JP2023522972A

JP2023522972A - ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のための製剤、投薬量レジメン、及び製造工程

Info

Publication number: JP2023522972A
Application number: JP2022564209A
Authority: JP
Inventors: ビゲロウ，ミッチェル; ブラウン，アレクサンドラ; エフチョン，アン; キュイユロ，ジャン－マリー; デローズ，マーク; グリンバーグ，アシャ; グティエレス，エバ; カービー，パトリック; ライアンモーガン，クリストファー; シーネイル，マイケル; オニール，スティーブン; シフリン，マイケル; ヴァクトマン，ニコライ
Original assignee: ドラゴンフライセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2023-06-01
Also published as: AU2021260960A1; CA3175809A1; CN116096353A; EP4138778A1; US20230272041A1; MX2022013112A; IL297495A; WO2021216916A1; KR20230004746A

Abstract

本発明は、生産時のタンパク質のより高い力価、保存時のより高い安定性、及び療法薬として使用したときの有効性の向上を実現するのに有利なヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の医薬製剤に関する。また、局所進行又は転移性固形腫瘍などの癌の治療に使用されるかかるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び医薬製剤の投薬量レジメンも提供される。【選択図】図１－１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０１３，８３４号明細書、及び２０２０年６月１日に出願された米国仮特許出願第６３／０３３，１６１号明細書に対する優先権及びその利益を主張するものであり、これらの各々は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。

配列表
本願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（ファイル名：３３３８＿２５９ＰＣ０３＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：９４６，３３６バイト；及び作成日：２０２１年４月２１日）の電子的に提出された配列表の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。

本開示は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の医薬製剤及び投薬量レジメン、並びに癌の治療のためのかかるタンパク質の使用方法に関する。

生理活性のあるタンパク質は、概ね生体内半減期が短いという欠点を有する。この欠点を解決するため、それをＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などとコンジュゲートするか、又はそれを抗体Ｆｃ（結晶化可能断片）領域に融合する試みがなされている。２つ以上の異なるサブユニットで構成されるタンパク質は、２つ以上の異なるサブユニットがタンパク質複合体を形成して生理活性を呈するというものであり、これを野生型Ｆｃドメインに融合させると、Ｆｃ融合タンパク質形態を調製することができ、Ｆｃは本質的にホモ二量体であるため、これはホモ二量体を形成し得る。２つ以上の異なるサブユニットで構成されるタンパク質は、２つ以上の異なるサブユニットがタンパク質複合体を形成して生理活性を呈するというものであり、これはまた、ＩｇＧ１のみならず、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４などの他のアイソタイプ抗体にも由来するヘテロ二量体Ｆｃ領域に融合させると、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を形成することもできる。このように、２つ以上の異なるサブユニットで構成される、且つ２つ以上のサブユニットがタンパク質複合体を形成することによって生理活性を呈するタンパク質の１つ以上のサブユニットをヘテロ二量体Ｆｃ変異体領域の末端に融合させると、改良されたＦｃ融合タンパク質形態を形成することができる。

Ｆｃヘテロ二量体化は、Ｆｃの２つの異なるＣＨ３ドメインに遺伝子工学によって突然変異を誘導することにより、これらの２つのＦｃ断片が、天然に存在する抗体に極めて類似した三次構造を有しながらも、最小限の配列変異を持つヘテロ二量体を形成することになるような技術である（例えば、特許文献１を参照のこと）。

米国特許第７，６９５，９３６号明細書

本開示に記載される本発明は、Ｆｃ融合タンパク質形態を改良するための設計を提供し、ここでは様々な長さのリンカーを導入するか、又はＦｃのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに突然変異を導入することにより、ヘテロ二量体タンパク質の２つのサブユニットが、異なるヘテロ二量化ドメインを有する２つのＦｃドメインに結び付けられている。本開示に記載される更なる本発明は、かかるタンパク質の医薬製剤、かかるタンパク質及び製剤の作製方法、並びにかかるタンパク質を使用した癌の治療方法を提供する。

本発明は、概して、ＩＬ１２サブユニットを含むある種のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬製剤、かかるタンパク質及び医薬製剤の調製工程に関する。また、局所進行又は転移性固形腫瘍などの癌の治療にかかるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び医薬製剤を使用するための投薬量レジメンも提供される。

従って、一態様において、本明細書には、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと多サブユニットサイトカインの第１のサブユニットとを含む第１のポリペプチド、及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと多サブユニットサイトカインの第２の異なるサブユニットとを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、クエン酸塩、糖、糖アルコール、及び非イオン性界面活性剤を含む、ｐＨ６．０～７．０の医薬製剤であって、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドが、各々、ヘテロ二量体化を促進する異なる突然変異を含み、及び多サブユニットサイトカインの第１のサブユニット及び第２の異なるサブユニットが互いに結合している、医薬製剤が提供される。一部の実施形態において、第１及び／又は第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含む。

一部の実施形態において、医薬製剤中のクエン酸塩の濃度は約１０ｍＭ～約３０ｍＭである。特定の実施形態において、医薬製剤中のクエン酸塩の濃度は約２０ｍＭである。一部の実施形態において、医薬製剤中の糖の濃度は約３％～約１２％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において、医薬製剤中の糖の濃度は約６％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において、糖は二糖である。特定の実施形態において、二糖はスクロースである。一部の実施形態において、医薬製剤中の糖アルコールの濃度は約０．５％～約６％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において、医薬製剤中の糖アルコールの濃度は約１％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において、糖アルコールは単糖に由来する。特定の実施形態において、糖アルコールはマンニトールである。

一部の実施形態において、医薬製剤中の非イオン性界面活性剤の濃度は約０．００５％～約０．０２％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において、医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度は約０．０１％（ｗ／ｖ）である。特定の実施形態において、非イオン性界面活性剤はポリソルベートである。特定の実施形態において、ポリソルベートはポリソルベート８０である。

一部の実施形態において、ｐＨは約６．１～約６．９である。特定の実施形態において、ｐＨは約６．２～約６．８である。特定の実施形態において、ｐＨは約６．３～約６．７である。一部の実施形態において、ｐＨは約６．４～約６．６である。特定の実施形態において、ｐＨは約６．５である。

一部の実施形態において、医薬製剤は、水を更に含む。特定の実施形態において、水は、ＵＳＰ注射用水である。

一部の実施形態において、医薬製剤は、約１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約２ｇ／Ｌ～約８ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約４ｇ／Ｌ～約６ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約５ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

一部の実施形態において、医薬製剤は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの投与用濃度のタンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．７５ｇ／Ｌ～約１．２５ｇ／Ｌの投与用濃度のタンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約１ｇ／Ｌの投与用濃度のタンパク質を含む。

一部の実施形態において、製剤は、２℃～８℃の温度で保存するように設計される。一部の実施形態において、医薬製剤は澄明な無色の溶液であり、目に見える粒子状物質を含まない。

一部の実施形態において、製剤は、示差走査型蛍光定量法により測定したとき、約６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、又は約６６℃より高いＴ_ｍ１；及び／又は約７０℃より高い、約７１℃より高い、約７２℃より高い、約７３℃より高い、約７４℃より高い、約７５℃より高い、約７６℃より高い、又は約７７℃より高いＴ_ｍ２によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する。特定の実施形態において、製剤は、約６７．０℃のＴ_ｍ１及び約７７．３℃のＴ_ｍ２によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する。特定の実施形態において、Ｔ_ｍ１及び／又はＴ_ｍ２によって定義されるとおりの、医薬製剤の熱安定性プロファイルは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない。

一部の実施形態において、製剤は、示差走査型蛍光定量法により測定したとき、約６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、約６６℃より高い、又は約６７℃より高いＴ_ａｇｇによって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する。特定の実施形態において、Ｔ_ａｇｇによって定義されるとおりの、医薬製剤の熱安定性プロファイルは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない。

一部の実施形態において、医薬製剤を５℃で１週間インキュベートした後、医薬製剤のｐＨは、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない。一部の実施形態において、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートした後、医薬製剤のｐＨは、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない。

一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約１５ｎｍ未満、約１４ｎｍ未満、約１３ｎｍ未満、又は約１２ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。特定の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１１．６ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、約１６ｎｍ未満、又は約１５ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。特定の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１４．４ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、又は約１６ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。特定の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１５．３ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。

一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、又は約０．２７未満である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．２６である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、約０．２７未満、又は約０．２６未満である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．２５である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．４０未満、約０．３５未満、又は約０．３４未満である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．３３である。

一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超である。特定の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９９．０％である。

一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約７５％超、約８０％超、約８１％超、約８２％超、約８３％超、約８４％超、又は約８５％超である。特定の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約８５．２％である。

一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、又は約９８％超である。特定の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９８．９％である。

別の態様において、本開示は、それを必要としている対象に、医薬製剤を単回用量療法として投与することを含む方法を提供する。

別の態様において、本開示は、それを必要としている対象に、複数回用量療法で、用量間に少なくとも３週間又は用量間に少なくとも４週間の間隔を置いて医薬製剤を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、医薬製剤は、対象に３週間に１回投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は、対象に４週間に１回投与される。特定の実施形態において、医薬製剤は、対象に６週間に１回投与される。

一部の実施形態において、本方法は、対象に病勢進行、許容できない毒性が現れた場合、又は対象が離脱基準を満たした場合、複数回用量療法を中止することを更に含む。一部の実施形態において、複数回用量療法の間に対象に完全奏効（ＣＲ）が見られた場合、完全奏効の確認後少なくとも１２ヵ月間にわたって複数回用量療法が更に投与される。特定の実施形態において、複数回用量療法の総継続期間は、２４ヵ月以下である。特定の実施形態において、総治療継続期間は、２４ヵ月より長い。

一部の実施形態において、医薬製剤は皮下注射によって投与される。

一部の実施形態において、医薬製剤は、対象の体重を基準として、約０．０５μｇ／ｋｇ～約１．７５μｇ／ｋｇの投薬量でヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で対象に投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は、対象の体重を基準として、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１０μｇ／ｋｇ、約０．２０μｇ／ｋｇ、約０．４０μｇ／ｋｇ、約０．６０μｇ／ｋｇ、約０．８０μｇ／ｋｇ、約１．００μｇ／ｋｇ、約１．２０μｇ／ｋｇ、約１．４０μｇ／ｋｇ、又は約１．７５μｇ／ｋｇの投薬量でヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で対象に投与される。特定の実施形態において、医薬製剤は、対象の体重を基準として、０．００μｇ／ｋｇより多く約０．０５μｇ／ｋｇより少ない投薬量でヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で対象に投与される。特定の実施形態において、医薬製剤は、対象の体重を基準として、約１．７５μｇ／ｋｇより多い投薬量でヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で対象に投与される。

一部の実施形態において、対象は癌を有する。特定の実施形態において、対象は局所進行又は転移性固形腫瘍を有する。特定の実施形態において、対象における癌の存在は、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲｅｓｐｏｎｓｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎＣｒｉｔｅｒｉａｆｏｒＳｏｌｉｄＴｕｍｏｒｓ：ＲＥＣＩＳＴ）、第１．１版を使用して確認される。特定の実施形態において、癌は、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及びトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、癌は、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及びトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、対象は抗ＰＤ－１不応性である。

一部の実施形態において、対象は黒色腫を有する。特定の実施形態において、対象は、過去に抗ＰＤ－１抗体で少なくとも６週間治療されたことがある。特定の実施形態において、対象は、抗ＰＤ－１抗体の投与を受けている間に、病勢進行の初期診断から少なくとも４週間後に病勢進行を確認されている。特定の実施形態において、病勢進行は、放射線学的又は臨床的所見によって確認される。特定の実施形態において、対象が、ＢＲＡＦ活性化突然変異を含む腫瘍を有する場合、対象は、過去にＢＲＡＦ阻害薬で治療されたことがある。

一部の実施形態において、対象はＲＣＣを有する。特定の実施形態において、ＲＣＣは明細胞を有する。特定の実施形態において、患者は、過去に抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体及び／又は抗血管内皮成長因子療法で治療されたことがある。特定の実施形態において、対象は、過去に３ライン以下の療法を受けたことがある。

一部の実施形態において、対象は尿路上皮癌を有する。特定の実施形態において、対象は局所進行又は転移性尿路移行上皮癌を有する。特定の実施形態において、対象は、過去に白金含有レジメンを含む単回治療で治療されたことがあり、且つ白金含有レジメンの最終回投与後６ヵ月以内のＸ線所見進行再発を示している。特定の実施形態において、対象は、過去に２ライン以下の療法を受けたことがある。特定の実施形態において、対象は、過去に単独療法としての又は白金ベースの化学療法と組み合わせたチェックポイント阻害薬（例えば、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）療法を受けたことがない。

一部の実施形態において、医薬製剤は対象に単独療法として投与される。

一部の実施形態において、医薬製剤は対象に組み合わせ療法として投与される。

一部の実施形態において、本方法は、抗ＰＤ－１抗体を対象に投与することを更に含む。特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体はペンブロリズマブである。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは静脈内投与される。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは、２００ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ペンブロリズマブの投与は、本医薬製剤の各投与よりも前に行われる。特定の実施形態において、本医薬製剤は、ペンブロリズマブの投与完了後１時間以内に投与される。

特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブである。特定の実施形態において、ニボルマブは静脈内投与される。特定の実施形態において、ニボルマブは、約４８０ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ニボルマブの投与は、医薬製剤の各投与よりも前に行われる。特定の実施形態において、本医薬製剤は、ニボルマブの投与完了後１時間以内に投与される。

一部の実施形態において、組み合わせ療法は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＲＣＣ、古典的ホジキンリンパ腫、ＨＮＳＣＣ、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、及び食道癌からなる群から選択される癌の治療用である。一部の実施形態において、組み合わせ療法は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＲＣＣ、古典的ホジキンリンパ腫、ＨＮＳＣＣ、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、及び前立腺癌からなる群から選択される癌の治療用である。一部の実施形態において、癌は黒色腫である。一部の実施形態において、黒色腫は切除不能である。一部の実施形態において、癌は結腸直腸癌である。一部の実施形態において、結腸直腸癌は高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損転移性（ｄＭＭＲ）結腸直腸癌である。

一部の実施形態において、本方法は、外科的介入を実施することにより、対象の癌細胞を溶解させ、腫瘍を除去し、又は腫瘍を減量させることを更に含む。特定の実施形態において、外科的介入は、凍結療法を含む。特定の実施形態において、外科的介入は、温熱療法を含む。特定の実施形態において、外科的介入は、対象に放射線療法を投与することを含む。特定の実施形態において、放射線療法は、体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）である。

一部の実施形態において、本方法は、対象にＮＫ細胞標的療法を投与することを更に含む。特定の実施形態において、対象には、多特異性結合タンパク質が投与される。一部の実施形態において、本方法は、対象にキメラ抗原受容体療法を投与することを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、対象にサイトカイン療法を投与することを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、対象に自然免疫系アゴニスト療法を投与することを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、対象に化学療法を投与することを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、対象に標的抗原療法を投与することを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、対象に腫瘍溶解性ウイルス療法を投与することを更に含む。

別の態様において、本開示は、医薬製剤の投与を受けている対象において毒性を検出する方法であって、対象の血中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を測定することを含む方法を提供し、ここで医薬製剤は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含み、及びヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、対象は、薬物有害反応を発症するリスクがあると同定され；及び対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値Ｃ反応性タンパク質濃度とほぼ同じであるか、又はそれより低い場合、対象は、薬物有害反応を発症するリスクはないと同定される。特定の実施形態において、対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、本医薬製剤の投与が中断されるか、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が用量を下げて投与されるか、又は対象における製剤の毒性効果を低減し若しくは緩和するための治療上の措置が講じられる。

本明細書に記載される医薬製剤又は方法の一部の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、多サブユニットサイトカインは、ヒトＩＬ１２である。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、ＥＵ番号付け方式に従い番号付けして、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＬ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓから選択される突然変異を含む。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａを含む。特定の実施形態において、多サブユニットサイトカインの第１のサブユニットは、ＩＬ１２のｐ４０サブユニットであり、多サブユニットサイトカインの第２のサブユニットは、ＩＬ１２のｐ３５サブユニットである。本医薬製剤又は本方法の特定の実施形態において、多サブユニットサイトカインの第１のサブユニットは配列番号１２７のアミノ酸配列を含み、多サブユニットサイトカインの第２のサブユニットは配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。本医薬製剤又は本方法の特定の実施形態において、多サブユニットサイトカインの第２のサブユニットは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインに融合している。本医薬製剤又は本方法の特定の実施形態において、第１の抗体Ｆｃドメインは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｋ３６０Ｅ、及びＫ４０９Ｗを含み、第２の抗体Ｆｃドメインは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｑ３４７Ｒ、Ｓ３５４Ｃ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む。本医薬製剤又は本方法の特定の実施形態において、第１の抗体Ｆｃドメインは配列番号２１５のアミノ酸配列を含み、第２の抗体Ｆｃドメインは配列番号２１６のアミノ酸配列を含む。本医薬製剤又は本方法の特定の実施形態において、第１の抗体Ｆｃドメインペプチドは配列番号２９０のアミノ酸配列を含み、第２の抗体Ｆｃドメインペプチドは配列番号２９１のアミノ酸配列を含む。

別の態様において、本明細書には、医薬製剤を含む１つ以上の容器を含むキットが提供され、ここで医薬製剤は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質並びにＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニット（ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む）と；薬学的に許容可能な担体とを含み、及び１つ以上の容器は、合計で約０．１ｍｇ～約２ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、１つ以上の容器は、合計で約０．５ｍｇ～約２ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、１つ以上の容器は、合計で約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、本キットは、約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む１つの容器を含む。一部の実施形態において、医薬製剤は凍結乾燥製剤又は液体製剤である。特定の実施形態において、医薬製剤は、１ｍＬの容積で供給される液体製剤である。

別の態様において、本開示は、癌の治療用医薬の製造におけるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用を提供し、ここで医薬は、１つ以上の容器に入った約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む液体医薬製剤として製造され、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、液体医薬製剤は、約１．０ｇ／Ｌのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

別の態様において、本明細書には、癌の治療用医薬の製造におけるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用が提供され、ここで医薬は、１つ以上の容器に入った約０．１ｍｇ～約２ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む液体医薬製剤として製造され、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、液体医薬製剤は、１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬は、１つの容器に入っている。一部の実施形態において、ここで各容器には、１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が入っている。特定の実施形態において、医薬は、３週間毎に１日目に対象に投与される。一部の実施形態において、医薬は、４週間毎に１日目に対象に投与される。一部の実施形態において、医薬は皮下投与される。一部の実施形態において、医薬は、約０．１ｍＬ～約１ｍＬの容積で投与される。特定の実施形態において、医薬は、約１ｍＬの容積で投与される。一部の実施形態において、医薬は、最大２ヵ所までの注射部位に投与される。特定の実施形態において、２回目の注射は、１回目の注射後１０分以内に完了される。一部の実施形態において、医薬は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１．７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、医薬は、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態において、医薬は投与前に０．９％生理食塩水（注射用塩化ナトリウム）及び０．０１％ポリソルベート８０の溶液中に希釈される。

別の態様において、本明細書には、その医薬製剤の調製用のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養液から入手したヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む溶液に酢酸を３０分～９０分間加えることを含む方法が提供され、ここでは酢酸塩が溶液のｐＨをｐＨ３．５５～３．７５に調整及び維持し、及びヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、酢酸は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む溶液に約６０分間加えられる。特定の実施形態において、酢酸は、溶液のｐＨを約３．６５に調整及び維持する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞培養液は、浮遊下に維持される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞培養液は、バイオリアクターにて７～２１日間培養される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞培養液は、バイオリアクターにて１４日間培養される。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞培養液を深層ろ過によって回収すると、ＣＨＯ回収培地が生じる。特定の実施形態において、深層ろ過は、ＤＯＨＣ及びＸＯＨＣフィルタからなる二段階使い捨て深層ろ過である。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をＣＨＯ回収培地からプロテインＡキャプチャークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製すると、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む溶液が生じる。

一部の実施形態において、プロテインＡキャプチャークロマトグラフィーは、プロテインＡ樹脂をｐＨ７．５の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌで平衡化させること、ＣＨＯ回収培地をプロテインＡ樹脂にロードすること；ロードされたプロテインＡ樹脂をｐＨ７．５の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌで洗浄すること；ロードされたプロテインＡ樹脂をｐＨ５．４の５０ｍＭ酢酸塩で洗浄すること；及びヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をｐＨ３．７の５０ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭアルギニンでプロテインＡ樹脂から溶出させること、及び２８０ｎｍＵＶによって１．２５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して１．２５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集することを含む。特定の実施形態において、プロテインＡ樹脂から溶出したヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む溶液に酢酸が０．５Ｍの濃度で加えられ、ここで酢酸は溶液のｐＨを６０分間にわたってｐＨ３．６５に酸性化し、続いて２Ｍトリスを加えることにより溶液をｐＨ５．２に中和する。特定の実施形態において、溶液の酸性化及び中和に続いて、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むこの溶液は、０．２μｍフィルタに通される。特定の実施形態において、プロテインＡ樹脂から溶出したヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むこのろ過した溶液は、Ｘ０ＳＰ深層ろ過に通される。

一部の実施形態において、混合モードクロマトグラフィーは、混合モードクロマトグラフィーカラムをｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸塩で平衡化させること；Ｘ０ＳＰろ過に通した溶液を混合モードクロマトグラフィーカラムにロードすること；ロードした混合モードクロマトグラフィーカラムをｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸塩で洗浄すること；及びヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸塩、２５０ｍＭＮａＣｌで混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出させること、及び２８０ｎｍＵＶによって０．６２５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して１．５０ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集することを含む。特定の実施形態において、混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出したヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むこの溶液は、０．２μｍフィルタに通される。

一部の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂をｐＨ７．４の５０ｍＭトリスで平衡化させること；混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出したろ過した溶液を陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂にロードすること；ロードした陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂をｐＨ７．４の５０ｍＭトリスで洗浄すること；及びヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をｐＨ７．４の５０ｍＭトリス及びｐＨ７．４の５０ｍＭトリス、０．５ＭＮａＣｌのグラジエントで陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させること、及び２８０ｎｍＵＶによって２．５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して４．５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集することを含む。特定の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出したヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む溶液は、０．２μｍフィルタに通される。特定の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出したヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むろ過した溶液は、前置フィルタ、２０ｎｍ公称フィルタ、及び０．２μｍ膜でナノろ過される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むナノろ過した溶液は、限外ろ過され、及びダイアフィルトレーションされ、ここで限外ろ過及びダイアフィルトレーションは、限外ろ過システムをｐＨ７．４の５０ｍＭトリス、２６５ｍＭＮａＣｌで平衡化させること；ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むナノろ過した溶液を約５．０ｇ／Ｌの濃度に濃縮すること；７ダイアボリュームのｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩を使用して緩衝液を交換すること；ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むダイアフィルトレーションした溶液を約１１．０ｇ／Ｌの濃度に濃縮すること；ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む濃縮溶液をｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩で約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの濃度に希釈すること；及びｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩、１８％（ｗ／ｖ）スクロース、３％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を加えることにより、２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｔｒａｔｉｏｎ）／ダイアフィルトレーション保持溶液の最終濃度を実現することを含む。特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む限外ろ過した／ダイアフィルトレーションした溶液を０．２μｍ膜に通してバルク原薬を生じさせる。

一部の実施形態において、バルク原薬は、ｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む０．２μｍフィルタでろ過した緩衝液中に、８０％薬物製品溶液となるように希釈される。特定の実施形態において、バルク原薬又は８０％薬物製品は、ｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む０．２μｍフィルタでろ過した緩衝液中に、１ｍｇ／ｍＬのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与用濃度となるように希釈される。

チェックポイント阻害薬抗体による治療を少なくとも６週間受けたことがある対象の癌を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を対象に投与することを含む方法、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬抗体は、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）抗体である。特定の実施形態において、癌は黒色腫である。特定の実施形態において、黒色腫は切除不能又は転移性である。特定の実施形態において、対象は、抗ＰＤ－１抗体の投与を受けている間に、病勢進行の初期診断から少なくとも４週間後に病勢進行を有すると確認される。特定の実施形態において、対象は、抗ＰＤ－１抗体の投与を受けている間に、病勢進行の初期診断から少なくとも４週間後に病勢進行を有すると確認される。特定の実施形態において、病勢進行は、放射線学的又は臨床的所見によって確認される。

別の態様において、本明細書には、チェックポイント阻害薬抗体又は抗血管内皮成長因子療法による治療を単独療法として、又は組み合わせで受けたことがある対象の癌を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を対象に投与することを含む方法が提供され、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬抗体は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。

特定の実施形態において、癌は進行性腎細胞癌（ＲＣＣ）である。特定の実施形態において、ＲＣＣは切除不能又は転移性である。特定の実施形態において、ＲＣＣは明細胞成分を有する。特定の実施形態において、対象は、過去に療法を３ライン以下だけ受けた。特定の実施形態において、対象は、チェックポイント阻害薬による治療を受けたことがない。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬は、単独療法としての、又は白金ベースの化学療法と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む。

別の態様において、本明細書には、ただ１つの白金含有レジメンによる治療を受けたことがある対象の癌を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を対象に投与することを含む方法が提供され、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、白金含有レジメンは、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンブラスチン、及びドキソルビシンから選択される薬剤と組み合わせた白金である。特定の実施形態において、癌は、局所進行又は転移性尿路移行上皮癌である。特定の実施形態において、尿路上皮癌には、腎盂、尿管、泌尿器尿路上皮、及び尿道からなる群の１つ以上が含まれる。特定の実施形態において、尿路上皮癌は手術不能である。特定の実施形態において、尿路上皮癌は、補助剤としての白金含有レジメンの最終回投与後６ヵ月以内のＸ線所見進行又は再発を伴い特徴付けられる。

一部の実施形態において、尿路上皮癌は、第一選択の白金含有レジメンの失敗と見なされる。特定の実施形態において、対象は、医薬製剤の投与前に、尿路上皮癌の治療のための療法（白金含有レジメンを含む）を２ライン以下だけ受けたことがある。特定の実施形態において、対象は、チェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）による治療を第一選択療法として受けたことがない。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬は単独療法であるか、又は白金ベースの化学療法との組み合わせである。

一部の実施形態において、医薬製剤は、ペンブロリズマブと組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは３週間毎に１回投与される。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは、医薬製剤の投与前に投与される。特定の実施形態において、医薬製剤は、ペンブロリズマブの投与完了後１時間以内に投与される。一部の実施形態において、ペンブロリズマブは、２００ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態において、ペンブロリズマブは静脈内投与される。一部の実施形態において、組み合わせは、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される癌の治療用である。一部の実施形態において、組み合わせは、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される癌の治療用である。

一部の実施形態において、医薬製剤は、ニボルマブと組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ニボルマブは、４週間毎に１回投与される。一部の実施形態において、ニボルマブは、医薬製剤の投与前に投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は、ニボルマブの投与完了後１時間以内に投与される。一部の実施形態において、ニボルマブは、約４８０ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態において、ニボルマブは静脈内投与される。一部の実施形態において、組み合わせは、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、及び食道癌からなる群から選択される癌の治療用である。一部の実施形態において、組み合わせは、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、及び前立腺癌からなる群から選択される癌の治療用である。一部の実施形態において、癌は黒色腫である。特定の実施形態において、黒色腫は切除不能又は転移性である。一部の実施形態において、癌は結腸直腸癌である。特定の実施形態において、結腸直腸癌は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌である。

一部の実施形態において、医薬製剤は、３週間毎に１日目に対象に投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は、４週間毎に１日目に対象に投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は皮下投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は、約０．１ｍＬ～約１ｍＬの容積で投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は、約１ｍＬの容積で投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は、最大２ヵ所までの注射部位に投与される。特定の実施形態において、２回目の注射は、１回目の注射後１０分以内に完了される。

一部の実施形態において、医薬製剤は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１．７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、医薬製剤は、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態において、医薬製剤は投与前に０．９％生理食塩水（注射用塩化ナトリウム）及び０．０１％ポリソルベート８０の溶液中に希釈される。

一部の実施形態において、癌の存在は、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）、第１．１版を使用して決定される。一部の実施形態において、完全奏効の確認が得られている対象は、打ち切り基準を満たさない限り、確認後少なくとも１２ヵ月間にわたって医薬製剤で治療される。

別の態様において、本明細書には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血中濃度がモニタされる対象を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を対象に投与することを含む方法が提供され、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、対象は、薬物有害反応を発症するリスクがあると同定され；及び対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値Ｃ反応性タンパク質濃度とほぼ同じであるか、又はそれより低い場合、対象は、薬物有害反応を発症するリスクはないと同定される。一部の実施形態において、対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、（１）医薬製剤の投与が中断されるか；（２）ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が用量を下げて投与されるか；又は（３）対象における製剤の毒性効果を低減し又は緩和するための治療上の措置が講じられる。

別の態様において、本明細書には、それを必要としている対象の癌を治療する方法であって、対象へのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤の皮下投与を含む方法が提供され、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、別々に、それぞれ第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域に連結されるか、又は第２のＦｃ領域及び第１のＦｃ領域に連結され、ｐ４０及びｐ３５サブユニットは、各々が、Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含み；及び医薬製剤は、クエン酸塩；糖；糖アルコール；及び非イオン性界面活性剤を含み、及び製剤のｐＨは５．５～７．０である。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域である。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域は、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含む。本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、ＥＵ番号付け方式に従い番号付けして、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＬ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓから選択される１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域は、各々が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａを含む。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の特定の実施形態において、ＩＬ１２のｐ４０サブユニットは配列番号１２７のアミノ酸配列を含み、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットは配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の特定の実施形態において、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットは、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２のＦｃ領域に融合される。一部の実施形態において、第１のＦｃ領域は、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｋ３６０Ｅ、及びＫ４０９Ｗを含み、第２のＦｃ領域は、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｑ３４７Ｒ、Ｓ３５４Ｃ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む。特定の実施形態において、第１のＦｃ領域は配列番号２１５のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃ領域は配列番号２１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ１２のｐ４０サブユニットに連結された第１のＦｃ領域は配列番号２９０のアミノ酸配列を含み、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットに連結された第２のＦｃ領域は配列番号２９１のアミノ酸配列を含む。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤は、（ａ）クエン酸塩；（ｂ）糖；（ｃ）糖アルコール；及び（ｄ）非イオン性界面活性剤を含み、更に製剤のｐＨは約６．０～約７．０である。本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のクエン酸塩の濃度は約１０～約３０ｍＭである。一部の実施形態において、医薬製剤中のクエン酸塩の濃度は約２０ｍＭである。一部の実施形態において、医薬製剤中の糖の濃度は約３％～約１２％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態において、医薬製剤中の糖の濃度は約６％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態において、糖は二糖である。一部の実施形態において、二糖はスクロースである。一部の実施形態において、医薬製剤中の糖アルコールの濃度は約０．５％～約６％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態において、医薬製剤中の糖アルコールの濃度は約１％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態において、糖アルコールは単糖に由来する。一部の実施形態において、糖アルコールはマンニトールである。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中の非イオン性界面活性剤の濃度は約０．００５％～約０．０２％（ｗ／ｖ）である。本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度は約０．０１％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤はポリソルベートである。本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、ポリソルベートはポリソルベート８０である。一部の実施形態において、ｐＨは約６．１～約６．９である。一部の実施形態において、ｐＨは約６．２～約６．８である。一部の実施形態において、ｐＨは約６．３～約６．７である。一部の実施形態において、ｐＨは約６．４～約６．６である。本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、ｐＨは約６．５である。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤は、水を更に含む。本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、水は、ＵＳＰ注射用水である。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤は、約１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬製剤は、約２ｇ／Ｌ～約８ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬製剤は、約４ｇ／Ｌ～約６ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬製剤は、約５ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬製剤は、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの投与用濃度のタンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬製剤は、約０．７５ｇ／Ｌ～約１．２５ｇ／Ｌの投与用濃度のタンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬製剤は、約１ｇ／Ｌの投与用濃度のタンパク質を含む。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤は、２℃～８℃の温度で保存するように設計される。一部の実施形態において、医薬製剤は澄明な無色の溶液であり、目に見える粒子状物質を含まない。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤は、示差走査型蛍光定量法により測定したとき、約６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、又は約６６℃より高いＴ_ｍ１；及び／又は約７０℃より高い、約７１℃より高い、約７２℃より高い、約７３℃より高い、約７４℃より高い、約７５℃より高い、約７６℃より高い、又は約７７℃より高いＴ_ｍ２によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する。一部の実施形態において、製剤は、約６７．０℃のＴ_ｍ１及び約７７．３℃のＴ_ｍ２によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、Ｔ_ｍ１及び／又はＴ_ｍ２によって定義されるとおりの、医薬製剤の熱安定性プロファイルは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない。一部の実施形態において、製剤は、示差走査型蛍光定量法により測定したとき、６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、約６６℃より高い、又は約６７℃より高いＴ_ａｇｇによって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する。一部の実施形態において、Ｔ_ａｇｇによって定義されるとおりの、医薬製剤の熱安定性プロファイルは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤を５℃で１週間インキュベートした後、医薬製剤のｐＨは、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない。一部の実施形態において、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートした後、医薬製剤のｐＨは、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約１５ｎｍ未満、約１４ｎｍ未満、約１３ｎｍ未満、又は約１２ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１１．６ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、約１６ｎｍ未満、又は約１５ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１４．４ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、又は約１６ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１５．３ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、又は約０．２７未満である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．２６である。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、約０．２７未満、又は約０．２６未満である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．２５である。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．４０未満、約０．３５未満、又は約０．３４未満である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．３３である。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超である。一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９９．０％である。一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、約７５％超、約８０％超、約８１％超、約８２％超、約８３％超、約８４％超、又は約８５％超である。一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約８５．２％である。

本明細書に提供されるキット、使用、又は方法の一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、又は約９８％超である。一部の実施形態において、ここで医薬製剤の純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９８．９％である。

要約すれば、本発明は、多サブユニットタンパク質のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質コンストラクトを提供する。こうした融合タンパク質コンストラクトは、未変性／天然の多サブユニットタンパク質と比較して長い血清半減期、生産時の収率の向上、保存時の安定性の亢進、及び／又は療法薬として使用したときの有効性の向上を呈し得る。

リンカーによって第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付いた多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと、別のリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付いた多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとを含む例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の様々な特徴を図解し、ここでこれらのサブユニットは、２つのジスルフィド結合によって結び付いている。図１Ａは、例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の種々の構成要素を示す一般的な概略図を示す。図１Ｂは、ＩＬ１２サブユニットｐ４０及びｐ３５と、リンカーと、突然変異を有するＦｃドメインとを含む例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を示す。図１Ｃは、図１Ａ又は図１Ｂのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に存在し得る例示的突然変異を図解する概略図を示す。図１Ｄは、図１Ａ、図１Ｂ、又は図１Ｃのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に形成することのできる例示的ジスルフィド結合を図解する概略図を示す。リンカーによって第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付いた多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと、別のリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付いた多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとを含む例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の様々な特徴を図解し、ここでこれらのサブユニットは、２つのジスルフィド結合によって結び付いている。図１Ａは、例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の種々の構成要素を示す一般的な概略図を示す。図１Ｂは、ＩＬ１２サブユニットｐ４０及びｐ３５と、リンカーと、突然変異を有するＦｃドメインとを含む例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を示す。図１Ｃは、図１Ａ又は図１Ｂのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に存在し得る例示的突然変異を図解する概略図を示す。図１Ｄは、図１Ａ、図１Ｂ、又は図１Ｃのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に形成することのできる例示的ジスルフィド結合を図解する概略図を示す。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、組換えマウスＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２）（図２Ａ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図２Ｂ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図２Ｃ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、組換えマウスＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２）（図２Ａ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図２Ｂ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図２Ｃ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、ｒｍＩＬ－１２、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図４Ａ）、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図４Ｂ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図４Ｃ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図４Ｄ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図４Ａ）、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図４Ｂ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図４Ｃ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図４Ｄ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図４Ａ）、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図４Ｂ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図４Ｃ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図４Ｄ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、ｒｍＩＬ－１２（図６Ａ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図６Ｂ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図６Ｃ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、ｒｍＩＬ－１２（図６Ａ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図６Ｂ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図６Ｃ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、ｒｍＩＬ－１２、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、０．５μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図８Ａ）、０．５μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図８Ｂ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図８Ｃ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図８Ｄ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、０．５μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図８Ａ）、０．５μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図８Ｂ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図８Ｃ）、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図８Ｄ）、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、０．５μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、０．５μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、０．１μｇｒｍＩＬ－１２とモル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療したマウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－１２レポーターアッセイを使用した、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（ＤＦＩＬ－１２－Ｆｃ）又は組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）による治療に対するＩＬ－１２応答を示すグラフである。ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（ＤＦＩＬ－１２－Ｆｃ）及びｒｈＩＬ－１２による治療に応答した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）によるＩＦＮγ産生を示すグラフである。１０μｇ／ｋｇの等モル量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は野生型ｒｈＩＬ－１２の単回静脈内投与後のカニクイザルＫ２ＥＤＴＡ血漿中におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、ｒｈＩＬ－１２、及びＩＦＮγの相対血漿濃度を示すグラフである。図１２Ａ～図１２Ｂは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおけるｒｍＩＬ－１２（図１２Ａ）及びＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図１２Ｂ）のＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ａは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおけるｒｍＩＬ－１２のＰＫ／ＰＤプロファイルを示し、図１２Ｂは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスＩＬ－１２におけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示す。血清中のＩＬ－１２及びＩＦＮγレベルはＥＬＩＳＡにより分析した。図１２Ｃは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける静脈内投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ｄは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける腹腔内投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ｅは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける皮下投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。平均血清レベルは平均値±ＳＥＭを表す。図１２Ａ～図１２Ｂは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおけるｒｍＩＬ－１２（図１２Ａ）及びＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図１２Ｂ）のＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ａは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおけるｒｍＩＬ－１２のＰＫ／ＰＤプロファイルを示し、図１２Ｂは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスＩＬ－１２におけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示す。血清中のＩＬ－１２及びＩＦＮγレベルはＥＬＩＳＡにより分析した。図１２Ｃは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける静脈内投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ｄは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける腹腔内投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ｅは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける皮下投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。平均血清レベルは平均値±ＳＥＭを表す。図１２Ａ～図１２Ｂは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおけるｒｍＩＬ－１２（図１２Ａ）及びＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図１２Ｂ）のＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ａは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおけるｒｍＩＬ－１２のＰＫ／ＰＤプロファイルを示し、図１２Ｂは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスＩＬ－１２におけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示す。血清中のＩＬ－１２及びＩＦＮγレベルはＥＬＩＳＡにより分析した。図１２Ｃは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける静脈内投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ｄは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける腹腔内投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。図１２Ｅは、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける皮下投与したＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイルを示すグラフである。平均血清レベルは平均値±ＳＥＭを表す。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、抗ＰＤ－１、又はこれらの組み合わせで治療したＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。０．５μｇアイソタイプ対照又は０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図１３Ａ）、アイソタイプ対照又は抗ＰＤ－１（図１３Ｂ）、及びアイソタイプ対照又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／抗ＰＤ－１（図１３Ｃ）によってマウスを腹腔内治療した。上記に指摘したとおり、動物にＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを週１回及び抗ＰＤ－１を毎週２回注射した。腫瘍成長は６０日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、抗ＰＤ－１、又はこれらの組み合わせで治療したＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。０．５μｇアイソタイプ対照又は０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図１３Ａ）、アイソタイプ対照又は抗ＰＤ－１（図１３Ｂ）、及びアイソタイプ対照又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／抗ＰＤ－１（図１３Ｃ）によってマウスを腹腔内治療した。上記に指摘したとおり、動物にＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを週１回及び抗ＰＤ－１を毎週２回注射した。腫瘍成長は６０日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、抗ＰＤ－１、又はこれらの組み合わせで治療したＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの生存率及び体重を示すグラフである。アイソタイプ、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、抗ＰＤ－１又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと抗ＰＤ－１との組み合わせによってマウスを治療した。動物に０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを週１回及び２００μｇ抗ＰＤ－１又はアイソタイプを毎週２回注射した。図１４Ａはカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１４Ｂは、マウスの体重を平均値±標準偏差として示す。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、ｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ、又はこれらの組み合わせで治療したＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。１５０μｇアイソタイプ対照又は０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図１５Ａ）、アイソタイプ対照又は１５０μｇＴｒｉＮＫＥＴ（図１５Ｂ）、及びアイソタイプ対照又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／ＴｒｉＮＫＥＴ（図１５Ｃ）によってマウスを腹腔内治療した。上記に指摘したとおり、動物にＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを週１回及びＴｒｉＮＫＥＴを毎週３回注射した。腫瘍成長は７２日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、ｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ、又はこれらの組み合わせで治療したＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。１５０μｇアイソタイプ対照又は０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（図１５Ａ）、アイソタイプ対照又は１５０μｇＴｒｉＮＫＥＴ（図１５Ｂ）、及びアイソタイプ対照又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／ＴｒｉＮＫＥＴ（図１５Ｃ）によってマウスを腹腔内治療した。上記に指摘したとおり、動物にＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを週１回及びＴｒｉＮＫＥＴを毎週３回注射した。腫瘍成長は７２日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、ｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴ、又はこれらの組み合わせで治療したＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの生存率及び体重を示すグラフである。アイソタイプ、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、ＴｒｉＮＫＥＴ、又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとＴｒｉＮＫＥＴとの組み合わせによってマウスを治療した。動物に０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを週１回及び１５０μｇＴｒｉＮＫＥＴ又はアイソタイプを毎週３回注射した。図１６Ａはカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１６Ｂは、マウスの体重を平均＋標準偏差として示す。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／ＴｒｉＮＫＥＴ組み合わせ療法（ｎ＝３）で治療し、２×１０^５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を移植することによって再チャレンジした図１５のＢ１６Ｆ１０腫瘍モデル実験からの完全奏効例（ＣＲ）マウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、単回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、毎週用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ、又はｒｍＩＬ－１２を投与したマウスの体重±標準偏差を示すグラフである。ナイーブであるか、又は過去にＣＴ２６腫瘍モデルにおいて単回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを投与したとき完全奏効例（ＣＲ）であったかのいずれかの、再チャレンジした個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、毎週用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを腹腔内（ＩＰ）（図１９Ａ）又は皮下（ＳＣ）（図１９Ｂ）のいずれかに投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、単回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を接種し、毎週用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを腹腔内（ＩＰ）（図２１Ａ）又は皮下（ＳＣ）（図２１Ｂ）のいずれかに投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、１μｇのｒｍＩＬ－１２とモル当量の単回用量（図２２Ａ）又は毎週１回用量（図２２Ｂ）のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを腹腔内に投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、毎週１回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを皮下に投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２３Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は１μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで（毎週）１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２３Ｂは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで（毎週）１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの単回投与後７２時間の血液（左）及び腫瘍（右）試料中のＩＦＮγ（図２４Ａ）、ＣＸＣＬ９（図２４Ｂ）、及びＣＸＣＬ１０（図２４Ｃ）レベルを示すグラフである。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの単回投与後７２時間の血液（左）及び腫瘍（右）試料中のＩＦＮγ（図２４Ａ）、ＣＸＣＬ９（図２４Ｂ）、及びＣＸＣＬ１０（図２４Ｃ）レベルを示すグラフである。１μｇ／ｋｇ（図２５Ａ）、２μｇ／ｋｇ（図２５Ｂ）、又は４μｇ／ｋｇ（図２５Ｃ）の単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの薬物動態を示す折れ線グラフである。２２４０、２２４１、２７４０、２７４１（図２５Ａ）；３２４０、３２４１、３７４０、３７４１（図２５Ｂ）；４２４０、４２４１、４７４０、４７４１（図２５Ｃ）は、個々のカニクイザル対象を表す。１μｇ／ｋｇ（図２５Ａ）、２μｇ／ｋｇ（図２５Ｂ）、又は４μｇ／ｋｇ（図２５Ｃ）の単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの薬物動態を示す折れ線グラフである。２２４０、２２４１、２７４０、２７４１（図２５Ａ）；３２４０、３２４１、３７４０、３７４１（図２５Ｂ）；４２４０、４２４１、４７４０、４７４１（図２５Ｃ）は、個々のカニクイザル対象を表す。単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＦＮγ及びＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０の濃度を示す折れ線グラフである。図２６Ａ、図２６Ｃ及び図２６Ｅは、それぞれ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＦＮγ濃度／発現レベルを示す。図２６Ｂ、図２６Ｄ及び図２６Ｆは、それぞれ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０濃度／発現レベルを示す。１２４０、１７４０、２２４０、２２４１、２７４０、２７４１（図２６Ａ～図２６Ｂ）；１２４０、１７４０、３２４０、３２４１、３７４０、３７４１（図２６Ｃ、図２６Ｄ、図２６Ｆ）；１２４０、１７４０、４２４０、４２４１、４７４０、４７４１（図２６Ｅ）は、個々のカニクイザル対象を表す。単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＦＮγ及びＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０の濃度を示す折れ線グラフである。図２６Ａ、図２６Ｃ及び図２６Ｅは、それぞれ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＦＮγ濃度／発現レベルを示す。図２６Ｂ、図２６Ｄ及び図２６Ｆは、それぞれ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０濃度／発現レベルを示す。１２４０、１７４０、２２４０、２２４１、２７４０、２７４１（図２６Ａ～図２６Ｂ）；１２４０、１７４０、３２４０、３２４１、３７４０、３７４１（図２６Ｃ、図２６Ｄ、図２６Ｆ）；１２４０、１７４０、４２４０、４２４１、４７４０、４７４１（図２６Ｅ）は、個々のカニクイザル対象を表す。単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＦＮγ及びＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０の濃度を示す折れ線グラフである。図２６Ａ、図２６Ｃ及び図２６Ｅは、それぞれ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＦＮγ濃度／発現レベルを示す。図２６Ｂ、図２６Ｄ及び図２６Ｆは、それぞれ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０濃度／発現レベルを示す。１２４０、１７４０、２２４０、２２４１、２７４０、２７４１（図２６Ａ～図２６Ｂ）；１２４０、１７４０、３２４０、３２４１、３７４０、３７４１（図２６Ｃ、図２６Ｄ、図２６Ｆ）；１２４０、１７４０、４２４０、４２４１、４７４０、４７４１（図２６Ｅ）は、個々のカニクイザル対象を表す。乳癌細胞を接種し、毎週用量の単独療法（アイソタイプ対照、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）（化学療法）、又は１０Ｇｙでの照射）又は組み合わせ療法（Ｄｏｘｉｌ（登録商標）又は放射線との組み合わせでのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ）を投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２８Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、アイソタイプ対照又は抗ＰＤ－１抗体のいずれかで（隔週で）治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２８ＢはＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、アイソタイプ対照又は１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの毎週の治療に加えた抗ＰＤ－１抗体のいずれかで（隔週で）治療したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２８Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、アイソタイプ対照又は抗ＰＤ－１抗体のいずれかで（隔週で）治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２８ＢはＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、アイソタイプ対照又は１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの毎週の治療に加えた抗ＰＤ－１抗体のいずれかで（隔週で）治療したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２９Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、アイソタイプ対照又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで（毎週）１回腫瘍内治療した個々のマウスにおける治療済み（Ｔｒ）腫瘍の腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２９Ｂは、図２９Ａに記載される個々のマウスの未治療（ＮＴ）ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍の腫瘍成長曲線を示すグラフである。図３０Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで１回治療した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図３０Ｂは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、１μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（毎週投与）、２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（毎週投与）、又は２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（１回）で治療した個々のマウスの平均腫瘍成長曲線を示すグラフである。図３１Ａは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ突然変異（ＬＡＬＡＰＡ）、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ突然変異（ＬＡＬＡＰＧ）を有するＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉで処理したＰＢＭＣのＰＨＡ刺激後のＩＦＮγ産生を示すグラフである。図３１Ｂは、ＬＡＬＡＰＡ突然変異、又はＬＡＬＡＰＧ突然変異を有するＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの存在下又は非存在下における、フルオロフォアをコンジュゲートしたｈＩｇＧ１によるＴＨＰ－１細胞への結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図３１Ａは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ突然変異（ＬＡＬＡＰＡ）、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ突然変異（ＬＡＬＡＰＧ）を有するＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉで処理したＰＢＭＣのＰＨＡ刺激後のＩＦＮγ産生を示すグラフである。図３１Ｂは、ＬＡＬＡＰＡ突然変異、又はＬＡＬＡＰＧ突然変異を有するＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの存在下又は非存在下における、フルオロフォアをコンジュゲートしたｈＩｇＧ１によるＴＨＰ－１細胞への結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの調製ステップを示す工程フロー図である。ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを含有する医薬製剤の調製ステップを示す工程フロー図である。図３４Ａは、異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの紫外・可視分光法（ＵＶ－Ｖｉｓ）計算濃度を示すグラフである。図３４Ｂは、ＤＦ－ＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを含有する様々な医薬製剤のｐＨを示すグラフである。ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを含有する特定の医薬製剤を５℃（図３５Ａ）及び５０℃（図３５Ｂ）で１週間インキュベートした後の様々な製剤の外観の写真である。５℃で１週間インキュベートした後の様々な医薬製剤におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの平均Ｔ_ｍ１（図３６Ａ）及びＴ_ｍ２（図３６Ｂ）を示すグラフである。５０℃で１週間インキュベートした後の様々な医薬製剤におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの平均Ｔｍ１（図３６Ｃ）及びＴｍ２（図３６Ｄ）を示すグラフである。５℃（図３６Ｅ～図３６Ｆ）及び５０℃（図３６Ｇ～図３６Ｈ）で１週間インキュベートした後の様々な医薬製剤におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの代表的な示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）融解曲線を示すグラフである。５℃（図３６Ｅ～図３６Ｆ）及び５０℃（図３６Ｇ～図３６Ｈ）で１週間インキュベートした後の様々な医薬製剤におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの代表的な示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）融解曲線を示すグラフである。５℃（図３７Ａ）及び５０℃（図３７Ｂ）で１週間インキュベートした後の様々な医薬製剤におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの平均Ｔ_ａｇｇを示すグラフである。５℃（図３７Ｃ～図３７Ｄ）及び５０℃（図３７Ｅ～図３７Ｆ）で１週間インキュベートした後の様々な医薬製剤におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの代表的なＤＳＦ凝集曲線を示すグラフである。５℃（図３７Ｃ～図３７Ｄ）及び５０℃（図３７Ｅ～図３７Ｆ）で１週間インキュベートした後の様々な医薬製剤におけるＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの代表的なＤＳＦ凝集曲線を示すグラフである。５℃（図３８Ａ）及び５０℃（図３８Ｂ）で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＵＶ－Ｖｉｓ計算濃度を示すグラフである。５℃（図３９Ａ）及び５０℃（図３９Ｂ）で１週間インキュベートした後のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを含有する様々な医薬製剤のｐＨを示すグラフである。５℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＺ平均流体力学直径（図４０Ａ）及び多分散性指数（図４０Ｂ）を示すグラフである。図４０Ｃ～図４０Ｄは、５℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの平均モノマー径及び平均モノマー率％Ｐｄを示すグラフである。５℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＺ平均流体力学直径（図４０Ａ）及び多分散性指数（図４０Ｂ）を示すグラフである。図４０Ｃ～図４０Ｄは、５℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの平均モノマー径及び平均モノマー率％Ｐｄを示すグラフである。図４０Ｅ～図４０Ｆは、５０℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＺ平均流体力学直径（図４０Ｅ）及び多分散性指数（図４０Ｆ）を示すグラフである。図４０Ｇ～図４０Ｈは、５０℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの平均モノマー径（図４０Ｇ）及び平均モノマー率％Ｐｄ（図４０Ｈ）を示すグラフである。図４０Ｅ～図４０Ｆは、５０℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＺ平均流体力学直径（図４０Ｅ）及び多分散性指数（図４０Ｆ）を示すグラフである。図４０Ｇ～図４０Ｈは、５０℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの平均モノマー径（図４０Ｇ）及び平均モノマー率％Ｐｄ（図４０Ｈ）を示すグラフである。図４０Ｉ～４０Ｊは、図４０Ａ～図４０Ｄに記載されるデータの計算に使用した代表的な動的光散乱法（ＤＬＳ）トレースを示す。図４０Ｋ～図４０Ｌは、図４０Ｅ～図４０Ｈに記載されるデータの計算に使用した代表的なＤＬＳトレースを示す。図４０Ｉ～４０Ｊは、図４０Ａ～図４０Ｄに記載されるデータの計算に使用した代表的な動的光散乱法（ＤＬＳ）トレースを示す。図４０Ｋ～図４０Ｌは、図４０Ｅ～図４０Ｈに記載されるデータの計算に使用した代表的なＤＬＳトレースを示す。サイズ排除クロマトグラフィー・高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により測定したときの、５０℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの％純度を示すグラフである。キャピラリー電気泳動・ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）により測定したときの、５０℃で１週間インキュベートした後の異なる緩衝液を含有する様々な医薬製剤中のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの％純度を示すグラフである。図４３Ａは、異なる緩衝液及び賦形剤を含有する様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのＵＶ－Ｖｉｓ計算濃度を示すグラフである。図４３Ａを参照すると、１が緩衝液交換を表し；２が２～８℃を表し；３が５０℃を表し；及び４が凍結／融解を表す。図４３Ｂは、異なる緩衝液及び賦形剤を含有する様々な医薬製剤中１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのＵＶ－Ｖｉｓ計算濃度を示すグラフである。図４３Ｂを参照すると：１が緩衝液交換を表し；２が２～８℃を表し；３が５０℃を表し；及び４が凍結／融解を表す。様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの平均Ｔ_ｍ１（図４４Ａ及び図４４Ｂ）及びＴ_ｍ２（図４４Ｃ及び図４４Ｄ）を示すグラフである。様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの平均Ｔ_ｍ１（図４４Ａ及び図４４Ｂ）及びＴ_ｍ２（図４４Ｃ及び図４４Ｄ）を示すグラフである。様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの平均Ｔ_ｍ１（図４４Ａ及び図４４Ｂ）及びＴ_ｍ２（図４４Ｃ及び図４４Ｄ）を示すグラフである。様々な医薬製剤中のＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの代表的なＤＳＦ融解曲線を示す。様々な医薬製剤中のＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの代表的なＤＳＦ融解曲線を示す。様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ（図４６Ａ）及び１０ｍｇ／ｍＬ（図４６Ｂ）のＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの平均Ｔ_ａｇｇを示すグラフである。様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの代表的なＤＳＦ凝集曲線である。様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの代表的なＤＳＦ凝集曲線である。異なるストレス条件に供された様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのサイズ分布を示す代表的なＤＬＳトレースを示す。異なるストレス条件に供された様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのサイズ分布を示す代表的なＤＬＳトレースを示す。異なるストレス条件に供された様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのＺ平均径（図４８Ａ～図４８Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（図４８Ｃ～図４８Ｄ）、モノマー径（４８Ｅ－４８Ｆ）、及びモノマー％Ｐｄ（図４８Ｇ～図４８Ｈ）を示す。図４８Ａ～図４８Ｈでは、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。異なるストレス条件に供された様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのＺ平均径（図４８Ａ～図４８Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（図４８Ｃ～図４８Ｄ）、モノマー径（４８Ｅ－４８Ｆ）、及びモノマー％Ｐｄ（図４８Ｇ～図４８Ｈ）を示す。図４８Ａ～図４８Ｈでは、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。異なるストレス条件に供された様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのＺ平均径（図４８Ａ～図４８Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（図４８Ｃ～図４８Ｄ）、モノマー径（４８Ｅ－４８Ｆ）、及びモノマー％Ｐｄ（図４８Ｇ～図４８Ｈ）を示す。図４８Ａ～図４８Ｈでは、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。異なるストレス条件に供された様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉのＺ平均径（図４８Ａ～図４８Ｂ）、多分散性指数（ＰＤＩ）（図４８Ｃ～図４８Ｄ）、モノマー径（４８Ｅ－４８Ｆ）、及びモノマー％Ｐｄ（図４８Ｇ～図４８Ｈ）を示す。図４８Ａ～図４８Ｈでは、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。異なるストレス条件に供した様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの純度を示すグラフである。図４９Ａ～図４９Ｂは、５０℃でインキュベートした後の％Ｍａｉｎピークを示す。図４９Ｃ～図４９Ｄは、２～８℃でインキュベートした後又は凍結融解サイクル後の％Ｍａｉｎピークを示す。図４９Ｃ～図４９Ｄを参照すると、１が２～８℃を表し、及び２が凍結融解を表す。異なるストレス条件に供した様々な医薬製剤中における１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬのＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの純度を示すグラフである。図４９Ａ～図４９Ｂは、５０℃でインキュベートした後の％Ｍａｉｎピークを示す。図４９Ｃ～図４９Ｄは、２～８℃でインキュベートした後又は凍結融解サイクル後の％Ｍａｉｎピークを示す。図４９Ｃ～図４９Ｄを参照すると、１が２～８℃を表し、及び２が凍結融解を表す。高精度液体粒子（ＨＩＡＣ）分析により測定したときの、異なるストレス条件に供したＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉを含有する様々な医薬製剤中における粒径別の粒子カウントを示すグラフである。図５０Ａ～図５０Ｂは≧２μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｃ～図５０Ｄは≧５μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｅ～図５０Ｆは≧１０μｍ粒子のカウントを示し、及び図５０Ｇ～図５０Ｈは≧２５μｍ粒子のカウントを示す。図５０Ａ～図５０Ｈを参照すると、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。高精度液体粒子（ＨＩＡＣ）分析により測定したときの、異なるストレス条件に供したＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉを含有する様々な医薬製剤中における粒径別の粒子カウントを示すグラフである。図５０Ａ～図５０Ｂは≧２μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｃ～図５０Ｄは≧５μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｅ～図５０Ｆは≧１０μｍ粒子のカウントを示し、及び図５０Ｇ～図５０Ｈは≧２５μｍ粒子のカウントを示す。図５０Ａ～図５０Ｈを参照すると、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。高精度液体粒子（ＨＩＡＣ）分析により測定したときの、異なるストレス条件に供したＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉを含有する様々な医薬製剤中における粒径別の粒子カウントを示すグラフである。図５０Ａ～図５０Ｂは≧２μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｃ～図５０Ｄは≧５μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｅ～図５０Ｆは≧１０μｍ粒子のカウントを示し、及び図５０Ｇ～図５０Ｈは≧２５μｍ粒子のカウントを示す。図５０Ａ～図５０Ｈを参照すると、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。高精度液体粒子（ＨＩＡＣ）分析により測定したときの、異なるストレス条件に供したＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉを含有する様々な医薬製剤中における粒径別の粒子カウントを示すグラフである。図５０Ａ～図５０Ｂは≧２μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｃ～図５０Ｄは≧５μｍ粒子のカウントを示し、図５０Ｅ～図５０Ｆは≧１０μｍ粒子のカウントを示し、及び図５０Ｇ～図５０Ｈは≧２５μｍ粒子のカウントを示す。図５０Ａ～図５０Ｈを参照すると、１が２～８℃を表し、２が５０℃を表し、及び３が凍結融解を表す。ＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉが単独療法として（図５１Ａ）及びペンブロリズマブとの組み合わせ療法で（図５１Ｂ）使用されることになる第１相及び第２相の試験デザインを示す概略図である。ＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉが単独療法として（図５２Ａ）及びニボルマブとの組み合わせ療法で（図５２Ｂ）使用されることになる第１相及び第２相の試験デザインを示す概略図である。

本発明は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、かかるタンパク質を含む医薬製剤、並びに癌の治療のための方法を含めた、かかるタンパク質及び医薬製剤を使用した治療法の改良を提供する。

本発明の理解を助けるため、以下に多くの用語及び語句を定義する。

用語「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」は、本明細書で使用されるとき、「１つ以上」を意味し、文脈上不適切でない限り、複数形を含む。

本明細書で使用されるとき、用語「対象」及び「患者」は、本明細書に記載される方法及び組成物によって治療されることになる生物を指す。かかる生物には、好ましくは、限定はされないが、哺乳類（例えば、マウス、サル、ウマ科動物、ウシ亜科動物、ブタ、イヌ科動物、ネコ科動物など）が含まれ、より好ましくはヒトが含まれる。

本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、有益な又は所望の結果（例えば、所望の予防的又は治療的効果）を生じさせるのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用又は投薬量で投与することができ、詳細な製剤又は投与経路に限定されることは意図されない。本明細書で使用されるとき、用語「治療すること」には、病態、疾患、障害などの改善をもたらす任意の効果、例えば、軽減、低減、調節、軽快若しくは除去、又はその症状の軽快が含まれる。

本明細書で使用されるとき、用語「医薬製剤」は、活性薬剤と、組成物をインビボ又はエキソビボでの診断又は治療使用に特に好適なものにする不活性又は活性な担体との組み合わせを指す。

本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水又は水／油エマルションなど）、及び各種の湿潤剤など、標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤及び保存剤も含むことができる。担体、安定剤及び補助剤の例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈＥｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照のこと。

本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な塩」は、対象への投与時に、本発明の化合物又はその活性代謝産物若しくは残渣を提供する能力のある本発明の化合物の任意の薬学的に許容可能な塩（例えば、酸又は塩基）を指す。当業者には公知のとおり、本発明の化合物の「塩」は、無機又は有機酸及び塩基に由来し得る。例示的酸としては、限定はされないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン２スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。本発明の化合物及びその薬学的に許容可能な酸付加塩を入手する際の中間体として有用な塩の調製においては、シュウ酸など、それ自体は薬学的に許容可能でないにしろ、他の酸が利用されてもよい。

例示的塩基としては、限定はされないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１～４アルキルである）の化合物などが挙げられる。

例示的塩としては、限定はされないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩（ｆｌｕｃｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモン酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル化物、ウンデカン酸塩などが挙げられる。塩の他の例としては、Ｎａ^＋、ＮＨ_４ ^＋、及びＮＷ_４ ^＋（式中、ＷはＣ_１～４アルキル基である）など、好適なカチオンと化合物化する本発明の化合物のアニオンが挙げられる。

治療的使用には、本発明の化合物の塩は薬学的に許容可能であると企図される。しかしながら、薬学的に許容できない酸及び塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容可能な化合物の調製又は精製において、用途が見出され得る。

本説明全体を通じて、組成物が特定の成分を有する、備える、又は含むと説明される場合、又は工程及び方法が特定のステップを有する、備える、又は含むと説明される場合、加えて、記載されている成分から本質的になる、又はそれからなる本発明の組成物があること、及び記載されている処理ステップから本質的になる、又はそれからなる本発明に係る工程及び方法があることが企図される。

一般的な事項として、パーセンテージを指定する組成物は、特に指定されない限り重量基準である。更に、変数に定義が伴わない場合には、その変数の以前の定義が優先する。

（ａ）タンパク質
本発明は、多サブユニットタンパク質のアミノ酸配列を含むＦｃ融合タンパク質コンストラクトを提供する。これらの融合タンパク質コンストラクトは、未変性／天然の多サブユニットタンパク質と比較して長い血清半減期、生産時の収率の向上、保存時の安定性の亢進、及び／又は療法薬として使用したときの有効性の向上を呈し得る。

（ｉ）ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質
一態様において、本発明は、第１の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドを含む第１のポリペプチドと、第１の抗体Ｆｃドメインに結合した第２の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドを含む第２のポリペプチドとを含むヘテロ二量体ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここで第１のポリペプチドは、配列番号２３７又は配列番号６のアミノ酸配列を含むリンカーによって第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合した多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを更に含み；多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合され、及び多サブユニットタンパク質のこれらのサブユニットは互いに結合しており；配列番号２３７又は配列番号６のＸ_１がＬを表し、及び／又は配列番号２３７又は配列番号６のＸ_２がＬを表すとき、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドのうちの少なくとも一方は、ヘテロ二量体化を促進するためのＱ３４７Ｒ突然変異を含む。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号２３７又は配列番号６のアミノ酸配列からなる。

特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、スペーサーペプチドを更に含む。特定の実施形態において、リンカーは、配列番号２３７又は配列番号６の配列と、スペーサーペプチドとを含む。

特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号２３７又は配列番号６の配列と、スペーサーペプチドとを含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号２３７又は配列番号６のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーのアミノ酸配列は、多サブユニットタンパク質のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーのアミノ酸配列と同一である。

見出し「スペーサーペプチド」の下に記載される任意のスペーサーペプチドを利用することができる。例えば、特定の実施形態において、スペーサーペプチドは、配列番号１０７～１２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、スペーサーペプチドは、配列番号１０７～１２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、本明細書に開示されるスペーサーペプチドと、配列番号２３７又は配列番号６の配列を有するペプチドとからなるか、又はそれから本質的になる。特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、本明細書に開示されるスペーサーペプチドと、配列番号２３７又は配列番号６の配列を有するペプチドとからなるか、又はそれから本質的になる。特定の実施形態において、スペーサーペプチドは、リンカーのいずれか一方又は両方のＮ末端側にある。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号２３９又は配列番号９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号２３９又は配列番号９のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号２３９のアミノ酸配列を含む）。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、アミノ酸配列、配列番号２３９からなる。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１０又は配列番号２４４のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１０又は配列番号２４４のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１０のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号２３８又は配列番号７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合させるリンカーは、配列番号２３８又は配列番号７のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号８又は配列番号２４１のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号８又は配列番号２４１のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１５又は配列番号２４２のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１５又は配列番号２４２のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１６又は配列番号２４３のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１６又は配列番号２４３のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６５又は配列番号２４５のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６５又は配列番号２４５のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６６又は配列番号２４６のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６６又は配列番号２４６のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号１１又は配列番号２４０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合させるリンカーは、配列番号１１又は配列番号２４０のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１２又は配列番号２４７のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１２又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６７又は配列番号２４８のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６７又は配列番号２４８のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６８又は配列番号２４９のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６８又は配列番号２４９のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

特定の実施形態において、Ｆｃドメインポリペプチドは、ＩｇＧ１Ｆｃのものである。一部の実施形態において、本発明のタンパク質は、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと、第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含み、これらは両方とも、互いのヘテロ二量体化を促進する突然変異したＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドである。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃに由来する場合、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでもよく、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置が異なり得る。

一部の実施形態において、抗体定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでもよく、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅからなる群から選択される１つ以上の置換が異なり得る。本明細書に開示されるＦｃドメイン又はヒンジ領域のアミノ酸位置は全て、ＥＵ付番に従い番号付けされる。

一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗから選択される１つ以上の突然変異を含み、第２の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔから選択される１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔから選択される１つ以上の突然変異を含み、第２の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗから選択される１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは突然変異Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含み、第２の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む。一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含み、第２の抗体ＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドは突然変異Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗを含む。

一部の実施形態において、ＩｇＧ１Ｆｃとの本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１及び／又は第２のポリペプチドのＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、又はＦｃγＲＩＩＩＢ）又は補体成分（例えば、Ｃ１ｑ）への結合を低減するため１つ以上の突然変異を含む。かかる突然変異は、エフェクター機能を低減するのに有用である。例えば、本開示のタンパク質は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ突然変異；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ突然変異；又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ突然変異を含む。

一部の実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、各々が突然変異Ｐ３２９Ｇ又はＰ３２９Ａを含む第１の抗体ＩｇＧ４又はＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドと第２の抗体ＩｇＧ４又はＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドとを含む。具体的な実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、各々が突然変異Ｐ３２９Ａを含む第１の抗体ＩｇＧ４又はＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドと第２の抗体ＩｇＧ４又はＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドとを含む。

一部の実施形態において、第１のＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の異なるＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択される突然変異を持つ。一部の実施形態において、第１のＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の異なるＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、突然変異Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを含有する。

特定の実施形態において、ＩｇＧ１Ｆｃモノマーの間に追加のジスルフィド結合が導入され、これはヘテロ二量体の安定性を向上させる。例示的実施形態において、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットに融合した第１の抗体ＦｃドメインポリペプチドがＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ置換を含み、これが、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットに融合した第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド上にあるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。或いは、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットに融合した第１の抗体ＦｃドメインポリペプチドがＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ置換を含み、これが、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットに融合した第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド上にあるＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。

以下の表２に提供されるＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドの任意のものを、以下の表１に提供されるＩｇＧ１ヒンジ配列の任意のもの（これは、本発明では、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットのタンパク質配列を第１のＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカー、又は追加のサブユニットを第２の異なるＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーの一部であるか、又はその全体である）と組み合わせて利用することができる。例示的ＩｇＧ１ヒンジ－Ｆｃドメインポリペプチドは、以下の表３に提供される。特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質の第１及び第２のポリペプチドは、それぞれ、配列番号２１２及び２１２；２１３及び２１４；２１５及び２１６；２１７及び２１８；２１４及び２１３；２１６及び２１５；又は２１８及び２１７のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質の第１及び第２のポリペプチドは、それぞれ、配列番号２２８及び２２８；２２９及び２３０；２３１及び２３２；２３３及び２３４；２３５及び２３６；２３０及び２２９；２３２及び２３１；２３４及び２３３；２３６及び２３５；２２８及び２５０；２５０及び２２８；２５０及び２５０；２２９及び２５２；２５２及び２２９；２５１及び２３０；２３０及び２５１；２５３及び２３２；２３２及び２５３；２３１及び２５４；２５４及び２３１；２５５及び２３４；２３４及び２５５；２３３及び２５６；２５６及び２３３；２５７及び２３６；２３６及び２５７；２５８及び２３５；又は２３５及び２５８のアミノ酸配列を含む。

（ｉｉ）ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質
一態様において、本発明は、多サブユニットタンパク質の改良を提供する。一態様において、本発明は、第１の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドを含む第１のポリペプチドと、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結合した第２の異なる抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドを含む第２のポリペプチドとを含むヘテロ二量体ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここで第１のポリペプチドは、第１の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドに融合した多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを更に含み；多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが第２の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドに融合され、及び多サブユニットタンパク質のこれらのサブユニットは互いに結合しており；第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する異なる突然変異を持つ。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質内では、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットのタンパク質配列を第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、スペーサーペプチドを更に含む。特定の実施形態において、リンカーは、配列番号１の配列とスペーサーペプチドとを含む。

特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１の配列と、スペーサーペプチドとを含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーのアミノ酸配列は、多サブユニットタンパク質のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーのアミノ酸配列と同一である。

見出し「スペーサーペプチド」の下に記載される任意のスペーサーペプチドを利用することができる。例えば、特定の実施形態において、スペーサーペプチドは、配列番号１０７～１２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、スペーサーペプチドは、配列番号１０７～１２０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。特定の実施形態において、多サブユニットタンパク質のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、本明細書に開示されるスペーサーペプチドと配列番号１とからなるか、又はそれから本質的になる。特定の実施形態において、リンカーは、本明細書に開示されるスペーサーペプチドと配列番号１とからなるか、又はそれから本質的になる。特定の実施形態において、スペーサーペプチドは、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーのＮ末端側にある。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合させるリンカーは、配列番号２のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１３のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号１４のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質内で、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合させるリンカーは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号５のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号５のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６３のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６３のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列を含むリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、配列番号６４のアミノ酸配列からなるリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

特定の実施形態において、Ｆｃドメインポリペプチドは、ＩｇＧ４Ｆｃのものである。ＩｇＧ４は、Ｆａｂアーム交換を起こして体内の他のＩｇＧ４抗体と対合し得る不安定な二量体である。特定の実施形態において、ヒンジ（これは、本発明では、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１のＩｇＧ４抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカー、又は追加のサブユニットを第２の異なるＩｇＧ４抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーの一部であるか、又はその全体である）の範囲内にＳ２２８Ｐ突然変異が導入され、これは、ヒンジ領域の安定性を増加させて、Ｆａｂアーム交換が起こる可能性を低減する。特定の実施形態において、Ｆｃドメインポリペプチドモノマーの間に追加のジスルフィド結合が導入され、これは、ヘテロ二量体の安定性を向上させる。例示的実施形態において、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットに連結した第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、ＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ置換を含み、これは、第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに連結した多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットに連結した第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド上にあるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。或いは、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットに連結した第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、ＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ置換を含み、これは、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットに連結した第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド上にあるＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。

一部の実施形態において、本発明のタンパク質は、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと、第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含み、これらは両方とも、互いのヘテロ二量体化を促進する突然変異したＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドである。

一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３７０Ｅ、及びＲ４０９Ｗから選択される１つ以上の突然変異を含み、第２の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｅ３５７Ｎ、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔから選択される１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｋ３７０Ｅ及びＲ４０９Ｗを含み、第２の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｅ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む。一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｅ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含み、第２の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｋ３７０Ｅ及びＲ４０９Ｗを含む。一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｋ３６０Ｅ及びＲ４０９Ｗを含み、第２の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む。一部の実施形態において、第１の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含み、第２の抗体ＩｇＧ４Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｋ３６０Ｅ及びＲ４０９Ｗを含む。

一部の実施形態において、ＩｇＧ４Ｆｃとの本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１及び／又は第２のポリペプチドにおけるＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、又はＦｃγＲＩＩＩＢ）又は補体成分（例えば、Ｃ１ｑ）への結合を低減するため１つ以上の突然変異を含む。かかる突然変異は、エフェクター機能を低減するのに有用である。例えば、本開示のタンパク質は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ突然変異；Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ａ突然変異；又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ突然変異を含む。

表２に提供されるＩｇＧ４抗体Ｆｃドメインポリペプチドの任意のものを、表１に提供されるＩｇＧ４ヒンジ配列の任意のもの（これは、本発明では、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１のＩｇＧ４抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカー、又は多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の異なるＩｇＧ４抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けているリンカーの一部であるか、又はその全体である）と組み合わせて利用することができる。例示的ＩｇＧ４ヒンジ－Ｆｃドメインポリペプチドは、表３に提供される。特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質の第１及び第２のポリペプチドは、それぞれ、配列番号２０５及び２０５；２０６及び２０７；２０８及び２０９；２１０及び２１１；２０７及び２０６；２０９及び２０８；又は２１１及び２１０のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質の第１及び第２のポリペプチドは、それぞれ、配列番号２１９及び２１９；２２０及び２２１；２２２及び２２３；２２４及び２２５；２２６及び２２７；２２１及び２２０；２２３及び２２２；２２５及び２２４；又は２２７及び２２６のアミノ酸配列を含む。

（ｂ）ジスルフィド結合
本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとの間に天然のヘテロ二量体ジスルフィド結合を含む。例えば、例示的実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１２のｐ３５とｐ４０とのサブユニット間に天然のヘテロ二量体ジスルフィド結合を含む。かかるタンパク質は、ｐ３５のＣ７４とｐ４０のＣ１７７との間に天然のジスルフィド結合を含む。

本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとの間に人工的な又はエンジニアリングされたヘテロ二量体ジスルフィド結合を含む。例えば、例示的実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ－１２のｐ３５とｐ４０とのサブユニット間に人工的な又はエンジニアリングされたヘテロ二量体ジスルフィド結合を含む。かかるタンパク質は、ｐ３５のＶ１８５Ｃとｐ４０のＹ２９２Ｃとの間に人工的な又はエンジニアリングされたジスルフィド結合を含む。

本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとの間に天然のヘテロ二量体ジスルフィド結合を含み、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとの間に人工的な又はエンジニアリングされたヘテロ二量体ジスルフィド結合を含む。例えば、例示的実施形態において、ＩＬ－１２のｐ３５とｐ４０とのサブユニット間の天然のヘテロ二量体ジスルフィド結合、及びＩＬ－１２のｐ３５とｐ４０とのサブユニット間に人工的な又はエンジニアリングされたヘテロ二量体ジスルフィド結合を含む。かかるタンパク質は、ｐ３５のＣ７４とｐ４０のＣ１７７との間に天然のジスルフィド結合を含み、ｐ３５のＶ１８５Ｃとｐ４０のＹ２９２Ｃとの間に人工的な又はエンジニアリングされたジスルフィド結合を含む。

本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、天然のジスルフィド結合を取り除き、それを非天然の人工的な又はエンジニアリングされたジスルフィド結合に置き換えるようにエンジニアリングされる。例えば、例示的実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、天然のＣ７４がセリンに突然変異しているＩＬ－１２のｐ３５と、天然のＣ１７７がセリンに突然変異しているＩＬ－１２のｐ４０とを含み、そのためＩＬ－１２のｐ３５とｐ４０とのサブユニット間の天然のジスルフィド結合が取り除かれる。この突然変異ＩＬ－１２には、２つの新規の突然変異、ｐ３５上のＶ１８５Ｃ及びｐ４０上のＹ２９２Ｃが導入され、そのため非天然の人工的な又はエンジニアリングされたジスルフィド結合が導入される。

（ｃ）Ｆｃ融合ポリペプチドの成分の配列
本発明の例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、以下の表１～表２に記載されるＩｇＧ１又はＩｇＧ４Ｆｃ変異体配列のいずれか１つ及び対応するリンカー配列のいずれか１つを含んで構築される。本発明の融合タンパク質コンストラクトは、未変性／天然の多サブユニットタンパク質と比較して長い血清半減期を付与し、生産時のタンパク質の収率を向上させ、保存時の安定性を亢進させ、及び／又は療法薬として使用したときの有効性を向上させることができる。

以下の表２に提供されるＩｇＧ４抗体Ｆｃ変異体ドメインポリペプチドの任意のものを、以下の表１に提供されるＩｇＧ４ヒンジ配列の任意のものと組み合わせて利用することができる。同様に、以下の表２に提供されるＩｇＧ１抗体Ｆｃ変異体ドメインポリペプチドの任意のものを、以下の表１に提供されるＩｇＧ１ヒンジ配列の任意のものと組み合わせて利用することができる。例示的ＩｇＧ１ヒンジ－Ｆｃドメインポリペプチドは、以下の表３に提供される。

（ｄ）ＩＬ－１２サブユニット
ＩＬ－１２は、ｐ４０サブユニットとｐ３５サブユニットとを含む多サブユニットタンパク質である。成熟野生型ＩＬ－１２ｐ４０のアミノ酸配列は、以下の配列番号１２７に示される、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２１７８．２のアミノ酸２３～３２８である。成熟野生型ＩＬ－１２ｐ３５のアミノ酸配列は、以下の配列番号１２８に示される、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８７３．２のアミノ酸５７～２５３である。本明細書で使用されるｐ４０及びｐ３５のアミノ酸残基の番号付けは、成熟野生型タンパク質配列に対応する。本明細書で使用されるとき、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットは、配列番号１２７と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一のアミノ酸配列を含む。本明細書で使用されるとき、ＩＬ－１２ｐ３５サブユニットは、配列番号１２８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一のアミノ酸配列を含む。

前述の態様のうちのいずれか１つの特定の実施形態において、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、それぞれ、配列番号１２１及び１２２；１２７及び１２８；２０１及び２０２；２０３及び２０４；１２３及び１２４；又は１２５及び１２６のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第１のポリペプチドは、ＩＬ－１２のｐ４０サブユニットのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第１のポリペプチドは、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＩＬ－１２のｐ４０サブユニットのアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態において、本開示は、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドを含む第１のポリペプチドと、第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドを含む第２のポリペプチドとを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含み、ここで第１のポリペプチドは、リンカーによって第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合したＩＬ－１２の第１のサブユニットを更に含み；及びＩＬ－１２の第２の異なるサブユニットが第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合され、ここでＩＬ－１２の第１及び第２の異なるサブユニットは互いに結合しており、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、ヘテロ二量体化を促進する異なる突然変異を含有し、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは互いに結合しており、及びＩＬ－１２の第１のサブユニットは、Ｙ２９２Ｃ置換を有するｐ４０サブユニットであり、ＩＬ－１２の第２の異なるサブユニットは、Ｖ１８５Ｃ置換を有するｐ３５サブユニットである。特定の実施形態において、ＩＬ－１２の第１のサブユニット及び第２の異なるサブユニットは、それぞれ、配列番号１２５及び１２６のアミノ酸配列を含む。

ＩＬ－１２の第１のサブユニット及び第２の異なるサブユニットは、本明細書に開示されるいずれかのリンカーを介して抗体Ｆｃドメインポリペプチドのいずれかに融合することができ、それにより、限定はされないが、表４に記載されるとおりのコンストラクト１２０、１２０－１、１２０－２、１２０－３、１２０－４、１２０－５、１２０－６、及び１２０－７、並びに表５に記載されるとおりのコンストラクト２０、２０－１、２０－２、２０－３、２０－４、２０－５、２０－６、２０－７、２０－８、及び２０－９を含む配列を有するＦｃ融合タンパク質が形成される。

特定の実施形態において、ＩＬ－１２のｐ４０サブユニットは、Ｃ１７７の置き換えを更に含み、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットは、Ｃ７４の置き換えを更に含む。特定の実施形態において、ＩＬ－１２のｐ４０サブユニット中のＣ１７７はＳによって置き換えられ、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニット中のＣ７４はＳによって置き換えられる。特定の実施形態において、ＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットは、それぞれ、配列番号１２３及び１２４のアミノ酸配列を含む。

ＩＬ－１２の第１のサブユニット及び第２の異なるサブユニットは、本明細書に開示されるいずれかのリンカーを介して抗体Ｆｃドメインポリペプチドのいずれかに融合することができ、それにより、限定はされないが、表４に記載されるとおりのコンストラクト１１９、１１９－１、１１９－２、１１９－３、１１９－４、１１９－５、１１９－６、１１９－７、及び１１９－８、並びに表５に記載されるとおりのコンストラクト１９、１９－１、１９－２、１９－３、１９－４、１９－５、１９－６、１９－７、１９－８、１９－９、及び１９－１０を含む配列を有するＦｃ融合タンパク質が形成される。

（ｅ）スペーサーペプチド
例示的スペーサーペプチド配列は表７に提供され、例示的完全長リンカー配列は表４及び表５に提供される。

本発明の第１のポリペプチドの範囲内では、アミノからカルボキシルへの向きに、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットがリンカーを介して第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（例えば、ＩｇＧ４抗体Ｆｃ変異体配列又はＩｇＧ１抗体Ｆｃ変異体配列、表２に開示されるとおり）に融合される。及び本発明の第２のポリペプチドの範囲内では、アミノからカルボキシルへの向きに、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットがリンカーを介して第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（例えば、ＩｇＧ４抗体Ｆｃ変異体配列又はＩｇＧ１抗体Ｆｃ変異体配列、表２に開示されるとおり）に融合される。

一部の実施形態において、本発明の多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットはリンカーを介して第１の抗体Ｆｃドメイン配列に融合され、ここでリンカーは、スペーサーペプチドＬ_１と、配列番号１、２、４、６、７、９、１１、２３７、２３８、２３９、又は２４０のアミノ酸配列とを含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、リンカーを介して第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合され、ここでリンカーは、スペーサーペプチドＬ_２と、配列番号１、２、４、６、７、９、１１、２３７、２３８、２３９、又は２４０のアミノ酸配列とを含むか、又はそれからなる。

特定の実施形態において、Ｌ_１及びＬ_２はペプチドリンカーであり、例えば、Ｌ_１及び／又はＬ_２は４～５０アミノ酸残基を含む。特定の実施形態において、Ｌ_１は４～５０アミノ酸残基からなる。特定の実施形態において、Ｌ_１は４～２０アミノ酸残基からなる。特定の実施形態において、Ｌ_２は４～５０アミノ酸残基からなる。特定の実施形態において、Ｌ_２は約４～２０アミノ酸残基からなる。特定の実施形態において、Ｌ_１及びＬ_２は、各々独立に、約４～５０アミノ酸残基からなる。特定の実施形態において、Ｌ_１及びＬ_２は、各々独立に、４～２０アミノ酸残基からなる。

一部の実施形態において、Ｌ_１及びＬ_２は、最適化された長さ及び／又はアミノ酸組成を有する。一部の実施形態において、Ｌ_１及びＬ_２は同じ長さであり、同じアミノ酸組成を有する。他の実施形態において、Ｌ_１及びＬ_２は異なる。

特定の実施形態において、Ｌ_１は、Ｌ_２と等しいアミノ酸数である；特定の実施形態において、Ｌ_１は、Ｌ_２よりも長い（即ち、アミノ酸数が多い）；特定の実施形態において、Ｌ_１は、Ｌ_２よりも短い（即ち、少ないアミノ酸数）。

特定の実施形態において、Ｌ_１及び／又はＬ_２は「短い」ものであり、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２アミノ酸残基からなる。従って、特定の例では、スペーサーペプチドは、約１２アミノ酸残基以下からなる。０アミノ酸残基の場合、スペーサーペプチドはペプチド結合である。特定の実施形態において、Ｌ_１及び／又はＬ_２は「長い」ものであり、例えば、１５、２０又は２５アミノ酸残基からなる。一部の実施形態において、スペーサーペプチドは、約３～約１５個、例えば、８、９又は１０個の隣接するアミノ酸残基からなる。Ｌ_１及びＬ_２のアミノ酸組成に関して、本発明のタンパク質の第１及び第２のポリペプチドに可動性を付与するが、第１及び第２の異なるサブユニットが互いに結合するのを妨げないとともに、プロテアーゼによる切断にも耐えるという特性を備えるペプチドが選択される。例えば、グリシン及びセリン残基は、概してプロテアーゼ耐性を提供する。多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを配列番号１、２、４、６、７、９、１１、２３７、２３８、２３９、又は２４０のアミノ酸配列に連結するのに好適な、及び／又は多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを配列番号１、２、４、６、７、９、１１、２３７、２３８、２３９、又は２４０のアミノ酸配列に連結するのに適したスペーサーペプチドは、リンカーの一部として、（ＧＳ）_ｎ、（ＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＳＧ）_ｎ、（ＧＧＳＧＧ）_ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）_ｎ配列（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である）を含み得る。一部の実施形態において、Ｌ_１及び／又はＬ_２は、独立に、（ＧＧＧＧＳ）_４（配列番号１０７）又は（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号１０８）配列をリンカーの一部として含む。他の実施形態において、Ｌ_１及び／又はＬ_２は、独立に、ペプチド配列を、表７に掲載されるとおりの、配列番号１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、及び１２０から選択される配列に示されるとおりの、リンカーの一部として含む。一部の実施形態において、Ｌ_１及び／又はＬ_２は、独立に、配列番号１０８、配列番号１０９、又は配列番号１１０である。

特定の実施形態において、Ｌ_１は、リンカーの一部としての配列、配列番号１０８を含み、Ｌ_２は、リンカーの一部として、配列番号１０９、又は配列番号１１０を含む。特定の実施形態において、Ｌ_２は、リンカーの一部としての配列、配列番号１０８を含み、Ｌ_１は、リンカーの一部として、配列番号１０９、又は配列番号１１０配列を含む。特定の実施形態において、Ｌ_１は、リンカーの一部として、配列番号１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、又は１２０に示されるとおりの配列を含まない。

特定の実施形態において、Ｌ_２のみが、リンカーの一部として、配列番号１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、又は１２０に示されるとおりの配列を含む。特定の実施形態において、Ｌ_１もＬ_２も、リンカーの一部として、配列番号１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、又は１２０に示されるとおりの配列を含まない。

本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドを含み、ここでは配列番号１１８を含むリンカーが、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドを含み、ここでは配列番号１１８を含むリンカーが、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１１８を含むリンカーが多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、追加のサブユニットが、配列番号１１８を含まないリンカーで第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１１８を含まないリンカーが多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが、配列番号１１８を含むリンカーで第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドを含み、ここでは配列番号１０９を含むリンカーが、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドを含み、ここでは配列番号１０９を含むリンカーが、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。

本開示の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１０９を含むリンカーを含み、このリンカーは、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けていて、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１０９を含むリンカーが、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、多サブユニットタンパク質の追加のサブユニットが、配列番号１０９を含まないリンカーで第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１０９を含まないリンカーが多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが、配列番号１０９を含むリンカーで第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドを含み、ここでは配列番号１１０を含むリンカーが、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドを含み、ここでは配列番号１１０を含むリンカーが、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。

本開示の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１１０を含むリンカーを含み、このリンカーは、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットを第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けていて、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットを第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド、例えばＩｇＧ４抗体のＦｃドメインポリペプチド又はＩｇＧ１抗体のＦｃドメインポリペプチドに結び付けている。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１１０を含むリンカーが多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが、配列番号１１０を含まないリンカーで第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１１０を含まないリンカーが多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが、配列番号１１０を含むリンカーで第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１１０を含むリンカー配列が多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが、配列番号１０９を含むリンカー配列で第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

特定の実施形態において、本発明の一部のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットと第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第１のポリペプチドであって、配列番号１０９を含むリンカー配列が多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットをＦｃドメインポリペプチドに結び付けている、第１のポリペプチドと、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとを含む第２のポリペプチドであって、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットが、配列番号１１０を含むリンカー配列で第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに結び付けられている、第２のポリペプチドとを含む。

（ｆ）Ｆｃドメイン及びヘテロ二量体化を促進するための置換
本発明のタンパク質のアセンブリは、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（例えば、ＩｇＧ４抗体Ｆｃ変異体配列又はＩｇＧ１抗体Ｆｃ変異体配列、表２に開示されるとおり）に融合した多サブユニットタンパク質の第１のサブユニット配列を含む第１のポリペプチドと、第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（例えば、ＩｇＧ４抗体Ｆｃ変異体配列又はＩｇＧ１抗体Ｆｃ変異体配列、表２に開示されるとおり）に融合した多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニット配列を含む第２のポリペプチドとを同じ細胞で発現させて、それが本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のアセンブリにつながることにより達成することができる。アセンブルしたタンパク質は、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドとが互いに結合したヘテロ二量体Ｆｃドメインポリペプチドを有する。Ｆｃのヘテロ二量体の優先的なアセンブリの促進は、米国特許出願第１３／４９４８７０号明細書、米国特許出願第１６／０２８８５０号明細書、米国特許出願第１１／５３３７０９号明細書、米国特許出願第１２／８７５０１５号明細書、米国特許出願第１３／２８９９３４号明細書、米国特許出願第１４／７７３４１８号明細書、米国特許出願第１２／８１１２０７号明細書、米国特許出願第１３／８６６７５６号明細書、米国特許出願第１４／６４７４８０号明細書、及び米国特許出願第１４／８３０３３６号明細書に示されるとおり、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける異なる突然変異の取込みによって達成することができる。例えば、突然変異は、ヒトＩｇＧ１をベースとするＣＨ３ドメインに作られてもよく、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドの範囲内に、これらの２本の鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化するのを許容する別個のアミノ酸置換対が取り込まれる。以下に例示するアミノ酸置換の位置は全て、ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い番号付けしている。

一つのシナリオでは、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド中のアミノ酸置換が、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）から選択される大型のアミノ酸に置き換え、第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ酸置換が、元のアミノ酸を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、又はバリン（Ｖ）から選択される小型のアミノ酸に置き換え、従って大型のアミノ酸置換（突起）が小型のアミノ酸置換（腔）の表面に嵌まり込む。例えば、一方の抗体ＦｃドメインポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を取り込むことができ、他方が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む３つの置換を取り込むことができる。

本発明の多サブユニットタンパク質の第１のサブユニット配列を含む第１のポリペプチド又は多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニット配列を含む第２のポリペプチドは、任意選択で、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをＣＨ１ドメインと共に又はそれ無しで含むＩｇＧ定常領域など、抗体定常領域と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一のアミノ酸配列にカップリングすることができる。一部の実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、又はＩｇＧ４定常領域など、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一である。一部の他の実施形態において、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、又はウマなど、別の哺乳類由来の抗体定常領域と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一である。１つ以上の突然変異は、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較すると、定常領域中に、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及び／又はＫ４３９において取り込まれてもよい。例示的置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが挙げられる。

特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に取り込むことのできる突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／又はＶ１７３にあり得る。特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに取り込むことのできる突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／又はＴ１６４にあり得る。

アミノ酸置換は、以下の表８に示される置換セットから選択される可能性がある。

或いは、アミノ酸置換は、以下の表９に示される置換セットから選択される可能性がある。

或いは、アミノ酸置換は、以下の表１０に示される置換セットから選択される可能性がある。

或いは、各ポリペプチド鎖中の少なくとも１つのアミノ酸置換は、表１１から選択される可能性がある。

或いは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の表１２にある置換セットから選択される可能性があり、ここで第１のポリペプチド欄に指示される位置は、任意の公知の負電荷アミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチド欄に指示される位置は、任意の公知の正電荷アミノ酸によって置き換えられる。

或いは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、以下の表１３にあるセットから選択される可能性があり、ここで第１のポリペプチド欄に指示される位置は、正電荷アミノ酸によって置き換えられ、第２のポリペプチド欄に指示される位置は、任意の公知の負電荷アミノ酸によって置き換えられる。

或いは、アミノ酸置換は、以下の表１４にあるセットから選択される可能性がある。

或いは、又は加えて、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の構造的安定性は、第１又は第２のポリペプチド鎖のいずれか一方にＳ３５４Ｃを導入し、反対側のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入して、これらの２つのポリペプチドの界面内に人工的ジスルフィド結合を形成することによって増加させてもよい。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、及びＫ４０９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７及びＫ４０９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＳ３５４Ｃ置換が異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＹ３４９Ｃ置換が異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＹ３４９Ｃ置換が異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＳ３５４Ｃ置換が異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換が異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＯ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換が異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とがＯ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換が異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３６６Ｗ置換が異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換が異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換が異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３６６Ｗ置換が異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換が異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換が異なる。

一部の実施形態において、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換が異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とＴ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換が異なる。

当業者は、タンパク質の作製及び／又は保存時、Ｎ末端グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）のサイクル処理によってラクタムが形成され得る（例えば、自然に、又は作製及び／又は保存時に存在する酵素によって触媒される）ことを理解するであろう。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端残基がＥ又はＱである一部の実施形態において、本明細書では、Ｅ又はＱがピログルタミン酸に置き換えられた対応するアミノ酸配列もまた企図される。

当業者であれば、タンパク質作製及び／又は保存時、タンパク質のＣ末端リジン（Ｋ）が除去され得る（例えば、自然に、又は作製及び／又は保存時に存在する酵素によって触媒される）こともまた理解するであろう。このようなＫの除去は、そのＣ末端にＦｃドメインを含むタンパク質で観察されることが多い。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列のＣ末端残基（例えば、Ｆｃドメイン配列）がＫである一部の実施形態において、本明細書では、Ｋが除去されている対応するアミノ酸配列もまた企図される。

（ｇ）エフェクター機能を低減するための突然変異
一態様において、本発明は、（ａ）第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットとを含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとを含む第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供し、ここで第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々、ヘテロ二量体化を促進する異なる突然変異を含み、第１及び／又は第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含み、及び第１のサブユニットと多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットとは互いに結合している。特定の実施形態において、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含む本明細書に開示されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を低減する１つ以上のＦｃ突然変異を持たないその対応物と比べて、腫瘍成長を阻害する活性の増加を示す。本明細書で企図される突然変異には、アミノ酸残基の置換、挿入、及び欠失が含まれる。本明細書に開示されるＦｃドメイン又はヒンジ領域のアミノ酸位置は全て、ＥＵ付番に従い番号付けされる。

特定の実施形態において、第１及び／又は第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｆｃドメインポリペプチドが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を誘導する能力を低減する１つ以上の突然変異を含む。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、典型的にはＦｃ受容体によって媒介される。例えば、特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４）抗体配列である。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）とも称されるヒトＩｇＧのＦｃ受容体には、限定はされないが、活性化型Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６又はＣＤ１６Ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）、並びに抑制型Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）が含まれる。従って、一部の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１及び／又は第２のポリペプチドの活性化型ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、又はＦｃγＲＩＩＩＢ）への結合を低減するため１つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１及び／又は第２のポリペプチドの抑制型ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ）への結合を増加させる１つ以上の突然変異を含む。

活性化型ＦｃγＲへの結合を低減する及び／又は抑制型ＦｃγＲへの結合を増加させるＦｃ突然変異は、当該技術分野において公知である。例えば、ヒンジ及びＦｃ領域内では、ＣＤ１６結合はヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５～Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７～Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７～Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４～Ｓｅｒ２３９、及びＣＨ２ドメインの炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎｅｔａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７－２７３を参照のこと）。これらの既知のドメインに基づき、ファージディスプレイライブラリ又は酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリの使用によるなどして、ＣＤ１６への結合親和性を増強又は低減するように突然変異を選択することができ、又は相互作用の既知の三次元構造に基づき設計することができる。

Ｗａｎｔｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＣｅｌｌ（２０１８）９（１）：６３－７３にレビューされているとおり、アミノ酸位置２３２～２３９、２６５～２７０、２９６～２９９、及び３２５～３３２を含む領域は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃの結晶構造に応じて活性化型ＦｃγＲ結合に関係があるとされている。Ｗａｎｇｅｔａｌ．はまた、ヒトＩｇＧ４抗体のＬ２３５Ｅ及びＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、ヒトＩｇＧ１抗体のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異、及びＩｇＧ抗体のＮ２９７突然変異（例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、又はＮ２９７Ｄ）が活性化型ＦｃγＲ結合を低減することも開示している。米国特許第８，９６９，５２６号明細書に開示されるとおり、３２９位における突然変異（例えば、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、又はＰ３２９Ｒ）もまた、活性化型ＦｃγＲ結合を低減する。活性化型ＦｃγＲ結合に関係があるとされる更なるアミノ酸位置及び突然変異（例えば、Ｅ２３３Ｐ突然変異）が、米国特許第７，９４３，７４３号明細書及びＩｓａａｃｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６１：３８６２－６９に開示されている。

従って、特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、２３３、２３４、２３５、２９７、及び３２９位から選択される位置の１つ以上に突然変異（例えば、ヒトＩｇＧ１と比べたときの置換）を含む。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｅ２３３Ｐ；Ｌ２３４Ａ（ヒトＩｇＧ１）又はＦ２３４Ａ（ヒトＩｇＧ４）；Ｌ２３５Ａ又はＬ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、又はＮ２９７Ｄ；及び／又はＰ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、又はＰ３２９Ｒを含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａを含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｌ２３５Ｅを含むヒトＩｇＧ４抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ａを含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。

特定の実施形態において、第１及び／又は第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、Ｆｃドメインポリペプチドが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する能力を低減する１つ以上の突然変異を含む。ＣＤＣは、典型的には補体成分（例えば、Ｃ１）によって媒介される。従って、特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１及び／又は第２のポリペプチドの補体成分（例えば、Ｃ１ｑ）への結合を低減するため１つ以上の突然変異を含む。

Ｃ１ｑへの結合を低減するＦｃ突然変異は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書及び同第５，６２４，８２１号明細書に開示されるとおり、Ｆｃの位置２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、及び３２２位にあるアミノ酸残基は、Ｃ１ｑ結合に関係があるとされている。Ｔａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９３）１７８：６６１－６６７及びＢｒｅｋｋｅｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２５４２－４７に開示されるとおり、３３１位の残基Ｐｒｏは、Ｃ１ｑ結合に関係があるとされている。Ｉｄｕｓｏｇｉｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６４：４１７８－８４に開示されるとおり、Ｆｃの２７０位（例えば、Ｄ２７０Ａ）、３２２位（Ｋ３２２Ａ）、３２９位（例えば、Ｐ３２９Ａ）、及び３３１位（例えば、Ｐ３３１Ａ、Ｐ３３１Ｓ、又はＰ３３１Ｇ）における突然変異は、Ｃ１ｑ結合を低減した。

従って、特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、２３４、２３５、２３６、２３７、２７０、２９７、３１８、３２０、３２２、３２９、及び３３１位から選択される位置の１つ以上に突然変異（例えば、ヒトＩｇＧ１と比べたときの置換）を含む。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、及び／又はＰ３２９Ａを含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、突然変異Ｐ３２９Ａを含むヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃドメインポリペプチドである。

ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを低減する突然変異及びＣＤＣを低減する突然変異は、組み合わせることができる。特定の実施形態において、第１及び／又は第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、ＦｃドメインポリペプチドがＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを誘導する能力を低減する１つ以上の突然変異を含み、更に、ＦｃドメインポリペプチドがＣＤＣを誘導する能力を低減する１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、ＦｃドメインポリペプチドがＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを誘導する能力を低減する１つ以上の突然変異を含み、更に、ＦｃドメインポリペプチドがＣＤＣを誘導する能力を低減する１つ以上の突然変異を含む。

一部の実施形態において、ＩｇＧ４Ｆｃとの本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１及び／又は第２のポリペプチドにおけるＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、又はＦｃγＲＩＩＩＢ）又は補体成分（例えば、Ｃ１ｑ）への結合を低減するため１つ以上の突然変異を含む。かかる突然変異は、エフェクター機能を低減するのに有用である。例えば、本開示のタンパク質は、Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ突然変異；Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ａ突然変異；又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ突然変異を含むことができる。

一部の実施形態において、ＩｇＧ１Ｆｃとの本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１及び／又は第２のポリペプチドにおけるＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、又はＦｃγＲＩＩＩＢ）又は補体成分（例えば、Ｃ１ｑ）への結合を低減するため１つ以上の突然変異を含む。かかる突然変異は、エフェクター機能を低減するのに有用である。例えば、本開示のタンパク質は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ突然変異；Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ突然変異；又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ突然変異を含むことができる。

一部の実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、各々が突然変異Ｐ３２９Ｇ又はＰ３２９Ａを持つ第１の抗体ＩｇＧ４又はＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドと第２の抗体ＩｇＧ４又はＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドとを含む。

一部の実施形態において、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択される突然変異を持つ。

一部の実施形態において、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドは、各々が、突然変異Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを持つ。

特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の第１のポリペプチドでは、多サブユニットタンパク質の第１のサブユニットは、第１のリンカーによって第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の第２のポリペプチドでは、多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニットは、第２のリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。かかる使用に好適なリンカーのアミノ酸配列は、見出し「ＩｇＧ４コンストラクト」及び「ＩｇＧ１コンストラクト」の下に記載される。第１及び／又は第２のポリペプチドにおける使用に好適な更なるリンカー配列としては、限定はされないが、野生型ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４）ヒンジ配列及びその突然変異体形態が挙げられる。例えば、特定の実施形態において、第１及び第２のリンカーは、各々が、アミノ酸配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＸＧＧ（式中、ＸはＬ又はＥである）（配列番号２８０）又はＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＸＧＧ（式中、ＸはＬ又はＥである）（配列番号２８１）を含む。特定の実施形態において、第１及び第２のリンカーは、各々が、配列番号２８２又は配列番号２８３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第１及び第２のリンカーは、各々が、配列番号２８４又は配列番号２８５のアミノ酸配列を含む。

（ｈ）血清半減期
本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、治療的使用に好適な薬物動態特性を有する。例えば、特定の実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも約５０時間の血清半減期を有する。特定の実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも約１００時間の血清半減期を有する。

特定の実施形態において、対象への静脈内投与の５０時間後、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の血清濃度は、前記対象における投与後１時間の本発明のタンパク質の血清濃度の少なくとも１０％である。

特定の実施形態において、本発明に係るヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインポリペプチドに融合していない多サブユニットタンパク質よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％長い血清半減期を有する。特定の実施形態において、本発明に係る多サブユニットタンパク質のタンパク質配列を含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインポリペプチドに融合していない多サブユニットタンパク質よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、又は２０倍長い血清半減期を有する。

（ｉ）腫瘍の貯留性
本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、任意選択で、腫瘍部位におけるタンパク質の貯留性を増強する更なる特徴を取り込むことができる。例えば、本発明の特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、プロテオグリカン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、及び／又はヒアルロン酸結合ドメインを更に含む。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、腫瘍に（例えば、腫瘍細胞の表面、腫瘍の細胞周囲マトリックス、又は腫瘍の細胞外マトリックスに）存在する１つ以上のプロテオグリカン（例えば、当該技術分野において公知のプロテオグリカン、例えば、Ｌｏｚｚｏｅｔａｌ．，ＭａｔｒｉｘＢｉｏ（２０１５）４２：１１－５５；及びＮｉｋｉｔｏｖｉｃｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０１８）９：６９に開示されるとおりのもの）に結合するプロテオグリカン結合ドメインを更に含む。特定の実施形態において、コラーゲン結合ドメインは、腫瘍に（例えば、腫瘍細胞の表面、腫瘍の細胞周囲マトリックス、又は腫瘍の細胞外マトリックスに）存在する１つ以上のコラーゲンに結合する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、腫瘍に存在する１つ以上のヒアルロン酸に結合するヒアルロン酸（ｈａｃｉｄ）結合ドメインを更に含む。かかるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、腫瘍における貯留性の亢進を示し、より低い用量及び／又は頻度で対象の腫瘍内に投与され得る。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に含まれるプロテオグリカン結合ドメインは、腫瘍に（例えば、腫瘍細胞の表面、腫瘍の細胞周囲マトリックス、又は腫瘍の細胞外マトリックスに）特異的に発現する１つ以上のプロテオグリカンに結合する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に含まれるコラーゲン結合ドメインは、腫瘍に（例えば、腫瘍細胞の表面、腫瘍の細胞周囲マトリックス、又は腫瘍の細胞外マトリックスに）特異的に発現する１つ以上のコラーゲンに結合する。かかるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、投与後に（例えば、静脈内、皮下、又は肺内投与後に）腫瘍において濃縮されて、亢進した腫瘍貯留性を有してもよく、ひいては、より低い用量及び／又は頻度での投与が可能となる。

特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、シンデカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、ベータグリカン、ホスファカン、グリピカン、パールカン、アグリン、コラーゲン（例えば、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＶ、又はＸＶＩＩＩ型コラーゲン）、ヒアレクタン、アグレカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン、及び小分子ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）から選択される１つ以上のプロテオグリカンに結合するプロテオグリカン結合ドメインを更に含む。癌に関係があるとされているプロテオグリカンとしては、限定はされないが、コラーゲン、シンデカン（例えば、シンデカン－１又はシンデカン－２）、セルグリシン、ＣＳＰＧ４、ベータグリカン、グリピカン（例えば、グリピカン－１又はグリピカン－３）、パールカン、バーシカン、ブレビカン、及びＳＬＰＲ（例えば、デコリン、バイグリカン、アスポリン、フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｄｕｌｉｎ）、及びルミカン）が挙げられる。従って、特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に含まれるプロテオグリカン結合ドメインは、シンデカン（例えば、シンデカン－１又はシンデカン－２）、セルグリシン、ＣＳＰＧ４、ベータグリカン、グリピカン（例えば、グリピカン－１又はグリピカン－３）、パールカン、バーシカン、ブレビカン、及びＳＬＰＲから選択される１つ以上のプロテオグリカンに結合する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に含まれるプロテオグリカン結合ドメインは、デコリン、バイグリカン、アスポリン、フィブロモジュリン（ｆｉｂｒｏｄｕｌｉｎ）、及びルミカンから選択される１つ以上のＳＬＰＲに結合する。

ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に含まれるプロテオグリカン結合ドメインは、タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）、ペプチド（例えば、プロテオグリカン結合タンパク質又はその変異体の一部分）、アプタマー、小分子、又はこれらの組み合わせであり得る。プロテオグリカン結合ドメインはまた、当該技術分野においても公知である。例えば、シンデカン結合ドメインについては、米国特許第６，５６６，４８９号明細書、同第８，６４７，８２８号明細書、及び同第１０，１２４，０３８号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２９７４７９号明細書；及び国際公開第２０１８１９９１７６Ａ１号パンフレットに開示されている。ＣＳＰＧ４結合ドメインについては、米国特許第９，８０１，９２８号明細書及び同第１０，０９３，７４５号明細書；及び米国特許出願公開第２０１６／００３２００７号明細書、同第２０１７／０３４２１５１号明細書、及び同第２０１８／００７２８１１号明細書に開示されている。β－グリカン結合ドメインについては、米国特許第７，４５５，８３９号明細書に開示されている。グリピカン結合ドメインについては、米国特許第７，９１９，０８６号明細書、同第７，７７６，３２９号明細書、同第８，６８０，２４７号明細書、同第８，３８８，９３７号明細書、同第９，２６０，４９２号明細書、同第９，３９４，３６４号明細書、同第９，７９０，２６７号明細書、同第９，５２２，９４０号明細書、及び同第９，４０９，９９４号明細書；米国特許出願公開第２００４／０２３６０８０号明細書、同第２０１１／０１２３９９８号明細書、同第２０１８／０２４４８０５号明細書、同第２０１８／０２３０２３０号明細書、及び同第２０１８／０３４６５９２号明細書；欧州特許第２２７０５０９号明細書；及び国際公開第２０１７０５３６１９Ａ１号パンフレット、同第２０１８０２６５３３Ａ１号パンフレット、同第２０１８１６５３４４Ａ１号パンフレット、及び同第２０１８１９９３１８Ａ１号パンフレットに開示されている。パールカン結合ドメインについては、米国特許出願第１０，１６６，３０４号明細書に開示されている。デコリン結合ドメインについては、米国特許第６，５１７，８３８号明細書及び国際公開第２００００２１９８９Ａ１号パンフレット、同第２００００７７０４１Ａ２号パンフレット、及び同第２００００７８８００Ａ２号パンフレットに開示されている。

特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、コラーゲン結合ドメインを更に含む。コラーゲンは、脊椎動物に少なくとも２８種類の異なる型が同定されているタンパク質の一クラスである。Ｆａｎｇｅｔａｌ．，ＴｕｍｏｒＢｉｏｌ．（２０１４）３５：２８７１－８２ａｎｄＸｉｏｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．ＣａｎｃｅｒＭｅｔａｓｔａ．Ｔｒｅａｔ．（２０１６）２：３５７－６４に開示されるとおり、各コラーゲン型が、その独自の構造特性及び分布パターンを有する。限定はされないが、Ｃｏｌ３Ａ１、Ｃｏｌ５Ａ２、Ｃｏｌ６、Ｃｏｌ７Ａ１、Ｃｏｌ１５Ａ１Ｃｏｌ１９Ａ１、及びＣｏｌ２２Ａ１を含め、様々なコラーゲン型が、癌に関係があるとされている。コラーゲン結合ドメインは、タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）、ペプチド（例えば、コラーゲン結合タンパク質又はその変異体の一部分）、アプタマー、小分子、又はこれらの組み合わせであり得る。コラーゲン結合ドメインは当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，７８８，９６６号明細書、同第５，５８７，３６０号明細書、同第５，８５１，７９４号明細書、同第５，７４１，６７０号明細書、同第５，８４９，７０１号明細書、同第６，２８８，２１４号明細書、同第６，３８７，６６３号明細書、同第６，９０８，９９４号明細書、同第７，１６９，９０２号明細書、同第７，４８８，７９２号明細書、同第７，８２０，４０１号明細書、同第８，９５６，６１２号明細書、同第８，６４２，７２８号明細書、及び同第８，９０６，６４９号明細書、及び米国特許出願公開第２００７／０１６１０６２号明細書、同第２００９／０１４２３４５号明細書、及び同第２０１２／０１００１０６号明細書に開示されている。

特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ヒアルロン酸結合ドメインを更に含む。ヒアルロン酸結合ドメインは、タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）、ペプチド（例えば、ヒアルロン酸結合タンパク質又はその変異体の一部分）、アプタマー、小分子、又はこれらの組み合わせであり得る。ヒアルロン酸結合ドメインは当該技術分野において公知であり、例えば米国特許第６，８６４，２３５号明細書、同第８，１９２，７４４号明細書、同第８，０４４，０２２号明細書、同第８，１６３，４９８号明細書、同第８，０３４，６３０号明細書、同第９，２１７，０１６号明細書、同第９，７９５，６８６号明細書、及び同第９，７５１，９１９号明細書、及び米国特許出願公開第２００２／００５５４８８号明細書及び同第２００７／０２５９３８０号明細書に開示されている。

プロテオグリカン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、及び／又はヒアルロン酸結合ドメインは、存在する場合、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の任意の位置にあってよい。例えば、特定の実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットが抗体ＦｃドメインポリペプチドのＮ末端側に位置する場合、本明細書に開示されるとおりのプロテオグリカン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、及び／又はヒアルロン酸結合ドメインは、第１の抗体ＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合されてもよく、及び／又は第２の抗体ＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合されてもよい。特定の実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットが抗体ＦｃドメインポリペプチドのＣ末端側に位置する場合、本明細書に開示されるとおりのプロテオグリカン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、及び／又はヒアルロン酸結合ドメインは、第１の抗体ＦｃドメインポリペプチドのＮ末端に融合されてもよく、及び／又は第２の抗体ＦｃドメインポリペプチドのＮ末端に融合されてもよい。

プロテオグリカン結合ドメイン、コラーゲン結合ドメイン、及び／又はヒアルロン酸結合ドメインは、存在する場合、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の残りの部分にリンカーを介して融合されてもよい。特定の実施形態において、プロテオグリカン結合ドメインは、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の残りの部分にペプチドリンカーを介して融合される。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、本明細書に開示されるスペーサーペプチドを含む。

例示的ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質
特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む。特定の実施形態において、配列番号２９０及び配列番号２９１を含む本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第１の抗体ＦｃドメインポリペプチドのＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ突然変異を含み、第２の抗体ＦｃドメインポリペプチドのＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ突然変異を含む。特定の実施形態において、配列番号２９０及び配列番号２９１を含む本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、それぞれのＦｃドメインポリペプチド配列に、Ｆｃドメイン間でのヘテロ二量体化を促進するための異なる突然変異を含む。

特定の実施形態において、第１のポリペプチド配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を含む第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（ヒトＩｇＧ１）配列を含む。特定の実施形態において、第２のポリペプチド配列は、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を含む第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（ヒトＩｇＧ１）配列を含む。特定の実施形態において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドアミノ酸配列は、エフェクター機能を低減するための１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ突然変異を含む。

特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の第１のポリペプチド（配列番号２９０）では、ヒトＩＬ－１２のｐ４０サブユニットは、第１のアミノ酸配列を含む第１のリンカーによって第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合され、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の第２のポリペプチド（配列番号２９１）では、ヒトＩＬ－１２のｐ３５サブユニットは、第２のアミノ酸配列を含む第２のリンカーによって第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合される。

配列番号２９０は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドに融合したヒトＩＬ－１２のｐ４０サブユニットの配列（下線のアミノ酸）である。突然変異は太字で示す。

配列番号２９１は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドに融合したヒトＩＬ－１２のｐ３５サブユニットの配列（下線のアミノ酸）である。突然変異は太字で示す。

それぞれ、アミノ酸配列の配列番号２９０及び配列番号２９１によって表される第１及び第２のポリペプチドは、配列番号２９０の第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（ヒトＩｇＧ１）のＣＨ３ドメインにあるＹ３４９Ｃ突然変異配列（太字及び下線）及び配列番号２９１の第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチド（ヒトＩｇＧ１）のＣＨ３ドメインにあるＳ３５４Ｃ突然変異配列（太字及び下線）に起因してジスルフィド結合を形成し、これがヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質に安定性を付与する（Ｆｃの番号付けは、ＥＵ方式に従う）。

ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の２つのＦｃドメインポリペプチド間のヘテロ二量体化を促進するため、配列番号２９０の第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド配列（ヒトＩｇＧ１）はＣＨ３ドメインにＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換を含み、配列番号２９１の第２の異なるＦｃドメインポリペプチド配列（ヒトＩｇＧ１）は、ＣＨ３ドメインにＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ置換を含む（Ｆｃの番号付けは、ＥＵ方式に従う）。

配列番号２９０及び配列番号２９１の第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチド配列及び第２の異なるＦｃドメインポリペプチド配列（ヒトＩｇＧ１）はまた、エフェクター機能を低減するためのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ（ＬＡＬＡＰＡ）突然変異も含む。

このヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書ではＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと称される。

（ｊ）調製及び作製方法
本発明のタンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて作ることができる。例えば、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合した多サブユニットタンパク質の第１のサブユニット配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ；第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合した多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニット配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ；及び第１及び第２の発現ベクターを宿主細胞へと共に安定にトランスフェクトすることにより、多量体タンパク質を作製することができる。

タンパク質の最も高い収率を実現するため、異なる比率の第１及び第２の発現ベクターを調べて、宿主細胞へのトランスフェクションに最適な比率を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、又はＣｌｏｎｅｐｉｘなど、当該技術分野で公知の方法を用いて、細胞バンク作成用に単一クローンを単離することができる。

クローンは、バイオリアクタースケールアップ及び本発明のタンパク質の発現の維持に好適な条件下で培養することができる。タンパク質は、遠心、深層ろ過、細胞溶解、均質化、凍結融解、アフィニティー精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含めた、当該技術分野で公知の方法を用いて単離し、及び精製することができる。

（ｉ）原薬調製
一部の実施形態において、本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、例えばＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で作製される。特定の実施形態において、本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、例えばＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、ＣＨＯ細胞で浮遊培養下に（例えば、振盪フラスコ内で）作製される。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞のバイアルを解凍し、２回以上継代した後に、タンパク質が作製される（例えば、２回、３回、４回、５回、６回）。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞のバイアルを解凍し、４回継代した後に、タンパク質が作製される。特定の実施形態において、４回目の継代のＣＨＯ細胞を使用して、第１のバイオリアクターの培養液が接種される。特定の実施形態において、第１のバイオリアクターは、約４０Ｌ、約４５Ｌ、約５０Ｌ、約５５Ｌ、又は約６０Ｌの容積を有する。特定の実施形態において、第１のバイオリアクターは、約５０Ｌの容積を有する。特定の実施形態において、第１のバイオリアクターの培養液からのＣＨＯ細胞を使用して、生産バイオリアクターの培養液が接種される。特定の実施形態において、生産バイオリアクターは、約１８０Ｌ、約１８５Ｌ、約１９０Ｌ、約１９５Ｌ、約２００Ｌ、約２０５Ｌ、約２１０Ｌ、約２１５Ｌ、又は約２２０Ｌの容積を有する。特定の実施形態において、生産バイオリアクターの最終的な培養液容積は約１８０Ｌである。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、Ｌ－グルタミン（例えば、６ｍＭＬ－グルタミン）を補足した成長培地で成長させる。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞は、約３７℃の温度で成長させる。特定の実施形態において、培養条件は、（例えば、グルコースに関して、乳酸塩に関して、ｐＨに関して）毎日モニタされる。

一部の実施形態において、生産バイオリアクターは、空気及び酸素を補足することによって培養液中の溶存酸素を調節する。一部の実施形態において、生産バイオリアクターは、二酸化炭素ガス及び／又は炭酸ナトリウムベースを加えることによってｐＨを調節する。一部の実施形態において、生産バイオリアクターは、目標細胞生存率に達するまで細胞密度及び生存率に関して毎日抜取り検査される。特定の実施形態において、目標細胞生存率は、約１０×１０^６生細胞／ｍＬ、約１１×１０^６生細胞／ｍＬ、約１２×１０^６生細胞／ｍＬ、約１３×１０^６生細胞／ｍＬ、約１４×１０^６生細胞／ｍＬ、約１５×１０^６生細胞／ｍＬ、約１６×１０^６生細胞／ｍＬ、約１７×１０^６生細胞／ｍＬ、約１８×１０^６生細胞／ｍＬ、約１９×１０^６生細胞／ｍＬ、又は約２０×１０^６生細胞／ｍＬである。特定の実施形態において、目標細胞生存率は約１４×１０^６生細胞／ｍＬ超である。特定の実施形態において、目標細胞生存率に達した後、培養液回収のため温度を約３７℃から約３３℃にシフトさせる。特定の実施形態において、培養液は、生存率が約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％より高くなったときに回収される。特定の実施形態において、培養液は、生存率が約８５％より高くなったときに回収される。特定の実施形態において、培養条件は、培養期間中毎日（例えば、グルコースに関して、乳酸塩に関して、ｐＨに関して）モニタされる。特定の実施形態において、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの力価が、約８日目（例えば、６日目、７日目、８日目、９日目、又は１０日目）から開始して、培養液中にてモニタされる。特定の実施形態において、培養液には、栄養供給濃縮物、濃縮グルコース溶液、及び／又は消泡剤が補足される。一部の実施形態において、細胞は、約７～約２１日間、約８～約２０日間、約９～約１９日間、約１０～約１８日間、約１１～約１７日間、約１２～約１６日間、又は約１１～約１５日間にわたって培養される。特定の実施形態において、細胞は、約１４日間にわたって培養される。

一部の実施形態において、生産バイオリアクターは、本開示のタンパク質、例えば、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの精製前に深層ろ過によって清澄化される。特定の実施形態において、清澄化には、ＤＯＨＣ及びＸＯＨＣフィルタからなる二段階使い捨て深層ろ過システムが使用される。特定の実施形態において、ろ過前、生産バイオリアクター温度を約１８℃に調整し、溶存酸素設定値を約７０％飽和度に増加させる。特定の実施形態において、回収フィルタを注射用水（ＷＦＩ）でリンスし、次に緩衝液で平衡化させる。一部の実施形態において、細胞懸濁液を蠕動ポンプを使用して回収フィルタに通過させて、そのフィルタをフラッシュすることにより生成物を収集する。特定の実施形態において、圧力がモニタされ、約２５ｐｓｉｇ未満（例えば、約２５ｐｓｉｇ未満、約２０ｐｓｉｇ未満、又は約１５ｐｓｉｇ未満）に維持される。次にろ液は０．４５／０．２μｍ膜でろ過され、例えば滅菌バッグに保存される。

一部の実施形態において、本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、例えばＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの精製は、３段階のクロマトグラフィーステップ及び２段階のウイルス除去ステップを含むか、又はそれからなる。特定の実施形態において、３段階クロマトグラフィーステップは、プロテインＡキャプチャークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーを含むか、又はそれからなる。特定の実施形態において、本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、例えばＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを含む清澄化された回収液は、プロテインＡキャプチャークロマトグラフィーによって（例えば、プロテインＡ樹脂カラムを使用して）捕捉される。特定の実施形態において、プロテインＡキャプチャークロマトグラフィーは、工程関連不純物（例えば、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質）、培地添加剤を除去し、及び容積の減量を可能にする。特定の実施形態において、初めにプロテインＡ樹脂カラムを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ約７．５の緩衝液で平衡化する。特定の実施形態において、ロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して未結合の、又は緩く結合した不純物を除去する。特定の実施形態において、初回洗浄後、５０ｍＭ酢酸塩を含むｐＨ約５．４の緩衝液でカラムを２回目に洗浄する。特定の実施形態において、２回目洗浄によってｐＨを下げ、カラムを溶出用に調製する。特定の実施形態において、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、５０ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭアルギニンを含むｐＨ約３．７の緩衝液で溶出する。特定の実施形態において、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、２８０ｎｍＵＶ波長によって１．２５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して、次に１．２５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集する。特定の実施形態において、溶出液は１つのプールに収集し、各カラムサイクルは低ｐＨウイルス不活性化によって個別に処理する。

特定の実施形態において、ウイルス除去ステップは、低ｐＨ不活性化及びナノろ過を含む。特定の実施形態において、プロテインＡ溶出液を低ｐＨでインキュベートすることにより、潜在的に存在する可能性のあるウイルスを不活性化させる。特定の実施形態において、溶出液のｐＨを酢酸、例えば０．５Ｍ酢酸で調整し、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも６０分間、少なくとも６５分間、少なくとも７０分間、少なくとも７５分間、少なくとも８０分間、少なくとも８５分間、又は少なくとも９０分間インキュベートする。特定の実施形態において、溶出液のｐＨを酢酸、例えば０．５Ｍ酢酸で調整し、少なくとも６０分間インキュベートする。特定の実施形態において、酢酸はｐＨを約３．５５～３．７５、例えば、約３．６０～３．７０、又は約３．６５に調整する。特定の実施形態において、酢酸はｐＨを約３．６５に調整する。特定の実施形態において、低ｐＨでのインキュベーション後、ｐＨを例えばトリス塩基で、例えば２Ｍトリス塩基で上昇させる。特定の実施形態において、ｐＨを約５．１、約５．２、又は約５．３の中性ｐＨにまで上昇させる。特定の実施形態において、プロテインＡ溶出液を０．２μｍろ過アセンブリに通してろ過する。特定の実施形態において、低ｐＨ不活性化はナノろ過よりも前に行われる。特定の実施形態において、ナノろ過は低ｐＨ不活性化よりも前に行われる。

一部の実施形態において、ウイルス除去ステップの後、プールを中間デプスフィルタ、例えばＸ０ＳＰ中間デプスフィルタでろ過する。特定の実施形態において、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、約５００～約１０００ｇ／ｍ^２（例えば、約４００～約１１００ｇ／ｍ^２、約４５０～約１０５０ｇ／ｍ^２、約５００～約１０００ｇ／ｍ^２）の範囲でロードされる。特定の実施形態において、混合モードクロマトグラフィー前に、Ｘ０ＳＰプールの電気伝導率をｐＨ約５．２の酢酸塩で、例えば５０ｍＭ酢酸塩で６．０ｍＳ／ｃｍ未満に調整する。

一部の実施形態において、混合モードクロマトグラフィーを実施することにより、高分子量（ＨＭＷ）種を除去する。特定の実施形態において、カラムは、例えば、５０ｍＭ酢酸塩を含むｐＨ約５．２の緩衝液で平衡化させて、及びロードする。特定の実施形態において、ロードした後、カラムを、例えば、５０ｍＭ酢酸塩及び２５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ約５．２の緩衝液で洗浄する。特定の実施形態において、収集は２８０ｎｍＵＶ検出によって０．６２５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して、１．５０ＡＵ／ｃｍ下降で終了する。特定の実施形態において、収集後、最終０．２μｍフィルタを持つフィルタ列に各サイクル液を通過させる。

一部の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施することにより、生成物関連不純物（例えば、ＨＭＷ種、低分子量（ＬＭＷ）種）及び工程関連不純物を除去する。一部の実施形態において、各生成物ロットについて複数の陽イオン交換クロマトグラフィーサイクル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回又はそれ以上のサイクル）を実施する。特定の実施形態において、サイクルは、例えば、５０ｍＭトリスを含むｐＨ７．４の緩衝液でプールし、希釈する。特定の実施形態において、プールされた試料は、塩基性溶液、例えばトリス、例えば２Ｍトリス塩基で約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、又は約７．７のｐＨに調整する。特定の実施形態において、プールされた試料は、約７．５のｐＨに調整する。特定の実施形態において、カラムは、５０ｍＭトリスを含むｐＨ７．４の緩衝液で平衡化させる。特定の実施形態において、溶出液は、５０ｍＭトリスで約７．４のｐＨ（緩衝液Ａ）及び５０ｍＭトリス及び０．５ＭＮａＣｌで約７．４のｐＨ（緩衝液Ｂ）のグラジエントを含む。特定の実施形態において、２８０ｎｍＵＶ検出によって２．５ＡＵ／ｃｍ上昇で開始して４．５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで、生成物収集を開始する。特定の実施形態において、収集後、最終０．２μｍフィルタを持つフィルタ列に各サイクル液を通過させる。

一部の実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーからサイクル液をナノろ過してウイルスを除去する。特定の実施形態において、初めに溶出液を前置フィルタ及び公称フィルタ（例えば、約２０ｎｍの公称フィルタ）に通過させる。特定の実施形態において、このシステムを緩衝液、例えば、５０ｍＭトリス及び２６５ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ約７．４の緩衝液で平衡化させる。特定の実施形態において、ロードした後、このシステムを平衡化緩衝液、例えば、５０ｍＭトリス及び２６５ｍＭＮａＣｌを含む約ｐＨ７．４の緩衝液でリンスする。特定の実施形態において、ろ液を膜、例えば０．２μｍ膜に通してろ過する。

一部の実施形態において、ろ液を限外ろ過及びダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）にかける。特定の実施形態において、限外ろ過及びダイアフィルトレーションは、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、又は約４０ｋＤａの分子量カットオフ膜を使用して実施する。特定の実施形態において、限外ろ過及びダイアフィルトレーションは、約３０ｋＤａの分子量カットオフ膜を使用して実施する。特定の実施形態において、このシステムを、緩衝液、例えば、５０ｍＭトリス及び２６５ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ約７．４の緩衝液で平衡化させる。特定の実施形態において、ウイルスろ液プールを約５．０ｇ／Ｌの目標に濃縮する。特定の実施形態において、少なくとも７ダイアボリューム（例えば、７、８、又は９ダイアボリューム）の、２０ｍＭクエン酸塩を含むｐＨ約６．５の緩衝液と緩衝液交換を実施する。一部の実施形態において、ダイアフィルトレーション後、約１１．０ｇ／Ｌを目標とする第２の濃縮ステップを実施する。特定の実施形態において、この生成物をダイアフィルトレーション緩衝液で最終的な目標濃度の約７．５ｇ／Ｌに希釈する。

一部の実施形態において、２０ｍＭクエン酸塩、１８％（ｗ／ｖ）スクロース、３％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５ストック溶液を、原薬中２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の最終濃度を目標としてＵＦ／ＤＦプールにスパイクする。

特定の実施形態において、製剤化された保持液を例えば０．２μｍ膜でろ過して最終的な原薬保存容器中に入れる。特定の実施形態において、最終的な充填容積は約１．０Ｌである。特定の実施形態において、最終的な原薬保存容器は、ポリプロピレン製の蓋付きの２Ｌポリカーボネートボトルを含む。特定の実施形態において、各ボトルを無菌的に抜取り検査し、表示を付し、及び－６５℃未満（例えば、－６５℃、－７０℃、－７５℃、－８０℃、又はそれ以下）で凍結する。

（ｉｉ）薬物製品の調製
一部の実施形態において、本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、例えばＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを含む凍結原薬は、暗所下に約２～８℃で９６時間超（例えば、９６時間、１２０時間、１４４時間、１６８時間、又はそれ以上）にわたって解凍する。特定の実施形態において、２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１％ポリソルベート８０（ｗ／ｖ）からなるｐＨ６．０の緩衝液を調製する。特定の実施形態において、緩衝液は、固体クエン酸ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、スクロース、及びマンニトールを注射用水（ＷＦＩ）に加え、溶解するまで混合することによって調製する。特定の実施形態において、薬物製品中のクエン酸塩は、固体クエン酸ナトリウム二水和物及び／又はクエン酸一水和物を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、ポリソルベート８０ストック溶液はＷＦＩ中に調製して緩衝液に加える。特定の実施形態において、緩衝液の許容ｐＨは、約６．５±０．４（例えば、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、又はｐＨ６．９）である。特定の実施形態において、緩衝液をＷＦＩで希釈し、約６．５±０．４（例えば、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、又はｐＨ６．９）の許容ｐＨ及び重量オスモル濃度に関して検査する。特定の実施形態において、緩衝液を膜、例えば０．２μｍ膜に通してろ過する。

一部の実施形態において、原薬の重量を用いて目標バッチ容積を計算する。特定の実施形態において、カーボイ（例えば、１０Ｌカーボイ）内の緩衝液に、計算したバッチ容積の約８０％まで原薬を加え、混合する。特定の実施形態において、この８０％薬物製品溶液を約６．５±０．３（例えば、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、又はｐＨ６．８）の許容ｐＨ許容に関して試験する。特定の実施形態において、８０％薬物製品溶液をタンパク質濃度に関して、２８０ｎｍの吸光度により１．４４Ｌ／（ｇ×ｃｍ）の消衰係数を用いて試験する。

一部の実施形態において、緩衝液成分は、約６．５のｐＨが生じるように設計する。特定の実施形態において、緩衝液ステップでは、ｐＨを約６．５±０．４（例えば、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、又はｐＨ６．９）の許容ｐＨの範囲内に至らせるため、１Ｎ水酸化ナトリウム又は１Ｎ塩酸による滴定を実施し得る。特定の実施形態において、８０％バルク薬物製品ステップでは、ｐＨを約６．５±０．３（例えば、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、又はｐＨ６．８）の許容ｐＨの範囲内に至らせるため、１Ｎ水酸化ナトリウム又は１Ｎ塩酸による滴定を実施し得る。

一部の実施形態において、本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、例えばＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの目標濃度は、約１ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態において、タンパク質濃度は、許容判定基準１．０±０．２ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ）として、２８０ｎｍの吸光度によって確かめる。一部の実施形態において、試料を採取して、約６．５±０．３（例えば、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、又はｐＨ６．８）の許容ｐＨ及び重量オスモル濃度を確認する。

一部の実施形態において、化合物化したバルク薬物製品溶液をバイオバーデン低減のためフィルタ、例えば滅菌０．２μｍフィルタに通過させて、カーボイ、例えば１０Ｌカーボイに入れ、滅菌ろ過及び充填まで保っておく。

一部の実施形態において、各フィルタカプセルが０．４５μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）プレフィルター膜及び０．２μｍＰＥＳ滅菌膜からなる連続した２つのフィルタカプセルにバルク薬物製品を通すことにより、ろ過を行う。特定の実施形態において、薬物製品をろ過し、充填特別室の制御下にあるグレードＢエリアにて滅菌ディスポーザブル充填バッグに入れる。特定の実施形態において、滅菌フィルタカプセルは両方とも、ＷＦＩを使用した、許容判定基準を３２００ｍｂａｒ超とするろ過後の泡立ち点により、完全性に関して試験する。

一部の実施形態において、バルク薬物製品溶液は、アクセス制限バリアシステム（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄａｃｃｅｓｓｂａｒｒｉｅｒシステム：ＲＡＢＳ）のすぐ外側にあるディスポーザブルバッグから充填する。特定の実施形態において、製品は、バイアル、例えば、既製の２Ｒホウケイ酸Ｉ型バイアルに充填する。

特定の実施形態において、バイアルを例えば滅菌１３ｍｍゴムセラム栓で打栓し、１３ｍｍアルミシールを巻き締める。特定の実施形態において、バイアルの充填容積は、１．３ｍＬ±５％（即ち、１．２３５ｍＬ～１．３６５ｍＬ）である。特定の実施形態において、バイアルを２～８℃の保存場所に移す。特定の実施形態において、バイアルは２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、又は８℃で保存する。

（ｋ）医薬製剤
本開示はまた、本明細書に記載されるタンパク質の有効量を含有する医薬組成物も特徴とする。この組成物は、種々の薬物送達システムでの使用向けに製剤化することができる。１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤又は担体もまた、適切な製剤となるように、組成物中に含めることができる。用語「賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、所望の物理的又は化学的特性、例えば、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、清澄性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸着性、又は透過性を付与するために製剤に加えられる任意の非治療用薬剤を意味する。

（ｉ）賦形剤及びｐＨ
本発明の医薬製剤中の１つ以上の賦形剤は、緩衝剤を含む。用語「緩衝剤」は、本明細書で使用されるとき、水溶液に加えると、酸又はアルカリの添加時の、又は溶媒による希釈に伴うｐＨの変動から溶液を保護する能力を持つ１つ以上の成分を指す。リン酸緩衝液に加えて、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン緩衝液などを使用することができ、その場合、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムイオンが対イオンとして働き得る。

特定の実施形態において、緩衝液又は緩衝系とは、ｐＨ５．５～７．４の範囲と全面的に又は部分的に重複する緩衝作用範囲を有する少なくとも１つの緩衝液を含む。特定の実施形態において、緩衝液は、約６．５±０．５のｐＫａを有する。特定の実施形態において、緩衝液は、クエン酸塩緩衝液を含む。具体的な実施形態において、クエン酸塩緩衝液は、クエン酸ナトリウム二水和物及びクエン酸一水和物を含む。特定の実施形態において、クエン酸塩は、約５～約１００ｍＭ、約１０～約１００ｍＭ、約１５～約１００ｍＭ、約２０～約１００ｍＭ、約５～約５０ｍＭ、約１０～約５０ｍＭ、約１５～約１００ｍＭ、約２０～約１００ｍＭ、約５～約２５ｍＭ、約１０～約２５ｍＭ、約１５～約２５ｍＭ、約２０～約２５ｍＭ、約５～約２０ｍＭ、約１０～約２０ｍＭ、又は約１５～約２０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態において、クエン酸塩は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、又は約５０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態において、クエン酸塩は、２０ｍＭの濃度で存在する。

本発明の医薬製剤は、６．０～７．０のｐＨを有し得る。例えば、特定の実施形態において、医薬製剤は、６．０～７．０（即ち、６．５±０．５）、６．１～６．９（即ち、６．５±０．４）、６．２～６．８（即ち、６．５±０．３）、６．３～６．７（即ち、６．５±０．２）、６．４～６．６（即ち、６．５±０．１）、又は６．４５～６．６５（即ち、６．５±０．０５）のｐＨを有する。特定の実施形態において、医薬製剤は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、又は約７．０のｐＨを有する。特定の実施形態において、医薬製剤は、６．５のｐＨを有する。科学的な丸め規則に基づき、６．４５以上６．５５以下のｐＨは６．０と丸める。

特定の実施形態において、医薬製剤の緩衝系は、６．５±０．２のｐＨで１０～２５ｍＭのクエン酸塩を含む。特定の実施形態において、医薬製剤の緩衝系は、６．５±０．２のｐＨで２０ｍＭのクエン酸塩を含む。特定の実施形態において、医薬製剤の緩衝系は、６．５±０．０５のｐＨで１０～２５ｍＭのクエン酸塩を含む。特定の実施形態において、医薬製剤の緩衝系は、６．５±０．０５のｐＨで２０ｍＭのクエン酸塩を含む。

本発明の医薬製剤中の１つ以上の賦形剤は、糖又は糖アルコールを更に含む。糖及び糖アルコールは、医薬製剤中で熱安定剤として有用である。特定の実施形態において、医薬製剤は、糖、例えば、単糖（例えば、グルコース、キシロース、又はエリスリトール）、二糖（例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、又はガラクトース）、又はオリゴ糖（例えば、スタキオース）を含む。具体的な実施形態において、医薬製剤は、スクロースを含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、糖アルコールを含む、例えば、単糖に由来する糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、又はキシリトール）、二糖に由来する糖アルコール（例えば、ラクチトール又はマルチトール）、又はオリゴ糖に由来する糖アルコール。具体的な実施形態において、医薬製剤は、マンニトールを含む。

製剤中に含まれる糖又は糖アルコールの量は、製剤が使用される具体的な状況及び意図される目的に応じて変わり得る。特定の実施形態において、医薬製剤は、０％ｗ／ｖ～約１２％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ～約１１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ～約１０％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ～約９％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ～約１２％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ～約８％ｗ／ｖ、又は約５％ｗ／ｖ～約７％ｗ／ｖの糖又は糖アルコールを含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、０％ｗ／ｖ～約２％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ～約１．５％ｗ／ｖ、約０．６％ｗ／ｖ～約１．４％ｗ／ｖ、約０．７％ｗ／ｖ～約１．３％ｗ／ｖ、約０．８％ｗ／ｖ～約１．２％ｗ／ｖ、又は約０．９％ｗ／ｖ～約１．１％ｗ／ｖの糖又は糖アルコールを含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約３％ｗ／ｖ、約４％ｗ／ｖ、約５％ｗ／ｖ、約６％ｗ／ｖ、約７％ｗ／ｖ、約８％ｗ／ｖ、約９％ｗ／ｖ、又は約１０％ｗ／ｖの糖又は糖アルコールを含む。具体的な実施形態において、医薬製剤は、約６％ｗ／ｖの糖又は糖アルコール（例えば、スクロース）を含む。具体的な実施形態において、医薬製剤は、約１％ｗ／ｖの糖又は糖アルコール（例えば、マンニトール）を含む。具体的な実施形態において、医薬製剤は、約６％ｗ／ｖの糖又は糖アルコール（例えば、スクロース）及び約１％ｗ／ｖの第２の糖又は糖アルコール（例えば、マンニトール）を含む。

本明細書に開示される医薬製剤中の１つ以上の賦形剤は、界面活性剤を更に含む。用語「界面活性剤」は、本明細書で使用されるとき、疎水性部分（例えば、アルキル鎖）及び親水性部分（例えば、カルボキシル及びカルボキシレート基）の両方を持つ界面活性分子を指す。界面活性剤は、医薬製剤中で、治療用タンパク質の凝集を低減するために有用である。医薬製剤中での使用に好適な界面活性剤は、概して非イオン性界面活性剤であり、限定はされないが、ポリソルベート類（例えば、ポリソルベート２０又は８０）；ポロキサマー類（例えば、ポロキサマー１８８）；ソルビタンエステル類及び誘導体；トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）；ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｌａｕｒｅｌｓｕｌｆａｔｅ）；オクチルグルコシドナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｏｃｔｙｌｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；ラウリルスルホベタイン（ｓｕｌｆｏｂｅｔａｄｉｎｅ）、ミリスチルスルホベタイン（ｓｕｌｆｏｂｅｔａｄｉｎｅ）、リノレイルスルホベタイン（ｓｕｌｆｏｂｅｔａｄｉｎｅ）、又はステアリルスルホベタイン（ｓｕｌｆｏｂｅｔａｄｉｎｅ）；ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン又はステアリルサルコシン；リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、又はセチルベタイン；ラウリン酸アミドプロピルベタインコカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピル（ｐａｌｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ベタイン、又はイソステアラミドプロピルベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル（ｌａｕｒｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））；ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピル（ｐａｌｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ジメチルアミン、又はイソステアラミドプロピルジメチルアミン；ココイルメチルタウリン酸ナトリウム、又はメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム；及びＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭシリーズ（ＭｏｎａＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ポリエチレングリコール、ポリプロピルグリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｇｌｙｃｏｌ）、及びエチレン・プロピレングリコール共重合体（例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ＰＦ６８等）が挙げられる。特定の実施形態において、界面活性剤はポリソルベートである。特定の実施形態において、界面活性剤はポリソルベート８０である。

本発明の医薬製剤中に含まれる非イオン性界面活性剤の量は、製剤の所望される具体的な特性、並びに製剤の使用が意図される詳細な状況及び目的に応じて異なり得る。特定の実施形態において、医薬製剤は、０．００５％～約０．５％、約０．００５％～約０．２％、約０．００５％～約０．１％、約０．００５％～約０．０５％、約０．００５％～約０．０２％、約０．００５％～約０．０１％、約０．０１％～約０．５％、約０．０１％～約０．２％、約０．０１％～約０．１％、約０．０１％～約０．０５％、又は約０．０１％～約０．０２％の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．００５％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．２５％、約０．３％、約０．３５％、約０．４％、約０．４５％、又は約０．５％の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含む。

本発明の医薬製剤は、増量剤又は保存剤など、１つ以上の他の物質を更に含み得る。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加える化合物であり、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの作製が容易となる）。具体例となる増量剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール及びソルビトールが挙げられる。本発明の凍結乾燥製剤は、かかる増量剤を含有し得る。保存剤は、細菌作用を低減し、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の作製が容易となり得る。

（ｉｉ）例示的製剤
特定の実施形態において、本発明の医薬製剤は、ｐＨ６．０～７．０で、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、クエン酸塩、糖（例えば、スクロース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）、及びポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。

特定の実施形態において、医薬製剤は、ｐＨ６．５～７．５で、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、１０～３０ｍＭのクエン酸塩、４％ｗ／ｖ～８％ｗ／ｖの糖（例えば、スクロース）、０．５％ｗ／ｖ～１．５％ｗ／ｖの糖アルコール（例えば、マンニトール）、及び０．００５％～０．０５％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、ｐＨ６．０～７．０で、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、２０ｍＭのクエン酸塩、６％ｗ／ｖの糖（例えば、スクロース）、０．５％ｗ／ｖ～１．５％ｗ／ｖの糖アルコール（例えば、マンニトール）、及び０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、ｐＨ６．３～６．７で、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、２０ｍＭのクエン酸塩、６％ｗ／ｖの糖（例えば、スクロース）、１％ｗ／ｖの糖アルコール（例えば、マンニトール）、及び０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、ｐＨ６．４５～６．５５で、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、２０ｍＭのクエン酸塩、６％ｗ／ｖの糖（例えば、スクロース）、１％ｗ／ｖの糖アルコール（例えば、マンニトール）、及び０．０１％のポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）を含む。

（ｉｉｉ）ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び製剤の安定性
本発明の医薬製剤は、高度な安定性を呈する。医薬製剤は、製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が規定の条件下での保存後に許容できる程度の物理的特性、化学構造、及び／又は生物学的機能を保持しているとき、安定している。特定の実施形態において、医薬製剤は澄明な液体であり、目に見える粒子状物質を含まない。特定の実施形態において、熱安定性は、５℃、５０℃で、凍結融解サイクル後に（例えば、５回の凍結融解サイクル後に）試験する。

安定性は、規定の温度で規定の時間長さにわたって保存した後に未変性のコンホメーションを保持している製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の割合を決定することにより測定し得る。未変性のコンホメーションにあるタンパク質の割合は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって決定することができ、ここでは未変性のコンホメーションにあるタンパク質は、凝集していないか（高分子量画分に溶出する）、又は分解している（低分子量画分に溶出する）。特定の実施形態において、２～８℃で２週間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が未変性コンホメーションを有する。特定の実施形態において、凍結融解後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が未変性コンホメーションを有する。特定の実施形態において、５０℃で２週間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約７５％超、約７６％超、約７７％超、約７８％超、約７９％超、約８０％超、約８１％超、約８２％超、約８３％超、約８４％超、又は約８５％超のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が未変性コンホメーションを有する。特定の実施形態において、２～８℃で２週間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、又は約１％未満のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が高分子量複合体を形成する（即ち、未変性タンパク質よりも高い分子量を有する）。特定の実施形態において、５０℃で２週間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が高分子量複合体を形成する（即ち、未変性タンパク質よりも高い分子量を有する）。特定の実施形態において、凍結融解後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、又は約１％未満のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が高分子量複合体を形成する（即ち、未変性タンパク質よりも高い分子量を有する）。特定の実施形態において、２～８℃で２週間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、又は約１％未満のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が分解される（即ち、未変性タンパク質よりも低い分子量を有する）。特定の実施形態において、５０℃で２週間インキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約１％未満、約１．５％未満、約２％未満、約２．５％未満、又は約３％未満のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が分解される（即ち、未変性タンパク質よりも低い分子量を有する）。特定の実施形態において、凍結融解後、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定したとき、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．３％未満、約０．４％未満、約０．５％未満、約０．６％未満、約０．７％未満、約０．８％未満、約０．９％未満、又は約１％未満のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が分解される（即ち、未変性タンパク質よりも低い分子量を有する）。

ＳＥＣ－ＨＰＬＣは、主ピークに占めるタンパク質、例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質のパーセンテージにより、医薬製剤の純度の尺度を提供することができる。純度プロファイルは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって決定される。一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超である。特定の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、約９９．０％である。一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、約７５％超、約８０％超、約８１％超、約８２％超、約８３％超、約８４％超、又は約８５％超である。特定の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、約８５．２％である。一部の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超であるか、又は約９８．５％より高い。特定の実施形態において、医薬製剤の純度プロファイルは、約９８．９％である。

安定性はまた、タンパク質溶液のパラメータを動的光散乱法によって決定することによっても測定し得る。Ｚ平均値及び多分散性指数（ＰＤＩ）値が、溶液中の平均粒径を指示し、これらの測定値は、溶液中に凝集体が存在すると増加する。モノマー％Ｐｄ値は、検出された異なるモノマーの広がりを指示し、ここでは低い値ほど単分散溶液を指示し、これは好ましい。ＤＬＳによって検出されるモノマー径は、主な集団がモノマーであることを確認するにおいて、及び存在し得る任意の高次凝集体を特徴付けるために有用である。特定の実施形態において、２～８℃で２週間インキュベートした後に、医薬製剤のＺ平均値は５％、１０％、又は１５％を超えて増加しない。特定の実施形態において、凍結融解後、医薬製剤のＺ平均値は２倍、３倍、４倍、又は５倍を超えて増加しない。特定の実施形態において、医薬製剤のＺ平均値は、５０℃で２週間インキュベートした後、約１０％を超えて、約２０％を超えて、約３０％を超えて、約４０％を超えて、約５０％を超えて、約６０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、約９０％を超えて、約１００％を超えて、約１５０％を超えて、又は約２００％超を超えて増加しない。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約１５ｎｍ未満、約１４ｎｍ未満、約１３ｎｍ未満、又は約１２ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。具体的な実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約１１．６ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。一部の実施形態において、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、約１６ｎｍ未満、約１５．５未満、約１５ｎｍ未満、又は約１４．５未満のＺ平均流体力学直径を有する。具体的な実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１４．４ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、約１６．５ｎｍ未満、約１６ｎｍ未満、又は約１５．５ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する。特定の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１５．３ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する。

特定の実施形態において、医薬製剤のＰＤＩ値は、２～８℃で２週間インキュベートした後、約２倍、約３倍、約４倍、又は約５倍を超えて増加しない。特定の実施形態において、医薬製剤のＰＤＩ値は、凍結融解後、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、又は約６倍を超えて増加しない。特定の実施形態において、医薬製剤のＰＤＩ値は、５０℃で２週間インキュベートした後、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、又は約６倍を超えて増加しない。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、約０．２７未満、約０．２６未満、又は約０．２５未満である。特定の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．２６である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、約０．２７未満、又は約０．２６未満である。特定の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．２５である。一部の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．４０未満、約０．３５未満、又は約０．３４未満である。特定の実施形態において、医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数は、約０．３３である。

安定性はまた、タンパク質溶液の熱安定性を示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定することによっても測定し得る。ＤＳＦによれば、様々な試験条件下、例えば、緩衝液又はｐＨでのタンパク質の熱変性温度及び安定性の変化を定量化することが可能である。一部の実施形態において、ＤＳＦは、２つの熱アンフォールディング温度（融解温度としても知られる）、Ｔ_ｍ１及びＴ_ｍ２を提供する_。特定の実施形態において、医薬製剤のＴ_ｍ１は、約６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、又は約６６℃より高い。特定の実施形態において、医薬製剤のＴ_ｍ１は、約７０℃より高い、約７１℃より高い、約７２℃より高い、約７３℃より高い、約７４℃より高い、約７５℃より高い、約７６℃より高い、又は約７７℃より高い。具体的な実施形態において、医薬製剤は、約６７．０℃のＴ_ｍ１及び約７７．３℃のＴ_ｍ２によって定義される熱安定性プロファイルを有する。特定の実施形態において、Ｔ_ｍ１及び／又はＴ_ｍ２は、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートされる同じ医薬製剤と比較すると、２℃未満、１．５℃未満、又は１℃未満しか変化しない。具体的な実施形態において、Ｔ_ｍ１は、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートされる同じ医薬製剤と比較すると、１℃未満しか変化しない。具体的な実施形態において、Ｔ_ｍ２は、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートされる同じ医薬製剤と比較すると、１℃未満しか変化しない。

一部の実施形態において、ＤＳＦは、タンパク質凝集が起こり始める温度、Ｔ_ａｇｇ．を提供する。一部の実施形態において、医薬製剤のＴ_ａｇｇ．は、６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、約６６℃より高い、又は約６７℃より高い。特定の実施形態において、Ｔ_ａｇｇは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートされる同じ医薬製剤と比較すると、約２℃未満、１．５℃未満、又は約１℃未満しか変化しない。特定の実施形態において、Ｔ_ａｇｇは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートされる同じ医薬製剤と比較すると、約２℃未満、約１．５℃未満、又は約１℃未満しか変化しない。特定の実施形態において、Ｔ_ａｇｇは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートされる同じ医薬製剤と比較すると、約１℃未満しか変化しない。

一部の実施形態において、医薬製剤の安定性の決定にｐＨが用いられる。一部の実施形態において、医薬製剤のｐＨは、医薬製剤を５℃で１週間インキュベートした後、約０．２５、約０．２、約０．１５、又は約０．１を超えるｐＨ値の変化を示さない。特定の実施形態において、医薬製剤を５℃で１週間インキュベートした後、医薬製剤のｐＨは、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない。一部の実施形態において、医薬製剤のｐＨは、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートした後、約０．２５、約０．２、約０．１５、又は約０．１を超えるｐＨ値の変化を示さない。特定の実施形態において、医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートした後、医薬製剤のｐＨは、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない。

医薬製剤中のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の安定性を決定する例示的方法は、本開示の実施例２４に記載される。

（ｉｖ）投薬形態
医薬製剤は、液体製剤又は凍結乾燥形態として調製及び保存することができる。特定の実施形態において、医薬製剤は澄明な無色の溶液であり、目に見える粒子状物質を含まない。特定の実施形態において、医薬製剤は、２～８℃（例えば、４℃）で保存される液体製剤、－２０℃以下で保存される凍結製剤、又は－６５℃以下で保存される凍結製剤である。製剤中には、凍結乾燥保護剤として糖及び／又は糖アルコールが使用される。

医薬品としての使用前に、医薬製剤は、投与経路に好適な水性担体中に希釈され、又は再構成され得る。他の例示的担体としては、滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液、又はデキストロース溶液が挙げられる。例えば、医薬製剤が投与に向けて調製されるとき、医薬製剤は０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中に希釈され得る。具体的な実施形態において、医薬製剤、医薬製剤は、０．０１％ポリソルベート８０を含む０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中に希釈される。特定の実施形態において、希釈された医薬製剤は等張性であり、皮下注射による投与に好適である。

医薬製剤は、保存に好適な濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．１～約２ｍｇ／ｍＬ、約０．２～約１．８ｍｇ／ｍＬ、約０．３～約１．７ｍｇ／ｍＬ、約０．４～約１．６ｍｇ／ｍＬ、約０．５～約１．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６～約１．４ｍｇ／ｍＬ、約０．７～約１．３ｍｇ／ｍＬ、約０．８～約１．２ｍｇ／ｍＬ、又は約０．９～約１．１ｍｇ／ｍＬの濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約４．５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

特定の実施形態において、医薬製剤は、約１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ～約８ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ～約６ｇ／Ｌ、又は約５ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、又は約１０ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。具体的な実施形態において、医薬製剤は、約５ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．５ｇ／Ｌ～約２ｇ／Ｌ、約０．７５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、又は約０．９ｇ／Ｌ～約１．１ｇ／Ｌの投与濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．１ｇ／Ｌ、約１．２ｇ／Ｌ、約１．３ｇ／Ｌ、約１．４ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、又は約２ｇ／Ｌの投与濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。具体的な実施形態において、医薬製剤は、約１ｇ／Ｌの投与濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

特定の実施形態において、医薬製剤は、容器（例えば、バイアル、バッグ、ペン、又はシリンジ）に包装される。特定の実施形態において、製剤は、凍結乾燥製剤又は液体製剤であってもよい。特定の実施形態において、容器内のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の量は、単回用量としての投与に好適である。特定の実施形態において、容器内のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の量は、複数回用量での投与に好適である。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．１～約１０ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０～約２ｍｇ、約０．２～約１．８ｍｇ、約０．３～約１．７ｍｇ、約０．４～約１．６ｍｇ、約０．５～約１．５ｍｇ、約０．６～約１．４ｍｇ、約０．７～約１．３ｍｇ、約０．８～約１．２ｍｇ、又は約０．９～約１．１ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、医薬製剤は、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、又は約１０ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。具体的な実施形態において、医薬製剤は、約１ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを含む。

（ｌ）投薬量レジメン及び治療的使用
別の態様において、本開示は、癌の治療方法であって、それを必要としている対象に、初期３週間治療サイクルの１日目に本明細書に開示されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ）を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、初期３週間治療サイクルの１日目に限り対象に投与される。

特定の実施形態において、本方法は、それを必要としている対象に、初期３週間治療サイクルの１日目にヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペンブロリズマブと組み合わせて投与することを含む。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体は、初期３週間治療サイクルの１日目に限り対象に投与される。特定の実施形態において、ＰＤ－１抗体の投与は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与よりも前に行われる。

特定の実施形態において、本方法は、対象に、初期治療サイクル後、１つ以上の後続の３週間治療サイクルでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を投与することを更に含み、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、各後続の治療サイクルの１日目に投与される。後続の治療サイクルは、対象がヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与を３週間に１回又は４週間に１回受けるものであり、対象に一定レベルのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を維持するように設計される。特定の実施形態において、対象は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与を３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、又は６週間に１回受ける。特定の実施形態において、対象は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与を６週間に１回、即ち、１治療サイクルおきに１回受ける。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５回の後続の治療サイクルを受ける。特定の実施形態において、対象は、癌が退縮する（即ち、完全奏効）まで後続の治療サイクルを受ける。特定の実施形態において、対象は、進行した（即ち、切除不能な又は転移性の）黒色腫を有する。特定の実施形態において、対象は、進行した（即ち、切除不能な又は転移性の）腎細胞癌を有する。

特定の実施形態において、本方法は、初期治療サイクル後、１回以上の後続の３週間治療サイクルでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペンブロリズマブと組み合わせて対象に投与することを更に含み、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体は、各後続の治療サイクルの１日目に投与される。後続の治療サイクルは、対象がヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体の投与を３週間に１回受けるものであり、対象に一定レベルのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び抗ＰＤ－１抗体を維持するように設計される。特定の実施形態において、対象は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５回の後続の治療サイクルを受ける。特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体の投与は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与よりも前に行われる。特定の実施形態において、対象は、癌が退縮する（即ち、完全奏効）まで後続の治療サイクルを受ける。特定の実施形態において、対象は、進行した（即ち、切除不能な又は転移性の）尿路上皮癌を有する。

特定の実施形態において、初期及び後続の治療サイクル中の１用量以上は、０．０１～約３μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．７５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約１μｇ／ｋｇ、約０．５～約１μｇ／ｋｇ、約０．１～約２μｇ／ｋｇ、約０．５～約２μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．２～約１μｇ／ｋｇ、約０．２～約２μｇ／ｋｇ、約１～約１．２μｇ／ｋｇ、約１～約１．５μｇ／ｋｇ、約１～約２μｇ／ｋｇ、約１～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．５～約２．５μｇ／ｋｇ、約１～約３μｇ／ｋｇ、又は約０．５～約３μｇ／ｋｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、初期及び後続の治療サイクル中の１用量以上は、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０３μｇ／ｋｇ、約０．０４μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１５μｇ／ｋｇ、約０．２μｇ／ｋｇ、約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．３μｇ／ｋｇ、約０．３５μｇ／ｋｇ、約０．４μｇ／ｋｇ、約０．４５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約０．６μｇ／ｋｇ、約０．７μｇ／ｋｇ、約０．８μｇ／ｋｇ、約０．９μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約１．２μｇ／ｋｇ、約１．２５μｇ／ｋｇ、約１．３μｇ／ｋｇ、約１．４μｇ／ｋｇ、約１．５μｇ／ｋｇ、約１．７５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、又は約５μｇ／ｋｇからなる群から選択される量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

特定の実施形態において、初期及び後続の治療サイクル中の用量の各々が、０．０１～約３μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．７５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約１μｇ／ｋｇ、約０．５～約１μｇ／ｋｇ、約０．１～約２μｇ／ｋｇ、約０．５～約２μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．２～約１μｇ／ｋｇ、約０．２～約２μｇ／ｋｇ、約１～約１．２μｇ／ｋｇ、約１～約１．５μｇ／ｋｇ、約１～約２μｇ／ｋｇ、約１～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．５～約２．５μｇ／ｋｇ、約１～約３μｇ／ｋｇ、又は約０．５～約３μｇ／ｋｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、初期及び後続の治療サイクル中の用量の各々が、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０３μｇ／ｋｇ、約０．０４μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１５μｇ／ｋｇ、約０．２μｇ／ｋｇ、約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．３μｇ／ｋｇ、約０．３５μｇ／ｋｇ、約０．４μｇ／ｋｇ、約０．４５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約０．６μｇ／ｋｇ、約０．７μｇ／ｋｇ、約０．８μｇ／ｋｇ、約０．９μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約１．２μｇ／ｋｇ、約１．２５μｇ／ｋｇ、約１．３μｇ／ｋｇ、約１．４μｇ／ｋｇ、約１．５μｇ／ｋｇ、約１．７５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、又は約５μｇ／ｋｇからなる群から選択される同じ量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

特定の実施形態において、初期及び後続の治療サイクル中の用量の各々が、０．０１～約３μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．７５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約１μｇ／ｋｇ、約０．５～約１μｇ／ｋｇ、約０．１～約２μｇ／ｋｇ、約０．５～約２μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．２～約１μｇ／ｋｇ、約０．２～約２μｇ／ｋｇ、約１～約１．２μｇ／ｋｇ、約１～約１．５μｇ／ｋｇ、約１～約２μｇ／ｋｇ、約１～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．５～約２．５μｇ／ｋｇ、約１～約３μｇ／ｋｇ、又は約０．５～約３μｇ／ｋｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、初期及び後続の治療サイクル中の用量の各々は、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０３μｇ／ｋｇ、約０．０４μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１５μｇ／ｋｇ、約０．２μｇ／ｋｇ、約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．３μｇ／ｋｇ、約０．３５μｇ／ｋｇ、約０．４μｇ／ｋｇ、約０．４５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約０．６μｇ／ｋｇ、約０．７μｇ／ｋｇ、約０．８μｇ／ｋｇ、約０．９μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約１．２μｇ／ｋｇ、約１．２５μｇ／ｋｇ、約１．３μｇ／ｋｇ、約１．４μｇ／ｋｇ、約１．５μｇ／ｋｇ、約１．７５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、又は約５μｇ／ｋｇからなる群から選択される同じ量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は皮下投与される。例えば、特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は皮下注射により、例えば、プレフィルドペン又はプレフィルドシリンジで投与される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約０．１ｍＬ、約０．２ｍＬ、約０．３ｍＬ、約０．４ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．６ｍＬ、約０．７ｍＬ、約０．８ｍＬ、約０．９ｍＬ、約１ｍＬ、約１．１ｍＬ、又は約１．２ｍＬの容積で投与される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、約１ｍＬの容積で投与される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、最大２ヵ所の注射部位に（例えば、１ヵ所の注射部位、又は２ヵ所の注射部位に）投与される。具体的な実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、単回注射で投与される。具体的な実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、２回の注射で投与される。具体的な実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は２回の注射で投与され、２回目の注射は、１回目の注射後１０分以内に完了される。

特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペンブロリズマブは、静脈内投与される。特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与よりも前に静脈内投与される。特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与の１時間前以内（例えば、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間前）に静脈内投与される。特定の実施形態において、ＰＤ－１抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与と同時に静脈内投与される。

本明細書に開示されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質又は医薬製剤で治療し得る癌の種類としては、限定はされないが、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はトリプルネガティブ乳癌が挙げられる。特定の実施形態において、癌は固形腫瘍である。特定の実施形態において、癌は局所進行又は転移性固形腫瘍である。特定の実施形態において、癌は黒色腫である。特定の実施形態において、癌は腎細胞癌である。特定の実施形態において、癌は尿路上皮膀胱癌である。特定の実施形態において、対象は、疾患の臨床的又は放射線学的エビデンスを有する。特定の実施形態において、対象は、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）、第１．１版によって決定したとき、測定可能な疾患を有する。特定の実施形態において、本明細書に開示される医薬製剤は、単独療法として投与される。特定の実施形態において、本明細書に開示される医薬製剤は、組み合わせ療法として投与される。特定の実施形態において、完全奏効の確認が得られている対象（ＣＲ）は、打ち切り基準を満たさない限り、確認後少なくとも１２ヵ月間にわたって医薬製剤で治療される。特定の実施形態において、複数回用量療法の総継続期間は、２４ヵ月以下（例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月、２４ヵ月）である。特定の実施形態において、複数回用量療法の総継続期間は２４ヵ月を超える。

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法によって治療される対象は、進行性黒色腫を有する。特定の実施形態において、対象は、抗ＰＤ－１抗体による治療を少なくとも６週間にわたって受けており、病勢進行が確認されている。特定の実施形態において、対象はＢＲＡＦ活性化変異を有し、ＢＲＡＦ阻害薬の投与を受けており、最終ラインの治療後に病勢進行を有する。特定の実施形態において、病勢進行は、放射線学的又は臨床的所見によって確認される。特定の実施形態において、対象はＢＲＡＦ活性化変異を有しない。

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法によって治療される対象は、進行腎明細胞癌（ＲＣＣ）を有する。特定の実施形態において、対象は明細胞成分を有する。特定の実施形態において、対象は、チェックポイント阻害薬、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、又はＶＥＧＦ療法による治療を単独療法として受けたことがある。特定の実施形態において、対象は、チェックポイント阻害薬、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体及びＶＥＧＦ療法による治療を組み合わせで受けたことがある。特定の実施形態において、対象は、チェックポイント阻害薬、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体、及び白金系化学療法による治療を組み合わせで受けたことがある。特定の実施形態において、対象は、チェックポイント阻害薬、例えば抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体による治療を受けたことがない。特定の実施形態において、対象は、過去に３ラインを超える療法を受けたことがある。

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法によって治療される対象は、進行尿路上皮癌を有する。特定の実施形態において、進行尿路上皮癌は、転移性又は切除不能である。特定の実施形態において、対象は、尿路上皮（限定はされないが、腎盂、尿管、尿路上皮、及び尿道を含む）の組織学的又は細胞学的に確認された局所進行又は転移性移行上皮癌を有する。特定の実施形態において、対象は、ただ１つの白金含有レジメン（例えば、白金＋別の薬剤、例えば、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン等）を受けたことがある。一部の実施形態において、対象は、手術不能局所進行性又は転移性尿路上皮癌に対する白金含有レジメンを１つしか受けたことがなく、補助薬としての白金含有レジメンの最終回投与後６ヵ月以内のＸ線所見進行を伴うか、又は再発を伴う。特定の実施形態において、対象は、チェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）（例えば、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１）による治療を単独療法として、又は白金ベースの化学療法との組み合わせで受けたことがない。特定の実施形態において、対象は２ライン以下の選択療法を受けたことがある。特定の実施形態において、尿路上皮癌は、第一選択の白金含有レジメンの失敗と見なされる。

一部の実施形態において、癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１～約３μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．７５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約１μｇ／ｋｇ、約０．５～約１μｇ／ｋｇ、約０．１～約２μｇ／ｋｇ、約０．５～約２μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．２～約１μｇ／ｋｇ、約０．２～約２μｇ／ｋｇ、約１～約１．２μｇ／ｋｇ、約１～約１．５μｇ／ｋｇ、約１～約２μｇ／ｋｇ、約１～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．５～約２．５μｇ／ｋｇ、約１～約３μｇ／ｋｇ、又は約０．５～約３μｇ／ｋｇの用量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与を含む。特定の実施形態において、癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０３μｇ／ｋｇ、約０．０４μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１５μｇ／ｋｇ、約０．２μｇ／ｋｇ、約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．３μｇ／ｋｇ、約０．３５μｇ／ｋｇ、約０．４μｇ／ｋｇ、約０．４５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約０．６μｇ／ｋｇ、約０．７μｇ／ｋｇ、約０．８μｇ／ｋｇ、約０．９μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約１．２μｇ／ｋｇ、約１．２５μｇ／ｋｇ、約１．３μｇ／ｋｇ、約１．４μｇ／ｋｇ、約１．５μｇ／ｋｇ、約１．７５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、又は約５μｇ／ｋｇからなる群から選択される用量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与を含む。特定の実施形態において、投与される用量は、対象の体重を基準とする。特定の実施形態において、癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、抗ＰＤ－１抗体、例えばペンブロリズマブ又はニボルマブを投与することを更に含む。

一部の実施形態において、癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０～約２ｍｇ、約０．２～約１．８ｍｇ、約０．３～約１．７ｍｇ、約０．４～約１．６ｍｇ、約０．５～約１．５ｍｇ、約０．６～約１．４ｍｇ、約０．７～約１．３ｍｇ、約０．８～約１．２ｍｇ、又は約０．９～約１．１ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、又は約１０ｍｇからなる群から選択される量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、抗ＰＤ－１抗体、例えばペンブロリズマブ又はニボルマブを投与することを更に含む。具体的な実施形態において、癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、２００ｍｇの抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブを投与することを更に含む。

一部の実施形態において、進行性黒色腫を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１～約３μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．７５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約１μｇ／ｋｇ、約０．５～約１μｇ／ｋｇ、約０．１～約２μｇ／ｋｇ、約０．５～約２μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．２～約１μｇ／ｋｇ、約０．２～約２μｇ／ｋｇ、約１～約１．２μｇ／ｋｇ、約１～約１．５μｇ／ｋｇ、約１～約２μｇ／ｋｇ、約１～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．５～約２．５μｇ／ｋｇ、約１～約３μｇ／ｋｇ、又は約０．５～約３μｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、進行性黒色腫を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０３μｇ／ｋｇ、約０．０４μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１５μｇ／ｋｇ、約０．２μｇ／ｋｇ、約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．３μｇ／ｋｇ、約０．３５μｇ／ｋｇ、約０．４μｇ／ｋｇ、約０．４５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約０．６μｇ／ｋｇ、約０．７μｇ／ｋｇ、約０．８μｇ／ｋｇ、約０．９μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約１．２μｇ／ｋｇ、約１．２５μｇ／ｋｇ、約１．３μｇ／ｋｇ、約１．４μｇ／ｋｇ、約１．５μｇ／ｋｇ、約１．７５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、又は約５μｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。

一部の実施形態において、進行性黒色腫を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０～約２ｍｇ、約０．２～約１．８ｍｇ、約０．３～約１．７ｍｇ、約０．４～約１．６ｍｇ、約０．５～約１．５ｍｇ、約０．６～約１．４ｍｇ、約０．７～約１．３ｍｇ、約０．８～約１．２ｍｇ、又は約０．９～約１．１ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、進行性黒色腫を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、又は約１０ｍｇからなる群から選択される量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

一部の実施形態において、進行ＲＣＣを有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１～約３μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．７５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約１μｇ／ｋｇ、約０．５～約１μｇ／ｋｇ、約０．１～約２μｇ／ｋｇ、約０．５～約２μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．２～約１μｇ／ｋｇ、約０．２～約２μｇ／ｋｇ、約１～約１．２μｇ／ｋｇ、約１～約１．５μｇ／ｋｇ、約１～約２μｇ／ｋｇ、約１～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．５～約２．５μｇ／ｋｇ、約１～約３μｇ／ｋｇ、又は約０．５～約３μｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、進行ＲＣＣを有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０３μｇ／ｋｇ、約０．０４μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１５μｇ／ｋｇ、約０．２μｇ／ｋｇ、約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．３μｇ／ｋｇ、約０．３５μｇ／ｋｇ、約０．４μｇ／ｋｇ、約０．４５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約０．６μｇ／ｋｇ、約０．７μｇ／ｋｇ、約０．８μｇ／ｋｇ、約０．９μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約１．２μｇ／ｋｇ、約１．２５μｇ／ｋｇ、約１．３μｇ／ｋｇ、約１．４μｇ／ｋｇ、約１．５μｇ／ｋｇ、約１．７５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、又は約５μｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。

一部の実施形態において、進行ＲＣＣを有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０～約２ｍｇ、約０．２～約１．８ｍｇ、約０．３～約１．７ｍｇ、約０．４～約１．６ｍｇ、約０．５～約１．５ｍｇ、約０．６～約１．４ｍｇ、約０．７～約１．３ｍｇ、約０．８～約１．２ｍｇ、又は約０．９～約１．１ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、進行ＲＣＣを有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、又は約１０ｍｇからなる群から選択される量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

一部の実施形態において、進行尿路上皮癌を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１～約３μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０１～約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約０．７５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１μｇ／ｋｇ、約０．０５～約１．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２μｇ／ｋｇ、約０．０５～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．０５～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約３μｇ／ｋｇ、約０．１～約１μｇ／ｋｇ、約０．５～約１μｇ／ｋｇ、約０．１～約２μｇ／ｋｇ、約０．５～約２μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、約０．１～約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．２～約１μｇ／ｋｇ、約０．２～約２μｇ／ｋｇ、約１～約１．２μｇ／ｋｇ、約１～約１．５μｇ／ｋｇ、約１～約２μｇ／ｋｇ、約１～約２．５μｇ／ｋｇ、約０．５～約２．５μｇ／ｋｇ、約１～約３μｇ／ｋｇ、又は約０．５～約３μｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、進行尿路上皮癌を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０２μｇ／ｋｇ、約０．０３μｇ／ｋｇ、約０．０４μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．１５μｇ／ｋｇ、約０．２μｇ／ｋｇ、約０．２５μｇ／ｋｇ、約０．３μｇ／ｋｇ、約０．３５μｇ／ｋｇ、約０．４μｇ／ｋｇ、約０．４５μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約０．６μｇ／ｋｇ、約０．７μｇ／ｋｇ、約０．８μｇ／ｋｇ、約０．９μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約１．２μｇ／ｋｇ、約１．２５μｇ／ｋｇ、約１．３μｇ／ｋｇ、約１．４μｇ／ｋｇ、約１．５μｇ／ｋｇ、約１．７５μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、又は約５μｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。

一部の実施形態において、進行尿路上皮癌を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０～約２ｍｇ、約０．２～約１．８ｍｇ、約０．３～約１．７ｍｇ、約０．４～約１．６ｍｇ、約０．５～約１．５ｍｇ、約０．６～約１．４ｍｇ、約０．７～約１．３ｍｇ、約０．８～約１．２ｍｇ、又は約０．９～約１．１ｍｇの量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、進行尿路上皮癌を有する対象の癌を治療する方法又は腫瘍成長を阻害する方法における使用のための薬物送達製剤は、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、又は約１０ｍｇからなる群から選択される量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む。

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法により治療される対象は、その癌の治療のための療法を過去に受けたことがない。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法により治療される対象は、その癌の治療のための化学療法又は免疫療法を過去に受けたことがない。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法により治療される対象は、過去に療法（例えば、化学療法又は免疫療法）を受けたことがあるが、過去の療法にもかかわらず、引き続き癌の進行が認められる。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法により治療される対象は、過去に療法（例えば、化学療法又は免疫療法）を受けた後に癌の退縮が認められたが、後に癌の再発が認められた。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法により治療される対象は、過去の療法（例えば、化学療法又は免疫療法）に不耐容である。

特定の実施形態において、本明細書に開示される方法により治療される対象は、実施例２６及び２９に記載される臨床試験コホート（例えば、用量漸増コホート、用量拡大コホート、黒色腫コホート、腎細胞癌コホート、尿路上皮癌コホート、又はペンブロリズマブ又はニボルマブとの組み合わせ療法コホート）の組入れ基準を全て満たしている。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法により治療される対象は、実施例２６及び２９に記載される除外基準のいずれにも該当しない。

本明細書に開示されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、単独療法として、又は１つ以上の療法との組み合わせで使用することができる。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示される投薬量レジメンに従い単独療法として使用される。他の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上の療法と組み合わせて使用され、ここでヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、本明細書に開示される投薬量レジメンに従い投与され、１つ以上の療法は、特定の癌を有する特定の対象の治療に好適であることが公知の投薬量レジメンに従い投与される。特定の実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、一次病巣の外科的切除の補助療法として使用される。特定の実施形態において、一次病巣の外科的介入は、対象の癌細胞を溶解させること、腫瘍を除去すること、又は腫瘍を減量することを含む。

ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と組み合わせて使用し得る例示的治療用薬剤としては、例えば、放射線照射、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン－α、インターフェロン－２α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、コロニー刺激因子－１、コロニー刺激因子－２、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン－２、黄体形成ホルモン放出因子及びそのコグネイト受容体への結合に差を呈し得るか、又は血清半減期が増加若しくは減少した前述の薬剤の変種が挙げられる。

癌の治療において組み合わせ療法の一部として使用し得る別の薬剤クラスは、免疫チェックポイント阻害薬である。例示的免疫チェックポイント阻害薬には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７－Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７－Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つ以上を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害薬イピリムマブは、米国食品医薬品局（ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）により黒色腫の治療用に承認されている。

癌の治療において組み合わせ療法の一部として使用し得る更に他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）及び非細胞傷害性薬剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害薬）である。

更に他のカテゴリーの抗癌剤には、例えば：（ｉ）ＡＬＫ阻害薬、ＡＴＲ阻害薬、Ａ２Ａ拮抗薬、塩基除去修復阻害薬、Ｂｃｒ－Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害薬、ブルトンチロシンキナーゼ阻害薬、ＣＤＣ７阻害薬、ＣＨＫ１阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、ＤＮＡ－ＰＫ阻害薬、ＤＮＡ－ＰＫ及びｍＴＯＲの両方の阻害薬、ＤＮＭＴ１阻害薬、ＤＮＭＴ１阻害薬＋２－クロロ－デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害薬、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害薬、ＩＤＯ阻害薬、ＪＡＫ阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬、ＭＥＫ阻害薬、ＭＥＬＫ阻害薬、ＭＴＨ１阻害薬、ＰＡＲＰ阻害薬、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害薬、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨの両方の阻害薬、プロテアソーム阻害薬、トポイソメラーゼ－ＩＩ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬、ＶＥＧＦＲ阻害薬、及びＷＥＥ１阻害薬から選択される阻害薬；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、又はＩＣＯＳのアゴニスト；及び（ｉｉｉ）ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。

特定の実施形態において、単回用量又はそれ以上のヘテロ二量体ＩＬ－１２－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号２９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む）で治療される癌は、転移性癌である。特定の実施形態において、転移性癌は、局所、限局、又は遠隔転移性癌である。特定の実施形態において、単回又は複数回用量のヘテロ二量体ＩＬ－１２－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号２９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む）は、発生源の臓器又は組織の原発性癌でない及び／又は治療レジメンの直接的な標的でない遠隔の癌をアブスコパル効果によって治療する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体ＩＬ－１２－Ｆｃ融合タンパク質のアブスコパル効果は、放射線照射及び／又は化学療法を含む治療計画の間に、及び／又はその後に亢進する。特定の実施形態において、単回又は複数回用量のヘテロ二量体ＩＬ－１２－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、配列番号２９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む）は、例えば、患者の血清及び／又は腫瘍におけるＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、及び／又はＣＸＣＬ１０の発現の増加によって決定される全身性の抗腫瘍応答を誘導することによって患者の癌を治療する。

組み合わせ療法
本発明の別の態様は、組み合わせ療法を提供する。本明細書に記載されるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬製剤は、癌の治療に追加の治療用薬剤と組み合わせて使用することができる。

特定の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２サブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）は、癌と診断された対象を治療するため組み合わせ療法として投与される。特定の実施形態において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、白血病、肺癌、リンパ腫、中皮腫、黒色腫、骨髄腫、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、膵癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、脳癌、肉腫、神経芽細胞腫、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、メルケル細胞癌、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、トリプルネガティブ乳癌、又は頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）である。特定の実施形態において、癌は結腸癌である。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、結腸癌と診断された対象に組み合わせ療法として投与される。特定の実施形態において、癌は黒色腫である。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、黒色腫と診断された対象に組み合わせ療法として投与される。特定の実施形態において、癌は乳癌である。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、乳癌と診断された対象に組み合わせ療法として投与される。

一部の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２サブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）は、進行悪性腫瘍の治療に、細胞傷害性化学療法；放射線療法；ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＴＧＦ－βなど、抗腫瘍免疫応答に関わる分子を標的とする抗体；ＡＤＣＣによって腫瘍関連抗原に作用する抗体；任意選択で、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体と組み合わせて投与される、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、及び腫瘍関連抗原に結合する多重特異性抗体；テーラーメイドの癌ワクチン；腫瘍溶解性癌ワクチン；及びＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体と組み合わせて投与されるテーラーメイドのワクチンから選択される別の治療用薬剤と組み合わせて使用される。

一部の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２サブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）は、悪性腫瘍（例えば、進行悪性腫瘍）の治療に、限定はされないが、ＮＫ標的化療法（例えば、ＣＡＲ－ＮＫ療法）、抗体療法、チェックポイント阻害薬療法、追加のサイトカイン療法、自然免疫系アゴニスト療法、化学療法、標的薬療法、放射線療法、養子ＮＫ療法、幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、アゴニスト抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）改変療法、多特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）、細胞老化を誘導する薬剤、及びワクチン及び／又は腫瘍溶解性ウイルス療法を含めた別の療法と組み合わせて使用される。一部の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、悪性腫瘍（例えば、進行悪性腫瘍）の治療に、ＮＫ標的化療法（例えば、ＣＡＲ－ＮＫ療法）、抗体療法、チェックポイント阻害薬療法、追加のサイトカイン療法、自然免疫系アゴニスト療法、化学療法、標的薬療法、放射線療法、養子ＮＫ療法、幹細胞移植（ＳＣＴ）療法、アゴニスト抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）改変療法、多特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）、細胞老化を誘導する薬剤、及びワクチン及び／又は腫瘍溶解性ウイルス療法から選択される２つ以上の追加の療法と組み合わせて使用される。

一部の実施形態において、本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２を含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）は、完全に切除することのできる局所進行悪性腫瘍の治療に、癌ワクチン又はＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体と組み合わせて使用される。

本発明のタンパク質はまた、一次病巣の外科的切除の補助療法としても使用することができる。

本発明のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２を含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）及び追加の治療用薬剤の量並びに相対的な投与タイミングは、所望の組み合わせ治療効果が実現するように選択されてもよい。例えば、かかる投与を必要としている患者に組み合わせ療法を投与したとき、その組み合わせ中の治療用薬剤、治療用薬剤を含む医薬製剤、又は治療用薬剤を含む医薬組成物は、例えば、逐次的に、並行して、一緒に、同時になど、いずれの順序で投与されてもよい。更に、例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、追加の治療用薬剤がその予防効果又は治療効果を発揮している最中に投与されてもよく、又は逆もまた同様である。

本明細書に開示されるとおり、本発明の方法は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２サブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）と追加の治療用薬剤との組み合わせの共投与を含む。本明細書に開示されるとおり、本発明の方法は、ＩＬ－１２サブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と追加の治療用薬剤との組み合わせの共投与を含む。

「共投与される」は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２サブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）と追加の治療用薬剤とが同時に与えられる方法、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と追加の治療用薬剤とが逐次的に与えられる方法、及びヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と追加の治療用薬剤とのいずれか一方、又はその両方が間欠的に又は継続的に与えられる方法、又は同時、逐次的、間欠的及び／又は継続的の任意の組み合わせを包含する。間欠的にはまた、ある薬剤の第１の投与と、次にそのまさしく同じ薬剤の後の時点での別の投与も含まれるため、当業者は、間欠的投与が必ずしも逐次的と同じでないことを認識するであろう。更に、間欠投与は、ある薬剤の第１の投与に、その第１の薬剤が再び投与される前に異なる薬剤の投与が割り込むことを実に含むため、当業者は、間欠投与にはまた、一部の実施形態において逐次投与も包含されることを理解する。更に、当業者にはまた、継続投与が、静脈内点滴（静脈内注入）又は栄養管等を含めた幾つもの経路によって達成され得ることも公知であろう。

更に、及びより一般的な言い回しでは、用語「共投与される」は、対象へのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の個別の投与と追加の治療用薬剤の個別の投与とが任意の時間フレームの中で重複するありとあらゆる方法を包含する。

対象へのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質又は追加の治療用薬剤の投与頻度は、当該技術分野においてＱｎｄ又はｑｎｄとして公知であり、ここではｎが、当該薬剤の連続する投与についての日数単位の頻度である。例えば、Ｑ３ｄであれば、３日に１回の薬剤の投与であり得る。特定の実施形態において、本方法は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び／又は追加の治療用薬剤のいずれか一方、又はその両方、又はこれらの任意の組み合わせをＱ１ｄ、Ｑ２ｄ、Ｑ３ｄ、Ｑ４ｄ、Ｑ５ｄ、Ｑ６ｄ、Ｑ７ｄ、Ｑ８ｄ、Ｑ９ｄ、Ｑ１０ｄ、Ｑ１４ｄ、Ｑ２１ｄ、Ｑ２８ｄ、Ｑ３０ｄ、Ｑ９０ｄ、Ｑ１２０ｄ、Ｑ２４０ｄ、又はＱ３６５ｄで対象に投与することを含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び／又は追加の治療用薬剤のいずれか一方又はその両方は、間欠的に投与される。特定の実施形態において、本方法は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質又は追加の治療用薬剤のいずれか一方、又はその両方を、投与間に少なくとも１０分間、１５分、２０分、３０分、４０分、６０分、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、又は４週間の遅延を置いて対象に投与することを含む。特定の実施形態において、遅延を置いた投与は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び／又は追加の治療用薬剤の一方、又はその両方、又はこれらの任意の組み合わせが約１０分～約３６５日の所与の期間にわたって継続的に投与され、次に約１０分～約３０日の所与の期間にわたって投与されないようなパターンに従う。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び／又は追加の治療用薬剤のいずれか一方、又はその任意の組み合わせは、他方が継続的に与えられている間に間欠的に投与される。特定の実施形態において、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の組み合わせは、第２の有効量の追加の治療用薬剤と逐次的に投与される。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と追加の治療用薬剤とは、同時に投与される。特定の実施形態において、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の組み合わせは、第２の有効量の追加の治療用薬剤と逐次的に投与される。かかる実施形態において、組み合わせはまた「共投与される」とも言われ、これは、この用語に、対象が両方の成分に組み合わせで曝露されるありとあらゆる方法が含まれるためである。しかしながら、かかる実施形態は、組み合わせがただ１つの製剤又は組成物だけで与えられることに限定されない。一定の間隔で送達するには、一定の濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び追加の治療用薬剤がより有利であるということであってもよく、そのため、第１の有効量及び第２の有効量は、投与下の製剤に応じて変化し得る。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び追加の治療用薬剤は、同時に又は逐次的に投与される。特定の実施形態では、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、第２の有効量の追加の治療用薬剤の後に逐次的に投与される。特定の実施形態では、第２の有効量の追加の治療用薬剤が、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の後に逐次的に投与される。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２サブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質）と追加の治療用薬剤との組み合わせは、１つの製剤で投与される。特定の実施形態において、組み合わせは２つの組成物で投与され、ここでは第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が第２の有効量の追加の治療用薬剤の製剤と別個の製剤で投与される。特定の実施形態において、組み合わせは２つの組成物で投与され、ここではヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の第１の有効量が第２の有効量の追加の治療用薬剤の製剤と別個の製剤で投与される。特定の実施形態において、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第２の有効量の追加の治療用薬剤の後に逐次的に投与される。特定の実施形態において、第２の有効量の追加の治療用薬剤は、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の後に逐次的に投与される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び追加の治療用薬剤が投与され；続いてヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と追加の治療用薬剤との両方が、少なくとも２４時間にわたって間欠的に投与される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び追加の治療用薬剤は、重複のない隔日のスケジュールで投与される。

特定の実施形態において、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第２の有効量の追加の治療用薬剤の４時間以上後に投与される。特定の実施形態において、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、第２の有効量の追加の治療用薬剤の１０分以上、１５分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、６０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、４日以上、６日以上、８日以上、１０日以上、１２日以上、１４日以上、２１日以上、又は３０日以上後に投与される。特定の実施形態において、第２の有効量の追加の治療用薬剤は、第１の有効量のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の１０分以上、１５分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、６０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１０時間以上、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、４日以上、６日以上、８日以上、１０日以上、１２日以上、１４日以上、２１日以上、又は３０日以上後に投与される。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び／又は追加の治療用薬剤のいずれか一方、又はその両方は、静脈内、皮下、皮膚、経口、筋肉内、及び腹腔内からなる群から選択される経路によって投与される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び／又は追加の治療用薬剤のいずれか一方、又はその両方は、静脈内に投与される。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び／又は追加の治療用薬剤のいずれか一方、又はその両方、又はこれらの任意の組み合わせは、経口的に投与される。

当業者によれば、本開示の単位用量形態は、同じ又は異なる物理的形態で、即ち、カプセル又は錠剤で経口的に、及び／又は静脈内注入で液体によるなどして投与されてもよいことが理解される。更に、投与毎の単位用量形態が、詳細な投与経路によって異なってもよい。ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質及び追加の治療用薬剤のいずれか一方、又はその両方、その組み合わせについて、幾つかの様々な投薬形態が存在し得る。医学的状態が異なれば、異なる投与経路が必要となり得るため、本明細書に記載される組み合わせの同じ成分は、組成及び物理的形態の点ではまさしく似たものであってよく、しかしその状態を軽減するためには、異なる方法で、恐らくは異なるタイミングで与えられる必要があり得る。例えば、持続する悪心、特に嘔吐を伴うものなどの状態は、経口投薬形態の使用が困難となり得るため、そのような場合には、代わりに、又は同様に、吸入、頬側、舌下、又は坐薬経路による、恐らくは過去に又は今後使用される他の投薬形態と同一のものでさえある、別の単位用量形態で投与することが必要になり得る。具体的な投薬形態は、化学安定性又は薬物動態のように様々な要因に関する問題があり得るのと同じく、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と追加の治療用薬剤との特定の組み合わせの要件であり得る。

（ｉ）ＮＫ標的化療法
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法はＮＫ標的化療法と組み合わされる。例えば、ある実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、ＮＫｐ４６を標的とする治療用薬剤と共投与される。特定の実施形態において、ＮＫｐ４６を標的とする治療用薬剤はまた、ＣＤ１６、１つ以上の腫瘍関連抗原、又はこれらの組み合わせにも結合する。ＮＫｐ４６を標的とする例示的治療用薬剤については、米国特許出願公開第２０１７０１９８０３８Ａ１号明細書（本明細書においてあらゆる目的から参照により援用される）に更に詳細に記載されている。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、二重及び三重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ）療法、例えばＮＫ細胞を標的とするＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法と組み合わされる。ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥは、目的の各抗体の可変領域の単一の重鎖（ＶＨ鎖）及び軽鎖（ＶＬ鎖）で構築される。ＶＨ及びＶＬドメインは、解離を防ぐため、短い可動性のポリペプチドリンカーによってつなぎ合わされる。ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥについては、米国特許出願公開第２０１８０２８２３８６Ａ１号明細書及び同第２０１８０２５８３９６Ａ１号明細書（本明細書においてあらゆる目的から参照により援用される）に更に詳細に記載されている。ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞に特異的な結合ドメインを持ち得る。

特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、高リスク骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、全身性肥満細胞症、又は肥満細胞性白血病を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、３つの１週間治療ブロックの単回コースとして投与される。特定の実施形態において、治療ブロックは、４連続の２４時間持続注入（約９６時間）と、それに続く７２時間の休息を含む。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、５μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日、２５μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、又は２００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、少なくとも５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも２５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００μｇ／ｋｇ／日、又は少なくとも２００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、少なくとも１μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、少なくとも５μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、少なくとも２００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、少なくとも５００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、少なくとも１０００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、２００μｇ／ｋｇ／日以下の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、５００μｇ／ｋｇ／日以下の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、１０００μｇ／ｋｇ／日以下の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、１～２００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、５～２００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、１～５００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、１－～１０００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、５～５００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、５～１０００μｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、最大耐用量で投与される。特定の実施形態において、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥ療法は、最大耐用量未満で投与される。

（ｉｉ）多特異性結合タンパク質（「ＴｒｉＮＫＥＴ」）療法
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位；（ｂ）腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位；及び（ｃ）ＣＤ１６、又はＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン又はその一部分（「ＴｒｉＮＫＥＴ」）を含む多特異性結合タンパク質（例えば、国際公開第２０１９／１５７３３２号パンフレット（この明細書に記載される多特異性結合タンパク質に関する内容は、参照によって本明細書に援用される）に記載される様々なＮＫＧ２Ｄ結合剤と腫瘍関連抗原結合部位とを含む多特異性結合タンパク質）を含む療法と組み合わせることにより、癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。例示的腫瘍関連抗原としては、限定はされないが、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＬＬ１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、ＨＬＡ－Ｅ、及びＰＤ－Ｌ１が挙げられる。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、体重を基準とする用量の多特異性結合タンパク質を含む療法と組み合わされる。例えば、体重を基準とする多特異性結合タンパク質の用量は、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ～約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ～約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ～約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ～約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ～約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重などである。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、１日、１週間、１ヵ月又は１年に１回以上、又は更には２～２０年に１回与えられる用量の多特異性結合タンパク質を含む療法と組み合わされる。当業者は、体液中又は組織中における標的を設定可能なコンストラクト又は複合体の測定された滞留時間及び濃度に基づいて用量投与反復率を容易に推定することができる。多特異性結合タンパク質の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルを通じた灌流によるか、又は直接的な病巣内注射による可能性がある。これは、毎日１回以上、毎週１回以上、毎月１回以上、及び毎年１回以上投与されてもよい。

（ｉｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法はＣＡＲ療法と組み合わされる。用語「キメラ抗原受容体」又は或いは「ＣＡＲ」は、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能性のシグナル伝達ドメイン（本明細書では「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む組換えポリペプチドコンストラクトを指す。

従って、特定の実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に結合する細胞外抗原結合部位と、膜貫通ドメインと、一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。特定の実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能性のシグナル伝達ドメイン（「共刺激シグナル伝達ドメイン」とも称される）を更に含む。

一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとして重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む腫瘍関連抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖドメイン）と、膜貫通ドメインと、一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとして重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む腫瘍関連抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖドメイン）、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとして重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む腫瘍関連抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖドメイン）と、膜貫通ドメインと、２つの共刺激シグナル伝達ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインとして重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む腫瘍関連抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、少なくとも２つの共刺激シグナル伝達ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。

膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合されている膜貫通ドメインを含むように設計される。一実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に会合しているものである。一部の例では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるため、かかるドメインが同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することが回避されるように選択され、又はアミノ酸置換によって修飾されてもよい。別の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲＴ細胞表面上にある別のＣＡＲとホモ二量体化する能力を有する。別の実施形態において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲＴ細胞中に存在する未変性結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小限に抑えるように修飾又は置換されてもよい。

膜貫通ドメインは、任意の天然に存在する膜結合型又は膜貫通型タンパク質に由来し得る。一実施形態において、膜貫通領域は、ＣＡＲが標的に結合すると常に細胞内ドメインにシグナルを送る能力を有する。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の膜貫通領域を含む。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫＧ２Ｃからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の膜貫通領域を含む。

細胞外腫瘍関連抗原結合ドメイン（例えば、腫瘍関連抗原結合ｓｃＦｖドメイン）は、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに結び付いていてもよい。限定はされないが、ヒトＩｇヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ）、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジ、及びＣＤ８αヒンジを含め、種々のヒンジを利用することができる。

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが置かれている免疫細胞の特殊化した機能（例えば、Ｔ細胞の細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性）のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。従って、本明細書で使用されるとき、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、且つ細胞が特殊化した機能を実施するように導くタンパク質の一部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体を利用し得るが、多くの場合、必ずしも鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた一部分が使用されるという点で、かかるトランケートされた一部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限りは、インタクトな鎖の代わりにそうした一部分が使用されてもよい。このように、用語の細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた一部分を含むことが意図される。

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（即ち、刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン）と、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン（即ち、少なくとも１つの共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン）とを含む。

本明細書で使用されるとき、用語「刺激分子」は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＢ細胞が発現する分子であって、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面について刺激する形で免疫細胞の活性化を調節する１つ以上の細胞質シグナル伝達配列を提供する分子を指す。一実施形態において、このシグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体がペプチドの負荷を有するＭＨＣ分子に結合することにより惹起され、それが、限定はされないが、増殖、活性化、分化などのＴ細胞応答の媒介につながるような一次シグナルである。

刺激する形で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを持つものであり得る。本開示において特に有用な細胞質シグナル伝達配列を持つＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（Ｆｃε Ｒ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３ｄｅｌｔａ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられる。一実施形態において、任意の１つ以上のＣＡＲの一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。

一部の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、４－１ＢＢ、及び／又はＣＤ３－ζの機能性シグナル伝達ドメインである。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（Ｆｃε Ｒ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及び／又はＤＡＰ１２の機能性シグナル伝達ドメインを含む。詳細な実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体複合体と会合しているζ鎖の機能性シグナル伝達ドメインである。

本明細書で使用されるとき、用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合して、それによって、限定はされないが増殖など、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上にあるコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子は、リンパ球が抗原に対して効率的に応答するために必要な、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。かかる共刺激分子の更なる例としては、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。一部の実施形態において、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載される共刺激分子の機能性シグナル伝達ドメイン、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２５８、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に結合するリガンド、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、又はこれらの任意の組み合わせである。

本明細書で使用されるとき、用語「シグナル伝達ドメイン」は、二次メッセンジャーを生成するか、又はかかるメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することにより、定義付けられたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するため細胞内の情報を伝達することによって作用するタンパク質の機能部分を指す。

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内にある細胞質シグナル伝達配列は、ランダムに、又は指定の順番で、互いに連結されてもよい。任意選択で、例えば２～１０アミノ酸長の、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーが、この連結を形成し得る。

（ｉｖ）抗体療法
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を抗体療法と組み合わせることにより、癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＨＥＲ２抗体プラットフォーム（例えば、抗ＨＥＲ２結合ドメインを含む二重特異性若しくは三重特異性抗体、抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲート、又は抗ＨＥＲ２ＣＡＲ）など、抗ＨＥＲ２結合ドメインを含む療法と組み合わされる。抗ＨＥＲ２抗体としては、限定はされないが、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｋａｎｊｉｎｔｉ－Ａｍｇｅｎ）、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＭＧＡＨ２２（米国特許第８，８０２，０９３号明細書（本明細書においてあらゆる目的から参照により援用される）に詳細に記載される）が挙げられる。抗ＨＥＲ２抗体プラットフォームとしては、限定はされないが、エルツマキソマブ（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標）－ＣｒｅａｔｉｖｅＢｉｏｌａｂｓ）及びトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン／Ｔ－ＤＭ１；ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、静脈内注入によって投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、１ｍｇ／ｋｇ／日、２ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、４ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、６ｍｇ／ｋｇ／日、７ｍｇ／ｋｇ／日、８ｍｇ／ｋｇ／日、９ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも４ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも６ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも７ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも８ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも９ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、１ｍｇ／ｋｇ／日未満の用量で投与される。

特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、乳癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象、例えば、転移性ＨＥＲ２過剰発現乳癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、４ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、４ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内注入によって９０分かけて投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、２ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、２ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内注入によって３０分かけて投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、４ｍｇ／ｋｇ／日の初期用量で投与され、次に続いて毎週２ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、４ｍｇ／ｋｇ／日の初期用量で投与され、次に続いて毎週２ｍｇ／ｋｇ／日で５２週間投与される。

特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、胃癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象、例えば、転移性ＨＥＲ２過剰発現胃癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、８ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、８ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内注入によって９０分かけて投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、６ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、６ｍｇ／ｋｇ／日で静脈内注入によって３０～９０分かけて投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、８ｍｇ／ｋｇ／日の初期用量で投与され、次に続いて毎週６ｍｇ／ｋｇ／日で投与される。特定の実施形態において、抗ＨＥＲ２結合ドメイン療法は、８ｍｇ／ｋｇ／日の初期用量で投与され、次に続いて毎週６ｍｇ／ｋｇ／日で５２週間投与される。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、抗ＣＤ２０抗体又は抗ＣＤ２０抗体プラットフォーム（例えば、抗ＣＤ２０結合ドメインを含む二重特異性又は三重特異性抗体、抗ＣＤ２０抗体－薬物コンジュゲート、又は抗ＣＤ２０ＣＡＲ）など、抗ＣＤ２０結合ドメインを含む療法と組み合わされる。抗ＣＤ２０抗体としては、限定はされないが、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、オクレリズマブ（ＯＣＲＥＶＵＳ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標）－Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びベルツズマブが挙げられる。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、静脈内注入によって投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、１００ｍｇ／ｍ^２、２００ｍｇ／ｍ^２、３００ｍｇ／ｍ^２、４００ｍｇ／ｍ^２、５００ｍｇ／ｍ^２、６００ｍｇ／ｍ^２、７００ｍｇ／ｍ^２、８００ｍｇ／ｍ^２、９００ｍｇ／ｍ^２、又は１０００ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、３７５ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、少なくとも１００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも２００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも３００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも４００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも５００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも６００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも７００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも８００ｍｇ／ｍ^２、少なくとも９００ｍｇ／ｍ^２、又は少なくとも１０００ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、４００ｍｇ／ｍ^２未満の用量で投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、３７５ｍｇ／ｍ^２未満の用量で投与される。

特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、３７５ｍｇ／ｍ^２の用量でＩＶ注入によって投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、３７５ｍｇ／ｍ^２未満の用量でＩＶ注入によって投与される。

特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、初回サイクルにおいて３７５ｍｇ／ｍ^２の用量でＩＶ注入によって投与され、追加の２～６サイクルにおいて１サイクル当たり５００ｍｇ／ｍ^２の用量でＩＶ注入によって投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、３７５ｍｇ／ｍ^２未満の用量でＩＶ注入によって投与される。この抗ＣＤ２０結合ドメインとヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法との組み合わせは、フルダラビン及びシクロホスファミド（ＦＣ）と組み合わせて使用することができる。

特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、関節リウマチ（ＲＡ）を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、２回の１０００ｍｇ用量として、用量間を２週間離して、ＩＶ注入によって投与される。特定の実施形態において、抗ＣＤ２０結合ドメイン療法は、２回の１０００ｍｇ用量として、用量間を２週間離して、ＩＶ注入によって最長２４週間まで投与される。特定の実施形態において、この抗ＣＤ２０結合ドメインとヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法との組み合わせは、メトトレキサートと共投与される。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、アゴニスト抗体を含む抗体療法を含む療法と組み合わされる。特定の実施形態において、アゴニスト抗体は、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、又は抗ＣＤ２７抗体である。特定の実施形態において、アゴニスト抗体は二重特異性抗体である。特定の実施形態において、アゴニスト抗体は、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、又は抗ＣＤ２７抗体から選択される２つ以上の抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。具体例となる例は、ウトミルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）など、４－１ＢＢ及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性アゴニスト抗体である。

（ｖ）チェックポイント阻害薬療法
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、チェックポイント阻害薬療法と組み合わせることができる。遮断又は阻害の標的となり得る具体例となる免疫チェックポイント分子としては、限定はされないが、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２分子ファミリーに属し、全てのＮＫ、γδ、及びメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞に発現する）、ＣＤ１６０（別名ＢＹ５５）、及びＣＧＥＮ－１５０４９が挙げられる。免疫チェックポイント阻害薬には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、及びＣＧＥＮ－１５０４９のうちの１つ以上に結合して、その活性を遮断又は阻害する抗体、若しくはその抗原結合断片、又は他の結合タンパク質が含まれる。具体例となる免疫チェックポイント阻害薬としては、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｍｂ）（抗ＰＤ－１；ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）－ＢＭＳ）、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤ－１；ＮＣＩ）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ－１；ＭＫ－３４７５／ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）－Ｍｅｒｃｋ）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１抗体；ＣＴ－０１１－Ｔｅｖａ／ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１；ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）－Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１；ＭＥＤＩ４７３６／ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標）－Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１；ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）－Ｐｆｉｚｅｒ）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤ－Ｌ１－ＢＭＳ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４；ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）－ＢＭＳ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４；Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リリルマブ（抗ＫＩＲ；ＢＭＳ）、モナリズマブ（抗ＮＫＧ２Ａ；ＩｎｎａｔｅＰｈａｒｍａ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＹ５５（抗ＣＤ１６０）、抗ＯＸ４０、抗ＴＩＭ３、及び抗ＬＡＧ３が挙げられる。

特定の実施形態において、本発明の方法は、抗ＰＤ－１抗体を対象に投与することを更に含む。多くの抗ＰＤ－１抗体が治療目的で開発されており、例えば、Ｇｏｎｇｅｔａｌ．，（２０１８）Ｊ．ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒＣａｎｃｅｒ（２０１８）６：８に記載されている。特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体はペンブロリズマブである。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは、様々な経路で、例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内に、又は腹腔内に投与することができる。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは静脈内投与される。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、又は約４００ｍｇの用量で投与することができる。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは、約２００ｍｇの用量で３週間毎に投与される。特定の実施形態において、ペンブロリズマブは、約４００ｍｇの用量で６週間毎に投与される。特定の実施形態において、初期治療サイクルの１日目に約２００ｍｇのペンブロリズマブが投与される。特定の実施形態において、対象が１回以上の後続の治療サイクルを受ける場合、後続の治療サイクルでは、初回の後続治療サイクルの１日目から開始して２００ｍｇのペンブロリズマブが３週間に１回投与される。一部の実施形態において、ペンブロリズマブの投与は、医薬製剤の各投与よりも前に行われてもよく、医薬製剤の各投与と同時であってもよく、又は医薬製剤の各投与の後に行われてもよい。特定の実施形態において、ペンブロリズマブの投与は、医薬製剤の各投与よりも前に行われる。一部の実施形態において、医薬製剤は、ペンブロリズマブの投与の完了後約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、又は約５時間以内に投与することができる。特定の実施形態において、医薬製剤は、ペンブロリズマブの投与完了後１時間以内に投与される。

一部の実施形態において、ペンブロリズマブと組み合わせて投与される医薬製剤は、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される癌の治療用である。

特定の実施形態において、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブである。特定の実施形態において、ニボルマブは、様々な経路で、例えば、静脈内に、皮下に、筋肉内に、又は腹腔内に投与することができる。特定の実施形態において、ニボルマブは静脈内投与される。一部の実施形態において、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｍａｂ）は、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５８０ｍｇ、又は約６００ｍｇの用量で投与することができる。特定の実施形態において、ニボルマブは、約２４０ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ニボルマブは、約２４０ｍｇの用量で約２週間に１回投与される。特定の実施形態において、ニボルマブは、約３６０ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ニボルマブは、約３６０ｍｇの用量で約３週間に１回投与される。特定の実施形態において、ニボルマブは、約４８０ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、ニボルマブは、約４８０ｍｇの用量で約４週間に１回投与される。一部の実施形態において、ニボルマブの投与は、医薬製剤の各投与よりも前に行われてもよく、医薬製剤の各投与と同時であってもよく、又は医薬製剤の各投与の後に行われてもよい。特定の実施形態において、ニボルマブの投与は、医薬製剤の各投与よりも前に行われる。一部の実施形態において、医薬製剤は、ニボルマブの投与の完了後約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約４．５時間、又は約５時間以内に投与することができる。特定の実施形態において、医薬製剤は、ニボルマブの投与完了後１時間以内に投与される。一部の実施形態において、ニボルマブと組み合わせて投与される医薬製剤は、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、及び食道癌からなる群から選択される癌の治療用である。特定の実施形態において、癌は黒色腫である。特定の実施形態において、黒色腫は切除不能又は転移性である。一部の実施形態において、癌は結腸直腸癌である。特定の実施形態において、結腸直腸癌は、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌である。

特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法は、静脈内注入によって投与される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法は、静脈内注入によって３０分かけて投与される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法は、３週間毎に投与される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法は、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、又は約１０００ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法は、２００ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法は、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ、少なくとも６００ｍｇ、少なくとも７００ｍｇ、少なくとも８００ｍｇ、少なくとも９００ｍｇ、又は少なくとも１０００ｍｇの用量で投与される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法は、２００ｍｇ未満の用量で投与される。特定の実施形態において、チェックポイント阻害薬療法をヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と組み合わせて使用することにより、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒｂａｎｃｅｒ）、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及びトリプルネガティブ乳癌を有すると分かっている、又はそれを有する疑いがある対象が治療される。

（ｖｉ）追加のサイトカイン療法
一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、１つ以上の追加のサイトカイン療法、１つ以上のケモカイン療法、又はこれらの組み合わせと組み合わされる。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、１つ以上の追加のサイトカイン療法と組み合わされる。一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、１つ以上のケモカイン療法と組み合わされる。一部の実施形態において、サイトカイン療法は、炎症誘発性サイトカイン、Ｔｈ１サイトカイン、又はＴｈ２サイトカインを含む。一部の実施形態において、サイトカイン療法は、組換えヒトサイトカイン又はケモカインを含む。

一部の実施形態において、サイトカイン療法には、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１及びＩＬ－２２）であるサイトカインが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン療法には、成長因子（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＬＴ、ＥＭＡＰ－ＩＩ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦ）であるサイトカインが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン療法は、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３及びＴＧＦ）を含む。

一部の実施形態において、ケモカイン療法には、炎症誘発性ケモカイン（例えば、ＧＲＯ－α、ＧＲＯ－ｂ、ＬＩＸ、ＧＣＰ－２、ＭＩＧ、ＩＰ１０、Ｉ－ＴＡＣ、及びＭＣＰ－１、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、ＳＤＦ－１、及びＭＩＰ３ａ）が含まれる。一部の実施形態において、ケモカイン療法には、ケモカイン受容体が含まれる。一部の実施形態において、ケモカイン療法には、ＣＸＣケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、及びＣＸＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、及びＣＣＲ１１）、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＸ３Ｃ１１）、又はＸＣケモカイン受容体（例えば、ＸＣＲ１）が含まれる。一部の実施形態において、ケモカイン療法は、Ｇタンパク質連結型膜貫通受容体を含む。

一部の実施形態において、サイトカイン療法は、ＩＬ－１２シグナル伝達と相乗作用するサイトカイン療法を含む。一部の実施形態において、サイトカイン療法は、ＩＬ－２サイトカイン又はその誘導体を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－２療法は、アルデスロイキン（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）－ＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）である。一部の実施形態において、ＩＬ－２療法及び／又はアルデスロイキンは静脈内投与される。一部の実施形態において、サイトカイン療法は、ＩＬ－１５サイトカイン又はその誘導体を含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１５療法は、ＡＬＴ－８０３（ＡｌｔｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又はＮＫＴＲ－２５５（Ｎｅｋｔａｒ）である。一部の実施形態において、ＩＬ－１５療法、ＮＫＴＲ－２５５、及び／又はＡＬＴ－８０３は皮下投与される。一部の実施形態において、ケモカイン療法は、ＣＸＣＬ９ケモカイン、ＣＸＣＬ１０ケモカイン、又はその誘導体を含む。

一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、サイトカイン又はケモカインを対象に投与することが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、組換えサイトカイン又はケモカインを対象に投与することが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、サイトカイン又はケモカインを産生するように細胞を操作することが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、サイトカイン又はケモカインを産生するように細胞をエキソビボ、インビトロ、又はインビボで操作することが含まれる。

一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓｅｔａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、限定はされないが、第２世代、第３世代又はハイブリッド第２／第３世代レンチウイルス及び特異的細胞型又は受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含めたレンチウイルス（例えば、Ｈｕｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＤｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＣａｎｃｅｒａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａｅｔａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅｏｆｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｒｏｎｌｏｓｓｍａｘｉｍｉｚｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎｕｂｉｑｕｉｔｉｎＣｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，Ｓｅｌｆ－ＩｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｆｏｒＳａｆｅａｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅＤｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）、又は米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８１：６４６６６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）に更に詳細に記載されるとおりのアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターなど、ウイルスベクターベースの送達プラットフォームを使用してサイトカイン又はケモカインを産生するように細胞を操作することが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、ＬＮＰ、リポソーム、又はエキソソームを使用してサイトカイン又はケモカインを産生するように細胞を操作することが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、ヌクレアーゼベースのゲノム編集システム（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリー、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）ベースのゲノム編集システム又はその誘導体）を使用するなど、ゲノム編集を使用してサイトカイン又はケモカインを産生するように細胞を操作することが含まれる。一部の実施形態において、サイトカイン又はケモカイン療法には、電気穿孔を使用してサイトカイン又はケモカインを産生するように細胞を操作することが含まれる。

（ｖｉｉ）自然免疫系アゴニスト療法
一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、１つ以上の自然免疫系アゴニストと組み合わされる。

一部の実施形態において、自然免疫系アゴニストは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７／８、又はＴＬＲ９アゴニストを含む。一部の実施形態において、ＴＬＲ２／６アゴニストは、細菌リポタンパク質又はＰａｍ２ＣＳＫ４などの誘導体など、リポタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＴＬＲ１／２アゴニストは、リポタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＴＬＲ３アゴニストは、リンタトリモド（ＡＭＰＬＩＧＥＮ（登録商標）－ＨｅｍｉｓｐｈｅｒｘＢｉｏｐｈａｒｍａ）又はポリＩＣ－ＬＣ（例えば、ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標））など、ｄｓＲＮＡ類似体を含む。一部の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、リポ多糖（ＬＰＳ、別名エンドトキシン）又はリピドＡなどの誘導体を含む。一部の実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストは、ｓｓＲＮＡ又は誘導体又はイミダゾキノリン誘導体、限定はされないが、レシキモド（別名Ｒ８４８）、イミキモド（ＺＹＣＬＡＲＡ（登録商標）、Ａｌｄａｒａ－Ｍｅｄｉｃｉｓ）、及びガーディキモドなどを含む。一部の実施形態において、ＴＬＲ７アゴニストはまた、イミキモド又はＭｅｄｉ－９１９７（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）など、ＴＬＲ８アゴニストでもある。一部の実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）又はＳＤ－１０１（Ｄｙｎａｖａｘ）を含む。

一部の実施形態において、自然免疫系アゴニストは、インターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの刺激薬を含む。一部の実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）を含む。一部の実施形態において、ＣＤＮは、サイクリックジＡＭＰ、サイクリックジＧＭＰ、又はサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）を含む。一部の実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃＧＡＳを刺激する核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＡＤＵ－Ｓ１００（別名ＭＩＷ８１５－Ａｄｕｒｏ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。

（ｖｉｉｉ）化学療法
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、１つ以上の化学療法と組み合わされる。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の化学療法と組み合わせることにより、癌と診断された対象が治療される。化学療法剤の例としては、アルデスロイキン、アルボシジブ、アンチネオプラストンＡＳ２－１、アンチネオプラストンＡ１０、抗胸腺細胞グロブリン、アミホスチン三水和物、アミノカンプトテシン、三酸化ヒ素、βアレチン、Ｂｃｌ－２ファミリータンパク質阻害薬ＡＢＴ－２６３、ＡＢＴ－１９９、ＢＭＳ－３４５５４１、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、ブリオスタチン１、ブスルファン、カルボプラチン、ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ、ＣＣ－５１０３、カルムスチン、酢酸カスポファンギン、クロファラビン、シスプラチン、クラドリビン（ＬＥＵＳＴＡＲＩＮ（登録商標））、クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、クルクミン、シクロスポリン、シクロホスファミド（シロキサン（Ｃｙｌｏｘａｎ）、エンドキサン（Ｅｎｄｏｘａｎ）、エンドキサナ（Ｅｎｄｏｘａｎａ）、シクロスチン（Ｃｙｃｌｏｓｔｉｎ））、シタラビン、デニロイキンジフチトクス、デキサメタゾン、ＤＴＰＡＣＥ、ドセタキセル、ドラスタチン１０、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＡＤＲＩＢＬＡＳＴＩＮＥ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン、エンザスタウリン、エポエチンアルファ、エトポシド、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、フェンレチニド、フィルグラスチム、メルファラン、メスナ、フラボピリドール、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、ゲルダナマイシン（１７－ＡＡＧ）、イホスファミド、塩酸イリノテカン、イクサベピロン、レナリドマイド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）、ＣＣ－５０１３）、リンホカイン活性化キラー細胞、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン塩酸塩、モテクサフィンガドリニウム、ミコフェノール酸モフェチル、ネララビン、オブリメルセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））オバトクラックス（ＧＸ１５－０７０）、オブリメルセン、オクトレオチド酢酸塩、ω－３脂肪酸、オキサリプラチン、パクリタキセル、ＰＤ０３３２９９１、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン塩酸塩、ペグフィルグラスチム、ペントスタチン（Ｐｅｎｔｓｔａｔｉｎ）（ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、ペリホシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、Ｒ－ロスコビチン（ＳＥＬＩＣＩＬＩＢ（登録商標）、ＣＹＣ２０２）、組換えインターフェロンアルファ、組換えインターロイキン－１２、組換えインターロイキン－１１、組換えｆｌｔ３リガンド、組換えヒトトロンボポエチン、リツキシマブ、サルグラモスチム、シルデナフィルクエン酸塩、シンバスタチン、シロリムス、スチリルスルホン類、タクロリムス、タネスピマイシン、テムシロリムス（ＣＣ１－７７９）、サリドマイド、治療用同種異系リンパ球、チオテパ、ティピファニブ、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）（ＢＯＲＴＥＺＯＭＩＢ（登録商標）又はＰＳ－３４１）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、硫酸ビンクリスチン、ビノレルビン二酒石酸塩、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、及びＦＲ（フルダラビン、リツキシマブ）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾン）、ＦＣＭ（フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン）、ＦＣＲ（フルダラビン、シクロホスファミド、リツキシマブ）、ハイパーＣＶＡＤ（多分割シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメタゾン、メトトレキサート、シタラビン）、ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン及びエトポシド）、ＭＣＰ（ミトキサントロン、クロラムブシル、及びプレドニゾロン）、Ｒ－ＣＨＯＰ（リツキシマブ＋ＣＨＯＰ）、Ｒ－ＣＶＰ（リツキシマブ＋ＣＶＰ）、Ｒ－ＦＣＭ（リツキシマブ＋ＦＣＭ）、Ｒ－ＩＣＥ（リツキシマブ－ＩＣＥ）、及びＲ－ＭＣＰ（Ｒ－ＭＣＰ）が挙げられる。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の化学療法と組み合わせることにより、結腸癌、直腸癌、又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、化学療法は、ＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵ、ロイコボリン、及びオキサリプラチン／エロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ））、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、５－ＦＵ、及びイリノテカン／カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ））、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ（ロイコボリン、５－ＦＵ、オキサリプラチン、及びイリノテカン）、ＣａｐｅＯｘ（カペシタビン及びオキサリプラチン）、５－ＦＵとロイコボリンの共投与、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））単独、又はトリフルリジン及びチピラシル（ＬＯＮＳＵＲＦ（登録商標））を含む。特定の実施形態において、化学療法は、ＶＥＧＦ標的薬剤、例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ｚｉｖ－アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標））、ラムシルマブ（ＣＹＲＡＭＺＡ（登録商標））、又はレゴラフェニブ（ＳＴＩＶＡＲＧＡ（登録商標））など、又はＥＧＦＲ標的薬剤、例えば、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）又はパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））などを含む。特定の実施形態において、化学療法は、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ、ＣａｐｅＯｘ、５－ＦＵとロイコボリンの共投与、カペシタビン単独、及びトリフルリジン／チピラシルをＶＥＧＦ標的薬剤又はＥＧＦＲ標的薬剤と併せたものから選択される化学療法を共投与する。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の化学療法と組み合わせることにより、乳癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、化学療法は、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、シスプラチン、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（登録商標））、又はエリブリン（ＨＡＬＡＶＥＮ）を含む。特定の実施形態において、化学療法は、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、シスプラチン、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（登録商標））、及びエリブリン（ＨＡＬＡＶＥＮ（登録商標））から選択される２つ以上の化学療法の組み合わせを含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の化学療法と組み合わせることにより、黒色腫／皮膚癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、化学療法は、ダカルバジン（別名ＤＴＩＣ）、テモゾロミド、ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、又はビンブラスチンを含む。

（ｉｘ）標的薬剤療法
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、１つ以上の標的薬剤と組み合わされる。一般に、標的薬剤は、癌に関連する標的など、特異的分子標的に作用する。標的薬剤は、標準的化学療法とは、標準的化学療法があらゆる急速に分裂する正常細胞及び癌性細胞に作用する点で区別される。標的薬剤としては、限定はされないが、ホルモン療法、シグナル伝達阻害薬、遺伝子発現調節薬、アポトーシス誘導薬、血管新生阻害薬、免疫療法、毒素送達分子（例えば、抗体薬物－コンジュゲート）、及びキナーゼ阻害薬が挙げられる。特定の実施形態において、標的薬剤は、受容体作動薬又はリガンドを含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の標的薬剤と組み合わせることにより、結腸癌、直腸癌、又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、標的薬剤は、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ｚｉｖ－アフリベルセプト（ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標））、レゴラフェニブ（ＳＴＩＶＡＲＧＡ（登録商標））、ラムシルマブ（ＣＹＲＡＭＺＡ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、又はイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））を含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の標的薬剤と組み合わせることにより、乳癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、標的薬剤は、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン（ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））、パルボシクリブ（ＩＢＲＡＮＣＥ（登録商標））、リボシクリブ（ＫＩＳＱＡＬＩ（登録商標））、ネラチニブマレイン酸塩（ＮＥＲＬＹＮＸ（商標））、アベマシクリブ（ＶＥＲＺＥＮＩＯ（商標））、オラパリブ（ＬＹＮＰＡＲＺＡ（商標））、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、又はアルペリシブ（ＰＩＱＲＡＹ（登録商標））を含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の標的薬剤と組み合わせることにより、黒色腫／皮膚癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、標的薬剤は、ビスモデギブ（ＥＲＩＶＥＤＧＥ（登録商標））、ソニデギブ（ＯＤＯＭＺＯ（登録商標））、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、トラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、コビメチニブ（ＣＯＴＥＬＬＩＣ（商標））、アリトレチノイン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、エンコラフェニブ（ＢＲＡＦＴＯＶＩ（商標））、ビニメチニブ（ＭＥＫＴＯＶＩ（登録商標））、又はセミプリマブ－ｒｗｌｃ（ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標））を含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、受容体作動薬又はリガンド療法と組み合わされる。特定の実施形態において、受容体作動薬又はリガンド療法は、アゴニスト抗体を含む。特定の実施形態において、受容体作動薬又はリガンド療法は、４－１ＢＢＬ又はＣＤ４０Ｌなど、受容体リガンドを含む。

（ｘ）放射線療法
一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、放射線療法と組み合わされる。特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、インジウムＩｎ－１１１、イットリウムＹ－９０、又はヨウ素Ｉ－１３１など、放射性同位体粒子と組み合わされる。組み合わせ療法の例としては、限定はされないが、ヨウ素－１３１トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、イットリウム－９０イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、及びＢＥＸＸＡＲ（登録商標）とＣＨＯＰが挙げられる。特定の実施形態において、放射線療法は、外照射放射線療法（ＥＢＲＴ）、内照射放射線療法（小線源照射療法）、腔内照射放射線療法、組織内小線源療法、放射線塞栓療法、少分割放射線療法、術中放射線療法（ＩＯＲＴ）、３次元原体放射線療法、定位手術的照射（ＳＲＳ）、又は体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）を含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の照射療法と組み合わせることにより、結腸癌、直腸癌、又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、放射線療法は、外照射放射線療法（ＥＢＲＴ）、内照射放射線療法（小線源照射療法）、腔内照射放射線療法、組織内小線源療法、又は放射線塞栓療法を含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の照射療法と組み合わせることにより、乳癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、放射線療法は、外照射放射線療法、少分割放射線療法、術中放射線療法（ＩＯＲＴ）、又は３次元原体放射線療法を含む。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を１つ以上の照射療法と組み合わせることにより、黒色腫／皮膚癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、放射線療法は、定位手術的照射（ＳＲＳ；例えば、ガンマナイフ又は線形加速器を使用する）又は体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）を含む。

（ｘｉ）ワクチン及び腫瘍溶解性ウイルス療法
一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、特異的免疫応答、例えば、腫瘍特異的免疫応答を生じさせる能力のある１つ以上の免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物又は腫瘍溶解性ウイルスと組み合わされる。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は、ワクチン組成物と組み合わされる。ワクチン組成物は、典型的には、標的とされる腫瘍に特異的な複数の抗原及び／又はネオ抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンとも称され得る。

一部の実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバント及び／又は担体を更に含む。一部の実施形態において、ワクチン組成物は、Ｔ細胞にペプチドを提示する能力のあるタンパク質などの担体又は樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と会合している。一部の実施形態において、担体は、そこに抗原又はネオ抗原を会合させる能力のある足場構造、例えばポリペプチド又は多糖である。

一般に、アジュバントは、ワクチン組成物に混入させると抗原又はネオ抗原に対する免疫応答が増加し、又は他の点で変化する任意の物質である。任意選択で、アジュバントは共有結合的又は非共有結合的にコンジュゲートされる。アジュバントが抗原に対する免疫応答を増加させる能力は、典型的には、免疫介在性反応の大幅な又は実質的な増加、又は疾患症状の低減に現れる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には、抗原に対して産生される抗体の力価の大幅な増加に現れ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には、細胞増殖、又は細胞傷害性、又はサイトカイン分泌の増加に現れる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性応答又はＴｈ応答を主に細胞性の応答、又はＴｈ応答に変化させることにより、免疫応答も改変し得る。好適なアジュバントとしては、限定はされないが、１０１８ＩＳＳ、ミョウバン、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔＩＭＰ３２１、ＩＳＰａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＭＳ１３１２、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０６、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ５０Ｖ、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクター系、ＰＬＧマイクロパーティクル、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、βグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロン（ＡｑｕｉｌａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ米国）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、及び他の所有権のあるアジュバント、例えば、ＲｉｂｉのＤｅｔｏｘ、Ｑｕｉｌ又はＳｕｐｅｒｆｏｓなどが挙げられる。不完全フロイント又はＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが有用である。樹状細胞に特異的な幾つかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びその調製については、過去に記載されている（ＤｕｐｕｉｓＭ，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７；ＡｌｌｉｓｏｎＡＣ；ＤｅｖＢｉｏｌＳｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）。サイトカインもまた使用することができる。幾つかサイトカインが、リンパ系組織への樹状細胞遊走に影響を与えること（例えば、ＴＮＦ－α）、Ｔリンパ球に効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速させること（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１及びＩＬ－４）（米国特許第５，８４９，５８９号明細書（全体として参照により本明細書に具体的に援用される））及び免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ－１２）（ＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈＤＩ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＥｍｐｈａｓｉｓＴｕｍｏｒＩｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）と直接関連付けられている。一部の実施形態において、アジュバントは、ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、アジュバントは、ＴＬＲアゴニストを含む。

有用なアジュバントの他の例としては、限定はされないが、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡ又はＲＮＡ並びに免疫活性小分子及び抗体、例えば、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレコキシブ、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｉｎｉｂ）、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５が挙げられ、これらは治療的に、及び／又はアジュバントとして作用し得る。アジュバント及び添加剤の量及び濃度は、当業者が過度の実験を行うことなく容易に決定することができる。更なるアジュバントとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）など、コロニー刺激因子が挙げられる。

一部の実施形態において、ワクチン組成物は、２つ以上の異なるアジュバントを含む。一部の実施形態において、ワクチン組成物は、上記のいずれか又はそれらの組み合わせを含む任意のアジュバント物質を含む。また、ワクチン及びアジュバントは、一緒に又は別個に任意の適切な順序で投与し得ることも企図される。

一部の実施形態において、担体（又は賦形剤）が、アジュバントと独立に存在する。一部の実施形態において、担体の機能は、分子量を増加させること、活性又は免疫原性を増加させること、安定性を付与すること、生物学的活性を増加させること、又は血清半減期を増加させることである。一部の実施形態において、担体は、Ｔ細胞へのペプチドの提示を助ける。一部の実施形態において、担体は、当業者に公知の任意の好適な担体、例えばタンパク質又は抗原提示細胞を含む。キャリアータンパク質の例としては、限定はされないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、チログロブリン又はオボアルブミンなど、免疫グロブリン、又はホルモン、例えばインスリンなど又はパルミチン酸が挙げられる。ヒトの免疫化には、担体は、概して、ヒトにとって許容できる安全な、生理学的に許容可能な担体である。しかしながら、破傷風トキソイド及び／又はジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素は好適な担体である。或いは、担体は、デキストラン、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅであってもよい。

一部の実施形態において、ワクチンは、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓｅｔａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照のこと）、又は限定はされないが、第２世代、第３世代又はハイブリッド第２／第３世代レンチウイルス及び特異的細胞型又は受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含めたレンチウイルス（例えば、Ｈｕｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＤｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＣａｎｃｅｒａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，ＩｍｍｕｎｏｌＲｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａｅｔａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒｅｔａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅｏｆｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｒｏｎｌｏｓｓｍａｘｉｍｉｚｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎｕｂｉｑｕｉｔｉｎＣｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，Ｓｅｌｆ－ＩｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｆｏｒＳａｆｅａｎｄＥｆｆｉｃｉｅｎｔＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅＤｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照のこと）など、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームを含む。一般に、宿主への導入時、感染細胞は抗原又はネオ抗原を発現し、それによってペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を引き出す。

上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング容量に応じて、一部の実施形態では、ワクチン組成物は１つ以上のウイルスベクターを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、非突然変異型配列が隣接している配列、リンカーによって隔てられている配列、又は細胞内コンパートメントを標的とする１つ以上の配列が前にある配列を含む（例えば、Ｇｒｏｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆｍｅｌａｎｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓ，ＮａｔＭｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎｅｔａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｃａｎｃｅｒｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓｗｉｔｈｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕｅｔａｌ．，ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｔａｔｅｄｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＴｃｅｌｌｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄｕｒａｂｌｅｔｕｍｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２０１４）２０（１３）：３４０１－１０を参照のこと）。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法については、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号明細書に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターについては、Ｓｔｏｖｅｒｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。当業者には、本明細書の記載から、ネオ抗原の治療的投与又は免疫化に有用な多種多様な他のワクチンベクター、例えば、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）ベクターなどが明らかであろう。

一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は腫瘍溶解性ウイルス療法と組み合わされる。一般に、腫瘍溶解性ウイルスは、主に癌細胞に感染してそれを死滅させるように操作されたウイルスである。一部の実施形態において、癌細胞を死滅させる腫瘍溶解性ウイルスに加えて、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に対する免疫応答を誘導する。

特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法を腫瘍溶解性ウイルス療法と組み合わせることにより、黒色腫／皮膚癌と診断された対象が治療される。特定の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（登録商標））、別名Ｔ－ＶＥＣを含む。一部の実施形態において、ＩＬ－１２のサブユニットを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質は、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（登録商標））又はＴ－ＶＥＣ）と組み合わせて癌（例えば、進行悪性腫瘍）の治療に使用される。

（ｘｉｉ）外科的介入
一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は外科的介入と組み合わされ、ここでは異常組織（例えば、腫瘍）が外科的に除去される。一部の実施形態において、腫瘍は対象の身体からメス又は他の鋭利な用具を用いて切り出され、腫瘍及び／又は周囲組織が切り取られることになる。一部の実施形態では、レーザーを用いて異常組織（例えば、腫瘍）が切り取られる。一部の実施形態において、外科的介入には、異常組織（例えば、腫瘍）を曝露することにより異常組織の細胞を死滅させるか、又は放射線照射及びある種の化学療法薬に対する細胞の感受性を高めるハイパーサーミア治療の使用が含まれ得る。一部の実施形態において、外科的介入には、ある種の薬物を光によって活性化させることにより癌細胞を死滅させる光線力学療法の使用が含まれ得る。外科的介入には、観血的手術又は最小侵襲手術が関わり得る。一部の実施形態において、外科的介入を用いると、腫瘍全体を除去し、腫瘍を減量し、又は癌症状を緩和することができる。

一部の実施形態において、外科的介入は、対象においてヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法の投与前に実施することができる。他の実施形態において、外科的介入は、対象においてヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と並行して実施することができる。他の実施形態において、外科的介入は、対象においてヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法後に実施することができる。

（ｘｉｉｉ）凍結療法
一部の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法は凍結療法（別名凍結アブレーション又は凍結手術）と組み合わされる。一部の実施形態において、凍結療法は、異常組織（例えば、腫瘍）を破壊する液体窒素又はアルゴンガスを適用することによって患者に投与される。一部の実施形態において、対象の体内にある腫瘍向けに、クライオプローブを使用して凍結療法を投与することができ、及び超音波又はＭＲＩなどのイメージング手技を用いると、クライオプローブをガイドし、及び／又は標的組織の凍結をモニタすることができる。

一部の実施形態において、凍結療法は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法前に患者に投与することができる。他の実施形態において、凍結療法は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法と並行して患者に投与することができる。他の実施形態において、凍結療法は、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質療法後に対象に投与することができる。

特定の実施形態において、本明細書に開示される治療方法は、疾患応答又は対象若しくは患者の生存の向上をもたらす。例えば、特定の実施形態において、疾患応答は、完全奏効、部分奏効、又は病勢安定である。特定の実施形態において、生存の向上は、無増悪生存（ＰＦＳ）又は全生存の向上である。向上（例えば、ＰＦＳの向上）は、本開示の治療の開始前の期間と比べて決定することができる。ＢＴＣ（例えば、進行ＢＴＣ、転移性ＢＴＣ）、即ち胆道腫瘍療法に対する疾患応答（例えば、完全奏効、部分奏効、又は病勢安定）及び患者生存（例えば、ＰＦＳ、全生存）を決定する方法は、当該技術分野の常法であり、本明細書で企図される。一部の実施形態において、疾患応答は、治療されている患者を患部（例えば、胸郭入口の上方部から恥骨結合までの範囲を入れた胸部／腹部及び骨盤）の造影コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に供した後に、ＲＥＣＩＳＴ１．１に基づき判定される。

一部の実施形態において、生物学的活性を評価するため、免疫活性化のバイオマーカーが測定される。特定の実施形態において、細胞パラメータ、例えば、免疫表現型タイピング（ＩＰＴ）について末梢血単核球（ＰＢＭＣ）がフローサイトメトリーにより評価される。特定の実施形態において、可溶性因子、例えば、血清試料中のサイトカイン及びケモカインが評価される。特定の実施形態において、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血清レベルが評価され、毒性が決定される。特定の実施形態において、対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、対象は、薬物有害反応を発症するリスクがあると同定される。特定の実施形態において、対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値Ｃ反応性タンパク質濃度とほぼ同じであるか、又はそれより低い場合、対象は、薬物有害反応を発症するリスクはないと同定される。具体的な実施形態において、対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、医薬製剤の投与が中断される；ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が用量を下げて投与されるか；又は対象における製剤の毒性効果を低減し若しくは緩和するための治療上の措置が講じられる。

特定の実施形態において、エキソビボＩＬ１２応答アッセイを用いて活性が評価され、ここではＰＢＭＣが収集されてエキソビボ刺激を受け、続いてＩＦＮγ産生が分析される。特定の実施形態において、循環腫瘍（ｃｔ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が評価されてもよい。特定の実施形態において、治療前及び治療後生検の組織由来バイオマーカーが判定され、例えば、臨床的有効性と分析したマーカーとの間の可能性のある相関が調査される。特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１発現レベルが、例えば、市販のキット（例えば、ＤａｋｏＰＤ－Ｌ１ＩＨＣ２２Ｃ３ｐｈａｒｍＤｘ）を使用して決定される。特定の実施形態において、Ｔ細胞浸潤アッセイ時にＣＤ３が陽性かどうかが免疫組織化学（ＩＨＣ）により決定される。特定の実施形態において、腫瘍浸潤白血球（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、Ｔ_ｒｅｇ、ＮＫ細胞、マクロファージ［Ｍ１／２プロファイル］）の頻度及び／又は局在性がＩＨＣ又は免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ）により決定される。一部の実施形態において、遺伝子発現プロファイルが実施される。一部の実施形態において、ファーマコゲノミクスが実施される。

（ｍ）キット
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの製剤は、凍結乾燥製剤又は液体製剤として調製される。凍結乾燥製剤の調製には、フリーズドライしたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉが滅菌され、使い捨てのガラスバイアルに保存される。次に数本のかかるガラスバイアルが、癌又は腫瘍と診断された対象へとある用量を送達するためのキットに包装される。

一態様において、本開示は、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、又は約１０ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の製剤が入った１つ以上の容器をまとめて含むキットを提供する。特定の実施形態において、本開示は、約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の製剤が入った１つ以上の容器をまとめて含むキットを提供する。特定の実施形態において、本開示は、配列番号２９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の製剤が入った１つ以上の容器をまとめて含むキットを提供する

特定の実施形態において、製剤は、液体製剤として調製及び包装され、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル（例えば、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル）として保存される。特定の実施形態において、製剤は液体製剤であり、約１ｍｇ／バイアルとして保存される。

特定の実施形態において、製剤は凍結乾燥製剤として調製及び包装され、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル（例えば、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．５ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．６ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．７ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．８ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．５ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．４ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．３ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．２ｍｇ／バイアル、約０．９ｍｇ／バイアル～約１．１ｍｇ／バイアル）として保存される。特定の実施形態において、製剤は凍結乾燥製剤であり、約１ｍｇ／バイアルとして保存される。

特定の実施形態において、容器にはまとめて、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１２ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２７ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約３６ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、又は約１００ｍｇの本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ）が入っていてもよい。特定の実施形態において、容器には、約１ｍｇの本開示のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ）が入っている。特定の実施形態において、容器には、配列番号２９０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が入っている。

特定の実施形態において、容器内の製剤は凍結乾燥製剤であってもよい。特定の実施形態において、容器内の製剤は液体製剤であってもよい。

特定の実施形態において、製剤は、好適な数のバイアルを含むキットに詰められてもよい。薬物投与に関する情報が含まれてもよく、それは承認済みの提出書類に従うものである。キットは、温度制御装置でモニタされる輸送用低温容器（２℃～８℃）で出荷されてもよい。

製剤は、使用時まで２℃～８℃で保存されてもよい。製剤のバイアルは無菌で非パイロジェニックであってもよく、静菌保存剤は含有しなくてもよい。

上記の説明は、本発明の複数の態様及び実施形態を説明している。本特許出願は、それらの態様及び実施形態のあらゆる組み合わせ及び並べ替えを具体的に企図する。

以上で本発明が概して説明されたが、単に本発明の特定の態様及び実施形態の説明のために含まれるに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない以下の例を参照すると、本発明は一層容易に理解されるであろう。

実施例１－調製方法
本発明のタンパク質は、典型的には、組換えＤＮＡ技術を用いて作られる。一例示的実施形態において、第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合した多サブユニットタンパク質の第１のサブユニット（ヒトＩＬ－１２のｐ４０サブユニット）を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸配列を、第１の発現ベクター（ｐＥＴ－ｐＳＵＲＥ－Ｐｕｒｏ）にクローニングした；第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドに融合した多サブユニットタンパク質の第２の異なるサブユニット（ヒトＩＬ－１２のｐ３５サブユニット）を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸配列を、第２の発現ベクター（ｐＥＴ－ｐＳＵＲＥ－Ｐｕｒｏ）にクローニングした；及び第１及び第２の発現ベクターを一緒に宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）に安定にトランスフェクトすることにより、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を作製した。

第１の発現ベクターによってコードされる例示的アミノ酸配列を配列番号２９２に示す。第１の発現ベクターは、Ｙ３４９Ｃ突然変異を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列に融合したヒトＩＬ－１２のｐ４０サブユニットを含む第１のポリペプチドをコードした。第１のポリペプチドはまた、ヘテロ二量体化を促進するＫ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ突然変異、並びにエフェクター機能を低減するＬＡＬＡＰＡ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ）突然変異も含んだ。配列番号２９２では、リーダー配列を斜体で示し、ヒトＩＬ－１２のｐ４０サブユニット配列に下線を付し、及び突然変異を太字で示す。

第２の発現ベクターからコードされる例示的アミノ酸配列を配列番号２９３に示す。第２の発現ベクターは、Ｓ３５４Ｃ突然変異を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列に融合したヒトＩＬ－１２のｐ３５サブユニットを含む第２のポリペプチドをコードした。第２のポリペプチドはまた、ヘテロ二量体化を促進するＱ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ突然変異、並びにエフェクター機能を低減するＬＡＬＡＰＡ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ）突然変異も含んだ。配列番号２９３では、リーダー配列を斜体で示し、ヒトＩＬ－１２のｐ３５サブユニット配列に下線を付し、及び突然変異を太字で示す。

タンパク質の最も高い収率を実現するため、異なる比率の第１及び第２の発現ベクターを調べて、宿主細胞へのトランスフェクションに最適な比率を決定する。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、又はＣｌｏｎｅｐｉｘなど、当該技術分野で公知の方法を用いて、細胞バンク作成用に単一クローンを単離することができる。

クローンは、バイオリアクタースケールアップ及びタンパク質の発現の維持に好適な条件下で培養する。タンパク質は、遠心、深層ろ過、細胞溶解、均質化、凍結融解、アフィニティー精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含めた、当該技術分野で公知の方法を用いて単離し、及び精製する。

実施例２－ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるサイレントなＦｃドメインポリペプチドと融合したＩＬ－１２による腫瘍抑制
本例は、組換えマウスＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２）の２つのＩＬ－１２－Ｆｃ融合コンストラクトがマウス結腸癌モデルにおいて腫瘍進行を制御する相対的な能力について記載する。本例で使用した２つのＩＬ－１２－Ｆｃ融合変異体は、野生型マウスＩｇＧ２ａＦｃドメインポリペプチドのＮ末端に融合した野生型マウスＩＬ－１２ｐ４０及びｐ３５サブユニットを含むｍＩＬ－１２－Ｆｃ野生型（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ）、及び突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇを有するマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインポリペプチドのＮ末端に融合した野生型マウスＩＬ－１２ｐ４０及びｐ３５サブユニットを含むｍＩＬ－１２－Ｆｃサイレント（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ）であった。タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す：
ｍＩＬ－１２－ｐ４０－ｍＩｇＧ２Ａ－ＥＷ（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔの第１の鎖）

ｍＩＬ－１２－ｐ３５－ｍＩｇＧ２Ａ－ＲＶＴ（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔの第２の鎖）

ｍＩＬ－１２－ｐ４０－ｍＩｇＧ２Ａ－ＥＷ－ＬＡＬＡＰＧ（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの第１の鎖）

ｍＩＬ－１２－ｐ３５－ｍＩｇＧ２Ａ－ＲＶＴ－ＬＡＬＡＰＧ（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの第２の鎖）

簡潔に言えば、１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後１４日目、腫瘍容積が２７０ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（各群ｎ＝１０）に無作為化し、１μｇのｒｍＩＬ－１２、１μｇｒｍＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、１μｇｒｍＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回腹腔内治療した。腫瘍成長は６０日間評価した。

図２Ａ～図２Ｃに示されるとおり、ＩＬ－１２（図２Ａ）及びＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ（図２Ｂ）は一部のマウスで腫瘍進行を効率的に制御したが、ロバストな腫瘍退縮を誘導し、１００％の完全腫瘍退縮が生じたのは、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのみであった（図２Ｃ）。更に、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ療法の治療によって全生存が大幅に延びた－治療したマウスの１００％が６０日目になおも生存していた一方、アイソタイプ対照、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、及びＩＬ－１２で治療したマウスの生存期間中央値は、それぞれ、２７日、３３日、及び４６日であった（図３）。

次に、腫瘍進行の制御における異なる用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ及びＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを比較した。簡潔に言えば、１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後１４日目、腫瘍容積が３００ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（各群ｎ＝１０）に無作為化し、１μｇ又は０．１μｇｒｍＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、又は１μｇ又は０．１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで週１回腹腔内治療した。腫瘍成長は５５日間評価した。

図４Ａ～図４Ｄに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔによる治療は一部のマウスで腫瘍進行の低減につながり、１μｇｒｍＩＬ－１２モル当量の用量の２例のマウスでは完全退縮につながったが（図４Ａ）、０．１μｇＩＬ－１２モル当量の用量では腫瘍抑制は認められなかった（図４Ｃ）。対照的に、１μｇＩＬ－１２モル当量の用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療では１００％の完全腫瘍退縮が生じ（図４Ｂ）、０．１μｇＩＬ－１２モル当量の低い用量でも腫瘍成長のロバストな遅延が誘導された（図４Ｄ）。１μｇＩＬ－１２モル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔで治療したマウスの生存期間中央値は３２日で、０．１μｇＩＬ－１２モル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したマウスの生存期間中央値である３４日と同様であったことから、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、その野生型変異体の１０倍高い効力があることが示唆される（図５）。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔは、０．１μｇＩＬ－１２モル当量の用量では効率的でなく、アイソタイプ治療群と同じ２４日の生存期間中央値を示した。

次に、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの異なる投与経路についてのインビボ有効性を比較した。簡潔に言えば、１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後１４日目、腫瘍容積が２７０ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（各群ｎ＝１０）に無作為化し、１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はモル当量のｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照によって腹腔内又は皮下のいずれかで週１回治療した。腫瘍成長は６０日間にわたって評価した。

図１９Ａ～図１９Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの腹腔内投与（図１９Ａ）及び皮下投与（図１９Ｂ）は両方とも、ロバストな腫瘍退縮を誘導し、１００％の完全腫瘍退縮が生じた。このように、様々な投与経路を用いたＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療が、有効性を実証した。

実施例３－Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおけるサイレントなＦｃドメインポリペプチドと融合したＩＬ－１２による腫瘍抑制
本例は、マウス黒色腫モデルにおけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ及びＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの相対的な腫瘍進行制御能力について記載する。簡潔に言えば、１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍接種後８日目、腫瘍容積が２５０ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（ｎ＝１０）に無作為化し、０．５μｇのＩＬ－１２、０．５μｇＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、０．５μｇＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、又は０．５μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した。腫瘍成長は３２日間評価した。

図６Ａ～図６Ｃに示されるとおり、試験したＩＬ－１２－Ｆｃコンストラクトの各々が腫瘍進行を遅延させたが、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉが最も効率的に腫瘍成長を制御した。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したマウスの生存期間中央値は２９日であり、これは、それぞれ１６日、２６日、及び２２日であったアイソタイプ対照、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、及びＩＬ－１２で治療したマウスの生存期間中央値よりも長かった（図７）。

次に、腫瘍進行の制御における異なる用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ及びＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを比較した。簡潔に言えば、１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後８日目、マウスを異なる治療群（各群ｎ＝１０）に無作為化し、０．５μｇ又は０．１μｇＩＬ－１２モル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ、又は０．５μｇ又は０．１μｇＩＬ－１２モル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで週１回腹腔内治療した。腫瘍成長は３０日間評価した。

図８Ａ～図８Ｄに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、いずれの用量においても、腫瘍成長の抑制の点でＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔよりも優れていた。更に、各用量で、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｗｔで治療したマウスの生存期間中央値は２０日であった。対照的に、０．１μｇＩＬ－１２モル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したマウスの生存期間中央値は２１日であり、０．５μｇＩＬ－１２モル当量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したマウスの生存期間中央値は２８日であった（図９）。これらの結果から、高用量（０．５μｇＩＬ－１２モル当量）のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉでは、その野生型対応物又はアイソタイプ対照と比較してマウスの生存が大幅に増加したことが実証された。

次に、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療の単回用量投与を先述の毎週の治療と比較した。簡潔に言えば、１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍接種後８日目、腫瘍容積が２００ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（ｎ＝１０）に無作為化し、０．５μｇＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はモル当量のｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で週１回治療した。腫瘍成長は３９日間評価した。

図２０に示されるとおり、単回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによって１００％のマウスに腫瘍増殖の低減が生じ、但し毎週の投与と比較すると、腫瘍増殖はより早く起こった（図６Ｃ）。加えて、マウスは一過性の体重減少を実証したが、これは初回用量後に限られた（データは示さず）。従って、単回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、治療が難しい腫瘍モデルで初期有効性を実証したが、このモデルでは、続く毎週の投与が、腫瘍増殖の遅延に一層良好である。

次に、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの異なる投与経路についてのインビボ有効性を比較した。簡潔に言えば、１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。腫瘍接種後７日目、腫瘍容積が２６０ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（ｎ＝１０）に無作為化し、１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はモル当量のｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照によって腹腔内又は皮下のいずれかで週１回治療した。腫瘍成長は４０日間評価した。

図２１Ａ～図２１Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの腹腔内投与（図２１Ａ）及び皮下投与（図２１Ｂ）は両方とも、１００％のマウスに腫瘍退縮を誘導した。このように、様々な投与経路を用いたＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療が、有効性を実証した。

実施例４－ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｗｔ及びｒｈＩＬ－１２のインビトロ効力
ｒｈＩＬ－１２と比較したＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの効力について、インビトロバイオアッセイを用いて評価した。

ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－１２レポーターアッセイを用いてＩＬ－１２効力を評価した。ＩＬ－１２Ｒ＋ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を培養液から回収し、培養培地中１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（ＤＦＩＬ－１２－Ｆｃ）及び組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を培地に希釈した。１００μＬのＰＢＭＣ懸濁液を１００μＬの希釈した被験物質と混合し、４８時間インキュベートした。上清を回収し、製造者の指示に従い、細胞からの分泌型胚性アルカリホスファターゼの測定により、レポーター細胞が安定に発現したＩＬ－１２受容体及びシグナル伝達成分の会合を検出した。簡潔に言えば、２５μＬの試料上清を２００μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ試薬と混合し、暗所下室温で１０分間インキュベートした。次にＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３ｘプレートリーダーによって６２０ｎＭでプレートを読み取り、光学濃度を相対的なＩＬ－１２活性を表すように報告した。

図１０Ａに示されるとおり、ＩＬ－１２Ｒ＋ＨＥＫレポーター細胞によるＳＥＡＰの産生は、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｒｈＩＬ－１２の濃度の増加に伴い増加した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーターアッセイにおける測定されたＩＬ－１２応答は、調べた濃度ではＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉとｒｈＩＬ－１２との間で同等であった。

次に、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮγ産生を定量化することにより、ＩＬ－１２効力を評価した。ヒト末梢血バフィーコートから密度勾配遠心法を用いてＰＢＭＣを単離し、培養培地中１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及び組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）を培地に希釈した。１００μＬのＰＢＭＣ懸濁液を１００μＬの希釈した被験物質と混合し、４８時間インキュベートした。上清を回収し、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡＭＡＸキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してＩＦＮγを定量化した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡプレートの発色後、それをＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３ｘ機器を用いて４５０ｎｍで読み取り、５４０ｎｍのバックグラウンドを差し引いた。サンプルウェル内のＩＦＮγ含有量は、アッセイ検量線から試料読取り値を補間することによって近似した。

図１０Ｂに示されるとおり、ヒトＰＢＭＣをＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｒｈＩＬ－１２と共に培養し、同時に５μｇ／ｍｌのＰＨＡで処理してＩＦＮγ応答の大きさを増幅したとき、ＩＦＮγ産生は増加した。ＩＦＮ－γ産生と、続くＩＬ－１２刺激は、調べた濃度ではＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉとｒｈＩＬ－１２との間で同等であった。

従って、これらの２つの細胞型及び刺激条件によるＥＣ５０値には、１桁を超える差があったが、両方のアッセイでＤＦ－ｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉとｒｈＩＬ－１２との同等の活性が実証されたことから、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉコンストラクトの効力が未変性組換えヒトＩＬ－１２と同程度の効力を呈することが示唆される。

実施例５－ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｒｈＩＬ－１２の静脈内注入後のサル血漿中におけるＩＬ－１２、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びＩＦＮγ濃度
カニクイザルにおいて、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｒｈＩＬ－１２の静脈内注入後に薬力学（ＰＤ）及び薬物動態（ＰＫ）を評価した。

カニクイザルにＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及び組換えヒトＩＬ－１２を１０μｇ／ｋｇでＩＶ注入によって投与した。

ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡヒトＩＬ－１２ｐ７０イムノアッセイキットに基づきイムノアッセイを用いてＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びヒトＩＬ－１２を検出した：このアッセイは定量的サンドイッチ酵素イムノアッセイ技法を利用するものであった。ヒトＩＬ－１２ｐ７０に特異的なモノクローナル抗体を固相捕捉として使用し、検出は、抗体ＨＲＰタグ付加レポーターを使用して達成した。ｒｈＩＬ－１２又はＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ参照標準品でスパイクした標準物質及びＱＣを、試験試料と共にマイクロタイタープレートのウェルにピペッティングし、試料中に存在する任意のＩＬ－１２ｐ７０を固相上の固定化した抗体によって結合させた。未結合の物質を洗い流し、ウェルにヒトＩＬ－１２ｐ７０に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を加えた。未結合の抗体－酵素試薬を洗い流し、各ウェルにＴＭＢ基質を加えた。結果として起こった酵素反応により青色の産物が生じ、これが酸停止液を加えると黄色に変わった。各ウェルで測定される色の強度は、初期段階で結合したｒｈＩＬ－１２又はＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの量に正比例する。データ収集ソフトウェア、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏＥｎｔｅｒｐｒｉｓｅのバージョン４．６を備えるＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダーの５４０ｎｍを基準として、プレートを４５０ｎｍで読み取った。データをテキストファイルに変換し、ＷａｔｓｏｎＬＩＭＳｖ．７．２．０．０２にインポートし／処理した。重み付け係数を１とするロジスティック（自動推定）曲線当てはめを用いて回帰を実行した。

イムノアッセイ（メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）－ＥＬＩＳＡ様のイムノアッセイ）もまた用いてＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを検出し、このアッセイは、未処理のＭＳＤマイクロタイタープレートをサル吸着ヤギ抗ヒトＩｇＧでコートすること、及び室温でインキュベートすることを伴う。プレートを洗浄し、ブロックし、洗浄し、試験試料と共に、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ参照標準品でスパイクした検量線用及び品質管理用試料とインキュベートした。このインキュベーション後、プレートを洗浄し、プレートに一次検出抗体としてビオチン抗ヒトＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０を加えた。もう一回の洗浄ステップ後、ストレプトアビジンコンジュゲートＳｕｌｆｏ－Ｔａｇを二次検出抗体として加えた。プレートの最終回の洗浄を行い、プレートにＭＳＤＲｅａｄＢｕｆｆｅｒＴを加え、ＭＳＤＳｅｃｔｏｒＩｍａｇｅｒＳ６００を使用してプレートを読み取った。未加工のＭＳＤデータをテキストファイルにエクスポートし、次にそれを、Ｅｎｖｉｇｏにてカスタム設計されたプログラム化したＥｘｃｅｌスプレッドシートを使用してＷａｔｓｏｎＬＩＭＳ互換ファイルに変換した。ＷａｔｓｏｎＬＩＭＳソフトウェアｖ．７．２．０．０２にてデータをインポートし、回帰を行った。

カニクイザル血漿中のＮＨＰ炎症誘発性バイオマーカーの相対的定量測定に、メソスケールディスカバリー方法を実施した。この方法（ｍｅｔｈｅｄ）は、カニクイザルＫ２ＥＤＴＡ血漿（サル血漿と称される）中の炎症誘発性パネル１バイオマーカー：ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６ＩＬ－８、及びＩＬ－１０の相対的定量測定に、サンドイッチイムノアッセイ手順を使用するものであった。この方法は、Ｖ－ＰＬＥＸ及びＶ－ＰＬＥＸＰｌｕｓ用のＭＳＤ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）キット、カタログ番号Ｋ１５０５６Ｄ－１、Ｋ１５０５６Ｄ－２、Ｋ１５０５６Ｄ－４、Ｋ１５０５６Ｄ－６、Ｋ１５０５６Ｇ－１、Ｋ１５０５６Ｇ－２、Ｋ１５０５６Ｇ－４、Ｋ１５０５６Ｇ－６に基づいている。この方法は、カニクイザルと反応するヒト捕捉抗体及び検出抗体を利用する。このキットは、９６ウェルマルチスポットプレートの各ウェルにおける独立した十分に画成されたスポット上に捕捉抗体を予めコートしてあるプレートを提供する。プレートをサル血漿試料とインキュベートし、洗浄し、次に、電気化学発光（ＥＣＬ）標識（ＭＳＤＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ）とコンジュゲートしている検出抗体（各分析物に特異的）とインキュベートした。試料中の分析物が、ワーキング電極表面に固定化した捕捉抗体に結合する；結合した分析物による検出抗体の動員により、サンドイッチが完成する。プレートを洗浄し、ＭＳＤＲｅａｄＢｕｆｆｅｒを加えることにより、電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ）に適切な化学的環境を作り出した。プレートをＭＳＤＳｅｃｔｏｒＩｍａｇｅｒ６００（ＳＩ６００）機器にロードし、そこでプレート電極に電圧を印加すると、捕捉された標識が光を放出した。この機器は、放出された光の強度を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定して試料中の分析物の相対的定量測定値を提供する。未加工のＲＬＵデータをテキストファイルにエクスポートし、次にそれを、Ｅｎｖｉｇｏにてカスタム設計されたプログラム化したＥｘｃｅｌスプレッドシートを使用してＷａｔｓｏｎＬＩＭＳ互換ファイルに変換した。続いてＷａｔｓｏｎＬＩＭＳソフトウェアｖ．７．２．０．０２にてデータをインポートし、回帰を行った。

図１１は、ＩＶ投与後の時間の経過に伴うＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及び組換えヒトＩＬ－１２の相対血漿濃度を示す。このデータは、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びｒｈＩＬ－１２の濃度が、予想どおり、時間の経過に伴い低下したことを示している。しかしながら、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、この時間経過にわたってｒｈＩＬ－１２と比較して半減期の延長及び全体的に多い曝露を実証した。

図１１はまた、ＩＶ投与後のサル血漿中のＩＦＮγ（ＰＤ）の相対濃度も示している。このデータは、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びｒｈＩＬ－１２の薬力学が、ＩＦＮγ産生によって評価したとき、両方とも、ＩＶ投与後に活性を実証したことを示している。しかしながら、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、ｒｈＩＬ－１２と比較してより高いピーク活性及びより長い持続期間を実証した。

実施例６－マウスサロゲートＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの薬理特性評価
ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと称される、半減期延長型マウスＩＬ－１２変異体の血清半減期及びインビボ薬力学を調べた。

１μｇＩＬ－１２に対応する等モル量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを非腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射し、ＰＫ／ＰＤ特性をＩＬ－１２と比較した。ナイーブＢａｌｂ／ｃ（ｎ＝６）に１μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びＩＬ－１２（１μｇＩＬ－１２と等モル）を静脈内注射した。注射後０．０１７、０．５、３、６、２４、４８、７２、９６、１４４及び２１９時間に血液を試料採取した。血清中のＩＬ－１２及びＩＦＮγレベルを先述のとおりＥＬＩＳＡによって分析した。

図１２Ａ及び図１２Ｂに示され、表１５に定量化されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、約３０時間という長く続く血清半減期を示しており（図１２Ｂ、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉＴ_１／２＝２９．８５時間）、これはＩＬ－１２（図１２Ａ；ＩＬ－１２Ｔ_１／２＝６．０５時間）の５倍の長さであった。半減期の延長に加えて、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ媒介性ＩＦＮγ産生（ＡＵＣ＝９１６６５４）もまた、ＩＬ－１２と比較して長時間にわたった（ＡＵＣ＝２０３０４）。

次に、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの異なる投与経路についてのＰＫ／ＰＤ特性を比較した。１μｇＩＬ－１２に対応する等モル量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを、単回用量として非腫瘍担持Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内、腹腔内、又は皮下投与によって注射し、記載するとおりのＰＫ／ＰＤ特性を評価した。

図１２Ｃ～図１２Ｅに示され、表１６に定量化されるとおり、静脈内（図１２Ｃ）、腹腔内（図１２Ｄ）、又は皮下（図１２Ｅ）投与では、いずれによっても、異なる投与経路間で同等のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ媒介性ＩＦＮγ産生が生じた。注目すべきことに、皮下投与では、より低いＩＬ－１２Ｃ_ｍａｘが生じた。従って、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ投与の薬物動態特性（例えば、ＩＬ－１２濃度）は、投与経路に応じて異なったが、薬力的特性（ＩＦＮγ産生）は、長く続き、異なる経路間で比較的同等のままであった。

実施例７－Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとＰＤ－１遮断との組み合わせ
ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとＰＤ－１遮断との組み合わせ療法を実施して、樹立Ｂ１６Ｆ１０腫瘍で抗腫瘍免疫応答を増幅し得るかどうかを分析した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウスの側腹部へと１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種後８日目、マウスを無作為化した（各群ｎ＝１０）。平均腫瘍容積が約２４５ｍｍ^３に達したとき、０．５μｇアイソタイプ対照、０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、２００μｇ抗ＰＤ－１クローンＲＭＰ１－１４、又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／抗ＰＤ－１の組み合わせによってマウスを腹腔内治療した。動物にＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを週１回及び抗ＰＤ－１を毎週２回注射した。腫瘍成長は６０日間評価し、生存率及び体重をモニタした。

図１３Ａ～図１３Ｃに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ単独の投与では腫瘍退縮が遅くなり（図１３Ａ）、及びＰＤ－１単独では腫瘍成長に最小限の効果しか見られなかったが（図１３Ｂ）、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉをＰＤ－１遮断と組み合わせると、腫瘍成長が更に遅くなり（図１３Ｃ）、抗ＰＤ－１治療によってＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療に対する抗腫瘍応答が更に増幅されたことが示唆された。

図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるとおり、アイソタイプの１５日及び２００μｇ抗ＰＤ－１治療マウスの１７．５日と比較して、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ療法による及びＰＤ－１遮断との組み合わせでの全生存は延長され、２９日（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ単独療法）及び３６日（組み合わせ）の生存期間中央値を示した（図１４Ａ）。注目すべきことに、高い奏効率にもかかわらず、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及び組み合わせ療法のレジメンはＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスによって良好に忍容されるように見えた（図１４Ｂ）。

従って、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとＰＤ－１遮断との組み合わせ療法は、いずれの治療単独と比較しても、有効性の向上を実証した。

実施例８－Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴとの組み合わせ
ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴとの組み合わせ療法を実施して、樹立Ｂ１６Ｆ１０腫瘍で抗腫瘍免疫応答を増幅し得るかどうかを分析した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後７日目、マウスを無作為化した（各群ｎ＝１０）。腫瘍平均が２００ｍｍ^３に達したとき、１５０μｇアイソタイプ対照、又は０．５μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、１５０μｇＴｒｉＮＫＥＴ、又は組み合わせＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／ＴｒｉＮＫＥＴによってマウスを腹腔内治療した。腫瘍成長は６０日間評価し、生存率及び体重をモニタした。

図１５Ａに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる単独療法は、腫瘍成長の低下につながった。出発腫瘍容積が２００ｍｍ^３での単剤としてのｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴによる治療によっては腫瘍進行は遅れなかった（図１５Ｂ）。対照的に、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９との組み合わせは、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ単独と比較して抗腫瘍応答を更に亢進させ（図１５Ｃ）、３０％の完全奏効例（ＣＲ）（ｎ＝３）が得られたことから、ＴｒｉＮＫＥＴ治療がＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療に対する抗腫瘍応答を更に増幅させたことが示唆される

図１６Ａに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ療法による及びｍｃＦＡＥ－Ｃ２６．９９ＴｒｉＮＫＥＴとの組み合わせでの全生存は延長し、アイソタイプの１６日及びＴｒｉＮＫＥＴ治療マウスの１７日と比較して、２９日（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ単独療法）及び６０日（ＴｒｉＮＫＥＴ組み合わせ）の生存期間中央値を示した。注目すべきことに、高い奏効率にもかかわらず、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及び組み合わせ療法のレジメンはＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスによって良好に忍容されるように見えた（図１６Ｂ）。

これらの３例の完全奏効例（上記に記載される実験及び図１５Ｃに提示されるデータによるＣＲ）を、初回腫瘍接種の７２日後に２×１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞で再チャレンジした。年齢対応ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを対照群として使用した。初期ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ／ＴｒｉＮＫＥＴ組み合わせ治療群からの３匹のマウス中１匹は無腫瘍のままであり、別のマウスは９５日目から始まる腫瘍形成を示し、第３のマウスの腫瘍進行は年齢対応対照群と同様であったことから（図１７）、組み合わせ療法による免疫学的記憶の形成が示唆された。

従って、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとＴｒｉＮＫＥＴとの組み合わせ療法は、いずれの治療単独と比較しても、マウス集団で完全な持続性のある応答を実証したことを含め、有効性の向上を実証した。

実施例９－ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる治療は、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて完全な回復を促進する
本例は、ＣＴ２６腫瘍を担持するマウスにおいてＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる治療が回復を促進することを示している。

簡潔に言えば、１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後１４日目、腫瘍容積が２７０ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群に無作為化し、１μｇｒｍＩＬ－１２と当量のモル用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を週１回腹腔内注射した。腫瘍成長は６０日間評価した。初回腫瘍接種の７２日後に、完全奏効例を１０^６個のＣＴ２６細胞で再チャレンジした。年齢対応ナイーブＢａｌｂ／Ｃマウスを対照群として使用した。

図１８Ａは、ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、単回用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図１８Ｂは、ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、毎週用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの体重を示すグラフである。図１８Ｃは、ＣＴ２６腫瘍細胞の接種で再チャレンジした個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。

図１８Ａ～図１８Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを投与すると、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプと比較してロバストな腫瘍退縮が生じ、治療動物の体重に影響を及ぼす毒性は認められなかった。図１８Ｃに示されるとおり、初期ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療マウスは無腫瘍のままであったことから、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療による免疫学的記憶の形成が示唆される。

実施例１０－腹腔内又は皮下送達したＤＦｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて腫瘍容積を低減するのに有効である
本例は、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの腹腔内又は皮下投与により、ＣＴ２６腫瘍を担持するマウスにおいて１００％の完全な回復が確実となることを示している。

簡潔に言えば、１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後１４日目、腫瘍容積が２７０ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群に無作為化し、１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を週１回腹腔内注射するか、又は１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を週１回皮下注射した。腫瘍成長は６０日間を超えて評価した。

図１９Ａは、ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、腹腔内に送達される毎週用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図１９Ｂは、ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、皮下送達される毎週用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。

図１９Ａ～図１９Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの腹腔内送達又は皮下送達のいずれも、ＣＴ２６腫瘍容積の低減に有効であった。

実施例１１－ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの単回用量投与は、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて腫瘍容積を低減するのに有効である
本例は、単回用量のＤＦ－ｍＩ１２－Ｆｃｓｉが、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍を担持するマウスにおける腫瘍容積の低減に有効であることを示している。

端的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対し、１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後７日目、マウスを無作為化した。腫瘍平均が２００ｍｍ^３に達したとき、単回用量のアイソタイプ対照、又は１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによってマウスを腹腔内治療した。腫瘍成長は５０日間評価した。

図２０に示されるとおり、μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの単回用量は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスにおいて腫瘍容積を低減するのに有効である。

実施例１２－腹腔内又は皮下送達したＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、Ｂ１６Ｆ１０マウスモデルにおいて腫瘍容積を低減するのに有効である
本例は、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの腹腔内又は皮下投与が、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫腫瘍を担持するマウスにおいて１００％の完全な回復につながったことを示している。

簡潔に言えば、１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後７日目、マウスを無作為化した。腫瘍平均が２００ｍｍ^３に達したとき、マウスに１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を週１回腹腔内注射し、又は１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を週１回皮下注射した。腫瘍成長は４０日間評価した。

図２１Ａ～図２１Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの腹腔内送達又は皮下送達のいずれも、アイソタイプ対照と比較すると、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍容積の低減に有効であった。

実施例１３－ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは単回用量として効果的である
本例は、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉが、単回用量として投与したときＣＴ２６腫瘍容積の低減に有効であり、及び反復投与で投与したとき、更に一層有効であることを示す。

簡潔に言えば、１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍接種後１４日目、腫瘍容積が２７０ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（各群ｎ＝１０）に無作為化し、０．１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量の単回用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を週１回腹腔内注射した。或いは、マウスに１μｇＩＬ－１２と当量のモル用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は１μｇのｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を週１回腹腔内注射した。腫瘍成長は６０日間を超えて評価した。

図２２Ａは、ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、単回用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２２Ｂは、ＣＴ２６腫瘍細胞を接種し、毎週用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。

図１８Ａ及び図２２Ａに示されるとおり、単回用量の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉにより、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプと比較すると、腫瘍担持マウスのロバストな７０％の完全な回復が生じた。しかしながら、図２Ｃ及び図２２Ｂに示されるとおり、反復毎週投与の１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉでは、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプと比較すると、腫瘍担持マウスの１００％の完全な回復が確実となった。図１８Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは反復投与であっても良好に忍容され、体重によって評価したとき、毒性は認められなかった。

加えて、完全奏効例（ＣＲ）を反対側の側腹部において５×１０^５個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞で再チャレンジし、同じ腫瘍用量でチャレンジしたナイーブマウスと腫瘍進行を比較した。図１８Ｃに示されるとおり、ナイーブマウスで腫瘍が成長した一方、完全奏効例の１００％が、再チャレンジ後にも無腫瘍のままであった。従って、単回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、マウス集団で完全な、持続性のある応答を実証した。

実施例１４－単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおける薬物動態
ＥＬＩＳＡ様のイムノアッセイ－メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）イムノアッセイ方法を利用して、カニクイザルにおいて１μｇ／ｋｇ（図２５Ａ）、２μｇ／ｋｇ（図２５Ｂ）、又は４μｇ／ｋｇ（図２５Ｃ）のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの皮下注射後に薬物動態を決定した。簡潔に言えば、未処理のＭＳＤマイクロタイタープレートにサル吸着ヤギ抗ヒトＩｇＧをコートし、室温でインキュベートした。コーティング及びインキュベーション後、プレートを洗浄し、ブロックし、洗浄し、試験試料と共に、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ参照標準品でスパイクした検量線用及び品質管理用試料とインキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄し、プレートに一次検出抗体としてビオチン抗ヒトＩＬ－１２／ＩＬ－２３ｐ４０を加えた。もう一回の洗浄ステップの後、ストレプトアビジンコンジュゲートＳｕｌｆｏ－Ｔａｇを二次検出抗体として加えた。プレートの最終回の洗浄を行った後、プレートにＭＳＤｒｅａｄｂｕｆｆｅｒＴを加えた。ＭＳＤＳｅｃｔｏｒＩｍａｇｅｒＳ６０００を使用してプレートを読み取った。

図２５Ａ～図２５Ｃは、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの１μｇ／ｋｇ（図２５Ａ）、２μｇ／ｋｇ（図２５Ｂ）、又は４μｇ／ｋｇ（図２５Ｃ）の単回皮下用量で治療したカニクイザルにおける薬物動態を示す折れ線グラフである。

このデータは、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びｒｈＩＬ－１２の濃度が、予想どおり、時間の経過に伴い低下したことを示しており、試験した全ての用量で同様の薬物動態プロファイルであった。

実施例１５－単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるサイトカイン放出
カニクイザルにおいて１μｇ／ｋｇ（図２６Ａ及び図２６Ｂ）、２μｇ／ｋｇ（図２６Ｃ及び図２６Ｄ）、又は４μｇ／ｋｇ（図２６Ｅ及び図２６Ｆ）のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを皮下注射した後のサイトカインの定量的測定について、ＭＳＤイムノアッセイキットを使用して決定した。この方法は、サンドイッチイムノアッセイキット（炎症誘発性パネル１バイオマーカー及びＶ－ＰＬＥＸＰｌｕｓケモカインパネル１ＮＨＰキット）を使用して、カニクイザルＫ２ＥＤＴＡ血漿（サル血漿と称される）中の炎症誘発性パネル１バイオマーカー：ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－６ＩＬ－８、及びＩＬ－１０の相対的定量測定を行うものであった。この方法は、Ｖ－ＰＬＥＸ及びＶ－ＰＬＥＸＰｌｕｓ用のＭＳＤ非ヒト霊長類（ＮＨＰ）キット、カタログ番号Ｋ１５０５６Ｄ－１、Ｋ１５０５６Ｄ－２、Ｋ１５０５６Ｄ－４、Ｋ１５０５６Ｄ－６、Ｋ１５０５６Ｇ－１、Ｋ１５０５６Ｇ－２、Ｋ１５０５６Ｇ－４、Ｋ１５０５６Ｇ－６に基づいている。この方法は、カニクイザルと反応するヒト捕捉抗体及び検出抗体を利用する。このキットは、９６ウェルマルチスポットプレートの各ウェル内の独立した十分に画成されたスポット上に捕捉抗体を予めコートしてあるプレートを提供する。プレートをサル血漿試料とインキュベートし、洗浄し、次に、電気化学発光（ＥＣＬ）標識（ＭＳＤＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ）とコンジュゲートしている検出抗体（各分析物に特異的）とインキュベートした。試料中の分析物が、ワーキング電極表面に固定化した捕捉抗体に結合する；結合した分析物による検出抗体の動員により、サンドイッチが完成する。プレートを洗浄し、ＭＳＤＲｅａｄＢｕｆｆｅｒを加えることにより、電気化学発光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ）に適切な化学的環境を作り出した。プレートをＭＳＤＳｅｃｔｏｒＩｍａｇｅｒ６００（ＳＩ６００）機器にロードし、そこでプレート電極に電圧を印加すると、捕捉された標識が光を放出した。この機器は、放出された光の強度を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定して試料中の分析物の相対的定量測定値を提供する。未加工のＲＬＵデータをテキストファイルにエクスポートし、次にそれを、Ｅｎｖｉｇｏにてカスタム設計されたプログラム化したＥｘｃｅｌスプレッドシートを使用してＷａｔｓｏｎＬＩＭＳ互換ファイルに変換した。続いてＷａｔｓｏｎＬＩＭＳソフトウェアｖ．７．２．０．０２にてデータをインポートし、回帰を行った。

図２６Ａ～図２６Ｆは、１μｇ／ｋｇ（図２９Ａ及び図２９Ｂ）、２μｇ／ｋｇ（図２６Ｃ及び図２６Ｄ）、又は４μｇ／ｋｇ（図２６Ｅ及び２６Ｆ）の単回皮下用量のＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療したカニクイザルにおけるＩＦＮγ（図２６Ａ、図２６Ｃ、及び図２６Ｅ）及びＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０（図２６Ｂ、図２６Ｄ、及び図２６Ｆ）の濃度を示す折れ線グラフである。

図２６Ａに示されるとおり、１μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの単回皮下用量では、検出可能なレベルのＩＦＮγは生じなかった。２μｇ／ｋｇ及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの皮下用量では、一部の動物にＩＦＮγレベルの増加が生じ、これは用量投与後４日目にピークに達した（図２６Ｃ及び図２６Ｅ）。１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、及び４μｇ／ｋｇのＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの皮下用量では、いずれもＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０レベルの上昇が生じ、これは用量投与後４日目にピークに達した（図２６Ｂ、図２６Ｄ、及び図２６Ｆ）。

実施例１６－４Ｔ１同所性マウスモデルにおける放射線照射又は化学療法を用いたＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ組み合わせ療法
ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの投与によって引き出される抗腫瘍活性を増幅することができるかどうかを示すため、放射線照射又は化学療法を用いた組み合わせ試験を実施した。簡潔に言えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスに５×１０^５個の４Ｔ１－ｌｕｃ腫瘍細胞を乳房脂肪パッドに同所性に注射した。腫瘍接種後１４日目、マウスを無作為化した（各群ｎ＝１０）。マウスは、単独療法としてのアイソタイプ、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（両方とも１μｇＩＬ－１２と等モル）、５ｍｇ／ｋｇＤｏｘｉｌ（登録商標）（化学療法）の静脈内、又は１０Ｇｙでの照射、又はＤｏｘｉｌ（登録商標）若しくは放射線との組み合わせでのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで皮下治療した。時間の経過に伴う腫瘍成長を評価した。図２７は、乳癌細胞を接種し、単独療法としての毎週用量のアイソタイプ対照、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、Ｄｏｘｉｌ（化学療法）、又は１０Ｇｙでの照射又はＤｏｘｉｌ（登録商標）若しくは放射線との組み合わせでのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを投与した個々のマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。グラフは、腫瘍成長の群平均±標準誤差平均値を示す。

図２７に見られるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる単独療法はそれ自体、４Ｔ１腫瘍担持マウスにおいて有効であったが、組み合わせ療法は抗腫瘍免疫応答を増幅し、１０～３０％のマウスでの完全な腫瘍退縮につながった。

実施例１７－ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは大型のＰＤ－１遮断抵抗性ＣＴ２６結腸癌腫瘍に対する抗腫瘍有効性を媒介する
本例は、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉがＰＤ－１遮断抵抗性ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍に対する強力な抗腫瘍応答を引き出したかどうかを分析する。簡潔に言えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスに０．５×１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を注射した。接種後に平均腫瘍容積が約１２０ｍｍ^３に達したとき、９日目にマウスを無作為化した。マウスを２００μｇアイソタイプ又は抗ＰＤ－１抗体（毎週２回）のいずれかで治療した。図２８Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、アイソタイプ対照又は抗ＰＤ－１抗体のいずれかで治療（隔週）したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。１７日目、抗ＰＤ－１で前治療した群（平均腫瘍容積が約８００ｍｍ^３）を２つの治療群に更に分割した。群１は、毎週２回のＰＤ－１遮断治療を受け続け、群２は、ＰＤ－１遮断（毎週２回）をＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（毎週１μｇ）と共に受けた。図２８Ｂは、１μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる毎週の治療と共に抗ＰＤ－１抗体（隔週）で治療した抗ＰＤ－１抗体による前治療のあるＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。

図２８Ａに示されるとおり、抗ＰＤ－１単独療法は腫瘍進行を制御できなかった。しかしながら、図２８Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを加えると、有効な腫瘍退縮が生じた。

実施例１８－大型ＣＴ２６結腸癌腫瘍に対するＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの局所治療はアブスコパル抗腫瘍応答を誘導する
本例は、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療がアブスコパル治療効果を誘導できるかどうかを示す。簡潔に言えば、Ｂａｌｂ／ｃの左側腹部（０．８×１０^６個の腫瘍細胞）及び右側腹部（０．４×１０^６個の腫瘍細胞）の両方に、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞を皮下移植した。腫瘍接種後１３日目、左の腫瘍には、０．１μｇアイソタイプ対照又は０．１μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかを毎週１回、２～３週間にわたって注射した。図２９Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、アイソタイプ対照又はＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで（毎週）１回治療したＢａｌｂ／ｃマウスにおける治療を受けた（Ｔｒ）腫瘍の腫瘍成長曲線を示すグラフである。右の腫瘍は未治療のままとした（ＮＴ）。

図２９Ｂは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける未治療の（ＮＴ）腫瘍の腫瘍成長曲線を示すグラフである。

図２９Ａ～図２９Ｂに示されるとおり、対照アイソタイプ治療腫瘍は、右部位及び左部位の両方で次第に成長した。図２９Ａ～図２９Ｂに示されるとおり、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、局所注入部位（図２９Ａ）及び遠隔の未治療腫瘍（図２９Ｂ）に有効な抗腫瘍応答を引き起こしたことから、アブスコパル治療効果が指摘される。

実施例１９－ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは大型ＣＴ２６結腸癌腫瘍に対する抗腫瘍有効性を媒介する
本例は、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇを持つマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインポリペプチドのＮ末端に融合した野生型マウスＩＬ－１２ｐ４０及びｐ３５サブユニットを含むＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（実施例２に考察される）が、大型の腫瘍容積に対して効果的であることを示す。

大型ＣＴ２６結腸癌腫瘍に対するＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ媒介性抗腫瘍有効性を試験した。簡潔に言えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスに１０^６個のＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１結腸癌細胞を皮下注射した。腫瘍接種後１８日目、腫瘍容積が８００ｍｍ^３に達したとき、マウスを異なる治療群（各群ｎ＝１０）に無作為化し、１μｇ又は２μｇＩＬ－１２と当量のモル用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、又はモル当量のｍＩｇＧ２ａアイソタイプで１回又は毎週１回腹腔内治療した。

腫瘍成長は６５日間評価した。図２３Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は１μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで（毎週）１回治療したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２３Ｂは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで（毎週）１回治療したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図３０Ａは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照又は２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのいずれかで１回治療したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線を示すグラフである。図３０Ｂは、ＣＴ２６－Ｔｙｒｐ１腫瘍細胞を接種し、２μｇｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、１μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（毎週投与）、２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（毎週投与）、又は２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ（１回）で治療したＢａｌｂ／ｃマウスの平均腫瘍成長曲線を示すグラフである。図２３Ａ、図２３Ｂ、及び図３０Ａは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す。図３０Ｂは、腫瘍平均±標準誤差平均値を示す。

図２３Ａ、図２３Ｂ、及び図３０Ｂに示されるとおり、毎週用量（１μｇ又は２μｇ）のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、腫瘍進行を効率的に制御し、１００％のマウスがＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療に応答した。加えて、図３０Ａに示されるとおり、２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる単回治療は腫瘍退縮を示し、１００％の奏効率が生じた。この例に記載されるデータ及び図は、単回用量として投与したときに、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉがより大型のＣＴ２６腫瘍容積の低減に有効であるのみならず、ＣＴ２６腫瘍容積の低減にもまた有効であることを示している。

実施例２０－Ｂ１６Ｆ１０黒色腫に対するＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療は血清及び腫瘍におけるサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する
本例は、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療により、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの血液及び腫瘍（ｔｕｎｏｒ）におけるＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のレベルの上昇が生じたことを示す。簡潔に言えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０^６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種後７日目（平均腫瘍容積が１５０ｍｍ^３に達したとき）、マウスを無作為化した（各群ｎ＝８）。アイソタイプ対照、ＩＬ－１２、又は１μｇＩＬ－１２と等モルのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃによってマウスを腹腔内治療した。

治療後７２時間が経った後、血清及び腫瘍ライセートを調製し、マルチプレックス技術を用いてＩＦＮγ（図２４Ａ）、ＣＸＣＬ９（図２４Ｂ）、及びＣＸＣＬ１０（図２４Ｃ）発現に関して分析した。図３１Ａ～図３１Ｃは、マウスの平均サイトカイン／ケモカインレベルを示す。

図２４Ａ～図２４Ｃに示されるとおり、単回用量の０．５μｇのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉにより、血清中（左側のパネル）及び腫瘍内（右側のパネル）におけるＩＦＮγ（図２４Ａ）、ＣＸＣＬ９（図２４Ｂ）、及びＣＸＣＬ１０（図２４Ｃ）の発現の増加が生じた一方、ＩＬ－１２治療では効果はほとんど又は全くなかった。

実施例２１－ＬＡＬＡＰＡ及びＬＡＬＡＰＧ突然変異を有するＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは同程度のＩＦＮγ刺激活性を有し、ＦｃγＲ結合を無効にした
本例は、ＬＡＬＡＰＡ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａ）突然変異、又はＬＡＬＡＰＧ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ）突然変異を有するＩｇＧ１Ｆｃを含むＤＦｈＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＩＦＮγ刺激及びＦｃγＲ結合活性を示す。端的には、ヒトＰＢＭＣを５μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びＬＡＬＡＰＡ又はＬＡＬＡＰＧ突然変異を有するＤＦｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｓｉの用量滴定液の両方と共に２日間培養した。２日間刺激した後、上清を回収し、ＩＦＮγ含有量をＥＬＩＳＡにより測定した。ＦｃγＲ結合活性を決定するため、高親和性ＦｃγＲＣＤ３２及びＣＤ６４を発現するＴＨＰ－１細胞に結合したフルオロフォアコンジュゲートｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体（８３ｎＭ）をフローサイトメトリーにより検出した。

図３１Ａに示されるとおり、ｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ＬＡＬＡＰＡ及びｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ＬＡＬＡＰＧは、ＰＨＡと並行してＰＢＭＣからのＩＦＮγ産生を刺激する能力が同程度であり、ＰＨＡ単独で産生される量をはるかに上回る。

図３１Ｂに示されるとおり、１６倍モル過剰のｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ｗｔ（１．３μＭ）を混合物中に標識したｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体と同時に含めると、恐らくはＩｇＧ１結合に関してＣＤ３２及びＣＤ６４と競合するため、結合シグナルの実質的な低下が生じた。対照的に、同じ濃度で、ｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ＬＡＬＡＰＡ又はｈＩＬ－１２－Ｆｃ－ＬＡＬＡＰＧのいずれとのインキュベーションによっても、検出可能なＩｇＧ１アイソタイプ結合は生じなかったことから、両方のタンパク質とも、ＬＡＬＡＰＡ及びＬＡＬＡＰＧ突然変異に起因してＦｃγＲ会合が無効になったことが示唆される。

実施例２２：ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの製造工程及び工程管理
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、浮遊培養下のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させる。マスターセルバンク（ＭＣＢ）からの細胞を使用して、動物成分不含の化学限定培地が入った振盪フラスコを接種する。次にこの細胞を使用して徐々に大きい容量の培養液を接種することにより、生産バイオリアクターの接種が可能となるまで細胞数を拡大する。

生産バイオリアクターを流加培養方式で動作させて、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉタンパク質の発現を増加させる。約１４日後、深層ろ過によって培養液を回収することにより細胞及び細胞デブリを取り出した後、初回精製にかける。プロテインＡキャプチャークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を含む一連のクロマトグラフィー及びろ過ステップを用いてＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉをＣＨＯ回収培地から精製する。

２回の特化した直交性ウイルス不活性化及び除去ステップ－低ｐＨ不活性化及びナノろ過－を含める。ウイルス不活性化ステップには、ろ過したＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ溶液に酢酸塩を加えてｐＨを約３．６５に調整し、少なくとも６０分間インキュベートすることが含まれた。

最後に、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを濃縮し、２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の最終的な組成物に製剤化する。次に、製剤化された原薬を０．２μｍ膜でろ過してポリカーボネートボトルに入れた後、－６５℃以下で保存する。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ原薬製造工程の概略図を図３２に提供する。

バッチスケール及び定義
ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉＭＣＢの単一のバイアルを１つの生産バイオリアクターに拡大し、各回収液を精製して１つの原薬ロットにする。

細胞培養液及び上流製造工程
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの上流原薬製造工程を図３３に示し、各単位操作の更なる詳細を提供する。

振盪フラスコ継代
マスターセルバンクのバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、ピペットによって内容物をゆっくりと混合し、次に、６ｍＭＬ－グルタミンを補足した予め平衡化させた成長培地（ＢａｌａｎＣＤＣＨＯＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍＡ、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が入った１２５ｍＬ振盪フラスコに加える。接種後に細胞数を取り、必要であれば、細胞密度を０．３０×１０^６～０．５０×１０^６生細胞／ｍＬの目標値に希釈する。次にフラスコを温度及び％ＣＯ_２（ｇ）制御付きインキュベーター内にあるオービタルシェーカーに置く。３日目、２継代目の前に細胞密度及び生存率を点検する。

２継代目については、６ｍＭＬ－グルタミンを補足した成長培地で５００ｍＬ振盪フラスコを予め平衡化させる。次にフラスコを１継代目からの細胞で接種し、温度及び％ＣＯ_２（ｇ）制御付きインキュベーター内にあるオービタルシェーカーに置く。細胞密度及び生存率を測定し、フォワードプロセシング判定基準に適合した時点で、それらの細胞を使用して３継代目を接種する。

３継代目については、３つの１０００ｍＬ振盪フラスコを、６ｍＭＬ－グルタミンを補足した成長培地で予め平衡化させる。次にフラスコを２継代目からの細胞で接種し、次に温度及び％ＣＯ_２（ｇ）制御付きインキュベーター内にあるオービタルシェーカーに置く。細胞密度及び生存率を測定し、フォワードプロセシング判定基準に適合した時点で、それらの細胞を使用して４継代目を接種する。

４継代目については、４つの５０００ｍＬ振盪フラスコを、６ｍＭＬ－グルタミンを補足した成長培地で予め平衡化させる。次にフラスコを２継代目からの細胞で接種し、次に温度及び％ＣＯ_２（ｇ）制御付きインキュベーター内にあるオービタルシェーカーに置く。細胞密度及び生存率を測定し、フォワードプロセシング判定基準に適合した時点で、それらの細胞を使用して５０ＬＷａｖｅバイオリアクターを接種する。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表１７にまとめる。

Ｗａｖｅバイオリアクター
５０ＬＷａｖｅＢｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）プラットフォーム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）をセットアップし、６ｍＭＬ－グルタミンを補足した成長培地（ＢａｌａｎＣＤＣＨＯＧｒｏｗｔｈＭｅｄｉｕｍＡ、ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を接種する。この培地は３６．５℃及び５％ＣＯ_２（ｇ）で予めコンディショニングし、次に４継代目からの培養液を接種する。バイオリアクターは、細胞密度及び生存率に関して毎日抜取り検査し、移し替えの細胞密度判定基準に達した時点で、この培養液を使用して２００Ｌ生産バイオリアクターを接種する。代謝産物濃度（例えば、グルコース及び乳酸塩）及びｐＨもまた、情報として毎日モニタする。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表１８にまとめる。

生産バイオリアクター
２００Ｌのディスポーザブルバイオリアクターをセットアップし、６ｍＭＬ－グルタミンを補足した成長培地を接種する。この培地は３７℃で予め平衡化させて、次に５０ＬＷａｖｅバイオリアクターからの培養液を接種する。初回接種容積は約１３０Ｌであり、最終的な培養液容積は約１８０Ｌである。空気及び酸素を補足することにより溶存酸素を制御し、二酸化炭素ガス及び／又は炭酸ナトリウム塩基を加えることによりｐＨを制御する。生産バイオリアクターは、細胞密度及び生存率に関して毎日抜取り検査し、生存細胞密度が１４×１０^６生細胞／ｍＬ以上になった時点で、温度設定値を３７℃から３３℃にシフトさせ、回収液判定基準に適合するまで３３℃に維持する。生存率が８５％以下の生存率になるか、又は培養１４日目になるか、いずれか早い方が到来したときに培養液を回収する。培養期間中は、代謝産物濃度（例えば、グルコース及び乳酸塩）及びＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ力価（８日目から開始）をモニタする。

培養３日目から開始して、１３日目まで栄養供給濃縮物を毎日加える。加えて、必要に応じて濃縮グルコース溶液を加えることにより、供給後のバイオリアクター内のグルコースの最低濃度を維持する。３日目から始めて、バイオリアクターに毎日消泡剤を加えることにより、泡の蓄積を最小限に抑える。回収当日、バイオリアクター培養液の試料を採取して、外来性作用因子の検査にかける。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表１９にまとめる。

回収液清澄化
バイオリアクターは、深層ろ過によって清澄化して細胞及び調製時の細胞デブリを取り除き、更なる精製ステップにかける。清澄化には、ＤＯＨＣ及びＸＯＨＣフィルタからなる二段階使い捨て深層ろ過システムを使用する。ろ過の開始前、バイオリアクター温度を１８℃に調整し、溶存酸素設定値を７０％飽和に増加させる。

回収フィルタを注射用水（ＷＦＩ）でリンスし、次に緩衝液で平衡化させる。細胞懸濁液を蠕動ポンプを使用して回収フィルタに通過させて、そのフィルタをフラッシュすることにより生成物を収集する。圧力をモニタし、１５ｐｓｉｇ以下に維持する。次にろ液を０．４５／０．２μｍ膜でろ過して滅菌バッグに入れる。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２０にまとめる。

清澄化した回収液は、直ちに処理に取り掛からない限り、キャプチャークロマトグラフィーステップまで２～８℃で保存する。

下流精製製造工程
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの下流原薬製造工程を図３２に示し、各単位操作の更なる詳細を以下の文に提供する。下流精製は、３段階クロマトグラフィーステップ及び２段階の特化したウイルス除去ステップ、低ｐＨ不活性化及びナノろ過からなる。各工程中間体について、許容されるホールドタイム及び温度を確立するため、ホールドタイム試験が実施されている。

プロテインＡキャプチャークロマトグラフィー
清澄化した回収液は、Ａｍｓｐｈｅｒｅ３プロテインＡ（ＪＳＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）樹脂で捕捉して工程関連不純物（例えば、ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質）、培地添加剤を除去し、後続の精製前の容積減量ステップとして働く。必要に応じて各ロットについて複数のサイクルを実施する。各ロード前に、初めに樹脂を２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化させる。ロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄して未結合の、又は緩く結合した不純物を除去し、次に５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．４による２回目の洗浄を実施してｐＨを下げ、カラムを溶出用に調製する。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、５０ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭアルギニン、ｐＨ３．７で溶出し、２８０ｎｍＵＶ波長によって１．２５ＡＵ／ｃｍ上昇で開始して、次に１．２５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集する。溶出液を１つのプールに収集し、各カラムサイクルを低ｐＨウイルス不活性化によって個別に処理する。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２１にまとめる。

低ｐＨウイルス不活性化
プロテインＡ溶出液を低ｐＨでインキュベートして、潜在的に存在する可能性のあるウイルスを不活性化させる。キャプチャー溶出液のｐＨを必要に応じて０．５Ｍ酢酸で調整し、最低でも６０分の間インキュベートする。インキュベーション時間の終了後、不活性化したプールを２Ｍトリス塩基で中和し、材料を０．２μｍろ過アセンブリに通過させる。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２２にまとめる。

Ｘ０ＳＰ深層ろ過
ウイルス不活性化中和化（ＶＩＮ）プールをＸ０ＳＰ中間デプスフィルタに通して処理することにより、工程関連不純物（例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ）を除去する。このシステムをＷＦＩでフラッシュした後、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを５００～１０００ｇ／ｍ^２の範囲内でロードする。ロードした後、システムに５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．２のチェイサーを流して生成物のホールドアップの回収を完了する。続いてＸ０ＳＰプール電気伝導率を５０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．２で６．０ｍＳ／ｃｍ以下に調整した後、最初のクロマトグラフィーステップにロードする。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２３にまとめる。

混合モードクロマトグラフィー
ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅＩｍｐＲｅｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）による混合モードクロマトグラフィーを結合－溶出モードで実施して、高分子量（ＨＭＷ）種を除去する。Ｘ０ＳＰろ液電気伝導率を上記に記載したとおり５０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．２で６．０ｍＳ／ｃｍ以下に調整し、必要に応じて複数のロードサイクルに分割する。ロード前、カラムを５０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．２で平衡化させて、ロードする。ロードした後、カラムを５０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５．２で洗浄し、次に５０ｍＭ酢酸塩２５０ｍＭＮａＣｌｐＨ５．２で溶出する。２８０ｎｍＵＶ検出によって０．６２５ＡＵ／ｃｍ上昇で開始して１．５０ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで、収集を開始する。収集後、最終０．２μｍフィルタを持つフィルタ列に各サイクル液を通過させる。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２４にまとめる。

陽イオン交換クロマトグラフィー
ＥｓｈｍｕｎｏＣＰＸ樹脂（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）による陽イオン交換クロマトグラフィーを実施して、生成物関連不純物（例えば、高分子量種、低分子量種）を除去するとともに、並びに更なる工程関連不純物も取り除く。必要に応じて各ロットにつき複数のサイクルを実施する。ロード前、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅＩｍｐＲｅｓサイクルをプールし、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４緩衝液で希釈し、ｐＨを２Ｍトリス塩基で７．５０±０．２０に調整する。カラムを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で平衡化した後、希釈してｐＨを調整したＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅＩｍｐＲｅｓプールをロードする。次にカラムを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４で洗浄し、次に５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）及び５０ｍＭトリス、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液Ｂ）のグラジエントで溶出させる。

２８０ｎｍＵＶ検出によって２．５ＡＵ／ｃｍ上昇で開始して４．５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで、生成物の収集を開始する。収集後、最終０．２μｍフィルタを持つフィルタ列に各サイクル液を通過させる。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２５にまとめる。

ナノろ過
ナノろ過を実施して、任意の潜在的に存在する可能性のあるウイルスをサイズを基準として除去する。ＥｓｈｍｕｎｏＣＰＸ溶出液を前置フィルタ（ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＰｒｅｆｉｌｔｅｒＰｏｄ、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通過させ、次に２０ｎｍ公称フィルタ（ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＰｒｏＭｏｄｕｓ、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通過させる。ロード前、このシステムをＷＦＩでフラッシュし、５０ｍＭトリス、２６５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化させる。ロードした後、このシステムを平衡化緩衝液でリンスしてシステムホールドアップを除去する。次にろ液を０．２μｍ膜に通過させた後、次のステップにかける。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２６にまとめる。

限外ろ過及びダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）
ＰｅｌｌｉｃｏｎＵｌｔｒａｃｅｌＤＳｃｒｅｅｎ再生セルロース３０ｋＤａ分子量カットオフ膜を使用して限外ろ過及びダイアフィルトレーションを実施する。このステップは、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを濃縮し、意図した濃度で最終的な製剤緩衝液中に交換した後、最終ろ過し、及び瓶充填する。システムは、初めに５０ｍＭトリス、２６５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化させて、次にウイルスろ液プールを５．０ｇ／Ｌの目標値に濃縮する。次に最低７ダイアボリュームの２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．５で緩衝液交換を実施する。ダイアフィルトレーション後、１１．０ｇ／Ｌを目標に２回目の濃縮を実施し、次に生成物を７．５ｇ／Ｌの最終保持液目標濃度にダイアフィルトレーション緩衝液で希釈する。

２０ｍＭクエン酸塩、１８％（ｗ／ｖ）スクロース、３％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．５ストック溶液を、原薬中２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の最終濃度を目標としてＵＦ／ＤＦプールにスパイクする。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２７にまとめる。

原薬のろ過、瓶充填、及び保存
製剤化されたＵＦ／ＤＦ保持液を０．２μｍ膜でろ過し、最終的な原薬保存容器、ポリプロピレン製の蓋付きの２Ｌポリカーボネートボトル（ＮａｌｇｅｎｅＢｉｏｔａｉｎｅｒ）に入れる。ろ過は、ＩＳＯ５／グレードＡエリアで実施する。ろ過後、各ボトルを無菌的に抜取り検査し、表示を付し、－６５℃以下で凍結する。工程パラメータ範囲及び工程内検査を表２８にまとめる。

実施例２３：ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの製剤化、包装、及び保存
製造ステップ及び工程内管理（ＩＰＣ）を指示するＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ薬物製品製造工程フロー図を図３２に示す。ろ過及び充填は、ＩＣＨガイドライン及び医薬品適正製造基準（ｃｕｒｒｅｎｔＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅｓ）に記載される適用規格に適合する無菌手順に従い実施する。

原薬の解凍
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ原薬（ＤＳ）は、暗所下２～８℃にて９６時間以下で解凍する。ＤＳの完全解凍は、ボトルの外観検査によって確認する。

目標バッチ容積の８０％への希釈
２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１％ポリソルベート８０（ｗ／ｖ）、ｐＨ６．０からなる緩衝液を１０Ｌガラスカーボイに調製する。固体クエン酸ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、スクロース、及びマンニトールは秤量し、ＷＦＩに加え、溶解するまで混合する。ポリソルベート８０ストック溶液は、ＷＦＩ中に調製して緩衝液に加える。緩衝液のｐＨを検査する（許容判定基準６．５±０．４）。緩衝液をＷＦＩで目標容積に希釈し、混合し、検査してｐＨ（６．５±０．４）及び重量オスモル濃度を確認し、０．２μｍ膜に通してろ過する。

原薬の重量を用いて目標バッチ容積を計算する。清浄な１０Ｌガラスカーボイ内の緩衝液に、計算したバッチ容積の約８０％となるように原薬を加え、混合する。この８０％薬物製品溶液をｐＨ（許容判定基準６．５±０．３）及びタンパク質濃度に関して２８０ｎｍの吸光度により１．４４Ｌ／（ｇ×ｃｍ）の消衰係数を用いて検査する。

緩衝液成分は、６．５のｐＨが生じるように設計する。ｐＨが緩衝液ステップ又は８０％バルク薬物製品段階のいずれにおいても許容判定基準に適合しない場合、ｐＨを許容判定基準の範囲内に至らせるため、１Ｎ水酸化ナトリウム又は１Ｎ塩酸による滴定を実施し得る。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの１ｍｇ／ｍＬへの希釈
前のステップから得られたタンパク質濃度を使用して、１ｍｇ／ｍＬのＤＦＨＩＬ１２－ＦＣＳＩ濃度に達するために必要な緩衝液の量を計算する。濃度は２８０ｎｍの吸光度によって確かめ（許容判定基準１．０±０．２ｍｇ／ｍＬ）、及び試料を採取してｐＨ（許容判定基準６．５±０．３）及び重量オスモル濃度を確認する。

バイオバーデン低減のため、化合物化したバルク薬物製品溶液を滅菌０．２μｍフィルタに通過させて清浄な１０Ｌガラスカーボイに入れ、滅菌ろ過及び充填まで保っておく。予備的ろ過用の試料のバイオバーデンは、１０Ｌガラスカーボイから除去する。

滅菌ろ過
各フィルタカプセルが０．４５μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）プレフィルター膜及び０．２μｍＰＥＳ滅菌膜からなる連続した２つのフィルタカプセルにバルク薬物製品を通すことにより、ろ過を行う。薬物製品をろ過し、充填特別室の制御下にあるグレードＢエリアにて滅菌ディスポーザブル充填バッグに入れる。両方の滅菌フィルタカプセルを完全性に関してろ過後の泡立ち点によって検査する（許容判定基準≧３２００ｍｂａｒ、ＷＦＩを使用）。

バイアルへの充填
バルク薬物製品溶液は、アクセス制限バリアシステム（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄａｃｃｅｓｓｂａｒｒｉｅｒｓｙｓｔｅｍ：ＲＡＢＳ）のすぐ外側にあるディスポーザブルバッグから充填する。この製品を、充填特別室の制御されたグレードＡＲＡＢＳエリア内で既製の２Ｒホウケイ酸Ｉ型バイアルに充填する。

バイアルを滅菌１３ｍｍゴムセラム栓で打栓し、１３ｍｍアルミシールを巻き締める。充填作業中にバッチの１００％の重量点検によってバイアルの充填容積を確かめる（許容判定基準１．３ｍＬ±５％）。充填後、バイアルを２～８℃の保存場所に移す。

目視検査、包装及び保存
充填したバイアルを、容器、蓋、及び製品の欠陥に関する１００％手動での目視検査と、続く合格品質限界検査（ＡＱＬ）にかける。検査済みのバイアルは、バルク包装し、出荷時まで２～８℃で保存する。

実施例２４：製剤分析
緩衝液分析
表２９に掲載する製剤を判定し、様々な緩衝液及びｐＨ条件がＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安定性に及ぼす効果について評価した。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを表２９に掲載される緩衝液中に１ｍｇ／ｍＬの目標タンパク質濃度となるように遠心限外ろ過装置（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－４３０ｋＭＷＣＯ）を使用して緩衝液交換した。最終回の緩衝液交換後、スポンサーが提供する消衰係数（１．４３ｍＬ／ｃｍ×ｍｇ）による紫外可視分光法を用いてタンパク質濃度を測定した。次に試料を３つの等しいサイズのアリコートに分割した。１つのアリコートは２～８℃で保存し、他の２つは５０℃で保存した。２～８℃で保存したアリコート及び５０℃のアリコートのうちの一方は、両方とも１週間の時点で取り出し、表３０に掲載されるとおりの検査にかけた。５０℃の他方のバイアルは２週間後に取り出し、－７５℃で保存した。

結果
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの試料を１２種の緩衝液／ｐＨ条件に緩衝液交換した。試料のｐＨ及び濃度を直ちに評価した。その後、試料をアリコートに分け、２～８℃及び５０℃で保存した。１週間インキュベートした後、次に表３０のアッセイパネルに従い試料を評価した。結果は、以下、及び図３４Ａ～図４２Ｂに示す。

外観（１週間インキュベーション）
試料を５℃又は５０℃でインキュベートしてから１週間後に、全ての試料の外観を評価した。試料は全て、無色の澄明な液体で、目に見える粒子状物質を含まなかった（図３５Ａ～図３５Ｂを参照）。

示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）（１週間インキュベーション）
ＤＳＦ実験は、ＵｎｃｈａｉｎｅｄＬａｂｓＵＮｃｌｅを使用して実施した。試料について、その熱安定性を判定した。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ熱アンフォールディング（Ｔ_ｍ）及び凝集の発生（Ｔ_ａｇｇ）を、それぞれ、固有のタンパク質蛍光及び静的光散乱（２６６ｎｍでのＳＬＳ）の温度の関数としての変化を判定することによりモニタした。試料はトリプリケートで判定し、トリプリケートの結果の平均を求めた。試料は０．５℃／分の定率線形ランプ速度で２５℃から９５℃までの温度ランプにわたって分析した。以下の表３３～表３６、及び図３６Ａ～図３７Ｄを参照のこと。

様々な緩衝液製剤中で、５℃及び５０℃で１週間インキュベートした後のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの濃度及びｐＨを評価した。表３７～表４０及び図３８Ａ～図３９Ｂを参照のこと。

動的光散乱法（ＤＬＳ）（１週間インキュベーション）
ＤＬＳ実験は、ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａサイザーを使用して実施した。各試料測定につき、５回の連続スキャンを２５℃で取得した。Ｚ平均流体力学直径及び多分散性指数（ＰＤＩ）をキュムラント解析及びストークス・アインシュタインの式から決定した。多分散性は、試料中の不均一性の尺度である。粒子径が均一でない場合、より高い多分散性が測定されることになる。低い多分散性指数（ＰＤＩ）（≦０．２００）は、その粒子の粒子径の均一性がより高いことを指し示している。表４１～表４２及び図４０Ａ～図４０Ｌを参照のこと。

サイズ排除クロマトグラフィー・高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）
ＳＥＣ実験は、ＴＯＳＯＨＧ３０００ＳＷｘｌ（７．８×３００ｍｍ）を使用して実施した。各試料につき９０μＬを注入して、９０μｇのカラムロードを実現した（１ｍｇ／ｍＬという低い濃度を考慮すると、１００μｇの目標カラムロードは実現不可能であった）。過去のデータが不足していることを考慮して、最も大きいピークを主ピークとして定義した。主ピークの前にあるピークを高分子量（ＨＭＷ）種として定義し、後ろにあるピークを低分子量（ＬＭＷ）種として定義した。表４３～表４４及び図４１を参照のこと。５℃で１週間のインキュベーションに関して試験した全ての条件について、主ピークの純度は９３％を超えた。

キャピラリー電気泳動・ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）（還元）
ＣＥ－ＳＤＳ実験は、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＰＡ８００＋キャピラリー電気泳動システムを使用して実施した。過去のデータが不足していることを考慮して、最も大きいピーク（ピーク７）を主ピークとして定義した。主ピークの前にあるピークをＬＭＷ種として定義し、後ろにあるピークをＨＭＷ種として定義した。表４５～表４６及び図４２を参照のこと。５℃で１週間のインキュベーションに関して試験した全ての条件について、主ピークの純度は４９％を超えた。

まとめ及び結論
全ての試料について、外観、ｐＨ、Ａ_２８０、ＤＬＳ、ＤＳＦ、ＳＥＣ、及びＣＥ－ＳＤＳにより分析した。外観及びｐＨによる判定では、様々な試料間に有意差は示されなかった。１週間のインキュベーション後に、全ての試料の濃度がやや低下した（０．１又は０．２ｍｇ／ｍＬの低下）。５℃で１週間のインキュベーション後のコハク酸塩試料（ｐＨ５．５及び６．５）の濃度は、（１．１ｍｇ／ｍＬから０．８ｍｇ／ｍＬへと）一層低下した。ＣＥ－ＳＤＳデータは、主ピーク純度の変動が最小限であることを示した（但しリン酸塩ｐＨ６．５緩衝液は例外で、これは５０℃で１週間のインキュベーション後に大幅に低い平均ピーク純度を有した）。

熱安定性データによれば、低ｐＨ（５．５）及びヒスチジン緩衝液は分子に悪影響を及ぼしたことが示された。クエン酸塩緩衝液（但しｐＨ５．５を除く）及びリン酸緩衝液は、（５℃及び５０℃の両方の１週間インキュベーション試料について）最も高い熱安定性を示した。

５℃で１週間のインキュベーション後の光散乱データによれば、クエン酸塩緩衝液試料（但しｐＨ５．５を除く）は、低い多分散性の最も小さい平均径を有したことが示された。リン酸塩及びコハク酸塩緩衝液も同様に、低い多分散性の小さい平均径を有した。５０℃で１週間のインキュベーション後、クエン酸塩緩衝液（但しｐＨ５．５を除く）、リン酸緩衝液（但しｐＨ６．５を除く）、及びコハク酸塩ｐＨ６．５緩衝液は、全てが小さい平均径を有した。

５℃で１週間のインキュベーション試料のＳＥＣデータは、主ピーク純度のばらつきが最小限であることを示した。５０℃で１週間のインキュベーション試料のＳＥＣデータは、５１．０％～９４．３％の範囲に及ぶ一層大きい変動程度を示した。最も望ましい緩衝液は、この場合もやはりクエン酸塩緩衝液（但しｐＨ５．５を除く）及びリン酸緩衝液であった。

クエン酸塩ｐＨ６．０緩衝液又はクエン酸塩ｐＨ７．０緩衝液の成績は、前掲に記載されたアッセイで試験されている代替的な緩衝液と比べて一層望ましいものであった。

賦形剤分析
表４７に掲載される製剤を判定し、２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．５中に緩衝したとき様々な賦形剤及び界面活性剤がＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの安定性に及ぼす効果を評価した。遠心限外ろ過装置（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５３０ｋＭＷＣＯ）を使用して、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを１ｍｇ／ｍＬ又は１０ｍｇ／ｍＬのいずれかの目標タンパク質濃度となるように表４７に掲載される緩衝液中に緩衝液交換した。最終回の緩衝液交換後、スポンサーが提供する消衰係数（１．４３ｍＬ／ｃｍ×ｍｇ）による紫外可視分光法（ＵＶ－Ｖｉｓ）を用いてタンパク質濃度を測定した。次に、Ｄｕｒａｐｏｒｅメンブレン（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＵＦＣ４０ＧＶ０Ｓ）を備えた０．２２μｍＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅＵｌｔｒａｆｒｅｅ－ＣＬ遠心フィルタ装置を使用して試料を滅菌ろ過した。滅菌ろ過後、各製剤は層流フードにて無菌的にハンドリングした。表４７に指定されるとおりの、製剤化された試料は、最終濃度０．０１％のポリソルベート８０（ＰＳ８０）でスパイクするか、又は界面活性剤でスパイクしないかのいずれかとした。次に試料を６つの等しいサイズのアリコートに分割した。２つのアリコートは２～８℃で保存し、３つは５０℃で保存し、及び最後のアリコートは５回の凍結融解サイクルを受けた。凍結融解アリコートについて、試料は－７５±１０℃で少なくとも１時間凍結して室温で解凍し、氷がないことを目視で確認した。２～８℃で保存した両方のアリコートとも、２週間で取り出した。一方のアリコートは試験に使用し、他方のアリコートは－７５±１０℃で凍結した。５０℃の単一のアリコートは２週間で試験のため取り出した。５０℃の他の２つのアリコートは３週間で取り出し、－７５±１０℃で凍結した（表４８に示される）。検査パネルを表４９に示す。高精度液体粒子カウント（ＨＩＡＣ）による粒子状物質の判定もまた実行して、界面活性剤を判定した。

結果
ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの試料を１４製剤中に緩衝液交換した。試料のｐＨ及び濃度を直ちに評価した。その後、試料をアリコートに分け、２～８℃、５０℃で保存するか、又は５回の凍結融解サイクルにかけた。２週間のインキュベーション後、次に表４９のアッセイパネルに従い試料を評価した。未試験の試料を取り出し、概要を先述したとおり凍結した。

表５０及び図４３Ａ～図４３Ｂは、ＵＶ－Ｖｉｓ濃度決定（ゼロ時点及び２週間試料）を示す。

表５１は、ゼロ時点及び２週間試料のｐＨ決定を示す。

外観（２週間試料）
試料は全て、無色の澄明な液体であった。表５２に概略を示すとおり、一部の試料に粒子状物質が認められた。

示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）（１週間試料）
ＤＳＦ実験は、ＵｎｃｈａｉｎｅｄＬａｂｓＵＮｃｌｅを使用して実施した。試料について、その熱安定性を判定した。ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ熱アンフォールディング（Ｔ_ｍ）及び凝集の発生（Ｔ_ａｇｇ）を、それぞれ、固有のタンパク質蛍光及び静的光散乱（２６６ｎｍでのＳＬＳ）の温度の関数としての変化を判定することによりモニタした。試料はトリプリケートで判定し、トリプリケートの結果の平均を求めた。試料は０．５℃／分の定率線形ランプ速度で２５℃から９５℃までの温度ランプにわたって分析した。結果を表５３及び図４４Ａ～図４６Ｆに示す。

動的光散乱法（ＤＬＳ）（２週間試料）
ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａサイザーを使用してＤＬＳ実験を実施した。各試料測定につき、５回の連続スキャンを２５℃で取得した。Ｚ平均流体力学直径及び多分散性指数をキュムラント解析及びストークス・アインシュタインの式から決定した。多分散性は、試料中の不均一性の尺度である。粒子径が均一でない場合、より高い多分散性が測定されることになる。低い多分散性（≦０．２００）は、その粒子の粒子径の均一性がより高いことを指し示している。結果を表５４～表６２及び図４７Ａ～図４８Ｈに示す。

サイズ排除クロマトグラフィー－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）（２週間試料）
ＳＥＣ実験は、ＴＯＳＯＨＧ３０００ＳＷｘｌ（７．８×３００ｍｍ）を使用して実施した。１ｍｇ／ｍＬ試料にニートを９０μＬで注射して、９０μｇのカラムロードを実現した（１ｍｇ／ｍＬという低い濃度を考慮すると、１００μｇの目標カラムロードは実現不可能であった）。１０ｍｇ／ｍＬ試料にニートを１０μＬで注射して、１００μｇのカラムロードを実現した。主ピークは、ピーク面積が最も大きいピークとして定義し、これは全試料で保持時間と一致した。主ピークの前に溶出するピークを高分子量（ＨＭＷ）種として定義し、後に溶出するピークを低分子量（ＬＭＷ）種として定義した。ドラフト法のＬＯＱを総ピーク面積の０．１％ピーク面積として定義した。

ＨＩＡＣ（２週間試料）
粒子状物質実験は、ＨＩＡＣ９７０３＋を使用して実施した。この分析のため、０．１ｍＬの試料で機器の風袋を測った後に、０．３ｍＬの試料容積を判定した。各ランの間に、機器を水で洗浄した。試料に加えて、緩衝液及び出発材料を分析し、有意な数の粒子がないことを示した。結果を表６６～表６９に示す。

まとめ及び結論
全ての試料について、外観（２週間）、ｐＨ（緩衝液交換及び２週間）、Ａ２８０（緩衝液交換及び２週間）、ＤＬＳ（２週間）、ＤＳＦ（１週間）、ＳＥＣ（２週間）、及びＨＩＡＣ（２週間）により分析した。

大多数の試料の濃度は、緩衝液交換の終わりに目標濃度から１０％以内であった。両方の試料Ｅ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、ｐＨ６．５）及びＦ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０ｐＨ６．５）とも、緩衝液交換の終わりに０．８９ｍｇ／ｍＬの濃度を有した。それぞれの条件（２～８℃、５０℃）でのインキュベーションの終わりに、判定した１４製剤中１０製剤が、その出発濃度と整合する濃度を有した。製剤Ａ（２０ｍＭクエン酸塩、８％スクロース、ｐＨ６．５）、Ｂ（２０ｍＭクエン酸塩、８％スクロース、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５）、Ｅ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、ｐＨ６．５）、及びＦ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０）についての３つの試料は全て、０．８７ｍｇ／ｍＬ～０．７９ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度を有した。

ｐＨによる判定は、様々な試料間で有意差を示さなかった。

外観による判定では、試料の色及び澄明度に有意差は見られなかった。ほとんどの試料は、外観に基づけば、目に見える粒子状物質を含まなかった。製剤Ａの５０℃試料（２０ｍＭクエン酸塩、８％スクロース、ｐＨ６．５）、製剤Ｄの凍結融解試料（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、ｐＨ６．５）、製剤Ｉの凍結融解試料（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、ｐＨ６．５）、及び製剤Ｌの凍結融解試料（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、２％マンニトール、ｐＨ６．５）は全て、幾らかの小さく丸い目に見える粒子状物質を有した。製剤Ｈの凍結融解試料（２０ｍＭクエン酸塩、２％マンニトール、ｐＨ６．５）は、多数の小さく丸い目に見える粒子状物質を有した。注目すべきことに、これら４つ全ての製剤が界面活性剤（０．０１％Ｐ８０）を欠いていた。

緩衝液交換した後（２～８℃で１週間保存した後）の残りの材料の示差走査型蛍光定量法による判定によれば、製剤Ｅ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、ｐＨ６．５）及びＩ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、ｐＨ６．５）が１ｍｇ／ｍＬ試料について最も高いＴ_ｍ１を有した一方、製剤Ｇ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｋ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０ｐＨ６．５、１０ｍｇ／ｍＬ）、及びＮ（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、２％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５、１０ｍｇ／ｍＬ）が１０ｍｇ／ｍＬ試料について最も高いＴ_ｍ１を有したことが示された。製剤Ｉ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、ｐＨ６．５）、Ｊ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５）、及びＬ（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、２％マンニトール、ｐＨ６．５）は、１ｍｇ／ｍＬ試料について最も高いＴ_ｍ２を有し、製剤Ｋ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５、１０ｍｇ／ｍＬ）は、１０ｍｇ／ｍＬ試料について最も高いＴ_ｍ２を有した。製剤Ｆ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０）は、他の１ｍｇ／ｍＬ試料と比べて大幅に高いＴ_ａｇｇを有した。１０ｍｇ／ｍＬ試料は、Ｔ_ａｇｇに関して一貫していた。全体的に見て、全ての試料が、６６℃を超えるＴ_ｍ１値を実証した。

２週間材料のＳＥＣ－ＨＰＬＣによる判定によれば、２～８℃試料並びに凍結融解試料間の変動は最小限であることが示された。１ｍｇ／ｍＬ５０℃試料の％Ｍａｉｎは、６８．８％～８８．９％の範囲であった。製剤Ｄ（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、ｐＨ６．５）、Ｅ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、ｐＨ６．５）、Ｉ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、ｐＨ６．５）、及びＪ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５）は全て、８０％を上回る％Ｍａｉｎを有した。１０ｍｇ／ｍＬ５０℃試料の％Ｍａｉｎは、５７．４％～７６．５％の範囲であった。製剤Ｃ（２０ｍＭクエン酸塩、８％スクロース、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５、１０ｍｇ／ｍＬ）、Ｎ（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、２％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５、１０ｍｇ／ｍＬ）は、７０％を上回る％Ｍａｉｎを有した一方、製剤Ｋ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５、１０ｍｇ／ｍＬ）は、５７．４％の最も低い％Ｍａｉｎを有した。

光散乱データによれば、製剤Ｉ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、ｐＨ６．５）及びＪ（２０ｍＭクエン酸塩、６％スクロース、１％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５）が、概して、３つの試験した条件について最も小さい平均径並びに最も小さいモノマー径を有したことが示された。１ｍｇ／ｍＬ試料の一部（製剤Ａ、Ｂ、Ｉ、Ｊ、Ｌ、及びＭ）では、スクロース及びマンニトールからのものである可能性が高い小さい種が検出された。これらの小さい種は、１０ｍｇ／ｍＬ試料では検出されておらず、濃度が高くなることによってかき消された可能性が高い。自動分析に起因して、この種の存在により試料の多分散性に関する結論が複雑になった。平均径に関しては、製剤Ｉ及びＪが、３つの条件の各々について、一貫して１ｍｇ／ｍＬ試料のほとんどよりも小さい平均径を有した。製剤Ｉ及びＪはまた、２～８℃条件並びに５０℃条件について、１ｍｇ／ｍＬ試料のほとんどより小さいモノマー径も有した。製剤Ｄ（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、ｐＨ６．５）、Ｅ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、ｐＨ６．５）、Ｆ（２０ｍＭクエン酸塩、６％マンニトール、０．０１％ＰＳ８０）、及びＨ（２０ｍＭクエン酸塩、２％マンニトール、ｐＨ６．５）は、凍結融解条件について、残りの１ｍｇ／ｍＬ試料よりも小さいモノマー径を有した。１０ｍｇ／ｍＬ試料について、全ての試料が、３つの試験した条件全てで概ね一貫していた。１０ｍｇ／ｍＬ５０℃試料は、両方の平均径並びにモノマー径の認め得る増加を示した。幾つもの試料において、第２の種が検出され（２００ｄ．ｎｍ～１２００ｄ．ｎｍ）、大多数の試料において第３の種が検出された（１５００ｄ．ｎｍ～５５００ｄ．ｎｍ）。これらの大型の種は、３つの条件のいずれにおいても、主に１ｍｇ／ｍＬ試料に検出された。

ＨＩＡＣによる判定は、概ね外観データを裏付けた。製剤Ａの５０℃試料（２０ｍＭクエン酸塩、８％スクロース、ｐＨ６．５）、製剤Ｄの凍結融解試料（２０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、ｐＨ６．５）、及び製剤Ｈの凍結融解試料（２０ｍＭクエン酸塩、２％マンニトール、ｐＨ６．５）は全て、一層多い≧２μｍ粒子カウント、≧５μｍ粒子カウント、及び≧１０μｍ粒子カウントを有した。これら３つの試料を除いては、残りの試料は比較的一貫していた。いずれの試料も、ＵＳＰ＜７８７＞規格を超えなかった。

製剤Ｊ（２０ｍＭクエン酸塩、６％ｗ／ｖスクロース、１％ｗ／ｖマンニトール、０．０１％ＰＳ８０、ｐＨ６．５）の性能が、最も望ましいと決定された。この緩衝液／賦形剤／界面活性剤の組み合わせは、１０ｍｇ／ｍＬ（製剤Ｋ）の一層高い濃度では、５０℃で２週間のインキュベーション後に、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによれば、十分な性能を発揮しなかった。加えて、１ｍｇ／ｍＬ試料は、概して、１０ｍｇ／ｍＬ試料よりも良好な、又はそれと同程度に十分な性能を発揮した。

実施例２５：ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの薬物動態（ＰＫ）分析
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、有害作用を比例的に増加させることなくＩＬ１２の有効性を亢進させるように設計された一価ヒトＩＬ１２－Ｆｃ融合タンパク質である。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、ｒｈＩＬ１２と比較して実質的に長い半減期を有する。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの半減期が延長すると、頻回反復投与の必要がなくなり、結果として、毒性を引き起こすＩＬ１２曝露における反復的なスパイクがなくなることに伴い、薬力学的プロファイルが長く続くことが可能となる。マウスモデルでは、半減期が長くなると、大幅に高い抗腫瘍活性が低い投与頻度で可能となることから、３週間に１回（Ｑ３Ｗ）など、患者における頻度の低い投与が効果的であり、許容できる安全性プロファイルをもたらし得ることが示唆される。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与に最適なものとして、薬物動態（ＰＫ）プロファイルがより良好であって、投与後観察される最高血清濃度（Ｃ_ｍａｘ）での薬物濃度のスパイクが回避され、その結果、より良好な忍容性が得られ得るという理由で皮下（ＳＣ）経路を選択した。

インビトロ薬理
インビトロ結合特性
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、未変性ＩＬ１２及びヒトＩｇＧ１Ｆｃの、そのそれぞれの受容体、ＩＬ１２Ｒ及びＦｃＲｎに対する結合親和性を保持していた。対照的に、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分は、ＦｃγＲへの結合が無効となるように突然変異していた。

インビトロ細胞活性
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの効力をｒｈＩＬ１２の効力と比較するため、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）又は抗ＣＤ３抗体のいずれかで刺激したヒト初代免疫細胞からのＩＦＮγ産生をインビトロで分析した。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ及びｒｈＩＬ１２は両方とも、ＩＦＮγ産生アッセイ全体を通して一貫して同等の効力を呈し、ヒトＰＢＭＣ、単離されたヒトＴ細胞、又は単離されたヒトＮＫ細胞を活性化した。

臨床グレードのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを伴う刺激されていないヒトＰＢＭＣにて、別個のインビトロ試験を行い、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘導する潜在的能力を判定した。この試験では、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉのみが、予想された薬理と一致したＩＦＮγの用量依存的増加につながったが、判定した他の７つのサイトカインの分泌は誘導しなかった。

インビトロ種交差反応性
毒性試験に適切な種を判定するため、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉがマウス、ラット、及びカニクイザル免疫細胞からのＩＦＮγ放出を刺激するインビトロ活性を分析した。

以下に基づき、非臨床安全性試験を行うのに唯一の薬理的に関連性のある種としてカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を選択した：種間でのＩＬ１２のアミノ酸配列の比較；ヒトＰＢＭＣサブセット上の結合パターンと比較した、ＰＢＭＣにおけるカニクイザル免疫細胞サブセット上のＩＬ１２Ｒβ１発現と比べたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの結合パターン；及びヒトと比べたカニクイザル初代免疫細胞におけるＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉによるＩＦＮγ放出の刺激。

文献と一致して（ＳｃｈｏｅｎｈａｕｔＤＳ，ＣｈｕａＡＯ，ＷｏｌｉｔｚｋｙＡＧ，ＱｕｉｎｎＰＭ，ＤｗｙｅｒＣＭ，ＭｃＣｏｍａｓＷ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１４８（１１）：３４３３－４０）、ヒトＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉもｒｈＩＬ１２も、マウス脾細胞又はラットＰＢＭＣからのＩＦＮγ産生を亢進させなかった。

インビボ薬理
マウスにおけるインビボ薬理
ヒトＩＬ１２はマウス細胞において機能性でなかったため、ヒトＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ薬物候補を反映するサロゲートマウスＩＬ１２－Ｆｃを作成し、これにより同系マウスインビボ腫瘍モデルにおけるＰＫ／ＰＤプロファイル及び有効性の調査が可能となった。マウスＩＬ１２は、未変性ＩＬ１２を有するヒトで観察されるものと比較して、マウスに同様の発現パターン及び機能を有すると見なされる（Ｃａｒ１９９９）。

ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと称されるサロゲート分子は、マウスＩＬ１２を利用するものであり、ここではｐ３５及びｐ４０サブユニットを２つの異なるＦｃ変異体のＮ末端に融合した。マウスＩｇＧ２ａＦｃ断片は、ＦｃＲｎへの結合は保持しながらもＦｃγＲ結合を無効にするように突然変異させており（ＳｃｈｏｅｎｈａｕｔＤＳ，ＣｈｕａＡＯ，ＷｏｌｉｔｚｋｙＡＧ，ＱｕｉｎｎＰＭ，ＤｗｙｅｒＣＭ，ＭｃＣｏｍａｓＷ，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１４８（１１）：３４３３－４０）、これは、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに利用されるヒトＦｃ変異体（ヒトＩｇＧ１Ｆｃサイレント）に最も類似していることが分かっている。

ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのエキソビボでの生物学的効力
ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの効力（平均５０％有効濃度［ＥＣ_５０］＝２．０７±０．８ｐＭ）は、ｒｍＩＬ１２（平均ＥＣ５０＝０．６９±０．１４ｐＭ）と同等であった。ヒトＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ又はｒｈＩＬ１２のいずれによっても、マウス脾細胞からのＩＦＮγ産生は亢進しなかったことから、種交差反応性がないこが確認された。

ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのインビボ特性評価及び薬物動態
この分子の単回用量投与後に、ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＰＫ／ＰＤプロファイル及びバイオアベイラビリティを判定した。

ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、２９．８５時間という長く続く血清ｔ_１／２を実証し、これはｒｍＩＬ１２の約５倍長くなる（ｔ_１／２＝６．０５時間）。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのｔ_１／２がこのように５倍延長したことにより、媒介されるＩＦＮγ産生が約４０倍多くなり（投与時点から最後の観察時点までの濃度時間曲線下面積［ＡＵＣ_{０－２１９ｈ}］＝９１６，６５４ｈ・ｐｇ／ｍＬ）、これは、ｒｍＩＬ１２（ＡＵＣ_{０－２１９ｈ}＝２０，３０４ｈ・ｐｇ／ｍＬ）と比べたものと比較して、より耐久性のある、持続的なものであった。ＩＦＮγレベルは、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの単回用量後２００時間超にわたって上昇したままであり、ＩＦＮγ曝露のこの亢進は、ｒｍＩＬ１２群と等モル量でのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの投与によって起こったもので、これによりほぼ同じＣ_ｍａｘが生じた。

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのバイオアベイラビリティは、ＩＰ及びＳＣ投与したとき、それぞれ６６％及び３２％であった。７３％及び４４％（それぞれ、ＩＰ及びＳＣ）の同等のバイオアベイラビリティがＣ５７ＢＬ／６マウスで達成された。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して約４倍高いＩＦＮγ分泌が観察された（ＩＦＮγのＣ_ｍａｘは、Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、それぞれ約２５，０００及び約６，０００ｐｇ／ｍＬであった）。

重要なことに、ＰＤ応答は、血清ＩＦＮγレベルにより測定したとき、バイオアベイラビリティの違い及びＳＣ投与後に観察された低いＣ_ｍａｘにもかかわらず、投与経路と無関係に同程度であった。これらの結果から、ＳＣ経路によるＩＬ１２－Ｆｃフォーマットが、ＩＶ経路によるときの僅か１０分の１のＣ_ｍａｘへの曝露でありながら、完全なＰＤ有効性を実現可能であることが示唆される。幾らかのＩＬ１２毒性がＩＦＮγによって媒介されるため、従ってＩＶ又はＳＣ投与後に同程度であり得るが、他の副作用は、ＩＦＮγ非依存的であることが報告されており（ＬｅｏｎａｒｄＪＰ，ＳｈｅｒｍａｎＭＬ，ＦｉｓｈｅｒＧＬ，ＢｕｃｈａｎａｎＬＪ，ＬａｒｓｅｎＧ，ＡｔｋｉｎｓＭＢ，ｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０（７）：２５４１－８）、ＳＣ投与後は、ＩＬ１２Ｃ_ｍａｘが低いため、あまり顕著でない可能性がある。

要約すれば、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは、Ｃ５７ＢＬ／６及びＢＡＬＢ／ｃマウス系統においてＩＰ及びＳＣ投与したとき、好都合なバイオアベイラビリティと共に、ｒｍＩＬ１２と比較して長時間にわたる血清ｔ_１／２及びＩＦＮγ産生の延長を実証した。しかしながら、両方の投与経路とも、ＩＶ投与と同様に、同程度の血清ＩＦＮγレベルが生じ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスではＢＡＬＢ／ｃと比較して４倍高いＩＦＮγ分泌が観察された。

ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療指数
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおいて、ＩＬ１２変異体ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びｒｍＩＬ１２をそのＩＬ１２血清曝露レベル（ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ毎週及びｒｍＩＬ１２毎日）と適合するように投与し、ＰＤ応答、忍容性、及びインビボ有効性を分析することにより、ｒｍＩＬ１２と比較したＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉのベネフィット・リスクプロファイルを決定した。

ナイーブＣ５７ＢＬ／６においてｒｍＩＬ１２を反復ＳＣ投与すると、毎週注射したＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと比較して、６日以内に血清ＩＦＮγの著明な蓄積が生じた；ｒｍＩＬ１２治療動物のＡＵＣＩＦＮγは、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療マウスと比べて２．８～４．５倍に増加した。加えて、ｒｍＩＬ１２の後続用量によっては、ＩＦＮγ産生がほとんど又は全くかったことから、応答を制限する強力な負のフィードバックが示唆される。対照的に、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの毎週投与では、持続的な中程度のＩＦＮγ分泌が生じ、２回目の用量が初回用量と同様のＰＤプロファイルを実証した。更に、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、０．５又は１μｇｒｍＩＬ１２の毎日の投与は致死性となり、１週間の治療後に全てのマウスを安楽死させた。０．２５μｇｒｍＩＬ１２の毎日の投与（ＭＴＤ）は、１μｇｒｍＩＬ１２と等モルレベルで毎週投与するＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと比較すると、腫瘍進行の制御において効果が低かった。

これらの知見は、ｒｈＩＬ１２で実施された臨床試験で観察された毒性が、少なくとも一部には、頻回投与スケジュールの帰結であったことを裏付けている。

マウス腫瘍モデルにおけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ単独療法の有効性
インビボでのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ有効性の分析に、２つの異なるマウスモデル、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫（Ｃ５７ＢＬ／６に由来する）及びＣＴ２６－２０．７結腸癌（ＢＡＬＢ／ｃに由来する）を選択した。Ｂ１６Ｆ１０は「寒性」腫瘍モデルであり、これは、単剤としてのチェックポイント遮断に対して抵抗性で、且つ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を持つモノクローナル抗体に対して抵抗性であることが報告されている（ＭｏｓｅｌｙＳＩ，ＰｒｉｍｅＪＥ，ＳａｉｎｓｏｎＲＣ，ＫｏｏｐｍａｎｎＪＯ，ＷａｎｇＤＹ，ＧｒｅｅｎａｗａｌｔＤＭ，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＲｅｓ．２０１７；５（１）：２９－４１）。ＣＴ２６は、炎症性腫瘍微小環境を呈することが公知の、十分に特徴付けられている結腸癌モデルである。ＣＴ２６－２０．７は、親系統と同様の成長及び特性の、マウスＴｙｒｐ１トランス遺伝子を持つ、形質導入によって得られたＣＴ２６のサブ系統である。

薬理試験を行うことにより、（１）ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ及びｒｍＩＬ１２のインビボ活性を比較し；（２）樹立された大型８００ｍｍ^３腫瘍においてＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの用量反応及び頻度を評価し；（３）ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉのＩＰ及びＳＣ投与が同様の抗腫瘍応答を媒介するかどうかを決定し；及び（４）異なる投与頻度が腫瘍量に及ぼす影響を判定した。

ＣＴ２６結腸癌モデルにおけるＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの有効性
ＣＴ２６－２０．７腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、平均腫瘍容積（ＭＴＶ）が２７０ｍｍ^３に達した後、１μｇｒｍＩＬ１２と等モルの用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、又はｒｍＩＬ１２で毎週１回、５週間にわたってＩＰ治療した。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉで治療すると、抗腫瘍応答の増加が生じ（ｐ＜０．０００１）、ｒｍＩＬ１２治療群の１０％のＣＲと比較して、１００％の完全奏効（ＣＲ）が得られた。

ＣＴ２６－２０．７腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスでＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ用量レベル及び頻度を調べたところ、単回用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉが１００％の奏効率を誘導したことが観察された。全てのマウスがＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ治療に応答したが、応答は耐久性が低く、腫瘍の２０％が後の段階で進行した。マウスに毎週１回、２週間にわたって投与したときも同様の結果が得られた。

可能性のある用量－効果を調べたところ、１又は０．１μｇで治療された群間において抗腫瘍効果の有意な（ｐ＜０．０５）用量依存的タイトレーションが明らかになった；しかしながら、１０分の１のＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ用量濃度（０．１μｇ）で治療したマウスの８０％が治療に応答し、生存は長時間にわたった。

更に、平均腫瘍容積が２３０ｍｍ^３の腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを異なる経路（ＩＰ又はＳＣ）によってＱＷで７週間、１μｇｒｍＩＬ１２と等モルの用量で投与したところ、ＣＴ２６－２０．７腫瘍に対する同様の抗腫瘍有効性が観察された（図１９Ａ～図１９Ｂ）。これらの知見は既発表のデータと一致していることから、ＩＦＮγが抗腫瘍有効性の主要なメディエーターであることが指摘され、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによるこれらの試験は、ＩＶ、ＩＰ又はＳＣ投与後に、これらの様々な経路に伴いＣ_ｍａｘが異なるにもかかわらず、同程度のレベルのＩＦＮγを実証した。

ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ単独療法が大型の末期腫瘍に対して有効な免疫応答を誘導することができたかどうかを分析するため、ＣＴ２６－２０．７腫瘍担持マウスを接種後、腫瘍容積が平均８１５ｍｍ^３に達した後に１８日間治療した。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを毎週１回、１又は２μｇのｒｍＩＬ１２と等モルの用量レベルで７週間ＳＣ投与するか、又は２μｇと等モルを１回投与した。大型の腫瘍容積を持つこのモデルでは、強力な抗腫瘍応答を誘導するのに単回用量の２μｇＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉが十分であり、ＣＲ率は８０％であった。更に、１又は２μｇのいずれかを毎週投与すると、腫瘍コントロールが維持され、ＣＲ率は１００％（１μｇ毎週）又は９０％（２μｇ毎週）になった。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉは良好に忍容され、大型腫瘍の退縮を媒介した一方で、臨床所見又は体重に対する効果はなかった。

Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおけるＰＤ１遮断とのＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ組み合わせ療法の有効性
ＰＤ１遮断は、樹立Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に対して有効性がほとんど又は全くないことが公知である（Ｍｏｓｅｌｙ２０１７）。２つの試験においてＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルでＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉとＰＤ１遮断との組み合わせ療法を実施して、抗腫瘍免疫応答が増幅され得るかどうかを分析した。平均腫瘍容積が約２１５ｍｍ^３又は約２００ｍｍ^３（それぞれ、試験１及び試験２）に達した時点で、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉ又は抗ＰＤ１によって単剤として、及び組み合わせでＣ５７ＢＬ／６マウスを治療した。腫瘍担持マウスに、０．５μｇのｒｍＩＬ１２と等モルの用量のＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉＩＰ（試験１においてＱＷで８週間）又はＳＣ（試験２においてＱＷで７週間）を投与し、抗ＰＤ１は、２００μｇで毎週２回、ＩＰ投与した（１９又は１３用量にわたって毎週２回、それぞれ試験１又は２において）。

ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを単独で投与すると、腫瘍退縮が遅れた一方、ＰＤ１遮断と組み合わせると、抗腫瘍応答の持続時間が更に延長した。生存は、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－ＦｃｓｉをＰＤ１遮断と組み合わせると、いずれかの単独療法で観察されるものと比較して延長した。相乗的な有効性にもかかわらず、ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと抗ＰＤ１との組み合わせ療法のレジメンは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスによって良好に忍容されるように見えた。ＤＦ－ｍＩＬ－１２－Ｆｃｓｉと抗ＰＤ１とを組み合わせることによる相加的又は相乗的毒性の徴候はなく、臨床所見又は体重への効果のいずれもなかった。

サルにおけるインビボ薬理
非臨床毒性試験においてカニクイザルでＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉをＩＶ投与（１．９～４０μｇ／ｋｇ）又はＳＣ投与（１～２０μｇ／ｋｇ）した。投与後、ＰＤマーカーＩＦＮγ及びインターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ－１０）の実質的な二次ピークが続いて起こり、これは用量依存的であった。

非ＧＬＰ及びＧＬＰ試験では、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉで治療したサルは、概して用量依存的なＩＦＮγの増加を実証し、ピークレベルは投与後４８～７２時間に起こった。ＩＰ１０もまた同様に増加した。等モル用量レベルのｒｈＩＬ－１２及びＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉとの一対一非ＧＬＰ比較では、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、概してＩＦＮγの大幅な増加を引き起こし、これはｒｈＩＬ１２によって生じたＩＦＮγ応答よりも長く続いた。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉでは、投与後１２０～１６８時間経ってもなお検出可能なＩＦＮγ応答が生じた一方、モル当量ｒｈＩＬ１２ＩＦＮγは同様の時点でベースラインに戻っていた。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉのより耐久性の高いＩＦＮγ応答は、ｒｈＩＬ１２と比較してＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの長時間にわたるｔ_１／２に起因する可能性が最も高い。ＩＰ１０は、ｒｈＩＬ１２との非ＧＬＰ一対一比較では評価しなかった。

ＧＬＰ試験では、ピークＩＦＮγレベルは、≧８μｇ／ｋｇＳＣ及び１２μｇ／ｋｇＩＶで概して同程度であったが、一部の個別の動物について群内でばらつきがあった。反復投与後にＩＦＮγ及びＩＰ１０応答の幾らかの減弱が観察されたが、このＧＬＰ試験の一部のサルは、１回目及び２回目の用量に対して有意なＩＦＮγ応答を実証した。このＧＬＰ試験において３回目の用量後、減弱又は可能性のある抗薬物抗体（ＡＤＡ）の影響のいずれかに起因して、ＩＦＮγの増加は最小限しかなく、乃至全くなかった。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの３回目の用量後のＩＰ１０応答は、ＩＦＮγ応答よりも一層顕著であったが、これはＩＰ１０のｔ_１／２がより長いことを反映している可能性がある。

副次的薬理
ＦｃγＲへの結合
ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉがＦｃγＲに結合する潜在的能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により判定した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）８ＫＳＰＲシステムを使用して、部位特異的ビオチン化によってチップ上に捕捉されたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉによる組換えヒト（ＣＤ６４、ＣＤ３２ａＨ１３１及びＲ１３１アレル、ＣＤ１６ａＶ１５８及びＦ１５８アレル、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ｂ）及びカニクイザル（ＣＤ６４及びＣＤ１６）受容体への結合を判定した。十分に確立されたＩｇＧ１バイオ医薬品であるトラスツズマブをアイソタイプ特異的実験対照薬として使用した。データの定性的評価から、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、試験したＦｃγＲのいずれに対しても、有意味な結合を実証しなかったと結論付けられた。対照的に、同じ受容体特異的な、生理学的に関連性のある濃度でのＩｇＧ１対照トラスツズマブのタイトレーションは、予想どおり、全ＦｃγＲにわたって最大限の範囲の用量依存的結合を実証した。

更に、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する古典的補体カスケードの成分であるＣ１ｑに結合することが公知である（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ２０００）。ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉがＣＤＣを引き出さないことを確認するため、ＰＨＡで３日間刺激したヒトＰＢＭＣを０．０８２３～２０ｎＭの範囲のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの存在下で５％ヒト補体血清とインキュベートした。血清を加えてもＣＤＣは惹起されなかった。対照的に、抗ＭＨＣ１抗体（陽性対照として使用した）は、補体血清依存的なＴ細胞死滅を誘導した。

ＩＦＮγ分泌のサロゲートとしてのＣ反応性タンパク質
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、重症感染症を有する疑いがある患者をモニタするために使用される炎症初期段階のマーカーである。ＣＲＰレベルの増加は、カニクイザル試験において、その半減期の短さ故に臨床バイオマーカーとして使用するにははるかに難易度が高いＩＦＮγの分泌測定のサロゲートとして使用される。これらの試験に基づけば、ＣＲＰの測定値は、臨床セッティングにおけるＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＰＤ活性の検出に一層信頼性の高いバイオマーカーに相当する。

ＦｃＲｎへの結合
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉがカニクイザル及びヒトＦｃＲｎに結合する潜在的能力を判定すると、予想どおり、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓｍｏｎｋｅｙ）ＦｃＲｎ結合はＦｃγＲサイレンシング突然変異の影響を受けなかったことが示された。ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉとＩｇＧ１アイソタイプ対照トラスツズマブとは、ｐＨ６．０におけるカニクイザル及びヒトＦｃＲｎについて、それらの結合親和性値の点で同等であった（１．５倍未満の差）。同じく、両方の分子とも、ｐＨ７．４で試験した濃度で定量化可能な結合を欠いている点でも同様であった。

安全性薬理
安全性薬理評価項目（例えば、サイトカイン評価、体温、呼吸数、血圧、心拍数、ＥＣＧ評価、及びＦＯＢ評価）をカニクイザルにおけるＧＬＰ３週間反復用量毒性試験に取り込んだ。

ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉをサルにＱＷで３週間、最高２０μｇ／ｋｇでＳＣ投与するか、又は１２μｇ／ｋｇでＩＶ投与した後、体温、血圧、又は中枢神経系（ＦＯＢ評価により測定したとき）、呼吸器系（呼吸数により測定したとき）、又は心血管系（ＥＣＧ及び心拍数により測定したとき）に関してＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ関連効果はなかった。

このＧＬＰ３週間反復用量毒性試験では、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与後にＩＦＮγ及びＩＰ１０がロバストに増加したが、これは、その予想される薬理と一致している。また、一部のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ治療サルにおいては、ＩＬ－６の散発的な最小限の増加もあった。サルにおける非ＧＬＰ試験では、予想されたＩＦＮγ及びＩＰ１０の増加に加えて、ＩＬ６、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、及び胸腺及び活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ）の最小限の主として一過性の増加もあった一方、測定された他のサイトカインに影響はなかった。サルにおけるこれらのインビボ結果は、ＩＦＮγの濃度依存的増加のみが観測された未刺激のヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン放出アッセイのインビトロ結果と一致しており、及び他のサイトカインに影響はなかった。従って、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、ＣＲＳについての潜在的能力は低いが、選ばれたサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＰ－１０）は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの予想される薬理が理由で増加するものと予想される。

動物における薬物動態及び薬物代謝
概要
４件の非ＧＬＰ毒性試験及び１件のＧＬＰ毒性試験において、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの毒物動態の（ＴＫ）プロファイルについて、カニクイザルへの単回、反復、及び／又はクロスオーバーＳＣ（２１～２０μｇ／ｋｇ）及びＩＶ（１．９～４０μｇ／ｋｇ）投与後に調査した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（各ＩＬ１２サブユニットを検出することによりＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＩＬ－１２ｐ７０を測定する）及びＭＳＤ（ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＩＬ１２ｐ４０及びＦｃを測定する）の両方によって得られたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ濃度を使用して血漿ＴＫを判定した。適格とされるＥＬＩＳＡ方法から導き出されたデータが、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの曝露量評価に好ましい供給源であった。抗薬物抗体（ＡＤＡ）方法もまた開発して、ＳＣ投与後のカニクイザル血清中の抗ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ抗体を検出した；この方法は、ＧＬＰ３週間毒性試験における使用がバリデートされた。

ＳＣ又はＩＶ投与後のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの優勢なＴＫプロファイルを用量非依存的（線形）反応速度論によって特徴付けたが、非ＧＬＰ試験における小動物数及びＡＤＡが、観察されるばらつきに寄与した可能性がある。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの血漿ＴＫに、全体的に見て性別に関連する差があるようには見えなかった。

非ＧＬＰ試験では、ＥＬＩＳＡデータに基づけば、ＳＣ投与後、バイオアベイラビリティは約６０％であった。推定ｔ_１／２は、４件の非ＧＬＰ試験で単回又は反復ＳＣ投与後に個別の動物間で１２．４～５６．４時間の範囲にわたった。ｔ_ｍａｘは、ＳＣ投与後に個別の動物間で４～３６時間の範囲にわたり、最も一般的には投与後８時間であった。推定ｔ_１／２は、ＩＶ投与後に個別の動物間で１６．２～８２．４時間の範囲にわたり、ｔ_ｍａｘは、投与後０．２５～１時間の範囲にわたった。

このＧＬＰ毒性試験では、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＴＫプロファイルを確認した。一般に、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ平均Ｃ_ｍａｘ、投与時点から投与後２４時間までの濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ_０－２４）、及びＡＵＣ_{０－１６８}値の性別に関連する差は、２倍未満であった。ＳＣ投与後、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ平均Ｃ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{０－１６８}によって評価したときの曝露量は、概して、４μｇ／ｋｇＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉからの用量レベルの増加に伴い増加した。平均Ｃ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{０－１６８}の増加は用量比例的であった。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの複数回用量後のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの蓄積は観察されなかった。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの皮下バイオアベイラビリティは約４０％であった。ＳＣ投与についての平均ｔ_１／２は、１及び１５日目に１７．５～３５．８時間の範囲であった一方、ＩＶ投与についての平均ｔ_１／２は、１日目に２２．２時間及び１５日目に４５．３時間であった。

サルにおける単回用量非ＧＬＰＳＣ試験では、８日目までにＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに対するＡＤＡが実証され、最長２２日目までＡＤＡが生じた；しかしながら、全体的なＡＤＡ力価は比較的低いままであり、低い陽性対照に近い値であったことが確認された。別の非ＧＬＰ試験では、初回ＳＣ用量と、続くＩＶ用量は、ＡＤＡによって説明し得る予想を下回るＩＶ曝露量プロファイルを実証したが、力価は測定しなかった。全体的に見て、非ＧＬＰ試験からのデータは、サルにおけるＳＣ経路では、同様にＧＬＰ試験で確認されたＩＶ経路と比べて、一層ＡＤＡを発生し易い傾向があり得ることを示唆している。例えば、２０μｇ／ｋｇＳＣの１０匹中９匹のサル及び１２μｇ／ｋｇＩＶの１０匹中３匹のサルでは、このＧＬＰ試験において１５日目までにＡＤＡが生じた。確認されたＡＤＡ試料の大多数は、３回目の用量よりも前の１５日目に見られ、一部の動物では最高濃度（Ｃ_ｍａｘ）が影響を受けたことから、中和抗体の存在が示唆される。非ＧＬＰ試験及びＧＬＰ試験の両方でＡＤＡは個別のサルの曝露量に影響を与えたが、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの毒性学プロファイルを確信をもって定義するのに十分に長い期間にわたって好適な曝露量が実現していた。しかしながら、サルにおけるＡＤＡには、ヒトにおける免疫原性の予測性はない。このような理由で、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ－００１ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）試験にて、この試験全体を通じた抗ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ抗体の血清力価が判定されることになる。

加えて、ＩＦＮγ応答により測定したときのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに対する薬理応答について、個別の動物間にばらつきがあり、明らかな性別に関連する差はなかったが、耐用量を比較すると、何らかの用量依存性が示された。ピークＩＦＮγ応答は、非ＧＬＰ及びＧＬＰ試験における動物間で投与後３～５日の範囲にわたった。ＧＬＰ試験では、ＩＦＮγ応答は反復投与に伴い減弱したが、動物のごく一部は、１回目及び２回目の両方の用量後にＩＦＮγ応答を実証した。加えて、１回目及び３回目の用量後にＩＰ－１０の用量依存的増加が検出可能であったが、減弱を伴った。投与経路は、ピーク薬理応答のタイミングに影響を与えないように見えた。

代謝及び排泄を判定する試験について、こうした試験は、小分子薬物に関してはルーチンで行われるが、モノクローナル抗体などの生物製剤には必要でない、又は有用でないと考えられるため、行わなかった。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ、ＩＬ１２－Ｆｃ融合タンパク質がシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素によって代謝されると考える理由はないため、薬物間相互作用（ＤＤＩ）の判定に特化した試験は行っていない。従って、ＣＹＰ酵素を阻害し又は誘導する小分子がＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＰＫに影響を与え得る見込みはあまりなく、ひいては、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉについてのＰＫＤＤＩの可能性は低いと見なされる。

吸収及び薬物動態
単回用量薬物動態
単回用量又は反復用量毒性試験の一環としての単回用量のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与後の曝露量は、急性毒性評価に関する情報を与えるものである。全試験で見て、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、単回ＳＣ用量として最大２０μｇ／ｋｇまで忍容された。単回用量ＩＶ最大耐用量（ＭＴＤ）は、雌で≦１９μｇ／ｋｇ及び雄で≦２０μｇ／ｋｇであり；単回ＩＶ用量は、雌又は雄で、それぞれ≧２０又は≧４０μｇ／ｋｇであったため、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ投与の８日後に早期安楽死となった。

１日目曝露量（Ｃ_ｍａｘ及び投与時点から試料の定量化が可能な最終回の時点までの濃度時間曲線下面積［ＡＵＣ_０－ｔ］により測定したとき）、並びに単回用量及び反復用量毒性試験から入手されたＥＬＩＳＡデータから導き出したｔ_ｍａｘ及びｔ_１／２を表７０にまとめる。

単回用量投与後の全毒性試験間での急性毒性及び曝露量の比較
反復用量毒性試験における初回第１回目の用量の投与後の忍容性評価及び曝露量は、急性毒性評価に関する情報を与えるものである（試験ＴＤ３６ＭＭ、ＱＷ５６ＬＨ、ＤＱ８１ＧＸ、及びＮＦ３７ＤＶ）。単回用量ＩＶＭＴＤは、雌で≦１９μｇ／ｋｇ及び雄で≦２０μｇ／ｋｇ；単回ＩＶ用量は、雌又は雄で、それぞれ≧２０又は≧４０μｇ／ｋｇであったため、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ投与の８日後に早期安楽死となった（試験ＤＱ８１ＧＸ）。１９及び２０μｇ／ｋｇＩＶでの曝露量は、同様のＩＦＮγ薬理と重なり合ったことから、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ治療に応答した免疫系の動物間変動が示唆され、これが忍容性の差につながった可能性がある。これは、標的器官としての免疫系の公知の変動と一致している（ＢｒｏｄｉｎＰ，ＤａｖｉｓＭＭ．，ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．２０１７；１７（１）：２１－９）。

反復用量薬物動態
クロスオーバー計画によるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの反復皮下／静脈内投与後の毒物動態（試験ＴＤ３６ＭＭ及びＤＸ８１ＧＸ）
非ＧＬＰ試験（試験ＴＤ３６ＭＭ）では、カニクイザルにＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを、最初にＳＣ投与し、次にＩＶ投与し、各用量後には１４日のウォッシュアウト期間を置いて、ＴＫ用の試料を投与後３３６時間にわたって収集した。

ＳＣ投与後、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉへの雄サル及び雌サルの両方の全身曝露は、４～８μｇ／ｋｇの用量範囲で用量非依存的（線形）反応速度によって特徴付けられるように見えた。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉへの全身曝露は、雄と比べて雌でやや高い傾向があった。

過去にＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉをＳＣ経路によって受けたことがあるサルへのＩＶ投与後、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉへの雄及び雌サルの全身曝露は、２～４μｇ／ｋｇの用量範囲の用量依存的（非線形）反応速度によって特徴付けられるように見え、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの用量を２μｇ／ｋｇを上回って増加させると、雄では線形関係から予測したよりも全身曝露量が低くなるが、雌では全身曝露量が高くなるというものであった。これらの結果は、ＩＶ用量が投与される前の２例の雄及び１例の雌におけるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに対するＡＤＡの産生と一致していると言える。結果的に、ＩＶ投与後の結果は、慎重に解釈しなければならない。

ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＳＣバイオアベイラビリティは、６０％～７０％であるように見えた（４例の動物に基づく）；しかしながら、異常に高いバイオアベイラビリティ推定値（ここに提示する範囲からは除外した）が一部の動物で観察され、それがＩＶ投与後の曝露量に影響を及ぼすＡＤＡの産生と一致したが、この試験ではＡＤＡは測定されなかったことに留意しなければならない。

別の非ＧＬＰ試験では（ＤＱ８１ＧＸ）、カニクイザルにＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを初めにＩＶボーラスで投与して、次にＳＣ投与し、用量間には１４日のウォッシュアウト期間を置いた。別の動物群は、ｒｈＩＬ１２を同じ投与経路及び頻度で受けて、比較を可能にした。投与後２４０時間にわたってＴＫ分析用の血液試料を入手した。血漿ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの濃度及びｒｈＩＬ１２を、適格とされるＥＬＩＳＡ方法（ＩＬ１２のｐ７０を標的とする［即ち、ｒｈＩＬ１２及びＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを測定する］）及びＭＳＤ方法（ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉのｐ４０及びＦｃを標的とする［即ち、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを測定し、ｒｈＩＬ１２を測定しない］）によって測定した。ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＩＶ投与後に観察された毒性が理由で、ＳＣ投与のＴＫプロファイルは、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ（男性のみ）及びｒｈＩＬ１２についてのみ特徴付けた。

ＭＳＤ方法によって測定したとき（予想されるとおり、ＥＬＩＳＡ方法はＩＬ１２ヘテロ二量体を検出することを考慮する）、ＩＶ投与後の血漿ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの濃度は、より低かった。このＭＳＤデータから導き出されたＣ_ｍａｘ値は、ＥＬＩＳＡ方法から導き出されたものよりも約５４％低く、ＡＵＣ_０－ｔ値は、雄ではＥＬＩＳＡ方法から導き出されたものと同程度であり、雌では１８％高かった。雌サルにおけるＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＡＵＣ_０－ｔ値は、ＥＬＩＳＡ方法を用いて測定したときＩＶ投与後の雄でのものと同程度であったが、ＭＳＤ方法によって測定したとき、やや高かった。ＡＵＣ_０－ｔとＩＶ投与後用量レベルとの間の関係（ＥＬＩＳＡデータに基づく）は、曝露量が、２０～４０μｇ／ｋｇの用量範囲では、用量比例的な増加よりもやや大きく増加したことを指示している。ＩＶ投与後のｔ_ｍａｘは、予想されたとおり、投与後０．２５時間（最初の試料採取時点）であった一方、ＳＣ投与後のｔ_ｍａｘは、個別の動物間で４～２４時間の範囲にわたった。

ｔ_１／２は、２０又は４０μｇ／ｋｇでのＩＶ投与後は極めて幅広く異なったが（個別の動物間で１６．２～８２．４時間の範囲にわたった）、ＳＣ投与後は１例の動物についてのみ適切な推定が可能であった（ＥＬＩＳＡデータに基づけば１４．９時間及びＭＳＤデータに基づけば６２．０時間）。２０μｇ／ｋｇでのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの皮下バイオアベイラビリティは、ばらつきがあるように見え、平均値はＥＬＩＳＡデータに基づけば５３．５％（３８．８％～６８．２％の範囲）及びＭＳＤ結果に基づけば８９．０％（６２．８％～１１５．３％の範囲）であった。

ＩＶ投与後、雌サルのｒｈＩＬ１２のＣ_ｍａｘ値及びＡＵＣ_０－ｔ値は雄のものと同程度であった；しかしながら、ＳＣ投与後、Ｃ_ｍａｘ値及びＡＵＣ_０－ｔ値は雄のものよりも低かった。ＩＶ投与後のｔ_ｍａｘもまた、投与後０．２５時間であった一方、ＳＣ投与後、ｔ_ｍａｘは投与後８時間であった。ｔ_１／２は、ＩＶ投与後は個別の動物間で９．１～１７．５時間の範囲にわたり、ＳＣ投与後は１８．９～２２．９時間の範囲にわたった。１０μｇ／ｋｇにおけるｒｈＩＬ１２の皮下バイオアベイラビリティは、雄で約３１％及び雌で１８％であった（全体では１８．０％～３５．２％の範囲）。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの反復静脈内投与後の毒物動態（試験ＱＷ５６ＬＨ）
非ＧＬＰ試験において、１及び８日目にカニクイザルにＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ、又はｒｈＩＬ１２をＩＶボーラスで投与し、投与後１６８時間にわたってＴＫ用の試料を収集した。適格とされるＥＬＩＳＡ方法（ＩＬ１２のｐ７０を標的とする［即ち、ｒｈＩＬ１２及びＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを測定する］）及びＭＳＤ方法（ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉのｐ４０及びＦｃを標的とする［即ち、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを測定し、ｒｈＩＬ１２を測定しない］）の両方によって血漿濃度を測定した。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの反復ＩＶボーラス投与後、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの蓄積はなかった。ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＡＵＣ_{０－１６８}は、雄では１及び８日目に１．９～１９μｇ／ｋｇの用量範囲にわたってほぼ用量比例的に増加したが、雌では用量比例的増加よりも大きく増加する傾向があった。１９μｇ／ｋｇでは、雌のＡＵＣ_{０－１６８}は、線形関係から予測されるものよりも約１．８倍高かった。雌のＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＡＵＣ_{０－１６８}は、概して雄のものと同程度であったが、ＭＳＤデータから導き出された雌ＡＵＣ_{０－１６８}は、１日目及び８日目の両方で、１．９μｇ／ｋｇの雄のものよりも低いように見えた。

終末ｔ_１／２は、全ての動物について適切に推定することができなかったが、推定することが可能であった場合、それは１７．４～３０．５時間の範囲にわたり、概して用量及び性別に依存しないように見えた。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの血漿クリアランスは低く、分布容積は血液量（７３．４ｍＬ／ｋｇ）よりもやや低く、且つ体内総水分量（６９３ｍＬ／ｋｇ）よりもかなり低かった（ＤａｖｉｅｓＢ，ＭｏｒｒｉｓＴ．，ＰｈａｒｍＲｅｓ．１９９３；１０（７）：１０９３－５）。

ｒｈＩＬ１２の反復ＩＶボーラス投与後、ｒｈＩＬ１２の蓄積はなかった。ｒｈＩＬ１２のＡＵＣ_{０－１６８}は、概して、１及び８日目に１～１０μｇ／ｋｇの用量範囲にわたってほぼ用量比例的に増加したが、１日目に雄では用量比例的増加よりも大きく増加する傾向があった。１０μｇ／ｋｇでは、１日目の雄ＡＵＣ_{０－１６８}は、線形関係から予測されるものよりも約１．８倍高かった。ｒｈＩＬ１２への全身曝露について雄及び雌で差はないように見えた。終末ｔ_１／２（７．２～１７．０時間）は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉよりも短かく、血漿クリアランスは低く、及び分布容積は血液量と同程度であり、且つ体内総水分量よりもかなり低かった。

ｒｈＩＬ１２の半減期がＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉと比較して短いというのは、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉで観察されるより高い（約４．５倍～７．４倍）ＡＵＣ_{０－１６８}を説明している。

一般に、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ平均Ｃ_ｍａｘ、ＡＵＣ_０－２４、及びＡＵＣ_{０－１６８}値の性別に関連する差は、２倍未満であった。ＳＣ投与後、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ平均Ｃ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{０－１６８}によって評価したときの曝露量は、概して、４μｇ／ｋｇＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉからの用量レベルの増加に伴い増加した。平均Ｃ_ｍａｘ及びＡＵＣ_{０－１６８}の増加は用量比例的であった。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの複数回用量後のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの蓄積は、サルでは観察されなかった。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの皮下バイオアベイラビリティは約４０％であった。ＳＣ投与についての平均ｔ_１／２は、１及び１５日目に１７．５～３５．８時間の範囲であった一方、ＩＶ投与についての平均ｔ_１／２は、１日目に２２．２時間及び１５日目に４５．３時間であった。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに対するＡＤＡ誘導の発生率は、０μｇ／ｋｇで０％（１０例中０）、４μｇ／ｋｇＳＣで３３％（６例中２）、８μｇ／ｋｇＳＣで８０％（１０例中８）、２０μｇ／ｋｇＳＣで９０％（１０例中９）、及び１２μｇ／ｋｇＩＶで３０％（１０例中３）であった。１５日目のＡＤＡ陽性動物における血漿ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの濃度は、ＡＤＡ陰性動物と比べると全体的に低かったが、概してなおも定量化可能であった。ＡＤＡの効果にはばらつきがあり、ＡＤＡ陽性動物の血漿濃度は、ある場合にはＡＤＡ陰性動物と同程度であるものから、他の場合にはそれより著しく低いものまでの範囲にわたった。しかしながら、これは、一般に、ＡＤＡ陽性動物は１５日目にもＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉになおも曝露されていることを示している。従って、投与期間のほとんどにわたって適切な曝露量があったとおり、ＡＤＡは毒性試験の解釈に悪影響を与えなかった。

バイオアベイラビリティ
非ＧＬＰ試験ＴＤ３６ＭＭ及びＤＱ８１ＧＸにおけるカニクイザルでのＳＣ投与後、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、概して約６０％のバイオアベイラビリティを実証したが、幾らかの変動が観察された。確認されていないが、試験ＴＤ３６ＭＭにおいてＡＤＡの発生は２回目のＩＶ用量に影響を与えたかもしれず、それが続いてバイオアベイラビリティの計算に影響を与えた可能性があると考えられる；従って、全動物の総平均バイオアベイラビリティを考えるとき、これらの値は除外した。表７２は、これらの試験の範囲内における全動物のバイオアベイラビリティを提示する。

ＧＬＰ試験ＮＦ３７ＤＶでは、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＳＣバイオアベイラビリティは、ＡＵＣ_{０－１６８}に基づけば、個別の雄及び雌動物で１８．２％～５２．８％の範囲であり、４、８、及び２０μｇ／ｋｇＳＣの初回用量後の平均値は、それぞれ３５．４％、３５．１％及び３８．２％であった。

分布
定常状態分布容積（Ｖ_ｓｓ）は、非ＧＬＰ試験、試験ＱＷ５６ＬＨにおいてのみ計算することができた。平均Ｖ_ｓｓは、１回目のＩＶ用量後に３７．６ｍＬ／ｋｇ及び２回目のＩＶ用量後に４７．５５ｍＬ／ｋｇであった。サルにおける後続の非ＧＬＰ試験では、静脈内注入後の終末相の特徴付けが不十分であったため、Ｖ_ｓｓは計算することができなかった。

ＧＬＰ試験では、平均Ｖ_ｓｓは、１回目のＩＶ用量後に雄及び雌でそれぞれ９１．９及び７１．１ｍＬ／ｋｇであり、全１０動物の総平均Ｖ_ｓｓは８１．５ｍＬ／ｋｇであった。１５日目、平均Ｖ_ｓｓは、判定した雄（ｎ＝２）で１０７ｍＬ／ｋｇ、及び単一の雌で１０８ｍＬ／ｋｇであり、これらの３動物の総平均Ｖ_ｓｓは１０８ｍＬ／ｋｇであった。

代謝
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの代謝試験は行っていない。小分子薬物に関してルーチンで行われている標準的な代謝試験は、抗体などの生物製剤には必要でない、又は有用でないと考えられる。

排泄
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの排泄試験は行っていない。小分子薬物に関してルーチンで行われている標標準的な排出試験は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉなどの生物製剤には必要でない、又は有用でないと考えられる。

薬物間相互作用
現在までのところ、薬物間相互作用（ＤＤＩ）試験は実施していない。サイトカイン調節薬として作用するサイトカイン又はモノクローナル抗体などの治療用タンパク質は、特異的サイトカインｐ４５０（ＣＹＰ）酵素及び薬物輸送体の発現及び安定性に影響を与えることによって小分子薬物と相互作用を呈するものと思われる（ＨｕａｎｇＳＭ，ＺｈａｏＨ，ＬｅｅＪＩ，ＲｅｙｎｏｌｄｓＫ，ＺｈａｎｇＬ，ＴｅｍｐｌｅＲ，ｅｔａｌ．，ＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ．２０１０；８７（４）：４９７－５０３）。サイトカインの中でも、ＩＬ６は、ＣＹＰ発現を下方制御することが公知である。モデル化によれば、ＩＬ－６は投与後約４８時間の時点でＣＹＰ３Ａ４の固有クリアランスを２８％低減する可能性があることが示される（ＸｕＹ，ＨｉｊａｚｉＹ，ＷｏｌｆＡ，ＷｕＢ，ＳｕｎＹＮ，ＺｈｕＭ．，ＣＰＴＰｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃｓＳｙｓｔＰｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；４（９）：５０７－１５）。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、サルにおいて耐用量でＩＬ６の最小限の散発的な増加を誘導した。ＣＹＰ酵素はデノボ合成されること（２４～３６時間のｔ_１／２）及びＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉによるＩＬ６サイトカインスパイクの持続期間が一過性であることを考慮すれば、ＤＤＩのリスクは重大でないと考えられる。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ、ＩＬ１２－Ｆｃ融合タンパク質がＣＹＰ酵素によって代謝されると考えられる理由はないため、ＣＹＰ酵素を阻害又は誘導する小分子がＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＰＫに影響を与える可能性があるとは考えにくい。これらの考察に基づき、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉについてＰＫＤＤＩの可能性は低いと見なされる。

免疫原性
サルにおける単回用量毒性試験では、１２例中７例の治療済み動物が、抗薬物抗体（ＡＤＡ）に関して陽性であることが分かった。加えて、ＡＤＡは判定しなかったが、カニクイザルでの４週間反復用量試験におけるＴＫのばらつき及び異常に高いバイオアベイラビリティ推定値は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに対するＡＤＡの産生と一致しているものと考えられた。非ＧＬＰ試験及びＧＬＰ試験の両方でＡＤＡは個別のサルの曝露量に影響を与えたが、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの毒性学プロファイルを確信をもって定義するのに十分に長い期間にわたって好適な曝露量が実現していた。サルにおけるＡＤＡには、ヒトにおける免疫原性の予測性はない。このような理由で、抗ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ抗体の血清力価は、臨床試験で判定することになる。

実施例２６：ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを使用した癌の治療
目的
本臨床試験は、以下のフェーズで設計する：第１相、第１ｂ相、及び第２相。

第１相の主要目的は、単独療法としてのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性及び忍容性を評価すること、及び進行（切除不能、再発性又は転移性）固形腫瘍を有する患者におけるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することである。

第１ｂ相の主要目的は、ペンブロリズマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性及び忍容性を評価すること、及び進行（切除不能、再発性、又は転移性）固形腫瘍を有する患者におけるペンブロリズマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することである。

第２相の主要目的は、単独療法としての又は組み合わせでのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの臨床活性を試験する全ての有効性拡大コホートについて、独立評価項目レビュー委員会（ＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＥｎｄｐｏｉｎｔＲｅｖｉｅｗＣｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＥＲＣ）による固形癌効果判定基準（ＲｅｓｐｏｎｓｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎＣｒｉｔｅｒｉａｉｎＳｏｌｉｄＴｕｍｏｒｓ）第１．１版（ＲＥＣＩＳＴ１．１）に基づき客観的奏効率（ＯＲＲ）を評価することである。

単独療法としての及びペンブロリズマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉによる第１相及び第１ｂ相の副次的目的は、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＰＫを特徴付けること；ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの免疫原性を判定すること、及びその曝露量と臨床活性とを相関付けること；治験責任医師によりＲＥＣＩＳＴ１．１を使用してＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに関して決定されるとおりの、最良総合効果（ＢＯＲ）を評価すること；ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの奏効期間（ＤＯＲ）を評価すること；ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに関する無増悪生存（ＰＦＳ）を評価すること；及び全生存（ＯＳ）期間を評価することである。

単独療法としての及びペンブロリズマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉによる第２相の副次的目的は、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＰＫを特徴付けること；ＩＥＲＣに従いＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの奏効期間（ＤＯＲ）を評価すること；ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用してＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの臨床的有用率（ＣＢＲ）を評価すること。ＣＢＲは、最良効果として完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、又は病勢安定（ＳＤ）である患者の割合として定義される；ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性を評価すること；ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの免疫原性を判定すること、及び曝露量及び臨床活性と相関付けること；ＩＥＲＣに従いＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに関する無増悪生存（ＰＦＳ）を評価すること；及び全生存（ＯＳ）期間を評価することである。

探索的目的
単独療法としての及びペンブロリズマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの両方による探索的目的は、腫瘍及び末梢バイオマーカーのベースラインからの変化、及びＰＫとの関係を判定すること；ペンブロリズマブのＰＫを評価すること（第１ｂ相及びコホート２Ｃのみ）；治験責任医師評価（ＲＥＣＩＳＴによるＯＲＲ、ＤＯＲ、ＣＢＲ、及びＢＯＲ）に従い有効性拡大コホートパート（第２相）におけるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの活性を判定すること；及び腫瘍及び末梢バイオマーカーと、腫瘍応答率との間の関連性を判定することである。

試験デザイン概要
本試験は、単独療法としての及びペンブロリズマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性、忍容性、ＰＫ、薬力学、及び予備的な抗腫瘍活性を決定するように設計される第１／２相非盲検用量漸増試験と、続く並行群間有効性拡大試験である。試験デザインの概略図を図５１Ａ（単独療法について）及び図５１Ｂ（ペンブロリズマブとの組み合わせ療法について）に示す。

本試験は３パートからなる：第１相：３＋３デザインを用いた単独療法としての用量漸増、第１相コホート拡大を伴う；第１ｂ相：３＋３デザインを用いたペンブロリズマブとの組み合わせとしての用量漸増、第１ｂ相コホート拡大を伴う；及び第２相：群逐次デザインを用いた有効性拡大。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、以下の適応疾患において有効性拡大コホートで単独療法として判定する：コホート２Ａ：進行（切除不能又は転移性）黒色腫；及びコホート２Ｂ：進行（切除不能又は転移性）腎細胞癌（ＲＣＣ）

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、以下の適応疾患において有効性拡大コホートでペンブロリズマブと組み合わせて判定する：コホートＣ：進行（切除不能又は転移性）尿路上皮癌

各試験フェーズにおいて、患者はＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与を３週間毎（Ｑ３Ｗ）に１日目に受ける。患者は、病勢進行（ＰＤ）の確認、許容できない毒性（即ち、用量制限毒性［ＤＬＴ］）、又は本試験若しくは治験薬（ＩＭＰ）から離脱する何らかの理由が発生するまでＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与を受ける。

第１相用量漸増ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ単独療法
本試験の第１相用量漸増フェーズは、標準的な３＋３デザインを用いて単独療法としてのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの用量制限毒性（ＤＬＴ）及び最大耐用量（ＭＴＤ）を決定するようにデザインされる。

次の用量レベル（ＤＬ）に漸増するかの判断は、ＤＬＴが理由でない限り、サイクル２、１日目（Ｃ２Ｄ１）までのコホートの全ての患者に対する安全性評価の実施が終わった後の安全性評価に基づく。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性を評価するため、用量漸増判断について責任を負う安全性監視委員会（ＳＭＣ）が設立される。

用量レベル「ｎ」の安全性が確立された後、ＳＭＣは、第１相拡大コホートにおいて当該のＤＬに最大１０例の患者の登録を許可する選択権を有する；この手順によって３０例以下の患者を登録することができる。

ＭＴＤは、６例の評価可能な患者のうち１例以上の患者にＤＬＴが認められるときの最も高いＤＬとして定義される。

第１ｂ相：ペンブロリズマブとの組み合わせとしての用量漸増
本試験の第１ｂ相用量漸増フェーズは、第１相について記載されるとおり、標準的な３＋３デザインを用いて、ペンブロリズマブとの組み合わせを所与としたときのＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＤＬＴ及びＭＴＤを決定するようにデザインされる。

ペンブロリズマブは、その米国添付文書に従い３週間毎に１回（各サイクルの１日目に）投与される。ペンブロリズマブの投与は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与よりも前に行われる。

ペンブロリズマブと組み合わせて試験されるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ用量レベルは、単独療法として試験されるレベルと同じである。

第１ｂ相は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ単独療法によって以下の判定基準のいずれかが満たされた後に開始する：ＤＬＴ観察期間中に発生するいずれかの用量レベルでグレード２薬物関連毒性が発生する；ＭＴＤとして確定されない用量レベルでＤＬＴが発生する；及び用量漸増が完了し、ＭＴＤが確定されていない。

これらの判定基準のうちの１つが満たされた後、上記の判定基準のいずれかを満たした用量レベルよりも２つ低い用量レベルの用量のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを使用して第１ｂ相（ペンブロリズマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ）を開始するか、又は判定基準のいずれかがＤＬ１又はＤＬ２で満たされる場合、ＤＬ１の安全性が確立された後に（ＤＬ２で治療した３例の患者又はＤＬ１で治療した６例の患者によって確定され、ＤＬ１で観察されるＤＬＴが１例を超えない）、組み合わせの開始用量はＤＬ１とする。

用量レベル「ｎ」の安全性が確立された後、ＳＭＣは、第１ｂ相拡大コホートにおいて当該の用量レベルに最大１０例の患者の登録を許可する選択権を有する；この手順によって３０例以下の患者を登録することができる。

第２相有効性拡大
推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ）で以下の腫瘍型を登録する：
単独療法として：コホート２Ａ：進行（切除不能又は転移性）黒色腫；及びコホート２Ｂ：進行（切除不能又は転移性）腎細胞癌。

ペンブロリズマブとの組み合わせで：コホート２Ｃ：進行（切除不能又は転移性）尿路上皮癌。

組み入れ基準及び除外基準
試験登録時の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥａｓｔｅｒｎＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＯｎｃｏｌｏｇｙＧｒｏｕｐ：ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスが０又は１であり、且つ推定平均余命が少なくとも３ヵ月の年齢１８歳以上の男性又は女性患者を登録する。

各試験フェーズ／コホートにおける主要組入れ基準は、以下のとおりである：
第１／１ｂ相における用量漸増コホート：疾患の臨床的又は放射線学的エビデンス
第１／１ｂ相における用量拡大コホートは、以下の腫瘍型：黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はトリプルネガティブ乳癌のうちの１つを有し；固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）、第１．１版を使用して治験責任医師によって決定されるとき、測定可能な疾患を有する。

コホート２Ａ
進行性黒色腫を有する患者であって、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）抗体による治療を少なくとも６週間受けた；抗ＰＤ－１の投与が行われる一方で、ＰＤの初回診断の少なくとも４週間後にＰＤの確認を有する患者。ＰＤの確認は、放射線学的又は臨床的所見に基づき得る；腫瘍がＢＲＡＦ活性化変異を持ち、及び最終ラインの治療後に進行した場合、ＢＲＡＦ阻害薬を受けていなければならない。

コホート２Ｂ
進行ＲＣＣを有する患者であって、任意の明細胞成分を有する；抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗血管内皮成長因子療法による治療を単独療法として又は組み合わせで受けた；過去に３ライン以下の療法を受けた患者

コホート２Ｃ
進行尿路上皮癌を有する患者であって、組織学的又は細胞学的に確認された局所進行又は転移性尿路移行上皮癌（腎盂、尿管、尿路上皮、尿道を含む）を有する；手術不能、局所進行又は転移性尿路上皮癌に対する１つの（及び１つを超えない）白金含有レジメン（例えば、白金＋別の薬剤、例えば、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン等）を受けたことがあり、Ｘ線所見進行を伴うか、又は補助療法としての白金含有レジメンの最終回投与後６ヵ月以内の再発を伴う（これらが伴えば、第一選択の白金含有レジメンの失敗と見なされることになり得る）；転移性疾患の治療に対する２ラインを超えない療法（白金含有レジメンを含む）を受けたことがある；チェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）による治療（即ち、単独療法としての、又は白金系化学療法との組み合わせでの抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１を受けたことがない患者。

用量／投与様式／投薬スケジュール
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、皮下（ＳＣ）注射としてＱ３Ｗで（即ち、各サイクルの１日目に）投与される。患者は薬物ＳＣの投与を最大２ヵ所の注射部位に１ｍＬを超えない容積で受ける。２回目の投与は、該当する場合、１回目の投与の完了後１０分以内に完了される。

第１／１ｂ相では、患者はＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの１回目の投与後に一晩入院する。

ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉＤＬ（μｇ／ｋｇ）は、以下の表７３にあるとおりである。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの用量は、ベースライン時の患者の体重を基準に計算する。患者の計算された用量は、その最後の用量計算時点から患者の体重が１０％以上変化した場合に限り再計算される。

探索的バイオマーカー
末梢バイオマーカー
末梢バイオマーカーは、全ての患者において、細胞パラメータ：フローサイトメトリーによる免疫表現型タイピング（ＩＰＴ）用の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）；可溶性因子：血清試料中のサイトカイン及びケモカイン；エキソビボＩＬ１２応答アッセイ：エキソビボ刺激と、続くＩＦＮγ産生分析用のＰＢＭＣ；循環腫瘍（ｃｔ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含めた末梢で評価する。

ＩＰＴ評価は、以下の試験来院：Ｃ１Ｄ３、Ｃ１Ｄ８、Ｃ２Ｄ８、及びＣ３Ｄ３の各々において、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉＣ１～Ｃ３の投与の２時間前に採取される全血試料に由来するＰＢＭＣで実施する。

可溶性因子は、各治療サイクルのＤ１、並びにＣ１Ｄ２、Ｃ１Ｄ３、Ｃ１Ｄ５、Ｃ１Ｄ８、Ｃ１Ｄ１５、Ｃ２Ｄ３、Ｃ３Ｄ３、及びＣ４Ｄ３、並びにＥＯＴ及びＳＦＵ来院時に、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ投与前２時間以内に採取した血清試料中で決定する。

腫瘍材料に関する全ての評価を完了するため、血液（例えば、全血、血漿、及び血清試料）を患者から採取する。

腫瘍組織に由来するバイオマーカー
用量漸増フェーズ（任意生検）、第１／１ｂ相拡大コホートパート（必須生検）、及び第２相有効性拡大コホートフェーズ（必須生検）に参加している患者の治療前生検及び治療生検に関して組織由来バイオマーカーを判定する。

保管されている腫瘍組織（又は利用可能な場合、新鮮腫瘍生検）、全血、及び血清試料から、ベースライン時に分子、可溶性及び細胞マーカーを含む推定マーカーのパネルを分析して、臨床的有効性と分析したマーカーとの間の可能性のある相関を調べる。

用量漸増フェーズに登録している患者については、市販のキット（ＤａｋｏＰＤ－Ｌ１ＩＨＣ２２Ｃ３ｐｈａｒｍＤｘ）を使用してＰＤ－Ｌ１発現レベルを決定し、ＣＤ３陽性（Ｔ細胞浸潤）の分析を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって実施する。

第１／１ｂ相拡大コホート及び有効性拡大コホートに登録している患者については、スクリーニング時（即ち、１回目の試験薬物用量前３０日以内）及び治療期間中の予め指定された時点で新鮮必須腫瘍生検を実施する。

評価される他のバイオマーカーとしては、以下が挙げられる：腫瘍浸潤白血球の頻度及び局在（例えば、ＩＨＣ又はＩＦによるＣＤ８、ＣＤ４Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、マクロファージ［Ｍ１／２プロファイル］）、遺伝子発現プロファイル、及びファーマコゲノミクス（ＰＧｘ）。

参照療法：用量／投与様式／投薬スケジュール
第１ｂ相及びコホート２Ｃでは、ペンブロリズマブは、米国添付文書に従い２００ｍｇの用量で静脈内（ＩＶ）注入により３週間に１回投与される。ペンブロリズマブの投与は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与よりも前に行われる。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、ペンブロリズマブの投与の完了後１時間以内に投与される。

患者毎に計画される治療期間
病勢進行（ＰＤ）若しくは許容できない毒性の発生、又は本試験若しくはＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉからの任意の離脱基準が起こるまで、患者は試験治療を受ける。

確認された完全奏効（ＣＲ）が得られた患者はいずれも、治験責任医師の裁量により、打ち切り基準を満たさない限り、確認後少なくとも１２ヵ月間治療する。治験責任医師が、かかる患者は１２ヵ月を超えて治療から利益を受け得ると考える場合、治験依頼者メディカルモニターとの協議を経て、治療を継続することが許容されてもよい。最大治療期間は２４ヵ月である。

統計的方法（標本サイズ計算を含む）
本試験の評価可能な患者数を用量漸増「３＋３」デザイン及び拡大コホートサイズから導き出した。最終的な標本サイズは、判定するＤＬの総数、該当する場合に、ＤＬＴ判定用の患者の入れ替え、及びＤＬＴが認められた場合の３例から６例の患者への拡大に応じて異なり得る。

拡大時の急速な募集によってＩＭＰの供給に影響が出た場合、２４時間前までに治験責任医師に通知があれば、任意のコホートの新規患者のスクリーニングを一時的に中断し得る。

最終的な標本サイズは、判定するＤＬの総数、該当する場合に、ＤＬＴ判定用の患者の補充、及びＤＬＴが認められた場合の３例から６例への患者の拡大に応じて異なり得る。

単独療法としての有効性拡大（コホート２Ａ及び２Ｂ）
このフェーズの主要評価項目は、ＯＲＲである。これらのコホートの各々について、帰無仮説は、客観的奏効率（ＯＲＲ）が５％を超えない（Ｈ０：ＯＲＲ＜５％）というものであり、対立仮説は、ＯＲＲが１０％より高い（Ｈ１：ＯＲＲ≧５％）というものである。

単独療法としてのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの目標ＯＲＲは２０％である。これらのコホートの各々について４０例の患者（即ち、合計約８０例の患者）を登録することが予想される。

指示コホートの各々に４０例の患者を含む群逐次デザインを用いると、この有効性コホートは、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉについて２０％の目標ＯＲＲと仮定すれば、片側の全体の第１種の過誤率０．０２５で１５％の差を検出するために約９０％の試験検出力を提供する。

コホート２Ａ及び２Ｂの各々について、ラン・ドメッツ（Ｌａｎ－ＤｅＭｅｔｓ）のオブライエン・フレミング境界を用いる無益性中間解析を５０％情報分数で（即ち、約２０例の患者で）計画する。

２０例の患者が３ヵ月フォローアップを完了した時点、又は本試験から離脱した時点で、登録した患者のうち、ＲＥＣＩＳＴ１．１に基づく未確認のＰＲ又はＣＲのＢＯＲを実現した者がいなかった場合には、無益性についての登録は中止してもよい。試験終了時、少なくとも５例の患者が、ＲＥＣＩＳＴ１．１に基づく確認されたＰＲ又はＣＲのＢＯＲを実現した場合には、コホートは成功が宣言される。

ペンブロリズマブとの組み合わせでの有効性拡大（コホート２Ｃ）
ペンブロリズマブとの組み合わせでの有効性拡大についての第２相部分では、１ラインの白金系化学療法後に進行したＵＢＣ患者における組み合わせでのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの臨床活性が決定される。

主要評価項目はＯＲＲである。本試験には４０例の患者が登録し、そのため４０例の患者中１５の奏効例（ＣＲ又はＰＲ）が観測されれば、９５％ＣＩ（０．２３１７；０．５４１９）につながることになり、これは、ＫＥＹＮＯＴＥ－０４５に登録した同様の集団でペンブロリズマブについて報告されている奏効例の割合の値を除外する。その試験では、ＯＲＲは２１．７％であった（ＢｅｌｌｍｕｎｔＪ，ｄｅＷｉｔＲ，ＶａｕｇｈｎＤＪ，ＦｒａｄｅｔＹ，ＬｅｅＪＬ，ＦｏｎｇＬ，ｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．２０１７；３７６（１１）：１０１５－１０２６．）。

最低でも４週間の計量を用いてＳＤを定量化し、ＣＲ、ＰＲ又はＰＤを確認する。ＤＯＲは、ＣＲ又はＰＲの最初の観察と病勢進行との間の時間から定義される。ＰＦＳは、ＲＥＣＩＳＴ１．１に基づき定義され、試験治療の最初の投与から、病勢進行の最初の観察又は死亡のうちいずれか早くが起こるまでと定義される。ＯＳは、試験治療の最初の投与から死亡までとして定義される。

安全性分析は、記述統計学的表現により、コホート別に、及び／又は全コホートにわたってまとめられる。

実施例２７：単回用量のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを使用した癌の治療
本試験の主要目的は、単回用量で投与したときの単独療法としてのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性及び忍容性を評価すること、及び進行（切除不能、再発性又は転移性）固形腫瘍を有する患者におけるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することである。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、皮下（ＳＣ）注射として単回用量で投与される。患者は薬物ＳＣの投与を最大２ヵ所の注射部位に１ｍＬを超えない容積で受ける。２回目の投与は、該当する場合、１回目の投与の完了後１０分以内に完了される。患者は単回用量のＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉのみを受ける。

実施例２８：ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを使用した癌の治療
これは、安全性、忍容性（ｔｏｌｅｒａｔｂｉｌｉｔｙ）、ＰＫ、薬力学、及び単独療法としての及びペンブロリズマブと組み合わせたＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの予備的抗腫瘍活性を決定するように設計された、連続的な並行群間有効性拡大試験を伴う第１／２相非盲検用量漸増試験である。

本試験は３パートからなる：第１相：３＋３デザインを用いた単独療法としての用量漸増、第１相コホート拡大を伴う；第１ｂ相：３＋３デザインを用いたペンブロリズマブとの組み合わせとしての用量漸増、第１ｂ相コホート拡大を伴う；第２相：群逐次デザインを用いた有効性拡大。

第２相では、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを以下の適応疾患において単独療法として判定する：コホート２Ａ：進行（切除不能又は転移性）黒色腫；コホート２Ｂ：進行（切除不能又は転移性）腎細胞癌（ＲＣＣ）。

第２相では、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを以下の適応疾患においてペンブロリズマブと組み合わせて判定する：コホートＣ：進行（切除不能な又は転移性（ｍｅｔｓｔａｔｉｃ））尿路上皮癌。

各試験フェーズにおいて、患者（ｐａｔｅｎｔｉｓ）はＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉを３週間毎（Ｑ３Ｗ）に１日目に受ける。患者は、病勢進行（ＰＤ）の確認、許容できない毒性（即ち、用量制限毒性［ＤＳＬ］）、又は本試験若しくは治験薬（ＩＭＰ）から離脱する何らかの理由が発生するまで、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの投与を受ける。

アーム及び介入（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔａｔｉｏｎ）を以下の表７５に提示する。

主要アウトカム尺度には、以下が含まれる：１．試験プロトコルにある判定基準に従い定義されるとおりの、単独療法ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる試験中に認められた用量制限毒性の数の評価［時間フレーム：各対象について治療下にある最初の３週間］；試験プロトコルに従う用量制限毒性判定基準を満たす、単独療法ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる治療中に認められた有害事象の数を評価すること；２．試験プロトコルにある判定基準に従い定義されるとおりの、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉとペンブロリズマブとの組み合わせ療法による試験中に認められた用量制限毒性の数の評価［時間フレーム：組み合わせ療法コホートの各対象について治療下にある最初の３週間］；用量制限毒性；試験プロトコルに従う判定基準を満たす、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉとペンブロリズマブとの組み合わせ療法による治療中に認められた有害事象の数を評価すること；３．全奏効率を評価する［時間フレーム：試験完了後９０日まで、平均１年］；第２相拡大コホートの患者のＲＥＣＩＳＴ第１．１版の判定基準に従う全奏効率（ＯＲＲ）を評価すること。

副次アウトカム尺度には、以下が含まれる：１．試験全体を通じた治療中に発生した有害事象の数を評価する［時間フレーム：試験の第２相部分に登録した最後の対象の最終回治療後３０日まで］；ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉによる治療下にある間に発生した有害事象の数を評価することにより、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの安全性プロファイルを特徴付ける；２．様々な時点でＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの血清濃度を決定する［時間フレーム：治療開始から最終回治療後２８日にわたるまで］；ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの濃度対時間が、試験中の様々な時点で採取された血液試料を使用して測定されることになる；３．奏効期間を評価する［時間フレーム：療法開始時点から、最初に腫瘍進行が記録された日まで、最長２４ヵ月まで評価される］；ＲＥＣＩＳＴ１．１判定基準を使用して奏効期間を評価すること；４．最良総合効果を評価する［時間フレーム：試験完了後９０日まで、平均１年］；ＲＥＣＩＳＴ１．１判定基準を使用して最良総合効果を評価すること；５．全生存を評価する［時間フレーム：本試験への登録から死亡までの時間、試験中の最終回治療後最長２年まで測定される］；治療後の全生存を評価すること；６．全奏効率を評価する［時間フレーム：試験への登録から、試験中の最終回治療後最長２年までの時間（ｌｉｍｅ）］；治験責任医師の判断により全奏効率を評価すること。

適格性判定基準
組入れ基準（第１相全般）は、以下である：１．署名した書面によるインフォームドコンセント；２．年齢１８歳以上の男性又は女性患者；３．標準療法が存在しないか、又は標準療法が失敗した、組織学的又は細胞学的に証明されている局所進行又は転移性固形腫瘍；４．試験登録時のＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０又は１及び推定平均余命が少なくとも３ヵ月；５．疾患の臨床的又は放射線学的エビデンス；６．６ヵ月以内に保管された腫瘍生検が利用可能、少なくとも８スライドが利用可能；又は任意選択の、スクリーニングウィンドウ中に入手された新鮮生検；７．白血球（ＷＢＣ）数≧３×１０^９／Ｌで、好中球絶対数（ＡＮＣ）≧１．５×１０^９／Ｌ、リンパ球数≧０．５×１０^９／Ｌ、血小板数≧７５×１０^９／Ｌ、及びヘモグロビン≧９ｇ／ｄＬ（輸血されたものであってもよい）によって定義される適切な血液学的機能；８．総ビリルビンレベル≦１．５×正常上限（ＵＬＮ）、ＡＳＴレベル≦２．５×ＵＬＮ、及びＡＬＴレベル≦２．５×ＵＬＮによって定義される適切な肝機能、又は肝転移疾患の記録がある患者について、ＡＳＴ及びＡＬＴレベル≦５×ＵＬＮ；９．コッククロフト・ゴールト式に従う推算クレアチニンクリアランス５０ｍｌ／分によって定義される適切な腎機能；１０．過去直近の抗癌療法の毒性作用が、ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ５．０に従う≦グレード１（脱毛を除く）に解消した、患者が大手術又は放射線療法を受けたのであれば＞３０グレイに解消したことが認められる、患者は、介入による毒性及び／又は合併症から回復していなければならない（≦グレード２ニューロパチー又は≦グレード２脱毛を有する患者は、この判定基準の例外とし、本試験に適格となり得る）；１１．妊娠可能な女性（ＷＯＣＢＰ）患者について、世界保健機関（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）ガイドラインによって１「極めて有効」な方法又は２「有効」な方法に定義されるとおりの有効な避妊法；１２．その承認されている表示に従いペンブロリズマブの投与を受けるのに適格である（組み合わせコホートのみ）。

追加的な第１相単独療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒｐａｈｙ）拡大組入れ基準は、以下である：１．以下の腫瘍型のうちの１つを有する：黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性高値の癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はトリプルネガティブ乳癌；２．治験責任医師によってＲＥＣＩＳＴ、第１．１版を使用して決定されるとおりの、測定可能な疾患；３．治療前生検及び治療下にある間の別の生検を受けることに同意する；４．治療前生検及び治療下にある間の別の生検を行ったことと一致するその疾患の臨床的／放射線学的発現を示す。

追加的な第１ｂ相組み合わせ療法拡大コホート判定基準は、以下である：１．治験責任医師によってＲＥＣＩＳＴ、第１．１版を使用して決定されるとおりの、測定可能な疾患；２．治療前生検及び治療下にある間の別の生検を受けることに同意する；３．治療前生検及び治療下にある間の別の生検を行ったことと一致するその疾患の臨床的／放射線学的発現を示す。

組入れ基準（第２相全般）は、以下である：１．署名した書面によるインフォームドコンセント；２．年齢１８歳以上の男性又は女性患者；３．試験登録時のＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０又は１及び推定平均余命が少なくとも３ヵ月；４．治験責任医師によってＲＥＣＩＳＴ、第１．１版を使用して決定されるとおりの、測定可能な疾患；５．治療前生検及び治療下にある間の別の生検を受けることに同意する；６．ＷＢＣ数≧３×１０^９／ＬであってＡＮＣ≧１．５×１０^９／Ｌ、リンパ球数≧０．５×１０^９／Ｌ、血小板数≧７５×１０^９／Ｌ、及びヘモグロビン≧９ｇ／ｄＬ（輸血されたものであってもよい）によって定義される適切な血液学的機能；７．総ビリルビンレベル≦１．５×ＵＬＮ、ＡＳＴレベル≦２．５×ＵＬＮ、及びＡＬＴレベル≦２．５×ＵＬＮ、又は肝転移疾患の記録がある患者について、ＡＳＴ及びＡＬＴレベル≦５×ＵＬＮによって定義される適切な肝機能；８．コッククロフト・ゴールト式に従う推算クレアチニンクリアランス＞５０ｍｌ／分によって定義される適切な腎機能；９．過去直近の抗癌療法の毒性作用がＮＣＩＣＴＣＡＥｖ５．０に従うグレード≦１（脱毛を除く）に解消した、患者が大手術又は放射線療法を受けたのであれば＞３０グレイに解消したことが認められる、患者は、介入による毒性及び／又は合併症から回復していなければならない（≦グレード２ニューロパチー又は≦グレード２脱毛を有する患者は、この判定基準の例外とし、本試験に適格となり得る）；１０．治療前生検及び治療下にある間の別の生検を行ったことと一致するその疾患の臨床的／放射線学的発現を示す；１１．ＷＯＣＢＰ患者について、ＷＨＯガイドラインによって１「極めて有効」な方法又は２「有効」な方法に定義されるとおりの有効な避妊法。

追加的な第２相組入れ基準（黒色腫のみ）は、以下である：１．抗ＰＤ－１抗体による治療を少なくとも６週間受けた；２．抗ＰＤ－１の投与が行われている間、ＰＤの初回診断の少なくとも４週間後にＰＤの確認を有する。ＰＤの確認は、放射線学的又は臨床的所見に基づき得る；３．腫瘍がＢＲＡＦ活性化変異を持ち、及び最終ラインの治療後に進行した場合、ＢＲＡＦ阻害薬を受けていなければならない。

追加的な第２相組入れ基準（腎細胞のみ）は、以下である：１．任意の明細胞成分；２．抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗血管内皮成長因子療法による治療を単独療法として又は組み合わせで受けた；３．過去に３ライン以下の療法を受けた。

追加的な第２相組入れ基準（尿路上皮癌のみ）は、以下である：１．組織学的又は細胞学的に確認された局所進行又は転移性尿路移行上皮癌（腎盂、尿管、尿路上皮、尿道を含む）；２．手術不能局所進行又は転移性尿路上皮癌に対する１つの（及び１つを超えない）白金含有レジメン（例えば、白金＋別の薬剤、例えば、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンなど）を受けたことがなければならず、Ｘ線所見進行を伴う又は補助療法としての白金含有レジメンの最終回投与後６ヵ月以内の再発を伴う（これらが伴えば、第一選択の白金含有レジメンの失敗と見なされることになり得る）；３．転移性疾患の治療に対する２ラインを超えない療法（白金含有レジメンを含む）を受けたことがある；４．ＣＰＩ（即ち、単独療法としての、又は白金系化学療法との組み合わせでの抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１による治療を受けたことがあってはならない。

除外基準は、以下である：１．許可されていない薬物による同時治療；２．ｒｈＩＬ２又はＩＬ２部分を含有する任意の組換え長時間作用型薬物前による過去の治療歴；３．同時に行われる抗癌治療（例えば、細胞減少療法、放射線療法［但し、骨転移に対する緩和放射線療法を除く］、免疫療法、又はエリスロポエチンを除くサイトカイン療法）、大手術（過去の診断的生検を除く）、同時に行われるステロイド又は他の免疫抑制剤による全身療法、又は試験治療の開始前２８日以内の任意の治験薬の使用。全身性ステロイド薬の（即ち、アレルギー反応又はｉｒＡＥの管理のための）短期投与は許容される；注記：ビスホスホネート系薬の投与を受けたことがある患者は、ＤＦ－ｈＩＬ－１２－Ｆｃｓｉの初回用量の少なくとも１４日前に治療が開始されたならば適格とする；４．過去３年以内の本試験で研究されることになる標的悪性腫瘍以外の悪性疾患歴、但し、皮膚基底細胞癌又は扁平上皮癌は例外とする、限局性前立腺癌又は子宮頸部上皮内癌；５．急速進行性疾患；６．抗ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１薬剤が単独療法として投与される治療中に起こる任意のグレード２以上の神経毒性又は肺毒性；７．活動中の又は過去の中枢神経系（ＣＮＳ）転移。脳転移を伴う黒色腫患者は、治療後４週間にわたって安定していれば適格である；８．自家又は同種異系幹細胞移植を含めた任意の臓器移植の受容；９．重大な急性又は慢性感染症（ヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ］の検査陽性歴、又はスクリーニングウィンドウ内で検査した活動性若しくは潜在性Ｂ型肝炎又は活動性Ｃ型肝炎）を含む；１０．過去３年以内に２８日超にわたって全身性免疫抑制剤による治療を必要とした既存の自己免疫疾患（白斑を有する患者を除く）又は臨床的に関連性のある免疫不全症（例えば、異常ガンマグロブリン血症又は先天性免疫不全症）、又は１日目から７日以内の発熱；１１．モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に対する既知の重症過敏性反応（≧グレード３ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ５．０）、任意のアナフィラキシー歴、又は喘息のコントロール不良（即ち、部分的にコントロールされている喘息の３つ以上の特徴）；１２．≧グレード２ＮＣＩＣＴＣＡＥｖ５．０の過去の療法に関連する持続性の毒性、しかしながら≦グレード２の脱毛及び感覚性ニューロパチーは許容される；１３．試験中に妊娠中又は授乳中の女性；１４．既知のアルコール又は薬物乱用；１５．重篤な心臓の病気又は病状であって、限定はされないが、ａ．ニューヨーク心臓協会（ＮｅｗＹｏｒｋＨｅａｒｔＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）クラスＩＩＩ又はＩＶ心不全又は収縮機能不全（左室駆出率［ＬＶＥＦ］＜５５％）の病歴；ｂ．高リスクのコントロールされていない不整脈、即ち、安静時心拍数１００／分超を伴う頻脈；ｃ．重大な心室性不整脈（心室頻拍）又は高グレード房室（ＡＶ）ブロック（第２度房室ブロック２型［モビッツ２型）又は第３度房室ブロック）；ｄ．抗狭心症薬投与を必要とする狭心症；ｅ．臨床的に重大な心臓弁膜症；ｆ．ＥＣＧ上の貫壁性梗塞のエビデンス；ｇ．コントロール不良の高血圧症（収縮期＞１８０ｍｎＨｇ又は拡張期＞１００ｍｍＨｇによって定義される）；ｈ．臨床的に関連性のあるコントロール不良の心リスク要因、治験責任医師の意見によれば本試験への参加を制限し得る臨床的に関連性ある肺疾患又は任意の臨床的に関連性のある病態を含むもの；１６．治験責任医師の意見によれば、患者が参加する能力を損なう可能性のある他のあらゆる重大な疾患（例えば、炎症性腸疾患）；１７．インフォームドコンセントの理解又は提出を妨げることになるであろう任意の精神医学的病態；１８．法的無能力又は限られた法的行為能力；１９．インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）及び本プロトコルに挙げられる要求事項及び制限事項の順守を含む、署名したインフォームドコンセントを差し出すことができない。

実施例２９：ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉを使用した癌の治療
目的
本臨床試験は、以下のフェーズで設計する：第１相、第１ｂ相、及び第２相。

第１相の主要目的は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性及び忍容性を評価することである（別名ＤＦ６００２）単独療法としての、及び進行（切除不能、再発性又は転移性）固形腫瘍を有する患者におけるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの最大耐用量（ＭＴＤ）を決定すること。

第１ｂ相の主要目的は、ニボルマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性及び忍容性を評価すること、及び進行（切除不能、再発性、又は転移性）固形腫瘍を有する患者におけるニボルマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することである。

単独療法としての及びニボルマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉによる第１相及び第１ｂ相の副次的目的は、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＰＫを特徴付けること；ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの免疫原性を判定すること、及びその曝露量と臨床活性とを相関付けること；治験責任医師によりＲＥＣＩＳＴ１．１を使用してＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに関して決定されるとおりの、最良総合効果（ＢＯＲ）を評価すること；治験責任医師によりＲＥＣＩＳＴ１．１を使用してＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに関して決定されるとおりの、最良総合効果（ＢＯＲ）を評価すること；ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの奏効期間（ＤＯＲ）を評価すること；ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに関する無増悪生存（ＰＦＳ）を評価すること；全生存（ＯＳ）期間を評価することである。

単独療法としての及びニボルマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉによる第２相の副次的目的は、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＰＫを特徴付けること；ＩＥＲＣに従いＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの奏効期間（ＤＯＲ）を評価すること；ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用してＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの臨床的有用率（ＣＢＲ）を評価すること。ＣＢＲは、最良効果として完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、又は病勢安定（ＳＤ）である患者の割合として定義される；ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性を評価すること；ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの免疫原性を判定すること、及び曝露量及び臨床活性と相関付けること；ＩＥＲＣに従いＲＥＣＩＳＴ１．１を使用して、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉに関する無増悪生存（ＰＦＳ）を評価すること；及び全生存（ＯＳ）期間を評価することである。

アーム及び介入は、以下の表７６に提示する。

主要アウトカム尺度としては、以下が挙げられる：
１．試験プロトコルにある判定基準に従い定義されるとおりの、単独療法ＤＦ６００２による試験中に認められた用量制限毒性の数の評価［時間フレーム：各対象について治療下にある最初の３週間］。試験プロトコルに従う用量制限毒性判定基準を満たす、単独療法ＤＦ６００２による治療中に認められた有害事象の数を評価すること；
２．試験プロトコルにある判定基準に従い定義されるとおりの、ＤＦ６００２とニボルマブとの組み合わせ療法による試験中に認められた用量制限毒性の数の評価［時間フレーム：組み合わせ療法コホートの各対象について治療下にある最初の３週間］。試験プロトコルに従う用量制限毒性判定基準を満たす、ＤＦ６００２とニボルマブとの組み合わせ療法による治療中に認められた有害事象の数を評価すること；及び
３．全奏効率を評価する［時間フレーム：試験完了後９０日まで、平均１年。］第２相拡大コホートの患者のＲＥＣＩＳＴ第１．１版の判定基準に従う全奏効率（ＯＲＲ）を評価すること。副次アウトカム尺度としては、以下が挙げられる：１．試験全体を通じた治療中に発生した有害事象の数を評価する［時間フレーム：試験の第２相部分に登録した最後の対象の最終回治療後３０日まで］。ＤＦ６００２による治療下にある間に発生した有害事象の数を評価することにより、ＤＦ６００２の安全性プロファイルを特徴付ける；２．様々な時点でＤＦ６００２の血清濃度を決定する［時間フレーム：治療開始から最終回治療後２８日にわたるまで］。ＤＦ６００２の濃度対時間が、試験中の様々な時点で採取された血液試料を使用して測定されることになる；
４．奏効期間を評価する［時間フレーム：療法開始時点から、最初に腫瘍進行が記録された日まで、最長２４ヵ月まで評価される］。ＲＥＣＩＳＴ１．１判定基準を使用して奏効期間を評価すること；
５．最良総合効果を評価する［時間フレーム：試験完了後９０日まで、平均１年］ＲＥＣＩＳＴ１．１判定基準を使用して最良総合効果を評価すること；
６．全生存を評価する［時間フレーム：本試験への登録から死亡までの時間、試験中の最終回治療後最長２年まで測定される］治療後の全生存を評価すること；及び
７．全奏効率を評価する［時間フレーム：試験への登録から、試験中の最終回治療後最長２年までの時間］治験責任医師の判断により全奏効率を評価すること。

組入れ基準（第１相及び第１ｂ相全般）には、以下が含まれる：１．年齢１８歳以上の男性又は女性患者；２．以下の腫瘍型の間の、標準療法が存在しない又は標準療法が失敗した、組織学的又は細胞学的に証明されている局所進行又は転移性固形腫瘍：黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、尿路上皮癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、皮膚扁平上皮癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、トリプル陰性乳癌、卵巣癌、及び前立腺癌；３．ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０又は１；４．疾患の臨床的又は放射線学的エビデンス；５．適切な血液学的機能、肝及び腎機能；６．抗癌療法前の毒性作用の≦グレード１への解消（≦グレード２ニューロパチー、≦グレード２内分泌病又は≦グレード２脱毛を有する患者は除外される）；及び７．妊娠可能な女性について世界保健機関（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）ガイドライン１「極めて有効」な方法又は２「有効」な方法によって定義されるとおりの有効な避妊法。

追加的な第１相単独療法及び第１ｂ相ニボルマブとの組み合わせ拡大組入れ基準には、以下が含まれる：１．以下の腫瘍型：黒色腫、非小細胞肺癌、又はトリプルネガティブ乳癌のうちの１つを有する；及び２．治療前生検及び治療下にある間の別の生検を受けることに同意する。

黒色腫に特異的な拡大組入れ基準には、以下が含まれる：１．対がん米国合同委員会（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｉｎｔＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎＣａｎｃｅｒ）ステージ分類システムに指定されるとおりの、組織学的に確認された切除不能なステージＩＩＩ又はステージＩＶ黒色腫；２．眼メラノーマ又はぶどう膜黒色腫を有する参加者は不適格である；３．利用可能な場合、ＰＤ－Ｌ１ステータスの記録がなければならない；４．ＢＲＡＦ（Ｖ６００）突然変異ステータスが既知でなければならない。ＢＲＡＦ突然変異型及び野生型の両方の参加者がこのコホートに許容される；５．ＢＲＡＦ突然変異型参加者は、承認済みのターゲット療法で治療したことがなければならない；６．ＲＥＣＩＳＴ１．１判定基準によるとおりの抗ＰＤ－（Ｌ）１療法（単独療法として又は組み合わせの一部として投与される）の中止時又は中止後における進行性又は再発性疾患の記録がなければならない；及び７．補助療法セッティングで抗ＰＤ－（Ｌ）１の投与を受けた参加者は、ＲＥＣＩＳＴ１．１判定基準によるとおりの抗ＰＤ－（Ｌ）１療法（単独療法として又は組み合わせの一部として投与される）の中止時又は中止から６ヵ月以内の進行性又は再発性疾患の記録がなければならない。

ＮＳＣＬＣに特異的な拡大組入れ基準には、以下が含まれる：１．ステージＩＩＩＢ、ステージＩＶ、又は再発性疾患に関するステージ判定基準を満たしている組織学的に確認されたＮＳＣＬＣ；２．参加者は、進行又は転移性疾患に対するプラチナダブレットベースの化学療法又は少なくとも２ラインの過去の全身療法の最中又はその後に再発性又は進行性疾患を有していなければならないか、又は局所性疾患に対する白金系化学療法の完了後６ヵ月以内の再発性又は進行性疾患を有していなければならない；３．参加者は、利用可能な場合、抗ＰＤ－（Ｌ）１療法の投与を受けたことがあり、その投与時又は投与後に進行していなければならない；及び４．アクショナブルな突然変異のステータス（例えば、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ等）（国／地域の標準治療実践によるとおり検査が利用可能なとき）が既知でなければならない；アクショナブルな突然変異を有する参加者は、標準チロシンキナーゼ阻害薬（国／地域の標準治療実践により利用可能なとおりの）の投与を受けたことがあり、その投与時に進行したか、それに不耐容であったか、又はそれが候補でない者でなければならない。

ＴＮＢＣに特異的な拡大組入れ基準には、以下が含まれる：１．組織学的に確認された切除不能局所進行性又は転移性トリプルネガティブ乳癌。登録前に、米国臨床腫瘍学会（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ）及び米国病理医協会（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＰａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ）のガイドラインによるＰＤ－Ｌ１ステータス、ＨＥＲ２陰性、エストロゲン受容体陰性、及びプロゲステロン受容体陰性ステータスが地方施設によって判定されていなければならない；２．患者は、転移性疾患の治療のための抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の投与を受けたことがあってはならず、但し補助療法セッティングでの抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の投与は許容される；３．患者は、その転移性疾患の治療のための１ラインの化学療法を受けたことがなければならず、その化学療法ラインの最中又はその後に進行が認められなければならない；及び４．患者は、その切除不能再発性又は転移性疾患の治療のための２ライン以上の化学療法を受けたことがあってはならない。

第２相（全般）の組入れ基準には、以下が含まれる：１．年齢１８歳以上の男性又は女性患者；２．ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０又は１；３．測定可能な疾患の臨床的又は放射線学的エビデンス；４．適切な血液学的機能、肝及び腎機能；５．過去の抗癌療法の毒性作用の≦グレード１への解消。（≦グレード２ニューロパチー、≦グレード２内分泌病又は≦グレード２脱毛を有する患者は除く。）；６．参加者は、抗ＰＤ－（Ｌ）１療法の投与を受けたことがあり、その投与時又は投与後に進行していなければならない；及び７．妊娠可能な女性について、世界保健機関（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）ガイドライン１「極めて有効」な方法又は２「有効」な方法によって定義されるとおりの有効な避妊法。

第２相（進行性黒色腫患者）の追加的な組入れ基準には、以下が含まれる：１．進行／転移性セッティングで抗ＰＤ－（Ｌ）１の投与を受けた参加者は、抗ＰＤ－（Ｌ）１療法の中止時又はその中止から３ヵ月以内の進行性又は再発性疾患の記録がなければならない；２．補助療法セッティングで抗ＰＤ－（Ｌ）１の投与を受けた参加者は、抗ＰＤ－（Ｌ）１療法の中止時又は中止から６ヵ月以内の進行性又は再発性疾患の記録がなければならない；３．抗ＰＤ－１抗体の投与を受けている間に病勢進行の初期診断から少なくとも４週間後に病勢進行が確認された；４．ＢＲＡＦ突然変異ステータスが既知であり、承認済みのターゲット療法で治療されなければならない；５．腫瘍がＢＲＡＦ活性化変異を担持している場合にＢＲＡＦ阻害薬の投与を受け、最終ラインの治療後に進行した；６．眼メラノーマ又はぶどう膜黒色腫を有する参加者は不適格である；及び７．初期進行から少なくとも４週間後に、抗ＰＤ－（Ｌ）１療法前のＸ線所見進行が、進行を確認するスキャンで確認される必要がある。

第２相（非小細胞肺癌）の追加的な組入れ基準には、以下が含まれる：１．参加者は、進行又は転移性疾患に対するプラチナダブレットベースの化学療法又は少なくとも２ラインの過去の全身療法の最中又はその後に再発性又は進行性疾患を有していなければならないか、又は局所性疾患に対する白金系化学療法の完了後６ヵ月以内の再発性又は進行性疾患を有しなければならない；及び２．アクショナブルな突然変異のステータスが既知でなければならない；アクショナブルな突然変異を有する参加者は、標準チロシンキナーゼ阻害薬の投与を受けたことがあり、その投与時に進行したか、それに不耐容であったか、又はそれが候補でない者でなければならない。

全ての患者（全てのフェーズ）の除外基準：１．ｒｈＩＬ２又はＩＬ２部分を含有する任意の組換え長時間作用型薬物前による過去の治療歴；２．同時に行われる抗癌治療（但し、骨転移に対する緩和放射線療法を例外とする）、免疫療法、又はサイトカイン療法（エリスロポエチンを除く）、大手術（過去の診断的生検を除く）、同時に行われるステロイド又は他の免疫抑制剤による全身療法、又は試験治療の開始前２８日以内の任意の治験薬の使用；３．過去３年以内の、目下の標的悪性腫瘍以外の悪性疾患歴、但し、皮膚基底細胞癌又は扁平上皮癌、限局性前立腺癌又は子宮頸部上皮内癌は例外とする；４．急速進行性疾患；５．抗ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１薬剤が単独療法として投与される治療中に起こる任意のグレード２以上の神経毒性又は肺毒性；６．活動中の又は過去の中枢神経系（ＣＮＳ）転移、但し、以下の判定基準の全てを満したときは、この限りでない：ａ．ＣＮＳ病変が無症候性であり、過去に治療されている；ｂ．患者は、副腎不全の補充療法のための連日のステロイド治療を継続する必要がない；ｃ．イメージングにより、ＣＮＳ転移に対する最終回の治療から２８日超にわたって疾患の安定性が実証される；７．任意の臓器移植の受容、自家又は同種異系幹細胞移植；８．重大な急性又は慢性感染症、又は活動性又は潜在性Ｂ型肝炎又は活動性Ｃ型肝炎；９．過去３年以内に２８日超にわたって全身性免疫抑制剤による治療を必要とした既存の自己免疫疾患、臨床的に関連性のある免疫不全症、又は１日目から７日以内の発熱；１０．モノクローナル抗体に対する既知の重症過敏性反応及び任意のアナフィラキシー歴、又は喘息のコントロール不良；１１．重篤な心臓の病気又は病状；及び１２．標準的な対応策で再発する見込みの低いものを除いた、過去の免疫療法に関連する生命を脅かす毒性の病歴。

探索的目的
単独療法としての及びニボルマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの両方による探索的目的は、腫瘍及び末梢バイオマーカーのベースラインからの変化、及びＰＫとの関係を判定すること；ニボルマブのＰＫを評価すること（第１ｂ相及びコホート２Ｃのみ）；治験責任医師評価（ＲＥＣＩＳＴによるＯＲＲ、ＤＯＲ、ＣＢＲ、及びＢＯＲ）に従い有効性拡大コホートパート（第２相）におけるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの活性を判定すること；腫瘍及び末梢バイオマーカーと、腫瘍応答率との間の関連性を判定することである。

試験デザイン概要
本試験は、単独療法としての及びニボルマブと組み合わせたＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性、忍容性、ＰＫ、薬力学、及び予備的な抗腫瘍活性を決定するように設計された、連続する並行群間有効性拡大試験による第１／２相非盲検用量漸増試験である。試験デザインの概略図を図５２Ａ（単独療法について）及び５２Ｂ（ニボルマブとの組み合わせ療法について）に示す。

本試験は３パートからなる：第１相：３＋３デザインを用いた単独療法としての用量漸増、第１相コホート拡大を伴う；第１ｂ相：３＋３デザインを用いたニボルマブとの組み合わせとしての用量漸増、第１ｂ相コホート拡大を伴う；第２相：群逐次デザインを用いた有効性拡大。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、以下の適応疾患において有効性拡大コホートで単独療法として判定する：コホート２Ａ：進行（切除不能又は転移性）黒色腫；コホート２Ｂ：進行（切除不能又は転移性）腎細胞癌（ＲＣＣ）。

ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、以下の適応疾患において有効性拡大コホートでニボルマブとの組み合わせで判定する：コホート２Ｃ：進行（切除不能又は転移性）尿路上皮癌。

各試験フェーズにおいて、患者はＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与を４週間毎に（Ｑ４Ｗ）１日目に受ける。患者は、病勢進行（ＰＤ）の確認、許容できない毒性（即ち、用量制限毒性［ＤＬＴ］）、又は本試験若しくは治験薬（ＩＭＰ）から離脱する何らかの理由が発生するまでＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与を受ける。

次の用量レベル（ＤＬ）に漸増するかの判断は、ＤＬＴが理由でない限り、サイクル１、２１日目（Ｃ１Ｄ２１）までのコホートの全ての患者に対する安全性評価の実施が終わった後の安全性評価に基づく。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの安全性を評価するため、用量漸増判断について責任を負う安全性監視委員会（ＳＭＣ）が設立される。

用量レベル「ｎ」の安全性が確立された後、ＳＭＣは、第Ｉ相拡大コホートにおいて当該の用量レベルまで登録を許可する選択権を有する；；この手順によって５０例以下の患者を登録することができる。

第１ｂ相：ニボルマブとの組み合わせとしての用量漸増
本試験の第１ｂ相用量漸増フェーズは、第１相について記載されるとおり、標準的な３＋３デザインを用いて、ニボルマブとの組み合わせを所与としたときのＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉのＤＬＴ及びＭＴＤを決定するようにデザインされる。

ニボルマブは、４週間毎に１回投与される（各サイクルの１日目に）その米国添付文書に従い。ニボルマブの投与は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与よりも前に行われる。

ニボルマブと組み合わせて試験されるＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ用量レベルは、単独療法として試験されるレベルと同じである。

第１ｂ相は、ＳＭＣがＤＬ２単独療法の安全性を確立した後に開始する（ＤＬ３への登録を開始することの合意として定義される）。第１ｂ相は、第１ｂ相が開始される時点で単独療法によって確立された安全用量の少なくとも１レベル低いＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ用量から開始する。

用量レベル「ｎ」の安全性が確立された後、ＳＭＣは、第１ｂ相拡大コホートにおいて登録を許可する選択権を有する；この手順によって全用量レベルで５０例以下の患者を登録することができる。

第２相有効性拡大
以下の腫瘍型を推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ）で登録する：単独療法として：コホート２Ａ：進行（切除不能又は転移性）黒色腫；コホート２Ｂ：進行（切除不能又は転移性）腎細胞癌。ニボルマブと組み合わせて、コホート２Ｃ：進行（切除不能又は転移性）尿路上皮癌。

安全性の監視
試験登録時の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥａｓｔｅｒｎＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＯｎｃｏｌｏｇｙＧｒｏｕｐ：ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスが０又は１であり、且つ推定平均余命が少なくとも３ヵ月の年齢１８歳以上の男性又は女性患者を登録する。各試験フェーズ／コホートにおける主要組入れ基準は、以下のとおりである：
第１／１ｂ相における用量漸増コホート：以下の適応疾患における標準療法が存在しない又はそれに対する標準療法が失敗した、組織学的又は細胞学的に証明されている局所進行又は転移性固形腫瘍：黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮癌、尿路上皮癌、胃癌、食道癌、子宮頸部癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、皮膚扁平上皮癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、卵巣癌、及び前立腺癌；疾患の臨床的又は放射線学的エビデンス。

第１／１ｂ相における用量拡大コホート：標準療法が存在しない又はそれに対する標準療法が失敗した組織学的又は細胞学的に証明されている局所進行又は転移性固形腫瘍；固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）、第１．１版を使用して治験責任医師によって決定されるとき、測定可能な疾患を有する。

コホート２Ａ
進行性黒色腫を有する患者であって、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）抗体による治療を少なくとも６週間受けた；抗ＰＤ－１の投与が行われている間、ＰＤの初回診断の少なくとも４週間後にＰＤの確認を有する。ＰＤの確認は、放射線学的又は臨床的所見に基づき得る；腫瘍がＢＲＡＦ活性化変異を持ち、及び最終ラインの治療後に進行した場合、ＢＲＡＦ阻害薬を受けていなければならない患者。

コホート２Ｂ
進行ＲＣＣを有する患者であって、任意の明細胞成分を有する；抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗血管内皮成長因子療法による治療を単独療法として又は組み合わせで受けた；過去に３ライン以下の療法を受けた患者。

用量／投与様式／投薬スケジュール
ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、単独療法コホート及び組み合わせコホートの両方においてＱ４Ｗ（即ち、各サイクルの１日目に）で皮下（ＳＣ）注射として投与される。患者は薬物ＳＣの投与を最大２ヵ所の注射部位に１ｍＬを超えない容積で受ける。２回目の投与は、該当する場合、１回目の投与の完了後１０分以内に完了される。

ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉＤＬ（μｇ／ｋｇ）は、以下の表７７にあるとおりである。

第１ｂ相及びコホート２Ｃでは、ニボルマブは、添付文書に従い、静脈内（ＩＶ）注入によって４週間毎に１回（Ｑ４Ｗ）、４８０ｍｇの用量で投与される。ニボルマブの投与は、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの投与よりも前に行われる。ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉは、ニボルマブの投与の完了後１時間以内に投与される。

単独療法としての有効性拡大（コホート２Ａ及び２Ｂ）
このフェーズの主要評価項目は、ＯＲＲである。これらのコホートの各々について、帰無仮説は、客観的奏効率（ＯＲＲ）が５％を超えない（Ｈ０：ＯＲＲ＜５％）というものであり、対立仮説は、ＯＲＲが５％より高いというものである（Ｈ１：ＯＲＲ≧５％）。

単独療法としてのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの目標ＯＲＲは、２０％である。これらのコホートの各々につき４０例の患者を登録することが予想される（即ち、合計で約８０例の患者）。

ニボルマブと組み合わせた有効性拡大（コホート２Ｃ）
ニボルマブと組み合わせた有効性拡大についての第２相部分は、１ラインの白金系化学療法後に進行したＵＢＣ患者において組み合わせでのＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉの臨床活性を決定する。

本試験には４０例の患者が登録し、そのため４０例の登録患者中１４例の奏効（ＣＲ又はＰＲ）が観察されれば、９５％ＣＩ（０．２０６；０．５１７）につながることになり、これは、Ｃｈｅｃｋｍａｔｅ２７５に登録された同様の集団でニボルマブについて報告されている奏効割合の値を除外する。その試験では、ＯＲＲは１９．６％であった（ＳｈａｒｍａＰ，ＲｅｔｚＭ，Ｓｉｅｆｋｅｒ－ＲａｄｔｋｅＡ，ＢａｒｏｎＡ，ＮｅｃｃｈｉＡ，ＢｅｄｋｅＪ，ｅｔａｌ．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂｉｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｕｒｏｔｈｅｉｌａｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｆｔｅｒｐｌａｔｉｎｔｈｅｒａｐｙ（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ２７５）：ａｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｓｉｎｇｌｅ－ａｒｍｐｈａｓｅ２ｔｒｉａｌ．ＬａｎｃｅｔＯｎｃｏｌ．２０１７Ｊａｎ２５；Ｓ１４７０－２０４５（１７）：３００６５－７）。

探索的バイオマーカー
末梢バイオマーカー
末梢バイオマーカーは、全ての患者において、細胞パラメータ：フローサイトメトリーによる免疫表現型タイピング（ＩＰＴ）用の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）；可溶性因子：血清試料中のサイトカイン及びケモカイン；エキソビボＩＬ１２応答アッセイ：エキソビボ刺激と、続くＩＦＮγ産生分析用のＰＢＭＣ；循環腫瘍（ｃｔ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含めた末梢で評価する。－遺伝子発現プロファイルはＮａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用して実施する：スクリーニング時及びＣ１Ｄ１５に採取した末梢血から全ＲＮＡを単離する；ＩＰＴ評価は、以下の試験来院：Ｃ１Ｄ３、Ｃ１Ｄ８、Ｃ２Ｄ８、及びＣ３Ｄ３の各々において、ＤＦｈＩＬ１２－ＦｃｓｉＣ１～Ｃ３の投与の２時間前に採取した全血試料に由来するＰＢＭＣで実施する；可溶性因子は、各治療サイクルのＤ１、並びにＣ１Ｄ２、Ｃ１Ｄ３、Ｃ１Ｄ５、Ｃ１Ｄ８、Ｃ１Ｄ１５、Ｃ２Ｄ３、Ｃ３Ｄ３、及びＣ４Ｄ３、並びにＥＯＴ及びＳＦＵ来院時に、ＤＦｈＩＬ１２－Ｆｃｓｉ投与前２時間以内に採取した血清試料中で決定する。

第１／１ｂ相拡大コホート及び有効性拡大コホートに登録している患者についてはスクリーニング時（即ち、１回目の試験薬物用量前３０日以内）及び治療期間中の予め指定された時点で、新鮮必須腫瘍生検を実施する。

評価される他のバイオマーカーとしては、腫瘍浸潤白血球の頻度及び局在（例えば、ＩＨＣ又はＩＦによるＣＤ８、ＣＤ４Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、マクロファージ［Ｍ１／２プロファイル］）、遺伝子発現プロファイル、及びファーマコゲノミクス（ＰＧｘ）が挙げられる。

全血及び／又は保管腫瘍から抽出したＤＮＡに関して、生殖細胞系列ＤＮＡが調べられてもよい。この抽出ＤＮＡを全エクソームシーケンシング及び／又は遺伝子タイピングに使用する。この目的で、全ての適応疾患について、ベースライン時に（即ち、試験治療の１回目の投与よりも前に）追加的な６ｍＬの全血を採取する；必要であれば、腫瘍遺伝学の試験のためのＤＮＡの抽出には、保管されている腫瘍試料の一部が使用されるため、追加の腫瘍試料は必要ない。

参照による援用
本明細書に引用される特許文献及び科学論文の各々の開示は、全体があらゆる目的から参照によって援用される。

均等物
本発明は、その趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化されてもよい。従って前述の実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載される発明を限定するのでなく、むしろ例示するものと考えられるべきである。このように、本発明の範囲は、前述の説明によるのでなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって指示され、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲に含まれるあらゆる変更が、特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims

（ａ）ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質であって、
（ｉ）第１の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと、多サブユニットサイトカインの第１のサブユニットとを含む第１のポリペプチド；及び
（ｉｉ）第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドと、前記多サブユニットサイトカインの第２の異なるサブユニットとを含む第２のポリペプチド
を含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質、
（ｂ）クエン酸塩；
（ｃ）糖；
（ｄ）糖アルコール；及び
（ｅ）非イオン性界面活性剤
を含む、ｐＨ６．０～７．０の医薬製剤であって、
前記第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドが、各々、ヘテロ二量体化を促進する異なる突然変異を含み、及び
前記多サブユニットサイトカインの前記第１のサブユニット及び第２の異なるサブユニットが互いに結合している、医薬製剤。
前記第１及び／又は第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドが、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中のクエン酸塩の濃度が約１０ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項１又は２に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中のクエン酸塩の濃度が約２０ｍＭである、請求項３に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記糖の濃度が約３％～約１２％（ｗ／ｖ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記糖の濃度が約６％（ｗ／ｖ）である、請求項５に記載の医薬製剤。
前記糖が二糖である、請求項５又は６に記載の医薬製剤。
前記二糖がスクロースである、請求項７に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記糖アルコールの濃度が約０．５％～約６％（ｗ／ｖ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記糖アルコールの濃度が約１％（ｗ／ｖ）である、請求項９に記載の医薬製剤。
前記糖アルコールが単糖に由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記糖アルコールがマンニトールである、請求項１１に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記非イオン性界面活性剤の濃度が約０．００５％～約０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）である、請求項１３に記載の医薬製剤。
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベートである、請求項１３又は１４に記載の医薬製剤。
前記ポリソルベートがポリソルベート８０である、請求項１５に記載の医薬製剤。
ｐＨが約６．１～約６．９である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
ｐＨが約６．２～約６．８である、請求項１７に記載の医薬製剤。
ｐＨが約６．３～約６．７である、請求項１８に記載の医薬製剤。
ｐＨが約６．４～約６．６である、請求項１９に記載の医薬製剤。
ｐＨが約６．５である、請求項２０に記載の医薬製剤。
水を更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記水が、ＵＳＰ注射用水である、請求項２２に記載の医薬製剤。
約１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
約２ｇ／Ｌ～約８ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項２４に記載の医薬製剤。
約４ｇ／Ｌ～約６ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項２５に記載の医薬製剤。
約５ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項２６に記載の医薬製剤。
約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの投与用濃度の前記タンパク質を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
約０．７５ｇ／Ｌ～約１．２５ｇ／Ｌの投与用濃度の前記タンパク質を含む、請求項２８に記載の医薬製剤。
約１ｇ／Ｌの投与用濃度の前記タンパク質を含む、請求項２９に記載の医薬製剤。
約２℃～約８℃の温度で保存するように設計される、１～３０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
澄明な無色の溶液であり、目に見える粒子状物質を含まない、請求項１～３１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
示差走査型蛍光定量法により測定したとき、
（ａ）約６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、又は約６６℃より高いＴ_ｍ１；及び／又は
（ｂ）約７０℃より高い、約７１℃より高い、約７２℃より高い、約７３℃より高い、約７４℃より高い、約７５℃より高い、約７６℃より高い、又は約７７℃より高いＴ_ｍ２
によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
約６７．０℃のＴ_ｍ１及び約７７．３℃のＴ_ｍ２によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する、請求項３３に記載の医薬製剤。
Ｔ_ｍ１及び／又はＴ_ｍ２によって定義されるとおりの、前記医薬製剤の熱安定性プロファイルが、前記医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない、請求項３４に記載の医薬製剤。
示差走査型蛍光定量法により測定したとき、約６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、約６６℃より高い、又は約６７℃より高いＴ_ａｇｇによって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する、１～３５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
Ｔ_ａｇｇによって定義されるとおりの、前記医薬製剤の熱安定性プロファイルが、前記医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない、請求項３６に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤を５℃で１週間インキュベートした後、前記医薬製剤のｐＨが、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない、請求項１～３７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートした後、前記医薬製剤のｐＨが、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない、請求項１～３８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約１５ｎｍ未満、約１４ｎｍ未満、約１３ｎｍ未満、又は約１２ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、約１１．６ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する、請求項４０に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、前記医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、約１６ｎｍ未満、又は約１５ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、約１４．４ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する、請求項４２に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、前記医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、又は約１６ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、約１５．３ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する、請求項４４に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、又は約０．２７未満である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、約０．２６である、請求項１～４６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、前記医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、約０．２７未満、又は約０．２６未満である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、約０．２５である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、前記医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．４０未満、約０．３５未満、又は約０．３４未満である、請求項１～４９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、約０．３３である、請求項１～５０のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９９．０％である、請求項５２に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、前記医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、約７５％超、約８０％超、約８１％超、約８２％超、約８３％超、約８４％超、又は約８５％超である、請求項１～５３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約８５．２％である、請求項５４に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、前記医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、又は約９８％超である、請求項１～５５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９８．９％である、請求項５６に記載の医薬製剤。
それを必要としている対象に、請求項１～５７のいずれか一項に記載の医薬製剤を単回用量療法として投与することを含む、方法。
それを必要としている対象に、請求項１～５７のいずれか一項に記載の医薬製剤を複数回用量療法で、用量間に少なくとも３週間又は用量間に少なくとも４週間の間隔を置いて投与することを含む、方法。
前記医薬製剤が、前記対象に３週間に１回投与される、請求項５９に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象に４週間に１回投与される、請求項５９に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象に６週間に１回投与される、請求項５９に記載の方法。
前記対象に病勢進行、許容できない毒性が現れた場合、又は前記対象が離脱基準を満たした場合、前記複数回用量療法を中止することを更に含む、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。
前記複数回用量療法の間に前記対象に完全奏効（ＣＲ）が見られた場合、前記完全奏効の確認後少なくとも１２ヵ月間にわたって前記複数回用量療法が更に投与される、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
前記複数回用量療法の総継続期間が２４ヵ月以下である、請求項６４に記載の方法。
前記総治療継続期間が２４ヵ月より長い、請求項６４に記載の方法。
前記医薬製剤が皮下注射によって投与される、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象の体重を基準として、約０．０５μｇ／ｋｇ～約１．７５μｇ／ｋｇの投薬量で前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で前記対象に投与される、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象の体重を基準として、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１０μｇ／ｋｇ、約０．２０μｇ／ｋｇ、約０．４０μｇ／ｋｇ、約０．６０μｇ／ｋｇ、約０．８０μｇ／ｋｇ、約１．００μｇ／ｋｇ、約１．２０μｇ／ｋｇ、約１．４０μｇ／ｋｇ、又は約１．７５μｇ／ｋｇの投薬量で前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で前記対象に投与される、請求項５８～６８のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象の体重を基準として、０．００μｇ／ｋｇより多く約０．０５μｇ／ｋｇより少ない投薬量で前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で前記対象に投与される、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象の体重を基準として、約１．７５μｇ／ｋｇより多い投薬量で前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を提供するのに十分な量で前記対象に投与される、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が癌を有する、請求項５８～７１のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が局所進行又は転移性固形腫瘍を有する、請求項７２に記載の方法。
前記対象における前記癌の存在が、前記固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）、第１．１版を使用して確認される、請求項７２又は７３に記載の方法。
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、子宮内膜癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及びトリプルネガティブ乳癌からなる群から選択される、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が抗ＰＤ－１不応性である、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が黒色腫を有する、請求項７５に記載の方法。
前記対象が、過去に抗ＰＤ－１抗体で少なくとも６週間治療されたことがある、請求項７７に記載の方法。
前記対象が、抗ＰＤ－１抗体の投与を受けている間に、病勢進行の初期診断から少なくとも４週間後に病勢進行を確認されている、請求項７８に記載の方法。
病勢進行が、放射線学的又は臨床的所見によって確認される、請求項７９に記載の方法。
前記対象が、ＢＲＡＦ活性化突然変異を含む腫瘍を有する場合、前記対象が、過去にＢＲＡＦ阻害薬で治療されたことがある、請求項７７に記載の方法。
前記対象がＲＣＣを有する、請求項７５に記載の方法。
前記ＲＣＣが明細胞を有する、請求項８２に記載の方法。
前記患者が、過去に抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体及び／又は抗血管内皮成長因子療法で治療されたことがある、請求項８２に記載の方法。
前記対象が、過去に３ライン以下の療法を受けたことがある、請求項８２に記載の方法。
前記対象が尿路上皮癌を有する、請求項７５に記載の方法。
前記対象が局所進行又は転移性尿路移行上皮癌を有する、請求項８６に記載の方法。
前記対象が、過去に白金含有レジメンを含む単回治療で治療されたことがあり、且つ前記白金含有レジメンの最終回投与後６ヵ月以内のＸ線所見進行再発を示している、請求項８６に記載の方法。
前記対象が、過去に２ライン以下の療法を受けたことがある、請求項８６に記載の方法。
前記対象が、過去に単独療法としての又は白金ベースの化学療法と組み合わせたチェックポイント阻害薬（例えば、抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）療法を受けたことがない、請求項８６に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象に単独療法として投与される、請求項５８～９０のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、前記対象に組み合わせ療法として投与される、請求項５８～９０のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に抗ＰＤ－１抗体を投与することを更に含む、請求項９２に記載の方法。
前記抗ＰＤ－１抗体がペンブロリズマブである、請求項９３に記載の方法。
ペンブロリズマブが静脈内投与される、請求項９４に記載の方法。
ペンブロリズマブが２００ｍｇの用量で投与される、請求項９４又は９５に記載の方法。
ペンブロリズマブの投与が、前記医薬製剤の各投与よりも前に行われる、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、ペンブロリズマブの投与完了後１時間以内に投与される、請求項９７に記載の方法。
前記抗ＰＤ－１抗体がニボルマブである、請求項９２に記載の方法。
ニボルマブが静脈内投与される、請求項９９に記載の方法。
ニボルマブが４８０ｍｇの用量で投与される、請求項９９又は１００に記載の方法。
ニボルマブの投与が、前記医薬製剤の各投与よりも前に行われる、請求項９９～１０１のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、ニボルマブの投与完了後１時間以内に投与される、請求項１０２に記載の方法。
前記癌が、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＲＣＣ、古典的ホジキンリンパ腫、ＨＮＳＣＣ、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、及び食道癌からなる群から選択される、請求項９９～１０３のいずれか一項に記載の方法。
前記癌が黒色腫である、請求項１０４に記載の方法。
前記黒色腫が切除不能である、請求項１０５に記載の方法。
前記癌が結腸直腸癌である、請求項１０４に記載の方法。
前記結腸直腸癌が高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損転移性（ｄＭＭＲ）結腸直腸癌である、請求項１０７に記載の方法。
外科的介入を実施することにより、前記対象の癌細胞を溶解させ、腫瘍を除去し、又は腫瘍を減量させることを更に含む、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
前記外科的介入が凍結療法を含む、請求項１０９に記載の方法。
前記外科的介入が温熱療法を含む、請求項１０９に記載の方法。
前記外科的介入が、前記対象に放射線療法を投与することを含む、請求項１０９に記載の方法。
前記放射線療法が、体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）である、請求項１１２に記載の方法。
前記対象にＮＫ細胞標的療法を投与することを更に含む、請求項９２～１１３のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に多特異性結合タンパク質が投与される、請求項１１４に記載の方法。
前記対象にキメラ抗原受容体療法を投与することを更に含む、請求項９２～１１５のいずれか一項に記載の方法。
前記対象にサイトカイン療法を投与することを更に含む、請求項９２～１１６のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に自然免疫系アゴニスト療法を投与することを更に含む、請求項９２～１１７のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に化学療法を投与することを更に含む、請求項９２～１１８のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に標的抗原療法を投与することを更に含む、請求項９２～１１９のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に腫瘍溶解性ウイルス療法を投与することを更に含む、請求項９２～１２０のいずれか一項に記載の方法。
医薬製剤の投与を受けている対象において毒性を検出する方法であって、前記対象の血中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度を測定することを含む方法において、前記医薬製剤が、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含み、及び前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、方法。
（１）前記対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、前記対象が、薬物有害反応を発症するリスクがあると同定され；及び
（２）前記対象の血中のＣＲＰ濃度が前記閾値Ｃ反応性タンパク質濃度とほぼ同じであるか、又はそれより低い場合、前記対象が、薬物有害反応を発症するリスクはないと同定される、
請求項１２２に記載の方法。
前記対象の血中のＣＲＰ濃度が前記閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、（１）前記医薬製剤の前記投与が中断されるか；（２）前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が用量を下げて投与されるか；又は（３）前記対象における前記製剤の毒性効果を低減し又は緩和するための治療上の措置が講じられる、請求項１２２に記載の方法。
前記第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドである、請求項１～５７のいずれか一項に記載の医薬製剤又は請求項５８～１２４のいずれか一項に記載の方法。
前記多サブユニットサイトカインがヒトＩＬ１２である、請求項１２５に記載の医薬製剤又は方法。
前記ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインポリペプチドが、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含む、請求項１２６に記載の医薬製剤又は方法。
前記第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドが、ＥＵ番号付け方式に従い番号付けして、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＬ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓから選択される突然変異を含む、請求項１２７に記載の医薬製剤又は方法。
前記第１及び第２の抗体Ｆｃドメインポリペプチドが、各々、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａを含む、請求項１２８に記載の医薬製剤又は方法。
多サブユニットサイトカインの前記第１のサブユニットが、ＩＬ１２のｐ４０サブユニットであり、多サブユニットサイトカインの前記第２のサブユニットが、ＩＬ１２のｐ３５サブユニットである、請求項１２９に記載の医薬製剤又は方法。
多サブユニットサイトカインの前記第１のサブユニットが配列番号１２７のアミノ酸配列を含み、多サブユニットサイトカインの前記第２のサブユニットが配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、請求項１３０に記載の医薬製剤又は方法。
多サブユニットサイトカインの前記第２のサブユニットが、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むリンカーによって前記第２の抗体Ｆｃドメインに融合している、請求項１３１に記載の医薬製剤又は方法。
（ａ）前記第１の抗体Ｆｃドメインが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｋ３６０Ｅ、及びＫ４０９Ｗを含み、
（ｂ）前記第２の抗体Ｆｃドメインが、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｑ３４７Ｒ、Ｓ３５４Ｃ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む、
請求項１３２に記載の医薬製剤又は方法。
（ａ）前記第１の抗体Ｆｃドメインが配列番号２１５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記第２の抗体Ｆｃドメインが配列番号２１６のアミノ酸配列を含む、
請求項１３３に記載の医薬製剤又は方法。
前記第１の抗体Ｆｃドメインペプチドが配列番号２９０のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗体Ｆｃドメインペプチドが配列番号２９１のアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載の医薬製剤又は方法。
医薬製剤を含む１つ以上の容器を含むキットであって、前記医薬製剤が、
（ａ）免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域を含むヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質並びにＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニット（ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む）；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体
を含み、
及び前記１つ以上の容器が、合計で約０．１ｍｇ～約２ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、キット。
前記１つ以上の容器が、合計で約０．５ｍｇ～約２ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項１３６に記載のキット。
前記１つ以上の容器が、合計で約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項１３７に記載のキット。
約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む１つの容器を含む、請求項１３８に記載のキット。
前記医薬製剤が凍結乾燥製剤又は液体製剤である、請求項１３６～１３９のいずれか一項に記載のキット。
前記医薬製剤が、１ｍＬの容積で供給される液体製剤である、請求項１４０に記載のキット。
癌の治療用医薬の製造におけるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用であって、前記医薬が、１つ以上の容器に入った約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む液体医薬製剤として製造され、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用。
前記液体医薬製剤が、約１．０ｇ／Ｌの前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項１４２に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用。
癌の治療用医薬の製造におけるヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用であって、前記医薬が、１つ以上の容器に入った約０．１ｍｇ～約２ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む液体医薬製剤として製造され、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々がヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用。
前記液体医薬製剤が、約１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項１４４に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用。
前記医薬が１つの容器に入っている、請求項１４２～１４５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用。
各容器に１ｍｇのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が入っている、請求項１４２～１４６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の使用。
前記医薬が、３週間毎に１日目に前記対象に投与される、請求項１４６～１４７のいずれか一項に記載の使用。
前記医薬が、４週間毎に１日目に前記対象に投与される、請求項１４６～１４７のいずれか一項に記載の使用。
前記医薬が皮下投与される、請求項１４６～１４８のいずれか一項に記載の使用。
前記医薬が、約０．１ｍＬ～約１ｍＬの容積で投与される、請求項１４６～１５０のいずれか一項に記載の使用。
前記医薬が、約１ｍＬの容積で投与される、請求項１５１に記載の使用。
前記医薬が、最大２ヵ所までの注射部位に投与される、請求項１４６～１５２のいずれか一項に記載の使用。
２回目の注射が、１回目の注射後１０分以内に完了される、請求項１５３に記載の使用。
前記医薬が、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１．７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１４６～１５４のいずれか一項に記載の使用。
前記医薬が、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１５５に記載の使用。
前記医薬が投与前に０．９％生理食塩水（注射用塩化ナトリウム）及び０．０１％ポリソルベート８０の溶液中に希釈される、請求項１４６～１５６のいずれか一項に記載の使用。
その医薬製剤の調製用のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を製造する方法であって、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養液から入手した前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む溶液に酢酸を３０分～９０分間加えることを含む方法において、前記酢酸塩が前記溶液のｐＨをｐＨ３．５５～３．７５に調整及び維持し、及び
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、方法。
前記酢酸が、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記溶液に約６０分間加えられる、請求項１５８に記載の方法。
前記酢酸が、前記溶液のｐＨを約３．６５に調整及び維持する、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現する前記ＣＨＯ細胞培養液が、浮遊下に維持される、請求項１５８に記載の方法。
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現する前記ＣＨＯ細胞培養液が、バイオリアクターにて７～２１日間培養される、請求項１６１に記載の方法。
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現する前記ＣＨＯ細胞培養液が、バイオリアクターにて１４日間培養される、請求項１６１又は１６２に記載の方法。
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を発現する前記ＣＨＯ細胞培養液を深層ろ過によって回収すると、ＣＨＯ回収培地が生じる、請求項１５８～１６３のいずれか一項に記載の方法。
前記深層ろ過が、ＤＯＨＣ及びＸＯＨＣフィルタからなる二段階使い捨て深層ろ過である、請求項１６４に記載の方法。
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を前記ＣＨＯ回収培地からプロテインＡキャプチャークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製すると、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記溶液が生じる、請求項１６４又は１６５に記載の方法。
プロテインＡキャプチャークロマトグラフィーが、
プロテインＡ樹脂をｐＨ７．５の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌで平衡化させること；
ＣＨＯ回収培地を前記プロテインＡ樹脂にロードすること；
前記ロードされたプロテインＡ樹脂をｐＨ７．５の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌで洗浄すること；
前記ロードされたプロテインＡ樹脂をｐＨ５．４の５０ｍＭ酢酸塩で洗浄すること；及び
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をｐＨ３．７の５０ｍＭ酢酸塩、１００ｍＭアルギニンで前記プロテインＡ樹脂から溶出させること、及び２８０ｎｍＵＶによって１．２５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して１．２５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集すること
を含む、請求項１６６に記載の方法。
前記プロテインＡ樹脂から溶出した前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記溶液に前記酢酸が０．５Ｍの濃度で加えられ、前記酢酸が前記溶液のｐＨを６０分間にわたってｐＨ３．６５に酸性化し、続いて２Ｍトリスを加えることにより前記溶液をｐＨ５．２に中和する、請求項１６７に記載の方法。
前記溶液の酸性化及び中和に続いて、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記溶液が０．２μｍフィルタに通される、請求項１６８に記載の方法。
前記プロテインＡ樹脂から溶出した前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記ろ過した溶液が、Ｘ０ＳＰ深層ろ過に通される、請求項１６９に記載の方法。
混合モードクロマトグラフィーが、
混合モードクロマトグラフィーカラムをｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸塩で平衡化させること；
Ｘ０ＳＰろ過に通した前記溶液を前記混合モードクロマトグラフィーカラムにロードすること；
前記ロードした混合モードクロマトグラフィーカラムをｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸塩で洗浄すること；及び
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をｐＨ５．２の５０ｍＭ酢酸塩、２５０ｍＭＮａＣｌで前記混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出させること、及び２８０ｎｍＵＶによって０．６２５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して１．５０ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集すること
を含む、請求項１７０に記載の方法。
前記混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出した前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含むこの前記溶液を０．２μｍフィルタに通す、請求項１７１に記載の方法。
陽イオン交換クロマトグラフィーが、
陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂をｐＨ７．４の５０ｍＭトリスで平衡化させること；
前記混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出した前記ろ過した溶液を前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂にロードすること；
前記ロードした陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂をｐＨ７．４の５０ｍＭトリスで洗浄すること；及び
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質をｐＨ７．４の５０ｍＭトリス及びｐＨ７．４の５０ｍＭトリス、０．５ＭＮａＣｌのグラジエントで前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出させること、及び２８０ｎｍＵＶによって２．５ＡＵ／ｃｍ上昇から開始して４．５ＡＵ／ｃｍ下降で終了するまで収集すること
を含む、請求項１７２に記載の方法。
前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出した前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記溶液が、０．２μｍフィルタに通される、請求項１７３に記載の方法。
前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶出した前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記ろ過した溶液が、前置フィルタ、２０ｎｍ公称フィルタ、及び０．２μｍ膜でナノろ過される、請求項１７４に記載の方法。
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記ナノろ過した溶液が限外ろ過され、及びダイアフィルトレーションされる、請求項１７５に記載の方法であって、限外ろ過及びダイアフィルトレーションが、
限外ろ過システムをｐＨ７．４の５０ｍＭトリス、２６５ｍＭＮａＣｌで平衡化させること；
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記ナノろ過した溶液を約５．０ｇ／Ｌの濃度に濃縮すること；
７ダイアボリュームのｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩を使用して緩衝液を交換すること；
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記ダイアフィルトレーションした溶液を約１１．０ｇ／Ｌの濃度に濃縮すること；
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記濃縮溶液をｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩で約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの濃度に希釈すること；及び
ｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩、１８％（ｗ／ｖ）スクロース、３％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を加えることにより、２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記限外ろ過／ダイアフィルトレーション保持溶液の最終濃度を実現すること
を含む、方法。
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む前記限外ろ過した／ダイアフィルトレーションした溶液を０．２μｍ膜に通してバルク原薬を生じさせる、請求項１７６に記載の方法。
前記バルク原薬が、ｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む０．２μｍフィルタでろ過した緩衝液中に、８０％薬物製品溶液となるように希釈される、請求項１７７に記載の方法。
前記原薬又は８０％薬物製品が、ｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸塩、６％（ｗ／ｖ）スクロース、１％（ｗ／ｖ）マンニトール、及び０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む０．２μｍフィルタでろ過した緩衝液中に、１ｍｇ／ｍＬの前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の投与用濃度となるように希釈される、請求項１７７又は１７８に記載の方法。
チェックポイント阻害薬抗体による治療を少なくとも６週間受けたことがある対象の癌を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を前記対象に投与することを含む方法において、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、方法。
前記チェックポイント阻害薬抗体が、抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）抗体である、請求項１８０に記載の方法。
前記癌が黒色腫である、請求項１８０又は１８１に記載の方法。
前記黒色腫が切除不能又は転移性である、請求項１８２に記載の方法。
前記対象が、前記抗ＰＤ－１抗体の投与を受けている間に、病勢進行の初期診断から少なくとも４週間後に病勢進行を有すると確認される、請求項１８２又は１８３に記載の方法。
前記対象が、前記抗ＰＤ－１抗体の投与を受けている間に、病勢進行の初期診断から少なくとも４週間後に病勢進行を有すると確認される、請求項１８２～１８４のいずれか一項に記載の方法。
病勢進行が、放射線学的又は臨床的所見によって確認される、請求項１８４又は１８５に記載の方法。
チェックポイント阻害薬抗体又は抗血管内皮成長因子療法による治療を単独療法として、又は組み合わせで受けたことがある対象の癌を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を前記対象に投与することを含む方法において、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、方法。
前記チェックポイント阻害薬抗体が、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１８７に記載の方法。
前記癌が進行性腎細胞癌（ＲＣＣ）である、請求項１８７又は１８８に記載の方法。
前記ＲＣＣが切除不能又は転移性である、請求項１８９に記載の方法。
前記ＲＣＣが明細胞成分を有する、請求項１８９又は１９０に記載の方法。
前記対象が、過去に療法を３ライン以下だけ受けた、請求項１８９～１９１のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、チェックポイント阻害薬による治療を受けたことがない、請求項１８９～１９２のいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害薬が、単独療法としての、又は白金ベースの化学療法と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、請求項１９３に記載の方法。
ただ１つの白金含有レジメンによる治療を受けたことがある対象の癌を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を前記対象に投与することを含む方法において、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、方法。
前記白金含有レジメンが、ゲムシタビン、メトトレキサート、ビンブラスチン、及びドキソルビシンから選択される薬剤との組み合わせでの白金である、請求項１９５に記載の方法。
前記癌が、局所進行又は転移性尿路移行上皮癌である、請求項１９５又は１９６に記載の方法。
前記尿路上皮癌に、腎盂、尿管、泌尿器尿路上皮、及び尿道からなる群の１つ以上が含まれる、請求項１９７に記載の方法。
前記尿路上皮癌が手術不能である、請求項１９７又は１９８に記載の方法。
前記尿路上皮癌が、補助剤としての白金含有レジメンの最終回投与後６ヵ月以内のＸ線所見進行又は再発を伴い特徴付けられる、請求項１９７～１９９のいずれか一項に記載の方法。
前記尿路上皮癌が、第一選択の白金含有レジメンの失敗と見なされる、請求項１９７～２００のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、前記医薬製剤の投与前に、前記尿路上皮癌の前記治療のための療法（前記白金含有レジメンを含む）を２ライン以下だけ受けたことがある、請求項１９７～２０１のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、チェックポイント阻害薬（ＣＰＩ）による治療を第一選択療法として受けたことがない、請求項１９７～２０２のいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害薬が、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項２０３に記載の方法。
前記チェックポイント阻害薬が単独療法であるか、又は白金ベースの化学療法との組み合わせである、請求項２０３又は２０４に記載の方法。
前記医薬製剤が、ペンブロリズマブと組み合わせて投与される、請求項１９５～２０５のいずれか一項に記載の方法。
ペンブロリズマブが３週間毎に１回投与される、請求項２０６に記載の方法。
ペンブロリズマブが、前記医薬製剤の投与前に投与される、請求項２０６又は２０７に記載の方法。
前記医薬製剤が、ペンブロリズマブの投与完了後１時間以内に投与される、請求項２０８に記載の方法。
ペンブロリズマブが、２００ｍｇの用量で投与される、請求項２０６～２０９のいずれか一項に記載の方法。
ペンブロリズマブが静脈内投与される、請求項２０６～２１０のいずれか一項に記載の方法。
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、高頻度マイクロサテライト不安定性癌、胃癌、食道癌、子宮頸癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、腎細胞癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される、請求項２０６～２１１のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、ニボルマブと組み合わせて投与される、請求項１９５～２０５のいずれか一項に記載の方法。
ニボルマブが、前記医薬製剤の投与前に投与される、請求項２１３に記載の方法。
前記医薬製剤が、ニボルマブの投与完了後１時間以内に投与される、請求項２１４に記載の方法。
ニボルマブが、約４８０ｍｇの用量で投与される、請求項２１３～２１５のいずれか一項に記載の方法。
ニボルマブが静脈内投与される、請求項２１３～２１６のいずれか一項に記載の方法。
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、腎細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸直腸癌、肝細胞癌、膀胱癌、及び食道癌からなる群から選択される、請求項２１３～２１７のいずれか一項に記載の方法。
前記癌が黒色腫である、請求項２１８に記載の方法。
前記黒色腫が切除不能又は転移性である、請求項２１９に記載の方法。
前記癌が結腸直腸癌である、請求項２１８に記載の方法。
前記結腸直腸癌が、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌である、請求項２２１に記載の方法。
前記医薬製剤が、３週間毎に１日目に前記対象に投与される、請求項１８０～２１１のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、４週間毎に１日目に前記対象に投与される、請求項１８０～２２２のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が皮下投与される、請求項１８０～２２３のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、約０．１ｍＬ～約１ｍＬの容積で投与される、請求項１８０～２２５のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、約１ｍＬの容積で投与される、請求項２２６に記載の方法。
前記医薬製剤が、最大２ヵ所までの注射部位に投与される、請求項１８０～２２７のいずれか一項に記載の方法。
２回目の注射が、１回目の注射後１０分以内に完了される、請求項２２８に記載の方法。
前記医薬製剤が、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１．７５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１８０～２２９のいずれか一項に記載の方法。
前記医薬製剤が、約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２３０に記載の方法。
前記医薬製剤が投与前に０．９％生理食塩水（注射用塩化ナトリウム）及び０．０１％ポリソルベート８０の溶液中に希釈される、請求項１８０～２３１のいずれか一項に記載の方法。
前記癌の存在が、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）、第１．１版を使用して決定される、請求項１８０～２３２のいずれか一項に記載の方法。
完全奏効の確認が得られている対象が、打ち切り基準を満たさない限り、確認後少なくとも１２ヵ月間にわたって前記医薬製剤で治療される、請求項１８０～２３３のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血中濃度がモニタされる対象を治療する方法であって、ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤を前記対象に投与することを含む方法において、前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含む、方法。
（１）前記対象の血中のＣＲＰ濃度が閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、前記対象が、薬物有害反応を発症するリスクがあると同定され；及び
（２）前記対象の血中のＣＲＰ濃度が前記閾値Ｃ反応性タンパク質濃度とほぼ同じであるか、又はそれより低い場合、前記対象が、薬物有害反応を発症するリスクはないと同定される、請求項２３５に記載の方法。
前記対象の血中のＣＲＰ濃度が前記閾値ＣＲＰ濃度よりも高い場合、（１）前記医薬製剤の前記投与が中断されるか；（２）前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が用量を下げて投与されるか；又は（３）前記対象における前記製剤の毒性効果を低減し又は緩和するための治療上の措置が講じられる、請求項２３５に記載の方法。
それを必要としている対象の癌を治療する方法であって、前記対象へのヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤の皮下投与を含む方法において、
前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃ（断片結晶化可能）対の第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域とＩＬ－１２のｐ４０及びｐ３５サブユニットとを含み、ＩＬ－１２の前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、別々に、それぞれ前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域に連結されるか、又は前記第２のＦｃ領域及び前記第１のＦｃ領域に連結され、前記ｐ４０及びｐ３５サブユニットが、各々、前記Ｆｃ領域のＮ末端又はＣ末端に連結され、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインが、各々、ヘテロ二量体化を促進する１つ以上の突然変異を含み；及び前記医薬製剤が、クエン酸塩；糖；糖アルコール；及び非イオン性界面活性剤を含み、及び前記製剤のｐＨが５．５～７．０である、方法。
前記第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域が、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域である、請求項１３６～１４１のいずれか一項に記載のキット、請求項１４２～１５７のいずれか一項に記載の使用、又は請求項１５８～２３８のいずれか一項に記載の方法。
ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域が、Ｆｃのエフェクター機能を低減する１つ以上の突然変異を含む、請求項２３９に記載のキット、使用、又は方法。
前記第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域が、ＥＵ番号付け方式に従い番号付けして、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＬ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓから選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項２４０に記載のキット、使用、又は方法。
前記第１のＦｃ領域及び第２のＦｃ領域が、各々、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ａを含む、請求項２４１に記載のキット、使用、又は方法。
ＩＬ１２の前記ｐ４０サブユニットが配列番号１２７のアミノ酸配列を含み、ＩＬ－１２の前記ｐ３５サブユニットが配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、請求項２４２に記載のキット、使用、又は方法。
ＩＬ－１２の前記ｐ３５サブユニットが、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むリンカーによって前記第２のＦｃ領域に融合される、請求項２４３に記載のキット、使用、又は方法。
（ａ）前記第１のＦｃ領域が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｋ３６０Ｅ、及びＫ４０９Ｗを含み、
（ｂ）前記第２のＦｃ領域が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｑ３４７Ｒ、Ｓ３５４Ｃ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔを含む、
請求項２４４に記載のキット、使用、又は方法。
（ａ）前記第１のＦｃ領域が配列番号２１５のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記第２のＦｃ領域が配列番号２１６のアミノ酸配列を含む、
請求項２４５に記載のキット、使用、又は方法。
ＩＬ１２の前記ｐ４０サブユニットに連結された前記第１のＦｃ領域が配列番号２９０のアミノ酸配列を含み、ＩＬ－１２の前記ｐ３５サブユニットに連結された前記第２のＦｃ領域が配列番号２９１のアミノ酸配列を含む、請求項２４６に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、（ａ）クエン酸塩；（ｂ）糖；（ｃ）糖アルコール；及び（ｄ）非イオン性界面活性剤を含み、更に前記製剤のｐＨが約６．０～約７．０である、請求項２３９～２４７のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中のクエン酸塩の濃度が約１０ｍＭ～約３０ｍＭである、請求項２４８に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中のクエン酸塩の濃度が約２０ｍＭである、請求項２４９に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記糖の濃度が約３％～約１２％（ｗ／ｖ）である、請求項２４８～２５０のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記糖の濃度が約６％（ｗ／ｖ）である、請求項２５１に記載のキット、使用、又は方法。
前記糖が二糖である、請求項２５１又は２５２に記載のキット、使用、又は方法。
前記二糖がスクロースである、請求項２５３に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記糖アルコールの濃度が約０．５％～約６％（ｗ／ｖ）である、請求項２４８～２５４のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記糖アルコールの濃度が約１％（ｗ／ｖ）である、請求項２５５に記載のキット、使用、又は方法。
前記糖アルコールが単糖に由来する、請求項２４８～２５６のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記糖アルコールがマンニトールである、請求項２５７に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記非イオン性界面活性剤の濃度が約０．００５％～約０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項２４８～２５８のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中のポリソルベート８０の濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）である、請求項２５９に記載のキット、使用、又は方法。
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベートである、請求項２５９又は２６０に記載のキット、使用、又は方法。
前記ポリソルベートがポリソルベート８０である、請求項２６１に記載のキット、使用、又は方法。
前記ｐＨが約６．１～約６．９である、請求項２４８～２６２のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記ｐＨが約６．２～約６．８である、請求項２６３に記載のキット、使用、又は方法。
前記ｐＨが約６．３～約６．７である、請求項２６４に記載のキット、使用、又は方法。
前記ｐＨが約６．４～約６．６である、請求項２６５に記載のキット、使用、又は方法。
前記ｐＨが約６．５である、請求項２６６に記載のキット、使用、又は方法。
水を更に含む前記医薬製剤、請求項２４８～２６７のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記水が、ＵＳＰ注射用水である、請求項２６８に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、約１ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項２４８～２６９のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、約２ｇ／Ｌ～約８ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項２７０に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、約４ｇ／Ｌ～約６ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項２７１に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、約５ｇ／Ｌのバルク濃度のヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項２７２に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、約０．５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌの投与用濃度の前記タンパク質を含む、請求項２４８～２７３のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、約０．７５ｇ／Ｌ～約１．２５ｇ／Ｌの投与用濃度の前記タンパク質を含む、請求項２７４に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、約１ｇ／Ｌの投与用濃度の前記タンパク質を含む、請求項２７５に記載のキット、使用、又は方法。
前記製剤が、２℃～８℃の温度で保存するように設計される、２４８～２７６のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、澄明な無色の溶液であり、目に見える粒子状物質を含まない、請求項２４８～２７７のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤が、
示差走査型蛍光定量法により測定したとき、
（ａ）約６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、又は約６６℃より高いＴ_ｍ１；及び／又は
（ｂ）約７０℃より高い、約７１℃より高い、約７２℃より高い、約７３℃より高い、約７４℃より高い、約７５℃より高い、約７６℃より高い、又は約７７℃より高いＴ_ｍ２
によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する、請求項２４８～２７８のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記製剤が、約６７．０℃のＴ_ｍ１及び約７７．３℃のＴ_ｍ２によって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する、請求項２７９に記載のキット、使用、又は方法。
Ｔ_ｍ１及び／又はＴ_ｍ２によって定義されるとおりの、前記医薬製剤の前記熱安定性プロファイルが、前記医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない、請求項２８０に記載のキット、使用、又は方法。
前記製剤が、示差走査型蛍光定量法により測定したとき、６０℃より高い、約６１℃より高い、約６２℃より高い、約６３℃より高い、約６４℃より高い、約６５℃より高い、約６６℃より高い、又は約６７℃より高いＴ_ａｇｇによって定義されるとおりの熱安定性プロファイルを有する、２４８～２８１のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
Ｔ_ａｇｇによって定義されるとおりの、前記医薬製剤の前記熱安定性プロファイルが、前記医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートしたとき、５℃で１週間インキュベートする同じ医薬製剤と比較すると、示差走査型蛍光定量法により測定したとき約２℃未満又は約１℃未満しか変化しない、請求項２８２に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤を５℃で１週間インキュベートした後、前記医薬製剤のｐＨが、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない、請求項２４８～２８３のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤を５０℃で１週間インキュベートした後、前記医薬製剤のｐＨが、約０．２又は約０．１のｐＨ値より大きく変化しない、請求項２４８～２８４のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約１５ｎｍ未満、約１４ｎｍ未満、約１３ｎｍ未満、又は約１２ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する、請求項２４８～２８５のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、約１１．６ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する、請求項２８６に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、前記医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、約１６ｎｍ未満、又は約１５ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する、請求項２４８～２８７のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、約１４．４ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する、請求項２８８に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、前記医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約２０ｎｍ未満、約１９ｎｍ未満、約１８ｎｍ未満、約１７ｎｍ未満、又は約１６ｎｍ未満のＺ平均流体力学直径を有する、請求項２４８～２８９のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質が、約１５．３ｎｍのＺ平均流体力学直径を有する、請求項２９０に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、又は約０．２７未満である、請求項２４８～２９１のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、約０．２６である、請求項２４８～２９２のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、前記医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．３０未満、約０．２９未満、約０．２８未満、約０．２７未満、又は約０．２６未満である、請求項２４８～２９３のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、約０．２５である、請求項２４８～２９４のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、前記医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、２５℃で動的光散乱法により測定したとき、約０．４０未満、約０．３５未満、又は約０．３４未満である、請求項２４８～２９５のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤中の前記ヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の多分散性指数が、約０．３３である、請求項２４８～２９６のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、又は約９９％超である、請求項２４８～２９７のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９９．０％である、請求項２９８に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、前記医薬製剤を５０℃で２週間インキュベートした後、約７５％超、約８０％超、約８１％超、約８２％超、約８３％超、約８４％超、又は約８５％超である、請求項２４８～２９９のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約８５．２％である、請求項３００に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、前記医薬製剤を５回の凍結融解サイクルに供した後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、又は約９８％超である、請求項２４８～３０１のいずれか一項に記載のキット、使用、又は方法。
前記医薬製剤の純度プロファイルが、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析における検出総面積に対する割合としての主ピークの面積によって測定したとき、約９８．９％である、請求項３０２に記載のキット、使用、又は方法。