 용해 - NK 세포 단독으로부터의 자발적 용해 - 암 세포 단독으로부터의 자발적 용해) / (최대 용해 - 음성 시약 대조군)) × 100%.
TriNKET는 CD33 양성 Molm-13 인간 AML 세포주에 대해 인간 NK 세포의 세포독성을 매개한다. 도 53B에 나타내는 바와 같이, 휴지 인간 NK 세포를 Molm-13 암 세포와 혼합하였고, TriNKET(예를 들어, C26-TriNKET-CD33 및 F04-TriNKET-CD33)는 암 세포에 대해 용량 반응 방식으로 휴지 인간 NK 세포의 세포독성 활성을 향상시킬 수 있다. 점선은 TriNKET가 없는 휴지 NK 세포의 세포독성 활성을 나타낸다. 활성화된 인간 NK 세포를 Molm-13 암 세포와 혼합하였고, 암 세포에 대해 용량 의존적 방식으로, TriNKET는 항-CD33 항체에 비해 활성화된 인간 NK 세포의 세포독성 활성을 훨씬 더 향상시킨다(도 53B).
TriNKET는 트라스투주맙, 항-HER2 단클론성 항체의 세포독성 활성에 비해 낮은 표면 발현을 갖는 표적에 대해 NK 세포의 세포독성을 향상시킨다. 휴지 인간 NK 세포를 높은 HER2-발현 SkBr 종양 세포 및 낮은 HER2-발현 786-O 암 세포와 혼합하였고, 용량-반응성 방식으로 고 및 저 HER2-발현 암 세포에 대한 휴지 인간 NK 세포의 세포독성 활성을 향성시키는 TriNKET의 능력을 분석하였다. 도 50A 및 도 50B의 점선은 TriNKET의 부재 하에 암 세포에 대한 휴지 NK 세포의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 50B에 나타낸 바와 같이, 저 HER2-발현 786-O 세포와 함께 활성화된 인간 NK 세포를 혼합 시, 암 세포에 대한 활성화된 인간 NK 세포의 TriNKET(예를 들어, CD26-TriNKET-HER2 및 F04-TriNKET-HER2) 용량-반응성 세포독성 활성을 관찰하였다.
BCMA 양성 골수종 세포의 TriNKET-매개 용해를 분석하였다. 도 64는 휴지된 인간 NK 효과기 세포에 의한 BCMA-양성 KMS12-PE 골수종 세포의 -TriNKET-매개 용해를 나타낸다. 동일한 NKG2D-결합 도메인(A49)을 이용하지만, 상이한 BCMA 표적화 도메인을 이용하는 2개의 TriNKET(cFAE-A49.801 및 cFAE-A49.901)를 시험관내 효능에 대해 시험하였다. TriNKET는 둘 다 KMS12-PE 세포의 NK 세포 용해를 유사한 정도로 향상시켰지만, EM-901 표적화 도메인을 이용하는 TriNKET는 증가된 효능을 제공하였다.
도 65는 상이한 NKG2D-결합 도메인(A40, A44, A49, C26 및 F47)을 이용하지만, 동일한 BCMA 표적화 도메인을 이용하는 몇몇 TriNKET의 세포독성 활성을 나타낸다. BCMA-표적화된 TriNKET의 NKG2D-결합 도메인을 변화시키는 것은 TriNKET의 최대 사멸뿐만 아니라 효능의 변형을 생성하였다. 모든 TriNKET는 EM-901 단클론성 항체에 비해 KMS12-PE 표적 세포의 증가된 사멸을 입증하였다(도 65).
실시예 13
NKG2D와 CD 16을 가교함으로써 인간 NK 세포의 상승적 활성화를 연구하였다.
1차 인간 NK 세포 활성화 분석
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. 음성 자기 비드(스템셀(StemCell) # 17955)를 이용하여 PBMC로부터 NK 세포를 정제하였다. 유세포분석에 의해 결정하여 NK 세포는 90% 초과의 CD3-CD56+였다. 이어서, 세포는 활성화 분석에서 사용 전에 100ng/㎖ hIL-2(펩프로테크 #200-02)를 함유하는 배지에서 48시간 확장되었다. 항체를 100㎕의 멸균 PBS에서 밤새 4℃에서 2㎍/㎖(항-CD16, 바이오레전드 # 302013) 및 5㎍/㎖(항-NKG2D, R&D #MAB139)의 농도로 96-웰 편평 바닥 플레이트에 코팅시킨 후에, 웰을 철저히 세척하여 과량의 항체를 제거하였다. 탈과립의 평가를 위해, IL-2-활성화된 NK 세포를 100ng/㎖ hIL2 및 1㎍/㎖ APC-접합 항-CD107a mAb(바이오레전드 # 328619)로 보충한 배양 배지에서 5×105개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 이어서, 1×105개의 세포/웰을 항체 코팅 플레이트에 첨가하였다. 단백질 수송 저해제 브레펠딘 A(BFA, 바이오레전드 # 420601) 및 모네신(바이오레전드 # 420701)를 각각 1:1000 및 1:270의 최종 희석물에 첨가하였다. 플레이팅된 세포를 5% CO2에서 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. IFN-γ의 세포내 염색을 위해 NK 세포를 항-CD3(바이오레전드 #300452) 및 항-CD56 mAb(바이오레전드 # 318328)로 표지하고, 후속적으로 고정시키고 나서, 투과시키고, 항-IFN-γ mAb(바이오레전드 # 506507)로 표지하였다. NK 세포를 생 CD56+CD3-세포 상에서 개폐 후에 유세포 분석에 의해 CD107a 및 IFN-γ의 발현에 대해 분석하였다.
수용체 조합물의 상대적 효능을 연구하기 위해, NKG2D 또는 CD16의 가교 및 플레이트-결합된 자극에 의한 수용체 둘 다의 공동 가교를 수행하였다. 도 45(도 45A 내지 도 45C)에 나타낸 바와 같이, combined stimulation of CD16 및 NKG2D의 조합된 자극은 고도로 상승된 수준의 CD107a(탈과립)(도 45A) 및/또는 IFN-γ생성을 초래하였다(도 45B). 점선은 각각의 수용체의 개개 자극의 부가적 효과를 나타낸다.
항-CD16, 항-NKG2D 또는 단클론성 항체 둘 다의 조합에 의한 플레이트-결합 자극 4시간 후에 IL-2-활성화된 NK 세포의 CD107a 수준 및 세포내 IFN-γ생성을 분석하였다. 그래프는 평균(n = 2) ±SD를 나타낸다. 도 45A는 CD107a의 수준을 보여주고; 도 45B는 IFNγ의 수준을 보여주며; 도 45C는 CD107a 및 IFN-γ의 수준을 보여준다. 도 45A 내지 도 45C의 데이터는 5명의 상이한 건강한 공여자를 이용하는 5가지 독립적 실험의 표현을 나타낸다.
트라스투주맙, 항-NKG2D, 또는 트라스투주맙 및 항-NKG2D 항체의 결합 도메인으로부터 유래된 TriNKET에 의한 플레이트-결합 자극 4시간 후에 IL-2-활성화된 NK 세포의 CD107a 탈과립 및 세포내 IFN-γ생성을 분석하였다(도 46). 모든 경우에, 시험한 항체는 인간 IgG1 아이소타입을 가졌다. 그래프는 평균(n = 2) ±SD를 나타낸다.
실시예 14
세포-발현 인간 NKG2D에 대한 TriNKET의 평가
인간 NKG2D를 형질도입한 EL4 세포를 사용하여 세포-발현된 인간 NKG2D에 대한 결합을 시험하였다. TriNKET을 20㎍/㎖로 희석시키고, 이어서 연속희석시켰다. mAb 또는 TriNKET 희석물을 사용하여 세포를 염색하였고, 형광단-접합 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여 TriNKET 또는 mAb의 결합을 검출하였다. 유세포분석에 의해 세포를 분석하였고, 결합 MFI를 2차 항체 대조군에 정규화시켜 배경에 대한 배수 값을 얻었다.
세포-발현 인간암 항원에 대한 TriNKET의 평가
CD33 또는 HER2 중 하나를 발현시키는 인간암 세포주를 사용하여 상이한 NKG2D 표적화 클론으로부터 유래된 TriNKET의 종양 항원 결합을 평가하였다. 인간 AML 세포주 MV4-11을 사용하여 세포-발현된 CD33에 대한 TriNKET의 결합을 평가하였다. 인간 신세포 암종 세포주 786-O는 저수준의 HER2를 발현시키고, 세포-발현된 HER2에 대한 TriNKET 결합을 평가하는 데 사용하였다. TriNKET를 20㎍/㎖로 희석시켰고, 각각의 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 형광단-접합 항-인간 IgG 2차 항체를 이용하여 TriNKET의 결합을 검출하였다. 유세포분석에 의해 세포를 분석하였고, 세포 발현된 CD33 및 HER2에 대한 MFI의 결합을 2차 항체 대조군에 정규화시켜 배경에 대한 배수 값을 얻었다.
인간 HER2-양성 암 세포주의 항체 결합 능력 결정
HER2-양성 인간암 세포주의 항체 결합 능력(ABC)을 측정하였다. Bangs Lab으로부터의 퀀텀 심플리 셀룰러(Quantum Simply Cellular) 키트를 사용하였고(#815), 항체 표지된 비드의 제조를 위해 제조업자의 설명서에 따랐다. 간략하게, 비드의 4개 집단 각각을 포화량의 항-HER2 항체로 염색하였고, 세포 집단을 또한 포화량의 동일한 항체로 염색하였다. 각각의 비드 집단뿐만 아니라 세포 집단에 대해 샘플 데이터를 획득하였다. 세포주 각각에 대한 표준 곡선의 생성 및 ABC 값의 외삽을 위해 키트와 함께 제공된 QuickCal 워크시트를 사용하였다.
TriNKET에 의한 1차 NK 세포의 활성화
PBMC는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. 단리된 PBMC를 세척하고, NK 세포 단리를 위해 준비하였다. NK 세포를 자기 비드에 의한 음성 선택 기법을 이용하여 단리시켰고; 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 90% 초과의 CD3-CD56+였다. 단리된 NK 세포는 사이토카인 없이 밤새 활성화 또는 휴지를 위해 100ng/㎖ IL-2를 함유하는 배지에서 배양시켰다. 24 내지 48시간 후에 IL-2-활성화된 NK 세포를 사용하였고; 정제 다음 날 휴지 NK 세포를 항상 사용하였다.
관심 대상의 암 표적을 발현시키는 인간 암 세포주를 배양물로부터 채취하였고, 세포를 2×106개의 세포/㎖로 조절하였다. 관심 대상의 암 표적을 표적화하는 단클론성 항체 또는 TriNKET를 배양 배지에서 희석시켰다. 휴지 및/또는 활성화된 NK 세포를 배양물로부터 채취하였고, 세포를 세척하고 나서, 배양 배지에서 2×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. IL-2 및 형광단-접합 항-CD107a는 활성화 배양물에 대한 NK 세포에 첨가하였다. 브레펠딘-A 및 모넨신을 배양 배지에 첨가하여 세포내 사이토카인 염색을 위해 세포 밖의 단백질 수송을 차단시켰다. 96-웰 플레이트 50㎕의 종양 표적 내로, mAb/TriNKET, BFA/모네신 및 NK 세포를 200㎕의 총 배양물 용적에 대해 첨가하였다. 플레이트를 4시간 동안 배양시킨 후에, FACS 분석을 위해 샘플을 제조하였다.
4시간의 활성화 후에, 세포는 CD3, CD56 및 IFNγ에 대해 형광단-접합 항체를 이용하여 유세포분석에 의한 분석을 위해 제조하였다. CD107a 및 IFNγ 염색을 CD3-CD56+ 집단에서 분석하여 NK 세포 활성화를 평가하였다.
1차 인간 NK 세포의 세포독성 분석
PBMC는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. 단리된 PBMC를 세척하고, NK 세포 단리를 위해 준비하였다. NK 세포를 자기 비드에 의한 음성 선택 기법을 이용하여 단리시켰고, 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 90% 초과의 CD3-CD56+였다. 단리된 NK 세포는 100ng/㎖ IL-2를 함유하는 배지에서 배양시키거나 사이토카인 없이 밤새 휴지시켰다. 다음날에 세포독성 분석에서 IL-2-활성화 또는 휴지 NK 세포를 사용하였다.
Cyto Tox 96 LHD 방출 분석:
종양 세포를 용해시키는 인간 NK 세포의 능력은 프로메가(G1780)로부터의 cyto Tox 96 비-방사성 세포독성 분석을 이용하여 TriNKET의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 측정하였다. 관심 대상의 암 표적을 발현시키는 인간암 세포주를 배양물로부터 채취하고, 세포를 PBS로 세척하고 나서, 표적 세포로서 사용을 위해 1 내지 2×105개의 세포/㎖로 성장 배지에서 재현탁시켰다. 50㎕의 표적 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하였다. 단클론성 항체 또는 관심 대상의 암 항원을 표적화하는 TriNKET를 배양 배지에서 희석시켰고, 50㎕의 희석된 mAb 또는 TriNKET를 각각의 웰에 첨가하였다. 휴지 및/또는 활성화된 NK 세포를 배양물로부터 채취하였고, 세포를 세척하고 나서, 목적하는 E:T 비에 따라서 배양 배지에서 105 내지 2.0×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 50㎕의 NK 세포를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여 총 150㎕의 배양 용적을 만들었다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 3시간 15분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 10x 용해 완충제를 최대 용해 및 용적 제어를 위해, 표적 세포 단독의 웰에, 그리고 배지 단독을 함유하는 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 진행 전에 총 4-시간의 인큐베이션이 되도록 추가 45분 동안 인큐베이션에 다시 넣었다.
인큐베이션 후에, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하였고, 세포를 200g에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화시켰다. 50㎕의 배양물 상청액을 깨끗한 미량정량판에 옮기고, 50㎕의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하였고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 50㎕의 중단 용액을 각각의 웰에 첨가하였고, 흡광도를 SpectraMax i3x 상에서 492㎚에서 판독하였다. 특이적 용해%를 다음과 같이 계산하였다: 특이적 용해% = ((실험 방출 - 효과기로부터의 자발적 방출 - 표적으로부터의 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출)) * 100%.
DELFIA 세포독성 분석:
관심 대상의 암 표적을 발현시키는 인간암 세포주를 배양물로부터 채취하고, 세포를 PBS로 세척하고 나서, BATDA 시약(퍼킨 엘머 AD0116)으로 표지를 위해 106개의 세포/㎖로 성장 배지에서 재현탁시켰다. 표적 세포의 표지를 위해 제조업자의 설명서에 따랐다. 표지 후에, 세포를 PBS로 3x 세척하고 나서, 배양 배지에서 0.5 내지 1.0×105개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 배경 웰을 준비하기 위해, 표지 세포의 분취액을 따로 떼어 두었고, 세포를 배지 밖에서 교반시켰다. 100㎕의 배지를 웰에 조심해서 3회 첨가하여 펠릿화된 세포의 붕괴를 피하였다. 100㎕의 BATDA 표지 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 표적 세포로부터의 자발적 방출을 위해 웰을 보호하고, 1% Triton-X의 첨가에 의해 표적 세포의 최대 용해에 대해 웰을 제조하였다. 단클론성 항체 또는 관심 대상의 종양 표적에 대한 TriNKET를 배양 배지에서 희석시켰고, 50㎕의 희석된 mAb 또는 TriNKET를 각각의 웰에 첨가하였다. 휴지 및/또는 활성화된 NK 세포를 배양물로부터 채취하였고, 세포를 세척하고 나서, 목적하는 E:T 비에 따라서 배양 배지에서 105 내지 2.0×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 50㎕의 NK 세포를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여 총 200㎕의 배양 용적을 만들었다. 분석을 진행하기 전에 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 2 내지 3시간 동안 인큐베이션시켰다.
2 내지 3시간 동안 배양시킨 후에, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하였고, 세포를 200g에서5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화시켰다. 20㎕의 배양물 상청액을 제조업자로부터 제공된 깨끗한 미량정량판에 옮기고, 200㎕의 실온 유로퓸 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하였고, 250 rpm에서 15분 동안 플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. 빅터 3(Victor 3) 또는 SpectraMax i3X 기기 중 하나를 이용하여 플레이트를 판독하였다. 특이적 용해%를 다음과 같이 계산하였다: 특이적 용해% = ((실험적 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출)) * 100%.
장기간 인간 PBMC 세포독성 분석:
SkBr-3 표적 세포를 BacMam 3.0 NucLight Green(#4622)으로 표지하여 표적 세포의 추적을 가능하게 한다. SkBr-3 표적 세포의 표지에 대해 제조업자의 프로토콜을 따른다. 아넥신 V Red(에센 바이오사이언스(Essen Bioscience) #4641)을 희석시키고, 제조업자의 설명서에 따라 제조하였다. 단클론성 항체 또는 TriNKET를 배양 배지에 희석시켰다. 50㎕의 mAb 또는 TriNKET, 아넥신 V, 및 휴지 NK 세포를 표지된 SkBr-3 세포를 이미 함유하는 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였고; 50㎕의 완전한 배양 배지를 총 200㎕의 배양 용적에 첨가하였다.
IncuCyte S3 상에서 영상 수집을 구성하였다. 상에 대한 영상, 녹색 및 적색 채널을 웰당 2개의 영상으로 매시간 수집하였다. IncuCyte S3 소프트웨어를 이용하여 영상 분석을 행하였다. 종양 세포, 및 아넥신 V 양성 세포 수를 각각 계수하기 위해 녹색 및 적색 채널에 대한 마스크를 생성하였다. 아넥신 V 양성 Mv4-11 표적 세포%를 계산하기 위해, 다음의 식을 사용하였다. 아넥신 V 양성 SkBr-3 세포% = ((중복 물체 계수) / (녹색 물체 계수)) * 100%.
HER+ 암세포를 표적화하는 TriNKET와 SC2.2의 비교
HER2를 표적화하는 TriNKET는 SkBr-3 세포수를 감소시키는 데 트라스투주맙보다 더 효과적이고, 0시점으로부터 세포의 60%만이 60시간 후에 남아있었다. HER2 발현 종양/암 세포를 표적화하는 본 개시내용의 TriNKET는 SC2.2보다 더 효과적이다 - 단일쇄 이중특이성 분자는 NKG2D에 대한 리간드인 ULBP-6에 연결된 트라스투주맙으로부터 유래된 scFv로부터 구성된다. SC2.2는 HER2+ 암 세포 및 NKG2D+ NK 세포는 동시에 결합한다. 따라서, HER2+ 암세포 수를 감소시킴에 있어서 SC2.2의 유효성이 연구되었다. 시험관내 활성화 및 세포독성 분석은 SC2.2가 NK 세포를 활성화시키고 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 입증하였다. 그러나, SC2.2는 RMA/S-HER2 피하 종양 모델에서의 효능을 입증하지 못하였다. SC2.2의 효능은 또한 상승적 마우스 모델을 과발현시키는 RMA/S-HER2를 이용하여 생체내에서 시험되었다. 이 마우스 모델에서, SC2.2는 비히클 대조군에 비해 종양 성장의 제어를 입증하지 못하였다. 따라서, SC2.2는 NK 세포를 활성화시키고 사멸시킬 수 있고, HER2+ 암 세포에 결합하지만, 이들 특성은 HER2+ 종양 성장을 효과적으로 제어하는 데 불충분하였다.
C57Bl/6 마우스에서 SC2.2 혈청 반감기의 평가
C57Bl/6 마우스에서 SC2.2의 혈청 반감기를 결정하기 위해, SC2.2를 형광 태그로 표지하여 생체내에서 이의 농도를 추적하였다. SC2.2를 IRDye 800CW(Licor #929-70020)로 표지하였다. 표지된 단백질을 3마리의 C57Bl/6 마우스에 정맥내로 주사하였고, 표시한 시점에 각각의 마우스로부터 혈액을 취하였다. 수집 후에, 혈액을 1000g에서 15분 동안 원심분리시키고, 혈청을 각각의 샘플로부터 수집하고 나서, 모든 시점에 수집될 때까지 4℃에서 저장하였다.
오디세이(Odyssey) CLx 적외선 영상화 시스템을 이용하여 혈청을 영상화시키고, 800 채널로부터의 형광 신호를 Image J 소프트웨어를 이용하여 정량화시켰다. 영상 강도를 제1 시점에 대해 정규화시켰고, 데이터를 2상 붕괴식에 적합화시켰다. 이 실험 시스템에서, SC2.2의 베타 반감기가 대략 7시간이 되는 것을 계산하였다.
RMA/S-HER2 피하 종양에 대한 SC2.2의 생체내 시험
도 56에 따라 생체내 연구를 설계하여 피하 RMA/S-HER2 종양에 대한 SC2.2의 효능을 시험하였다. 인간 HER2로 형질도입한 106개의 RMA/S 세포를 20마리의 C57Bl/6 마우스 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 접종 후 2일에 시작해서, SC2.2를 IP 주사를 통해 매일 투약하였다. SC2.2를 비히클 대조군과 함께 고농도 및 저농도로 투약하였다. 종양 접종 후 4일에 시작해서, 종양을 연구의 지속 동안 월요일, 수요일 및 금요일에 측정하였다. 다음의 식을 이용하여 종양 용적을 계산하였다: 종양 용적 = 길이 × 폭 × 높이
TriNKET은 세포 발현 인간 NKG2D에 결합한다
인간 NKG2D를 발현시키는 세포에 결합하는 TriNKET의 능력을 결정하였다. 도 37 및 도 38은 상이한 NKG2D-결합 도메인을 함유하는 2개의 TriNKET의 용량 반응성 결합을 나타낸다. 도 37은 CD33-결합 도메인이 제2 표적화 아암으로서 사용될 때 2개의 TriNKET의 결합을 도시한 도면. 도 38은 HER2 제2 표적화 아암과 현재 짝지어진 동일한 2개의 NKG2D-결합 도메인을 도시한 도면. 6개의 NKG2D-결합 도메인은 종양 표적화 도메인 둘 다와 동일한 결합 프로파일을 보유한다.
TriNKET은 세포 발현 인간 암 항원에 결합한다
인간 암 항원을 발현시키는 세포에 결합하는 TriNKET의 능력을 결정하였다. 도 41 및 도 42는 세포-발현된 CD33(도 41) 및 HER2(도 42)에 대한 TriNKET의 결합을 나타낸다. 세포 발현된 항원에 대한 TriNKET 결합은 NKG2D-결합 도메인 간에 일치되었다. TriNKET는 모 단클론성 항체와 비슷한 수준으로 결합되었다.
인간 HER2-양성 암 세포주의 항체 결합 능력
표 8은 HER2 표면 정량화 결과를 나타낸다. SkBr-3 및 HCC1954 세포는 고(+++) 수준의 표면 HER2를 갖는 것을 확인하였다. ZR-75-1 및 Colo201은 중간 수준(++)의 표면 HER2를 나타내었고, 786-O는 가장 저수준의 HER2(+)를 나타내었다.
Figure pct00021
1차 인간 NK 세포는 다른 수준의 HER2를 발현시키는 인간 암 계통과의 공동 배양물에서 TriNKET에 의해 활성화된다
도 47A 내지 도 47c은 TriNKET 및 트라스투주맙이 HER2-양성 인간 종양 세포와의 공동 배양물에서 1차 인간 NK 세포를 활성화시킬 수 있다는 것을 보여주며, CD107a 탈과립 및 IFNg 사이토카인 생성의 증가로 나타낸다. 단클론성 항체 트라스투주맙에 비해, TriNKET는 둘 다 다양한 인간 HER2 암 세포에 의한 인간 NK 세포의 우수한 활성화를 나타낸다.
도 47A는 인간 NK 세포는 SkBr-3 세포와 함께 배양시킬 때 TriNKET에 의해 활성화된다는 것을 나타낸다. 도 47B는 인간 NK 세포는 Colo201 세포와 함께 배양시킬 때 TriNKET에 의해 활성화된다는 것을 나타낸다. 도 47c는 인간 NK 세포는 HCC1954 세포와 함께 배양시킬 때 TriNKET에 의해 활성화된다는 것을 나타낸다.
TriNKET는 휴지 및 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 활성을 향상시킨다
도 48A 내지 도 48B는 CD33-발현 인간 AML 세포주 MV4-11과의 공동 배양물에서 휴지 또는 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 나타낸다. 도 48A는 휴지 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 나타낸다. 도 48B는 동일한 공여자로부터의 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 TriNKET-매개 활성화를 도시한 도면. 휴지된 NK 세포는 IL-2-활성화된 NK 세포 보다 더 적은 배경 IFNγ 생성 및 CD107a 탈과립을 나타내었다. 휴지된 NK 세포는 IL-2-활성화된 NK 세포에 비해 IFNγ 생성 및 CD107a 탈과립의 더 큰 변화를 나타내었다. IL-2-활성화된 NK 세포는 TriNKET에 의한 자극 후에 IFNγ+; CD107a+가 되는 세포의 더 큰 백분율을 나타내었다.
TriNKET는 휴지 및 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 세포독성을 향상시킨다
도 49A 내지 도 49B는 IL-2-활성화된 및 휴지 인간 NK 세포를 이용하여 세포독성 활성의 TriNKET 향상을 나타낸다. 도 49A는 휴지 인간 NK 세포의 SkBr-3 종양 세포의 특이적 용해 백분율을 나타낸다. 도 49B는 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 SkBr-3 종양 세포의 특이적 용해 백분율을 나타낸다. IL-2-활성화 및 휴지 NK 세포 집단은 동일한 공여자로부터 유래된다. 트라스투주맙에 비해, TriNKET는 활성화 또는 휴지 NK 세포 집단에 의해 SkBr-3 세포에 대한 반응을 더 강력하게 보낸다.
TriNKET는 낮은 표면 발현을 갖는 표적에 대해 NK 세포의 세포독성을 향상시킨다.
도 50A 내지 도 50B는 TriNKET가 트라스투주맙에 비해 HER2가 중간이거나 낮은 암에 대해 가장 큰 이점을 제공한다는 것을 나타낸다. 도 50A는 HER2 고-SkBr-3 종양 세포의 활성화된 인간 NK 세포 사멸을 나타낸다. 도 50B는 HER2 저-786-O 종양 세포의 인간 NK 세포 사멸을 나타낸다. TriNKET는 낮은 HER2 발현을 갖는 암 세포에 대한 트라스투주맙에 비해 더 큰 이점을 제공한다. TriNKET는 낮은 표면 발현을 갖는 표적에 대해 가장 큰 이점을 제공한다.
고발현의 FcR을 이용하여 암을 치료함에 있어서, 또는 고수준의 FcR을 갖는 종양 미세환경에서 TriNKET의 이점
단클론성 항체 요법은 혈액학적 종양과 고형 종양을 둘 다 포함하는 다수의 암 유형 치료에 대해 승인되었다. 암 치료에서 단클론성 항체의 사용은 환자 결과를 개선시켰지만, 여전히 한계가 있다. 메커니즘 연구는 단클론성 항체가 ADCC, CDC, 식세포작용, 및 특히 신호 차단을 포함하는 다중 메커니즘에도 불구하고 종양 성장에 대해 이들의 효과를 발휘한다는 것을 입증하였다.
가장 주목할 만하게는, ADCC는 단클론성 항체가 그들의 효과를 발휘하는 주요 메커니즘인 것으로 생각된다. ADCC는 종양 세포의 직접 용해를 매개하는 자연 살해 세포의 표면 상의 저친화도 FcγRIII(CD16)의 항체 Fc 맞물림에 의존한다. FcγR 중에서, CD16은 IgG Fc에 대해 가장 낮은 친화도를 가지며, FcγRI(CD64)는 고친화도 FcR이고, CD16보다 IgG에 약 1000배 더 강하게 결합한다.
CD64는 다수의 조혈 계통, 예컨대 골수 계통 상에서 정상적으로 발현되고, 이들 세포 유형으로부터 유래된 종양, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML)에 대해 발현될 수 있다. 종양 내로 침윤하는 면역 세포, 예컨대 MDSC 및 단핵구는 또한 CD64를 발현시키고, 종양 미세환경을 침윤시키는 것으로 알려져 있다. 종양에 의한 또는 종양 미세환경에서 CD64의 발현은 단클론성 항체 요법에 대해 유해한 효과를 가질 수 있다. 항체가 고친화도 수용체에 결합하는 것을 선호하기 때문에, 종양 미세환경에서 CD64의 발현은 이들 항체가 NK 세포 표면 상의 CD16에 맞물리는 것을 어렵게 만든다. NK 세포 표면 상에서 2개의 활성화 수용체를 표적화함에도 불구하고, TriNKET는 단클론성 항체 요법에 대해 CD64 발현의 유해한 효과를 극복할 수 있다.
3가지 AML 세포주 상의 FcRγI(CD64) 발현
고수준 및 저수준의 CD64 표면 발현을 갖는 종양에 대해 TriNKET 및 단클론성 항체의 활성을 시험하기 위한 시험관내 배양 시스템을 개발하였다. Molm-13 및 THP-1은 표면 CD33의 유사한 발현을 갖는 2가지의 인간 AML 세포주이지만, Molm-13 세포는 CD64를 발현시키지 않는 한편, THP-1은 이들의 표면 상에서 CD64를 발현시킨다(도 51A 내지 도 51C). 표적 CD33에 보내진 단클론성 항체 또는 TriNKET를 이용하여, 단클론성 항체 또는 TriNKET 요법 상의 종양에 의한 CD64 발현 효과를 시험하였다. 도 51A 내지 도 51C는 3가지 인간 AML 세포주, Molm-13 세포주(도 51A), Mv4-11 세포주(도 51B) 및 THP-1 세포주(도 51C)에 대한 고친화도 FcRγ(CD64)의 발현을 나타낸다. Molm-13 세포는 CD64를 발현시키지 않는 한편, Mv4-11 세포는 저수준을 가지고, THP-1는 고수준의 세포 표면 CD64를 가진다.
TriNKET는 FcR의 높은 표면 발현을 갖는 종양 세포를 표적화함에 있어서 이점을 가진다
도 52A 내지 도 52B는 Molm-13(도 52B) 또는 THP-1(도 52A) 세포 중 하나와의 공동-배양물에서 인간 NK 세포의 단클론성 항체 또는 TriNKET 매개 활성화를 나타낸다. 인간 CD33에 대한 단클론성 항체는 증가된 CD107a 탈과립 및 IFNγ 생성에 의해 입증된 바와 같이 Molm-13 공동배양 시스템에서 인간 NK 세포의 양호한 활성화를 입증하였다. 단클론성 항체는 고수준의 CD64가 종양 상에 존재하는 THP-1 공동배양 시스템에서 효과가 없다. 흥미롭게도, TriNKET는 Molm-13(도 52B)과 THP-1(도 52A) 세포 둘 다에 대해 효과적이지만, 단클론성 항체는 FcR-Hi THP-1 세포와 함께 배양물에서 NK 세포를 활성화시키지 못하는데, 이는 TriNKET가 종양 상에서 CD64에 대한 결합을 극복할 수 있고, 활성화를 위해 NK 세포를 효과적으로 표적화한다는 것을 나타낸다. NK 세포 상의 2개의 활성화 수용체의 이중 표적화는 NK 세포에 대한 더 강한 특이적 결합을 제공하였다. NK 세포 상에서 CD16만을 표적화하는 단클론성 항체는 다른 고친화도 FcR에 의해 결합될 수 있고, NK 세포 상에서 CD16의 맞물림을 방지한다.
Molm-13 및 THP-1 공동배양 시스템을 이용하는 인간 NK 세포의 세포독성 분석은 고수준의 CD64의 존재 하에 TriNKET의 효능을 뒷받침하는 추가적인 증거를 제공한다. 이들 세포독성 분석에서, 제3 인간 AML 세포주인 Mv4-11을 사용하였다. Mv4-11 세포는 저수준의 CD64를 발현시키며, THP-1과 Molm-13 세포 간에 그들의 표면 상의 CD64 수준에 대해서는 하락한다(도 51A 내지 도 51C).
TriNKET는 FcγRI 발현과 상관없이 AML 세포주 상에서 효능을 입증한다
도 53A 내지 도 53c는 표적으로서 3가지의 인간 AML 세포주를 이용하는 인간 NK 세포독성 분석을 나타낸다. CD33에 대한 단클론성 항체는 CD64를 발현시키지 않는 Molm-13 세포(도 53B)에 대해 양호한 효능을 나타낸다. CD64를 발현시키지만, THP-1보다는 더 낮은 수준인 Mv4-11 세포(도 53A)는 단클론성 항-CD33에 의해 감소된 효능을 나타내었다. THP-1 세포(도 53c)는 단클론성 항-CD33 단독에 의해 효과 없음을 나타낸다. 종양 세포 상의 CD64 발현과 상관없이, TriNKET는 본 명세서에서 시험한 모든 종양 세포에 대해 인간 NK 세포 반응을 매개할 수 있었다.
도 53A 내지 도 53c는 표면 상의 고수준의 고친화도 FcR 발현때문에, THP-1 세포가 단클론성 항체 요법에 대해 보호되었다는 것을 나타낸다. TriNKET는 NK 세포의 표면 상에서 2개의 활성화 수용체를 표적화함으로써 이 보호를 피하였다. 세포독성 데이터는 공동배양물 활성화 실험에서 알 수 있는 것과 직접적으로 상관관계가 있었다. TriNKET는 THP-1 세포에 의해 알게된 mAb 요법으로부터의 보호를 피할 수 있었고, 고수준의 FcR에도 불구하고 NK 세포 매개 용해를 유도한다.
PBMC 배양물에서 정상 골수 및 정상 B 세포의 사멸: TriNKET는 더 적은 표적 비표적 부작용을 통해 더 양호한 안전성 프로파일을 제공한다
NK 세포 및 CD8 T 세포가 자신을 정상으로 인식하는 메커니즘은 종양세포와 다르지만 자연살해 세포와 CD8 T 세포는 둘 다 종양 세포를 직접적으로 용해시킬 수 있다. NK 세포의 활성은 활성화(NCR, NKG2D, CD16 등) 및 저해(KIR, NKG2A 등) 수용체로부터의 신호 균형에 의해 조절된다. 이들 활성화 신호와 저해 신호의 균형은 NK 세포가 스트레스, 바이러스 감염 또는 형질전환 자가-세포로부터 건강한 자가 세포를 결정하게 한다. 자가 관용의 이러한 '빌트인' 메커니즘은 정상의 건강한 조직을 NK 세포 반응으로부터 보호하도록 도울 것이다. 이런 원칙을 연장시키기 위해, NK 세포의 자가 관용은 TriNKET가 종양을 벗어난 부작용 없이, 또는 증가된 치료적 창에 의해 자가와 종양 둘 다에 대해 발현된 항원을 표적화하는 것을 가능하게 할 것이다.
자연 살해 세포와 달리, T 세포는 활성화 및 효과기 기능에 대한 MHC 분자에 의해 제시되는 특정 펩타이드의 인식을 필요로 한다. T 세포는 면역요법의 1차 표적이었고, T 세포 반응이 종양으로 다시 보내지는 다수의 전략이 개발되었다. T 세포 이중특이성, 관문 저해제 및 CAR-T 세포는 모두 FDA에 의해 승인되었지만, 종종 용량-제한 독성을 겪고 있다. T 세포 이중특이성 및 CAR-T 세포는 종양 세포 표면 상에서 표적 항원에 대한 결합 도메인을 이용하고, 효과기 세포에 활성화 신호를 도입하도록 조작된 신호전달 도메인을 이용함으로써 TCR-MHC 인식 시스템 주변에서 작동한다. 항-종양 면역 반응을 유발하는데 효과적이지만, 이들 요법은 종종 사이토카인 방출 증후군(CRS) 및 표적 비표적 부작용과 결합된다. TriNKET는 NK 세포 활성화 및 저해의 천연 시스템보다 더 중요하지 않기 때문에 이와 관련하여 독특하다. 대신에, TriNKET는 균형이 흔들리도록 설계되며, NK 세포에 대한 추가적인 활성화 신호를 제공하는 한편, 건강체 자신에 대한 NK 관용을 유지한다.
PBMC는 밀도 구배 원심분리에 의해 전혈로부터 단리시켰다. 임의의 오염 적혈구를 ACK 용해 완충제에서 인큐베이션에 의해 용해시켰다. PBMC를 PBS에서 3x 세척하였고, 총 PBMC를 계수하였다. PBMC는 1차 세포 배양물 배지에서 106개의 세포/㎖로 조절하였다. 1 ㎖의 PBMC를 24 웰 플레이트의 웰에 파종시키고 나서, 표시된 TriNKET 또는 mAb를 PBMC 배양물에 10㎍/㎖로 첨가하였다. 세포를 밤새 37℃에서 5% CO2와 함께 배양시켰다. 다음 날(24시간 이후) PBMC를 배양물로부터 채취하고 나서, FACS 분석을 위해 준비하였다. CD45+; CD19+ B 세포 및 CD45+; CD33+; CD11b+ 골수 세포의 백분율을 상이한 처리군에 대해 분석하였다.
도 54B 및 도 54D는 자가 골수 세포가 TriNKET 매개 NK 세포 반응으로부터 보호된다는 것을 나타낸다. 도 54A 및 도 54B는 shows 건강한 공여자로부터의 B 세포가 TriNKET 매개 용해에 민감하지만, 골수 세포는 TriNKET 용해에 대해 내성이 있다는 것을 나타낸다. CD20을 표적화하는 TriNKET로 처리한 PBMC는 CD45+ 림프구 집단에 의한 CD19+ B 세포의 감소된 빈도를 나타내었지만(도 54A), CD45+, CDD3-, CD56- 림프구 집단에서의 효과는 없었다(도 54C). 이들 배양물에서, CD45+, CD19+ 골수 세포의 빈도(도 54B), 또는 CD33+, CD 33+, CD11b+ 골수 세포의 빈도(도 54D)는 변화되지 않았다.
TriNKET는 장기간 공동배양물에서 SkBr-3 종양 세포의 hPBMC 사멸을 매개한다
1차 인간 PBMC 세포독성 분석
도 55는 인간 PBMC가 있는 배양물에서 SkBr-3 세포의 장기간 사멸을 나타낸다. 배양된 단독 SkBr-3 세포가 증식될 때, 60시간에 거의 2배가 된다. 인간 PBMC가 배양물 내 SkBr-3 세포에 첨가될 때, 증식 속도는 느려지며, CD33을 표적화하는 아이소타입 대조군 TriNKET가 첨가될 때, 증식은 또한 느려지지만, 정도는 더 줄어든다. 배양물을 트라스투주맙 SkBr-3으로 처리할 때, 더 이상 증식하지 않으며, 0시점으로부터 세포의 80%만이 60시간 후에 남아있다. SkBr-3 세포는 HER2 신호 차단에 대해 민감하기 때문에, SkBr-3 세포 성장에 대한 효과는 HER2 신호 차단에 의해 또는 Fc 효과기 기능, 예컨대 ADCC를 통해 매개될 수 있었다.
실시예 15
시험관내 mcFAE-C26.99 TriNKET의 항-종양 효능
뮤린 cFAE-C26.99 TriNKET의 결합 활성을 입증하기 위해, Tyrp-1-양성 B16F10 흑색종 세포(도 58A) 및 뮤린 NKG2D를 과발현시키는 EL4 계통(EL4-mNKG2D, 도 58B)에 대한 유세포분석에 의해 단클론성 항체와의 비교에서 직접 결합을 측정하였다.
mcFAE-C26.99 TriNKET가 세포독성을 매개하는 능력을 보유하는지의 여부를 시험하기 위해, 뮤린 IL-2-활성화된 NK 세포에 의한 Tyrp-1-양성 B16F10 종양 표적의 사멸을 측정하였다. 도 59에 나타낸 바와 같이, 뮤린 NK 세포는 mcFAE-C26.99의 존재 하에 그들의 세포독성 활성을 증가시켰다. 중요하게는, 항-Tyrp-1 단클론성 항체 TA99는 단지 미미한 효과를 나타내었다.
mcFAE-C26.99 TriNKET에 의해 매개되는 증가된 NK 세포독성
웰당 약 5×103개의 B16F10 흑색종 세포를 분석 2일 전에 파종시켰다. 실험일에, 5×104개의 뮤린 IL-2-활성화된 NK 세포를 TA99 단클론성 항체 또는 mcFAE-C26.99 TriNKET의 존재 하에 첨가하였다(mcFAE-C26.99는 Fc로서 마우스 IgG2를 갖는 mC26 및 TA99의 이형이량체이다. Gm 돌연변이는 이형이량체를 생성하기 위해 사용한 이형이량체화 돌연변이를 지칭한다). 4배 희석시킨 20㎍/㎖의 항체를 사용하였다. 4시간의 공동 배양 후에, LDH 방출을 위한 CytoTox96 키트를 이용하여 세포독성 백분율을 평가하였다. 점선은 항체의 부재 하의 기준 세포독성을 나타낸다.
Figure pct00022
실시예 16
생체내 mcFAE-C26.99 TriNKET의 항-종양 효능
mcFAE-C26.99가 생체내 항종양 기능을 유발하는지의 여부를 시험하기 위해, C57BL/6 마우스를 2×105개의 B16F10 종양 세포로 피하 주사하였다. 마우스를 아이소타입 대조군, 단클론성 TA99 항체 또는 mcFAE-C26.99 TriNKET로 처리하였다. 단클론성 TA99 항체에 의한 처리는 아이소타입으로 처리한 대조군에서와 같이 유사한 종양 진행을 나타내었다. 그러나, mcFAE-C26.99 TriNKET의 투여는 아이소타입 처리군에 비해 지연된 종양 진행을 초래하였다. 약 2×105개의 B16F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 접종 후 제6일에 마우스를 무작위화시켰다(그룹당 n=10). 마우스를 150㎍의 용량으로 주사되는(제6일, 제8일, 제10일, 제12일, 제14일, 제16일 및 제21일)(도 60A) 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4 및 마우스 항-Tyrp-1 단클론성 항체 또는 (도 60B) 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4 및 mcFAE-C26.99 TriNKET을 복강내로 처리하였다. 28일 동안 종양 성장을 평가하였다. 그래프는 개개 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
피하 B16F10 종양 모델에 추가로, mcFAE-C26.99 TriNKET는 또한 파종성 종양 상황에서의 종양 효능에 대해 시험하였다. 1×105개의 B16F10 세포를 마우스에 정맥내로 주사하였다. 낮은(300㎍/주사) 및 높은(600㎍/주사) 항체 용량으로 제4일 또는 제7일에 치료를 시작하였다. 접종 후 제18일에, 폐 전이를 계수하였다. 종양 접종 후 제4일 및 제7일에 시작한 치료는 TA99 단클론성 항체 또는 mcFAE-C26.99 TriNKET가 아이소타입-처리 대조군에 비해 고농도에서 사용될 때 감소된 수의 폐 전이를 초래하였다. 저농도에서, mcFAE-C26.99 TriNKET만이 종양 부담을 감소시켰다(도 61A). 종양 접종 후 제7일에 시작해서 항체를 투여하였을 때 유사한 효과가 보였다. 전반적으로, mcFAE-C26.99 TriNKET 요법은 모든 시험 조건에서 단클론성 TA99 항체에 비해 더 적은 수의 폐 전이를 초래하였다. 약 1×105개의 B16F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스(그룹당 n=8)의 꼬리 정맥에 정맥내로 주사하였다. 마우스를 비처리로 두거나 대조군 단클론성 항체(아이소타입, 클론 C1.18.4), 단클론성 TA99 항체 또는 TA99 TriNKET(mcFAE-C26.99)로 복강내로 처리하였다. 도 61A는 항체를 150㎍ 용량으로(제4일, 제6일, 제8일, 제11일, 제13일, 제15일) 투여할 때의 종양 부담을 나타낸다. 도 61B는 항체를 150㎍ 용량으로(제7일, 제9일, 제11일, 제13일, 제15일) 투여할 때의 종양 부담을 나타낸다. 종양 시험감염 후 18일에, 마우스를 안락사시키고 나서, 표면 폐 전이를 점수화하였다(도 61B).
실시예 17
생체내 mcFAE-C26.99 TriNKET와의 병용 요법
다른 항-종양제와 병용할 때 본 개시내용의 다중-특이성 단백질의 항-종양 반응 수준을 결정하였다. mcFAE-C26.99에 의해 매개되는 항-종양 면역 반응이 증폭될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 항-PD-1 항체 또는 IL-2 사이토카인을 이용하는 조합물 연구를 수행하였다. C57BL/6 마우스를 2×105개의 B16F10 종양 세포로 피하 주사하였다. 마우스를 아이소타입 대조군, mcFAE-C26.99 TriNKET, 항-PD-1 단클론성 항체, 또는 mcFAE-C26.99와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물로 처리하였다. mcFAE-C26.99 또는 항-PD-1 중 하나에 의한 단일요법은 10% 반응자 마우스를 초래하였다. 그러나, mcFAE-C26.99와 항-PD-1 단클론성 항체의 병용 요법은 종양 진행을 지연시켰고, 아이소타입-처리군에 비해 40% 반응자 마우스를 야기하였다.
항-PD-1 단클론성 항체와의 병용 요법
2×105개의 B16F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 접종 후 제6일에 마우스를 무작위화시켰다(그룹당 n=10). 마우스를 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4와 래트 IgG2a 단클론성 항체 2A3 및 mcFAE-C26.99; 아이소타입 대조군과 항-PD-1 단클론성 항체 클론 RPM1-14; 또는 mcFAE-C26.99와 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물로 복강내로 처리하였다. 동물은 단일 용량의 150㎍(mcFAE-C26.99 및 C1.18.4) 및 200㎍(항-PD-1 단클론성 항체 및 2A3)으로 상기 나타낸 바와 같이 주사하였다. 30일 동안 종양 성장을 평가하였다. 도 66a 내지 도 66c의 그래프는 개개 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 도 66a는 래트 IgG2a 단클론성 항체 2A3을 갖는 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4, 또는 mcFAE-C26.99로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 66b는 아이소타입 대조군 또는 항-PD-1 단클론성 항체 클론 RPM1-14로 복강내로 처리한 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 66c는 mcFAE-C26.99 및 항-PD-1 단클론성 항체의 조합물로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다.
IL-2와의 병용 요법
mcFAE-C26.99와 재조합 인간 IL-2의 조합물의 투여 시 종양 크기에 대한 효과를 또한 평가하였다. C57BL/6 마우스를 2×105개의 B16F10 종양 세포로 피하 주사하였다. 이들 마우스는 아이소타입 대조군, mcFAE-C26.99 TriNKET, 또는 IL-2로 개개로 치료하거나, mcFAE-C26.99와 IL-2의 조합물로 치료하였다. mcFAE-C26.99(도 67a) 또는 IL-2(도 67b) 중 하나에 의한 단일요법은 10% 반응자 마우스를 초래하였다. 그러나, 병용 요법(도 67c)은 종양 진행을 지연시켰고, 아이소타입-처리군에 비해 70 내지 90%의 반응자 마우스를 야기하였다.
이 실험에 대해, 2×105개의 B16F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 접종 후 제6일에 마우스를 무작위화시켰다(그룹당 n=10). 마우스를 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4 또는 mcFAE-C26.99; 아이소타입 대조군 또는 IL-2; 또는 mcFAE-C26.99와 IL-2의 조합물로 복강내로 처리하였다. 동물은 단일 용량의 150㎍(mcFAE-C26.99 및 C1.18.4) 및 100.000IU(IL-2, 1일 2회)으로 상기 나타낸 바와 같이 주사하였다. 무 종양으로 남아있는 조합 그룹으로부터의 3마리 마우스를 이용하여 40일 동안 종양 성장을 평가하였다. 그래프는 개개 마우스의 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 67a는 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4 또는 mcFAE-C26.99로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 67b는 아이소타입 대조군 또는 IL-2로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다. 도 67c는 mcFAE-C26.99 및 IL-2의 조합물로 복강내로 처리한 마우스의 종양 크기(㎣)를 나타내는 선 그래프이다.
실시예 18
HER2-양성 세포에 대한 TriNKET, 단클론성 항체, 또는 이중특이성 항체에 의해 매개된 휴지 인간 NK 세포의 세포독성 활성
PBMC는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. 단리된 PBMC를 세척하고, NK 세포 단리를 위해 준비하였다. NK 세포를 자기 비드에 의한 음성 선택 기법을 이용하여 단리시켰고; 단리된 NK 세포의 순도는 전형적으로 90% 초과의 CD3-CD56+였다. 단리된 NK 세포는 100ng/㎖ IL-2를 함유하는 배지에서 배양시키거나 사이토카인 없이 밤새 휴지시켰다. 다음날에 세포독성 분석에서 IL-2-활성화 또는 휴지 NK 세포를 사용하였다.
DELFIA 세포독성 분석:
관심 대상의 암 표적을 발현시키는 인간암 세포주를 배양물로부터 채취하고, 세포를 HBS로 세척하고 나서, BATDA 시약(퍼킨 엘머 AD0116)으로 표지를 위해 106개의 세포/㎖로 성장 배지에서 재현탁시켰다. 표적 세포의 표지를 위해 제조업자의 설명서에 따랐다. 표지 후에, 세포를 HBS로 3x 세척하고 나서, 배양 배지에서 0.5 내지 1.0×105개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 배경 웰을 준비하기 위해, 표지 세포의 분취액을 따로 떼어 두었고, 세포를 배지 밖에서 교반시켰다. 100㎕의 배지를 웰에 조심해서 3회 첨가하여 펠릿화된 세포의 붕괴를 피하였다. 100㎕의 BATDA 표지 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 표적 세포로부터의 자발적 방출을 위해 웰을 보호하고, 1% Triton-X의 첨가에 의해 표적 세포의 최대 용해에 대해 웰을 제조하였다. 단클론성 항체 또는 관심 대상의 종양 표적에 대한 TriNKET를 배양 배지에서 희석시켰고, 50㎕의 희석된 mAb 또는 TriNKET를 각각의 웰에 첨가하였다. 휴지 및/또는 활성화된 NK 세포를 배양물로부터 채취하였고, 세포를 세척하고 나서, 목적하는 E:T 비에 따라서 배양 배지에서 105 내지 2.0×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 50㎕의 NK 세포를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여 총 200㎕의 배양 용적을 만들었다. 분석을 진행하기 전에 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 2 내지 3시간 동안 인큐베이션시켰다.
2 내지 3시간 동안 배양시킨 후에, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하였고, 세포를 200g에서5분 동안 원심분리에 의해 펠릿화시켰다. 20㎕의 배양물 상청액을 제조업자로부터 제공된 깨끗한 미량정량판에 옮기고, 200㎕의 실온 유로퓸 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 빛으로부터 보호하였고, 250 rpm에서 15분 동안 플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. 빅터 3 또는 SpectraMax i3X 기기 중 하나를 이용하여 플레이트를 판독하였다. 특이적 용해%를 다음과 같이 계산하였다: 특이적 용해% = ((실험적 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출)) * 100%.
단클론성 항체와 이중특이성 NK 세포 관여자의 조합물은 TriNKET 활성을 개괄하지 않는다
도 68은 HER2-양성 세포 Colo-201 세포주에 대한 TriNKET, 단클론성 항체, 또는 이중특이성 항체에 의해 매개된 휴지 인간 NK 세포의 세포독성 활성을 나타낸다. HER2를 표적화하는 TriNKET(ADI-29404(F04))는 휴지된 인간 NK 세포에 의한 Colo-201 세포의 최대 용해를 유도하였다. FcR 결합을 없애기 위해 D265A 돌연변이를 TriNKET의 CH2 도메인에 도입하였다. HER2-TriNKET(ADI-29404 (F04))-D265A는 Colo-201 세포 용해를 매개하지 못하는데, NK 세포 상에서 CD16 및 NKG2D의 이중 표적화 중요성을 입증한다. NK 세포 상의 이중 표적화 중요성을 추가로 입증하기 위해, 단클론성 항체 트라스투주맙을 사용하여 HER2를 표적화하고, NK 세포에 의해 ADCC를 매개하며, 트라스투주맙 단독은 Colo-201 세포의 NK 세포 용해를 증가시킬 수 있지만, 트라스투주맙 단독에 의해 달성된 최대 용해는 TriNKET에 비해 약 4x 더 낮았다. 동일한 분자 상에서 CD16 및 NKG2D 표적화를 갖는 중요성을 이해하기 위해, TriNKET(ADI-29404 (F04)) 활성을 트라스투주맙과 조합한 HER2 및 NKG2D를 표적화하는 이중특이성 항체의 활성과 비교하였다. 등물 농도로 사용할 때, 이중특이성과 트라스투주맙의 조합은 휴지 인간 NK 세포에 의해 Colo-201 세포의 최대 용해를 매개할 수 없었다. 트라스투주맙 + 이중특이성 조합물의 실패는 하나의 분자에서 TriNKET의 삼중특이성-결합을 함유하는 것의 중요성을 입증한다.
실시예 19
실시예 14는 HER2-, CD33- 및 BCMA-TriNKET가 휴지 및 IL-2-활성화된 인간 NK 세포의 세포독성을 향상시킨다는 것을 입증한다. 본 실시예는 IL-12- 및 IL-15-활성화된 인간 NK 세포 상에서 TriNKET의 효과를 추가로 특성규명한다. 3가지 상이한 종양-연관 항원, 즉, HER2, CD33 및 BCMA와 관련하여 세포독성을 측정하였고, 실시예 14에 기재한 바와 같은 DELFIA 세포독성 분석을 이용하여 인간 PBMC로부터 NK 세포를 단리시켰다.
HER2-발현 세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해, 인간 NK 세포를 IL-2, IL-12 또는 IL-15와 함께 배양시키거나, 사이토카인 없이 밤새 휴지시켰다. 휴지 또는 사이토카인-활성화된 NK 세포는 연속 희석된 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-유래 HER2-TriNKET의 존재 하에 HER2-저 786-O 종양 세포와 함께 공동배양시켰다. 도 73A에 나타낸 바와 같이, 휴지 인간 NK 세포는 786-O 표적 세포의 사멸 없음을 나타내었고, 트라스투주맙은 786-O 표적 세포의 용량을 증가시킬 수 없었다. HER2-TriNKET는 786-O 표적 세포의 휴지 NK 세포 용해를 증가시킬 수 있었지만, 용해는 단지 약 20%에 도달되었다. 도 73B 내지 도 73D에 나타내는 바와 같이, 사이토카인-활성화된 NK 세포는 786-O 표적 세포와 함께 공동 배양시켰을 때 약 20%의 특이적 용해를 나타내었다. 휴지 NK 세포와 달리, 트라스투주맙은 약 40%의 특이적 용해에 대한 사이토카인-활성화된 NK 세포의 활성을 증가시킬 수 있었다. HER2-TriNKET는 786-O 표적 세포의 사이토카인-활성화된 NK 세포 용해를 더 강력하게 향상시켰다. 특이적 용해는 또한 사이토카인-활성화된 NK 효과기 세포와 함께 트라스투주맙에 비해 HER2-TriNKET에 의해 더 높은 최대값이 도달되었다.
CD33-발현 세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해, 인간 NK 세포를 IL-2, IL-12 또는 IL-15와 함께 배양시키거나, 사이토카인 없이 밤새 휴지시켰다. 휴지 또는 사이토카인-활성화된 NK 세포를 연속 희석시킨 린투주맙, 등록상표 항-CD33 단클론성 항체, 또는 등록상표 항-CD33 항체로부터 유래된 CD33-TriNKET의 존재 하에 CD33-양성 Molm-13 종양 세포와 함께 공동배양시켰다. 도 74A에 나타낸 바와 같이, 휴지 인간 NK 세포는 Molm-13 표적 세포의 사멸을 나타내지 않았으며, 단클론성 항체는 둘 다 Molm-13 표적 세포의 NK 세포 용해의 적은 증가만을 야기하였다. 도 74B 내지 도 74D에 나타낸 바와 같이, CD33-TriNKET는 약 30%의 특이적 용해에 대한 Molm-13 표적 세포의 휴지 NK 세포 용해를 증가시킬 수 있었다. 사이토카인-활성화된 NK 세포는 Molm-13 표적 세포와 함께 공동배양시켰을 때 약 35 내지 55% 용해를 나타내었다. 휴지 NK 세포와 달리, 단클론성 항체는 둘 다 60 내지 70%의 특이적 용해에 대해 사이토카인-활성화된 NK 세포의 활성을 증가시킬 수 있다. CD33-TriNKET는 Molm-13 표적 세포의 사이토카인-활성화된 NK 세포 용해를 더 강력하게 향상시켰다. 특이적 용해는 또한 사이토카인-활성화된 NK 효과기 세포와 함께 단클론성 항체에 비해 CD33-TriNKET에 의해 더 높은 최대값이 도달되었다.
BCMA-발현 세포에 대한 세포독성을 측정하기 위해, 인간 NK 세포를 IL-2, IL-12 또는 IL-15와 함께 배양시키거나, 사이토카인 없이 밤새 휴지시켰다. 휴지 또는 사이토카인-활성화된 NK 세포를 연속 희석시킨 EM-901 항-BCMA 항체 또는 EM-901-유래 BCMA-TriNKET의 존재 하에 BCMA-양성 KMS12-PE 종양 세포와 함께 공동 배양시켰다. 도 75A에 나타낸 바와 같이, 휴지 인간 NK 세포는 KMS12-PE 표적 세포의 사멸을 나타내지 않았고, EM-901 및 BCMA-TriNKET는 KMS12-PE 표적 세포의 NK 세포 용해의 적은 증가만을 나타내었다. 도 75B 내지 도 75D에 나타낸 바와 같이, 사이토카인-활성화된 NK 세포는 KMS12-PE 표적 세포와 함께 공동 배양시켰을 때 약 10 내지 40%의 용해를 나타내었고, 용해 정도는 상이한 사이토카인으로 처리한 NK 세포에 대해 달랐다. 휴지 NK 세포와 달리, EM-901은 사용한 사이토카인에 따라서 약 40 내지 80%의 특이적 용해에 대한 사이토카인-활성화된 NK 세포의 활성을 증가시킬 수 있었다. BCMA-TriNKET는 KMS12-PE 표적 세포의 사이토카인 활성화된 NK 세포 용해를 더 강하게 향상시켰다. 특이적 용해는 또한 사이토카인-활성화된 NK 효과기 세포와 함께 모 단클론성 항체에 비해 BCMA-TriNKET에 의해 더 높은 최대값이 도달되었다.
포말리도마이드는 면역조절 활성을 갖는 것으로 보고된 화합물이다. BCMA-발현 세포에 대한 NK 세포의 세포독성에 대한 포말리도마이드 및/또는 IL-2의 효과를 평가하기 위해, 인간 NK 세포를 휴지시키거나, IL-2, 포말리도마이드, 또는 IL-2와 포말리도마이드의 조합물과 함께 밤새 배양시켰다. 휴지 또는 활성화된 NK 세포를 연속 희석시킨 EM-901 또는 EM-901-유래 BCMA-TriNKET의 존재 하에 KMS12-PE 표적 세포와 함께 공동배양시켰다. 도 76A에 나타낸 바와 같이, 휴지 인간 NK 세포는 KMS12-PE 표적 세포의 사멸을 나타내지 않았다. EM-901은 KMS12-PE 표적 세포의 NK 세포 용해의 적은 증가만을 나타낸 반면, BCMA-TriNKET는 더 높고 더 강력한 특이적 용해를 입증하였다. 도 76B에 나타낸 바와 같이, 포말리도마이드 활성화된 NK 세포는 휴지 NK 세포와 유사한 KMS12-PE 표적 세포의 용해를 나타내었다. BCMA-TriNKET는 휴지 NK 세포에 의한 용해의 증가보다 더 큰 정도로 포말리도마이드-활성화된 NK 세포에 의한 표적 세포의 용해를 증가시켰다. 도 76C에 나타낸 바와 같이, IL-2-활성화된 NK 세포는 공동배양물에서 표적 세포의 약 20%를 용해시켰다. EM-901은 KMS12-PE 표적 세포의 NK 세포 용해를 약 40%로 증가시킨 반면, BCMA-TriNKET는 특이적 용해를 약 60%로 증가시켰다. 따라서, NK 세포는 포말리도마이드에 의한 치료에 비해 IL-2에 의한 치료 후에 더 활성이었다. IL-2와 포말리도마이드를 NK 세포 활성화를 위해 조합할 때, NK 세포는 약 30%의 특이적 용해의 훨씬 더 높은 활성을 입증하였다. EM-901은 IL-2/포말리도마이드-활성화된 NK 세포를 약 60%로 증가시키고, BCMA-TriNKET는 용해를 약 80%로 증가시켰다. 이 결과는 이의 모 항체에 비해 TriNKET의 더 큰 효능을 입증하였고, 본 실시예에서 시험한 다른 조건과 일치된다.
실시예 20
본 실시예는 HER2-TriNKET 및 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙의 존재 하에 HER2-발현 표적 세포에 대한 인간 CD8+ T 세포의 세포독성을 나타낸다.
간략하게, 인간 PBMC는 밀도 구배 원심분리를 이용하여 인간 말초 혈액 버피코트로부터 단리시켰다. 단리된 PBMC는 1㎍/㎖ 콘카나발린 A(Concanavalin A: ConA)로 37℃에서 18시간 동안 자극하였다. 이어서, ConA를 제거하고, PBMC를 25 U/㎖ IL-2와 함께 37℃에서 4일 동안 배양시켰다. 자기 비드에 의한 음성 선택 방법을 이용하여 CD8+ T 세포를 정제하였다. 정제된 CD8+ T 세포를 10ng/㎖ IL-15를 함유하는 배지에서 37℃에서 3 내지 14일 동안 배양시켰다.
세포 집단의 순도뿐만 아니라 NKG2D, CD16 및 PD-1의 발현을 평가하였다. 간략하게, 세포는 CD3, CD8, CD56, CD4, NKG2D 및 CD16에 대한 형광단 접합 항체로 염색하고, 유세포분석에 의해 분석하였다. 도 77A에 나타낸 바와 같이, CD8+ T 세포는 고순도를 가졌다. CD3+CD8+ T 세포는 NKG2D에 대해 균일하게 양성이고, CD16에 대해 음성이었다. CD3+CD8+ T 세포의 약 20%는 PD-1을 발현시켰다.
세포의 추적을 허용하기 위해 HER2를 발현시키고, BacMam 3.0 NucLight Green(#4622)으로 형질도입한 인간 암 세포주 HCC1954를 표적 세포로서 사용하였다. 세포를 HER2 및 PD-L1에 대한 형광단-접합 항체로 염색하였고, HER2 및 PD-L1의 발현을 유세포분석에 의해 분석하였다. 도 77B에 나타낸 바와 같이, HER2 및 PD-L1 발현은 HCC1954 세포 상에서 검출되었다.
T 세포의 세포독성에 대한 HER2-TriNKET, 펨브롤리주맙, 및 이들의 조합물의 효과를 장기간 CD8+ T 세포의 세포독성 분석을 이용하여 평가하였다. 간략하게, HCC1954 표적 세포를 배양물로부터 채취하고 나서, 세척 후, 성장 배지에서 재현탁시키고, 96-웰 플레이트에서 5,000개의 세포/웰로 플레이팅한다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. HER2-TriNKET, 펨브롤리주맙, 및 이들 각각의 아이소타입 대조군을 배양 배지에서 희석시켰다. 조합한 50㎕의 항체와 TriNKET를 각각의 웰에 첨가하였다. CD8+ 효과기 T 세포를 배양물로부터 채취하고 나서, 세척 후, 배양 배지에서 (10:1의 E:T 비에 대해) 1×106개의 세포/㎖ 또는 (25:1의 E:T 비에 대해) 2.5×106개의 세포/㎖로 재현탁시켰다. 50㎕의 CD8+ T 세포를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하여 각각의 웰에서 총 200㎕의 배양 용적을 만들었다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 최대 7일 동안 인큐베이션시켰다. 상의 영상 및 녹색 채널을 IncuCyte S3 기지를 이용하여 웰당 2개의 영상으로 1시간마다 수집하였다. IncuCyte S3 소프트웨어를 이용하여 영상을 분석하였다. 웰에서 생 종양 셀포의 수를 녹색 물체의 계수에 의해 나타내었다.
도 78a에 나타낸 바와 같이, 20nM HER2-TriNKET와 6.7nM, 20nM, 또는 67nM 펨브롤리주맙의 조합물은 HER2-TriNKET 또는 펨브롤리주맙 단독보다 더 강한 종양 사멸 효과를 나타내었다. 조합물 효과는 더 높은 E:T 비 및 증가된 펨브롤리주맙 농도에 의해 더 실질적이었다. HER2-TriNKET를 0.04 nM의 저용량으로 사용하고 펨브롤리주맙을 67nM으로 사용하였을 때, 상이한 공여자로부터 단리한 CD8+ 효과기 T 세포에 의해 유사한 조합 효과가 관찰되었다(도 78b).
실시예 21
본 실시예는 HER2-TriNKET 및 TLR 작용제(인비보겐 TL8-506)의 존재 하에 HER2-발현 인간 유방암 세포주 Skbr-3에 대한 인간 PBMC의 세포독성을 나타낸다.
간략하게, Skbr-3 세포를 형질도입하여 NucLight Green(에센 바이오사이언스(Essen BioScience) 4475)를 안정하게 발현시켰다. 퓨로마이신 선택 후에, 배양물로부터 세포를 채취하고 나서, 배양 배지에서 재현탁시켰다. 3×103개의 표적 세포를 100㎕ 배지에서 편평-바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 20시간 동안 인큐베이션시켰다.
50㎕의 HER2-TriNKET 및/또는 배양 배지에서 희석시킨 TLR 작용제를 각각 10㎍/㎖ 및 50㎍/㎖의 최종 분석 농도로 첨가하였다. 새로 가공한 인간 PBMC를 배양 배지에서 1.2×106개의 세포/㎖로 재현탁시키고, 표적-단독 대조군(50㎕의 배양 배지를 받음)을 제외한 50㎕의 PBMC를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 분석 기간 동안 인큐사이트(Incucyte) 기기(에센 바이오사이언스)에 넣었고, 상 및 녹색 형광 영상을 4일 동안 매시간 획득하였다. 파편을 제외하기 위해 최소 면적 제한으로 녹색 사건 마스크를 이용하여 세포 계수를 얻었다. 각각의 시점에 세포 계수를 성장 백분율을 얻기 위해 시작 SKBR-3 녹색 세포 계수에 정규화시켰다.
도 79에 나타낸 바와 같이, 인간 PBMC 단독의 첨가는 SKBR-3 표적 세포의 증식에 대한 효과를 발휘하지 않았지만, 배양물 내 HER2-TriNKET의 동시 포함은 PBMC가 종양 세포 성장을 실질적으로 저해하는 것을 가능하게 하였다. 시험 용량에서, TLR 작용제는 초기 계수로부터 SKBR-3 세포 집단을 서서히 감소시키기 위해 PBMC를 자극하였다. HER2-TriNKET와 TLR 작용제의 조합물은 더 강력하였고, 4일 이내에 거의 모든 표적 세포의 사멸을 용이하게 하였다.
실시예 22
실시예 17은 mcFAE-C26.99 TriNKET가 B16F10 종양 세포 이종이식 마우스 모델에서 단독으로 또는 IL-2 또는 항-PD-1 단클론성 항체와의 조합물로 종양 성장을 억제하였다는 것을 입증한다. 본 실시예는 mcFAE-C26.99 TriNKET와 IL-12의 조합물을 추가로 특성규명한다.
간략하게, 2×105개의 B16F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 접종 후 제5일에 마우스를 무작위화시켰다(그룹당 n=10). 마우스는 (A) 7.5㎎/㎏ mcFAE-C26.99 TriNKET 또는 7.5㎎/㎏ 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4, (B) 1㎍ 재조합 뮤린 IL-12(rmIL-12) 또는 7.5㎎/㎏ 아이소타입 대조군 마우스 IgG2a 단클론성 항체 C1.18.4, 또는 (C) 7.5㎎/㎏ mcFAE-C26.99 TriNKET와 1㎍ rmIL-12의 조합물로 복강내로 주사하였다. 61일 동안 종양 성장을 평가하고, 마우스의 생존을 모니터링하였다.
도 80a 내지 도 80c에 나타낸 바와 같이, mcFAE-C26.99 TriNKET(도 80a) 또는 뮤린 IL-12(도 80b)의 단일요법은 단독으로 B16F10 종양 성장을 억제하는 데 효과적이었지만, mcFAE-C26.99 TriNKET와 IL-12의 조합 요법(도 80c)은 더 실질적인 효과를 가져서, 치료 마우스의 40%에서 완전한 종양 퇴행을 야기하였다. 도 81에 나타낸 바와 같이, 전반적인 생존은 병용 요법에 의해 상당히 연장되었다: 병용 요법으로 치료한 마우스의 70%는 제61일에 여전히 생존한 반면, 중위 생존 시간은 대조군 및 TriNKET-처리군에서 단지 20일이고, IL-12 단일 제제 처리군에서 37일이었다.
참고에 의한 포함
본 명세서에 언급된 특허 문헌 및 과학적 논문 각각의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.
균등론
본 발명은 이의 정신 또는 본질적 특징으로부터 벗어나는 일 없이 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서 앞서 언급한 실시형태는 본 명세서에 기재된 발명을 제한하기보다는 예시적인 모든 사항에 고려되어야 한다. 따라서 본 발명의 범주는 앞서 언급한 설명에 의하기 보다는 첨부하는 청구범위로 나타내며, 청구범위의 의미 및 범위 내인 모든 변화는 이에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> DRAGONFLY THERAPEUTICS, INC. <120> COMBINATION THERAPY OF CANCER INVOLVING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT ACTIVATE NATURAL KILLER CELLS <130> WO/2019/157332 <140> PCT/US2019/017284 <141> 2018-02-08 <150> US 62/628,178 <151> 2018-02-08 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg 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Synthetic polypeptide <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro Thr 1 5 <210> 69 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 81 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro 85 90 95 Asp Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 84 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr 1 5 10 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Ser Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 93 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 94 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Gly Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 95 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 96 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Glu Val Gln Leu Val Glu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 99 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 104 Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 105 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 109 Ala Arg Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 110 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 111 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> VARIANT <222> (102)..(102) <223> Met, Leu, Ile, Val, Gln, or Phe <400> 111 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Met, Leu, Ile, Val, Gln, or Phe <400> 112 Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 15 <210> 113 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Met, Leu, Ile, Val, Gln, or Phe <400> 113 Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 114 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 114 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 115 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 115 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 116 Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 117 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 118 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 118 Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 119 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 120 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 121 Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 122 Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 123 Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 124 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 124 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 125 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 125 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 126 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 127 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 127 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 130 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 Val

Claims (47)

  1. 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질에,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(stem cell transplant: SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  2. 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질; 또는 상기 단백질을 포함하는 제형을,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 47의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 48의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열로 표시되는 상보성-결정 영역 1(complementarity-determining region 1: CDR1) 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 상보성-결정 영역 2(CDR2) 서열 및 서열번호 113의 아미노산 서열로 표시되는 상보성-결정 영역 3(CDR3) 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 93의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 59의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 104의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 57의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 58의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 103의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 60의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 61의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  8. 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질에,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  9. 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질 또는 상기 단백질을 포함하는 제형을,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 45의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 91의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 51의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 52의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 53의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 55의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 56의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  12. 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질에,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  13. 암 치료가 필요한 환자에서의 암 치료 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질 또는 상기 단백질을 포함하는 제형을,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 49의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 50의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 암 치료 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 94의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 95의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 67의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 68의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 63의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 64의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 65의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 66의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 67의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 68의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  16. 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질에,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 114의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 115의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  17. 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질 또는 상기 단백질을 포함하는 제형을,
    상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 114의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 115의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 122의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 123의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 119의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 120의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 121의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 116의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 118의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 119의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 120의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 121의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  20. 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질에,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(stem cell transplant: SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 124의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 125의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  21. 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질 또는 단백질을 포함하는 제형을,
    관문 차단제, 사이토카인, TLR 작용제, STING 작용제, 화학치료제, 암 표적제, 종양용해 바이러스, 백신, 방사선, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 124의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 125의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 122의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 130의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 경쇄 가변 도메인은 서열번호 127의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 128의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 129의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 116의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열 및 서열번호 126의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하며; 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 127의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1 서열, 서열번호 128의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 서열, 및 서열번호 129의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3 서열을 포함하는, 방법.
  24. 종양 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 향상시키는 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질에,
    TLR 작용제, STING 작용제, 종양용해 바이러스, 백신, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법, 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    종양 및 자연 살해 세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 암 치료가 필요한 환자에서의 암 치료 방법으로서,
    (a) NKG2D에 결합하는 제1 항원-결합 부위;
    (b) 종양-연관 항원에 결합하는 제2 항원-결합 부위; 및
    (c) CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인, 이의 일부, 또는 CD16에 결합하는 제3 항원-결합 부위
    를 포함하는 단백질 또는 상기 단백질을 포함하는 제형을,
    TLR 작용제, STING 작용제, 종양용해 바이러스, 백신, 양자 NK 요법, 줄기 세포 이식(SCT) 요법, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법, 및 세포 노화를 유도하는 제제로부터 선택된 제2 치료제와 병용하여,
    상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관문 차단제는 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-CTLA4 항체, 항-KIR 항체, 항-NKG2A 항체, 항-LAG3 항체 및 항-TIM3 항체로부터 선택된, 방법.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-15, IL-12, INFα, IL-21, PEG-IL-2 및 IL15/IL15R 이형이량체로부터 선택된, 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 작용제는 TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR7/8 작용제, TLR9 작용제, TLR4 작용제 및 TLR3 작용제로부터 선택된, 방법.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 작용제는 ADU-S100인, 방법.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학치료제는 파클리탁셀(paclitaxel), 납-파클리탁셀(nab-paclitaxel) 또는 사이클로포스파마이드인, 방법.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관문 차단제는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 두르발루맙(durvalumab), 아벨루맙(avelumab), 이필리무맙(ipilimumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), 릴리루맙(lirilumab) 및 모날리주맙(monalizumab)으로부터 선택된, 방법.
  32. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TLR 작용제는 R848/레시퀴모드, VTX-2337, 이미퀴모드 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드로부터 선택된, 방법.
  33. 제2항 내지 제7항, 제9항 내지 제11항, 제13항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항 및 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 급성 골수단핵구 백혈병, B 세포 림프종, 방광암, 유방암, 결장직장암, 미만성 거대 B 세포 림프종 식도암, 유잉 육종, 여포성 림프종, 위암, 위장암, 위장 기질 종양, 교모세포종, 두경부암, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신세포 암종, 신경아세포종, 비소세포 폐암, 신경내분비 종양, 난소암 및 췌장암, 전립선암, 육종, 소세포 폐암, T 세포 림프종, 고환암, 흉선 암종, 갑상선암, 요로상피암, 골수-유래 억제 세포에 의해 침윤된 암, 세포외 기질 침착암, 고수준의 반응성 기질을 갖는 암 및 신생혈관형성을 갖는 암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 상기 제1 항원-결합 부위는 인간, 비-인간 영장류 및 설치류에서 NKG2D에 결합하는, 방법.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 도메인 및 상기 경쇄 가변 도메인은 동일한 폴리펩타이드 상에 존재하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 부위는 또한 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 부위의 상기 경쇄 가변 도메인은 상기 제2 항원-결합 부위의 상기 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는, 방법.
  39. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 부위는 단일-도메인 항체인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 단일-도메인 항체는 VHH 단편 또는 VNAR 단편인, 방법.
  41. 제1항 내지 제36항, 제39항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 부위는 단일-도메인 항체인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 부위는 VHH 단편 또는 VNAR 단편인, 방법.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양-연관 항원은 EpCAM, CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 및 PD-L1로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 CD16에 결합하는 데 충분한 항체 Fc 도메인의 일부를 포함하되, 상기 항체 Fc 도메인은 힌지 및 CH2 도메인을 포함하는, 방법.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 인간 IgG1 항체의 아미노산 234 내지 332에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  47. 제2항 내지 제7항, 제9항 내지 제11항, 제13항 내지 제15항, 제17항 내지 제19항 및 제21항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 방법.
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